特表 2023-552815 脂質ナノ粒子を調製するためのハイスループット方法及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-19

(54)【発明の名称】脂質ナノ粒子を調製するためのハイスループット方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/16 20060101AFI20231212BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 47/06 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20231212BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 38/04 20060101ALI20231212BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231212BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231212BHJP

【ＦＩ】

A61K9/16

A61K9/127

A61K47/06

A61K47/24

A61K47/10

A61K31/7088

A61K31/713

A61K31/7105

A61K38/04

A61K45/00

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023534898

(86)(22)【出願日】2021-12-08

(85)【翻訳文提出日】2023-08-02

(86)【国際出願番号】 US2021062344

(87)【国際公開番号】W WO2022125622

(87)【国際公開日】2022-06-16

(31)【優先権主張番号】63/123,343

(32)【優先日】2020-12-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ファン， ユイチェン

(72)【発明者】

【氏名】イェン， チュン－ワン

(72)【発明者】

【氏名】チャン， コー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA31

4C076DD33

4C076DD63

4C076EE23

4C084AA03

4C084AA17

4C084BA03

4C084NA10

4C084ZB211

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA41

4C086NA10

4C086ZB21

(57)【要約】

様々な脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を最適化及び製造するためのハイスループット方法及びその使用が本明細書で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＮＰ組成物を製造するためのハイスループットスクリーニング方法であって、ペイロードと自己集合することができる複数の分子とを含む少なくとも２つの混合可能な溶液を得ることと、一連の制御された条件下で前記少なくとも２つの溶液を混合することとを含み、それによって注入順序、速度、体積、相比及び混合持続時間が変動する、ハイスループットスクリーニング方法を提供する。様々な実施形態において、本開示は、最適な封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性を決定することを可能にする。本明細書に開示される方法は、ＬＮＰベースの治療薬を調製するための製造条件の効率的な最適化を可能にする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法であって、
ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を前記第１の溶液又は前記第２の溶液のいずれかに溶解すること；
ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む、最適化されたハイスループットスクリーニング方法。

【請求項2】

前記ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記オリゴヌクレオチドが約１０～約３０ヌクレオチド長である、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

ｍＲＮＡのサイズが約５００～約３０００ヌクレオチド長である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ペイロードがポリペプチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ペイロードが小分子である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記小分子が約１００Ｄａ～１０００Ｄａである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ペイロードが前記第１の溶液に溶解される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ペイロードが前記第２の溶液に溶解される、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の溶液の前記有機相がメタノールを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記第２の溶液の前記有機相がエタノールを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、イオン化可能な脂質種、非カチオン性脂質種、リン脂質種、及び非リン脂質種からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項22】

脂質の総濃度が変動する、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

脂質の総濃度が約０．４～約４ｍＭの間で変動する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記Ｎ：Ｐ比が約０．５～約５の間で変動する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ＬＮＰがリポソームである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１に記載の方法。

【請求項33】

前記最適なパラメータが、８０％を超える前記ペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための方法を最適化するためのハイスループット方法であって、
ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を前記第１の溶液又は前記第２の溶液のいずれかに溶解すること；
ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む、ハイスループット方法。

【請求項37】

前記ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記オリゴヌクレオチドが約１０～約３０ヌクレオチド長である、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記ペイロードがｍＲＮＡである、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂ～約２ｋｂである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記ペイロードがポリペプチドである、請求項３６に記載の方法。

【請求項45】

前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである、請求項４５に記載の方法。

【請求項46】

前記ペイロードが小分子である、請求項３６に記載の方法。

【請求項47】

前記小分子が約１００Ｄａ～１０００Ｄａである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ペイロードが前記第１の溶液に溶解される、請求項３６に記載の方法。

【請求項49】

前記ペイロードが前記第２の溶液に溶解される、請求項３６に記載の方法。

【請求項50】

前記第１の溶液が水性緩衝液である、請求項３６に記載の方法。

【請求項51】

前記第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項52】

前記第２の溶液の前記有機相がメタノールを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項53】

前記第２の溶液の前記有機相がエタノールを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項54】

前記自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項55】

前記少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項５４又は５５に記載の方法。

【請求項57】

脂質の総濃度が変動する、請求項３６に記載の方法。

【請求項58】

脂質の総濃度が約０．４～約４ｍＭの間で変動する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項５４又は５５に記載の方法。

【請求項60】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記Ｎ：Ｐ比が約０．５～約５の間で変動する、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項３６～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記ＬＮＰがリポソームである、請求項３６～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項３６～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項３６に記載の方法。

【請求項67】

前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項３６に記載の方法。

【請求項68】

前記最適なパラメータが、８０％を超える前記ペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項３６～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項３６～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項３６～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法であって、
ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を前記第１の溶液又は前記第２の溶液のいずれかに溶解すること；
ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む、最適化されたハイスループット方法。

【請求項72】

前記ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項７３に記載の方法。

【請求項76】

前記オリゴヌクレオチドが約１０～約３０ヌクレオチド長である、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記ペイロードがｍＲＮＡである、請求項７１に記載の方法。

【請求項78】

ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂ～約２ｋｂである、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記ペイロードがポリペプチドである、請求項７１に記載の方法。

【請求項80】

前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記ペイロードが小分子である、請求項７１に記載の方法。

【請求項82】

前記小分子が約１００Ｄａ～１０００Ｄａである、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記ペイロードが前記第１の溶液に溶解される、請求項７１に記載の方法。

【請求項84】

前記ペイロードが前記第２の溶液に溶解される、請求項７１に記載の方法。

【請求項85】

前記第１の溶液が水性緩衝液である、請求項７１に記載の方法。

【請求項86】

前記第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項87】

前記第２の溶液の前記有機相がメタノールを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項88】

前記第２の溶液の前記有機相がエタノールを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項89】

前記自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項90】

前記少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項８９又は９０に記載の方法。

【請求項92】

脂質の総濃度が変動する、請求項８９又は９０に記載の方法。

【請求項93】

脂質の総濃度が約０．４～約４ｍＭの間で変動する、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項８９又は９０に記載の方法。

【請求項95】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項７２～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記Ｎ：Ｐ比が約０．５～約５の間で変動する、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項７１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記ＬＮＰがリポソームである、請求項７１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項７１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項７１に記載の方法。

【請求項102】

前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項７１に記載の方法。

【請求項103】

前記最適なパラメータが、８０％を超える前記ペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項７１～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項７１～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項７１～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

ＬＮＰ調製物を、それを必要とする患者に投与する方法であって、前記ＬＮＰ調製物が、
ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を前記第１の溶液又は前記第２の溶液のいずれかに溶解すること；
ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
によって製造される、方法。

【請求項107】

前記ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項１０８に記載の方法。

【請求項111】

前記オリゴヌクレオチドが約１０～約３０ヌクレオチド長である、請求項１０７～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１０６に記載の方法。

【請求項113】

ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂ～約２ｋｂである、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記ペイロードがポリペプチドである、請求項１０６に記載の方法。

【請求項115】

前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記ペイロードが小分子である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項117】

前記小分子が約１００Ｄａ～１０００Ｄａである、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記ペイロードが前記第１の溶液に溶解される、請求項１０６に記載の方法。

【請求項119】

前記ペイロードが前記第２の溶液に溶解される、請求項１０６に記載の方法。

【請求項120】

前記第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項121】

前記第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項122】

前記第２の溶液の前記有機相がメタノールを含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項123】

前記第２の溶液の前記有機相がエタノールを含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項124】

前記自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項125】

前記少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１２４又は１２５に記載の方法。

【請求項127】

脂質の総濃度が変動する、請求項１２４又は１２５に記載の方法。

【請求項128】

脂質の総濃度が約０．４～約４ｍＭの間で変動する、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１２４又は１２５に記載の方法。

【請求項130】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項１０７～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項132】

前記Ｎ：Ｐ比が約０．５～約５の間で変動する、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１０６～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項134】

前記ＬＮＰがリポソームである、請求項１０６～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１０６～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項136】

前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１０６に記載の方法。

【請求項137】

前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１０６に記載の方法。

【請求項138】

前記最適なパラメータが、８０％を超える前記ペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１０６～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１０６～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１０６～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法であって、
ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を前記第１の溶液又は前記第２の溶液のいずれかに溶解すること；
ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む、最適化されたハイスループットスクリーニング方法。

【請求項142】

前記ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項143】

前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項１４２に記載の方法。

【請求項144】

前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１４２に記載の方法。

【請求項145】

前記オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項１４２に記載の方法。

【請求項146】

前記オリゴヌクレオチドが約１０～約３０ヌクレオチド長である、請求項１４２～１４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項147】

前記ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項148】

ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂ～約２ｋｂである、請求項１４７に記載の方法。

【請求項149】

前記ペイロードがポリペプチドである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項150】

前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである、請求項１４９に記載の方法。

【請求項151】

前記ペイロードが小分子である、請求項１４１に記載の方法。

【請求項152】

前記小分子が約１００Ｄａ～１０００Ｄａである、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記ペイロードが前記第１の溶液に溶解される、請求項１４１に記載の方法。

【請求項154】

前記ペイロードが前記第２の溶液に溶解される、請求項１４１に記載の方法。

【請求項155】

前記第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１４１に記載の方法。

【請求項156】

前記第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１４１に記載の方法。

【請求項157】

前記第２の溶液の前記有機相がメタノールを含む、請求項１４１に記載の方法。

【請求項158】

前記第２の溶液の前記有機相がエタノールを含む、請求項１４１に記載の方法。

【請求項159】

前記自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１４１に記載の方法。

【請求項160】

前記少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項１５９に記載の方法。

【請求項161】

前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１５９又は１６０に記載の方法。

【請求項162】

脂質の総濃度が変動する、請求項１５９又は１６０に記載の方法。

【請求項163】

脂質の総濃度が約０．４～約４ｍＭの間で変動する、請求項１６２に記載の方法。

【請求項164】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１５９又は１６０に記載の方法。

【請求項165】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する、請求項１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項１４２～１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記Ｎ：Ｐ比が約０．５～約５の間で変動する、請求項１６６に記載の方法。

【請求項168】

前記ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１４１～１６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項169】

前記ＬＮＰがリポソームである、請求項１４１～１６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項170】

前記ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１４１～１６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項171】

前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１４１に記載の方法。

【請求項172】

前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１４１に記載の方法。

【請求項173】

前記最適なパラメータが、８０％を超える前記ペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１４１～１７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項174】

前記最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１４１～１７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項175】

前記ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１４１～１７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項176】

以下の工程：
ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；
ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；
ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を前記第１の溶液又は前記第２の溶液のいずれかに溶解すること；
ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；
ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；
ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；
ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに
ｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造すること
を含む方法によって製造される、最適化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。

【請求項177】

前記ペイロードがオリゴヌクレオチドである、請求項１７６に記載の方法。

【請求項178】

前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子である、請求項１７７に記載の方法。

【請求項179】

前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１７８に記載の方法。

【請求項180】

前記オリゴヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項１７８に記載の方法。

【請求項181】

前記オリゴヌクレオチドが約１０～約３０ヌクレオチド長である、請求項１７７～１８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項182】

前記ペイロードがｍＲＮＡである、請求項１７６に記載の方法。

【請求項183】

ｍＲＮＡのサイズが約１ｋｂ～約２ｋｂである、請求項１８２に記載の方法。

【請求項184】

前記ペイロードがポリペプチドである、請求項１７６に記載の方法。

【請求項185】

前記ポリペプチドが約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである、請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記ペイロードが小分子である、請求項１７６に記載の方法。

【請求項187】

前記小分子が約１００Ｄａ～１０００Ｄａである、請求項１８６に記載の方法。

【請求項188】

前記ペイロードが前記第１の溶液に溶解される、請求項１７６に記載の方法。

【請求項189】

前記ペイロードが前記第２の溶液に溶解される、請求項１７６に記載の方法。

【請求項190】

前記第１の溶液が水性緩衝液である、請求項１７６に記載の方法。

【請求項191】

前記第１の溶液が、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む、請求項１７６に記載の方法。

【請求項192】

前記第２の溶液の前記有機相がメタノールを含む、請求項１７６に記載の方法。

【請求項193】

前記第２の溶液の前記有機相がエタノールを含む、請求項１７６に記載の方法。

【請求項194】

前記自己集合性分子が、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む、請求項１７６に記載の方法。

【請求項195】

前記少なくとも１種の脂質分子が、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される、請求項１９４に記載の方法。

【請求項196】

前記第２の溶液が、２種類以上の脂質を含む、請求項１９４又は１９５に記載の方法。

【請求項197】

脂質の総濃度が変動する、請求項１９４又は１９５に記載の方法。

【請求項198】

脂質の総濃度が約０．４～約４ｍＭの間で変動する、請求項１９７に記載の方法。

【請求項199】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが変動する、請求項１９４又は１９５に記載の方法。

【請求項200】

ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージが、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する、請求項１９９に記載の方法。

【請求項201】

前記ペイロードのＮ：Ｐ比が変動する、請求項１７７～１８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項202】

前記Ｎ：Ｐ比が約０．５～約５の間で変動する、請求項２０１に記載の方法。

【請求項203】

前記ＬＮＰがポリマー脂質ナノ粒子である、請求項１７６～２０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項204】

前記ＬＮＰがリポソームである、請求項１７６～２０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項205】

前記ＬＮＰがリポタンパク質ナノ粒子である、請求項１７６～２０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項206】

