特表 2023-553049 ＣＤ１９＋、ＣＤ２０＋、若しくはＣＤ２２＋腫瘍又はＢ細胞由来の自己免疫疾患を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-20

(54)【発明の名称】ＣＤ１９＋、ＣＤ２０＋、若しくはＣＤ２２＋腫瘍又はＢ細胞由来の自己免疫疾患を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20231213BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231213BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231213BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20231213BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231213BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20231213BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/705 ZNA

C12N15/54

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/867 Z

C12N15/869 Z

C12N5/10

C12N1/00 B

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/17

A61K38/17

A61K39/39

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023534361

(86)(22)【出願日】2021-12-10

(85)【翻訳文提出日】2023-08-02

(86)【国際出願番号】 IT2021050402

(87)【国際公開番号】W WO2022123613

(87)【国際公開日】2022-06-16

(31)【優先権主張番号】102020000030266

(32)【優先日】2020-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520352377

【氏名又は名称】オスペダーレ ペディアトリコ バンビーノ ジェス

【氏名又は名称原語表記】ＯＳＰＥＤＡＬＥ ＰＥＤＩＡＴＲＩＣＯ ＢＡＭＢＩＮＯ ＧＥＳＵ’

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】クインタレッリ， コンチェッタ

(72)【発明者】

【氏名】デ アンジェリス， ビアジョ

(72)【発明者】

【氏名】ロカテッリ， フランコ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BB19

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084NA14

4C084ZB08

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085AA38

4C085EE06

4C085FF24

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB08

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、白血病及びリンパ系悪性腫瘍などのＣＤ１９^＋、ＣＤ２０^＋又はＣＤ２２^＋腫瘍を治療するための強力なＣＡＲ Ｔ細胞に関し、これは、前記腫瘍の治療における安全性の向上を提供し、及びＣＡＲ^＋ Ｂ細胞白血病芽球におけるエピトープマスキングを防止し、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９^－／ＣＡＲ^＋、ＣＤ２０^－／ＣＡＲ^＋又はＣＤ２２^－／ＣＡＲ^＋白血病再発の潜在的リスクを減少させることができる。さらに、本発明によるＣＡＲ Ｔ細胞は、自己抗体を産生するＢ細胞によって引き起こされる自己免疫疾患の治療においても、安全性の向上を提供する。
【選択図】 図６Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ末端からＣ末端まで：
ａ）シグナルペプチド、
ｂ）抗ＣＤ１９一本鎖抗体ドメイン、抗ＣＤ２０一本鎖抗体ドメイン、又は抗ＣＤ２２一本鎖抗体ドメインからなる群から選択される一本鎖抗体ドメインであって、前記一本鎖抗体ドメインは、リンカーによって互いに連結されたＶＬ及びＶＨ配列を含むか、又はそれらからなる、一本鎖抗体ドメイン、
ｃ）ヒンジ、
ｄ）膜貫通ドメイン、
ｅ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、及び
ｆ）ＣＤ３ゼータ鎖配列
を含むか、又はそれらからなるキメラ抗原受容体であって、
前記リンカーは、例えば７個～１２個又は７個～１０個又は８個などの７個～１４個のアミノ酸の長さの短いフレキシブルなリンカーである、キメラ抗原受容体。

【請求項2】

抗ＣＤ１９一本鎖抗体ドメインは、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ及びＶＨ配列を含み、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ配列は、ＣＤＲ１配列QDISKY（配列番号１）、ＣＤＲ２配列HTS及びＣＤＲ３配列GNTLP（配列番号２）を含む一方で、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＨ配列は、ＣＤＲ１配列GVSLPDYG（配列番号３）、ＣＤＲ２配列IWGSETT（配列番号４）及びＣＤＲ３配列AKHYYYGGSYAMDY（配列番号５）を含み；
抗ＣＤ２０一本鎖抗体ドメインは、抗ＣＤ２０ ＶＬ及びＶＨ配列を含み、抗ＣＤ２０ ＶＬ配列は、ＣＤＲ１配列SSVSY（配列番号６）、ＣＤＲ２配列ATS及びＣＤＲ３配列QQWTSNPPT（配列番号７）を含む一方で、抗ＣＤ２０ ＶＨ配列は、ＣＤＲ１配列GYTFTSYN（配列番号８）、ＣＤＲ２配列IYPGNGDT（配列番号９）及びＣＤＲ３配列ARSTYYGGDWYFNV（配列番号１０）を含み；
抗ＣＤ２２一本鎖抗体ドメインは、抗ＣＤ２２ ＶＬ及びＶＨ配列を含み、抗ＣＤ２２ ＶＬ配列は、ＣＤＲ１配列QSLANSYGNTF（配列番号１１）、ＣＤＲ２配列GIS及びＣＤＲ３配列LQGTHQP（配列番号１２）を含む一方で、抗ＣＤ ２２ ＶＨ配列は、ＣＤＲ１配列GYRFTNYWIH（配列番号１３）、ＣＤＲ２配列INPGNNYA（配列番号１４）及びＣＤＲ３配列TRを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ配列が、以下の配列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT（配列番号１５）
を含むか、又は配列からなり、
抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＨ配列が、以下の配列
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS（配列番号１６）；
を含むか、又は配列からなり、
抗ＣＤ２０ ＶＬ配列が、以下の配列
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号１７）
を含むか、又は配列からなり、
抗ＣＤ２０ ＶＨ配列が、以下の配列
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA（配列番号１８）；
を含むか、又は配列からなり、
抗ＣＤ２２ ＶＬ配列が、以下の配列
DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK（配列番号１９）
を含むか、又は配列からなり、
抗ＣＤ２２ ＶＨ配列が、以下の配列
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号２０）
を含むか、又は配列からなる、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

ＶＬ及びＶＨ配列を連結する前記リンカーが、（Ｇ４Ｓ）２リンカーGGGGSGGGG（配列番号３５）、Ｇ４ＳＧ２リンカーGGGGSGG（配列番号３７）又はＧ３ＳＧ４リンカーGGGSGGGG（配列番号３８）、ＳＧ４ＳＧ３リンカーSGGGGSGGG（配列番号１８６）、（ＳＧ４）２ ＳリンカーSGGGGSGGGGS（配列番号１８７）、（ＳＧ４）２ ＳＧリンカーSGGGGSGGGGSG（配列番号１８８）、（ＳＧ４）２ ＳＧ３リンカーSGGGGSGGGGSGGGリンカー（配列番号１８９）、（ＳＧ４）２ SGGGGSGGGG（配列番号１９０）、（ＳＧ４）２ ＳＧ２ SGGGGSGGGGSGG（配列番号１９１）などの、グリシンを豊富に含むフレキシブルなフレックスリンカーからなる群から選択され、好ましくはＧ３ＳＧ４リンカーである、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記ヒンジが、以下のヒンジ：
ＣＤ８ストーク
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号２１）；
ヒンジＣＤ２８
EVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP（配列番号２２）；
ヒンジＣＨ２－ＣＨ３
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号２３）；又は
ヒンジＣＨ３：
ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号２４）、
のうちの１つ又は複数を含むか、又はそれらからなり、
好ましくは、ＣＤ８ストークである、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記ヒンジが、Ｎ末端で追跡可能なマーカーに連結されており、前記追跡可能なマーカーは、任意選択で第２のリンカーによって、前記一本鎖抗体ドメインに連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記追跡可能なマーカーが：
ΔＣＤ３４ ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号２５）；又は
NGFR
KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN（配列番号２６）、
からなる群から選択され、
好ましくは、ΔＣＤ３４である、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記ヒンジＣＤ８ストークが、前記追跡可能なマーカーΔＣＤ３４に連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８ＴＭ FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV（配列番号２７）又はＣＤ８ａＴＭ IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号２８）からなる群から選択され、好ましくはＣＤ８ａＴＭである、請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記共刺激性シグナル伝達ドメインが、
ＣＤ２８細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２９）、
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号３０）、
ＯＸ４０配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号３１）、又は
以下を連結して得られる配列：
ＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）とＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）、
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）とＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）、
ＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）とＯＸ４０配列（配列番号３１）、
ＯＸ４０配列（配列番号３１）とＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）、
ＯＸ４０配列（配列番号３１）とＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）、
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）とＯＸ４０配列（配列番号３１）
からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

前記ＣＤ３ゼータ鎖配列が
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号３２）である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

前記膜貫通ドメインと前記共刺激性シグナル伝達ドメインとの間にＣＤ８ｃｙｔ：LYCNHRNRRRVCKCPR（配列番号４０）の細胞質部分をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項13】

前記シグナルペプチドがMEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号４１）を含むか、又はそれからなる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項14】

前記抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体が、以下の配列：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号７２）
又は
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号３３）
を含むか、又はそれらからなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなるヌクレオチド配列。

【請求項16】

抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ配列が、以下のヌクレオチド配列
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA（配列番号５２）
によってコードされ、
抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＨ配列が、以下のヌクレオチド配列
GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（配列番号５３）；
によってコードされ、
抗ＣＤ２０ ＶＬ配列が、以下のヌクレオチド配列
CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG（配列番号５４）
によってコードされ、
抗ＣＤ２０ ＶＨ配列が、以下のヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGC（配列番号５５）；
によってコードされ、
抗ＣＤ２２ ＶＬ配列が、以下のヌクレオチド配列
GACGTGCAGGTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGCCAACAGCTACGGCAACACCTTCCTGAGCTGGTACCTGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCCAGCTGCTGATCTACGGCATCAGCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCACCCACCAGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG（配列番号５６）
によってコードされ、
抗 ＣＤ２２ ＶＨ配列が、以下のヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGGTTCACCAACTACTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCGGCAACAACTACGCCACCTACAGGAGGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCGCCGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGGAGGGCTACGGCAACTACGGCGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC（配列番号５７）
によってコードされる、請求項１５に記載のヌクレオチド配列。

【請求項17】

抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列が：
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA（配列番号５８）
又は
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA（配列番号３４）
である、請求項１５～１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。

【請求項18】

２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列によって前記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列に連結された自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。

【請求項19】

前記自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列が、キメラカスパーゼ－９ポリペプチドであるか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを含む、請求項１８に記載のヌクレオチド配列。

【請求項20】

ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGATGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATGCTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGATGTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCAACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAAAGCGGAGGAGGATCCGGAGTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTTTCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGGCAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAAGACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCTACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACCTCCGCATCTAGGGCCCCGCGGGAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCACCATGGATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA（配列番号１８０）
である、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。

【請求項21】

ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、γ－レトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター、又は非ウイルスベクターである、請求項１５～２０のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。

【請求項22】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の前記キメラ抗原受容体及び／又は請求項２１に記載の前記ベクター若しくは前記プラスミドを含む、アルファ／ベータ及びガンマ／デルタＴ細胞などのＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞などの細胞。

【請求項23】

キメラカスパーゼ－９ポリペプチドなどの自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列をさらに含むか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをさらに含む、請求項２２に記載の細胞。

【請求項24】

前記キメラカスパーゼ－９ポリペプチドが：
短い５’リーダーペプチドMLEMLE（配列番号４３）及び以下の配列
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号４４）のヒトＦＫＢＰ１２（Ｖ３６Ｆ）の変異体を含むか、又はそれらからなるＦＫＢＰ１２結合領域であって、該ＦＫＢＰ１２結合領域は、SGGGSG（配列番号４５）リンカーなどのリンカーによってカスパーゼ－９ポリペプチド
VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号４６）に連結されており、該カスパーゼ－９ポリペプチドは、ASRAPR（配列番号４７）リンカーなどのリンカーによって、
Ｔ２Ａ AEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号４８）、Ｐ２Ａ ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号４９）、Ｅ２Ａ QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５０）、又はＦ２Ａ：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５１）からなる群から選択されるポリヌクレオチド２Ａ自己切断ペプチド、好ましくは、Ｔ２Ａに連結されている、ＦＫＢＰ１２結合領域を含むか、又はそれらからなる、請求項２３に記載の細胞。

【請求項25】

ＩＬ－７及びＩＬ－１５の両方が存在する培養条件、例えば、前記細胞の調製のための過程の活性化ステップ、形質導入ステップ及び／又は拡大ステップの培養条件で得られる、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項26】

請求項１６～２０のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、又は請求項２１に記載のベクター、又は請求項２２～２５のいずれか一項に記載の細胞を、１つ以上の賦形剤及び／又はアジュバントとともに含む、医薬組成物。

【請求項27】

医療用途のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、請求項２１に記載のベクター、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の細胞、請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

ＣＤ１９^＋、ＣＤ２０^＋又はＣＤ２２^＋がん、例えば、Ｂ細胞リンパ腫（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞由来の自己免疫疾患の治療への使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、請求項２１に記載のベクター、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の細胞、請求項２６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、自己抗体を産生するＢ細胞によって引き起こされるＣＤ１９＋、ＣＤ２０＋、若しくはＣＤ２２＋腫瘍又は自己免疫疾患を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞に関する。特に、本発明は、白血病及びリンパ系悪性腫瘍などのＣＤ１９＋、ＣＤ２０＋又はＣＤ２２＋腫瘍を治療するための強力なＣＡＲ Ｔ細胞に関し、これは前記腫瘍の治療における安全性の向上を提供し、ＣＡＲ＋ Ｂ細胞白血病芽球におけるエピトープマスキングを防止し、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９－／ＣＡＲ＋、ＣＤ２０－／ＣＡＲ＋又はＣＤ２２－／ＣＡＲ＋白血病再発の潜在的リスクを減少させることができる。さらに、本発明によるＣＡＲ Ｔ細胞は、自己抗体を産生するＢ細胞によって引き起こされる自己免疫疾患の治療においても、安全性の向上を提供する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された患者由来Ｔ細胞は、再発／難治性のＢ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（Ｂｃｐ－ＡＬＬ）患者にとって、新規で効果的な選択肢となる^１、２。実際、最近の２つの短期のＦＤＡ承認（それぞれレンチウイルス及びレトロウイルスのプラットフォームに基づくノバルティスのＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞製品キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（商標）及びＫｉｔｅの製品イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（商標））は、この分野での急速な進歩を浮き彫りにした。ＣＡＲ Ｔ細胞を投与されたＣＤ１９＋悪性腫瘍患者で報告された刺激的な結果^３，４を考慮すると、この治療を検討する患者の数が継続的に増加し、遺伝子組み換え製品にさらされる患者数も増加すると予想される。遺伝子操作の技術は比較的新しいため、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に関連する遅発性副作用のいくつかはまだ予測不可能であり、医学研究者、医療機関、規制当局は、遺伝子療法が可能な限り安全であることを保証するために取り組んでいる。

【0003】

Ｂ－ＡＬＬの場合、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は迅速かつ持続的な臨床反応を引き起こすが、再発、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及びオンターゲットオフ腫瘍効果などの生命を脅かす反応が普及への障壁となっている。

【0004】

初期の完全寛解率が高いにもかかわらず、再発はＣＡＲ Ｔ細胞抗白血病療法にとって克服するのが困難な段階である。早期再発である、ＣＤ１９陽性（又はＣＤ２０／ＣＤ２２陽性の場合も早期再発が予想される）は、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの短い持続期間、又は微小環境によって誘導される阻害に関連している。時間の経過とともに、再発する患者の最大３０％はＣＤ１９陰性Ｂ－ＡＬＬの進行を特徴とし、選択的エクソンスプライシング又は遺伝子欠失による抗原の喪失が生じる。この変異により、腫瘍細胞は、装甲ＣＡＲ－Ｔ^５に対して再び見えなくなる。

【0005】

ＣＲＳは、多数のＴ細胞の活性化及び炎症性サイトカインの過剰分泌を特徴とする免疫介在性疾患であり、致命的な可能性のある合併症の中でも特に内臓又は血管内皮損傷、心不全、呼吸困難を引き起こす^６。

【0006】

オンターゲットオフ腫瘍は、腫瘍関連抗原を発現する正常組織に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の反応性によるものである。したがって、オフ腫瘍ターゲッティングを減らすために、標的抗原は可能な限り特異的である必要がある。

【0007】

ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞治療の争点では、患者におけるＴ細胞のオフ腫瘍作用は長期的なＢ細胞形成不全と関連している^７。

【0008】

安全性の点として、養子移入されたＴ細胞を選択的に除去するためにＣＡＲコンストラクトを修飾することが、このアプローチの臨床応用を成功させるための重要なステップになりつつある。

【0009】

自殺遺伝子を組み込むことで、重篤な毒性が発生した場合の追加の安全対策が提供される。

【0010】

細胞傷害性プロドラッグ（ＨＳＶ－ＴＫ）を活性化する遺伝子組換え酵素や、遺伝子組換えＴ細胞の抗体依存性枯渇メカニズムを媒介する表面分子（ＣＤ２０、ＥＧＦＲ）の遺伝子組込みに基づいたスイッチがいくつか開発されている^８、９。

【0011】

自殺遺伝子誘導性キャスペース９（ｉＣ９）の臨床使用も、ＧＶＨＤ又はＣＲＳ制御を改善するためにドナーのリンパ球が改変されたハプロ同一造血幹細胞移植を受けた患者において報告されている。ＡＰ１９０３薬剤の注入は、ｉＣ９二量体化の活性化を介して細胞アポトーシスを開始する^{１０，１１}。

