(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-20
(54)【発明の名称】過酸化水素進化型宿主細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20231213BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231213BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231213BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231213BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20231213BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12P21/08
C12P21/02 C
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023534647
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-07-28
(86)【国際出願番号】 IB2021061570
(87)【国際公開番号】W WO2022123519
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】63/199,177
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508098350
【氏名又は名称】メドイミューン・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】１ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃｒｉｃｋ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｍｐｕｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ２ ０ＡＡ， ＵＮＩＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100218268
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】ミストリー，ラジェシュ クマール
(72)【発明者】
【氏名】ケルソール，エマ ジェーン
(72)【発明者】
【氏名】ソウ，シ ンガ
(72)【発明者】
【氏名】ハットン，ダイアン
(72)【発明者】
【氏名】ギブソン，スザンヌ
(72)【発明者】
【氏名】ジェンス，ミカル
(72)【発明者】
【氏名】ウィリス，ケイティ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
(57)【要約】
哺乳動物宿主細胞の性能を改善するための指向性進化法、並びに指向性進化法を使用して生成された宿主細胞が提供される。一態様では、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型宿主細胞が提供される。一態様では、（Ｈ２Ｏ２）進化型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的のタンパク質を発現することができる過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型哺乳動物宿主細胞であって、前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、親対照と比較するとき、細胞ストレスに対する増加された耐性を有する、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項2】
前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が抗酸化防御系を有し、前記抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが、親対照と比較するとき増加されている、請求項１に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項3】
前記抗酸化防御系の１つ以上の成分が、グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）；及びそれらの組合せから選択される、請求項２に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項4】
前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、前記親対照と比較するとき、ＧＳＨの増加されたレベルを有する、請求項３に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項5】
前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、前記親対照よりも約１％～約２５％、約２％～約２０％、若しくは約３％～約１０％、又は少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、若しくは約２０％高いレベルのＧＳＨを有する、請求項３又は４に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項6】
前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、親対照と比較するとき、総グルタチオン：酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の増加された比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）を有する、請求項３～５のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項7】
前記総グルタチオン対ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）が、前記親対照と比較すると、約１％～約１５％、若しくは約２％～約１０％、又は少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、若しくは約１５％だけ増加されている、請求項３～６のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項8】
前記総グルタチオン対ＧＳＳＧの比が、約２．５：１～約３：１、又は少なくとも約２．５：１、約２．６：１、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、若しくは約３：１である、請求項６又は７に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項9】
１つ以上の抗酸化防御遺伝子が、前記親対照と比較すると、アップレギュレートされている、請求項１～８のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項10】
１つ以上の抗酸化防御遺伝子が、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）；及びそれらの組合せから選択される、請求項９に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項11】