前記第１の溶液が、前記第２の溶液に注入される、請求項１７６に記載の方法。

【請求項207】

前記第２の溶液が、前記第１の溶液に注入される、請求項１７６に記載の方法。

【請求項208】

前記最適なパラメータが、８０％を超える前記ペイロードの封入効率をもたらすパラメータである、請求項１７６～２０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項209】

前記最適なパラメータが、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである、請求項１７６～２０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項210】

前記ＬＮＰが、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する、請求項１７６～２０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項211】

ＬＮＰ形成のための複数のパラメータのＨＴＳスクリーニングのためのワークフローであって、
（ｉ）ロボット液体ハンドラ；
（ｉｉ）所望のＬＮＰ特性を測定することができる少なくとも１つの機器；及び
（ｉｉｉ）複数のマイクロウェルを含む少なくとも１つのマイクロプレート、を含み、
前記ロボット液体ハンドラは、前記マイクロウェルの各々に複数の溶液を注入することができ；
前記パラメータは、マイクロウェル間で系統的に変動し；及び
前記所望のＬＮＰ特性は、各マイクロウェルについて測定することができる、ワークフロー。

【請求項212】

前記複数のパラメータが、総脂質含有量、自己集合分子のタイプ；前記自己集合分子の組成比；前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度；相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、体積及び速度、並びに混合持続時間から選択される、請求項２１１に記載の方法。

【請求項213】

前記所望のＬＮＰ特性が、平均粒径、粒径分布、封入効率及び粒子安定性からなる群から選択される、請求項２１１に記載の方法。

【請求項214】

前記機器が、動的光散乱（ＤＬＳ）、紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光法又は蛍光分光法のいずれかが可能である、請求項２１１に記載のワークフロー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２０年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１２３，３４３号の優先権及び利益を主張し、その全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、生体適合性で安定な医薬送達プラットフォームとして広く開発されてきた。脂質ナノ粒子を調製するために使用される脂質は、通常、低毒性の生理学的脂質（生体適合性及び生分解性）である。脂質の物理化学的多様性及び生体適合性、並びに薬物の経口バイオアベイラビリティを高めるそれらの能力は、脂質ナノ粒子を薬物送達にとって非常に魅力的な担体にしている。さらに、脂質ベースの製剤は、可溶化能力の増加、腸希釈に対する薬物沈殿の防止、膜透過性の増強、排出輸送体の阻害、ＣＹＰ酵素の減少、カイロミクロン産生及びリンパ輸送の増強を含むいくつかの方法で薬物吸収にプラスの影響を及ぼすことができる。ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡ送達のための主要な非ウイルス担体であり、２０１９年の時点でナノ医薬臨床試験の７０％で使用されている。Ａｎｓｅｌｍｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｂｉｏｅｎｇ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．４（３）：ｅ１０１４３．

【0003】

脂質系ナノキャリアは、その複雑な物理化学的特性に部分的に起因して、薬物製品の品質管理においてさらなる課題をもたらす。米国ＦＤＡによって最近公表されたリポソーム薬物製品に関するガイダンスによれば、これらの製剤は、粒子構造及びサイズ分布、粒子表面の物理化学的特性、脂質含有量、遊離ＡＰＩの量及び封入効率、並びに物理的及び化学的安定性を含む品質属性について指定されるべきである。異なる調製条件及びパラメータは、ＬＮＰ製剤の品質属性に影響を及ぼし得る。例えば、脂質組成、特に異なる量及び／又は分子量のＰＥＧ化脂質の組み込みは、リポソームのコロイド安定性、細胞取り込み、及び薬物動態に有意に影響を及ぼしたが（例えばＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１０６６（１）：２９－３６；Ｇａｒｂｕｚｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ，１３５（２）：１１７－２９；Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １（３）（２００６）２９７－３１５を参照）、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯ負荷は、カチオン性脂質との電荷媒介性相互作用によって調整され得る。Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２６７（１）：９－２１；Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５（７）：１４６７－１４７５．ＬＮＰの下流性能もまた、それらの品質属性によって高度に左右される。したがって、様々なレベルのこれらのパラメータのスクリーニングは、容易な手順及び複数の分析出力を有するハイスループットアプローチを非常に必要とする。

【発明の概要】

【0004】

発明の概要
脂質ベースのナノ医薬のスクリーニング及び最適化の必要性に対処するために、本開示は、様々な治療ペイロードを封入するそのような脂質ベースのナノ粒子を調製するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ワークフローを提供する。様々な実施形態において、本発明は、ロボット液体ハンドラを使用してＬＮＰの容易な自己集合のための最適化された溶媒注入方法を提供する。様々な実施形態において、最適な脂質組成、総脂質濃度、及びペイロードの負荷量が記載される。

【0005】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。

【0006】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは、約５００～３０００ヌクレオチドである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0007】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0008】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性又はイオン化可能な脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0009】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0010】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための方法を最適化するためのハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。

【0011】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0012】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0013】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0014】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0015】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。

【0016】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0017】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0018】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0019】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0020】

様々な実施形態において、本開示は、ＬＮＰ調製物を、それを必要とする患者に投与する方法に関し、前記ＬＮＰ調製物は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することによって製造される。

【0021】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0022】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0023】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0024】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0025】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。

【0026】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0027】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0028】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0029】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0030】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物を製造するための最適化されたハイスループットスクリーニング方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。

【0031】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0032】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0033】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0034】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0035】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。

【0036】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0037】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0038】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0039】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0040】

様々な実施形態において、本開示は、以下の工程：ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む方法によって製造された、最適化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に関する。

【0041】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0042】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0043】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0044】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0045】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調製物中にペイロードを封入するための最適化されたハイスループット方法に関し、本方法は、ａ．水相を含む第１の溶液を得ること；ｂ．有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；ｃ．少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；ｄ．ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；ｅ．前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボット液体ハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；ｆ．前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；ｇ．前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；及びｈ．前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む。

【0046】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、ｍＲＮＡのサイズは約１ｋｂ～約２ｋｂである。様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、前記ポリペプチドは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。

【0047】

様々な実施形態において、ペイロードは第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、第１の溶液は水性緩衝液である。様々な実施形態において、第１の溶液は、ｐＨ調整済み緩衝液及び重量オスモル濃度調整済み緩衝液を含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はメタノールを含む。様々な実施形態において、第２の溶液の有機相はエタノールを含む。

【0048】

様々な実施形態において、自己集合性分子は、少なくとも１種の脂質分子から構成される少なくとも１つの脂質成分を含む。様々な実施形態において、少なくとも１種の脂質分子は、カチオン性脂質種、非カチオン性脂質種、及びリン脂質種から選択される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、脂質の総濃度は変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージは、全脂質組成の約０．５％～約５％の間で変動する。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。

【0049】

様々な実施形態において、ＬＮＰはポリマー脂質ナノ粒子である。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームである。様々な実施形態において、ＬＮＰはリポタンパク質ナノ粒子である。様々な実施形態において、前記第１の溶液は、前記第２の溶液に注入される。様々な実施形態において、前記第２の溶液は、前記第１の溶液に注入される。様々な実施形態において、最適なパラメータは、８０％を超えるペイロードの封入効率をもたらすパラメータである。様々な実施形態において、最適なパラメータは、単峰性サイズ分布及び約３０％未満の多分散性を有する、８０～２００ｎｍの平均直径を有するＬＮＰをもたらすパラメータである。様々な実施形態において、ＬＮＰは、４℃の溶液中での保存下で少なくとも１ヶ月間、同様のサイズ分布及びペイロード封入を維持する。

【0050】

様々な実施形態において、本開示は、ＬＮＰ形成についての複数のパラメータのＨＴＳスクリーニングのためのワークフローであって、（ｉ）ロボット液体ハンドラ；（ｉｉ）所望のＬＮＰ特性を測定することができる少なくとも１つの機器；及び；（ｉｉｉ）複数のマイクロウェルを含む少なくとも１つのマイクロプレート、を含み、前記ロボット液体ハンドラは、前記マイクロウェルの各々に複数の溶液を注入することができ；前記パラメータは、マイクロウェル間で系統的に変動し；前記所望のＬＮＰ特性は、各マイクロウェルについて測定することができる、ワークフローに関する。

【0051】

様々な実施形態において、複数のパラメータは、総脂質含有量、自己集合分子のタイプ；前記自己集合分子の組成比；前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度；相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、体積及び速度、並びに混合持続期間から選択される。様々な実施形態において、所望のＬＮＰ特性は、平均粒径、粒径分布、封入効率及び粒子安定性からなる群から選択される。様々な実施形態において、機器は、動的光散乱（ＤＬＳ）、紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光法又は蛍光分光法のいずれかが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1A-1F】高速のエタノール－緩衝液注入とそれに続く複数回の混合により生成された、ＡＳＯ負荷が高い均一なＬＮＰのデータを示す。０．４μｍｏｌの総脂質及び１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００で構成されるＬＮＰを、異なる混合条件を使用して１のＮ／Ｐ比の下でＡＳＯ－１と混合した。ＴＥＣＡＮロボットを使用して、０．１、０．５、又は０．９ｍｌ／ｓの速度での逆の注入順序（エタノール－緩衝液又は緩衝液－エタノール）とそれに続く１０回の混合反復（図１Ａ～１Ｃ）、又は０．５又は０．９ｍｌ／ｓの速度でのエタノール－緩衝液注入とそれに続く１０又は２０回の混合反復（図１Ｄ～１Ｆ）を調査した。粒径（図１Ａ及び１Ｄ）及び多分散性（図１Ｂ及び１Ｅ）を動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。遊離ＡＳＯ－１をＯＤ２６０によって測定し、封入効率について計算した（図１Ｃ及び１Ｆ）。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（図１Ａ～１Ｃ）二元配置又は一元配置（図１Ｄ～１Ｆ）ＡＮＯＶＡ、引き続いてＴｕｋｅｙの多重比較によって分析した。

【0053】

【図2】ＡＳＯ負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳワークフローを示す。ＴＥＣＡＮ（登録商標）液体ハンドラを使用する自動溶媒注入法によって、４レベルの脂質組成、２レベルの総脂質濃度、及び４レベルのＡＳＯ負荷量で変動する９６個の試料（３２条件、ｎ＝３）を調製し、続いて、２６０ｎｍでの吸光度によるＤＬＳ及びＡＳＯ封入による粒径分布の特性評価を行った。代表的なＬＥＡ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ設計レイアウトを試料プレートについて示した。

【0054】

【図3A-3E】ＡＳＯ－１負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ分析である。図３Ａは、スクリーニング設計を示す画像である。全脂質濃度（２レベル）脂質組成に組み込まれたＰＥＧ化脂質含有量（４レベル）、及びＡＳＯの負荷比（４レベル）を含む製剤パラメータを、各条件について３回反復して９６ウェルプレートでスクリーニングした。図３Ｂ～３Ｄは、試料をＰＢＳで希釈し、ＤＬＳによって粒径分布について特徴付けたことを示す。図３Ｂは、代表的なサイズ分布を示すグラフであり、脂質組成中に添加されたＰＥＧ化脂質の量が増加した小粒子集団を示した。図３Ｃ～３Ｄは、「範囲外」の黒い点によって示されるように、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００が脂質組成に組み込まれなかった場合の多峰性サイズ分布を有する大きな凝集体（５００～１５００ｎｍの直径）を除いて、ＬＮＰが４５～１４５ｎｍの平均直径及び１０～５０％の％ＰＤを有したことを示すヒートマップである。２ｍＭの総脂質濃度を有する試料についても定量分析を示した。図３Ｅは、封入効率を計算するためにＯＤ２６０によって非封入量のＡＳＯについて測定された試料アリコート（２ｍＭの総脂質濃度）を示す棒グラフである。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＴｕｋｅｙの多重比較によって分析）。このデータはＬＣによって確認された。

【0055】

【図4】ＰＥＧ化脂質なしで調製したＬＮＰが大きな凝集体を産生したことを示す棒グラフである。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００なしで調製したＡＳＯ－１負荷ＬＮＰ（スクリーニングされた条件を図３Ｃ～３Ｄの列Ａ及びＥに示す）の平均粒径を平均±ＳＤとして示す、ｎ＝３；ｎｓ、有意でない、＊Ｐ＜０．０５、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＳｉｄａｋの多重比較によって分析）。

【0056】

【図5A-5C】ＡＳＯ－１負荷カチオン性ＬＮＰ製剤のＨＴＳ分析である。スクリーニングしたカチオン性ＬＮＰは、６０～１２０ｎｍの平均直径（図５Ａ）、１０～５０％の多分散性（図５Ｂ）、及びＰＥＧ化脂質の量の増加に関してＭＣ３ ＬＮＰと同様の傾向を示した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を存在しない場合、「範囲外」の黒い点又は白い点によって示される不完全な測定（大きな凝集体のため）によって示されるように、多峰性のサイズ分布を持つ大きな凝集体が生成された。２ｍＭの総脂質濃度を有する試料についても定量分析を示した。（図５Ｃ）ＯＤ２６０によって非封入ＡＳＯの量について試料を測定して、封入効率を計算した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＴｕｋｅｙ（図５Ａ～５Ｂ）又はＳｉｄａｋ（図５Ｃ）の多重比較によって分析）。

