特表 2023-553014 同種アデノウイルスワクチン接種の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-20

(54)【発明の名称】同種アデノウイルスワクチン接種の方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20231213BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20231213BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 15/861 20060101ALN20231213BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20231213BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231213BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231213BHJP

   C12N 15/19 20060101ALN20231213BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20231213BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20231213BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

A61K35/761

A61P37/04

A61P43/00 105

A61P35/00

A61P33/00

A61P31/10

A61P31/12

A61P31/00

A61P31/04

A61K48/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/39

A61K39/395 U

A61K39/395 D

A61P31/18

A61K38/19

A61K38/20

C12N15/861 Z ZNA

C07K16/28

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/19

C12Q1/6869 Z

C12N7/01

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023534100

(86)(22)【出願日】2021-12-03

(85)【翻訳文提出日】2023-06-29

(86)【国際出願番号】 US2021061876

(87)【国際公開番号】W WO2022120217

(87)【国際公開日】2022-06-09

(31)【優先権主張番号】63/121,164

(32)【優先日】2020-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518213307

【氏名又は名称】グリットストーン バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ヨース カリン

(72)【発明者】

【氏名】スカラン シアラン ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ギトリン レオニド

(72)【発明者】

【氏名】ファーガスン アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】ルソー ラファエル

(72)【発明者】

【氏名】イェレンスキー ロマン

(72)【発明者】

【氏名】サン ジェームス シン

(72)【発明者】

【氏名】デイビス マシュー ジョゼフ

(72)【発明者】

【氏名】ラッパポート エイミー レイチェル

(72)【発明者】

【氏名】パーマー クリスティーヌ デニス

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ08

4B063QQ43

4B063QR08

4B063QR42

4B063QS34

4B063QX02

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA45

4C084AA13

4C084AA19

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA14

4C084MA02

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB321

4C084ZB322

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZB371

4C084ZB372

4C084ZC75

4C085AA03

4C085AA13

4C085AA38

4C085BA02

4C085BA07

4C085BA49

4C085BA51

4C085BB01

4C085BB11

4C085CC01

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085EE06

4C085FF13

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA66

4C087NA13

4C087ZB09

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB32

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZB37

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045EA31

(57)【要約】

ワクチンとしての使用を含む組成物に関連するヌクレオチド、細胞、及び方法であって、同種プライム／ブーストワクチン接種戦略に使用するためのアデノウイルスベクター等の同種プライム／ブーストワクチン接種戦略のためのベクター及び方法を含む、前記ヌクレオチド、細胞、及び方法を開示する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＶ）ベクターを含む組成物を対象に送達するための方法であって、前記方法が、複数の用量の前記組成物を前記対象に投与することを含み、前記複数の用量が少なくとも初回用量及び２回目の用量を含み、前記初回用量と前記２回目の用量の間の期間が少なくとも２７週間である、前記方法。

【請求項2】

チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＶ）ベクターを含む組成物を対象に送達するための方法であって、前記方法が、複数の用量の前記組成物を前記対象に投与することを含み、前記複数の用量が少なくとも初回用量及び２回目の用量を含み、２回目の用量の投与の前にＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価が中和閾値未満であると決定される、前記方法。

【請求項3】

チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＶ）ベクターを含む組成物を対象に送達するための方法であって、
（ａ）前記組成物の初回用量を前記対象に投与すること、
（ｂ）ＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価を決定するかまたは決定しておくこと、及び
（ｃ）ＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価が中和閾値未満であると決定された場合に、前記組成物の２回目の用量を前記対象に投与すること
を含む、前記方法。

【請求項4】

前記初回用量と前記２回目の用量の間の期間が、少なくとも２７週間、少なくとも２８週間、少なくとも２９週間、少なくとも３０週間、少なくとも３１週間、または少なくとも３２週間である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記初回用量がプライミング用量である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記複数の用量が３回以上の用量を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記複数の用量のうちの１回以上が前記初回用量の前に投与される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記初回用量と前記２回目の用量の間に前記組成物の追加の用量が投与されない、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記中和抗体価が、
ＣｈＡｄＶウイルスを５０％中和する、免疫化された前記対象からの血清の最小希釈度として計算されるＮＴ５０値
である、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記中和閾値が、９００以下のＮＴ５０値である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記中和抗体価を決定することが、
（１）免疫化された前記対象からの血清の１つ以上の希釈液を、ＣｈＡｄＶウイルスの中和に十分な条件下で前記ＣｈＡｄＶウイルスと接触させるステップ、及び
（２）中和されていないウイルスと比べて前記ＣｈＡｄＶウイルスの中和を評価するステップ
を含む、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記中和を評価するステップが、前記ＣｈＡｄＶウイルスにより発現されるレポーターコンストラクトの発現を評価することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記中和閾値が、前記２回目の用量における前記ＣｈＡｄＶウイルスの完全中和のための最小中和抗体価である、請求項２～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記中和閾値が、前記対象において前記２回目の用量が免疫応答を誘導する最小中和抗体価である、請求項２～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記ＣｈＡｄＶベクターが、少なくとも１つの抗原をコードする、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記少なくとも１つの抗原が非自己由来ペプチドであり、前記非自己由来ペプチドが前記対象の野生型遺伝子によってコードされない、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記少なくとも１つの抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記腫瘍関連抗原がネオアンチゲンである、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記少なくとも１つの抗原が外来性抗原である、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

前記外来性抗原が、病原体、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫からのものである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記複数の用量の各々が、同じ抗原を含む、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記組成物が（ＩＭ）投与される、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記ＩＭ投与が、別々の注射部位において実施される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記別々の注射部位が、相対する三角筋における注射部位である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記別々の注射部位が、両側の殿筋部位または大腿直筋部位における注射部位である、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記方法には免疫調節物質の投与が含まれないか、または、前記方法が免疫調節物質の非存在下で実施され、
任意選択で、前記免疫調節物質がチェックポイント阻害物質である、
上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

免疫調節物質を投与することをさらに含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項２７または２８に記載の方法。

【請求項30】

前記対象のＨＬＡハプロタイプを決定するかまたは決定しておくことをさらに含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＣｈＡｄＶベクターが、
（ａ）ＣｈＡｄＶ骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ＣｈＡｄＶ骨格、及び
（ｂ）カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、前記エピトープコード核酸配列と、
ｂ．任意選択で５’リンカー配列と、
ｃ．任意選択で３’リンカー配列と
を任意選択で含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列
を含む、前記カセット
を含み、
ここで、前記カセットが、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列及び前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列に機能的に連結されている、
上記方法請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記ＣｈＡｄＶベクターが、
（ａ）ＣｈＡｄＶ骨格であって、
（ｉ）配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む改変ＣｈＡｄＶ６８配列であって、前記ヌクレオチド２～３６，５１８が、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、及び（３）部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠く、前記改変ＣｈＡｄＶ６８配列と、
（ｉｉ）ＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）ＳＶ４０ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、
前記ＣｈＡｄＶ骨格、ならびに
（ｂ）カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、前記エピトープコード核酸配列と、
ｂ．任意選択で５’リンカー配列と、
ｃ．任意選択で３’リンカー配列と
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列
を含む、前記カセット
を含み、
ここで、前記カセットが前記Ｅ１欠失内に挿入されており、かつ前記カセットが、前記ＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列及び前記ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列に機能的に連結されている、
上記方法請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記エピトープコード核酸配列が、細胞の表面にＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩによって提示されることが既知であるかまたは疑われているエピトープをコードし、任意選択で、前記細胞の表面が腫瘍細胞表面または感染細胞表面であり、任意選択で、前記細胞が前記対象の細胞である、上記方法請求項３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、エピトープへの抗原プロセシングを受けることができるポリペプチド配列をコードし、任意選択で、前記エピトープが、細胞の表面にＭＨＣクラスＩによって提示されることが知られているかまたは疑われており、任意選択で、前記細胞の表面が腫瘍細胞表面または感染細胞表面である、上記方法請求項３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞が、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵がん、脳腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、非小細胞肺がん、及び小細胞肺がんからなる群から選択される腫瘍細胞であるか、または
前記細胞が、病原体感染細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、真菌感染細胞、及び寄生虫感染細胞からなる群から選択される感染細胞である、
請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ウイルス感染細胞がＨＩＶ感染細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記エピトープコード核酸配列が、ＨＩＶ ＧＡＧタンパク質またはエピトープをコードする、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ＣｈＡｄＶベクター中の前記カセットの各要素の順番に並べられた配列が、５’から３’方向へ、以下：
Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ－Ｇ３_ｇ
を含む式で表され、
式中、
Ｐは、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている前記少なくとも１つのプロモーター配列を含み、ａ＝１であり、
Ｎは、前記エピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｃ＝１であり、
Ｌ５は前記５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、
Ｌ３は前記３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、
Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、
Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、
Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、
Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮ_ｃはエピトープコード核酸配列であり、
Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵ_ｆはＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である、
上記方法請求項３１または３３～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

各Ｘについて、前記対応するＮ_ｃが、別個のエピトープコード核酸配列である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

各Ｙについて、前記対応するＵ_ｆが、別個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１０、Ｙ＝２であり、
ＰがＣＭＶプロモーター配列であり、
各Ｎが、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、
Ｌ５が、前記エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、前記５’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、
Ｌ３が、前記エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、前記３’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、
Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列の各々であり、
前記ＣｈＡｄＶベクターが、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む改変ＣｈＡｄＶ６８配列を含み、ここで、前記ヌクレオチド２～３６，５１８が、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、及び（３）部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠き、ネオアンチゲンカセットが前記Ｅ１欠失内に挿入されており、かつ
Ｉ抗原コード核酸配列の各々が、２５アミノ酸長であるポリペプチドをコードする、
上記方法請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記カセットが、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列の間に組み込まれている、上記方法請求項３１または３３～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記カセットに機能的に連結されている、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記ＣｈＡｄＶ骨格がＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格を含む、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、ＣｈＡｄＶ６８ゲノムに関してまたは配列番号１に示される配列に関して、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における機能欠失を含み、任意選択で、アデノウイルス骨格または改変ＣｈＡｄＶ６８配列が、アデノウイルスゲノムに関して、または配列番号１に示される配列に関して、（１）Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂにおいて、または（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、及びＥ３において完全に欠失しているかまたは機能的に欠失しており、任意選択で、Ｅ１遺伝子が、配列番号１に示される配列に関して、少なくともヌクレオチド５７７～３４０３のＥ１欠失を介して機能的に欠失しており、任意選択で、Ｅ３遺伝子が、配列番号１に示される配列に関して、少なくともヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５のＥ３欠失を介して機能的に欠失している、請求項４４または４５に記載の方法。

【請求項47】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、ＣｈＡｄＶ６８ゲノムに関して、または配列番号１に示される配列に関して、１つ以上の遺伝子または制御配列を含み、任意選択で、前記１つ以上の遺伝子または制御配列が、チンパンジーアデノウイルス末端逆位反復（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される、請求項４４または４５に記載の方法。

【請求項48】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、部分的に欠失したＥ４遺伝子を含む、請求項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記部分的に欠失したＥ４遺伝子が、
Ａ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列、
Ｂ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３４，９４２、ヌクレオチド３４，９５２～３５，３０５、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，３０２～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列であって、前記ベクターが、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む、前記Ｅ４遺伝子配列、
Ｃ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９８０～３６，５１６を欠く、Ｅ４遺伝子配列であって、前記ベクターが、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む、前記Ｅ４遺伝子配列、
Ｄ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９７９～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列であって、前記ベクターが、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む、前記Ｅ４遺伝子配列、
Ｅ．Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ３、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失、
Ｆ．Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、Ｅ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失、
Ｇ．Ｅ４Ｏｒｆ１の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ２、及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失、または
Ｈ．Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失
を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、前記ヌクレオチド２～３６，５１８が、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、及び（３）部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠き、任意選択で、抗原カセットが前記Ｅ１欠失内に挿入されている、請求項４４に記載の方法。

【請求項51】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号２９３６９に記載の配列を含み、任意選択で、抗原カセットが前記Ｅ１欠失内に挿入されている、請求項４４に記載の方法。

【請求項52】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、前記ヌクレオチド２～３６，５１８が、
Ａ．Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、
Ｂ．Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、
Ｃ．部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２、
Ｄ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド４５６～３０１４、
Ｅ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，８１６～３１，３３３、
Ｆ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド３９５７～１０３４６、
Ｇ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド２１７８７～２３３７０、
Ｈ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド３３４８６～３６１９３、または
それらの組み合わせ
を欠く、請求項４４に記載の方法。

【請求項53】

前記ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格が、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、前記ヌクレオチド２～３６，５１８が、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、及び（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠く、請求項４４に記載の方法。

【請求項54】

前記カセットが、Ｅ１領域にて、Ｅ３領域にて、及び／または前記カセットの組み込みを可能にする任意の欠失ＡｄＶ領域にて前記ＣｈＡｄＶ骨格内に挿入されている、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記ＣｈＡｄＶ骨格が、第一世代、第二世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターのうちの１つから作製される、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、ＣＭＶプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ＥＦ－１プロモーター配列、ＲＳＶプロモーター配列、ＰＧＫプロモーター配列、ＨＳＡプロモーター配列、ＭＣＫプロモーター配列、及びＥＢＶプロモーター配列からなる群から選択される、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列がＣＭＶプロモーター配列である、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つが、発現及び翻訳された場合に前記対象の細胞上にＭＨＣクラスＩによって提示され得るエピトープをコードする、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つが、発現及び翻訳された場合に前記対象の細胞上にＭＨＣクラスＩＩによって提示され得るエピトープをコードする、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、２個以上の抗原コード核酸配列を含む、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

各抗原コード核酸配列が、リンカーをコードする核酸配列により別個の抗原コード核酸配列に連結されている、上記方法請求項３１～４０または４２～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記リンカーが、２つのエピトープコード核酸配列を連結するか、またはエピトープコード核酸配列をＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列に連結する、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記リンカーが、
（１）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するグリシン残基、（２）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するアラニン残基、（３）２つのアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳類のプロテアソームによって効率的にプロセシングされる、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基のコンセンサス配列、及び（６）起源同族のタンパク質に由来する抗原に隣接し、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０アミノ酸残基である、１つ以上の天然配列
からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記リンカーが、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を連結するか、またはＭＨＣクラスＩＩ配列をエピトープコード核酸配列に連結する、請求項６２に記載の方法。

【請求項66】

前記リンカーが配列ＧＰＧＰＧを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記抗原コード核酸配列が、前記抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞輸送、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を増強させる分離したまたは連続した配列に機能的にまたは直接、連結されている、上記方法請求項３１～４０または４２～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変されたユビキチン配列（例えば、前記ユビキチン配列が、７６位でのＧｌｙからＡｌａへの置換を含有する）、免疫グロブリンシグナル配列（例えば、ＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列、のうちの少なくとも１つを含み、任意選択で、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変化を含み、前記変化により、翻訳された対応する野生型核酸配列と比べて、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有する、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変化を含み、前記変化により、翻訳された対応する野生型核酸配列と比べて、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有する、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変化を含み、前記変化により、翻訳された対応する野生型核酸配列と比べて、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレル上での増大した提示の可能性を有する、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記少なくとも１つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、または、プロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

前記エピトープコード核酸配列が、がんを有することがわかっているかまたは疑われている対象において発現することが既知であるかまたは疑われているエピトープをコードする、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記がんが固形腫瘍を含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記がんが、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵がん、膀胱がん、脳腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、非小細胞肺がん、及び小細胞肺がんからなる群から選択される、請求項７３または７４に記載の方法。

【請求項76】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも２～１０、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする、上記方法請求項３１～４０または４２～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする、上記方法請求項３１～４０または４２～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含む、上記方法請求項３１～４０または４２～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも２～４００個の抗原コード核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうち少なくとも２個が、細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示されるエピトープ配列またはそれらの部分をコードする、上記方法請求項３１～４０または４２～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

ＭＨＣクラスＩエピトープのうち少なくとも２つが、腫瘍細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示される、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、８～３５アミノ酸長、任意選択で、９～１７、９～２５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする、上記方法請求項３１～４０または４２～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在する、上記方法請求項３１～４０または４２～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、存在し、かつ、少なくとも１つの変化を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、前記変化が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、上記方法請求項３１～４０または４２～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記エピトープコード核酸配列がＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、１２～２０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする、上記方法請求項３１～４０または４２～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

前記エピトープコード核酸配列がＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列が破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む、上記方法請求項３１～４０または４２～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ＳＶ４０ポリＡ配列を含む、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０個の連続するＡヌクレオチドである、請求項３１、３３～４０、または４２～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも１００個の連続するＡヌクレオチドである、上記方法請求項３１、３３～４０、または４２～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

前記カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）の配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フーリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、ｍＲＮＡの核外輸送、安定性、もしくは翻訳効率を増強させることが知られており前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている５’もしくは３’の非コード領域内の配列、のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項92】

前記カセットがレポーター遺伝子をさらに含み、前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むが、これらに限定されない、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項93】

前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

１つ以上の前記ベクターが、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項95】

前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異的であるかもしくは複数の特異性を一緒に連結させた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科の動物の抗体ドメイン）、または全長一本鎖抗体（例えば、重鎖と軽鎖が可動性リンカーによって連結されている全長ＩｇＧ）である、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記抗体の重鎖配列及び軽鎖配列が、２Ａ等の自己切断配列もしくはＩＲＥＳのいずれかで区切られている連続した配列であるか、または前記抗体の重鎖配列及び軽鎖配列が、連続するグリシン残基等の可動性リンカーによって連結されている、請求項９５または９６に記載の方法。

【請求項98】

前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項９４に記載の方法。

【請求項99】

前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１またはそれら各々のバリアントのうちの少なくとも１つである、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

少なくとも１つのエピトープコード核酸配列が、
（ａ）腫瘍、感染細胞、または感染症生物から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、前記ヌクレオチド配列決定データが、抗原のセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、前記取得するステップ、
（ｂ）各抗原の前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、細胞表面に、任意選択で腫瘍細胞表面または感染細胞表面にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって前記抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成するステップ、及び
（ｃ）前記少なくとも１つのエピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択された抗原のセットを生成するために、前記数値的尤度のセットに基づいて前記抗原のセットのサブセットを選択するステップ
を実施することによって選択される、上記方法請求項３１～４０または４２～９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項101】

前記エピトープコード核酸配列の各々が、
（ａ）腫瘍、感染細胞、または感染症生物から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、前記ヌクレオチド配列決定データが、抗原のセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、前記取得するステップ、
（ｂ）各抗原の前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、細胞表面に、任意選択で腫瘍細胞表面または感染細胞表面にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって前記抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成するステップ、及び
（ｃ）少なくとも２０個の前記エピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択された抗原のセットを生成するために、前記数値的尤度のセットに基づいて前記抗原のセットのサブセットを選択するステップ
を実施することによって選択される、請求項４１に記載の方法。

【請求項102】

選択されたエピトープのセットの数が２～２０である、請求項１００に記載の方法。

【請求項103】

前記提示モデルが、
（ａ）前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置における特定のアミノ酸との対の存在と、
（ｂ）前記対の前記ＭＨＣアレルのうちの前記特定の１つによる、細胞表面での、任意選択で腫瘍細胞表面または感染細胞表面での、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の提示の可能性と
の間の依存性を表す、請求項１００～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項104】

選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて前記細胞表面に提示される可能性が増大している抗原を選択することを含み、任意選択で、前記選択された抗原が、１つ以上の特定のＨＬＡアレルによって提示されると確認されている、請求項１００～１０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

選択されたエピトープのセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答の誘導能がある可能性が増大しているエピトープを選択することを含む、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的または感染症特異的な免疫応答の誘導能がある可能性が増大している抗原を選択することを含む、請求項１００～１０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に提示される能力がある可能性が増大している抗原を選択することを含み、任意選択で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、請求項１００～１０６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項108】

選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害を受ける可能性が減少している抗原を選択することを含む、請求項１００～１０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項109】

選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答の誘導能がある可能性が減少している抗原を選択することを含む、請求項１００～１０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項110】

エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチド配列決定データが、腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、感染細胞、または感染症生物においてシークエンシングを実施することによって取得される、請求項１００～１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記シークエンシングが次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシング手法である、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記カセットが、前記カセット内の隣接配列によって形成される接合部エピトープ配列を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項113】

少なくとも１つまたはそれぞれの接合部エピトープ配列が、ＭＨＣに対する５００ｎＭ超の親和性を有する、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

各接合部エピトープ配列が非自己である、請求項１１２または１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記ＭＨＣクラスＩエピトープの各々が、集団の少なくとも５％に存在する少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があると予測または確認される、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項116】

前記ＭＨＣクラスＩエピトープの各々が、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があると予測または確認され、抗原／ＨＬＡの各対の、集団における抗原／ＨＬＡ保有率が少なくとも０．０１％である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項117】

前記ＭＨＣクラスＩエピトープの各々が、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があると予測または確認され、抗原／ＨＬＡの各対の、集団における抗原／ＨＬＡ保有率が少なくとも０．１％である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項118】

前記カセットが、翻訳された野生型核酸配列を含む非治療的なＭＨＣクラスＩエピトープ核酸配列もクラスＩＩエピトープ核酸配列もコードせず、ここで、前記非治療的なエピトープが、前記対象のＭＨＣアレルに提示されると予測される、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項119】

予測される前記非治療的なＭＨＣクラスＩエピトープ核酸配列またはクラスＩＩエピトープ配列が、前記カセット内の隣接配列によって形成される接合部エピトープ配列である、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記予測が、前記非治療的なエピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づく、請求項１１２～１１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項121】

前記カセット内の前記抗原コード核酸配列の順序が、
（ａ）前記抗原コード核酸配列の様々な順序に対応する候補カセット配列のセットを生成すること、
（ｂ）各候補カセット配列について、前記候補カセット配列における非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定すること、及び
（ｃ）抗原ワクチンのカセット配列として、所定の閾値を下回る提示スコアと関連する候補カセット配列を選択すること
を含む一連のステップによって決定される、上記方法請求項１１２～１２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項122】

前記組成物が、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化されている、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項123】

前記組成物が、前記ＣｈＡｄＶベクターを含むウイルス粒子を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項124】

前記エピトープコード核酸配列のうちの１つ以上が、前記対象の腫瘍に由来する、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項125】

前記エピトープコード核酸配列の各々が、前記対象の腫瘍に由来する、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項126】

前記エピトープコード核酸配列のうちの１つ以上が、前記対象の腫瘍に由来しない、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項127】

前記エピトープコード核酸配列の各々が、前記対象の腫瘍に由来しない、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項128】

前記エピトープコード核酸配列が、配列番号５７～２９，３６４からなる群から選択されるエピトープを含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項129】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも、
（Ａ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、配列番号１４，９５４、１９，８４８、及び１９，８５０からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、配列番号１９，７４９、１９，８６５、及び１９，８６３からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、ならびに
（Ｃ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、配列番号１９，９７６、１９，７７９、１１，４９５、及び１９，９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
の各々を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項130】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、
（Ａ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｃ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｄ）ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｅ）ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｆ）ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｇ）ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
またはそれらの組み合わせ
を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項131】

自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系を投与することをさらに含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項132】

前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための前記組成物が（ＩＭ）投与される、請求項１３１または１３２に記載の方法。

【請求項134】

前記ＩＭ投与が、別々の注射部位において実施される、請求項１３３に記載の方法。

【請求項135】

前記別々の注射部位が、相対する三角筋の注射部位である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記別々の注射部位が、両側の殿筋部位または大腿直筋部位の注射部位である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項137】

１つ以上のブースト用量の前記注射部位が、前記プライミング用量の前記注射部位に可能な限り近い、請求項１３３～１３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項138】

前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための前記組成物が、
（Ａ）前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系であって、前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系が、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに
（ｂ）カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、前記エピトープコード核酸配列と、
ｂ．任意選択で５’リンカー配列と、
ｃ．任意選択で３’リンカー配列と
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列、
（ｉｉ）任意選択で、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列に機能的に連結されている第２のプロモーターヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）任意選択で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記アルファウイルスにとって天然ポリ（Ａ）配列であるかまたは外因性ポリ（Ａ）配列である、前記第２のポリ（Ａ）配列
を含む、前記カセット
を含む、前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系、ならびに
（Ｂ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系を内包する、前記ＬＮＰ
を含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項139】

前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための前記組成物が、
（Ａ）前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系であって、前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系が、１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、配列番号６に記載の核酸配列を含み、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格配列が、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列を含み、前記２６Ｓプロモーター配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性であり、前記ポリ（Ａ）配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性である、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格、及び
（ｂ）前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ（Ａ）配列の間に組み込まれているカセットであって、
前記カセットが、前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、かつ、前記カセットが、少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含み、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、
ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、前記エピトープコード核酸配列と、
ｂ．任意選択で５’リンカー配列と、
ｃ．任意選択で３’リンカー配列と
を含む、
前記カセット
を含む、前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系、ならびに
（Ｂ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系を内包する、前記ＬＮＰ
を含む、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項140】

前記ＣｈＡｄＶベクターの前記カセットが、前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための前記組成物の前記カセットと同一である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項141】

前記自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための前記組成物における前記カセットの各要素の順番に並べられた配列が、５’から３’方向へ、以下：
Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ－Ｇ３_ｇ
を含む式で表され、
式中、
Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ａ＝０または１であり、
Ｎは、前記エピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｃ＝１であり、
Ｌ５は前記５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、
Ｌ３は前記３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、
Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、
Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、
Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、
Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮ_ｃはエピトープコード核酸配列であり、
Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵ_ｆはＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である、
上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項142】

各Ｘについて、前記対応するＮ_ｃが、別個のエピトープコード核酸配列である、請求項１４１に記載の方法。

【請求項143】

各Ｙについて、前記対応するＵ_ｆが、別個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である、請求項１４１または１４２に記載の方法。

【請求項144】

ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、
前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって提供される単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、
前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって提供される少なくとも１００個の連続するＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、
前記カセットが、前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ（Ａ）配列の間に組み込まれており、ここで、前記カセットが、前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及び前記ポリ（Ａ）配列に機能的に連結されており、
各Ｎが、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、
Ｌ５が、前記エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、前記５’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、
Ｌ３が、前記エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、前記３’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、
Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列の各々であり、
前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、配列番号６に記載の配列であり、かつ
前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の各々が、１３～２５アミノ酸長であるポリペプチドをコードする、
上記方法請求項１４１～１４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項145】

前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質、ホスファチジルコリン、コレステロール、ＰＥＧベースのコート脂質、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項146】

前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧベースのコート脂質を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項147】

前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート）分子を含む、請求項１４５または１４６に記載の方法。

【請求項148】

前記ＬＮＰに内包された発現系が約１００ｎｍの直径を有する、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項149】

前記カセットが、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列の間に組み込まれている、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項150】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記カセットに機能的に連結されている、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項151】

前記１つ以上のベクターが、１つ以上のプラス鎖ＲＮＡベクターを含む、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項152】

前記１つ以上のプラス鎖ＲＮＡベクターが、５’の７－メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記１つ以上のプラス鎖ＲＮＡベクターがインビトロ転写により生成される、請求項１５１または１５２に記載の方法。

【請求項154】

前記１つ以上のベクターが哺乳類細胞内で自己複製する、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項155】

前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、アウラウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項156】

前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項157】

前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、少なくとも、
前記アウラウイルス、前記フォートモーガンウイルス、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルス、前記ロスリバーウイルス、前記セムリキ森林ウイルス、前記シンドビスウイルス、または前記マヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子
を含む、請求項１５５または１５６に記載の方法。

【請求項158】

前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、少なくとも、
前記アウラウイルス、前記フォートモーガンウイルス、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルス、前記ロスリバーウイルス、前記セムリキ森林ウイルス、前記シンドビスウイルス、または前記マヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列
を含む、請求項１５５または１５６に記載の方法。

【請求項159】

非構造タンパク質媒介性増幅のための配列が、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、２４ｎｔ ＣＳＥ、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列、１９ｎｔ ＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５７または１５８に記載の方法。

【請求項160】

前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、構造ビリオンタンパク質カプシドであるＥ２及びＥ１をコードしない、上記方法請求項１５７～１５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項161】

前記カセットが、前記アウラウイルス、前記フォートモーガンウイルス、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルス、前記ロスリバーウイルス、前記セムリキ森林ウイルス、前記シンドビスウイルス、または前記マヤロウイルスのヌクレオチド配列内に構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、請求項１６０に記載の方法。

【請求項162】

前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、配列番号３または配列番号５の配列を含む、請求項１５５または１５６に記載の方法。

【請求項163】

前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対７５４４と１１１７５の間の欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む、請求項１５５または１５６に記載の方法。

【請求項164】

前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む、請求項１６３に記載の方法。

【請求項165】

前記カセットが、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５の間の欠失を置き換えるように７５４４位に挿入されている、請求項１６３または１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記カセットの挿入が、ｎｓＰ１～４遺伝子と少なくとも１つの前記核酸配列とを含むポリシストロン性ＲＮＡの転写を提供し、前記ｎｓＰ１～４遺伝子及び少なくとも１つの前記核酸配列が、別々のオープンリーディングフレーム中に存在する、請求項１６１～１６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項167】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によってコードされる天然２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項168】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が外因性ＲＮＡプロモーターである、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項169】

前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項170】

前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写を提供する、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項171】

前記１つ以上のベクターがそれぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項172】

前記１つ以上のベクターがそれぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項173】

前記１つ以上のベクターがそれぞれ２ｋｂのサイズである、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項174】

前記１つ以上のベクターがそれぞれ５ｋｂ未満のサイズである、上記方法請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項175】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、２個以上の抗原コード核酸配列を含む、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項176】

各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項１７５に記載の方法。

【請求項177】

各抗原コード核酸配列が、リンカーをコードする核酸配列により別個の抗原コード核酸配列に連結されている、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項178】

前記リンカーが、２つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を連結するか、またはＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列をＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列に連結する、請求項１７７に記載の方法。

【請求項179】

前記リンカーが、
（１）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するグリシン残基、（２）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するアラニン残基、（３）２つのアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳類のプロテアソームによって効率的にプロセシングされる、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基のコンセンサス配列、及び（６）起源同族のタンパク質に由来する抗原に隣接し、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０アミノ酸残基である、１つ以上の天然配列
からなる群から選択される、請求項１７８に記載の方法。

【請求項180】

前記リンカーが、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を連結するか、またはＭＨＣクラスＩＩ配列をＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列に連結する、請求項１７７に記載の方法。

【請求項181】

前記リンカーが配列ＧＰＧＰＧを含む、請求項１８０に記載の方法。

【請求項182】

前記抗原コード核酸配列が、前記抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞輸送、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を増強させる分離したまたは連続した配列に機能的にまたは直接、連結されている、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項183】

前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変されたユビキチン配列（例えば、前記ユビキチン配列が、７６位でのＧｌｙからＡｌａへの置換を含有する）、免疫グロブリンシグナル配列（例えば、ＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列、のうちの少なくとも１つを含み、任意選択で、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である、請求項１８２に記載の方法。

【請求項184】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも２～１０、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項185】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項186】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含む、請求項１３８～１４３または１４５～１８３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項187】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも２～４００個の抗原コード核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうち少なくとも２個が、細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示されるエピトープ配列またはそれらの部分をコードする、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項188】

前記ＭＨＣクラスＩエピトープのうち少なくとも２つが、前記腫瘍細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示される、請求項１４４に記載の組成物。

【請求項189】

前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、８～３５アミノ酸長、任意選択で、９～１７、９～２５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項190】

前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在する、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項191】

前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、存在し、かつ、少なくとも１つの変化を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、前記変化が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、上記方法請求項１４１～１４３または１４５～１８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項192】

前記エピトープコード核酸配列がＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、１２～２０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１９１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項193】

前記エピトープコード核酸配列がＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列が破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～１９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項194】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項195】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項196】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスにとって天然のポリ（Ａ）配列を含む、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項197】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスにとって外因性のポリ（Ａ）配列を含む、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項198】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも１つの前記核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項199】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０個の連続するＡヌクレオチドである、請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項200】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも１００個の連続するＡヌクレオチドである、上記方法請求項１３８、１４０～１４３、または１４５～１９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項201】

前記エピトープコード核酸配列がＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列が、
（ａ）前記腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、前記腫瘍ヌクレオチド配列決定データが、エピトープのセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、前記取得するステップ、
（ｂ）各エピトープの前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記腫瘍の腫瘍細胞表面に前記ＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって前記エピトープの各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成するステップ、及び
（ｃ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択されたエピトープのセットを生成するために、前記数値的尤度のセットに基づいて前記エピトープのセットのサブセットを選択するステップ
を実施することによって選択される、上記方法請求項１３８～１４３または１４５～２００のいずれか１項に記載の方法。

【請求項202】

前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の各々が、
（ａ）前記腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、前記腫瘍ヌクレオチド配列決定データが、エピトープのセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、前記取得するステップ、
（ｂ）各エピトープの前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記腫瘍の腫瘍細胞表面に前記ＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって前記エピトープの各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成するステップ、及び
（ｃ）少なくとも２０個の前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択されたエピトープのセットを生成するために、前記数値的尤度のセットに基づいて前記エピトープのセットのサブセットを選択するステップ
を実施することによって選択される、請求項１４４に記載の方法。

【請求項203】

前記選択されたエピトープのセットの数が２～２０である、請求項２０１に記載の方法。

【請求項204】

前記提示モデルが、
（ａ）前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置における特定のアミノ酸との対の存在と、
（ｂ）前記対の前記ＭＨＣアレルのうちの前記特定の１つによる、前記腫瘍細胞表面での、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の提示の可能性と
の間の依存性を表す、請求項２０１～２０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項205】

選択されたエピトープのセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて前記腫瘍細胞表面に提示される可能性が増大しているエピトープを選択することを含む、請求項２０１～２０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項206】

選択されたエピトープのセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答の誘導能がある可能性が増大しているエピトープを選択することを含む、請求項２０１～２０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項207】

選択されたエピトープのセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に提示される能力がある可能性が増大しているエピトープを選択することを含み、任意選択で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、請求項２０１～２０６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項208】

選択されたエピトープのセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害を受ける可能性が減少しているエピトープを選択することを含む、請求項２０１～２０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項209】

選択されたエピトープのセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答の誘導能がある可能性が減少しているエピトープを選択することを含む、請求項２０１～２０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項210】

エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチド配列決定データが、前記腫瘍組織においてシークエンシングを実施することによって取得される、請求項２０１～２０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項211】

前記シークエンシングが次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシング手法である、請求項２１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１２月３日に出願された米国特許仮出願第６３／１２１，１６４号の利益を主張するものであり、あらゆる目的のために参照することによりその全体が本発明に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月３日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＧＳＯ－０９６＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前であり、サイズが６，９２５，５４７バイトである。

【背景技術】

【0003】

背景
腫瘍特異抗原に基づく治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として大いに有望である。^１～３例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び黒色腫等の遺伝子変異量の高いがんは特に、ネオアンチゲン生成の可能性が比較的高いことから、そのような治療法の魅力的な標的である。^４、５初期の証拠では、ネオアンチゲンに基づくワクチン接種がＴ細胞応答を誘発することができること^６、及びネオアンチゲン標的細胞療法が特定の患者においてある特定の状況下で腫瘍退縮を生じさせ得ること^７が示されている。

【0004】

がん及び感染症のいずれの状況においても抗原ワクチン設計に関する問題の１つは、存在する多くのコード変異のうちどれが「最良の」治療用抗原、例えば、免疫を誘発することができる抗原を生成するのかということである。