ＧＳＳ発現が、前記親対照と比較すると、約１０％～約３００％、若しくは約２５％～約２００％、又は少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、且つ最大約１５０％、約２００％、約２５０％、若しくは約３００％増加されている、請求項１０に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項12】
ＧＣＬＭ発現が、前記親対照と比較すると、約１０％～約１００％、若しくは約２５％～約７５％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、若しくは約７５％増加されている、請求項１０又は１１に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項13】
カタラーゼ発現が、前記親対照と比較すると、約１０％～約１００％、若しくは約２５％～約７５％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、若しくは約７５％増加されている、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項14】
ｘＣＴ発現が、前記親対照と比較すると、約１０％～約５０％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、若しくは約５０％増加されている、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項15】
ＧＰｘ－１発現が、前記親対照と比較すると、約１０％～約１００％、若しくは約１０％～約５０％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、若しくは約５０％増加されている、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項16】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項17】
目的のタンパク質をコードする異種遺伝子を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項18】
前記異種遺伝子が、宿主細胞ＤＮＡ中に安定して組み込まれる、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項19】
前記異種遺伝子が、抗体又は抗原結合抗体フラグメントをコードする、請求項１７又は１８に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項20】
前記異種遺伝子が、二重特異性抗体をコードする、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項21】
目的の治療用タンパク質を発現する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であって、前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が抗酸化防御系を有し、グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）から選択される前記抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが、親対照と比較するとき、増加されている、Ｈ２Ｏ２進化型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を含む、細胞の集団。
【請求項23】
前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有し、改善された性能が、（ａ）増加された生細胞密度；
（ｂ）増加された生存率；
（ｃ）減少された乳酸レベル；
（ｄ）増加された力価；
（ｅ）増加された比生産性（ｑＰ）；
又はそれらの組合せのうちの１つ以上を含む、請求項２２に記載の細胞の集団。
【請求項24】
前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、流加培養プロセスで培養されるとき、親対照の集団と比較すると、改善された性能を有する、請求項２３に記載の細胞の集団。
【請求項25】
前記Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、目的のタンパク質を発現するとき、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有する、請求項２３又は２４に記載の細胞の集団。
【請求項26】
前記目的のタンパク質が、二重特異性抗体を含む、請求項２５に記載の細胞の集団。
【請求項27】
前記Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、前記親対照細胞の集団と比較すると、増加された生細胞密度を有する、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項28】
前記Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、約１５×１０６細胞／ｍＬ～約２５×１０６細胞／ｍＬ、又は約１５×１０６細胞／ｍＬ、約１６×１０６細胞／ｍＬ、約１７×１０６細胞／ｍＬ、約１８×１０６細胞／ｍＬ、約１９×１０６細胞／ｍＬ、若しくは約２０×１０６細胞／ｍＬのピーク生細胞密度を有する、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項29】
前記Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、前記親対照細胞の集団と比較すると、増加された生存率を有する、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項30】
前記Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、過酸化水素でチャレンジされるとき、前記親対照細胞の集団と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％増加された生存率を有する、請求項２９に記載の細胞の集団。
【請求項31】
前記Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、少なくとも約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、又は約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされる、請求項３０に記載の細胞の集団。
【請求項32】
前記Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされる、請求項３０に記載の細胞の集団。
【請求項33】
前記Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、前記親対照細胞の集団と比較すると、減少された乳酸レベルを有する、請求項２３～３２のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項34】
前記細胞の集団が、前記親対照細胞の集団と比較すると、少なくとも約１．５倍～３．５倍、又は少なくとも約１．５倍、約１．７５倍、約２．０倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．２５倍、若しくは約３．５倍増加した力価で目的のタンパク質を発現する、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項35】
前記目的のタンパク質が、二重特異性抗体である、請求項３４に記載の細胞の集団。
【請求項36】
