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▶ クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-19
(54)【発明の名称】二重特異性抗体およびその適用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20231212BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20231212BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231212BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231212BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231212BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231212BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20231212BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20231212BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/24
C07K16/28
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 N
G01N33/531 A
G01N33/574 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535529
(86)(22)【出願日】2021-05-19
(85)【翻訳文提出日】2023-06-09
(86)【国際出願番号】 CN2021094672
(87)【国際公開番号】W WO2022121239
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】202011427863.9
(32)【優先日】2020-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521501093
【氏名又は名称】クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チー シャンドン
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB17
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、二重特異性抗体およびその適用を提供し、本発明の二重特異性抗体の第１の抗体の２本の鎖にそれぞれＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαを導入し（例えば、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、それぞれＣＬ１およびＣＨ１を置き換える）、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの高親和性を利用してＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成し、それにより、第１の抗体の軽鎖／重鎖の正しいペアリングを実現し、二重特異性抗体の軽鎖／重鎖の不正確なマッチングの問題を解決する。同時に、第１の抗体の可変ドメインＶＨ１、ＶＬ１、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαのアミノ酸配列の突然変異により、ＶＨ１とＶＬ１との間、およびＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間に一対または複数対のジスルフィド結合を添加し、第１の抗体の軽鎖／重鎖間の結合活性をさらに増強し、それにより、二重特異性抗体の調製プロセス中の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング、多量の副産物、安定性の低さ等の課題を効果的に克服し、最後に、サイトカインを標的とする、正しくペアリングされた二重特異性多機能抗体を調製する。同時に、二重特異性抗体の開発サイクルを短縮し、生産コストを削減する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二重特異性抗体であって、ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体の軽鎖および重鎖と、ならびに
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体の軽鎖および重鎖とを含み、
ここで、第１の抗体中の２本の鎖は、それぞれＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαを含み、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成することができ、
前記ＩＬ１５は、ＩＬ１５Ｒαに結合できる突然変異体を含み、前記ＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５に結合できる突然変異体を含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体。
【請求項2】
前記ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間に一対または複数対のジスルフィド結合があり、前記ＩＬ１５は、以下に示される突然変異を含み、カウント方法は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＩＬ１５の最初のアミノ酸から１番目としてカウントされ、
【表1】
請求項１に記載の二重特異性抗体。
【表2】
【請求項3】
前記第１の抗体の可変ドメインＶＨ１とＶＬ１との間には一対または複数対のジスルフィド結合があり、前記ＶＨ１およびＶＬ１は、ＥＵナンバリングに基づいた以下の突然変異の組み合わせの形態を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【表3】
【請求項4】
前記第１および第２の抗体重鎖は、それぞれＦｃセグメントを含み、前記Ｆｃセグメントは、それぞれ、異なる突然変異を有するＡ鎖およびＢ鎖を含み、前記Ａ鎖およびＢ鎖は、ＥＵナンバリングに基づいた以下の突然変異の組み合わせの形態を有することを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【表4】
【請求項5】
前記Ｆｃセグメントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃおよびその突然変異体を含み、前記ＦｃセグメントのＡ鎖およびＢ鎖において、１本の鎖は、プロテインＡに結合することができ、もう１本の鎖は、プロテインＡに結合できない突然変異体であり、前記突然変異は、ＥＵナンバリングに基づいたＨ４３５ＲまたはＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含むことを特徴とする請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
前記第１の抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２１７、ＣＤ２３９、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＰＤ－１、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＣＣＲ４、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ６、ＣＴＬＡ－４、インテグリンα４、ＤＮＡ／ヒストン複合体（ｈｉｓｔｏｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、ＰＤＧＦＲα、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－６Ｒαのいずれか一つであり、前記第２の抗原は、第１の抗原の異なるエピトープまたは上記の別の抗原であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
前記第１の抗体および／または第２の抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒト由来抗体であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
式Ｉまたは式ＩＩに示される構造を有し、【化1】
鎖１：ＶＬ１またはＶＨ１は、Ｌ１を介してＩＬ１５またはＩＬ１５ＲαのＮ末端またはＣ末端に連結され、
鎖２：Ｎ末端からＣまで、ＶＨ１またはＶＬ１、Ｌ２、ＩＬ１５ＲαまたはＩＬ１５、Ｌ３、Ｆｃの順位で配置され、
鎖３：第２の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：第２の抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
ＶＨ１、ＶＬ１は、第１の抗体の可変ドメインを表し、
ＶＨ２、ＶＬ２は、第２の抗体の可変ドメインを表し、
ＣＨ１、ＣＬは、第２の抗体の定常ドメインを表し、
「－」は、ペプチド結合を表し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、結合またはリンカー配列であり、
【化2】
鎖１：ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαは、Ｌ１を介してＶＬ１またはＶＨ１のＮ末端またはＣ末端に連結され、
鎖２：Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ１５ＲαまたはＩＬ１５、Ｌ２、ＶＨ１またはＶＬ１、Ｌ３、Ｆｃの順位で配置され、
鎖３：第２の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：第２の抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
ＶＨ１、ＶＬ１は、第１の抗体の可変ドメインを表し、
ＶＨ２、ＶＬ２は、第２の抗体の可変ドメインを表し、
ＣＨ１、ＣＬは、第２の抗体の定常ドメインを表し、
「－」は、ペプチド結合を表し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、結合またはリンカー配列であることを特徴とする
請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項9】
前記鎖１および鎖２は、以下の表の組み合わせの形態を含むことを特徴とする請求項８に記載の二重特異性抗体。
【表5】
【請求項10】
Ｎ末端からＣ末端までのその配置は、式ＩＩＩに示される構造を有し、【化3】
ＶＨ１、ＶＬ１は、第１の抗体の可変ドメインを表し、
ＶＨ２、ＶＬ２は、第２の抗体の可変ドメインを表し、
ＣＨ１、ＣＬは、第２の抗体の定常ドメインを表し、
「－」は、ペプチド結合を表し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、免疫原性の低いアミノ酸リンカー配列であることを特徴とする
請求項８に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
前記ＩＬ１５配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されたとおりであり、前記ＩＬ１５Ｒα配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示されたとおりであることを特徴とする請求項８～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
前記Ｆｃ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９に示されたとおりであることを特徴とする請求項８～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
前記第１の抗原および第２の抗原は、それぞれ、Ｈｅｒ２の二つの異なるエピトープに結合する抗原であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項14】
前記二重特異性抗体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の配列の融合によって得られることを特徴とする請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項15】
前記第１の抗原および第２の抗原は、それぞれ、ＣＳ１抗原およびＣＤ３８抗原であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項16】
ここで、前記二重特異性抗体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６の配列の融合によって得られることを特徴とする請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項17】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
（ａ）請求項１～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、および
（ｂ）薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項18】
癌（または腫瘍）、感染症および免疫調節性疾患を治療するための薬物の調製における、請求項１～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の適用。
【請求項19】
腫瘍増殖を阻害するための薬物の調製における、請求項１～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の適用。
【請求項20】
前記癌（または腫瘍）は、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がん、腎臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、神経内分泌がん、頭頸部がん、肝臓がん、鼻咽腔癌、精巣がん、骨髄がん、リンパ腫、白血病、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、扁平上皮皮膚がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群を含むことを特徴とする請求項１８または１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項21】
Ｈｅｒ２陽性腫瘍（例えば、乳がん、胃がん）を診断するための試薬またはキットの調製における、請求項１４に記載の二重特異性抗体の用途。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、生物医学の分野に属し、二重特異性抗体に関し、本発明は、このような二重特異性抗体の適用にも関する。
本発明は、生物医学の分野に属し、二重特異性抗体に関し、本発明は、このような二重特異性抗体の適用にも関する。
【0002】
［背景技術］
二機能性抗体としても呼ばれる二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、二つの異なる抗原およびエピトープを同時に識別して結合し、二つの異なるシグナル経路を遮断してその効果を発揮することができる。ＢｓＡｂは、通常の抗体と比較して、特異的な抗原結合部位を追加し、治療面では次のような利点を有する。
二機能性抗体としても呼ばれる二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、二つの異なる抗原およびエピトープを同時に識別して結合し、二つの異なるシグナル経路を遮断してその効果を発揮することができる。ＢｓＡｂは、通常の抗体と比較して、特異的な抗原結合部位を追加し、治療面では次のような利点を有する。
【0003】
腫瘍に対する免疫細胞の殺傷の媒介：二重特異性抗体の重要な作用機序は、免疫細胞の殺傷を媒介することであり、二重特異性抗体は、２本の抗原結合アームを有し、そのうちの１本は、標的抗原に結合し、もう１本は、エフェクター細胞上の標識抗原に結合し、後者は、エフェクター細胞を活性化して、腫瘍細胞を標的にして殺傷することができる。現在、販売が承認されている二つの二重特異性抗体製品は、このクラスに属し、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ会社によって開発されたｃａｔｕｍａｘｏｍａｂは、腫瘍表面抗原ＥｐＣＡＭおよびＴ細胞表面受容体ＣＤ３を標的にすることができるが、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ会社およびＡｍｇｅｎ会社によって開発されたＢｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂは、ＣＤ１９およびＣＤ３に同時に結合することができる。両者は、キラーＴ細胞をすべて活性化して動員することで、腫瘍を治療するという目的を達成する。
【0004】