【0005】

現在の抗原予測方法の課題に加え、多くがヒトに由来する、ヒトにおける抗原送達に使用することができる利用可能なベクター系に関しても、ある特定の課題が存在する。例えば、多くのヒトは、それまでの自然曝露の結果として、ヒトウイルスに対する既存の免疫を有しており、この免疫が、がん治療または感染症に対するワクチン接種等の、ワクチン接種戦略における抗原送達のための組換えヒトウイルスの使用に対する大きな障害となり得る。上記問題に対処するワクチン接種戦略でいくらかの前進が見られるが、特に、臨床応用のためには依然として改善、例えば、ワクチンの効力及び有効性の改善が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

概要
本明細書では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＶ）ベクターを含む組成物を対象に送達するための方法であって、方法が、複数の用量の組成物を対象に投与することを含み、複数の用量が少なくとも初回用量及び２回目の用量を含み、初回用量と２回目の用量の間の期間が少なくとも２７週間である、方法を開示する。

【0007】

また、本明細書では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＶ）ベクターを含む組成物を対象に送達するための方法であって、方法が、複数の用量の組成物を対象に投与することを含み、複数の用量が少なくとも初回用量及び２回目の用量を含み、２回目の用量の投与の前にＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価が中和閾値未満であると決定される、方法も開示する。

【0008】

また、本明細書では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＶ）ベクターを含む組成物を対象に送達するための方法であって、（ａ）組成物の初回用量を対象に投与すること、（ｂ）ＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価を決定するかまたは決定しておくこと、及び（ｃ）ＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価が中和閾値未満であると決定された場合に、組成物の２回目の用量を対象に投与すること、を含む、方法も開示する。

【0009】

いくつかの態様では、初回用量と２回目の用量の間の期間は、少なくとも２７週間、少なくとも２８週間、少なくとも２９週間、少なくとも３０週間、少なくとも３１週間、または少なくとも３２週間である。

【0010】

いくつかの態様では、初回用量はプライミング用量である。

【0011】

いくつかの態様では、複数の用量は、３回以上の用量を含む。いくつかの態様では、複数の用量のうちの１回以上は、初回用量の前に投与される。

【0012】

いくつかの態様では、初回用量と２回目の用量の間に組成物の追加の用量は投与されない。

【0013】

いくつかの態様では、中和抗体価は、ＣｈＡｄＶウイルスを５０％中和する、免疫化された対象からの血清の最小希釈度として計算されるＮＴ５０値である。いくつかの態様では、中和閾値は、９００以下のＮＴ５０値である。いくつかの態様では、中和抗体価を決定することは、（１）免疫化された対象からの血清の１つ以上の希釈液を、ＣｈＡｄＶウイルスの中和に十分な条件下でＣｈＡｄＶウイルスと接触させるステップ、及び（２）中和されていないウイルスと比べてＣｈＡｄＶウイルスの中和を評価するステップを含む。いくつかの態様では、中和を評価するステップは、ＣｈＡｄＶウイルスにより発現されるレポーターコンストラクトの発現を評価することを含む。

【0014】

いくつかの態様では、中和閾値は、２回目の用量におけるＣｈＡｄＶウイルスの完全中和のための最小中和抗体価である。いくつかの態様では、中和閾値は、２回目の用量が対象において免疫応答を誘導する最小中和抗体価である。

【0015】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶベクターは、少なくとも１つの抗原をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原は非自己由来ペプチドであり、非自己由来ペプチドは対象の野生型遺伝子によってコードされない。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原は腫瘍関連抗原である。いくつかの態様では、腫瘍関連抗原はネオアンチゲンである。

【0016】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原は外来性抗原である。いくつかの態様では、外来性抗原は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫からのものである。

【0017】

いくつかの態様では、複数の用量の各々は同じ抗原を含む。

【0018】

いくつかの態様では、組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される。いくつかの態様では、組成物は、（ＩＭ）投与される。いくつかの態様では、ＩＭ投与は、別々の注射部位において実施される。いくつかの態様では、別々の注射部位は、相対する三角筋における注射部位である。いくつかの態様では、別々の注射部位は、両側の殿筋部位または大腿直筋部位における注射部位である。

【0019】

いくつかの態様では、方法には免疫調節物質の投与が含まれないか、または方法が免疫調節物質の非存在下で実施され、任意選択で、免疫調節物質はチェックポイント阻害物質である。

【0020】

いくつかの態様では、方法はさらに、免疫調節物質を投与することを含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合断片である。

【0021】

いくつかの態様では、方法はさらに、対象のＨＬＡハプロタイプを決定するかまたは決定しておくことを含む。

【0022】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶベクターは、（ａ）ＣｈＡｄＶ骨格であって、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、を含む、ＣｈＡｄＶ骨格、ならびに（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、エピトープコード核酸配列、ｂ．任意選択で５’リンカー配列、及びｃ．任意選択で３’リンカー配列、を任意選択で含む、少なくとも１つの抗原コード核酸配列、を含む、カセット、を含み、ここで、カセットが、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列及び少なくとも１つのポリ（Ａ）配列に機能的に連結されている。

【0023】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶベクターは、（ａ）ＣｈＡｄＶ骨格であって、（ｉ）配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む改変ＣｈＡｄＶ６８配列であって、ヌクレオチド２～３６，５１８が、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、及び（３）部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠く、改変ＣｈＡｄＶ６８配列、（ｉｉ）ＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、を含む、ＣｈＡｄＶ骨格、ならびに（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、エピトープコード核酸配列、ｂ．任意選択で５’リンカー配列、及びｃ．任意選択で３’リンカー配列、を含む、少なくとも１つの抗原コード核酸配列、を含む、カセット、を含み、ここで、カセットがＥ１欠失内に挿入されており、かつカセットが、ＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列及びＳＶ４０ポリ（Ａ）配列に機能的に連結されている。

【0024】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、細胞の表面にＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩによって提示されることが既知であるかまたは疑われているエピトープをコードし、任意選択で、細胞の表面は腫瘍細胞表面または感染細胞表面であり、任意選択で、細胞は対象の細胞である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、エピトープへの抗原プロセシングを受けることができるポリペプチド配列をコードし、任意選択で、エピトープは、細胞の表面にＭＨＣクラスＩによって提示されることが知られているかまたは疑われており、任意選択で、細胞の表面は腫瘍細胞表面または感染細胞表面である。いくつかの態様では、細胞は、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵がん、脳腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、非小細胞肺がん、及び小細胞肺がんからなる群から選択される腫瘍細胞であるか、または細胞は、病原体感染細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、真菌感染細胞、及び寄生虫感染細胞からなる群から選択される感染細胞である。

【0025】

いくつかの態様では、ウイルス感染細胞はＨＩＶ感染細胞である。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、ＨＩＶ ＧＡＧタンパク質またはエピトープをコードする。

【0026】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶベクター中のカセットの各要素の順番に並べられた配列は、５’から３’方向へ、以下：
Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ－Ｇ３_ｇ
を含む式で表され、
式中、Ｐは、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている少なくとも１つのプロモーター配列を含み、ａ＝１であり、Ｎはエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮ_ｃはエピトープコード核酸配列であり、Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵ_ｆはＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である。

【0027】

いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮ_ｃは別個のエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵ_ｆは別個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である。

【0028】

いくつかの態様では、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１０、Ｙ＝２であり、ＰはＣＭＶプロモーター配列であり、各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、５’リンカー配列は、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｌ３は、エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、３’リンカー配列は、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列の各々であり、ＣｈＡｄＶベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む改変ＣｈＡｄＶ６８配列を含み、ここで、ヌクレオチド２～３６，５１８が、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、及び（３）部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠き、ネオアンチゲンカセットはＥ１欠失内に挿入されており、Ｉ抗原コード核酸配列の各々は、２５アミノ酸長であるポリペプチドをコードする。

【0029】

いくつかの態様では、カセットは、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と少なくとも１つのポリ（Ａ）配列の間に組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、カセットに機能的に連結されている。

【0030】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ骨格は、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格を含む。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は配列番号１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、ＣｈＡｄＶ６８ゲノムに関してまたは配列番号１に示される配列に関して、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における機能欠失を含み、任意選択で、アデノウイルス骨格または改変ＣｈＡｄＶ６８配列は、アデノウイルスゲノムに関して、または配列番号１に示される配列に関して、（１）Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂにおいて、または（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、及びＥ３において完全に欠失しているかまたは機能的に欠失しており、任意選択で、Ｅ１遺伝子は、配列番号１に示される配列に関して、少なくともヌクレオチド５７７～３４０３のＥ１欠失を介して機能的に欠失しており、任意選択で、Ｅ３遺伝子は、配列番号１に示される配列に関して、少なくともヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５のＥ３欠失を介して機能的に欠失している。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、ＣｈＡｄＶ６８ゲノムに関して、または配列番号１に示される配列に関して、１つ以上の遺伝子または制御配列を含み、任意選択で、１つ以上の遺伝子または制御配列は、チンパンジーアデノウイルス末端逆位反復（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される。

【0031】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、部分的に欠失したＥ４遺伝子を含む。いくつかの態様では、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、Ａ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列、Ｂ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３４，９４２、ヌクレオチド３４，９５２～３５，３０５、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，３０２～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列であって、ベクターが、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む、Ｅ４遺伝子配列、Ｃ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９８０～３６，５１６を欠く、Ｅ４遺伝子配列であって、ベクターが、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む、Ｅ４遺伝子配列、Ｄ．配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９７９～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列であって、ベクターが、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む、Ｅ４遺伝子配列、Ｅ．Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ３、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失、Ｆ．Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、Ｅ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失、Ｇ．Ｅ４Ｏｒｆ１の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ２、及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失、またはＨ．Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失、を含む。

【0032】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、ヌクレオチド２～３６，５１８は、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、及び（３）部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠き、任意選択で、抗原カセットがＥ１欠失内に挿入される。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号２９３６９に記載の配列を含み、任意選択で、抗原カセットがＥ１欠失内に挿入される。いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、ヌクレオチド２～３６，５１８は、Ａ．Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、Ｂ．Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５、Ｃ．部分的Ｅ４欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２、Ｄ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド４５６～３０１４、Ｅ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，８１６～３１，３３３、Ｆ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド３９５７～１０３４６、Ｇ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド２１７８７～２３３７０、Ｈ．配列番号１に示される配列のヌクレオチド３３４８６～３６１９３、またはそれらの組み合わせを欠く。

【0033】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ６８ベクター骨格は、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含み、ヌクレオチド２～３６，５１８は、（１）Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３、及び（２）Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠く。

【0034】

いくつかの態様では、ここで、カセットが、Ｅ１領域にて、Ｅ３領域にて、及び／またはカセットの組み込みを可能にする任意の欠失ＡｄＶ領域にてＣｈＡｄＶ骨格内に挿入される。

【0035】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶ骨格は、第一世代、第二世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターのうちの１つから作製される。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ＥＦ－１プロモーター配列、ＲＳＶプロモーター配列、ＰＧＫプロモーター配列、ＨＳＡプロモーター配列、ＭＣＫプロモーター配列、及びＥＢＶプロモーター配列からなる群から選択される。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーター配列である。

【0036】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つは、発現及び翻訳された場合に、対象の細胞上にＭＨＣクラスＩによって提示され得るエピトープをコードする。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つは、発現及び翻訳された場合に、対象の細胞上にＭＨＣクラスＩＩによって提示され得るエピトープをコードする。

【0037】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、２個以上の抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列は、互いに直接連結されている。

【0038】

いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列は、リンカーをコードする核酸配列により別個の抗原コード核酸配列に連結されている。いくつかの態様では、リンカーは、２つのエピトープコード核酸配列を連結するか、またはエピトープコード核酸配列をＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列に連結する。いくつかの態様では、リンカーは、（１）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するグリシン残基、（２）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するアラニン残基、（３）２つのアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳類のプロテアソームによって効率的にプロセシングされる、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基のコンセンサス配列、及び（６）起源同族のタンパク質に由来する抗原に隣接し、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０アミノ酸残基である、１つ以上の天然配列、からなる群から選択される。いくつかの態様では、リンカーは、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を連結するか、またはＭＨＣクラスＩＩ配列をエピトープコード核酸配列に連結する。いくつかの態様では、リンカーは配列ＧＰＧＰＧを含む。

【0039】

いくつかの態様では、抗原コード核酸配列は、抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞輸送、プロセシング及び提示、及び／または免疫原性を増強させる分離したまたは連続した配列に機能的にまたは直接、連結されている。いくつかの態様では、分離したまたは連続した配列は、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変されたユビキチン配列（例えば、ユビキチン配列は、７６位でのＧｌｙからＡｌａへの置換を含有する）、免疫グロブリンシグナル配列（例えば、ＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列、のうちの少なくとも１つを含み、任意選択で、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変されたユビキチン配列がＡ７６である。

【0040】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、少なくとも１つの変化を含み、この変化により、翻訳された対応する野生型核酸配列と比べて、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有する。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、少なくとも１つの変化を含み、この変化により、翻訳された対応する野生型核酸配列と比べて、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有する。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、少なくとも１つの変化を含み、この変化により、翻訳された対応する野生型核酸配列と比べて、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレル上での増大した提示の可能性を有する。いくつかの態様では、少なくとも１つの変化は、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、または、プロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む。

【0041】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、がんを有することがわかっているかまたは疑われている対象において発現することが既知であるかまたは疑われているエピトープをコードする。いくつかの態様では、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの態様では、がんは、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵がん、膀胱がん、脳腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、非小細胞肺がん、及び小細胞肺がんからなる群から選択される。

【0042】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも２～１０、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含む。

【0043】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも２～４００個の抗原コード核酸配列を含み、抗原コード核酸配列のうち少なくとも２個が、細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示されるエピトープ配列またはそれらの部分をコードする。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのうち少なくとも２個は、腫瘍細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示される。

【0044】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列は、８～３５アミノ酸長、任意選択で、９～１７、９～２５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする。

【0045】

いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在する。

【0046】

いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、存在し、かつ、少なくとも１つの変化を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、前記変化が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする。

【0047】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、１２～２０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、少なくとも１つのユニバーサル配列が破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む。

【0048】

いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は非誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ＳＶ４０ポリＡ配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０個の連続するＡヌクレオチドである。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１００個の連続するＡヌクレオチドである。

【0049】

いくつかの態様では、カセットはさらに、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）の配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フーリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、ｍＲＮＡの核外輸送、安定性、もしくは翻訳効率を増強させることが知られており少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている５’もしくは３’の非コード領域内の配列、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、カセットはさらに、レポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、検出可能なペプチドまたはエピトープは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される。

【0050】

いくつかの態様では、１つ以上のベクターはさらに、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異的であるかもしくは複数の特異性を一緒に連結させた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科の動物の抗体ドメイン）、または全長一本鎖抗体（例えば、重鎖と軽鎖が可動性リンカーによって連結されている全長ＩｇＧ）である。いくつかの態様では、抗体の重鎖配列及び軽鎖配列は、２Ａ等の自己切断配列もしくはＩＲＥＳのいずれかで区切られている連続した配列であるか、または抗体の重鎖配列及び軽鎖配列は、連続するグリシン残基等の可動性リンカーによって連結されている。いくつかの態様では、免疫調節物質はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１またはそれら各々のバリアントのうちの少なくとも１つである。

【0051】

いくつかの態様では、少なくとも１つのエピトープコード核酸配列は、（ａ）腫瘍、感染細胞、または感染症生物から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、ヌクレオチド配列決定データが、抗原のセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、取得するステップ、（ｂ）各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力して、細胞表面に、任意選択で腫瘍細胞表面または感染細胞表面にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、生成するステップ、及び（ｃ）少なくとも１つのエピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択された抗原のセットを生成するために、数値的尤度のセットに基づいて抗原のセットのサブセットを選択するステップ、を実施することによって選択される。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列の各々は、（ａ）腫瘍、感染細胞、または感染症生物から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、ヌクレオチド配列決定データが、抗原のセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、取得するステップ、（ｂ）各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力して、細胞表面に、任意選択で腫瘍細胞表面または感染細胞表面にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成し、数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、ステップ、及び（ｃ）少なくとも２０個のエピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択された抗原のセットを生成するために、数値的尤度のセットに基づいて抗原のセットのサブセットを選択するステップ、を実施することによって選択される。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットの数は２～２０である。いくつかの態様では、提示モデルは、（ａ）ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置における特定のアミノ酸との対の存在と、（ｂ）対のＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、細胞表面での、任意選択で腫瘍細胞表面または感染細胞表面での、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の提示の可能性、との間の依存性を表す。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて細胞表面に提示される可能性が増大している抗原を選択することを含み、任意選択で、選択された抗原は、１つ以上の特定のＨＬＡアレルによって提示されると確認されている。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて対象において腫瘍特異的な免疫応答の誘導能がある可能性が増大しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて対象において腫瘍特異的または感染症特異的な免疫応答の誘導能がある可能性が増大している抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に提示される能力がある可能性が増大している抗原を選択することを含み、任意選択で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害を受ける可能性が減少している抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかった抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答の誘導能がある可能性が減少している抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチド配列決定データは、腫瘍細胞もしくは腫瘍組織、感染細胞、または感染症生物においてシークエンシングを実施することによって取得される。いくつかの態様では、シークエンシングは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシング手法である。

【0052】

いくつかの態様では、カセットは、カセット内の隣接配列によって形成される接合部エピトープ配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つまたはそれぞれの接合部エピトープ配列は、ＭＨＣに対する親和性が５００ｎＭ超である。いくつかの態様では、各接合部エピトープ配列は非自己である。

【0053】

いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープの各々は、集団の少なくとも５％に存在する少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があると予測または確認される。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープの各々は、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があると予測または確認され、抗原／ＨＬＡの各対の、集団における抗原／ＨＬＡ保有率は少なくとも０．０１％である。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープの各々は、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があると予測または確認され、抗原／ＨＬＡの各対の、集団における抗原／ＨＬＡ保有率は少なくとも０．１％である。

【0054】

いくつかの態様では、カセットは、翻訳された野生型核酸配列を含む非治療的なＭＨＣクラスＩエピトープ核酸配列もクラスＩＩエピトープ核酸配列もコードせず、ここで、非治療的なエピトープは、対象のＭＨＣアレルに提示されると予測される。いくつかの態様では、予測される非治療的なＭＨＣクラスＩエピトープ核酸配列またはクラスＩＩエピトープ配列は、カセット内の隣接配列によって形成される接合部エピトープ配列である。いくつかの態様では、予測は、非治療的なエピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づく。いくつかの態様では、カセット内の抗原コード核酸配列の順序は、（ａ）抗原コード核酸配列の様々な順序に対応する候補カセット配列のセットを生成すること、（ｂ）各候補カセット配列について、候補カセット配列における非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定すること、及び（ｃ）抗原ワクチンのカセット配列として、所定の閾値を下回る提示スコアと関連する候補カセット配列を選択すること、を含む一連のステップによって決定される。

【0055】

いくつかの態様では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、組成物は、ＣｈＡｄＶベクターを含むウイルス粒子を含む。

【0056】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列のうちの１つ以上は、対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列の各々は、対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列のうちの１つ以上は、対象の腫瘍に由来しない。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列の各々は、対象の腫瘍に由来しない。

【0057】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、配列番号５７～２９，３６４からなる群から選択されるエピトープを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも、（Ａ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、配列番号１４，９５４、１９，８４８、及び１９，８５０からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、（Ｂ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、配列番号１９，７４９、１９，８６５、及び１９，８６３からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、ならびに（Ｃ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、配列番号１９，９７６、１９，７７９、１１，４９５、及び１９，９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、の各々を含む。

【0058】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、（Ａ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、（Ｂ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、（Ｃ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、（Ｄ）ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、（Ｅ）ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、（Ｆ）ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、（Ｇ）ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。

【0059】

いくつかの態様では、方法はさらに、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系を投与することを含む。いくつかの態様では、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される。いくつかの態様では、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための組成物は、（ＩＭ）投与される。いくつかの態様では、ＩＭ投与は、別々の注射部位において実施される。いくつかの態様では、別々の注射部位は、相対する三角筋における注射部位である。いくつかの態様では、別々の注射部位は、両側の殿筋部位または大腿直筋部位における注射部位である。いくつかの態様では、１つ以上のブースト用量の注射部位は、プライミング用量の注射部位に可能な限り近い。

【0060】

いくつかの態様では、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための組成物は、（Ａ）自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系であって、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系が、１つ以上のベクターを含み、１つ以上のベクターが、（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、エピトープコード核酸配列、ｂ．任意選択で５’リンカー配列、及びｃ．任意選択で３’リンカー配列、を含む、少なくとも１つの抗原コード核酸配列、（ｉｉ）任意選択で、少なくとも１つの抗原コード核酸配列に機能的に連結されている第２のプロモーターヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）任意選択で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、アルファウイルスにとって天然ポリ（Ａ）配列であるかまたは外因性ポリ（Ａ）配列である、第２のポリ（Ａ）配列、を含む、カセット、を含む、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系、ならびに（Ｂ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系を内包する、ＬＮＰと、を含む。

【0061】

いくつかの態様では、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための組成物は、（Ａ）自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系であって、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系が、１つ以上のベクターを含み、１つ以上のベクターが、（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、ＲＮＡアルファウイルス骨格が、配列番号６に記載の核酸配列を含み、ＲＮＡアルファウイルス骨格配列が、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列を含み、２６Ｓプロモーター配列がＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性であり、ポリ（Ａ）配列が、ＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性である、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに（ｂ）２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列とポリ（Ａ）配列の間に組み込まれているカセットであって、カセットが、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、かつ、カセットが、少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含み、少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を任意選択で含む、エピトープコード核酸配列、ｂ．任意選択で５’リンカー配列、及びｃ．任意選択で３’リンカー配列、を含む、カセット、を含む、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系、ならびに、（Ｂ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系を内包する、ＬＮＰと、を含む。

【0062】

いくつかの態様では、ＣｈＡｄＶベクターのカセットは、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための組成物のカセットと同一である。

【0063】

いくつかの態様では、自己増幅型アルファウイルスに基づく発現系の送達のための組成物におけるカセットの各要素の順番に並べられた配列は、５’から３’方向へ、Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ－Ｇ３_ｇを含む式で表され、式中、Ｐは、第２のプロモーターヌクレオチド配列であり、ａ＝０または１であり、Ｎはエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮ_ｃはエピトープコード核酸配列であり、Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵ_ｆはＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である。

【0064】

いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮ_ｃは別個のエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵ_ｆは別個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって提供される単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって提供される少なくとも１００個の連続するＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、カセットは、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列とポリ（Ａ）配列の間に組み込まれており、ここで、カセットが、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列に機能的に連結されており、各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、５’リンカー配列は、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｌ３は、エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、３’リンカー配列は、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列の各々であり、ＲＮＡアルファウイルス骨格は配列番号６に記載の配列であり、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の各々は、１３～２５アミノ酸長であるポリペプチドをコードする。

【0065】

いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質、ホスファチジルコリン、コレステロール、ＰＥＧベースのコート脂質、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質を含む。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧベースのコート脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート）分子を含む。いくつかの態様では、ＬＮＰに内包された発現系は約１００ｎｍの直径を有する。

【0066】

いくつかの態様では、カセットは、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と少なくとも１つのポリ（Ａ）配列の間に組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、カセットに機能的に連結されている。

【0067】

いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、１つ以上のプラス鎖ＲＮＡベクターを含む。いくつかの態様では、１つ以上のプラス鎖ＲＮＡベクターは、５’の７－メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む。いくつかの態様では、１つ以上のプラス鎖ＲＮＡベクターは、インビトロ転写により生成される。

【0068】

いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、哺乳類細胞内で自己複製する。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、アウラウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は少なくとも、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は少なくとも、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列は、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、２４ｎｔ ＣＳＥ、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列、１９ｎｔ ＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、構造ビリオンタンパク質カプシドであるＥ２及びＥ１をコードしない。いくつかの態様では、カセットは、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内に構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、塩基対７５４４と１１１７５の間の欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、カセットは、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５の間の欠失を置き換えるように７５４４位に挿入される。いくつかの態様では、カセットの挿入は、ｎｓＰ１～４遺伝子と少なくとも１つの核酸配列とを含むポリシストロン性ＲＮＡの転写を提供し、ｎｓＰ１～４遺伝子及び少なくとも１つの核酸配列は、別々のオープンリーディングフレーム中に存在する。

【0069】

いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によってコードされる天然２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、外因性ＲＮＡプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列は、別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写を提供する。

【0070】

いくつかの態様では、１つ以上のベクターはそれぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターはそれぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターはそれぞれ２ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターはそれぞれ５ｋｂ未満のサイズである。

【0071】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、２個以上の抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列は、互いに直接連結されている。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列は、リンカーをコードする核酸配列により別個の抗原コード核酸配列に連結されている。いくつかの態様では、リンカーは、２つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を連結するか、またはＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列をＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列に連結する。いくつかの態様では、リンカーは、（１）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するグリシン残基、（２）長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基である、連続するアラニン残基、（３）２つのアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳類のプロテアソームによって効率的にプロセシングされる、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基のコンセンサス配列、及び（６）起源同族のタンパク質に由来する抗原に隣接し、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０アミノ酸残基である、１つ以上の天然配列、からなる群から選択される。いくつかの態様では、リンカーは、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を連結するか、またはＭＨＣクラスＩＩ配列をＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列に連結する。いくつかの態様では、リンカーは配列ＧＰＧＰＧを含む。

【0072】

いくつかの態様では、抗原コード核酸配列は、抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞輸送、プロセシング及び提示、及び／または免疫原性を増強させる分離したまたは連続した配列に機能的にまたは直接、連結されている。いくつかの態様では、分離したまたは連続した配列は、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変されたユビキチン配列（例えば、ユビキチン配列は、７６位でのＧｌｙからＡｌａへの置換を含有する）、免疫グロブリンシグナル配列（例えば、ＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列、のうちの少なくとも１つを含み、任意選択で、プロテアソームターゲティングが増大するよう改変されたユビキチン配列がＡ７６である。

【0073】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも２～１０、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含み、任意選択で、各抗原コード核酸配列が、別個の抗原コード核酸配列をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または最大４００個の抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも２～４００個の抗原コード核酸配列を含み、抗原コード核酸配列のうち少なくとも２個が、細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示されるエピトープ配列またはそれらの部分をコードする。

【0074】

いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのうち少なくとも２つは、腫瘍細胞表面にＭＨＣクラスＩによって提示される。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列は、８～３５アミノ酸長、任意選択で、９～１７、９～２５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする。

【0075】

いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在する。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、存在し、かつ、少なくとも１つの変化を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、前記変化が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、１２～２０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、少なくとも１つのユニバーサル配列が破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む。

【0076】

いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は非誘導性である。

【0077】

いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、アルファウイルスにとって天然のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、アルファウイルスにとって外因性のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０個の連続するＡヌクレオチドである。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１００個の連続するＡヌクレオチドである。

【0078】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列はＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列は、（ａ）腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、腫瘍ヌクレオチド配列決定データが、エピトープのセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、取得するステップ、（ｂ）各エピトープのペプチド配列を提示モデルに入力して腫瘍の腫瘍細胞表面にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって、エピトープの各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、生成するステップ、及び（ｃ）ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択されたエピトープのセットを生成するために、数値的尤度のセットに基づいてエピトープのセットのサブセットを選択するステップ、を実施することによって選択される。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の各々は、（ａ）腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチド配列決定データのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、腫瘍ヌクレオチド配列決定データが、エピトープのセットの各々についてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、取得するステップ、（ｂ）各エピトープのペプチド配列を提示モデルに入力して、腫瘍の腫瘍細胞表面にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によってエピトープの各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、生成するステップ、及び（ｃ）少なくとも２０個のＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために使用される選択されたエピトープのセットを生成するために、数値的尤度のセットに基づいてエピトープのセットのサブセットを選択するステップ、を実施することによって選択される。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットの数は２～２０である。いくつかの態様では、提示モデルは、（ａ）ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置における特定のアミノ酸との対の存在と、（ｂ）対のＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、腫瘍細胞表面での、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の提示の可能性、との間の依存性を表す。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて腫瘍細胞表面に提示される可能性が増大しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて対象において腫瘍特異的な免疫応答の誘導能がある可能性が増大しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に提示される能力がある可能性が増大しているエピトープを選択することを含み、任意選択で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害を受ける可能性が減少しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様では、選択されたエピトープのセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されなかったエピトープと比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答の誘導能がある可能性が減少しているエピトープを選択することを含む。

【0079】

いくつかの態様では、エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチド配列決定データは、腫瘍組織においてシークエンシングを実施することによって取得される。いくつかの態様では、シークエンシングは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシング手法である。

【図面の簡単な説明】

【0080】

本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、及び添付の図面に関してより良く理解される。

【図1】ワクチン接種プロトコルの概略を示す。

【図2A】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６つの重複ペプチドプールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した（それぞれ２０ペプチド、１５アミノ酸長）。動物全体（ｎ＝６）の各プールの平均を示す。各試料についてバックグラウンドをＤＭＳＯ対照に合わせて補正し、０～４週にはカウント変換係数を適用した。積み上げ棒グラフにはそれぞれ、プール１～６の応答が上から下へ示されている。

【図2B】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６つの重複ペプチドプールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した（それぞれ２０ペプチド、１５アミノ酸長）。個々の霊長類＃１～３の応答を示す（それぞれ上のパネルから下のパネルへ）。各試料についてバックグラウンドをＤＭＳＯ対照に合わせて補正し、０～４週にはカウント変換係数を適用した。積み上げ棒グラフにはそれぞれ、プール１～６の応答が上から下へ示されている。

【図2C】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６つの重複ペプチドプールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した（それぞれ２０ペプチド、１５アミノ酸長）。個々の霊長類＃４～６の応答を示す（それぞれ上のパネルから下のパネルへ）。各試料についてバックグラウンドをＤＭＳＯ対照に合わせて補正し、０～４週にはカウント変換係数を適用した。積み上げ棒グラフにはそれぞれ、プール１～６の応答が上から下へ示されている。

【図3A】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された、ＧＲＡＮＩＴＥ被験者Ｇ１の抗原特異的細胞性免疫応答を示す。ＣＤ８エピトーププールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した。グラフは、三連ＥＬＩＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）＋／－標準偏差（ＳＤ）を示す。ＬＯＤ＝アッセイ検出限界。ＵＬＯＱ＝定量上限（５，０００ ＳＦＵ／１０^６ＰＢＭＣ）。

【図3B】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された、ＧＲＡＮＩＴＥ被験者Ｇ１の抗原特異的細胞性免疫応答を示す。ミニＣＤ８エピトーププールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した。グラフは、三連ＥＬＩＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）＋／－標準偏差（ＳＤ）を示す。ＬＯＤ＝アッセイ検出限界。全経時変化が示されている。

【図3C】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された、ＧＲＡＮＩＴＥ被験者Ｇ１の抗原特異的細胞性免疫応答を示す。ミニＣＤ８エピトーププールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した。グラフは、三連ＥＬＩＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）＋／－標準偏差（ＳＤ）を示す。ＬＯＤ＝アッセイ検出限界。図３Ｂからの６８週目及び７０週目が示されている。

【図4】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された、ＧＲＡＮＩＴＥ被験者Ｇ３の抗原特異的細胞性免疫応答を示す。ＣＤ８エピトーププールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した。グラフは、三連ＥＬＩＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）＋／－標準偏差（ＳＤ）を示す。ＬＯＤ＝アッセイ検出限界。

【図5】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された、ＧＲＡＮＩＴＥ被験者Ｇ８の抗原特異的細胞性免疫応答を示す。ＣＤ８エピトーププールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した。グラフは、三連ＥＬＩＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）＋／－標準偏差（ＳＤ）を示す。ＬＯＤ＝アッセイ検出限界。

【図6】ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された、ＧＲＡＮＩＴＥ被験者Ｇ１１の抗原特異的細胞性免疫応答を示す。ＣＤ８エピトーププールで刺激したＰＢＭＣで抗原特異的ＩＦＮ－ガンマ産生を測定した。グラフは、三連ＥＬＩＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）＋／－標準偏差（ＳＤ）を示す。ＬＯＤ＝アッセイ検出限界。

【図7】同種ＣｈＡｄＶプライム－ブーストワクチン戦略の免疫細胞特徴付けデータを示す。左パネル：患者Ｇ１、Ｇ３、Ｇ８、及びＧ１１について、患者特異的ペプチドプールでエキソビボＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔにおいて一晩刺激したＰＢＭＣからのＣｈＡｄＶブースト前後のＥＬＩＳｐｏｔデータを示す。グラフは、三連ＥＬＩＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）を示す。中央パネル：ＣｈＡｄＶブースト前後のエキソビボＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｇ１、Ｇ３、Ｇ８、及びＧ１１）からの上清を、患者特異的ＣＤ８プールでの刺激後のグランザイムＢ（ＧＲＺＢ）のレベルについてＭＳＤ Ｕ－ｐｌｅｘアッセイによって分析した。グラフは、複製ウェルからの平均ＧＲＺＢレベルをｐｇ／ｍｌ単位で示す（バックグラウンドは差し引いている）。右パネル：患者Ｇ１１からのＣｈＡｄＶブースト前後の時点のＰＢＭＣをエキソビボＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイによって分析し、ＤＭＳＯまたは患者特異的ＣＤ８プールでの一晩の刺激後のＩＦＮｇ、ＧＲＺＢ及びＩＬ－２の発現を測定した。グラフは、ＩＦＮγ、ＧＲＺＢ、及びＩＬ－２について、複製ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔウェルの１０^６ＰＢＭＣあたりの平均ＳＦＵ＋／－標準偏差（ＳＤ）を積み上げで示している。

【図8A】エフェクターメモリー集団を評価するための四量体染色及びメモリー表現型決定のフローサイトメトリーデータを示す。患者Ｇ１のＣｈＡｄ６８ブースト前のペプチド－ＨＬＡ（ＨＬＡ－Ｂ^＊４４：０５－ＰＥ）の認識を示す密度プロット。フロープロットは、ＣＤ８四量体^＋集団におけるナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋）細胞、中央メモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋）細胞、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^－）細胞、及びＴエフェクターメモリーＲＡ^＋（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^－）細胞の頻度を示す。

【図8B】エフェクターメモリー集団を評価するための四量体染色及びメモリー表現型決定のフローサイトメトリーデータを示す。患者Ｇ１のＣｈＡｄ６８ブースト後のペプチド－ＨＬＡ（ＨＬＡ－Ｂ^＊４４：０５－ＡＰＣ）の認識を示す密度プロット。フロープロットは、ＣＤ８四量体^＋集団におけるナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋）細胞、中央メモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋）細胞、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^－）細胞、及びＴエフェクターメモリーＲＡ^＋（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^－）細胞の頻度を示す。

【図8C】エフェクターメモリー集団を評価するための四量体染色及びメモリー表現型決定のフローサイトメトリーデータを示す。患者Ｇ１のＣｈＡｄ６８ブースト前後のペプチド－ＨＬＡ（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１－ＢＶ４２１）の認識を示す密度プロット。対応するドットプロットからのＣＤ８四量体^＋集団におけるナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋）細胞、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋）細胞、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^－）細胞、及びＴエフェクターメモリーＲＡ^＋（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^－）細胞の頻度を示す円グラフ。

【発明を実施するための形態】

【0081】

詳細な説明
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書で使される用語は、当業者によって理解される平易な意味を有するものと解釈されることが意図される。さらに明確にするために、以下に特定の用語を定義する。平易な意味と記載の定義の間に矛盾がある場合は、記載の定義が使用される。

【0082】

本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、免疫応答を刺激する物質である。抗原は、ネオアンチゲンであり得る。抗原は、特定の集団、例えば、がん患者の特定の集団の間で見られる抗原である「共通抗原」であり得る。

