特表 2023-552748 細胞表面タンパク質を提示する生物学的小胞及びそれに関連する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-19

(54)【発明の名称】細胞表面タンパク質を提示する生物学的小胞及びそれに関連する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20231212BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20231212BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231212BHJP

   C12Q 1/66 20060101ALI20231212BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231212BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20231212BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20231212BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20231212BHJP

   C12Q 1/42 20060101ALI20231212BHJP

   C12N 1/02 20060101ALI20231212BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20231212BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N33/53 D

G01N33/53 S

C12Q1/02

C12Q1/66

C12N5/10

C12N7/01

C12Q1/37

C12Q1/48 Z

C12Q1/42

C12N1/02

C12Q1/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023533300

(86)(22)【出願日】2021-11-30

(85)【翻訳文提出日】2023-07-18

(86)【国際出願番号】 US2021061120

(87)【国際公開番号】W WO2022119805

(87)【国際公開日】2022-06-09

(31)【優先権主張番号】63/227,039

(32)【優先日】2021-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/120,167

(32)【優先日】2020-12-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/212,021

(32)【優先日】2021-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】マルティネス－マーティン， ナディア

(72)【発明者】

【氏名】ピーターソン， ショーン エム．

(72)【発明者】

【氏名】カオ， シェンヤ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA36

2G045FB01

2G045FB03

2G045FB12

4B063QA05

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4B063QQ08

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4B063QX02

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4B065BA01

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA46

(57)【要約】

細胞表面タンパク質を提示する生物学的小胞、並びにそのような小胞を使用してタンパク質－タンパク質相互作用を同定及び特徴付ける方法が本明細書で提供される。
【選択図】図３Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質－タンパク質相互作用を同定するための方法であって、
（ａ）１つ以上の固体表面上に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供することと、
（ｂ）異種膜結合タンパク質と前記標的ポリペプチドの少なくとも１つとの結合を可能にする条件下で、工程（ａ）の前記集合体を、前記異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含む生物学的小胞（ＢＶ）と接触させることであって、前記異種膜結合タンパク質が、前記ＢＶの表面上に閾値レベル以上で発現される、工程（ａ）の前記集合体を、前記異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含む生物学的小胞（ＢＶ）と接触させることと、
（ｃ）前記異種膜結合タンパク質と少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それによりタンパク質－タンパク質相互作用を同定することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記標的ポリペプチドの１つ以上が、前記１つ以上の固体表面上の別個の位置に固定化されている、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

相互作用を検出することが、前記固体表面上の位置で、閾値レベルを超えるシグナルを検出することを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記膜出芽物質が、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記膜出芽物質が検出可能なマーカーを更に含み、相互作用を検出することが、前記固体表面上の位置で、閾値レベルを超える前記検出可能なマーカーのレベルを検出することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記検出可能なマーカーが、基質の存在下で蛍光シグナルを生成する酵素である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記酵素がウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）であり、前記基質がＲｌｕｃ基質である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＢＶが膜マーカーを含み、相互作用を検出することが、前記固体表面上の位置で、閾値レベルを超える前記膜マーカーのレベルを検出することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記膜マーカーがコレステロールマーカーである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記コレステロールマーカーがＡＭＰＬＥＸ^ＴＭＲｅｄである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記相互作用が一過性の相互作用である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記相互作用が低親和性相互作用である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記異種膜結合タンパク質が完全長タンパク質である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記異種膜結合タンパク質が、タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記アンカーが、前記タンパク質フラグメントをＢＶの膜の表面に繋ぎ止める、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記アンカーが、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである、請求項１４又は１５に記載の方法。

【請求項17】

前記タグを、直接的又は間接的に視覚化することができる、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記タグが、抗体又は抗体フラグメントを使用して検出することができる部分を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記タグが、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ポリペプチドである、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

前記異種膜結合タンパク質の発現レベルが、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイを使用して決定される、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記タグがｇＤポリペプチドであり、前記異種膜結合タンパク質の発現が、抗ｇＤ抗体を使用して検出され、前記閾値レベルが、３０℃で前記ＢＬＩアッセイを使用して測定した場合に、１．５ｎｍのシフトである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記タグが蛍光タンパク質を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項23】

前記異種膜結合タンパク質が、膜貫通受容体又はそのフラグメントである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記受容体が１回膜貫通（ＳＴＭ）受容体である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記タンパク質フラグメントが細胞外ドメインである、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

標的ポリペプチドの前記集合体の各メンバーがＦｃタグ付き細胞外ドメインであり、前記固体表面がプロテインＡでコーティングされている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも２５％の前記細胞外ドメインを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも５０％の前記細胞外ドメインを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも７５％の前記細胞外ドメインを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも９０％の前記細胞外ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の全ての前記タンパク質の前記細胞外ドメインを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ＢＶであって、（ａ）タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む、異種膜結合タンパク質であって、前記ＢＶの外面に存在する異種膜結合タンパク質と、（ｂ）膜出芽物質とを含む、ＢＶ。

【請求項33】

ＢＶであって、（ａ）タンパク質フラグメント、タグ及びアンカーを含む異種膜関連タンパク質であって、前記ＢＶの外面に存在する異種膜結合タンパク質と、（ｂ）膜出芽物質とを含み、前記ＢＶが、（ｉ）前記異種膜結合タンパク質及び前記膜出芽物質を発現するように改変された親細胞を提供すること、並びに（ｉｉ）前記親細胞から前記ＢＶを単離すること、を含む方法によって生成される、ＢＶ。

【請求項34】

前記膜出芽物質が、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される、請求項３２又は３３に記載のＢＶ。

【請求項35】

前記アンカーが、前記タンパク質フラグメントをＢＶの脂質膜の表面に繋ぎ止める、請求項３２～３４のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項36】

前記アンカーが、ＧＰＩポリペプチドである、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項37】

前記タグを、直接的又は間接的に視覚化することができる、請求項３２～３６のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項38】

前記タグが、抗体又は抗体フラグメントを使用して検出することができる部分を含む、請求項３７に記載のＢＶ。

【請求項39】

前記タグが、ｇＤポリペプチドである、請求項３７又は３８に記載のＢＶ。

【請求項40】

前記タグが蛍光タンパク質を含む、請求項３７に記載のＢＶ。

【請求項41】

前記タンパク質フラグメントが、膜貫通受容体の細胞外ドメインである、請求項３２～４０のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項42】

前記膜貫通受容体がＳＴＭ受容体である、請求項４１に記載のＢＶ。

【請求項43】

前記ＢＶが、ＢＬＩアッセイを使用して測定した場合に、前記タグに対する抗体と接触したときに閾値レベル以上のシフトを生じる、請求項３２～４２のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項44】

前記タグがｇＤポリペプチドであり、前記抗体が抗ｇＤ抗体であり、前記閾値レベルが、３０℃で前記ＢＬＩアッセイを使用して測定した場合に、１．５ｎｍのシフトである、請求項４３に記載のＢＶ。

【請求項45】

前記膜出芽物質が検出可能なマーカーを含む、請求項３２～４４のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項46】

前記検出可能なマーカーが、基質の存在下で蛍光シグナルを生成する酵素である、請求項４５に記載のＢＶ。

【請求項47】

前記酵素がＲｌｕｃであり、前記基質がＲｌｕｃ基質である、請求項４６に記載のＢＶ。

【請求項48】

前記ＢＶが膜マーカーを含む、請求項３２～４７のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項49】

前記膜マーカーがコレステロールマーカーである、請求項４８に記載のＢＶ。

【請求項50】

前記コレステロールマーカーがＡＭＰＬＥＸ^ＴＭＲｅｄである、請求項４９に記載のＢＶ。

【請求項51】

前記ＢＶが哺乳動物親細胞によって生成される、請求項３２～５０のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項52】

前記ＢＶが細胞外小胞（ＥＶ）である、請求項５１に記載のＢＶ。

【請求項53】

前記ＢＶがエキソソーム又は微小胞である、請求項５１に記載のＢＶ。

【請求項54】

前記ＢＶがウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、請求項５１に記載のＢＶ。

【請求項55】

前記親細胞が、前記異種膜結合タンパク質をコードするプラスミド、及び前記膜出芽物質をコードするプラスミドでトランスフェクトされている、請求項３３～５４のいずれか一項に記載のＢＶ。

【請求項56】

表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１の前記タンパク質を表２の前記タンパク質と接触させることであって、表１の前記タンパク質及び表２の前記タンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表１の前記タンパク質を表２の前記タンパク質と接触させることと、
（ｃ）表１の前記タンパク質の表２の前記タンパク質への前記結合を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、前記候補モジュレーターを、表１の前記タンパク質と表２の前記タンパク質との間の前記相互作用のモジュレーターとして同定する、表１の前記タンパク質の表２の前記タンパク質への前記結合を測定することと
を含む、方法。

【請求項57】

表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１の前記タンパク質を表２の前記タンパク質と接触させることであって、表１の前記タンパク質及び表２の前記タンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表１の前記タンパク質を表２の前記タンパク質と接触させることと、
（ｃ）表１の前記タンパク質の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、表１の前記タンパク質の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、表１の前記タンパク質の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項58】

表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）表２のタンパク質の表１のタンパク質への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表２の前記タンパク質を表１の前記タンパク質と接触させることであって、表１の前記タンパク質及び表２の前記タンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表２の前記タンパク質を表１の前記タンパク質と接触させることと、
（ｃ）表２の前記タンパク質の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、表２の前記タンパク質の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、表２の前記タンパク質の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項59】

結合の前記増加又は減少が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、ＢＬＩアッセイ、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に、少なくとも７０％である、請求項５６に記載の方法。

【請求項60】

前記モジュレーターが、表１又は表２の前記タンパク質の前記下流活性の阻害剤である、請求項５７又は５８に記載の方法。

【請求項61】

前記モジュレーターが、表１又は表２の前記タンパク質の前記下流活性の活性剤である、請求項５７又は５８に記載の方法。

【請求項62】

前記下流活性の前記変化が、前記下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である、請求項５７又は５８に記載の方法。

【請求項63】

前記下流活性の前記変化が、前記下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である、請求項５７又は５８に記載の方法。

【請求項64】

前記モジュレーターが、小分子、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項５６～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記抗原結合フラグメントが、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、表１の前記タンパク質に結合する、請求項６４又は６５に記載の方法。

【請求項67】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、表２の前記タンパク質に結合する、請求項６４又は６５に記載の方法。

【請求項68】

表１の前記タンパク質がＬＲＲＣ１５である、請求項５６～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

表２の前記タンパク質がＴＥＭ１である、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記下流活性が腫瘍成長である、請求項６８又は６９に記載の方法。

【請求項71】

腫瘍成長が、前記モジュレーターの存在下で減少する、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

腫瘍成長が、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記モジュレーターが、ＬＲＲＣ１５を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記モジュレーターが、ＴＥＭ１を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

ＬＲＲＣ１５とＴＥＭ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＬＲＲＣ１５をＴＥＭ１と接触させることと、
（ｃ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への前記結合を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、前記候補モジュレーターを、ＬＲＲＣ１５とＴＥＭ１との間の前記相互作用のモジュレーターとして同定する、ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への前記結合を測定することと
を含む、方法。

【請求項76】

ＬＲＲＣ１５の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＬＲＲＣ１５をＴＥＭ１と接触させることと、
（ｃ）ＬＲＲＣ１５の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、ＬＲＲＣ１５の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、ＬＲＲＣ１５の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項77】

ＴＥＭ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＴＥＭ１のＬＲＲＣ１５への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＴＥＭ１をＬＲＲＣ１５と接触させることと、
（ｃ）ＴＥＭ１の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、ＴＥＭ１の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、ＴＥＭ１の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項78】

結合の前記増加又は減少が、ＳＰＲアッセイ、ＢＬＩアッセイ、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である、請求項７５に記載の方法。

【請求項79】

前記下流活性が腫瘍成長である、請求項７６又は７７に記載の方法。

【請求項80】

腫瘍成長が、前記モジュレーターの存在下で減少する、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

腫瘍成長が、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

変化した結合プロファイルを有する生物学的小胞（ＢＶ）を同定するための方法であって、
（ａ）１つ以上の固体表面上に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供することと、
（ｂ）工程（ａ）の前記集合体を目的のＢＶと接触させることと、
（ｃ）前記目的のＢＶと少なくとも１つの前記標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それによって相互作用プロファイルを同定することと、
（ｄ）前記目的のＢＶの前記相互作用プロファイルを対照ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することであって、前記目的のＢＶの前記相互作用プロファイルと前記対照ＢＶの前記相互作用プロファイルとの間の差により、前記目的のＢＶを、変化した結合プロファイルを有するものとして同定する、前記目的のＢＶの前記相互作用プロファイルを対照ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することと
を含む、方法。

【請求項83】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも５０％の前記細胞外ドメインを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも７５％の前記細胞外ドメインを含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも９０％の前記細胞外ドメインを含む、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の全ての前記タンパク質の前記細胞外ドメインを含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記目的のＢＶが操作されたＢＶである、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記目的のＢＶが対象からの試料に由来する、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記目的のＢＶ及び前記対照ＢＶが、異なる組織又は異なる細胞型に由来する、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

前記目的のＢＶが疾患組織に由来し、前記対照ＢＶが健康な組織に由来する、請求項８９に記載の方法。

【請求項92】

表５のタンパク質と表６のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表５の前記タンパク質を表６の前記タンパク質と接触させることであって、表５の前記タンパク質及び表６の前記タンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表５の前記タンパク質を表６の前記タンパク質と接触させることと、
（ｃ）表５の前記タンパク質の表６の前記タンパク質への結合を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、前記候補モジュレーターを、表５の前記タンパク質と表６の前記タンパク質との間の前記相互作用のモジュレーターとして同定する、表５の前記タンパク質の表６の前記タンパク質への結合を測定することと
を含む、方法。

【請求項93】

表５のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表５の前記タンパク質を表６の前記タンパク質と接触させることであって、表５の前記タンパク質及び表６の前記タンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表５の前記タンパク質を表６の前記タンパク質と接触させることと、
（ｃ）表５のタンパク質の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、表５の前記タンパク質の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、表５のタンパク質の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項94】

表６のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）表６のタンパク質の表５のタンパク質への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表６の前記タンパク質を表５の前記タンパク質と接触させることであって、表５の前記タンパク質及び表６の前記タンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表６の前記タンパク質を表５の前記タンパク質と接触させることと、
（ｃ）表６の前記タンパク質の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、表６の前記タンパク質の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、表６の前記タンパク質の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項95】

結合の前記増加又は減少が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、ＢＬＩアッセイ、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に、少なくとも７０％である、請求項９２に記載の方法。

【請求項96】

前記モジュレーターが、表５又は表６の前記タンパク質の前記下流活性の阻害剤である、請求項９３又は９４に記載の方法。

【請求項97】

前記モジュレーターが、表５又は表６の前記タンパク質の前記下流活性の活性化剤である、請求項９３又は９４に記載の方法。

【請求項98】

前記下流活性の前記変化が、前記下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である、請求項９３又は９４に記載の方法。

【請求項99】

前記下流活性の前記変化が、前記下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である、請求項９３又は９４に記載の方法。

【請求項100】

前記モジュレーターが、小分子、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項９２～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記抗原結合フラグメントが、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、表５の前記タンパク質に結合する、請求項１００又は１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、表６の前記タンパク質に結合する、請求項１００又は１０１に記載の方法。

【請求項104】

表５の前記タンパク質がＡＤＧＲＢ１である、請求項９２～１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

表６の前記タンパク質がＰＤ－Ｌ１である、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記下流活性が腫瘍成長である、請求項１０４又は１０５に記載の方法。

【請求項107】

腫瘍成長が、前記モジュレーターの存在下で減少する、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

腫瘍成長が、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記モジュレーターが、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

表６の前記タンパク質がＩＣＯＳＬＧである、請求項１０４に記載の方法。

【請求項111】

前記下流活性がＴ細胞活性化である、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

Ｔ細胞活性化が前記モジュレーターの存在下で増加する、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

Ｔ細胞活性化が少なくとも２０％増加する、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記モジュレーターが、ＩＣＯＳＬＧを標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記モジュレーターが、ＡＤＧＲＢ１を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１０４～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

ＰＤ－Ｌ１とＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＰＤ－Ｌ１をＡＤＧＲＢ１と接触させることと、
（ｃ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への前記結合を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、前記候補モジュレーターを、ＰＤ－Ｌ１とＡＤＧＲＢ１との間の前記相互作用のモジュレーターとして同定する、ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への前記結合を測定することと
を含む、方法。

【請求項117】

ＰＤ－Ｌ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＰＤ－Ｌ１をＡＤＧＲＢ１と接触させることと、
（ｃ）ＰＤ－Ｌ１の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、ＰＤ－Ｌ１の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、ＰＤ－Ｌ１の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項118】

ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＡＤＧＲＢ１のＰＤ－Ｌ１への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＡＤＧＲＢ１をＰＤ－Ｌ１と接触させることと、
（ｃ）ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、ＡＤＧＲＢ１の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項119】

結合の前記増加又は減少が、ＳＰＲアッセイ、ＢＬＩアッセイ、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である、請求項１１６に記載の方法。

【請求項120】

前記下流活性が腫瘍成長である、請求項１１７又は１１８に記載の方法。

【請求項121】

腫瘍成長が、前記モジュレーターの存在下で減少する、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

腫瘍成長が、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する、請求項１２１に記載の方法。

【請求項123】

ＩＣＯＳＬＧとＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＩＣＯＳＬＧをＡＤＧＲＢ１と接触させることと、
（ｃ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への前記結合を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、前記候補モジュレーターを、ＩＣＯＳＬＧとＡＤＧＲＢ１との間の前記相互作用のモジュレーターとして同定する、ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への前記結合を測定することと
を含む、方法。

【請求項124】

ＩＣＯＳＬＧの下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＩＣＯＳＬＧをＡＤＧＲＢ１と接触させることと、
（ｃ）ＩＣＯＳＬＧの下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、ＩＣＯＳＬＧの前記下流活性のモジュレーターとして同定する、ＩＣＯＳＬＧの下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項125】

ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供することと、
（ｂ）ＡＤＧＲＢ１のＩＣＯＳＬＧへの結合を可能にする条件下で、前記候補モジュレーターの存在下又は非存在下で、ＡＤＧＲＢ１をＩＣＯＳＬＧと接触させることと、
（ｃ）ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することであって、前記候補モジュレーターの非存在下での前記下流活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での前記下流活性の変化により、前記候補モジュレーターを、ＡＤＧＲＢ１の前記下流活性のモジュレーターとして同定する、ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することと
を含む、方法。

【請求項126】

結合の前記増加又は減少が、ＳＰＲアッセイ、ＢＬＩアッセイ、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である、請求項１２３に記載の方法。

【請求項127】

前記下流活性がＴ細胞活性化である、請求項１２４又は１２５に記載の方法。

【請求項128】

Ｔ細胞活性化が前記モジュレーターの存在下で減少する、請求項１２６に記載の方法。

【請求項129】

Ｔ細胞活性化が少なくとも２０％増加する、請求項１２７に記載の方法。

【請求項130】

細胞株の相互作用プロファイルを特徴付けるための方法であって、
（ａ）前記細胞株を、膜出芽物質を含むように改変することと、
（ｂ）前記細胞株によって生成された生物学的小胞（ＢＶ）の相互作用プロファイルを特徴付けることと
を含む、方法。

【請求項131】

膜出芽物質を含むように改変された細胞株の相互作用プロファイルを特徴付けるための方法であって、前記細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることを含む、方法。

【請求項132】

細胞株の前記相互作用プロファイルの変化を同定するための方法であって、
（ａ）前記細胞株を、膜出芽物質を含むように改変することと、
（ｂ）第１の時点において、前記細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｃ）第２の時点において、前記細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｄ）前記第１の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することであって、前記第１の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと、前記第２の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルとの間の差により、前記細胞株の前記相互作用プロファイルの変化を同定する、前記第１の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することと
を含む、方法。

【請求項133】

膜出芽物質を含むように改変された細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定するための方法であって、
（ａ）第１の時点において、前記細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｂ）第２の時点において、前記細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｃ）前記第１の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することであって、前記第１の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと、前記第２の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルとの間の差により、前記細胞株の前記相互作用プロファイルの変化を同定する、前記第１の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の時点で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することと
を含む、方法。

【請求項134】

前記細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項１３０～１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記哺乳動物細胞株が、免疫細胞株、神経細胞株、又は線維芽細胞株である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記免疫細胞株が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は単球のうちの１つ以上を含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記方法が、前記第１の時点の後かつ前記第２の時点の前に、前記細胞株を刺激に曝露することを含む、請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項138】

前記刺激が、シグナル伝達を誘導する条件又は作用因子である、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

前記刺激が、疾患関連状態を誘発する条件又は作用因子である、請求項１３７に記載の方法。

【請求項140】

前記細胞株が免疫細胞株であり、前記疾患関連状態が免疫疲弊である、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

前記刺激が分化を誘導する条件又は作用因子である、請求項１３７に記載の方法。

【請求項142】

前記方法が、１つ以上の追加の時点において、前記細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることを更に含む、請求項１３２～１４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

２つの細胞株の相互作用プロファイルの差を同定するための方法であって、
（ａ）前記細胞株の各々を、膜出芽物質を含むように改変することと、
（ｂ）第１の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｃ）第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｄ）前記第１の細胞株で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することであって、前記第１の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと、前記第２の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルとの差により、２つの細胞株の表面タンパク質プロファイルの差を同定する、前記第１の細胞株で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することと
を含む、方法。

【請求項144】

膜出芽物質を含むように改変された２つの細胞株の相互作用プロファイルの差を同定するための方法であって、
（ａ）第１の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｂ）第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、
（ｃ）前記第１の細胞株で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することであって、前記第１の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと、前記第２の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルとの差により、２つの細胞株の表面タンパク質プロファイルの差を同定する、前記第１の細胞株で生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを、前記第２の細胞株によって生成された前記ＢＶの前記相互作用プロファイルと比較することと
を含む、方法。

【請求項145】

前記膜出芽物質の発現が誘導性である、請求項１３０～１４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項146】

前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを特徴付けることが、前記ＢＶ上の１つ以上の目的の膜結合タンパク質のレベルを決定することを含む、請求項１３０～１４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項147】

前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを特徴付けることが、前記ＢＶ上の１つ以上の目的の受容体のレベルを決定することを含む、請求項１３０～１４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

前記ＢＶの前記相互作用プロファイルを特徴付けることが、
（ａ）１つ以上の固体表面上に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供することと、
（ｂ）工程（ａ）における標的ポリペプチドの前記集合体を前記ＢＶと接触させることと、
（ｃ）前記ＢＶと、前記標的ポリペプチドの前記集合体の少なくとも１つの前記標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それにより、相互作用プロファイルを同定することと
を含む方法を使用して行われる、請求項１３０～１４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項149】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む、請求項１４８に記載の方法。

【請求項150】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも５０％の前記細胞外ドメインを含む、請求項１４９に記載の方法。

【請求項151】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも７５％の前記細胞外ドメインを含む、請求項１５０に記載の方法。

【請求項152】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の前記タンパク質の少なくとも９０％の前記細胞外ドメインを含む、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

標的ポリペプチドの前記集合体が、表４の全ての前記タンパク質の前記細胞外ドメインを含む、請求項１５２に記載の方法。

【請求項154】

前記方法が、前記ＢＶの細胞質タンパク質プロファイルを特徴付けることを更に含む、請求項１３０～１５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項155】

前記膜出芽物質が、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される、請求項１３０～１５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項156】

異種膜出芽物質を含むＢＶであって、（ｉ）誘導可能な制御下で前記膜出芽物質を発現するように改変された親細胞株を提供することと、（ｉｉ）前記膜出芽物質の発現を誘導することと、（ｉｉｉ）前記親細胞株から前記ＢＶを単離することと、を含む方法によって生成される、ＢＶ。

【請求項157】

前記膜出芽物質が、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される、請求項１５６に記載のＢＶ。

【請求項158】

前記親細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項１５６又は１５７に記載のＢＶ。

【請求項159】

前記ＢＶが細胞外小胞（ＥＶ）である、請求項１５８に記載のＢＶ。

【請求項160】

膜結合タンパク質の酵素活性を評価するための方法であって、前記タンパク質を含むＢＶに対する酵素活性についてのアッセイを行うことを含む、方法。

【請求項161】

前記膜結合タンパク質がペプチダーゼであり、酵素活性についての前記アッセイがペプチダーゼ活性についてのアッセイである、請求項１６０に記載の方法。

【請求項162】

前記膜結合タンパク質がプロテアーゼであり、酵素活性についての前記アッセイがプロテアーゼ活性についてのアッセイである、請求項１６０に記載の方法。

【請求項163】

前記膜結合タンパク質がキナーゼであり、酵素活性についての前記アッセイがキナーゼ活性についてのアッセイである、請求項１６０に記載の方法。

【請求項164】

前記膜結合タンパク質がホスファターゼであり、酵素活性についての前記アッセイがホスファターゼ活性についてのアッセイである、請求項１６０に記載の方法。

【請求項165】

前記膜結合タンパク質が、前記ＢＶが由来する親細胞に対して内因性である、請求項１６０～１６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項166】

前記膜結合タンパク質が、前記ＢＶが由来する親細胞に対して異種である、請求項１６０～１６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記異種膜結合タンパク質が完全長タンパク質である、請求項１６６に記載の方法。

【請求項168】

前記異種膜結合タンパク質が、タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む、請求項１６６に記載の方法。

【請求項169】

前記アンカーが、前記タンパク質フラグメントを前記ＢＶの膜の前記表面に繋ぎ止める、請求項１６８に記載の方法。

【請求項170】

前記アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである、請求項１６８又は１６９に記載の方法。

【請求項171】

培養培地又は対象由来の試料からＢＶを精製する方法であって、ＢＶを表８又は表９のタンパク質のうちの１つ以上を含む固体表面と接触させることを含む、方法。

【請求項172】

前記対象からの前記試料が、尿試料、血液試料、又は消化組織試料である、請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

前記固体表面が、プロテインＡ官能化ビーズを含むカラムであり、前記方法が、表８又は表９の前記タンパク質のうちの前記１つ以上を含む馴化培地を前記カラムに流すことを含み、表８又は表９の１つ以上のタンパク質がＦｃ領域を含むように改変されている、請求項１７１又は１７２に記載の方法。

【請求項174】

前記方法が、前記ＢＶを含む前記培養培地を前記カラムに流すことを更に含む、請求項１７３に記載の方法。

【請求項175】

前記方法が、前記ＢＶを溶出することを更に含む、請求項１７４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１日に出願された米国特許出願第６３／１２０，１６７号、２０２１年６月１７日に出願された米国特許出願第６３／２１２，０２１号；及び２０２１年７月２９日に出願された米国特許出願第６３／２２７，０３９号の優先権を主張し、それらの各々の全内容が、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年１１月２９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は５０４７４－２３１ＷＯ４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１＿２９＿２１＿ＳＴ２５であり、サイズは４，７１３バイトである。

【0003】

発明の分野
細胞表面タンパク質を提示する生物学的小胞、並びにそのような小胞を使用してタンパク質－タンパク質相互作用を同定及び特徴付ける方法が本明細書で提供される。

【背景技術】

【0004】

背景
原形質膜発現タンパク質及びそれらの相互作用因子は、細胞の細胞質ゾルへのシグナル伝達の開始において顕著な役割を果たし、したがって、ほとんどの生物学的経路の重要な調節因子である。証拠の増加は、受容体が、それらの生物学的機能に直接影響を及ぼす細胞外環境における相互作用パートナーの複雑なランドスケープを有することを実証している。結果として、受容体－リガンドのクロストークの調節不全が、しばしば病態及び疾患の進行の根底にある。しかしながら、膜タンパク質をそれらの天然の立体配座タンパク質に維持することに関連する生化学的課題及び典型的には受容体間の弱い相互作用のために、受容体相互作用ネットワークは依然として解明されていない。

【0005】

このように、細胞表面タンパク質間の相互作用の同定のための方法及び組成物、並びにそのような相互作用の新規モジュレーター及びそれを使用する方法に対する満たされていない必要性が存在する。

【発明の概要】

【0006】

一態様では、本開示は、タンパク質－タンパク質相互作用を同定する方法であって、（ａ）１つ以上の固体表面に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供することと、（ｂ）工程（ａ）の集合体を、異種膜結合タンパク質と標的ポリペプチドの少なくとも１つとの結合を可能にする条件下で、異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含む生物学的小胞（ＢＶ）と接触させることであって、異種膜結合タンパク質がＢＶの表面上に閾値レベル以上で発現される、異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含む生物学的小胞（ＢＶ）と接触させることと、（ｃ）異種膜結合タンパク質と少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それによりタンパク質－タンパク質相互作用を同定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0007】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの１つ以上は、１つ位以上の固体表面上の別個の位置に固定化される。

【0008】

いくつかの態様では、相互作用を検出することは、固体表面上の位置で、閾値レベルを上回るシグナルを検出することを含む。

【0009】

いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。

【0010】

いくつかの態様では、膜出芽物質は検出可能なマーカーを更に含み、相互作用を検出することは、固体表面上の位置で、閾値レベルを超える検出可能なマーカーのレベルを検出することを含む。いくつかの態様では、検出可能なマーカーは、基質の存在下で蛍光シグナルを生成する酵素である。いくつかの態様では、酵素はウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）であり、基質はＲｌｕｃ基質である。

【0011】

いくつかの態様では、ＢＶは膜マーカーを含み、相互作用を検出することが、固体表面上の位置で、閾値レベルを超える膜マーカーのレベルを検出することを含む。いくつかの態様では、膜マーカーはコレステロールマーカーである。いくつかの態様では、コレステロールマーカーはＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄである。

【0012】

いくつかの態様では、相互作用は一過性の相互作用である。

【0013】

いくつかの態様では、相互作用は低親和性相互作用である。

【0014】

いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は完全長タンパク質である。

【0015】

いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は、タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む。

【0016】

いくつかの態様では、アンカーは、タンパク質フラグメントをＢＶの膜の表面に繋ぎ止める。いくつかの態様では、アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである。

【0017】

いくつかの態様では、タグは直接的又は間接的に視覚化することができる。いくつかの態様では、タグは、抗体又は抗体フラグメントを使用して検出することができる部分を含む。いくつかの態様では、タグは糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ポリペプチドである。

【0018】

いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質の発現レベルは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイを使用して決定される。

【0019】

いくつかの態様では、タグはｇＤポリペプチドであり、異種膜結合タンパク質の発現は、抗ｇＤ抗体を使用して検出され、閾値レベルは、３０℃でＢＬＩアッセイを使用して測定した場合に、１．５ｎｍのシフトである。

【0020】

いくつかの態様では、タグは蛍光タンパク質を含む。

【0021】

いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は、膜貫通受容体又はそのフラグメントである。いくつかの態様では、受容体は１回膜貫通（ＳＴＭ）受容体である。

【0022】

いくつかの態様では、タンパク質フラグメントは細胞外ドメインである。

【0023】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体の各メンバーはＦｃタグ付き細胞外ドメインであり、固体表面はプロテインＡで被覆されている。

【0024】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも５０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも７５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも９０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の全ての細胞外ドメインを含む。

【0025】

別の態様では、本開示は、ＢＶであって、（ａ）タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む、異種膜結合タンパク質であって、ＢＶの外面に存在する異種膜結合タンパク質と、（ｂ）膜出芽物質とを含む、ＢＶを特徴とする。

【0026】

別の態様では、本開示は、ＢＶであって、（ａ）タンパク質フラグメント、タグ及びアンカーを含む異種膜結合タンパク質であって、ＢＶの外面に存在する異種膜結合タンパク質と、（ｂ）膜出芽物質とを含み、ＢＶが、（ｉ）異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を発現するように改変された親細胞を提供すること、並びに（ｉｉ）親細胞からＢＶを単離すること、を含む方法によって生成される、ＢＶを特徴とする。

【0027】

いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。

【0028】

いくつかの態様では、アンカーは、タンパク質フラグメントをＢＶの脂質膜の表面に繋ぎ止める。いくつかの態様では、アンカーはＧＰＩポリペプチドである。

【0029】

いくつかの態様では、タグは直接的又は間接的に視覚化することができる。いくつかの態様では、タグは、抗体又は抗体フラグメントを使用して検出することができる部分を含む。いくつかの態様では、タグはｇＤポリペプチドである。

【0030】

いくつかの態様では、タグは蛍光タンパク質を含む。

【0031】

いくつかの態様では、タンパク質フラグメントは膜貫通受容体の細胞外ドメインである。いくつかの態様では、膜貫通受容体はＳＴＭ受容体である。

【0032】

いくつかの態様では、ＢＶは、ＢＬＩアッセイを使用して測定した場合に、タグに対する抗体と接触したときに閾値レベル以上のシフトを生じる。

【0033】

いくつかの態様では、タグはｇＤポリペプチドであり、抗体は抗ｇＤ抗体であり、閾値レベルは、３０℃でＢＬＩアッセイを使用して測定した場合に、１．５ｎｍのシフトである。

【0034】

いくつかの態様では、膜出芽物質は検出可能なマーカーを含む。いくつかの態様では、検出可能なマーカーは、基質の存在下で蛍光シグナルを生成する酵素である。いくつかの態様では、酵素はＲｌｕｃであり、基質はＲｌｕｃ基質である。

【0035】

いくつかの態様では、ＢＶは膜マーカーを含む。いくつかの態様では、膜マーカーはコレステロールマーカーである。いくつかの態様では、コレステロールマーカーはＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄである。