【0012】

ＣＡＲ Ｔ細胞の分野では、第２世代ＣＡＲ．ＣＤ１９をコードするレンチウイルスベクターに基づく遺伝子操作によって得られた患者由来の製剤（ＤＰ）に白血病のクロノタイプが存在することが報告された。特に、ＣＤ１９陰性、ＣＡＲ．ＣＤ１９発現Ｂ型白血病を再発した２人のＢｃｐ－ＡＬＬ患者が報告されている。この観察は、ＣＡＲ Ｔ細胞製造中に第２世代のＣＡＲ．ＣＤ１９レンチウイルスで白血病Ｂ細胞を不注意に形質導入したものと解釈できる。この白血病クローンは、異種移植モデルにおいてＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞死滅に対して耐性を示す結果となった^１２。基本的に、標準的なＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞注入を受けた患者の臨床診療において、ＣＡＲ．ＣＤ１９を発現する白血病で再発した、患者の症例が発見された。同じＣＡＲ＋白血病では、Ｂ細胞白血病に対するＣＡＲ自体のマスキング効果により、標的抗原ＣＤ１９はもはや検出できなかった。

【0013】

さらなる１７の輸液製品の次世代免疫グロブリン重鎖配列決定（ＮＧＩＳ）分析により、追加の６つの製品（３５％）の白血病クロノタイプも同定された。

【0014】

インビトロ及びインビボ実験により、これらのＣＡＲ＋白血病細胞クローンはＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞^１２によって殺されないことが証明された。したがって、ＣＡＲ Ｔ細胞へのアプローチにより、ＣＤ１９－／ＣＡＲ＋白血病再発の潜在的なリスクが明らかになった。ＣＡＲ＋白血病細胞クローンが抗ＣＡＲ．ＣＤ１９イディオタイプＣＡＲによって制御できることが、研究により示されている^１３。このアプローチによれば、患者ごとにＣＡＲ－Ｔ細胞と抗ＣＡＲ細胞の両方を生成する必要があり、結果的にコストが増大する。

【0015】

現在の自己免疫疾患の治療法は、主に非ステロイド性抗炎症薬、抗マラリア薬、糖質コルチコイド、及び臓器機能不全を伴う重度の症状に対する免疫抑制の使用に依存している。Ｂ細胞はこれらの疾患の病因において中心的な役割を果たしているため、多くのＢ細胞を対象とした免疫療法が最近、開発されている。しかしながら、これらの治療法では、血清学的に活動性の疾患を有するＳＬＥ患者のサブグループにおいて、わずかな成功しか示されていない。抗ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）剤であるベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）は、ＳＬＥに対する最初の標的生物学的治療法であり、食品医薬品局及び欧州医薬品庁から承認を得ているが、ナイーブＢ細胞を部分的に枯渇させることができるのみである。対照的に、他の２つのＢＡＦＦ遮断薬である、タバルマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）及びブリシビモド（ｂｌｉｓｉｂｉｍｏｄ）は、ＳＬＥ治療に対して臨床試験で陰性の結果を示した。ＣＤ２０に対する抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）は、より効率的にＢ細胞を枯渇させることができるが、ＳＬＥ患者の奏効率は研究間で大きく異なる。リツキシマブによる治療後の病気の再発は依然として問題である。ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ２２などのＢ細胞マーカーの発現は、Ｂ細胞分化の全ての段階を通じて高レベルに維持される。したがって、これらは、これらの患者においてより効率的で長期にわたる治療反応を達成するための良い標的であると考えられている。この理由により、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現する自己Ｔ細胞の移植が、３人のＳＬＥ患者の治療に使用されている（ＤＯＩ： １０．１０５６／ＮＥＪＭｃ２１０７７２５）。

【0016】

ＣＡＲ Ｔ注入の恩恵を受ける患者の数が増加するにつれて、遺伝子治療アプローチの安全性レベルを高めることが必須となっている。

【0017】

したがって、上記を考慮すると、既知のＣＡＲ Ｔ細胞の欠点を克服することができる、さらなるＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２標的ＣＡＲ Ｔ細胞を提供する必要があることは明らかである。

【発明の概要】

【0018】

この議論において、本発明の目的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２標的ＣＡＲ Ｔ細胞遺伝子治療の安全性を高めることである。

【0019】

本目的は、がん治療に関連したもののほかに、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）、皮膚筋炎（ＤＭ）などを含むがそれらに限定されない、自己抗体を産生するＢ細胞に起因する自己免疫疾患患者にＣＡＲ Ｔ細胞を使用する場合にも関連する。

【0020】

本発明によれば、短いリンカーを含むＣＡＲは、不要なＣＡＲ＋腫瘍Ｂ細胞を認識して死滅させることができるため、ＣＡＲの標準コンフォメーションに対して安全性のレベルが向上した分子であることが見出された。

【0021】

本発明によれば、ＣＡＲ Ｔ細胞産生が白血病細胞を豊富に含む患者由来材料（白血病芽球の４５％以上が含まれる末梢血及び骨髄由来細胞）から開始された場合であっても、ＣＡＲ＋白血病Ｂ細胞生成の可能性が低い場合において保護を提供することができる、新しいＣＡＲ ＣＤ１９、ＣＤ２０又はＣＤ２２デザインが提供される。

【0022】

実験結果は、本発明のＣＡＲデザインが、望ましくないＣＡＲ＋白血病細胞の潜在的な生成を認識して死滅させることができるＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞を提供することを示している。

【0023】

特に、インビトロ研究では、長いヒンジ（ＬＨ）を有することに加えて、短いリンカー（ＳＬ）ベクターを特徴とする、本発明のＣＡＲ．ＣＤ１９（ｉＣａｓ９ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ－ＬＨ）で形質導入されたＣＤ１９＋白血病細胞は、標的抗原ＣＤ１９の発現が減少しているがヌルではないことを示しており、インビトロ及びインビボでＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞によって認識されるようになる。

【0024】

実験結果によると、本発明のＣＡＲ．ＣＤ１９は、白血病芽球の重度の混入を特徴とする生物学的材料から産生が開始された場合であっても、インビトロ及びインビボ実験の両方でＣＡＲ＋白血病細胞を制御できることを示している。

【0025】

本発明によれば、患者由来の出発材料（ＳＭ）中における高率の白血病混入が、ＣＡＲ Ｔ細胞製剤（ＤＰ）に及ぼす影響も評価された。その結果、ＳＭ中に多数のＣＤ１９＋細胞が存在しても、ＤＰの形質導入レベルには影響しないこと、並びに、ＳＭに４５％以上のＣＤ１９＋Ｂ白血病細胞が混入していても、最終的な回収率には影響しないことが示された。ＤＰは、細胞蛍光定量アッセイ及び免疫グロブリン（Ｉｇ）再編成に関する分子生物学によって詳細に特徴づけられ、ＤＰ内のＢ細胞混入レベルが、ＳＭ内のＣＤ１９＋細胞の割合と相関しないことが示された。

【0026】

したがって、Ｂ型白血病細胞が高度に濃縮された患者由来の材料の使用が、白血病細胞の顕著な混入を有するＣＡＲ Ｔ細胞産物の生成をもたらしたという証拠が提供される。

【0027】

本発明によれば、循環芽球の割合が高い患者（出発材料中に高レベルのＢ細胞混入の可能性を高めるために診断時又は再発時）から単離された末梢血単核球を、第二世代ＣＡＲ．ＣＤ１９．４１ｂｂ分子を保持したγ－レトロウイルスベクターで遺伝子改変した。Ｉｇ再編成に定量的ＰＣＲを適用することにより（分子ＭＲＤ）、ＤＰ内のＭＲＤと出発材料に存在するＣＤ１９＋白血病細胞の割合との間に統計的相関関係が存在しないにもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞産物の５０％にＢ細胞混入が観察された。分子アッセイの感度を下回るＢ細胞の検出レベルを持つＣＡＲ Ｔ細胞サンプルにおいては、ＥｕｒｏＦｌｏｗフローサイトメトリープラットフォームは確かにかなりの割合の混入Ｂ細胞の存在を検出することができ、これらもＣＡＲ．ＣＤ１９の存在について陽性に染色された。

【0028】

本発明によれば、実施例に示すように、短いリンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９ベクターで遺伝子改変されたＢ型白血病細胞株は、長いリンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９を発現するＢ型白血病細胞株で観察されたものと比較して、ＣＤ１９ ＭＦＩの有意な減少を示し、ＣＤ１９は依然として細胞蛍光定量アッセイで検出可能であり、ＣＤ１９抗体の完全な陰性結合を示している。

【0029】

機能分析により、次の結果が確認された：本発明のＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞は、インビトロ共培養においてＣＡＲ＋白血病細胞株を排除することができた。

【0030】

最終的に、インビボモデルは上記のインビトロデータを裏付ける。

【0031】

本発明によるＣＡＲ．ＣＤ１９は、コンストラクト中に自殺遺伝子誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）も含むことができる。

【0032】

本発明によれば、自殺遺伝子ｉＣ９とインフレームでクローニングされたバイシストロニックベクターである、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９をコードするγ－レトロウイルスベクターが使用された。

【0033】

したがって、ＣＡＲ＋ Ｂ細胞白血病は、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の全身注入によるか、又は自殺遺伝子誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）を活性化するＡＰ１９０３の投与によって、インビボで制御できる可能性がある。

【0034】

事実、ＡＰ１９０３（Ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）は不活性な低分子生体分子であり、コンストラクトのＦＫ結合タンパク質ドメインの二量体化を誘導することにより、ｉＣ９媒介カスパーゼカスケードを活性化することができる^１０。Ｔ細胞を枯渇させた同種移植片を与えられ、その後ｉＣ９で形質導入したドナーＴ細胞を移植後注入された患者を対象に行われた極めて重要な研究では、ＡＰ１９０３の投与が化学的誘導二量体化を引き起こし、末梢血と中枢神経系（ＣＮＳ）の両方から遺伝子改変Ｔ細胞を排除し、ＧＶＨＤ及びＣＲＳの迅速な消失につながることが示された。したがって、ＡＰ１９０３の単回投与によるｉＣ９の活性化は、自殺遺伝子を保持するＴ細胞の迅速で長期的な制御をもたらす^１１。

【0035】

以下の実施例で説明するように、ＣＤ１９^＋腫瘍細胞株は、ＣＡＲ＋白血病クロノタイプを再現するために、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９をコードするバイシストロニックベクターで遺伝子改変された。ＡＰ１９０３への曝露によるｉＣ９の活性化により、ＣＡＲ＋白血病細胞を除去することができることが、インビトロ実験によって示された。特に、ＡＰ１９０３で処理したｉＣ９．ＣＡＲ＋白血病細胞株の細胞蛍光定量分析は、培養液中に生き残っている残りの細胞が、未処理細胞と比較してＣＡＲの発現が強く低下していることを特徴としているが、依然として検出可能なＣＡＲ ＭＦＩ閾値を持っていることを示している。より高感度の分子分析により、ｉＣ９の活性化は、処理後の残存細胞間の導入遺伝子検出の大幅な減少と関連しており、ＡＰ１９０３処理後に生存している白血病Ｂ細胞は残存する低いＶＣＮ閾値を示していることが明らかになった。

【0036】

これらのデータは、ｉＣ９発現レベルが低い細胞を温存しながら、ＡＰ１９０３処理がｉＣ９＋細胞の大部分を除去するのに非常に効率的であることを示す、インビトロ^{１４，１５}及びインビボの証拠^１６の両方を確証するものであった。確かに、遺伝子組み換えＴ細胞の文脈では、ＧＶＨＤ治療のためにＨＳＣＴ後にハプロアイデンティカルｉＣ９－Ｔ細胞注入を受けた患者では、ＡＰ１９０３投与後にｉＣ９－Ｔ細胞が１％残存していた。残存するｉＣ９＋ Ｔ細胞は、おそらく低レベルのＴ細胞活性化に関連した、顕著に鈍い導入遺伝子の発現を特徴としていた。確かに、ｉＣ９＋ Ｔ細胞の除去は、ＡＰ１９０３の反復投与中のＴ細胞活性化によって増強される可能性がある^１６。対照的に、ｉＣ９が腫瘍細胞で発現している場合、ＡＰ１９０３は、大規模かつ迅速なアポトーシスを誘導することができ、インビボでの顕著な腫瘍制御をもたらす^{１４，１５}。

【0037】

本発明の文脈において、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子をコードするレトロウイルスベクターによる白血病細胞の遺伝子改変という起こりそうもない出来事の場合には、ＡＰ１９０３曝露まで生き残った白血病細胞は、その表面で高いＣＡＲ発現を欠いており、その結果、ＷＴ白血病／リンパ腫細胞と同様に、ＣＡＲ．ＣＤ１９同種異系ＮＫ細胞とＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の両方によって、高効率でＣＤ１９抗原を標的化できる可能性が生じる。

【0038】

さらに、本発明の文脈において、ＣＡＲデザインは、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の抗白血病活性を実質的に改変することなく、ＣＡＲ＋白血病細胞を認識して殺すことができるＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の能力を調節する関連因子でもある。確かに、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ又はＳＬ／ＳＨ Ｔ細胞は、インビトロ及びインビボのモデルの両方において、より従来のＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞と同程度の顕著な抗白血病活性を発揮する。それにもかかわらず、ＣＤ１９及びショートリンカーＣＡＲ．ＣＤ１９が白血病Ｂ細胞株の同じ細胞膜上のＣＩＳで発現する場合、ＣＤ１９はフローサイトメトリーによって依然として検出可能であるものの、後者は野生型Ｂ細胞と比較してＣＤ１９ ＭＦＩの大幅な低下を示し、抗原の不完全なＣＩＳマスキングが示唆された。

【0039】

したがって、本発明の特定の目的は、Ｎ末端からＣ末端まで：
ａ）シグナルペプチド、
ｂ）抗ＣＤ１９一本鎖抗体ドメイン、抗ＣＤ２０一本鎖抗体ドメイン、又は抗ＣＤ２２一本鎖抗体ドメインからなる群から選択される一本鎖抗体ドメインであって、互いにリンカーによって連結されたＶＬ配列及びＶＨ配列を含むか、又はそれらからなる、一本鎖抗体ドメイン、
ｃ）ヒンジ、
ｄ）膜貫通ドメイン、
ｅ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、及び
ｆ）ＣＤ３ゼータ鎖配列
を含むか、又はそれらからなるキメラ抗原受容体であって、
前記リンカーは、例えば７個～１２個又は７個～１０個又は８個などの７個～１４個の長さ（すなわち、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個又は１４個のアミノ酸の長さ）のアミノ酸の短いフレキシブルなリンカーである。

【0040】

特定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ可変領域及びＶＨ可変領域をいずれの順序で有してもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。

【0041】

本発明によれば、抗ＣＤ１９一本鎖抗体ドメインは、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ配列及びＶＨ配列をいずれかの順序で含んでもよく、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ配列は、ＣＤＲ１配列QDISKY（配列番号１）、ＣＤＲ２配列HTS及びＣＤＲ３配列GNTLP（配列番号２）を含む一方で、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＨ配列は、ＣＤＲ１配列GVSLPDYG（配列番号３）、ＣＤＲ２配列IWGSETT（配列番号４）及びＣＤＲ３配列AKHYYYGGSYAMDY（配列番号５）を含み；抗ＣＤ２０一本鎖抗体ドメインは、抗ＣＤ２０ ＶＬ配列及びＶＨ配列を含むことができ、抗ＣＤ２０ ＶＬ配列^２２は、ＣＤＲ１配列SSVSY（配列番号６）、ＣＤＲ２配列ATS及びＣＤＲ３配列QQWTSNPPT（配列番号７）を含む一方で、抗ＣＤ２０ ＶＨ配列は、ＣＤＲ１配列GYTFTSYN（配列番号８）、ＣＤＲ２配列IYPGNGDT（配列番号９）及びＣＤＲ３配列ARSTYYGGDWYFNV（配列番号１０）を含み；抗ＣＤ２２一本鎖抗体ドメインは、抗ＣＤ２２ ＶＬ及びＶＨ配列を含むことができ、抗ＣＤ２２ ＶＬ配列は、ＣＤＲ１配列QSLANSYGNTF（配列番号１１）、ＣＤＲ２配列GIS及びＣＤＲ３配列LQGTHQP（配列番号１２）を含む一方で、抗ＣＤ ２２ ＶＨ配列は、ＣＤＲ１配列GYRFTNYWIH（配列番号１３）、ＣＤＲ２配列INPGNNYA（配列番号１４）及びＣＤＲ３配列TRを含む。

【0042】

本発明によれば、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ配列は、配列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT（配列番号１５）
を含むか、又はそれからなることができ、
抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＨ配列は、配列
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS（配列番号１６）；
を含むか、又はそれからなることができ、
抗ＣＤ２０ ＶＬ配列は、配列
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号１７）
を含むか、又はそれからなることができ、
抗ＣＤ２０ ＶＨ配列は、配列
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA（配列番号１８）；
を含むか、又はそれからなることができ、
抗ＣＤ２２ ＶＬ配列は、配列
DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK（配列番号１９）
を含むか、又はそれからなることができ、
抗ＣＤ２２ ＶＨ配列は、配列
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号２０）
を含むか、又はそれからなることができる。

【0043】

ＶＬ配列とＶＨ配列を連結するリンカーは、短くフレキシブルなアミノ酸グリシンリッチな配列、例えば、（Ｇ４Ｓ）２リンカーGGGGSGGGG（配列番号３５）、Ｇ４ＳＧ２リンカーGGGGSGG（配列番号３７）又はＧ３ＳＧ４リンカーGGGSGGGG（配列番号３８）、ＳＧ４ＳＧ３リンカーSGGGGSGGG（配列番号１８６）、（ＳＧ４）２ ＳリンカーSGGGGSGGGGS（配列番号１８７）、（ＳＧ４）２ＳＧリンカーSGGGGSGGGGSG（配列番号１８８）、（ＳＧ４）２ＳＧ３リンカーSGGGGSGGGGSGGGリンカー（配列番号１８９）、（ＳＧ４）２ SGGGGSGGGG（配列番号１９０）、（ＳＧ４）２ ＳＧ２ SGGGGSGGGGSGG（配列番号１９１）からなるグループから選択することができ、好ましくはＧ３ＳＧ４リンカーである。

