特表 2023-552750 機能性ペプチドが結合した生体適合ポリペプチドを含む炎症疾患の抑制用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-19

(54)【発明の名称】機能性ペプチドが結合した生体適合ポリペプチドを含む炎症疾患の抑制用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/64 20170101AFI20231212BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20231212BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 17/10 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20231212BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20231212BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20231212BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20231212BHJP

   C07K 14/435 20060101ALN20231212BHJP

【ＦＩ】

A61K47/64

A61P29/00

A61K38/00

A61K47/65

A61K38/10

A61K38/16

A61P17/00

A61P37/08

A61P17/06

A61P17/04

A61P17/10

A61P11/06

A61P11/02

A61P27/02

A61P19/02

A61P11/00

A61P17/02

A61P35/00

A61K38/08

A61K8/64

A61Q19/00

A61K38/18

C07K19/00

C07K14/435

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023533311

(86)(22)【出願日】2021-10-15

(85)【翻訳文提出日】2023-05-30

(86)【国際出願番号】 KR2021014295

(87)【国際公開番号】W WO2022114521

(87)【国際公開日】2022-06-02

(31)【優先権主張番号】10-2020-0163705

(32)【優先日】2020-11-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

(71)【出願人】

【識別番号】521349233

【氏名又は名称】バイオヴィット カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】キム・ヨンテ

(72)【発明者】

【氏名】チュ・ウンビン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C083

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076CC05

4C076CC10

4C076CC18

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C083AD411

4C083EE12

4C083EE13

4C083EE14

4C083FF01

4C084AA01

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA18

4C084BA19

4C084BA23

4C084CA53

4C084CA59

4C084DA42

4C084DB52

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA341

4C084ZA342

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB131

4C084ZB132

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC521

4C084ZC522

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA50

4H045EA15

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の抑制または改善用組成物に関する。本発明の組成物は、人体に安全であるだけでなく、初期炎症を発生するサイトカインおよび腫瘍壊死因子を抑制して炎症を抑制するために広範に適用されることができ、炎症を阻害するための医薬品、医療製品、化粧品、日常用品などの分野に使用することができ、またさらなる新薬の開発にも活用されることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項2】

前記炎症疾患は、炎症性皮膚疾患および胃腸、食道、小腸、尿道、結膜の炎症性疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記炎症疾患は、アトピー皮膚炎、乾癬、喘息、接触性皮膚炎、鼻炎、結膜炎、関節炎、気管支炎、褥瘡、潰瘍、がん、魚鱗癬、天疱瘡、にきび、紅斑性狼瘡、皮膚老化および皮膚しわからなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記生体適合ポリペプチドは、イガイ接着タンパク質またはフジツボ接着タンパク質である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記イガイは、ミチルス・エドゥリス（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）、ミチルス・ガロプロヴィンシアリス（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）、およびミチルス・コラスカス（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｃｏｒｕｓｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記イガイ接着タンパク質は、配列番号７～配列番号１０のいずれか一つの配列を含むＦＰ－３、配列番号１２～配列番号１５のいずれか一つの配列を含むＦＰ－５、および配列番号１６の配列を含むＦＰ－６からなる群から選択される第１ペプチドの炭素末端やアミン末端あるいは両末端の全てに、配列番号１～配列番号５のいずれか一つの配列を含むＦＰ－１、配列番号６の配列を含むＦＰ－２、および配列番号１１の配列を含むＦＰ－４からなる群から選択される第２ペプチドが融合したタンパク質である、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記イガイ接着タンパク質は、ＦＰ－５の両末端にＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－１５１（配列番号１７～配列番号２１）；ＦＰ－３の両末端にＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－１３１（配列番号２２）；ＦＰ－５の両末端にＦＰ－２およびＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－２５１（配列番号２３）；およびＦＰ－５の両末端にＦＰ－３が互いに融合した形態のＦＰ－３５３（配列番号１７～配列番号２４）；からなる群から選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記機能性ペプチドは、抗菌ペプチド、細胞外基質タンパク質、および成長因子からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記機能性ペプチドは、抗菌ペプチドである、請求項８に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記生体適合ポリペプチドと機能性ペプチドは、直接結合するか、ペプチド性または非－ペプチド性リンカーを介して結合する、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記抗菌ペプチドは、ＫＬＷＫＫＷＡＫＫＷＬＫＬＷＫＡ（配列番号２９）、ＦＡＬＡＬＫＡＬＫＫＬ（配列番号３０）、ＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号３１）、ＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号３２）、ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬ（配列番号３３）、ＬＶＫＬＶＡＧＩＫＫＦＬＫＷＫ（配列番号３４）、ＩＷＳＩＬＡＰＬＧＴＴＬＶＫＬＶＡＧＩＧＱＱＫＲＫ（配列番号３５）、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ（配列番号３６）、ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＧＡＶＬＫＶＬ（配列番号３７）、ＫＫＬＦＫＫＩＬＫＹＬ（配列番号３８）、ＧＬＫＫＬＩＳＷＩＫＲＡＡＱＱＧ（配列番号３９）、ＧＷＬＫＫＩＧＫＫＩＥＲＶＧＱＨＴＲＤＡＴＩＱＧＬＧＩＡＱＱＡＡＮＶＡＡＴＡＲ（配列番号４０）、ＬＫＫＬＡＫＬＡＬＡＦ（配列番号４１）、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４２）、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号４３）、ＧＷＬＫＫＩＧＫＷＫＩＦＫＫ（配列番号４４）、ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ（配列番号４５）、ＲＲＷＷＣＲＣ（配列番号４６）、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４７）、ＬＫＫＬＡＫＬＡＬＡＦＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号４８）、ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ（配列番号４９）、ＦＬＫＬＬＫＫＬＡＡＫＬＦ（配列番号５０）、ＷＬＫＫＩＧＫＫＩＥＲＶＧＱＨＴＲＤＡＴＩＱＧＬＧＩＡＱＱＡＡＮＶＡＡＴＡＲ（配列番号５１）、およびＧＴＮＮＷＷＱＳＰＳＩＱＮ（配列番号５２）からなる群から選択される、請求項９に記載の薬学的組成物。。

【請求項12】

生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の改善用化粧料組成物。

【請求項13】

前記生体適合ポリペプチドは、イガイ接着タンパク質である、請求項１２に記載の化粧料組成物。

【請求項14】

前記機能性ペプチドは、抗菌ペプチドである、請求項１２に記載の化粧料組成物。

【請求項15】

前記炎症疾患は、アトピー皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、化膿性汗腺炎、ざ瘡、喘息、接触性皮膚炎、鼻炎、結膜炎、関節炎、気管支炎、褥瘡、潰瘍、がん、魚鱗癬、天疱瘡、にきび、紅斑性狼瘡、皮膚老化、および皮膚しわからなる群から選択される、請求項１２に記載の化粧料組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、機能性ペプチドが結合した生体適合ポリペプチドを含む炎症疾患の抑制用組成物に関し、より詳細には、イガイ接着タンパク質由来の生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む様々な炎症作用の抑制用組成物、例えば、医薬品、医療製品、化粧品、日常用品などに関する。