【0083】

本明細書で使用される場合、用語「ネオアンチゲン」は、例えば、腫瘍細胞における変異または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、対応する野生型抗原とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を有する抗原である。ネオアンチゲンには、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列が含まれ得る。変異には、フレームシフトもしくは非フレームシフトのインデル、ミスセンスもしくはナンセンスの置換、スプライス部位の変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、またはネオＯＲＦを生じさせる任意のゲノム変化もしくは発現変化が含まれ得る。変異にはまた、スプライスバリアントも含まれ得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれ得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾にはまた、プロテアソームにより生成されたスプライス抗原も含まれ得る。Ｌｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｏｃｔ ２１；３５４（６３１０）：３５４－３５８を参照のこと。対象は、様々な診断方法、例えば、以下に詳述される患者選択方法の使用を介して投与のために特定され得る。

【0084】

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍抗原」は、対象の腫瘍細胞もしくは組織中に存在するが、対象の対応する正常な細胞もしくは組織には存在しない抗原であるか、または正常な細胞もしくは組織と比較して、腫瘍細胞もしくはがん性組織において発現が変化していることが既知であるかもしくはそのことが見出されたポリペプチドに由来する抗原である。

【0085】

本明細書で使用される場合、用語「抗原に基づくワクチン」は、１つ以上の抗原、例えば、複数の抗原に基づいたワクチン組成物である。ワクチンは、ヌクレオチドベース（例えば、ウイルスベース、ＲＮＡベース、またはＤＮＡベース）、タンパク質ベース（例えば、ペプチドベース）、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0086】

本明細書で使用される場合、用語「候補抗原」は、抗原を表し得る配列を生じさせる変異または他の異常である。

【0087】

本明細書で使用される場合、用語「コード領域」は、タンパク質をコードする遺伝子の部分である。

【0088】

本明細書で使用される場合、用語「コード変異」は、コード領域に生じる変異である。

【0089】

本明細書で使用される場合、用語「ＯＲＦ」とは、オープンリーディングフレームを意味する。

【0090】

本明細書で使用される場合、用語「ＮＥＯ－ＯＲＦ」は、変異またはスプライシング等の他の異常から生じる腫瘍特異的ＯＲＦである。

【0091】

本明細書で使用される場合、用語「ミスセンス変異」は、あるアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。

【0092】

本明細書で使用される場合、用語「ナンセンス変異」は、あるアミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすか、または標準開始コドンの除去を引き起こす変異である。

【0093】

本明細書で使用される場合、用語「フレームシフト変異」は、タンパク質のフレームに変化を引き起こす変異である。

【0094】

本明細書で使用される場合、用語「インデル」は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。

【0095】

本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連において、用語「同一性」パーセントとは、以下に記載の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用するかまたは目視検査によって測定される、最大一致度について比較及びアラインメントを行った場合に、明示されたパーセンテージのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同じである２つ以上の配列またはサブ配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在することもあれば、別の場合には、比較される２配列の全長にわたって存在することもある。

【0096】

配列比較では典型的には、１つの配列が参照配列の役目を果たし、これに対して被験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列同一性パーセントを算出する。別法として、配列の類似性または非類似性は、特定のヌクレオチド、または翻訳された配列の場合は選択された配列の位置（例えば、配列モチーフ）におけるアミノ酸の、有無の組み合わせによって確立することができる。

【0097】

比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．内にあるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装によるか、または目視検査（概要は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、以下を参照のこと）によって行うことができる。

【0098】

配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公的に入手可能である。

【0099】

本明細書で使用される場合、用語「ノンストップまたはリードスルー」は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異である。

【0100】

本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体またはＴ細胞受容体が典型的に結合する、抗原の特定の部分である。

【0101】

本明細書で使用される場合、用語「免疫原性」は、免疫応答を、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または両方を介して刺激する能力である。

【0102】

本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」とは、特定の抗原と特定のＭＨＣアレルの間での結合の親和性を意味する。

【0103】

本明細書で使用される場合、用語「ベイト」は、試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの特定の配列を濃縮するために使用される核酸プローブである。

【0104】

本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、対象の核酸と対照として使用される参照ヒトゲノムの間の差である。

【0105】

本明細書で使用される場合、用語「バリアントコール」は、典型的にはシークエンシングからの、バリアントの存在のアルゴリズム的決定である。

【0106】

本明細書で使用される場合、用語「多型」は、生殖細胞系列バリアント、すなわち、個体の、ＤＮＡを持つ細胞すべてに見出されるバリアントである。

【0107】

本明細書で使用される場合、用語「体細胞バリアント」は、個体の非生殖系細胞に生じるバリアントである。

【0108】

本明細書で使用される場合、用語「アレル」は、遺伝子のバージョンまたは遺伝子配列のバージョンまたはタンパク質のバージョンである。

【0109】

本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ型」は、ＨＬＡ遺伝子アレルを補足するものである。

【0110】

本明細書で使用される場合、用語「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」は、未成熟終止コドンが原因の細胞によるｍＲＮＡの分解である。

【0111】

本明細書で使用される場合、用語「幹変異（ｔｒｕｎｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、腫瘍発生の初期に生じる、腫瘍の細胞の大部分に存在する変異である。

【0112】

本明細書で使用される場合、用語「サブクローナル変異（ｓｕｂｃｌｏｎａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、腫瘍発生の後期に生じる、腫瘍細胞のサブセットにのみ存在する変異である。

【0113】

本明細書で使用される場合、用語「エクソーム」は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムのうちのエクソン集であり得る。

【0114】

本明細書で使用される場合、用語「ロジスティック回帰」は、従属変数が１に等しい確率のロジットを、従属変数の線形関数としてモデル化する、統計からの２値のデータに関する回帰モデルである。

【0115】

本明細書で使用される場合、用語「ニューラルネットワーク」は、複数の層の線形変換、それに続く、典型的には確率的勾配降下法及び誤差逆伝播法により訓練される要素ごとの非線形性からなる、分類または回帰のための機械学習モデルである。

【0116】

本明細書で使用される場合、用語「プロテオーム」は、細胞、細胞群、または個体によって発現及び／または翻訳される全タンパク質のセットである。

【0117】

本明細書で使用される場合、用語「ペプチドーム」は、細胞表面上のＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩによって提示される全ペプチドのセットである。ペプチドームは、細胞または細胞集の特性を指す場合がある（例えば、腫瘍を構成する細胞すべてのペプチドームの結合体を意味する腫瘍ペプチドーム、または感染症により感染している細胞すべてのペプチドームの結合体を意味する感染症ペプチドーム）。

【0118】

本明細書で使用される場合、用語「ＥＬＩＳＰＯＴ」とは、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味し、これは、ヒト及び動物での免疫応答をモニタリングするための一般的な方法である。

【0119】

本明細書で使用される場合、用語「デキストラマー」は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド－ＭＨＣ多量体である。

【0120】

本明細書で使用される場合、用語「寛容または免疫寛容」は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫非応答性の状態である。

【0121】

本明細書で使用される場合、用語「中枢性寛容」は、自己反応性Ｔ細胞クローンを除去することによるか、または自己反応性Ｔ細胞クローンを促進して免疫抑制性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に分化させることによって、胸腺において影響を受ける寛容である。

【0122】

本明細書で使用される場合、用語「末梢性寛容」は、中枢性寛容を生き延びる自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化することによるか、またはこれらのＴ細胞を促進してＴｒｅｇに分化させることによって、末梢において影響を受ける寛容である。

【0123】

用語「試料」には、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、または当該技術分野で公知の他の介入もしくは手段が含まれる手段によって対象から採取された、単一細胞もしくは複数の細胞または細胞の断片または体液のアリコートが含まれ得る。

【0124】

用語「対象」は、細胞、組織、または生物、ヒトもしくは非ヒトを包含し、雌雄、インビボ、エキソビボ、またはインビトロを問わない。対象という用語は、ヒト等の哺乳類を含む。

【0125】

用語「哺乳類」は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、これには、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタが含まれるが、これらに限定されない。

【0126】

用語「臨床因子」とは、対象の病態の尺度、例えば、疾患の活動性または重症度を指す。「臨床因子」は、非試料マーカーを含む対象の健康状態のすべてのマーカー、及び／または対象の他の特徴、例えば、限定することなく、年齢及び性を包含する。臨床因子は、決定されている条件下での、対象からの試料（または試料の集団）または対象の評価から取得され得るスコア、値、または値のセットであり得る。臨床因子はまた、マーカー及び／または他のパラメータ、例えば、遺伝子発現代替物によって予測することもできる。臨床的因子には、腫瘍の種類、腫瘍サブタイプ、感染症の種類、感染症サブタイプ、及び喫煙歴が含まれ得る。

【0127】

用語「腫瘍に由来する抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲを介して、腫瘍から取得される核酸配列；または腫瘍をシークエンシングし、次いで、シークエンシングデータを使用して、例えば、当該技術分野で公知の様々な合成法もしくはＰＣＲベースの方法を介して核酸配列を合成することにより取得される配列データを指す。派生配列には、配列が最適化された核酸配列バリアント（例えば、コドン最適化及び／または発現のための他の最適化）等の、核酸配列バリアントが含まれ得、それらは、腫瘍から取得される対応する天然核酸配列がコードするポリペプチド配列と同じポリペプチド配列をコードする。

【0128】

用語「感染症に由来する抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲを介して、感染細胞もしくは感染症生物から取得される核酸配列；または感染細胞もしくは感染症生物をシークエンシングし、次いで、シークエンシングデータを使用して、例えば、当該技術分野で公知の様々な合成法もしくはＰＣＲベースの方法を介して核酸配列を合成することにより取得される配列データを指す。派生配列には、配列が最適化された核酸配列バリアント（例えば、コドン最適化及び／または発現のための他の最適化）等の、核酸配列バリアントが含まれ得、それらは、対応する天然感染症生物核酸配列がコードするポリペプチド配列と同じポリペプチド配列をコードする。派生配列には、天然感染症生物ポリペプチド配列に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５）の変異を有する改変感染症生物ポリペプチド配列をコードする核酸配列バリアントが含まれ得る。例えば、改変ポリペプチド配列は、感染症生物タンパク質の天然ポリペプチド配列に対して１つ以上のミスセンス変異を有し得る。

【0129】

用語「アルファウイルス」とは、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーを指し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは典型的には、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、マヤロウイルス、チクングニアウイルス、及びセムリキ森林ウイルス等の旧世界、または東部ウマ脳炎、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその派生株ＴＣ－８３等の新世界に分類される。アルファウイルスは典型的には、自己複製ＲＮＡウイルスである。

【0130】

用語「アルファウイルス骨格」とは、ウイルスゲノムの自己複製を可能にする、アルファウイルスの最小配列を指す。最小配列には、非構造タンパク質媒介性増幅のための保存された配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及びポリＡ配列、ならびにサブゲノム（例えば、２６Ｓ）プロモーターエレメント等のウイルスのサブゲノムＲＮＡの発現のための配列が含まれ得る。

【0131】

用語「非構造タンパク質媒介性増幅のための配列」には、当業者に周知のアルファウイルス保存配列エレメント（ＣＳＥ：ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）が含まれる。ＣＳＥとしては、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、２４ｎｔ ＣＳＥ、サブゲノムプロモーター配列（例えば、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列）、１９ｎｔ ＣＳＥ、及びアルファウイルス３’ＵＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。

【0132】

用語「ＲＮＡポリメラーゼ」には、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡポリヌクレオチドの産生を触媒するポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６等のバクテリオファージ由来のポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【0133】

用語「脂質」には、疎水性及び／または両親媒性の分子が含まれる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であり得る。脂質は、合成でも天然由来でもあり得、場合によっては生物分解性であり得る。脂質には、コレステロール、リン脂質、脂質複合体が含まれ得、それらとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）、ワックス、油、グリセリド、脂肪、及び脂溶性ビタミンが挙げられるが、これらに限定されない。脂質にはまた、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート（ＭＣ３）及びＭＣ３様分子も含まれ得る。

【0134】

用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」には、水性内部を囲む脂質含有膜を使用して形成される小胞様構造が含まれ、リポソームとも呼ばれる。脂質ナノ粒子には、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを有する脂質ベース組成物が含まれる。コア脂質は、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びこれらの界面活性剤の混合物であり得る。リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸塩（タウロコール酸ナトリウム）、及びステロール（コレステロール）等の生体膜脂質を安定化剤として用いることができる。脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性、アニオン性、または中性の脂質の定義された比等のこれに限定されない、異なる脂質分子の定義された比を使用して形成することができる。脂質ナノ粒子は、外膜シェル内に分子を内包することができ、その後、標的細胞と接触させて内包された分子を宿主細胞サイトゾルに送達することができる。脂質ナノ粒子は、それらの表面を含め、非脂質分子を用いて修飾または機能化することができる。脂質ナノ粒子は、単一層（単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ））または多層（多重層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ））であり得る。脂質ナノ粒子は、核酸と複合体を形成することができる。単層脂質ナノ粒子は核酸と複合体を形成することができ、ここで、核酸は水性内部にある。多重層脂質ナノ粒子は核酸と複合体を形成することができ、ここで、核酸は水性内部にあるか、または形成するかもしくは間に挟まれる。

【0135】

略語： ＭＨＣ：主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、またはヒトＭＨＣ遺伝子座（ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ）；ＮＧＳ：次世代シークエンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）；ＰＰＶ：陽性適中率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）；ＴＳＮＡ：腫瘍特異的ネオアンチゲン（ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ）；ＮＭＤ：ナンセンス変異依存分解機構（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ）；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）；ＤＣ：樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）。

【0136】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意すべきである。

【0137】

具体的に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、用語「約」は、当該従来技術における通常の許容公差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内であると理解される。「約」は、記述された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解され得る。文脈から別様に明確でない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。

【0138】

本明細書で直接定義されていないいかなる用語も、本発明の技術分野内で理解されるような、それらの用語に共通して関連付けられる意味を有すると理解されるべきである。本明細書では、本発明の態様の組成物、デバイス、方法等、及びそれらをどのように作製または使用するかを説明する際に、実践者に追加のガイダンスを提供するために特定の用語が論じられる。同じことが複数の言い方で言われる場合があることを認識されよう。したがって、本明細書で論じられる用語のうちの任意の１つまたは複数について代替言語及び同義語が使用される場合がある。ある用語が本明細書で詳述されるかもしくは論じられているか否かは重要ではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料等が提供される。明示的に記述されていない限り、１つまたは少数の同義語または同等物の記述は、他の同義語または同等物の使用を排除するものではない。用語の例を含め、例の使用は、例示のみを目的としており、本明細書での本発明の態様の範囲及び意味を限定するものではない。

【0139】

本明細書の本文中で引用されているすべての参考文献、発行済特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0140】

ＩＩ．抗原同定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ分析のための研究方法が報告されており、抗原同定領域に適用されている。^{６、１４、１５}臨床現場での抗原同定に対する感度及び特異性の増大のための特定の最適化を考慮することができる。これらの最適化は、２つの領域、すなわち、実験室プロセスに関連するもの、及びＮＧＳデータ分析に関連するものに分類することができる。記載の研究方法はまた、他の状況での抗原の同定、例えば、感染症生物、対象での感染、または対象の感染細胞から抗原を同定する同定に適用することができる。最適化の例は当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、米国出願公開第１６／６０６，５７７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０２０１８１２４０Ａ１号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に方法が詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0141】

抗原（例えば、腫瘍または感染症生物に由来する抗原）を同定するための方法には、細胞表面に提示される（例えば、樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞を含め、腫瘍細胞上、感染細胞上、または免疫細胞上にＭＨＣによって提示される）可能性の高い抗原、及び／または免疫原性である可能性の高い抗原を同定することが含まれる。一例として、そのような方法の１つは、腫瘍、感染細胞、もしくは感染症生物から、エクソーム、トランスクリプトームまたは全ゲノムのヌクレオチド配列決定及び／または発現のデータのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、ヌクレオチド配列決定データ及び／または発現データが、抗原（例えば、腫瘍または感染症生物に由来する抗原）のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、取得するステップ；各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力して、細胞表面に、例えば、対象の腫瘍細胞または感染細胞の表面に１つ以上のＭＨＣアレルによって抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するステップであって、数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、生成するステップ；ならびに選択された抗原のセットを生成するために、数値的尤度のセットに基づいて抗原のセットのサブセットを選択するステップ、を含み得る。

【0142】

ＩＩＩ．ネオアンチゲンにおける腫瘍特異的変異の同定
本明細書ではまた、ある特定の変異（例えば、がん細胞に存在するバリアントまたはアレル）の同定のための方法も開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソームには存在するが、対象の正常組織には存在しない可能性がある。共通ネオアンチゲンを含め、腫瘍に特異的なネオアンチゲンを同定するための特定の方法が当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に方法が詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。腫瘍に特異的な共通ネオアンチゲンの例は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９２２６９４１Ａ１号に詳述されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。共通ネオアンチゲンには、ＫＲＡＳ関連変異（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、及び／またはＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ変異）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＫＲＡＳ関連ＭＨＣクラスＩネオエピトープには、野生型（ＷＴ）ヒトＫＲＡＳに関する変異、例えば、以下の例示的アミノ酸配列に関する変異が含まれ得る：ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ。

【0143】

腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍においてのみタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす場合には、免疫学的腫瘍ターゲティングに有用であると見なすことができる。有用な変異には、（１）タンパク質に異なるアミノ酸をもたらす非同義変異、（２）終止コドンが変更または欠失されて、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を持つ長いタンパク質の翻訳をもたらすリードスルー変異、（３）成熟ｍＲＮＡにイントロンが包含されてしまい、そのため固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらすスプライス部位変異、（４）２つのタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を持つキメラタンパク質をもたらす染色体再構成（すなわち、遺伝子融合）、（５）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を持つ新たなオープンリーディングフレームをもたらすフレームシフト変異または欠失、が挙げられる。変異にはまた、非フレームシフトインデル、ミスセンス置換もしくはナンセンス置換、スプライス部位の変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、またはネオＯＲＦを生じさせる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの１つ以上も含まれ得る。

【0144】

腫瘍細胞において、例えば、スプライス部位、フレームシフト、リードスルー、もしくは遺伝子融合の変異から生じる変異を有するペプチドまたは変異ポリペプチドは、腫瘍と正常細胞を対比させたＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質のシークエンシングを行うことによって同定することができる。

【0145】

また、変異には、以前に同定されている腫瘍特異的変異も含まれ得る。既知の腫瘍変異は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースに見出すことができる。

【0146】

個体のＤＮＡまたはＲＮＡにおける特定の変異またはアレルの存在を検出するために様々な方法が利用可能である。この分野での進歩により、正確、容易、かつ安価な大規模ＳＮＰジェノタイピングがもたらされた。例えば、いくつかの技術が報告されており、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンス法、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップのような各種ＤＮＡ「チップ」技術が含まれる。これらの方法では、標的遺伝子領域の増幅、典型的にはＰＣＲによるものを利用する。侵襲的切断、それに続く質量分析法または固定化南京錠型プローブ（ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）及びローリングサークル増幅による小シグナル分子の生成に基づく、さらに他の方法。特異的変異を検出するための当該技術分野で公知の方法のいくつかを以下にまとめる。

【0147】

ＰＣＲベースの検出手段には、複数のマーカーの同時のマルチプレックス増幅が含まれ得る。例えば、サイズが重複しない、同時に分析可能なＰＣＲ産物を生成するようＰＣＲプライマーを選択することは当該技術分野において周知である。別法として、差別的に標識されるプライマーを用いて異なるマーカーを増幅させることが可能であり、したがって、各々を差別的に検出することができる。当然のことながら、ハイブリダイゼーションに基づく検出手段により、試料中の複数のＰＣＲ産物の差別的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重分析を可能にする他の技術が当該技術分野で公知である。

【0148】

ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡにおける一塩基多型の分析を容易にするために、いくつかの方法が開発されている。例えば、一塩基多型は、例えばＭｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）に開示されているような、特殊化したエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用することによって検出することができる。その方法によれば、多型性部位に対して３’に隣接するアレル配列に相補的なプライマーが、特定の動物またはヒトから取得された標的分子にハイブリダイズすることができるようにされている。標的分子上の多型性部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含有している場合、その誘導体が、ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれる。そのような組み込みは、プライマーをエキソヌクレアーゼに対して耐性にし、それによりその検出を可能にする。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性が分かっているため、そのプライマーがエキソヌクレアーゼに対して耐性になったという所見から、標的分子の多型性部位に存在するヌクレオチドが、反応に使用されるヌクレオチド誘導体のヌクレオチドに相補的であることが明らかになる。この方法には、大量の外来性配列データの決定を必要としないという利点がある。

【0149】

多型性部位のヌクレオチドの同一性を決定するために溶液を用いる方法を使用することができる。Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法でのように、多型性部位に対して３’に隣接するアレル配列に相補的なプライマーが用いられる。この方法では、多型性部位のヌクレオチドに相補的である場合にプライマーの末端に組み込まれる標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を使用して、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。

【0150】

Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして知られる代替的方法がＧｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．によって報告されている（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法では、標識されたターミネーターと、多型性部位に対して３’にある配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する。したがって、組み込まれている標識されたターミネーターは、評価される標的分子の多型性部位に存在するヌクレオチドによって決定され、かつ、それに相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、不均一相アッセイであり得、ここで、プライマーまたは標的分子は、固相に固定化されている。

【0151】

ＤＮＡの多型性部位を評価するためのプライマー誘導型ヌクレオチド組み込み手順がいくつか報告されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９－７７８４（１９８９）、Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）、Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４－６９２（１９９０）、Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３－１１４７（１９９１）、Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９－１６４（１９９２）、Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７－１１２（１９９２）、Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１－１７５（１９９３））。これらの方法は、ＧＢＡとは異なり、多型性部位における塩基同士を識別するために標識デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する。そのようなフォーマットでは、シグナルは組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランで生じる多型は、ランの長さに比例するシグナルを生じさせ得る、（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６－５９（１９９３））。

【0152】

多数のイニシアチブが、ＤＮＡまたはＲＮＡの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得している。合成時リアルタイム１分子シークエンシング技術は、蛍光ヌクレオチドの検出に依存しており、配列決定されるテンプレートに相補的なＤＮＡの新生鎖に蛍光ヌクレオチドが組み込まれる。一方法では、３０～５０塩基長のオリゴヌクレオチドが、カバーガラスに５’末端で共有結合により係留されている。これらの係留鎖は２つの機能を果たす。第１に、テンプレートが、表面に結合したオリゴヌクレオチドに相補的な捕捉尾部を伴って構成されている場合に、それらの係留鎖は標的テンプレート鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成するテンプレート指向性のプライマー伸長のためのプライマーとして作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの、合成、検出、及び色素を除去するための色素－リンカーの化学的切断を使用する配列決定のための定位置部位として機能する。各サイクルには、ポリメラーゼ／標識ヌクレオチドの混合物の添加、すすぎ、イメージング及び色素の切断が含まれる。代替的方法では、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、各ヌクレオチドは、ガンマ－リン酸に結合しているアクセプター蛍光部分で色分けされる。システムは、蛍光修飾したヌクレオチドが新たな鎖に組み込まれる際の、蛍光タグ付きポリメラーゼと蛍光修飾したヌクレオチドとの相互作用を検出する。他の合成時解読技術もまた存在する。

【0153】

変異を同定するために任意の好適な合成時解読プラットフォームを使用することができる。上記のように、現在４つの主要な合成時解読プラットフォームが利用可能である：Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａの１Ｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステム。合成時解読プラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても報告されている。いくつかの実施形態では、配列決定される複数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体に固定化するために、捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位をテンプレートの３’及び／または５’末端に付加することができる。支持体に共有結合で結合している相補配列に捕捉配列をハイブリダイズすることによって、核酸を支持体に結合させることができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも呼ばれる）は、ユニバーサルプライマーとして二重の役目を果たし得る支持体に結合している配列に相補的な核酸配列である。

【0154】

捕捉配列の代替として、結合対（例えば、米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されるような、例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、またはアビジン－ビオチンの対等）のメンバーを、その結合対それぞれの第２のメンバーでコートされた表面に捕捉されるべき各断片に連結することができる。

【0155】

捕捉の後、例えば、テンプレート依存性合成時解読を含め、例えば、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号に記載のような、一分子検出／シークエンシングによって配列を分析することができる。合成時解読では、表面に結合した分子が、ポリメラーゼ存在下で複数の標識ヌクレオチド三リン酸に曝露される。成長鎖の３’末端に組み込まれる標識ヌクレオチドの順序によってテンプレートの配列が決定される。これは、リアルタイムで実施することも、ステップアンドリピート方式で実施することもできる。リアルタイム分析の場合、各ヌクレオチドに異なる光学標識を組み込むことができ、組み込まれたヌクレオチドの刺激に複数のレーザーを利用することができる。

【0156】

シークエンシングにはまた、他の超並列シークエンシングまたは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の技術及びプラットフォームも含まれ得る。超並列シークエンシング技術及びプラットフォームのさらなる例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ、Ｔｈｅｒｍｏ ＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、Ｐａｃ Ｂｉｏ ＲＳ ＩＩまたはＳｅｑｕｅｌ、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｒｅａｄｅｒ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮである。追加で同様の現在の超並列シークエンシング技術、及びこれらの技術の将来の世代を使用することができる。

【0157】

本明細書に記載される方法に使用するための核酸試料を取得するために、任意の細胞種または組織を用いることができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料は、腫瘍もしくは既知の技術（例えば、静脈穿刺）により得られる体液、例えば、血液、または唾液から得ることができる。別法として、乾燥試料（例えば、毛髪または皮膚）で核酸試験を実施することができる。さらに、ある試料をシークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、組織型が腫瘍と同じである正常組織からシークエンシングのために取得することができる。ある試料をシークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、腫瘍と比べて組織型が異なる正常組織からシークエンシングのために取得することができる。

【0158】

腫瘍には、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵がん、脳腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、及びＴ細胞リンパ性白血病、非小細胞肺がん、及び小細胞肺がんのうちの１つ以上が含まれ得る。

【0159】

別法として、タンパク質質量分析法を使用して、腫瘍細胞上でＭＨＣタンパク質に結合している変異ペプチドの存在を同定または検証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸溶出させ、その後、質量分析法を使用して同定することができる。

【0160】

ＩＶ．抗原
抗原には、ヌクレオチドまたはポリペプチドが含まれ得る。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であり得る。したがって、ワクチンに有用な抗原には、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が含まれ得る。

【0161】

本明細書では、本明細書に開示の方法によって同定される腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、既知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、及び本明細書に開示の方法によって同定される変異ポリペプチドまたはそれらの断片を開示する。ネオアンチゲンペプチドは、それらのコード配列との関連において説明することができ、その場合、ネオアンチゲンには、関連ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

【0162】

本明細書ではまた、正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織において発現が変化していることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するペプチド、例えば、正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織で異常に発現されることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドも開示する。抗原ペプチドが由来し得る好適なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報を管理している。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。腫瘍抗原（例えば、共通腫瘍抗原及び腫瘍ネオ抗原）には、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国出願第１７／０５８，１２８号に記載のものが含まれ得るが、これに限定されない。抗原ペプチドは、それらのコード配列との関連において説明することができ、その場合、抗原には、関連ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

【0163】

本明細書ではまた、感染症生物、対象における感染、または対象の感染細胞と関連する任意のポリペプチドに由来するペプチドも開示する。抗原は、感染症生物のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に由来し得る。感染症生物のポリペプチド配列には、病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び／または寄生虫由来ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。感染症生物には、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、エボラ、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、チクングニアウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、デング熱ウイルス、オルチミクソウイルス科（ｏｒｔｈｙｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス、及び結核が含まれるが、これらに限定されない。

【0164】

本明細書では、本明細書に開示の方法によって同定される感染症生物特異的な抗原またはエピトープを含む単離されたペプチド、既知の感染症生物特異的な抗原またはエピトープを含むペプチド、及び本明細書に開示の方法によって同定される変異ポリペプチドまたはそれらの断片を開示する。抗原ペプチドは、それらのコード配列との関連において説明することができ、その場合、抗原には、関連ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

【0165】

本明細書に記載されるベクター及び関連組成物を使用して、任意の生物からの抗原、例えば、それらの毒素もしくは他の副生成物を送達し、生物もしくはその副生成物と関連する感染症もしくは他の有害反応を予防及び／または治療することができる。

【0166】

ワクチンに組み込むことができる（例えば、カセットにしてコードされる）抗原には、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する病原性ウイルス等のウイルスに対してヒトまたは非ヒト動物を免疫化するのに有用な免疫原が含まれる。抗原は、様々なウイルス科から選択され得る。対抗する免疫応答が望まれる望ましいウイルス科の例には、ピコルナウイルス科が含まれ、これには、感冒の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、及びＡ型肝炎ウイルス等のヒトエンテロウイルスが含まれるエンテロウイルス属；ならびに主に非ヒト動物での、口蹄疫の原因であるアプトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）属が含まれる。ウイルスのうちピコルナウイルス科の中では、標的抗原には、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びＶＰＧが含まれる。別のウイルス科には、カルシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）科が含まれ、これにはノーウォーク群のウイルスが包含され、これらは流行性胃腸炎の重要な病原体である。ヒト及び非ヒト動物での免疫応答を刺激するための標的抗原に使用するために望ましいさらに別のウイルス科はトガウイルス科であり、これにはアルファウイルス属が含まれ、これには、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎及び西部ウマ脳炎、ならびに風疹ウイルス等のルビウイルスが含まれる。フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）には、デングウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス及びダニ媒介性脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎またはコロナウイルス科から生成される場合があり、これには、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）等の多数の非ヒトウイルス、及びヒト呼吸器コロナウイルスが含まれ、これらは、感冒及び／または非Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎を引き起こす場合がある。コロナウイルス科の中では、標的抗原には、Ｅ１（Ｍタンパク質またはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓタンパク質またはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたはヘマグルチン－エルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ－ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）の糖タンパク質（コロナウイルスすべてに存在するわけではない）、またはＮ（ヌクレオカプシド）が含まれる。さらに他の抗原は、ラブドウイルス科に対してターゲティングされ得、これには、ベシクロウイルス属（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、及びリッサウイルス全般（例えば狂犬病）が含まれる。ラブドウイルス科の中では、好適な抗原は、Ｇタンパク質またはＮタンパク質に由来し得る。マールブルグウイルス及びエボラウイルス等の出血熱ウイルスが含まれるフィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）は、好適な抗原源であり得る。パラミクソウイルス科には、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ウブラウイルス（ムンプスウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、モルビリウイルス（麻疹及びイヌジステンパーを含む）、ならびに呼吸器多核体ウイルスが含まれるニューモウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから配列が入手可能な糖（Ｇ）タンパク質及び融合（Ｆ）タンパク質）が含まれる。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科の中に分類され、好適な抗原源であり得る（例えば、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科には、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス属（リフトバレー熱）、ハンタウイルス属（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン熱（ｈｅｍａｈａｇｉｎ ｆｅｖｅｒ）ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビ羊病）及び様々な未分類のブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）が含まれる。アレナウイルス科では、ＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原源が得られる。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス属（小児に急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス属、及びカルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）属（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）が含まれる。レトロウイルス科にはオンコリビリナル（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）亜科が含まれ、これには、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ、レンチビリナル（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（これには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、及びスプマビリナル（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）が含まれる）のようなヒト及び動物の疾患が包含される。レンチウイルスの中から、多くの好適な抗原が報告されており、容易に選択することができる。好適なＨＩＶ抗原及びＳＩＶ抗原の例には、非限定的に、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、及びＲｅｖといったタンパク質、ならびにそれらの様々な断片が含まれる。例えば、Ｅｎｖタンパク質の好適な断片には、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１等のそのサブユニット、またはより小さなそれらの断片、例えば、少なくとも約８アミノ酸長のもの、のうちのいずれかが含まれ得る。同様に、ｔａｔタンパク質の断片が選択され得る。［米国特許第５，８９１，９９４号及び米国特許第６，１９３，９８１号を参照のこと。］また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２－２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１）、及びＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４（６ Ａｐｒ．２００１）に記載のＨＩＶタンパク質及びＳＩＶタンパク質も参照のこと。別の例では、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶの免疫原性タンパク質もしくはペプチドを使用して、融合タンパク質または他の免疫原性分子が形成され得る。例えば、２００１年８月２日に公開されたＷＯ０１／５４７１９、及び、１９９９年４月８日に公開されたＷＯ９９／１６８８４に記載のＨＩＶ－１ Ｔａｔ及び／またはＮｅｆ融合タンパク質及び免疫化レジメンを参照のこと。本発明は、本明細書に記載されるＨＩＶ及び／またはＳＩＶの免疫原性タンパク質もしくはペプチドに限定されない。さらに、これらのタンパク質に対する様々な改変は、報告されているか、または当業者であれば容易に行うことができる。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記載されている改変ｇａｇタンパク質を参照のこと。さらに、任意の所望のＨＩＶ免疫原及び／またはＳＩＶ免疫原が、単独または組み合わせで送達され得る。そのような組み合わせには、単一ベクターからかまたは複数のベクターからの発現が含まれ得る。パポーバウイルス科には、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵウイルス及びＪＣＵウイルス）及びパピローマウイルス亜科（がんまたは乳頭腫の悪性進行と関連する）が含まれる。アデノウイルス科には、呼吸器疾患及び／または腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルス科ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科には、単純ウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス属（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を包含するアルファヘルペスウイルス亜科（ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）、ならびにサイトメガロウイルス属（ヒトＣＭＶ）、ムロメガロウイルス属）が含まれるベータヘルペスウイルス亜科（ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）、ならびにリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、及びラジノウイルス属が含まれるガンマヘルペスウイルス亜科（ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）が含まれる。ポックスウイルス科には、オルソポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）及びワクシニア属（牛痘））、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、ブタポックスウイルス属を包含するコードポックスウイルス亜科（ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｙｉｒｉｎａｅ）、ならびにエントモポックスウイルス亜科（ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｙｉｒｉｎａｅ）が含まれる。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎ウイルスが含まれる。好適な抗原源であり得る分類対象外ウイルスの１つは、デルタ型肝炎ウイルスである。さらに他のウイルス源には、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス及び豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスが含まれ得る。アルファウイルス科には、ウマ動脈炎ウイルス及び様々な脳炎ウイルスが含まれる。