二重標的シグナル遮断により、独特または重複する機能を発揮し、薬剤耐性を効果的に防止する。二重標的を同時に結合して、二重シグナル経路を遮断することは、二重特異性抗体の別の重要な作用機序である。受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ＲＴＫｓ）は、酵素結合受容体の最大のクラスであり、Ｈｅｒファミリー等の細胞増殖プロセスにおいて重要な調節作用を果たす。ＲＴＫｓは、腫瘍細胞の表面で異常に高度に発現し、腫瘍細胞の悪性増殖を引き起こすため、腫瘍治療の重要な標的でもある。ＲＴＫｓに対する単一標的のモノクローナル抗体は、腫瘍治療に広く適用されているが、腫瘍細胞は、シグナル経路を切り替えることによって、またはＨＥＲファミリーメンバ自体もしくは異なるメンバ間の相同二量体もしくはヘテロ二量体を通じて細胞内シグナルを活性化することによって、免疫から逃避することができる。従って、二重特異性抗体薬を使用して、二つまたは複数のＲＴＫｓまたはそのリガンドを同時に遮断すると、腫瘍細胞の逃避を減少し、治療効果を向上する。
【0005】
より強力な特異性、標的性およびオフターゲット毒性の軽減：二重特異性抗体の二つの抗原結合アームが異なる抗原に結合できるという特性を利用し、二つの抗原結合アームは、それぞれ、癌細胞表面の二つの抗原に結合でき、癌細胞に対する抗体の結合特異および和標的性を効果的に増強し、オフターゲット等の副作用を軽減する。
【0006】
治療費を効果的に削減する：ＢｉＴＥを例にして、従来の抗体と比較して、組織透過率、腫瘍細胞の殺傷効率、オフターゲット率および臨床適応症等の指標面で強力な競争力があり、臨床上の大きな利点を有する。特に投与量に関しては、その治療効果が通常の抗体の１００～１０００倍に達することができるため、最低投与量は、元の１／２０００にすることができ、薬物治療に係るコストを大幅に削減することができる。併用療法と比較すると、二重特異性抗体のコストも、二つの単一薬剤の組み合わせよりもはるかに低くなる。
【0007】
現在、世界で販売が承認されている二重特異性抗体薬は、三つある。
２００９年、欧州連合は、癌性腹水の治療用として、最初の治療用二重特異性抗体であるＴｒｉｏｎＰｈａｒｍａ会社のＣａｔｕｍａｘｏｍａｂを承認した（ＣＤ３およびＥｐＣＡＭを標的する）。２０１４年、ＦＤＡは、急性Ｂリンパ性白血病の治療のために、ＢｉＴＥ（登録商標）技術に基づいてＡｍｇｅｎ会社が開発した二重特異性抗体薬Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ（ＣＤ３およびＣＤ１９を標的する）を迅速に承認し、それは、ＣＤ１９を標的とする最初に承認された薬物でもある。Ａｍｇｅｎは、一連の血液悪性腫瘍および固形腫瘍の幅広いポートフォリオにわたって、臨床開発中の十数種類のＢｉＴＥ（登録商標）分子を保有する。ここで、ＢＣＭＡ／ＣＤ３を標的とするＡＭＧ４２０は、ＦＤＡ認可のファストトラック承認ステータスを取得している。固形腫瘍の治療において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とするＢｉＴＥ（登録商標）分子ＡＭＧ２１２（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）の臨床試験結果もその優位性を示す。２０１７年１１月、ＦＤＡは、血友病治療のためにロシュの二重特異性抗体Ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ（凝固因子Ｘおよび因子ＩＸａを標的とする）を迅速に承認した。２０１８年１２月に中国での販売が承認され、中国で承認された最初の二重特異性抗体である。
２００９年、欧州連合は、癌性腹水の治療用として、最初の治療用二重特異性抗体であるＴｒｉｏｎＰｈａｒｍａ会社のＣａｔｕｍａｘｏｍａｂを承認した（ＣＤ３およびＥｐＣＡＭを標的する）。２０１４年、ＦＤＡは、急性Ｂリンパ性白血病の治療のために、ＢｉＴＥ（登録商標）技術に基づいてＡｍｇｅｎ会社が開発した二重特異性抗体薬Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ（ＣＤ３およびＣＤ１９を標的する）を迅速に承認し、それは、ＣＤ１９を標的とする最初に承認された薬物でもある。Ａｍｇｅｎは、一連の血液悪性腫瘍および固形腫瘍の幅広いポートフォリオにわたって、臨床開発中の十数種類のＢｉＴＥ（登録商標）分子を保有する。ここで、ＢＣＭＡ／ＣＤ３を標的とするＡＭＧ４２０は、ＦＤＡ認可のファストトラック承認ステータスを取得している。固形腫瘍の治療において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とするＢｉＴＥ（登録商標）分子ＡＭＧ２１２（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）の臨床試験結果もその優位性を示す。２０１７年１１月、ＦＤＡは、血友病治療のためにロシュの二重特異性抗体Ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ（凝固因子Ｘおよび因子ＩＸａを標的とする）を迅速に承認した。２０１８年１２月に中国での販売が承認され、中国で承認された最初の二重特異性抗体である。
【0008】
二重特異性抗体の自体は、多くの利点があり、癌、慢性炎症性疾患、自己免疫性疾患、および感染症などの複数の治療分野で適用されることができる。しかし、二重特異性抗体を調製する主な技術的困難は、特にＦｃ領域（ＩｇＧ様）を含む非対称二重特異性抗体の場合、正しくペアリングされた二重特異性抗体を取得し、ＨＣ／ＨＣとＬＣ／ＨＣとの不正確なマッチング問題に同時に直面することである。その後、ＨＣ／ＨＣの不正確なマッチングを減少させるために、ＫｉＨ、ＡＲＴ－ＩｇおよびＢｉＭａｂ技術を開発した。ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術（そのうちの一対の重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置換され、同時に定常ドメインＣＬおよびＣＨ１も互いに置換される）、ＹＢＯＤＹ技術（一側は従来のＦａｂを採用して抗原Ａを標的とする一価ユニットＦａｂ－Ｆｃを校正し、もう一側は、一本鎖抗体を採用して抗原Ｂを標的とする一本鎖ユニットＳｃＦｖ－Ｆｃを構成する）、ＷｕＸｉＢｏｄｙ（ＴＣＲ定常領域は、重鎖定常領域ＣＨ１および軽鎖定常領域ＣＬを置換する）および共通軽鎖技術を使用して、ＬＣ／ＨＣの不正確なマッチングを減少する。しかし、二重特異性抗体の分野については、ＬＣ／ＨＣの不正確なマッチング問題を解決するための新しい技術をさらに開発する必要が依然としてある。
【0009】
１．Ｈｅｒ２
受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバは、細胞の成長、分化および生存の重要なメディエーターである。当該受容体ファミリーは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ３）およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む、四つの固有のメンバを含む。Ｈｅｒ２は、膜貫通型の表面結合型受容体チロシンキナーゼであり、通常の場合に、細胞の増殖および分化につながるシグナル伝達経路に関与する。
受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバは、細胞の成長、分化および生存の重要なメディエーターである。当該受容体ファミリーは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ３）およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む、四つの固有のメンバを含む。Ｈｅｒ２は、膜貫通型の表面結合型受容体チロシンキナーゼであり、通常の場合に、細胞の増殖および分化につながるシグナル伝達経路に関与する。
【0010】
Ｈｅｒ２の過剰発現は、正常な細胞機能の障害を引き起こす可能性があり、通常、腫瘍の発生および発展に密接に関連する。Ｈｅｒ２の相同またはヘテロ重合は、受容体チロシン残基のリン酸化を引き起こし、多くのシグナル伝達経路を引き起こし、細胞増殖および腫瘍形成を引き起こす可能性がある。予後および予測のバイオマーカーとして、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅または過剰発現は、約１５～３０％の乳がんおよび１０～３０％の胃がん／食道がんで発生する。卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、肺がん、結腸がんおよび頭頸部がん等の他の腫瘍も出Ｈｅｒ２の過剰発現が観察されることができる。
【0011】
トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、Ｈｅｒ２の細胞外ドメインＩＶ膜近位エピトープを識別する。具体的には、Ｈｅｒ２の細胞外ドメインＩＶ部分のＣ末端にある３個の環（５５７－５６１、５７０－５７３および５９３－６０３）で構成されるエピトープである。エピトープは、その二量体化パートナーの結合ドメインに近接しているか、または直接相互作用している可能性があるため、トラスツズマブのエピトープへの結合は、二量体化プロセスを阻害する立体障害が誘発される可能性がある。さらに、トラスツズマブの結合は、Ｈｅｒ２受容体の細胞外ドメインをプロテアーゼの攻撃や加水分解から保護することもできる。
【0012】
現在、トラスツズマブを乳がん治療の第１の選択薬として使用されており、Ｈｅｒ２の過剰発現を伴う転移性乳がんを効果的に治療し、単剤第１の選択治療の客観的奏効率は、３０～５０％であり、しかし、Ｈｅｒ２発現が低い転移性乳がんの治療には、効果がよくなく、抗体が最初に効果を示した場合でも１年以内に多くの患者で耐性が発見される。Ｈｅｒ２は、当該ファミリーの他のメンバ（Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ３およびＨｅｒ４）とともに、リガンド依存性またはリガンド非依存性のヘテロ二量体を形成することができ、それにより、下流の経路を活性化し、腫瘍細胞の増殖を引き起こすが、トラスツズマブは、ヘテロ二量体形成を阻害できなかったため、これは、薬剤耐性の発生の理由の一つである可能性がある。
【0013】
ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）は、ＨＥＲ２受容体が細胞表面上の他のＨＥＲ受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）とペアリング（二量体化）するのを防ぐように特別に設計されたヒト化モノクローナル抗体であり、当該プロセスは、腫瘍の増殖および生存に役割を果たすと考えられる。ペルツズマブは、進行前立腺がん、非小細胞肺がん、卵巣がんおよび乳がんに対して一定の治療効果を示すが、その治療効果は、Ｈｅｒ２発現レベルに依存する。ペルツズマブは、Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＩヘテロ二量体の重要な部位を識別し、これによって識別されたエピトープは、サブ領域ＩＩの中心のセグメント２４５～３１１に位置し、重要な残基は、Ｈ２４５、Ｖ２８６、Ｓ２８８、Ｌ２９５、Ｈ２９６およびＫ３１１である。ここで、Ｌ２９５、Ｈ２９６は、Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３ヘテロ二量体を媒介する重要な部位であり、Ｌ２９５Ａ／Ｈ２９６Ａの二重突然変異は、Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３のヘテロ二量体化を完全に遮断することができる（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＥｒｂＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥｒｂＢ２－ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００４．５（４）：ｐｐ．３１７－２８）。従って、ペルツズマブは、Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体の形成を効果的に阻害するために使用されることができるが、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２ヘテロ二量体の形成に対して顕著な阻害効果は、示されていない。
【0014】
２．ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ
ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の機能に非常に重要な１４～１５ｋＤａのサイトカインである。ＩＬ－１５は、体内にほとんど存在しないが、その受容体ＩＬ－１５Ｒαと結合することで形質導入され、非常に高い生物学的効力を有する複合体ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５ＳＡ）が生成された後に一緒に標的細胞に輸送される。ＩＬ－１５ＳＡは、ＩＬ－１５を応答する細胞、特にＮＫ細胞を強力に活性化し、それによって抗腫瘍および抗ウイルス機能を促進する。
ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の機能に非常に重要な１４～１５ｋＤａのサイトカインである。ＩＬ－１５は、体内にほとんど存在しないが、その受容体ＩＬ－１５Ｒαと結合することで形質導入され、非常に高い生物学的効力を有する複合体ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５ＳＡ）が生成された後に一緒に標的細胞に輸送される。ＩＬ－１５ＳＡは、ＩＬ－１５を応答する細胞、特にＮＫ細胞を強力に活性化し、それによって抗腫瘍および抗ウイルス機能を促進する。
【0015】
研究者らは、１９９４年にＩＬ－１５をＴリンパ球増殖因子として初めて同定し、それは、ＩＬ－２と約１９％の相同配列を有し、多くの生物学的特性も非常に類似している。ＩＬ－１５の三次元構造は、ＩＬ－２に似ており、四つの「上－下－下－下」ヘリックスバンドルで構成され、ＩＬ－４、ＩＬ－７およびＩＬ－９等の他のサイトカインもこのようなコンフォメーションを含む。ＩＬ－１５は、他のサイトカインとは異なる作用をし、ＩＬ－１５受容体αは、ＩＬ－１５を生成する細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）で発現し、ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＳＡを形成して、ＩＬ－１５Ｒβ（ＩＬ－２Ｒβとも呼ばれる）および共通γ鎖（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９およびＩＬ－２１と共有する）を発現するＮＫ、ＮＫＴおよびメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞にシグナルを伝達し、ＩＬ－１５に独特の機能を仲介する能力を与えるのは、この独特の提示である可能性が非常に高い。マウスＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５と７０％のアミノ酸配列相同性を有し、ヒトＩＬ－１５およびマウスＩＬ－１５も、同様のトランス発現パターン、シグナル伝達経路および生物学的活性を有する。ＩＬ－１５は、単球、マクロファージ、ＤＣ、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞および神経細胞を含む多くの細胞タイプおよび組織で発現される。ＩＬ－１５は、多面発現性サイトカインとして自然免疫および適応免疫において重要な役割を果たす。
【0016】
トランス発現したＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαシグナルは、細胞上に発現したβ鎖およびγ鎖を応答して、ＪＡＫ１およびＪＡＫ３の動員および活性化を誘導し、活性化されたＪＡＫ１およびＪＡＫ３は、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５をさらにリン酸化する。ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５がリン酸化された後に相同二量体を形成し、細胞核に移行して標的遺伝子の転写を促進する。ＩＬ－１５シグナル伝達は、下流反応のカスケードを刺激し、細胞増殖を誘導し、アポトーシスを減少させ、免疫細胞の活性化および移行を増強する。高親和性ＩＬ－１５Ｒαが存在しない場合、ＩＬ－１５は、中程度の親和性（Ｋａ＝１．１０９／Ｍ）のβおよびγ受容体複合体（ＩＬ－１５Ｒβγ）と単独に結合し、他のチロシンキナーゼ（例えば、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ）のリン酸化および活性化を誘導し、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ経路と相互作用することもできる。研究によると、代謝チェックポイントキナーゼｍＴＯＲは、高濃度のＩＬ－１５によって活性化されることもでき、これは、ＮＫ細胞の増殖および活性化の増強に関連することを示し、ｍＴＯＲを選択的にノックダウンすると、骨髄ＮＫ細胞の成熟がブロックされる。ＩＬ－１５がＮＫ細胞の増殖を促進する能力は、部分的にはＩＬ－１５が媒介した好気性解糖によるものであり、ＩＬ－１５が存在しない場合、ＮＫ細胞の基礎代謝は、非常に低くなるが、ＩＬ－１５の濃度を向上させることでこの生理活性を大幅に増強させることができる。
【0017】
ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と同様の免疫学的特性を有するため、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導し、ＮＫ細胞の増殖および分化を促進し、細胞傷害性Ｔリンパ球の生成を誘導する。しかし、ＩＬ－２とは異なり、ＩＬ－１５は、Ｔｒｅｇ細胞に対して明らかな影響を及ぼさず、マウスまたは非ヒト霊長類動物（ＮＨＰ）で毛細管漏出症候群を引き起こされないため、ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－１５は、腫瘍免疫療法のより好ましい選択である。アカゲザルＩＬ－１５（ｒＩＬ－１５）は、インビボ実験で使用される最初のＩＬ－１５の形態であり、研究者らは、ｒＩＬ－１５が細胞表面ＩＬ－１５Ｒαに優先的に結合できると考えている。ヘテロ二量体ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαは、細胞から溶解されたＩＬ－１５の天然的な形態であり、細胞刺激相互作用とは独立して応答することができ、現在、ノバルティス会社は、固形腫瘍におけるこのような形態の分子（ＮＩＺ９８５）の臨床試験を実施している。Ｃｙｔｕｎｅによって開発されたＲＬＩは、ＩＬ－１５ＲαのＳｕｓｈｉドメインに結合したＩＬ－１５で構成される融合タンパク質であり、可溶性ＩＬ－１５アゴニストとして機能する。ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ複合体は、市販のＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃキメラ融合タンパク質を、前臨床研究で広く使用されているｒＩＬ－１５と混合することによって生成される。
【0018】
しかしながら、サイトカインの臨床使用には、単剤投与では標的化が難しく、高濃度投与でないと抗腫瘍効果が得られず、高濃度投与では免疫阻害効果および高い毒性が生じるという欠点がある。また、非標的サイトカインによる免疫系の活性化は、漸進的であり、免疫系は、広範囲に活性化され、致命的な副作用が伴う。さらに、サイトカインは、小分子量タンパク質であり、抗体の体内循環保護機序がないため、単純サイトカインは、半減期が短いことが多く、短期間に高用量を繰り返し投与する必要がある。現在、ほとんどの臨床研究薬は、サイトカインの半減期を延長させるためにＰＥＧ化またはＦｃ融合を使用し、半減期は延長されているが、サイトカインの標的化が不十分であるという問題は、依然として解決できない。
【0019】
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
［課題を解決するための手段］
本発明の第１の態様は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体の軽鎖および重鎖と、ならびにｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体の軽鎖および重鎖とを含む、二重特異性抗体を提供し、ここで、第１の抗体中の２本の鎖をそれぞれＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαに導入し（例えば、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、それぞれＣＬ１およびＣＨ１を置き換える）、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの高親和性を利用して、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成し、それにより、第１の抗体の軽鎖／重鎖の正しいペアリングを実現し、二重特異性抗体の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング問題を解決する。同時に、第１の抗体の可変ドメインＶＨ１、ＶＬ１、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαのアミノ酸配列の突然変異により、ＶＨ１とＶＬ１との間、およびＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間に一対または複数対のジスルフィド結合を添加し、第１の抗体の軽鎖／重鎖間の結合活性をさらに増強し、それにより、二重特異性抗体の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング問題を効果的に克服する。
［発明が解決しようとする課題］
［課題を解決するための手段］
本発明の第１の態様は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体の軽鎖および重鎖と、ならびにｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体の軽鎖および重鎖とを含む、二重特異性抗体を提供し、ここで、第１の抗体中の２本の鎖をそれぞれＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαに導入し（例えば、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、それぞれＣＬ１およびＣＨ１を置き換える）、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの高親和性を利用して、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成し、それにより、第１の抗体の軽鎖／重鎖の正しいペアリングを実現し、二重特異性抗体の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング問題を解決する。同時に、第１の抗体の可変ドメインＶＨ１、ＶＬ１、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαのアミノ酸配列の突然変異により、ＶＨ１とＶＬ１との間、およびＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間に一対または複数対のジスルフィド結合を添加し、第１の抗体の軽鎖／重鎖間の結合活性をさらに増強し、それにより、二重特異性抗体の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング問題を効果的に克服する。
【0020】
本発明で構築された二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体の軽鎖および重鎖と、ならびにｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体の軽鎖および重鎖とを含み、ここで、第１の抗体中の２本の鎖は、それぞれＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαを含み、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成することができる。
【0021】
別の好ましい例において、前記ＩＬ１５は、ＩＬ１５Ｒαに結合できる突然変異体を含み、前記ＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５に結合できる突然変異体を含む。
別の好ましい例において、前記第１の抗体可変ドメインＶＨ１とＶＬ１とは、連結または重合し、前記ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとは、連結または重合する。
別の好ましい例において、前記第１の抗体可変ドメインＶＨ１とＶＬ１とは、連結または重合し、前記ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとは、連結または重合する。
【0022】
別の好ましい例において、前記ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、第１の抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＬを置換する。
別の好ましい例において、前記第１の抗体の可変ドメインＶＬ１およびＶＨ１は、ＩＬ１５およびＩＬ１５ＲαのＮ末端に連結される。
別の好ましい例において、前記第１の抗体の可変ドメインＶＬ１およびＶＨ１は、ＩＬ１５およびＩＬ１５ＲαのＮ末端に連結される。
【0023】
別の好ましい例において、前記第１の抗体の可変ドメインＶＬ１およびＶＨ１は、ＩＬ１５およびＩＬ１５ＲαのＣ末端に連結される。
別の好ましい例において、前記第１の抗体の可変ドメインＶＬ１およびＶＨ１は、互いに位置を入れ替わる。
別の好ましい例において、前記第１の抗体の可変ドメインＶＬ１およびＶＨ１は、互いに位置を入れ替わる。
【0024】
別の好ましい例において、前記第１の抗体軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）は、第１の抗体重鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）と同向の重合される。
別の好ましい例において、前記第１の抗体軽鎖（Ｃ末端からＮ末端まで）は、第１の抗体重鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）と逆重合される。
別の好ましい例において、前記第１の抗体軽鎖（Ｃ末端からＮ末端まで）は、第１の抗体重鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）と逆重合される。
【0025】
別の好ましい例において、前記第１の抗体の可変ドメインＶＬ１およびＶＨ１は、低免疫原性アミノ酸リンカー配列を介してＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαに連結される。
別の好ましい例において、前記ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間には、一対または複数対のジスルフィド結合が存在する。
別の好ましい例において、前記ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間には、一対または複数対のジスルフィド結合が存在する。
【0026】
別の好ましい例において、前記ＩＬ１５は、以下に示される突然変異を含み、カウント方法は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＩＬ１５の最初のアミノ酸から１番目としてカウントされる。
【0027】
【表1】
【0028】
別の好ましい例において、前記ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、以下に示される突然変異の組み合わせを含み、カウント方法は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＩＬ１５の最初のアミノ酸から１番目としてカウントされ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示されるＩＬ１５Ｒαの最初のアミノ酸から１番目としてカウントされる。
【0029】
【表2】
【0030】
別の好ましい例において、前記第１の抗体の可変ドメインＶＨ１とＶＬ１との間には、一対または複数対のジスルフィド結合が存在する。
別の好ましい例において、前記ＶＨ１およびＶＬ１は、ＥＵナンバリングに基づいた以下の突然変異の組み合わせの形態を含む。
別の好ましい例において、前記ＶＨ１およびＶＬ１は、ＥＵナンバリングに基づいた以下の突然変異の組み合わせの形態を含む。
【0031】
【表3】
【0032】
別の好ましい例において、前記第１および第２の抗体重鎖は、それぞれ、Ｆｃセグメントに異なる突然変異を有するＡ鎖およびＢ鎖を含み、前記Ａ鎖およびＢ鎖は、ＥＵナンバリングに基づいた以下の突然変異の組み合わせの形態を有する。
【0033】
【表4】
【0034】
別の好ましい例において、前記Ｆｃセグメントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃおよびその突然変異体を含む。
【0035】
別の好ましい例において、前記ＦｃセグメントのＡ鎖およびＢ鎖において、１本の鎖は、プロテインＡに結合することができ、もう１本の鎖は、プロテインＡに結合できない突然変異体であり、前記突然変異は、ＥＵナンバリングに基づいたＨ４３５ＲまたはＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含む。
【0036】
別の好ましい例において、前記第１の抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２１７、ＣＤ２３９、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＰＤ－１、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＣＣＲ４、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ６、ＣＴＬＡ－４、インテグリンα４、ＤＮＡ／ヒストン複合体（ｈｉｓｔｏｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、ＰＤＧＦＲα、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－６Ｒαのいずれか一つであり、前記第２の抗原は、第１の抗原の異なるエピトープまたは上記の別の抗原である。
【0037】
別の好ましい例において、前記第１の／第２の抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒト由来抗体である。
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式Ｉに示される構造を有し、
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式Ｉに示される構造を有し、
【0038】
【化1】
【0039】
ここで、
鎖１：ＶＬ１またはＶＨ１は、Ｌ１を介してＩＬ１５またはＩＬ１５ＲαのＮ末端またはＣ末端に連結され、
鎖２：Ｎ末端からＣまで、ＶＨ１またはＶＬ１、Ｌ２、ＩＬ１５ＲαまたはＩＬ１５、Ｌ３、Ｆｃの順位で配置され、
鎖３：第２の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：第２の抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
「－」は、ペプチド結合を表し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、結合またはリンカー配列であり、
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩに示される構造を有し、
鎖１：ＶＬ１またはＶＨ１は、Ｌ１を介してＩＬ１５またはＩＬ１５ＲαのＮ末端またはＣ末端に連結され、
鎖２：Ｎ末端からＣまで、ＶＨ１またはＶＬ１、Ｌ２、ＩＬ１５ＲαまたはＩＬ１５、Ｌ３、Ｆｃの順位で配置され、
鎖３：第２の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：第２の抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
「－」は、ペプチド結合を表し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、結合またはリンカー配列であり、
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩに示される構造を有し、
【0040】
【化2】
【0041】
ここで、
鎖１：ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαは、Ｌ１を介してＶＬ１またはＶＨ１のＮ末端またはＣ末端に連結され、
鎖２：Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ１５ＲαまたはＩＬ１５、Ｌ２、ＶＨ１またはＶＬ１、Ｌ３、Ｆｃの順位で配置され、
鎖３：第２の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：第２の抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
「－」は、ペプチド結合を表し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、結合またはリンカー配列である。
鎖１：ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαは、Ｌ１を介してＶＬ１またはＶＨ１のＮ末端またはＣ末端に連結され、
鎖２：Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ１５ＲαまたはＩＬ１５、Ｌ２、ＶＨ１またはＶＬ１、Ｌ３、Ｆｃの順位で配置され、
鎖３：第２の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：第２の抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
「－」は、ペプチド結合を表し、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、結合またはリンカー配列である。
【0042】
別の好ましい例において、上記の鎖１および鎖２は、以下の表の組み合わせの形態を含む。
【0043】
【表5】
【0044】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩＩに示される構造を有し、