【0057】

【図6A-6C】２ｍＭの総脂質濃度、異なる量のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、及び異なるオリゴヌクレオチド負荷下でイオン化可能な脂質と製剤化されたＡＳＯ－２負荷ＬＮＰのＨＴＳ分析である。結果は、ＡＳＯの粒径（図６Ａ）、多分散性（図６Ｂ）、及び封入効率（図６Ｃ）に関して、ＡＳＯ－１負荷ＬＮＰ（図３Ａ～３Ｅ）と同様の傾向を示した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；ｎｓ、有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＴｕｋｅｙの多重比較によって分析）。

【0058】

【図7A-7E】ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）を使用したマイクロ流体調製からの結果と相関するＨＴＳ分析結果である。図７Ａは、ＰＥＧ化脂質の量の増加に伴う粒径の減少及び多分散性の増加の相関を示すグラフである。ＬＮＰは、異なるモル比のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００及び固定Ｎ／Ｐ比２で調製した。図７Ｂは、高い総脂質濃度下で粒径が安定であったことを示すグラフである。ＬＮＰは、０．４、０．７、１、又は２ｍＭの総脂質濃度、１．５ｍｏｌ％の固定ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、及びＮ／Ｐ比２の下で調製した。図７Ｃ～図７Ｄは、粒径（図７Ｃ）が安定していた一方で、ＡＳＯ（図７Ｄ）の％ＥＥが高及び過剰のＡＳＯ負荷下で減少したことを示す。ＬＮＰは、Ｎ／Ｐ比＝５、２、１、又は０．５、及び１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００下で調製した。図７Ｅナノアセンブリ又は異なる製剤パラメータを用いたハイスループット溶媒注入によって調製されたＡＳＯ－１負荷ＬＮＰの代表的なｃｒｙｏ－ＴＥＭ画像。拡大画像は、２つのアプローチを使用して同じ製剤パラメータで調製された代表的なＬＮＰ（青色矢印で示す）の同様の構造パターンを示した。パネル（図７Ａ、７Ｃ、７Ｄ）におけるＨＴＳの結果は、図３に示される同じスクリーニング実験からのものである。結果は平均±ＳＤであり、図７Ｄのマイクロ流体結果についてｎ＝１を除いてｎ＝３である。

【0059】

【図8A-8B】ハイスループット溶媒注入法又はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）によって調製されたＡＳＯ－１負荷ＭＣ３ ＬＮＰの４°Ｃで２週間の安定性を示す。図８Ａは、平均粒径を示し、図８Ｂは、２週間にわたる多分散性を示すグラフである。総脂質濃度は２ｍＭであり、Ｎ／Ｐ比は１（ＨＴＳ試料）又は０．５（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）試料）であり、ＰＥＧ量は１．５から５ｍｏｌ％まで変動した。結果は平均±ＳＤであり、ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対各群の０日目の結果（一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較によって分析）。その後の研究（図示せず）は、４°Ｃで１ヶ月貯蔵した後に同様の結果を示した。

【0060】

【図9】図８Ａ～８Ｂに示されるＨＴＳ ＬＮＰの４０℃での２週間にわたる安定性を示すグラフである。結果は平均±ＳＤであり、ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５対各群の０日目の結果（一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較によって分析）。

【0061】

【図10】４０℃でのＬＮＰからのＡＳＯ漏出を示すグラフである。２週間以内にＬＮＰから放出されたＡＳＯ－１をＯＤ２６０によって測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３であり；＊Ｐ＜０．０５及びｎｓ、１．５ｍｏｌ％ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００群に対して有意ではない（二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてＴｕｒｋｅｙの多重比較によって分析）。

【0062】

【図11】ＨＴＳアプローチが、ＡＳＯ負荷ＬＮＰのマイクロ流体調製と比較して、原材料を有意に節約し、分析出力を改善したことを示す。１．５モル％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００及びＮ／Ｐ比（ＭＣ３及びＡＳＯ－１に基づく）１を含有する２ｍＭの総脂質を有する典型的な試料について、必要とされる材料を計算した。

【0063】

【図12A-12B】ＡＳＯ封入の定量化の代替方法を示す。図１２Ａは、ワークフローの概略図である。ＡＳＯ負荷ＬＮＰをハイスループット溶媒注入法によって調製し、蛍光プローブＳｙｂｒ－金と混合し、続いて蛍光プレートリーダー（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５５０ｎｍ）を使用して定量した。図１２Ｂは、異なるＮ／Ｐ比の下で調製された２つの異なるＬＮＰ製剤の同等の封入効率％を示すグラフである。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝２であり；ｎｓ、有意ではない。

【0064】

【図13A】ＨｉＢｉＴペプチド負荷リポソーム製剤のＨＴＳワークフローを示す。９６ウェルプレート形式でのハイスループットゲル濾過及び透析を含む２つの精製方法を比較した。ＬＮＰをハイスループット溶媒注入法によって合成し、続いてＤＬＳによる粒径分布及びＵＶ－Ｖｉｓ、発光及び蛍光による遊離カーゴ量の特性評価を行った。次いで、ハイスループットゲル濾過又は透析のいずれかを使用してＬＮＰを精製し、続いてＵＶ－Ｖｉｓ、蛍光及びＤＬＳをそれぞれ使用して、精製効率、粒子回収及び粒径安定性の分析を行った。

【0065】

【図13B】スクリーニング設計を示す画像である。ＭＣ３を含まないＤＰＰＣ ＬＮＰ、ＭＣ３を含むＤＰＰＣ ＬＮＰ、ＭＣ３を含まないＤＳＰＣ ＬＮＰ、及びアジドとコンジュゲートした遮蔽ペグ化脂質及びペグ化脂質の両方を含むＭＣ３を含むＤＳＰＣ ＬＮＰを含む製剤パラメータを、各条件について３連で９６ウェルプレートでスクリーニングした。

【0066】

【図13C】「範囲外」の黒い点によって示されるように、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００が脂質組成に組み込まれなかった場合の多峰性サイズ分布を有する大きな凝集体を除いて、ＬＮＰが５０～２００ｎｍの平均直径を有したことを示すヒートマップである。

【0067】

【図13D-13F】精製前（図１３Ｄ）及び精製後の遊離ペプチド濃度の定量を示す表である。ゲル濾過及び透析は、それぞれ約９８％（図１３Ｅ）及び約６１％（図１３Ｆ）の平均精製効率をもたらした。４０ｋＤのＭＷＣＯを有する９６の小さいカラムプレートをゲル濾過及びＰＢＳによる溶出のために使用した。１０ｋＤのＭＷＣＯを有する９６ウェル透析プレートを、３ＬのＰＢＳにおける透析のために一晩使用し、３回の培地交換を行った。透析後のデータ点の喪失は、試料回収が低いためであった。

【0068】

【図13G-13H】ゲル濾過による精製後の粒子回収率及びサイズの定量化を示すデータである。（図１３Ｇ）回収率は、ペグ化脂質なしで調製された凝集試料のための低い値を除いて、一般に８０～１２０％の間であった。（図１３Ｈ）粒径分布は、ゲル濾過による精製後も一定のままであった。

【発明を実施するための形態】

【0069】

詳細な説明
薬物送達のための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製造は、様々な製剤パラメータの影響を受ける複雑な物理化学的特性のために困難である。ＬＮＰ製造における粒子構造及びサイズ分布、粒子表面の物理化学的特性、脂質含有量、遊離ＡＰＩの量及び封入効率、並びに物理的及び化学的安定性の制御は困難かつ複雑である。従来のバッチ法による、脂質種、パーセンテージ、濃度及び薬物負荷を含むＬＮＰ製剤パラメータのスクリーニングは、かなりの時間及び原材料を必要とする。したがって、最小の材料入力並びに効率的な調製及び分析出力を有するハイスループットスクリーニングアプローチが、最適な品質属性を有するリード製剤候補を決定するために好ましいであろう。ロボット液体ハンドラは、主に液体の添加及び移送に使用されており、精密に調整された機器パラメータを有するＬＮＰ製剤化装置としては使用されていない。さらに、ＬＮＰ調製及び分析の両方を統合した合理化されたハイスループットワークフローが不足している。本明細書では、注入ベースのＬＮＰ形成のためのロボット液体ハンドラを使用して、所望の特性に基づいてＬＮＰ製造を最適化するためのハイスループット方法が提供される。最適化されたＬＮＰ粒子及びそれらの製造方法を、本明細書中にさらに提供する。

【0070】

本明細書の説明は例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことが理解されよう。本出願では、特に明記しない限り、単数形の使用は複数形を含む。

【0071】

本明細書で使用されるいかなる項目の見出しも、構成上の目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。本出願で引用された全ての文書、又は文書の一部（特許、特許出願、記事、書籍、及び論文）は、任意の目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本開示に従って利用される場合、以下の用語は、他に別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解すべきである。

【0072】

本出願では、「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的ではない。また、「要素」又は「構成成分」などの用語は、特に明記しない限り、１つの単位を含む要素及び構成成分と、１つよりも多くのサブユニットを含む要素及び構成成分の両方を包含する。

【0073】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、特定の処置のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象に関して本明細書では交換可能に使用される。

【0074】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖の両方のヌクレオチドポリマーを含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾としては、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース修飾、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート及びホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。

【0075】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、例えば突然変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原標識を含む標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。

【0076】

「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、天然配列の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含む、タンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を指す。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有する抗原結合分子、抗体、又は配列を特に包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長天然タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片はまた、天然タンパク質と比較して修飾アミノ酸を含むことができる。有用なポリペプチド断片には、抗原結合分子の免疫学的に機能的な断片が含まれる。

【0077】

「単離された」という用語は、（ｉ）通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない；（ｉｉ）同じ供給源、例えば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない；（ｉｉｉ）自然界で関連しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の材料の少なくとも約５０％から分離されている；（ｉｖ）自然界で関連していないポリペプチドと（共有結合又は非共有結合相互作用によって）作動可能に関連している；又は（ｖ）自然界では存在しないことを意味する。

【0078】

ポリペプチド（例えば、抗原結合分子）の「バリアント」は、１つ以上のアミノ酸残基が別のポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列に挿入、欠失及び／又は置換されているアミノ酸配列を含む。バリアントには、例えば、融合タンパク質が含まれる。

【0079】

「同一性」という用語は、配列をアライメントして比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較される分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一の残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。

【0080】

同一性パーセントを計算するために、比較される配列は、典型的には、配列間の最大一致を与えるようにアライメントされる。同一性パーセントを決定するために使用され得るコンピュータプログラムの一例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８４，１２，３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）である。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、パーセント配列同一性が決定される２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドをアラインメントするために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適なマッチングのためにアライメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。特定の実施形態では、標準的な比較行列もアルゴリズムによって使用される（例えば、ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５－３５２を参照し；ＢＬＯ－ＳＵＭ ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，１０９１５－１０９１９を参照のこと）。

【0081】

「誘導体」という用語は、アミノ酸（又は核酸）の挿入、欠失、又は置換以外の化学修飾を含む分子を指す。特定の実施形態において、誘導体は、限定されないが、ポリマー、脂質、又は他の有機若しくは無機部分との化学結合を含む共有結合修飾を含む。特定の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合分子は、化学的に修飾されていない抗原結合分子よりも大きい循環半減期を有することができる。いくつかの実施形態において、誘導体抗原結合分子は、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、又はポリプロピレングリコールを含む１つ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有結合的に修飾される。

【0082】

ペプチド類似体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として製薬業界で一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」又は「ペプチド模倣薬」と呼ばれる。任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ｌ．，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１９８６，１５，２９；Ｖｅｂｅｒ，Ｄ．Ｆ．＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．，１９８５，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８，３９２－３９６；及びＥｖａｎｓ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０，１２２９－１２３９。

【0083】

「治療有効量」という用語は、哺乳動物において治療応答を生じるように決定された免疫細胞又は他の治療剤の量を指す。そのような治療有効量は、当業者によって容易に確認される。

【0084】

「患者」及び「対象」という用語は互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物対象、並びに正式に診断された障害を有する対象、正式に認識された障害を有しない対象、医学的注意を受けている対象、障害を発症するリスクがある対象などを含む。

【0085】

「処置する（ｔｒｅａｔ）」及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療的処置、予防的処置、及び対象が障害又は他の危険因子を発症するリスクを低下させる適用を含む。処置は、障害の完全な治癒を必要とせず、症候又は根底にある危険因子を軽減する実施形態を包含する。「防止する」という用語は、事象の可能性を１００％排除することを必要としない。むしろ、これは、化合物又は方法の存在下で事象の発生の可能性が低下したことを示す。

【0086】

組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、又は当技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実施することができる。前述の技術及び手順は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されているように実行することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0087】

本明細書で使用される場合、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量又は長さと比較して約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％高い量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。一実施形態において、「本質的に同じ」又は「実質的に同じ」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さとほぼ同じ量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さの範囲を指す。

【0088】

本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換的に使用され、細胞集団又は培養培地等の組成物を説明するために使用される場合、特定の物質を含まない、例えば９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まない、又は従来の手段で測定して検出不能な組成物を指す。同様の意味は、組成物の特定の物質又は成分の非存在を指す「非存在」という用語にも適用することができる。

【0089】

本明細書で使用される場合、「認識できる」という用語は、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量若しくは長さの範囲、又は１つ以上の標準的な方法によって容易に検出可能な事象を指す。「認識不可能」及び「認識できない」という用語及び等価物は、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量若しくは長さの範囲、又は標準的な方法では容易に検出できない若しくは検出不可能な事象を指す。一実施形態において、事象は、それが５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．００１％、又はそれ未満の時間で発生する場合、認識できない。