【背景技術】

【0002】

炎症とは、刺激による生体組織の防御反応の一つであり、兔疫細胞、血管、炎症媒介体などが関与し、細胞損傷を引き起こすすべての因子は、炎症の原因になり得る。炎症反応は、生体に加えられた損傷の要因を除去し、損傷した組織を再生して、生体内の生理機能を回復する人体の最も重要な生体防御メカニズムである。

【0003】

ヒトの炎症反応は、様々な複雑なシステムを介して調節される。炎症反応が生じると、血流の増加と血液毛細管の透過性が向上し、負傷、感染または免疫反応部位への白血球、抗体、サイトカインおよび補体といった大分子の移動を誘導し、高い血流量と炎症部位への血漿の流出は、熱、発赤、浮腫および痛症を引き起こす（Ｃａｌｄｅｒ ＰＣ．ｎ－３ Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．２００６；８３（６）:１５０５Ｓ－１９Ｓ）。また、病原体由来の分子、損傷した細胞の生成物、毒素またはアレルゲンのような炎症刺激によって引き起こされた炎症反応は、ＩＬ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）系のサイトカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）のような一部の細胞由来の媒介体の放出につながる。

【0004】

最近、産業化および西洋化による生活環境の変化に伴い、過敏性あるいは炎症性免疫疾患の発病率が急増しており、炎症が慢性化すると、アトピー、リウマチ関節炎のような自己免疫疾患だけでなく、成人病、心血管疾患、がんのような疾患として現れ得る。

【0005】

しかし、このような疾患を引き起こすにもかかわらず、炎症反応は、非常に複雑な機転を有しており、断片的にのみその作用機転が明らかになっており、炎症を治療するための薬物の場合、ほとんどが偶然に使用されたり、経験的に使用されているだけである。代表的には、炎症を抑制するための用途に使用される非ステロイド性物質としては、イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）やインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）などがあり、ステロイド性物質としては、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などがあるが、この場合にも、その詳細な薬理作用が明らかになり始めたのは最近のことであり、人体安全性に問題があるため使用が制限されている。

【0006】

一方、イガイやフジツボが分泌する接着剤は、タンパク質で構成されている生体接着剤であり、耐水性を示しており、固有の生分解性の特性により、微生物や酵素作用によって生分解される環境にやさしい接着剤である。そのうち、イガイの足糸から分泌するイガイ接着タンパク質は、生命体由来のバイオ基盤素材として、ヒト細胞を攻撃するか免疫反応を引き起こさないと知られて、手術時に生体組織の接着や折れた歯の接着などの医療分野において応用可能性が大きいバイオ素材として注目されてきた（韓国登録特許公報第１０－１５７８５２２号、韓国登録特許公報第１０－１６３１７０４号）。実際、イガイ接着タンパク質を生体適合素材として活用するために、生体特性を確認している。イガイ接着タンパク質の接触および投与が如何なる影響を及ぼすか確認するために、動物実験により臓器に及ぼす毒性と免疫反応に関する研究を行っており、結果、臓器ごとに毒性による特別な特異所見が見つからず、組織の壊死や急性炎症反応などが確認されなかった（Ｊ．Ｄｏｖｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｅｎｔａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １１２，８７９，１９８６）。したがって、既存のイガイ接着タンパク質に関する特許および研究は、ほとんどがその主要特性である接着性に注目している（韓国公開特許公報第１０－２０１８－００３３５１７号、韓国公開特許公報第１０－２０１８－００２９２２８号）。

【0007】

イガイ接着タンパク質に関する研究は、様々なイガイタンパク質の開発および遺伝子組換え技術を用いる大量生産に分けて行われており、主に、ミチルス・エドゥリス（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）、ミチルス・ガロプロヴィンシアリス（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）およびミチルス・コラスカス（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｃｏｒｕｓｃｕｓ）由来のイガイ接着タンパク質について知られている。イガイ接着タンパク質のメカニズムを明らかにするために、足糸タンパク質の種類およびそのアミノ酸配列が長い間研究されており、約１２種以上のタンパク質で構成されていることが明らかになった。

【0008】

一方、抗菌ペプチドは、自然免疫系の一員として、生体適合性に優れた最も安全な抗菌物質の一つであり、直接的な殺菌作用だけでなく、宿主の防御機能を調節すると知られている。既存の抗生物質とは異なる作用機転で作用し、抗生剤耐性を有する細菌は言うまでもなく、真菌に至るまでの広範で強力な死滅活性を示すことができ、病原性微生物を制御する作用時間も非常に速いと知られている（韓国登録特許公報第１０－１６５２２６３号）。しかし、抗菌ペプチドの抗炎症効果については本技術分野において具体的に知られていない。

【0009】

したがって、本発明者らは、生体適合ポリペプチドに各種の抗菌ペプチドが融合した組換えポリペプチドを開発し、前記組換えポリペプチドを用いて、より効果的に抗炎症効果を示すことで、アトピーなどの炎症性疾患に適用することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】韓国登録特許公報第１０－１５７８５２２号

【特許文献2】韓国登録特許公報第１０－１６３１７０４号

【特許文献3】韓国公開特許公報第１０－２０１８－００３３５１７号

【特許文献4】韓国公開特許公報第１０－２０１８－００２９２２８号

【特許文献5】韓国登録特許公報第１０－１６５２２６３号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｃａｌｄｅｒ ＰＣ．ｎ－３ Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．２００６；８３（６）:１５０５Ｓ－１９Ｓ

【非特許文献2】Ｊ．Ｄｏｖｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｅｎｔａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １１２，８７９，１９８６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、上述のような従来の技術の問題を解決するためのものであり、本発明の目的は、生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供するものである。

【0013】

また、本発明の目的は、生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の改善用化粧料組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記課題を解決するために、本発明は、生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0015】

一実施態様において、前記炎症疾患は、炎症性皮膚疾患、または胃腸、食道、小腸、尿道、結膜の炎症性疾患であることができるが、これに限定されるものではない。好ましい実施態様において、前記炎症疾患は、アトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、化膿性汗腺炎（ｈｉｄｒａｄｅｎｉｔｉｓ ｓｕｐｐｕｒａｔｉｖａ、ＨＳ）、ざ瘡（ａｃｎｅ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、鼻炎（ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、結膜炎（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、褥瘡（ｂｅｄｓｏｒｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、がん（ｃａｎｃｅｒ）、魚鱗癬、天疱瘡、にきび、紅斑性狼瘡、皮膚老化、または皮膚しわであることができるが、これに限定されるものではない。

【0016】

一実施態様において、前記生体適合ポリペプチドは、イガイ接着タンパク質またはフジツボ接着タンパク質であることができるが、これに限定されるものではない。好ましい実施態様において、前記イガイは、ミチルス・エドゥリス、ミチルス・ガロプロヴィンシアリス、またはミチルス・コラスカスであることができるが、これに限定されるものではない。

【0017】

一実施態様において、前記イガイ接着タンパク質は、配列番号７～配列番号１０のいずれか一つの配列を含む足糸タンパク質（ｆｏｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）－３（ＦＰ－３）、配列番号１２～配列番号１５のいずれか一つの配列を含むＦＰ－５、および配列番号１６の配列を含むＦＰ－６からなる群から選択される第１ペプチドのＣ－末端やＮ－末端、あるいは両末端の全てに、配列番号１～配列番号５のいずれか一つの配列を含むＦＰ－１、配列番号６の配列を含むＦＰ－２、および配列番号１１の配列を含むＦＰ－４からなる群から選択される第２ペプチドが融合したタンパク質であることができる。