【0036】

いくつかの態様では、ＢＶは哺乳動物親細胞によって産生される。いくつかの態様では、ＢＶは細胞外小胞（ＥＶ）である。いくつかの態様では、ＢＶはエキソソーム又は微小胞である。いくつかの態様では、ＢＶはウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。

【0037】

いくつかの態様では、親細胞は、異種膜結合タンパク質をコードするプラスミド、及び膜出芽物質をコードするプラスミドでトランスフェクトされている。

【0038】

別の態様では、本開示は、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、候補モジュレーターを、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0039】

別の態様では、本開示は、表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表１のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表１のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法。

【0040】

別の態様では、本開示は、表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）表２のタンパク質の表１のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表２のタンパク質を表１のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表２のタンパク質を表１のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表２のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表２のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法。

【0041】

いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、ＢＬＩアッセイ、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0042】

いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の阻害剤である。いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の活性剤である。

【0043】

いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である。いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である。

【0044】

いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。

【0045】

いくつかの態様では、抗原結合フラグメントは、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。

【0046】

いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表１のタンパク質に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表２のタンパク質に結合する。

【0047】

いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＲＲＣ１５である。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＴＥＭ１である。いくつかの態様では、下流活性は腫瘍成長である。いくつかの態様では、腫瘍成長は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する。

【0048】

いくつかの態様では、モジュレーターは、ＬＲＲＣ１５を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである。

【0049】

いくつかの態様では、モジュレーターは、ＴＥＭ１を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである。

【0050】

別の態様では、本開示は、ＬＲＲＣ１５とＴＥＭ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＬＲＲＣ１５をＴＥＭ１と接触させることと、（ｃ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の増加又は減少により、候補モジュレーターを、ＬＲＲＣ１５とＴＥＭ１との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0051】

別の態様では、本開示は、ＬＲＲＣ１５の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＬＲＲＣ１５をＴＥＭ１と接触させることと、（ｃ）ＬＲＲＣ１５の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＬＲＲＣ１５の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＬＲＲＣ１５の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0052】

別の態様では、本開示は、ＴＥＭ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＴＥＭ１のＬＲＲＣ１５への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＴＥＭ１をＬＲＲＣ１５と接触させることと、（ｃ）ＴＥＭ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＴＥＭ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＴＥＭ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0053】

いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、ＳＰＲアッセイ、ＢＬＩアッセイ、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0054】

いくつかの態様では、下流活性は腫瘍成長である。

【0055】

いくつかの態様では、腫瘍成長は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する。

【0056】

別の態様では、本開示は、変化した結合プロファイルを有する生物学的小胞（ＢＶ）を同定する方法であって、（ａ）１つ以上の固体表面上に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供ことと、（ｂ）工程（ａ）の集合物を目的のＢＶと接触させることと、（ｃ）目的のＢＶと少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それにより、相互作用プロファイルを同定することと、（ｄ）目的ＢＶの相互作用プロファイルを対照ＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、目的ＢＶの相互作用プロファイルと対照ＢＶの相互作用プロファイルとの間の差により、目的のＢＶを、変化した結合プロファイルを有するものとして同定する、目的ＢＶの相互作用プロファイルを対照ＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0057】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも５０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも７５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも９０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の全ての細胞外ドメインを含む。

【0058】

いくつかの態様では、目的のＢＶは、操作されたＢＶである。

【0059】

いくつかの態様では、目的のＢＶは、対象からの試料に由来する。いくつかの態様では、目的のＢＶ及び対照ＢＶは、異なる組織又は異なる細胞型に由来する。いくつかの態様では、目的のＢＶは疾患組織に由来し、対照ＢＶは健康な組織に由来する。

【0060】

別の態様では、本開示は、（ａ）異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含むＢＶと、（ｂ）標的ポリペプチドとを含むタンパク質複合体であって、異種膜結合タンパク質と標的ポリペプチドとが互いに結合している、タンパク質複合体を特徴とする。

【0061】

別の態様では、本開示は、表５のタンパク質と表６のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることであって、表５のタンパク質及び表６のタンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、候補モジュレーターを、表５のタンパク質と表６のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を測定することと、を含む、方法。

【0062】

別の態様では、本開示は、表５のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることであって、表５のタンパク質及び表６のタンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表５のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表５のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表５のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0063】

別の態様では、本開示は、表６のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）表６のタンパク質の表５のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表６のタンパク質を表５のタンパク質と接触させることであって、表５のタンパク質及び表６のタンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表６のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表６のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表６のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0064】

いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、ＢＬＩアッセイ、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0065】

いくつかの態様では、モジュレーターは、表５又は表６のタンパク質の下流活性の阻害剤である。

【0066】

いくつかの態様では、モジュレーターは、表５又は表６のタンパク質の下流活性の活性剤である。

【0067】

いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である。いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である。

【0068】

いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。

【0069】

いくつかの態様では、抗原結合フラグメントは、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。

【0070】

いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表５のタンパク質に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表６のタンパク質に結合する。

【0071】

いくつかの態様では、表５のタンパク質はＡＤＧＲＢ１である。

【0072】

いくつかの態様では、表６のタンパク質はＰＤ－Ｌ１である。

【0073】

いくつかの態様では、下流活性は腫瘍成長である。いくつかの態様では、腫瘍成長は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する。

【0074】

いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである。

【0075】

いくつかの態様では、表６のタンパク質はＩＣＯＳＬＧである。

【0076】

いくつかの態様では、下流活性はＴ細胞活性化である。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化はモジュレーターの存在下で増加する。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化は少なくとも２０％増加する。

【0077】

いくつかの態様では、モジュレーターは、ＩＣＯＳＬＧを標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである。

【0078】

いくつかの態様では、モジュレーターは、ＡＤＧＲＢ１を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントである。

【0079】

別の態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１とＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＰＤ－Ｌ１をＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の増加又は減少により、候補モジュレーターを、ＰＤ－Ｌ１とＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0080】

別の態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＰＤ－Ｌ１をＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＰＤ－Ｌ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＰＤ－Ｌ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＰＤ－Ｌ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0081】

別の態様では、本開示は、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＡＤＧＲＢ１のＰＤ－Ｌ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＡＤＧＲＢ１をＰＤ－Ｌ１と接触させることと、（ｃ）ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0082】

いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、ＳＰＲアッセイ、ＢＬＩアッセイ、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0083】

いくつかの態様では、下流活性は腫瘍成長である。いくつかの態様では、腫瘍成長は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、少なくとも２０％減少する。

【0084】

別の態様では、本開示は、ＩＣＯＳＬＧとＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＩＣＯＳＬＧをＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の増加又は減少により、候補モジュレーターを、ＩＣＯＳＬＧとＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0085】

別の態様では、本開示は、ＩＣＯＳＬＧの下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＩＣＯＳＬＧをＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＩＣＯＳＬＧの下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＩＣＯＳＬＧの下流活性のモジュレーターとして同定する、ＩＣＯＳＬＧの下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0086】

別の態様では、本開示は、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＡＤＧＲＢ１のＩＣＯＳＬＧへの結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＡＤＧＲＢ１をＩＣＯＳＬＧと接触させることと、（ｃ）ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0087】

いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、ＳＰＲアッセイ、ＢＬＩアッセイ、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0088】

いくつかの態様では、下流活性はＴ細胞活性化である。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化はモジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化は少なくとも２０％増加する。

【0089】

別の態様では、本開示は、細胞株の相互作用プロファイルを特徴付けるための方法であって、（ａ）細胞株を、膜出芽物質を含むように改変することと、（ｂ）細胞株によって生成された生物学的小胞（ＢＶ）の相互作用プロファイルを特徴付けることと、を含む、方法を特徴とする。

【0090】

別の態様では、本開示は、膜出芽物質を含むように改変された細胞株の相互作用プロファイルを特徴付けるための方法であって、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることを含む、方を特徴とする。

【0091】

別の態様では、本開示は、細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定するための方法であって、（ａ）細胞株を、膜出芽物質を含むように改変することと、（ｂ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｄ）第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの間の差により、細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定する、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0092】

別の態様では、本開示は、膜出芽物質を含むように改変された細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定するための方法であって、（ａ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｂ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの間の差により、細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定する、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0093】

いくつかの態様では、細胞株は哺乳動物細胞株である。いくつかの態様では、哺乳動物細胞株は、免疫細胞株、ニューロン細胞株、又は線維芽細胞株である。いくつかの態様では、免疫細胞株は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は単球のうちの１つ以上を含む。

【0094】

いくつかの態様では、本方法は、第１の時点の後かつ第２の時点の前に、細胞株を刺激に曝露することを含む。

【0095】

いくつかの態様では、刺激は、シグナル伝達を誘導する条件又は作用因子である。いくつかの態様では、刺激は、疾患関連状態を誘導する条件又は作用因子である。いくつかの態様では、細胞株は免疫細胞株であり、疾患関連状態は免疫疲弊である。

【0096】

いくつかの態様では、刺激は、分化を誘導する条件又は作用因子である。

【0097】

いくつかの態様では、本方法は、１つ以上の追加の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることを更に含む。

【0098】

別の態様では、本開示は、２つの細胞株の相互作用プロファイルの差を同定するための方法であって、（ａ）細胞株の各々を、膜出芽物質を含むように改変することと、（ｂ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｄ）第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの差により、２つの細胞株の表面タンパク質プロファイルの差を同定する、第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0099】

別の態様では、本開示は、膜出芽物質を含むように改変された２つの細胞株の相互作用プロファイルの差を同定するための方法であって、（ａ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｂ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの差により、２つの細胞株の表面タンパク質プロファイルの差を同定する、第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0100】

いくつかの態様では、膜出芽物質の発現は誘導可能である。

【0101】

いくつかの態様では、ＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることは、ＢＶ上の１つ以上の目的の膜結合タンパク質のレベルを決定することを含む。

【0102】

いくつかの態様では、ＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることは、ＢＶ上の１つ以上の目的の受容体のレベルを決定することを含む。

【0103】

いくつかの態様では、ＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることは、（ａ）１つ以上の固体表面上に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供ことと、（ｂ）工程（ａ）の集合物を目的のＢＶと接触させることと、（ｃ）ＢＶと標的ポリペプチドの集合体の少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それにより相互作用プロファイルを同定することと、を含む方法によって実施される。

【0104】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも５０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも７５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも９０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の全ての細胞外ドメインを含む。

【0105】

いくつかの態様では、本方法は、ＢＶの細胞質タンパク質プロファイルを特徴付けることを更に含む。

【0106】

いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。

【0107】

別の態様では、本開示は、異種膜出芽物質を含むＢＶであって、（ｉ）誘導可能な制御下で膜出芽物質を発現するように改変された親細胞株を提供することと、（ｉｉ）膜出芽物質の発現を誘導することと、（ｉｉｉ）親細胞株からＢＶを単離することと、を含む方法によって生成される、ＢＶを特徴とする。

【0108】

いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。

【0109】

いくつかの態様では、細胞株は親細胞株である。

【0110】

いくつかの態様では、ＢＶは細胞外小胞（ＥＶ）である。

【0111】

別の態様では、本開示は、膜結合タンパク質の酵素活性を評価するための方法であって、タンパク質を含むＢＶに対する酵素活性についてのアッセイを行うことを含む、方法を特徴とする。

【0112】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はペプチダーゼであり、酵素活性についてのアッセイはペプチダーゼ活性についてのアッセイである。

【0113】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はプロテアーゼであり、酵素活性のアッセイについてはプロテアーゼ活性のアッセイである。

【0114】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はキナーゼであり、酵素活性についてのアッセイはキナーゼ活性についてのアッセイである。

【0115】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はホスファターゼであり、酵素活性についてのアッセイはホスファターゼ活性についてのアッセイである。

【0116】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質は、ＢＶが由来する親細胞に対して内因性である。

【0117】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質は、ＢＶが由来する親細胞に対して異種である。いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は完全長タンパク質である。いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は、タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む。いくつかの態様では、アンカーは、タンパク質フラグメントをＢＶの膜の表面に繋ぎ止める。いくつかの態様では、アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである。

【0118】

別の態様では、本開示は、培養培地又は対照由来の試料からＢＶを精製する方法であって、ＢＶを表８又は表９のタンパク質のうちの１つ以上を含む固体表面と接触させることを含み、表８又は表９の１つ以上のタンパク質がＦｃ領域を含むように改変されている方法を特徴とする。

【0119】

いくつかの態様では、対象からの試料は、尿試料、血液試料、又は消化組織試料である。

【0120】

いくつかの態様では、固体表面はプロテインＡ官能化ビーズを含むカラムであり、本方法は、表８又は表９のタンパク質のうちの１つ以上を含む馴化培地をカラムに流すことを含む。

【0121】

いくつかの態様では、本方法は、ＢＶを含む培養培地をカラムに流すことを更に含む。

【0122】

いくつかの態様では、本方法は、ＢＶを溶出することを更に含む。

【図面の簡単な説明】

【0123】

【図1A】図１Ａは、細胞培養物からの受容体発現細胞外小胞（ＥＶ）の単離を示す概略図である。ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞を、目的の受容体をコードするプラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）に融合したＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした。遠心分離及び濾過によって細胞及び残屑をＥＶ含有上清から分離した。５０％スクロース緩衝液を使用して小タンパク質凝集体を除去し、小型小胞を単離した。

【図1B】図１Ｂは、スクロースクッションステップを用いて（右パネル）及び用いずに（左パネル）調製したＥＶを示す陰性染色電子顕微鏡写真のセットである。ＥＶ調製物を、電子顕微鏡検査の前に同じタンパク質濃度に希釈した。矢印は、試料中の代表的なＥＶを指す。

【図1C】図１Ｃは、ナノ粒子追跡分析を使用して測定した場合に、全長（ＦＬ）ＰＶＲタンパク質（左パネル）又はＰＶＲ外部ドメイン、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ、及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカー（ｇＤ－ＧＰＩ）を含むタンパク質（右パネル）を担持するＥＶのサイズ分布（ｎｍ単位）を示す一対のグラフである。５つの複製物を各グラフに示す。黒線は平均を表す；灰色の線は、平均の標準誤差を表す。ＥＶは、一貫して約１２０ｎｍのサイズである。

【図2A】図２Ａは、細胞の原形質膜及びＥＶ膜に埋め込まれた膜貫通タンパク質を示す図である。

【図2B】図２Ｂは、ＥＶ発現受容体の２つの実験設定を示す図である。左：細胞の膜及びＥＶ膜に埋め込まれたＨＩＶ ｇａｇタンパク質及び完全長膜貫通受容体。右：ＨＩＶ ｇａｇタンパク質及び細胞の膜及びＥＶ膜に埋め込まれたｇＤ－ＧＰＩタグを含む脂質アンカー型外部ドメイン。

【図2C】図２Ｃは、ナノ粒子追跡分析を使用して測定した場合に、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質で形質転換された親細胞（Ｇａｇあり）及び対照非形質転換細胞（Ｇａｇなし）によって産生された２０～５００ｎｍサイズ範囲のＥＶの粒子数を示すグラフである。

【図2D】図２Ｄは、Ｒｌｕｃに融合したＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするプラスミドで形質転換した親細胞から産生されたＥＶ調製物の３倍希釈系列におけるＲｌｕｃの発光シグナルを示すグラフである。

【図2E】図２Ｅは、ＰＶＲリガンドを発現する哺乳動物細胞の表面に結合した完全長ＰＶＲを発現するＥＶを示す概略図であり、示された完全長ＰＶＲリガンドを発現する細胞の表面に結合したＥＶを示す顕微鏡写真のセットである。ＥＶはｇａｇ－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎを含み、緑色はＥＶからの直接蛍光を表す。哺乳動物細胞のＤＮＡを青色で示す。

【図2F】図２Ｆは、ＰＶＲリガンドを発現する哺乳動物細胞の表面に結合したｇＤ－ＧＰＩタグを有するＰＶＲ外部ドメインを発現するＥＶを示す概略図であり、示された完全長ＰＶＲリガンドを発現する細胞の表面に結合したＥＶを示す顕微鏡写真のセットである。ＥＶはｇａｇ－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎを含み、緑色はＥＶからの直接蛍光を表す。哺乳動物細胞のＤＮＡを青色で示す。スケールバーは２０μｍである。

【図2G】図２Ｇは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）実験の設計及び結果を示す概略図及びグラフである。ＣＤ２２６－Ｆｃ又は対照のヒトＩｇＧをセンサに取り付けた。センサを、完全長（ＦＬ）ＰＶＲ又はｇＤ－ＧＰＩ ＰＶＲ外部ドメイン又は単量体ＰＶＲタンパク質（ＰＶＲ単量体）を発現するＥＶを含む溶液に浸し、ＢＬＩシグナル（ｎｍ単位）を測定した。右側のパネルは、０ｎｍを超えるシグナルのズームである。

【図3A】図３Ａは、ＲＤＩＭＩＳ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｄｉｓｐｌａｙ Ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ）プロトコルのワークフローを示す概略図である。ＥＶは、ｇａｇ－ｌｕｃと共に目的の受容体を発現する細胞の馴化培地から単離される。Ｆｃタグ付き外部ドメイン（ＥＣＤ－Ｆｃ）として発現される１回膜貫通（ＳＴＭ）タンパク質のライブラリをプレートに固定化する。受容体－ＥＶは、半自動化されたワークフローを使用して、プレートに結合したＳＴＭタンパク質の集合体に対してスクリーニングされる。ライブラリ中の相互作用する外部ドメインへのＥＶ結合は、ルミネセンスを使用して検出される。

【図3B】図３Ｂは、ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についての２つの独立したＲＤＩＭＩＳスクリーニング（反復１及び反復２）試験の結果を示す散布図である。

【図3C】図３Ｃは、ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験（図３Ｂの反復２）、及び完全長（ＦＬ）ＰＶＲ ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験の結果を示す散布図である。

【図4A】図４Ａは、完全長タグなし受容体ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＨＡ３、ＣＤ２４８、ＬＲＲＣ１５、ＰＶＲ又はＰＶＲＬ１を発現し、受容体に特異的な抗体で染色された全細胞溶解物（細胞）又はＥＶのウエスタンブロットを示す顕微鏡写真のセットである。抗チューブリン（α－Ｔｕｂ）及び抗アクチン（α－アクチン）染色を対照として提供する。

【図4B】図４Ｂは、示されたｇＤ－ＧＰＩタグ付き受容体外部ドメインを発現し、ｇＤタグに特異的な抗体（α－ｇＤ）で染色した全細胞溶解物又はＥＶのウエスタンブロットを示す顕微鏡写真のセットである。抗チューブリン（α－Ｔｕｂ）及び抗アクチン（α－アクチン）染色を対照として提供する。

【図4C】図４Ｃは、ｇＤ－ＧＰＩ発現小胞の選択的抗ｇＤ免疫金標識を示す陰性染色電気顕微鏡写真のセットである。

【図4D】図４Ｄは、バイオレイヤー干渉法実験の設計及び結果を示すグラフである。抗ｇＤ抗体をセンサに付着させた。センサを、示されたｇＤ－ＧＰＩ外部ドメインを発現するＥＶとインキュベートし、ＢＬＩシグナル（ｎｍ単位）を測定した。

【図5A】図５Ａは、ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験、及びＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験の結果を示す散布図である。スクリーニングは、受容体特異的ヒット（いずれかの軸の近く）をスクリーニング間で共通の包括的小胞結合剤と区別するために互いにプロットされる。個々のスクリーニングごとにシグナルが９８％分位点を上回り、特定のスクリーニングに対して少なくとも４倍の濃縮が存在するヒットが標識される。他のヒットは、スクリーニング間で共通の包括的小胞結合剤として同定される。

【図5B】図５Ｂは、ＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験、及びＣＤ２７６ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験の結果を示す散布図である。受容体特異的ヒットは、軸の近くに位置する。個々のスクリーニングごとにシグナルが９８％分位点を上回り、特定のスクリーニングに対して少なくとも４倍の濃縮が存在するヒットが標識される。他のヒットは、スクリーニング間で共通の包括的小胞結合剤として同定される。

【図5C】図５Ｃは、本研究においてＰＶＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８０及びＣＤ２７６について同定された結合パートナーと、ＳＴＲＩＮＧ、Ｂｉｏｐｌｅｘ及びＢｉｏｇｒｉｄデータベースに列挙された相互作用との間の重複を示す図のセットである。ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４の場合、ＳＴＭライブラリのメンバーとの相互作用はＢｉｏｐｌｅｘデータベースに存在しなかった。実験的に検証された相互作用はＣＤ２７６／Ｂ７－Ｈ３についてＳＴＲＩＮＧに列挙されていない。

【図6A】図６Ａは、ＬＲＲＣ１５外部ドメイン五量体とＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＡＶＥＸＩＳスクリーニング試験の結果を示す散布図である。ＬＲＲＣ１５五量体結合は、ＣＤ２４８外部ドメインを含有するウェル（強調）においてバックグラウンドより上では観察されなかった。灰色のドットは、各プレート上の陽性対照ウェルを示し、ここではストック五量体を添加したが、洗い流さなかった。

【図6B】図６Ｂは、ＥＶ中のＬＲＲＣ１５完全長（ＦＬ）又はｇＤ－ＧＰＩ外部ドメインを使用して本明細書で同定されたヒットと、Ｂｉｏｐｌｅｘ及びＢｉｏｇｒｉｄデータベースに表されたヒットとの比較を示す図のセットである。ライブラリ中のＬＲＲＣ１５とＳＴＭタンパク質との間の実験的証拠との相互作用はＳＴＲＩＮＧデータベースに示されなかった。

【図7A】図７Ａは、ＬＲＲＣ１５ ｇＤ－ＧＰＩ－ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験の結果を示す散布図である。結果を図３Ｃに示すＰＶＲスクリーニング結果と比較する。個々のスクリーニングごとにシグナルが９８％分位点を上回り、特定のスクリーニングに対して少なくとも４倍の濃縮が存在するヒットが標識される。他のヒットは、スクリーニング間で共通の包括的小胞結合剤として同定される。

【図7B】図７Ｂは、ＬＲＲＣ１５完全長ＥＶとＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＲＤＩＭＩＳスクリーニング試験の結果を示す散布図である。結果を図３Ｃに示すＰＶＲスクリーニング結果と比較する。個々のスクリーニングごとにシグナルが９８％分位点を上回り、特定のスクリーニングに対して少なくとも４倍の濃縮が存在するヒットが標識される。他のヒットは、スクリーニング間で共通の包括的小胞結合剤として同定される。

【図8A】図８Ａは、頭頸部扁平上皮癌についてのＬＲＲＣ１５（ｘ軸）及びＣＤ２４８（ｙ軸）のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ発現レベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ））を示す散布図である。各点は、単一の患者試料を表す。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数及び有意値を右上に示す。

【図8B】図８Ｂは、乳房浸潤癌についてのＬＲＲＣ１５（ｘ軸）及びＣＤ２４８（ｙ軸）のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ発現レベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ））を示す散布図である。各点は、単一の患者試料を表す。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数及び有意値を右上に示す。

【図8C】図８Ｃは、頭頸部癌患者の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータからの非腫瘍細胞を示す一対の均一マニホールド近似投影（ＵＭＡＰ）次元削減プロットである。細胞を、示されたマーカー遺伝子（左；ＬＲＲＣ１５；右：ＣＤ２４８）の発現レベルによって網掛けする。

【図9A】図９Ａは、膵管腺癌についてのＬＲＲＣ１５（ｘ軸）及びＣＤ２４８（ｙ軸）のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ発現レベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ））を示す散布図である（癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ：ＴＣＧＡ）データ）。

【図9B】図９Ｂは、尿路上皮膀胱癌についてのＬＲＲＣ１５（ｘ軸）及びＣＤ２４８（ｙ軸）のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ発現レベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ））を示す散布図である（癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ：ＴＣＧＡ）データ）。

【図9C】図９Ｃは、頭頸部癌患者の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータからの非腫瘍細胞を示す一対のＵＭＡＰ次元削減プロットである。細胞を、示されたマーカー遺伝子（左；ＤＣＮ癌関連線維芽細胞；右：ＲＧＳ５癌関連周皮細胞マーカー）の発現レベルによって網掛けする。

【図10A】図１０Ａは、ＣＤ２４８外部ドメイン五量体とＳＴＭタンパク質ライブラリとの間の相互作用についてのＡＶＥＸＩＳスクリーニング試験の結果を示す散布図である。ＣＤ２４８五量体結合は、ＬＲＲＣ１５外部ドメインを含有するウェル（強調）においてバックグラウンドより上では観察されなかった。灰色のドットは、各プレート上の陽性対照ウェルを示し、ここではストック五量体を添加したが、洗い流さなかった。

【図10B】図１０Ｂは、ＬＲＲＣ１５－ＦｃをＳＰＲチップ上のプロテインＡによって捕捉し、示された分析物を添加した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイの結果を示すグラフである。ＬＲＲＣ１５を５μｇ／ｍＬ（赤色及び緑色の線）又は５０μｇ／ｍＬの濃度でロードした。分析物を４００ ｎＭの濃度でロードした。

【図11A】図１１Ａは、ＢＬＩ実験の設計及び結果を示す概略図及びグラフである。ＣＤ２４８を組換えタンパク質として発現させ、センサに固定化した。センサを、ＬＲＲＣ１５－Ｆｃ（５００ｎＭ）を含む溶液又はＬＲＲＣ１５完全長若しくはｇＤ－ＧＰＩ ＬＲＲＣ１５（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＶと接触させ、ＢＬＩシグナル（ｎｍ単位）を測定した。

【図11B】図１１Ｂは、完全長ＣＤ２４８又はｇＤ－ＧＰＩ ＣＤ２４８を一過性に発現する細胞への、ｇａｇ－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ及び完全長（ＦＬ）ＬＲＲＣ１５、ｇＤ－ＧＰＩ ＬＲＲＣ１５（ＬＲＲＣ１５－ｇＤ）、又は空ベクター対照を含むＥＶの結合を示す概略図及び顕微鏡写真のセットである。

【図11C】図１１Ｃは、完全長ＬＲＲＣ１５又はｇＤ－ＧＰＩ ＬＲＲＣ１５を一過性に発現する細胞への、ＣＤ２４８（四量体化組換え外部ドメインとして）又は空ベクター対照の結合を示す概略図及び顕微鏡写真のセットである。スケールバーは２０μｍを表す。

【図11D】図１１Ｄは、ＮｅｏｎＧｒｅｅｎシグナルレベル（３回の独立した反復の平均±標準誤差）に基づく図１１ＢのＥＶ結合の定量化を示す棒グラフである。

【図12A】図１２Ａは、ｇａｇ－ＲｌｕｃでトランスフェクトされたＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞又はトランスフェクトされていない細胞から回収されたＰＤ－Ｌ１及びＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶの希釈系列の読み出しとしてＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（コレステロール）を使用して検出されたウミシイタケルシフェラーゼ蛍光とコレステロールの蛍光との比較を示す散布図である。

【図12B】図１２Ｂは、列挙した遺伝子をウェルに固定し、ＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶを使用してプローブした小規模ＲＤＩＭＩＳスクリーニングで観察されたウミシイタケルシフェラーゼ及びＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）からの相対シグナルレベルを示す棒グラフである。両方の読み出しの結果をそれぞれのＰＤＣＤ１シグナルに対して正規化する。

【図12C】１２Ｃは、ｇａｇ－Ｒｌｕｃを発現するＥＶ（ｘ軸）又は非トランスフェクト細胞から採取した小胞（ｙ軸）に対して読み出しとしてコレステロールを使用して実施したＲＤＩＭＩＳスクリーニングの結果を示す散布図である。

【図13A】図１３Ａは、ｇＤタグに特異的な抗体（α－ｇＤ）で染色した、受容体ＰＶＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７６、ＣＤ８０、及びＬＲＲＣ１５の完全長（ＦＬ）又はｇＤ－ＧＰＩタグ付き外部ドメインを発現するＥＶのウエスタンブロットを示す顕微鏡写真のセットである。α－アクチン、α－ＰＶＲ及びα－ＬＲＲＣ１５の染色も示す。

【図13B】図１３Ｂは、ＢＬＩ実験の設計及び結果を示す概略図及びグラフである。ビオチン化ＰＤ－Ｌ１をストレプトアビジンＢＬＩバイオセンサとインキュベートした。次いで、これを完全長又はｇＤ－ＧＰＩ ＬＲＴＭ１を発現するＥＶ又はベクター対照とインキュベートし、ＢＬＩシグナル（ｎｍ単位）を測定した。

【図13C】図１３Ｃは、完全長又はｇＤ－ＧＰＩタグ付きＰＤ－Ｌ１を一過性に発現する細胞の表面に結合したＥＶを示す顕微鏡写真のセットである。ＥＶは、完全長又はｇＤ－ＧＰＩ ＬＲＴＭ１又はベクター対照を含んでいた。ＥＶはｇａｇ－ＮｅｏｎＧｒｅｅｎを含み、緑色はＥＶからの直接蛍光を表す。哺乳動物細胞のＤＮＡを青色で示す。

【図13D】図１３Ｄは、ＢＬＩ実験の設計及び結果を示す概略図及びグラフである。ビオチン化ＰＤ－Ｌ１をストレプトアビジンＢＬＩバイオセンサとインキュベートした。次いで、これを、異なる濃度のＦｃタグＰＤ１外部ドメイン、又はヒトＩｇＧ対照の存在下若しくは非存在下で、完全長若しくはｇＤ－ＧＰＩ ＬＲＴＭ１を発現するＥＶ、又はベクター対照とインキュベートし、ＢＬＩシグナル（ｎｍ単位）を測定した。

【図14A】図１４Ａは、ベクター対照（Ｘ軸）でトランスフェクトした細胞に由来する「空の」ＥＶと比較した、ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩを含むＥＶ（Ｙ軸）を使用して実施したＲＤＩＭＩＳスクリーニングの結果を示す散布図である。

【図14B】図１４Ｂは、ベクター対照（Ｘ軸）でトランスフェクトした細胞に由来する「空の」ＥＶと比較した、ＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩを含むＥＶ（Ｙ軸）を使用して実施したＲＤＩＭＩＳスクリーニングの結果を示す散布図である。

【図14C】図１４Ｃは、ベクター対照（Ｘ軸）でトランスフェクトした細胞に由来する「空の」ＥＶと比較した、ＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩを含むＥＶ（Ｙ軸）を使用して実施したＲＤＩＭＩＳスクリーニングの結果を示す散布図である。

【図14D】図１４Ｄは、ベクター対照（Ｘ軸）でトランスフェクトした細胞に由来する「空の」ＥＶと比較した、ＣＤ２７６ ｇＤ－ＧＰＩを含むＥＶ（Ｙ軸）を使用して実施したＲＤＩＭＩＳスクリーニングの結果を示す散布図である。

【図14E】図１４Ｅは、ベクター対照（Ｘ軸）でトランスフェクトした細胞に由来する「空の」ＥＶと比較した、ＬＲＲＣ１５ ｇＤ－ＧＰＩを含むＥＶ（Ｙ軸）を使用して実施したＲＤＩＭＩＳスクリーニングの結果を示す散布図である。

【図14F】図１４Ｆは、ベクター対照（Ｘ軸）でトランスフェクトした細胞に由来する「空の」ＥＶと比較した、完全長ＬＲＲＣ１５を含むＥＶ（Ｙ軸）を使用して実施したＲＤＩＭＩスクリーニングの結果を示す散布図である。

【図15】図１５は、潜在的な相互作用パートナーを同定するためのＩｇＳＦインタラクトームの高信頼性相互作用のリスト（１）（青色のエッジ）、及びＳＴＲＩＮＧからの相互作用の実験的及びデータベースのリスト（２）（赤色のエッジ）と統合された、本明細書で同定された包括的小胞結合剤（緑色のボックス）を示すネットワーク図である。ボックスの高さは、ＥＶ親細胞、したがってＥＶ自体における潜在的な結合パートナーの発現を推定するためのＴｈｅ Ｃｅｌｌ Ａｔｌａｓ（３）からのＨＥＫ２９３細胞における正規化された発現値を表す。

【図16A】図１６Ａは、実施されたＲＤＩＭＩＳスクリーニングの各々に対する相関及び相関係数を示す散布図のセットである。スクリーニングをいくつかのバッチで行った：１）ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ反復１、２）ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ反復２及びＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩ、３）ＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩ及びＣＤ２６ ｇＤ－ＧＰＩ、４）ＬＲＲＣ１５ ｇＤ－ＧＰＩ、ＬＲＲＣ１５ ＦＬ及びＰＶＲ ＦＬ、５）目的の受容体が過剰発現していないＥＶである小胞対照。

【図16B】図１６Ｂは、ＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩスクリーニングとＰＶＲ－ＦＬスクリーニングとの間の相関を示す一組の散布図である。包括的小胞結合剤の２つの集団が示されている。下部パネル：ｘ軸の拡大図。右パネル：除去された包括的小胞結合剤との相関。

【図17A】図１７Ａは、コレステロール結合剤Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩで膜を破壊したＢＬＩ実験の結果を示すグラフである。ＣＤ２４８単量体をＮｉＮＴＡバイオセンサにロードし、ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩで室温にて３０分間前処理したＬＲＲＣ１５ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとインキュベートした。空の小胞又はｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを陰性対照として示す。

【図17B】図１７Ｂは、コレステロール結合剤Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩで膜を破壊したＢＬＩ実験の結果を示すグラフである。ＣＤ２４８単量体をＮｉＮＴＡバイオセンサにロードし、室温で３０分間、ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩで前処理した完全長ＬＲＲＣ１５ ＥＶとインキュベートした。空の小胞又はｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを陰性対照として示す。