【0044】

特定の実施形態によれば、前記ヒンジは、以下のヒンジ：
ＣＤ８ストーク
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号２１）（ヌクレオチド番号Ｍ１２８２８．１及びタンパク質番号ＡＡＢ０４６３７．１）；
ヒンジＣＤ２８ EVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP（配列番号２２）（ヌクレオチド番号ＡＪ５１７５０４．１及びタンパク質番号ＣＡＤ５７００３．１）；
ヒンジＣＨ２－ＣＨ３（ＵＮＩＰＲＯＴＫＢ：Ｐ０１８６１）
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号２３）；
又は
ヒンジＣＨ３（ＵＮＩＰＲＯＴＫＢ：Ｐ０１８６１）：
ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号２４）
のうちの１つ又は複数を含むか、又はそれらからなることができ、好ましくはＣＤ８ストークを含むか、又はそれらからなることができる。

【0045】

本発明によれば、ヒンジは、第２のリンカー（又はアダプター）によって一本鎖抗体ドメインに連結することができる。

【0046】

本発明によれば、前記ヒンジは、Ｎ末端で追跡可能なマーカーと連結させることができ、前記追跡可能なマーカーは、任意選択で第２のリンカー（又はアダプター）によって、一本鎖抗体ドメインに連結され、すなわち、第２のリンカーは一本鎖抗体ドメイン及び追跡可能なマーカーを連結する。例えば、第２のリンカー（又はアダプター）は、例えばＧＳなどのジペプチドであり得る。

【0047】

本発明によれば、追跡可能なマーカーは、以下の群から選択できる：
ΔＣＤ３４ ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号２５）（ヌクレオチド番号ＡＢ２３８２３１．１及びタンパク質番号ＢＡＥ４６７４８．１）；又は
NGFR
KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN（配列番号２６）（ヌクレオチド番号ＡＫ３１３６５４．１及びタンパク質番号ＢＡＧ３６４０８．１）、好ましくはΔＣＤ３４。

【0048】

本発明によれば、ヒンジＣＤ８ストークを追跡可能なマーカーΔＣＤ３４に連結することができる。

【0049】

膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ＴＭ ＦＷＶLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV（配列番号２７）（ヌクレオチド番号ＢＣ１１２０８５．１及びタンパク質番号ＡＡＩ１２０８６．１）、又はＣＤ８ａＴＭ IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号２８）（ヌクレオチド番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質番号ＮＰ＿００１７５９．３）、好ましくはＣＤ８ａＴＭからなる群から選ぶことができる。

【0050】

本発明によれば、共刺激性シグナル伝達ドメインは、以下からなる群から選ぶことができる：
ＣＤ２８細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２９）（ヌクレオチドＩＤ番号：ＡＦ２２２３４１．１及びタンパク質番号：ＡＡＦ３３７９２．１）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号３０）（ヌクレオチド番号：Ｕ０３３９７．１及びタンパク質番号：ＡＡＡ５３１３３．１）、ＯＸ４０配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号３１）（ヌクレオチド番号：ＮＭ＿００３３２７．３及びタンパク質番号：ＮＰ＿００３３１８．１）、又は
以下を連結することによって得られる配列：
ＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）とＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）、
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）とＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）、
ＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）とＯＸ４０配列（配列番号３１）、
ＯＸ４０配列（配列番号３１）とＣＤ２８細胞質配列（配列番号２９）、
ＯＸ４０配列（配列番号３１）とＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）、
ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列（配列番号３０）とＯＸ４０配列（配列番号３１）。
本発明によれば、ＣＤ３ゼータ鎖配列は、
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号３２）（ヌクレオチド番号：Ｊ０４１３２．１及びタンパク質番号：ＡＡＡ６０３９４．１）である。

【0051】

本発明によれば、キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインと共刺激性シグナル伝達ドメインの間のＣＤ８ｃｙｔ：LYCNHRNRRRVCKCPR（配列番号４０）（ヌクレオチド番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質番号：ＮＰ＿００１７５９．３）の細胞質部分をさらに含むことができる。

【0052】

ＣＤ８ｃｙｔの細胞質部分は、ジペプチド、例えばＶＤなどのリンカーによって、共刺激性シグナル伝達ドメインに連結していてもよい。

【0053】

本発明によれば、シグナルペプチドは、MEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号４１）（ヌクレオチド番号：ＡＢ７７６８３８．１及びタンパク質番号：ＢＡＮ６３１３１．１）を含むか、又はそれからなることができる。
本発明によれば、キメラ抗原受容体は、
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号７２）
又は
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号３３）を含むか、又はそれらからなる。

【0054】

すなわち、本発明による抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体は、以下からなることができる：
シグナルペプチドMEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号：４１）、これはＳＲリンカーによって、以下と連結されている：
ＦＭＣ６３ハイブリドーマ由来の抗ＣＤ１９一本鎖抗体ドメイン、これは、ＦＭＣ６３ ＶＬ配列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT（配列番号１５）からなり、フレックスリンカー（短いリンカー－ＳＬ）、好ましくはＧ３ＳＧ４リンカーGGGSGGGG（配列番号３８）によってＦＭＣ６３ ＶＨ配列
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS（配列番号１６）、に連結されており、ＦＭＣ６３ ＶＨ配列は、ＧＳリンカー（すなわち、第２のリンカー又はアダプター）によって以下に連結されている：
追跡可能なマーカーΔＣＤ３４ ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号２５）及びＣＤ８ストーク PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号２１）（長いヒンジ－ＬＨ：ΔＣＤ３４＋ＣＤ８ストーク）又はＣＤ８ストーク PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号２１）（短いヒンジ－ＳＨ：ＣＤ８ストーク）、これは以下と連結されている：
ＣＤ８ａＴＭ IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号２８）、これは以下と連結される：
ＣＤ８ｃｙｔの細胞質部分 LYCNHRNRRRVCKCPR（配列番号４０）、これはリンカーＶＤによって以下と連結されている：
共刺激性シグナル伝達ドメインＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号３０）、これはＣＤ３ゼータ鎖RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号３２）に結合されている。

【0055】

本発明は、上で定義したキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなるヌクレオチド配列にも関する。
特に、抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＬ配列は、以下のヌクレオチド配列
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA（配列番号５２）
によってコードされ得、
抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ハイブリドーマＶＨ配列は、以下のヌクレオチド配列
GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（配列番号５３）；
によってコードされ得、
抗ＣＤ２０ ＶＬ配列は、以下のヌクレオチド配列
CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG（配列番号５４）
によってコードされ得、
抗ＣＤ２０ ＶＨ配列は、以下のヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGC（配列番号５５）；
によってコードされ得、
抗ＣＤ２２ ＶＬ配列は、以下のヌクレオチド配列
GACGTGCAGGTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGCCAACAGCTACGGCAACACCTTCCTGAGCTGGTACCTGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCCAGCTGCTGATCTACGGCATCAGCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCACCCACCAGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG（配列番号５６）
によってコードされ得、
抗 ＣＤ２２ ＶＨ 配列は、以下のヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGGTTCACCAACTACTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCGGCAACAACTACGCCACCTACAGGAGGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCGCCGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGGAGGGCTACGGCAACTACGGCGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC（配列番号５７）
によってコードされ得る。
本発明によれば、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列は、
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA（配列番号５８）
又は
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA（配列番号３４）
である。

【0056】

本発明によれば、ヌクレオチド配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列によって、前記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列に連結された自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列は、キメラカスパーゼ－９ポリペプチドであってもよく、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを含む。

【0057】

したがって、細胞において、ポリヌクレオチド２Ａ自己切断ペプチドは、自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列及びキメラ抗原受容体を含むペプチドを、２つの別個のペプチド、すなわち自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列及びキメラ抗原受容体アミノ酸配列に切断する。
一実施形態によれば、ヌクレオチド配列は以下のものであり得る：
ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGATGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATGCTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGATGTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCAACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAAAGCGGAGGAGGATCCGGAGTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTTTCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGGCAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAAGACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCTACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACCTCCGCATCTAGGGCCCCGCGGGAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCACCATGGATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA（配列番号１８０）

【0058】

すなわち、この塩基配列は、ｉＣａｓ９ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ－ＬＨとも名付けられる配列をコードしており、以下の配列を含む：
ｉＣａｓ９キメラタンパク質（ＦＫＢＰ１２ｗｔ結合領域－リンカー－カスパーゼ９ポリペプチド）：
ＦＫＢＰ１２ｗｔ結合領域：
ATGCTCGAGATGCTGGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATTAGCCCCGGAGATGGCAGAACATTCCCCAAAAGAGGACAGACTTGCGTCGTGCATTATACTGGAATGCTGGAAGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCCGGGACCGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAGGAAGGAGTCGCACAGATGTCAGTGGGACAGAGGGCCAAACTGACTATTAGCCCAGACTACGCTTATGGAGCAACCGGCCACCCCGGGATCATTCCCCCTCATGCTACACTGGTCTTCGATGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAA（配列番号５９）（ヌクレオチド番号：ＢＴ００７０６６．１）
接続の連結
AGCGGAGGAGGATCCGGA（配列番号６０）
カスパーゼ－９ポリペプチド
GTGGACGGGTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAATCCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGTCTATGGAGCCTTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGGCTGCGGACCAGAACAGGATCCAATATTGACTGTGAAAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAGGTGAAAGGCGATCTGACCGCTAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAACTGGCTCGGCAGGACCATGGGGCACTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGAGTCACGGCTGCCAGGCTTCACATCTGCAGTTCCCTGGGGCAGTCTATGGAACTGACGGCTGTCCAGTCAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCTCTTGCCCAAGTCTGGGCGGGAAGCCCAAACTGTTCTTTATTCAGGCCTGTGGAGGCGAGCAGAAAGATCACGGCTTCGAAGTGGCTAGCACCTCCCCCGAGGACGAATCACCTGGAAGCAACCCTGAGCCAGATGCAACCCCCTTCCAGGAAGGCCTGAGGACATTTGACCAGCTGGATGCCATCTCAAGCCTGCCCACACCTTCTGACATTTTCGTCTCTTACAGTACTTTCCCTGGATTTGTGAGCTGGCGCGATCCAAAGTCAGGCAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGATATCTTTGAGCAGTGGGCCCATTCTGAAGACCTGCAGAGTCTGCTGCTGCGAGTGGCCAATGCTGTCTCTGTGAAGGGGATCTACAAACAGATGCCAGGATGCTTCAACTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACCTCC（配列番号６１）（ヌクレオチド番号：ＡＫ２９２１１１．１）
接続の連結
GCATCTAGGGCCCCGCGG（配列番号６２）
Ｔ２Ａ自己切断ペプチド
GAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCA（配列番号６３）（ヌクレオチド番号：ＡＦ０６２０３７．１）
接続の短いリンカー
CCATGG
シグナルペプチド
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGG（配列番号６４）（ヌクレオチド番号：ＡＢ７７６８３８．１）
ＶＬ配列（ＦＭＣ６３）
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA（配列番号５２）
フレックスショートリンカー
GGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGC（配列番号６５）
ＶＨ配列（ＦＭＣ６３）
GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（配列番号５３）
ＬＨ（長いヒンジ）：（短いリンカー、すなわち、第２のリンカー又はアダプター）＋（追跡可能なマーカー：ΔＣＤ３４細胞外＋ヒンジ：ＣＤ８ストーク細胞外）：
短いアダプター
GGATCC
ΔＣＤ３４細胞外
GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT（配列番号６６）（ヌクレオチド番号ＡＢ２３８２３１．１）
ＣＤ８ストーク細胞外
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGAC（配列番号６７）（ヌクレオチド番号：Ｍ１２８２８．１）；
ＣＤ８ａＴＭ（膜貫通型）
ATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACT（配列番号６８）（ヌクレオチド番号ＮＭ＿００１７６８．６）
ＣＤ８ｃｙｔ（細胞質）
CTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGG（配列番号６９）（ヌクレオチド番号ＮＭ＿００１７６８）
短いリンカー（Ｓａｌ Ｉ部位を含む）
GTCGAC
４－１ＢＢ
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG（配列番号７０）（ヌクレオチド番号：Ｕ０３３９７．１）
ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３Ｚｅｔａ）鎖
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA（配列番号７１）（ヌクレオチド番号：Ｊ０４１３２．１）。

【0059】

本発明によれば、ｉＣａｓ９ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ－ＳＨは、短いヒンジ（ＳＨ）：（短いアダプター）＋（ヒンジ：ＣＤ８ストーク細胞外）を含むという事実を除いて、ｉＣａｓ９ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ－ＬＨの配列からなる。

【0060】

本発明は、上で定義したヌクレオチド配列を含むベクターであって、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、γ－レトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター、又は非ウイルスベクターである、ベクターにも関する。

【0061】

さらに、本発明は、上で定義したキメラ抗原受容体及び／又は上で定義したベクター若しくはプラスミドを含む、アルファ／ベータ及びガンマ／デルタＴ細胞などのＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞などの細胞に関する。

【0062】

本発明による細胞は、キメラカスパーゼ－９ポリペプチドなどの自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列をさらに含むことができるか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK配列番号４２）を含む。

【0063】

自殺遺伝子誘導性アミノ酸配列はキメラカスパーゼ－９ポリペプチドであるか、又は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK配列番号４２）を含むことができる。
キメラカスパーゼ－９ポリペプチドは、以下を含むか、又はそれらからなることができる：
短い５’リーダーペプチドMLEMLE（配列番号４３）及び以下の配列のヒトＦＫＢＰ１２（Ｖ３６Ｆ）の変異体を含むか、又はそれらからなるＦＫＢＰ１２結合領域
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号４４）（ヌクレオチド番号：ＢＴ００７０６６．１及びタンパク質番号：ＡＡＰ３５７２９．１）、これはSGGGSG（配列番号４５）などのリンカーによってカスパーゼ－９ポリペプチドへ連結されている
VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号４６）（ヌクレオチド番号：ＡＫ２９２１１１．１及びタンパク質番号：ＢＡＦ８４８００．１）、これはASRAPR（配列番号４７）リンカー（ＳａｃＩＩ酵素部位を含む）などのリンカーによって、Ｔ２Ａ（トセアアシグナウイルス２（ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ ｖｉｒｕｓ ２）から由来）AEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号４８）（ヌクレオチド番号： ＡＦ０６２０３７．１及びタンパク質番号：ＹＰ＿００９６６５２０６．１）、Ｐ２Ａ（ブタテスコウイルス－１ ２Ａ（ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１ ２Ａ）由来）ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号４９）（ヌクレオチド番号：ＡＢ０３８５２８．１及びタンパク質番号：ＢＡＢ３２８２８．１）、Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス由来）QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５０）（ヌクレオチド番号ＮＣ＿０３９２０９．１及びタンパク質番号：「ＹＰ＿００９５１３０２７．１」）
又はＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス由来：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５１）（ヌクレオチド番号：ＡＹ５９３８２５．１及びタンパク質番号：ＡＡＴ０１７６８．１）、好ましくはＴ２Ａからなる群から選ばれるポリヌクレオチド２Ａ自己切断ペプチドに連結されている。

【0064】

本発明の特定の実施形態によれば、キメラカスパーゼ－９ポリペプチドは以下からなる：
－リーダーペプチドMLEMLE（配列番号４３）、
－ ＦＫＢＰ１２結合領域
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号４４）、これは（配列番号４５）によって以下のものに連結されている
－ カスパーゼ－９ポリペプチド
VDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号４６）、これはリンカーASRAPR（配列番号４７）によって以下のものに連結されている
－AEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号４８）をコードするＴ２Ａ自己切断ペプチド。

【0065】

本発明によれば、細胞は、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の両方が存在する培養条件で得ることができ、例えば、前記細胞の調製のための過程の活性化ステップ、形質導入ステップ及び／又は拡大ステップの培養条件で得ることができる。

【0066】

本発明はまた、上記で定義したヌクレオチド配列、又は上記で定義したベクター、又は上記で定義した細胞を、１つ又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントとともに含む医薬組成物にも関する。

【0067】

さらに、本発明は、医療用途のための、上に定義したキメラ抗原受容体、上に定義したヌクレオチド配列、上に定義したベクター、上に定義した細胞、上に定義した医薬組成物に関する。

【0068】

ＣＤ１９＋、ＣＤ２０＋、又はＣＤ２２＋がん、例えばＢ細胞リンパ腫（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療に使用するための、上記で定義したキメラ抗原受容体、上記で定義したヌクレオチド配列、上記で定義したベクター、上記で定義した細胞、上記で定義した医薬組成物も、本発明の目的である。

【0069】

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）、皮膚筋炎（ＤＭ）を含むがこれらに限定されない、自己抗体を生成するＢ細胞によって引き起こされる自己免疫疾患の治療に使用するための、上記で定義したキメラ抗原受容体、上記で定義したヌクレオチド配列、上記で定義したベクター、上記で定義した細胞、上記で定義した医薬組成物も、本発明の目的である。
次に、本発明を、特に実施例及び添付の図面を参照しながら、その好ましい実施形態に従って、例示的にではあるが、限定的にではなく説明する：