【0167】

ワクチンに組み込むことができる（例えば、カセットにしてコードされる）抗原には、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する、細菌、真菌、寄生性微生物もしくは多細胞寄生虫が含まれる病原体に対して、ヒトまたは非ヒト動物を免疫化するのに有用な免疫原も含まれる。細菌性病原体の例には、病原性グラム陽性球菌が含まれ、肺炎連鎖球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、及び連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）が含まれる。病原性グラム陰性球菌には、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、淋菌（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。病原性腸内グラム陰性桿菌には、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシドバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びエイケネラ属（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス属（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ））；モラクセラ属（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ）；フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルシニア属（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ属（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ならびにスピリルム属（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）が含まれる。グラム陽性桿菌には、リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ブタ丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ（ｃｈｏｌｅｒａ）；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；及びバルトネラ症が含まれる。病原性嫌気性菌によって引き起こされる疾患には、破傷風；ボツリヌス症；他のクロストリジウム；結核；ハンセン病；及び他のマイコバクテリアが含まれる。特定の細菌種の例は、限定することなく、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、赤痢菌、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）複合体、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘモリチカ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）である。病原性スピロヘータによる疾患には、梅毒；トレポネーマ症：イチゴ腫、ピンタ及び風土病梅毒；及びレプトスピラ症が含まれる。高病原体細菌及び病原性真菌によって引き起こされる他の感染症には、アクチノミセス症／放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症（クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、醸母菌症（ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ））、ヒストプラスマ症（ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ））及びコクチジオイデス真菌症（コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ））；カンジダ症（カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ））、アスペルギルス症（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ））、及びムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫及びクロモミコーシス；及び皮膚糸状菌症が含まれる。リケッチア感染症には、チフス熱、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、及びリケッチア痘症が含まれる。マイコプラズマ感染症及びクラミジア感染症の例には、肺炎マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；及び周産期クラミジア感染症が挙げられる。病原性真核生物は、病原性の原生動物及び蠕虫を包含し、それらにより引き起こされる感染症には、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症（例えば、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）によって引き起こされる）；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症（例えば、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）によって引き起こされる）；ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）感染症；トリカン（Ｔｒｉｃｈａｎ）感染症；トキソプラズマ感染症（トキソプラズマ原虫）；バベシア症；ジアルジア症（例えば、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）によって引き起こされる）；施毛虫症（例えば、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）によって引き起こされる）；フィラリア症；住血吸虫症（例えば、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）によって引き起こされる）；線虫感染症；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）または吸虫（ｆｌｕｋｅ）感染症；及び条虫（サナダムシ）感染症が挙げられる。他の寄生虫感染症は、特に回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、及びニューモシスチス・カリニによって引き起こされ得る。

【0168】

本明細書ではまた、感染症生物、対象における感染、または対象の感染細胞と関連する任意のポリペプチドに由来するペプチドも開示する。抗原は、感染症生物の核酸配列またはポリペプチド配列に由来し得る。感染症生物のポリペプチド配列には、病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び／または寄生虫由来ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。感染症生物には、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、エボラ、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、チクングニアウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、デング熱ウイルス、オルチミクソウイルス科ウイルス、及び結核が含まれるが、これらに限定されない。

【0169】

抗原は、腫瘍細胞、感染細胞、または樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む免疫細胞等の細胞の細胞表面に提示されると予測されるものを選択することができる。抗原は、免疫原性であると予測されるものを選択することができる。

【0170】

抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下：ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満であるＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドの場合は８～１５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸の長さ、プロテアソームによる切断を促進するペプチドの内部または近傍での配列モチーフの存在、及びＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、のうちの少なくとも１つを含むことができる。ＭＨＣクラスＩＩペプチドの場合は６～３０、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０アミノ酸の長さ、細胞外もしくはリソソームでのプロテアーゼ（例えば、カテプシン）による切断またはＨＬＡ－ＤＭに触媒されるＨＬＡ結合を促進するペプチドの内部もしくは近傍での配列モチーフの存在。

【0171】

１つ以上の抗原が腫瘍の表面に提示され得る。１つ以上の抗原が感染細胞の表面に提示され得る。

【0172】

１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であり得、例えば、対象でのＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激する能力がある。１つ以上の抗原は、感染症を有するかまたは有すると疑われる対象において免疫原性であり得、例えば、対象でのＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激する能力がある。１つ以上の抗原は、感染症のリスクのある対象において免疫原性であり得、例えば、その感染症に対する免疫学的防御（すなわち、免疫）を提供する、対象でのＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激する能力、例えば、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、またはその感染症に特異的な抗体の産生を刺激する等の能力がある。

【0173】

１つ以上の抗原は、１つ以上の抗原を認識する抗体（例えば、腫瘍または感染症抗原を認識する抗体）の産生等のＢ細胞応答を刺激する能力があり得る。抗体は、直鎖ポリペプチド配列を認識することができるか、または二次及び三次構造を認識することができる。したがって、Ｂ細胞抗原には、直鎖ポリペプチド配列または二次構造及び三次構造を有するポリペプチドが含まれ得、それらとしては、全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン、または二次構造及び三次構造を有することが既知であるかもしくは予測される任意のポリペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍または感染症抗原に対するＢ細胞応答を刺激する能力がある抗原はそれぞれ、腫瘍細胞または感染症生物の表面に見られる抗原であり得る。腫瘍または感染症抗原に対するＢ細胞応答を誘発する能力がある抗原はそれぞれ、腫瘍または感染症生物で発現される細胞内ネオアンチゲンであり得る。

【0174】

１つ以上の抗原には、Ｔ細胞応答を刺激する能力がある抗原（例えば、予測されるＴ細胞エピトープ配列等のペプチド）と、Ｂ細胞応答を刺激する能力がある別個の抗原（例えば、全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン）の組み合わせが含まれ得る。

【0175】

対象での自己免疫応答を刺激する１つ以上の抗原は、対象のためのワクチン作製との関連では、考慮から除外することができる。

【0176】

少なくとも１つの抗原ペプチド分子（例えば、エピトープ配列）のサイズは、限定するわけではないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、またはそれ以上のアミノ分子残基、及びそこから導き出せる任意の範囲を含むことができる。具体的な実施形態では抗原ペプチド分子は５０アミノ酸以下である。

【0177】

抗原ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩの場合は、１５残基長以下、通常は約８～約１１残基、特に９または１０残基からなり、ＭＨＣクラスＩＩの場合は、６以上３０以下の残基であり得る。

【0178】

必要に応じて、より長いペプチドをいくつかの方法で設計することができる。ある場合では、ＨＬＡアレルでのペプチドの提示可能性が予測されているかまたは既知である場合、より長いペプチドは、（１）個々の提示されるペプチドが、各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端へ向かって２～５アミノ酸の伸長を有する、（２）提示されたペプチドの一部または全部と、各々について伸長された配列との連結、のいずれかからなり得る。別の場合では、シークエンシングにより腫瘍内に存在する長い（１０残基超）ネオエピトープ配列が明らかになる場合（例えば、新規ペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルーまたはイントロン包含による）、より長いペプチドは、（３）新規の腫瘍特異的または感染症特異的なアミノ酸の領域全体からなり、したがって、計算によるかまたはインビトロ試験に基づいた、最も強力なＨＬＡ提示の短いペプチドの選択の必要性が省かれる。いずれの場合も、より長いペプチドの使用により、患者細胞による内因性プロセシングが可能になり、より効果的な抗原提示及びＴ細胞応答の刺激がもたらされ得る。より長いペプチドにはまた、腫瘍または感染症生物でそれぞれ発現されるもの等の、ペプチドの全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン、及びそれらの組み合わせも含まれ得る。Ｂ細胞応答を刺激するために、より長いペプチド（例えば、全長タンパク質、タンパク質サブユニット、またはタンパク質ドメイン）及びそれらの組み合わせを含めることができる。

【0179】

抗原ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示され得る。いくつかの態様では、抗原ペプチド及びポリペプチドはＨＬＡタンパク質上に提示され、親和性が野生型ペプチドよりも高い。いくつかの態様では、抗原ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれより低いＩＣ５０を有し得る。

【0180】

いくつかの態様では、抗原ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に自己免疫応答を誘導しない、及び／または免疫寛容を引き起こさない。

【0181】

少なくとも２つ以上の抗原ペプチドを含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つの別個のペプチドを含有する。少なくとも２つの別個のペプチドは、同じポリペプチドに由来し得る。別個のポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方で異なっていることを意味する。ペプチドには、腫瘍特異的変異が含まれ得る。腫瘍特異的ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来し得るか、あるいは正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織において発現が変化していることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチド、例えば、正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織で異常に発現されることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するペプチドであり得る。ペプチドは、感染症生物と関連することが既知であるかまたは疑われている任意のポリペプチドに由来し得るか、あるいは正常な細胞もしくは組織と比較して感染細胞において発現が変化していることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するペプチドであり得る（例えば、発現が宿主細胞に限定されている感染症のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが含まれる、感染症のポリヌクレオチドまたはポリペプチド）。抗原ペプチドが由来し得る好適なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＧＥＮＩＥ）データベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報を管理している。ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥは、臨床グレードのがんゲノムデータを集約し、それらを何万ものがん患者からの臨床転帰と関連付けている。いくつかの態様では、腫瘍特異的変異は、特定のがん種のドライバー変異である。ペプチドには、ＫＲＡＳ変異（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、及び／またはＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈの変異）が含まれ得る。

【0182】

所望の活性または特性を有する抗原ペプチド及びポリペプチドを修飾して、ある特定の所望の属性、例えば薬理学的特性の改善を提供し、一方で、未修飾ペプチドが所望のＭＨＣ分子と結合して適切なＴ細胞を活性化させるという生物学的活性を増大させるかまたはその実質的にすべてを少なくとも保持するようにすることができる。例えば、抗原ペプチド及びポリペプチドは、保存的または非保存的な置換等の様々な変更を受ける可能性があり、その場合、そのような変更により、それらの使用における特定の利点、例えば、ＭＨＣの結合、安定性または提示の改善等が提供され得る。保存的置換とは、あるアミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似する別のアミノ酸残基に置き換えること、例えば、ある疎水性残基を別の残基に、もしくはある極性残基を別の残基に置き換えることを意味する。置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組み合わせが含まれる。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ－アミノ酸を使用してプローブされ得る。そのような修飾は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－２８４（１９７９）、及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されている、周知のペプチド合成手順を使用して行うことができる。

【0183】

様々なアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの修飾は、ペプチド及びポリペプチドの安定性をインビボで増大させる際に特に有用であり得る。安定性は、多数の方法でアッセイされ得る。例えば、ペプチダーゼ及び様々な生物学的媒体、例えば、ヒトの血漿及び血清が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１－３０２（１９８６）を参照のこと。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して好都合に決定され得る。プロトコルは一般に以下のとおりである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、非熱非働化）を、使用前に遠心分離により脱脂する。次いで、血清をＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。所定の時間間隔で少量の反応溶液を取り出し、６％トリクロロ酢酸またはエタノールの水溶液に加える。混濁反応試料を１５分間冷却（４℃）し、その後、沈殿した血清タンパク質を遠心にかけてペレットにする。その後、安定性特異的なクロマトグラフィー条件を使用した逆相ＨＰＬＣによって、ペプチドの存在を決定する。

【0184】

ペプチド及びポリペプチドは、血清中半減期改善以外の所望の属性が得られるよう、修飾され得る。例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を刺激する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を刺激する能力がある少なくとも１つのエピトープを含有する配列への結合によって増強され得る。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー複合体は、スペーサー分子によって連結され得る。スペーサーは典型的には、生理学的条件下で実質的に非荷電である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物等の比較的小さい中性分子で構成される。スペーサーは典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意選択で存在するスペーサーは同じ残基で構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーでもホモオリゴマーでもあり得ることが理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは一般には少なくとも１つまたは２つの残基、より一般には３～６つの残基である。別法として、ペプチドは、スペーサーを用いずにＴヘルパーペプチドに連結され得る。

【0185】

抗原ペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接連結することができ、またペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれにおいてもスペーサーを介して連結することもできる。抗原ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれのアミノ末端も、アシル化が可能である。例示的Ｔヘルパーペプチドには、破傷風トキソイド８３０～８４３、インフルエンザ３０７～３１９、マラリアスポロゾイト周囲３８２～３９８及び３７８～３８９が含まれる。

【0186】

タンパク質またはペプチドは、標準的分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然物からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成等の、当業者に公知の任意の技術によって作製可能である。様々な遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースに見出すことができる。そのようなデータベースの１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈウェブサイトに設けられたＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術または当業者に公知であろう技術を使用して、増幅及び／または発現が可能である。別法として、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの様々な市販の調製物が当業者に公知である。

【0187】

さらなる態様では、抗原には、抗原ペプチドまたはその部分をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖及び／または二本鎖、あるいは天然ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの安定化形態、例えば、チオリン酸骨格を有するポリヌクレオチド等、あるいはそれらの組み合わせのいずれかの、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得、イントロンを含有する場合もあれば、含有しない場合もある。抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、発現が改善するよう転写、翻訳、転写後プロセシング、及び／またはＲＮＡ安定性を改善すること等を介して、配列最適化が可能である。例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、コドンが最適化されたものであり得る。本明細書で「コドン最適化」とは、所与の生物のコドンバイアスに関して使用頻度の低いコドンを、使用頻度の高い同義コドンに置き換えることを指す。ポリヌクレオチド配列を、転写後プロセシングが改善するよう最適化することができ、例えば、意図しないスプライシングが減少するよう、スプライシングモチーフ（例えば、標準及び／または潜在的／非標準のスプライスドナー配列、分岐配列、及び／またはアクセプター配列）の除去、及び／またはバイアスに優先されるスプライシング現象への外因性スプライシングモチーフ（例えば、スプライスドナー配列、分岐配列、及び／またはアクセプター配列）の導入等を介して最適化することができる。外因性イントロン配列には、ＳＶ４０に由来するもの（例えば、ＳＶ４０ミニイントロン）及び免疫グロブリンに由来するもの（例えば、ヒトβ－グロビン遺伝子）が含まれるが、これらに限定されない。外因性イントロン配列は、プロモーター／エンハンサー配列と抗原配列の間に組み込まれ得る。発現ベクターに使用するための外因性イントロン配列は、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７ Ｊｕｌ ５；３６３（２）：２８８－３０２）に詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ポリヌクレオチド配列を、転写安定性が改善するよう、例えば、ＲＮＡ不安定性モチーフ（例えば、ＡＵリッチエレメント及び３’ＵＴＲモチーフ）及び／または反復ヌクレオチド配列の除去を介して最適化することができる。ポリヌクレオチド配列を、正確な転写が改善するよう、例えば、潜在的転写イニシエーター及び／またはターミネーターの除去を介して最適化することができる。ポリヌクレオチド配列を、翻訳及び翻訳精度が改善するよう、例えば、潜在的ＡＵＧ開始コドン、早期ポリＡ配列、及び／または二次構造モチーフの除去を介して最適化することができる。ポリヌクレオチド配列を、転写産物の核外輸送が改善するよう、構成輸送要素（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送因子（ＲＴＥ）、またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）の付加等を介して最適化することができる。発現ベクターに使用するための核外輸送シグナルは、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７ Ｊｕｌ ５；３６３（２）：２８８－３０２）に詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ポリヌクレオチド配列を、ＧＣ含量に関して、例えば、所与の生物の平均ＧＣ含量が反映されるよう最適化することができる。配列最適化により、転写、翻訳、転写後プロセシング、及び／またはＲＮＡ安定性等の１つ以上の配列特性のバランスを取ることができる。配列最適化により、転写、翻訳、転写後プロセシング、及びＲＮＡ安定性のそれぞれのバランスの取れた最適配列を生成することができる。ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（ＩＤＴ）、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、ＳＧＩ－ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）等の配列最適化アルゴリズムが当業者に公知である。抗原をコードするタンパク質の１つ以上の領域を別々に配列最適化することができる。

【0188】

さらに別の態様では、ポリペプチドまたはその部分を発現する能力がある発現ベクターを提供する。様々な細胞型の発現ベクターが当該技術分野において周知であり、過度の実験を伴うことなく選択することができる。一般に、ＤＮＡは、プラスミド等の発現ベクター内に、発現のための適切な配向及び正しいリーディングフレームで挿入される。必要に応じて、所望の宿主により認識される、適切な転写調節性及び翻訳調節性の制御ヌクレオチド配列にＤＮＡを連結することができるが、そのような制御は一般に発現ベクターで利用可能である。その後、標準的技術により宿主にベクターが導入される。ガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに見出すことができる。

【0189】

Ｖ．ワクチン組成物
本明細書ではまた、特異的免疫応答、例えば、腫瘍特異的免疫応答または感染症生物特異的免疫応答を生じさせる能力がある免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も開示する。ワクチン組成物は典型的には、１つまたは複数の、例えば、本明細書に記載の方法を使用して選択されるか、あるいは病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び／または寄生虫由来ペプチドから選択される抗原を含む。ワクチン組成物はワクチンとも呼ばれ得る。

【0190】

ワクチンは、１～３０個のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の異なるペプチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の異なるペプチド、または１２、１３、もしくは１４個の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドには、翻訳後修飾が含まれ得る。ワクチンは、１～１００個、もしくはそれ以上のヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれ以上の異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の異なるヌクレオチド配列、または１２、１３、もしくは１４個の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、１～３０個の抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれ以上の異なる抗原配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の異なる抗原配列、または１２、１３、もしくは１４個の異なる抗原配列を含有することができる。

【0191】

ワクチンは、１～３０個の抗原コード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれ以上の異なる抗原コード核酸配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の異なる抗原コード核酸配列、または１２、１３、もしくは１４個の異なる抗原コード核酸配列を含有することができる。抗原コード核酸配列とは、「抗原カセット」の部分をコードする抗原を指し得る。抗原カセットの特徴については本明細書で詳述されている。抗原コード核酸配列は、１つ以上のエピトープコード核酸配列を含有することができる（例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードする抗原コード核酸配列）。

【0192】

ワクチンは、１～３０個の別個のエピトープコード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、もしくはそれ以上の別個のエピトープコード核酸配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の別個のエピトープコード核酸配列、または１２、１３、もしくは１４個の別個のエピトープコード核酸配列を含有することができる。エピトープコード核酸配列とは、個々のエピトープ配列のための配列、例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードする抗原コード核酸配列中のＴ細胞エピトープのそれぞれを指し得る。

【0193】

ワクチンは、エピトープコード核酸配列の少なくとも２つのリピートを含有することができる。本明細書で使用される、「反復」（または互換的に「繰り返し」）とは、抗原コード核酸配列内での同一の核酸エピトープをコードする核酸配列（本明細書に記載される任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）の２回以上の反復を指す。一例では、カセットの抗原コード核酸配列部分は、エピトープコード核酸配列の少なくとも２回の反復をコードする。さらなる非限定的な例では、カセットの抗原コード核酸配列部分は、複数の別個のエピトープをコードし、別個のエピトープのうちの少なくとも１つは、別個のエピトープをコードする核酸配列の少なくとも２回の反復によってコードされる（すなわち、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列）。例示的な非限定的例では、抗原コード核酸配列は、エピトープコード核酸配列によってコードされるエピトープＡ、Ｂ、及びＣをコードし、エピトープコード配列Ａ（Ｅ_Ａ）、エピトープコード配列Ｂ（Ｅ_Ｂ）、及びエピトープコード配列Ｃ（Ｅ_Ｃ）、ならびに別個のエピトープのうちの少なくとも１つの反復を有する例示的な抗原コード核酸配列は、以下の式によって例示されるが、これらに限定されない。
－ １つの別個のエピトープの反復（エピトープＡの反復）：
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ、または
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ
－ 複数の別個のエピトープの反復（エピトープＡ、Ｂ、及びＣの反復）：
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ、または
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ
－ 複数の別個のエピトープの多回反復（エピトープＡ，Ｂ，及びＣの反復）：
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ、または
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ

【0194】

上記の例は限定的なものではなく、別個のエピトープのうちの少なくとも１つの反復を有する抗原コード核酸配列は、別個のエピトープの各々を任意の順序または頻度でコードすることができる。例えば、順序及び頻度は、別個のエピトープのランダムな配置、例えば、エピトープＡ、Ｂ、及びＣを用いる例では式Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｂが可能である。

【0195】

また、本明細書では抗原コードカセットも提供され、この抗原コードカセットは、５’から３’方向へ下式：
（Ｅ_ｘ－（Ｅ^Ｎ _ｎ）_ｙ）_ｚ
で表される、少なくとも１つの抗原コード核酸配列を有し、
式中、Ｅは、別個のエピトープコード核酸配列等のヌクレオチド配列を表し、
ｎは、別々の別個のエピトープコード核酸配列の数を表し、かつ、０を含めた任意の整数であり、
Ｅ^Ｎは、それぞれの対応するｎの、別々の別個のエピトープコード核酸配列を構成するヌクレオチド配列を表し、
ｚ回の反復ごとに、ｘ＝０または１、各ｎについてｙ＝０または１、及びｘまたはｙの少なくとも一方＝１、かつ
ｚ＝２以上であり、ここで、抗原コード核酸配列は、Ｅ、所与のＥ^Ｎ、またはそれらの組み合わせの少なくとも２回の反復を含む。

【0196】

各ＥまたはＥ^Ｎは、独立して、本明細書に記載の任意のエピトープコード核酸配列（例えば、感染症Ｔ細胞エピトープ及び／またはネオアンチゲンエピトープをコードするペプチド）を含むことができる。例えば、各ＥまたはＥ^Ｎは、独立して、５’から３’方向へ式（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）で表されるヌクレオチド配列を含むことができ、その場合、Ｎは、各ＥまたはＥ^Ｎと関連する別個のエピトープコード核酸配列を含み、ｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１である。使用可能なエピトープ及びリンカーは本明細書に詳述されており、例えば、Ｖ．Ａ．抗原カセットを参照されたい。

【0197】

エピトープコード核酸配列（任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）の反復は、配列同士を直鎖状に直接連結され得る（例えば、上記例示のようにＥ_Ａ－Ｅ_Ａ－・・・）。エピトープコード核酸配列の反復は、１つ以上の追加のヌクレオチド配列によって区切られ得る。一般に、エピトープコード核酸配列の反復は、本明細書に記載の組成物に適用可能な任意のサイズのヌクレオチド配列によって区切られ得る。一例では、エピトープコード核酸配列の反復は、別々の別個のエピトープコード核酸配列（例えば、Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ・・・、上記例示のように）によって区切られ得る。反復が、単一の別々の別個のエピトープコード核酸配列によって区切られており、各エピトープコード核酸配列（任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）が２５アミノ酸長のペプチドをコードする例では、反復は７５ヌクレオチドによって区切られ得、例えば、Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ａ・・・で表される抗原コード核酸の場合、Ｅ_Ａは７５ヌクレオチドによって区切られている。例を用いて説明すると、２５ｍｅｒの抗原であるＴｒｐ１（ＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱ）及びＴｒｐ２（ＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴ）の反復をコードする配列ＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴを有する抗原コード核酸では、Ｔｒｐ１の反復は２５ｍｅｒのＴｒｐ２によって区切られており、したがって、Ｔｒｐ１エピトープコード核酸配列の反復は、７５ヌクレオチドのＴｒｐ２エピトープコード核酸配列で区切られている。反復が、２、３、４、５、６、７、８、または９個の別々の別個のエピトープコード核酸配列によって区切られており、各エピトープコード核酸配列（任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）が２５アミノ酸長のペプチドをコードする例では、反復はそれぞれ、１５０、２２５、３００、３７５、４５０、５２５、６００、または６７５個のヌクレオチドによって区切られ得る。

【0198】

一実施形態では、異なるペプチド及び／またはポリペプチド、あるいはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子等の異なるＭＨＣ分子と会合する能力を持つよう選択される。いくつかの態様では、１つのワクチン組成物は、出現頻度が最も高いＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する能力があるペプチド及び／またはポリペプチドのためのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２つの好ましい、少なくとも３つの好ましい、または少なくとも４つの好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する能力がある異なる断片を含むことができる。

【0199】

前記ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答及び／または特異的ヘルパーＴ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答及び特異的ヘルパーＴ細胞応答を刺激する能力があり得る。

【0200】

前記ワクチン組成物は、特異的Ｂ細胞応答（例えば、抗体反応）を刺激する能力があり得る。

【0201】

前記ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び／または特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答及び特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的ヘルパーＴ細胞応答及び特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。

【0202】

ワクチン組成物はさらに、アジュバント及び／または担体を含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例は、本明細書で以下に記載される。組成物は、担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞等、例えば、Ｔ細胞にペプチドを提示する能力がある樹状細胞（ＤＣ）等と会合することができる。

【0203】

アジュバントは、ワクチン組成物内に混合することにより抗原に対する免疫応答を増大させるか、そうでなければ修正する、任意の物質である。担体は、足場構造、例えば、抗原を会合させることができるポリペプチドまたは多糖であり得る。任意選択で、アジュバントは、共有結合または非共有結合により結合される。

【0204】

アジュバントが抗原に対する免疫応答を増大させる能力は、典型的には、免疫介在性反応の大幅もしくは実質的な増大、または疾患症状の軽減により示される。例えば、液性免疫の増大は典型的には、抗原に対して産生された抗体の力価の大幅な増大によって示され、及びＴ細胞活性の増大は、典型的には、細胞の増殖、または細胞傷害性、またはサイトカイン分泌の増大に示される。アジュバントはまた、免疫応答を、例えば、主に液性またはＴｈによる応答を主に細胞性またはＴｈによる応答に変えることによって変化させ得る。

【0205】

好適なアジュバントには、１０１８ ＩＳＳ、ミョウバン、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクター系、ＰＬＧ微粒子、レジキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニン由来のＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、ならびにＲｉｂｉのＤｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ等の所有権のある他のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。不完全フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦ等のアジュバントが有用である。樹状細胞に対して特異的ないくつかの免疫アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製物が、以前に報告されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７；Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）。サイトカインも使用され得る。いくつかのサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織への遊走に影響を与えること（例えば、ＴＮＦ－アルファ）、Ｔリンパ球に対する効率的抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を促進すること（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１及びＩＬ－４）（参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ－１２）（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）に直接関連している。

【0206】

ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドもまた、ワクチンという状況ではアジュバントの効果を増強させることが報告されている。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９と結合するＲＮＡ等の他のＴＬＲ結合分子も使用され得る。

【0207】

有用なアジュバントの他の例には、化学修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非－ＣｐＧ細菌ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに治療薬及び／またはアジュバントとして作用し得るシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５等の免疫活性小分子及び抗体が含まれるが、これらに限定されない。アジュバント及び添加物の量及び濃度は、過度の実験を伴うことなく当業者により容易に決定され得る。追加のアジュバントには、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）等のコロニー刺激因子が含まれる。

【0208】

ワクチン組成物は、複数の異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療用組成物は、上記のものまたはそれらの組み合わせのいずれかを含め、任意のアジュバント物質を含むことができる。また、ワクチン及びアジュバントを一緒に、または任意の適切な順序で別々に投与可能であることも企図される。

【0209】

担体（または賦形剤）は、アジュバントとは独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増大させるために特に変異体の分子量を増加させること、安定性を付与すること、生物学的活性を増大させること、または血清中半減期を延長することであり得る。さらに、担体は、ペプチドをＴ細胞に提示するのを助けることができる。担体は、当業者に既知の任意の好適な担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であり得る。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン等、免疫グロブリン、またはホルモン、例えば、インスリンもしくはパルミチン酸等であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫化の場合、担体は一般に、ヒトに許容され、かつ安全な、生理学的に許容される担体である。ただし、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは好適な担体である。別法として、担体は、デキストラン、例えばセファロースであり得る。

【0210】

細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来性抗原それ自体ではなく、ＭＨＣ分子に結合したペプチドという形態にある抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣの三量体複合体が存在する場合に可能である。これに一致して、ペプチドがＣＴＬの活性化に使用されるだけではなく、さらなるＡＰＣがそれぞれのＭＨＣ分子と共に加えられる場合、免疫応答が増強され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ワクチン組成物はさらに、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有する。

【0211】

抗原はまた、ウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォーム、例えば、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、または第２世代、第３世代もしくは第２／第３世代ハイブリッドのレンチウイルス及び特定の細胞型もしくは受容体を標的にするよう設計された任意の世代の組換えレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１，Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８，Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０，Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）等に含めることもできる。上記のウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォームのパッケージング容量に応じて、この手法では、１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列に隣接する場合もあれば、リンカーによって区切られている場合も、細胞内コンパートメントを標的とする１つ以上の配列が先行する場合もある（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０を参照のこと）。宿主への導入時、感染細胞は抗原を発現し、それによりペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答が刺激される。免疫プロトコルに有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ：カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫に有用な多種多様な他のワクチンベクター、例えば、チフス菌ベクター等は本明細書での説明から当業者に明らかであろう。

【0212】

Ｖ．Ａ．抗原カセット
１つ以上の抗原の選択、「抗原カセット」のクローニング及び構築ならびにウイルスベクターへのその挿入に用いられる方法は、本明細書で提供される教示を考慮すれば、当業者の技量の範囲内である。「抗原カセット」または「カセット」とは、選択された抗原または複数の抗原（例えば、抗原コード核酸配列）と、抗原を転写し、転写された産物を発現するために必要な他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。選択された抗原または複数の抗原とは、別個のエピトープ配列を指し得、例えば、カセット内の抗原コード核酸配列は、エピトープが転写され、発現されるよう、エピトープコード核酸配列（または複数のエピトープコード核酸配列）をコードすることができる。抗原または複数の抗原は、転写が可能な方法で調節性成分に機能的に連結され得る。そのような成分には、ウイルスベクターをトランスフェクトされた細胞において抗原の発現を誘導することができる従来の調節エレメントが含まれる。したがって、抗原カセットは、抗原に連結され、かつ、組換えベクターの選択ウイルス配列内に他の任意選択の調節エレメントと共に位置する、選択されたプロモーターを含有することもできる。カセットには、１つ以上の病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、寄生虫由来ペプチド、及び／または腫瘍由来ペプチド等の１つ以上の抗原が含まれ得る。カセットは、１つ以上の抗原コード核酸配列を有することができ、例えば、複数の抗原コード核酸配列を含有するカセットは、それぞれ独立して別々のプロモーターに機能的に連結されている、及び／または他のマルチシストン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｏｎｉｃ）の系、例えば、２Ａリボソームスキッピング配列要素（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列要素等を使用して一緒に連結されている。リンカーはまた、ＴＥＶまたはフーリンの切断部位等の切断部位を有することができる。切断部位を有するリンカーを、他の要素、例えば、多シストロン性の系にあるものと組み合わせて使用することができる。非限定的な例を用いて説明すると、フーリンプロテアーゼ切断部位を２Ａリボソームスキッピング配列要素と組み合わせて使用して、フーリンプロテアーゼ切断部位が、翻訳後の２Ａ配列の除去を促進するよう構成されるようにすることができる。複数の抗原コード核酸配列を含有するカセットでは、各抗原コード核酸配列は、１つ以上のエピトープコード核酸配列を含有することができる（例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードする抗原コード核酸配列）。

【0213】

有用なプロモーターは、構成的プロモーターまたは調節（誘導性）プロモーターであり得、発現される抗原の量の制御を可能にする。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサーのプロモーターである［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照のこと］。別の望ましいプロモーターには、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーター／エンハンサーが含まれる。さらに別のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリ細胞質ベータアクチンプロモーターである［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］。他の好適または望ましいプロモーターは、当業者により選択され得る。

【0214】

前記抗原カセットにはまた、ウイルスベクター配列にとって異種の核酸配列も含まれ得、これには、転写物（ポリ（Ａ）、ポリＡまたはｐＡ）の効率的なポリアデニル化のためのシグナルをもたらす配列、及び機能的なスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位を有するイントロンが含まれる。本発明の例示的ベクターで用いられる一般的なポリＡ配列は、パポーバウイルスＳＶ－４０に由来するものである。ポリＡ配列は一般に、抗原に基づく配列の後、ウイルスベクター配列の前のカセット内に挿入され得る。一般的なイントロン配列はまたＳＶ－４０に由来し得、ＳＶ－４０ Ｔイントロン配列と呼ばれる。抗原カセットはまた、プロモーター／エンハンサー配列と抗原の間に位置するようなイントロンを含有することもできる。これら及び他の一般的ベクター要素の選択は、従来通りであり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及びそこに引用されている参考文献を参照のこと］、そのような配列の多くが商業的及び産業的供給源ならびにＧｅｎｂａｎｋから利用可能である。

【0215】

抗原カセットは、１個以上の抗原を有することができる。例えば、所与のカセットには、１～１０、１～２０、１～３０、１０～２０、１５～２５、１５～２０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の抗原が含まれ得る。抗原は、互いに直接連結され得る。抗原はまた、リンカーと互いに連結され得る。抗原は、ＮからＣへ、またはＣからＮへ等の、互いに対して任意の配向が可能である。

【0216】

本明細書の他の箇所に記載があるように、抗原カセットは、選択され得る部位の中でも特に、ＶＥＥ骨格の欠失させた構造タンパク質等のウイルスベクター内の任意の選択欠失の部位か、またはＣｈＡｄに基づくベクターのＥ１遺伝子領域欠失もしくはＥ３遺伝子領域欠失の部位に位置させることができる。

【0217】

前記抗原カセットは、５’から３’方向へ、各要素の順番に並べられた配列を表すために、以下の式：
（Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ）_Ｚ－（Ｐ２_ｈ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ）_Ｗ－Ｇ３_ｇ
を使用して表すことができ、式中、Ｐ及びＰ２は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、各Ｘについて、対応するＮｃは、核酸配列をコードするエピトープであり、各Ｙについて、対応するＵｆは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列（例えば、ユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列）である。ユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含むことができる。ユニバーサル配列は、破傷風トキソイドペプチドを含むことができる。ユニバーサル配列は、ＰＡＤＲＥペプチドを含むことができる。ユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥペプチドを含むことができる。存在する要素の数を選択することにより、組成物及び規則配列をさらに定義することができ、例えば、ａ＝０または１、ｂ＝０または１、ｃ＝１、ｄ＝０または１、ｅ＝０または１、ｆ＝１、ｇ＝０または１、ｈ＝０または１、Ｘ＝１～４００、Ｙ＝０、１、２、３、４または５、Ｚ＝１～４００、及びＷ＝０、１、２、３、４または５である。

【0218】

一例では、存在する要素には、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝０、Ｘ＝１０、Ｙ＝２、Ｚ＝１、及びＷ＝１が含まれ、これは、追加のプロモーターは存在せず（例えば、ＲＮＡアルファウイルスまたはＣｈＡｄＶの骨格等のベクター骨格で提供されるプロモーターヌクレオチド配列のみが存在する）、１０個のＭＨＣクラスＩエピトープが存在し、５’リンカーが各Ｎに存在し、３’リンカーが各Ｎに存在し、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープが存在し、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを連結するリンカーが存在し、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープの５’末端を最終ＭＨＣクラスＩエピトープの３’リンカーに連結するリンカーが存在し、かつ、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープの３’末端をベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）に連結するリンカーが存在することを表している。

【0219】

前記抗原カセットの３’末端をベクター骨格（例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格）に連結することの例には、３’の１９ｎｔ ＣＳＥ等のベクター骨格によって提供される３’ＵＴＲ要素に直接連結することが含まれる。抗原カセットの５’末端をベクター骨格（例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格）に連結することの例には、サブゲノムプロモーター配列（例えば、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列）、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、もしくは２４ｎｔ ＣＳＥ等の、ベクター骨格のプロモーターまたは５’ＵＴＲ要素に直接連結することが含まれる。

【0220】

他の例には、以下が含まれる：ａ＝１であり、ここで、ベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列以外のプロモーターが存在することを表し；ａ＝１、かつ、Ｚが１より大きい場合、ベクター骨格によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列以外の複数のプロモーターが存在し、各々が、核酸配列をコードする１つ以上の別個のＭＨＣクラスＩエピトープの発現を誘導し；ｈ＝１であり、ここで、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列の発現を誘導するための別個のプロモーターが存在することを表し；かつ、ｇ＝０であり、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列は、存在する場合に、ベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）に直接連結されていることを表す。例えば、ＣｈＡｄＶベクター骨格は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下に置かれた抗原カセットを有することができる。

【0221】

他の例には、存在している各ＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーを有し得る場合、３’リンカーを有し得る場合、どちらも有し得ない場合、または両方を有し得る場合が含まれる。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカーと３’リンカーの両方を有し得るが、他のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する他の例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカーまたは３’リンカーのいずれかを有し得るが、他のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。

【0222】

複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが、同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーと３’リンカーの両方を有し得るが、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する他の例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーまたは３’リンカーのいずれかを有し得るが、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。