【図17C】図１７Ｃは、図１７ＡのＥＶの抗ｇＤ抗体への結合を示すグラフである。

【図17D】図１７Ｄは、メチル－ベータ－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）で膜を破壊したＢＬＩ実験の結果を示すグラフである。ＣＤ２４８単量体をＮｉＮＴＡバイオセンサにロードし、ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩで室温にて３０分間前処理したＬＲＲＣ１５ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶとインキュベートした。空の小胞又はｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを陰性対照として示す。

【図17E】図１７Ｅは、ＭβＣＤで膜を破壊したＢＬＩ実験の結果を示すグラフである。ＣＤ２４８単量体をＮｉＮＴＡバイオセンサにロードし、室温で３０分間、ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩで前処理した完全長ＬＲＲＣ１５ ＥＶとインキュベートした。空の小胞又はｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを陰性対照として示す。

【図17F】図１７Ｆは、図１７ＤのＥＶの抗ｇＤ抗体への結合を示すグラフである。

【図18A】図１８Ａは、抗体表面染色レベル（ａ．ｕ．）細胞上に発現された＞５００個の多重膜貫通受容体を示す散布図、並びに低発現受容体（ＤＲＤ２）及び高発現受容体（Ｓ１ＰＲ１）についての代表的な細胞表面染色を示す一対の顕微鏡写真である。バックグラウンド染色を線で示す。

【図18B】図１８Ｂは、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ及びＣ末端Ｖｅｎｕｓで操作された＞４００Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に対して抗ＦＬＡＧ抗体及びＶｅｎｕｓタグの蛍光（Ｘ軸；全受容体（ａ．ｕ．））を使用する、表面染色のレベル（ａ．ｕ．）を示す散布図である。挿入画像は、低発現受容体（ＤＲＤ２）、高発現受容体（Ｓ１ＰＲ１）、及び非常に高発現の単一膜貫通受容体（ＥＧＦＲ）についての代表的な細胞表面染色（マゼンタ）及びＶｅｎｕｓ蛍光（緑色）を示す顕微鏡写真である。バックグラウンド染色は、トランスフェクトされていない細胞上のシグナルの平均によって決定され、線で示される。

【図18C】図１８Ｃは、多重膜貫通（ＭＴＭＲ）受容体ライブラリの１７９１個のメンバーの特徴を示す円グラフである。５００を超えるメンバーのみが細胞外ＨＩＳタグを有し、それらの受容体の約半分のみがバックグラウンドを超える染色を示す。

【図18D】図１８Ｄは、低、中、及び高ＦＬＡＧ染色発現レベルを有する図１８ＢのＧＰＣＲの割合を示す円グラフである。「中」受容体発現を、バックグラウンドシグナルの１０倍と定義した。

【図19A】図１９Ａは、多重膜貫通受容体ライブラリのメンバーへのＥＧＦ－６４７の結合（ａ．ｕ．）についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。ＥＧＦ－６４７は、トランスフェクション対照として各プレートに印刷されたＥＧＦＲのみに結合した。挿入パネルは、蛍光リガンドを示す顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ染色を示す。

【図19B】図１９Ｂは、多重膜貫通受容体ライブラリのメンバーへのＲＳＰＯ３の結合（ａ．ｕ．）についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。ＲＳＰＯ３はＬＧＲ４及びＬＧＲ５に結合した。撮像アーチファクトは、Ｘで示されている。挿入パネルは、蛍光リガンドを示す顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ染色を示す。

【図19C】図１９Ｃは、多重膜貫通受容体ライブラリのメンバーへのＰＶＲの結合（ａ．ｕ．）についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。ＰＶＲは、陽性対照として添加した１回膜貫通受容体であるＣＤ２２６に結合した。挿入パネルは、蛍光リガンドを示す顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ染色を示す。

【図19D】図１９Ｄは、多重膜貫通受容体ライブラリのメンバーへのＰＤ－Ｌ１の結合（ａ．ｕ．）についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＶＲ、接着性Ｇタンパク質共役受容体Ｂ１（ＡＤＧＲＢ１）、並びに陽性対照として添加した１回膜貫通受容体ＰＤ１、ＰＤＬ２、ＣＤ８０及びＥＰＨＡ３に結合した。挿入パネルは、蛍光リガンドを示す顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ染色を示す。

【図20A】図２０Ａは、タグ付きの複数回膜貫通受容体を含む細胞外小胞（ＥＶ）を示す概略図である。受容体の細胞外領域はＥＶの外側にあり、細胞内領域はＥＶの内腔にある。ＦＬＡＧタグ及び蛍光タグ（Ｌｕｃ）の位置を示す。

【図20B】図２０Ｂは、ＥＶを示す陰性染色電子顕微鏡画像である。

【図20C】図２０Ｃは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ粒子追跡を使用して測定した場合に、ＰＶＲ及びＧＡＧでトランスフェクトした；ＰＶＲのみでトランスフェクトした；又は、トランスフェクトされていない（対照）細胞からのＥＶのサイズ分布（ｎｍ）及び濃度（１０^６粒子／ｍＬ）を示すグラフである。

【図20D】図２０Ｄは、図２０ＣのＥＶの平均サイズ（ｎｍ）を示す棒グラフである。

【図20E】図２０Ｅは、ＰＶＲ及びＧＡＧ；ＰＶＲのみをトランスフェクトした細胞に由来するＥＶ、又はトランスフェクトされていない細胞からのＥＶに対する抗ｇＤ抗体の結合を評価するＢＬＩ実験の結果を示すグラフである。

【図20F】図２０Ｆは、ＰＶＲ及びＧＡＧ；ＰＶＲのみをトランスフェクトした細胞に由来するＥＶ、又はトランスフェクトされていない細胞からのＥＶに対するＰＶＲリガンドＴＩＧＩＴ（ＴＩＧＩＴ Ｆｃ）の結合を評価するＢＬＩ実験の結果を示すグラフである。

【図20G】図２０Ｇは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＡＤＧＲＢ１、ＬＧＲ４及びＬＧＲ５を含むＥＶへの抗ＦＬＡＧ抗体の結合を評価するＢＬＩ実験の結果を示すグラフである。ＧＰＣＲは、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含んでいた。

【図21A】図２１Ａは、多重膜貫通受容体ライブラリのメンバーへの及び陽性対照へのＰＶＲを含むＥＶの結合（ａ．ｕ．）についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。ＰＶＲは陽性対照に結合した。撮像アーチファクトは、Ｘで示されている。挿入パネルは、ＧＡＧ－ｎｅｏｎＧｒｅｅｎ融合物からの小胞蛍光を示す顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ染色を示す。

【図21B】図２１Ｂは、多重膜貫通受容体ライブラリのメンバーへの及び陽性対照へのＰＤ－Ｌ１を含むＥＶの結合（ａ．ｕ．）についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。ＰＶＲは陽性対照及びＡＤＧＲＢ１に結合した。撮像アーチファクトは、Ｘで示されている。挿入パネルは、ＧＡＧ－ｎｅｏｎＧｒｅｅｎ融合物からの小胞蛍光を示す顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ染色を示す。

【図21C】図２１Ｃは、結合のためのスクリーニング（ａ．ｕ．）Ｆｃ融合単一膜貫通受容体（ＳＴＭＲ）の細胞外ドメインを含むライブラリのメンバーへのＡＤＧＲＢ１の結合を示す散布図である。ＲＴＮ４Ｒ及びＰＤ－Ｌ１との相互作用が確認され、新しい相互作用が明らかになった。

【図22A】図２２Ａは、ＡＤＧＲＢ１又はＬＧＲ４を含むＥＶへの組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ＩＣＯＳＬＧ－Ｆｃ及びＲＴＮ４Ｒ－Ｆｃ（それぞれプロテインＡプレートにコンジュゲート）の結合の定量化を示す棒グラフである。

【図22B】図２２Ｂは、Ｖｅｎｕｓに融合したＡＤＧＲＢ１を発現するＨＥＫ細胞への組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ＩＣＯＳＬＧ－Ｆｃ、及びＲＴＮ４Ｒ－Ｆｃの結合についてのアッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。合成画像では、ＤＡＰＩを青色で示し、ＡＤＧＲＢ１融合タンパク質からのＶｅｎｕｓシグナルを緑色で示し、Ｆｃタグを染色するためのシグナルをマゼンタで示す。共局在化された緑色シグナル及びマゼンタシグナルが白色で示されている。

【図23】図２３は、ＧＰＣＲスクリーニングプラットフォームの設計を示す概略図である。包括的なライブラリを３８４ウェルプレート形式で収集する。過剰発現プラスミドの包括的な集合体を３８４ウェルイメージングプレート上に印刷する。細胞を逆トランスフェクトし、次いで蛍光リガンドで処理し、ハイスループット、ハイコンテンツイメージャで分析する

【図24A】図２４Ａは、Ｖｅｎｕｓに融合したＡＤＧＲＢ１を発現するＨＥＫ細胞への組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの結合についてのアッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。合成画像では、ＤＡＰＩを青色で示し、ＡＤＧＲＢ１融合タンパク質からのＶｅｎｕｓシグナルを緑色で示し、Ｆｃタグを染色するためのシグナルをマゼンタで示す。共局在化された緑色シグナル及びマゼンタシグナルが白色で示されている。全てのコントラスト及び輝度設定は、図２２Ｂと一致する。

【図24B】図２４Ｂは、Ｖｅｎｕｓに融合したＡＤＧＲＢ１を発現するＨＥＫ細胞への組換えタンパク質ＩＣＯＳＬＧ－Ｆｃの結合についてのアッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。合成画像では、ＤＡＰＩを青色で示し、ＡＤＧＲＢ１融合タンパク質からのＶｅｎｕｓシグナルを緑色で示し、Ｆｃタグを染色するためのシグナルをマゼンタで示す。共局在化された緑色シグナル及びマゼンタシグナルが白色で示されている。全てのコントラスト及び輝度設定は、図２２Ｂと一致する。

【図24C】図２４Ｃは、Ｖｅｎｕｓに融合したＡＤＧＲＢ１を発現するＨＥＫ細胞への組換えタンパク質ＲＴＮ４Ｒ－Ｆｃの結合についてのアッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。合成画像では、ＤＡＰＩを青色で示し、ＡＤＧＲＢ１融合タンパク質からのＶｅｎｕｓシグナルを緑色で示し、Ｆｃタグを染色するためのシグナルをマゼンタで示す。共局在化された緑色シグナル及びマゼンタシグナルが白色で示されている。全てのコントラスト及び輝度設定は、図２２Ｂと一致する。

【図25A】図２５Ａは、ＨＥＫ細胞におけるβ－アレスチン及びＳＨ２動員についての生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイの結果を示すグラフである。ＰＤ－Ｌ１に応答してＡＤＧＲＢ１又はＥｐｈＡ３の活性化は観察されなかった。

【図25B】図２５Ｂは、ＨＥＫ細胞の処理後のカルシウム感知（ＧＣａＭＰ６ｓ蛍光）を示すグラフである。ＰＤ－Ｌ１に応答してＡＤＧＲＢ１又はＥｐｈＡ３の下流で応答は観察されなかった。

【図25C】図２５Ｃは、ＨＥＫ細胞の処置後のｃＡＭＰ刺激（ＧＬＯＳＥＮＳＯＲ（商標）によって評価される）を示すグラフである。応答は観察されなかった。

【図25D】図２５Ｄは、ＨＥＫ細胞の処理後のｃＡＭＰ阻害を示すグラフである。応答は観察されなかった。

【図26A】図２６Ａは、ＡＤＧＲＢ１を含むＥＶの分泌タンパク質Ｆｃライブラリのメンバーへの結合についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。陽性対照（抗ＦＬＡＧ抗体）を標識する。

【図26B】図２６Ｂは、Ｆｃに融合した単一膜貫通受容体の細胞外ドメインを含むライブラリ（ＳＴＭライブラリ）のメンバーへの、ＡＤＧＲＢ１を含むＥＶの結合についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。ＲＴＮ４Ｒ及びＰＤ－Ｌ１への結合が確認され、新たな相互作用が同定された。新規ヒットは標識されている。

【図26C】図２６Ｃは、ＬＧＲ４を含むＥＶの分泌タンパク質Ｆｃライブラリのメンバーへの結合についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。陽性対照（抗ＦＬＡＧ抗体）を標識する。

【図26D】図２６Ｄは、ＬＧＲ４を含むＥＶのＳＴＭライブラリのメンバーへの結合のスクリーニングの結果を示す散布図である。陽性対照（ＲＳＰＯ３）を標識する。新規ヒットを緑色で示す。

【図26E】図２６Ｅは、ＬＧＲ５を含むＥＶの分泌タンパク質Ｆｃライブラリのメンバーへの結合についてのスクリーニングの結果を示す散布図である。陽性対照（抗ＦＬＡＧ抗体）を標識する。新規ヒットを緑色で示す。

【図26F】図２６Ｆは、ＬＧＲ５を含むＥＶのＳＴＭライブラリのメンバーへの結合のスクリーニングの結果を示す散布図である。陽性対照（抗ＦＬＡＧ抗体）を標識する。新規ヒットを緑色で示す。共有ＬＧＲ４及びＬＧＲ５のヒットは青色で示されている。

【図27】図２７は、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）活性アッセイの結果を示す棒グラフである。ＣＰＭ－ＦＬ：小胞は完全長ＣＰＭを含んでいた。ＣＰＭｇＤ：小胞はｇＤ－ＧＰＩ（ｇＤ）ＣＰＭを含んでいた。ｐＲＫ ＥＶ：ベクター対照；ＰＢＳのみ：緩衝液対照。

【図28】図２８は、完全長ＥＰＨＡ３（ＥＰＨＡ３－ＦＬ）及びＰＤＬ１－Ｆｃ、ＥＰＨＡ３－Ｆｃ、ＥＰＨＡ３リガンドＥＦＮＡ１－Ｆｃ及びＥＦＮＡ５－Ｆｃ、並びに完全長ＰＤＬ１を含むＥＶにおいて検出された総ＥＰＨＡ３種及びリン酸化ＥＰＨＡ３種（ｐＥＰＨＡ２／３／４及びｐＥＰＨＡ３／４／５）のレベルを示す一対のウエスタンブロットを示す一対の顕微鏡写真である。ｐＲＫ ＥＶ：ベクター対照。

【発明を実施するための形態】

【0124】

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「生物学的小胞」又は「ＢＶ」という用語は、親細胞、例えば哺乳動物細胞から天然に分泌される脂質二重層で区切られた粒子を指す。ＢＶは、例えば、細胞外小胞（ＥＶ；ナノメートルサイズの粒子、例えば組換え細胞外小胞（ｒＥＶ））、エキソソーム、微小胞、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得る。ＶＬＰは、例えば、Ｔｉｔｅｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１２（５）：８８１－８９８，２０１７）に記載されている。ＢＶ組成物又は調製物は、ＥＶ、エキソソーム、微小胞、又はＶＬＰの１つのみを含み得るか、又はＥＶ、エキソソーム、微小胞、及びＶＬＰの２つ、３つ、又は４つ全ての混合物を含み得る。ＢＶは、折り畳まれ、親細胞の内因性機構を使用してそれらの天然膜に挿入されたタンパク質を含む。いくつかの態様では、ＢＶは、親細胞に天然ではないタンパク質、例えば、親細胞が発現するように改変されているタンパク質（例えば、異種膜結合タンパク質、例えば、タンパク質フラグメント、タグ及びアンカーを含む異種膜結合タンパク質）を含む。親細胞によるＢＶの産生は、親細胞を膜出芽物質と接触させること（例えば、膜出芽物質、例えばＨＩＶ ｇａｇタンパク質で細胞を形質転換すること）、及び／又はＢＶの形成を促進する条件に細胞を曝露することによって増加され得る。いくつかの態様では、ＢＶは親細胞（例えば、親細胞を含む培養培地から精製される）から精製される。

【0125】

本明細書で使用される場合、「膜出芽物質」という用語は、親細胞によるＢＶ（例えば、細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム、微小胞及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ））の産生を増加させる作用因子を指す。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。いくつかの態様では、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、配列番号１に対して９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。いくつかの態様では、親細胞を膜出芽物質で形質転換する。細胞は、追加的又は代替的に、親細胞によるＢＶ（例えば、細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム、微小胞及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ））の産生を増加させる条件（例えば、培養条件）に曝露され得る。膜出芽物質の更なる例としては、自己集合性ＶＬＰ（例えば、ＭＬＧａｇ、ＡＡＲＤＣ１（例えば、ｈＡＡＲＤＣ１）及びＡｃｙｌ．Ｈｒｓ）；エキソソーム又は腫瘍経路などの内因性小胞形成経路を増強する作用因子（例えば、ＲｈｏＡ．Ｆ３ＯＬ、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌ、ＶＰＳ４ａ、ＨＡＳ３、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１）；及びアポトーシス小体に関連する因子（例えば、構成的に活性なＲＯＣＫ１）が挙げられる。

【0126】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、この技術分野の当業者であれば容易に理解する、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書中の値又はパラメータに関する「約」の言及は、その値又はパラメータそれ自体に向けられる態様を含む（及び記述する）。

【0127】

本明細書で使用される場合、「単一膜貫通受容体」、「１回膜貫通受容体」、又は「ＳＴＭ受容体」という用語は、単一膜貫通ドメインを有するタンパク質を指す。いくつかの態様では、ＳＴＭ受容体は細胞表面上に発現される。例示的なＳＴＭ受容体は、表４、並びにＰＣＴ／ＵＳ ２０２０／０２５４７１、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８、及びＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１３：２２６５－２２７０，２００３に提供されており、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、ＳＴＭタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ注釈の「ロイシンリッチ」、「システインリッチ」、「ＩＴＩＭ／ＩＴＡＭ」（免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ／免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、「ＴＮＦＲ」（腫瘍壊死因子受容体）、「ＴＬＲ／ＩＬＲ」（Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン受容体）、「セマフォリン」、「キナーゼ様」、「Ｉｇ様」（免疫グロブリン様）、「フィブロネクチン」、「エフリン」、「ＥＧＦ」、「サイトカインＲ」、又は「カドヘリン」を有する。ＳＴＭ受容体は、例えば、アミノ酸配列中のシグナルペプチド又は予測される膜貫通領域の存在に基づいて同定され得る。いくつかの態様では、ＳＴＭ受容体は細胞外ドメインとして発現される。

【0128】

本明細書で使用される場合、「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」という用語は、細胞の外側の原形質膜の外側に局在すると予測されるタンパク質ドメインを指す。いくつかの例では、ＥＣＤは、受容体、例えばＳＴＭ受容体のＥＣＤである。いくつかの態様では、ＥＣＤはＩｇＳＦタンパク質のＥＣＤである。いくつかの態様では、ＥＣＤはＰＤＰＮのＥＣＤである。いくつかの態様では、細胞外ドメインの境界は、タンパク質が原形質膜を通過することを示すドメイン、例えば、膜貫通ドメイン（例えば、膜貫通ヘリックス）の予測によって同定され得る。いくつかの態様では、細胞外ドメインの存在は、タンパク質が原形質膜に輸送されることを示すドメイン、配列、又はモチーフ、例えば、シグナル配列又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合部位の存在によって予測され得る。いくつかの態様では、ＥＣＤの境界はＵｎｉＰｒｏｔ注釈に従って決定される。いくつかの態様では、ＥＣＤは可溶性である。いくつかの態様では、細胞外ドメインは、完全長タンパク質との関連において発現される。他の態様では、細胞外ドメインは、単離された細胞外ドメイン、例えば、細胞外であると予測されるタンパク質のアミノ酸残基のみを含むアミノ酸残基の配列として発現される。

【0129】

いくつかの態様では、単離されたＥＣＤは融合タンパク質に含まれる。いくつかの態様では、融合タンパク質に含まれることは、溶解性、発現の容易さ、捕捉の容易さ（例えば、プロテインＡでコーティングされたプレート上）、多量体化、又はＥＣＤの他の望ましい特性を増加させる。いくつかの態様では、ＥＣＤ又はＥＣＤ融合タンパク質は単量体である。他の態様では、ＥＣＤ又はＥＣＤ融合タンパク質は、多量体、例えば四量体又は五量体である。いくつかの態様では、ＥＣＤはヒトＩｇＧに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはヒトＦｃタグに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはＡｖｉｄｉｔｙ ＡＶＩＴＡＧ（商標）（Ａｖｉタグ）に融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤは、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカー、例えばｇＤ－ＧＰＩタグに融合される。他の態様では、ＥＣＤは、例えばＢｕｓｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１８：６２２－６３０，２００８に記載されているように、ラット軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の五量体化ドメイン及びβ－ラクタマーゼタンパク質に融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤ融合タンパク質は、１つ以上のドメインの除去を可能にするために、切断配列、例えば、ＴＥＶ切断配列を更に含む。いくつかの例では、切断配列で切断可能なＡｖｉタグ及びＦｃタグを有するＥＣＤ融合タンパク質を更に処理して、Ｆｃタグを除去し、Ａｖｉタグをビオチン化し、ビオチン化ＥＣＤ融合タンパク質を蛍光ストレプトアビジン（ＳＡ）に融合させ、例えば、四量体化ＥＣＤ融合タンパク質を形成する。いくつかの例では、単離されたＥＣＤ又はＥＣＤ融合タンパク質は精製される。

【0130】

本明細書で使用される場合、「モジュレーター」は、所与の生物学的活性、例えば、相互作用又は相互作用から生じる下流活性を調節する（例えば、増加させる、減少させる、活性化する、又は阻害する）薬剤である。モジュレーター又は候補モジュレーターは、例えば、小分子、抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメイン）、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。

【0131】

「増加させる」又は「活性化する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、又は９５％以上の全体的な増加を引き起こす能力を意味する。特定の態様では、増加させる又は活性化するとは、タンパク質－タンパク質相互作用の下流活性を指すことができる。

【0132】

「減少させる」又は「阻害する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。特定の態様では、減少させる又は阻害するとは、タンパク質－タンパク質相互作用の下流活性を指すことができる。

【0133】

「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、特に明記しない限り、結合対（例えば、受容体及びリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表し得る。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。

【0134】

本明細書で使用される場合、「複合体」又は「複合体型」は、ペプチド結合ではない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性力）を介して互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一態様では、複合体はヘテロ多量体である。本明細書で使用される場合、「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」という用語は、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質実体（例えば、限定しないが、毒素又は検出剤などの化学分子を含む）を有する複合体が含まれることを理解するべきである。

【0135】

「親細胞」という用語は、ＢＶが産生される細胞を指す。親細胞には、外因性核酸が導入された細胞が含まれ、そのような細胞の子孫を含む。親細胞には、「トランスフェクトされた細胞」、「形質転換された細胞」、及び「形質転換体」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか若しくは選択されるのと同じ機能、又は生物活性を有する突然変異体の後代が本発明に含まれる。いくつかの態様では、親細胞は外因性核酸で安定に形質転換される。他の態様では、親細胞は、外因性核酸で一過性に形質転換される。

【0136】

本明細書で使用される場合、「ロイシンリッチリピート含有タンパク質１５」又は「ＬＲＲＣ１５」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源由来の任意の天然ＬＲＲＣ１５を広く指す。この用語は、完全長ＬＲＲＣ１５及びＬＲＲＣ１５の単離された領域又はドメイン、例えばＬＲＲＣ１５ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＬＲＲＣ１５のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＬＲＲＣ１５のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８ＴＦ６６の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＬＲＲＣ１５の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＬＲＲＣ１５の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0137】

本明細書で使用される場合、「プログラム細胞死１リガンド１」又は「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＤ－Ｌ１を広く指す。ＰＤ－Ｌ１はＣＤ２７４とも呼ばれる。この用語は、完全長ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ１の単離された領域又はドメイン、例えばＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＰＤ－Ｌ１のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＺＱ７の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＤ－Ｌ１の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＤ－Ｌ１の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0138】

本明細書で使用される場合、「ポリオウイルス受容体」又は「ＰＶＲ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＶＲを広く指す。この用語は、完全長ＰＶＲ及びＰＶＲの単離された領域又はドメイン、例えばＰＶＲ ＥＣＤを包含する。この用語は、ＰＶＲの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＶＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ａ０Ａ０Ｃ４ＤＧ４９の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＶＲの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＶＲの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0139】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ８０」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＣＤ８０を広く指す。ＣＤ８０は、Ｂ７－１とも呼ばれる。この用語は、完全長ＣＤ８０及びＣＤ８０の単離された領域又はドメイン、例えばＣＤ８０ ＥＣＤを包含する。この用語は、ＣＤ８０の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＣＤ８０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ３３６８１の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＣＤ８０の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＣＤ８０の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0140】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２７６」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＣＤ２７６を広く指す。ＣＤ２７６は、Ｂ７－Ｈ３とも呼ばれる。この用語は、完全長ＣＤ２７６及びＣＤ２７６の単離された領域又はドメイン、例えばＣＤ２７６ ＥＣＤを包含する。この用語は、ＣＤ２７６の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＣＤ２７６のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ５ＺＰＲ３の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＣＤ２７６の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＣＤ２７６の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0141】

本明細書で使用される場合、「ＴＥＭ１」、「ＣＤ２４８」及び「エンドシアリン」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＴＥＭ１を広く指す。この用語は、完全長ＴＥＭ１及びＴＥＭ１の単離された領域又はドメイン、例えばＴＥＭ１ ＥＣＤを包含する。この用語は、ＴＥＭ１の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＴＥＭ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９ＨＣＵ０の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＴＥＭ１の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＴＥＭ１の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0142】

本明細書で使用される場合、「ＡＤＧＲＢ１」、「接着ＧＰＣＲ Ｂ１」及び「接着Ｇタンパク質共役受容体Ｂ１」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＡＤＧＲＢ１を広く指す。この用語は、完全長ＡＤＧＲＢ１及びＡＤＧＲＢ１の単離された領域又はドメイン、例えばＡＤＧＲＢ１ ＥＣＤを包含する。この用語は、ＡＤＧＲＢ１の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＡＤＧＲＢ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ１４５１４の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＴＥＭ１の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＴＥＭ１の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0143】

本明細書で使用される場合、「ＩＣＯＳＬＧ」、「誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド」及び「ＩＣＯＳリガンド」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＩＣＯＳＬＧを広く指す。この用語は、完全長ＩＣＯＳＬＧ及びＩＣＯＳＬＧの単離された領域又はドメイン、例えばＩＣＯＳＬＧ ＥＣＤを包含する。この用語は、ＩＣＯＳＬＧの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント、又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＩＣＯＳＬＧのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ７５１４４の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＩＣＯＳＬＧの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＩＣＯＳＬＧの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。

【0144】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理から生じるあらゆる形態のタンパク質を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアント、例えば、アミノ酸置換変異又はアミノ酸欠失変異を包含する。この用語はまた、タンパク質の単離された領域又はドメイン、例えば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。

【0145】

「単離された」タンパク質又はペプチドは、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様では、タンパク質又はペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。

【0146】

「単離された」核酸とは、自然環境の構成要素から切り離されている核酸分子のことである。単離核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。

【0147】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

【0148】

「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメント（例えば、ｂｉｓ－Ｆａｂ）を含めた、様々な抗体構造を包含する。

【0149】

「抗原結合フラグメント」又は「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗原結合フラグメントの例としては、限定されないが、ｂｉｓ－Ｆａｂ；Ｆｖ；Ｆａｂ；Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。

【0150】

「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、あるいは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体フラグメントを指す。特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（例えば、米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照）。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨＨが含まれるが、これに限定されない。

【0151】

「Ｆａｂ」フラグメントは、抗体のパパイン消化によって生成される抗原結合フラグメントであり、Ｌ鎖全体と、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のパパイン消化により、２つの同一のＦａｂフラグメントを生成する。抗体のペプシン処理により単一の大きなＦ（ａｂ’）_２フラグメントが生じ、これは二価の抗原結合活性を有するジスルフィドで連結された２つのＦａｂフラグメントにほぼ対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有している点でＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生されたものであった。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも既知である。

【0152】

本明細書において「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって取り除かれ得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＬｙｓ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｌｙｓ４４７残基が除かれていない抗体集団、及びＬｙｓ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。

【0153】

「Ｆｖ」は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、かつ抗原結合特異性を抗体に与える６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各３つのループ）が生じる。ただし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であることが多いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。

【0154】

「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、ネイティブ抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。

【0155】

「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖中に接続するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖのレビューについては、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；Ｍａｌｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：７－１３，１９９５を参照されたい。

【0156】

「小分子」という用語はとは、分子量約２０００ダルトン以下、例えば約１０００ダルトン以下の任意の分子を指す。いくつかの態様では、小分子は小さな有機分子である。

【0157】

本明細書で使用される場合、「模倣物」、「ペプチド模倣物」、「ポリペプチド模倣物」又は「分子模倣物」という用語は、コンホメーション及び／又は結合能力において、所与のポリペプチドに対して又は当該ポリペプチドの結合パートナーに結合するための当該ポリペプチドの部分に対して十分な類似性（例えば、二次構造、三次構造）を有するポリペプチドを指す。模倣物は、それが模倣するポリペプチドと等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。分子模倣物は、それが模倣するポリペプチドと明らかなアミノ酸配列類似性を有していても、有していなくてもよい。模倣物は、自然に発生することもあれば、操作されることもある。いくつかの態様では、模倣物は表１のタンパク質の模倣物である。他の態様では、模倣物は表２のタンパク質の模倣物である。更に別の態様では、模倣物は、表１のタンパク質又は表２のタンパク質に結合する別のタンパク質の模倣物である。いくつかの態様では、模倣物は表５のタンパク質の模倣物である。他の態様では、模倣物は表６のタンパク質の模倣物である。更に別の態様では、模倣物は、表５のタンパク質又は表６のタンパク質に結合する別のタンパク質の模倣物である。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。

【0158】

本明細書で使用される場合、２つ以上のタンパク質（例えば、表１のタンパク質及び表２のタンパク質、又は表５のタンパク質及び表６のタンパク質）の相互の「結合を可能にする条件」という用語は、２つ以上のタンパク質がモジュレーター又は候補モジュレーターの非存在下で相互作用するであろう条件（例えば、タンパク質濃度、温度、ｐＨ、塩濃度）を指す。結合を可能にする条件は個々のタンパク質によって異なり、タンパク質－タンパク質相互作用アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイ、バイオレイヤー干渉法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、細胞外相互作用アッセイ、及び細胞表面相互作用アッセイ）の間で異なる可能性がある。

【0159】

基準ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、基準ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。

【0160】

ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
この場合、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。

【0161】

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、例えば、物理的、生化学的、化学的、及び／又は生理学的特性に基づいて、特徴付けられ及び／又は同定される細胞及び／又は他の分子実体を含有する、目的の対象及び／又は個体から得られるか、又はそれに由来する組成物を指す。例えば、「疾患試料」という語句及びその変形は、特徴付けられるべき細胞及び／又は分子実体を含有することが期待されるか又は含有することが知られている、目的の対象から得られた任意の試料を指す。試料は、限定されないが、組織試料、初代若しくは培養細胞又は細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、全血、血漿、血清、血液由来細胞、尿、脳脊髄液、唾液、頬スワブ、痰、涙液、発汗、粘液、腫瘍溶解物、及び組織培養培地、ホモジナイズした組織等の組織抽出物、腫瘍組織、細胞抽出物、及びそれらの組み合わせを含む。試料は、保存試料、新鮮な試料、又は凍結試料であり得る。いくつかの態様では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。

【0162】

ＩＩ．タンパク質を提示する生物学的小胞
膜結合タンパク質（例えば、受容体－リガンド相互作用）を含む相互作用の研究は、細胞外環境で起こる細胞コミュニケーションを理解するのに役立つ。しかしながら、これらの相互作用の同定及び理解の進歩は、一部には受容体－リガンド相互作用が膜内で起こるため、細胞質タンパク質に関するものよりも遅れている。生理学的膜は、脂質、ステロール、タンパク質及びグリカンの複雑な混合物を含み、それらは全て相互作用に関与することができる。さらに、膜は、弱いタンパク質－タンパク質相互作用を強化する受容体のクラスター化、配向及び折り畳みを助ける。タンパク質－タンパク質相互作用を評価するための標準的な方法は、典型的には、細胞膜の非存在又は細胞膜からの抽出を必要とする。結果として、これらの一般的に利用される方法論は、受容体－リガンド相互作用を十分に表していない。

【0163】

本開示は、生物学的小胞（ＢＶ）、例えば細胞外小胞（ＥＶ）の表面に提示されるタンパク質（例えば、膜貫通受容体）を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、ＢＶであって、（ａ）タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む、異種膜結合タンパク質であって、ＢＶの外面に存在する異種膜結合タンパク質と、（ｂ）膜出芽物質とを含む、ＢＶを特徴とする。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。

【0164】

いくつかの態様では、本開示は、ＢＶであって、（ａ）タンパク質フラグメント、タグ及びアンカーを含む異種膜結合タンパク質であって、ＢＶの外面に存在する異種膜結合タンパク質と、（ｂ）膜出芽物質とを含み、膜出芽物質がＨＩＶ ｇａｇタンパク質であり、ＢＶが、（ｉ）異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を発現するように改変された親細胞を提供すること、並びに（ｉｉ）親細胞からＢＶを単離すること、を含む方法によって生成される、ＢＶを特徴とする。