【0018】

好ましい実施態様において、前記イガイ接着タンパク質は、ＦＰ－５の両末端にＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－１５１（配列番号１７～配列番号２１）；ＦＰ－３の両末端にＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－１３１（配列番号２２）；ＦＰ－５の両末端にＦＰ－２およびＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－２５１（配列番号２３）；およびＦＰ－５の両末端にＦＰ－３が互いに融合した形態のＦＰ－３５３（配列番号１７～配列番号２４）；からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。

【0019】

一実施態様において、前記機能性ペプチドは、抗菌ペプチド、細胞外基質タンパク質、または成長因子であることができ、抗菌ペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0020】

一実施態様において、前記生体適合ポリペプチドと機能性ペプチドは、直接結合するか、ペプチド性リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）または非－ペプチド性リンカーを介して結合することができるが、これに限定されるものではない。

【0021】

好ましい実施態様において、前記抗菌ペプチドは、ＫＬＷＫＫＷＡＫＫＷＬＫＬＷＫＡ（配列番号２９）、ＦＡＬＡＬＫＡＬＫＫＬ（配列番号３０）、ＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号３１）、ＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号３２）、ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬ（配列番号３３）、ＬＶＫＬＶＡＧＩＫＫＦＬＫＷＫ（配列番号３４）、ＩＷＳＩＬＡＰＬＧＴＴＬＶＫＬＶＡＧＩＧＱＱＫＲＫ（配列番号３５）、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ（配列番号３６）、ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＧＡＶＬＫＶＬ（配列番号３７）、ＫＫＬＦＫＫＩＬＫＹＬ（配列番号３８）、ＧＬＫＫＬＩＳＷＩＫＲＡＡＱＱＧ（配列番号３９）、ＧＷＬＫＫＩＧＫＫＩＥＲＶＧＱＨＴＲＤＡＴＩＱＧＬＧＩＡＱＱＡＡＮＶＡＡＴＡＲ（配列番号４０）、ＬＫＫＬＡＫＬＡＬＡＦ（配列番号４１）、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４２）、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号４３）、ＧＷＬＫＫＩＧＫＷＫＩＦＫＫ（配列番号４４）、ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ（配列番号４５）、ＲＲＷＷＣＲＣ（配列番号４６）、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４７）、ＬＫＫＬＡＫＬＡＬＡＦＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号４８）、ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ（配列番号４９）、ＦＬＫＬＬＫＫＬＡＡＫＬＦ（配列番号５０）、ＷＬＫＫＩＧＫＫＩＥＲＶＧＱＨＴＲＤＡＴＩＱＧＬＧＩＡＱＱＡＡＮＶＡＡＴＡＲ（配列番号５１）、またはＧＴＮＮＷＷＱＳＰＳＩＱＮ（配列番号５２）であることができるが、これに限定されるものではない。

【0022】

また、本発明は、生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の改善用の化粧料組成物を提供する。

【0023】

また、本発明は、上記開示された生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドまたは前記組換えポリペプチドを含む組成物、例えば、薬学的組成物または化粧料組成物を個体に投与するステップを含む炎症疾患の抑制または改善方法を提供する。

【発明の効果】

【0024】

本発明の組換えポリペプチドを含む組成物は、人体に安全なだけでなく、初期炎症を発生するサイトカインおよび腫瘍壊死因子を抑制して炎症を抑制するために広範に適用されることができ、炎症を阻害するための医薬品、医療製品、化粧品、日常用品などの分野に使用することができ、また、さらなる新薬の開発にも活用されることができる。

【0025】

本発明の上述の特徴とさらに他の特徴および利点は、例示的な目的に提供される下記の実施態様と図面をともに考慮すると明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明の組換えポリペプチドの三次構造モデルを示す。前記組換えポリペプチドは、イガイ接着タンパク質のＮ－末端およびＣ－末端に機能性ペプチドが結合している。ＭＡＰは、イガイ接着タンパク質を示す。

【図2】炎症性サイトカインであるＩＬ－６が本発明のＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を処理した後、著しく阻害されることを示すグラフである。

【図3】腫瘍壊死因子であるＴＮＦ－αがＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を処理した後、著しく阻害されることを示すグラフである。

【図4】１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール－１３－アセテート（ＴＰＡ）を処理したマウスの耳の厚さがＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を処理した後、正常対照群と同様になって炎症が減少することを示すグラフである。

【図5】炎症がある子犬の皮膚で本発明のＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を処理した後、炎症が著しく減少することを確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0028】

本発明は、生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む炎症疾患の予防または治療用組成物を提供する。

【0029】

本発明において、用語「炎症疾患」は、炎症誘発因子などの有害な刺激によって人体免疫系を過剰に亢進させてマクロファージのような免疫細胞から分泌するＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｄｉｎ）、ロイコトリエン（ｌｕｅｃｏｔｒｉｅｎｅ）または酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ、ＮＯ）のような炎症誘発物質（炎症性サイトカイン）によって引き起こされる任意の疾患を制限なく含む意味で使用される。

【0030】

本発明において、用語「治療」は、他に言及されない限り、前記用語が適用される疾患または疾病、または前記疾患または疾病の一つ以上の症状を逆転させるか、緩和させるか、その進行を抑制するか、または予防することを制限なく含む意味で使用される。また、哺乳動物において、炎症疾患の「治療」または「治療療法」は、下記の一つ以上を含むことができる。

【0031】

（１）炎症疾患の発達を阻止する。
（２）炎症疾患の拡散を予防する。
（３）炎症疾患を軽減する。
（４）炎症疾患の再発を予防する。および
（５）炎症疾患の症状を緩和する。

【0032】

本発明において、適用可能な炎症疾患は、炎症性皮膚疾患および胃腸、食道、小腸、尿道、結膜などの組織の炎症性疾患が制限なく含まれることができる。前記炎症疾患としては、アトピー皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、例えば、慢性蕁麻疹、化膿性汗腺炎、ざ瘡、例えば、集簇性ざ瘡（Ａｃｎｅ ｃｏｎｇｌｏｂａｔａ）、喘息、接触性皮膚炎、鼻炎、結膜炎、関節炎、気管支炎、褥瘡、潰瘍、がん、魚鱗癬、天疱瘡、にきび、紅斑性狼瘡、皮膚老化、皮膚しわなどの疾患が含まれることができるが、これに限定されるものではなく、皮膚での炎症反応によって引き起こされ得る任意の疾患が、全て本発明の皮膚疾患の範囲に含まれることができる。

【0033】

前記生体適合ポリペプチドは、イガイまたはフジツボ由来の接着タンパク質であることができ、イガイ由来の接着タンパク質であることが好ましいが、これに限定されるものではない。一実施態様において、前記イガイは、ミチルス・エドゥリス、ミチルス・ガロプロヴィンシアリス、およびミチルス・コラスカスからなる群から選択されることができ、好ましくは、ミチルス・ガロプロヴィンシアリスであることができるが、これに限定されるものではない。