【0090】

本明細書を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載された工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群を含むが、任意の他の工程若しくは要素又は工程若しくは要素の群を除外しないことを意味すると理解される。特定の実施形態では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義的に使用される。

【0091】

本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句に続くものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。

【0092】

「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素について本開示で指定された活性又は作用に干渉又は寄与しない他の要素に限定される。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意ではなく、列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。

【0093】

本明細書を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、又は「さらなる実施形態」、又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらにまた、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ又は複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられることができる。

【0094】

本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、基準の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％変動する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。特定の実施形態では、数値に先行する場合の「約」又は「およそ」という用語は、１５％、１０％、５％若しくは１％の範囲、又はそれらの任意の介在範囲をプラス又はマイナスした値を示す。

【0095】

脂質ナノ粒子の製造を最適化するためのハイスループットスクリーニング方法
脂質ベースのナノ医薬のスクリーニング及び最適化の必要性に対処するために、本明細書の開示は、脂質ナノ粒子の調製のための、並びにそれらの粒径分布及びペイロード封入の特徴付けのためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）ワークフローを提供する。

【0096】

様々な実施形態において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製造を最適化するためのハイスループットスクリーニング方法に関する。様々な実施形態において、本明細書に開示される方法は、（ｉ）ロボット液体ハンドラと、（ｉｉ）所望のＬＮＰ特性を測定することができる少なくとも１つの機器と、（ｉｉｉ）複数のマイクロウェルを含む、少なくとも１つのマイクロプレートとを含むハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）スクリーニングワークフローを利用する。様々な実施形態では、ＬＮＰは、溶媒注入法を使用して上記のＨＴＳスクリーニングワークフローによって形成される。例えば、Ｇｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．２２，１８－３０；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ－Ｇｏｙｍａｎｎ，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５５，１２５－１３１を参照のこと。

【0097】

様々な実施形態において、ＨＴＳワークフローは、所望のＬＮＰ特性を測定することができる機器を含む。そのような特性には、封入効率、平均粒径、及び粒径分布が含まれる。物理的安定性はまた、貯蔵後の異なる時点で粒径及びペイロード放出を測定することによって決定することができる。そのような分析技術は当技術分野で公知であり、走査／透過型電子顕微鏡法（ＳＥＭ／ＴＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）分析超遠心分離（ＡＵＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、紫外線（ＵＶ）分光法、及び流れ場分画（ＦＦＦ）を含む。様々な実施形態において、ＨＴＳワークフローは、ＤＬＳ、ＵＶ－Ｖｉｓ又は蛍光分光法が可能な機器を含む。様々な実施形態において、本明細書に開示される方法は、（ｉ）ロボット液体ハンドラと、（ｉｉ）ＤＬＳを実行することができる機器と、（ｉｉｉ）試料に対するＵＶ－Ｖｉｓ又は蛍光分光法が可能な機器と、（ｉｖ）複数のマイクロウェルを含む少なくとも１つのマイクロプレートとを含むハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）スクリーニングワークフローを利用する。

【0098】

様々な実施形態において、ＨＴＳワークフローは、溶媒注入システムを使用してＬＮＰ製造を最適化する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「溶媒注入システム」は、脂質含有自己集合性分子を含む第１の溶液を第２の溶液に迅速に注入することを意味する。様々な実施形態において、溶液は混合可能又は混和性である。様々な実施形態において、第１の溶液は水混和性溶媒である。様々な実施形態において、少なくとも１つの溶液は有機相溶媒である。アセトン、エタノール、イソプロパノール及びメタノールは全て、ＬＮＰ調製に適した溶媒である。様々な実施形態において、第１の溶液はアルコールである。様々な実施形態において、第１の溶液はエタノールである。様々な実施形態において、第１の溶液はメタノールである。

【0099】

様々な実施形態において、ＬＮＰによって封入されるペイロードは、前記第２の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ＬＮＰによって封入されるペイロードは、前記第１の溶液に溶解される。様々な実施形態において、ペイロードは、第３の水混和性溶媒によって封入される。

【0100】

様々な実施形態において、溶液の少なくとも２つは異なる相である。様々な実施形態において、３つの溶液が互いに注入される。様々な実施形態において、少なくとも４つの溶液が互いに注入される。様々な実施形態において、少なくとも１つの有機相及び少なくとも１つの水相が存在する。

【0101】

様々な実施形態において、溶液の１つは水性溶媒を含む。様々な実施形態において、水性溶媒は水性緩衝液である。

【0102】

一方の溶液の他方の溶液への注入は、ロボット液体ハンドラによって制御される。本明細書で使用される場合、「ロボット液体ハンドラ」という用語は、液体を複数のウェル、マイクロウェル、又は他の液体リザーバに並列に自動的にピペッティング、移送、及び混合することができる装置を意味する。様々な実施形態において、ロボット液体ハンドラは、異なる組成又は異なる量の液体を異なるウェル、マイクロウェル又は液体リザーバに並行して送達することができる。様々な実施形態において、ロボット液体ハンドラは、液体を異なるウェル、マイクロウェル又は液体リザーバに、様々な速度又は持続時間で並行してピペッティング、移送及び混合することができる。

【0103】

様々な実施形態において、前記一方の溶液を前記第２の溶液に注入した後、ロボット液体ハンドラは前記溶液を繰り返し取り上げて再注入し、それによって少なくとも２つの溶液を混合する。様々な実施形態において、この注入及び／又は混合の速度及び持続時間を変化させて、ＬＮＰ形成の最適なパラメータを決定する。様々な実施形態において、注入及び／又は混合の速度は、０．１ｍｌ／ｓ～０．９ｍｌ／ｓで変動する。様々な実施形態において、初期注入速度（すなわち、液体の第１の注入）は、０．１ｍｌ／ｓ～０．９ｍｌ／ｓの速度で行われる。図１を参照されたい。様々な実施形態において、その後の注入／混合は、１～１０秒間にわたって行われる（０．１ｍｌ／秒～０．９ｍｌ／秒で１０×混合）。

【0104】

様々な実施形態において、ＬＮＰ形成は、少なくとも１つのマイクロプレートで完了する。様々な実施形態では、マイクロプレートは複数のマイクロウェルで構成され、形成条件（例えば、脂質種、脂質組成、総脂質濃度、ペイロード、ペイロード負荷比、相種）はマイクロウェル間で変動する。マイクロプレートは、任意のサイズであり得、任意の数のマイクロウェルを含み得る。様々な実施形態において、マイクロプレートは、４、６、８、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６個のマイクロウェルを含む。

【0105】

本明細書で提供されるＨＴＳ方法の１つの利点は、ＬＮＰ形成が少量の溶液中で迅速に起こり得ることである。本明細書に開示される方法は、材料消費を１０倍減少させ、処理出力を１００倍改善する（図１１参照）。マイクロウェルにおけるＬＮＰ形成は、例えばマイクロ流体ベースの調製物を使用して形成されたＬＮＰよりもかなり少ない材料を使用する。様々な実施形態において、マイクロウェルは、体積が約１０μＬ、約２０μＬ、約３０μＬ、約４０μＬ、約５０μＬ、約６０μＬ、約７０μＬ、約８０μＬ、約９０μＬ、約１００μＬ、約１２５μＬ、約１５０μＬ、約１７５μＬ、約２００μＬ、約２５０μＬ、約３５０μＬ、約３６０μＬ、約４００μＬ、約５００μＬ、約１０００μＬ、約２０００μＬ、約３０００μＬ、約４０００μＬである。

【0106】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
本明細書では、最適化された脂質ナノ粒子、並びにこれらの脂質ナノ粒子「ＬＮＰ」の製造を最適化する方法が提供される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、（ｉ）複数の自己集合性分子（前記自己集合性分子は脂質成分を含む）及び（ｉｉ）ペイロードを含む組成物を指す。本発明を使用して製造が最適化されたＬＮＰは、任意の目的に使用することができる。様々な実施形態において、最適化されたＬＮＰは、ワクチンを送達するために使用され得る。様々な実施形態において、最適化されたＬＮＰは、薬物を、それを必要とする患者に送達するために使用され得る。ＬＮＰは、核酸、ペプチド、タンパク質及び小分子を含むがこれらに限定されない任意のペイロードを担持し得る。さらに、ＬＮＰは、脂質（例えば、リポソーム）のみからなっていてもよく、又は自己集合が可能なポリマー若しくはタンパク質などの他の成分を含んでいてもよい。

【0107】

様々な実施形態において、ＬＮＰは、上記の技術を使用して製造された最適化されたＬＮＰである。様々な実施形態において、最適化されたＬＮＰは、以下の工程：（ｉ）水相を含む第１の溶液を得ること、（ｉｉ）有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；（ｉｉｉ）少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；（ｉｖ）ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；（ｖ）前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボットハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることであって、以下の条件：自己集合分子のタイプ、前記自己集合分子の組成比、前記自己集合分子の前記ペイロードに対する比及び／又は濃度、相、緩衝液タイプ及びｐＨの選択、注入順序、注入速度、混合速度、体積、相比、注入持続時間、並びに混合持続時間のうちの少なくとも１つが、異なるウェル間で変動する、脂質ナノ粒子を得ること；（ｖｉ）前記ＬＮＰの封入効率、粒径分布、精製及び粒子回収率、並びに製剤安定性のうちの少なくとも１つを測定すること；（ｖｉｉ）前記ＬＮＰ調製物を製造するための最適なパラメータを決定すること；並びに（ｖｉｉｉ）前記最適なパラメータに基づいて前記ＬＮＰ調製物を製造することを含む方法によって製造される。

【0108】

様々な実施形態において、本発明は、ハイスループット方法を使用してＬＮＰを製造する方法に関し、その方法は以下の工程：（ｉ）水相を含む第１の溶液を得ること、（ｉｉ）有機相と自己集合することができる複数の分子とを含む第２の溶液を得ることであって、前記第１の溶液及び前記第２の溶液が混合可能である、第２の溶液を得ること；（ｉｉｉ）少なくとも１つのペイロード分子を第１の溶液又は第２の溶液のいずれかに溶解すること；（ｉｖ）ロボット液体ハンドラを使用して、様々な組成を有する前記相を調製し、複数のウェルに分注すること；（ｖ）前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ＬＮＰ形成に適した条件下で前記ロボットハンドラを使用して前記ペイロードを封入する脂質ナノ粒子を得ることを含む。

【0109】

自己集合性分子
本明細書で使用される場合、「自己集合性分子」という用語は、外部供給源からの案内又は管理なしに定義された配置が可能な任意の分子を指す。最適化されたＬＮＰは、単一種の自己集合性分子から構成され得るか、又は複数種の自己集合性分子から構成され得る。様々な実施形態において、最適化されたＬＮＰは、少なくとも１種の脂質分子を有する脂質成分を含む。様々な実施形態において、ＬＮＰは、ポリマー分子及び／又はタンパク質／ペプチド分子を含み得る。様々な実施形態において、ＬＮＰの自己集合性分子は、脂質分子のみを含み得る。

【0110】

脂質成分は、単一の脂質種を含んでもよく、又は２種類以上の脂質を含んでもよい。本発明の様々な実施形態において、ＬＮＰ調製物中の脂質の相対組成は変動する。様々な実施形態において、所与のＬＮＰ製剤の製造のための最適パラメータを考慮する場合、異なる脂質種又は異なる脂質種の組み合わせが評価される。様々な実施形態において、少なくとも１つの脂質分子がペグ化される。様々な実施形態において、脂質成分は、リン脂質を含み得る。

【0111】

様々な実施形態において、ＬＮＰ製剤は、１つ又は複数のカチオン性又はイオン化可能な脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（標的２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（標的２４）、Ｎ１ＧＬ、Ｎ２ＧＬ、Ｖ１ＧＬ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0112】

いくつかの実施形態において、１つ又は複数のカチオン性又はイオン化可能な脂質はアミノ脂質である。様々な実施形態において、アミノ脂質は、第一級、第二級、第三級、第四級アミン、ピロリジン又はピペリジンである。本発明での使用に適したアミノ脂質には、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７１８０９１７号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１７１８０９１７号における例示的なアミノ脂質には、段落

【0113】

に記載されるもの、例えば、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）及び化合物１８が含まれる。他のアミノ脂質としては、化合物２、化合物２３、化合物２７、化合物１０及び化合物２０が挙げられる。本発明での使用に適したさらなるアミノ脂質には、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７１１２８６５号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１７１１２８６５号の例示的なアミノ脂質には、式（Ｉ）、（Ｉａｌ）－（Ｉａ６）、（ｌｂ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩＩ）、（Ｉｌｉａ）、（ＩＶ）、（１７－１）、（１９－１）、（１９－１１）、及び（２０－１）の１つによる化合物、並びに段落［００１８５］、［００２０１］、［０２７６］の化合物が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明での使用に適したカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６１１８７２５号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１６１１８７２５号の例示的なカチオン性脂質には、ＫＬ２２及びＫＬ２５などが含まれる。いくつかの実施形態において、本発明での使用に適したカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６１１８７２４号に記載されているものが含まれる。国際公開第２０１６１１８７２５号における例示的なカチオン性脂質には、ＫＬ１０、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）及びＫＬ２５などが含まれる。

【0114】

いくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤は、１つ又は複数の非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される。

【0115】

いくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤は、１つ又は複数のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ_６－Ｃ_２０ 長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した５ｋＤａまでの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ｎａｄ ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ又はＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。