【0045】
【化3】
【0046】
ここで、
鎖１：Ｎ末端からＣ末端まで配置され、ＶＬ１－Ｌ１－ＩＬ１５、Ｌ１は、免疫原性の低いアミノ酸リンカー配列であり、
鎖２：Ｎ末端からＣ末端まで配置され、ＶＨ１－Ｌ２－ＩＬ１５Ｒα－Ｌ３－Ｆｃ、Ｌ２、Ｌ３は、免疫原性の低いアミノ酸リンカー配列であり、
鎖３：Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
「－」は、ペプチド結合を表す。
鎖１：Ｎ末端からＣ末端まで配置され、ＶＬ１－Ｌ１－ＩＬ１５、Ｌ１は、免疫原性の低いアミノ酸リンカー配列であり、
鎖２：Ｎ末端からＣ末端まで配置され、ＶＨ１－Ｌ２－ＩＬ１５Ｒα－Ｌ３－Ｆｃ、Ｌ２、Ｌ３は、免疫原性の低いアミノ酸リンカー配列であり、
鎖３：Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ２－ＣＨ１－Ｆｃの順位で配置され、
鎖４：Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ２－ＣＬの順位で配置され、
「－」は、ペプチド結合を表す。
【0047】
別の好ましい例において、前記Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基を含む。
別の好ましい例において、前記Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、一つまたは複数のＧＧＧＧＳリピートを含む。
別の好ましい例において、前記Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、一つまたは複数のＧＧＧＧＳリピートを含む。
【0048】
別の好ましい例において、前記ＩＬ１５配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されたとおりであり、前記ＩＬ１５Ｒα配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示されたとおりである。
【0049】
別の好ましい例において、前記Ｆｃ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９に示されたとおりである。
別の好ましい例において、前記第１の抗原および第２の抗原は、それぞれ、Ｈｅｒ２の二つの異なるエピトープに結合する抗原である。
別の好ましい例において、前記第１の抗原および第２の抗原は、それぞれ、Ｈｅｒ２の二つの異なるエピトープに結合する抗原である。
【0050】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の配列の融合によって得られる。
【0051】
別の好ましい例において、前記第１の抗原および第２の抗原は、それぞれ、ＣＳ１抗原およびＣＤ３８抗原である。
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６の配列の融合によって得られる。
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６の配列の融合によって得られる。
【0052】
本発明の第２の態様は、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体と、および
（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。。
（ａ）本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体と、および
（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。。
【0053】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、化学療法薬等の癌（または腫瘍）を治療するための他の薬物をさらに含む。
本発明の第３の態様は、癌（または腫瘍）、感染症または免疫調節疾患を治療するための薬物の調製における、本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体および本発明の第２の態様に記載の医薬組成物の適用を提供する。
本発明の第３の態様は、癌（または腫瘍）、感染症または免疫調節疾患を治療するための薬物の調製における、本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体および本発明の第２の態様に記載の医薬組成物の適用を提供する。
【0054】
本発明の第４の態様は、腫瘍増殖を阻害するための薬物の調製における本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体の適用を提供する。
別の好ましい例において、前記癌または腫瘍は、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がん、腎臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、神経内分泌がん、頭頸部がん、肝臓がん、鼻咽腔癌、精巣がん等の部位からの癌または腫瘍を含む。
別の好ましい例において、前記癌または腫瘍は、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がん、腎臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、神経内分泌がん、頭頸部がん、肝臓がん、鼻咽腔癌、精巣がん等の部位からの癌または腫瘍を含む。
【0055】
別の好ましい例において、前記癌（または腫瘍）は、骨髄がん、リンパ腫、白血病、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、扁平上皮皮膚がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群を含む。
【0056】
本発明の第５の態様は、調製ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば、乳がん、胃がん）を診断するための試薬またはキットの調製における、本発明の第１の態様に記載のＨｅｒダブルエピトープに結合する二重特異性抗体の用途を提供する。
【0057】
［発明の効果］
実験を通じて、本発明の発明者は、驚くべきことに、二重特異性抗体が、第１の抗体の２本の鎖にそれぞれＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒα（例えば、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、それぞれＣＬ１およびＣＨ１を置き換える）を導入し、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの高親和性を利用して、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成し、それにより、第１の抗体の軽鎖／重鎖の正しいペアリングを実現し、二重特異性抗体の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング問題を解決することを発見した。同時に、第１の抗体の可変ドメインＶＨ１、ＶＬ１、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαのアミノ酸配列の突然変異により、ＶＨ１とＶＬ１との間、およびＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間に一対または複数対のジスルフィド結合を添加し、第１の抗体の軽鎖／重鎖間の結合活性をさらに増強し、それにより、二重特異性抗体の調製プロセス中の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング、多量の副産物、安定性の低さ等の課題を効果的に克服し、最後に、サイトカインを標的とする、正しくペアリングされた二重特異性多機能抗体を調製する。同時に、二重特異性抗体の開発サイクルを短縮し、生産コストを削減する。
実験を通じて、本発明の発明者は、驚くべきことに、二重特異性抗体が、第１の抗体の２本の鎖にそれぞれＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒα（例えば、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、それぞれＣＬ１およびＣＨ１を置き換える）を導入し、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの高親和性を利用して、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα複合体を形成し、それにより、第１の抗体の軽鎖／重鎖の正しいペアリングを実現し、二重特異性抗体の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング問題を解決することを発見した。同時に、第１の抗体の可変ドメインＶＨ１、ＶＬ１、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαのアミノ酸配列の突然変異により、ＶＨ１とＶＬ１との間、およびＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの間に一対または複数対のジスルフィド結合を添加し、第１の抗体の軽鎖／重鎖間の結合活性をさらに増強し、それにより、二重特異性抗体の調製プロセス中の軽鎖／重鎖の不正確なマッチング、多量の副産物、安定性の低さ等の課題を効果的に克服し、最後に、サイトカインを標的とする、正しくペアリングされた二重特異性多機能抗体を調製する。同時に、二重特異性抗体の開発サイクルを短縮し、生産コストを削減する。
【0058】
別の態様において、本発明で構築された二重特異性抗体は、軽鎖／重鎖の不正確なマッチング問題を克服する同時に、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα活性を有し、サイトカインを腫瘍部位に標的化することができ、腫瘍部位でＰＭＢＣ中のＴ細胞およびＮＫ細胞を特異的に増幅および活性化して、免疫細胞の数およびキラーサイトカインの放出を増加させ、腫瘍細胞をより効果的に殺すことができ、投与量を軽減することができる。
【0059】
第３の態様において、本発明は、正しくペアリングされたトラスツズマブ／ペルツズマブ／ＩＬ１５二重特異性抗体の構築に成功し、Ｈｅｒ２二重特異性抗体の標的化を利用して、ＩＬ１５を腫瘍組織に標的化し、免疫応答を刺激し、複数の機序を通じてＨｅｒ２陽性腫瘍を殺傷する。
【0060】
第４の態様において、本発明は、ＣＳ１モノクローナル抗体と同等のＣＳ１抗原結合結合能を有する、ＣＳ１／ＣＤ３８抗原に結合する正しくペアリングされたエロツズマブ／ダラツムマブ／ＩＬ１５二重特異性抗体の構築に成功し、同時に、ＣＤ３８モノクローナル抗体と同等のＣＤ３８抗原結合結合能を有し、血液腫瘍の治療において大きな可能性を秘めている。
【0061】
本発明をより容易に理解するために、特定の技術的および化学的用語を以下に具体的に定義する。この文書の他の場所で明確に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および化学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0062】
用語
本発明で使用されるアミノ酸の３文字表記および１文字表記は、Ｊ．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載されたとおりである。
本発明で使用されるアミノ酸の３文字表記および１文字表記は、Ｊ．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載されたとおりである。
【0063】
本発明に記載の「抗体」は、完全な抗体だけでなく、抗原結合活性を有する断片、ポリペプチド配列、およびその誘導体および類似体も含む。
前記抗原結合断片は、完全長抗体の一つまたは複数の部分を指し、前記部分は、抗原（例えば、ＨＥＲ２）に結合する能力を保持し、抗原への特異的結合に関して完全な抗体と競合する。通常は、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照し、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。組換えＤＮＡ技術によって、または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって抗原結合部分を生成することができる。いくつかの場合によっては、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ポリペプチドに特異的抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むキメラ抗体を含む。当業者に知られている従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的または化学的切断法）を使用して、所定の抗体（例えば、モノクローナル抗体２Ｅ１２）から抗体の抗原結合部分（例えば、上記の抗体断片）を得ることができ、完全な抗体の場合と同じ方法で特異性について抗体の抗原結合部分をスクリーニングする。「Ｆｄ断片」という用語は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指し、「Ｆｖ断片」という用語は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインで構成される抗体断片を指し、「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨドメインで構成される抗体断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６（１９８９））を指し、「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指し、「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
前記抗原結合断片は、完全長抗体の一つまたは複数の部分を指し、前記部分は、抗原（例えば、ＨＥＲ２）に結合する能力を保持し、抗原への特異的結合に関して完全な抗体と競合する。通常は、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照し、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。組換えＤＮＡ技術によって、または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって抗原結合部分を生成することができる。いくつかの場合によっては、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ポリペプチドに特異的抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むキメラ抗体を含む。当業者に知られている従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的または化学的切断法）を使用して、所定の抗体（例えば、モノクローナル抗体２Ｅ１２）から抗体の抗原結合部分（例えば、上記の抗体断片）を得ることができ、完全な抗体の場合と同じ方法で特異性について抗体の抗原結合部分をスクリーニングする。「Ｆｄ断片」という用語は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指し、「Ｆｖ断片」という用語は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインで構成される抗体断片を指し、「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨドメインで構成される抗体断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６（１９８９））を指し、「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指し、「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
【0064】
本明細書で使用されるように、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の抗体と基本的に同じ生物学機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は、（ｉ）一つのまたは複数の保存的または非保存性的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド（このように置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされる場合とされない場合であり得る）、または（ｉｉ）一つのまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチドまたは（ｉｖ）追加のアミノ酸配列がポリペプチド配列に融合されることによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質配列または６Ｈｉｓタグで形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示に従って、これらの断片、誘導体および類似体は、当業者の周知の範囲内である。
【0065】