【0034】

本発明において、イガイ接着タンパク質は、イガイから由来した接着タンパク質であり、湿気のある環境や乾燥した環境で自己接着が可能な接着性タンパク質であり、組換えイガイ接着タンパク質またはイガイ接着タンパク質の変異体（ｍｕｔａｎｔ）であることが好ましいが、これに限定されるものではなく、好ましくは、国際公開番号第ＷＯ２００６／１０７１８３Ａ１号または第ＷＯ２００５／０９２９２０号に記載の任意のイガイ接着タンパク質を制限なく含むことができる。前記イガイ接着タンパク質の変異体は、好ましくは、イガイ接着タンパク質の接着力を維持する前提の下で、前記イガイ接着タンパク質のカルボキシル末端（Ｃ－末端）やアミノ末端（Ｎ－末端）にさらなる配列を含むか、一部のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであることができる。より好ましくは、前記イガイ接着タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に、生理機能性ペプチド、例えば、ＲＧＤを含む３～２５個のアミノ酸からなるポリペプチドが連結されたものであるか、イガイ接着タンパク質をなすチロシン残基総数の１～１００％、好ましくは５～１００％、より好ましくは５０～１００％が３、４－ジヒドロキシフェニル－Ｌ－アラニン（ＤＯＰＡ）で置換されたものであることができる。

【0035】

市販のイガイ接着タンパク質の例としては、ソウル特別市麻浦区所在の（株）ＢｉｏＶｉｔによって販売されているイガイ由来組換え抗菌接着タンパク質であるＢＶ＿Ｓｅｒｉｅｓあるいは米国サウスキャロライナ州ノースオーガスタ所在のＫｏｌｌｏｄｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社が販売しているイガイ接着タンパク質があるが、これに限定されるものではない。

【0036】

一実施態様において、前記イガイ接着タンパク質は、それ自体で使用するか、ＦＰ－１、ＦＰ－２、ＦＰ－３、ＦＰ－４、ＦＰ－５、ＦＰ－６、およびその断片からなる群から選択されることができる。他の実施態様において、前記イガイ接着タンパク質は、ＦＰ－１、ＦＰ－２、ＦＰ－３、ＦＰ－４、ＦＰ－５、ＦＰ－６、およびその断片のうち２以上が互いに融合した融合タンパク質または融合ポリペプチドであることができる。

【0037】

好ましい実施態様において、前記イガイ接着タンパク質は、それ自体で使用するか、配列番号７、８、９または１０で記載するＦＰ－３、配列番号１２、１３、１４または１５で記載するＦＰ－５、または配列番号１６で記載するＦＰ－６に該当する第１ペプチドの炭素末端やアミン末端あるいは両方にイガイ接着タンパク質ＦＰ－１（配列番号１，２，３、４、５）、ＦＰ－２（配列番号６）またはＦＰ－４（配列番号１１）および各タンパク質の切片からなる群から選択される少なくとも一つの第２ペプチドが融合した融合タンパク質として使用されることができる。前記第２ペプチドとして選択されるタンパク質は、さらに、炭素またはアミン末端にスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）が含まれることができ、好ましいスペーサは、配列番号２５～配列番号２８のいずれか一つで記載するアミノ酸配列を含むことができる。前記スペーサは、配列番号２５、２６、２７、または２８が、複数回、例えば、２回以上繰り返されたペプチドを使用してもよい。

【0038】

好ましくは、前記第１ペプチドは、配列番号１２～配列番号１５のアミノ酸配列を含むＦＰ－５であり、前記第２ペプチドは、配列番号１～配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＰ－１である。より好ましくは、本発明で利用可能なイガイ接着タンパク質は、配列番号１～配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＰ－１のアミンあるいは炭素末端に配列番号２５～配列番号２８のいずれか一つのスペーサが結合した接着タンパク質である。

【0039】

他の実施態様において、前記イガイ接着タンパク質は、ＦＰ－５の両末端にＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－１５１（配列番号１７～配列番号２１）、ＦＰ－３の両末端にＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－１３１（配列番号２２）、ＦＰ－５の両末端にＦＰ－２およびＦＰ－１が互いに融合した形態のＦＰ－２５１（配列番号２３）、およびＦＰ－５の両末端にＦＰ－３が互いに融合した形態のＦＰ－３５３（配列番号１７～配列番号２４）であることができるが、これに限定されるものではない。

【0040】

本発明において、前記組換えポリペプチドを構成する生体適合ポリペプチド、例えば、イガイ接着タンパク質は、自然に存在するイガイ接着タンパク質あるいは遺伝子組換え的に考案されたイガイ接着タンパク質のＣ－末端あるいはＮ－末端に機能性ペプチドが付加された形態を有することが好ましい。

【0041】

一実施態様において、前記機能性ペプチドは、抗菌ペプチド、細胞外基質タンパク質、および成長因子からなる群から由来することができ、好ましくは、抗菌ペプチドから由来することができるが、これに限定されるものではない。

【0042】

一実施態様において、前記生体適合ポリペプチド、例えば、イガイ接着タンパク質と機能性ペプチドは、直接結合するか、リンカーを介して結合することができる。前記リンカーは、ペプチド性リンカーまたは非－ペプチド性リンカーであることができる。

【0043】

前記リンカーがペプチド性リンカーである時に、１個以上のアミノ酸を含むことができ、例えば、１個～１０個、好ましくは２個～６個、例えば、２個のアミノ酸を含むことができるが、これに限定されるものではない。好ましい実施態様において、前記リンカーは、ＫＬのジペプチドであることができる。

【0044】

前記リンカーが非－ペプチド性リンカーである時に、繰り返し単位が２個以上結合した生体適合性重合体が使用されることができる。前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく任意の共有結合により互いに連結される。前記非－ペプチド性リンカーは、脂肪酸、多糖類、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。

【0045】

本発明において、前記組換えポリペプチドを構成する生体適合ポリペプチドに付加される機能性ペプチドは、自然から由来するか人工的に合成される任意のペプチドを制限なく使用することができる。一実施態様において、前記機能性ペプチドは、抗菌ペプチド、細胞外基質タンパク質、および成長因子からなる群から由来することができ、好ましくは、抗菌ペプチドから由来することができるが、これに限定されるものではない。前記抗菌ペプチドは、微生物の細胞膜を破壊するか細胞膜を透過して代謝機能を阻害するメカニズムを介して抗菌効果を発揮することができ、微生物の細胞膜を破壊するメカニズムを介して抗菌効果を発揮する任意の抗菌ペプチドがいずれも本発明に使用されることができる。好ましくは、接着タンパク質に結合する抗菌ペプチドは、グラム陽性菌は言うまでもなく、グラム陰性菌に効果がある抗菌ペプチドから任意に選択されることができる。