【0223】

他の例には、存在している各抗原が、５’リンカーを有し得る場合、３’リンカーを有し得る場合、どちらも有し得ない場合、または両方を有し得る場合が含まれる。複数の抗原が同じ抗原カセット内に存在する例では、一部の抗原は５’リンカーと３’リンカーの両方を有し得るが、他の抗原は５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。複数の抗原が同じ抗原カセット内に存在する他の例では、一部の抗原は５’リンカーまたは３’リンカーのいずれかを有し得るが、他の抗原は５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。

【0224】

プロモーターヌクレオチド配列であるＰ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格等のベクター骨格によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列と同じであり得る。例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって提供されるプロモーター配列であるＰｎ及びＰ２は、各々がサブゲノムプロモーター配列（例えば、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列）またはＣＭＶプロモーターを含むことができる。プロモーターヌクレオチド配列であるＰ及び／またはＰ２は、ベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列とは異なり得、また、互いに異なり得る。

【0225】

５’リンカーであるＬ５は、天然配列または非天然配列であり得る。非天然配列には、ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰが含まれるが、これらに限定されない。３’リンカーであるＬ３もまた、天然配列または非天然配列であり得る。さらに、Ｌ５及びＬ３は、両方が天然配列であること、両方が非天然配列であること、または一方が天然であり、他方が非天然であることが可能である。各Ｘについて、アミノ酸リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０アミノ酸長であり得る。

【0226】

アミノ酸リンカーＧ５は各Ｙについて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。各Ｙについて、アミノ酸リンカーはまた、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０アミノ酸長であり得る。

【0227】

アミノ酸リンカーＧ３は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。Ｇ３はまた、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０アミノ酸長であり得る。

【0228】

各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、及びＢ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原の組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ及びＭＨＣクラスＩＩエピトープの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ及びＢ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原の組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ及びＢ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原の組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原をコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎはまた、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎはまた、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。

【0229】

１つ以上の抗原をコードするカセットは、７００ヌクレオチド以下であり得る。１つ以上の抗原をコードするカセットは７００ヌクレオチド以下であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる（例えば、免疫原性ポリペプチドをコードする２つの別個の感染症または腫瘍に由来する核酸配列をコードすることができる）。１つ以上の抗原をコードするカセットは７００ヌクレオチド以下であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは７００ヌクレオチド以下であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは７００ヌクレオチド以下であり得、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは７００ヌクレオチド以下であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の抗原を含めることができる。

【0230】

１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～７００ヌクレオチド長であり得る。１つ以上の抗原をコードするカセットは３７５～７００ヌクレオチド長であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる（例えば、免疫原性ポリペプチドをコードする２つの別個の感染症または腫瘍に由来する核酸配列をコードすることができる）。１つ以上の抗原をコードするカセットは３７５～７００ヌクレオチド長であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは３７５～７００ヌクレオチド長であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは３７５～７００ヌクレオチド長であり、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードする。１つ以上の抗原をコードするカセットは３７５～７００ヌクレオチド長であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の抗原を含めることができる。

【0231】

１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得る。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の抗原を含めることができる。

【0232】

１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得る。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。１つ以上の抗原をコードするカセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の抗原を含めることができる。

【0233】

場合によっては、さらなる抗原及び／またはエピトープをコードするカセット内の抗原またはエピトープは、コードされる他のものに対して免疫優性なエピトープであり得る。免疫優性は一般に、１つまたは少数の特定の免疫原性ペプチドのみへの免疫応答の偏向である。免疫優性は、免疫モニタリングプロトコルの一部として評価され得る。例えば、免疫優性は、コードされた抗原に対するＴ細胞及び／またはＢ細胞の応答を評価することにより評価され得る。

【0234】

免疫優性は、免疫優性抗原の存在が、１つ以上の他の抗原に対する免疫応答に与える影響として評価され得る。例えば、免疫優性抗原及びそのそれぞれの免疫応答（例えば、免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープ）は、別の抗原の免疫応答を、免疫優性抗原の非存在下での免疫応答と比べて低下させることができる。この低下は、免疫優性抗原の存在下での免疫応答が、治療に有効な応答とは見なされないようなものであり得る。例えば、他の抗原に対するＴ細胞応答が、免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープの非存在下で刺激される応答と比較してもはや治療に有効な応答と見なされない場合、ＭＨＣクラスＩエピトープは一般に免疫優性であると見なされる。免疫応答はまた、免疫優性抗原の非存在下での応答と比べて、検出限界未満または検出限界近くまで低下され得る。例えば、他の抗原に対するＴ細胞応答が、免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープの非存在下で刺激される応答と比較して検出限界以下である場合、ＭＨＣクラスＩエピトープは一般に免疫優性であると見なされる。一般に、免疫優性の評価は、免疫応答を刺激する能力がある２つの抗原間で、例えば、それぞれ、各エピトープを提示することが既知であるかまたは予測される同族ＭＨＣアレルを有する対象に投与されるワクチン組成物中の２つのＴ細胞エピトープ間で行われる。免疫優性は、疑わしい免疫優性抗原の存在下及び非存在下での、他の抗原に対する相対的免疫応答を評価することにより評価され得る。

【0235】

免疫優性は、２つ以上の抗原間の免疫応答の相対差として評価され得る。免疫優性とは、特定の抗原の免疫応答が、同じカセット内でコードされる別の抗原と比べて５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍であることを指し得る。免疫優性とは、特定の抗原の免疫応答が、同じカセット内でコードされる別の抗原と比べて１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、または５００倍であることを指し得る。免疫優性とは、特定の抗原の免疫応答が、同じカセット内でコードされる別の抗原と比べて１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、または５０００倍であることを指し得る。免疫優性とは、特定の抗原の免疫応答が、同じカセット内でコードされる別の抗原と比べて１０，０００倍であることを指し得る。

【0236】

場合によっては、免疫優性エピトープを含有するワクチン組成物を避けることが望ましい場合がある。例えば、免疫優性エピトープをコードするワクチンカセットの設計を避けることが望ましい場合がある。理論に拘束されることは望まないが、免疫優性エピトープを、追加のエピトープと一緒に投与すること及び／またはコードすることが、その追加のエピトープに対するワクチンの有効性を最終的には低下させる可能性を含めて、追加のエピトープに対する免疫応答を低下させる場合がある。例示的な非限定的例として、ＴＰ５３関連ネオエピトープ等のワクチン組成物は、免疫応答、例えばＴ細胞応答を、ＴＰ５３関連ネオエピトープに偏らせて、ワクチン組成物中の他の抗原またはエピトープ（例えば、ワクチン組成物中の１つ以上のＫＲＡＳ関連ネオエピトープ）に対する免疫応答にマイナスの影響（例えば、免疫応答が治療に有効な応答ではないところまで、及び／または検出限界未満まで免疫応答を低下させる）を与える場合がある。したがって、ワクチン組成物を、免疫優性エピトープを含有しないよう設計すること、例えば、免疫優性エピトープをコードしないようワクチンカセット（例えば、（ネオ）抗原コードカセット）を設計することができる。例えば、カセットは、対象にワクチン組成物にして投与される場合に、カセット内でコードされる別のエピトープに対する免疫応答を、その別のエピトープが免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープの非存在下で投与される場合の免疫応答と比べて低下させるエピトープをコードしない。別の例では、カセットは、対象にワクチン組成物にして投与される場合に、カセット内でコードされる別のエピトープに対する免疫応答を、その別のエピトープが免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープの非存在下で投与される場合の免疫応答と比べて検出限界未満まで低下させるエピトープをコードしない。別の例では、カセットは、対象にワクチン組成物にして投与される場合に、カセット内でコードされる別のエピトープに対する免疫応答を、その別のエピトープが免疫優性ＭＨＣクラスＩエピトープの非存在下で投与される場合の免疫応答と比べて低下させ、その免疫応答が治療に有効な応答ではないエピトープをコードしない。別の例では、カセットは、対象に投与されるワクチン組成物中の同じカセット内でコードされる別のエピトープと比べて、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍もしくは５０倍またはそれ以上の免疫応答を刺激するエピトープをコードせず、その場合、それぞれの抗原が対象での免疫応答を刺激する能力がある。別の例では、カセットは、対象に投与されるワクチン組成物中の同じカセット内でコードされる別のエピトープと比べて、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍もしくは５００倍またはそれ以上の免疫応答を刺激するエピトープをコードせず、その場合、それぞれの抗原が対象での免疫応答を刺激する能力がある。別の例では、カセットは、対象に投与されるワクチン組成物中の同じカセット内でコードされる別のエピトープと比べて、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、もしくは５０００倍またはそれ以上の免疫応答を刺激するエピトープをコードせず、その場合、それぞれの抗原が対象での免疫応答を刺激する能力がある。別の例では、カセットは、対象に投与されるワクチン組成物中の同じカセット内でコードされる別のエピトープと比べて１０，０００倍またはそれ以上の免疫応答をもたらすエピトープをコードせず、その場合、それぞれの抗原が対象での免疫応答を刺激する能力がある。

【0237】

Ｖ．Ｂ．免疫調節物質
本明細書に記載されるＣｈＡｄＶベクターまたは本明細書に記載されるアルファウイルスベクター等の本明細書に記載されるベクターは、少なくとも１つの抗原をコードする核酸を含むことができ、同じかまたは別個のベクターが、少なくとも１つの免疫調節物質コードする核酸を含むことができる。免疫調節物質には、免疫チェックポイント分子に結合して、その活性を遮断する結合分子（例えば、ｓｃＦｖ等の抗体）が含まれ得る。免疫調節物質には、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（ＩＬ－１２のｐ３５、ｐ４０、ｐ７０、及び／またはｐ７０融合コンストラクトを含む）、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１等のサイトカインが含まれ得る。免疫調節物質には、修飾サイトカイン（例えば、ｐｅｇＩＬ－２）が含まれ得る。ベクターは、抗原カセット、及び免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸分子を含むことができる。

【0238】

遮断または阻害の標的となり得る例示的な免疫チェックポイント分子には、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ、γδ、及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞に発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、及びＣＧＥＮ－１５０４９が含まれるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害物質には、抗体、もしくはその抗原結合断片、またはＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、及びＣＧＥＮ－１５０４９のうちの１つ以上に結合して、その活性を遮断または阻害する他の結合タンパク質が含まれる。例示的な免疫チェックポイント阻害物質には、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７－Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１遮断薬）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ－０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害物質）が含まれる。抗体をコードする配列は、当該技術分野の通常の技能を使用してＣ６８等のベクター内に操作が可能である。例示的な方法は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるＦａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｍａｙ；２３（５）：５８４－９０．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ １７に記載されている。

【0239】

Ｖ．Ｃ．ワクチンの設計及び製造に関する追加考慮事項
Ｖ．Ｃ．１．すべての腫瘍サブクローンを対象とするペプチドのセットの決定
すべてまたはほとんどの腫瘍サブクローンによって提示されるペプチドを意味する幹ペプチド（Ｔｒｕｎｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）に、ワクチン内に含めるための優先順位を付けることができる。任意選択で、提示され、かつ高い確率で免疫原性であると予測される幹ペプチドがない場合、または提示され、かつ高い確率で免疫原性であると予測される幹ペプチドの数が、追加の非幹ペプチドをワクチンに含めることができるほど十分に少ない場合は、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定し、ワクチンでカバーされる腫瘍サブクローンの数が最大限となるようにペプチドを選択することにより、さらなるペプチドに優先順位を付けることができる。

【0240】

Ｖ．Ｃ．２．抗原の優先順位付け
上記の抗原フィルターがすべて適用された後でも、ワクチン技術で支持できるよりも多くの候補抗原が、依然としてワクチンに含めるために利用可能な場合がある。さらに、抗原分析の様々な側面が依然として不確かな場合があり、ワクチン抗原候補の異なる特性間でのトレードオフが存在し得る。したがって、選択工程の各ステップにおける所定のフィルターの代わりに、統合的多次元モデル、すなわち、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を配し、統合的手法を使用して選択を最適化するモデルを考慮することができる。
１．自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（典型的には、自己免疫のリスクが低い方が好ましい）
２．シークエンシングアーチファクトの確率（典型的には、アーチファクトの確率の低い方が好ましい）
３．免疫原性の確率（典型的には、免疫原性の確率の高い方が好ましい）
４．提示の確率（典型的には、提示の確率の高い方が好ましい）
５．遺伝子発現（典型的には、発現の高い方が好ましい）
６．ＨＬＡ遺伝子の対象範囲（抗原のセットの提示に関与するＨＬＡ分子の数ガ大きいほど、腫瘍、感染症、及び／または感染細胞がＨＬＡ分子の下方制御もしくは変異を介して免疫攻撃から逃避する確率が低くなり得る）
７．ＨＬＡクラスの対象範囲（ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの両方を対象とすることにより、治療効果の確率が上がり、腫瘍または感染症の逃避の確率が下がり得る）

【0241】

さらに、任意選択で、抗原が、患者の腫瘍もしくは感染細胞の全部または一部で喪失または不活性化しているＨＬＡアレルにより提示されると予測される場合、それらの抗原をワクチン接種の優先順位から外す（例えば、除外する）ことができる。ＨＬＡアレルの喪失は、体細胞変異、ヘテロ接合性の消失、または遺伝子座のホモ接合性の欠失のいずれかによって起こる。ＨＬＡアレル体細胞変異の検出のための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。体細胞ＬＯＨ（ヘテロ接合性の消失）及びホモ接合性の欠失（ＨＬＡ遺伝子座を含む）の検出のための方法も同様に十分に報告されている。（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２、ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗原はまた、質量分析データから、予測抗原が予測ＨＬＡアレルにより提示されないことが示される場合にも優先順位から外され得る。

【0242】

Ｖ．Ｄ．自己増幅ＲＮＡベクター
一般に、すべての自己増幅ＲＮＡ（ＳＡＭ）ベクターは、自己複製ウイルスに由来する自己増幅骨格を含有する。用語「自己増幅骨格」とは、ウイルスゲノムの自己複製を可能にする、自己複製ウイルスの最小配列を指す。例えば、アルファウイルスの自己複製を可能にする最小配列には、非構造タンパク質媒介性増幅のための保存された配列（例えば、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及び／またはポリＡ配列）が含まれ得る。自己増幅骨格にはまた、ウイルスのサブゲノムＲＮＡの発現のための配列（例えば、アルファウイルスでは２６Ｓプロモーターエレメント）も含まれ得る。ＳＡＭベクターは、プラス鎖またはマイナス鎖自己複製ウイルスに由来する骨格を持つベクター等の、プラス鎖ＲＮＡポリヌクレオチドまたはマイナス鎖ＲＮＡポリヌクレオチドであり得る。自己複製ウイルスには、アルファウイルス、フラビウイルス（例えば、クンジンウイルス）、麻疹ウイルス、及びラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。自己複製ウイルスに由来するＳＡＭベクター系の例は、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８ Ｄｅｃ １３；２３（１２）．ｐｉｉ：Ｅ３３１０．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２３１２３３１０）に詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0243】

Ｖ．Ｄ．１．アルファウイルス生物学
アルファウイルスはトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。それらのメンバーは典型的には、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、マヤロウイルス、チクングニアウイルス、及びセムリキ森林ウイルス等の旧世界、または東部ウマ脳炎、アウラウイルス、フォートモーガンウイルス、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその派生株ＴＣ－８３等の新世界に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然アルファウイルスゲノムは典型的には、長さが約１２ｋｂであり、その最初の３分の２には、ウイルスゲノムの自己複製のためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子が含有され、最後の３分の１には、ビリオン産生のための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットが含有される（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。

【0244】

アルファウイルスのモデル生活環には、いくつかの異なる段階が伴う（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４，Ｊｏｓｅ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００９）。宿主細胞へのウイルスの吸着に続き、ビリオンが細胞内コンパートメント内の膜と融合し、最終的にサイトゾル内へのゲノムＲＮＡの放出をもたらす。プラス鎖の配向にある、５’のメチルグアニル酸キャップ及び３’のポリＡ尾部を含むゲノムＲＮＡは、翻訳されて、複製複合体を形成する非構造タンパク質ｎｓＰ１～４を生成する。感染初期にはその後、プラス鎖は複合体によりマイナス鎖のテンプレートに複製される。現在のモデルでは、複製複合体は、感染の進行につれてさらなるプロセシングを受け、そこから生じるプロセシングされた複合体が、全長プラス鎖ゲノムＲＮＡ、及び構造遺伝子を含有する２６Ｓサブゲノムのプラス鎖ＲＮＡの両方へのマイナス鎖の転写に切り替わる。アルファウイルスのいくつかの保存配列エレメント（ＣＳＥ）は、様々なＲＮＡ複製ステップにおいて役割を果たすことが確認されており、それらには、マイナス鎖テンプレートからのプラス鎖ＲＮＡの複製における５’ＵＴＲの相補鎖、ゲノムテンプレートからのマイナス鎖合成の複製における５１ｎｔ ＣＳＥ、マイナス鎖からのサブゲノムＲＮＡの転写におけるｎｓＰと２６Ｓ ＲＮＡの間の接合部領域での２４ｎｔ ＣＳＥ、及びプラス鎖テンプレートからのマイナス鎖合成における３’ １９ｎｔ ＣＳＥが含まれる。

【0245】

様々なＲＮＡ種の複製に続き、ウイルス粒子がウイルスの自然の生活環で典型的に構築される。２６Ｓ ＲＮＡが翻訳され、そこから生じたタンパク質がさらなるプロセシングを受けて、カプシドタンパク質、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびに２つの小ポリペプチドＥ３及び６Ｋ等の構造タンパク質が生成される（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。ウイルスＲＮＡのカプシド形成が起こり、通常はパッケージされるゲノムＲＮＡにのみ特異的なカプシドタンパク質を持ち、その後、ビリオンが組み立てられ、膜表面に出芽する。

【0246】

Ｖ．Ｄ．２．送達ベクターとしてのアルファウイルス
アルファウイルス（アルファウイルスの配列、特徴、及び他の要素を含む）を使用して、アルファウイルス系送達ベクター（アルファウイルスベクター（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、アルファウイルスウイルスベクター（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクター、または自己増幅ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）ベクターとも呼ばれる）を生成することができる。アルファウイルスは、以前から発現ベクター系として使用するために操作されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７，Ｒｈｅｍｅ ２００４）。アルファウイルスは、特に、異種抗原発現が所望され得るワクチンという状況において、いくつかの利点を提供する。宿主サイトゾルで自己複製するその能力のため、アルファウイルスベクターは一般に、細胞内に多くのコピー数の発現カセットを生成することができ、高レベルの異種抗原生成をもたらす。さらに、ベクターは一般に一過性であるため、バイオセーフティの改善、ならびにベクターに対する免疫寛容の誘導の減少をもたらす。一般に、公衆には、ヒトアデノウイルス等の他の標準的ウイルスベクターと比較して、アルファウイルスベクターに対する既存の免疫も欠いている。また、アルファウイルスに基づくベクターは一般に、感染細胞に対する細胞傷害性応答ももたらす。細胞傷害性は、発現された異種抗原に対する免疫応答を適切に刺激するために、ワクチンという状況ではある程度重要であり得る。ただし、所望の細胞傷害性の程度は綱渡り的であり得るため、ＶＥＥのＴＣ－８３株を含め、いくつかの弱毒化アルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例は、高レベルの抗原発現を可能にし、抗原に対する強い免疫応答を刺激し、ベクター自体に対する免疫応答を刺激せず、かつ安全な方法で使用可能である、アルファウイルス骨格を利用することができる。さらに、抗原発現カセットは、ＶＥＥまたはその弱毒化派生株ＴＣ－８３に由来する配列が含まれるがこれらに限定されない、ベクターが使用するアルファウイルス配列の最適化を介して、異なるレベルの免疫応答を刺激するよう設計可能である。

【0247】

アルファウイルス配列を使用して、いくつかの発現ベクター設計戦略が設計されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。一戦略では、アルファウイルスベクター設計には、２６Ｓプロモーター配列エレメントの第２のコピーを構造タンパク質遺伝子の下流に挿入し、それに続けて異種遺伝子を挿入することが含まれる（Ｆｒｏｌｏｖ １９９３）。したがって、天然の非構造タンパク質及び構造タンパク質に加え、異種タンパク質を発現する追加のサブゲノムＲＮＡが生成される。この系では、感染性ビリオンの生成のための全エレメントが存在するため、非感染細胞における発現ベクターの感染の繰り返しが発生し得る。

【0248】

別の発現ベクター設計では、ヘルパーウイルス系を利用している（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。この戦略では、構造タンパク質が異種遺伝子に置き換えられる。したがって、まだ無傷の非構造遺伝子に媒介されるウイルスＲＮＡの自己複製に続いて、２６ＳサブゲノムＲＮＡにより、異種タンパク質の発現が提供される。従来、構造タンパク質を発現する追加のベクターはその後、細胞株のコトランスフェクション等によりトランスで供給され、感染性ウイルスが生成される。系は、ＵＳＰＮ８，０９３，０２１に詳述されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヘルパーベクター系は、感染性粒子が形成される可能性を制限するという利益を提供し、したがって、バイオセーフティが改善する。さらに、ヘルパーベクター系はベクター全長を短縮し、複製及び発現の効率が改善する。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例は、アルファウイルス骨格を利用することができ、ここで、構造タンパク質は抗原カセットに置き換えられ、得られたベクターは、バイオセーフティの問題を減らすと同時に、発現ベクター全体のサイズの縮小による効率的な発現を促進する。

【0249】

Ｖ．Ｄ．３．インビトロでの自己増幅ウイルスの生成
ＲＮＡ生成のための当該技術分野で周知の好都合な技術は、インビトロ転写（ＩＶＴ）である。この技術では、まず所望のベクターのＤＮＡテンプレートが、当業者に周知の技術、例えば、クローニング、制限酵素消化、ライゲーション、遺伝子合成（例えば、化学合成及び／または酵素による合成）、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の標準的な分子生物学技術によって生成される。

【0250】

ＤＮＡテンプレートは、ＲＮＡへの転写が所望される配列（例えば、ＳＡＭ）の５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する。プロモーターには、Ｔ３、Ｔ７、Ｋ１１、またはＳＰ６等のバクテリオファージポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。選択される特定のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に応じて、所望の配列に加え、追加の５’ヌクレオチドを転写させることができる。例えば、標準Ｔ７プロモーターは、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧにより参照され得、ここで、所望の配列Ｎの生成のためにＤＮＡテンプレートＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＮを使用するＩＶＴ反応により、ｍＲＮＡ配列ＧＧ－Ｎがもたらされる。理論に拘束されることは望まないが、一般に、Ｔ７ポリメラーゼは、グアノシンで始まるＲＮＡ転写産物をより効率的に転写する。追加の５’ヌクレオチドが所望されない場合（例えば、追加のＧＧがない場合）、ＤＮＡテンプレートに含有されているＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、所望の配列（例えば、ＳＡＭベクターが由来する自己複製ウイルスの天然５’配列を有するＳＡＭ）の５’ヌクレオチドのみを含有する転写産物をもたらす配列であり得る。例えば、最小Ｔ７プロモーターは、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡにより参照され得、ここで、所望の配列Ｎの生成のためにＤＮＡテンプレートＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＮを使用するＩＶＴ反応により、ｍＲＮＡ配列Ｎがもたらされる。同様に、配列ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡにより参照される最小ＳＰ６プロモーターを、追加の５’ヌクレオチドを含まない転写産物を生成するために使用することができる。典型的ＩＶＴ反応では、ＤＮＡテンプレートは、適切なＲＮＡポリメラーゼ酵素、緩衝剤、及びヌクレオチド（ＮＴＰ）と共にインキュベートされる。

【0251】

得られたＲＮＡポリヌクレオチドを任意選択でさらに修飾することができ、これには、７－メチルグアノシンまたは関連構造等の５’キャップ構造の付加、及び任意選択で、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部が含まれるよう３’末端を修飾することが含まれるが、これに限定されない。修飾ＩＶＴ反応では、ＲＮＡは、ＩＶＴ中のキャップ類似体付加を介して共転写により５’キャップ構造でキャップ化される。キャップ類似体には、ジヌクレオチド（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ）キャップ類似体またはトリヌクレオチド（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ－Ｎ）キャップ類似体が含まれ得、ここで、Ｎは、ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを表す（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びウリジン等の、これらに限定されないリボヌクレオシド）。例示的キャップ類似体及びＩＶＴ反応におけるそれらの使用は、米国特許第１０，５１９，１８９号にも詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。考察されているように、Ｔ７ポリメラーゼは、グアノシンで始まるＲＮＡ転写産物をより効率的に転写する。グアノシンで始まっていないテンプレートでの転写効率を改善するために、トリヌクレオチドキャップ類似体（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ－Ｎ）を使用することができる。トリヌクレオチドキャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップ類似体（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ）を使用するＩＶＴ反応と比べて転写効率を、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはそれ以上高めることができる。

【0252】

５’キャップ構造はまた、ｍＲＮＡ ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及びＳ－アデノシルメチオニンヲ含有するワクシニアキャッピング系（例えば、ＮＥＢカタログ番号Ｍ２０８０）等を使用して、転写後に付加することが可能である。

【0253】

得られたＲＮＡポリヌクレオチドを、任意選択で、記載されているキャッピング技術とは別に、またはそれに加えてさらに修飾することができ、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部が含まれるよう３’末端を修飾することが含まれるが、これに限定されない。

【0254】

その後、ＲＮＡは、当該技術分野で周知の技術、例えば、フェノール－クロロホルム抽出またはカラム精製（例えば、クロマトグラフィーを用いる精製）を使用して精製可能である。

【0255】

Ｖ．Ｄ．４．脂質ナノ粒子による送達
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面は、ベクターそれ自体に対する免疫である（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、ある特定のヒトアデノウイルス系の場合のように、ベクターそれ自体に対する免疫を既に有している形の場合もあれば、ワクチン投与の後でベクターに対する免疫が発生している形の場合もある。後者は、プライミング用量とブースト用量が分かれている場合のように、同じワクチンの複数投与が実施される場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクター系が使用される場合、重要な考慮事項である。

【0256】

アルファウイルスベクターの場合、標準的送達方法は、カプシドタンパク質、Ｅ１タンパク質、及びＥ２タンパク質をトランスで提供して感染性ウイルス粒子を生成する、既に考察されているヘルパーウイルス系である。ただし、Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質は多くの場合、中和抗体の主な標的であることに留意することが重要である（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。したがって、感染性粒子が中和抗体により標的とされる場合には、標的細胞に目的抗原を送達するためにアルファウイルスベクターを使用することの有効性が低減され得る。

【0257】

ウイルス粒子媒介性の遺伝子送達の代替は、発現ベクターを送達するためのナノ材料の使用である（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。ナノ材料ビヒクルは重要なことには、非免疫原性物質で作製可能であり、一般に、送達ベクターそれ自体に対する免疫が刺激されることを回避できる。これらの材料には、脂質、無機ナノ材料、及び他の高分子材料が含まれ得るが、これらに限定されない。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であり得る。材料は、合成でも天然由来でもあり得、場合によっては生物分解性であり得る。脂質には、脂肪、コレステロール、リン脂質、脂質複合体が含まれ得、それらとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）、ワックス、油、グリセリド、及び脂溶性ビタミンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0258】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、両親媒性という脂質の性質が膜及び小胞様構造の形成を可能にするため、魅力的な送達システムである（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般に、これらの小胞は、標的細胞の膜内への吸収及びサイトゾル内への核酸の放出により発現ベクターを送達する。さらに、ＬＮＰは、特定の細胞型のターゲティングが促進されるよう、さらに修飾または機能化され得る。ＬＮＰ設計での別の考慮事項は、ターゲティング効率と細胞毒性の間のバランスである。脂質組成物には一般に、カチオン、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質の定義された混合物が含まれる。場合によっては、ＬＮＰの凝集を防ぐため、脂質の酸化を防ぐため、または追加の部分の結合を促進する官能性化学基を提供するために、特定の脂質を含める。脂質の組成は、ＬＮＰ全体のサイズ及び安定性に影響を与え得る。一例では、脂質組成物は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質組成物は、ＰＥＧもしくはＰＥＧ結合脂質、ステロール、または中性脂質等の１つ以上の他の脂質が含まれるよう製剤化され得る。

【0259】

血清に直接曝露される発現ベクター等の核酸ベクターでは、血清ヌクレアーゼによる核酸の分解または遊離核酸によるオフターゲットの免疫系刺激を含め、いくつかの望ましくない結果が生じる可能性がある。したがって、分解を回避すると同時に、潜在的オフターゲット作用も回避するために、アルファウイルスベクターの封入を使用することができる。ある特定の例では、アルファウイルスベクターは、送達ビヒクル内、例えば、ＬＮＰの水性内部内に、完全に封入されている。アルファウイルスベクターのＬＮＰ内封入は、マイクロ流体混合及びマイクロ流体液滴生成デバイスでの液滴生成等の当業者に周知の技術によって実施可能である。そのようなデバイスには、標準的Ｔ字型デバイスまたはフローフォーカス型デバイスが含まれるが、これらに限定されない。一例では、ＭＣ３またはＭＣ３様を含有する組成物等の所望の脂質製剤が、アルファウイルス送達ベクター及び他の所望の物質と並行して液滴生成デバイスに提供され、送達ベクター及び所望の物質が、ＭＣ３またはＭＣ３様を用いるＬＮＰの内部内に完全に封入される。一例では、液滴生成デバイスは、生産されるＬＮＰのサイズ範囲及び粒度分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、１～１０００ナノメートルの直径、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ナノメートルの範囲のサイズを有し得る。液滴生成後、発現ベクターを内包する送達ビヒクルをさらに処理または修飾して、それらを投与用に調製することができる。

【0260】

Ｖ．Ｅ．チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）
Ｖ．Ｅ．１．チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
１つ以上の抗原の（例えば、抗原カセットを介した）送達のためのワクチン組成物は、チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、様々な新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を提供することにより作製が可能である。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ばれる）のヌクレオチド配列（配列番号１を参照のこと）を、抗原送達のためのワクチン組成物に使用することができる。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターは、ＵＳＰＮ６，０８３，７１６に詳述されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣｈＡｄＶ６８を用いるベクター及び送達システムは、米国出願公開第ＵＳ２０２００１９７５００Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０２０２４３７１９Ａ１号に詳述されており、その各々は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0261】

さらなる態様では、Ｃ６８等のチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列を含む組換えアデノウイルス、及びその発現を導く制御配列に機能的に連結されている抗原カセットが本明細書で提供される。組換えウイルスは、哺乳類の細胞、好ましくはヒトの細胞に感染する能力があり、細胞において抗原カセット産物を発現させる能力がある。このベクターでは、天然のチンパンジーＥ１遺伝子、及び／またはＥ３遺伝子、及び／またはＥ４遺伝子を欠失させることができる。これらの遺伝子欠失部位のいずれにも抗原カセットを挿入することができる。抗原カセットには、抗原刺激された免疫応答が所望される対象となる抗原が含まれ得る。

【0262】

別の態様では、Ｃ６８等のチンパンジーアデノウイルスに感染した哺乳類細胞が本明細書で提供される。

【0263】

さらに別の態様では、チンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｃ６８由来）またはその機能的断片を発現する新規哺乳類細胞株が提供される。

【0264】

さらに別の態様では、哺乳類細胞に抗原カセットを送達するための方法が本明細書で提供され、細胞に、抗原カセットを発現するよう操作されているＣ６８等のチンパンジーアデノウイルスを有効量にて導入するステップを含む。

【0265】

さらに別の態様では、がんを治療するために、哺乳類宿主での免疫応答を刺激するための方法が提供される。この方法は、免疫応答が標的とする対象である腫瘍からの１つ以上の抗原をコードする抗原カセットを含むＣ６８等の組換えチンパンジーアデノウイルスを、有効量にて宿主に投与するステップを含むことができる。

【0266】

さらに別の態様では、感染症等の対象での疾患を治療または予防するために、哺乳類宿主での免疫応答を刺激するための方法が提供される。この方法は、免疫応答が標的とする対象である感染症等からの１つ以上の抗原をコードする抗原カセットを含むＣ６８等の組換えチンパンジーアデノウイルスを、有効量にて宿主に投与するステップを含むことができる。

【0267】

また、配列番号１の配列から得られるチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する非サル哺乳類細胞も開示する。遺伝子は、配列番号１のアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５からなる群から選択され得る。

【0268】

また、配列番号１の配列から得られる遺伝子を含むチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列を含む核酸分子も開示する。遺伝子は、配列番号１の前記チンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択され得る。いくつかの態様では、核酸分子は配列番号１を含む。いくつかの態様では、核酸分子は配列番号１の配列を含み、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を欠いている。

【0269】

また、配列番号１から得られるチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列を含むベクター、及び抗原カセットであって、異種宿主細胞におけるかかるカセットの発現を導く１つ以上の制御配列に機能的に連結されている、抗原カセット、も開示し、任意選択で、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なシスエレメントを少なくとも含み、シスエレメントは、抗原カセット及び制御配列に隣接している。いくつかの態様では、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子配列からなる群から選択される遺伝子を含む。いくつかの態様では、ベクターは、Ｅ１Ａ及び／またはＥ１Ｂ遺伝子を欠くことができる。

【0270】

本明細書ではまた、部分的に欠失したＥ４遺伝子を含むアデノウイルスベクターであって、欠失または部分的欠失Ｅ４ｏｒｆ２領域、及び欠失または部分的欠失Ｅ４ｏｒｆ３領域、ならびに任意選択で、欠失または部分的欠失Ｅ４ｏｒｆ４領域、を含む、アデノウイルスベクターも開示する。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３４，９４２の少なくとも部分欠失、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９５２～３５，３０５の少なくとも部分欠失、及び配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，３０２～３５，６４２の少なくとも部分欠失、のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９８０～３６，５１６のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９７９～３５，６４２のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ３、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、Ｅ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ２、及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の開始部位からＥ４Ｏｒｆ５の開始部位までのＥ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ３の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ４の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１１００ヌクレオチド、少なくとも１２００ヌクレオチド、少なくとも１３００ヌクレオチド、少なくとも１４００ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１６００ヌクレオチド、少なくとも１７００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも１９００ヌクレオチド、または少なくとも２０００ヌクレオチドであり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも７００ヌクレオチドであり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも１５００ヌクレオチドであり得る。Ｅ４欠失は、５０ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、９００ヌクレオチド以下、１０００ヌクレオチド以下、１１００ヌクレオチド以下、１２００ヌクレオチド以下、１３００ヌクレオチド以下、１４００ヌクレオチド以下、１５００ヌクレオチド以下、１６００ヌクレオチド以下、１７００ヌクレオチド以下、１８００ヌクレオチド以下、１９００ヌクレオチド以下、または２０００ヌクレオチド以下であり得る。Ｅ４欠失は、７５０ヌクレオチド以下であり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも１５５０ヌクレオチド以下であり得る。

【0271】

部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠く、配列番号１に示されるＥ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３４，９４２、ヌクレオチド３４，９５２～３５，３０５、及び配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，３０２～３５，６４２を欠くＥ４遺伝子配列を欠く、配列番号１に示されるＥ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９８０～３６，５１６を欠く、Ｅ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示され、かつ、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９７９～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、カセットを有することができ、ここで、カセットは、少なくとも１つのペイロード核酸配列を含み、かつ、カセットは、少なくとも１つのペイロード核酸配列に機能的に連結されている少なくとも１つのプロモーター配列を含む。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示されるＣｈＡｄＶ６８配列の１つ以上の遺伝子または制御配列を有することができ、任意選択で、１つ以上の遺伝子または制御配列は、配列番号１に示される配列のチンパンジーアデノウイルス末端逆位反復（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６を有することができ、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、任意選択で、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、及び／またはＥ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠く。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８を有することができ、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８の５’である。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６を有することができ、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、かつ、Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠く。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６を有することができ、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、かつ、Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠き、また配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８を有し、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８の５’である。