本発明に記載の「エピトープ」または「抗原エピトープ」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、当該技術分野において「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は、通常、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基で構成され、且つ通常は、特定の三次元構造特徴および特定の電荷特徴を有する。例えば、エピトープは、通常、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続アミノ酸を独特の交換構造で含み、それは、「線形」または「コンフォメーション」であり得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照する。線形エピトープにおいて、タンパク質はと相互作用分子（例えば、抗体）との間のすべての相互作用点は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。コンフォメーションエピトープにおいて、相互作用点は、互いに分離されたタンパク質のアミノ酸残基を横切って存在する。
【0066】
本発明に記載の「ＩＬ－１５」は、ヒトＩＬ－１５または非ヒト哺乳動物または非哺乳動物のＩＬ－１５等の任意のＩＬ－１５、またはＩＬ１５Ｒαに結合できる突然変異体であり得る。ブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウス等の非ヒト哺乳動物、ニワトリ等の非哺乳動物、好ましくは、ヒトＩＬ－１５が例示される。「ＩＬ１５Ｒαに結合できる突然変異体」という用語は、一つまたは複数のアミノ酸の置換、増加または欠失突然変異によって得られる、ＩＬ－１５とその受容体との間の親和性を向上または減少させるか、またはＴ細胞またはＮＫ細胞を刺激する活性を増加または減少させる突然変異体分子を指す。本発明に記載の「ＩＬ－１５」は、好ましくはその変異体形態であり、より好ましくは、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２である。
【0067】
本発明に記載の「ＩＬ－１５Ｒα」は、ヒトＩＬ－１５Ｒαまたは非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαまたは非哺乳動物ＩＬ－１５Ｒα等の、任意の種のＩＬ－１５Ｒα、またはＩＬ１５Ｒαに結合できる突然変異体であり得る。ブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウス等の非ヒト哺乳動物、ニワトリ等非哺乳動物が例示される。好ましくはヒトＩＬ－１５Ｒα、より好ましくはＥＣＤと呼ばれるヒトＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン断片ＩＬ－１５Ｒαが例示される（データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、登録番号Ｑ１３２６１、３１－２０５ａａ）。「ＩＬ１５Ｒαに結合できる突然変異体」という用語は、ＩＬ－１５Ｒα上の一つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入または置換突然変異によって形成されるＩＬ－１５等のそのリガンド分子に結合する能力を有する機能的突然変異体を指し、好ましくは、ヒトＩＬ－１５Ｒα分子、より好ましくはヒトＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン断片の短縮型、すなわち、細胞外ドメイン断片Ｃ末端から始まる一つまたは複数のアミノ酸欠失突然変異によって得られる、好ましくは６５～１７８個のアミノ酸欠失突然変異型を保持する、ＩＬ－１５Ｒα（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３－９）等のヒトＩＬ－１５受容体α活性を有する分子である。
【0068】
本発明に記載の「Ｆｃセグメント」とは、抗原結合活性を有さない免疫グロブリンのＣ末端領域を指し、抗体分子がエフェクター分子および細胞と相互作用する部位であり、二つのジスルフィドした抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含む二量体分子である。Ｆｃ領域は、パパイン消化またはＩｄｅＳ消化によってトリプシン処理された完全な（全長）抗体に生成するか、または組換えによって生成することができる。「Ｆｃ部分」は、好ましくは、少なくとも一つの免疫グロブリンヒンジ領域、並びにＩｇＧのＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。
【0069】
Ｆｃヘテロ二量体突然変異とは、Ｆｃの適切な部位における一つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失突然変異によって引き起こされるＦｃ構造または機能の変化を指す。突然変異によって設計されたＦｃ変異体間では、空間充填効果、静電ステアリング、水素結合作用、疎水性作用等が形成される。Ｆｃ突然変異体間の相互作用は、安定なヘテロ二量体の形成に寄与する。好ましい突然変異は、「Ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ」形態の突然変異設計として設計される。さらに、本発明に記載のＦｃには、グリコシル化修飾突然変異、ＦｃγＲ結合領域突然変異（ＡＤＣＣ活性を調整するため）、抗体の安定性を向上させるアミノ酸突然変異等昨日の変化をもたらすほかの突然変異も存在することができる。本発明におけるＦｃは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃおよびその突然変異を含み、ここで、１本の鎖は、ｐｒｏｔｅｉｎＡに結合でき、もう１本の鎖は、ｐｒｏｔｅｉｎＡに結合できない突然変異体であり、ＥＵナンバリングに基づいた突然変異Ｈ４３５ＲまたはＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含む。
【0070】
本発明に記載の「ヘテロ二量体」は、遺伝子の共発現生成物であることが好ましい。原核細胞内の大腸菌で共発現されるか、または２９３、ＣＨＯ等の真核細胞で共発現される。前記「共発現」とは、細胞内で複数の遺伝子同時に発言し、それらの生成物が同時に出現することを指す。これらの遺伝子は、同時に存在し、別々にまたは一緒に発言を阻害できる。本発明において、一つの真核細胞での共発現が好ましい。共発現によって得られた遺伝子発現生成物は、複合体の郷率的かつ簡単な形成に有利し、本発明において、ヘテロ二量体の形成に遊有利する。
【0071】
Ｆｃ変異体の突然変異設計技術は、二重特異性抗体またはヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質形態を調製するためにこの分野で広く使用されている。代表的なものは、Ｃａｔｅｒら、（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖｏｌ．９ｎｏ．７ｐｐ６１７－６２１，１９９６）によって提案された「Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ」形態；Ａｍｇｅｎ会社の技術者の静電ステアリングを使用したＦｃ含有ヘテロ二量体形態の形成（ＵＳ２０１０２８６３７４Ａ１）；Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｈ．Ｄａｖｉｓら、（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｐｐ．１-８，２０１０）によって提案されたＩｇＧ／ＩｇＡ鎖交換によって形成されるヘテロ二量体形態（ＳＥＥＤ ｂｏｄｉｅｓ）；Ｇｅｎｍａｂ会社のＤｕｏＢｏｄｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３１７（５８４４））プラットフォーム技術によって形成された二重特異性分子；Ｘｅｎｃｏｒ会社の技術者の構造計算およびＦｃアミノ酸突然変異を統合し、異なる作用機序を統合したヘテロ二量体タンパク質形態の形成（ｍＡｂｓ３：６，５４６－５５７；Ｎｏｖｅｍｂｅｒ／Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１１）；蘇州ＡＬＰＨＡＭＡＢ ＯＮＣＯＬＯＧＹ会社の電荷ネットワークベースのＦｃ修飾方法（ＣＮ２０１１１０４５９１００．７）によるヘテロ二量体タンパク質の形態の取得；ならびにヘテロ二量体機能性タンパク質を形成するための、Ｆｃアミノ酸の変化または機能修飾手段に基づくほかの遺伝子工学的方法がある。本発明に記載のＦｃ変異体断片上のＫｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ構造とは、２本のＦｃ断片がそれぞれ突然変異し、突然変異後に「Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ」形態で結合できることを指す。得られた第１のＦｃ変異体および第２のＦｃ変異体を「Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ」の携帯で組み合わせてヘテロ二量体形成できるように、Ｃａｔｅｒらの「Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ」モデルを使用してＦｃ領域に部位突然変異修飾を行うことが好ましい。特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリンＦｃ領域の選択は、当業者の知識の範囲内である。ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃ領域が好ましくは、ヒト抗体ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＦｃ領域がより好ましい。第１のＦｃ変異体または第２のＦｃ変異体の一つは、ｋｎｏｂ突然変異について、もう一つは、ｈｏｌｅ突然変異についてランダムに選択される。実施例において、前記第１のＦｃ変異体は、ｋｎｏｂ突然変異であり、前記第２のＦｃ変異体は、ｈｏｌｅ突然変異である。
【0072】
「リンカー配列」という用語は、交換された二重可変領域免疫グロブリンに折り畳まれる軽鎖および重鎖のドメインに十分な移動性を提供するために、免疫グロブリンドメインに挿入された一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。本発明では、タンパク質の正確なフォールディングおよびペプチドの安定性を確保するために、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαを対応する軽鎖または重鎖への連結に使用される。本発明の「連結ペプチド」は、好ましくは、低免疫原性アミノ酸障害、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３、４、５またはそれ以上であり、好ましくは、ｎは、１～５である。
【0073】
本発明の抗体は、単独で使用してもよく、または検出可能なマーカー（診断目的）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分または上記のこれらの任意の組み合わせに結合またはカップリングさせてもよい。
【0074】
診断目的の検出可能なマーカーとしては、蛍光マーカーまたは発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピューター断層撮影法）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素を含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図1】二重特異性抗体の構造形態１である。
【図2】二重特異性抗体の構造形態２である。
【図3】二重特異性抗体の構造形態３である。
【図4】二重特異性抗体の構造形態４である。
【図5】二重特異性抗体の構造形態５である。
【図6】二重特異性抗体の構造形態６である。
【図7】二重特異性抗体の構造形態７である。
【図8】二重特異性抗体の構造形態８である。
【図9】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析されたＱＰ３４５６３４５７タンパク質の還元バンドおよび非還元バンドである。
【図10】ＱＰ３４５６３４５７タンパク質純度のＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析である。
【図12】Ｈｅｒ２－Ｆｃ融合タンパク質に結合したＱＰ３４５６３４５７等の分子のＥＬＩＳＡ検出である。
【図13】Ｈｅｒ２Ｍ２－Ｆｃ融合タンパク質に結合したＱＰ３４５６３４５７等の分子のＥＬＩＳＡ検出である。
【図14】ＣＤ３８タンパク質に結合したＱＰ３４６２３４６３等の分子のＥＬＩＳＡ検出である。
【図15】ＣＳ１タンパク質に結合したＱＰ３４６２３４６３等の分子のＥＬＩＳＡ検出である。
【図16】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に結合したＱＰ３４５６３４５７等の分子のＦＡＣＳ検出である。
【図17】ＢＴ－４７４細胞に結合したＱＰ３４５６３４５７等の分子のＦＡＣＳ検出である。
【図18】ＳＫ－ＯＶ－３細胞に結合したＱＰ３４５６３４５７等の分子のＦＡＣＳ検出である。
【図19】ヒト乳がん細胞ＳＫ－ＢＲ－３に対するＱＰ３４５６３４５７等の分子の増殖阻害曲線である。
【図20】ヒト乳がん細胞ＢＴ－４７４に対するＱＰ３４５６３４５７等の分子の増殖阻害曲線である。
【図21】ヒト卵巣がん細胞ＳＫ－ＯＶ－３に対するＱＰ３４５６３４５７等の分子の増殖阻害曲線である。
【図22】ＱＰ３４５６３４５７等が媒介したＰＢＭＣ殺傷ヒト乳がん細胞ＳＫ－ＢＲ－３細胞である。
【図23】ＱＰ３４５６３４５７等が媒介したＰＢＭＣ殺傷ヒト乳がん細胞ＢＴ－４７４細胞である。
【図24】ＱＰ３４５６３４５７等が媒介したＰＢＭＣ殺傷ヒト卵巣がん細胞ＳＫ－ＯＶ－３細胞である。
【図25】Ｍｏ７ｅ細胞に対する増殖を検出するＱＰ３４５６３４５７等の分子の実験である。
【図26】ＳＫ－ＯＶ－３インビボ薬物効果モデルの腫瘍増殖曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0076】
以下の実施形態において具体的な条件を示さない実験方法は、通常、従来高知の条件、または原料メーカーまたは商品メーカーが提案する条件や方法に従って行われる。例えば、分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、現代の分子生物学手法、細胞生物学等である。具体的な出所が示されていない試薬は、市販で購入された従来の試薬である。
【0077】
実施例１：融合タンパク質のクローニングおよび発現
タンパク質配列は、次のとおりである。
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶ領域）ＶＬ－ＩＬ１５ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＣＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶ領域）ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＣＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＩ領域）ＶＬ－ＣＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＩ領域）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＬ－ＩＬ１５ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＣＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＤＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＣＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＬ－ＣＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＮＳＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＤＫＩＬＷＦＧＥＰＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
クローニングおよび構築方法：
クローン設計は、表１に示されたとおりである。ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｔｍａｂ）ＶＬ－ＩＬ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｔｍａｂ）ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＬ－ＩＬ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）をコードする担体をそれぞれ構築する。プラスミドにはスクリーニングマーカーとしてＤＨＦＲを含み、安定株のスクリーニングに使用されることができ、抗腫瘍特異性抗原抗体をコードする担体の軽鎖配列（配列）および抗腫瘍特異性抗原抗体をコードする担体の重鎖配列（ここで、Ｆｃは、Ｈｏｌｅ突然変異、即ち（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′ ＶＬ（Ｐｍａｂ）－ＣＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′（Ｐｍａｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＬ－ＣＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を含み）、プラスミドは、スクリーニングマーカーとしてＧＳを含み、安定株のスクリーニングに使用されることができる。タンパク質分子の構造の模式図は、図６に示されたとおりである。他の的実施形態において、タンパク質分子は、それぞれ図２～図８に示されるような他の構造形態であり得る。