【0165】

Ａ．タンパク質フラグメント
いくつかの態様では、タンパク質フラグメントは、膜貫通受容体、例えば１回膜貫通（ＳＴＭ）受容体又は複数回膜貫通受容体（多重膜貫通；ＭＴＭＲ）、例えばＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の細胞外ドメインである。例示的なＳＴＭ受容体は、本明細書のセクションＩＩＩに記載されており、表２及び表４に提供されている。

【0166】

Ｂ．アンカー
いくつかの態様では、アンカーは、タンパク質フラグメントをＢＶの脂質膜の表面に繋ぎ止める。いくつかの態様では、アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである。いくつかの態様では、アンカーは、タンパク質の脂質化に使用される部分、例えば、システインパルミトイル化、グリシンミリストイル化、リジン脂肪アシル化、コレステロールエステル化、システインプレニル化、又はセリン脂肪アシル化に使用される部分である。

【0167】

Ｃ．タグ
いくつかの態様では、タグは、直接的又は間接的に視覚化され得るか、又は別の方法で検出され得る。例えば、タグは、抗体又は抗体フラグメントを使用して検出することができる部分を含み得、例えば、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、タグは蛍光タンパク質を含む。いくつかの態様では、タンパク質フラグメントは、ｇＤタグ及びＧＰＩアンカーを含むｇＤ－ＧＰＩコンストラクトに（例えば、融合）コンジュゲートされる。

【0168】

Ｄ．膜出芽物質
ＢＶは、親細胞内に存在する場合に、親細胞によるＢＶ（例えば、細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム、微小胞及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ））の産生を増加させる膜出芽物質を更に含み得る。親細胞は膜出芽物質でトランスフェクトされ得、膜出芽物質は、例えば膜出芽プロセス中にＢＶによって継承され得る。

【0169】

いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。いくつかの態様では、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、配列番号１に対して９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。いくつかの態様では、膜出芽物質（例えば、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質）は、直接的若しくは間接的に可視化され得るか、又はそうでなければ検出され得るマーカーを含む。いくつかの態様では、検出可能なマーカーは蛍光タンパク質である。いくつかの態様では、検出可能なマーカーは、基質、例えばウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）の存在下で蛍光シグナルを生成する酵素である。更なる膜出芽物質は、下記のセクションＩＩＩ（Ｃに記載される。

【0170】

細胞は、追加的又は代替的に、親細胞によるＢＶ（例えば、細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム、微小胞及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ））の産生を増加させる条件（例えば、培養条件）に曝露され得る。膜出芽物質を含むＥＶは、組換えＥＶ（ｒＥＶ）と呼ばれることがある。

【0171】

ＢＶ産生を増加させる膜出芽物質及び／又は作用因子若しくは条件は、親細胞によるＢＶ産生を、例えば、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、又は４倍超増加させ得る（例えば、１．５～２．５倍、２．５～３．５倍、又は３．５～４．５倍）。いくつかの態様では、膜出芽物質（例えば、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質）は、親細胞によるＢＶ産生を約４倍増加させる。

【0172】

Ｅ．親細胞及び単離方法
生物学的小胞（ＢＶ）は、親細胞に由来する（例えば、以下によって生成され、以下から分離される）任意の適切な脂質小胞構造を含む。いくつかの態様では、ＢＶは哺乳動物細胞によって産生される。細胞は、例えば、ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞であり得る。いくつかの態様では、ＢＶは、細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム、微小胞、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。いくつかの態様では、ＢＶ調製物又は組成物は、ＥＶ、エキソソーム、微小胞、及び／又はＶＬＰの混合物を含む。ＢＶは、例えば遠心分離（例えば、超遠心分離）を使用して、親細胞及び／又は大型ＥＶ及びタンパク質凝集体から分離され得る（例えば、親細胞の培養培地から分離され得る）。

【0173】

いくつかの態様では、親細胞は、異種膜結合タンパク質をコードするプラスミド、及び膜出芽物質をコードするプラスミドでトランスフェクトされている。異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質は、単一のプラスミドによってコードされ得るか、又は別々のプラスミドによってコードされ得る。

【0174】

親細胞の表面上及び／又はＢＶの表面上の異種膜結合タンパク質及び／又は膜出芽物質の発現レベルが評価され得る。いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質の発現レベルは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して評価され、ＢＶは、異種膜結合タンパク質に関連するタグに対する抗体と接触した場合に閾値レベル以上の少なくとも１つのシフトを生じる。いくつかの態様では、タグはｇＤポリペプチドであり、抗体は抗ｇＤ抗体であり、ＢＬＩアッセイを３０℃で実施した場合、シフトは少なくとも１．５ｎｍである。他の態様では、ＢＶを異種膜結合タンパク質に特異的な抗体と接触させる。

【0175】

いくつかの態様では、ＢＶは、ＢＶの直接的又は間接的な可視化を可能にするマーカー、例えば膜マーカー（例えば、蛍光膜マーカー）を含む。いくつかの態様では、膜マーカーはコレステロールマーカー、例えばＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄである。

【0176】

ＩＩＩ．タンパク質－タンパク質相互作用を同定する方法
生物学的小胞（ＢＶ）は、結合コンピテント受容体を得るためのタンパク質精製のない方法を提供する。次いで、受容体を有するＢＶを、受容体のリガンド（例えば、リガンドのライブラリ）との相互作用について試験し、したがってタンパク質－タンパク質相互作用を同定及び評価する方法を提供し得る。

【0177】

いくつかの態様では、本開示は、タンパク質－タンパク質相互作用を同定する方法であって、（ａ）標的ポリペプチドの集合体を提供することであって、任意に、標的ポリペプチドの集合体が１つ以上の固体表面に固定化される、標的ポリペプチドの集合体を提供することと、（ｂ）異種膜結合タンパク質と標的ポリペプチドの少なくとも１つとの結合を可能にする条件下で、工程（ａ）の集合体を、異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含む生物学的小胞（ＢＶ）と接触させることであって、膜出芽物質がＨＩＶ ｇａｇタンパク質であり、異種膜結合タンパク質がＢＶの表面上に閾値レベル以上で発現される、工程（ａ）の集合体を、異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含む生物学的小胞（ＢＶ）と接触させることと、（ｃ）異種膜結合タンパク質と少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それによりタンパク質－タンパク質相互作用を同定することを含む、方法を特徴とする。

【0178】

Ａ．異種膜結合タンパク質
異種膜結合タンパク質は、ＥＶに組み込むことができる任意のタンパク質若しくはポリペプチド又はそのフラグメントであり得る。

【0179】

いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は完全長タンパク質である。他の態様では、異種膜結合タンパク質は、タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカーを含む。タンパク質フラグメントは、例えば、細胞外ドメイン（例えば、目的のタンパク質の細胞外ドメイン、例えば、膜貫通受容体）であり得る。ＥＣＤは、細胞の原形質膜の外側に局在すると予測されるタンパク質のドメインである。したがって、タンパク質のこのドメインは、細胞外環境と相互作用するために利用可能であり、例えば、可溶性タンパク質及び細胞上又は隣接する細胞上の他のタンパク質のＥＣＤと相互作用する。タンパク質の１つ以上のＥＣＤは、バイオインフォマティクス分析、例えばＵｎｉＰｒｏｔ注釈の分析によって同定され得る。例えば、ＥＣＤの境界は、隣接する予測される膜貫通領域、例えば、膜貫通ヘリックスの境界に対して同定され得る。いくつかの態様では、細胞外ドメインの存在は、タンパク質が原形質膜に輸送されることを示すドメイン、配列、又はモチーフ、例えば、シグナル配列又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合部位の存在によって予測され得る。いくつかの態様では、細胞外ドメインは、完全長タンパク質との関連において発現される。他の態様では、細胞外ドメインは、単離された細胞外ドメイン、例えば、細胞外であると予測されるタンパク質のアミノ酸残基のみを含むアミノ酸残基の配列として発現される。いくつかの態様では、単離された細胞外ドメインは融合タンパク質で発現される。

【0180】

異種膜結合タンパク質がタンパク質フラグメント、タグ及びアンカーを含むいくつかの態様では、アンカーは、タンパク質フラグメントをＢＶの脂質膜の表面に繋ぎ止める。いくつかの態様では、アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである。いくつかの態様では、アンカーは、タンパク質の脂質化に使用される部分、例えば、システインパルミトイル化、グリシンミリストイル化、リジン脂肪アシル化、コレステロールエステル化、システインプレニル化、又はセリン脂肪アシル化に使用される部分である。

【0181】

異種膜結合タンパク質がタンパク質フラグメント、タグ及びアンカーを含むいくつかの態様では、タグは、直接的又は間接的に可視化され得るか、そうでなければ検出され得る。例えば、タグは、抗体又は抗体フラグメントを使用して検出することができる部分を含み得、例えば、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、タグは蛍光タンパク質を含む。いくつかの態様では、タンパク質フラグメントは、ｇＤタグ及びＧＰＩアンカーを含むｇＤ－ＧＰＩコンストラクトに（例えば、融合）コンジュゲートされる。いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は、以下の表１に提供されるタンパク質（例えば、ｇＤ－ＧＰＩコンストラクトにコンジュゲートされた表１に提供されるタンパク質のＥＣＤ）又は表５に提供されるタンパク質である。

【表1】

【0182】

Ｂ．ＢＶ及び親細胞
生物学的小胞（ＢＶ）は、本明細書のセクションＩＩ（Ｅ）に記載されているように、親細胞に由来する（例えば、以下によって生成され、以下から分離される）任意の適切な脂質小胞構造を含む。

【0183】

いくつかの態様では、親細胞は、異種膜結合タンパク質をコードするプラスミド、及び膜出芽物質をコードするプラスミドでトランスフェクトされている。異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質は、単一のプラスミドによってコードされ得るか、又は別々のプラスミドによってコードされ得る。

【0184】

親細胞の表面上及び／又はＢＶの表面上の異種膜結合タンパク質及び／又は膜出芽物質の発現レベルが評価され得る。いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質の発現レベルは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して評価され、ＢＶは、異種膜結合タンパク質に関連するタグに対する抗体と接触した場合に閾値レベル以上の少なくとも１つのシフトを生じる。いくつかの態様では、タグはｇＤポリペプチドであり、抗体は抗ｇＤ抗体であり、閾値レベルは、ＢＬＩアッセイを３０℃で実施した場合の少なくとも１．５ｎｍのシフトである。他の態様では、ＢＶを異種膜結合タンパク質に特異的な抗体と接触させる。

【0185】

いくつかの態様では、ＢＶは、ＢＶの直接的又は間接的な可視化を可能にするマーカー、例えば膜マーカー（例えば、蛍光膜マーカー）を含む。いくつかの態様では、膜マーカーはコレステロールマーカー、例えばＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄである。

【0186】

Ｃ．膜出芽物質
ＢＶは、本明細書のセクションＩＩ（Ｄ）に記載されているように、親細胞によるＢＶ（例えば、細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム、微小胞及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ））の産生を増加させる膜出芽物質を更に含み得る。

【0187】

いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。いくつかの態様では、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、配列番号１に対して９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。

【0188】

更なる例示的な膜出芽物質としては、自己集合性ＶＬＰ（例えば、ＭＬＧａｇ、ＡＡＲＤＣ１（例えば、ｈＡＡＲＤＣ１）及びＡｃｙｌ．Ｈｒｓ）；エキソソーム又は腫瘍経路などの内因性小胞形成経路を増強する作用因子（例えば、ＲｈｏＡ．Ｆ３ＯＬ、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌ、ＶＰＳ４ａ、ＨＡＳ３、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１）；及びアポトーシス小体に関連する因子（例えば、構成的に活性なＲＯＣＫ１）が挙げられる。

【0189】

いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１（例えば、ｈＡＡＲＤＣ１）、ＡＲＦ６（例えば、ＡＲＦ６Ｑ６７Ｌ）、ＲｈｏＡ（例えば、ＲｈｏＡ．Ｆ３０Ｌ）、又はそれらの組合せである。

【0190】

いくつかの態様では、膜出芽物質はＧａｇタンパク質、例えばキメラＧａｇタンパク質（例えば、Ｈａｍｍａｒｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７８（１１）：５６８６－９７，２００４又はＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８（２６）：１５２３９－４４，２００１で検討されるキメラＧａｇタンパク質）である。いくつかの態様では、キメラＧａｇタンパク質は、ＨＩＶ Ｇａｇの一部と、異なるレトロウイルス由来のＧａｇの一部とを含む。例えば、限定するものではないが、キメラＧａｇは、ＨＩＶ Ｇａｇを含み、その局在を指示することが知られているＨＩＶ Ｇａｇの領域が、マウスレトロウイルスであるモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来の機能的に相同な領域で置換されている。特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｇａｇの置換領域は、マトリックスドメイン（ＭＡ）であり、したがって本明細書でＭＬＧａｇと称されるキメラＧａｇを生成する。特定の実施形態では、キメラＧａｇタンパク質及び完全長Ｇａｇタンパク質を、例えば、Ｓｔｏｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６５（２１）：３３８３－３３９８，２００８に記載される、任意の種に由来する内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列から生成することができる。特定の実施形態では、小胞因子はＭＬＧａｇである。

【0191】

特定の実施形態では、小胞因子は、アレスチンドメイン含有タンパク質１（ＡＲＲＤＣ１）である。特定の実施形態では、小胞因子はマウスＡＲＲＤＣ１（ｍＡＲＲＤＣ１）である。特定の実施形態では、小胞因子はヒトＡＲＲＤＣ１（ｈＡＲＲＤＣ１）である。ＡＲＲＤＣ１は、アクセサリータンパク質のテトラペプチドＰＳＡＰモチーフであり、ＥＶ形成を誘導する宿主タンパク質である。ＡＲＲＤＣ １の過剰発現により、微小胞（ＭＶ）形成が促進されることが示されている。このような効果は、ＰＳＡＰ／ＰＴＡＰペプチドを介したＴｓｇ １０１の動員によって媒介される。ＡＴＰアーゼＶＰ Ｓ４ａの過剰発現は、ＭＶ形成の更なる増強をもたらす（Ｎａｂｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０９（１１）：４１４６－５１，２０１２）。特定の実施形態では、小胞因子はＡＤＰリボシル化因子－６（ＡＲＦ６）である。ＡＲＦ６は、ＥＲＫ依存的様式で腫瘍細胞における微小胞形成を駆動するＲｈｏ ＧＴＰアーゼであることが示されているＭｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ－Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．，１９（２２）：１８７５－８５，２００９）．特定の実施形態では、小胞因子は構成的に活性な形態のＡＲＦ６である。例えば、限定するものではないが、構成的に活性な形態のＡＲＦ６は、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌである（例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１２８（６）：１００３－１０１７，１９９５を参照）

【0192】

特定の実施形態では、小胞因子は、腫瘍細胞における微小胞形成も駆動することができる変異ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ１である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３１（４５）：４７４０－９，２０１２）。特定の実施形態では、小胞因子は、構成的に活性な形態のＲｈｏＡである。例えば、限定するものではないが、構成的に活性な形態のＲｈｏＡは、ＲｈｏＡ．Ｆ３ＯＬである（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２７４（３３）：２３６３３－２３６４１，１９９９を参照）。

【0193】

特定の実施形態では、小胞因子は、原形質膜（ＰＭ）結合ドメイン、自己組織化ドメイン、及び輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）動員ドメインを含む。ＥＶ形成の設計原理は、ＥＶ因子／カーゴの迅速な生成を可能にすることである。ＰＭターゲティング及び高次オリゴマー化がＥＶ組込みを推進することが示されている（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．，５（６）：ｅ１５８，２００７）。特定の実施形態では、小胞因子は、アシル化タグのＰＭ結合ドメイン、及びコイルドコイルの自己組織化ドメインからなる肝細胞増殖因子調節チロシンキナーゼ基質（Ｈｒｓ）のＣ末端ドメイン、並びにＥＳＣＲＴ動員ドメインを含む、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓである。特定の実施形態では、小胞因子は、マトリックスのＰＭ結合ドメイン、カプシドの自己組織化ドメイン、及びｐ６のＥＳＣＲＴ動員ドメインを含む、ＭＬＧａｇである。特定の実施形態では、小胞因子は、自己組織化ドメインとＥＳＣＲＴ動員ドメインとを含む。特定の実施形態では、小胞因子は、アレスチンドメインの自己組織化ドメインとＥＳＣＲＴ動員ドメインとを含むＡＲＲＤＣ１である。

【0194】

追加の小胞因子は、当技術分野で知られている任意の方法によって同定することができる。例えば、限定するものではないが、全てのタンパク質、例えばヒトタンパク質のｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを実施して、ＥＶの産生を増加させる単一の遺伝子又は遺伝子の組合せを同定することができる。代替的又は追加的に、ＣＲＩＳＰＲ又はＲＮＡｉのスクリーニングを実施して、ＥＶの産生を阻害する単一の遺伝子又は遺伝子の組合せを同定することができる。

【0195】

いくつかの態様では、膜出芽物質（例えば、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質）は、直接的若しくは間接的に可視化され得るか、又はそうでなければ検出され得るマーカーを含む。いくつかの態様では、検出可能なマーカーは、基質の存在下で蛍光シグナルを生成する酵素であり、例えば、酵素はウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）であり、基質はＲｌｕｃ基質である。

【0196】

細胞は、追加的又は代替的に、親細胞によるＢＶ（例えば、細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム、微小胞及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ））の産生を増加させる条件（例えば、培養条件）に曝露され得る。

【0197】

ＢＶ産生を増加させる膜出芽物質及び／又は作用因子若しくは条件は、親細胞によるＢＶ産生を、例えば、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、又は４倍超増加させ得る（例えば、１．５～２．５倍、２．５～３．５倍、又は３．５～４．５倍）。いくつかの態様では、膜出芽物質（例えば、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質）は、親細胞によるＢＶ産生を約４倍増加させる。

【0198】

Ｄ．標的ポリペプチドの集合体
いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、膜貫通受容体又はそのフラグメントの集合体である。いくつかの態様では、受容体は１回膜貫通（ＳＴＭ）受容体である。ＳＴＭ受容体タンパク質は、原形質膜を通過する単一ドメインを有する膜結合受容体の大きなカテゴリである。多くのＳＴＭ受容体は細胞表面に発現しているため、細胞外インタラクトームに関与している可能性がある。例示的なＳＴＭ受容体が、表２及び表４、並びにＭａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８及びＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１３：２２６５－２２７０，２００３。

【0199】

いくつかの態様では、タンパク質フラグメントは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、例えば上記のように同定されたＥＣＤである。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体の各メンバーはＦｃタグ付き細胞外ドメインであり、固体表面はプロテインＡで被覆されている。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの１つ以上は、１つ位以上の固体表面上の別個の位置に固定化される。他の態様では、１つ以上の標的ポリペプチドは表面に固定化されていない。

【表2】

【表3】

【表4】

【0200】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質のうちの、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％、例えば、表４のタンパク質のうちの５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５５、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％の細胞外ドメインを含む。

【0201】

いくつかの態様では、ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質のうちの少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表４のポリペプチドのうちの１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１０５０、１０５０～１１００、１１００～１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含む。

【0202】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも５０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも７５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも９０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の全ての細胞外ドメインを含む。

【0203】

他の態様では、受容体は、多重膜貫通受容体（ＭＴＭＲ）、例えばＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーである。

【0204】

Ｅ．相互作用のためのアッセイ
タンパク質－タンパク質相互作用アッセイを実施するために、標的ポリペプチド（例えば、表面に固定化された標的ポリペプチド、例えば、プレートのウェルに固定化された標的ポリペプチド）の集合体を、異種膜結合タンパク質（例えば、精製ＢＶを含む溶液と接触させる）を含むＢＶと接触させる。次いで、アッセイをインキュベートし、１回以上洗浄して非結合ＢＶを除去してもよい。

【0205】

いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質と少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用は、閾値レベルを超える固体表面上の位置でシグナルを検出することによって同定される。検出されるシグナルは、以下のように、ＢＶの１つ以上の可視化可能な成分からのものであってもよい。

【0206】

いくつかの態様では、膜出芽物質（例えば、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質）は検出可能なマーカーを更に含み（例えば、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ）、相互作用を検出することは、閾値レベルを超える固体表面上の位置で検出可能なマーカーのレベルを検出することを含む。いくつかの態様では、検出可能なマーカーは、基質の存在下で蛍光シグナルを生成する酵素である。いくつかの態様では、酵素はウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）であり、アッセイは、Ｒｌｕｃ基質を添加し、したがって相互作用が生じた固体表面上の位置で蛍光シグナルを生成することを更に含む。

【0207】

いくつかの態様では、ＢＶは膜マーカーを含み、相互作用を検出することが、固体表面上の位置で、閾値レベルを超える膜マーカーのレベルを検出することを含む。いくつかの態様では、膜マーカーはコレステロールマーカーである。いくつかの態様では、コレステロールマーカーはＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄである。

【0208】

いくつかの態様では、相互作用は一過性の相互作用である。

【0209】

いくつかの態様では、相互作用は低親和性相互作用である。

【0210】

いくつかの態様では、表１に提供されるタンパク質及び表４に提供されるＳＴＭタンパク質は、上記のタンパク質－タンパク質相互作用アッセイにおける相互作用について試験される。

【0211】

いくつかの態様では、本明細書に記載されるアッセイは、表３に提供される相互作用を同定し得る。

【0212】

いくつかの態様では、本明細書に記載されるアッセイは、ＬＲＲＣ１５と、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８／エンドシアリン、ＰＬＸＤＣ２、ＰＴＰＲＤ、ＳＡＲＡＦ、ＡＳＧＲ１、ＢＭＰ１０、ＣＰＭ、ＬＤＬＲ、ＰＩＬＲＡ及び／又はＰＲＲＧ２との間における相互作用を同定し得る。

【0213】

いくつかの態様では、本明細書に記載されるアッセイは、ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４と、Ｃ６ｏｒｆ７２、ＬＲＴＭ１、ＣＤＨＲ２、ＩＧＦ２Ｒ、ＮＣＲ３及び／又はＳＵＳＤ３との間の相互作用を同定し得る。

【0214】

いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＰＶＲと、ＣＬＥＣ１７Ａ及び／又はＰＶＲＬ４との間の相互作用を同定し得る。

【0215】

いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＣＤ８０／Ｂ７－１と、ＢＴＮＬ３、ＣＤＨＲ２、ＧＬＴ８Ｄ２、ＫＩＡＡ１４６７、及び／又はＲＮＦ１５２との間の相互作用を同定し得る。

【0216】

いくつかの態様では、本明細書に記載されるアッセイは、ＣＤ２７６／Ｂ７－Ｈ３と、ＬＲＦＮ１、ＭＸＲＡ５、ＰＶＲＬ１、ＬＲＩＴ２、ＰＬＡ２Ｒ１及び／又はＳＬＩＴＲＫ４との間における相互作用を同定し得る。いくつかの態様では、１つ以上の多重膜貫通受容体（ＭＴＭＲ）、例えば、ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーが、上記で記載されるようなタンパク質－タンパク質相互作用アッセイにおける相互作用について試験される。

【0217】

いくつかの態様では、表５に提供されるタンパク質及び表６に提供されるタンパク質は、上記のタンパク質－タンパク質相互作用アッセイにおける相互作用について試験される。

【0218】

いくつかの態様では、本明細書に記載されるアッセイは、表７に提供される相互作用を同定し得る。

【表5】

【表6】

【表7】

【0219】

いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＡＤＧＲＢ１と、ＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳＬＧ、ＤＮＥＲ及び／又はＣＮＴＮ６との間の相互作用を同定し得る。

【0220】

いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＬＧＲ４と、ＣＬＰＳ、ＥＤＩＬ３、ＩＺＵＭＯ４、ＩＺＵＭＯ１、ＢＴＮＬ３、ＣＤ９３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＩＬ－６、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＳＣＡＲＦ１、及び／又はＴＲＩＬとの間の相互作用を同定し得る。

【0221】

いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＬＧＲ５と、ＣＬＰＳ、ＥＤＩＬ３、ＩＺＵＭＯ４、ＣＤ９３、ＧＰＲ１２５、ＩＬ６－Ｒ及び／又はＴＲＩＬとの間の相互作用を同定し得る。

【0222】

Ｆ．ＢＶ－タンパク質複合体
別の態様では、本開示は、（ａ）異種膜結合タンパク質及び膜出芽物質を含むＢＶと、（ｂ）標的ポリペプチドとを含むタンパク質複合体であって、異種膜結合タンパク質と標的ポリペプチドとが互いに結合している、タンパク質複合体を特徴とする。例示的な異種膜結合タンパク質及び標的ポリペプチドは、それぞれセクションＩＩＩＡ及びＩＩＩＤに記載されている。いくつかの態様では、標的ポリペプチドは表面に固定化され、複合体は表面に局在化する。

【0223】

ＩＶ．タンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーターを同定する方法
Ａ．相互作用の調節に関するアッセイ
ｉ．表１及び表２のタンパク質
いくつかの態様では、本開示は、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載されている候補モジュレーター）を提供することと、（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、候補モジュレーターを、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0224】

ｉｉ．ＴＥＭ１及びＬＲＲＣ１５
いくつかの態様では、本開示は、ＬＲＲＣ１５とＴＥＭ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＬＲＲＣ１５をＴＥＭ１と接触させることと、（ｃ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の増加又は減少により、候補モジュレーターを、ＬＲＲＣ１５とＴＥＭ１との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0225】

ｉｉｉ．表５及び表６のタンパク質
いくつかの態様では、本開示は、表５のタンパク質と表６のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載されている候補モジュレーター）を提供することと、（ｂ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることであって、表５のタンパク質及び表６のタンパク質は、表７において相互作用することが報告されている、表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少により、候補モジュレーターを、表５のタンパク質と表６のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0226】

ｉｖ．ＰＤ－Ｌ１及びＡＤＧＲＢ１
いくつかの態様では、本開示は、ＰＤ－ＬとＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＰＤ－Ｌ１をＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の増加又は減少により、候補モジュレーターを、ＰＤ－Ｌ１とＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0227】

ｖ．ＩＣＯＳＬＧ及びＡＤＧＲＢ１
いくつかの態様では、本開示は、ＩＣＯＳＬＧとＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＩＣＯＳＬＧをＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の増加又は減少により、候補モジュレーターを、ＩＣＯＳＬＧとＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0228】

ｖｉ．相互作用の調節に関するアッセイ
いくつかの態様では、候補モジュレーターは、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に、細胞培養培地に、馴化培地に、表１のタンパク質（例えば、ＢＶ上で発現されるタンパク質１の形態）及び／又は表２のタンパク質の精製された形態に、及び／又は表５のタンパク質（例えば、ＢＶ上に発現されるタンパク質５の形態）及び／又は表６のタンパク質の精製された形態に提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、又は１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、０．１ｎＭ～１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、溶液中、例えば、可溶性の形態で提供される。

【0229】

いくつかの態様では、（例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に）結合の増加が少なくとも７０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、結合の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）である。いくつかの態様では、結合の増加は少なくとも７０％である。

【0230】

いくつかの態様では、（例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に）結合の減少が少なくとも７０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、結合の減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）である。いくつかの態様では、結合の減少は少なくとも７０％である。タンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーター、並びにそのような相互作用を調節し得る薬剤を同定するための例示的な方法は、以下及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２５４７１に記載されている。

【0231】

表１のタンパク質と表２のタンパク質との間、又は表５のタンパク質と表６のタンパク質との間の相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較して、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の増加、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）の増加として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の減少、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％（例えば、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）の減少として同定され得る。タンパク質－タンパク質相互作用のためのアッセイは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、細胞外相互作用アッセイ、又は細胞表面相互作用アッセイであり得る。

【0232】

タンパク質－タンパク質相互作用の調節のためのＳＰＲアッセイ
いくつかの態様では、タンパク質－タンパク質相互作用のアッセイは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイである。いくつかの態様では、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合、又は表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合の調節は、モジュレーターの非存在下と比較したその存在下でのＳＰＲシグナル応答単位（ＲＵ）の差として測定される。

【0233】

タンパク質－タンパク質相互作用の調節のためのＢＬＩアッセイ
いくつかの態様では、タンパク質－タンパク質相互作用についてのアッセイは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイである。いくつかの態様では、ＢＬＩアッセイは、単離された細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を使用して行われる。いくつかの態様では、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合、又は表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合の調節は、モジュレーターの非存在下と比較したその存在下でのバイオセンサチップで測定された波長シフト（Δλ）の差として測定される。

【0234】

タンパク質－タンパク質相互作用の調節のためのＥＬＩＳＡ
いくつかの態様では、タンパク質－タンパク質相互作用についてのアッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。いくつかの態様では、第１のタンパク質はプレートに結合され（例えば、プレートに直接結合されるか、又はプレートに結合された抗体によって認識される親和性タグを介してプレートに結合される）、第２のタンパク質は可溶性形態で提供され、例えば、単離されたＥＣＤとして提供される。第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用は、第２のタンパク質又はその親和性タグに結合する抗体を提供することによって検出され得、ここで、抗体はその抗体の存在についてのアッセイにおいて検出され、例えば視覚化され得る。

【0235】

タンパク質－タンパク質相互作用の調節のための他のアッセイ
いくつかの態様では、アッセイは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２５４７１に記載されるような細胞外相互作用アッセイである。いくつかの態様では、アッセイは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２５４７１に記載されるような細胞表面相互作用アッセイである。いくつかの態様では、アッセイは、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）アッセイ、免疫沈降を含むアッセイ、又はＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（商標）技術を含むアッセイである。

【0236】

Ｂ．下流活性における変化のアッセイ
ｉ．表１及び表２のタンパク質
いくつかの態様では、本開示は、表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載の候補モジュレーター）を提供することと、（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表１のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表１のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0237】

いくつかの態様では、本開示は、表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載の候補モジュレーター）を提供することと、（ｂ）表２のタンパク質の表１のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表２のタンパク質を表１のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質が、表３において相互作用することが報告されている、表２のタンパク質を表１のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表２のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表２のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0238】

ｉｉ．ＴＥＭ１及びＬＲＲＣ１５
いくつかの態様では、本開示は、ＬＲＲＣ１５の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＬＲＲＣ１５のＴＥＭ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＬＲＲＣ１５をＴＥＭ１と接触させることと、（ｃ）ＬＲＲＣ１５の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＬＲＲＣ１５の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＬＲＲＣ１５の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0239】

いくつかの態様では、本開示は、ＴＥＭ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＴＥＭ１のＬＲＲＣ１５への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＴＥＭ１をＬＲＲＣ１５と接触させることと、（ｃ）ＴＥＭ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＴＥＭ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＴＥＭ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0240】

ｉｉｉ．表５及び表６のタンパク質
いくつかの態様では、本開示は、表５のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載の候補モジュレーター）を提供することと、（ｂ）表５のタンパク質の表６のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることであって、表５のタンパク質及び表６のタンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表５のタンパク質を表６のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表５のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表５のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表５のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0241】

いくつかの態様では、本開示は、表６のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載の候補モジュレーター）を提供することと、（ｂ）表６のタンパク質の表５のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表６のタンパク質を表５のタンパク質と接触させることであって、表５のタンパク質及び表６のタンパク質が、表７において相互作用することが報告されている、表６のタンパク質を表５のタンパク質と接触させることと、（ｃ）表６のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、表６のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、表６のタンパク質の下流活性を測定することと、を含む、方法を特徴とする。

【0242】

ｉｖ．ＰＤ－Ｌ１及びＡＤＧＲＢ１
いくつかの態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＰＤ－Ｌ１をＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＰＤ－Ｌ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＰＤ－Ｌ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＰＤ－Ｌ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0243】

いくつかの態様では、本開示は、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＡＤＧＲＢ１のＰＤ－Ｌ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＡＤＧＲＢ１をＰＤ－Ｌ１と接触させることと、（ｃ）ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0244】

ｖ．ＩＣＯＳＬＧ及びＡＤＧＲＢ１
いくつかの態様では、本開示は、ＩＣＯＳＬＧの下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＩＣＯＳＬＧのＡＤＧＲＢ１への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＩＣＯＳＬＧをＡＤＧＲＢ１と接触させることと、（ｃ）ＩＣＯＳＬＧの下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＩＣＯＳＬＧの下流活性のモジュレーターとして同定する、ＩＣＯＳＬＧの下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。

【0245】

いくつかの態様では、本開示は、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供することと、（ｂ）ＡＤＧＲＢ１のＩＣＯＳＬＧへの結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＡＤＧＲＢ１をＩＣＯＳＬＧと接触させることと、（ｃ）ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化により、候補モジュレーターを、ＡＤＧＲＢ１の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＡＤＧＲＢ１の下流活性を測定することと、を含む、方法特徴とする。いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又はＥＬＩＳＡによって測定した場合に、少なくとも７０％である。

【0246】

ｖｉ．下流活性における変化のアッセイ
いくつかの態様では、候補モジュレーターは、少なくとも０．１ ｎＭ、０．５ ｎＭ、１ ｎＭ、１０ ｎＭ、５０ ｎＭ、１００ ｎＭ、２５０ ｎＭ、５００ ｎＭ、７５０ ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、又は１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、０．１ ｎＭ～１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、例えば、図４Ｆのように、ある範囲の濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、溶液中で、例えば可溶性の形態で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、表１のタンパク質と表２のタンパク質を含む生物に、表１のタンパク質と表２のタンパク質を含む組織に、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に、細胞培養培地に、馴化培地に、及び／又は表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の精製された形態に提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、表５のタンパク質と表６のタンパク質を含む生物に、表５のタンパク質と表６のタンパク質を含む組織に、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に、細胞培養培地に、馴化培地に、及び／又は表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の精製された形態に提供される。