【0116】

様々な実施形態において、ＬＮＰ中のＰＥＧ化されている脂質のパーセンテージ（すなわち、ＰＥＧ密度）は変動する。ＬＮＰ中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）密度は、粒径、表面電荷及び安定性に影響を及ぼすことが分かっている。様々な実施形態において、ＰＥＧ密度は、約０．１％～約１０％の間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ密度は、約０．２％～約９％の間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ密度は、約０．３％～約８％の間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ密度は、約０．４％～約７％の間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ密度は、約０．５％～約６％の間で変動する。様々な実施形態において、ＰＥＧ密度は、約０．５％～約５％の間で変動する。

【0117】

様々な実施形態において、ＬＮＰ調製のための溶液中に存在する脂質成分の総濃度は、任意の所与のＬＮＰの最適な特性を達成するために変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．１ｍＭ～約８ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．２ｍＭ～約７ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．３ｍＭ～約６ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．４ｍＭ～約４ｍＭの間で変動する。様々な実施形態において、脂質の総濃度は、約０．５ｍＭ～約３ｍＭの間で変動する。

【0118】

様々な実施形態において、ＬＮＰは、２種類以上の脂質を含む。様々な実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも２種類の脂質を含む。様々な実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも３種類の脂質を含む。様々な実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも４種類の脂質を含む。様々な実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも５種類の脂質を含む。様々な実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも６種類の脂質を含む。様々な実施形態において、ＬＮＰは、少なくとも７種類の脂質を含む。

【0119】

ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ又は複数の構造脂質を含み得る。本発明のナノ粒子組成物は、構造脂質（例えば、コレステロールフェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸又はアルファ－トコフェロール）を含み得る。

【0120】

ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ以上のリン脂質、例えば１つ又は複数の（ポリ）不飽和脂質を含み得る。一般に、そのような脂質は、リン脂質部分及び１つ又は複数の脂肪酸部分を含み得る。

【0121】

リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然種も企図される。

【0122】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又はＤＳＰＣとＤＯＰＥの両方を含み得る。本発明の組成物及び方法において有用なリン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。

【0123】

ＬＮＰ組成物は、前のセクションで説明したものに加えて、１つ又は複数の成分を含んでもよい。例えば、ナノ粒子組成物は、ビタミン（例えば、ビタミンＡ又はビタミンＥ）又はステロールなどの１つ又は複数の疎水性小分子を含み得る。

【0124】

ＬＮＰ組成物はまた、１つ又は複数の透過性増強分子、炭水化物、ポリマー、治療薬、表面変化剤、又は他の成分を含み得る。透過性亢進分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖（例えば、グリコーゲン及びその誘導体及び類似体）を含み得る。

【0125】

ポリマーは、ＬＮＰ組成物に含まれてもよく、及び／又はＬＮＰ組成物を封入又は部分的に封入するために使用されてもよい。ポリマーは、生分解性及び／又は生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマーとしては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノクララレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＥＶＡ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などのポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、アルキルセルロースなどの誘導体化セルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えばポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）及びそれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリオキサミン、ポリ（オルソ）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）及びトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられ得る。

【0126】

治療剤には、細胞傷害剤、化学療法剤、及び他の治療剤が含まれ得るが、これらに限定されない。細胞傷害性薬剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ラケマイシン及びそれらの類似体が挙げられ得る。放射性イオンも治療薬として使用することができ、例えば、放射性ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、コバルト、イットリウム、サマリウム、及びプラセオジウムを含んでもよい。他の治療薬としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン及び５－フルオロウラシル、並びにデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、ラケマイシン、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、及びシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール及びメイタンシノイド）が挙げられ得る。

【0127】

表面変化剤には、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖又は糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレロデンドラム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミドール、レトスチン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシン１３４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン及びエルドステイン）及びＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮアーゼ）が含まれ得るが、これらに限定されない。表面改質剤は、ＬＮＰ内及び／又はＬＮＰ組成物の表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、又は他のプロセスによって）配置され得る。

【0128】

これらの成分に加えて、本発明のＬＮＰ組成物は、医薬組成物に有用な任意の物質を含み得る。例えば、ＬＮＰ組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容され得る賦形剤又は補助成分、例えば限定されないが、１つ又は複数の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、油、保存剤及び他の種を含み得る。ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味料、及び芳香剤などの賦形剤も含まれ得る。薬学的に許容され得る賦形剤は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６）。

【0129】

希釈剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖及び／又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルスターチナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、及び／又はそれらの組み合わせからなる非限定的なリストから選択され得る。

【0130】

界面活性剤及び／又は乳化剤としては、限定されないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、軟骨、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂肪、コレステロール、ワックス及びレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル及びモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、セトリモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ドクサートナトリウム及び／又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。

【0131】

結合剤はデンプン（例えばコーンスターチ及びデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワールガム、ガティガム、イサポールハスクの粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、及びカラスムギのアラビアガム）；アルギネート；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；及びそれらの組み合わせ、又は任意の他の適切な結合剤であり得る。

【0132】

防腐剤としては、限定されないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及び／又は他の防腐剤が挙げられる。酸化防止剤としては、限定されないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／又は亜硫酸ナトリウムが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／又はエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌防腐剤としては、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／又はチメロサールが挙げられる。抗真菌性防腐剤としては、限定されないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム及び／又はソルビン酸が挙げられる。アルコール保存剤の例としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、ベンジルアルコール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート及び／又はフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。酸性保存剤の例としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸及び／又はフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の防腐剤としては、限定されないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デスルホキシムメシラート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）及び／又はＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられる。

【0133】

緩衝剤の例としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノ－スルホン酸緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張性生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群から選択され得る。

【0134】

油の例としては、限定されないが、アーモンド、アプリコット穀粒、アボガド、ババス、ベルガモット、黒カウ種子、ボリジ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラの肝臓、コーヒー、コーン、綿実種、エムー、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ひょうたん、グレープ種子、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、クク落花生、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リシークベバ、マカデミアナッツ、マロウ、マンゴー種子、メドウフォーム種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、トウニン、ピーナッツ、ケシ種子、カボチャ種子、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、ビャクダン、サスカナ、セイボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽油、並びにステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0135】

様々な実施形態において、ＬＮＰはリポソームであり得る。様々な実施形態では、ＬＮＰはポリマー－脂質ナノ粒子であり得る。様々な実施形態において、ＬＮＰは、追加のタンパク質又はペプチド分子を含み得る。

【0136】

ペイロード
本発明のＬＮＰは、ペイロードを封入するために製造される。「ペイロード」という用語は、本開示に記載される脂質ナノ粒子製剤と複合体を形成する任意の化学的実体、医薬、薬物（そのような薬物は、小分子、無機固体、ポリマー、又はバイオポリマーであり得るが、これらに限定されない）、小分子、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチドなどを指す。ペイロードはまた、身体機能の疾患、病気、病い、又は障害を処置又は予防するための候補（例えば、未知の構造及び／又は機能）を包含し、公知の治療化合物及び潜在的な治療化合物の両方である試験化合物を含むが、これらに限定されない。試験化合物は、本開示のスクリーニング方法を用いたスクリーニングによって治療的であると決定することができる。

【0137】

様々な実施形態において、ペイロードは１つ又は複数のヌクレオチドからなる。例えば、様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、そのようなペイロード封入ＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比によって特徴付けられ得る。本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」は、正に帯電したポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基対負に帯電した核酸リン酸（Ｐ）基の比を指す。Ｎ／Ｐ比は、細胞内ペイロード送達において重要な役割を果たす。様々な実施形態において、ペイロードのＮ：Ｐ比は変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．５～約５の間で変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．２５～約１０の間で変動する。様々な実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約０．１、約０．２、約０．２５、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０である。

【0138】

様々な実施形態において、ペイロードはオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。オリゴヌクレオチドは、様々な長さのものであり得る。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９又は約４０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約２～約４０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約４～約３５ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０及び約３０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１２～約１７ヌクレオチド長である。

【0139】

様々な実施形態において、ペイロードはｍＲＮＡである。様々な実施形態において、そのｍＲＮＡは、約５００～３０００ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ｍＲＮＡは、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２５００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、ｍＲＮＡは抗原ペプチドをコードする。様々な実施形態において、ｍＲＮＡはワクチンの一部である。

【0140】

様々な実施形態では、ペイロードはポリペプチドである。様々な実施形態において、ポリペプチドは、約１，０００～１０，０００Ｄａである。様々な実施形態において、ポリペプチドは、約５００Ｄａ、約６００Ｄａ、約７００Ｄａ、約８００Ｄａ、約９００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約２，５００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約３，５００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約４，５００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約５，５００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約６，５００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約７，５００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約８，５００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約９，５００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ又は約２０，０００Ｄａである。

【0141】

様々な実施形態において、ペイロードは小分子である。様々な実施形態において、小分子は、約１００Ｄａ～１０００Ｄａである。様々な実施形態において、小分子は、約５０Ｄａ、約６０Ｄａ、約７０Ｄａ、約８０Ｄａ、約９０Ｄａ、約１００Ｄａ、約１５０Ｄａ、約２００Ｄａ、約２５０Ｄａ、約３００Ｄａ、約３５０Ｄａ、約４００Ｄａ、約４５０Ｄａ、約５００Ｄａ、約５５０Ｄａ、約６００Ｄａ、約６５０Ｄａ、約７００Ｄａ、約７５０Ｄａ、約８００Ｄａ、約８５０Ｄａ、約９００Ｄａ、約９５０Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ又は約２，０００Ｄａである。

【0142】

医薬製剤
様々な実施形態において、最適化された脂質ナノ粒子は、医薬製剤として全体的又は部分的に製剤化され得る。本発明の医薬製剤は、１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つ又は複数の異なるペイロードを含む１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容され得る賦形剤又は本明細書に記載されるものなどの補助成分をさらに含み得る。医薬組成物及び薬剤の製剤化及び製造のための一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６で利用可能である。従来の賦形剤及び補助成分は、任意の従来の賦形剤又は補助成分が本発明のナノ粒子組成物の１つ又は複数の成分と不適合であり得る限りを除いて、本発明の任意の医薬組成物に使用され得る。賦形剤又は補助成分は、その成分との組み合わせが任意の望ましくない生物学的効果又は他の有害な効果をもたらし得る場合、ナノ粒子組成物の成分と不適合であり得る。

【0143】

いくつかの実施形態において、１つ又は複数の賦形剤又は補助成分は、本発明のナノ粒子組成物を含む医薬組成物の総質量又は体積の５０％超を構成し得る。例えば、１つ又は複数の賦形剤又は補助成分は、薬学的慣例の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれよりも多くを構成し得る。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用及び獣医学的使用のために承認されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は医薬品グレードである。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方及び／又は国際薬局方の基準を満たす。

【0144】

本開示による医薬組成物中の１つ又は複数のナノ粒子組成物、１つ又は複数の薬学的に許容され得る賦形剤、及び／又は任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、及び／又は症状に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて、変動する。例として、医薬組成物は、０．１％～１００％（ｗｔ／ｗｔ）の１つ又は複数のナノ粒子組成物を含み得る。

【0145】

１つ又は複数のナノ粒子組成物を含むナノ粒子組成物及び／又は医薬組成物は、ｍＲＮＡを１つ又は複数の特定の細胞、組織、器官、又はその系若しくは群、例えば腎臓系に送達することによって提供される治療効果から利益を得ることができる患者又は対象を含む任意の患者又は対象に投与することができる。本明細書で提供されるナノ粒子組成物及びナノ粒子組成物を含む医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した組成物に関するものであるが、そのような組成物は一般に任意の他の哺乳動物への投与に適していることが当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするためのヒトへの投与に適した組成物の改変は十分に理解されており、当業者の獣医学薬理学者は、仮にあるとしても単なる通常の実験でそのような改変を設計及び／又は実施することができる。組成物の投与が企図される対象には、ヒト、他の霊長類、並びにウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。

【0146】

１つ又は複数のナノ粒子組成物を含む医薬組成物は、薬理学の分野で公知の又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ若しくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、所望又は必要に応じて、製品を所望の単回又は複数回投与単位に分割、成形及び／又は包装することを含む。

【0147】

本開示による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／又は複数の単一単位用量として調製、包装、及び／又は販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物（例えば、ナノ粒子組成物）の離散量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投与量及び／又はそのような投与量の好都合な割合、例えばそのような投与量の半分又は１／３に等しい。

【0148】

本発明の医薬組成物は、様々な投与経路及び投与方法に適した様々な形態で調製され得る。例えば、本発明の医薬組成物は、液体剤形（例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル）、注射剤形、固体剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末及び顆粒）、局所及び／又は経皮投与用の剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤及びパッチ）、懸濁液、粉末、及び他の形態で調製され得る。

【0149】

経口及び非経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容され得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及び／又はエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば水、又はエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル等のその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤並びにこれらの混合物等の、当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤及び／又は芳香剤などのアジュバントを含むことができる。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／又はそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。

【0150】

注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁化剤を使用する既知の技術に従って製剤化されうる。滅菌注射用製剤は、無毒の非経口的に許容され得る希釈剤及び／又は溶媒中の，滅菌注射用溶液，懸濁液、及び／又はエマルジョンであってもよく、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液である。利用され得る許容され得る賦形剤及び溶媒には、水、リンゲル液、ＵＳＰ、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油を用い得る。オレイン酸といった脂肪酸が、注射物の調製に使用することができる。