【0046】

一実施態様において、前記抗菌ペプチドは、ＫＬＷＫＫＷＡＫＫＷＬＫＬＷＫＡ（配列番号２９）、ＦＡＬＡＬＫＡＬＫＫＬ（配列番号３０）、ＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号３１）、ＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号３２）、ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬ（配列番号３３）、ＬＶＫＬＶＡＧＩＫＫＦＬＫＷＫ（配列番号３４）、ＩＷＳＩＬＡＰＬＧＴＴＬＶＫＬＶＡＧＩＧＱＱＫＲＫ（配列番号３５）、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ（配列番号３６）、ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＧＡＶＬＫＶＬ（配列番号３７）、ＫＫＬＦＫＫＩＬＫＹＬ（配列番号３８）、ＧＬＫＫＬＩＳＷＩＫＲＡＡＱＱＧ（配列番号３９）、ＧＷＬＫＫＩＧＫＫＩＥＲＶＧＱＨＴＲＤＡＴＩＱＧＬＧＩＡＱＱＡＡＮＶＡＡＴＡＲ（配列番号４０）、ＬＫＫＬＡＫＬＡＬＡＦ（配列番号４１）、ＫＬＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＫ（配列番号４２）、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号４３）、ＧＷＬＫＫＩＧＫＷＫＩＦＫＫ（配列番号４４）、ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ（配列番号４５）、ＲＲＷＷＣＲＣ（配列番号４６）、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４７）、ＬＫＫＬＡＫＬＡＬＡＦＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号４８）、ＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ（配列番号４９）、ＦＬＫＬＬＫＫＬＡＡＫＬＦ（配列番号５０）、ＷＬＫＫＩＧＫＫＩＥＲＶＧＱＨＴＲＤＡＴＩＱＧＬＧＩＡＱＱＡＡＮＶＡＡＴＡＲ（配列番号５１）、およびＧＴＮＮＷＷＱＳＰＳＩＱＮ（配列番号５２）からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。他の実施態様において、前記抗菌ペプチドは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の皮膚から分離したα－螺旋状２３個アミノ酸ペプチドであるマガイニン（Ｍａｇａｉｎｉｎ）やデルマセプチン（Ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）、ヒトデフェンシン（ｈｕｍａｎ ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、カテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）ＬＬ－３７、ヒスタチン（Ｈｉｓｔａｔｉｎ）などが使用されることができるが、これに限定されるものではない。

【0047】

他の実施態様において、前記細胞外基質タンパク質は、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）、およびビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）からなる群から選択されることができ、前記成長因子は、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、および血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。

【0048】

一実施態様において、前記機能性ペプチドは、前記生体適合ポリペプチド、例えば、イガイ接着タンパク質のＣ－末端、Ｎ－末端、または両末端の全てに融合することができる。

【0049】

本発明において、生体適合ポリペプチド、例えば、イガイ接着タンパク質に機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを含む組成物を炎症治療剤として使用するために、前記組成物は、凍結乾燥した粉末状、凍結乾燥した粉末を用いた溶液状、ゲル状などで使用することができる。炎症治療剤として使用するための有効濃度は、経口、経皮および静脈など、各適用分野の毒性テストを経て本技術分野において通常の技術基が容易に定めることができる。

【0050】

本発明に開示されている組換えポリペプチドを構成するアミノ酸のうちチロシン残基は、化学修飾によりＤＯＰＡ、そして、さらにＤＯＰＡキノンに変化することができる。一実施態様において、このような化学修飾を媒介することができる、例えば、キノコ由来のチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）酵素を用いて、組換えポリペプチドの化学修飾を行うことができる。

【0051】

一実施態様において、本発明に開示されている生体適合ポリペプチド、例えば、イガイ接着タンパク質は、好ましくは、外部遺伝子を発現することができる用途に作製された通常のベクターに発現可能に挿入し、遺伝工学的な方法で大量生産することができるが、これに限定されるものではない。前記ベクターは、タンパク質を生産するための宿主細胞の種類および特性によって適切に選択するか、新規で作製することができる。前記ベクターを宿主細胞に形質転換する方法および形質転換体から組換えタンパク質を生産する方法は、通常の方法で容易に実施することができる。上記のベクターの選択、作製、形質転換および組換えタンパク質の発現などの方法は、本願発明が属する技術分野における通常の技術者であれば容易に実施することができ、通常の方法において一部の変形も本発明に含まれる。

【0052】

一実施態様において、前記宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であることができ、好ましくは、大腸菌細胞であることができるが、これに限定されるものではない。

【0053】

本発明において、用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）を生産するために必要なコーディング配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を制限なく含む意味で使用される。本発明において、用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡとゲノム形態の両方を含む。ゲノム形態または遺伝子のクローンは「イントロン」または「挿入領域」または「挿入配列」と称する非－コーディング配列によって妨げられるコーディング領域を含む。ポリペプチドは、完全な長さのコーディング配列によってコーディングされるか、完全な長さまたは断片の目的とする活性または機能的特性（例えば、酵素的活性、リガンド結合、シグナル導入、免疫原性など）が維持される限り、コーディング配列の一部分によってコーディングされることができる。また、前記用語は、構造遺伝子のコーディング領域および前記遺伝子が完全な長さのｍＲＮＡの長さに相当するように、末端から約１ｋｂ以上の距離で５’および３’末端のコーディング領域に隣接して位置した配列を含む。

【0054】

本発明において、前記ベクターは、本発明の組換えポリペプチドをコーディングする遺伝子の効率的な発現のために発現ベクターを使用することが好ましい。本発明において、「発現ベクター」とは、適当な宿主細胞において目的ペプチドを発現することができる組換えベクターを示し、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物を意味する。本発明の発現ベクターは、好適な発現ベクターが一般的に有している要素として、プロモータ、オペレータ、開始コドンのような発現調節要素を含むことができる。開始コドンおよび終止コドンは、一般的にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部として見なされ、遺伝子作製物が投与された時に個体で必ず作用を示す必要があり、コーディング配列とインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）に存在しなければならない。ベクターのプロモータは、構成的または誘導性であることができる。

【0055】

また、前記ベクターは、細胞培養液から本発明の組換えポリペプチドの分離を促進するために、融合ポリペプチドの排出のためのシグナル配列を含むことができる。特異的な開始シグナルは、また挿入された核酸配列の効率的な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列を含む。ある場合には、ＡＴＧ開始コドンを含むことができる外因性翻訳調節シグナルが提供されなければならない。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、様々な天然および合成供給源であることができる。発現効率は、適当な転写または翻訳強化因子の導入によって増加することができる。

【0056】

一実施態様において、前記ベクターは、通常のすべての発現ベクターを制限なく使用することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが使用されることができる。プラスミドＤＮＡの具体的な例としては、ｐＵＣ１８、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰのような商業的なプラスミドを含む。本発明で使用可能なプラスミドの他の例としては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）－由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０およびｐＴＰ５）および酵母－由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４およびＹＣｐ５０）がある。ファージＤＮＡの具体的な例としては、λ－ファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１およびλＺＡＰ）がある。また、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）またはワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のような動物ウイルス、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）のような昆虫ウイルスが使用されることができる。このような発現ベクターは、宿主細胞に応じて、タンパク質の発現量と修飾などが異なり、目的に最も適する宿主細胞を選択して使用すればよい。