【0247】

いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の活性剤である。いくつかの態様では、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の増加が少なくとも３０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、モジュレーターは、表５又は表６のタンパク質の下流活性の活性剤である。いくつかの態様では、表５のタンパク質又は表６のタンパク質の下流活性の増加が少なくとも３０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、下流活性の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％超（例えば、少なくとも５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）である。いくつかの態様では、下流活性の増加は少なくとも３０％である。いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である。

【0248】

いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の阻害剤である。いくつかの態様では、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の減少が少なくとも３０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、モジュレーターは、表５又は表６のタンパク質の下流活性の阻害剤である。いくつかの態様では、表５のタンパク質又は表６のタンパク質の下流活性の減少が少なくとも３０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、下流活性の減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％（例えば、少なくとも５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）である。いくつかの態様では、下流活性の減少は少なくとも３０％である。いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である。

【0249】

いくつかの態様では、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性は、１つ以上のアッセイにおいて評価される。いくつかの態様では、表５のタンパク質又は表６のタンパク質の下流活性は、１つ以上のアッセイにおいて評価される。

【0250】

いくつかの態様では、下流活性は、疾患、例えば癌の発症又は進行に関連する活性である。

【0251】

いくつかの態様では、下流活性は腫瘍成長である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＲＲＣ１５であり、表２のタンパク質はＴＥＭ１であり、下流活性は腫瘍成長である。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％（例えば、少なくとも１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイにおいて測定した場合に、モジュレーターの存在下において少なくとも２０％減少する。

【0252】

いくつかの態様では、表５のタンパク質はＡＤＧＲＢであり、表２のタンパク質はＰＤ－Ｌ１であり、下流活性は腫瘍成長である。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイで測定した場合に、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％（例えば、少なくとも１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する。いくつかの態様では、腫瘍成長は、腫瘍成長アッセイにおいて測定した場合に、モジュレーターの存在下において少なくとも２０％減少する。

【0253】

いくつかの態様では、表５のタンパク質はＡＤＧＲＢであり、表２のタンパク質はＰＤ－Ｌ１であり、下流活性は細菌細胞又はアポトーシス細胞の貪食である。いくつかの態様では、貪食の速度は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％（例えば、少なくとも１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）増加する。

【0254】

いくつかの態様では、表５のタンパク質はＡＤＧＲＢであり、表２のタンパク質はＩＣＯＳＬＧであり、下流活性はＴ細胞活性化である。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％（例えば、少なくとも１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）増加する。いくつかの態様では、Ｔ細胞活性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも２０％増加する。

【0255】

Ｃ．小分子
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは小分子である。小分子は、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質、又は表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質に、好ましくは特異的に結合し得る、本明細書で定義される結合ポリペプチド又は抗体以外の分子である。結合する小分子は、既知の方法論を使用して同定され、化学的に合成され得る（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照）。結合する小分子のサイズは、通常約２０００ダルトン未満（例えば、サイズが約２０００、１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満）であり、ここで、本明細書に記載のポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、既知の技術を使用して、過度の実験をすることなく同定され得る。この点については、ポリペプチド標的に結合することができる分子について小分子ライブラリをスクリーニングするための技術が当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照）。結合小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ－置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。

【0256】

いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0257】

いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0258】

Ｄ．抗体及び抗原結合フラグメント
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗原結合フラグメントは、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表１のタンパク質に結合する。他の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表２のタンパク質に結合する。

【0259】

いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性）は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0260】

いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗原結合フラグメントは、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表５のタンパク質に結合する。他の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表６のタンパク質に結合する。

【0261】

いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性）は、抗体又は抗原結合フラグメントの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0262】

Ｅ．ペプチド
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質に結合するペプチドである。ペプチドは、天然に存在するペプチドであり得るか、又は操作され得るペプチドであり得る。いくつかの態様では、ペプチドは、表１のタンパク質、表２のタンパク質、又は表１のタンパク質若しくは表２のタンパク質に結合する別のタンパク質のフラグメントである。ペプチドは、完全長タンパク質と等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。いくつかの態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行する。他の態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行するわけではない。

【0263】

いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0264】

いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質に結合するペプチドである。ペプチドは、天然に存在するペプチドであり得るか、又は操作され得るペプチドであり得る。いくつかの態様では、ペプチドは、表５のタンパク質、表６のタンパク質、又は表５のタンパク質若しくは表６のタンパク質に結合する別のタンパク質のフラグメントである。ペプチドは、完全長タンパク質と等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。いくつかの態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行する。他の態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行するわけではない。

【0265】

いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0266】

Ｆ．模倣物
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質に結合する模倣物、例えば、分子模倣物である。模倣物は、表１のタンパク質、表２のタンパク質、又は表１のタンパク質若しくは表２のタンパク質に結合する別のタンパク質の分子模倣物であり得る。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。

【0267】

いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0268】

いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質に結合する模倣物、例えば、分子模倣物である。模倣物は、表５のタンパク質、表６のタンパク質、又は表５のタンパク質若しくは表６のタンパク質に結合する別のタンパク質の分子模倣物であり得る。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。

【0269】

いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質と表６のタンパク質との結合は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％）減少する）。いくつかの態様では、表５のタンパク質及び／又は表６のタンパク質の下流活性は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は１００％超）増加する）。

【0270】

Ｖ．同定されたタンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーターを含む処置方法
いくつかの態様では、本明細書に記載されるタンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーターは、病的状態、疾患、障害、又は症状、例えば、癌を処置する又はその進行を遅延させるために使用される。

【0271】

いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターが投与された個体におけるタンパク質－タンパク質相互作用の下流活性、例えば腫瘍形成又は腫瘍成長の量、強度又は持続時間を増加又は減少させる。

【0272】

Ａ．癌
いくつかの態様では、本明細書に記載のタンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーター（例えば、ＬＲＲＣ１５とＴＥＭ１との間の相互作用のモジュレーター；ＰＤ－Ｌ１とＡＤＧＲＢ１との間の相互作用のモジュレーター；又はＡＤＧＲＢ１とＩＣＯＳＬＧとの間の相互作用のモジュレーター）、例えば、小分子、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡを使用して、それを必要とする対象の癌を処置するか、又は癌の進行を遅延させる。いくつかの態様では、対象はヒトである。癌は、固形腫瘍癌又は非固形腫瘍癌であり得る。固形癌腫瘍には、限定されないが、膀胱癌、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、若しくは前立腺癌、又はそれらの転移型が含まれる。いくつかの態様では、癌は膀胱癌である。膀胱癌の更なる態様には、尿路上皮癌、筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）、又は筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）が含まれる。いくつかの態様では、膀胱癌は転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）である。いくつかの態様では、癌は乳癌である。乳癌の更なる態様には、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）乳癌、例えば、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳癌、プロゲステロン受容体陽性（ＰＲ＋）乳癌、又はＥＲ＋／ＰＲ＋乳癌が含まれる。乳癌の他の態様には、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）乳癌が含まれる。乳癌の更に他の態様には、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）が含まれる。いくつかの態様では、乳癌は早期乳癌である。いくつかの態様では、癌は肺癌である。肺癌の更なる態様には、上皮成長因子受容体陽性（ＥＧＦＲ＋）肺癌が含まれる。肺癌の他の態様には、上皮成長因子受容体陰性（ＥＧＦＲ－）肺癌が含まれる。肺癌の更に他の態様には、非小細胞肺癌、例えば、扁平上皮肺癌又は非扁平上皮肺癌が含まれる。肺癌の他の態様には、小細胞肺癌が含まれる。いくつかの態様では、癌は頭頸部癌である。頭頸部癌の更なる態様は、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）が含まれる。いくつかの態様では、癌は腎臓癌である。腎臓癌の更なる態様には、腎細胞癌（ＲＣＣ）が含まれる。いくつかの態様では、癌は肝癌である。肝癌の更なる態様には、肝細胞癌が含まれる。いくつかの態様では、癌は前立腺癌である。前立腺癌の更なる態様には、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）が含まれる。いくつかの態様では、癌は固形腫瘍の転移型である。いくつかの態様では、固形腫瘍の転移型は、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌の転移型である。いくつかの態様では、癌は転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）である。いくつかの態様では、癌は非固形腫瘍癌である。非固形腫瘍癌には、限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫が含まれる。Ｂ細胞リンパ腫の更なる態様には、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は菌状息肉症（ＭＦ）が含まれる。

【0273】

Ｂ．併用療法
上記の処置及び予防方法のいくつかの態様では、本方法は、個体に少なくとも１つの追加の治療（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は４つを超える追加の療法）を投与することを含む。モジュレーターは、少なくとも１つの追加の治療の前、同時に、又は後に個体に投与され得る。

【0274】

Ｃ．送達方法
本明細書に記載の方法において利用される組成物（例えば、本明細書に記載のタンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーター、例えば、小分子、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ）は任意の適切な方法で投与することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮的、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所的、腫瘍内、腹膜、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、眼窩内、経口的、経皮的、硝子体内（例えば、硝子体内注射による）、点眼による、吸入による、注射による、移植による、注入による、連続的注入による、局所灌流浴標的細胞により直接、カテーテルによる、灌流による、クリーム中、又は脂質組成物中が含まれる。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、全身的又は局所的に投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物又は組成物、及び処置される症状、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。いくつかの態様では、タンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーターは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口で、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に投与される。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが企図される。

【0275】

本明細書に記載されるタンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーター（及び任意の追加の治療剤）は、良好な医学的実践と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与され得る。この文脈で考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に公知である他の要因が挙げられる。モジュレーターは、必要ではないが、任意に、問題の障害を予防又は処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化され、及び／又は同時に投与される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するモジュレーターの量、障害又は処置のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同投与量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投与量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投与量及び任意の経路で使用される。

【0276】

ＶＩ．変化した結合プロファイルを有する生物学的小胞を同定する方法
いくつかの態様では、本開示は、変化した結合プロファイルを有する生物学的小胞（ＢＶ）を同定する方法であって、（ａ）１つ以上の固体表面上に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供ことと、（ｂ）工程（ａ）の集合物を目的のＢＶと接触させることと、（ｃ）目的のＢＶと少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それにより、相互作用プロファイルを同定することと、（ｄ）目的ＢＶの相互作用プロファイルを対照ＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、目的ＢＶの相互作用プロファイルと対照ＢＶの相互作用プロファイルとの間の差により、目的のＢＶを、変化した結合プロファイルを有するものとして同定する、目的ＢＶの相互作用プロファイルを対照ＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0277】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質のうちの、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％、例えば、表４のタンパク質のうちの５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５５、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％の細胞外ドメインを含む。

【0278】

いくつかの態様では、ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質のうちの少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表４のポリペプチドのうちの１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１０５０、１０５０～１１００、１１００～１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含む。

【0279】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも５０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも７５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも９０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の全ての細胞外ドメインを含む。

【0280】

いくつかの態様では、プレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメインは、天然のコンホメーション、例えば、野生型タンパク質において観察されるコンホメーションを有する。いくつかの態様では、プレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメインは、天然の翻訳後修飾を含む。

【0281】

いくつかの態様では、目的のＢＶは、操作されたＢＶ、例えば、改変された親細胞（例えば、異種タンパク質、例えば受容体を発現するように改変されたもの）に由来するＢＶである。対照ＢＶは、例えば、対照プロセスによって産生されたＢＶ又は未改変の親細胞に由来するＢＶであり得る。

【0282】

いくつかの態様では、ＢＶは薬物送達ビヒクルとして使用するためのＢＶである。対照ＢＶは、例えば、薬物送達ビヒクルの所望の特性を有するＢＶであり得る。いくつかの態様では、本方法は、例えばＥＶの結合プロファイルの予想外の変化（例えば、標的受容体の過剰発現、治療薬の添加、又はＥＶを生成する細胞の改変から生じる変化）を検出するための品質管理に使用される。

【0283】

いくつかの態様では、目的のＢＶは、対象からの試料に由来する。いくつかの態様では、本方法は、対象からの試料からのＥＶの受容体の不偏プロファイリングに使用される（例えば、異なる組織、細胞型、腫瘍細胞株、又は免疫細胞によって産生されたＥＶの比較に使用される）。いくつかの態様では、目的のＢＶ及び対照ＢＶは、異なる組織又は異なる細胞型に由来する。いくつかの態様では、目的のＢＶは疾患組織（例えば、腫瘍組織）に由来し、対照ＢＶは健康な組織に由来する。

【0284】

ＶＩＩ．細胞株の相互作用プロファイルを特徴付ける方法
Ａ．細胞株の相互作用プロファイルを特徴付ける方法
いくつかの態様では、本開示は、細胞株の相互作用プロファイルを特徴付けるための方法であって、（ａ）細胞株を、膜出芽物質を含むように改変することと、（ｂ）細胞株によって生成された生物学的小胞（ＢＶ）の相互作用プロファイルを特徴付けることと、を含む、方法を特徴とする。

【0285】

いくつかの態様では、本開示は、膜出芽物質を含むように改変された細胞株の相互作用プロファイルを特徴付けるための方法であって、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることを含む、方を特徴とする。

【0286】

いくつかの態様では、細胞株は哺乳動物細胞株であり得る。いくつかの態様では、哺乳動物細胞株は、ニューロン細胞株、線維芽細胞株、又は免疫細胞株である。いくつかの態様では、免疫細胞株は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は単球（例えば、Ｔ細胞からなる、又はＢ細胞からなる、又は単球からなる）のうちの１つ以上を含み、例えばＴ細胞株、Ｂ細胞株、又は単球細胞株である。

【0287】

いくつかの態様では、細胞株は、目的の組織型（例えば、疾患組織型又は健康な組織型）若しくは目的の細胞型を表す（例えば、それに由来する）哺乳動物細胞株、又は目的の腫瘍を表す（例えば、それに由来する）細胞株（例えば、腫瘍細胞株）である。いくつかの態様では、細胞株（例えば、哺乳動物細胞株）は、対象、例えば疾患を有する対象からの試料に由来する。

【0288】

例示的な膜出芽物質は、本明細書のセクションＩＩＩ（Ｃ）に提供されている。いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。いくつかの態様では、細胞株における膜出芽物質の発現は誘導可能である。細胞株に導入され得る膜出芽物質の誘導性発現のための例示的なコンストラクトとしては、（ａ）小分子（例えば、細胞透過性小分子）、例えばＴ－ＲＥＸ（商標）システムの添加後に膜出芽物質の発現を緩和又は抑制する誘導性プロモーター；（ｂ）誘導時に速やかに分解される小分子誘導分解システム（例えば、ＴＩＲ１オーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）システム）；及び（ｃ）膜出芽物質が分解ドメインを含み、タンパク質が誘導時に分解から保護される、小分子誘導安定化システム（例えば、Ｓｈｉｅｌｄ－１－ＦＫＢＰシステム）が挙げられる。コンストラクトの統合は、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はゲノム工学技術を使用してコンストラクトをセーフハーバー遺伝子座に挿入することによって行うことができる。あるいは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステム（ＳＢＩ）などのランダム積分の方法を使用することができる。細胞株における膜出芽物質の発現は、任意の所望の時点で誘導され得るため、細胞株でのＢＶの産生は、任意の時点で誘導され得る。

【0289】

いくつかの態様では、ＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることは、ＢＶ上の１つ以上の目的の膜結合タンパク質（例えば、１つ以上の目的の受容体）のレベルを決定することを含む。

【0290】

いくつかの態様では、ＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることは、（ａ）１つ以上の固体表面上に固定化された標的ポリペプチドの集合体を提供ことと、（ｂ）工程（ａ）の集合物を目的のＢＶと接触させることと、（ｃ）ＢＶと標的ポリペプチドの集合体の少なくとも１つの標的ポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それにより相互作用プロファイルを同定することと、を含む方法によって実施される。

【0291】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質のうちの、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％、例えば、表４のタンパク質のうちの５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％の細胞外ドメインを含む。

【0292】

いくつかの態様では、ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質のうちの少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表４のポリペプチドのうちの１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１０５０、１０５０～１１００、１１００～１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含む。

【0293】

いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも２５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも５０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも７５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の少なくとも９０％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、標的ポリペプチドの集合体は、表４のタンパク質の全ての細胞外ドメインを含む。

【0294】

いくつかの態様では、プレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメインは、天然のコンホメーション、例えば、野生型タンパク質において観察されるコンホメーションを有する。いくつかの態様では、プレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメインは、天然の翻訳後修飾を含む。

【0295】

いくつかの態様では、本方法は、ＢＶの細胞質タンパク質プロファイルを特徴付けることを更に含む（例えば、ＢＶの内腔に存在するタンパク質を特徴付けることを含む）。

【0296】

Ｂ．細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定する方法
いくつかの態様では、本開示は、細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定するための方法であって、（ａ）細胞株を、膜出芽物質を含むように改変することと、（ｂ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｄ）第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの間の差により、細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定する、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0297】

いくつかの態様では、本開示は、膜出芽物質を含むように改変された細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定するための方法であって、（ａ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｂ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの間の差により、細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定する、第１の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の時点で生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0298】

いくつかの態様では、本方法は、第１の時点の後かつ第２の時点の前に細胞株を刺激に曝露することを含み、したがって、この方法を使用して、刺激への曝露の結果として生じる細胞株の相互作用プロファイルの変化を同定することができる。刺激は、例えば、シグナル伝達を誘導する条件若しくは作用因子、疾患関連状態を誘導する条件若しくは作用因子、及び／又は分化を誘導する条件若しくは作用因子であり得る。いくつかの態様では、細胞株は免疫細胞株であり、疾患関連状態は免疫疲弊である。

【0299】

他の態様では、本方法は、細胞株を刺激に曝露することを含まない。例えば、いくつかの態様では、第１の時点及び第２の時点は、細胞株の分化中に異なる段階にあるように選択されるか、又は第１の時点及び第２の時点で産生されたＢＶを評価して、細胞株が時点間で分化したかどうかを判定する。

【0300】

いくつかの態様では、本方法は、１つ以上の追加の時点、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０を超える追加の時点で細胞株によって産生されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることを更に含む。いくつかの態様では、方法は、第２の時点の後に細胞株を刺激に曝露すること、例えば、１つ以上の追加の時点の前に細胞株を刺激に曝露することを含む。

【0301】

細胞株は哺乳動物細胞株であり得る。いくつかの態様では、哺乳動物細胞株は、ニューロン細胞株、線維芽細胞株、又は免疫細胞株である。いくつかの態様では、免疫細胞株は、１つ以上のＴ細胞、Ｂ細胞、又は単球（例えば、Ｔ細胞からなる、又はＢ細胞からなる、又は単球からなる）のうちの１つ以上を含み、例えばＴ細胞株、Ｂ細胞株、又は単球細胞株である。

【0302】

いくつかの態様では、細胞株は、目的の組織型（例えば、疾患組織型又は健康な組織型）若しくは目的の細胞型を表す（例えば、それに由来する）哺乳動物細胞株、又は目的の腫瘍を表す（例えば、それに由来する）細胞株（例えば、腫瘍細胞株）である。いくつかの態様では、細胞株（例えば、哺乳動物細胞株）は、対象、例えば疾患を有する対象からの試料に由来する。

【0303】

例示的な膜出芽物質は、本明細書のセクションＩＩＩ（Ｃ）に提供されている。いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。いくつかの態様では、細胞株における膜出芽物質の発現は誘導可能である。例示的な膜出芽物質は、本明細書のセクションＩＩＩ（Ｃ）に提供され、例示的な誘導性コンストラクトは、上記のセクションＶＩＩ（Ａ）に記載されている。親細胞株における膜出芽物質の発現、したがって親細胞株によるＢＶの産生は、任意の所望の時点で誘導され得る。例えば、いくつかの態様では、膜出芽物質の発現は、第１の時点、第２の時点、及び任意に１つ以上の追加の時点で誘導される。いくつかの態様では、膜出芽物質の発現は、第１の時点と第２の時点との間の区間において誘導されず、例えば、膜出芽物質は、第１の時点と第２の時点との間の区間において発現されない。

【0304】

いくつかの態様では、第１の時点で細胞株によって産生されたＢＶ及び第２の時点で細胞株によって産生されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることは、上記のセクションＶＩＩ（Ａ）に記載されているように、各ＢＶ上の１つ以上の目的の膜結合タンパク質（例えば、１つ以上の目的の受容体）のレベルを決定することを含む。

【0305】

いくつかの態様では、本方法は、第１の時点で細胞株によって産生されたＢＶ及び第２の時点で細胞株によって産生されたＢＶの細胞質タンパク質プロファイルを特徴付けることを更に含む（例えば、第１の時点で細胞株によって産生されたＢＶ及び第２の時点で細胞株によって産生されたＢＶの内腔に存在するタンパク質を特徴付けることを含む）。

【0306】

Ｃ．細胞株の相互作用プロファイルを比較する方法
いくつかの態様では、本開示は、２つの細胞株の相互作用プロファイルの差を同定するための方法であって、（ａ）細胞株の各々を、膜出芽物質を含むように改変することと、（ｂ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｄ）第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの差により、２つの細胞株の表面タンパク質プロファイルの差を同定する、第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0307】

いくつかの態様では、本開示は、膜出芽物質を含むように改変された２つの細胞株の相互作用プロファイルの差を同定するための方法であって、（ａ）第１の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｂ）第２の時点において、細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることと、（ｃ）第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することであって、第１の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルとの差により、２つの細胞株の表面タンパク質プロファイルの差を同定する、第１の細胞株で生成されたＢＶの相互作用プロファイルを、第２の細胞株によって生成されたＢＶの相互作用プロファイルと比較することと、を含む、方法を特徴とする。

【0308】

いくつかの態様では、第１の細胞株及び第２の細胞株は哺乳動物細胞株である。いくつかの態様では、第１の細胞株によって産生されるＢＶ及び第２の細胞株によって産生されるＢＶは、異なる組織又は異なる細胞型に由来する。いくつかの態様では、第１の細胞株によって産生されるＢＶは疾患組織（例えば、腫瘍組織）に由来し、第２の細胞株によって産生されるＢＶは健康な組織に由来する。

【0309】

例示的な膜出芽物質は、本明細書のセクションＩＩＩ（Ｃ）に提供されている。いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。いくつかの態様では、細胞株における膜出芽物質の発現は誘導可能である。例示的な膜出芽物質は、本明細書のセクションＩＩＩ（Ｃ）に提供され、例示的な誘導性コンストラクトは、上記のセクションＶＩＩ（Ａ）に記載されている。

【0310】

いくつかの態様では、第１の時点で細胞株によって産生されたＢＶ及び第２の時点で細胞株によって産生されたＢＶの相互作用プロファイルを特徴付けることは、上記のセクションＶＩＩ（Ａ）に記載されているように、各ＢＶ上の１つ以上の目的の膜結合タンパク質（例えば、１つ以上の目的の受容体）のレベルを決定することを含む。

【0311】

いくつかの態様では、本方法は、第１の時点で細胞株によって産生されたＢＶ及び第２の時点で細胞株によって産生されたＢＶの細胞質タンパク質プロファイルを特徴付けることを更に含む。

【0312】

別の態様では、本開示は、異種膜出芽物質を含むＢＶであって、（ｉ）誘導可能な制御下で膜出芽物質を発現するように改変された親細胞株を提供することと、（ｉｉ）膜出芽物質の発現を誘導することと、（ｉｉｉ）親細胞株からＢＶを単離することと、を含む方法によって生成される、ＢＶを特徴とする。いくつかの態様では、膜出芽物質は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６からなる群から選択される。いくつかの態様では、膜出芽物質はＨＩＶ ｇａｇタンパク質である。いくつかの態様では、細胞株は親細胞株である。いくつかの態様では、ＢＶは細胞外小胞（ＥＶ）である。

【0313】

ＶＩＩＩ．生物学的小胞を使用して膜タンパク質活性を評価する方法
いくつかの態様では、本開示は、膜結合タンパク質の酵素活性を評価するための方法であって、タンパク質を含む生物学的小胞（ＢＶ）に対する酵素活性についてのアッセイを行うことを含む、方法を特徴とする。

【0314】

例示的なＢＶは、本明細書のセクションＩＩＩ（Ｂ）に記載されている。いくつかの態様では、膜結合タンパク質は、ＢＶ及び／又はその親細胞に対して内因性であり、すなわち、内因性膜結合タンパク質の酵素活性は、本方法を使用して評価される。

【0315】

他の態様では、ＢＶ膜結合タンパク質は、ＢＶの外面に存在する異種膜結合タンパク質であり、すなわち、異種膜結合タンパク質の酵素活性は、本方法を使用して評価される。異種膜結合タンパク質を含むＢＶは、本明細書のセクションＩＩに記載されている。

【0316】

いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は完全長タンパク質である。他の態様では、異種膜結合タンパク質はタンパク質フラグメントである。いくつかの態様では、異種膜結合タンパク質は、タンパク質フラグメント、タグ、及びアンカー（例えば、タンパク質フラグメントをＢＶの膜の表面に繋ぎ止めるアンカー、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチド）を含む。

【0317】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はペプチダーゼであり、酵素活性についてのアッセイは、ペプチダーゼ活性についてのアッセイ、例えば、ペプチダーゼの１つ以上の公知の又は推定される基質の分解についてのアッセイである。

【0318】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はプロテアーゼであり、酵素活性についてのアッセイは、プロテアーゼ活性についてのアッセイ、例えば、プロテアーゼの１つ以上の公知の又は推定される基質の分解についてのアッセイである。

【0319】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はキナーゼであり、酵素活性についてのアッセイは、キナーゼ活性についてのアッセイ、例えば、キナーゼの１つ以上の公知の又は推定される基質の分解についてのアッセイである。

【0320】

いくつかの態様では、膜結合タンパク質はホスファターゼであり、酵素活性についてのアッセイは、ホスファターゼ活性についてのアッセイ、例えば、ホスファターゼの１つ以上の公知の又は推定される基質の分解についてのアッセイである。

【0321】

ＩＸ．生物学的小胞の精製方法
いくつかの態様では、本開示は、培養培地（例えば、液体培地）又は対象からの試料（例えば、液体試料、例えば、尿試料、血液試料、又は消化組織試料）から生物学的小胞（ＢＶ）を精製する方法であって、ＢＶ（例えば、培養培地中のＢＶ）を、表８又は表９の包括的小胞結合剤タンパク質のうちの１つ以上を含む固体表面と接触させることを含む方法を特徴とする。

【表8】

【表9】

【0322】

例示的なＢＶは、本明細書のセクションＩＩＩ（Ｂ）に記載されている。ＢＶは、本明細書のセクションＩＩに記載されているように、未改変ＢＶであってもよく、又は外因性タンパク質（例えば、異種膜結合タンパク質、例えば、完全長異種膜結合タンパク質、又はタンパク質フラグメント、タグ及びアンカーを含む異種膜結合タンパク質）を含み得る。いくつかの態様では、ＢＶは膜出芽物質を含み、（ｉ）膜出芽物質を発現するように改変された親細胞を提供することと、（ｉｉ）親細胞からＢＶを単離することと、を含む方法によって産生される。

【0323】

固体表面は、親和性精製に適した任意の固定表面、例えば、カラム（例えば、プロテインＡ官能化ビーズを含むカラム）、ビーズ、平面又はプレートであり得る。

【0324】

固体表面は、任意の適切な方法を使用して、表８又は表９のタンパク質のうちの１つ以上を含むように修飾され得る。いくつかの態様では、固体表面は、表８又は表９の１つ以上のタンパク質に対して親和性を有する部分を含み、固体表面は、表８又は表９の１つ以上のタンパク質と接触し（例えば、それによって洗浄され）、したがって、表８又は表９の１つ以上のタンパク質を固体表面上に固定化する。表８又は表９の１つ以上のタンパク質は、部分（例えば、タグ）を含むように修飾されてもよく、固体表面に含まれる部分の親和性は、その部分又はタグに対するものであってもよい。例えば、一態様では、固体表面はプロテインＡを含み、表８又は表９の１つ以上のタンパク質はＦｃ領域を含むように改変されている。

【0325】

いくつかの態様では、固体表面は、表８又は表９の単一タンパク質を含む。いくつかの態様では、固体表面は、ＨＡＶＣＲ１、ＭＡＧ、ＴＩＭＤ４、ＳＩＧＬＥＣ７、ＣＤ３００ＬＦ、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ８、又はＣＤ３００ＬＧを含む。いくつかの態様では、固体表面は、ＨＡＶＣＲ１を含む。いくつかの態様では、固体表面はＭＡＧを含む。いくつかの態様では、固体表面はＳＩＧＬＥＣ７を含む。いくつかの態様では、固体表面はＣＤ３００ＬＦを含む。いくつかの態様では、固体表面は、ＨＡＶＣＲ１、ＭＡＧ、ＴＩＭＤ４、ＳＩＧＬＥＣ７、ＣＤ３００ＬＦ、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＧＬＥＣ９、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ８及びＣＤ３００ＬＧの２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個全てを含む。

【0326】

いくつかの態様では、固体表面は、表８又は表９の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２５個を超えるタンパク質を含み、例えば、表８又は表９のタンパク質のうちの２～５、５～１０、１０～１５、１５～２０又は２０～２５個を含む。いくつかの態様では、固体表面は、表８又は表９のタンパク質のうちの２個を含む。いくつかの態様では、固体表面は、表８又は表９のタンパク質のうちの３個を含む。いくつかの態様では、固体表面は、表８又は表９のタンパク質のうちの４個を含む。いくつかの態様では、固体表面は、表８又は表９のタンパク質のうちの５個を含む。

【0327】

いくつかの態様では、表８又は表９のタンパク質のうちの１つ以上はヒトタンパク質である。いくつかの態様では、ＢＶはヒト細胞に由来する。

【0328】

いくつかの態様では、ＢＶを固体表面と接触させることは、固体表面にＢＶを含む培養培地又は対象からの試料（例えば、液体試料、例えば、尿試料、血液試料、又は消化組織試料）を流すことを含む。いくつかの態様では、培養培地は馴化培地である。いくつかの態様では、培養培地又は試料は、ＢＶが産生された１つ以上の親細胞を含む。他の態様では、培養培地又は試料は親細胞を含まず、例えば、親細胞を除去するように処理されている。

【0329】

いくつかの態様では、方法は、固体表面からＢＶを脱離すること（例えば、溶出）を更に含む。ＢＶは、固体表面からＢＶを脱離するのに適した任意の方法を使用して溶出され得る。例えば、洗浄（例えば、過酷な洗浄、例えば高塩洗浄）及び／又は適切なリガンドを使用してＥＶを脱離してもよい。例えば、いくつかの態様では、表８又は表９の１つ以上のタンパク質は、タンパク質のＳＩＧＬＥＣファミリーのメンバーを含み、１つ以上のシアロ糖鎖が溶出に使用される。

【0330】

いくつかの態様では、固体表面はプロテインＡ官能化ビーズを含むカラムであり、本方法は、表８又は表９の１つ以上のタンパク質を含む馴化培地をカラムに流すことであって、表８又は表９のタンパク質のうちの１つ以上はＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ領域）を含むように改変されている、表８又は表９の１つ以上のタンパク質を含む馴化培地をカラムに流すことと、そのようにして表８又は表９の１つ以上のタンパク質を固定化することと、培養培地又はＢＶを含む対象からの試料をカラムに流すこと、及びにカラムからＢＶを溶出させることと、を含む。

【0331】

いくつかの態様では、本方法は、超遠心分離に基づく浄化工程を含む。他の態様では、本方法は超遠心分離を含まない。

【0332】

いくつかの態様では、本方法はＢＶの大規模精製に使用される。いくつかの態様では、本方法は、少なくとも１０ｍＬの試料体積を使用して行われ、すなわち、少なくとも１０ｍＬの培養培地又は対象からの試料が本方法に従って処理される。例えば、いくつかの態様では、本方法は、少なくとも１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、５０ｍＬ、５５ｍＬ、６０ｍＬ、６５ｍＬ、７０ｍＬ、７５ｍＬ、８０ｍＬ、８５ｍＬ、９０ｍＬ、９５ｍＬ又は１００ｍＬの試料体積を用いて実施される（例えば、１０～２０ｍＬ、２０～３０ｍＬ、３０～４０ｍＬ、４０～５０ｍＬ、５０～６０ｍＬ、６０～７０ｍＬ、７０～８０ｍＬ、８０～９０ｍＬ又は９０～１００ｍＬの試料体積を用いて実施される）。いくつかの態様では、本方法は、少なくとも５０ｍＬの試料体積を用いて実施される。いくつかの態様では、本方法は、少なくとも１００ｍＬの試料体積を用いて実施される。例えば、いくつかの態様では、本方法は、少なくとも１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬ、５５０ｍＬ、６００ｍＬ、６５０ｍＬ、７００ｍＬ、７５０ｍＬ、８００ｍＬ、８５０ｍＬ、９００ｍＬ、９５０ｍＬ又は１Ｌの試料体積を用いて実施される（例えば、１００～２００ｍＬ、２００～３００ｍＬ、３００～４００ｍＬ、４００～５００ｍＬ、５００～６００ｍＬ、６００～７００ｍＬ、７００～８００ｍＬ、８００～９００ｍＬ又は９００ｍＬ～１Ｌの試料体積を用いて実施される）。

【0333】

これらの方法に従って精製されたＢＶは、本明細書に記載の方法のいずれかで使用され得る。

【0334】

本明細書で引用された全ての特許、特許公報及び参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0335】