【0151】

注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、及び／又は使用前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体に溶解するか又は分散させることのできる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。

【0152】

有効成分の効果を延長するために、皮下注射又は筋肉内注射からの有効成分の吸収を遅らせることがしばしば望ましい。これは、水溶度の低い結晶性又は非晶性の材料の液体懸濁液を使用することにより、達成可能である。次いで、薬物の吸収速度は、薬物の溶解速度に依存し、次いで、溶解速度は、結晶の大きさ及び結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、油ビヒクル中に薬物を溶解又は懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物の微量封入マトリックスを形成することによって生成される。薬物とポリマーとの比及び使用される具体的なポリマーの性質に応じて、薬物放出速度は制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。

【0153】

直腸投与又は膣内投与のための組成物は、典型的には、組成物を、ココアバター、ポリエチレングリコール又は坐剤用蝋等の適切な非刺激性賦形剤又は担体であって、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、それゆえ直腸又は膣腔内で融解し、活性成分を放出する賦形剤と混合することによって調製することができる坐剤である。

【0154】

経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、フィルム剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形において、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容され得る賦形剤、例えばクエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウム及び／又は充填剤若しくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース及びアカシア）、湿潤剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム）、溶液遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイト粘土、ケイ酸塩）及び潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、並びにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含んでもよい。

【0155】

このような賦形剤をラクトース（すなわち乳糖）として使用し、並びに高分子量ポリエチレングリコールなども使用することで、類似タイプの固体組成物を、ソフトゼラチンカプセル及びハードゼラチンカプセルの充填剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、及び顆粒の固体投薬形態は、腸溶性コーティング、及び製剤技術分野において既知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルにより調製することができる。それらは、任意に乳白剤を含んでもよく、それらが１つ又は複数の活性成分を、腸管の特定の部分にのみ、又は優先的に、任意選択的に遅延させて、放出する組成物のものとすることもできる。使用可能な埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質及び蝋が挙げられる。このような賦形剤をラクトース（すなわち乳糖）として使用し、並びに高分子量ポリエチレングリコールなども使用することで、類似タイプの固体組成物を、ソフトゼラチンカプセル及びハードゼラチンカプセルの充填剤として使用することができる。

【0156】

組成物の局所投与及び／又は経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ジェル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤及び／又はパッチ剤が含まれ得る。一般に、活性成分は、滅菌条件下で薬学的に許容され得る賦形剤及び／又は必要に応じて任意の必要な保存剤及び／又は緩衝剤と混合される。さらに、本開示は、身体への化合物の制御された送達を提供するというさらなる利点を有することが多い経皮パッチの使用を企図する。そのような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体に溶解及び／又は分注することによって調製され得る。代替的又は追加的に、速度制御膜を提供することによって、及び／又は化合物をポリマーマトリックス及び／又はゲルに分散させることによって、速度を制御することができる。

【0157】

本明細書中に記載される皮内医薬組成物を送達する際に使用するための好適な装置としては、短針装置、例えば、米国特許第４，８８６，４９９号；米国特許第５，１９０，５２１号；米国特許第５，３２８，４８３号；米国特許第５，５２７，２８８号；米国特許第４，２７０，５３７号；米国特許第５，０１５，２３５号；米国特許第５，１４１，４９６号；及び米国特許第５，４１７，６６２号に記載されるものが挙げられる。皮内組成物は、皮膚への針の有効な貫通長さを制限する装置、例えば、国際公開第９９／３４８５０号に記載されているもの及びその機能的等価物によって投与され得る。液体ジェット注射器を介して、及び／又は角質層を穿刺し、真皮に到達するジェットを生成する針を介して、真皮に液体組成物を送達するジェット注射装置が適している。ジェット噴射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；米国特許第５，５９９，３０２号；米国特許第５，３３４，１４４号；米国特許第５，９９３，４１２号；米国特許第５，６４９，９１２号；米国特許第５，５６９，１８９号；米国特許第５，７０４，９１１号；米国特許第５，３８３，８５１号；米国特許第５，８９３，３９７号；米国特許第５，４６６，２２０号；米国特許第５，３３９，１６３号；米国特許第５，３１２，３３５号；米国特許第５，５０３，６２７号；米国特許第５，０６４，４１３号；米国特許第５，５２０，６３９号；米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第４，７９０，８２４号；米国特許第４，９４１，８８０号；米国特許第４，９４０，４６０号；並びに国際公開第９７／３７７０５号及び国際公開第９７／１３５３７号に記載されている。圧縮ガスを使用して粉末形態のワクチンを皮膚の外層を通して真皮まで加速する弾道粉末／粒子送達装置が適している。代替的又は追加的に、従来のシリンジは、皮内投与の古典的なマントー法で使用されてもよい。

【0158】

局所投与に適した製剤には、液体及び／又は半液体製剤、例えば、リニメント、ローション、水中油及び／又は油中水エマルジョン、例えば、クリーム、軟膏及び／又はペースト、並びに／あるいは溶液及び／又は懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。局所投与可能な製剤は、例えば、約１％～約１０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限界と同じくらい高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書中に記載される１つ又は複数の追加の成分をさらに含み得る。

【0159】

医薬組成物は、口腔を介した肺投与に適した製剤で調製、包装、及び／又は販売され得る。そのような製剤は、活性成分を含んでおり約０．５ｎｍ～約７ｎｍ又は約１ｎｍ～約６ｎｍの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。そのような組成物は、粉末を分散させるために推進剤の流れが導かれ得る乾燥粉末リザーバを含む装置を使用して、及び／又は密封容器内の低沸点推進剤に溶解及び／又は懸濁された活性成分を含む装置などの自己推進溶媒／粉末分配容器を使用して投与するための乾燥粉末の形態であることが好都合である。このような粉末は、粒子の少なくとも９８％（重量基準）が０．５ｎｍを超える直径を有し、粒子の少なくとも９５％（数基準）が７ｎｍ未満の直径を有する粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５％（重量基準）が１ｎｍを超える直径を有し、粒子の少なくとも９０％（数基準）が６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉末希釈剤を含んでもよく、単位用量形態で好都合に提供される。

【0160】

低沸点噴射剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は、組成物の５０％～９９．９％（ｗｔ／ｗｔ）を構成し得、活性成分は、組成物の０．１％～２０％（ｗｔ／ｗｔ）を構成し得る。噴射剤は、液体非イオン性及び／又は固体アニオン性界面活性剤及び／又は固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同じ程度の粒径を有し得る）などの追加の成分をさらに含み得る。

【0161】

肺送達用に製剤化された医薬組成物は、溶液及び／又は懸濁液の液滴の形態の活性成分を提供し得る。そのような製剤は、活性成分を含む水性及び／又は希釈アルコール溶液及び／又は懸濁液（任意に滅菌）として調製、包装及び／又は販売され得、任意の噴霧化及び／又は霧化装置を使用して好都合に投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウムなどの香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、及び／又はヒドロキシ安息香酸メチルなどの防腐剤を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の追加の成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。

【0162】

肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、有効成分を含んでおり約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。そのような製剤は、スナッフの服用方法で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻通路を介した迅速な吸入によって投与される。

【0163】

経鼻投与に適した製剤は、例えば、約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）程度の少量から１００％（ｗｔ／ｗｔ）もの活性成分を含み得、本明細書中に記載される１つ又は複数の追加の成分を含み得る。医薬組成物は、頬側投与に適した製剤で調製、包装及び／又は販売され得る。そのような製剤は、例えば、従来の方法を使用して製造された錠剤及び／又はロゼンジの形態であってもよく、例えば、０．１％～２０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分であってもよく、残部は、経口溶解性及び／又は分解性組成物、並びに任意に、本明細書に記載の１つ又は複数の追加の成分を含む。あるいは、口腔投与に適した製剤は、活性成分を含む粉末及び／又はエアロゾル化及び／又は噴霧化溶液及び／又は懸濁液を含み得る。そのような粉末化、エアロゾル化、及び／又はエアロゾル化製剤は、分散されると、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒子及び／又は液滴サイズを有し得、本明細書に記載される任意の追加の成分のうちの１つ又は複数をさらに含み得る。

【0164】

医薬組成物は、眼科投与に適した製剤で調製、包装、及び／又は販売され得る。そのような製剤は、例えば、水性又は油性液体賦形剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗｔ／ｗｔ）溶液及び／又は懸濁液を含む点眼剤の形態であり得る。そのような滴剤は、緩衝剤、塩、及び／又は本明細書に記載の任意の追加の成分のうちの１つ又は複数をさらに含み得る。有用な他の眼投与可能な製剤には、微結晶形態及び／又はリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳剤及び／又は点眼剤は、本開示の範囲内であると考えられる。

【0165】

１つ又は複数のペイロードを含むナノ粒子組成物は、任意の経路によって投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明の１つ又は複数のナノ粒子組成物を含む予防組成物、診断組成物、又はイメージング組成物を含む本発明の組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮又は真皮内、真皮間、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション及び／又は滴剤）、粘膜、鼻、頬側、経腸、硝子体内、腫瘍内、舌下、鼻腔内を含む様々な経路の１つ又は複数によって；気管内注入、気管支注入、及び／又は吸入によって；経口スプレー及び／又は粉末、経鼻スプレー及び／又はエアロゾルとして、及び／又は門脈カテーテルを介して投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、又は皮下投与され得る。しかしながら、本開示は、薬物送達の科学における可能性のある進歩を考慮した任意の適切な経路による本発明の組成物の送達を包含する。一般に、最も適切な投与経路は、１つ又は複数のｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物の性質（例えば、血流及び消化管などの様々な身体環境におけるその安定性）、患者の症状（例えば、患者が特定の投与経路に耐えることができるかどうか）などを含む様々な因子に依存する。

【0166】

特定の実施形態において、本開示による組成物は、所与の用量において、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇを送達するに十分な用量レベルで投与され得、１ｍｇ／ｋｇの用量は、対象体重１ｋｇあたり１ｍｇの組成物を供給する。特定の実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量の本発明のナノ粒子組成物を投与することができる。用量は、所望のレベルのｍＲＮＡ発現及び／又は治療、診断、予防、若しくはイメージング効果を得るために、同じ量又は異なる量で１日に１回又は複数回投与され得る。所望の投与量は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日おき、毎週、２週間ごと、３週間ごと、又は４週間ごとに送達され得る。ある特定の実施形態において、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、又はそれよりも多くの投与）を使用して送達され得る。いくつかの実施形態において、単回用量は、例えば、外科的処置の前若しくは後に、又は急性の疾患、障害、若しくは症状の場合に投与され得る。

【0167】

１つ又は複数のペイロードを含むナノ粒子組成物は、１つ又は複数の他の治療剤、予防剤、診断剤、又はイメージング剤と組み合わせて使用され得る。「と組み合わせて」とは、薬剤を同時に投与しなければならないこと、及び／又は一緒に送達するために製剤化しなければならないことを意味するものではないが、これらの送達方法は本開示の範囲内である。例えば、１つ又は複数の異なるｍＲＮＡを含む１つ又は複数のナノ粒子組成物を組み合わせて投与することができる。組成物は、１つ又は複数の他の所望の治療薬又は医療処置と同時に、その前に、又はその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／又は時間スケジュールで投与される。いくつかの実施形態において、本開示は、バイオアベイラビリティを改善し、代謝を減少及び／若しくは改変し、排泄を阻害し、及び／又は体内での分布を改変する薬剤と組み合わせた本発明の組成物又はそのイメージング、診断若しくは予防組成物の送達を包含する。

【0168】

組み合わせて利用される治療的、予防的、診断的、又はイメージング活性剤は、単一の組成物で一緒に投与されてもよく、又は異なる組成物で別々に投与されてもよいことがさらに理解されるであろう。一般に、組み合わせて利用される薬剤は、それらが個別に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予想される。いくつかの実施形態において、組み合わせて利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも低くてもよい。

【0169】

併用レジメンで使用する治療（治療薬又は手順）の特定の組み合わせは、所望の治療薬及び／又は手順の適合性及び達成される所望の治療効果を考慮に入れる。使用される治療は、同じ障害に対して所望の効果を達成し得るか（例えば、癌を処置するために有用である組成物は、化学療法剤と同時に投与され得る）、又は異なる効果（例えば、任意の有害作用の制御）を達成し得ることも理解されよう。

【実施例】

【0170】

実施例
以下の実施例は、限定することを意図するものではなく、本発明のさらなる情報及び支持を提供するために提示される。以下の実施例は、最適なペイロード負荷及び粒径分布のためにＬＮＰ形成を最適化するＨＴＳ方法が、マイクロ流体ベースのアプローチなどのスケールアップされた製造方法に直接変換され得ることを実証する。このＨＴＳアプローチは、材料消費を約１０倍減少させ、処理出力を約１００倍改善した。これらの結果は、ＬＮＰ製造を最適化するためのＨＴＳ方法のロバスト性及び有用性を示し、したがって、それらの臨床移行を促進する。

【0171】

材料及び方法
材料
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００）、及びカチオン性１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む脂質を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。イオン化可能な脂質ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノ酪酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＭＣ３）はＭＣＥ（ＮＪ，ＵＳＡ）から、コレステロールはＳｉｇｍａ（ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。２つのモデルＡＳＯ、ＡＳＯ－１（１３マー、Ｎａ塩形態）及びＡＳＯ－２（１６マー、Ｎａ塩形態）を社内で合成した。他の全ての試薬は、少なくとも試薬グレードであり、ＤＮａｓｅ／ＲＮＡｓｅを含まなかった。