【図面の簡単な説明】

【0070】

【図1A】診断時にＢｃｐ－ＡＬＬ患者由来のＰＢＭＣから生成されたＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞を示す図である。（Ａ）α－ＣＤ１９のｓｃＦｖは、ｉＣ９自殺遺伝子、ΔＣＤ３４追跡可能なマーカー、及び４．１ＢＢ及びＣＤ３σシグナル伝達エンドドメインの両方とインフレームでクローン化される。診断時のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢＭＣは、可溶性α－ｈＣＤ３／α－ｈＣＤ２８ ｍＡｂ及びｒｈ－ＩＬ７／ｒｈ－ＩＬ１５で活性化され、ＣＡＲ．ＣＤ１９γ－レトロウイルス上清で形質導入される。（Ｂ）非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（陰性対照；左パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞（右パネル）におけるΔＣＤ３４検出によるＣＡＲ発現を示す代表的なドナーのフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の製造に使用される出発原料中の、ＣＤ１９＋白血病／リンパ腫細胞が４５％超（ｎ＝８）又は４５％と等しいか未満（ｎ＝７）であるＤＰにおける、生産終了時（１４日目）のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合を示す図である。中央値の４５％をカットオフとして使用した。（Ｄ）生産終了時のＤＰ中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合と、患者からの出発原料中のＣＤ１９＋白血病細胞の割合との間の相関マトリックスを示す図である。（Ｅ）ＳＭ中のＣＤ１９＋ Ｂ細胞が４５％未満又は４５％を超える患者の２つのサブグループにおける、３日目からＣＡＲ Ｔ細胞の生産終了時までの総拡大倍率を表すヒストグラムを示す図である。

【図1B】診断時にＢｃｐ－ＡＬＬ患者由来のＰＢＭＣから生成されたＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞を示す図である。（Ａ）α－ＣＤ１９のｓｃＦｖは、ｉＣ９自殺遺伝子、ΔＣＤ３４追跡可能なマーカー、及び４．１ＢＢ及びＣＤ３σシグナル伝達エンドドメインの両方とインフレームでクローン化される。診断時のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢＭＣは、可溶性α－ｈＣＤ３／α－ｈＣＤ２８ ｍＡｂ及びｒｈ－ＩＬ７／ｒｈ－ＩＬ１５で活性化され、ＣＡＲ．ＣＤ１９γ－レトロウイルス上清で形質導入される。（Ｂ）非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（陰性対照；左パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞（右パネル）におけるΔＣＤ３４検出によるＣＡＲ発現を示す代表的なドナーのフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の製造に使用される出発原料中の、ＣＤ１９＋白血病／リンパ腫細胞が４５％超（ｎ＝８）又は４５％と等しいか未満（ｎ＝７）であるＤＰにおける、生産終了時（１４日目）のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合を示す図である。中央値の４５％をカットオフとして使用した。（Ｄ）生産終了時のＤＰ中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合と、患者からの出発原料中のＣＤ１９＋白血病細胞の割合との間の相関マトリックスを示す図である。（Ｅ）ＳＭ中のＣＤ１９＋ Ｂ細胞が４５％未満又は４５％を超える患者の２つのサブグループにおける、３日目からＣＡＲ Ｔ細胞の生産終了時までの総拡大倍率を表すヒストグラムを示す図である。

【図1C】診断時にＢｃｐ－ＡＬＬ患者由来のＰＢＭＣから生成されたＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞を示す図である。（Ａ）α－ＣＤ１９のｓｃＦｖは、ｉＣ９自殺遺伝子、ΔＣＤ３４追跡可能なマーカー、及び４．１ＢＢ及びＣＤ３σシグナル伝達エンドドメインの両方とインフレームでクローン化される。診断時のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢＭＣは、可溶性α－ｈＣＤ３／α－ｈＣＤ２８ ｍＡｂ及びｒｈ－ＩＬ７／ｒｈ－ＩＬ１５で活性化され、ＣＡＲ．ＣＤ１９γ－レトロウイルス上清で形質導入される。（Ｂ）非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（陰性対照；左パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞（右パネル）におけるΔＣＤ３４検出によるＣＡＲ発現を示す代表的なドナーのフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の製造に使用される出発原料中の、ＣＤ１９＋白血病／リンパ腫細胞が４５％超（ｎ＝８）又は４５％と等しいか未満（ｎ＝７）であるＤＰにおける、生産終了時（１４日目）のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合を示す図である。中央値の４５％をカットオフとして使用した。（Ｄ）生産終了時のＤＰ中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合と、患者からの出発原料中のＣＤ１９＋白血病細胞の割合との間の相関マトリックスを示す図である。（Ｅ）ＳＭ中のＣＤ１９＋ Ｂ細胞が４５％未満又は４５％を超える患者の２つのサブグループにおける、３日目からＣＡＲ Ｔ細胞の生産終了時までの総拡大倍率を表すヒストグラムを示す図である。

【図1D】診断時にＢｃｐ－ＡＬＬ患者由来のＰＢＭＣから生成されたＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞を示す図である。（Ａ）α－ＣＤ１９のｓｃＦｖは、ｉＣ９自殺遺伝子、ΔＣＤ３４追跡可能なマーカー、及び４．１ＢＢ及びＣＤ３σシグナル伝達エンドドメインの両方とインフレームでクローン化される。診断時のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢＭＣは、可溶性α－ｈＣＤ３／α－ｈＣＤ２８ ｍＡｂ及びｒｈ－ＩＬ７／ｒｈ－ＩＬ１５で活性化され、ＣＡＲ．ＣＤ１９γ－レトロウイルス上清で形質導入される。（Ｂ）非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（陰性対照；左パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞（右パネル）におけるΔＣＤ３４検出によるＣＡＲ発現を示す代表的なドナーのフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の製造に使用される出発原料中の、ＣＤ１９＋白血病／リンパ腫細胞が４５％超（ｎ＝８）又は４５％と等しいか未満（ｎ＝７）であるＤＰにおける、生産終了時（１４日目）のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合を示す図である。中央値の４５％をカットオフとして使用した。（Ｄ）生産終了時のＤＰ中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合と、患者からの出発原料中のＣＤ１９＋白血病細胞の割合との間の相関マトリックスを示す図である。（Ｅ）ＳＭ中のＣＤ１９＋ Ｂ細胞が４５％未満又は４５％を超える患者の２つのサブグループにおける、３日目からＣＡＲ Ｔ細胞の生産終了時までの総拡大倍率を表すヒストグラムを示す図である。

【図1E】診断時にＢｃｐ－ＡＬＬ患者由来のＰＢＭＣから生成されたＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞を示す図である。（Ａ）α－ＣＤ１９のｓｃＦｖは、ｉＣ９自殺遺伝子、ΔＣＤ３４追跡可能なマーカー、及び４．１ＢＢ及びＣＤ３σシグナル伝達エンドドメインの両方とインフレームでクローン化される。診断時のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢＭＣは、可溶性α－ｈＣＤ３／α－ｈＣＤ２８ ｍＡｂ及びｒｈ－ＩＬ７／ｒｈ－ＩＬ１５で活性化され、ＣＡＲ．ＣＤ１９γ－レトロウイルス上清で形質導入される。（Ｂ）非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（陰性対照；左パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞（右パネル）におけるΔＣＤ３４検出によるＣＡＲ発現を示す代表的なドナーのフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞の製造に使用される出発原料中の、ＣＤ１９＋白血病／リンパ腫細胞が４５％超（ｎ＝８）又は４５％と等しいか未満（ｎ＝７）であるＤＰにおける、生産終了時（１４日目）のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合を示す図である。中央値の４５％をカットオフとして使用した。（Ｄ）生産終了時のＤＰ中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合と、患者からの出発原料中のＣＤ１９＋白血病細胞の割合との間の相関マトリックスを示す図である。（Ｅ）ＳＭ中のＣＤ１９＋ Ｂ細胞が４５％未満又は４５％を超える患者の２つのサブグループにおける、３日目からＣＡＲ Ｔ細胞の生産終了時までの総拡大倍率を表すヒストグラムを示す図である。

【図2A】ＢＭ患者由来のＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及び形質導入を示す図である。（Ａ）診断時に患者のＢＭ単核細胞から生成された代表的なＤＰにおけるフローサイトメトリー分析を示す図である。上のパネルＡは、ＮＴ Ｔ細胞の陰性対照サンプルにおけるＣＡＲ＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示し、一方、下のパネルは、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞における分析を示している。（Ｂ）ＢＭ Ｂｃｐ－ＡＬＬ患者から生成されたＤＰにおけるＣＤ１９＋白血病芽球及びＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合（ｎ＝１０）を示す図である。（Ｃ）生産終了時における１０人のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢ由来Ｔ細胞（白色のバー）と比較した、ＮＴ及びｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＢＭ由来Ｔ細胞（黒色のバー）の拡大倍率を示す図である。データは平均値±ＳＤとして表される。

【図2B】ＢＭ患者由来のＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及び形質導入を示す図である。（Ａ）診断時に患者のＢＭ単核細胞から生成された代表的なＤＰにおけるフローサイトメトリー分析を示す図である。上のパネルＡは、ＮＴ Ｔ細胞の陰性対照サンプルにおけるＣＡＲ＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示し、一方、下のパネルは、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞における分析を示している。（Ｂ）ＢＭ Ｂｃｐ－ＡＬＬ患者から生成されたＤＰにおけるＣＤ１９＋白血病芽球及びＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合（ｎ＝１０）を示す図である。（Ｃ）生産終了時における１０人のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢ由来Ｔ細胞（白色のバー）と比較した、ＮＴ及びｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＢＭ由来Ｔ細胞（黒色のバー）の拡大倍率を示す図である。データは平均値±ＳＤとして表される。

【図2C】ＢＭ患者由来のＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及び形質導入を示す図である。（Ａ）診断時に患者のＢＭ単核細胞から生成された代表的なＤＰにおけるフローサイトメトリー分析を示す図である。上のパネルＡは、ＮＴ Ｔ細胞の陰性対照サンプルにおけるＣＡＲ＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示し、一方、下のパネルは、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変Ｔ細胞における分析を示している。（Ｂ）ＢＭ Ｂｃｐ－ＡＬＬ患者から生成されたＤＰにおけるＣＤ１９＋白血病芽球及びＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合（ｎ＝１０）を示す図である。（Ｃ）生産終了時における１０人のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＰＢ由来Ｔ細胞（白色のバー）と比較した、ＮＴ及びｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＢＭ由来Ｔ細胞（黒色のバー）の拡大倍率を示す図である。データは平均値±ＳＤとして表される。

【図3A】白血病細胞が高度に混入した診断時の患者の原料から生成されたＤＰにおけるＭＲＤ分析を示す図である。（Ａ）時間経過実験は、ＤＰのＭＲＤ値に対する製造時間の影響を評価するようにデザインされている。Ｔ細胞は５人の異なる患者（ｎ＝５）から生成され、８、１４、又は３０日間培養した後に、ＭＲＤ分析のために細胞を収集し、ＭＲＤ分析は、表１に指定された検出限界でＩｇ再編成に対するｑＰＣＲ分析によって実行され、図中に１０～４と１０～５の間の負の範囲（点線の領域）として表される。（Ｂ）２つのＤＰのフローサイトメトリー分析：高いＭＲＤ値を持つＡＬＬ＃１２及びＭＲＤの検出がＰＣＲ感度を下回ったＡＬＬ＃１４。パネルは、ＣＡＲコンストラクト内のＣＤ３４エピトープを標的とする、抗ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＦＩＴＣ抗体（抗ＣＡＲＴＣＤ１９、Ｃｙｔｏｇｎｏｓ ＳＬ、Ｓａｌａｍａｎｃａ， Ｓｐａｉｎ）及び抗ＣＤ３４ ＡＰＣ（ＣＤ３４ＱＢＥＮＤ１０）の両方で検出された、ＣＡＲ発現陽性の白血病細胞（黒い点）の存在を示す。Ｂ細胞前駆体は、フローサイトメトリーによるＢｃｐ－ＡＬＬの高感度ＭＲＤ測定について以前に説明された（２７～２９）、ＥｕｒｏＦｌｏｗ Ｂｃｐ－ＡＬＬ ＭＲＤチューブによる表面マーカーの染色のためのＥｕｒｏＦｌｏｗ標準操作手順（ＳＯＰ）（ｗｗｗ．ＥｕｒｏＦｌｏｗ．ｏｒｇ）（２６）の使用によって同定された。

【図3B】白血病細胞が高度に混入した診断時の患者の原料から生成されたＤＰにおけるＭＲＤ分析を示す図である。（Ａ）時間経過実験は、ＤＰのＭＲＤ値に対する製造時間の影響を評価するようにデザインされている。Ｔ細胞は５人の異なる患者（ｎ＝５）から生成され、８、１４、又は３０日間培養した後に、ＭＲＤ分析のために細胞を収集し、ＭＲＤ分析は、表１に指定された検出限界でＩｇ再編成に対するｑＰＣＲ分析によって実行され、図中に１０～４と１０～５の間の負の範囲（点線の領域）として表される。（Ｂ）２つのＤＰのフローサイトメトリー分析：高いＭＲＤ値を持つＡＬＬ＃１２及びＭＲＤの検出がＰＣＲ感度を下回ったＡＬＬ＃１４。パネルは、ＣＡＲコンストラクト内のＣＤ３４エピトープを標的とする、抗ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＦＩＴＣ抗体（抗ＣＡＲＴＣＤ１９、Ｃｙｔｏｇｎｏｓ ＳＬ、Ｓａｌａｍａｎｃａ， Ｓｐａｉｎ）及び抗ＣＤ３４ ＡＰＣ（ＣＤ３４ＱＢＥＮＤ１０）の両方で検出された、ＣＡＲ発現陽性の白血病細胞（黒い点）の存在を示す。Ｂ細胞前駆体は、フローサイトメトリーによるＢｃｐ－ＡＬＬの高感度ＭＲＤ測定について以前に説明された（２７～２９）、ＥｕｒｏＦｌｏｗ Ｂｃｐ－ＡＬＬ ＭＲＤチューブによる表面マーカーの染色のためのＥｕｒｏＦｌｏｗ標準操作手順（ＳＯＰ）（ｗｗｗ．ＥｕｒｏＦｌｏｗ．ｏｒｇ）（２６）の使用によって同定された。

【図4】１人の代表的なＢｃｐ－ＡＬＬ患者からの対照の非形質導入Ｔ細胞及びｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。上のパネルは、ＡＬＬ＃１４患者の対照の非形質導入Ｔ細胞におけるＣＤ１９及びＣＤ１０ Ｂ細胞マーカーのフローサイトメトリー分析を示しており、１．５％の白血病細胞が明らかになったが、同じ患者のＡＬＬ＃１４から製造されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ Ｔ細胞サンプルにおいては混入が大幅に減少していた（白血病細胞の０．００３６％）。

【図5】白血病細胞が高度に混入した診断時のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＢＭ原料から生成されたＤＰのＭＲＤ分析を示す図である。ＡＬＬ＃１及びＡＬＬ＃２患者の２つのＢＭ由来ＤＰにおけるＢ細胞マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。パネルは、白血病細胞（黒点）の存在を示す。

【図6A】両方が同じ細胞膜上で発現される場合、ＣＡＲ．ＣＤ１９の構造がＣＤ１９抗原エンゲージメントに影響を与えることを示す図である。（Ａ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（ａ）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＬＨ（ｂ）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨ（ｃ）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（ｄ）を表す模式図。（Ｂ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨによって遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６細胞におけるフローサイトメトリーによって検出されたＣＤ１９発現。一致したアイソタイプ染色ヒストグラム及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ細胞についての特異的ＣＤ１９染色ヒストグラムが示されている（矢印を参照）。（Ｃ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ上のＣＤ１９発現のヒストグラムと比較した、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＬＨ（Ｃ）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨ（Ｄ）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（Ｅ）によって遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６細胞におけるフローサイトメトリーによって検出されたＣＤ１９発現をヒストグラムで示す図である。

【図6BCDF】両方が同じ細胞膜上で発現される場合、ＣＡＲ．ＣＤ１９の構造がＣＤ１９抗原エンゲージメントに影響を与えることを示す図である。（Ａ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（ａ）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＬＨ（ｂ）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨ（ｃ）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（ｄ）を表す模式図。（Ｂ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨによって遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６細胞におけるフローサイトメトリーによって検出されたＣＤ１９発現。一致したアイソタイプ染色ヒストグラム及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ細胞についての特異的ＣＤ１９染色ヒストグラムが示されている（矢印を参照）。（Ｃ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ上のＣＤ１９発現のヒストグラムと比較した、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＬＨ（Ｃ）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨ（Ｄ）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（Ｅ）によって遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６細胞におけるフローサイトメトリーによって検出されたＣＤ１９発現をヒストグラムで示す図である。