前記二重特異性抗体の前記力価が、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、若しくは約０．５ｇ／Ｌ～約１．１ｇ／Ｌ、又は約０．５０ｇ／Ｌ、約０．５５ｇ／Ｌ、約０．６０ｇ／Ｌ、約０．６５ｇ／Ｌ、約０．７０ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ、約０．８０ｇ／Ｌ、約０．８５ｇ／Ｌ、約０．９０ｇ／Ｌ、約０．９５ｇ／Ｌから、且つ最大約１．０ｇ／Ｌ、約１．１ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約１．３ｇ／Ｌ、約１．４ｇ／Ｌ、若しくは約１．５ｇ／Ｌである、請求項３５に記載の細胞の集団。
【請求項37】
前記二重特異性抗体の前記力価が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、又は約１．０ｇ／Ｌである、請求項３５又は３６に記載の細胞の集団。
【請求項38】
前記細胞が、前記親対照細胞の集団と比較すると、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、又は約２．０倍増加されている比生産性（ｑＰ）を有する、請求項２３～３７のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項39】
目的のタンパク質を産生する方法であって、前記目的のタンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項40】
前記目的のタンパク質が、異種タンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記目的のタンパク質が、抗体又は抗原結合抗体フラグメントを含む、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項42】
前記抗体が、二重特異性抗体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記目的のタンパク質が、構成的に発現される、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記目的のタンパク質を単離することを更に含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
請求項４４に記載の単離された目的のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項46】
請求項１～２１のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞の、目的のタンパク質を産生するための、使用。
【請求項47】
前記目的のタンパク質が、抗体又は抗原結合抗体フラグメントを含む、請求項４６に記載の使用。
【請求項48】
前記抗体が、二重特異性抗体を含む、請求項４７に記載の使用。
【請求項49】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で改善された生存率を有する単離された宿主細胞であって、前記宿主細胞が、約２ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２、若しくは約３５ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２への曝露の約１日～約１５日後、約３０分～約２時間後に、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、若しくは約５０％の生存率を有する、単離された宿主細胞。
【請求項50】
前記宿主細胞が、少なくとも約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、且つ最大約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、若しくは約５０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される、請求項４９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項51】
前記宿主細胞が、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される、請求項４９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項52】
細胞ストレスに対する増加された耐性を有する哺乳動物宿主細胞の進化型集団を産生する方法であって、前記方法が、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１５ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で前記細胞の集団を複数ラウンドで培養することと、細胞が、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下で生存できるようになるまで、前記細胞を回復させることと、を含む、方法。
【請求項53】
（ａ）細胞の集団を提供することと、（ｂ）細胞培養基中で前記細胞の集団を培養することと、
（ｃ）前記細胞の集団を、約５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分間～約１２０分間接触させて、移行細胞の集団を提供することと、
（ｄ）前記移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な細胞培養基中に再浮遊させて、細胞が少なくとも約７０％の生存率に達するまで培養することと、
（ｅ）ステップ（ｃ）～（ｄ）を繰り返して、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、約３０分間～約１時間インキュベートするときに生存することができるＨ２Ｏ２進化型細胞の集団を得ることと、を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記細胞の集団が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項55】
前記細胞が、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記異種遺伝子が、宿主細胞ＤＮＡ中に安定して組み込まれる、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記異種遺伝子が、抗体又は抗原結合抗体フラグメントをコードする、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項58】
前記異種遺伝子が、二重特異性抗体をコードする、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記細胞が、浮遊状態で培養される、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
（ｂ）における前記細胞の集団が、少なくとも約７０％、約８０％、又は約９０％の生存率まで培養される、請求項５３に記載の方法。
【請求項61】
（ｃ）における前記細胞の集団が、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、又は約１５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される、請求項５３に記載の方法。
【請求項62】
（ｃ）における前記細胞の集団が、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１１．５ｍＭ、約１２ｍＭ、約１２．５ｍＭ、約１３ｍＭ、約１３．５ｍＭ、約１４ｍＭ、約１４．５ｍＭ、約１５ｍＭ、約１５．５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１６．５ｍＭ、約１７ｍＭ、約１７．５ｍＭ、約１８ｍＭ、約１８．５ｍＭ、約１９ｍＭ、約１９．５ｍＭ、又は約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される、請求項５３に記載の方法。