【0057】

好ましい実施態様において、前記ベクターとしては、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターが使用されることができる。前記ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターは、タンパク質発現用ベクターであり、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターのＮｄｅ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素サイトに組換えＭＧＦＰ－２突然変異体が挿入されており、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｈｏ Ｉ制限酵素サイトに抗菌ペプチドが挿入されている。前記ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターは、Ｔ７プロモータを含んでおり、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を用いて発現を誘導することができ、親和性クロマトグラフィーを用いたタンパク質分離精製のための親和性リガンド（例えば、ｈｅｘａｈｉｓｉｔｉｄｉｎｅ）遺伝子配列がＸｈｏ Ｉ制限酵素サイトの後ろに存在する。

【0058】

本発明において、形質転換体は、前記ベクターを好適な宿主細胞内に導入することで得ることができる。宿主の種類としては、エスケリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属（Ｇｅｎｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｂｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラックトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などの各種細菌が挙げられる。また、前記細菌以外に、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの酵母、また各種のカビなどが宿主として挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0059】

例えば、大腸菌などの細菌を宿主として使用する場合、前記組換えベクターは、自分が宿主の中で自律複製可能であるとともに、プロモータ、組換えポリペプチドをコーディングする遺伝子を含むＤＮＡおよび転写終結配列などの発現に必要な構成を有することが好ましい。細菌への組換えＤＮＡの導入方法としては、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが利用可能であるが、これに限定されるものではない。

【0060】

一実施態様において、本発明の組成物に含まれる組換えポリペプチドは、（ａ）本発明の組換えポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを製造するステップと、（ｂ）前記ベクターを宿主細胞に形質転換した形質転換体を製造するステップと、（ｃ）前記形質転換体を培養するステップとを含む製造方法により製造されることができる。他の実施態様において、前記製造方法は、（ｄ）前記組換えポリペプチドを分離および精製するステップをさらに含むことができる。

【0061】

前記形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に使用される通常の方法を使用すれば良い。また培養方法は、バッチ（ｂａｔｃｈ）式、流動バッチ式、連続培養、リアクター形式など、通常の微生物の培養に使用する任意の方法を使用することができる。大腸菌などの細菌を宿主として得られた形質転換体の培地としては、完全培地または合成培地、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地などが挙げられる。また、培養温度は、上述の適温の範囲で培養することで、本発明の組換えポリペプチドを菌体内に蓄積させ、回収することができる。

【0062】

炭素源は、微生物の増殖に必要であり、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ガラクトース、デンプンなどの糖類；エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコール類；グリセロールなどの多価アルコール類；酢酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸；プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸などの脂肪酸などを用いることができる。

【0063】

窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアムモニウム塩の他に、ペプトン、肉汁、酵母抽出物、麦芽抽出物、カゼイン分解物、トウモロコシ浸漬液などの天生成物由来のものが挙げられる。また、無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。培養液にカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシンなどの抗生物質を添加しても良い。

【0064】

また、プロモータが誘導性の発現ベクターを使用して形質転換した微生物を培養する場合には、プロモータの種類に適する誘導物質を培地に添加すれば良い。例えば、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）などが誘導物質として挙げられる。本発明の組換えポリペプチドの取得および精製は、得られる培養物の中から菌体または上澄み液を遠心回収し、菌体破砕、抽出、親和性クロマトグラフィー、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などを単独でまたは適当に組み合わせることで行うことができるが、これに限定されるものではない。

【0065】

一実施態様において、前記形質転換体は、通常のＬＢ培地で培養することができ、組換えポリペプチドの発現を誘導するために、ＩＰＴＧを添加することができる。好ましい組換えポリペプチドの発現方法は、前記形質転換体をＬＢ（５ｇ／リットル酵母抽出物、１０ｇ／リットルトリプトン、１０ｇ／リットルＮａＣｌ）培地に培養し、培養液の吸光度が６００ｎｍで０．６～０．８である時にＩＰＴＧを０．５ｍＭ～４ｍＭ添加して３時間培養することができるが、これに限定されるものではない。前記の方法で発現させた組換えポリペプチドは、封入体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ）の形態に生産され、前記封入体を可溶化して組換えポリペプチドを分離および精製することができる。

【0066】

好ましい実施態様において、本発明の組成物は、薬学的組成物の形態であることができ、前記薬学的組成物は、生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドを薬学的組成物の全重量に対して、０．００１～１０重量％、または０．０１～５重量％、または０．０１～３重量％、または０．１～２重量％、または０．５～１．５重量％含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0067】

本発明の薬学的組成物は、前記組換えポリペプチドの他に、本発明が目的とする効果を損傷しない範囲内で、好ましくは、前記組換えポリペプチドの効果に相昇効果を与えることができる他の成分などをさらに含むことができる。例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料のような通常の補助剤、または担体を含むことができる。

【0068】

前記薬学的組成物の投与経路は、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれ、例えば、塗布による局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）方式で適用されることができる。前記非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、病巣内注射または注入技術を含む。

【0069】

本発明の薬学的組成物は薬学的に有効な量で投与することができる。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な利益／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効容量の水準は、個体種類および重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出の比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野において周知の要素に応じて決定されることができる。本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順にまたは同時に投与されることができる。また、単一または多重投与されることができる。前記要素を全て考慮して、副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、本技術分野において通常の技術者によって容易に決定されることができる。

【0070】

本発明の薬学的組成物は、抗炎作用を目的とする組織、器官、または個体に制限なく適用されることができ、いかなるものでも適用可能である。例えば、本発明の薬学的組成物は、ヒトだけでなく、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどのヒトではない動物、鳥類および魚類など、いずれにおいても使用可能である。

【0071】

本発明の薬学的組成物は、前記組換えポリペプチドにさらに同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。前記薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用されることができる。

【0072】

非経口投与のための製剤としては、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、坐剤、エアロゾルなどの外用剤および滅菌注射製剤の形態に剤形化して使用されることができ、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラスマ剤の皮膚外用薬学的組成物を製造して使用することができるが、これに限定されるものではない。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されることができる。

【0073】

本発明の薬学的組成物は、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの補助剤、およびその他の治療的に有用な物質をさらに含有することができ、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティング方法によって剤形化することができる。

【0074】

本発明の薬学的組成物の投与量は、個体の年齢、体重、一般的な健康、性別、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および特定の疾患の重症度を含む様々な要因によって様々に変化することができる。

【0075】

また、本発明の薬学的組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。また前記薬学的組成物は、成人基準に、１～２０，０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１～１０，０００ｍｇ／ｋｇ、１～１，０００ｍｇ／ｋｇ、または１～２００ｍｇ／ｋｇの範囲内の投与量で投与されることができ、前記薬学的組成物が外用剤である場合には、成人基準に、（１．０～３．０ｍｌ）の量で１日１回～５回塗布し、１ヶ月以上継続することが好ましいが、前記投与量は、本発明の範囲を限定するものではない。前記薬学的組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。

【0076】

他の好ましい実施態様において、本発明の組成物は、化粧料組成物の形態であることができる。

【0077】

本発明の化粧料組成物は、化粧品分野において通常使用される基剤、補助剤および添加剤を使用して液体または固体状に製造されることができる。液体または固体状の化粧品としては、例えば、これに限定されないが、化粧水、クリーム剤、ローション剤などの形態を含むことができる。

【0078】

本発明の化粧料組成物は、通常用いられる成分を含むことができ、例えば、抗酸化剤、防腐剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料のような通常の補助剤、そして担体を含むことができる。