【図7A】ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株の両方におけるＣＤ１９ ｍＲＮＡ発現を示す図である。（Ａ）ＷＴ、ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９_ＳＨ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株におけるＣＤ１９ ｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を示す図である。Ｋａｒｐａｓ細胞株は陰性対照として使用されている。ｍＲＮＡレベルは、標的遺伝子対ＡＣＴ－Ｂ ｍＲＮＡ発現の相対的な発現として示される。反応は３回繰り返して実行された。（Ｂ）白血病及びリンパ腫細胞株におけるＣＡＲ．ＣＤ１９発現のＭＦＩ分析を示す図である。ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ ＤＡＵＤＩ（上のパネル）及びＲＡＪＩ（下のパネル）におけるＣＡＲ．ＣＤ１９発現レベルのＭＦＩ値。データは１つの代表的な実験を示している。（Ｃ）ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＡＬＭ－６細胞株の両方に対するＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。７日間のインビトロ共培養後のＷＴ（黒色のバー）、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＵＰｅｎｎ（ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＬＬ／ＳＨとも呼ばれる）白血病細胞（縞模様のバー）の割合。ＮＡＬＭ－６ Ｂｃｐ－ＡＬＬ腫瘍細胞株に対して、エフェクター標的比を１：１から１：３２に減少させてアッセイを実行した。実験は３回繰り返して実行された。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図7B】ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株の両方におけるＣＤ１９ ｍＲＮＡ発現を示す図である。（Ａ）ＷＴ、ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９_ＳＨ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株におけるＣＤ１９ ｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を示す図である。Ｋａｒｐａｓ細胞株は陰性対照として使用されている。ｍＲＮＡレベルは、標的遺伝子対ＡＣＴ－Ｂ ｍＲＮＡ発現の相対的な発現として示される。反応は３回繰り返して実行された。（Ｂ）白血病及びリンパ腫細胞株におけるＣＡＲ．ＣＤ１９発現のＭＦＩ分析を示す図である。ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ ＤＡＵＤＩ（上のパネル）及びＲＡＪＩ（下のパネル）におけるＣＡＲ．ＣＤ１９発現レベルのＭＦＩ値。データは１つの代表的な実験を示している。（Ｃ）ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＡＬＭ－６細胞株の両方に対するＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。７日間のインビトロ共培養後のＷＴ（黒色のバー）、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＵＰｅｎｎ（ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＬＬ／ＳＨとも呼ばれる）白血病細胞（縞模様のバー）の割合。ＮＡＬＭ－６ Ｂｃｐ－ＡＬＬ腫瘍細胞株に対して、エフェクター標的比を１：１から１：３２に減少させてアッセイを実行した。実験は３回繰り返して実行された。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図7C】ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株の両方におけるＣＤ１９ ｍＲＮＡ発現を示す図である。（Ａ）ＷＴ、ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９_ＳＨ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株におけるＣＤ１９ ｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を示す図である。Ｋａｒｐａｓ細胞株は陰性対照として使用されている。ｍＲＮＡレベルは、標的遺伝子対ＡＣＴ－Ｂ ｍＲＮＡ発現の相対的な発現として示される。反応は３回繰り返して実行された。（Ｂ）白血病及びリンパ腫細胞株におけるＣＡＲ．ＣＤ１９発現のＭＦＩ分析を示す図である。ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ ＤＡＵＤＩ（上のパネル）及びＲＡＪＩ（下のパネル）におけるＣＡＲ．ＣＤ１９発現レベルのＭＦＩ値。データは１つの代表的な実験を示している。（Ｃ）ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＡＬＭ－６細胞株の両方に対するＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。７日間のインビトロ共培養後のＷＴ（黒色のバー）、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＵＰｅｎｎ（ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＬＬ／ＳＨとも呼ばれる）白血病細胞（縞模様のバー）の割合。ＮＡＬＭ－６ Ｂｃｐ－ＡＬＬ腫瘍細胞株に対して、エフェクター標的比を１：１から１：３２に減少させてアッセイを実行した。実験は３回繰り返して実行された。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図8A】ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及びＣＡＲ．ＣＤ１９陽性白血病又はリンパ腫細胞株を制御するｉＣ９の活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。（Ａ－Ｂ）ＷＴ（黒色のバー）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）とＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞との７日間共培養アッセイ（Ｅ：Ｔ比は培養中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合としてグラフのｘ軸に示される）。（Ｃ）ＮＡＬＭ－６ ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変ＮＡＬＭ－６とＮＴ（黒色のバー）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（縞模様のバー）との７日間共培養アッセイ。全ての実験は３回繰り返して実行された（ｎ＝６）。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞を０ｎＭ（Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｅ）ＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、フローサイトメトリーによって経時的にモニタリングされた。（Ｆ）ＡＰ１９０３曝露後のｑＲＴ －ＰＣＲによる腫瘍細胞におけるＣＡＲ．ＣＤ１９ベクターの検出。反応は３回繰り返して実行された。黒色のヒストグラムは参照の陽性対照（０ｎＭ ＡＰ１９０３）を表し、白色のヒストグラムは１回の薬物曝露後の結果（２０ｎＭのＡＰ１９０３）を表す。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図8B】ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及びＣＡＲ．ＣＤ１９陽性白血病又はリンパ腫細胞株を制御するｉＣ９の活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。（Ａ－Ｂ）ＷＴ（黒色のバー）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）とＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞との７日間共培養アッセイ（Ｅ：Ｔ比は培養中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合としてグラフのｘ軸に示される）。（Ｃ）ＮＡＬＭ－６ ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変ＮＡＬＭ－６とＮＴ（黒色のバー）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（縞模様のバー）との７日間共培養アッセイ。全ての実験は３回繰り返して実行された（ｎ＝６）。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞を０ｎＭ（Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｅ）ＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、フローサイトメトリーによって経時的にモニタリングされた。（Ｆ）ＡＰ１９０３曝露後のｑＲＴ －ＰＣＲによる腫瘍細胞におけるＣＡＲ．ＣＤ１９ベクターの検出。反応は３回繰り返して実行された。黒色のヒストグラムは参照の陽性対照（０ｎＭ ＡＰ１９０３）を表し、白色のヒストグラムは１回の薬物曝露後の結果（２０ｎＭのＡＰ１９０３）を表す。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図8C】ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及びＣＡＲ．ＣＤ１９陽性白血病又はリンパ腫細胞株を制御するｉＣ９の活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。（Ａ－Ｂ）ＷＴ（黒色のバー）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）とＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞との７日間共培養アッセイ（Ｅ：Ｔ比は培養中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合としてグラフのｘ軸に示される）。（Ｃ）ＮＡＬＭ－６ ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変ＮＡＬＭ－６とＮＴ（黒色のバー）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（縞模様のバー）との７日間共培養アッセイ。全ての実験は３回繰り返して実行された（ｎ＝６）。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞を０ｎＭ（Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｅ）ＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、フローサイトメトリーによって経時的にモニタリングされた。（Ｆ）ＡＰ１９０３曝露後のｑＲＴ －ＰＣＲによる腫瘍細胞におけるＣＡＲ．ＣＤ１９ベクターの検出。反応は３回繰り返して実行された。黒色のヒストグラムは参照の陽性対照（０ｎＭ ＡＰ１９０３）を表し、白色のヒストグラムは１回の薬物曝露後の結果（２０ｎＭのＡＰ１９０３）を表す。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図8D】ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及びＣＡＲ．ＣＤ１９陽性白血病又はリンパ腫細胞株を制御するｉＣ９の活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。（Ａ－Ｂ）ＷＴ（黒色のバー）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）とＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞との７日間共培養アッセイ（Ｅ：Ｔ比は培養中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合としてグラフのｘ軸に示される）。（Ｃ）ＮＡＬＭ－６ ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変ＮＡＬＭ－６とＮＴ（黒色のバー）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（縞模様のバー）との７日間共培養アッセイ。全ての実験は３回繰り返して実行された（ｎ＝６）。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞を０ｎＭ（Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｅ）ＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、フローサイトメトリーによって経時的にモニタリングされた。（Ｆ）ＡＰ１９０３曝露後のｑＲＴ －ＰＣＲによる腫瘍細胞におけるＣＡＲ．ＣＤ１９ベクターの検出。反応は３回繰り返して実行された。黒色のヒストグラムは参照の陽性対照（０ｎＭ ＡＰ１９０３）を表し、白色のヒストグラムは１回の薬物曝露後の結果（２０ｎＭのＡＰ１９０３）を表す。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図8E】ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及びＣＡＲ．ＣＤ１９陽性白血病又はリンパ腫細胞株を制御するｉＣ９の活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。（Ａ－Ｂ）ＷＴ（黒色のバー）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）とＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞との７日間共培養アッセイ（Ｅ：Ｔ比は培養中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合としてグラフのｘ軸に示される）。（Ｃ）ＮＡＬＭ－６ ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変ＮＡＬＭ－６とＮＴ（黒色のバー）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（縞模様のバー）との７日間共培養アッセイ。全ての実験は３回繰り返して実行された（ｎ＝６）。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞を０ｎＭ（Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｅ）ＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、フローサイトメトリーによって経時的にモニタリングされた。（Ｆ）ＡＰ１９０３曝露後のｑＲＴ －ＰＣＲによる腫瘍細胞におけるＣＡＲ．ＣＤ１９ベクターの検出。反応は３回繰り返して実行された。黒色のヒストグラムは参照の陽性対照（０ｎＭ ＡＰ１９０３）を表し、白色のヒストグラムは１回の薬物曝露後の結果（２０ｎＭのＡＰ１９０３）を表す。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図8F】ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及びＣＡＲ．ＣＤ１９陽性白血病又はリンパ腫細胞株を制御するｉＣ９の活性を評価するための長期インビトロアッセイを示す図である。（Ａ－Ｂ）ＷＴ（黒色のバー）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）とＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞との７日間共培養アッセイ（Ｅ：Ｔ比は培養中のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合としてグラフのｘ軸に示される）。（Ｃ）ＮＡＬＭ－６ ＷＴ及びＣＡＲ．ＣＤ１９遺伝子改変ＮＡＬＭ－６とＮＴ（黒色のバー）、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ（白色のバー）、及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ（縞模様のバー）との７日間共培養アッセイ。全ての実験は３回繰り返して実行された（ｎ＝６）。データは平均±ＳＤとして表される。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ－Ｅ）ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞を０ｎＭ（Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｅ）ＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、フローサイトメトリーによって経時的にモニタリングされた。（Ｆ）ＡＰ１９０３曝露後のｑＲＴ －ＰＣＲによる腫瘍細胞におけるＣＡＲ．ＣＤ１９ベクターの検出。反応は３回繰り返して実行された。黒色のヒストグラムは参照の陽性対照（０ｎＭ ＡＰ１９０３）を表し、白色のヒストグラムは１回の薬物曝露後の結果（２０ｎＭのＡＰ１９０３）を表す。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図9A】ＣＡＲ構成以外、同様のＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞活性化プロファイルを示す図である。（Ａ）エフェクターＴ細胞及びＮＡＬＭ－６ ＷＴ、又はＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトで遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６との２４時間の共培養後にＩＦＮ－γ産生を測定した。ＨＤから生成された６つの異なるＣＡＲ Ｔ産物のデータが、平均±ＳＤとして表されている。（Ｂ）刺激を受けていないＣＡＲ Ｔ細胞と、ＷＴ又はＣＡＲ．ＣＤ１９改変ＮＡＬＭ－６細胞で刺激されたＣＡＲ Ｔ細胞のオーバーレイを表すＣＦＳＥ増殖分析。

【図9B】ＣＡＲ構成以外、同様のＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞活性化プロファイルを示す図である。（Ａ）エフェクターＴ細胞及びＮＡＬＭ－６ ＷＴ、又はＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトで遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６との２４時間の共培養後にＩＦＮ－γ産生を測定した。ＨＤから生成された６つの異なるＣＡＲ Ｔ産物のデータが、平均±ＳＤとして表されている。（Ｂ）刺激を受けていないＣＡＲ Ｔ細胞と、ＷＴ又はＣＡＲ．ＣＤ１９改変ＮＡＬＭ－６細胞で刺激されたＣＡＲ Ｔ細胞のオーバーレイを表すＣＦＳＥ増殖分析。

【図10A】ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株に対するＡＰ１９０３投与の効果を示す図である。ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ）ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株を０ｎＭ（Ａ－Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｂ－Ｄ）のＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、ＦＡＣＳによって経時的にモニタリングされた。ＡＰ１９０３処理（２０ｎＭ）により、薬物曝露後６時間からＣＡＲ＋細胞が速やかに減少する。ＡＰ１９０３曝露後のＣＡＲ陽性率の減少は、細胞表面上のＣＤ１９抗原の段階的な検出に関連している。（Ｅ）ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞株を０ｎＭ（黒線）及び２０ｎＭ ＡＰ１９０３（短い点線）で処理した；ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＭＦＩをフローサイトメトリー分析によって、処理後０日目から１５日目まで経時的にモニタリングし、対照ＷＴ ＮＡＬＭ－６細胞株（長い点線）と比較した。（Ｆ）未処理（黒色のバー）又は２０ｎＭ（白色のバー）ＡＰ１９０３に曝露したＷＴ及び遺伝子改変ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株における導入遺伝子のベクターコピー数（ＶＣＮ）を報告するグラフ。データは平均±ＳＤとして表される。

【図10B】ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株に対するＡＰ１９０３投与の効果を示す図である。ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ）ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株を０ｎＭ（Ａ－Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｂ－Ｄ）のＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、ＦＡＣＳによって経時的にモニタリングされた。ＡＰ１９０３処理（２０ｎＭ）により、薬物曝露後６時間からＣＡＲ＋細胞が速やかに減少する。ＡＰ１９０３曝露後のＣＡＲ陽性率の減少は、細胞表面上のＣＤ１９抗原の段階的な検出に関連している。（Ｅ）ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞株を０ｎＭ（黒線）及び２０ｎＭ ＡＰ１９０３（短い点線）で処理した；ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＭＦＩをフローサイトメトリー分析によって、処理後０日目から１５日目まで経時的にモニタリングし、対照ＷＴ ＮＡＬＭ－６細胞株（長い点線）と比較した。（Ｆ）未処理（黒色のバー）又は２０ｎＭ（白色のバー）ＡＰ１９０３に曝露したＷＴ及び遺伝子改変ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株における導入遺伝子のベクターコピー数（ＶＣＮ）を報告するグラフ。データは平均±ＳＤとして表される。

【図10C】ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株に対するＡＰ１９０３投与の効果を示す図である。ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ）ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株を０ｎＭ（Ａ－Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｂ－Ｄ）のＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、ＦＡＣＳによって経時的にモニタリングされた。ＡＰ１９０３処理（２０ｎＭ）により、薬物曝露後６時間からＣＡＲ＋細胞が速やかに減少する。ＡＰ１９０３曝露後のＣＡＲ陽性率の減少は、細胞表面上のＣＤ１９抗原の段階的な検出に関連している。（Ｅ）ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞株を０ｎＭ（黒線）及び２０ｎＭ ＡＰ１９０３（短い点線）で処理した；ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＭＦＩをフローサイトメトリー分析によって、処理後０日目から１５日目まで経時的にモニタリングし、対照ＷＴ ＮＡＬＭ－６細胞株（長い点線）と比較した。（Ｆ）未処理（黒色のバー）又は２０ｎＭ（白色のバー）ＡＰ１９０３に曝露したＷＴ及び遺伝子改変ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株における導入遺伝子のベクターコピー数（ＶＣＮ）を報告するグラフ。データは平均±ＳＤとして表される。

【図10D】ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株に対するＡＰ１９０３投与の効果を示す図である。ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ）ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株を０ｎＭ（Ａ－Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｂ－Ｄ）のＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、ＦＡＣＳによって経時的にモニタリングされた。ＡＰ１９０３処理（２０ｎＭ）により、薬物曝露後６時間からＣＡＲ＋細胞が速やかに減少する。ＡＰ１９０３曝露後のＣＡＲ陽性率の減少は、細胞表面上のＣＤ１９抗原の段階的な検出に関連している。（Ｅ）ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞株を０ｎＭ（黒線）及び２０ｎＭ ＡＰ１９０３（短い点線）で処理した；ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＭＦＩをフローサイトメトリー分析によって、処理後０日目から１５日目まで経時的にモニタリングし、対照ＷＴ ＮＡＬＭ－６細胞株（長い点線）と比較した。（Ｆ）未処理（黒色のバー）又は２０ｎＭ（白色のバー）ＡＰ１９０３に曝露したＷＴ及び遺伝子改変ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株における導入遺伝子のベクターコピー数（ＶＣＮ）を報告するグラフ。データは平均±ＳＤとして表される。

【図10E】ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株に対するＡＰ１９０３投与の効果を示す図である。ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ）ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株を０ｎＭ（Ａ－Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｂ－Ｄ）のＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、ＦＡＣＳによって経時的にモニタリングされた。ＡＰ１９０３処理（２０ｎＭ）により、薬物曝露後６時間からＣＡＲ＋細胞が速やかに減少する。ＡＰ１９０３曝露後のＣＡＲ陽性率の減少は、細胞表面上のＣＤ１９抗原の段階的な検出に関連している。（Ｅ）ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞株を０ｎＭ（黒線）及び２０ｎＭ ＡＰ１９０３（短い点線）で処理した；ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＭＦＩをフローサイトメトリー分析によって、処理後０日目から１５日目まで経時的にモニタリングし、対照ＷＴ ＮＡＬＭ－６細胞株（長い点線）と比較した。（Ｆ）未処理（黒色のバー）又は２０ｎＭ（白色のバー）ＡＰ１９０３に曝露したＷＴ及び遺伝子改変ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株における導入遺伝子のベクターコピー数（ＶＣＮ）を報告するグラフ。データは平均±ＳＤとして表される。

【図10F】ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｂｃｐ－ＡＬＬ細胞株に対するＡＰ１９０３投与の効果を示す図である。ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ）ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株を０ｎＭ（Ａ－Ｄ）及び２０ｎＭ（Ｂ－Ｄ）のＡＰ１９０３で処理した；ＣＡＲ及びＣＤ１９の発現は両方とも、ＦＡＣＳによって経時的にモニタリングされた。ＡＰ１９０３処理（２０ｎＭ）により、薬物曝露後６時間からＣＡＲ＋細胞が速やかに減少する。ＡＰ１９０３曝露後のＣＡＲ陽性率の減少は、細胞表面上のＣＤ１９抗原の段階的な検出に関連している。（Ｅ）ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞株を０ｎＭ（黒線）及び２０ｎＭ ＡＰ１９０３（短い点線）で処理した；ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＭＦＩをフローサイトメトリー分析によって、処理後０日目から１５日目まで経時的にモニタリングし、対照ＷＴ ＮＡＬＭ－６細胞株（長い点線）と比較した。（Ｆ）未処理（黒色のバー）又は２０ｎＭ（白色のバー）ＡＰ１９０３に曝露したＷＴ及び遺伝子改変ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ及びＮＡＬＭ－６細胞株における導入遺伝子のベクターコピー数（ＶＣＮ）を報告するグラフ。データは平均±ＳＤとして表される。