【請求項63】
（ｃ）における接触させることが、前記細胞の集団をＨ２Ｏ２と共に、少なくとも約３０分間、約４５分間、若しくは約６０分間、且つ最大約９０分間、若しくは約１２０分間インキュベートすることを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項64】
ステップ（ｃ）～（ｄ）が、少なくとも約３回、４回、又は５回繰り返される、請求項５３に記載の方法。
【請求項65】
前記進化型細胞の集団が、少なくとも約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、若しくは約１００、且つ最大約１２０の細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）後、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させるとき生存することができる、請求項５３に記載の方法。
【請求項66】
前記細胞培養基が、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ～約８ｍＭ、又は約４ｍＭ～約６ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項５３～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
請求項５２～６６のいずれか一項に記載の方法によって産生される、進化型宿主細胞。
【請求項68】
目的のタンパク質をコードする異種遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＨ２Ｏ２進化型宿主細胞であって、前記宿主細胞が、トランスフェクション後約９～約１２日以内に約７０％～約８５％の生存率を有する、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項69】
前記宿主細胞が、トランスフェクション後少なくとも約９日、約１０日、約１１日、又は約１２日で約７０％～約８５％の生存率を有する、請求項６８に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項70】
前記宿主細胞が、トランスフェクション後少なくとも約９日、１０日、１１日、又は１２日で約１．０×１０６細胞／ｍｌ～約１．６×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度（ＶＣＤ）を有する、請求項６８又は６９に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項71】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項６８～７０のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項72】
安定的なトランスフェクションが、エレクトロポレーション、それに続くメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）選択を含む、請求項６８～７１のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項73】
前記異種遺伝子が、抗体又は抗原結合フラグメントをコードする、請求項６８～７２のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【請求項74】
前記異種遺伝子が、二重特異性抗体をコードする、請求項６８～７３のいずれか一項に記載のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１９９，１７７号に対する優先権の利益を主張する。前述した内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１９９，１７７号に対する優先権の利益を主張する。前述した内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型宿主細胞及び（Ｈ２Ｏ２）進化型宿主細胞を作製及び使用するための方法、特に（Ｈ２Ｏ２）進化型宿主細胞を使用して目的のタンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
１００を超える治療用タンパク質が、ヨーロッパ共同体及びアメリカ合衆国において臨床使用に承認されており、これらの大部分は組換えにより製造されている。（非特許文献１）。二重特異性抗体、多重特異性融合タンパク質、及び抗体コンジュゲートなどの非天然形式で操作されたタンパク質もまた開発中である。タンパク質をベースとした治療薬の大成功にも関わらず、効率的な開発は依然として課題である。特に、タンパク質過剰発現は宿主代謝に影響を与える場合があり、大規模な細胞培養は細胞ストレスを引き起こし、宿主細胞生産性能を低下させる。
【0004】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、好気性代謝の自然な副産物であり、これは高レベルで存在するとき、細胞増殖及び生産性を妨げ得る。（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。組換えタンパク質産生に対する細胞レドックス状態の影響の認識は、近年増加している。（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；及び非特許文献９）。
【0005】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び二重特異性抗体（ＢｉｓＡｂ）などの他の非天然生物製剤分子の発現に頻繁に使用されている。（非特許文献１０；及び非特許文献１１。しかしながら、ＣＨＯ細胞は、大規模細胞培養中に高レベルのＲＯＳを生産し、これが酸化的ストレス、最適以下の細胞培養性能及びより低い抗体価につながり得る。（非特許文献１２）。特に、二重特異性抗体などの新規抗体形式の開発は、低い製品収率によって妨げられ得（非特許文献１３）、低い製品収率は、酸化ストレスを含む、高レベルの細胞ストレスに関連する（非特許文献１４）。
【0006】
細胞内プロセスを変更するための過剰発現又は標的を定めた遺伝子アブレーションによる特定の遺伝子の操作を伴う遺伝子工学的アプローチは、生産の障害を緩和し、より予測可能且つロバストな細胞株を生み出すために実装されている。現在までに、この戦略は細胞周期（非特許文献１５）、代謝（非特許文献１６）、タンパク質分泌（非特許文献１７）及び細胞レドックス（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）を含む多様な細胞内プロセスを変更するために使用されている。これらの遺伝子工学戦略は、まずまずの成功を収めているが、特定の生化学的経路を標的化して特定の遺伝子を操作することは、当初仮説されたほど効果的ではない可能性がある。したがって、例えば、異種タンパク質、又は二重特異性抗体などの非天然形式を有するタンパク質を発現する場合、細胞培養中に改善された性能を有する細胞株に対する必要性が依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，ＤＳ（２０１２）“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１－２６
【非特許文献2】Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（４）：１１７２－１１８６