Ｘ．実施例
実施例１．膜における細胞外タンパク質－タンパク質相互作用を検出するための細胞外小胞ベースのスクリーニング
Ａ．背景
膜タンパク質は、細胞外キューを細胞内応答に変換するのに不可欠な役割を果たす。それらの細胞表面曝露は、治療分子へのアクセス可能性を増加させ、細胞挙動を調整する能力は、それらを魅力的な薬物標的にする。したがって、それらがヒト遺伝子の約３０％を占めるにすぎないが、それらが全ての薬物標的の６０％超を占めることは驚くべきことではない（Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，１６：９－３４，２０１６．）。

【0336】

したがって、受容体－リガンド相互作用の同定は、細胞外環境で起こる細胞コミュニケーションを理解するのに役立つ。しかしながら、膜タンパク質及びそれらの相互作用パートナーの特性評価の進歩は、細胞質タンパク質のそれに大きく遅れをとっている。これは、一部には、膜タンパク質をそれらの天然の立体配座で発現させることが困難であること、及び膜タンパク質に一般的な弱い相互作用を検出するのに十分な感度を有する技術が欠如していることに起因する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ，２０１７：２１９７６１５，２０１７；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．５：１４０５－１４１２，２００９）。一般的なタンパク質－タンパク質相互作用の発見のために設計された方法は、ウェルフォールディング精製タンパク質（例えば、マイクロアレイ又はプレートベースのスクリーニング方法（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ，２０１７：２１９７６１５，２０１７；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ，，３８：９１９－９２２，２０１０））、又は膜からのタンパク質の抽出及び洗浄に耐えることができる強い相互作用（例えば、アフィニティー精製－質量分析（ＡＰ／ＭＳ）（Ｈｕｔｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０１．１９．９０５１０９，２０２０））のいずれかを必要とする。いくつかのより新しいアプローチは、弱い相互作用を強化するために多量体化を使用することによって多くの膜タンパク質相互作用を捕捉することができたが（Ｂｕｓｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１８：６２２－６３０，２００８；Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８：２３１０－２３２３，２０１９）、タンパク質はそれらの天然の膜状況から除去されるので、それらは依然として重要な相互作用を見逃す可能性がある。

【0337】

生理学的膜は、相互作用に関与することができる脂質、ステロール、タンパク質及びグリカンの複雑な混合物を含む（Ｇｏｎｉｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ－Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．，１８３８：１４６７－１４７６，２０１４）。さらに、膜は、クラスター化及び配向によって個々に弱いタンパク質－タンパク質相互作用を強化することができる（Ｂａｎｊａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，３：１－２４，２０１４；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６９：１０８－１１９ｅ．２０，２０１７；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１０：１５２８３－１５２８８，２０１３）。受容体－リガンド相互作用のこれらの膜依存的態様は、スクリーニング方法の開発における大きな障害のままである。最近の近接に基づく技術の進歩は、膜中の相互作用の検出を可能にし、一過性結合剤の研究に役立っている（Ｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６７：１０９１－１０９７，２０２０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８０：３７３－３８６．ｅ１５，２０２０，Ｇｉｎｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４８：５５－５４，２０１９）。しかしながら、これらの技術は、直接相互作用パートナーを近くのバイスタンダーと区別するのに苦労することが多く、典型的には、同じ細胞内の結合パートナー（イン－シス相互作用）に焦点を合わせ、ハイスループット研究とは適合しないことが多い。ナノディスク及びリポソーム粒子などの代替アプローチは、膜タンパク質の再構成を可能にし、困難な受容体を研究するために首尾よく使用されている（Ｒｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５９１：２０５７－２０８８，２０１７；Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１３２：２０１９）。しかしながら、これらの方法は、天然の折畳みを破壊し得、潜在的なタンパク質又は非タンパク質補因子をほとんど説明し得ないタンパク質精製を必要とする。結果として、細胞外タンパク質クロストークは、既存のデータセットにおいて著しく過小表示されたままである（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３８：９１９－９２２，２０１０；Ｂａｕｓｃｈ－Ｆｌｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０１８）。これらの制限は、膜タンパク質の研究のために特別に設計された追加の技術の必要性を強調し、受容体インタラクトームの特徴付けのための十分なスループット及び感度を有する。

【0338】

膜内受容体ディスプレイ法の必要性は、エンベロープウイルスからの機構を利用して受容体を哺乳動物膜に組み込むいくつかの解決策を加速させた。例えば、異なる膜タンパク質を提示する単純ヘルペスビリオン（ＶｉｒＤ）からなるマイクロアレイは、リガンド発見のためのＧＰＣＲライブラリとして首尾よく使用されているＨｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１０：１５２８３－１５２８８，２０１３；Ｄａ Ｓｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０：１－１２，２０１９．）。さらに、組換え細胞外小胞（ｒＥＶ）と呼ばれるＨＩＶ ｇａｇタンパク質を含有する細胞外小胞は、免疫化及び抗体生成（Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１５：Ｅ４９９０－Ｅ４９９９，２０１８）、並びに抗体選択及びリガンド結合特性評価（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：６９８８－６９９０，２００８）のための多重膜貫通タンパク質を提示するために使用されている。これらのｒＥＶは、細胞コミュニケーション及び複数の疾患の病因において役割を果たす天然に存在するＥＶと同様の脂質及びタンパク質組成物を有する（Ｌａｖａｄｏ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９：４５１６－４５３２，２０２０；Ｇｅｅｕｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０：１－１２，２０１９）。したがって、ｒＥＶのインタラクトームを定義することは、表示された目的の受容体の結合プロファイルと基本的なＥＶ生物学の両方に洞察を提供することができる。

【0339】

これらの以前のアプローチの限界に対処するために、直接タンパク質－タンパク質相互作用スクリーニングのロバスト性と膜の状況での目的の標的の提示とを組み合わせたアッセイを、ＥＶ、例えば上記のｒＥＶを使用して設計した。ＥＶは、細胞から自然に分泌されるナノメートルサイズの脂質二重層で区切られた粒子である（Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３０：２５５－２８９，２０１４）。ＥＶは、細胞の内因性機構を使用して折り畳まれ、それらの天然膜に挿入されたタンパク質を含む。本明細書では、ＥＶは、結合適格受容体を得るためのタンパク質精製のない方法を提供することが示されている。これらの天然に分泌される粒子を利用するために、受容体－リガンド発見のための新しいプラットフォームであるＲＤＩＭＩＳ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｄｉｓｐｌａｙ Ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ）（ＥＶＥＸＩＳ（細胞外小胞（ＥＶ）ベースの細胞外相互作用スクリーニング）とも呼ばれる）が開発された。ＲＤＩＭＩＳは、ＥＶ上に発現された任意の目的のタンパク質をＳＴＭ外部ドメインの包括的な馴化培地ライブラリに対してスクリーニングすることによって、１回膜貫通（ＳＴＭ）タンパク質インタラクトームの迅速で偏りのない同定を可能にする（Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，４：１０１５－１０２８，２０１２；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１．ｅ１９，２０１８）。

【0340】

ＲＤＩＭＩＳは、受容体非依存性であり、したがってＥＶに組み込まれ得るほとんどの目的の標的に適用可能な受容体－リガンド相互作用を解明するための時間効率の良い方法である。膜タンパク質のインタラクトームのプロファイリングは、その発現のためにプラスミドのみを必要とする。ＥＶ状況は、単純化されたプレートベースのシステムでタンパク質を研究する利点を保持しながら、時間がかかり不確実なタンパク質精製を回避する。ＥＶは、内因性細胞機構を使用して、タンパク質を膜に翻訳し、折り畳んで挿入し、したがって、機能性タンパク質を発現する可能性が最適である。さらに、馴化培地から直接ＳＴＭライブラリタンパク質を捕捉すると、全てのタンパク質精製工程が排除され、より高い処理量の研究が可能になり、タンパク質活性を損なうことなく資源消費精製工程が再び最小限に抑えられる（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８：２３１０－２３２３，２０１９）。これにより、目的の膜タンパク質のインタラクトームの特徴付けを約１週間で行うことが可能になり、これは主に細胞がタンパク質及びＥＶを産生するのにかかる時間によって制限される。

【0341】

ｒＥＶベースのアプローチは、完全長非タグ付き受容体分子の使用を可能にするが、ｇＤ－ＧＰＩタグ付き外部ドメインの使用は、同様の結果を達成することができ、受容体取り込みを測定するための難解な高親和性抗体の必要性を回避することができる。ｇＤ－ＧＰＩタグは、受容体ファミリーにわたって作用し、ＢＬＩによる発現の直接的な定量的比較を可能にする。このタグ付け戦略はまた、外部ドメインと完全長タンパク質の相互作用プロファイルの直接比較を可能にし、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインが役割を果たし得る相互作用を迅速に同定する。最後に、ｇＤ－ＧＰＩタグは、非膜タンパク質を固定することができ、膜に近接した細胞外マトリックス又は分泌因子を研究する方法を提供する。

【0342】

ｒＥＶはまた、高次複合体形成において役割を果たすことができる細胞骨格要素を有する細胞質内腔空間を含む（Ｂａｎｊａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，３：１－２４，２０１４；Ｋｅｅｒｔｈｉｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２８：６８８－６９２，２０１６）。細胞膜の複雑さを捕捉することに加えて、ｒＥＶ（Ｃｏｌｏｍｂｏ ａｎｄ Ｒａｐｏｓｏ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３０：２５５－２８９，２０１４）の小さいサイズ及び安定性は、生理学的に関連する状況でのハイスループットスクリーニングのための非常に魅力的なビヒクルとなる。このように、この研究で実施されるアプローチは、高カバレッジの集合体から受容体ファミリー又はタンパク質疾患バリアントなどのより集中的なライブラリまで、選択された任意のライブラリに結合することができ、クエリタンパク質の質を最大化しながら、インタラクトームの高感度かつ比較的低リソース集中的な同定を可能にする。

【0343】

タンパク質インタラクトームの同定、及び複合体又は精製困難な標的の脱オーファン化を超えて、ＲＤＩＭＩＳアプローチは、受容体、膜及びヒトＥＶ生物学の研究において広い用途を有する。ＲＤＩＭＩＳは、ＨＥＫ細胞由来のヒトＥＶの集団について１００個を超える小胞特異的結合剤を同定し、組換え及び内因的に生成されたＥＶのインタラクトームが著しく類似していることを示した。これは、ｒＥＶ及び内因性ＥＶのプロテオミクス組成物と脂質組成物との間の強い類似性を示す以前の研究と一致している（Ｌａｖａｄｏ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９：４５１６－４５３２，２０２０；Ｇｅｅｕｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０：１－１２，２０１９）。したがって、これらの結合剤は、内因性ＥＶ向性及びシグナル伝達に光を当て得る。結果は、ＥＶが免疫調節タンパク質（すなわち、ＳＩＧＬＥＣファミリー、ＬＩＬＲファミリー及びＣＤ３００ファミリー）、成長調節タンパク質（すなわち、成長因子受容体、例えば、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１及びＮＲＰタンパク質並びにいくつかの受容体チロシンキナーゼ）、又はニューロンタンパク質（すなわち、ＡＰＰ及びＣＬＳＴＮタンパク質）などの主要なシグナル伝達タンパク質と相互作用することを示しており、ＥＶが細胞間コミュニケーションを媒介するという考えを裏付けている。この研究は、疾患特異的ＥＶ、組織特異的ＥＶ又は細胞特異的ＥＶ並びに細胞コミュニケーション又は免疫応答におけるそれらの役割に焦点を当てた将来の研究のための段階を設定する。スループット及び再現性を考慮すると、この方法は、地球規模でＥＶの品質を評価する方法を提供する。ＥＶは薬物送達のための手段として研究されているため（Ｖａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ，１０６：１４８－１５６，２０１６）、ＲＤＩＭＩＳは、ＥＶの複雑さに関連する変動性、免疫原性及びオフターゲット効果に関する懸念に対処する方法を提供することができる。このプラットフォームは、分子レベルでＥＶ機能に影響を与えるプレイヤーを解明するための独自のツールを提供するため、標的受容体の過剰発現、治療薬の添加、又はＥＶを生成する細胞の改変から生じるＥＶの結合プロファイルの予想外の変化を検出することができる。

【0344】

Ｂ．膜提示用の細胞外小胞
天然膜における受容体－リガンド発見のための方法は、いくつかの部分を必要とする。第１に、安定な細胞膜片を捕捉しなければならない。これは、ほとんどの細胞によって自然に生成されるＥＶ、脂質二重層含有粒子を精製することによって達成することができる（図１Ａ～図１Ｃ）（Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３０：２５５－２８９，２０１４）。ＥＶは、膜結合高分子（Ｋｅｅｒｔｈｉｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２８：６８８－６９２，２０１６）の宿主を組み込み、それらを細胞膜環境の微小空間にする（図２Ａ）。この環境は、しばしば膜タンパク質相互作用に関与し、ＥＶをハイスループットプラットフォームにとって非常に魅力的な基礎とする。

【0345】

第２に、ハイスループットで高感度のスクリーニングには大量のＥＶが必要である可能性が高い。ＥＶ産生を最大化するために、タンパク質発現のための効率的な系を提供するＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞を選択した（Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，８：１－１２，２００８；Ａｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，１１：９７７－９８６，２０１９）。ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞を、１５０ｒｐｍで振盪しながらＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地中で培養した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0346】

ＥＶ産生を更に促進するために（Ｇｅｅｕｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０：１－１２，２０１９；Ｃｅｒｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６６：１５２－１６５，２０１３）、細胞をＨＩＶ ｇａｇコンストラクトでトランスフェクトした（図２Ｂ）。Ｇａｇ発現は、２０～５００ｎｍ小胞の収率をほぼ４倍増加させた（図２Ｃ）。

【0347】

第３に、ＥＶを検出するためにロバストで定量的な方法が必要である。細胞は、他の分子の複雑で可変のバックグラウンドも含む周囲の培地にＥＶを放出する。これらは、下流アッセイから再現可能な定量的データを得ることを困難にする。この問題に対処するために、一段階密度ベースのＥＶ精製を最適化した。これにより、凝集体を含まない純粋で一貫したｒＥＶ集団が得られた（図１Ａ及び１Ｂ）。最後に、ハイスループットスクリーニングは、必然的に各反応の規模を縮小させる。これは、結合ＥＶのロバストで定量的な検出の課題をもたらす。したがって、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）をＨＩＶ ｇａｇコンストラクトに融合した。これにより、ほぼ３桁（図２Ｄ）にわたって小胞濃度に線形比例するロバストな発光シグナルが得られた。

【0348】

次に、ＥＶが受容体ディスプレイのプラットフォームとして広く適用可能であるかどうかを決定するために、様々な全長のタグなしの受容体をｇａｇ－Ｒｌｕｃと共に細胞内で過剰発現させた。試験した全ての場合において、受容体は、受容体に特異的な抗体を使用してＥＶで容易に検出可能であった（図４Ａ）。より大きな受容体セットを試験し、ＥＶへのそれらの取り込みを測定するために、受容体特異的抗体に依存しない検出方法が必要であった。これに対処するために、無関係な受容体外部ドメインの集合体を糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）－グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）タグに融合した。ＧＰＩは、膜中の外部ドメインを維持する脂質アンカーを提供し、一方、ｇＤエピトープタグは、抗ｇＤ抗体を使用した外部ドメイン検出を可能にする。これらの受容体を小胞への組み込みについて試験した場合、アッセイした受容体のほとんどは、抗ｇＤ抗体を使用してＥＶで容易に検出可能であった（図４Ｂ、図４Ｃ、図１３Ａ）。したがって、ｇＤ－ＧＰＩタグ付け戦略は、ＥＶ中の様々なタンパク質の容易な検出を可能にする。

【0349】

Ｃ．膜タンパク質を発現する細胞外小胞の生成
ＨＥＫ２９３Ｔ又はＥＸＰＩ２９３（商標）細胞を、目的の受容体又は空のベクター対照（示されているように）、及びＲｌｕｃ（スクリーニング用）又はｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（可視化用）のいずれかに融合したＨＩＶ ｇａｇを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした全てのプラスミドを発現ベクターｐＲＫ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にクローニングした。小胞採取のために、３００×ｇで１０分間回転させ、続いて２０００×ｇで２０分間清澄化する（発現＜１００ｍＬの場合）か、又は濾別する（発現≧１００ｍＬの場合）ことによって細胞を除去した。全ライブラリスクリーニングのために、ｒＥＶ発現を１Ｌスケールで行い、７日間成長させた。仕様書に従って、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。錠剤を完全に溶解した後、馴化培地を１２，０００×ｇで４０分間回転させて、残っている高密度微粒子及び微小胞を除去した。上清を７０ｍＬポリカーボネート超遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に管あたり約６０ｍＬの体積で移した。１０ｍＬの５０％スクロースを、シリンジ及び長針を使用してチューブの底部から重層し、スクロースのクッションを形成した。試料をＴｉ－４５ローター中、１００，０００×ｇで９０分間回転させた。小胞はスクロースの上に浮遊する。小胞層の上の培地を吸引した。二つのチューブに相当するクッションと小胞を合わせ、ＰＢＳを用いて新しい超遠心管で７０ｍＬに希釈した。試料を再び１００，０００×ｇで回転させ、得られたペレットをＰＢＳに溶解した。ＨＡＬＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１×に添加した。全ての回転を４℃で行った。

【0350】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、過剰発現受容体及びｇａｇタンパク質融合物が小胞において検出可能であることを確認した。ＨＥＫ２９３Ｔを、１０％ ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されたＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭａｘにおいて培養した。

【0351】

実施例２．ＰＶＲの結合パートナーの同定
Ａ．ＥＶを使用したＰＶＲの結合パートナーの同定
ＥＶ上に発現される受容体がアクセス可能であり、結合適格であるかどうかを決定するために、受容体ＰＶＲを使用して概念実証研究を行った。

【0352】

目的の受容体に対する結合パートナーの同定は、ｒＥＶがそれらの表面上にアクセス可能な結合適格受容体を表示することを必要とする。ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）を概念実証研究のために使用した。ＰＶＲは、様々な結合親和性を有する様々なよく特徴付けられた細胞表面発現受容体に結合することが知られているので、有用なベンチマークである（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８：２３１０－２３２３，２０１９）。ｒＥＶ上のＰＶＲが活性であるかどうかを決定するために、完全長ＰＶＲを発現するｒＥＶを単離し、細胞表面に発現するいくつかのＰＶＲ結合パートナーへの結合について試験した。ＰＶＲ－ｒＥＶは、ＰＶＲリガンドを発現する細胞に選択的に結合し、試験した条件下でトランスフェクトされていない細胞ではバックグラウンドは無視できるほどであった（図２Ｅ）。

【0353】

次に、ｇＤ－ＧＰＩ戦略が結合適格受容体ディスプレイをもたらすかどうかを決定するために、ＰＶＲ外部ドメインをｇＤ－ＧＰＩタグに融合した。抗マウスＩｇＧ Ｆｃ捕捉バイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、１０μｇ／ｍＬのマウス抗ｇＤ抗体（Ａｂｃａｍ）に対してＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度で、ｇＤ－ＧＰＩ小胞をＢＬＩによって測定した。完全長ＰＶＲを発現するＥＶと同様に、ＰＶＲ外部ドメインｇＤ－ＧＰＩ ＥＶは、ＰＶＲリガンドを発現する細胞に選択的に結合し、タグ付き外部ドメインが結合に活性であることを示した（図１Ｆ）。ｇＤタグはまた、電子顕微鏡法によるＥＶ上のＰＶＲ受容体発現の検出を可能にした（図４Ｃ）。一般的な小胞染色のために、小胞の懸濁液を、ホルマール被覆及び炭素被覆ＴＥＭグリッドの表面に１５分間吸着させた。蒸留水で短時間すすいだ後、試料を２％リンタングステン酸（ＰＴＡ）で６０秒間染色し、次いで風乾した。ｇＤエピトープ検出のために、小胞を３０分間吸着し、ヤギコンジュゲート用Ａｕｒｉｏｎブロッキング溶液で３０分間ブロッキングした。次いで、試料をブロッキング溶液中で１時間マウス抗ｇＤ（ａｂｃａｍ）で染色し、ヤギ抗マウス１２ｎｍ金コンジュゲートを使用して検出した。次いで、試料をＰＢＳで１５分間、水で１分間洗浄し、１％酢酸ウラニルで１分間染色した後、ブロットし、風乾した。ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及びＧＡＴＡＮ ＵＬＴＲＡＳＣＡＮ（登録商標）１０００ ＣＣＤカメラを用いて５，０００倍～５０，０００倍の倍率で撮像を行った。

【0354】

Ｂ．ＥＶベースのアッセイと組換えタンパク質を使用するアッセイとの比較

【0355】

次に、本発明者らは、ｒＥＶが洗浄工程及び本発明者らのハイスループットアッセイの取り扱い遅延に耐えるのに十分に強く結合することができるかどうかを決定した。この目的のために、本発明者らは、完全長ＰＶＲ又はＰＶＲのｇＤ－ＧＰＩタグ付き外部ドメインのいずれかを示すｒＥＶ、及び既知のリガンドＣＤ２２６に対する組換え単量体ＰＶＲの結合速度を決定した。非破壊的技術であるバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用すると、大きなサイズのｒＥＶ（図２Ｇ、左パネル）を考えると予想されるように、強い負のＢＬＩシグナルが両方のＰＶＲ ｒＥＶ型について観察された。これは、ＰＶＲ－ｒＥＶを対照としてのヒトＩｇＧとインキュベートした場合には観察されず、これが特異的相互作用であることを示唆した（図２Ｇ、右パネル）。ｒＥＶは１０分にわたって解離をほとんど示さず、ハイスループットスクリーニング（図２Ｇ、右パネル）に適していた。さらに、ＥＶは、ＰＶＲ単量体と比較してより速い会合及びより遅い解離を達成し、より高い親和性相互作用を示した（図２Ｇ、右パネル）。注目すべきことに、細胞ベースのアッセイ（図２Ｅ及び図２Ｆ）と一致して、ｇＤ－ＧＰＩタグ付きＰＶＲ ＥＶは、完全長ＰＶＲ ＥＶと同様の結合プロファイルを示し、操作された受容体がイン－トランス結合パートナーの検出に適していることを更に示した。

【0356】

Ｃ．ＢＬＩ法

【0357】

ＢＬＩ測定を、８チャンネルＯＣＴＥＴ（登録商標）ＲＥＤシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行った。ＰＶＲ ｒＥＶ結合のために、ＣＤ２２６－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標））又は天然ヒトＩｇＧ（ａｂｃａｍ）を２５ｎＭで抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にロードした。全ての組換えタンパク質を３００秒間ロードした。全ての測定を３０℃で行った。Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で分析を行った。ＰＢＳ緩衝液対照を差し引いて、機器のドリフトを説明した（ＰＢＳ曲線が示されていない限り）。アラインメントをベースラインとし、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを行った。６００秒にわたる２ｎｍを超える会合値が推奨される。

【0358】

Ｄ．ＥＶ試料特性評価法

【0359】

ＥＶ試料の総タンパク質濃度を、試料１．５μＬを１４８．５μＬのＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合することによって測定した。濃度を滴定ＢＳＡ曲線に対して計算した。この試薬は、膜を透過性にするメタノールを含有するため、洗浄剤は添加しなかった。ＥＶ粒子数及び濃度は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＴＡ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用してナノ粒子追跡分析から計算した。０．１ｍｇ／ｍＬの総タンパク質の小胞をＰＢＳで１０００倍希釈し、４８８ｎｍレーザーを使用して１分間の記録を５回繰り返した。ＮＴＡ ３．４ソフトウェアを使用してトレースを分析し、これにより、モル濃度を計算するために使用される粒子濃度を得た。

【0360】

Ｅ．考察

【0361】

この実施例は、研究中の受容体の完全長天然タンパク質及びｇＤ－ＧＰＩタグ付き外部ドメインの両方がＥＶに組み込まれ、ＥＶベースの結合研究に適していることを実証する。ｇＤ－ＧＰＩタグ付けを使用して外部ドメインをＥＶにアンカリングすると、ＲＤＩＭＩＳの能力が向上する。第１に、それは外部ドメインと完全長タンパク質の相互作用プロファイルの比較を可能にする。第２に、無関係な受容体を研究する場合、ｇＤ－ＧＰＩタグは、受容体にわたる発現及び局在化を比較するための共通の方法を提供し、しばしば利用できない受容体特異的抗体の必要性を回避する。最後に、ｇＤ－ＧＰＩタグは、非膜タンパク質を固定することができ、膜に近接した細胞外マトリックス又は分泌因子を研究する方法を提供する。

【0362】

ＥＶにおける目的の標的のレベルは、主に親細胞における発現のレベルに依存するようである。したがって、低発現タンパク質の場合、結合パートナーの効率的な検出のための十分な発現を達成するために、実験条件の最適化が必要とされ得る。

【0363】

実施例３．ＲＤＩＭＩＳは、ハイスループットでのＳＴＭタンパク質インタラクトームの同定を可能にする
Ａ．タイスループットスクリーニングのためのＥＶ及び外部ドメインライブラリの設計
次に、ＲＤＩＭＩＳシステムを、受容体－リガンド相互作用のハイスループット発見のために使用した（図３Ａ）。

【0364】

偏りのない同定を達成するために、目的のタンパク質を発現するＥＶを、外部ドメイン－Ｆｃタグ融合物（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）として発現されるほとんどのヒト１回膜貫通（ＳＴＭ）タンパク質からなる以前に開発された馴化培地ライブラリとの結合について評価した。ライブラリを作製するために、細胞を、外部ドメイン－Ｆｃタグ融合物をコードするプラスミドでトランスフェクトして、成長培地中にＦｃタグ付き外部ドメインを発現及び分泌するように誘導した。次いで、培地をプロテインＡ被覆プレートに移し、プレートの各ウェルに異なるＦｃタグ付き外部ドメインを受容させた。これにより、ハイスループットスクリーニング（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）に適した固定化外部ドメインの集合体が得られた。

【0365】

並行して、ＥＶ産生のための細胞培養物を、目的の受容体及びｇａｇ－ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした（図３Ａ）。ＥＶの迅速な大規模単離を可能にする最適化された精製プロトコルを使用して、受容体含有ＥＶを単離した（図１Ａ）。ＥＶを単離した後、それらをＳＴＭタンパク質ライブラリを含むプレートとインキュベートした。次いで、プレートを十分に洗浄して未結合ＥＶを除去した。受容体含有ＥＶとウェルに固定化されたＳＴＭタンパク質との間の相互作用を検出するために、Ｒｌｕｃ基質を添加し、したがって相互作用が起こったウェルで蛍光シグナルを生成した（図３Ａ）。

【0366】

Ｂ．ＰＶＲ ＥＶのＳＴＭインタラクトーム
ＲＤＩＭＩＳプラットフォームを使用して、ＰＶＲ－ＥＶ（ｇＤ－ＧＰＩタグ付きＰＶＲ外部ドメインを保有する単離されたＥＶ）のＳＴＭインタラクトームを研究した。小胞上の受容体の表示を、ＢＬＩを使用し、ウエスタンブロットによって確認したところ、ｒＥＶのｇＤ抗体へのロバストな結合が示された（図４Ｄ及び図１３Ａ）。注目すべきことに、ＲＤＩＭＩＳは、全ての予想されるＰＶＲ結合パートナー：ＣＤ９６、ＣＤ２２６、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＰＶＲＬ３、ＰＶＲＬ４及びＴＩＧＩＴ（図３Ｂ、青色）を、２つの独立したｒＥＶ及びＳＴＭライブラリ調製物にわたって再現性よく同定した（相関係数０．９０；図１６Ａ）。これらのスクリーニングは、２つの独立したＰＶＲ－ＥＶ調製物及び２つの独立したＳＴＭライブラリ調製物を使用して実施し、試料の発現又は調製中の潜在的な変動性を制御した。さらに、重要なことに、完全長のタグなしのＰＶＲ（図３Ｃ）を担持するｒＥＶを研究するためにＲＤＩＭＩＳを利用した場合、全体的な相関係数は０．８８（図１６Ａ）であり、ヒットは実質的に同一であった。まとめると、これらの結果は、ｒＥＶ上のｇＤ－ＧＰＩタグ付き受容体の発現が、関連するリガンドのイン－トランスの検出を可能にし、開発された自動化ワークフローと組み合わせて、偏りのない様式で、高親和性相互作用及び低親和性相互作用の検出に対する感度を高めた膜タンパク質インタラクトームのロバストな同定を可能にすることを更に実証する。

【0367】

Ｃ．Ｂ７ファミリータンパク質のＳＴＭインタラクトーム

【0368】

この技術の感受性を更にベンチマークするために、チェックポイント阻害剤ＰＤ－Ｌ１を含む顕著な免疫受容体を含む免疫調節タンパク質のＢ７ファミリーの３つのメンバーを研究するためにプラットフォームを適用した。３つ全てのタンパク質をｇＤ－ＧＰＩ外部ドメイン融合物として発現させ、小胞中でのそれらの発現をモニターし、ｒＥＶを含有するＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩと直接比較することを可能にした。全てのｒＥＶにおいて、タグ付き外部ドメインは、ＢＬＩ（図４ Ｄ）又はウエスタンブロット（図１３Ａ）によってアッセイした場合、ＰＶＲに匹敵するレベルで抗ｇＤ抗体に結合した。

【0369】

ａ．ＰＤ－Ｌ１ ＥＶのＳＴＭインタラクトーム
ＲＤＩＭＩＳをＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４に適用した。ＰＤ－Ｌ１をｇＤ－ＧＰＩタグ付き外部ドメインとして発現させて、上記のようにスクリーニング前のＰＤ－Ｌ１ ＥＶの特徴付けを可能にした。ＰＤ－Ｌ１ ＥＶは、ＢＬＩによってｇＤ抗体への容易に検出可能な結合を示した（図４Ｄ）。ＳＴＭライブラリとの相互作用についてスクリーニングした場合、ＰＤ－Ｌ１ ＥＶは、既知のＰＤ－Ｌ１リガンドＰＤＣＤ１（ＰＤ１）、ＥＰＨＡ３、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＰＤＣＤ１ＬＧ２（ＰＤＬ２）を高い信頼性で同定した。ＰＤ－Ｌ １／ＰＤ－Ｌ ２相互作用の推定解離定数は約１０μＭ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７：１－９，２０１６）であることから、この結果は、ＲＤＩＭＩＳが生化学的に困難な弱い相互作用を同定できることを更に実証している。さらに、多数の他の高得点ヒットが同定された（図５Ａ）。ＩＧＦ２Ｒは、関連のない実験において広範に粘着性であることが見出されており（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８：２３１０－２３２３，２０１９）、したがって非特異的相互作用因子として標識されているが、他のヒットは、ＰＤ－Ｌ１についての新たな推定結合剤を表す。

【0370】

ｂ．ＣＤ８０及びＣＤ２７６ ＥＶのＳＴＭインタラクトーム
最後に、ＲＤＩＭＩＳの広い適用性を更に確実にするために、新たなプラットフォームを２つの更なる膜発現受容体、ＣＤ８０（Ｂ７－１）及びＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）に適用した（図５Ｂ）。ここでも、関連する全てのパートナーが両方のタンパク質について検出され、細胞表面発現標的に対するこの方法論の広範な有用性が確認された。十分に記載されている結合剤ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４及びＰＤ－Ｌ１、並びにより最近に記載された結合剤ＮＧＦＲは、免疫受容体ＣＤ８０に対する最高スコアヒットとして同定された。スクリーニング技術の進歩によりごく最近になって脱オーファン化されたＢ７－Ｈ３／ＣＤ２７６の場合（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８：２３１０－２３２３，２０１９）、ＲＤＩＭＩＳは、最近記載されたインターアクターＩＬ２０ＲＡ並びにＭＸＲＡ５を捕捉し、これは同じ研究で非特異的インターアクターであることが分かった（図５Ｂ）。特に、両方の場合において、既知の相互作用パートナーは最もスコアの高いヒットの中にあったが、文献に以前に記載されていないいくつかの追加の推定受容体特異的結合パートナーが同定され、この方法の感度を実証した。

【0371】

Ｄ．公開データベースとの比較
次に、これらの４つの顕著な免疫受容体について同定された相互作用のランドスケープの数の全体的な感覚を得るために、ＲＤＩＭＩＳ法を使用して同定された受容体特異的ヒットと、タンパク質相互作用の最も包括的なリポジトリのいくつかであるＳＴＲＩＮＧ（Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４７：Ｄ６０７－Ｄ６１３，２０１９）、Ｂｉｏｐｌｅｘ（Ｈｕｔｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０１．１９．９０５１０９，２０２０）及びＢｉｏｇｒｉｄ（Ｏｕｇｈｔｒｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４７：Ｄ５２９－Ｄ５４１，２０１９）データベース（図５Ｃ）に列挙された相互作用との間の重複を評価した。

【0372】

均一な比較のために、この研究で照会されたＳＴＭライブラリに存在するタンパク質間の相互作用のみを検討した。ＳＴＲＩＮＧデータベースについては、実験的証拠を有すると指定された相互作用のみを使用した。全てのスクリーニングについてヒットのストリンジェントなリストを生成するために、データの分布が正規分布から逸脱し、長い上部テールを有していたので、各スクリーニングについて９８％分位点でカットオフを描いた。全てのスクリーニングにおいて、特定のスクリーニングのシグナルが他のスクリーニングのシグナルの少なくとも４倍である場合、受容体特異的ヒットが呼び出された。