【図11A】ｉＣ９活性化後に免れたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９白血病細胞及びリンパ腫細胞が、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及び同種異系ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞によって効率的に認識され、排除され得ることを示す図である。（Ａ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｂ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｃ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｄ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図11B】ｉＣ９活性化後に免れたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９白血病細胞及びリンパ腫細胞が、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及び同種異系ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞によって効率的に認識され、排除され得ることを示す図である。（Ａ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｂ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｃ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｄ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図11C】ｉＣ９活性化後に免れたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９白血病細胞及びリンパ腫細胞が、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及び同種異系ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞によって効率的に認識され、排除され得ることを示す図である。（Ａ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｂ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｃ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｄ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図11D】ｉＣ９活性化後に免れたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９白血病細胞及びリンパ腫細胞が、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞及び同種異系ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞によって効率的に認識され、排除され得ることを示す図である。（Ａ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｂ）非形質導入Ｔ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｃ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＤＡＵＤＩ細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩ細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＤＡＵＤＩはＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。（Ｄ）非形質導入ＮＫ細胞又はＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞とｗｔ ＮＡＬＭ－６細胞の間で、７日間の共培養アッセイを実行し、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６細胞はＡＰ１９０３にまったく曝露されず、ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ ＮＡＬＭ－６はＡＰ１９０３曝露後に残存し、さらに再増殖した（Ｅ：Ｔ比１：１）。＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１。

【図12A】異なるＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトで遺伝子改変されたＴ細胞が、異種移植マウスモデルにおけるＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御することを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６ ＷＴ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞／マウスで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を投与された３匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｂ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｃ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０ｘ１０^６の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞／マウスで処理した。各処理マウスの生物発光画像。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞（点線）を投与された２つのマウスコホートの生物発光値の平均と標準偏差。＊ｐ値＝＜０．０５。（Ｅ）ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ ＮＡＬＭ－６細胞を有するマウス間の１６日目の腫瘍生物発光の差異を表すヒストグラム。データは、０日目と比較した１６日目の２匹のマウスコホートの生物発光増加の平均±ＳＤとして示されている。

【図12B】異なるＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトで遺伝子改変されたＴ細胞が、異種移植マウスモデルにおけるＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御することを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６ ＷＴ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞／マウスで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を投与された３匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｂ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｃ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０ｘ１０^６の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞／マウスで処理した。各処理マウスの生物発光画像。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞（点線）を投与された２つのマウスコホートの生物発光値の平均と標準偏差。＊ｐ値＝＜０．０５。（Ｅ）ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ ＮＡＬＭ－６細胞を有するマウス間の１６日目の腫瘍生物発光の差異を表すヒストグラム。データは、０日目と比較した１６日目の２匹のマウスコホートの生物発光増加の平均±ＳＤとして示されている。

【図12C】異なるＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトで遺伝子改変されたＴ細胞が、異種移植マウスモデルにおけるＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御することを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６ ＷＴ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞／マウスで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を投与された３匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｂ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｃ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０ｘ１０^６の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞／マウスで処理した。各処理マウスの生物発光画像。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞（点線）を投与された２つのマウスコホートの生物発光値の平均と標準偏差。＊ｐ値＝＜０．０５。（Ｅ）ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ ＮＡＬＭ－６細胞を有するマウス間の１６日目の腫瘍生物発光の差異を表すヒストグラム。データは、０日目と比較した１６日目の２匹のマウスコホートの生物発光増加の平均±ＳＤとして示されている。

【図12D】異なるＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトで遺伝子改変されたＴ細胞が、異種移植マウスモデルにおけるＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御することを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６ ＷＴ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞／マウスで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を投与された３匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｂ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｃ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０ｘ１０^６の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞／マウスで処理した。各処理マウスの生物発光画像。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞（点線）を投与された２つのマウスコホートの生物発光値の平均と標準偏差。＊ｐ値＝＜０．０５。（Ｅ）ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ ＮＡＬＭ－６細胞を有するマウス間の１６日目の腫瘍生物発光の差異を表すヒストグラム。データは、０日目と比較した１６日目の２匹のマウスコホートの生物発光増加の平均±ＳＤとして示されている。

【図12E】異なるＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトで遺伝子改変されたＴ細胞が、異種移植マウスモデルにおけるＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御することを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６ ＷＴ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞／マウスで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を投与された３匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｂ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞（短点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。（Ｃ）－３日目に注入されたＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ陽性／ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＮＡＬＭ－６細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０×１０６個の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨで処理した（上のパネル）。各処理マウスの生物発光イメージング（中央パネル）。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞（長点線）を受けた２匹のマウスコホートの生物発光値の平均±ＳＤ（下のパネル）。＊ｐ値＝＜０．０５、＊＊ｐ値＝＜０．０１、＊＊＊ｐ値＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＝＜０．０００１。（Ｄ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を用いた実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、１０ｘ１０^６の非形質導入（ＮＴ）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞／マウスで処理した。各処理マウスの生物発光画像。ＮＴ（黒線）又はＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞（点線）を投与された２つのマウスコホートの生物発光値の平均と標準偏差。＊ｐ値＝＜０．０５。（Ｅ）ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ ＮＡＬＭ－６細胞を有するマウス間の１６日目の腫瘍生物発光の差異を表すヒストグラム。データは、０日目と比較した１６日目の２匹のマウスコホートの生物発光増加の平均±ＳＤとして示されている。

【図13A】ｉＣ９活性化が異種移植マウスモデルにおけるｉＣ９．ＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御できることを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を使用した実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、０日目から２８日目まで１００μｇ／マウスのＡＰ１９０３で処理した。（Ｂ）各対照未処理マウス及び各ＡＰ１９０３処理マウスの生物発光画像。マウスは、ＡＰ１９０３中止後、３０日以上モニタリングされた。（Ｃ）２つのコホート、未処理マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理マウス（点線）における各処理マウスの経時的な生物発光値。（Ｄ）未処理の白血病担持マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理した白血病担持マウス（青線）のカプラン－マイヤー生存曲線分析。＊＊＊＊ｐ値＝＜０．００００１。ＡＰ１９０３投与後のＩＶＩＳ分析で持続的な陽性シグナルを示した唯一のマウス（＃２０）を、白血病細胞を特徴付けるために、陰性対照（＃１１）及び陽性対照（ＡＰ１９０３投与に曝露されていないマウス、＃６）とともに３５日目に犠牲にした。

【図13B】ｉＣ９活性化が異種移植マウスモデルにおけるｉＣ９．ＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御できることを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を使用した実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、０日目から２８日目まで１００μｇ／マウスのＡＰ１９０３で処理した。（Ｂ）各対照未処理マウス及び各ＡＰ１９０３処理マウスの生物発光画像。マウスは、ＡＰ１９０３中止後、３０日以上モニタリングされた。（Ｃ）２つのコホート、未処理マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理マウス（点線）における各処理マウスの経時的な生物発光値。（Ｄ）未処理の白血病担持マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理した白血病担持マウス（青線）のカプラン－マイヤー生存曲線分析。＊＊＊＊ｐ値＝＜０．００００１。ＡＰ１９０３投与後のＩＶＩＳ分析で持続的な陽性シグナルを示した唯一のマウス（＃２０）を、白血病細胞を特徴付けるために、陰性対照（＃１１）及び陽性対照（ＡＰ１９０３投与に曝露されていないマウス、＃６）とともに３５日目に犠牲にした。

【図13C】ｉＣ９活性化が異種移植マウスモデルにおけるｉＣ９．ＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御できることを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を使用した実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、０日目から２８日目まで１００μｇ／マウスのＡＰ１９０３で処理した。（Ｂ）各対照未処理マウス及び各ＡＰ１９０３処理マウスの生物発光画像。マウスは、ＡＰ１９０３中止後、３０日以上モニタリングされた。（Ｃ）２つのコホート、未処理マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理マウス（点線）における各処理マウスの経時的な生物発光値。（Ｄ）未処理の白血病担持マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理した白血病担持マウス（青線）のカプラン－マイヤー生存曲線分析。＊＊＊＊ｐ値＝＜０．００００１。ＡＰ１９０３投与後のＩＶＩＳ分析で持続的な陽性シグナルを示した唯一のマウス（＃２０）を、白血病細胞を特徴付けるために、陰性対照（＃１１）及び陽性対照（ＡＰ１９０３投与に曝露されていないマウス、＃６）とともに３５日目に犠牲にした。

【図13D】ｉＣ９活性化が異種移植マウスモデルにおけるｉＣ９．ＣＡＲ陽性白血病のインビボ拡大を制御できることを示す図である。（Ａ）－３日目に注入されたｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ陽性ＦＦ－ルシフェラーゼ陽性ＤＡＵＤＩ細胞を使用した実験デザインの概略図。０日目に、マウスを白血病生着について評価し、０日目から２８日目まで１００μｇ／マウスのＡＰ１９０３で処理した。（Ｂ）各対照未処理マウス及び各ＡＰ１９０３処理マウスの生物発光画像。マウスは、ＡＰ１９０３中止後、３０日以上モニタリングされた。（Ｃ）２つのコホート、未処理マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理マウス（点線）における各処理マウスの経時的な生物発光値。（Ｄ）未処理の白血病担持マウス（黒線）又はＡＰ１９０３処理した白血病担持マウス（青線）のカプラン－マイヤー生存曲線分析。＊＊＊＊ｐ値＝＜０．００００１。ＡＰ１９０３投与後のＩＶＩＳ分析で持続的な陽性シグナルを示した唯一のマウス（＃２０）を、白血病細胞を特徴付けるために、陰性対照（＃１１）及び陽性対照（ＡＰ１９０３投与に曝露されていないマウス、＃６）とともに３５日目に犠牲にした。

【図14】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ ８アミノ酸リンカーＧ３ＳＧ４配列番号３８に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【図15】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ ９アミノ酸リンカーＧ４ＳＧ３配列番号１８６に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【図16】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ １０アミノ酸リンカー（ＳＧ４）２配列番号１９０に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【図17】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ １１アミノ酸リンカー（ＳＧ４）２Ｓ配列番号１８７に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【図18】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ １２アミノ酸リンカー（ＳＧ４）２ＳＧ配列番号１８８に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【図19】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ １３アミノ酸リンカー（ＳＧ４）２ＳＧ２（配列番号１９１）に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【図20】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ １４アミノ酸リンカー（ＳＧ４）２ ＳＧ３配列番号１８９に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【図21】ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９対ＣＡＲ．ＣＤ１９ １５アミノ酸リンカー（ＳＧ４）３配列番号３９に関するインシリコモデリングデータを示す図である。

【実施例】

【0071】

実施例１：本発明によるＣＡＲベクターデザイン及びＣＡＲ＋白血病再発の場合のその安全性の研究
材料及び方法
これらの実験で使用されたヒト由来の生物学的材料は、ローマのバンビーノゲス小児病院の施設審査委員会（ＩＲＢ）の定める規則に従い（ＯＰＢＧ；倫理委員会の承認Ｎ°９６９／２０１５ ｐｒｏｔ． Ｎ°６６９ＬＢ及びＮ°１４２２／２０１７ ｐｒｏｔ．Ｎ°８１０）、両親及び健康なドナーがインフォームドコンセントに署名した後にサンプリングされた。

【0072】

実験に記載されたＯＧＭは、ＯＧＭに関する国内又は共同体の規則、特に２００１年４月１２日の第２０６番及び２００３年７月８日の第２２４番の第６パラグラフ及び法令に基づく義務を遵守して調製された。

【0073】

細胞培養。

【0074】

ＣＤ１９陽性ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ、ＮＡＬＭ－６及びＲａｊｉ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＡＴＣＣ））並びにＣＤ１９陰性非ホジキン大細胞リンパ腫細胞株Ｋａｒｐａｓ－２９９（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＲＰＭＩ １６４０（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅ、イタリア）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅ、イタリア）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ、米国）、２５ＩＵ／ｍＬのペニシリン、及び２５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅ、イタリア）を添加して、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下、３７℃で維持した。全ての細胞株は、「ＢＭＲ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓ．ｒ．ｌ．」のＰＣＲ単一遺伝子座技術（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ ２１ ＰＣＲ）分析によって認証され、マイコプラズマ及び表面マーカーの発現について定期的にチェックされた。

【0075】

エフェクター細胞の生成及び拡大。

【0076】

健常人ドナー（ＨＤ）由来のバフィーコート（ＢＣ）、Ｂｃｐ－ＡＬＬ患児由来の末梢血（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）を使用して、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カナダ）を使用して未分画単核細胞を単離した。Ｔ細胞は、可溶性ＯＫＴ３及び抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用い、組換えヒトインターロイキン－７（ＩＬ７、１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ；米国）及びインターロイキン－１５（ＩＬ１５、５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ；米国）の組み合わせで活性化された。ＮＫ細胞は、以前に記載された方法^１７に従って、ＨＤのＢＣから生成された。次いで、３／４日後、組換えヒトレトロネクチン（タカラバイオ株式会社；日本）でプレコーティングされた２４ウェルのプレート中で、Ｔ細胞及びＮＫ細胞にレトロウイルス上清を形質導入した。Ｔリンパ球は、サイトカインの存在下、ＴｅｘＭａｃ完全培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，ドイツ）中で増殖させ、週に２回補充した。

【0077】

ＣＡＲコンストラクト。
実験を行うために４つの異なるレトロウイルスＣＡＲコンストラクトが使用された。１）ＣＤ８ ストークドメイン（短いヒンジ、ＳＨ）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４．１ｂｂ及びＣＤ３σ細胞質ドメインとインフレームで、ＶＬ及びＶＨフラグメントが３つのＧＳＳＳＳ繰り返し（３ｘＧ４Ｓ、長いリンカー、ＬＬ）で表されるリンカーによって結合された、ＦＭＣ６３クローン由来の抗ヒトＣＤ１９－ｓｃＦｖを保持するＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＶＬ－３ＧＳ－ＶＨ－ＣＤ８－４．１ｂｂ．σ、すなわちＬＬ／ＳＨ）。ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＬＬ／ＳＨ ヌクレオチド（配列番号７３）
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＬＬ／ＳＨ アミノ酸（配列番号７４）
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGGGGSGGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-
２）ヒトＣＤ３４抗原由来の１６アミノ酸配列（ΔＣＤ３４、長いヒンジ、ＬＨ）、ＣＤ８ ストークドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４．１ｂｂ及びＣＤ３σ細胞質ドメインとインフレームで、ＶＬ及びＶＨフラグメントが３つのＧＳＳＳＳ繰り返し（３ｘＧ４Ｓ、長いリンカー、ＬＬ）で表されるリンカーによって結合された、ＦＭＣ６３クローン由来の抗ヒトＣＤ１９－ｓｃＦｖを保持するＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＶＬ－３ＧＳ－ＶＨ－ＣＤ３４－ＣＤ８～４．１ｂｂ．σ、すなわちＬＬ／ＬＨ）；
ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＬＨ ヌクレオチド配列（配列番号３６）：
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGCATGCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTGCGGCCGCcCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＬＨ アミノ酸配列（配列番号３９）：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITSGGGGSGGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSACELPTQGTFSNVSTNVSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-
３）ＣＤ８ストークドメイン（短いヒンジ、ＳＨ）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４．１ｂｂ及びＣＤ３σ細胞質ドメインとインフレームで、ＶＬ及びＶＨフラグメントが１つのGGGSGGGG繰り返し（配列番号３８）（Ｇ３ＳＧ４、短いリンカー、ＳＬ）によって表されるリンカーによって結合された、ＦＭＣ６３クローン由来の抗ヒトＣＤ１９－ｓｃＦｖを保持するＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＶＬ－１ＧＳ－ＶＨ－ＣＤ８－４．１ｂｂ．σ、すなわちＳＬ／ＳＨ）。
ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＳＬ／ＳＨヌクレオチド配列（配列番号３４）：
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAA
ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＳＬ／ＳＨアミノ酸配列（配列番号３３）：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
４）ヒトＣＤ３４抗原に由来する１６アミノ酸配列（ΔＣＤ３４、長いヒンジ、ＬＨ）、ＣＤ８ ストークドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４．１ｂｂ及びＣＤ３σ細胞質ドメインのフレームとインフレームで、ＶＬ及びＶＨフラグメントが１つのGGGSGGGG（配列番号３８）繰り返し（Ｇ３ＳＧ４、短いリンカー、ＳＬ）によって表されるリンカーによって結合された、ＦＭＣ６３クローン由来の抗ヒトＣＤ１９－ｓｃＦｖを保持するＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＶＬ－１ＧＳ－ＶＨ－ＣＤ３４－ＣＤ８－４．１ｂｂ．σ、すなわちＳＬ／ＬＨ））。ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ ヌクレオチド配列（配列番号５８）：
ATGGAGTTTGGACTTTCTTGGTTGTTTTTGGTGGCAATTCTGAAGGGTGTCCAGTGTAGCAGGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCGGAGGAAGCGGAGGTGGGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTATATCTGGGCACCTCTCGCTGGCACCTGTGGAGTCCTTCTGCTCAGCCTGGTTATTACTCTGTACTGTAATCACCGGAATCGCCGCCGCGTTTGTAAGTGTCCCAGGGTCGACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨのプロテイン（ＰＲＯＴＥＩＮ）（配列番号７２）：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGSGGGGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRVDKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
すでに公開（５）されているＣＡＲ．ＣＤ１９を保持するレンチウイルスベクターで遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６は、ＮＡＬＭ６ ＣＡＲ ＵＰｅｎｎ（Ｒｕｅｌｌａ博士（５）によって提供されたレンチウイルスプラットフォームのＣＡＲ．ＣＤ１９ ＬＬ／ＳＨ ）として実験に含まれている。