タンパク質配列は、次のとおりである。
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶ領域）ＶＬ－ＩＬ１５ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＣＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶ領域）ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＣＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＩ領域）ＶＬ－ＣＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′（Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＩ領域）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＬ－ＩＬ１５ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＣＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＤＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＣＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＬ－ＣＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＮＳＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＤＫＩＬＷＦＧＥＰＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
クローニングおよび構築方法：
クローン設計は、表１に示されたとおりである。ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｔｍａｂ）ＶＬ－ＩＬ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ａｎｔｉ Ｈｅｒ２（Ｔｍａｂ）ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＬ－ＩＬ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ａｎｔｉ ＣＳ１ ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ（Ｋｎｏｂ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）をコードする担体をそれぞれ構築する。プラスミドにはスクリーニングマーカーとしてＤＨＦＲを含み、安定株のスクリーニングに使用されることができ、抗腫瘍特異性抗原抗体をコードする担体の軽鎖配列（配列）および抗腫瘍特異性抗原抗体をコードする担体の重鎖配列（ここで、Ｆｃは、Ｈｏｌｅ突然変異、即ち（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′ ＶＬ（Ｐｍａｂ）－ＣＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、ａｎｔｉ Ｈｅｒ２′（Ｐｍａｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＬ－ＣＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ａｎｔｉ ＣＤ３８ ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｈｏｌｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を含み）、プラスミドは、スクリーニングマーカーとしてＧＳを含み、安定株のスクリーニングに使用されることができる。タンパク質分子の構造の模式図は、図６に示されたとおりである。他の的実施形態において、タンパク質分子は、それぞれ図２～図８に示されるような他の構造形態であり得る。
【0078】
【表6】
【0079】
表７に示されるように、対照抗体であるトラスツズマブ、ペルツズマブ、エロツズマブ、ダラツムマブを設計及び構築する。
【0080】
【表7】
【0081】
標的分子の一過性発現
Ｅｘｐｉ ＣＨＯ－Ｓ細胞を、８ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを追加したＦｏｒｔｉ ＣＨＯ培地に接種し（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１４８３０１）、３７℃、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養する。トランスフェクションの前日に、Ｅｘｐｉ ＣＨＯ－Ｓ細胞の密度を３×１０Ｅ６／ｍＬに調整して、シェーカーに入れ、３７℃、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養し、トランスフェクション当日、サンプルを採取してカウントし、細胞密度を６×１０Ｅ６／ｍｌに希釈し、フラスコ当たり４０ｍｌで１２５ｍｌの振とうフラスコにいて、対応するプラスミドをそれぞれ２０ｕｇとり、４．８ｍＬのＯｐｔｉ ＭＥＭと混合し、１２０ｕｌのＰｏｌｙｐｌｕｓ－ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬を加え、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を均等に混合した後、室温下で１０分間おき、混合物を細胞にゆっくりと入れ、均等に混合した後、シェーカーに入れて培養する。培養プロセスにおいて、それぞれ１日目、４日目、６日目、８日目に２ｍＬのＦｅｅｄ ＰＦＦ０５（ＯＰＭ、Ｆ８１２７９－００１）および１ｍの３０％グルコース溶液を各フラスコに追加する。トランスフェクションの初日、温度を３２℃に下げ、ＣＯ２濃度を５％に下げる。１３日目にサンプルを収集し、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、精製のために上清を採取する。
Ｅｘｐｉ ＣＨＯ－Ｓ細胞を、８ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを追加したＦｏｒｔｉ ＣＨＯ培地に接種し（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１４８３０１）、３７℃、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養する。トランスフェクションの前日に、Ｅｘｐｉ ＣＨＯ－Ｓ細胞の密度を３×１０Ｅ６／ｍＬに調整して、シェーカーに入れ、３７℃、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養し、トランスフェクション当日、サンプルを採取してカウントし、細胞密度を６×１０Ｅ６／ｍｌに希釈し、フラスコ当たり４０ｍｌで１２５ｍｌの振とうフラスコにいて、対応するプラスミドをそれぞれ２０ｕｇとり、４．８ｍＬのＯｐｔｉ ＭＥＭと混合し、１２０ｕｌのＰｏｌｙｐｌｕｓ－ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬を加え、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を均等に混合した後、室温下で１０分間おき、混合物を細胞にゆっくりと入れ、均等に混合した後、シェーカーに入れて培養する。培養プロセスにおいて、それぞれ１日目、４日目、６日目、８日目に２ｍＬのＦｅｅｄ ＰＦＦ０５（ＯＰＭ、Ｆ８１２７９－００１）および１ｍの３０％グルコース溶液を各フラスコに追加する。トランスフェクションの初日、温度を３２℃に下げ、ＣＯ２濃度を５％に下げる。１３日目にサンプルを収集し、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、精製のために上清を採取する。
【0082】
実施例２：融合タンパク質の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、遠心分離後の培地の上清を固に通し、４０ｍｌのサンプルをロードし、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、溶離液をカラムに通過させ、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに上昇したときに、溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに低下したときに、収集を停止し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプルを収集完了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調節する。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、遠心分離後の培地の上清を固に通し、４０ｍｌのサンプルをロードし、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり、少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、溶離液をカラムに通過させ、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに上昇したときに、溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵに低下したときに、収集を停止し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプルを収集完了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調節する。
【0083】
ＣＨ１－ＸＬアフィニティークロマトグラフィー
プロテインＡで処理したサンプルを８０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、遠心分離後の上清をサンプルループに通し、流速０．３３ｍｌ／ｍｉｎでカラムに通過させ、少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、溶離液をカラムに通過させ、ＵＶ２８０が１０ｍＡＵに上昇したときに、溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１０ｍＡＵに低下したときに、収集を停止し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプルを収集完了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調節する。
プロテインＡで処理したサンプルを８０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、遠心分離後の上清をサンプルループに通し、流速０．３３ｍｌ／ｍｉｎでカラムに通過させ、少なくとも３ＣＶの平衡溶液をカラムに通過させ、実際の体積は、２０ｍｌであり、最終機器から流出する溶液のｐＨおよび導電率が平衡溶液と一致し、流速は、０．３３ｍｌ／ｍｉｎであることを確保し、溶離液をカラムに通過させ、ＵＶ２８０が１０ｍＡＵに上昇したときに、溶出ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１０ｍＡＵに低下したときに、収集を停止し、流速は、１ｍｌ／ｍｉｎである。サンプルを収集完了後、ｐＨ調節液でＰＡＣ－ＥＰを中性に調節する。
【0084】
ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化
３９．５μｌのサンプルを取り、１．９８μｌの１０％ＳＤＳおよび１．５８μｌの１Ｍ ＤＴＴを加え、均等に混合した後に１００℃で１０分間煮沸し、サンプルを冷却した後、４．８μｌの１０％ＮＰ－４０および１．０μｌのＰＮＧａｓｅ Ｆを加え、均等に混合した後に４℃で一晩浸し、一晩後のサンプルを７５℃で１０分間加熱して熱失活させた後、サンプルに対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＳＥＣを行い、タンパク質の純度を検出する。
３９．５μｌのサンプルを取り、１．９８μｌの１０％ＳＤＳおよび１．５８μｌの１Ｍ ＤＴＴを加え、均等に混合した後に１００℃で１０分間煮沸し、サンプルを冷却した後、４．８μｌの１０％ＮＰ－４０および１．０μｌのＰＮＧａｓｅ Ｆを加え、均等に混合した後に４℃で一晩浸し、一晩後のサンプルを７５℃で１０分間加熱して熱失活させた後、サンプルに対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＳＥＣを行い、タンパク質の純度を検出する。
【0085】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動分析およびＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析
消化の前後に各サンプルを５μｇ採取し、１×ＰＢＳで体積を４８μｌに希釈し、１２μｌの５×Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅを加え、９５℃で１０分間加熱する。電気泳動槽にｐＨ８．３のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（０．１％ＳＤＳを含む）を注ぎ、ピペットガンでサンプル槽にサンプルを加え、各サンプル槽に６０μｌずつサンプルを加える。電圧を１４０Ｖ、時間を１００分間に設定して電気泳動を開始する。電気泳動完了後にゲルを取り出し、染色液に３０分間浸漬し、タンパク質領域のバンドが鮮明になるまで脱色駅で脱色する。図９は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析されたＱＰ３４５６３４５７タンパク質の還元バンドおよび非還元バンドである。図１０は、ＱＰ３４５６３４５７タンパク質純度のＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析である。
消化の前後に各サンプルを５μｇ採取し、１×ＰＢＳで体積を４８μｌに希釈し、１２μｌの５×Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅを加え、９５℃で１０分間加熱する。電気泳動槽にｐＨ８．３のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（０．１％ＳＤＳを含む）を注ぎ、ピペットガンでサンプル槽にサンプルを加え、各サンプル槽に６０μｌずつサンプルを加える。電圧を１４０Ｖ、時間を１００分間に設定して電気泳動を開始する。電気泳動完了後にゲルを取り出し、染色液に３０分間浸漬し、タンパク質領域のバンドが鮮明になるまで脱色駅で脱色する。図９は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析されたＱＰ３４５６３４５７タンパク質の還元バンドおよび非還元バンドである。図１０は、ＱＰ３４５６３４５７タンパク質純度のＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析である。
【0086】
実施例３：タンパク質ＱＰ３４５６３４５７のペプチドマップ分析
この実施例では、ＬＣ－ＭＳを使用して、ＱＰ３４５６３４５７タンパク質のアミノ酸配列を同定する。ＱＰ３４５６３４５７タンパク質の変性および還元後、トリプシンを加えて酵素消化した後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析し（ＬＣ機器Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ、カラムＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｌｕｓ ｃｏｌｕｍｎ。ＭＳ機器Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ Ｑ－ＴＯＦ）、得られたデータをＰｅａｋｓで検索し、Ｐｅａｋｓ検索の結果を厳密なカード値でろ過して、信頼性の高いペプチドセグメントを取得し、ＱＰ３４５６３４５７タンパク質のトラスツズマブＶＬ－ＩＬ１５鎖に対する３６％の配列カバー率（図１１ａ、灰色は、同定されたアミノ酸配列である）、トラスツズマブ ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ鎖に対する５６％の配列カバー率（図１１ｂ、灰色は、同定されたアミノ酸配列である）、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＬ－ＣＬ鎖に対する６４％の配列カバー率（図１１ｃ、灰色は、同定されたアミノ酸配列である）、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ鎖に対する５６％の配列カバー率（図１１ｄ，灰色は、同定されたアミノ酸配列である）を達成する。ＬＣ－ＭＳによるペプチドマップ分析により、トラスツズマブＶＬ、ＩＬ１５、トラスツズマブ ＶＨ、ＩＬ１５Ｒａ、Ｆｃ、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＬ、ＣＬ、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＨ、ＣＨ１、Ｆｃ等を含むＱＰ３４５６３４５７分子内の各断片をそれぞれ発見した。