【0172】

ＡＳＯ負荷ＬＮＰのハイスループット調製
ＬＥＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、９６ウェルプレートマトリックスで設計された様々な脂質組成、総脂質濃度、及びＡＳＯ負荷量について、ＬＮＰ製剤をスクリーニングした。ＡＳＯ－１負荷ＭＣ３ ＬＮＰの典型的なスクリーニングでは、ＡＳＯをクエン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４）に５、２、１、及び０．５のＮ／Ｐ比に相当する濃度で溶解し、ロボット液体ハンドラ（ＴＥＣＡＮ（登録商標）Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して１５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５１０１，ＮＣ，ＵＳＡ）に分注した。様々な総脂質量（０．２又は０．４μｍｏｌ／ウェル）及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００含有量（全脂質の０、１．５、３、又は５ｍｏｌ％）を有する脂質混合物を、個々の脂質ストック（エタノール中２０ｍｇ／ｍｌ）を混合し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを用いてエタノールで希釈することによって調製した。次いで、５０μｌの脂質を０．５ｍｌ／ｓでＡＳＯプレートに迅速に分注し、続いてＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを使用して１０回のピペッティング（毎回１００μｌ）によって相混合して、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの自己集合を促進した。得られたプレートは、並行して３２の条件で変動した９６個のＬＮＰ試料（２００μｌ／ウェル）を含有していた（４レベルのＡＳＯ負荷、２レベルの総脂質濃度、及び４レベルの脂質組成、ｎ＝３）。他の実験では、イオン化可能な脂質ＭＣ３を永久カチオン性脂質ＤＯＴＡＰで置き換え、又は１３マーのＡＳＯ－１を１６マーのＡＳＯ－２で置き換え、同様の製剤パラメータについてスクリーニングした。逆の分注順序（ＡＳＯ溶液の脂質混合物への注入）並びに異なる混合速度及び回数も、相混合プロセスを最適化するために調査した。

【0173】

ＡＳＯ負荷ＬＮＰの特性評価
ＡＳＯ負荷ＬＮＰの構造を、低温透過型電子顕微鏡（ｃｙｒｏ－ＴＥＭ）によって決定した。ＤＬＳを使用して粒径分布を測定した。手短に言えば、ＡＳＯ負荷ＬＮＰを、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ロボットを使用して９６ウェルのガラス底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ ６５５８９２，ＮＣ，ＵＳＡ）中のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で４０倍希釈し、ＤｙｎａＰｒｏ（登録商標）プレートリーダーＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して平均粒径及び粒径分布（多分散性％、ＰＤ％で表される）について分析した。６０μｌのアリコートを、１５μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を添加することによって中性ｐＨに調整し、次いで、フィルタープレート（ＭＷＣＯ １００ｋＤ；ＡｃｒｏＰｒｅｐ，ＰＡＬＬ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移し、遠心分離（２，０００ｘｇ、１０分）して濾過した。次いで、５０μｌの濾液中の未封入ＡＳＯを、ＵＶプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ（登録商標）Ｓｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用してＯＤ_２６０によって定量化し、ＡＳＯの封入効率パーセント（％ＥＥ）について計算した：

【0174】

ＡＳＯ標準を同じ緩衝液中で調製し、ＬＮＰ試料と同じ濾過プロセスに供した。安定性実験のために、Ｎ／Ｐ比１の下で調製した６０μｌのＬＮＰをＰＢＳで１０倍に直接希釈し、４又は４０℃で保存し、２週間にわたって粒径及びＡＳＯ放出について分析した。

【0175】

ＡＳＯ負荷ＬＮＰのマイクロ流体調製
マイクロ流体アプローチを、上記のハイスループットアプローチによってスクリーニングされたＡＳＯ負荷ＬＮＰのスケールアップ調製に使用した。簡単に記載すると、種々の濃度のＡＳＯ－１（クエン酸緩衝液に溶解）と、総脂質濃度及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００含有量が変動する脂質（エタノールに溶解）とを、マイクロ流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）によって、水性緩衝液／エタノール相比３／１及び一定の総流量１２ｍｌ／分で混合した。収集したＬＮＰを遠心分離ベース（２，０００ｘｇ、３０分）限外濾過（ＭＷＣＯ １０ｋＤ；Ａｍｉｃｏｎ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって精製して遊離ＡＳＯ及び脂質を除去し、続いてＰＢＳと緩衝液交換した。ＬＮＰを、親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）によるＤＬＳ及びＡＳＯ封入によって粒径分布について分析した。簡単に記載すると、０．７５％ Ｔｒｉｔｏｎ溶液に溶解することによって、精製ＬＮＰから封入ＡＳＯを抽出した。ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ，１３０Å，１．７μｍ，３ｍｍｘ５０ｍｍ）、移動相Ａ（８０／２０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中２５ｍＭ酢酸アンモニウム）、及び移動相Ｂ（４０／６０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中２５ｍＭ酢酸アンモニウム）を、１０分以内に、０．８ｍｌ／分の流速、４０℃のカラム温度、及び２６０ｎｍの検出波長で、相Ｂの０～１００％からの勾配溶出に使用した。

【0176】

統計分析
全ての結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。データを、一元配置分散分析又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後、Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して複数の群を比較するためのＴｕｒｋｅｙ、Ｓｉｄａｋ又はＤｕｎｎｅｔｔの事後検定によって分析した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。

【0177】

実施例１
ロボット液体ハンドラによる相混合プロセスの最適化
ＬＮＰ調製のためのハイスループット溶媒注入方法を開発するために、粒径及びＡＳＯ封入に対する相混合の効果を最初に調べた。ＡＳＯ－１を、０．４μｍｏｌの総脂質及び１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００から構成されるＬＮＰに、Ｎ／Ｐ比１の下で電荷媒介錯化によって負荷した。脂質を含有するエタノール相を分注し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）液体ハンドラを使用して、機器の設定に従って最小０．１ｍｌ／ｓから最大０．９ｍｌ／ｓの範囲の異なるピペット操作速度で水性ＡＳＯ相と混合し、逆も同様に行った。エタノール－緩衝液注入は、注入とそれに続く１０回の混合のための低速、中速、又は高速下で、平均直径約１４５ｎｍ（図１Ａ）、％ＰＤ約１８％（図１Ｂ）、及びＡＳＯの％ＥＥ約８３％（図１Ｃ）を有する同様のＬＮＰを生成した。対照的に、低速（０．１ｍｌ／ｓ）での緩衝液－エタノール注入は、より低い％ＥＥ（約４３％）でより大きな（平均直径約２２０ｎｍ）及びより多分散（％ＰＤ約４１％）粒子を生成した（図１Ａ～１Ｃ）。しかしながら、注入速度を増加させると、エタノール－緩衝液注入と同様のＬＮＰが生成され、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの形成には水性緩衝液中の濃縮脂質の迅速な消散が必要であることが示唆された。次に、ＬＮＰをエタノール－緩衝液注入下で調製し、続いて異なるピペッティング回数及び速度で相混合した。中速（０．５ｍｌ／ｓ）及び１０回の混合は、高いＡＳＯ負荷で均一なＬＮＰを生成するのに十分であったが、混合速度又は回数のさらなる増加は、粒径及び％ＥＥに影響しなかった（図１Ｄ～１Ｆ）。したがって、以下の研究のために、エタノール－緩衝液注入とそれに続く０．５ｍｌ／ｓでの１０回の混合の条件を選択した。

【0178】

実施例２
ＡＳＯ負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ
ＬＮＰの主要な品質属性に対する製剤パラメータの影響を調査するために、これらの製剤の合理化された調製及び特性評価を可能にするＨＴＳワークフローを設計した（図２）。ＡＳＯを最初に、脂質が正電荷を帯びて電荷媒介錯化を促進するように、ＭＣ３のｐＫａ（６．４）より低いｐＨ４．０のクエン酸緩衝液に溶解した。次いで、溶液のｐＨをリン酸緩衝液によって中性に調整した後、分析を行った。

【0179】

典型的なスクリーニングのために、２つのレベルの総脂質濃度、Ｎ／Ｐ比によって調整される４つのレベルのＡＳＯ負荷、及び４つのレベルのＰＥＧ化脂質含有量で変動する３２の異なる試料（それぞれ３つの反復）を、９６ウェルプレートで並行してスクリーニングした（図３Ａ）。調査した３つの製剤パラメータの中で、ＰＥＧ化脂質は、脂質組成にＰＥＧが組み込まれていない場合に多峰性の大きな凝集体が生成されたため、ＬＮＰ形成に不可欠であった（図３Ｃ～３Ｄ、図４）。ＰＥＧ化脂質含有量を有意に増加させると（Ｐ＜０．０００１）、平均粒径が減少した、すなわち、１．５、３、及び５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００を含有する脂質は、それぞれ約１２０、約８０、及び約６０ｎｍのＬＮＰ直径をもたらした（図３Ｃ～３Ｄ）。しかし、多分散性も増加し、５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００は、おそらく小さなＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００ミセルの形成に起因して、亜集団を生成しさえした（図３Ｃ）。例えば、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８５（６）：３８３９－４７；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ２３（３）：２２２－３１を参照のこと。

【0180】

一方、ＡＳＯの％ＥＥは、主にＮ／Ｐ比によって決定された。ＭＣ３中の過剰な錯化部位を有する１より高いＮ／Ｐ比は、８０％超の％ＥＥをもたらした。一方、充電バランス点を超える２倍過剰量のＡＳＯ－１は、％ＥＥを約５０％まで有意に減少させた（図３Ｅ）。ＭＣ３を別のカチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（図５Ａ～５Ｃ）で置き換えた場合、又はＡＳＯ－１をＡＳＯ－２（図６Ａ～６Ｃ）で置き換えた場合にも同様の結果が見られ、ＨＴＳ結果のロバスト性が実証された。

【0181】

実施例３
スケールアップＬＮＰ調製によるＨＴＳ結果の検証
次いで、スクリーニングされた製剤パラメータのＬＮＰ品質属性への影響を、ＨＴＳアプローチからの結果をマイクロ流体製剤化装置からの結果と比較することによって検証した。２つの方法は同様の結果を示した：（１）ＰＥＧ含有量が増加すると、ＬＮＰサイズは減少したが、多分散性は増加した（図７Ａ）；（２）ＬＮＰサイズは、２ｍＭまでの全脂質濃度の増加に伴って安定していた（図７Ｂ）；（３）Ｎ／Ｐ比＜２の場合、ＬＮＰサイズは安定したままであった（図７Ｃ）；（４）過剰なＡＳＯ負荷（Ｎ／Ｐ比＜１）は、％ＥＥの有意な減少をもたらした（図７Ｄ）；及び（５）ＬＮＰは、同じＮ／Ｐ比及びＰＥＧ化脂質含有量で調製された同様の構造を示した（図７Ｅ）。さらに、ＨＴＳアプローチは、線形回帰Ｒ^２＞０．９（図７Ａ）との強い相関によって示される、ＰＥＧ化脂質含有量に対する粒径及び多分散性の依存性を首尾よく予測した。

【0182】

実施例４
ＡＳＯ負荷ＬＮＰの安定性スクリーニング
製剤安定性に対する異なる粒径の影響をさらに調査するために、様々なＰＥＧ含有量で調製したＡＳＯ－１負荷ＬＮＰをＰＢＳで１０倍希釈し、４℃又は４０℃でインキュベートし、２週間にわたる粒径分布を監視した。Ｎ／Ｐ比は１以上に保たれ、ＡＳＯの％ＥＥは約９０％であったので、安定性試験中のＬＮＰからのＡＳＯ漏出を定量化することができた。図８Ａ～図８Ｂに示すように、１．５又は３ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００を含むハイスループット溶媒注入又はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）によって調製されたＬＮＰも同様に、４℃でのインキュベーション中、それらの初期平均粒径（図８Ａ）及び多分散性（図８Ｂ）のままであった。４０℃で、１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００を含有するＬＮＰは、１週間後に粒径の増加を示したが、一定の多分散性（図９）のままであった。１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００を含むＬＮＰもまた、最初の３日以内に最小のＡＳＯ漏出を示したが、２週間後に３及び５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００を含むＬＮＰと同様のレベルのＡＳＯ漏出を示した（図１０）。４℃でのＡＳＯ漏出は１ヶ月にわたって検出されなかった。

【0183】

ＬＮＰ製剤のハイスループット調製のための溶媒注入法は、相混合プロセスがロボット液体ハンドラによって実行され得るので選択された。手動ピペッティングと比較して、マルチチャネル液体ハンドラは、９６個の試料のハイスループット並列処理を可能にし、ウェル全体で均一な液体分注及び混合を達成した。重要なプロセスは、球状脂質層及びナノ粒子構造への脂質の自己集合を促進するために、相互混和相、例えば脂質を溶解するエタノールと核酸を溶解する水性緩衝液との迅速かつ徹底的な混合を伴った。この方法は、リポソームを調製するために広く使用されており、エタノール相を５０体積％未満に調整すると均一なナノ粒子を生成した。エタノール相比及び／又は脂質濃度を増加させると、低速の緩衝液－エタノール注入（図１Ａ～１Ｂ）の結果によっても示されるように、おそらく非効率的な相混合のために大きな粒子又は凝集体が生成された。液体ハンドラによる自動混合プロセスからの知見は、マイクロ流体法によって調製されたＬＮＰの結果と高度に相関していた。流量比（ＦＲＲ、水性対有機流量）は、マイクロ流体調製中の重要な製剤パラメータの１つであり、低いＦＲＲはより大きな粒子を生成する。低速での緩衝液－エタノール注入は、低いＦＲＲの状態を示した。したがって、自動化された混合条件を最適化し、エタノール－緩衝液注入を１／３のエタノール／水性体積比（２５体積％のエタノール）の下で０．５ｍｌ／ｓに設定し、続いて１０回ピペッティングして効率的な相混合を達成し、高い封入効率で均一な粒子を生成した。