【非特許文献3】Ｚｅｅｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）“Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＯＳ”．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．１７（３）：３２７
【非特許文献4】Ｔｕｒｒｅｎｓ ＪＦ．（２００３）“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ”．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５２（Ｐｔ ２）：３３５－４４
【非特許文献5】Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ａｎｄ ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ”．Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．１１（１０）：２４０９－２７
【非特許文献6】Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１４（７）：１４６９－７７
【非特許文献7】Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｆｏｒ ａ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１５（１）：１２６－３８
【非特許文献8】Ｏｒｅｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｈｉｇｈ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１４（２）：６０９－１８
【非特許文献9】Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｎｌｉｎｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｄｏｘ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（５）：１３２９－１３３６
【非特許文献10】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３（３）：９１７－３０
【非特許文献11】Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．８（３）：４３
【非特許文献12】Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ．１３３：１２－２０
【非特許文献13】Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｓｈｉｆｗｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２ Ｐｔ Ａ）：９５－１０６
【非特許文献14】Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（４）：１１７２－１１
【非特許文献15】Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ”．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（５）：４６８－７２
【非特許文献16】Ｆｏｇｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｏｎ ｈＧＭ－ＣＳＦ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ”．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０９（１－２）：１７９－９１
【非特許文献17】Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ：ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．９８（３）：６１１－５
【非特許文献18】Ｏｒｅｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｉｇａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１４（８）：１８２５－３６
【非特許文献19】Ｂａｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５ ｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ”．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．３６（１）：６５－７７
【非特許文献20】Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｍｎ ＳＯＤ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｏｘｉｄａｎｔ ｉｎｊｕｒｙ”．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６４（６ Ｐｔ １）：Ｌ５９８－６０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、例えば、抗体、抗原結合抗体フラグメント、又は二重特異性抗体を含む目的の組換えタンパク質を製造するための方法、及び、特に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型哺乳動物宿主細胞を使用して、目的の組換えタンパク質を製造する方法に関する。
【0009】
一態様では、目的のタンパク質を発現することができる過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型哺乳動物宿主細胞が提供される。一態様では、（Ｈ２Ｏ２）進化型宿主細胞は、親対照と比較するとき、抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが増加されている抗酸化防御系を有する。一態様では、抗酸化防御系の１つ以上の成分は、グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）；及びそれらの組合せから選択される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照と比較するとき、増加された細胞ストレスに対する耐性を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照と比較するとき、増加された酸化ストレスに対する耐性を有する。
【0010】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照と比較するとき、増加されたレベルの総グルタチオンを有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照よりも約１％～約２５％、約２％～約２０％、若しくは約３％～約１０％、又は少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、若しくは約２０％高いレベルのＧＳＨを有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照と比較するとき、総グルタチオン対酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の増加された比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）を有する。一態様では、総グルタチオン対ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は、親対照と比較すると、約１％～約１５％、若しくは約２％～約１０％、又は少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、若しくは約１５％だけ増加している。一態様では、総グルタチオン対ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は、約２．５：１～約３：１、又は少なくとも約２．５：１、約２．６：１、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、若しくは約３：１である。