この実施例では、ＬＣ－ＭＳを使用して、ＱＰ３４５６３４５７タンパク質のアミノ酸配列を同定する。ＱＰ３４５６３４５７タンパク質の変性および還元後、トリプシンを加えて酵素消化した後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析し（ＬＣ機器Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ、カラムＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｌｕｓ ｃｏｌｕｍｎ。ＭＳ機器Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ Ｑ－ＴＯＦ）、得られたデータをＰｅａｋｓで検索し、Ｐｅａｋｓ検索の結果を厳密なカード値でろ過して、信頼性の高いペプチドセグメントを取得し、ＱＰ３４５６３４５７タンパク質のトラスツズマブＶＬ－ＩＬ１５鎖に対する３６％の配列カバー率（図１１ａ、灰色は、同定されたアミノ酸配列である）、トラスツズマブ ＶＨ－ＩＬ１５Ｒａ－Ｆｃ鎖に対する５６％の配列カバー率（図１１ｂ、灰色は、同定されたアミノ酸配列である）、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＬ－ＣＬ鎖に対する６４％の配列カバー率（図１１ｃ、灰色は、同定されたアミノ酸配列である）、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ鎖に対する５６％の配列カバー率（図１１ｄ，灰色は、同定されたアミノ酸配列である）を達成する。ＬＣ－ＭＳによるペプチドマップ分析により、トラスツズマブＶＬ、ＩＬ１５、トラスツズマブ ＶＨ、ＩＬ１５Ｒａ、Ｆｃ、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＬ、ＣＬ、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ＶＨ、ＣＨ１、Ｆｃ等を含むＱＰ３４５６３４５７分子内の各断片をそれぞれ発見した。
【0087】
実施例４：Ｈｅｒ２へのＱＰ３４５６３４５７の結合およびその突然変異体活性のＥＬＩＳＡ検出
ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のみに結合するＨｅｒ２変異体タンパク質の設計。Ｍａｔｔｈｅｗ Ｃ．Ｆｒａｎｋｌｉｎは、ペルツズマブＦａｂとＨｅｒ２細胞外構造の複合体構造をＣａｎｃｅｒ ｃｅｌｌに発表した。当該チームは、アラニンスキャニング法を使用して、Ｈｅｒ２のどの主要なアミノ酸がペルツズマブＦａｂへの結合に影響を与えるかを研究した。ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のみに結合し、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）に結合しないＨｅｒ２変異体タンパク質をＨｅｒ２Ｍ２（タンパク質番号ＱＰ３７３２）と名付ける。Ｈｅｒ２ ｗｔ（タンパク質番号ＱＰ３７３１）およびＨｅｒ２Ｍ２（タンパク質番号ＱＰ３７３２）のアミノ酸配列は、それぞれ次のとおりである。
ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のみに結合するＨｅｒ２変異体タンパク質の設計。Ｍａｔｔｈｅｗ Ｃ．Ｆｒａｎｋｌｉｎは、ペルツズマブＦａｂとＨｅｒ２細胞外構造の複合体構造をＣａｎｃｅｒ ｃｅｌｌに発表した。当該チームは、アラニンスキャニング法を使用して、Ｈｅｒ２のどの主要なアミノ酸がペルツズマブＦａｂへの結合に影響を与えるかを研究した。ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）のみに結合し、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）に結合しないＨｅｒ２変異体タンパク質をＨｅｒ２Ｍ２（タンパク質番号ＱＰ３７３２）と名付ける。Ｈｅｒ２ ｗｔ（タンパク質番号ＱＰ３７３１）およびＨｅｒ２Ｍ２（タンパク質番号ＱＰ３７３２）のアミノ酸配列は、それぞれ次のとおりである。
【0088】
ＱＰ３７３１：（Ｈｅｒ２ ＥＣＤ－Ｆｃ）
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＳＣＴＬＶＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＰＦＣＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊
ＱＰ３７３２（Ｈｅｒ２Ｍ２－Ｆｃ）：
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＳＣＴＬＶＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＡＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＡＦｃＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊
実験材料：ミルク（ｍｉｌｋ）（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｂ５４８１１７－０５００）；ＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）；ＴＭＢ（洛陽ＢＡＩＡＯＴＯＮＧ実験材料センター、Ｃ０６０２０１）；Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：８．００ｇのＮａＣｌ、０．２０ｇのＫＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を、８００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに秤量して溶解し、十分に溶解した後に１Ｌに定量し、ｐＨを７．４に調節して、高温で滅菌して備蓄する。または市販の１０×、２０×ＰＢＳ溶液を購入して、１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用する。ブロッキング溶液：５ｇのミルクをＰＢＳに秤量し、ブロッキング溶液を調製してすぐに使用する。停止溶液（１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を取り、２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下する。ＴＭＢを３７℃で１０分間発色させ、シェーカーに入れ（１２０ｒｐｍ）、１００μｌ／ウェル。
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＳＣＴＬＶＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＰＦＣＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊
ＱＰ３７３２（Ｈｅｒ２Ｍ２－Ｆｃ）：
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＳＣＴＬＶＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＡＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＡＦｃＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊
実験材料：ミルク（ｍｉｌｋ）（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｂ５４８１１７－０５００）；ＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）；ＴＭＢ（洛陽ＢＡＩＡＯＴＯＮＧ実験材料センター、Ｃ０６０２０１）；Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：８．００ｇのＮａＣｌ、０．２０ｇのＫＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を、８００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに秤量して溶解し、十分に溶解した後に１Ｌに定量し、ｐＨを７．４に調節して、高温で滅菌して備蓄する。または市販の１０×、２０×ＰＢＳ溶液を購入して、１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用する。ブロッキング溶液：５ｇのミルクをＰＢＳに秤量し、ブロッキング溶液を調製してすぐに使用する。停止溶液（１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を取り、２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下する。ＴＭＢを３７℃で１０分間発色させ、シェーカーに入れ（１２０ｒｐｍ）、１００μｌ／ウェル。
【0089】
実験プロセス：Ｈｅｒ２およびその変異体タンパク質ＱＰ３７３１およびＱＰ３７３２を１ｕｇ／ｍｌで４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄する。２００μＬ／ウェルでブロッキング溶液５％ミルクを加え、３７℃かで１時間インキュベートする。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、サンプルをインキュベートし、２０ｕｇ／ｍｌに従って５倍希釈し、合計七つの購買で希釈し、最後のウェルで１００倍に希釈し、１００μｌ／ウェルで完全に混合し、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、酵素標識抗体の添加：ＨＲＰ－抗ヒトＦａｂ抗体をインキュベートし、１：５０００の希釈率に従って１００μｌ／ウェルをよく混合した後、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで６回洗浄する。基質発色液の添加：１００μＬ／ウェルの用量で基質発色液ＴＭＢを加え、シェーカーに入れ、２００ｒｐｍ、３５℃の暗所で１０分間発色する。
【0090】
終了：発色終了後、１００μＬ／ウェルの用量で停止溶液を速やかに加えて反応を終了させる。検出：マイクロプレートリーダーで、そのＡ４５０ｎｍのＯＤ値を測定し、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
【0091】
実験結果：トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、Ｈｅｒ２ ｗｔに非常によく結合できるが、基本的にＨｅｒ２Ｍ２に結合せず、ＱＰ３４５６３４５７およびペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）は、すべてＨｅｒ２ ｗｔおよびＨｅｒ２Ｍ２に非常によく結合できることを示す（結果は、図１２および図１３に示されたとおりである）。
【0092】
実施例５：ＱＰ３４６２３４６３のＣＤ３８およびＣＳ１活性への結合のＥＬＩＳＡ検出
実験材料：ミルク（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｂ５４８１１７－０５００）；ＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）；ＴＭＢ（洛陽ＢＡＩＡＯＴＯＮＧ実験材料センター、Ｃ０６０２０１）；Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：８．００ｇのＮａＣｌ、０．２０ｇのＫＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を秤量して８００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解し、十分に溶解した後に１Ｌに定量し、ｐＨを７．４に調節し、高温で滅菌して備蓄する。または市販の１０×、２０×ＰＢＳ溶液を購入して１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用する。ブロッキング溶液：５ｇのミルクを秤量してＰＢＳに加え、ブロッキング溶液を調製してすぐに使用する。停止溶液（１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を取り、２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下する。ＴＭＢを３７℃で１０分間発色させ、１００μｌ／ウェルでシェーカーに入れる（１２０ｒｐｍ）。
実験材料：ミルク（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（ＳＡＮＧＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｂ５４８１１７－０５００）；ＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）；ＴＭＢ（洛陽ＢＡＩＡＯＴＯＮＧ実験材料センター、Ｃ０６０２０１）；Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：８．００ｇのＮａＣｌ、０．２０ｇのＫＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を秤量して８００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解し、十分に溶解した後に１Ｌに定量し、ｐＨを７．４に調節し、高温で滅菌して備蓄する。または市販の１０×、２０×ＰＢＳ溶液を購入して１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用する。ブロッキング溶液：５ｇのミルクを秤量してＰＢＳに加え、ブロッキング溶液を調製してすぐに使用する。停止溶液（１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を取り、２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下する。ＴＭＢを３７℃で１０分間発色させ、１００μｌ／ウェルでシェーカーに入れる（１２０ｒｐｍ）。
【0093】
実験プロセス：ＣＤ３８－ＦｃおよびＣＳ１－Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ１ｕｇ／ｍｌで４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄する。２００μＬ／ウェルでブロッキング溶液５％ミルクを加え、３７℃かで１時間インキュベートする。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、サンプルをインキュベートし、２０ｕｇ／ｍｌに従って５倍希釈し、合計七つの購買で希釈し、最後のウェルで１００倍に希釈し、１００μｌ／ウェルで完全に混合し、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、酵素標識抗体の添加：ＨＲＰ－抗ヒトＦａｂ抗体をインキュベートし、１：５０００の希釈率に従って１００μｌ／ウェルをよく混合した後、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで６回洗浄する。基質発色液の添加：１００μＬ／ウェルの用量で基質発色液ＴＭＢを加え、シェーカーに入れ、２００ｒｐｍ、３５℃の暗所で１０分間発色する。終了：発色終了後、１００μＬ／ウェルの用量で停止溶液を速やかに加えて反応を終了させる。検出：マイクロプレートリーダーで、そのＡ４５０ｎｍのＯＤ値を測定し、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
【0094】
実験結果：ＱＰ３４６２３４６３は、ＣＤ３８抗原だけでなく、ＣＳ１抗原にも結合できる（図１４および図１５に示されたとおりである）。
実施例６：ＱＰ３４５６３４５７のＨｅｒ２高発現細胞への結合のＦＡＣＳ検出
実験材料：ＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＯＶ－３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。
実施例６：ＱＰ３４５６３４５７のＨｅｒ２高発現細胞への結合のＦＡＣＳ検出
実験材料：ＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＯＶ－３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。
【0095】
実験方法：