【0272】

部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠き、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６である、配列番号１に示されるＥ４遺伝子配列であり得、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、かつ、Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠き、また配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８を有し、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８の５’である。

【0273】

本明細書ではまた、抗原カセットを発現するよう操作されたＣ６８ベクター等の本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトされた宿主細胞も開示する。本明細書ではまた、ヒト細胞への本明細書に開示されるベクターの導入を介して導入された選択遺伝子を発現するヒト細胞も開示する。

【0274】

本明細書ではまた、抗原カセットを哺乳類細胞に送達するための方法も開示し、抗原カセットを発現するよう操作されたＣ６８ベクター等の本明細書に開示されるベクターを有効量にて前記細胞に導入することを含む。

【0275】

本明細書ではまた、本明細書に開示されるベクターを哺乳類細胞内に導入すること、細胞を好適な条件下で培養すること、及び抗原を生成することを含む、抗原を生成するための方法も開示する。

【0276】

Ｖ．Ｅ．２． Ｅ１を発現する補完細胞株
本明細書に記載される遺伝子のいずれかが欠失した組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するために、欠失遺伝子領域の機能は、ウイルスの複製及び感染性に必須であれば、ヘルパーウイルスまたは細胞株によって、すなわち、補完細胞株またはパッケージング細胞株によって組換えウイルスに供給が可能である。例えば、複製欠損型チンパンジーアデノウイルスベクターを作製ために、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株には、ＨＥＫ２９３またはそのバリアントが含まれ得る。チンパンジーＥ１遺伝子産物を発現する細胞株の作製のためのプロトコル（ＵＳＰＮ６，０８３，７１６の実施例３及び４）に従って、任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。

【0277】

チンパンジーアデノウイルスＥ１発現細胞株を同定するには、ＡＡＶ増強アッセイを使用することができる。このアッセイは、特徴付けられていない他の（例えば、他の種からの）アデノウイルスのＥ１遺伝子を使用して作製された細胞株でのＥ１機能を確認するために有用である。そのアッセイは、ＵＳＰＮ６，０８３，７１６の実施例４Ｂに記載されている。

【0278】

選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子、例えば、Ｅ１は、選択された親細胞株での発現のためのプロモーターの転写調節下にあり得る。この目的のために、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターを用いることができる。誘導性プロモーターの中には、亜鉛による誘導性のヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、またはグルココルチコイド、特に、デキサメタゾンによる誘導性のマウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターが含まれる。参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ９５／１３３９２号において特定されているプロモーター等の他の誘導性プロモーターも、パッケージング細胞株の生産に使用することができる。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の発現制御に構成的プロモーターを用いることもできる。

【0279】

親細胞は、任意の所望Ｃ６８遺伝子を発現する新規細胞株の作製のために選択され得る。制限することなく、そのような親細胞株は、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１８５］、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］、及びＷＩ－３８［ＣＣＬ７５］細胞であり得る。他の好適な親細胞株は、他の供給源から入手可能である。親細胞株には、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａが含まれ得る。

【0280】

Ｅ１発現細胞株は、組換えチンパンジーアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製に有用であり得る。本質的に同じ手順を使用して構築される、１つ以上の他のチンパンジーアデノウイルスの遺伝子産物を発現する細胞株は、それらの産物をコードする遺伝子が欠失した組換えチンパンジーアデノウイルスベクターの作製において有用である。さらに、他のヒトＡｄ Ｅ１遺伝子産物を発現する細胞株もまた、チンパンジー組換えＡｄの作製に有用である。

【0281】

Ｖ．Ｅ．３．ベクターとしての組換えウイルス粒子
本明細書に開示される組成物は、細胞に少なくとも１つの抗原を送達するウイルスベクターを含むことができる。そのようなベクターは、Ｃ６８等のチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列、及び抗原カセットであって、そのカセットの発現を導く制御配列に機能的に連結されている、抗原カセット、を含む。Ｃ６８ベクターは、感染哺乳類細胞においてカセットを発現させる能力がある。Ｃ６８ベクターは、１つ以上のウイルス遺伝子が機能的に欠失していてよい。抗原カセットは、プロモーター等の１つ以上の制御配列の制御下にある少なくとも１つの抗原を含む。任意選択のヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株は、欠失したアデノウイルス遺伝子の任意の必要産物をチンパンジーウイルスベクターに供給することができる。

【0282】

「機能的に欠失した」という用語は、遺伝子領域がもはや遺伝子発現の１つ以上の機能的産物を生成することができなくなるよう、十分な量の遺伝子領域が除去されるか、そうでなければ、例えば、変異または修飾によって改変されることを意味する。機能欠失をもたらし得る変異または修飾には、未成熟終止コドンの導入ならびに標準及び非標準の開始コドンの除去等のナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライシングもしくは他の転写プロセシングを変化させる変異、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。所望される場合、遺伝子領域全体が除去され得る。

【0283】

本明細書に開示されるベクターを形成する核酸配列の修飾、例えば、配列の欠失、挿入、及び他の変異は、標準的分子生物学的技術を使用して生成され得、それらは本発明の範囲内である。

【0284】

Ｖ．Ｅ．４．ウイルスプラスミドベクターの構築
本発明に有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子が機能的に欠失しており、任意選択で、他の変異、例えば、温度感受性変異または他の遺伝子の欠失を持つチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列はまた、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成する上でも有用であることが予測される。ヒトアデノウイルスから調製される相同アデノウイルスベクターは、公開されている文献に記載されている［例えば、上記Ｋｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、及びそこで引用されている参考文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照のこと］。

【0285】

ヒト（または他の哺乳類の）細胞への抗原カセットの送達に有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターの構築では、一連のアデノウイルス核酸配列をベクターで用いることができる。最小チンパンジーＣ６８アデノウイルス配列を含むベクターをヘルパーウイルスと併用して感染性組換えウイルス粒子を生成することができる。ヘルパーウイルスは、ウイルスの感染性及び最小チンパンジーアデノウイルスベクターの増殖に必要とされる必須遺伝子産物を提供する。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の１つ以上の選択欠失のみが、他の点では機能的なウイルスベクターで行われる場合、欠失させた遺伝子産物は、欠失した遺伝子機能をトランスで提供する選択パッケージング細胞株でウイルスを増殖させることにより、ウイルスベクター生成工程において供給可能である。

【0286】

Ｖ．Ｅ．５．組換え最小アデノウイルス
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスは、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスシスエレメントのみを含有するウイルス粒子である。すなわち、ベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列（複製起点として機能）ならびに天然５’パッケージング／エンハンサードメイン（線状Ａｄゲノムのパッケージング及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントに必要な配列を含有）を含有する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ９６／１３５９７号中の「最小」ヒトＡｄベクターの調製について記載されている技術を参照のこと。

【0287】

Ｖ．Ｅ．６．他の欠損アデノウイルス
組換え複製欠損アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列よりも多く含有することもできる。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の様々な部分の欠失、ならびにヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の任意選択の使用により形成される感染性ウイルス粒子を特徴とし得る。

【0288】

一例として、好適なベクターは、Ｃ６８アデノウイルス最初期遺伝子Ｅ１ａ及び遅初期（ｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ）遺伝子Ｅ１ｂの全部または十分な部分を、それらの正常な生物学的機能が排除されるよう欠失させることによって形成され得る。複製欠損型Ｅ１欠失ウイルスは、機能的アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含有する、対応遺伝子産物をトランスで提供する、チンパンジーアデノウイルスに形質転換された補完細胞株で増殖させた場合、感染性ウイルスを複製及び生成する能力がある。既知のアデノウイルス配列との相同性に基づき、当該技術分野のヒト組換えＥ１欠失アデノウイルスについても言えるように、得られる組換えチンパンジーアデノウイルスは多くの細胞型に感染する能力があり、抗原を発現することはできるが、細胞が非常に高い感染多重度で感染しない限り、チンパンジーＥ１領域ＤＮＡを持たない大半の細胞においては複製することはできないことが予測される。

【0289】

別の例として、Ｃ６８アデノウイルス遅初期遺伝子Ｅ３の全部または一部は、組換えウイルスの一部を形成するチンパンジーアデノウイルス配列から排除され得る。

【0290】

チンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターはまた、Ｅ４遺伝子の欠失を有して構築可能である。さらに別のベクターは、遅初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を含有することができる。

【0291】

欠失は、チンパンジーＣ６８アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１～Ｌ５のいずれかにおいても行うことができる。同様に、中期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２での欠失も一部の目的に有用であり得る。他の欠失は、他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子で行われ得る。

【0292】

上記で考察した欠失は個々に使用することができる、すなわち、アデノウイルス配列は、Ｅ１欠失のみを含有することができる。別法として、生物学的活性の破壊または低下に有効な遺伝子全体またはそれらの部分の欠失を任意の組み合わせで使用することができる。例えば、１つの例示的ベクターでは、アデノウイルスＣ６８配列は、Ｅ３欠失の有無を問わず、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子の欠失、またはＥ１、Ｅ２ａ及びＥ３遺伝子の欠失、またはＥ１及びＥ３遺伝子の欠失、またはＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４遺伝子の欠失等を有することができる。上述のように、そのような欠失を温度感受性変異等の他の変異と組み合わせて使用して、所望の結果を達成することができる。

【0293】

抗原を含むカセットは、任意選択で、チンパンジーＣ６８ Ａｄウイルスの任意の欠失領域に挿入され得る。別法として、所望される場合、既存の遺伝子領域にカセットを挿入して、その領域の機能を破壊することができる。

【0294】

Ｖ．Ｅ．７．ヘルパーウイルス
抗原カセットを運ぶために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルス断片を使用して、カセットを含有する感染性組換えウイルス粒子を生成するのに十分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を提供することができる。

【0295】

有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターコンストラクト中に存在しない、及び／またはベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞株によって発現されない、選択アデノウイルス遺伝子配列を含有する。ヘルパーウイルスは、複製欠損であり得、上記配列に加えて様々なアデノウイルス遺伝子を含有し得る。ヘルパーウイルスを、本明細書に記載されるＥ１発現細胞株と組み合わせて使用することができる。

【0296】

Ｃ６８の場合、「ヘルパー」ウイルスは、Ｃ６８ゲノムのＣ末端とＳｓｐＩをクリッピングすることにより形成される断片であり得、この場合、ウイルスの左端から約１３００ｂｐが除去される。次いで、このクリッピングされたウイルスは、プラスミドＤＮＡと共にＥ１発現細胞株にコトランスフェクトされ、それにより、プラスミドでのＣ６８配列との相同組換えによって組換えウイルスが形成される。

【0297】

ヘルパーウイルスはまた、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５－１６９８７（１９８９）、Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒ．１，１９９４）に記載されているようにポリカチオン複合体に形成することもできる。ヘルパーウイルスは、任意選択で、レポーター遺伝子を含有することができる。多数のそのようなレポーター遺伝子が当該技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の抗原カセットとは異なる、ヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在により、Ａｄベクターとヘルパーウイルスの両方を独立してモニターすることが可能になる。この第２のレポーターは、得られた組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を精製時に可能にするために使用される。

【0298】

Ｖ．Ｅ．８．ウイルス粒子のアセンブリ及び細胞株の感染
アデノウイルスの選択されたＤＮＡ配列、抗原カセット、及び他のベクター要素の、様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を生成するためのプラスミド及びベクターの使用はいずれも、従来技術を使用して達成することができる。そのような技術には、従来のｃＤＮＡクローニング技術、インビトロ組換え技術（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列をもたらす任意の好適な方法が含まれる。標準的トランスフェクション及びコトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミン等のリポソーム媒介性トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来方法には、ウイルスゲノムの相同組換え、寒天重層でのウイルスプラーク形成、シグナル発生を測定する方法等が含まれる。

【0299】

例えば、所望抗原カセットを含有するウイルスベクターの構築及びアセンブリの後、ヘルパーウイルス存在下、インビトロでベクターをパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。ヘルパーとベクター配列の間で相同組換えが起こり、これにより、ベクター中のアデノウイルス抗原の配列が複製されてビリオンカプシド内にパッケージングされることができ、組換えウイルスベクター粒子がもたらされる。

【0300】

得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルスは、選択された細胞への抗原カセットの導入に有用である。パッケージング細胞株で増殖させた組換えウイルスを用いたインビボ試験では、Ｅ１欠失組換えチンパンジーアデノウイルスは、非チンパンジー細胞、好ましくはヒト細胞にカセットを導入する際の有用性を示している。

【0301】

Ｖ．Ｅ．９．組換えウイルスベクターの使用
このように、抗原カセットを含有する得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記のようにアデノウイルスベクターとヘルパーウイルスまたはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株の協働により生成）により、対象にインビボまたはエキソビボで抗原を送達することができる効率的な遺伝子導入ビヒクルが提供される。

【0302】

上記の組換えベクターは、公開されている遺伝子治療法に従ってヒトに投与される。抗原カセットを担持するチンパンジーウイルスベクターは、好ましくは、生物学的に適合する溶液または薬学的に許容される送達ビヒクルに懸濁させて、患者に投与され得る。好適なビヒクルには、滅菌生理食塩水が含まれる。薬学的に許容される担体であることが既知であり、かつ当業者に周知の他の水性及び非水性の等張無菌注射液ならびに水性及び非水性の無菌懸濁液は、この目的のために用いられ得る。

【0303】

チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト細胞に形質導入するのに十分な量であり、かつ、過度の有害作用を伴わないか、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療上の利益を提供するのに十分なレベルの抗原導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与され、これは、医療分野の当業者により決定され得る。従来の及び薬学的に許容される投与経路には、肝臓への直接送達、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口及び他の非経口による投与経路が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、必要に応じて組み合わせてよい。

【0304】

ウイルスベクターの投与量は、主に、治療される病態、患者の年齢、体重及び健康等の要因に応じて異なるため、患者によって異なり得る。投与量は、任意の副作用に対する治療上の利益のバランスが取れるよう調整され、そのような投与量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて異なり得る。抗原の発現レベルをモニターして、投与量の投与頻度を決定することができる。

【0305】

組換え複製欠損アデノウイルスは、「薬学的に有効な量」、すなわち、所望の細胞にトランスフェクトするため、及びワクチン効果、すなわち、ある程度の測定可能なレベルの防御免疫を得るのに十分なレベルの選択遺伝子の発現を提供するための投与経路において有効な組換えアデノウイルスの量にて投与され得る。抗原カセットを含むＣ６８ベクターは、アジュバントと共に同時投与され得る。アジュバントは、特に、アジュバントがタンパク質である場合、ベクターとは別個（例えば、ミョウバン）であってもベクター内でコードされてもよい。アジュバントは、当該技術分野において周知である。

【0306】

従来の薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸、経口及び他の非経口による投与経路が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、必要に応じて組み合わされる場合もあれば、免疫原または疾患に応じて調整される場合もある。例えば、狂犬病予防では、皮下、気管内及び鼻腔内の経路が好ましい。投与経路は主に、治療される疾患の性質に応じて異なる。

【0307】

抗原に対する免疫レベルをモニターして、ブースターがある場合はその必要性を決定することができる。例えば、血清中の抗体価の評価の後、任意選択のブースター免疫が望ましい場合がある。

【0308】

ＶＩ．治療方法及び製造方法
対象での腫瘍特異的な免疫応答を刺激すること、腫瘍に対するワクチン接種をすること、対象でのがんの症状を、１つ以上の抗原、例えば、本明細書に開示される方法を使用して同定される複数の抗原を対象に投与することによって治療及び／または軽減すること、を行う方法もまた提供される。

【0309】

対象での感染症生物特異的な免疫応答を刺激すること、感染症生物に対するワクチン接種をすること、対象での感染症生物と関連する感染症の症状を、１つ以上の抗原、例えば、本明細書に開示される方法を使用して同定される複数の抗原を対象に投与することによって治療及び／または軽減すること、を行う方法もまた提供される。

【0310】

いくつかの態様では、対象は、がんと診断されているかまたはがんを発症するリスクがある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマまたは腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であり得る。腫瘍は、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、及び組織器官の他の腫瘍等の任意の固形腫瘍、ならびにリンパ腫及び白血病等の血液腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、及びＢ細胞リンパ腫であり得る。

【0311】

いくつかの態様では、対象は、感染症と診断されているかまたは感染症のリスクがある（例えば、年齢、地理／旅行により、及び／または仕事上、感染症のリスクが高いかもしくはその素因がある、あるいは季節性及び／または新規疾患による感染症のリスクがある）。

【0312】

抗原は、ＣＴＬ応答を刺激するのに十分な量で投与され得る。抗原は、Ｔ細胞応答を刺激するのに十分な量で投与され得る。抗原は、Ｂ細胞応答を刺激するのに十分な量で投与され得る。抗原は、Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答の両方を刺激するのに十分な量で投与され得る。

【0313】

抗原は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与され得る。治療剤には、抗ウイルス剤または抗生物質等の感染症生物を標的とするものが含まれ得る。

【0314】

さらに、チェックポイント阻害物質等の抗免疫抑制剤／免疫刺激剤を対象にさらに投与することができる。例えば、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１を対象にさらに投与することができる。抗体によるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１の遮断は、患者でのがん性細胞に対する免疫応答を増強させることができる。特に、ＣＴＬＡ－４の遮断は、ワクチン接種プロトコルに従った場合、有効であることが示されている。

【0315】

ワクチン組成物中に含められる各抗原の最適量、及び最適投与レジメンを決定することができる。例えば、抗原またはそのバリアントは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射用に調製可能である。注射の方法には、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．が含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡ注射の方法には、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．が含まれる。ワクチン組成物の他の投与方法は当業者に公知である。

【0316】

ワクチンは、組成物中に存在する抗原の選択、数及び／または量が、組織、がん、感染症、及び／または患者に特異的であるよう編集可能である。例えば、ペプチドの正確な選択は、所与の組織における親タンパク質の発現パターンによって導くことができ、また患者の変異または疾患状態によっても導くことができる。選択は、特定の種類のがん、特定の感染症（例えば、対象が感染しているかまたはそれによる感染リスクがある特定の感染症の分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）／株（ｓｔｒａｉｎ））、疾患の状態、ワクチン接種の目的（例えば、予防的か、または進行中の疾患のターゲティング）、先行治療レジメン、患者の免疫状態、及び当然のことながら患者のＨＬＡハプロタイプ、に応じて異なり得る。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人のニーズに従って、個別化された成分を含有することができる。例としては、特定の患者での抗原の発現に従った抗原選択の変更、または一次治療もしくは治療スキームに続く二次治療の調整が含まれる。

【0317】

患者は、様々な診断方法、例えば、以下に詳述される患者選択方法の使用を介して抗原ワクチンの投与のために特定され得る。患者選択には、１つ以上の遺伝子における変異、または、１つ以上の遺伝子の発現パターンを特定することを伴い得る。患者選択には、進行中の感染の感染症を特定することを伴い得る。患者選択には、感染症による感染のリスクを特定することを伴い得る。場合によっては、患者選択には、患者のハプロタイプを特定することを伴う。様々な患者選択方法を並行して実施することができ、例えば、シークエンシング診断では、患者の変異及びハプロタイプの両方を特定することができる。様々な患者選択方法を順次に実施することができ、例えば、１つの診断検査で変異を特定し、別の診断検査で患者のハプロタイプを特定し、その場合、各検査は、同じ診断法（例えば、両方ともハイスループットシークエンシング）でも、異なる診断法（例えば、一方がハイスループットシークエンシング、他方がサンガー法による配列決定）でも可能である。

【0318】

がんまたは感染症のためのワクチンとして使用される組成物の場合、正常組織で高量発現される自己ペプチドと同様の正常な自己ペプチドを持つ抗原は、本明細書に記載される組成物では回避され得るかまたは低量で存在し得る。一方、患者の腫瘍または感染細胞が高量の特定の抗原を発現することが知られている場合、このがんまたは感染症を治療するための医薬組成物はそれぞれ、高量で存在することができ、及び／またはこの特定の抗原またはこの抗原の経路に特異的な複数の抗原が含まれ得る。

【0319】

抗原を含む組成物は、すでにがんまたは感染症を患っている個体に投与され得る。治療用途では、組成物は、腫瘍抗原または感染症生物抗原に対する有効なＣＴＬ応答を刺激し、症状及び／または合併症を治癒もしくは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で対象に投与される。これを達成するために適した量は、「治療的有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、組成物、投与様式、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全身の健康状態、及び処方医師の判断に応じて異なる。組成物は一般に、重篤な病状、すなわち、生命を脅かすかもしくは生命を脅かす可能性のある状況、特に、がんが転移している、または感染症生物により臓器障害及び／または他の免疫病理が誘導されている場合に用いられ得ることに留意すべきである。そのような場合、外来性物質の最小化及び抗原の相対的無毒性を考慮し、これらの組成物を実質的に過剰に投与することが可能であり、またそのことが望ましいと担当医に感じてもらうことができる。

【0320】

治療的使用の場合、投与は、腫瘍の検出時もしくは外科的除去時に開始するか、または検出時もしくは感染症治療時に開始することができる。これに続き、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、及びその後の期間、または免疫が提供されている（例えば、メモリーＢ細胞もしくはメモリーＴ細胞集団、または抗原特異的Ｂ細胞もしくは抗体が産生される）と見なされるまで用量をブーストすることができる。

【0321】

治療的処置のための医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経鼻、経口または局所（ｌｏｃａｌ）の投与について意図される。医薬組成物は、非経口で、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与され得る。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を刺激するために外科的切除部位に投与され得る。組成物は、対象の特定の感染した組織及び／または細胞を標的とするために投与され得る。本明細書では、非経口投与用の組成物を開示し、これは、抗原の溶液を含み、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌することができ、また濾過滅菌することもできる。得られた水溶液は、そのままでの使用のためにパッケージングされるか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と合わせられる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等のような、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、オレイン酸トリエタノールアミン等を含有し得る。

【0322】

抗原はまた、それらをリンパ組織等の特定の細胞組織にターゲティングさせるリポソームにより投与され得る。リポソームもまた、半減期延長に有用である。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が含まれる。これらの調製物では、送達される抗原は、単独で、あるいはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体等の、例えば、リンパ系細胞の間で高頻度に見られる受容体に結合する分子と組み合わせて、または他の治療用もしくは免疫原性の組成物と組み合わせて、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の抗原が充填されたリポソームをリンパ系細胞の部位に配向させることができ、そこで、リポソームが、選択された治療用／免疫原性の組成物を送達する。リポソームは、標準的小胞形成脂質から形成することができ、これには一般に、中性及び負の電荷を帯びたリン脂質及びコレステロール等のステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性及び血流中でのリポソーム安定性を考慮することによって導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、リポソームを調製するために様々な方法が利用可能である。

【0323】

免疫細胞へのターゲティングの場合、リポソーム内に組み込まれるリガンドには、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片が含まれ得る。リポソーム懸濁液は、特に、投与様式、送達されるペプチド、及び治療される疾患病期によって異なる用量で、静脈内、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）等に投与され得る。

【0324】

治療または免疫を目的とする場合、ペプチドをコードし、任意選択で本明細書に記載されるペプチドのうちの１つ以上をコードする核酸もまた患者に投与され得る。患者に核酸を送達するために多数の方法が好都合に使用される。例えば、核酸は、「裸のＤＮＡ」として直接送達され得る。この手法は、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載のような弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。ＤＮＡのみで構成されている粒子が投与され得る。別法として、ＤＮＡを金粒子等の粒子に付着させることができる。核酸配列を送達するための手法には、電気穿孔を用いるかまたは用いない、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターが含まれ得る。

【0325】

核酸はまた、カチオン性脂質等のカチオン性化合物と複合体にして送達され得る。脂質媒介性遺伝子送達方法は、例えば、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ９６／１８３７２、９３２４６４０ＷＯＡＷＯ９３／２４６４０、Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２－６９１（１９８８）、米国特許第５，２７９，８３３号（Ｒｏｓｅ）、米国特許第５，２７９，８３３号、９１０６３０９ＷＯＡＷＯ９１／０６３０９、及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３－７４１４（１９８７）に記載されている。

【0326】

抗原はまた、ウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォーム、例えば、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、または第２世代、第３世代もしくは第２／第３世代ハイブリッドのレンチウイルス及び特定の細胞型もしくは受容体を標的にするよう設計された任意の世代の組換えレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）等に含めることもできる。上記のウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォームのパッケージング容量に応じて、この手法では、１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列に隣接する場合もあれば、リンカーによって区切られている場合も、細胞内コンパートメントを標的とする１つ以上の配列が先行する場合もある（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０を参照のこと）。宿主への導入時、感染細胞は抗原を発現し、それによりペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答が刺激される。免疫プロトコルに有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ：カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫に有用な多種多様な他のワクチンベクター、例えば、チフス菌ベクター等は本明細書での説明から当業者に明らかであろう。

【0327】

核酸を投与する手段は、１つまたは複数のエピトープをコードするミニ遺伝子コンストラクトを使用する。ヒト細胞における発現のための選択されたＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。ヒトのコドン使用表を使用して、各アミノ酸についてのコドン選択を導き出す。これらのエピトープコードＤＮＡ配列を直接隣接し、連続ポリペプチド配列を作成する。発現及び／または免疫原性を最適化するために、追加の要素をミニ遺伝子設計に組み込むことができる。逆翻訳され、ミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例には、ヘルパーＴリンパ球、エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保留シグナルが挙げられる。さらに、合成（例えば、ポリアラニン）または天然に存在するフランキング配列をＣＴＬエピトープに隣接して含めるこれにより、ＭＨＣのＣＴＬエピトープ提示を改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによりＤＮＡに変換される。重複オリゴヌクレオチド（３０～１００塩基長）は、周知の技術を使用して適切な条件下で合成、リン酸化、精製及びアニールされる。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結される。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子はその後、所望の発現ベクターにクローニング可能である。

【0328】

精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を使用して注射用に調製され得る。これらのうち最も簡便なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が報告されており、また新たな技術が利用可能になり得る。上記のように、核酸は、カチオン性脂質を用いて好都合に製剤化される。さらに、保護的相互作用性非凝縮性（ＰＩＮＣ）と総称される糖脂質、膜融合性リポソーム、ペプチド及び化合物はまた、安定性、筋肉内分散、または特定の器官もしくは細胞型への輸送等の可変要素に影響を与えるために、精製プラスミドＤＮＡと複合体を形成させることが可能である。

【0329】

また、本明細書に開示される方法のステップを実施すること、及び複数の抗原または複数の抗原のサブセットを含むワクチンを生成すること、を含むワクチンを製造する方法も開示する。

【0330】

本明細書に開示される抗原は、当該技術分野で公知の方法を使用して製造され得る。例えば、本明細書に開示される抗原またはベクター（例えば、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を生成する方法には、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、かかる抗原またはベクターの発現に好適な条件下で培養すること、及び抗原またはベクター精製することが含まれ得る。標準的精製方法には、クロマトグラフィー法、電気泳動法、免疫学的技術、沈殿、透析、ろ過、濃縮、及びクロマトフォーカシング技術が含まれる。

【0331】

宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞が含まれ得る。宿主細胞は、本明細書に開示される抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換が可能であり、ここで、任意選択で、単離されたポリヌクレオチドはさらに、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドはｃＤＮＡであり得る。

【0332】

ＶＩＩ．抗原の使用及び投与
他に使用可能な、ワクチン接種の方法、プロトコル、及びスケジュールには、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０２１０９２０９５号に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。

【0333】

プライム／ブースト戦略における各ベクターには、典型的には、抗原が含まれるカセットが含まれる。カセットには、約１～５０個の抗原が含まれ得、通常は各抗原を囲む天然配列等のスペーサー、またはＡＡＹ等の他の非天然スペーサー配列によって区切られている。カセットにはまた、ユニバーサルなクラスＩＩ抗原と見なすことができる破傷風トキソイド抗原及びＰＡＤＲＥ抗原のようなＭＨＣＩＩ抗原も含まれ得る。カセットにはまた、ユビキチンターゲティング配列等のターゲティング配列も含まれ得る。さらに、各ワクチン用量は、免疫調節物質と併せて（例えば、同時に、前に、または後に）対象に投与され得る。各ワクチン用量は、チェックポイント阻害物質（ＣＰＩ）と併せて（例えば、同時に、前に、または後に）対象に投与され得る。ＣＰＩには、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及び／またはＰＤＬ１を阻害するもの、例えば、抗体またはそれらの抗原結合部分が含まれ得る。そのような抗体には、トレメリムマブまたはデュルバルマブが含まれ得る。各ワクチン用量は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（ＩＬ－１２のｐ３５、ｐ４０、ｐ７０、及び／またはｐ７０融合コンストラクトを含む）、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１等のサイトカインと併せて（例えば、同時に、前に、または後に）対象に投与され得る。各ワクチン用量は、修飾サイトカイン（例えば、ｐｅｇＩＬ－２）と併せて（例えば、同時に、前に、または後に）対象に投与され得る。

【0334】

対象に１つ以上の抗原を投与するには、ワクチン接種プロトコルを使用することができる。対象への投与にはプライミングワクチン及びブースティングワクチンを使用することができる。プライミングワクチンには、本明細書に記載される抗原コードベクター、例えば、ＣｈＡｄＶ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）に基づくベクターのいずれかが用いられ得る。ブースト用量には、本明細書に記載される抗原コードベクター、例えば、ＣｈＡｄＶ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはＳＡＭ系ベクター（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づくベクターのいずれかが用いられ得る。１つ以上のブースト用量を投与することができ、同じブースティングワクチンの連続的投与（例えば、同じＣｈＡｄＶ６８系ベクターの連続的投与もしくは同じＳＡＭ系ベクターの連続的投与）、または異なるブースティングワクチンの連続的投与（例えば、ＳＡＭ系ベクターの投与、それに続くＣｈＡｄＶ６８系ベクターの投与）が可能である。異なるワクチンの連続的投与には、異なるワクチンの任意の組み合わせが含まれ得る。例えば、ワクチン戦略では、ＣｈＡｄＶ６８系のプライム、それに続く１回以上のＳＡＭ系ブースト、及びＳＡＭ系ブーストに続くＣｈＡｄＶ６８系ブーストを使用することができる。例示的な非限定的なワクチン戦略には、ＣｈＡｄＶプライム－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＣｈＡｄＶブースト、またはＣｈＡｄＶプライム－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＣｈＡｄＶブーストが含まれるが、これらに限定されない。

【0335】

ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、１×１０^１１ウイルス粒子～１×１０^１２ウイルス粒子の範囲の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、１×１０^１１ウイルス粒子の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、５×１０^１１ウイルス粒子の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、１×１０^１２ウイルス粒子の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンについて選択された投与量は、例えば、組成物、投与様式、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全身の健康状態、ならびに処方医師の判断に応じて異なる。

【0336】

ＳＡＭベースのワクチンは、１０～３００μｇのＲＮＡの範囲の用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンは、１００～３００μｇのＲＮＡの範囲の用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンは、１００μｇのＲＮＡの用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンは、３００μｇのＲＮＡの用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンについて選択された投与量は、例えば、組成物、投与様式、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全身の健康状態、ならびに処方医師の判断に応じて異なる。

【0337】

プライミングワクチンは、対象に（例えば、筋肉内に）注射され得る。用量ごとの両側注射を使用することができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）１回以上の注射を使用することができる（例えば、総投与量が１×１０^１２ウイルス粒子）；０．００１～１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、特に０．１ｕｇもしくは１ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる；または１～１００ｕｇＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、特に１０ｕｇ、１００ｕｇ、もしくは３００ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる。

【0338】

ワクチンブースト（ブースティングワクチン）は、プライムワクチン接種後に（例えば、筋肉内に）注射され得る。用量ごとの両側注射を使用することができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）１回以上の注射を使用することができる（例えば、総投与量が１×１０^１２ウイルス粒子）；０．００１～１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、特に０．１ｕｇもしくは１ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる；または１～１００ｕｇＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、特に１０ｕｇ、１００ｕｇ、もしくは３００ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる。

【0339】

ブースティングワクチンは、プライムの後、約１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、または１０週間ごと、例えば、４週間ごと及び／または８週間ごとに投与され得る。ブースティングワクチンは、プライムの後、４週間ごとに投与され得る。ブースティングワクチンは、プライムの後、６週間ごとに投与され得る。ブースティングワクチンは、プライムの後、１２週間ごとに投与され得る。ブースト用量は、ワクチン接種プロトコルの期間中、異なる間隔で投与され得る。例えば、例示的な非限定的例には、プライム－４ｗ－ブースト－１２ｗ－ブースト－１２ｗ－ブースト；またはプライム－４ｗ－ブースト－６ｗ－ブースト－６ｗ－ブースト－６ｗ－ブースト－６ｗ－ブーストが含まれる（「ｗ」は週を表す）。

【0340】

ワクチン投与のうちの１回以上には、１つ以上のチェックポイント阻害物質の同時投与が含まれ得る。例示的な免疫チェックポイント阻害物質には、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７－Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１遮断薬）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ－０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害物質）が含まれる。例示的な非限定的例では、ニボルマブ、ヤーボイ／イピリムマブ、またはそれらの組み合わせ。

【0341】

抗ＣＴＬＡ－４（例えば、トレメリムマブ）もまた、対象に投与され得る。例えば、抗ＣＴＬＡ４は、同じリンパ節への流入が確実に行われるよう、筋肉内ワクチン注射（ＣｈＡｄＶ６８プライムまたはＳＡＭ低用量）部位の近くに皮下投与され得る。トレメリムマブは、ＣＴＬＡ－４の選択的ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂ阻害物質である。抗ＣＴＬＡ－４（トレメリムマブ）目的皮下用量は、典型的には、７０～７５ｍｇ（特に７５ｍｇ）であり、用量範囲は、例えば、１～１００ｍｇまたは５～４２０ｍｇである。

【0342】

ある特定の場合には、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）等の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用することができる。デュルバルマブは、ＰＤ－１及びＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断する選択的高親和性ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである。デュルバルマブは一般に、４週間ごとに２０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与される。

【0343】

ワクチンの投与前、投与中、及び／または投与後に免疫モニタリングが実施され得る。そのようなモニタリングから、パラメータの中でも特に安全性及び有効性の情報を得ることができる。

【0344】

免疫モニタリングの実施には、ＰＢＭＣが一般に使用される。ＰＢＭＣは、プライムワクチン接種前、及びプライムワクチン接種後（例えば、４週間及び８週間後）に分離され得る。ＰＢＭＣは、ブーストワクチン接種の直前及び各ブーストワクチン接種後（例えば、４週間及び８週間後）に採取され得る。

【0345】

Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答等の免疫応答は、免疫モニタリングプロトコルの一部として評価され得る。例えば、本明細書に記載されるワクチン組成物が免疫応答を刺激する能力を、モニター及び／または評価することができる。本明細書で使用される場合、「免疫応答を刺激する」とは、免疫応答の任意の増大、例えば、免疫応答の開始（例えば、プライミングワクチンが未処置対象での免疫応答の開始を刺激すること）、または免疫応答の任意の増強作用（例えば、ブースティングワクチンが、プライミングワクチンにより開始された既存の免疫応答等の、抗原に対する既存の免疫応答を有する対象での免疫応答の増強作用を刺激すること）を指す。Ｔ細胞応答は、当該技術分野で公知の１つ以上の方法を使用して、例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、サイトカイン分泌及び細胞表面捕捉、Ｔ細胞増殖、ＭＨＣマルチマー染色、または細胞毒性アッセイにより測定され得る。ワクチンでコードされるエピトープに対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、ＩＦＮ－ガンマ等のサイトカインの誘導を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに対する特定のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを使用して、細胞内または細胞外で捕捉されるＩＦＮ－ガンマ等のサイトカインの誘導を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに対する特定のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞応答は、ＭＨＣマルチマー染色を使用して、エピトープ／ＭＨＣクラスＩ複合体に特異的なＴ細胞受容体を発現しているＴ細胞集団を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに対する特定のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞応答は、３Ｈ－チミジン、ブロモデオキシウリジン及びカルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）取り込み後のＴ細胞集団のエキソビボ増殖を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに特異的なＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の抗原認識能及び溶解活性は、クロム遊離アッセイまたは代替的比色細胞毒性アッセイによって機能的に評価され得る。