【0373】

予想通り、十分に特徴付けられた相互作用のほとんどがデータベースの少なくとも１つで表され、ＳＴＲＩＮＧの１２の相互作用のうち１１が本発明者らのデータセットと重複する実験的証拠を有するとして列挙された（図５Ｃ）。さらに、研究中の全ての免疫受容体について、ＲＤＩＭＩＳは、公的に利用可能なデータベースには示されていない推定相互作用を同定した（図５Ｃ）。これは、目的の受容体が原形質膜に関連して研究される場合、新しい相互作用の同定が促進され得ることを示唆する。

【0374】

ＣＤ８０について、ＳＴＲＩＮＧデータベースは、更なる結合パートナーであるＣＤ８６を示唆した。ＳＴＲＩＮＧデータベースにおいてこの相互作用を支持して引用された論文を含む文献の更なる総説は、これらのタンパク質が相互作用するようには見えないことを示唆した。Ｂｉｏｐｌｅｘ及びＢｉｏｇｒｉｄは追加の推定パートナーを同定しているが、これらはほとんど検証されていない。

【0375】

Ｅ．ＲＤＩＭＩＳスクリーニング方法
小胞を、１×ＰＢＳ＋０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ_２＋０．９ｍＭ ＣａＣｌ_２（ＰＣＭ）＋１％ＢＳＡ画分Ｖ（Ｓｉｇｍａ）中０．０３～０．０５ｍｇ／ｍＬ（Ｂｒａｄｆｏｒｄによって測定した場合）の最終濃度に希釈した。タンパク質－タンパク質相互作用のハイスループット分析を可能にするために、自動液体処理装置（プレートディスペンサ及びワッシャ）からなる統合ロボットシステムを使用して、ヒト受容体ライブラリの調製を行った。Ｆｃタグ付き受容体ＥＣＤを含有する馴化培地を白色の３８４ウェルプロテインＡ被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に分注し、必要になるまで４℃で保存した。ＥＣＤ－Ｆｃの濃度は変動したが、平均１５９μｇ／ｍＬであった。プレートをＰＣＭで３回洗浄して、馴化培地の未結合成分を除去した。小胞をプレートに添加し、４℃で一晩静置した。プレートをＰＣＭで３回洗浄して未結合小胞を除去した。乾燥を防ぐために、２５μＬのＰＣＭをプレートに添加した。正規化に使用した陽性対照については、全ての洗浄工程後に、スクリーニングに使用した同じ小胞ストック２５μＬを各プレートの第１のカラムに添加した。これらは洗浄されないため、これらの陽性対照ウェルは入力値を表すが、自動化の限界により、１００％結合のウェルと比較した場合、希釈される。ＰＣＭ中の２５μＬの１μＭセランテラジンｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに分注し、５分間インキュベートし、次いで０．１秒の発光読み取り時間を使用してＴＥＣＡＮで読み取る。スクリーニングにおいてウェルの大部分は小胞のいずれにも結合しなかったため、追加の陰性対照ウェルは分析に使用せず、かわりに、シグナルを、ヒットを呼び出すために画面全体にわたる強度の分布に関して分析した。空のウェルは、分布の下半分に入り、非結合Ｆｃシグナルを表さないＥＣＤ－Ｆｃ馴化培地を受けたウェルよりも高いシグナルを有する傾向があった。

【0376】

Ｆ．膜染色を用いたＥＶの定量
コレステロールは、ＥＶの脂質二重層の主成分である。ＥＶをＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、したがって、タグ付けされていない標的及び／又は内因性ＥＶを含むＥＶの検出を可能にした。ベクター対照でトランスフェクトされたがｇａｇ－Ｒｌｕｃを含有するｒＥＶ、又はトランスフェクトされていない細胞から回収されたＥＶ（図１２Ｃ）のいずれかを使用して、完全なＲＤＩＭＩＳスクリーニングを実施した。両方のＥＶ種が同様に挙動し（０．９２の相関係数）、同じ細胞株からのｒＥＶ及び天然に生成されたＥＶが同様の結合プロファイルを有することを示した。

【0377】

ＥＶを上記のように生成し、回収した。ｇａｇ－Ｒｌｕｃを含有するＰＤ－Ｌ１又はＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶを白色３８４ウェルプレートに連続希釈し、推奨プロトコルに従って、セレンテラジンｈ（ＲＤＩＭＩＳの場合のように）の添加によるＲｌｕｃ、又はＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の使用いずれかによりＥＶ濃度を測定した。ＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩ ＲＤＩＭＩＳを測定するために、ＥＶを通常のＲＤＩＭＩＳと同様に結合させた。次いで、プレートを吸引して乾燥させ、２５μＬのＡＭＰＬＥＸ（商標）Ｒｅｄ試薬を各ウェルに分注した。ストックＥＶ溶液を各プレートの第１のカラムに添加して陽性対照とした。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、５６０＋／１ １０ｎｍでの励起及び５９０＋／－１０ｎｍでの蛍光検出を使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ １０００ ＩｎｆｉｎｉｔｅＰｒｏで読み取った（図１２Ａ～１２Ｃ）。

【0378】

全てのコレステロールエステルも確実に検出されるように、コレステロールエステラーゼを推奨量で含めた。小胞を、ＥＶＥＸＩＳスクリーニングと同様にＦｃ－ＥＣＤタンパク質とインキュベートし、ＥＶＥＸＩＳと同様に洗浄した。セラントラジン－ｈを添加するのではなく、プレートを手ではじいて乾燥（ｆｌｉｃｋｅｄ ｄｒｙ）させた。ルシフェラーゼシグナルに対する滴定のために、４つの３倍段階希釈を行った。２０μＬの０．５μＭセラントラジンｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、５分間インキュベートし、Ｔｅｃａｎ Ｍ １０００ ＩｎｆｉｎｉｔｅＰｒｏで読み取った。マニュアルに明記されているように、２０μＬのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙミックスをウェルに添加し、１時間インキュベートし、読み取った。０．１秒の発光読み取り時間を使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ １０００ ＩｎｆｉｎｉｔｅＰｒｏで発光を読み取った。蛍光を、５６０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光波長を使用してＴＥＣＡＮにおいて読み取った。ＰＢＳ及びセラントラジンｈ及びＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙミックスのみを含むブランクウェルも測定し、値をシグナルから差し引いた。ＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩ ＥＶ結合のために、ウェルをコエラントラジンｈとＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙとの間ではじいて乾燥させた。ブランクのウェルを差し引くのではなく、Ｆｃタグ付き種をトランスフェクトしなかったが、馴化培地を依然として添加したウェルを使用した。

【0379】

Ｇ．ＬＲＴＭ１の相互作用

【0380】

アッセイの感度を更に評価するために、低シグナルを有する新しいヒットの１つ、ＬＲＴＭ１を調査した。ＬＲＴＭ１について市販のタンパク質を見出すことができなかったため、ｒＥＶ上に発現させたＬＲＴＭ１を使用して相互作用を研究した。この研究は、ＰＤ－Ｌ１外部ドメインがｒＥＶ上のＬＲＴＭ１に選択的に結合し、ｇＤ－ＧＰＩタグ付き外部ドメイン又は完全長タンパク質のいずれかとして提示されることを示した（図１３Ｂ）。ＬＲＴＭ１ ｒＥＶはまた、ベクター対照（図１３Ｃ）でトランスフェクトした細胞上の細胞上に発現したｇＤ－ＧＰＩタグ付き又は完全長ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合した。ＰＤ１（ＰＤＣＤ１）は、ＰＤ－Ｌ１の既知の相互作用パートナーであり、癌におけるチェックポイント遮断免疫療法の標的であるため、これらの相互作用が競合するかどうかを決定するために実験を行った。高濃度の組換えＰＤ１－Ｆｃタンパク質は、濃度依存的にＬＲＴＭ１小胞結合を打ち負かすことができ（図１３Ｄ）、タンパク質がＰＤ－Ｌ１上の同様の領域に結合することを示唆した。

【0381】

実施例４．ＲＤＩＭＩＳは、包括的細胞外小胞結合剤の同定を可能にする
興味深いことに、全ての無関係なスクリーニングにより、予想される結合パートナーの間に散在する追加のヒットが明らかになった（表８）。ｒＥＶは複雑な混合物であるため、これらの新しい結合剤がｒＥＶ上に発現される受容体に特異的であるか、又は小胞自体に特異的であるかは明らかではなかった。これに対処するために、異なる受容体を示すｒＥＶのスクリーニングを直接比較して、共通及び示差的な結合剤を同定した。バッチ一致スクリーニングを、互いに対して（図５Ａ及び５Ｂ）、又は独立して行われる目的の受容体の代わりにベクター対照でトランスフェクトした細胞を用いたスクリーニングに対して（図１４Ａ～１４Ｆ）プロットした。これにより、３つの異なる群が明らかになった：ＰＶＲ特異的結合剤（青色）、ＰＤ－Ｌ１特異的結合剤（赤色）、及び特定のスクリーニングで濃縮されておらず、したがって受容体特異的ではなかったヒットの集団（図５Ａ及び５Ｂ、グレーの網掛け影；表８及び９）。

【0382】

注目すべきことに、ＣＬＥＣ及びＳＩＧＬＥＣのような糖結合剤だけでなく、ＬＩＬＲ及びエフリン受容体のようなシグナル伝達受容体も含むいくつかのタンパク質ファミリーが包括的小胞結合剤リストにおいて濃縮された。任意の生物学的経路又は機能が過剰に表されているかどうかを決定するために、図５Ａ及び５Ｂに示す４つのＲＤＩＭＩＳスクリーニングで同定された一組の包括的小胞結合剤について遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析を行った。表１０は、ＰＡＮＴＨＥＲ １５．０過剰提示試験（２０２０－０３－２３リリース）を用いて実施した、表８の包括的小胞結合剤のＧＯ濃縮分析の結果を示す。表１１は、ＰＡＮＴＨＥＲ １６．０放出過剰提示試験（Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４９：Ｄ３９４－Ｄ４０３，２０２１）を用いて行った、表９の包括的小胞結合剤のＧＯ濃縮分析の結果を示す。有意に濃縮された分子機能には、炭水化物、硫黄及びアニオン結合が含まれ、全て小胞及び細胞膜への一般的な結合と一致していた。リストはまた、ＧＯ細胞成分分析による三次顆粒及び三次顆粒膜に関連するタンパク質が豊富であり（表１２）、これらが一般的なＥＶ結合剤であることを更に示唆した。ＧＯ生物学的プロセス分析も行ったが、有意な結果は見られなかった。したがって、このプラットフォームは、無関係な目的の標的についてはインタラクトーム（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ）にわたって保存されている小胞特異的結合剤の同定を可能にし、ＥＶについてはこれまで知られていない受容体を示唆する。

【表10】

【表11】

【表12】

【0383】

ＧＯ分析は、包括的小胞結合剤の多くが共通の細胞表面修飾を認識することを示唆したが、結合剤の多くはｒＥＶ中にタンパク質相互作用パートナーも有し得る。潜在的な結合剤のリストを作成するために、包括的小胞結合剤のリストを、公開されている免疫グロブリンスーパーファミリー受容体（Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８２：３２９－３４４．ｅ１９，２０２０）及び相互作用のＳＴＲＩＮＧデータベース（Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４７：Ｄ６０７－Ｄ６１３，２０１９）と相互参照した。これらのデータを使用して、潜在的な相互作用のネットワークを生成した（図１５）。各ノードは、包括的小胞結合剤（緑色）であるか、公開された研究及びデータベースから同定されたもの（青色）であるかによって色分けされた、ネットワーク中に見出されるタンパク質である。データのソースは、エッジにおいて色分けされる。これらのタンパク質が小胞に存在する可能性があるかどうかを理解するために、発現データを、Ｃｅｌｌ Ａｔｌａｓ（Ｔｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５６（６３４０），２０１７）を使用して、ｒＥＶを生成するための使用されるＥＸＰＩ２９３（商標）細胞の親細胞株であるＨＥＫ２９３について相互参照した。ｒＥＶへのタンパク質の組み込みが典型的には細胞におけるその発現と相関するという知見に基づいて、高度に発現されたタンパク質が、検出された結合を担う可能性がより高いと推論された。発現は、図１５の各タンパク質名を囲むボックスの高さとして示され、より高いボックスはより大きな発現を表す。このネットワークは、包括的小胞結合剤リスト中のタンパク質との既知の相互作用を有するいくつかの高発現タンパク質を示唆している。

【0384】

同時に実施されたスクリーニング（ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ反復２及びＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩ；ＣＤ２７６及びＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩ；ＬＲＲＣ１５及びＰＶＲ ＦＬ）又は同じ受容体を発現する細胞間（ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ反復又はＰＶＲ－ＦＬ）で高い再現性が見られたが、スクリーニングの全てを互いにプロットした場合にいくらかの変動が観察された（図１６Ａ）。特に、より低い相関の一部は受容体特異的ヒット（すなわち、ＰＶＲ ｇＤ－ＧＰＩ対ＰＤ－Ｌ１ ｇＤ－ＧＰＩ）によって引き起こされたが、最も悪い相関を有するスクリーニングはＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩ及びＰＶＲ ＦＬスクリーニングであった。興味深いことに、これは包括的小胞結合剤の２つの分離可能な集団によって駆動され、一方はスクリーニング間で一貫しているように見え（図１６Ｂ、空色ドット）、他方はＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩスクリーニングで濃縮されていた（図１６Ｂ、金色ドット）。しかしながら、これらのヒットはＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩスクリーニングにおいて有意により濃縮されたため、両方の集団は依然としてＣＤ８０ ｇＤ－ＧＰＩ特異的ヒットと区別することができた。これは、ｙ軸付近にズームインすることによって（図１６Ｂ）、又は全てのスクリーニング間で共通の包括的小胞結合剤のリストを除去することによって（図１６Ｂ）見ることができた。これらの２つの集団の間にいくらかの違いがあるかどうかを決定するために、ＧＯ分子機能分析をこのスクリーニングで同定された２つの集団で行った（表１３及び１４）。興味深いことに、ヘパリン及びグリコサミノグリカン結合は、包括的小胞結合剤の第１の集団で濃縮され（表１３）、シアル酸結合及び膜貫通シグナル伝達活性は、第２の集団で濃縮された（表１４）。

【表13】

【表14】

【0385】

スクリーニングの個々の対ごとのリストを得るために、データの分布が正規分布から逸脱し、長い上部テールを有していたので、９０％分位点でカットオフを描いた。これは各スクリーニングについて個別に行われ、最終リストは、スクリーニング特異的ヒットを除去した全てのスクリーニング間で共通の遺伝子のリストであった。遺伝子をランク付けするために、強度を全てのスクリーニングにわたって平均し、その平均によってソートした。遺伝子オントロジー分析は、包括的小胞結合剤のリストでＰＡＮＴＨＥＲ１５．０放出過剰提示試験（２０２０－０３－２３リリース）又はＰＡＮＴＨＥＲ １６．０放出過剰提示試験（Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４９：Ｄ３９４－Ｄ４０３，２０２１）を使用して行った。参照リストは、ＳＴＭライブラリ中の全ての遺伝子のリストであった。ＧＯ分子機能完全、生物学的プロセス完全及び細胞成分完全アノテーションデータセットを、フィッシャーの正確検定を使用して分析した。

【0386】

したがって、ＲＤＩＭＩＳアプローチは、例えばヒトＥＶ生物学の研究のための小胞特異的結合剤のプロファイリングを可能にする。ＨＥＫ細胞由来のヒトＥＶについて１００を超える結合剤が同定され、細胞とのＥＶ相互作用を媒介し得る推定受容体、最適なツールの欠如のために依然として解明されていない小胞生物学の一態様を示唆した（Ｇｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１７：３３７－３４７，２０１９）。本発明者らの結果は、ＥＶが免疫調節タンパク質（例えば、ＳＩＧＬＥＣファミリー、ＬＩＬＲファミリー及びＣＤ３００ファミリー）、成長調節タンパク質（例えば、成長因子受容体、例えば、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１及びＮＲＰタンパク質並びにいくつかの受容体チロシンキナーゼ）、及びニューロンタンパク質（例えば、ＡＰＰ及びＣＬＳＴＮタンパク質）などの主要なシグナル伝達タンパク質と相互作用することを示しており、ＥＶが細胞間コミュニケーションを媒介するという考えを裏付けている。スループット及び再現性を考慮すると、この方法は、地球規模でＥＶの品質を評価する方法を提供する。さらに、このプラットフォームは、分子レベルでＥＶ機能に影響を与えるプレイヤーを解明するための独自のツールを提供し、したがって、標的受容体の過剰発現、治療薬の添加、又はＥＶを生成する細胞の改変から生じるＥＶの結合プロファイルの予想外の変化を検出するために使用することができる。

【0387】

実施例５．ＲＤＩＭＩＳは、オーファン癌関連受容体ＬＲＲＣ１５の新規相互作用パートナーとしてＣＤ２４８を同定する
上記の結果は、ＲＤＩＭＩＳが、他の生化学的スクリーニングアプローチに対して難治性の困難な標的の脱オーファン化を可能にし得ることを示唆した。一例として、ＲＤＩＭＩＳを使用して、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）受容体ＬＲＲＣ１５を研究した。ＬＲＲＣ１５は、大きな腫瘍に関連するＣＡＦの特異的マーカーとして最近出現した（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．，１０（２）：２３２－２５３，２０２０）。この生物学的重要性にもかかわらず、相互作用パートナーは同定されておらず、したがって、ＬＲＲＣ１５生物学の基本的な態様は未定義のままである。ＬＲＲＣ１５相互作用パートナーは、先に実施された技術である小型化されたＡＶＥＸＩＳ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８；Ｂｕｓｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１８：６２２－６３０，２００８）を使用して最初に検索された。この技術は、上記のＳＴＭタンパク質ライブラリに対して五量体化ＬＲＲＣ１５外部ドメインをスクリーニングする。この技術で以前に示された一過性相互作用の検出のためのＡＶＥＸＩＳスクリーニングの高感度にもかかわらず、ＬＲＲＣ１５について結合パートナーは同定されず（図６Ａ）、ＬＲＲＣ１５が最適な活性のためにより生理学的に関連する設定を必要とし得ることを示唆した。この仮説を試験するために、ＲＤＩＭＩＳを使用して、ＬＲＲＣ１５をｇＤ－ＧＰＩ（図７Ａ）及び完全長（図７Ｂ）受容体－ｒＥＶとしてスクリーニングした。注目すべきことに、これらの取り組みの両方が、利用可能なデータベースに記載されていないＬＲＲＣ１５についての推定相互作用物質の同様のセットを同定した（図６Ｂ）。

【0388】

ＣＤ２４８を、ＥＺ－ＬＩＮＫ（商標）Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してビオチン化し、７Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＺｅｂａ脱塩カラムで浄化した。ＣＤ２４８をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサ上に２５ｎＭでロードした。ＬＲＲＣ１５－Ｆｃタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を５００ｎＭで提供した。ＬＲＲＣ１５ ｒＥＶを０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質（２．５～３．５ｎＭ）で提供した。

【0389】

ＣＤ２４８は両方のスクリーニングにおいて最高のスコアリングヒットであり、その発現は腫瘍間質においてアップレギュレートされ（Ｒｏｕｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：７２２３－７２３６，２００８；Ｒｏｕｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，３９：７３－８９，２０１１；Ｔｅｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１０：９９３－１００，２０１９）、腫瘍成長を促進することが示唆されているため（Ｍａｉａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２：１－１２，２０１１）、ＬＲＲＣ１５－ＣＤ２４８相互作用を更なる特徴付けのために選択した。ＬＲＲＣ１５及びＣＤ２４８は、固形腫瘍においてアップレギュレートされることが独立して報告されているが（Ｒｏｕｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：７２２３－７２３６，２００８；Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７８：４０５９－４０７２，２０１８）、それらが同じ腫瘍試料において発現されたかどうかは不明であった。４つの異なる腫瘍適応症について、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）からのバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータにおいて、ＣＤ２４８及びＬＲＲＣ１５（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ）の発現間の有意な相関が同定された。これらの相関は、ＣＤ２４８及びＬＲＲＣ１５が同じ細胞型上に見出されるか、又は共調節されることを示唆する。これらの２つの可能性を区別するために、頭頸部癌患者からの単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータを再分析して、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ ２４８発現を強調した（Ｐｕｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７１：１６１１－１６２４ｅ．２４，２０１７）。この分析により、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ２４８がＣＡＦのサブセットで同時発現されることが明らかになり（同時生起スコア（オッズ比）＝９．４４）（図８Ｃ）、ＣＤ２４８は、ＤＣＮ及びＲＧＳ５などのマーカーを使用して同定された全てのＣＡＦ及び癌関連周皮（ＣＡＰ）細胞を包含するより広範な発現を示す（図９Ｃ）。

【0390】

まとめると、これらの結果は、組換えタンパク質発現に依存する他の技術に適合しない受容体のための新しい相互作用因子を同定するためのロバストな方法としてＲＤＩＭＩＳを位置付ける。さらに、ＬＲＲＣ１５とＣＤ２４８との間の相互作用が同じ細胞上で起こるのか細胞間で起こるのかは不明であるが、上記の分析は、これらのタンパク質が患者の腫瘍において相互作用する十分な機会を有し、この相互作用が関連し得る潜在的な生物学的状況を提供することを示唆している。

【0391】

Ａ．ＬＲＲＣ１５－ＣＤ２４８相互作用は膜上のＬＲＲＣ１５発現を必要とする
生物物理学的及び生化学的方法を使用して、ＬＲＲＣ１５－ＣＤ２４８相互作用を更に特徴付けた。最初に、小型ＡＶＥＸＩＳアッセイを、ＣＤ２４８五量体化外部ドメインを使用して行った。ＬＲＲＣ１５（図６Ａ）と同様に、ＣＤ２４８五量体化外部ドメインをＳＴＭタンパク質ライブラリに対してスクリーニングした場合、高信頼性ヒットは同定されなかった（図１０Ａ）。この結果と一致して、相互作用をＢＬＩ又は表面プラズモン共鳴のいずれかによって分析した場合、検出の感度を最大にする実験条件を用いた場合でさえ、ＬＲＲＣ１５組換えタンパク質とＣＤ２４８組換えタンパク質との間に結合は観察されなかった（図１０Ｂ及び１１Ａ）。ＬＲＲＣ１５及びＣＤ２４８の両方を組換え外部ドメインとして試験した場合、ＢＬＩ分析により、検出可能な結合の欠如が確認された。対照的に、ＥＶ上にＬＲＲＣ１５が示された場合、相互作用は容易に検出可能であった（図１１Ａ）。同様に、この相互作用は、細胞の原形質膜上でも観察することができた。第１に、空のベクター対照でトランスフェクトされた細胞よりも１０倍を超えて（図１１Ｂ）細胞表面上に過剰発現されたＣＤ２４８に結合したＬＲＲＣ１５を示すｒＥＶ（図１１Ｄ）。第２に、ＬＲＲＣ１５を細胞上に発現させ、蛍光標識ストレプトアビジンを使用してビオチン化及び四量体化したＣＤ２４８組換えタンパク質と共にインキュベートした。結合は、ＬＲＲＣ１５発現細胞では容易に検出可能であったが、対照タンパク質を発現する細胞では検出可能ではなかった（図１１Ｂ～１１Ｄ）。これらのアッセイは、この相互作用が膜を必要とするが、具体的にはｒＥＶを必要としないという考えを強化する。

【0392】

この相互作用の膜依存性の根底にあるかもしれないものをよりよく理解するために、コレステロール超微細構造（図１７Ａ～１７Ｃ）を形成するＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩを使用してｒＥＶ膜を破壊することによって、又はメチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）（図１７Ｄ～１７Ｆ）で膜コレステロールを枯渇させることによって、ｒＥＶ膜を変化させた（Ｐｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，４８：１０３５－１０４５，２００６）。細胞を１００μＭのＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ又は１５ｍＭのＭβＣＤで処理すると、ＢＬＩによって示されるように、ＬＲＲＣ１５ ｇＤ－ＧＰＩ発現小胞のＣＤ２４８単量体への結合が全て排除された。これらの薬剤は、抗ｇＤ抗体によるｇＤエピトープタグの検出にも影響を及ぼした。興味深いことに、１００μＭのＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩもＣＤ２４８へのＬＲＲＣ１５ ＦＬ ｒＥＶの結合を劇的に減少させたが、ＭβＣＤではわずかな効果が観察された。

【0393】

ＬＲＲＣ１５及びＣＤ２４８は膜依存的に相互作用できることが示されたが、それらが同じ生理学的環境に存在するかどうかは知られていなかった。ＬＲＲＣ１５及びＣＤ２４８は、固形腫瘍においてアップレギュレートされることが独立して報告されているのに対し（Ｒｏｕｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：７２２３－７２３６，２００８；Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７８：４０５９－４０７２，２０１８）、それらが同じ腫瘍試料において発現されたかどうかは不明であった。４つの異なる腫瘍適応症についての癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ：ＴＣＧＡ）からのバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＣＤ２４８の発現とＬＲＲＣ１５の発現との間に有意な相関を示した（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ～９Ｃ）。この相関は、ＣＤ２４８及びＬＲＲＣ１５が同じ細胞型上に見出されるか、又はＣＤ２４８及びＬＲＲＣ１５が共調節されることを示唆した。その疑問に答えるのを助けるために、頭頸部癌患者からの単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータを再分析して、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ２４８の発現を強調した（Ｐｕｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７１：１６１１－１６２４．ｅ２４，２０１７）。これにより、ＬＲＲＣ１５及びＣＤ２４８がＣＡＦのサブセットで同時発現されることが明らかになり（同時生起スコア（オッズ比）＝９．４４）（図８Ｃ）、ＣＤ２４８は、ＤＣＮ及びＲＧＳ５などのマーカーを使用して同定された全てのＣＡＦ及び癌関連周皮細胞（ＣＡＰ）を包含するより広範な発現を示す（図９Ｃ）。相互作用の膜依存性を説明し得るいくつかのモデルがある。最も単純なモデルは、ＬＲＲＣ １５外部ドメインが適切な折り畳みのために膜環境を必要とすることである。興味深いことに、完全長及びｇＤ－ＧＰＩタグ付き外部ドメインの両方がこの相互作用を捕捉したので、この依存性を担う決定基は、膜貫通ドメイン内又は膜と外部ドメインとの間の正確な間隔内にない可能性がある。別の妥当な説明は、膜の存在が受容体の高度にクラスター化したアレイの形成を促進し、試験した五量体化を超えてタンパク質結合活性を増加させて相互作用を安定化することである。これは、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ及びＭβＣＤがこの相互作用を妨害し得るという証拠によって部分的に裏付けられる。特に、膜中のコレステロール（Ｂｏｌａｒｄ，ＢＢＡ－Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．，８６４：２５７－３０４，１９８６）のようなヒドロキシステロールに結合するが除去しないと考えられるＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩは、受容体がクラスター形成する能力を低下させる可能性がある。Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩは膜に一般的な破壊を引き起こし、したがって完全長及びｇＤ－ＧＰＩタグ付き種の両方に影響を及ぼす可能性があるが、ＭβＣＤの効果は主にｇＤ－ＧＰＩタグ付きＬＲＲＣ１５に対するものであった。これは、葉酸受容体のようなＧＰＩアンカー型受容体がクラスター形成のために膜コレステロールに依存することを示唆する研究と一致している（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１１：２９３１－２９３８，１９９０）。あるいは、ＬＲＲＣ１５－ＣＤ２４８相互作用は、複合体を促進又は安定化するまだ未知の因子の動員に依存し得る。

【0394】

免疫蛍光アッセイのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃で３０分間、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ－Ｄ－リジン（Ｇｉｂｃｏ）でコーティングした９６ウェルＳＥＮＳＯＰＬＡＴＥＳ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に分割した。製造業者の仕様に従ってＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞をトランスフェクトした。蛍光ｒＥＶ実験のために、ｇａｇ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ及び目的の受容体を一過性に同時トランスフェクトしたＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞からｒＥＶを回収した。細胞及び残屑を除去するために、３００×ｇで１０分間のスピン及び３，０００×ｇで１時間のスピン後、１００，０００×ｇで９０分間の超遠心分離によってそれらを精製した。ｒＥＶをＰＢＳに再懸濁し、４℃で３０分間細胞とインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡを使用して１０分間固定した。ＥＺ－ＬＩＮＫ（商標）Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＣＤ２４８タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をビオチン化し、Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて四量体化した。ＤＮＡを１０μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。

【0395】

全体として、これらの結果は、ＣＤ２４８がＬＲＲＣ１５の新しい相互作用パートナーであることを確認し、ＬＲＲＣ１５－ＣＤ２４８相互作用が膜との関連で促進されることを示す。これらの知見は、膜タンパク質を伴う相互作用の検出のための性能の向上をもたらし、組換えタンパク質の使用を必要とする他の技術に対して抵抗性であるＲＤＩＭＩＳの利点を強調している。

【0396】

タンパク質インタラクトームの同定を超えて、ｒＥＶベースの受容体ディスプレイは、膜における受容体挙動の定量的調査を提供することができる。例えば、ＢＬＩを使用して、膜（図１１ Ａ）中の受容体とそのリガンドとの結合動態を特徴付けることができる。

【0397】

実施例６．Ｇタンパク質共役受容体相互作用スクリーニングは、接着ＧＰＣＲ Ｂ１（ＡＤＧＲＢ１）と呼ばれるＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）の新規受容体の発見を可能にする
Ａ．背景
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーは、ヒトゲノム中の細胞外タンパク質のほぼ２０％を包含し、全てのＦＤＡ承認薬の１／３超の標的である。しかしながら、通常は細胞外タンパク質相互作用を破壊する２つの生物学的薬物のみがＧＰＣＲを標的とする。ＧＰＣＲは、部分的には、ＧＰＣＲの細胞外相互作用マッピングがヒトゲノムの残りの部分より遅れているため、生物学的薬物開発において遅れをとっている。したがって、癌における免疫療法の標的となる受容体の相互作用をマッピングするために、ＧＰＣＲに焦点を当てた細胞外相互作用スクリーニングを実施した。接着ＧＰＣＲ Ｂ１（ＡＤＧＲＢ１）と呼ばれるＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）の新規受容体が観察された。第２に、ＡＤＧＲＢ１の相互作用をヒトゲノム中の単一膜貫通受容体の大部分に対してマッピングし、ＩＣＯＳＬＧ（誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド）との新規な相互作用を観察した。これらのデータは、新しい生物学のマッピング及び癌における治療的介入のための新しい道の開発におけるＧＰＣＲ相互作用スクリーニングの可能性を実証している。

【0398】

細胞のタンパク質／タンパク質相互作用を理解するために、「インタラクトミクス（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ）」と呼ばれることが多い相互作用マッピングの分野が開発された。１９８９年の酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Ｙｏｕｎｇ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，５８（２）：３０２－３１１，１９９８）の開発から始まり、相互作用マッピングは、生理学的条件下及び疾患においてタンパク質相互作用ネットワークがどのように機能するかについて多くの洞察をもたらした。最近、インタラクトミクスの分野は、コンテキスト特異的タンパク質ネットワークの完全なマッピングで発展している（Ｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９５：１２０－１２４，２０２１；Ｈｕｔｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（１１）：３０２２－３０４０，２０２１）。タンパク質／タンパク質相互作用のマッピングにおける主要な課題の１つは、細胞膜に埋め込まれたタンパク質を含むことである。システイン還元及びグリコシル化（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ，２０１７：２１９７６１５，２０１７）などの翻訳後修飾をしばしば伴う典型的には一過性の相互作用のために、細胞外空間における相互作用ネットワークを定義することは更に困難である。したがって、細胞外タンパク質相互作用マッピングは、この分野を前進させるために新しい技術が必要とされているため、インタラクトミクス分野において遅れをとっている。

【0399】

細胞外相互作用技術の開発への重要な洞察の１つは、アビディティーが一過性であるが生理学的に関連する細胞外タンパク質相互作用を解読するための重要な構成要素であるという認識であった（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，５７（４）：４４８－４５８，２０１２）。ヒトゲノム中のほとんどの細胞外タンパク質にわたる相互作用をマッピングするために結合活性を利用するためのスクリーニングが開発されている。例えば、ポリオウイルスレセプター（ＰＶＲ）がＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）と相互作用するという発見は、潜在的なタンパク質をＦｃタグ付き二量体としてスクリーニングすることによってなされた（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０（１）：４８－５７，２００９）。マイクロビーズは、リガンドを多量体化し、タンパク質マイクロアレイに対してスクリーニングして、ヒトアデノウイルスの細胞外インタラクトームをマッピングするために使用されてきた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７：１１４７３，２０１６）。同様に、バキュロウイルスを、これらのタンパク質マイクロアレイに対するスクリーニングのための多量体化プローブとして受容体を提示する方法として使用した（Ｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７９：１－５，２０１５）。Ｆｃタグ付き細胞外タンパク質の大規模ライブラリは、マイクロビーズ（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８：２３１０－２３２３，２０１９）及びアビディティベースの細胞外相互作用スクリーニングのための遺伝子融合によって多量体化されたリガンド（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８；Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８２：３２９－３４４．ｅ１９，２０２０）を使用して相互作用をスクリーニングするために使用されてきた。しかしながら、これらの成功にもかかわらず、細胞外タンパク質の１つの主要なファミリー、多重膜貫通受容体（ＭＴＭＲ）が、インタラクトミクススクリーニングにおいて足間スクリーニングにおいて依然として扱いにくいままである。