【0078】

ＨＤからのＮＫ細胞、及びＨＤ又はＢｃｐ－ＡＬＬ患者からのＴ細胞は、ＣＤ８ストークドメイン、ヒトＣＤ３４抗原由来の１６アミノ酸配列（ΔＣＤ３４；長いヒンジ）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４．１ｂｂ及びＣＤ３σ細胞質ドメインとインフレームで、Ｖ_ＨフラグメントとＶ_Ｌフラグメントが１つのGGGSGGGGで表されるリンカー（配列番号３８）（Ｇ３ＳＧ４、短いリンカー）によって結合したＦＭＣ６３クローンからの抗ヒトＣＤ１９－ｓｃＦｖを保持するレトロウイルスコンストラクトによって遺伝子改変されている（ＣＡＲ．ＣＤ１９ 長いヒンジ、ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ）。レトロウイルスベクターは、上記のＣＡＲコンストラクトが自殺遺伝子誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）をコードする遺伝子カセットとインフレームになっているバイシストロニックコンストラクトである。ｉＣ９－ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨレトロウイルスコンストラクトは、ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ、及びＮＡＬＭ－６を含むＢ白血病細胞株を遺伝子改変するためにも使用されている。ＣＡＲ＋ Ｂ細胞株は、形質導入後にＣＡＲ発現についてＦＡＣＳソートされた。ＮＡＬＭ－６細胞も、ＣＤ８ストークドメイン（短いヒンジ）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４．１ｂｂ及びＣＤ３σ細胞質ドメインとインフレームで、Ｖ_Ｈフラグメント及びＶ_Ｌフラグメントが（Ｓ３Ｇ４）３ Ｆｌｅｘリンカー（SGGGGSGGGGSGGGG（配列番号３９）、長いリンカー）で表されるリンカーによって結合された、ＦＭＣ６３クローン由来の抗ヒトＣＤ１９－ｓｃＦｖを保持するレンチウイルスコンストラクトで遺伝的に改変されている（ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９短いヒンジ、ＣＡＲ．ＣＤ１９_{ＵＰｅｎｎ}；Ｒｕｅｌｌａ博士の厚意により提供されたもの）。

【0079】

自殺遺伝子の活性化。
ｉＣ９のインビトロ活性化を誘導するために、細胞を２０ｎＭのＡＰ１９０３（Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ、カタログ番号ＨＹ－１６０４６）で１回処理した。ＡＰ１９０３処理後のＣＡＲ^＋細胞の割合を、示された時点でＦＡＣＳによって評価した。インビボ実験では、自殺遺伝子ｉＣ９がＡＰ１９０３による活性化によるＣＡＲ＋白血病拡大の制御において活性となる能力があることを証明するために、ＦＦ－ルシフェラーゼについてレトロウイルスコンストラクトで遺伝子改変した０．２５ｘ１０^６ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ－ＤＡＵＤＩ細胞をＮＳＧマウスに注入した；
腫瘍生着をＩＶＩＳイメージングシステムによってモニタリングした後、二量体化薬剤ＡＰ１９０３を１日目から２８日目まで腹腔内投与した（１００μｇ／マウス）。対照コホートには、ビヒクル溶液として滅菌ＰＢＳを注入した。毎週のＩＶＩＳ画像解析によって、腫瘍をモニタリングした。

【0080】

表現型分析。
フローサイトメトリー分析を行って、細胞表面抗原の発現を測定した：
ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４（全てＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国から）のモノクローナル抗体を、必要に応じて異なる蛍光と組み合わせた。ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９発現は、ｈＣＤ３４エピトープに対するｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、米国からの抗ＣＤ３４ ＱＢｅｎｄ－１０ ＰＥ）、又はＣＤ１９ ＣＡＲ検出試薬（ビオチン；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）を使用して検出した。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０サイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を使用してフローサイトメトリー分析を実行し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）によって分析した。ＣＡＲ形質導入腫瘍細胞株のＦＡＣＳソーティングは、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）で実行した。

【0081】

ＤＰは、ｗｗｗ．ＥｕｒｏＦｌｏｗ．ｏｒｇ^１８で入手可能である、表面マーカーのみを染色するためのＥｕｒｏＦｌｏｗ標準操作手順（ＳＯＰ）を使用して、抗体とＣＤ１９－ＦＩＴＣヒトタンパク質の１１色又は１６色のいずれかの組み合わせによって特徴付けられた。使用した抗体の組み合わせは両方とも、フローサイトメトリーによるＢ細胞急性リンパ芽球性白血病の高感度ＭＲＤ測定について以前に記載されているＥｕｒｏＦｌｏｗ ＢＣＰ－ＡＬＬ ＭＲＤチューブからなるバックボーンに基づいていた^{１９～２１}。

【0082】

これに、トランスフェクト及び非トランスフェクトＴ細胞の染色並びにＣＤ１９陰性Ｂ細胞前駆体及び芽球の特異的ゲーティングのために、それぞれ抗ＣＤ３並びに抗ＣＤ２２及び抗ＨＬＡＤＲ抗体の両方の試薬を加えた。最後に、トランスフェクトされた ＣＡＲ．ＣＤ１９ 細胞を同定するために、抗ＣＤ３４ Ｑｂｅｎｄ１０ クローン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）及び ＣＤ１９－ＦＩＴＣ ヒトタンパク質（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ ＳＬ、スペイン、サラマンカ）も試薬染色ミックスに追加した。

【0083】

全ての特定の試薬は、以下のように報告するように、表１Ａ、Ｂ及びＣに示している。

【0084】

【表1】

【0085】

【表2】

【0086】

【表3】

サンプル採取はサンプル調製終了後直ちに実行され、サンプルごとに＞１．５×１０^６細胞（範囲：１．６～７．５×１０^６細胞）を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０［Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ），Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ］フローサイトメーター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）、又は３－ｌａｓｅｒ Ａｕｒｏｒａ（Ｃｙｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）スペクトルフローサイトメーターとＳｐｅｃｔｒｏＦｌｏソフトウェア（Ｃｙｔｅｋ）を用いて測定した。機器のセットアップ及びデータ取得については、ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｌｏｗ．ｏｒｇで入手可能な機器のセットアップ及び校正についてのＥｕｒｏＦｌｏｗ ＳＯＰは、ＤＯＩ： １０．１０３８／ｌｅｕ．２０１２．１２２に厳密に従った。データ分析にはＩｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェア（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ ＳＬ Ｓａｌａｍａｎｃａ、スペイン）を使用した。

【0087】

定量的リアルタイムＰＣＲ。

【0088】

全ＤＮＡは、製造業者に従ってＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、米国）に従って、精製された。
定量的リアルタイムPCR
細胞あたりのベクターコピー数（ＶＣＮ）の平均は、プライマーエクスプレス（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してレトロウイルスコンストラクト上にデザインされたＴａｑＭａｎプローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって決定し、表２に報告した（ｉＣ９プローブ及びプライマーｉＣ９）。

【0089】

【表4】

ＴａｑＭａｎプライマー／プローブは、プライマーエクスプレス（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、イタリア）によって、各特異的免疫グロブリン（ＩＧ）又はＴ細胞受容体（ＴＲ）クローン標的に対してデザインされた。

【0090】

ＶＣＮについては、各サンプルを３回重ねて分析し、閾値サイクルの平均を使用して、陰性対照サンプルの平均値と比較してＤＮＡコピーを定量した。相対的な遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴ１Ｎ１（Ｈｓ＿０２２４９５１６ ＡＣＴ１Ｎ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して計算された。ｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、実行された。ＤＰのＩＧ／ＴＲ ＰＣＲ－ＭＲＤについては、各ＭＲＤ値は対応する標準曲線から計算され、結果はハウスキーピングアルブミン遺伝子の値に対して正規化された。分析された各サンプルに適切なＭＲＤ値を割り当てるために、定量範囲（ＱＲ）及び感度範囲（ＳＲ）、陽性の値、反復の再現性が、ユーロＭＲＤガイドラインに従って解釈された。ｑＰＣＲは、７９００ ＨＴ ｆａｓｔ－リアルタイム－ＰＣＲシステム及びＶｉｉＡ７システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行された。

【0091】

インビボＣＡＲ＋白血病マウスモデル。

【0092】

Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）雌マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから提供され、カステルロマーノ、ローマのＰｌａｉｓａｎｔ動物施設で維持された。全ての手順は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の動物管理及び使用に関するガイドライン（動物実験倫理委員会Ｐｒｏｔ． Ｎ ０８８／２０１６－ＰＲ）に従って実行された。ＣＡＲ＋白血病に対するＣＡＲ Ｔ活性を試験するために、ＮＳＧマウスモデルにホタルルシフェラーゼ（ＦＦ－Ｌｕｃ）で遺伝子組み換えされた０．２５ｘ１０^６のＮＡＬＭ－６ ＷＴ又はＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９_{ＳＬ／ＬＨ}又はＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９_{ＬＬ／ＳＨ}又はＤＡＵＤＩ ＣＡＲ．ＣＤ１９_{ＳＬ／ＬＨ}細胞を静脈内移植した。＋３日目に、マウスを１０ｘ１０^６ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞又は対照の非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞で処理した。Ｄ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｄ－ルシフェリンカリウム塩）の腹腔内投与後、腫瘍増殖をＩＶＩＳイメージングシステムにより毎週モニタリングした。

【0093】

統計分析。

【0094】

特に明記しない限り、データは平均±標準偏差（ＳＤ）として要約される。スチューデントｔ検定（両側）を使用して、ｐ値＜０．０５が有意差を示す、サンプル間の統計的有意差を決定した。マウスの生存データは、カプランマイヤー生存曲線を使用して分析され、フィッシャーの直接確率検定を使用して統計的に有意な差が測定された。貴重なサンプルは分析から除外されなかった。動物は、腫瘍移植後であるが、処理前である時に死亡した場合にのみ除外された。インビボ研究では、ランダム化も盲検化も行われなかった。しかしながら、マウスは、対照又は特異的なものを注入する前の、対照群及び処理群の腫瘍シグナルに基づいて照合された。経時的な腫瘍の増殖を比較するために、生物発光シグナル強度をブラインド方式で収集した。生物発光シグナル強度を対数変換し、２サンプルｔ検定を使用して比較した。サンプルサイズは、データの各群内で大きな変動がないことを考慮して推定された。できるだけ小さいサンプルサイズを使用して、結論に達するように試みられた。有意水準０．０５で標準偏差２の平均の差を検出力８０％で検出するためのサンプルサイズを推定した。グラフ表示及び統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実行された。

【0095】

結果
Ｂｃｐ－ＡＬＬに罹患した患者のＰＢ単核細胞からのＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の生成。

【0096】

ＰＢ単核細胞の未分画集団は、中央値４５．０５±２８．１２％の循環芽球を有する診断時の患者から単離された（ｎ＝１０、範囲、５．５～８６．４％）。図１Ａに詳述する方法に従って、第２世代ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９長いヒンジ（ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ）を登録された患者のＰＢ由来の単核細胞に形質導入した。形質導入プロセスから５日後に、Ｔ細胞産物は、５５．１５±１６．５４％の形質導入効率を示した（図１Ｂは例示的な分析を示す一方で、図１Ｃは、４５％中央値カットオフを考慮した、出発材料中の％ＣＤ１９^＋細胞に基づいて２つの群に細分化された１５人の白血病患者の平均を示す）。特にＤＰにおけるＣＡＲ形質導入レベル並びに生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の総数の観点から、患者のサンプル中の白血病性芽球の混入が、ＣＡＲ Ｔ細胞の産生に影響を与えるかどうかが評価された。製造手順の終了時のＣＡＲ Ｔ細胞の割合と、出発材料に混入しているＣＤ１９＋ Ｂ細胞のレベル（図１Ｃ及び図１Ｄ）、並びに４５％を超えるＣＤ１９^＋細胞（カットオフ培地値；図１Ｅ）を特徴とする患者の材料から開始して製造した場合に観察されたＣＡＲ Ｔ細胞収量との間に相関関係は認められなかった。白血病芽球細胞の割合が増加した患者のサンプル、並びにより未熟な段階の白血病細胞を考慮するために、診断時のＢｃｐ－ＡＬＬ患者のＢＭ吸引サンプルから開始したＣＡＲ Ｔ細胞を生成した（ｎ＝６、図２Ａ）が、出発材料中のＣＤ１９＋細胞の平均は、７３．１±１７．８０％（範囲、４０．５～８３．５％）であった。ＢＭ由来サンプルの形質導入レベルはＰＢサンプルよりも有意に低かったものの（図２ Ａ－Ｂ；それぞれ３６，０４±１９，８３％対５５，１５±１６，５４％ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞；ｐ＝０．０３）、ＰＢ又はＢＭサンプルからのＤＰ回収の総収量に関しては、差異は観察されなかった（図２Ｃ）。

【0097】

患者由来のＣＡＲ Ｔ細胞製品の詳細な特性評価。

【0098】

各患者の診断時に観察された患者特異的Ｉｇ再編成を増幅するために、ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰ（１４日目、産生終了時）に対してリアルタイム定量的ＰＣＲを実行した。試験した１４個のＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰのうち７個でＭＲＤ陽性が観察され、ＭＲＤ中央値は６．０１Ｅ－３±１．００Ｅ－２であった（表３）。

【0099】

【表5】

表３は、ＣＡＲ Ｔ製造のために考慮された出発原料中のＣＤ１９＋白血病細胞の割合、及び各々個人の患者の診断時において同定された２つの異なるＩｇマーカー（ＭＲＤ＃１及びＭＲＤ＃２）のＭＲＤ値に関する各登録患者からのデータを示している。ＭＲＤデータは、対照の非形質導入Ｔ細胞サンプル（ＮＴ）及びＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞サンプル（ＣＡＲ）の両方について報告された。

【0100】

さらに、白血病芽球細胞の混入はまた、試験した１３個の非形質導入Ｔ細胞サンプルのうち９個にも存在することが観察され（ＮＴ、表３）、形質導入プロセスとは無関係に白血病細胞が培養液中に生存することが証明された。さらに詳しくは、活性化後＋８日目の非常に早い時点、ＣＡＲ Ｔ製造の標準手順として＋１４日目、及びＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰの培養について同様に延長された＋３０日目でＤＰがＭＲＤについて分析された、経時的実験が行われた（データは５人の異なる患者の生産物から得られた、ｎ＝５）。図３Ａに示すように、ＭＲＤレベルとインビトロ培養の時間経過の間には逆相関が観察され、培養時間が徐々に増加するにつれてＭＲＤが有意に減少し（＋８日目対＋１４日目のＭＲＤを考慮するとｐ＝０．０２）、Ｄａｙ＋３０の最後の時点での感度を下回るレベルに達した。十分な材料が入手可能なサンプルについては、高感度ＥｕｒｏＦｌｏｗサイトメトリープラットフォームを適用してＤＰ分析も実行されている（Ｌｅｕｋｅｍｉａ． ２０１２年９月；２６（９）：１８９９～１９０７ページ）。製造プロセスの＋１４日目における１つの例示的なＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰ及びＮＴ Ｔ細胞の対照培養物からのデータを報告する図３Ｂに明らかに示されるように、適用された細胞蛍光定量分析は陽性のＭＲＤを検出するのに十分な感度であった。ＣＡＲ産物を混入したＢ細胞前駆体は、非常に鈍いＣＤ１９であったが（図４）、ＣＤ１０などの他のＢ細胞マーカーは保存されていた（図４）。それにもかかわらず、インビトロで増殖させたＮＴ Ｔ細胞にＢ細胞が混入してＣＤ１９＋ ＣＤ１０＋を生じた割合は、ＣＡＲサンプルで観察されたものよりも有意に高かった（図４、ＭＲＤ １．５％対０．０００３６％）。Ｂ細胞がＣＡＲ形質導入によって特徴付けられるかどうかを検証した。図５に示すように、ＰＣＲでＭＲＤ陽性であった２つのサンプルについて、細胞蛍光定量アッセイにより分析したところ、ＣＡＲ陽性白血病細胞が検出され、ＣＡＲ分子の２つの異なる染色（抗ＣＤ３４はｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨ並びにＣＡＲ．ＣＤ１９ ｓｃＦｖによって認識されるＣＤ１９エピトープのヒンジ領域上のエピトープを検出）に対して二重陽性を示した。ＢＭ由来のＤＰについてもデータが確認され、ＲＴ－ｑＰＣＲにより６つのＣＡＲ Ｔ産生のうち６つでＭＲＤ陽性が示された（表４）。

【0101】

【表6】

表４は、ＣＡＲ Ｔ細胞製造のための出発原料として使用される患者由来ＢＭ単核細胞におけるＣＤ１９＋白血病細胞の割合、及び各患者個人における診断時に同定された２つの異なるＩｇマーカーについてのＭＲＤ値に関する各登録患者のデータを示している。ＭＲＤデータは、対照の非形質導入Ｔ細胞サンプル（ＮＴ）及びｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＨ Ｔ細胞サンプル（ＣＡＲ）の両方について報告された。

【0102】

２つのＢＭ由来ＤＰについては、ＭＲＤはＥｕｒｏＦｌｏｗサイトメトリープラットフォームによっても確認された（図５）。これらの場合では、アッセイの感度及び凍結サンプルの品質により、ＣＡＲ陽性Ｂ細胞前駆体を検出することはできなかった。また、ＢＭ由来ＣＡＲ Ｔ細胞産物では、ＤＰに混入しているＢ細胞前駆体は、ＣＤ１９弱／陰性であったが、Ｂ細胞に混入している非形質導入Ｔ細胞産物ではＣＤ１９の高い発現が示された。

【0103】

要約すると、製剤の特性評価を綿密に行えば、白血病ＣＡＲ＋ Ｂ細胞の発生がしばしば検出可能であるという証拠が提供され、今後、多くの患者が間もなくＣＡＲ Ｔ細胞で治療される予定であるため、ＣＡＲコンストラクトの安全性プロファイルの改善が急務であることが強調された。