【0346】

Ｂ細胞応答は、当該技術分野で公知の１つ以上の方法、例えば、Ｂ細胞分化（例えば、形質細胞への分化）、Ｂ細胞もしくは血漿細胞の増殖、Ｂ細胞もしくは形質細胞の活性化（例えば、ＣＤ８０もしくはＣＤ８６等の共刺激マーカーの上方制御）、抗体クラススイッチ、及び／または抗体産生（例えば、ＥＬＩＳＡ）を決定するために使用されるアッセイを使用して測定され得る。

【0347】

ワクチン接種レジメンには、ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチン等の目的のワクチン組成物に対する中和抗体価を評価することが含まれ得る。例えば、ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンはプライミング用量として投与され得、再投与前、ＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価が中和閾値未満であることを決定した後、ブースト用量としてのＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンの再投与が行われる。中和抗体価は、ＣｈＡｄＶウイルスを５０％中和する、免疫化された対象からの血清の最小希釈度として計算されるＮＴ５０値であり得る。中和抗体価を決定することには、（１）免疫化された対象からの血清の１つ以上の希釈液を、ＣｈＡｄＶウイルスの中和に十分な条件下でＣｈＡｄＶウイルスと接触させるステップ、及び（２）中和されていないウイルスと比べてＣｈＡｄＶウイルスの中和を評価するステップ、が含まれ得る。

【0348】

対象の疾患状態は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれかの投与後にモニター可能である。例えば、疾患状態は、対象からの単離されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用してモニターされ得る。さらに、ワクチン療法の有効性は、対象からの単離されたｃｆＤＮＡを使用してモニターされ得る。ｃｆＤＮＡのモニタリングには、ａ．対象からｃｆＤＮＡを単離するか、または単離しておくステップ、ｂ．単離されたｃｆＤＮＡをシークエンシングするか、またはシークエンシングしておくステップ、ｃ．対象の野生型生殖細胞系列核酸配列と比べて、ｃｆＤＮＡでの１つ以上の変異の頻度を決定するか、または決定しておくステップ、及びｄ．対象の疾患の状態を、ステップ（ｃ）から評価するか、または、評価しておくステップ、が含まれ得る。方法にはまた、上記ステップ（ｃ）に続いて、ｄ．所与の対象についてステップ（ａ）～（ｃ）の反復を複数回実施し、複数回の反復で決定された１つ以上の変異の頻度を比較すること、及びｆ．対象の疾患の状態をステップ（ｄ）から評価するかまたは評価しておくこと、も含めることができる。複数回の反復は、異なる時点で実施され得、例えば、ステップ（ａ）～（ｃ）の第１の反復をワクチン組成物の投与の前に実施し、ステップ（ａ）～（ｃ）の第２の反復をワクチン組成物の投与の後で実施することができる。ステップ（ｃ）には、複数回の反復で決定された１つ以上の変異の頻度、または第１の反復で決定された１つ以上の変異の頻度と、第２の反復で決定された１つ以上の変異の頻度と、を比較することが含まれ得る。後続の反復または第２の反復で決定された１つ以上の変異の頻度の増加は、疾患の進行として評価され得る。後続の反復または第２の反復で決定された１つ以上の変異の頻度の減少は、応答として評価され得る。いくつかの態様では、応答は、完全奏功（ＣＲ）または部分奏効（ＰＲ）である。評価ステップに続いて、例えば、ｃｆＤＮＡにおける１つ以上の変異の頻度の評価により対象が疾患を有することが示される場合は、療法が対象に実施され得る。ｃｆＤＮＡ単離ステップでは、細胞または細胞片からｃｆＤＮＡを分離するために遠心分離を使用することができる。ｃｆＤＮＡは、血漿層、バフィーコート、及び赤血球を分離する等により全血から分離され得る。ｃｆＤＮＡシークエンシングでは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、サンガー法による配列決定、デュプレックスシークエンシング、全エクソームシークエンシング、全ゲノムシークエンシング、デノボシークエンシング、段階的シークエンシング、ターゲットアンプリコンシークエンシング、ショットガンシークエンシング、またはそれらの組み合わせを使用することができ、また、シークエンシングの前に１つ以上の目的ポリヌクレオチド領域についてｃｆＤＮＡを濃縮させることが含まれ得る（例えば、１つ以上の変異をコードすることが既知である、もしくはその疑いのあるポリヌクレオチド、コード領域、及び／または腫瘍エクソームポリヌクレオチド）。ｃｆＤＮＡを濃縮させることには、修飾（例えば、ビオチン化）され得る１つ以上のポリヌクレオチドプローブを、１つ以上の目的ポリヌクレオチド領域にハイブリダイズさせることが含まれ得る。一般に、任意の数の変異が同時または並行してモニターされ得る。

【0349】

同種ワクチン接種レジメンには、２回目の用量の有効性を改善するため、同種の用量間の間隔が含まれ得る。例えば、ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、初回用量として投与が可能であり、有効性改善のため、例えば、ＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価がブースト用量の有効性に与える影響を軽減するために、ブースト用量としてのＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンの再投与の前に間隔を含めることが可能である。例えば、初回用量によって、中和抗体の産生が誘導され得、これは、その後、経時的に減少する。本明細書に記載されるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンの例示的な非限定的例では、間隔は、少なくとも２７週間である。間隔は、２７週間であり得る。間隔は、２８週間であり得る。間隔は、２９週間であり得る。間隔は、３０週間であり得る。間隔は、３１週間であり得る。間隔は、３２週間であり得る。間隔は、３３週間であり得る。間隔は、少なくとも２７週間であり得る。間隔は、少なくとも２８週間であり得る。間隔は、少なくとも２９週間であり得る。間隔は、少なくとも３０週間であり得る。間隔は、少なくとも３１週間であり得る。間隔は、少なくとも３２週間であり得る。間隔は、少なくとも３３週間であり得る。

【0350】

同種プライム－ブースト戦略におけるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチン投与の間隔は、わずか８週間であり得る。間隔は、８週間であり得る。間隔は、９週間であり得る。間隔は、１０週間であり得る。間隔は、１１週間であり得る。間隔は、１２週間であり得る。間隔は、１３週間であり得る。間隔は、１４週間であり得る。間隔は、１５週間であり得る。間隔は、１６週間であり得る。間隔は、１７週間であり得る。間隔は、１８週間であり得る。間隔は、１９週間であり得る。間隔は、２０週間であり得る。間隔は、２１週間であり得る。間隔は、２３週間であり得る。間隔は、２４週間であり得る。間隔は、２５週間であり得る。間隔は、２６週間であり得る。

【0351】

同種プライム－ブースト戦略におけるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチン投与の間隔は、少なくとも８週間であり得る。間隔は、少なくとも９週間であり得る。間隔は、少なくとも１０週間であり得る。間隔は、少なくとも１１週間であり得る。間隔は、少なくとも１２週間であり得る。間隔は、少なくとも１３週間であり得る。間隔は、少なくとも１４週間であり得る。間隔は、少なくとも１５週間であり得る。間隔は、少なくとも１６週間であり得る。間隔は、少なくとも１７週間であり得る。間隔は、少なくとも１８週間であり得る。間隔は、少なくとも１９週間であり得る。間隔は、少なくとも２０週間であり得る。間隔は、少なくとも２１週間であり得る。間隔は、少なくとも２３週間であり得る。間隔は、少なくとも２４週間であり得る。間隔は、少なくとも２５週間であり得る。間隔は、少なくとも２６週間であり得る。

【0352】

同種プライム－ブースト戦略におけるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチン投与の間隔は、２か月であり得る。間隔は、２．５か月であり得る。間隔は、３か月であり得る。間隔は、３．５か月であり得る。間隔は、４か月であり得る。間隔は、４．５か月であり得る。間隔は、５か月であり得る。間隔は、５．５か月であり得る。間隔は、６か月であり得る。間隔は、６．５か月であり得る。間隔は、７か月であり得る。間隔は、７．５か月であり得る。間隔は、８か月であり得る。間隔は、８．５か月であり得る。間隔は、少なくとも２か月であり得る。間隔は、少なくとも２．５か月であり得る。間隔は、少なくとも３か月であり得る。間隔は、少なくとも３．５か月であり得る。間隔は、少なくとも４か月であり得る。間隔は、少なくとも４．５か月であり得る。間隔は、少なくとも５か月であり得る。間隔は、少なくとも５．５か月であり得る。間隔は、少なくとも６か月であり得る。間隔は、少なくとも６．５か月であり得る。間隔は、少なくとも７か月であり得る。間隔は、少なくとも７．５か月であり得る。間隔は、少なくとも８か月であり得る。間隔は、少なくとも８．５か月であり得る。

【0353】

ＶＩＩＩ．ＨＬＡペプチドの単離及び検出
組織試料の溶解及び可溶化後、古典的免疫沈降（ＩＰ）法を使用してＨＬＡペプチド分子の単離を実施した（５５～５８）。ＨＬＡ特異的ＩＰには清澄化したライセートを使用した。例及び方法は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳述されている。

【0354】

ＩＸ．提示モデル
患者におけるペプチド提示の可能性を特定するために、提示モデルを使用することができる。様々な提示モデルが当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号及び同第ＵＳ２０１１０２９３６３７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、及び同第ＷＯ２０１６１８７５０８号に提示モデルが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0355】

Ｘ．トレーニングモジュール
ペプチド配列が、そのペプチド配列と関連するＭＨＣアレルによって提示されるかどうかの可能性を生成するトレーニングデータセットに基づいて、１つ以上の提示モデルを構築するために、トレーニングモジュールを使用することができる。様々なトレーニングモジュールが当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に提示モデルが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。トレーニングモジュールでは、アレルごとにペプチドの提示可能性を予測するための提示モデルを構築することができる。トレーニングモジュールではまた、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル設定でのペプチドの提示可能性を予測するための提示モデルを構築することができる。

【0356】

ＸＩ．予測モジュール
配列データを受け取り、提示モデルを使用して配列データにおいて候補抗原を選択するために、予測モジュールを使用することができる。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞、患者の感染細胞、もしくは感染症生物自体から抽出された、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であり得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較し、１つ以上の変異を含有する部分を特定することによって、変異ペプチド配列である候補ネオアンチゲンを特定し得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の感染細胞から抽出された配列データと比較し、感染症生物と関連する１つ以上の抗原を含有する部分を特定すること等によって、病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び寄生虫由来ペプチドである候補抗原を特定し得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較し、不適切に発現された候補抗原を特定することによって、正常な細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織において発現が変化している候補抗原を特定し得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の感染組織細胞から抽出された配列データと比較し、発現された候補抗原を特定する（例えば、発現されたポリヌクレオチド及び／または感染症に特異的なポリペプチドを特定する）ことによって、正常な細胞または組織と比較して感染細胞または感染組織で発現している候補抗原を特定し得る。

【0357】

提示モジュールでは、処理されたペプチド配列に１つ以上の提示モデルを適用して、ペプチド配列の提示可能性を推定することができる。具体的には、予測モジュールは、候補抗原に提示モデルを適用することによって、腫瘍ＨＬＡ分子または感染細胞ＨＬＡ分子に提示される可能性の高い１つ以上の候補抗原ペプチド配列を選択し得る。一実施態様では、提示モジュールは、推定提示可能性が所定の閾値を上回る、候補抗原配列を選択する。別の実施態様では、提示モデルは、推定提示可能性が最も高いＮ個の候補抗原配列を選択する（Ｎは一般に、ワクチンで送達可能な最大エピトープ数である）。所与の患者について選択された候補抗原が含まれるワクチンを対象に注射して免疫応答を刺激することができる。

【0358】

ＸＩ．Ｂ．カセット設計モジュール
ＸＩ．Ｂ．１ 概要
患者への注射用に選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成するために、カセット設計モジュールを使用することができる。例えば、カセット設計モジュールを使用して、連結されたＴ細胞エピトープ等の連結されたエピトープ配列をコードする配列を生成することができる。様々なカセット設計モジュールが当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号にカセット設計モジュールが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0359】

治療用エピトープのセットは、所定の閾値を上回る提示可能性と関連している予測モジュールによって決定された選択ペプチドに基づいて生成され得、ここで、提示可能性は提示モデルにより決定される。ただし、他の実施形態では、治療用エピトープのセットは、多数の方法（単独または組み合わせ）のうちのいずれか１つ以上に基づいて、例えば、患者のＨＬＡクラスＩアレルまたはＨＬＡクラスＩＩアレルへの結合親和性もしくは予測結合親和性、患者のＨＬＡクラスＩアレルまたはＨＬＡクラスＩＩアレルへの結合安定性もしくは予測結合安定性、ランダムサンプリング等に基づいて生成され得ることが理解される。

【0360】

治療用エピトープは、選択されたペプチド自体に対応し得る。治療用エピトープには、選択されたペプチドに加え、Ｃ末端及び／またはＮ末端のフランキング配列も含まれ得る。Ｎ末端及びＣ末端のフランキング配列は、その供給源であるタンパク質との関連における治療用ワクチンエピトープの天然のＮ末端及びＣ末端のフランキング配列であり得る。治療用エピトープは、長さが固定されたエピトープを表し得る。治療用エピトープは、長さが可変のエピトープを表し得、ここで、エピトープの長さは、例えば、Ｃ－フランキング配列またはＮ－フランキング配列の長さに応じて変動し得る。例えば、Ｃ末端フランキング配列及びＮ末端フランキング配列は、各々が２～５残基の異なる長さを有することができ、エピトープに１６の可能な選択肢をもたらす。

【0361】

カセット設計モジュールはまた、カセット内の１対の治療用エピトープ間の接合部にまたがる接合部エピトープの提示を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。接合部エピトープは、カセット内で治療用エピトープとリンカー配列を連結させる過程が原因でカセットに生じる、非自己であるが無関係な新規エピトープ配列である。接合部エピトープの新規配列は、カセット自体の治療用エピトープとは異なる。

【0362】

カセット設計モジュールは、接合部エピトープが患者において提示される可能性を低下させるカセット配列を生成することができる。具体的には、カセットが患者に注射される場合、接合部エピトープには、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩのアレルによって提示され、それぞれ、ＣＤ８またはＣＤ４のＴ細胞応答を刺激する可能性がある。そのような反応は、その接合部エピトープに反応性のＴ細胞には、治療上の利益がなく、カセット内の選択された治療用エピトープに対する免疫応答を抗原競合により減弱させる可能性があるため、望ましくない場合が多い。^７６

【0363】

カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセットを反復処理することができ、カセット配列が、そのカセット配列と関連する接合部エピトープの提示スコアが数的閾値を下回るものを決定することができる。接合部エピトープ提示スコアは、カセット内の接合部エピトープの提示可能性と関連する量であり、接合部エピトープ提示スコアが高値であるほど、カセットの接合部エピトープがＨＬＡクラスＩもしくはＨＬＡクラスＩＩまたは両方によって提示される可能性が高いことを示す。

【0364】

一実施形態では、カセット設計モジュールは、候補カセット配列のうち接合部エピトープ提示スコアが最も低いものと関連するカセット配列を決定し得る。

【0365】

カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセット配列を反復処理し、候補カセットの接合部エピトープ提示スコアを決定して、閾値を下回る接合部エピトープ提示スコアと関連する最適カセット配列を特定し得る。

【0366】

カセット設計モジュールはさらに１つ以上の候補カセット配列をチェックして、候補カセット配列内の接合部エピトープのいずれかが、ワクチンを設計する対象である所与の患者の自己エピトープであるかどうかを特定し得る。これを達成するために、カセット設計モジュールは、ＢＬＡＳＴ等の既知のデータベースに対して接合部エピトープをチェックする。一実施形態では、カセット設計モジュールは、接合部自己エピトープを回避するカセットを設計ように構成される。

【0367】

カセット設計モジュールは、力任せ（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）法を実施して、可能性のある全部またはほとんどの候補カセット配列を反復処理し、接合部エピトープ提示スコアが最も小さい配列を選択することができる。ただし、そのような候補カセットの数は、ワクチン容量が増大するにつれて、とてつもなく大きくなり得る。例えば、ワクチン容量が２０エピトープの場合、カセット設計モジュールは、接合部エピトープ提示スコアが最低のカセットを決定するために、約１０^１８個の可能な候補カセットを反復処理しなければならない。こうした決定は、カセット設計モジュールが、患者のためのワクチン生成を妥当な時間内に完了させるには、計算的に負担となり（計算処理資源が必要という点で）、ときに解決困難な場合がある。さらに、可能な接合部エピトープを候補カセットごとに考慮することは、さらに大きな負担となり得る。したがって、カセット設計モジュールは、力任せ法の場合の候補カセット配列数よりは大幅に少数の、多数の候補カセット配列を反復処理する方法に基づいてカセット配列を選択し得る。

【0368】

カセット設計モジュールは、ランダムまたは少なくとも準ランダムに生成された候補カセットのサブセットを生成することができ、カセット配列として、所定の閾値を下回る接合部エピトープ提示スコアと関連する候補カセットを選択する。さらに、カセット設計モジュールは、カセット配列として接合部エピトープ提示スコアが最も低いサブセットからの候補カセットを選択し得る。例えば、カセット設計モジュールは、２０個の選択されたエピトープのセットに対して約１００万候補カセットのサブセットを生成し、接合部エピトープ提示スコアが最も小さい候補カセットを選択し得る。ランダムカセット配列のサブセットを生成し、そのサブセットから接合部エピトープ提示スコアが低いカセット配列を選択することは、力任せ法と比べて最適以下であり得るが、計算資源が大幅に少なくて済むため、その実装が技術的に実現可能となる。さらに、より効率的なこの手法とは対照的に、力任せ法を実施しても、接合部エピトープ提示スコアにはわずかな、さらには無視できるほどの改善しかもたらされない場合があるため、資源配分の観点からは価値がない。カセット設計モジュールは、非対称巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）としてカセットのエピトープ配列を定式化することにより、改善されたカセット構成を決定することができる。ノードのリストと各ノードペア間の距離が与えられている場合、ＴＳＰは、各ノードを１回だけ訪問し、元のノードへ戻るための総距離が最小となるものと関連するノードの配列を決定する。例えば、互いの距離が既知の都市Ａ、Ｂ、及びＣが与えられている場合、ＴＳＰの解法は、各都市を１回だけ訪問するために巡回した総距離が可能経路のうちで最小である閉の都市配列を生成する。ＴＳＰの非対称バージョンでは、ノードペア間の距離が非対称である場合の最適ノード配列を決定する。例えば、ノードＡからノードＢまで巡回するための「距離」は、ノードＢからノードＡまで巡回するための「距離」とは異なる場合がある。非対称ＴＳＰを使用して改善された最適カセットについて解くことによって、カセット設計モジュールは、カセットのエピトープ間の接合部を横断して、提示スコア減少をもたらすカセット配列を見出すことができる。非対称ＴＳＰの解は、カセットの接合部全体の接合部エピトープ提示スコアを最小限に抑えるために、エピトープがカセット内で連結されるべき順序に対応する治療用エピトープの配列を示す。この手法で決定されたカセット配列は、接合部エピトープの提示が大幅に少ない配列となる可能性があり、一方で、生成される候補カセット配列数が大きい場合は特に、ランダムサンプリング法よりも計算資源が大幅に少なくて済む可能性が高い。様々な計算手法及びカセット設計最適化のための比較の例示的な例は、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0369】

共通抗原ワクチンに含めるための共通（ネオ）抗原配列及びそのようなワクチンによる治療に適切な患者は、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国出願第１７／０５８，１２８号に記載のように、当業者により選択され得る。共通（ネオ）抗原候補の質量分析（ＭＳ）による確認は、選択工程の一部として実施可能である。

【0370】

カセット設計モジュールはまた、ワクチンでコードされる追加のタンパク質配列を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードする配列を生成するために使用されるカセット設計モジュールは、ワクチン中に存在する追加のタンパク質配列（例えば、全長タンパク質配列）によってすでにコードされているＴ細胞エピトープを考慮に入れることができ、例えば、追加のタンパク質配列によってすでにコードされているＴ細胞エピトープを候補配列の一覧から除去すること等により行う。

【0371】

カセット設計モジュールはまた、配列のサイズを考慮に入れてカセット配列を生成することができる。理論に拘束されることは望まないが、一般に、カセットサイズの増大は、ワクチン生成及び／またはワクチン有効性等のワクチンの態様にマイナスの影響を与え得る。一例では、カセット設計モジュールは、重複Ｔ細胞エピトープ配列等の重複配列を考慮に入れることができる。一般に、重複Ｔ細胞エピトープ配列を含有する単一配列（「フレーム」とも呼ばれる）は、複数のペプチドをコードするために必要な配列サイズが縮小されることから、個々のＴ細胞エピトープを別々に連結している配列よりも効率的である。したがって、例示的な例では、連結されたＴ細胞エピトープをコードする配列を生成するために使用されるカセット設計モジュールは、１つ以上の追加のＴ細胞エピトープをコードするようＴ細胞エピトープ候補を拡張することのコスト／利益を考慮に入れることができ、例えば、追加のＴ細胞エピトープを提示するＭＨＣにさらなる集団を対象とさせることで得られる利益を、配列サイズ増大のコストと対比させて決定することができる。

【0372】

カセット設計モジュールはまた、確認されたエピトープにより引き起こされる免疫応答の刺激の程度を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。

【0373】

カセット設計モジュールはまた、例えば、集団のある割合で、例えば、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％で、少なくとも１つの免疫原性エピトープが少なくとも１つのＨＬＡにより提示される（例えば、４つの主要な民族集団、すなわちヨーロッパ人（ＥＵＲ）、アフリカ系米国人（ＡＦＡ）、アジア人・太平洋諸島住民（ＡＰＡ）及びヒスパニック（ＨＩＳ）にわたる、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子）、ある集団全体のコードされるエピトープの提示を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。例示的な非限定的例として、カセット設計モジュールはまた、少なくとも１つの確認されたエピトープを提示するか、または少なくとも４つ、５つ、６つ、もしくは７つの予測エピトープを提示する、少なくとも１つのＨＬＡが少なくとも集団の８５％、９０％、または９５％にわたって存在するよう、カセット配列を生成することができる。

【0374】

カセット設計モジュールはまた、潜在的安全性を改善する他の態様を考慮に入れてカセット配列を生成することができ、例えば、安全性リスクを示す可能性のある機能性タンパク質、機能性タンパク質ドメイン、機能性タンパク質サブユニット、または機能性タンパク質断片を、コードすること、もしくはコードする可能性を制限する。場合によっては、カセット設計モジュールは、コードされるペプチドの配列サイズを、翻訳された対応する全長タンパク質の５０％未満、４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満であるよう制限することができる。場合によっては、カセット設計モジュールは、単一の連続した配列が、翻訳された対応する全長タンパク質の５０％未満であるよう、コードされるペプチドの配列サイズを制限することができるが、複数の配列が、同じ翻訳された対応する全長タンパク質に由来し得、合わせて５０％超をコードし得る。例を用いて説明すると、重複Ｔ細胞エピトープ配列を含有する単一配列（「フレーム」）が、翻訳された対応する全長タンパク質の５０％よりも大きい場合、フレームを複数のフレームに分割して（例えば、ｆ１、ｆ２等）、各フレームが翻訳された対応する全長タンパク質の５０％未満となるようにすることができる。カセット設計モジュールはまた、コードされたペプチドの配列サイズを、単一の連続した配列が、翻訳された対応する全長タンパク質の４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満となるよう制限することができる。同じ遺伝子からの複数のフレームがコードされる場合、複数のフレームは、互いに重複する配列を有することができ、言い換えれば、それぞれが別々に同じ配列をコードすることができる。同じ遺伝子からの複数のフレームがコードされる場合、同じ遺伝子に由来する２つ以上の核酸配列を、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の直前またはそれに連結されることのないよう並べることができるが、これは、対応する遺伝子において第１の核酸配列に第２の核酸配列が続く場合であり、それが直後であるか否かは問わない。例えば、同じ遺伝子内に３つのフレームがある場合（アミノ酸位置が増加する順にｆ１、ｆ２、ｆ３）：
－ 以下のカセット順序は許容されない：
○ ｆ１の直後にｆ２
○ ｆ２の直後にｆ３
○ ｆ１の直後にｆ３
－ 以下のカセット順序は許容される：
○ ｆ３の直後にｆ２
○ ｆ２の直後にｆ１

【0375】

ＸＩＩＩ．コンピュータの例
本明細書に記載される計算方法のいずれかではコンピュータを使用することができる。当業者は、コンピュータが、異なるアーキテクチャを有し得ることを認識するであろう。コンピュータの例は当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号にコンピュータが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0376】

ＸＩＶ．実施例
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は、あくまで事例を提供するにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。使用する数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差は当然のことながら許容されるべきである。

【0377】

本発明の実施には、特に明記しない限り、当技術分野の技術の範囲内であるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来方法が使用される。そのような技術は文献に十分な説明がある。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。

【0378】

ＸＩＶ．Ａ．ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクター
一例では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＶ）を、抗原カセットの送達ベクターになるよう操作した。さらなる例では、全長ＣｈＡｄＶ６８ベクターをＡＣ＿００００１１．１（特許第ＵＳ６０８３７１６号からの配列２）に基づいて合成し、Ｅ１（ｎｔ４５７～３０１４）配列及びＥ３（ｎｔ２７，８１６～３１，３３２）配列を欠失させた。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失Ｅ１配列の代わりに挿入した。ＨＥＫ２９３細胞へのこのクローンのトランスフェクションでは、感染性ウイルスを得られなかった。野生型Ｃ６８ウイルスの配列を確認するため、分離株ＶＲ－５９４をＡＴＣＣから入手して、継代し、その後、独立して配列決定した（配列番号１０）。ＡＣ＿００００１１．１配列を野生型ＣｈＡｄＶ６８ウイルスのＡＴＣＣ ＶＲ－５９４配列（配列番号１０）と比較した際、６つのヌクレオチドの相違が同定された。一例では、改良型ＣｈＡｄＶ６８ベクターをＡＣ＿００００１１．１に基づいて生成し、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ配列番号１）。

【0379】

別の例では、改良型ＣｈＡｄＶ６８ベクターをＡＣ＿００００１１．１に基づいて生成し、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列及びＥ３（ｎｔ２７，８１６－３１，３３２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１１）またはモデルネオアンチゲンカセット（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ；配列番号１２）を、欠失Ｅ１配列の代わりに挿入した。

【0380】

別の例では、改良型ＣｈＡｄＶ６８ベクターをＡＣ＿００００１１．１に基づいて生成し、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１３）またはモデルネオアンチゲンカセット（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ；配列番号２）を、欠失Ｅ１配列の代わりに挿入した。

【0381】

別の例では、抗原発現系のための改良型ＣｈＡｄＶ６８ベクター（「ｃｈＡｄ６８－空－Ｅ４欠失」配列番号２９３６９）をＡＣ＿００００１１．１に基づいて生成し、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列、Ｅ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列、及びＥ４領域（ｎｔ３４，９１６～３５，６４２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４（独立して配列決定された全長ＶＲ－５９４ Ｃ６８ 配列番号１０）ヌクレオチドを５つの位置で置換した。対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドが５つの位置で置換された全長ＣｈＡｄＶ６８ ＡＣ＿００００１１．１配列を、「ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ」（配列番号１）と呼ぶ。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある抗原カセットを、欠失Ｅ１配列の代わりに挿入する。

【0382】

関連ベクターを以下に記載する：
－ 全長ＣｈＡｄＶＣ６８配列「ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ」（配列番号１）；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドが５つの位置で置換されたＡＣ＿００００１１．１配列、
－ ＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ Ｃ６８（配列番号１０）；独立して配列決定；全長Ｃ６８、
－ ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（配列番号１１）；Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列及びＥ３（ｎｔ２７，８１６－３１，３３２）配列を欠失させたＡＣ＿００００１１．１；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換；ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーターを欠失Ｅ１の代わりに挿入、
－ ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ（配列番号１２）；Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列及びＥ３（ｎｔ２７，８１６－３１，３３２）配列を欠失させたＡＣ＿００００１１．１；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換；ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるモデルネオアンチゲンカセットを欠失Ｅ１の代わりに挿入、
－ ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（配列番号１３）；Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列を欠失させたＡＣ＿００００１１．１；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換；ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーターを欠失Ｅ１の代わりに挿入、
－ ＣｈＡｄ６８－空－Ｅ４欠失（配列番号２９３６９）：Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列、Ｅ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列、及びＥ４領域（ｎｔ３４，９１６～３５，６４２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４（独立して配列決定された全長ＶＲ－５９４ Ｃ６８ 配列番号１０）ヌクレオチドを５つの位置で置換したＡＣ＿００００１１．１、
－ ＣｈＡｄＶ６８－ＧＡＧ（完全長ＣｈＡｄ６８－ＣＭＶ－ＳＩＶＧａｇ－ＳＶ４０ポリＡ；配列番号２９３７１）；Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列を欠失させたＡＣ＿００００１１．１；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換；ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある完全長コドン最適化ＳＩＶ_{ＳＭＥ５４３}ＧＡＧを欠失Ｅ１の代わりに挿入。

【0383】

２９３Ｆ細胞におけるアデノウイルス生成
インキュベーターで８％ＣＯ_２にて２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）培地中で増殖させた２９３Ｆ細胞においてＣｈＡｄＶ６８ウイルス生成を実施した。感染当日、細胞を、９８％の生存率で１０^６細胞／ｍＬまで希釈し、１Ｌ三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）での生産ランあたり４００ｍＬを使用した。目的ＭＯＩが３．３超の４ｍＬの三次ウイルス原液を感染ごとに使用した。トリパンブルーで測定した生存率が７０％未満になるまで細胞を４８～７２時間インキュベートした。その後、感染細胞を、遠心分離（最高速度ベンチトップ型遠心機）によって回収して、１×ＰＢＳで洗浄し、再度遠心分離にかけた後、２０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４に再懸濁させた。細胞ペレットを３回の凍結融解により溶解し、４，３００×ｇで５分間の遠心分離により清澄化した。

【0384】

ＣｓＣｌ遠心分離によるアデノウイルスの精製
ウイルスＤＮＡをＣｓＣｌ遠心分離により精製した。２回の不連続勾配運転を実施した。１回目は細胞成分からウイルスを精製し、２回目で細胞成分からさらに精密に分離し、感染性粒子から欠陥粒子を分離する。

【0385】

１０ｍＬの１．２（９２ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶解した２６．８ｇのＣｓＣｌ）ＣｓＣｌをポリアロマーチューブに加えた。その後、８ｍＬの１．４ ＣｓＣｌ（８７ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶解した５３ｇのＣｓＣｌ）を、ピペットを使用してチューブ下層に送達して慎重に加えた。清澄化したウイルスを１．２層の上に慎重に重層する。必要に応じて、チューブのバランスをとるために、さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓを加えた。その後、チューブをＳＷ－３２Ｔｉローターに置き、１０℃で２時間３０分遠心分離にかけた。その後、チューブを層流キャビネットに移し、１８ゲージ針及び１０ｍＬシリンジを使用して、ウイルスバンドを吸引した。混入している宿主細胞のＤＮＡ及びタンパク質を取り出さないよう注意した。その後、バンドを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で少なくとも２回希釈し、上記のように不連続勾配で重層した。遠心ランの実施は前述同様であるが、今回はランを一晩実施した。翌日、欠陥のある粒子バンドを吸引しないよう注意しながらバンドを吸引した。その後、ウイルスを、Ｓｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＡＲＭ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％グリセロール）に対して透析した。これを、緩衝液交換ごとに１時間ずつ、３回実施した。その後、ウイルスを等量分割して－８０℃で保存した。

【0386】

アデノウイルスのウイルスアッセイ
ＶＰ濃度は、１．１×１０^１２ウイルス粒子（ＶＰ）の吸光係数が、ＯＤ２６０ｎｍでの吸光度値１と等しいことに基づくＯＤ２６０アッセイを使用して実施された。ウイルス溶解バッファー（０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）にアデノウイルスの２つの希釈液（１：５及び１：１０）を作った。両方の希釈液でＯＤを２連で測定し、ＯＤ２６０値×希釈倍率×１．１×１０^１２ＶＰをかけてＶＰ濃度／ｍＬを測定した。

【0387】

ウイルス原液の限界希釈アッセイによって感染単位（ＩＵ）力価を計算した。最初にウイルスをＤＭＥＭ／５％ＮＳ／１×ＰＳで１００倍に希釈し、その後、１０倍希釈を使用して１×１０^－７まで希釈した。次いで、これらの希釈液を１００μＬにて、少なくとも１時間前に３ｅ５細胞／ウェルで播種された２４ウェルプレートの２９３Ａ細胞に加えた。これを２連で実施した。プレートを、ＣＯ２（５％）インキュベーターで３７℃にて４８時間インキュベートした。その後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄してから、１００％冷メタノール（－２０℃）で固定した。その後、プレートを－２０℃で最低２０分間インキュベートした。ウェルを１×ＰＢＳで洗浄した後、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに室温で１時間ブロッキングした。ウサギ抗Ａｄ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をブロッキングバッファーに１：８，０００の希釈で加え（ウェルあたり０．２５ｍｌ）、室温１時間インキュベートした。ウェルを、ウェルあたり０．５ｍＬのＰＢＳで４回洗浄した。１０００倍希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｔｅｘａｓ）をウェルごとに加え、洗浄最終ラウンドの前に１時間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄を５回実施し、プレートを、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン四塩酸塩）基質の０．０１％Ｈ_２Ｏ_２添加Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．６７ｍｇ／ｍＬのＤＡＢ）を使用して作成した。ウェルは、計数の５分前に作成された。細胞を、視野あたり４～４０の染色細胞が得られる希釈を使用して、１０倍率対物レンズ下で計数した。使用された視野は、２４ウェルプレートで視野あたり６２５グリッドに相当する０．３２ｍｍ^２のグリッドであった。感染性ウイルス数／ｍＬは、グリッドあたりの染色細胞数に、視野あたりのグリッド数を掛け、希釈倍率１０を掛けることにより決定され得る。同様に、ＧＦＰ発現細胞を用いる場合には、カプシド染色ではなく蛍光を使用してＧＦＰ発現ビリオン数／ｍＬを決定することができる。

【0388】

ＸＩＶ．Ｂ．アルファウイルスに基づく抗原カセット送達ＳＡＭベクター
抗原発現系のためのＲＮＡアルファウイルス骨格を、自己複製ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス（Ｋｉｎｎｅｙ，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：４００－４１３）から２６Ｓサブゲノムプロモーターの３’に位置するＶＥＥの構造タンパク質を欠失させることによって生成した（ＶＥＥ配列７５４４～１１，１７５を欠失；Ｋｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ １９８６に基づく番号付け；配列番号６）。自己増幅ｍＲＮＡ（「ＳＡＭ」）ベクターを生成するために、欠失配列を抗原配列に置き換える。２０のモデル抗原を含有する代表的ＳＡＭベクターは、「ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ」（配列番号４）である。ＭＡＧ２５ｍｅｒカセットを有する記載の抗原カセットを特徴とするベクターは、全長ＳＩＶ ＧＡＧ等の本明細書に記載されるカセット及び／または全長タンパク質に置き換えることが可能である（下記参照）。