【0011】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞の１つ以上の抗酸化防御遺伝子は、親対照と比較するとアップレギュレートされている。一態様では、１つ以上の抗酸化防御遺伝子は：グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）；及びそれらの組合せから選択される。一態様では、ＧＳＳ発現は、親対照と比較すると、約１０％～約３００％、若しくは約２５％～約２００％、又は少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、且つ最大約１５０％、約２００％、約２５０％、若しくは約３００％増加されている。一態様では、ＧＣＬＭ発現は、親対照と比較すると、約１０％～約１００％、若しくは約２５％～約７５％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、若しくは約７５％増加されている。一態様では、カタラーゼ発現は、親対照と比較すると、約１０％～約１００％、若しくは約２５％～約７５％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、若しくは約７５％増加されている。一態様では、ｘＣＴ発現は、親対照と比較すると、約１０％～約５０％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、若しくは約５０％増加されている。一態様では、ＧＰｘ－１発現は、親対照と比較すると、約１０％～約１００％、若しくは約１０％～約５０％、又は少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、若しくは約５０％増加されている。
【0012】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0013】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子を含む。一態様では、異種遺伝子は、宿主細胞ＤＮＡに安定して組み込まれている。一態様では、異種遺伝子は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントをコードする。一態様では、異種遺伝子は、二重特異性抗体をコードする。
【0014】
一態様では、目的の治療用タンパク質を発現することができる、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が提供される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は抗酸化防御系を有し、この中で、グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）；又はそれらの組合せから選択される抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが、親対照と比較するとき増加されている。
【0015】
一態様では、本明細書に記載されるＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を含む細胞の集団が提供される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞は、以下のうちの１つ以上を含む改善された性能を有する：
（ａ）増加された生細胞密度；
（ｂ）増加された生存率；
（ｃ）減少された乳酸レベル；
（ｄ）増加された力価；
（ｅ）増加された比生産性（ｑｐ）；
又はそれらの組合せ。
（ａ）増加された生細胞密度；
（ｂ）増加された生存率；
（ｃ）減少された乳酸レベル；
（ｄ）増加された力価；
（ｅ）増加された比生産性（ｑｐ）；
又はそれらの組合せ。
【0016】
一態様では、細胞の集団は、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）プロセスで培養されるとき、親対照細胞の集団と比較して、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型細胞を含む。一態様では、細胞の集団は、目的のタンパク質を発現するとき、親対照細胞の集団と比較して、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型細胞を含む。一態様では、細胞の集団は、二重特異性抗体である目的のタンパク質を発現する。
【0017】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較して、増加した生細胞密度を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約１５×１０６細胞／ｍＬ～約２５×１０６細胞／ｍＬ、又は少なくとも約１５×１０６細胞／ｍＬ、約１６×１０６細胞／ｍＬ、約１７×１０６細胞／ｍＬ、約１８×１０６細胞／ｍＬ、若しくは約１９×１０６細胞／ｍＬ、且つ最大約２０×１０６細胞／ｍＬのピーク生細胞密度を有する。
【0018】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較して、低減した乳酸レベルを有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団での乳酸蓄積は、非進化の対照培養物の乳酸蓄積の約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、又は約２０％未満である。
【0019】
一態様では、細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較して、少なくとも約１．５倍～３．５倍、又は少なくとも約１．５倍、約１．７５倍、約２．０倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．２５倍、若しくは約３．５倍増加した力価で目的のタンパク質を発現する。一態様では、細胞の集団は、二重特異性抗体である目的のタンパク質を発現する。一態様では、二重特異性抗体の力価は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、若しくは約０．５ｇ／Ｌ～約１．１ｇ／Ｌ、又は約０．５０ｇ／Ｌ、約０．５５ｇ／Ｌ、約０．６０ｇ／Ｌ、約０．６５ｇ／Ｌ、約０．７０ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ、約０．８０ｇ／Ｌ、約０．８５ｇ／Ｌ、約０．９０ｇ／Ｌ、約０．９５ｇ／Ｌから、且つ最大約１．０ｇ／Ｌ、約１．１ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約１．３ｇ／Ｌ、約１．４ｇ／Ｌ、若しくは約１．５ｇ／Ｌである。一態様では、二重特異性抗体の力価は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、若しくは約１．０ｇ／Ｌ、且つ最大約１．０ｇ／Ｌである。
【0020】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較して、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、又は約２．０倍増加された比生産性（ｑＰ）を有する。