実験プロセス：ＢＴ４７４細胞は、１０％ＦＢＳ、０．１１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウムおよび２．５ｇ／Ｌグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地を使用し、ＳＫ－ＢＲ－３細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）を使用し、ＳＫ－ＯＶ－３細胞は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ′ｓ ５ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）を使用する。３７℃下で５％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、トリプシン消化によって細胞を収集し、各ウェルに１０００００個の細胞ずつ９６ウェルプレートに接種し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで氷上で１時間ブロッキングし、異なる濃度のタンパク質ＱＰ３４５６３４５７および対照タンパク質をインキュベートし、氷上に１時間置き、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦｃ（１：２００）希釈液をインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳで平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
実験プロセス：ＢＴ４７４細胞は、１０％ＦＢＳ、０．１１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウムおよび２．５ｇ／Ｌグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地を使用し、ＳＫ－ＢＲ－３細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）を使用し、ＳＫ－ＯＶ－３細胞は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ′ｓ ５ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）を使用する。３７℃下で５％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、トリプシン消化によって細胞を収集し、各ウェルに１０００００個の細胞ずつ９６ウェルプレートに接種し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで氷上で１時間ブロッキングし、異なる濃度のタンパク質ＱＰ３４５６３４５７および対照タンパク質をインキュベートし、氷上に１時間置き、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦｃ（１：２００）希釈液をインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳで平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
【0096】
実験結果：ＱＰ３４５６３４５７は、ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３およびＳＫ－ＯＶ－３のこれらのＨｅｒ２高発現細胞を非常によく結合でき、結合能力は、陽性対照モノクローナル抗体トラスツズマブおよびペルツズマブの結合能力に近いが、陰性対照抗体は、Ｈｅｒ２高発現細胞に結合できない（図１６～１８に示されたとおりである）。
【0097】
実施例７：Ｈｅｒ２二重特異性抗体によって媒介される増殖阻害
実験目的：腫瘍細胞の増殖対するＨｅｒ２二重特異性抗体の阻害効果を確認すること
実験材料：ＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＯＶ－３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。細胞増殖および毒性検出キット（ＣＣＫ－８）は、ＭＥＩＬＵＮＢｉｏから購入され、カタログ番号は、ＭＡ０２１８であり、ヒトＩｇＧは、Ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号は、Ｉ４５０６であり、他の抗体は、自体で調製される。
実験目的：腫瘍細胞の増殖対するＨｅｒ２二重特異性抗体の阻害効果を確認すること
実験材料：ＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＯＶ－３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。細胞増殖および毒性検出キット（ＣＣＫ－８）は、ＭＥＩＬＵＮＢｉｏから購入され、カタログ番号は、ＭＡ０２１８であり、ヒトＩｇＧは、Ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号は、Ｉ４５０６であり、他の抗体は、自体で調製される。
【0098】
実験プロセス：ＢＴ４７４細胞は、１０％ＦＢＳ、０．１１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウムおよび２．５ｇ／Ｌグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地を使用し、ＳＫ－ＢＲ－３細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）を使用し、ＳＫ－ＯＶ－３細胞は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ′ｓ ５ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）を使用する。３７℃下で、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、トリプシン消化によって細胞を収集し、遠心分離後に１％ＦＢＳを含む培地で再懸濁し、１００００個の細胞で９６ウェルプレートに各ウェル５０μｌ接種し、３７℃下で３時間接着培養し、試験する各抗体を培地で３倍勾配に希釈した後、ウェルあたり５０μｌを細胞懸濁液と均等に混合し、３７℃下で、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間培養し、各ウェルに１０μｌずつＣＣＫ－８試薬を試験する９６ウェルプレートに加え、３７℃下で、５％ＣＯ２インキュベーター中で２時間インキュベートし、９６ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長での吸光度値を検出し、細胞生存率値を計算し、サンプル濃度の対数に対してプロットし、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。四つのパラメーターによって細胞増殖阻害曲線をフィッティングする。
【0099】
実験結果：ＱＰ３４５６３４５７は、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、ＳＫ－ＯＶ－３の増殖に対して顕著な阻害効果を示し、これは、トラスツズマブまたはペルツズマブのモノクローナル抗体および両者の併用よりも優位に優れている（相乗効果ある）（図１９～２１に示されたとおりである）。
【0100】
実施例８：ＨＥＲ２二重特異性抗体によって媒介されるＡＤＣＣ効果
実験目的：ＨＥＲ２二重特異性抗体のＡＤＣＣ効果を確認する。
実験材料：ＰＢＭＣは、上海ＳＡＩＬＹＢｉｏ株式会社から購入され、ＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＯＶ－３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入され、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６ ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ検出キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）から購入される。
実験目的：ＨＥＲ２二重特異性抗体のＡＤＣＣ効果を確認する。
実験材料：ＰＢＭＣは、上海ＳＡＩＬＹＢｉｏ株式会社から購入され、ＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ヒト乳がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入される。ＳＫ－ＯＶ－３細胞（ヒト卵巣がん細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入され、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６ ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ検出キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）から購入される。
【0101】
実験プロセス：ＰＢＭＣを蘇生させ、細胞を収集して翌日に使用するために備蓄する。標的細胞の準備：ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＯＶ－３をトリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで５分間処理する。ＰＢＳで２回洗浄した後、９６ウェルプレートにウェルあたり２００００個の細胞、ウェルあたり５０μｌずつプレーティングし、３７℃下で５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。抗体の準備：培地（１０％ｌｏｗ－ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で１：４に１０個の濃度の抗体（８０ｕｇ／ｍｌ～０．０００５１２ｕｇ／ｍｌ、０ｕｇ／ｍｌ）を連続希釈する。上記で希釈した各濃度の抗体を各ウェルに５０μｌ加え、３７℃下で１５分間インキュベートする。ＰＢＭＣの準備：初日に蘇生したＰＢＭＣを遠心分離し、培地（１０％ｌｏｗ－ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で再懸濁し、カウントする。ＰＢＭＣ：Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ＝３０：１に従って、上記のウェルプレートにウェルあたり５０μｌ加え、３７℃下で４時間インキュベートする。ＬＤＨ検出：最大放出群および体積補正群の場合、４５分前に１０μｌの溶離液を加え、インキュベーターで培養を続ける。４時間培養した後、５０μｌの上清をマイクロタイタープレートに移し、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６ ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）の説明書に従って、５０μｌの試薬を加える。室温下で、暗所で３０分間反応させた後、５０μｌの停止溶液を加える。４９０ｎｍの吸光度値を読み取る（停止溶液を加えた後１時間内に読み取りを完了する）。計算：殺傷率＝（サンプルの放出－標的細胞の自然放出－エフェクター細胞の自然放出）／（標的細胞の最大放出－標的細胞の自然放出）×１００。自然放出（抗体の非存在下でエフェクター細胞とインキュベートされた標的細胞に相当する）を０％細胞毒性と定義し、最大放出（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶出された標的細胞）を１００％細胞毒性と定義する。
【0102】
実験結果：ＱＰ３４５６３４５７は、二つのＨＥＲ２モノクローナル抗体と比較して、ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、ＳＫ－ＯＶ－３腫瘍細胞に対して同等のＡＤＣＣ活性を維持することを示す（図２２～２４に示されたとおりである）。
【0103】
実施例９：Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験
実験材料：Ｍｏ７ｅ細胞（ヒト巨細胞性白血病細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入され、細胞増殖および毒性検出キット（ＣＣＫ－８）は、ＭＥＩＬＵＮＢｉｏから購入され、カタログ番号は、ＭＡ０２１８であり、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、ｐｅｒｐｒｏｔｅｃｈから購入され、カタログ番号は、３００－０３であり、ヒトＩｇＧは、Ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号は、Ｉ４５０６であり、他の抗体は、自体で調製される。
実験材料：Ｍｏ７ｅ細胞（ヒト巨細胞性白血病細胞株）は、中国医学院基礎医学研究所細胞資源センターから購入され、細胞増殖および毒性検出キット（ＣＣＫ－８）は、ＭＥＩＬＵＮＢｉｏから購入され、カタログ番号は、ＭＡ０２１８であり、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、ｐｅｒｐｒｏｔｅｃｈから購入され、カタログ番号は、３００－０３であり、ヒトＩｇＧは、Ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号は、Ｉ４５０６であり、他の抗体は、自体で調製される。
【0104】
実験プロセス：Ｍｏ７ｅ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび８ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用して３７℃下で５％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、Ｍｏ７ｅ細胞を収集し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を捨て、ＧＭ－ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を２回洗浄し、ＧＭ－ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を再懸濁し、かつカウントし、細胞を９６ウェルプレートに２×１０４個、ウェルあたり８０μｌで接種し、３７℃下で５％ＣＯ２インキュベーターで１時間培養し、試験する各抗体を培地で４倍勾配に希釈した後、ウェルあたり２０μｌで細胞懸濁液と均一に混合し、３７℃下で、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間培養し、各ウェルに１０μｌずつＣＣＫ－８試薬を試験する９６ウェルプレートに加え、３７℃下で、５％ＣＯ２インキュベーター中で４時間インキュベートし、９６ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長の吸光度値を検出する。
【0105】
実験結果：Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験により、Ｍｏ７ｅ細胞が適切なＩＬ１５活性を有することを確信された（図２５に示されたとおりである）。
実施例１０：動物薬物効果実験
ＨＥＲ２を高発現するヒト卵巣がん細胞ＳＫ－ＯＶ－３モデルで腫瘍増殖に対するＱＰ３４５６３４５７の阻害効果を評価する。
実施例１０：動物薬物効果実験
ＨＥＲ２を高発現するヒト卵巣がん細胞ＳＫ－ＯＶ－３モデルで腫瘍増殖に対するＱＰ３４５６３４５７の阻害効果を評価する。
【0106】
実験プロセス：ＳＫ－ＯＶ－３細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ＋１０％ＦＢＳ培地で培養される。指数成長期にあるＳＫ－ＯＶ－３細胞を収集し、接種に適した濃度になるまでＰＢＳに再懸濁する。各ＢＡＬＢ／Ｃ－ｎｕｄｅマウスの右背部に１×１０６のＳＫ－ＯＶ－３細胞を皮下接種し、定期的に腫瘍増殖を観察し、腫瘍が平均約５０ｍｍ３の体積に成長したとき、マウスを腫瘍の大きさおよび体重に応じてランダムにグループに分けて投与し（投与体積は、１０ｕｌ／ｇ体重である）、初回投与日は、Ｄ０と定義する。投与計画は次のとおりである。
【0107】
【表8】
【0108】
投与ごとにマウスの体重および腫瘍体積を観察して記録し、ノギスで腫瘍の長径および短径を測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（ａ×ｂ２）の式に計算して、腫瘍増殖の状況を記録し、腫瘍増殖の曲線をプロットする。最後の投与から６日後に観察し、実験データを記録する。
【0109】
実験結果：結果によると、Ｔａｓｔｕｚｕｍａｂ、ペルツズマブ、トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびＱＰ３４５６３４５７は、すべてＳＫ－ＯＶ－３腫瘍の増殖を有意に阻害することができ、腫瘍は、６回の投与後に退縮したことを示し（ＴＧＩｔｖ＞１００％）、これは、ＱＰ３４５６３４５７がより低い用量（モノクローナル抗体用用量の１０％）の前提下で、ｈｕＰＢＭＣ－ｇｒａｆｔ ＮＣＧマウスモデルにおいて依然として有意な腫瘍増殖阻害活性を有することを証明することを示す（図２６および表４に示される）。
【0110】
【表9】
【0111】
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、当業者は、開示されたすべての教示に基づいて、それらの詳細に対して様々な修正および置換を行うことができ、これらの変更は、すべて本発明の範囲内にあることを理解されたい。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって与えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
【国際調査報告】