【0184】

次に、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの最適な品質属性について、総脂質濃度、脂質組成、及びＡＳＯ負荷量を含む製剤変数をスクリーニングするための合理化されたワークフローを開発した。この目的のために、ＡＳＯの粒径分布及び％ＥＥをそれぞれハイスループットＤＬＳ及びＯＤ_２６０によって測定して、高いＡＳＯ負荷量で均一なナノ粒子を生成することができる条件を決定した。スクリーニング結果は、ＰＥＧ化脂質含有量が粒径分布に有意に影響を及ぼすことを示した（図３Ｂ～３Ｄ、５Ａ～５Ｂ、６Ａ～６Ｂ）。総脂質の１．５ｍｏｌ％で組み込まれたＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００は、約１２０ｎｍの平均直径を有する単峰性ナノ粒子を産生したが、より多くのＰＥＧは多分散性を増加させた。第三級アミン構造からなるイオン化可能な脂質は、ヌクレオチドのための脂質ベースの送達システムにますます使用されており、永続的に荷電したカチオン性脂質よりも良好な細胞内送達効率及び低い細胞傷害性を示す。例えば、Ｃｕｌｌｉｓ＆Ｈｏｐｅ，２０１７，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（７）：１４６７－１４７５，Ｓａｂｎｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２６（６）：１５０９－１５１９；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８（２）：１７２－１７６を参照のこと。電荷媒介錯化の負荷機構と一致して、スクリーニング結果はＮ／Ｐ比によって決定されるＡＳＯ封入を示し、Ｎ／Ｐ比＝１で約９０％の％ＥＥを示し（図３Ｅ、５Ｃ、６Ｃ）、０．２９ｍｇのＲＴＲ３８３３／ｍｇ脂質の負荷能力に対応した（１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００を含む２ｍＭの総脂質）。

【0185】

重要なことに、ＨＴＳアプローチからの結果は、スケーラブルな生産を伴うナノ粒子製剤を調製するためにますます利用されているマイクロ流体製剤化装置からの結果を首尾よく予測した。例えば、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１，ｅ３７；ｖａｎ Ｓｗａａｙ＆ｄｅＭｅｌｌｏｗ，２０１３，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １３（５）：７５２－６７を参照のこと。両方の方法は、ＰＥＧ化脂質含有量（図７Ａ）、総脂質濃度（図７Ｂ）、及びＮ／Ｐ比（図７Ｃ）に対するＬＮＰサイズの同様の依存性を示し、ＡＳＯの％ＥＥは、Ｎ／Ｐ比によって同様に調整された（図７Ｄ）。２つの方法はまた、同じ製剤パラメータ（図７Ｅ）下で類似の構造を有するＬＮＰを生成した。さらに、これらのＡＳＯ負荷ＬＮＰは、安定した粒径分布（図８Ａ～８Ｂ）及び４０°Ｃで２週間の貯蔵にわたって封入ＡＳＯの約２０％の漏出を示した（図１０）。しかしながら、マイクロ流体調製と比較して、ＨＴＳアプローチは、調製及び分析出力を約１００倍増加させながら、原料を約１０倍節約することにおいて有意な利点を示した（単一のマイクロ流体実行と比較して、マイクロプレート内の９６個の試料を並列処理する）ことから、初期段階の製剤スクリーニングの大きな可能性が示された（図１１）。スクリーニング結果に基づいて、１．５ｍｏｌ％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００及びＮ／Ｐ比≧１は、均一で安定した粒径並びに高いＡＳＯ負荷を有する最適なＬＮＰ製剤を生成することが決定された。ＨＴＳシステムに異なる脂質及び他のＡＳＯを導入した後も、同じ意見が依然として有効であり、このスクリーニングプラットフォームがｓｉＲＮＡ及び単一ガイドＲＮＡなどの様々な種類の担体及びカーゴへの適用を拡大できることを示唆した。

【0186】

ＨＴＳスクリーニングアプローチは、ＬＮＰを調製するための再現性のある製剤プラットフォームを実証した。自動注入プラットフォームからマイクロ流体調製物への変換可能な結果は、スクリーニング及びスケールアップ製剤をサポートするためのシームレスなワークフローを作り出し、製剤の不整合から生じるブリッジ研究を回避した。次なるステップは、現在のワークフローを下流のインビトロスクリーニングと統合して、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの物理化学的属性を治療有効性と相関させることである。さらに、ゼータ電位及び液体クロマトグラフィー戦略によるＡＰＩ及び賦形剤の両方の同時定量化などのより多くの製剤属性に対処するために、ワークフローをさらに改善することができる。Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ８７９（２０），３６２０－５，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｒ Ａ １６０１：１４５－１５４。

【0187】

この実施例では、製剤パラメータをスクリーニングし、ＡＳＯ負荷ＬＮＰの品質属性に対処するためのハイスループットアプローチが開発された。自動化された液体の分注及び混合から始まり、続いてハイスループットな粒径及びＡＳＯ封入の分析の合理化されたワークフローは、ＰＥＧ化脂質含有量及びＮ／Ｐ比がそれぞれ粒径分布及び封入効率の主要な決定因子であることを同定した。さらに、ＨＴＳの結果は、マイクロ流体を用いたスケールアップ調製からの結果を首尾よく予測した。ロバストなスクリーニング結果、並びに材料の大幅な節約及び分析出力の改善は、脂質ベースのナノ粒子製剤の開発を進めるためのこのアプローチの大きな将来性を示唆している。

【0188】

実施例５
ＡＳＯ封入の定量化の代替方法
ＡＳＯ封入の定量化を、蛍光プレートリーダーを使用して決定した。手短に言えば、ハイスループット溶媒注入法によってＡＳＯ負荷ＬＮＰを調製し、次いで、ＴＥ緩衝液で５０倍希釈し、等体積の５０００倍希釈蛍光プローブＳｙｂｒ－ｇｏｌｄと混合し、蛍光プレートリーダー（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５５０ｎｍ）を使用して非封入ＡＳＯを定量した。次いで、ＬＮＰを、１体積％Ｔｒｉｔｏｎ ＴＥ中の等体積の１００００倍希釈Ｓｙｂｒ－ｇｏｌｄ（すなわち、最終プローブ希釈を１００００倍に保ち、Ｔｒｉｔｏｎ濃度を０．５体積％にした）の直接添加によって破壊した（図１２Ａ）。次いで、蛍光測定を行い、総ＡＳＯを定量した。封入効率（％ＥＥ）を以下のように計算した：

【0189】

計算は、蛍光法及びＵＶ－Ｖｉｓ法を使用して異なるＮ／Ｐ比で調製された２つの異なるＬＮＰ製剤について同等の％ＥＥ結果を示した（図１２Ｂ）。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝２として表され；ｎｓ、有意ではない（二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＳｉｄａｋの多重比較によって分析）。

【0190】

実施例６
ＨｉＢｉＴペプチド負荷ＬＮＰ製剤のＨＴＳ
リポソームの主要な品質属性に対する製剤パラメータの影響を調査するために、これらの製剤の合理化された調製及び特性評価を可能にするＨＴＳワークフローを設計した。ＨｉＢｉＴを最初に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を補充した２０ｍＭヒスチジン－酢酸緩衝液に溶解し、ロボット液体ハンドラを使用してマイクロウェルプレートに分注した。実施例２と同様に脂質混合物を調製した（図１３Ａ）。

【0191】

典型的なスクリーニングのために、４種類のＬＮＰ製剤並びにＰＥＧ化脂質、遮蔽ＰＥＧ化脂質及びアジドとコンジュゲートしたＰＥＧ化脂質の８つの組み合わせで変動する３２個の異なる試料（それぞれ３つの反復）を、９６ウェルプレートで並行してスクリーニングした（図１３Ｂ）。調査した８つの製剤パラメータの中で、ＰＥＧ化脂質は、脂質組成にＰＥＧが組み込まれていない場合に多峰性の大きな凝集体が生成されたため、ＬＮＰ形成に必要であった（図１３Ｃ）。精製前後の遊離ペプチド濃度の定量により、ゲル濾過及び透析についてそれぞれ約９８％及び約６１％の平均精製効率が得られた（図１３Ｄ～１３Ｆ）。粒子回収率は、ペグ化脂質なしで調製された凝集試料のための低い値を除いて、一般に８０～１２０％の間であった（図１３Ｇ）。さらに、粒径分布は、ゲル濾過による精製後も一定のままであった（図１３Ｈ）。
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Ｃ．Ｊａａｆａｒ－Ｍａａｌｅｊ，Ｒ．Ｄｉａｂ，Ｖ．Ａｎｄｒｉｅｕ，Ａ．Ｅｌａｉｓｓａｒｉ，Ｈ．Ｆｅｓｓｉ，Ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇ－ｌｏａｄｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ ２０（３）（２０１０）２２８－４３．
Ｉ．Ｖ．Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｎ．Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｉ．Ｈａｆｅｚ，Ａ．Ｋ．Ｌｅｕｎｇ，Ｊ．Ｈｕｆｔ，Ｃ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ．Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８（７）（２０１２）３６３３－４０．
Ｓ．Ｓａｂｎｉｓ，Ｅ．Ｓ．Ｋｕｍａｒａｓｉｎｇｈｅ，Ｔ．Ｓａｌｅｒｎｏ，Ｃ．Ｍｉｈａｉ，Ｔ．Ｋｅｔｏｖａ，Ｊ．Ｊ．Ｓｅｎｎ，Ａ．Ｌｙｎｎ，Ａ．Ｂｕｌｙｃｈｅｖ，Ｉ．ＭｃＦａｄｙｅｎ，Ｊ．Ｃｈａｎ，Ｏ．Ａｌｍａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｋ．Ｅ．Ｂｅｎｅｎａｔｏ，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄ Ｓｅｒｉｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｅｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６（６）（２０１８）１５０９－１５１９．
Ｓ．Ｃ．Ｓｅｍｐｌｅ，Ａ．Ａｋｉｎｃ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｐ．Ｓａｎｄｈｕ，Ｂ．Ｌ．Ｍｕｉ，Ｃ．Ｋ．Ｃｈｏ，Ｄ．Ｗ．Ｓａｈ，Ｄ．Ｓｔｅｂｂｉｎｇ，Ｅ．Ｊ．Ｃｒｏｓｌｅｙ，Ｅ．Ｙａｗｏｒｓｋｉ，Ｉ．Ｍ．Ｈａｆｅｚ，Ｊ．Ｒ．Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｑｉｎ，Ｋ．Ｌａｍ，Ｋ．Ｇ．Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｆ．Ｗｏｎｇ，Ｌ．Ｂ．Ｊｅｆｆｓ，Ｌ．Ｎｅｃｈｅｖ，Ｍ．Ｌ．Ｅｉｓｅｎｈａｒｄｔ，Ｍ．Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．Ｋａｚｅｍ，Ｍ．Ａ．Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌｕ，Ｍ．Ｊ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｑ．Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ａｌｖａｒｅｚ，Ｓ．Ａ．Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ．Ｄｅ，Ｓ．Ｋ．Ｋｌｉｍｕｋ，Ｔ．Ｂｏｒｌａｎｄ，Ｖ．Ｋｏｓｏｖｒａｓｔｉ，Ｗ．Ｌ．Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｙ．Ｋ．Ｔａｍ，Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｉｕｆｏｌｉｎｉ，Ｍ．Ａ．Ｔｒａｃｙ，Ａ．ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｉ．ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｐ．Ｒ．Ｃｕｌｌｉｓ，Ｔ．Ｄ．Ｍａｄｄｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｈｏｐｅ，Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（２）（２０１０）１７２－６．
Ｎ．Ｍ．Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｊ．Ｈｕｆｔ，Ｐ．Ｊ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｋ．Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｌｅａｖｅｒ，Ａ．Ｗ．Ｗｉｌｄ，Ｊ．Ｂ．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｙ．Ｋ．Ｔａｍ，Ｃ．Ｌ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ．Ｃｕｌｌｉｓ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ Ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １（２０１２）ｅ３７．
Ｄ．ｖａｎ Ｓｗａａｙ，Ａ．ｄｅＭｅｌｌｏ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｆｏｒｍｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １３（５）（２０１３）７５２－６７．
Ｅ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｈｙｏｄｏ，Ｎ．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ａｓａｋａｗａ，Ｄｉｒｅｃｔ，ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｏｎ－ｌｉｎｅ ＳＰＥ－ＳＰＥ－ＨＰＬＣ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ８７９（３０）（２０１１）３６２０－５．
Ｌ．Ｌｉ，Ｊ．Ｐ．Ｆｏｌｅｙ，Ｒ．Ｈｅｌｍｙ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｉｏｎ－ｐａｉｒ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １６０１（２０１９）１４５－１５４．

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図13G】

【図13H】

【国際調査報告】