【0389】

完全長コドン最適化ＳＩＶ_{ＳＭＥ５４３}ＧＡＧヌクレオチド配列；ＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＧＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＡＧＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＴＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＡＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＡ。

【0390】

完全長ＳＩＶ_{ＳＭＥ５４３}ＧＡＧアミノ酸配列；ＭＧＡＲＮＳＶＬＳＧＫＫＡＤＥＬＥＫＩＲＬＲＰＮＧＫＫＫＹＭＬＫＨＶＶＷＡＡＮＥＬＤＲＦＧＬＡＥＳＬＬＤＮＫＥＧＣＱＫＩＬＳＶＬＡＰＬＶＰＴＧＳＥＮＬＫＳＬＹＮＴＶＣＶＩＷＣＩＨＡＥＥＫＶＫＨＴＥＥＡＫＱＩＶＱＲＨＬＶＶＥＴＧＴＡＤＫＭＰＡＴＳＲＰＴＡＰＰＳＧＲＧＧＮＹＰＶＱＱＶＧＧＮＹＶＨＬＰＬＳＰＲＴＬＮＡＷＶＫＬＶＥＥＫＫＦＧＡＥＶＶＰＧＦＱＡＬＳＥＧＣＴＰＹＤＩＮＱＭＬＮＣＶＧＥＨＱＡＡＭＱＩＩＲＥＩＩＮＥＥＡＡＤＷＤＬＱＨＰＱＰＧＰＬＰＡＧＱＬＲＥＰＲＧＳＤＩＡＧＴＴＳＴＶＥＥＱＩＱＷＭＹＲＱＱＮＰＩＰＶＧＮＩＹＲＲＷＩＱＬＧＬＱＫＣＶＲＭＹＮＰＴＮＩＬＤＶＫＱＧＰＫＥＰＦＱＳＹＶＤＲＦＹＫＳＬＲＡＥＱＴＤＰＡＶＫＮＷＭＴＱＴＬＬＩＱＮＡＮＰＤＣＫＬＶＬＫＧＬＧＭＮＰＴＬＥＥＭＬＴＡＣＱＧＩＧＧＰＧＱＫＡＲＬＭＡＥＡＬＫＥＡＬＲＰＤＱＬＰＦＡＡＶＱＱＫＧＱＲＲＴＩＫＣＷＮＣＧＫＥＧＨＳＡＲＱＣＲＡＰＲＲＱＧＣＷＧＣＧＫＴＧＨＶＭＡＫＣＰＥＲＱＡＧＦＬＧＦＧＰＷＧＫＫＰＲＮＦＰＭＡＱＭＰＱＧＬＴＰＴＡＰＰＥＤＰＡＶＤＬＬＫＮＹＭＫＭＧＲＫＱＲＥＮＲＥＲＰＹＫＥＶＴＥＤＬＬＨＬＮＳＬＦＧＥＤＱ^＊。

【0391】

ＲＮＡを生成するためのインビトロ転写
インビボ研究の場合、ＳＡＭ ＲＮＡを以下のプロトコルに従って、示されているように生成した：
（１）ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより精製し、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃａｐ１でキャップ化、または
（２）「ＡＵ－ＳＡＭ」ベクターとして生成した。標準３’ジヌクレオチドＧＧを欠く改変Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）をＳＡＭベクターの５’末端に加えて、インビトロ転写テンプレートＤＮＡ（配列番号２９３７０；挿入抗原カセットを用いずに７５４４～１１，１７５を欠失）を生成した。反応条件は、以下に記載のとおりである。
－ １×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼミックス（Ｅ２０４０Ｓ）の最終濃度を使用する、１×転写バッファー（４０ｍＭトリス－ＨＣＬ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び２７ｍＭ塩化マグネシウム）；０．０２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ転写テンプレート（制限消化による線状化）；８ｍＭ ＣｌｅａｎＣａｐ試薬ＡＵ（カタログ番号Ｎ－７１１４）ならびに１０ｍＭずつのＡＴＰ、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ＧＴＰ、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）。
－ 転写反応物を３７℃で２時間インキュベートし、最終２ Ｕ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＡＭ２２３９）／０．００１ｍｇのＤＮＡ転写テンプレート含有ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液で３７℃にて１時間処理した。
－ ＳＡＭをＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ（ＱＩＡＧＥＮ，７５１６２）で精製した。

【0392】

共転写による５’キャップ構造の付加の別法として、ｍＲＮＡ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及びＳ－アデノシルメチオニンを含有するワクシニアキャッピング系（ＮＥＢカタログ番号Ｍ２０８０）を使用した転写後に、７－メチルグアノシンまたは関連５’キャップ構造を酵素により加えることができる。

【0393】

ＸＶ．ＣｈＡｄＶブーストプロトコルはＮＨＰにおけるＴ細胞応答を生じさせる
免疫原性を実証するため、全長ＳＩＶ抗原ＧＡＧを発現するＣｈＡｄＶ６８ベクター及びＳＡＭベクターを使用してＭａｍｕ Ａ０１インドアカゲザル（ＮＨＰ）でワクチン試験を行った。図１は、ワクチン接種戦略を示し、ＣｈＡｄＶ６８ワクチン接種（１ｅ１２ｖｐ／動物）を０週目及び３３週目に行い、ＶＥＥ－アルファウイルスベースのＳＡＭワクチン接種（ＡＵ－ＳＡＭキャップ）を４週目及び１７週目に行う。

【0394】

免疫化
Ｍａｍｕ－Ａ^＊０１インドアカゲザルを、（１）ＣｈＡｄＶ６８－ＧＡＧ（配列番号２９３７１）または（２）同じく全長ＳＩＶ抗原ＧＡＧを発現するカセットを含有するよう操作されている３００ｕｇのＶＥＥ系ＳＡＭベクター（配列番号６）で、１×１０^１２ウイルス粒子（注射あたり５×１０^１１ウイルス粒子）にて筋肉内両側により免疫化した。ＣｈＡｄＶ６８及びＳＡＭのワクチンブーストをプライムワクチン接種後に示されている時点で投与した。

【0395】

免疫モニタリング
プライムワクチン接種後の示されている時期に、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）及びＬｅｕｃｏＳｅｐ分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を使用してＰＢＭＣを分離し、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩに再懸濁させた。死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためにヨウ化プロピジウム染色を使用して、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で細胞を計数した。その後、細胞を、以降の分析用に適切な濃度の生細胞に調整した。試験のそれぞれのサルについて、ＥＬＩＳｐｏｔまたはフローサイトメトリーの方法を使用してＴ細胞応答を測定した。ワクチンでコードされた６つの異なるプールのＳＩＶ ＧＡＧエピトープ（６つの重複ペプチドプール、それぞれ２０ペプチド、１５アミノ酸）に対するＴ細胞応答を、エキソビボ酵素結合免疫スポット（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ：ＥＬＩＳｐｏｔ）分析を使用してＩＦＮ－ガンマ等のサイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣからモニターした。サルＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）でＥＬＩＳｐｏｔ調和ガイドライン｛ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝に従ってＥＬＩＳｐｏｔ分析を実施した。２００，０００ＰＢＭＣを、ＩＦＮｇ抗体コート済み９６ウェルプレートで、１０ｕＭの示されているペプチドと共に１６時間インキュベートした。アルカリホスファターゼを使用してスポットを作成した。反応を１０分計り、水道水下でプレートを流して反応を停止させた。ＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用してスポットを計数した。ＥＬＩＳｐｏｔ分析の場合、飽和度が５０％超のウェルは「過多のため計数不能」として記録された。複製ウェルの偏差が１０％超の試料は分析から除外された。その後、スポットカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス％／［１００％－コンフルエンス％］）を使用してウェルのコンフルエントな状態について補正した。抗原刺激ウェルからペプチド刺激陰性ウェルのスポットカウントを差し引いて陰性バックグラウンドを補正した。最後に、過多のため計数不能とラベル付けされたウェルを補正最大観測値に設定し、１００の位まで切り上げた。

【0396】

結果
ワクチン接種後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）での抗原特異的細胞性免疫応答を評価した。図２に示されるように、ＣｈＡｄＶのプライム後に免疫応答が観察され、それぞれのＳＡＭブースト用量の後にも免疫応答増大が観察された。注目すべきことに、免疫応答増大はまた、３３週目に投与されたＣｈＡｄＶブースト用量後にも観察された。具体的には、６匹の霊長類全体の各プールの平均を示す図２Ａに示されるように、３３週目と比べて、３４週目では４．０倍の平均増加、３５週目では６．６倍の平均増加が観察された（３３週目の平均ＳＦＣ：２４９７；３４週目の平均ＳＦＣ：９９３０；３５週目の平均ＳＦＣ：１６４４５）。図２Ｂは、応答が非常に高い個々の霊長類＃１～３の結果を示し（１８，０００ＳＦＣ／１ｅ６ ＰＢＭＣを超える）、それぞれ、３３週目と比べて３５週目に６．６倍、４．０倍、及び１６．６倍の増加である。図２Ｃは、応答が高い個々の霊長類＃４～６の結果を示し（１８，０００ＳＦＣ／１ｅ６ ＰＢＭＣ未満）、霊長類＃４及び＃６ではそれぞれ、３３週目と比べて３５週目に５．８倍及び４．７倍の増加、及び霊長類＃４では、３３週目と比べて３４週目に５４．８倍の増加である。結果は、ワクチン接種戦略、特にＣｈＡｄＶブースト用量が、強い抗原特異的免疫応答をもたらしたことを示す。

【0397】

ＸＶＩ．ＣｈＡｄＶ中和抗体はＮＨＰにおいて経時的に減少する
免疫原性を実証するため、ＳＩＶ抗原を発現するベクター使用してＭａｍｕ Ａ０１インドアカゲザル（ＮＨＰ）でワクチン試験を行った。３群のＮＨＰを、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ（配列番号２）により、チェックポイント阻害物質抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブ（群５及び群６）と共に、またはチェックポイント阻害物質なし（群４）のいずれかで免疫化した。抗体を、静脈内（群５）または皮下（群６）に投与した。ＣｈＡｄＶ６８ワクチン接種（１ｅ１２ ｖｐ／動物）を０週目及び３２週目に投与し、その間に、ＶＥＥ－アルファウイルスベースのＳＡＭワクチン接種の追加投与を行った。

【0398】

中和抗体価
処置後の示されている時点で血清を採取した。ＮＨＰの血清を５６℃で３０分間熱非働化した。ＤＭＥＭで血清の２倍希釈を１：２０から１：１０，２４０まで行った。その後、体積が５０ｕＬのＣｈＡｄＶ－ＬａｃＺウイルス（７ｅ６ ＩＵ／ｍＬ）を、等体積の希釈血清と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。この混合物の２０ｕＬを、７ｅ４ ＨＥＫ２９３細胞／ｍＬで播種しておいた９６ウェルプレートのウェルごとに加えた。各希釈度で三連ウェルを実施し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、Ｇａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）化学発光キットを使用してベータ－ガラクトシダーゼ活性を測定した。希釈血清と混合したウイルスの中和パーセントを、細胞培養培地で希釈した中和されていないウイルスからの発現に対して測定する。中和力価（ＮＴ５０）は、ウイルスを５０％中和する血清の最小希釈度として計算され、これは、非線形回帰曲線フィッティングを使用して計算される。

【0399】

結果
ＣｈＡｄＶ中和抗体価は、ワクチン接種プロトコルの期間中に評価され、結果を表２に示す。ワクチン接種（０日目）前、ＮＴ５０値から、既存のＣｈＡｄＶ中和抗体の意味のある存在は示されなかった。ワクチン接種後、試験した全群で、ＣｈＡｄＶ中和抗体価は７週目に増加し、２４週目にさらに増加した。３２週目、ＣｈＡｄＶ処置群の中和力価は、ＩＰＩを受けていない群では２４週目の値の約３分の１に（群４；ＮＴ５０が２５２７から８４６）減少しており、ＩＰＩ同時投与群では約半分に（群５／６；ＮＴ５０が１１８４から６０１に）減少していた。注目すべきことに、３２週目のＣｈＡｄＶブースト投与の５週間後、同じ群で力価がそれぞれ５６６４及び５０９６に再び増加した。結果から、ＣｈＡｄＶに指向した中和抗体は、ＣｈＡｄＶプライミング用量後に予測される初期増加に続いて減少することが示される。

【0400】

（表２）ワクチン接種後のＣｈＡｄＶ中和抗体価

【0401】

ＸＶＩＩ．ＣｈＡｄＶブーストプロトコルではヒト被検者においてＴ細胞応答を生じさせる
方法
個別化ネオアンチゲンがんワクチン（「ＧＲＡＮＩＴＥ」）を免疫チェックポイント阻害物質と組み合わせて進行がん患者に投与した。ＧＲＡＮＩＴＥ異種プライム／ブーストワクチンレジメンには、（１）プライムワクチン接種として使用されるＣｈＡｄＶ［ＧＲＴ－Ｃ９０１］、及び（２）ＧＲＴ－Ｃ９０１に続くブーストワクチン接種に使用される、ＬＮＰに製剤化されたＳＡＭ［ＧＲＴ－Ｒ９０２］が含まれた。ＣｈＡｄＶベクターは、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）欠失及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）欠失を伴う配列番号１の配列を有する改変ＣｈＡｄＶ６８配列に基づく。ＳＡＭベクターは、配列番号６に記載の核酸配列を有するＲＮＡアルファウイルス骨格に基づく。ＧＲＴ－Ｃ９０１及びＧＲＴ－Ｒ９０２のどちらも、同じ２０の個別化ネオアンチゲン及び２つのユニバーサルＣＤ４ Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ及び破傷風トキソイド）を発現した。体細胞変異を検出するための全エクソーム及びトランスクリプトームのシークエンシングには腫瘍を使用し、ＥＤＧＥアルゴリズムを使用して被験者の個別化ネオアンチゲンカセットを生成するための、ＨＬＡタイピング及び生殖細胞系列エクソームバリアントの検出／減算には、血液を使用した。

【0402】

ＧＲＡＮＩＴＥレジメンでは、免疫チェックポイント阻害物質、具体的には、ＳＣ ＩＶニボルマブと組み合わせて、ワクチンをＩＭ注射で両側に（例えば、それぞれの三角筋に）投与した。

【0403】

ＧＲＴ－Ｃ９０１は、チンパンジーアデノウイルス６８に基づいた、複製欠損型のＥ１及びＥ３が欠失したアデノウイルスベクターである。ベクターは、２０のネオアンチゲン及び２つのユニバーサルＣＤ４ Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ及び破傷風トキソイド）をコードする発現カセットを含有した。ＧＲＴ－Ｃ９０１を、５×１０^１１ｖｐ／ｍＬで溶液に製剤化し、相対する三角筋の２つの両側ワクチン注射部位のそれぞれに１．０ｍＬをＩＭ注射した。評価された被検者についてのＧＲＴ－Ｃ９０１カセット（表３Ａ）及び決定されたＨＬＡ（表３Ｂ）は以下のとおりである。

【0404】

（表３Ａ）ＧＲＡＮＩＴＥカセット

【0405】

（表３Ｂ）ＧＲＡＮＩＴＥ被験者ＨＬＡ

【0406】

ＧＲＴ－Ｒ９０２は、アルファウイルスに由来するＳＡＭベクターである。ＧＲＴ－Ｒ９０２ベクターは、ＲＮＡ増幅に必要なウイルスタンパク質ならびに５’及び３’のＲＮＡ配列をコードしたが、構造タンパク質はコードしなかった。ＳＡＭベクターは、ＳＡＭを封入しＬＮＰを形成するために４つの脂質、すなわち、イオン化可能なアミノ脂質、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧベースのコート脂質が含まれた、ＬＮＰに製剤化された。ＧＲＴ－Ｒ９０２ベクターは、各患者でＧＲＴ－Ｃ９０１に使用されたものと同じネオアンチゲン発現カセットをそれぞれ含有した。ＧＲＴ－Ｒ９０２を１ｍｇ／ｍＬで溶液に製剤化し、相対する三角筋の２つの両側ワクチン注射部位のそれぞれにＩＭ注射した（三角筋が好ましいが、両側の殿筋［背側もしくは腹側］または大腿直筋が使用される場合がある）。ブーストワクチン接種部位は、可能な限りプライムワクチン接種部位の近くにした。注射量は、投与される用量に基づいた。被検者Ｇ１及びＧ３のＳＡＭの用量は３０μｇ、被験者Ｇ８では１００μｇ、及び被験者Ｇ１１では３００μｇであった。用量の量は、ＳＡＭベクターの量を明示的に指す、すなわち、ＬＮＰ等の他成分を指してはいない。ＬＮＰ：ＳＡＭの比は約２４：１であった。したがって、ＬＮＰの用量はそれぞれ、７２０μｇ、２４００μｇ、または７２００μｇであった。

【0407】

ニボルマブは、ＰＤ－１と、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との相互作用を遮断するヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体（配列番号２９５２２及び２９５２３を参照のこと）である。ニボルマブを１０ｍｇ／ｍＬで溶液に製剤化し、０．２ミクロン～１．２ミクロンの孔径の低タンパク質結合性インラインフィルターを通して、プロトコル指定の用量にてＩＶ注入（４８０ｍｇ）として投与した。ＩＶプッシュまたはボーラス注射としては投与されなかった。ニボルマブ注入の直後に希釈剤でフラッシュし、ラインをきれいにする。イピリムマブを含むかまたは含まない各ワクチン接種（すなわち、ＧＲＴ－Ｃ９０１またはＧＲＴ－Ｒ９０２のそれぞれ）に続いてニボルマブが同じ日に投与された。ニボルマブの用量及び経路は、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ承認の用量及び経路に基づいた。

【0408】

ＧＲＡＮＩＴＥ被検者のワクチン接種後の免疫応答を評価した。被験者に対して採血を行い、ＰＢＭＣを採取した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。再刺激に使用されたペプチドを以下に示す。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を２×１０^５細胞／ウェル（エキソビボ）または１０^５細胞／ウェル（ＩＶＳ後）で播種し、最小エピトープペプチド（８～１１ｍｅｒ）または対照の存在下、抗ヒトインターフェロン－ガンマ抗体でコートしたＥＬＩＳｐｏｔプレートで一晩刺激した。加湿５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターでの２０時間のインキュベーション後、細胞を除去しＥＬＩＳｐｏｔプレートを標準的プロトコルに従って作成した。データは、１０^６脾細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告される。

【0409】

エキソビボＩＦＮガンマＥＬＩＳｐｏｔ
ＩＦＮｇ産生Ｔ細胞の検出を、エキソビボＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｊａｎｅｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）によって実施した。簡単に言えば、細胞を回収して計数し、４×１０^６細胞／ｍｌ（エキソビボＰＢＭＣ）または２×１０^６細胞／ｍｌ（ＩＶＳ増殖細胞）で培地に再懸濁させ、ＤＭＳＯ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、フィトヘマグルチニン－Ｌ（ＰＨＡ－Ｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ，ＵＳＡ）、ＣＥＦペプチドプール、または同族ペプチドの存在下、抗ヒトＩＦＮｇ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎａｔｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）でコートしたＥＬＩＳｐｏｔ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で培養した。５％ＣＯ_２、３７℃の加湿インキュベーターでの１８～２４時間のインキュベーション後、上清を採取し、細胞をプレートから除去し、抗ヒトＩＦＮｇ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎアビジンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＡＥＣ基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、膜に結合したＩＦＮｇを検出した。ＥＬＩＳｐｏｔプレートを乾燥させ、遮光して保存し、標準化された評価（Ｊａｎｅｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）のためにＺｅｌｌｎｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｒｔ Ｌｅｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）に送付した。データは、１００万細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示される。

【0410】

ＥＬＩＳｐｏｔ上清におけるＭＳＤ
Ｕ－ｐｌｅｘアッセイＭＳＤ Ｕ－ＰＬＥＸバイオマーカーアッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、エキソビボＥＬＩＳｐｏｔ上清中での分泌されたＩＬ－２、ＴＮＦａ、及びグランザイムＢ（ＧＲＺＢ）の検出を実施した。アッセイを製造者の指示書に従って実施した。被分析物濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、各サイトカインの既知標準の段階希釈を使用して計算した。グラフでのデータ表示の場合、標準曲線の最小範囲を下回る値はゼロとして表した。

【0411】

トリプレックスＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ
ＩＦＮｇ、ＩＬ－２及びグランザイムＢを産生するＴ細胞の検出のために、患者試料のサブセットでマルチプレックスＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイを製造者（ＭＡＢｔｅｃｈ）の指示書に従って実施した。簡単に言えば、患者ＰＢＭＣを融解し、２×１０^６細胞／ｍｌで一晩静置した。翌日、細胞を回収して計数し、播種前に４×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁させた。プレコートしたＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートをＰＢＳで洗浄し、培地でブロッキングしてから患者特異的ペプチドプール及び細胞を加えた（２×１０^５ＰＢＭＣ／ウェル）。５％ＣＯ_２、３７℃の加湿インキュベーターで１８～２４時間インキュベートした後、抗ヒトＩＦＮｇ－ＢＡＭ／抗ＢＡＭ－４９０、ビオチン化抗ヒトグランザイムＢ／ストレプトアビジン－５５０、及び抗ヒト－ＩＬ－２－ＷＡＳＰ／抗ＷＡＳＰ－６５０抗体対に続けて、蛍光エンハンサーを使用して、分泌されたＩＦＮｇ、ＩＬ－２及びグランザイムＢを検出した。プレートを画像化し、ＡＩＤ ｉＳｐｏｔリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）で計数した。データは、１００万細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示される。

【0412】

クラスＩ四量体染色
ＨＬＡクラスＩ四量体を、Ｆｌｅｘ－Ｔ（商標）ビオチン化ＨＬＡモノマー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から、かかるモノマーに、製造者の指示書に従ってＵＶ交換により標的ペプチドを搭載して生成した。ＵＶ交換による標的ペプチド搭載の成功を、ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、製造者の指示書に従う）により評価した。別法として、ビオチン化モノマーを自社生成し、標的ペプチドを用いて事前に折り畳みを行った。フルオロフォア結合ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製ＰＥ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ製ＡＰＣ；ＢＶ４２１）を使用してペプチド－ＨＬＡ（ｐＨＬＡ）モノマーを四量体に組み立てた。生成されたフルオロフォア標識ペプチド－ＭＨＣ四量体を使用して、ＰＢＭＣに四量体染色を行い、抗原特異的Ｔ細胞の識別に役立てた。患者ＰＢＭＣ試料を融解し、ＦＡＣ緩衝液（ＰＢＳ、１０％ＦＢＳ［ｖ／ｖ］）で９６ウェルＶ底プレートに再懸濁させた。染色前、試料を５０ｎＭダサチニブ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共に５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内で３０分間インキュベートした。その後、目的の標的ペプチドを搭載したＨＬＡクラスＩフルオロフォア標識四量体を、それぞれ対応するＰＢＭＣ試料に直接加えた。同じ試料に複数の四量体を加える必要がある場合には、各四量体が等量のカクテルを作り、次いで混合し、同時に加えた。試料を室温で１時間、暗所にてインキュベートした。インキュベーション後、試料をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、精製された抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体、抗ヒトＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、抗ヒトＣＣＲ７－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ３－ＢＶ４２１（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ－ＳＢ７０２、抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ－ｅＦ７８０（どちらもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有する抗体マスターミックスで染色した。試料を混合し、遮光した暗所で４℃にて２０分間インキュベートした。試料をＦＡＣｓ緩衝液で１回洗浄し、その後、ＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁させてから、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での取得を行った。

【0413】

フローサイトメトリー解析
ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して、フローサイトメーターで取得された試料を分析した。ヒト試料のゲーティング戦略は、以下のとおりである：リンパ球（ＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａ）、単一細胞（ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａ）、生存細胞（ＦＳＣ－Ａ対ＬＤ－ＡＦ４８８）、ＣＤ３^＋細胞（ＦＳＣ－Ａ対ＣＤ３－ＢＶ４２１）、ＣＤ８^＋Ｔｅｔ^＋（ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５対四量体－ＰＥもしくは四量体－ＡＰＣ、または対四量体－ＢＶ４２１）、メモリー表現型（ＣＤ４５ＲＡ－ＳＢ７０２対ＣＣＲ７－ＰＥ－Ｃｙ７）。結果は、陽性細胞集団％として表される（親の頻度）。示されている場合は、バックグラウンドを差し引いたデータとして示される。

【0414】

（表４）再刺激アッセイにおけるＧＲＡＮＩＴＥ患者Ｇ１のペプチド

【0415】

（表５）再刺激アッセイにおけるＧＲＡＮＩＴＥ患者Ｇ３のペプチド

【0416】

（表６）再刺激アッセイにおけるＧＲＡＮＩＴＥ患者Ｇ８のペプチド

【0417】

（表７）再刺激アッセイにおけるＧＲＡＮＩＴＥ患者Ｇ１１のペプチド

【0418】

結果
ＧＲＡＮＩＴＥ被検者Ｇ１及びＧ３のＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳｐｏｔによりＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を評価した。図３に示されるように、被験者Ｇ１では、最初にプライミングワクチンとして使用されたＣｈＡｄＶベクター［ＧＲＴ－Ｃ９０１］によるブースト用量を６８週目に投与された後、早くも２週間でＣＤ８Ｔ細胞応答の増大が示された。図３Ａは、ＣＤ８エピトーププール全体に対する被験者Ｇ１の応答を示す。図３Ｂ（試験の全タイムライン）及び図３Ｃ（６８週目及び７０週目のみ）は、ＣＤ８エピトープのミニプールに対する被験者Ｇ１の応答を示す。図４に示されるように、被験者Ｇ３でも、最初にプライミングワクチンとして使用されたＣｈＡｄＶベクター［ＧＲＴ－Ｃ９０１］によるブースト用量を３６週目に投与された後、早くも１週間で（３７週目）ＣＤ８Ｔ細胞応答の増大が示された。図５に示されるように、被験者Ｇ８でも、ＣＤ８Ｔ細胞応答の増大が示され、最初にプライミングワクチンとして使用されたＣｈＡｄＶベクター［ＧＲＴ－Ｃ９０１］によるブースト用量を３６週目に投与された後、２９週間まで検出された。図６に示されるように、被験者Ｇ１１でも、最初にプライミングワクチンとして使用されたＣｈＡｄＶベクター［ＧＲＴ－Ｃ９０１］によるブースト用量を２７週目に投与された後、早くも３週間で（３０週目）ＣＤ８Ｔ細胞応答の増大が示され、Ｔ細胞応答の増大持続は、ＣｈＡｄＶベクターによるブースト後２４週間まで続いた。

【0419】

ＣｈＡｄＶベクターによるブーストの有効性を評価するため、免疫細胞の特徴（例えば、機能及び免疫表現型）もまた決定された。図７に示されるように、ＣｈＡｄＶブーストにより、腫瘍患者での抗原特異的なＩＦＮγ及びグランザイムＢ ＣＤ８Ｔ細胞応答が増大した。最小ＩＬ－２産生もまた観察され、これは、主にＣＤ８Ｔ細胞により誘導される応答と一致する。

【0420】

その後、エフェクターメモリーＴ細胞集団を評価した。エフェクターメモリーＴ細胞は、末梢循環及び組織に見られ、細胞傷害性機能を保持しており、再曝露時に病原体／抗原提示細胞に即時に応答がもたらされるよう高い増殖能を有する。図８Ａ（ブースト前）及び図８Ｂ（ブースト後）に示されるように、ＣｈＡｄＶブーストにより、ＨＬＡ－Ｂ^＊４４：０５拘束性細胞のエフェクターメモリー表現型を有する抗原特異的Ｔ細胞頻度が増大した。図８Ｃに示されるように、ＣｈＡｄＶブースト（右パネル）では、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１拘束性細胞のエフェクターメモリー表現型を有する、抗原特異的Ｔ細胞の頻度が増大した。いずれの場合にも、ブーストにより、四量体陽性ＨＬＡ拘束性抗原特異的Ｔ細胞全体のパーセンテージも増加した。したがって、データから、ＣｈＡｄＶブーストが抗原特異的Ｔ細胞の増殖を全体的に刺激し、特にエフェクターメモリー表現型を有するＴ細胞の増殖を刺激したことが実証された。

【0421】

結果は、ＧＲＡＮＩＴＥ ＣｈＡｄＶベクターＧＲＴ－Ｃ９０１が、プライミング用量としての同じベクターの投与後にブースト用量として早くも２７週目に投与した場合に、強いＣＤ８Ｔ細胞の免疫応答を刺激して、集団全体を増加させること、ならびに細胞の機能及び分化（例えば、活性化、サイトカイン産生、及び免疫表現型）を促進することの両方を刺激し、ＣｈＡｄＶブースト前と比べてＴ細胞応答を高め、それが少なくとも２９週間続くことを示している。したがって、データは、ＣｈＡｄＶベクターが、同種プライム／ブーストワクチン接種戦略において有効であったことを示す。

【0422】

ＸＶＩＩＩ．ＨＩＶ治療におけるＣｈＡｄＶブーストプロトコル
ＨＩＶである対象は、プライム／ブーストワクチンレジメンで治療され、プライムワクチン接種として使用されるＣｈＡｄＶベースのワクチンならびにブーストワクチン接種に使用されるＬＮＰに製剤化されたＳＡＭベースのワクチン及びＣｈＡｄＶベースのワクチンの組み合わせが含まれる。対象には、現在ＡＲＴ療法を受けているＨＩＶ陽性個人が含まれる。ＣｈＡｄＶベクターは、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）欠失及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）欠失を伴う配列番号１の配列を有する改変ＣｈＡｄＶ６８配列、またはＥ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列、Ｅ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列、及びＥ４領域（ｎｔ３４，９１６～３５，６４２）配列が欠失している配列番号２９３６９の配列を有する改変ＣｈＡｄＶ６８配列に基づく。ＳＡＭベクターは、配列番号６に記載の核酸配列を有するＲＮＡアルファウイルス骨格に基づく。ＣｈＡｄＶベース及びＳＡＭベースのワクチンはいずれも、コドンが最適化された全長ＧＡＧ等のＨＩＶ抗原、ならびに２つのユニバーサルＣＤ４ Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ及び破傷風トキソイド）をコードする。

【0423】

ワクチンは、ＩＭ注射で両側に（例えば、それぞれの三角筋に）投与される。ＣｈＡｄＶベースのワクチンは、５×１０^１１ウイルス粒子の総投与量で投与され、必要に応じて１×１０^１１または１×１０^１２ウイルス粒子にスケーリングされる。ＳＡＭベースのワクチンは、３００μｇのＲＮＡの用量で投与され、必要に応じて１００μｇのＲＮＡに漸減される。

【0424】

２つのワクチンレジメンを評価する。第１のコホートは、以下のレジメンで治療される：ＣｈＡｄＶ－４ｗ－ＳＡＭ－１２ｗ－ＳＡＭ－１２ｗ－ＣｈＡｄＶ。第２のコホートは、以下のレジメンで治療される：ＣｈＡｄＶ－４ｗ－ＳＡＭ－６ｗ－ＳＡＭ－６ｗ－ＳＡＭ－６ｗ－ＳＡＭ－６ｗ－ＣｈＡｄＶ。

【0425】

対象をモニターし、その結果から、プライム／ブーストワクチンレジメンがＨＩＶの治療に有効であることが示される。

【0426】

ＸＩＸ．ＣｈＡｄＶブースト療法プロトコル
対象は、プライム／ブーストワクチンレジメンで治療され、プライムワクチン接種及びブーストワクチン接種として使用されるＣｈＡｄＶベースのワクチンが含まれる。プロトコルには、ブーストワクチン接種に使用されるＬＮＰに製剤化されたＳＡＭベースのワクチンとの組み合わせも含まれ得る。ＣｈＡｄＶベクターは、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）欠失及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）欠失を伴う配列番号１の配列を有する改変ＣｈＡｄＶ６８配列、またはＥ１（ｎｔ５７７～３４０３）配列、Ｅ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列、及びＥ４領域（ｎｔ３４，９１６～３５，６４２）配列が欠失している配列番号２９３６９の配列を有する改変ＣｈＡｄＶ６８配列に基づく。ＳＡＭベクターは、配列番号６に記載の核酸配列を有するＲＮＡアルファウイルス骨格に基づく。ＣｈＡｄＶベースのワクチン、及びＳＡＭベースのワクチン（該当する場合）は、連結されたＴ細胞エピトープ及び／または疾患、すなわち、対象が、それを有すると診断されている、それを有することが予測される、もしくはそれを有するリスクがある疾患に関連する全長タンパク質、ならびに２つのユニバーサルＣＤ４ Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ及び破傷風トキソイド）をコードする抗原カセットをコードする。

【0427】

ワクチンは、ＩＭ注射で両側に（例えば、それぞれの三角筋に）投与される。ＣｈＡｄＶベースのワクチンは、５×１０^１１ウイルス粒子の総投与量で投与され、必要に応じて１×１０^１１または１×１０^１２ウイルス粒子にスケーリングされる。ＳＡＭベースのワクチンは、３００μｇのＲＮＡの用量で投与され、例えば、必要に応じて１０μｇ及び／または１００μｇのＲＮＡまで、必要に応じて漸減される。

【0428】

評価されるワクチンレジメンにはブーストが、２か月目または約２か月目（例えば、８週目または約８週目）に投与される、同種のＣｈＡｄＶベースのプライム／ブーストワクチンレジメンが含まれる。

【0429】

対象をモニターし、その結果から、プライム／ブーストワクチンレジメンが、対象を治療及び／または免疫化するのに有効であることが示される。

【0430】

配列
表Ａ
配列表、配列番号１０，７５５～２１，０１５を指す。明確にするため、所与のＨＬＡアレルペプチドと関連すると予測された、ＥＤＧＥスコアが０．００１超であるＨＬＡアレルを伴う各ペプチドには、固有の配列番号が割り当てられる。上記の配列識別子のそれぞれが、ペプチドのアミノ酸配列、ＨＬＡサブタイプ、ペプチドに対応する遺伝子名、ペプチドと関連する変異、及びそのペプチド：ＨＬＡ対の保有率が０．１％超（「１」と表す）であるのか、または０．１％未満（「０」と表す）であるのかに関連付けられている。

【0431】

表Ａは、その全体が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年１２月５月２３日出願の米国仮出願第６２／６７５，５５９号に開示されている。

【0432】

ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果
配列表、配列番号２１，０１６～２９，３５７を指す。明確にするため、所与のＨＬＡアレルペプチドと関連すると予測された、ＥＤＧＥスコアが０．００１超及び保有率が０．１％超であるＨＬＡアレルを伴う各ペプチドには、固有の配列番号が割り当てられる。上記の配列識別子のそれぞれが、ペプチド、ＨＬＡサブタイプ、及びそのペプチドのアミノ酸配列に対応する、遺伝子名及び変異に関連付けられている。

【0433】

追加のＭＳ確認済みネオアンチゲン（配列番号２９３５８～２９３６４）

【0434】

表１．２
配列表、配列番号５７～１０，７５４を指す。がん症例の少なくとも０．９８％において少なくとも１０ＴＰＭの量で発現される遺伝子と関連する、予測共通抗原。上記の配列識別子のそれぞれが、遺伝子名、ペプチドのアミノ酸配列、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ、及び対応するＨＬＡアレルに関連付けられている。

【0435】

特定の配列
本明細書で言及されるベクター、カセット、及び抗体は以下に記載され、配列番号により言及される。

【0436】

参考文献

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【配列表】

2023553014000001.app

【国際調査報告】