【0079】

また、本発明の化粧料組成物は、機能性を追加または増進するために、しわ改善化粧料、美白用化粧料、紫外線遮断剤、光散乱剤などをさらに含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0080】

本発明の化粧料組成物は、本技術分野において通常製造されるいかなる剤形でも製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤－含有クレンジング、オイル、パウダーファンデーション、エマルジョンファンデーション、ワックスファンデーションおよびスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造されることができる。

【0081】

本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられることができる。

【0082】

本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられることができ、特に、スプレーである場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進薬を含むことができる。

【0083】

本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

【0084】

本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガントなどが用いられることができる。

【0085】

本発明の剤形が界面－活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられることができる。

【0086】

本発明の化粧料組成物は、単独または重複塗布して使用するか、本発明以外の他の化粧料組成物と重複塗布して使用することができる。また、本発明による細胞の再生または抗炎用化粧料組成物は、通常の使用方法によって使用されることができ、ユーザの皮膚状態または好みに応じてその使用回数を異ならせることができる。

【0087】

他の好ましい実施態様において、本発明は、前記開示されている生体適合ポリペプチドに機能性ペプチドが結合した組換えポリペプチドまたは前記組換えポリペプチドを含む組成物、例えば、薬学的組成物または化粧料組成物を個体に投与するステップを含む炎症抑制方法を提供する。

【0088】

本発明の一実施態様において、本発明者らは、炎症関連疾患を引き起こす炎症性サイトカインを前記機能性タンパク質組成物が効果的に阻害することを確認した。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、皮膚炎症を引き起こす１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール－１３－アセテート（ＴＰＡ）によって発現する炎症性サイトカインであるＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）および腫瘍壊死因子であるＴＮＦ－αを著しく阻害し、ＴＰＡ処理マウスで耳の厚さを正常対照群と同様に減少させて、優れた抗炎活性を有していることを確認した（図２～図４参照）。ＩＬ－６は先天免疫と適応免疫の両方において機能するサイトカインとして、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、皮膚角質細胞などから生成され、様々な免疫および炎症反応に関与することから、炎症モデルにおいてＩＬ－６発現量の減少は非常に重要な意味を有する。他の実施態様において、本発明者らは、前記機能性タンパク質組成物を炎症性疾患がある子犬に適用し、炎症が著しく減少することを確認した（図５参照）。

【0089】

ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６と様々な炎症疾患との連関性が本技術分野に知られている。ＴＮＦ－αは、炎症反応に関与し、急性期反応の構成員であるサイトカインの一種として、免疫細胞を調節する役割をする。ＴＮＦ－αは、アポトーシス誘導、ＩＬ－１とＩＬ－６の生産による敗血症を引き起こし、非正常な調節によって様々なヒト炎症疾患を引き起こす。また、ＩＬ－６は、炎症反応の初期ステップで生成されるサイトカインの一種であり、細胞が異なる細胞にシグナルを与えるために放出する生理活性タンパク質である。ＩＬ－６の作用は、主に、免疫反応と関連しているが、感染、外傷、やけどや炎症につながる組織損傷による様々な炎症反応も促進する。

【0090】

アトピー皮膚炎がある患者においてＴＮＦ－αの増加が発見され、皮膚炎の重症度と相関関係がある。また、ＴＮＦ－αとかゆみを引き起こすヒスタミン濃度との間に有意な相関関係が発見され、ＴＮＦ－αの過剰分泌がアトピー皮膚炎の病態生理学的メカニズムに影響を及ぼし得ることが確認された（Ｓｕｍｉｍｏｔｏ、Ｓ．，Ｋａｗａｉ，Ｍ．，Ｋａｓａｊｉｍａ，Ｙ．，＆ Ｈａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．（１９９２）Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，６７（３），２７７－２７９．ｄｏｉ:１０．１１３６／ａｄｃ．６７．３．２７７）。なお、アトピー皮膚炎患者の８０％以上において血清ＩｇＥが増加しており、この数値は、アトピー皮膚炎の臨床的重症度と比例するが、ＩＬ－６がＩｇＥの生成を増幅させることが知られている。

【0091】

また、ＩＬ－６は、長い間乾癬の病因と関連があると研究されており、ＴＮＦ－αとＩＬ－６の数値増加は、乾癬の特徴であると知られている（Ａ．Ｃａｓｔｅｌｌｓ－Ｒｏｄｅｌｌａｓ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｄｅｒｍａｔｏ－Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｉｃａ，ｖｏｌ．７２，ｎｏ．３、ｐｐ．１６５－１６８，１９９２；Ｐ．Ｎｅｕｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９７，ｎｏ．１，ｐｐ．２７－３３，１９９１；Ｒ．Ｍ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，ｖｏｌ．８６，ｎｏ．１６，ｐｐ．６３６７－６３７１，１９８９）。乾癬において、ＩＬ－６は、ＳＴＡＴ３経路を活性化して、角質細胞の生存および増殖を制御する遺伝子発現に影響を及ぼすことが知られている。乾癬の治療のために、ＴＮＦ－αの濃度を減少させるインフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）が開発され、ＩＬ－６抑制剤は、乾癬患者のうち、特に、膿疱性乾癬患者において成功的な治療効果があった（Ａｎｄｒｅａ Ｓａｇｇｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９６４０６９，１０ ｐａｇｅｓ，２０１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１４／９６４０６９）。

【0092】

また、慢性蕁麻疹患者において、ＩＬ－６の濃度が有意に増加したことが知られている（Ｋａｓｐｅｒｓｋａ－Ｚａｊａｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ，４１（１０），１３８６－１３９１，２０１１，１１１／ｊ．１３６５－２２２２．２０１１．０３７８９．ｘ）

【0093】

また、自己炎症性疾患である化膿性汗腺炎患者の皮膚においてＩＬ－６水準が増加したことが知られており（Ｈａｏｘｉａｎｇ Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｏｓｔｅｐｙ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ａｌｅｒｇｏｌ．２０１７ Ｆｅｂ；３４（１）：８２－８４．）、特に、重症化膿性汗腺炎患者においてＴＮＦ－αの濃度を減少させるインフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）を投与した時に、効果的な治療代案になり得ることが分かった（Ｊ．Ｍ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｖｏｚｍｅｄｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２１５（１），４１－４４，２００７，ｄｏｉ：１０．１１５９／０００１０２０３２）。

【0094】

なお、ざ瘡は、ＴＮＦ、ＩＬ－１βのような特定のサイトカインの上昇によって引き起こされる炎症状態であり、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ）は、角質細胞からＴＮＦ生成を刺激して炎症を引き起こすことが知られている。したがって、ＴＮＦ抑制剤の使用が治療の役割を果たすことができると考えられている（Ｆｒｅｊａ Ｌａｅｒｋｅ Ｓａｎｄ ｅｔ ａｌ，ＪＡＭＡ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３；１４９（１１）:１３０６－１３０７．ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３．６６７８）。

【実施例】

【0095】

以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。

【0096】

ただし、下記の実施例は、本発明の好ましい実施態様を説明するために提供され、本発明は、例示の目的にのみ提供される下記の特定の実施態様によってその範囲が制限されるものではない。本発明に開示されているように、機能的に同一の製品、組成物および方法は、本発明の範囲に含まれることが自明である。