【0104】

ＣＡＲリンカーの長さはエピトープマスキングに影響する

【0105】

ＣＡＲ．ＣＤ１９が同じ細胞膜上でＣＤ１９と共発現する場合、リンカー及びヒンジ領域のＣＡＲ．ＣＤ１９のデザインがＣＤ１９マスキングに影響を与えるか否かを評価した。特に、図６Ａに要約した４つの特定の立体構造は、ＣＡＲコンストラクトのどの構成立体構造がＣＡＲ＋白血病細胞におけるＣＤ１９抗原マスキングに関与するかを示すと考えられた。この目的のために、４つの異なるＣＡＲコンストラクトを使用してＮＡＬＭ－６細胞株を遺伝的に改変した。細胞はＣＤ１９陽性をｍＲＮＡレベルで維持していたが（図７Ａ）、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨのＣＤ１９関連蛍光レベルのパターン（薄灰色のヒストグラム）は、対照アイソタイプ（濃い灰色のヒストグラム）と重ねることができ（図６Ｂ）、以前に公開されたデータ（５）を確証した。次に、異なる第２世代ＣＡＲ．ＣＤ１９構成は、ΔＣＤ３４を含む長いヒンジが存在しているが、（以前のものと同様に）長いリンカーを特徴とするものと考えられる（ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＬＨ）。この場合、マスキングフローサイトメトリー分析では、参照ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨと比較して差異は示されなかった（図６Ｃ）。次に、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨを保持するＮＡＬＭ－６におけるＣＤ１９のＭＦＩ検出を考慮して、ＶＬ領域とＶＨ領域との間のリンカー長の寄与を評価した。図６Ｄに示すように、ＣＤ１９ ＭＦＩは、参照ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨと比較して、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨにおいて高かった。最後に、本発明のＣＡＲコンストラクトで遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６は、ＶＬとＶＨの間の短いリンカーが、ＣＡＲ Ｔ細胞の追跡可能なマーカーとしてΔＣＤ３４を含む長いヒンジと関連していると考えられる。また、ＬＨの場合、ＳＨは参照構造とは異なるＣＤ１９ ＭＦＩと関連している（図６Ｅ）。同じデータは、他の２つの異なるＢ細胞株、ＤＡＵＤＩ細胞及びＲＡＪＩ細胞においても観察され、リンパ腫細胞がＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨで遺伝子改変された場合、不完全なＣＤ１９マスキングが示された（図７Ｂ）。これらの観察に基づいて、リンカーの長さが、レトロウイルスプラットフォームにおけるＣＡＲ＋白血病細胞上の完全又は不完全なＣＤ１９抗原ＣＩＳマスキングを駆動する要因である可能性があると推測された。これらの結果は機能分析によっても裏付けられた。確かに、ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ、及びＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ細胞上の非常に低いレベルのＣＤ１９発現は、特にエフェクター／標的比率が低いと、野生型細胞株と比較した場合、程度は低いものの、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞応答を誘発するのに十分であった（図８Ａ－Ｃ）。図８Ｃに示すように、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞は、ＮＡＬＭ－６ ＷＴに対して完全な白血病制御を発揮し、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨ及びＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨに対して観察された抗白血病活性と比較して有意な差はない。注目すべきことに、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞は、Ｒｕｅｌｌａらによって以前の出版物（５）において適用されたＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ＋を完全に認識できなかったが（図７Ｃ）、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＳＨ及びＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨと比較すると程度は低いものの、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨに対するＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞のある程度の活性が観察された（図８Ｃ）。これらの発見と一致して、ＳＬ又はＬＬを持ったＣＡＲ．ＣＤ１９の両方で遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞によってかなりの量のインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ｇ）を誘導でき（図９Ａ）、それらの増殖を誘導する（図９Ｂ）ことができることも観察された。

【0106】

ＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトの短いリンカー及び長いヒンジは、ＣＡＲの機能性及び免疫原性に影響を与えなかった。

【0107】

注目すべきことに、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨは不完全なＣＤ１９抗原ＣＩＳマスキングをもたらす一方で、Ｔ細胞で発現させると、顕著な白血病／リンパ腫制御を発揮することができた。特に、共培養アッセイを使用して、ＤＡＵＤＩ（図８Ａ）、Ｒａｊｉ（図８Ｂ）、及びＮＡＬＭ－６（図８Ｃ）細胞株に対するＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞の細胞傷害効果を実証した。図８Ａ及び８Ｂに示すように、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞は、低いエフェクター／標的比で使用した場合でも、培養物から腫瘍細胞を除去することができる。ＮＡＬＭ－６モデルについては、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞の抗白血病活性も、より標準的なＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞の抗白血病活性と比較されており、細胞毒性（図８Ｃ、ＮＡＬＭ－６ ＷＴ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）産生（図９Ａ）、又は抗原刺激後の増殖指数（図９Ｂ）の点で実質的な差異は示されていない。この最後のアッセイは、ＣＦＳＥをロードしたＣＡＲ Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６ ＷＴ細胞で刺激し、ＣＡＲコンストラクトに関係なく、両方のＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞が刺激されていない細胞（濃い灰色のヒストグラム）に対して同程度のレベルの高増殖細胞（薄灰色のヒストグラム）に到達できることを観察することによって実行された。さらに、追跡可能なマーカーＣＤ３４がＣＡＲ構成に含まれているため、その免疫原性を予測するためにインシリコ解析も行われた。特に、ＣＤ３４ドメインを含むＣＡＲ領域において、ＭＨＣ分子によって提示されると確信を持って予測されるペプチド配列が研究されてきた。「STNVSPAPR」（配列番号１８１ペプチドは、ＣＤ３４含有コンストラクトに対して潜在的に免疫原性であると予測される（表５、ＭＨＣ分子ＨＬＡ－Ａ１１：０１及びＨＬＡ－Ａ３３：０３によって提示される。ペプチド「GSELPTQGTF」（配列番号１８２）も、選択基準に合致するが、この場合、その結合コアは「ELPTQGTF」（配列番号１８３）であり、完全にＣＤ３４エピトープ領域の一部となっている；したがって、免疫原性が高いとは考えにくい。ＣＤ３４ドメインが考慮されていないコンストラクトについては、ペプチド「SVTVSSPAPR」（配列番号１８４）及びその短いバージョン「VTVSSPAPR」（配列番号１８５）は両方とも免疫原性があり、同じ対立遺伝子ＨＬＡ－Ａ１１：０１及びＨＬＡ－Ａ３３：０３によって提示されると予測される。これらのデータに照らし合わせると、コンストラクトにＣＤ３４ドメインを含めることは、ＣＡＲの免疫原性プロファイルに実質的な影響を及ぼさなかったものと予測される。

【0108】

【表7】

自殺遺伝子ｉＣ９の活性化は、ＣＡＲ＋白血病細胞の拡大を制御する。

【0109】

ＤＡＵＤＩ、ＲＡＪＩ、及びＮＡＬＭ－６ ｉＣ９．ＣＡＲ＋細胞を２０ｎＭのＡＰ１９０３に曝露することにより、ＣＡＲ＋白血病細胞を迅速に除去できる可能性が実証された。確かに、自殺遺伝子ｉＣ９の非常に早期の活性化（６時間）は、ＣＡＲ＋白血病細胞の割合の有意な減少に対応している（ＤＡＵＤＩ細胞については図８Ｄ及び図８Ｅ、ＲＡＪＩ細胞及びＮＡＬＭ６細胞については図１０）。ＡＰ１９０３処理ｉＣ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＤＡＵＤＩ細胞の長期培養は、ｉＣ９．ＣＡＲ＋白血病細胞の再拡大と関連しなかった（図８Ｅ）。特に、ＡＰ１９０３処理細胞におけるＣＡＲ発現のＭＦＩは１４２±２２（閾値；図１０Ｅ）に等しく、未処理細胞と比較して有意に劣る値であるが、ＤＡＵＤＩ ＷＴ細胞のＣＡＲ染色（１２５．８±２０．６、図１０Ｅ）よりは高かった。ＲＡＪＩ（図１０Ａ～Ｂ）及びＮＡＬＭ－６（図１０Ｃ～Ｄ）細胞モデルにおいても、同じ結果が確認された。高いＣＡＲ発現ＭＦＩを有する白血病細胞の存在は、ＡＰ１９０３処理細胞におけるフローサイトメトリー分析では検出されなかった一方で、白血病細胞の存在は、ＣＡＲ．ＣＤ１９の非常に弱い（すなわち中程度の）発現と共に観察されたが、野生型細胞株と同様に、完全で再確立されたＣＤ１９抗原が検出された（図８Ｅ、図１０Ｂ、及び図１０Ｄ）。確かに、ｑＰＣＲ分析により、未処理のＣＡＲ＋細胞と比較すると有意に減少しているものの、ＡＰ１９０３曝露後の残りの細胞で導入遺伝子（ＴＧ）が検出されたことが明らかになった（図９Ｆ）（ＤＡＵＤＩ細胞の２２．８％、ＲＡＪＩ細胞の１８．６％、及びＮＡＬＭ－６細胞の０．６％で、ＴＧ陽性が観察された）。ベクターコピー数分析により、ＡＰ１９０３処理残存細胞は未処理のものと比較して挿入ベクター数が有意に少ないことが明らかになった（考慮された全ての細胞モデルにわたって、未処理及びＡＰ１９０３処理Ｂ細胞におけるＶＣＮ閾値の平均が、それぞれ５．３±４．２及び０．１±０．１；図１０Ｆ）。ＡＰ１９０３曝露後にレスキューされたｉＣ９．ＣＡＲ＋ Ｂ細胞においてＣＤ１９検出が完全に再確立されたため、それらがＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞の標的となり得るかどうかが検証された。図１１に示すように、ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞（図１１Ａ及び図１１Ｂ）は、ＡＰ１９０３処理によって免れたＣＡＲ＋白血病細胞を排除することができた。さらに、ＣＡＲ＋ Ｂ細胞再発患者から自家ＣＡＲ Ｔ細胞産物を生成することは臨床的に不可能であるため、健康なドナー由来のＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫ細胞が、ＡＰ１９０３曝露後にレスキューされたｉＣ９．ＣＡＲ＋ Ｂ細胞を有意に制御できることも証明されている（図１１Ｃ及び図１１Ｄ）。

【0110】

ＣＡＲ＋白血病のインビボ制御のための二重戦略。

【0111】

ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞が、ＳＬ又はＬＬを有するＣＡＲコンストラクト以外に野生型Ｂ細胞白血病を標的とする能力は、Ｂ細胞白血病ＮＳＧ異種移植モデルにおいてインビボで証明されている。特に、マウスにＦＦ－ルシフェラーゼで遺伝子改変されたＮＡＬＭ－６を全身注入して、白血病負荷を経時的にインビボでモニタリングできるようにした。生物発光シグナルを測定することによって腫瘍の生着を分析し、＋０日目に、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞の両方、並びにＨＤ由来の対照ＮＴ－Ｔ細胞でマウスを処理した（図１２Ａ）。ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ及びＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨ Ｔ細胞は、ＮＡＬＭ－６のインビボでの拡大を有意に制御することができることが、生物発光分析によって明確に実証された。次に、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨがインビボ環境でもＣＡＲ Ｔ細胞によって認識されるかどうかが評価された。図１２Ｂに示すように、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞は、対照ＮＴ Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ＋ ＮＡＬＭ－６細胞のインビボ拡大を有意に減少させることができた。同じデータは、ＤＡＵＤＩ細胞株の悪性度の低いリンパ腫モデルでも確認された（図１２Ｄ）。このモデルにおいて、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨ Ｔ細胞は、全ての処理マウスにおいてＣＡＲ＋リンパ腫細胞を制御し、排除することができた。ＣＡＲ．ＣＤ１９ Ｔ細胞で処理したマウスコホートでは、実験手順の終了時（２１日目）に１００％の無病生存率（ＤＦＳ）に達したが、ＮＴ Ｔ細胞を投与したマウスの対照コホートでは０％のＤＦＳであった。さらに、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨに関するインビトロデータも、裏付けられている。また、インビボ設定において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲ．ＣＤ１９ＳＬ／ＬＨモデルで観察されたものよりも低い程度であった（図１２Ｂ及び図１２Ｅ）ものの、ＮＡＬＭ－６ ＣＡＲ．ＣＤ１９ＬＬ／ＳＨに対して、抗白血病制御を発揮することができた（図１２Ｃ）。

【0112】

最後に、自殺遺伝子ｉＣ９が、ＡＰ１９０３による活性化によるＣＡＲ＋白血病拡大の制御において活性であることも、インビボで証明された。特に、ｉＣａｓ９．ＣＡＲ．ＣＤ１９_ＬＨＤＡＵＤＩ細胞が、ＮＳＧマウスに注入された；腫瘍の生着後、二量体化薬剤ＡＰ１９０３を１日目～２８日目まで腹腔内投与した（図１３Ａ）。ＡＰ１９０３の投与によるｉＣ９の活性化により、研究対象マウス１０匹中９匹でＣＡＲ＋白血病が完全に根絶された（図１３Ｂ及び図１３Ｃ）。さらに、ＡＰ１９０３の投与により、薬物投与中断後であっても、処理マウスの１００％の生存が可能となり、６３日目（実験の終点；図１３Ｄ）まで白血病の再発を示したマウスはいなかった。ＣＩＤ投与後のＩＶＩＳ分析で陽性シグナルを示した唯一のマウスは、陰性対照（同じコホートのマウス）及び陽性対照（ＣＩＤ投与なしのマウス）とともに、苦しみの兆候もなく３５日目に早期屠殺し、白血病細胞を特徴付けた。末梢血、脾臓、及び脛骨ＢＭ（左脇腹）にシトフルオロメトリー分析を適用したところ、ＣＡＲ分子の陽性発現とともにＣＩＤで処理されたマウスでは白血病細胞が検出されなかった。

【0113】

実施例２：８アミノ酸～１４アミノ酸までの短いリンカーと長いリンカーを有する異なるＣＡＲ．ＣＤ１９分子の比較

【0114】

インシリコモデルは、８から１４アミノ酸にわたる短いリンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９分子が、１５アミノ酸の長いリンカーを有する古典的なＣＡＲ．ＣＤ１９と比較して異なる３Ｄ構造によって特徴付けられることを実証するために実行され、短い長さのリンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９は、１５アミノ酸の標準リンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９で観察されるものに対して異なる標的のマスキングを提供する空間構成を持つという追加の証拠を提供する。
以下のリンカーは、ＶＬ配列の配列番号１５とＶＨ配列の配列番号１６を連結するために使用された：
Ｇ３ＳＧ４ GGGSGGGG短いリンカー（配列番号３８）
ＳＧ４ＳＧ３ SGGGGSGGG（配列番号１８６）、
（ＳＧ４）２ SGGGGSGGGG（配列番号１９０）
（ＳＧ４）２ Ｓ SGGGGSGGGGS（配列番号１８７）
（ＳＧ４）２ ＳＧ SGGGGSGGGGSG（配列番号１８８）
（ＳＧ４）２ ＳＧ２ SGGGGSGGGGSGG（配列番号１９１）
（ＳＧ４）２ ＳＧ３ SGGGGSGGGGSGGG（配列番号１８９）
（ＳＧ４）３ SGGGGSGGGGSGGGG長いリンカー（配列番号３９）
このモデルでは、スーパーポーズ（Ｓｕｐｅｒｐｏｓｅ）ツールを使用して、修正クォータニオンアプローチを使用したタンパク質の重ね合わせを計算した。スーパーポーズは、２つ以上の構造の重ね合わせから、配列アラインメント、構造アラインメント、ＰＤＢ座標、ＲＭＳＤ統計、差分距離プロット、重ね合わせ構造のインタラクティブ画像を生成する。スーパーポーズウェブサーバーは、ＰＤＢ形式のファイル又はＰＤＢアクセッション番号の送信をサポートしている。このツールを使用することで、８アミノ酸から１５アミノ酸までのレパートリー全体にわたる、異なる長さのリンカーを含むＣＡＲ．ＣＤ１９の構造を比較した。

【0115】

８～１４アミノ酸のリンカーを含む構造に対して、１５アミノ酸の長いリンカーを含む標準的なＣＡＲ．ＣＤ１９構造との間に有意な違いがある領域を視覚的に識別するために使用できるＰＮＧ画像として、異なる距離マトリックスが生成される。領域が明るいほど、構造はより類似している（図１４～２１）。同様に、領域が暗いほど、構造はより異なる。スーパーポーズの差分距離プロットのデフォルト表示では、６つの段階的なカットオフが示される。

【0116】

０と１．５オングストローム（Ａ）の差は白である；１．５Ａと３．０Ａの差は非常に明るい灰色である；３，０Ａと５，０Ａの差は明るい灰色である；５Ａと７Ａの差は灰色である；７Ａと９Ａの差は濃い灰色である；９Ａと１２Ａの差は非常に濃い灰色であり、１２Ａを超える差は黒である。

【0117】

図１４～２１は、アルファ炭素及びバックボーン、並びに重い構造に関する（二乗平均平方根偏差）ＲＭＳＤデータの要約した表も、示している。これらの表は、より長い１５アミノ酸リンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９と比較して、８～１４アミノ酸にわたるリンカーを有する全てのＣＡＲ．ＣＤ１９構成の有意な差異を示している。これらの差異は、８～１４アミノ酸からなるリンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９が、より長いリンカーを有するＣＡＲ．ＣＤ１９とは異なるマスキング能力を有することを示唆している。原子位置の二乗平均平方根偏差、又は単なる二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）は、重ね合わせたタンパク質の原子（通常はバックボーン原子）間の平均距離の尺度となる。

【0118】

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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6BCDF】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】