【0400】

ヒトゲノムは、細胞外空間と相互作用する５，０００を超える受容体及び分泌タンパク質をコードする。単一膜貫通受容体は、２，０００を超えるこれらの細胞外タンパク質を包含するが、分泌タンパク質は６００を超える（Ｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１２（６０９），２０１９）。残りの２，０００個未満の細胞外タンパク質はＭＴＭＲであり、そのうち８００個超がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する。ＧＰＣＲスーパーファミリーは、それに対して開発された成功した臨床治療薬の豊富な歴史を有しており、ＦＤＡ承認された全薬物の１／３がこれらの８００個のＧＰＣＲのうちのちょうど１００個超を標的としている（Ｃｏｎｇｒｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８１（１）：８１－９１，２０２０）。ＧＰＣＲスーパーファミリーの残りのメンバーには４００を超える嗅覚受容体が含まれるが、これらの受容体はほとんどが嗅上皮での発現が制限されている。しかしながら、嗅覚受容体は、嗅覚受容体が嗅上皮の外側で発現される組織における疾患モデルにおいて生理学及び調節不全の重要なドライバーであることが示されているため（Ｐｒｏｎｉｎ ａｎｄ Ｓｌｅｐａｋ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９６：１００４７５，２０２１）、嗅覚受容体は薬物開発の検討から除外されるべきではない。ＧＰＣＲスーパーファミリーは、ほとんど全ての生理学的系において重要であり、受容体が原形質膜で発現されるが、それらの発現は比較的低く、特定の細胞型に限定されているので、そのような成功した薬物標的である。

【0401】

原形質膜局在化及びＧＰＣＲスーパーファミリーの低く制限された発現は、これらのタンパク質を薬物開発のための理想的な標的にするが、これらの同じ特性は、ＧＰＣＲ生物学を研究するための固有の課題を提示する。実際、重要な生理学的機能を制御する未知のリガンドを有するオーファンＧＰＣＲは依然として１００を超える（Ｌａｓｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１５３：６２－７４，２０１８）。さらに、ＧＰＣＲの相互作用マッピングは、他の細胞外タンパク質に遅れをとっている（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，７１（４）：５０３－５１９，２０１９）。ＧＰＣＲはまた、生物学的薬物開発において過小評価されている。ＧＰＣＲはＦＤＡ承認薬の３０％超を包含するが、ＧＰＣＲスーパーファミリーはＦＤＡ承認生物学的薬物の２％の標的にすぎない（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０（８）；９２５－９３５，２０２０）。生物学的薬物開発は、ロバストなタンパク質相互作用の破壊又は増強、組織標的化、及びコンジュゲート薬物送達を可能にする（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７（１）：１，２０２０）。第２に、抗原として利用可能な事実上任意のアロステリック部位に対する複雑なファーマコフォアを開発することが可能であり、この可能性は、偏ったアゴニスト又はアロステリックモジュレーターなどの次世代ＧＰＣＲ薬物クラスの開発を促進する可能性がある。したがって、相互作用マッピング及び生物学的薬物特性評価を可能にするＧＰＣＲに焦点を当てたツールのセットを構築した。

【0402】

本明細書に記載の第１のＧＰＣＲに焦点を当てたプラットフォームは、リガンド多量体化を利用して細胞表面上のタンパク質／タンパク質相互作用を検出する細胞過剰発現系である。第２に、ＧＰＣＲを組換え細胞外小胞（Ｇｅｅｕｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０：１－１２，２０１９）にパッケージングし、Ｆｃタグ付き単一膜貫通受容体細胞外ドメイン（Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８２：３２９－３４４．ｅ１９，２０２０）の最近公開されたライブラリに対する相互作用についてスクリーニングした。これらの相補的アプローチを使用して、オーファンリガンドをヒトゲノム中の全てのＧＰＣＲにわたってスクリーニングすることができ、オーファンＧＰＣＲを細胞外空間中のほとんどのタンパク質に対してスクリーニングすることができる。

【0403】

Ｂ．包括的な細胞ベースの過剰発現相互作用スクリーニングの使用は、接着受容体Ｂ１（ＡＤＧＲＢ１）がＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）の新規受容体であることを明らかにする
哺乳動物過剰発現ベクターにおける多重膜貫通受容体の包括的なライブラリを、ゲートウェイドナーベクターにおける多重膜貫通受容体のそれらの集合体をｐＴ－Ｒｅｘ－ＤＥＳＴ３１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングするために、ＤＮＡＳＵプラスミドリポジトリ（Ｓｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ），Ｄ１２５３－１２６０）と協力して開発した。これにより、細胞の表面上に検出されたＮ末端ＨＩＳタグが作成された（図１８Ａ）。さらに、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ及びＣ末端Ｖｅｎｕｓを有するＧタンパク質共役受容体に焦点を当てたＤＮＡライブラリを作成した。ＧＰＣＲ集合体により、低発現受容体（図１８Ｂ）の検出が可能になった。全体として、ＨＩＳタグ付きＭＴＭＲ集合体は、ほとんどが標識されていない受容体が細胞表面で過剰発現されることを可能にし（図１８Ｃ）、一方、ＧＰＣＲ－Ｖｅｎｕｓ集合体は、バックグラウンド染色を上回る低発現受容体の検出を可能にする（図１８Ｄ）。

【0404】

この包括的ライブラリを使用して、ハイスループットトランスフェクション及びハイコンテンツイメージングを使用して、４つの蛍光標識ペプチドリガンドをスクリーニングした（図２３）。ＥＧＦ及びＲＳＰＯ３は、よく特徴付けられた受容体を有することから選択された。ＰＤ－Ｌ１及びＰＶＲは、受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーの複雑なネットワークに結合し、多くの生物学的治療薬の標的である（Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０：１４２５－１４３４，２０１９）。ＥＧＦ－６４７は、トランスフェクション対照（図１９Ａ）として各プレートに添加した対照ＥＧＦＲのみに結合した。Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）をＡｖｉｄｉｔｙ ＡＶＩＴＡＧ（商標）（Ａｖｉタグ）に融合して、ＡＰＣ標識ストレプトアビジンによるビオチン化及び四量体化を可能にした。この四量体化ＲＳＰＯ３は、その既知のＧタンパク質共役受容体、ロイシンリッチリピートＧＰＣＲ（ＬＧＲ）４及び５（図１９Ｂ）に結合した。ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）の細胞外ドメインを四量体化し、対照としてスクリーニングに加えられた対照の単一膜貫通受容体ＣＤ２２６にのみ結合することが見出された（図１９Ｃ）。

【0405】

プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の細胞外ドメインを蛍光四量体としてスクリーニングした場合、それは対照及び接着ＧＰＣＲＢ１（ＡＤＧＲＢ１）にも結合した（図１９Ｄ）。この予想外の発見に基づいて、潜在的な相互作用タンパク質のファミリーに対する１つのＧＰＣＲの完全な相互作用をマッピングするための方法が開発された。

【0406】

Ｃ．ＡＤＧＲＢ １及びロイシンリッチＧＰＣＲの小胞ベースの相互作用マップ
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の相互作用をマッピングするために、組換え細胞外小胞（ｒＥＶ）（Ｇｅｅｕｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０：１－１２，２０１９）を使用した。ｒＥＶは、実施例１に記載されるように、ＨＩＶ由来のＧＡＧタンパク質と共に目的の受容体を同時トランスフェクトすることによって生成される。ＧＡＧは、均一なパッケージング配向（図２０ Ａ）及びサイズ（図２０Ｂ～２０Ｄ）を有する微小胞及びエキソソーム（Ｇｅｅｕｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１６：６０３－６３３，２０２１）の産生を刺激する。ＧＡＧコトランスフェクションは、受容体の小胞へのパッケージングを増強し（図２０Ｅ及び２０Ｆ）、ＧＰＣＲは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して示されるように、ｒＥＶに効率的に輸送された（図２０Ｇ）。ＢＬＩは、会合曲線が反転している小胞の検出を可能にし（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｃｔｅｔ（登録商標） Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｓａｔｏｒｉｕｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ，２０２１）、会合が本発明者らのＢＬＩ読み出しにおいてｒＥＶサイズの粒子との会合であるという確信的な決定を可能にする。

【0407】

ポリオウイルスレセプター（ＰＶＲ）及びプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を蛍光標識ＧＡＧと共に小胞にパッケージングし、これらのｒＥＶを包括的多重膜貫通ライブラリに対してスクリーニングした。図１８Ａ～１８Ｄに示す組換えタンパク質と同様に、ｒＥＶにパッケージングされたＰＶＲは、対照単一膜貫通受容体（図２１Ａ）のみに結合し、ＰＤ－Ｌ１は対照受容体並びにＡＤＧＲＢ１に結合した（図２１Ｂ）。

【0408】

次に、最近公開された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７：１１４７３，２０１６；Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８２：３２９－３４４．ｅ１９，２０２０）アビディティベースのタンパク質の細胞外相互作用ライブラリを、ｒＥＶにパッケージングされたＧＰＣＲの相互作用をマッピングするように適合させた。簡潔には、ライブラリは、培地への分泌のためのシグナル配列を有する哺乳動物発現ベクター中のＦｃタグ付きタンパク質の大きな集合体を含む。トランスフェクション後、馴化培地をプロテインＡ被覆白色プレート上でインキュベートし、したがって上記のように培地からタンパク質を捕捉する。このスクリーニングのために、受容体－リガンド相互作用の迅速かつ高感度の検出を可能にするために、各ＧＰＣＲをＲｌｕｃ８（Ｌｏｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１９（９）：３９１－４００，２００６）に融合した。タンパク質ライブラリのメンバーに結合するｒＥＶにパッケージングされたＧＰＣＲを、ルシフェラーゼ産生光を使用して検出した。

【0409】

ＡＤＧＲＢ１を、Ｆｃ（図２１Ｃ）に融合された単一膜貫通受容体細胞外ドメイン（ＳＴＭライブラリ）の集合体に対してスクリーニングした。ＡＤＧＲＢ １及びＲＴＮ ４ Ｒファミリーメンバー（Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９（１）：２０５，２０１８）並びにＰＤ－Ｌ１間の相互作用が確認された。ＰＤ－Ｌ１に関連するタンパク質であるＩＣＯＳＬＧ（表１５；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２３：５１５－５４８，２００５）を含むいくつかの新規相互作用も明らかになった。図２６Ａ～２６Ｆは、ＡＤＧＲＢ１、ＬＧＲ４、又はＬＧＲ５を含むＥＶの、ＳＴＭライブラリ又はＦｃに融合した分泌タンパク質のライブラリへの結合についてのスクリーニングの結果を示す。これらのスクリーニングで同定された新規相互作用を表１５に示す。

【表15】

【0410】

Ｄ．組換えタンパク質は、見出されたＡＤＧＲＢ１結合剤を確認する。

【0411】

組換えタンパク質を使用して、いくつかの相互作用を確認した（図２２Ａ）。Ｖｅｎｕｓに融合したＡＤＧＲＢ１を過剰発現する細胞（図２２Ｂ）を、Ｆｃタグに融合した組換えＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳＬＧ、又はＲＴＮ４Ｒで処理し、Ｆｃタグに対する染色によってロバストな結合が観察された。この結合は、ＡＤＧＲＢ ２又はＡＤＧＲＢ ３では観察されなかった（図２４Ａ～２４Ｃ）。

【0412】

Ｅ．考察
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）相互作用マッピングは、強力であるが未開発の研究分野である。この実施例では、２つの相互作用マッピングプラットフォームがＧＰＣＲに対応するように適合されている（図２３）。第１は、オーファンリガンドに対する新規受容体を発見するために使用することができる細胞ベースのプラットフォームである。ここで、この細胞ベースのプラットフォームを使用して、接着ＧＰＣＲ Ｂ１（ＡＤＧＲＢ１）と呼ばれるＰＤ－Ｌ１のこれまでに認識されていない受容体を発見した。第２に、上記のように、組換え細胞外小胞（ｒＥＶ）中のＧＰＣＲを使用して、アビディティベースの相互作用スクリーニングを実施した。このようにして、目的のＧＰＣＲを、潜在的な相互作用パートナーのライブラリに対してスクリーニングすることができる。この小胞ベースのプラットフォームを使用して、ＡＤＧＲＢ １がＩＣＯＳＬＧに結合することが示された。

【0413】

ＡＤＧＲＢ１は、顕著な長いＮ末端を共有する３３個の接着ＧＰＣＲのファミリーに属する。接着ＧＰＣＲは、ゴルジ体内のこの長い細胞外ドメインを自己タンパク質分解するが、原形質膜で一緒に複合体化したままであると考えられている。リガンドが結合すると、プロテアーゼ活性化受容体ファミリーと同様に（Ｎｉｊｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１１４：８８－１０２，２０１６）、大きな細胞外ドメインが７回膜貫通ドメインから解離し、残りの短いストークが７回膜貫通ドメインを活性化する。接着ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質を活性化し、アレスチンも動員することが示されている（Ｋｉｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９１（７）：３３８５－３３９４）。ＡＤＧＲＢ １の大きな細胞外ドメインはリポ多糖及びホスファチジルセリンに結合し、受容体活性化は細菌細胞及びアポトーシス細胞の貪食を促進すると考えられている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１６８）：４３０－４３４，２００７；Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，２８（５）：２２１４－２２２４）。マクロファージ上のＡＤＧＲＢ １発現は以前に実証されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１６８）：４３０－４３４，２００７）が、最近では、この観察に異議が唱えられている（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：９６２，２０１９）。ＡＤＧＲＢ １は、癌細胞においてダウンレギュレートされる腫瘍抑制遺伝子であることも知られている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，３３（６）：１００４－１０１６ｅ１５，２０１８）。

【0414】

Ｔ細胞活性化のための２つの古典的リガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＩＣＯＳＬＧ）へのＡＤＧＲＢ１結合が観察されたことに注目することは興味深い。しかしながら、これらのリガンドは、ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞を阻害し、ＩＣＯＳＬＧがそれらを活性化するＴ細胞活性化に対して反対の効果を有することが知られている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２３：５１５－５４８，２００５）。腫瘍がＴ細胞を回避する方法の１つは、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現させることによるものであり、これはＴ細胞のサイレンシングを駆動し、したがって腫瘍が免疫系を回避することを可能にする。実際、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞サイレンシングを脱抑制する生物学的薬物によって標的化されており、癌のための証明された臨床的に有効な免疫療法である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７（１）：５５３２，２０１７）。ＡＤＧＲＢ１と、ＰＤ－Ｌ１及びＩＣＯＳＬＧとの相互作用は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断が無効であり得ることから（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１２：６８１３２０，２０２１）、薬物開発のための新しい道を提供し得る。

【0415】

１つの解明されていない疑問は、ＡＤＧＲＢ１と、ＰＤ－Ｌ１及びＩＣＯＳＬＧとの相互作用がシグナル伝達に及ぼす影響である。異種細胞株においてＡＤＧＲＢ１ベースのシグナル伝達モデルを開発することは困難であった（図２５Ａ～２５Ｄ）。最近、別の接着ＧＰＣＲファミリーメンバーが、Ｎ末端結合に応答して、また７回膜貫通ドメインに直接結合するコレステロールでの処理によってＧ_αｉを活性化することが示された（Ｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５８９（７８４３），６２０－６２６，２０２１）。以前の研究は、ＡＤＧＲＢ １がＨＥＫ細胞において切断されないこと（Ａｒａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３１（６）：１３６４－１３７８，２０１２）、及びＡＤＧＲＢ１がＥＬＭＯと呼ばれる非標準エフェクターを介してシグナル伝達すること（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１６８）：４３０－４３４，２００７）を示している。ＡＤＧＲＢ１の活性化は、関連する細胞株又はｉｎ ｖｉｖｏにおいてのみ可能であり得る。

【0416】

ＧＰＣＲは、多くの薬物開発プログラムにとって重要な標的である。ＧＰＣＲに対する多くの小分子剤が、診療所に首尾よく持ち込まれている。しかしながら、生物製剤などの新規な薬物モダリティは、ＧＰＣＲ薬物開発のための小分子に遅れを取っている。新規なモダリティ、特に抗体ベースの生物学的製剤は、細胞外タンパク質相互作用を標的とし、受容体活性化を調節するためのロバストな方法を提供する。ここでは、ＧＰＣＲ細胞外相互作用をマッピングするための方法が開発され、癌免疫療法に関連する新しい相互作用が見出された。

【0417】

Ｆ．材料及び方法
細胞培養
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ７細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４及びペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）中で維持した。ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞を、１５０ＲＰＭで振盪しているＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地中で培養した。

【0418】

多重膜貫通受容体ライブラリの作製
受容体を、ｐＴ－Ｒｅｘ－ＤＥＳＴ３１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐＲＫプラスミド（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のいずれかにクローニングし、配列を確認した。１００ｎｇの受容体ＤＮＡ（１０μＬ／ウェルに対して１０ｎｇ／μＬ）を３８４ウェルブラックＡｕｒｏｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（カタログ番号ＡＢＣ２－３１２－１Ｂ－ＰＤＬ）の各ウェルにプレーティングした。ＤＮＡ印刷Ａｕｒｏｒａプレートを密封し、実験日まで－２０℃で保存した。

【0419】

トランスフェクションの日に、ＤＮＡ印刷Ａｕｒｏｒａプレートを室温で解凍し、スピンダウンした。１：０．００７２に希釈したＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＬＴＸ及び１：０．００２４に希釈したＰＬＵＳ（商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５３３８１００）を含む２０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１０５８０２１）を３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２下、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰ／Ｓ中１５０，０００細胞／ｍＬで希釈したＣＯＳ７細胞２０μＬを各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２と共に３７℃で４８時間インキュベートした。

【0420】

受容体発現分析
４８時間後、発現を受容体蛍光によって確認した。細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）＋５％ＢＳＡ中、３７℃、５％ＣＯ_２で４５分間飢餓状態にした。次に、ウサギ抗ＨＩＳ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２３６５）又はマウス抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ３１６５）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）＋５％ＢＳＡで１：１０００に希釈し、細胞上で４℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇで洗浄し、室温で２０分間、４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇで再度洗浄し、室温でＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）＋５％ＢＳＡで１：１０００に希釈したウサギ又はマウスＡｌｅｘａ－６４７二次抗体で染色した。次いで、細胞を洗浄し、次いで、室温で２０分間、１μｇ／ｍＬでＤＡＰＩ染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号６２２４８）し、再び洗浄し、ＰＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇ中で４℃にて撮像日まで保存した。

【0421】

受容体発現を、ＤＡＰＩ、ＧＦＰ及びＣｙ５のための予め設定されたフィルタを備えたＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１０倍対物レンズを使用して２つの撮像視野を捕捉することによって評価した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔソフトウェアを使用して、ＤＡＰＩ、ＧＦＰ、及びＣｙ５チャネルの対象領域を描画し、物体の総数並びに視野全体のピクセル密度をカウントした。全発現は、ＧＦＰチャネルを細胞の総数（ＤＡＰＩカウント）で割ったものとして表される。表面発現は、抗体チャネル（Ｃｙ５）を細胞の総数で割ったものとして表される。

【0422】

細胞ベースの相互作用スクリーニング
受容体発現分析と同様に、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標＋５％ＢＳＡにおけるトランスフェクションの４８時間後に細胞をブロックした。一次抗体の代わりに、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）＋５％ＢＳＡで希釈した１００ｎＭ四量化リガンドで細胞を４℃で４５分間処理した。四量体を、以前に記載されたように（Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８２（２）：３２９－３４４．ｅ１９，２０２０）、わずかな変更を加えて調製した。簡潔には、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＰＪ２７Ｓ）及び目的のビオチン化タンパク質（ＲＳＰＯ３及びＰＶＲは社内で製造し、ＰＤ－Ｌ１はＢｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅから購入した、カタログ番号ＡＶＩ１５６）の総質量を計算した。必要とされるタンパク質の総体積を等分し、ストレプトアビジンの体積を、間に室温での１０分間のインキュベーションを用いて四段階で加えた。最終添加及びインキュベーションの後、四量体をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）＋５％ＢＳＡ中１００ｎＭの最終濃度に希釈した。ＥＧＦ－６４７については、蛍光タンパク質をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（カタログ番号Ｅ３５３５１）から購入し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）＋５％ＢＳＡで１００ｎＭに希釈した。次いで、細胞をＰＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇで洗浄し、室温で２０分間４％ＰＦＡに固定し、再び洗浄し、ＤＡＰＩ染色し（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号６２２４８）、画像化の日までＰＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇ中４℃で保存した。

【0423】

小胞ベースの相互作用スクリーニングのために、四量化リガンドの代わりに小胞を添加し、ＧＡＧをＮｅｏｎ Ｇｒｅｅｎに融合させた。

【0424】

受容体発現分析について上記のようにイメージングを行った。

【0425】

組換え細胞外小胞調製物
１００ｍＬのＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞に１００μｇのＤＮＡをトランスフェクトし、５０μｇのＧＡＧ ＤＮＡと５０μｇの受容体を分割した。トランスフェクションの７日後、細胞をスピンダウンし、培地を０．２ミクロンフィルタに通して濾過した。プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を、フィルタにかけた培地に添加し、これを２，０００×ｇの低速で３０分間回転させた。次に、媒体を１００，０００×ｇで９０分間回転させた。小胞ペレットをＰＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇ中で再構成し、実験日まで保存した。

【0426】

電子顕微鏡法
電子顕微鏡法を本明細書に記載のように実施した。小胞の懸濁液を、ホルムバール及び炭素被覆ＴＥＭグリッドの表面に１５分間吸着させた。蒸留水で少しすすいだ後、試料をＥＶ分取用の２％リンタングステン酸（ＰＴＡ）で６０秒間染色し、次いで風乾した。次いで、試料をＰＢＳで１５分間、水で１分間洗浄し、１％酢酸ウラニルで１分間染色した後、ブロットし、風乾した。ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及びＧＡＴＡＮ ＵＬＴＲＡＳＣＡＮ（登録商標）１０００ ＣＣＤカメラを用いて５０００倍～５００００倍の倍率で撮像を行った。スケールバーを画像に示す。

【0427】

ＮａｎｏＳｉｇｈｔ
小胞を清浄なＰＢＳで希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）データを収集し、清浄なＰＢＳをベースラインとして使用して３回平均した。

【0428】

バイオレイヤー干渉法
小胞をＰＢＳに希釈し、ｇＤ抗体（ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６５０７）及びＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ３１６５）をＰＢＳで１：１０に希釈し、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ（Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅカタログ番号７８９８－ＴＧＢ）を１００μｇ／ｍＬに希釈した。ＡＭＣチップ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号１８－５０８８）又はＡＨＣチップ（カタログ番号１８－５０６０）を使用して、抗体又はＦｃタグをそれぞれ捕捉した。

【0429】

小胞ベースの相互作用スクリーニング
小胞ベースの相互作用スクリーニングを上記のように行った。対照タンパク質及び追跡実験のため、組換えタンパク質及び抗体を白色の３８４ウェルプロテインＡ被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＮＣＩ１５１３３）の空のウェルに添加し、４℃で少なくとも２４時間インキュベートした。

【0430】

リガンド結合
リガンド結合のために、目的の受容体をリン酸カルシウムトランスフェクションを使用してＨＥＫ細胞で一過性に過剰発現させ、次いでＡｕｒｏｒａイメージングプレートにプレーティングしたことを除いて、相互作用スクリーニングと同じプロトコルを使用した。四量体化リガンドの代わりに、Ｆｃ融合タンパク質（ＢＩＯ－ＴＥＣＨＮＥ（登録商標）、ＰＤ－Ｌ１ カタログ番号ＡＶＩ１５６、ＩＣＯＳＬＧ カタログ番号ＡＶＩ１６５、ＲＴＮ４Ｒ カタログ番号１２０８－ＮＧ）を１０μｇ／ｍＬ（各二量体につき約７０ｎＭ）の濃度で細胞上でインキュベートした。その後、Ａｌｅｘａ－６４７に融合した抗ヒトＦｃを二次抗体として用い、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００で画像を撮影した。

【0431】

実施例７．異なる細胞株におけるｒＥＶベースのＲＤＩＭＩＳを使用した細胞状態プロファイリング
上記の実施例は、ｒＥＶを使用して、目的の受容体との相互作用を同定及び特徴付けることができることを実証している。さらに、一般にｒＥＶと相互作用するいくつかの結合パートナーが同定された（例えば、実施例４を参照）。目的の受容体並びに多くの他の膜タンパク質及び細胞質タンパク質が、親細胞におけるそれらの発現レベルに比例するレベルでｒＥＶに組み込まれているようであるため、これらの相互作用は、ｒＥＶについての起源細胞（親細胞）の状態のスナップショットを捕捉し得る。

【0432】

したがって、ｒＥＶは細胞表面タンパク質（例えば、所与の時点で細胞表面タンパク質の代表的な試料を捕捉することができる）を捕捉することができ、したがって、ＲＤＩＭＩＳを使用して、異なる細胞状態を有する細胞に関連する相互作用をプロファイリングすることができると仮定される。具体的には、ｒＥＶは、ｒＥＶの親細胞との細胞相互作用の代理として使用され得、例えば疾患特異的刺激、分化、及び細胞型の違いに起因して生じる重要な相互作用を捕捉し得る。このアプローチの１つの利点は、複合体及び複雑な相互作用ダイナミクスを含む細胞表面タンパク質の凝集体結合挙動だけでなく、グリコシル化マーク及び脂質のような非タンパク質成分に依存する相互作用も捕捉することである。

【0433】

方法
小胞出芽物質を発現する安定な細胞株及びＲＤＩＭＩＳの読み出し（例えば、ＲＤＩＭＩＳ、例えば、ｇａｇ－Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ｇａｇ－ＲＬｕｃ）の読み出しに付着した小胞出芽因子）を、Ｔ細胞（ＪＵＲＫＡＴ）、Ｂ細胞（ＢＪＡＢ）及び単球（ＴＨＰ １）を表す免疫細胞株；ニューロン細胞株；及び線維芽細胞株を含むがこれらに限定されない細胞株のために作製する。実施例１に記載したように、これらの細胞株からｒＥＶを作製する。

【0434】

細胞株及びそこから生成されたｒＥＶを、以下について実施する：
１．異なる細胞型を代表する異なる細胞株からのｒＥＶの相互作用プロファイルの違いの特徴づけ；及び
２．同じ細胞株由来のｒＥＶの相互作用プロファイルの経時的な特徴づけ（例えば、刺激の添加の前後の時点、シグナル伝達の誘導の前後の時点、及び／又は疾患関連状態（例えば、免疫疲弊）の誘導の前後の時点、又は分化経路若しくはプロファイルの２つ以上の時点）。１つのアプローチでは、ｒＥＶは、例えば刺激が加えられた後の選択された時点で収集される。別のアプローチでは、出芽因子が選択された期間中にのみ存在する（例えば、発現される）ように細胞株を改変する。出芽因子の発現は、以下を使用して制御され得る：
（ａ）小分子（例えば、細胞透過性小分子）、例えばＴ－ＲＥＸ（商標）システムの添加後に出芽因子の発現を緩和又は抑制する誘導性プロモーター；
（ｂ）タンパク質（例えば、出芽因子）が誘導時に急速に分解される小分子誘導分解システム（例えば、ＴＩＲ１オーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）システム）；又は
（ｃ）タンパク質（例えば、出芽因子）が分解ドメインを含み、タンパク質が誘導時に分解から保護される、小分子誘導安定化システム（例えば、Ｓｈｉｅｌｄ－１－ＦＫＢＰシステム）。

【0435】

コンストラクトの統合は、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ９又はゲノム工学技術を使用してコンストラクトをセーフハーバー遺伝子座に挿入することによって行うことができる。あるいは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステム（ＳＢＩ）などのランダム積分の方法を使用することができる。

【0436】

実施例８．膜タンパク質関連酵素活性を測定するためのＥＶの使用
上記の実施例は、ＥＶを使用して、膜の状況で膜タンパク質及び膜結合タンパク質を表示することができることを実証している。これには、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、及びホスファターゼなどの酵素活性を有するタンパク質が含まれる。そのようなタンパク質の活性をＥＶ上で検出及びアッセイすることができ、したがって、組換えタンパク質のために通常設計されたアッセイを使用して、膜中又は膜上の膜タンパク質の酵素効果の生化学的特徴付けを可能にする。

【0437】

１つのアプローチでは、酵素活性を有するタンパク質を含むｒＥＶが膜タンパク質の酵素アッセイに使用される。別のアプローチでは、酵素活性を有するタンパク質を含むｒＥＶは、例えば分子粘着剤の創薬に使用され、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、及びキナーゼは、同じＥＶ上の別の膜タンパク質に動員され得るか、又は特定の膜結合酵素活性を阻害することができる。

【0438】

ペプチダーゼ活性アッセイ
概念実証として、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）のペプチダーゼ活性を検出し、小胞でアッセイすることができるかどうかを試験した。完全長（ＦＬ）又はｇＤ－ＧＰＩ（ｇＤ）ＣＰＭのいずれかを小胞で発現させた。

【0439】

ペプチダーゼ活性のアッセイを以下のように行った。このアッセイは、組換えヒトカルボキシペプチダーゼＭタンパク質（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標））の使用のための製造業者によって提供されたプロトコルから修正された。

【0440】

１．ＥＶを希釈した。アッセイ緩衝液２００μＬを添加し、以下に列挙するように更なる試薬を添加した。

【0441】

２．基質Ｂｚ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＯＨ（５０ｍＭストック溶液）をアッセイ緩衝液（６３００μＬアッセイ緩衝液中１２６μＬ）で１ｍＭに希釈した。

【0442】

３．１５０μＬのＥＶ及び１５０μＬの１ｍＭ基質を混合した。１５０μＬの１ｍＭ基質のみを含有する対照を調製した。

【0443】

４．反応物を室温で１０分間インキュベートした。

【0444】

５．０．１％（ｖ／ｖ）２－メルカプトエタノールを含有する０．２Ｍ ＮａＯＨ中の１５ｍＭ ｏ－ＰＡを含有する溶液３００μＬを添加し、よく混合することによって反応を停止させた。（１２６０μＬの２Ｍ ＮａＯＨ＋１２．６μＬのＢｍｅ＋５０７μＬのｏ－ＰＡ＋１０．８ｍＬの水）

【0445】

６．反応停止後、１５０μＬのＥＶを対照に添加した。

【0446】

７．全ての試料を室温で１０分間インキュベートした。

【0447】

８．１９５μＬのインキュベートした試料をプレートに三連でロードした。

【0448】

９．残りのＥＶ溶液もプレートに添加して、基質バックグラウンドがないことを確認した。

【0449】

１０．エンドポイントモードで、それぞれ３３０ｎｍ及び４５０ｎｍの励起波長及び発光波長で試料を読み取った（トップリード）。

【0450】

アッセイの結果を図２７に示す。ＣＰＭ発現ＥＶに対するロバストなペプチダーゼ活性が検出された（図２７）。この活性は、ＣＰＭを過剰発現していないＥＶで観察された活性よりも有意に高かった（ｐＲＫ ＥＶ；ペプチダーゼ活性のバックグラウンドレベルを示すベクター対照）。この活性は、組換えタンパク質を使用して観察されたペプチダーゼ活性と比較して、より容易に検出可能であった。

【0451】

キナーゼ活性アッセイ
キナーゼ活性の徴候を小胞で検出できることも実証された：図２８に示すように、ＥＰＨＡ３ ＥＶとＥＰＨＡ３リガンドＥＦＮＡ１－Ｆｃ及びＥＦＮＡ５－Ｆｃとの同時発現は、小胞で検出されたＥＰＨＡ３リン酸化種の量を増強した。ＥＶを溶解し、試料緩衝液に入れ、アクリルアミド勾配ゲル上で泳動させてタンパク質種を分離した。次いで、それらをＥＰＨＡ３、リン特異性、チューブリン抗体及び一次抗体でブロットし、蛍光タグ付き二次抗体（６８０及び８００ｎｍのＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）色素）又は抗ヒト抗体のいずれかで検出して、発現されている様々なタンパク質上のＦｃ領域を検出した。次いで、ブロットをＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）装置で画像化した。同じ試料を、上下の画像に対応する２つの異なるゲルに別々にロードした。

【0452】

実施例９．小胞精製のための包括的ＥＶ結合剤の使用
今日までのＥＶ精製のゴールドスタンダードは超遠心分離であり、これは長く面倒なプロセスである。特定のＥＶを精製するためのいくつかの親和性ベースの方法があるが、それらはあまりにも汚れているか、受容体特異的であるか、又はＲＤＩＭＩＳスクリーニング及び大量のＥＶを必要とする他の用途に有用であるにはスケールが小さすぎるように設計されている。

【0453】

実施例４に記載されているように、包括的小胞結合剤が同定されている。これらの包括的小胞結合剤を使用して、馴化培地から直接ＥＶを親和性精製することができる。包括的小胞結合剤は、本明細書に記載の純粋な組換えＥＶに結合する能力によってランク付けされており（表９）、一般にヒトＥＶを精製するために使用することができる。１つのアプローチでは、上記の実施例において記載される結合条件がカラムにおいて再現される。１つのアプローチでは、カラムはプロテインＡ官能化ビーズ（例えば、プロテインＡセファロース（登録商標）カラムである）を含む。Ｆｃ領域（例えば、ヒトＦｃ領域）を含むように改変された上位の包括的ＥＶ結合剤（表９）の１つ以上を含む馴化培地をカラムに流し、カラムを洗浄し、次いでＥＶを含む馴化培地をカラムに流す。次いで、適切な方法、例えば高塩のような過酷な洗浄及び／又はタンパク質のＳＩＧＬＥＣファミリーのシアロ糖鎖のような特定のリガンドを使用してＥＶを溶出する。必要に応じて、迅速な超遠心分離に基づく浄化を行ってもよい。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図17F】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図20E】

【図20F】

【図20G】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図27】

【図28】

【配列表】

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【国際調査報告】