【0097】

実施例１．組換えポリペプチドをコードする遺伝子のクローニング
本発明の組換えポリペプチドを含む組成物を製造するために、イガイ接着タンパク質のＣ－末端またはＮ－末端部位に機能性ペプチド配列が付加された３種の遺伝子配列を設計して鋳型ＤＮＡを合成した後、ＰＣＲを行い、これを最終ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターに挿入した。前記３種の組換えポリペプチドは、それぞれ、配列番号２０のイガイ接着タンパク質、配列番号２５のスペーサ、および配列番号２９、３１、および４１のいずれか一つのポリペプチドが融合した構造を有する。ベクターの具体的な形態は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターにイガイ接着タンパク質／機能性ペプチドが挿入された融合ポリペプチドの形態である。前記ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターは、Ｔ７プロモータを含んでおり、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を用いて発現を誘導することができる。前記３種の組換えポリペプチドをそれぞれＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３と称した。

【0098】

実施例２．組換えポリペプチドを生産する形質転換体の製造および培養
実施例１で製造されたｐＥＴ２２ｂ（＋）イガイ接着タンパク質／機能性ペプチドベクターは、クローニング用大腸菌ＤＨ５α細胞およびタンパク質発現用に使用された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞にそれぞれＣａＣｌ２バッファーを使用してコンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）セルを製造した後、熱衝撃（４２℃で１分間放置）方法によって形質転換した。形質転換されたコロニーの選別は、アンピシリン（ａｍｐｃｉｌｌｉｎ、Ｇｏｌｄ ｂｉｏ）を使用して行い、これにより、大腸菌Ｄｈ５α ｐＥＴ２２ｂ（＋）イガイ接着タンパク質／機能性ペプチドおよび大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）イガイ接着タンパク質／機能性ペプチドを生産する形質転換体を取得した。

【0099】

実施例３：組換えポリペプチドの生産および取得
ＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを生産するために、大腸菌ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ（＋）形質転換体をＬＢ培地（５ｇ／リットル酵母抽出物、１０ｇ／リットルトリプトン、１０ｇ／リットルＮａＣｌ）で培養し、適正Ｏ．Ｄ値に逹した時に、ＩＰＴＧを添加して、前記組換えポリペプチドの発現を誘導した。それぞれのＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを発現した後、分離および精製して最終高純度のタンパク質を確保した。

【0100】

ＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸分析装置（Ｈｅｗｌｅｔｔｅ Ｐａｃｋａｒｄ、米国）で分析して同じタンパク質であることを確認し、前記３種の組換えポリペプチドのうちＰＤＢ（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｄａｔａ ｂａｎｋ）を介してＢＶＩ１８３ポリペプチドの構造を予想した（図１）。

【0101】

実施例４：本発明の組成物のＩＬ－６およびＴＮＦ－α分泌阻害効果
ＩＬ－６は、免疫および炎症反応に関与するサイトカインであり、本発明のＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドがＩＬ－６およびＴＮＦ－αを阻害できるか否かを確認した。このために、組織培養用ディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）にマウスＩＬ－６、ＴＮＦ－αに対する捕獲抗体をコーティングバッファーで希釈した溶液１００μｌを分注し、４℃で約１２～２０時間放置した後、洗浄用緩衝液で洗浄した。前記準備したサンプルに分析希釈液（ＰＢＳ－Ｔ；０．０１Ｍ－ＰＢＡ、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌを分注し、洗浄して準備した。準備した組織培養用ディッシュに検出抗体１００μｌを分注した後、洗浄し、次に、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）溶液１００μｌを分注した後、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）が含まれた基質液を入れて反応させた。次に、停止溶液（２％Ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）５０μｌずつを加えて反応を停止させた。光学密度は、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、４５０ｎｍで測定した。

【0102】

本発明のＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を１μＭ、１０μＭ、および１００μＭの濃度でそれぞれ適用した結果、ＩＬ－６が、炎症モデル（１００ｐｇ／ｍｌ）に比べて本発明の組成物を適用したサンプルでは低濃度の１μＭから全て阻害されることを確認し、特に、１００μＭである時に、各ＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドの阻害結果は、２５±２，２５±１，３２±８ｐｇ／ｍｌと著しく減少することを確認した（図２）。

【0103】

また、本発明のＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を１μＭ、１０μＭ、および１００μＭの濃度で適用した結果、ＴＮＦ－αが炎症モデル（３０ｐｇ／ｍｌ）に比べて、本発明の組成物を適用したサンプルでは、低濃度の１μＭから全て阻害されることを確認し、特に、１００μＭである時に、各ＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドの阻害結果は、１５±２、１５±１，１３±３ｐｇ／ｍｌと著しく減少することを確認した（図３）。

【0104】

実施例５：本発明の組成物のＴＰＡ誘導耳浮腫マウスの炎症緩和効果
ＴＰＡ誘導耳浮腫マウスモデルは、急性炎症による紅斑と浮腫が観察されるモデルであり、本モデルにそれぞれのＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を処理して、炎症緩和効果を観察した。このために、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳にＴＰＡを処理した後、１０μＭ濃度の各ＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物を３日間一日に１時間接触させて炎症緩和効果を観察した。

【0105】

結果、それぞれのＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組成物を処理した後、すべて１日目から正常マウスの耳の厚さと同様になり、これにより、本発明の組成物の炎症緩和効果を確認した。具体的には、各ＢＶＩ１８１、ＢＶＩ１８２およびＢＶＩ１８３組成物を処理した後、３日目の耳の厚さは、組成物を処理していない群の０．５３±０．０２ｍｍでそれぞれ０．３７±０．０４、０．３４±０．０１、および０．３４±０．０１ｍｍに緩和し、正常マウスの耳の厚さである０．２８±０．０２ｍｍと同様になることを確認した（図４）。

【0106】

実施例６：ＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物の子犬の皮膚炎緩和効果
ＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物をそれぞれ細菌性皮膚炎およびアレルギー性皮膚炎がある子犬に処理して、抗炎効能があるか否かを観察した。実験に使用された子犬のうち、ビション・フリーゼは、アレルギー性皮膚炎を患っており、代表的な症状としてはかゆみがあり、主に、タンパク質の摂取やホコリダニの分泌物によって発生することが知られている。また、プードルは、細菌性皮膚炎で膿皮症または皮膚細菌感染を患っており、皮膚に細菌が過増殖して掻痒症、皮膚角質などの症状を発生することが知られている。

【0107】

図５は、皮膚炎がある子犬（犬種：ビション・フリーゼ、プードル）の皮膚にそれぞれＢＶＩ１８３組換えポリペプチドを含む組成物をスプレー形態で１日１回塗布した後、４日が経過してから観察した様子を示す。ＢＶＩ１８３組成物を塗布した後、皮膚炎が急激に減少することが分かり、特に、ビション・フリーゼは、アレルギー性皮膚炎が緩和し、毛が再び伸びることも観察された。

【0108】

本研究は、韓国中小ベンチャー企業部の革新分野創業パッケージ［Ｂ００８０８２７０００４３３］の支援を受けて行っている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】