【0021】
一態様では、目的のタンパク質を製造する方法が提供される。一態様では、本方法は、本明細書に記載されるようなＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を、目的のタンパク質の発現を可能にする条件下で培養することを含む。一態様では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。一態様では、目的のタンパク質は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。一態様では、抗体は、二重特異性抗体である。一態様では、本方法は、目的のタンパク質を単離することを含む。一態様では、単離された目的のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。
【0022】
一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるようなＨ２Ｏ２進化型宿主細胞の目的のタンパク質を製造するための使用である。一態様では、目的のタンパク質は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。一態様では、抗体は、二重特異性抗体である。
【0023】
一態様では、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で、改善された生存率を有する単離された宿主細胞が提供される。一態様では、宿主細胞は、約２ｍＭ～約５０ｍＭのＨ２Ｏ２、約１０ｍＭ ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２又は約３５ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２の曝露後約１～約１５日後に、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％生存率の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、少なくとも約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、且つ最大約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、若しくは約５０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。
【0024】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、少なくとも約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、若しくは約３５ｍＭ、且つ最大約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされる。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされる。一態様では、過酸化水素でのチャレンジ後のＨ２Ｏ２進化型細胞の改善された生存率は、少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、又は約１００の細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）にわたって維持される。一態様では、細胞ストレスに対する増加した耐性を有する哺乳動物宿主細胞の進化した集団を製造するための方法が提供される。一態様では、酸化ストレスに対する増加した耐性を有する哺乳動物宿主細胞の進化した集団を製造するための方法が提供される。一態様では、本方法は、細胞の集団を、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１５ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で複数のラウンドで培養することと、細胞が約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下で生存できるようになるまで細胞を回復させることと、を含む。一態様では、本方法は下記を含む：
（ａ）細胞の集団を提供すること；
（ｂ）細胞培養基中で細胞の集団を培養すること；
（ｃ）細胞の集団を約５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、移行（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ）細胞の集団を提供すること；
（ｄ）移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な細胞培養基中に再浮遊させて、細胞が少なくとも約７０％の生存率に達するまで培養すること；
（ｅ）ステップ（ｃ）～（ｄ）を繰り返して、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、約３０分～約１時間インキュベートするときに生存することができるＨ２Ｏ２進化型細胞の集団を得ること。
（ａ）細胞の集団を提供すること；
（ｂ）細胞培養基中で細胞の集団を培養すること；
（ｃ）細胞の集団を約５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、移行（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ）細胞の集団を提供すること；
（ｄ）移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な細胞培養基中に再浮遊させて、細胞が少なくとも約７０％の生存率に達するまで培養すること；
（ｅ）ステップ（ｃ）～（ｄ）を繰り返して、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、約３０分～約１時間インキュベートするときに生存することができるＨ２Ｏ２進化型細胞の集団を得ること。
【0025】
一態様では、（ｂ）で製造される細胞の集団は、少なくとも約７０％、約８０％、又は約９０％の生存率まで培養される。一態様では、（ｃ）で製造される細胞の集団は、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、又は約１５～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させる。一態様では、（ｃ）で製造される細胞の集団は、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１１．５ｍＭ、約１２ｍＭ、約１２．５ｍＭ、約１３ｍＭ、約１３．５ｍＭ、約１４ｍＭ、約１４．５ｍＭ、約１５ｍＭ、約１５．５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１６．５ｍＭ、約１７ｍＭ、約１７．５ｍＭ、約１８ｍＭ、約１８．５ｍＭ、約１９ｍＭ、約１９．５ｍＭ、且つ最大約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させる。一態様では、（ｃ）で製造される細胞の集団は、細胞の集団をＨ２Ｏ２と共に、少なくとも約３０分間、約４５分間、若しくは約６０分間、且つ最大約９０分間、若しくは約１２０分間インキュベートすることを含む。一態様では、ステップ（ｃ）～（ｄ）は、少なくとも約３回，約４、若しくは約５、且つ最大約６、約７、約８、約９、若しくは約１０回繰り返される。
【0026】
一態様では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の進化させた集団を製造するための方法が提供される。
【0027】
一態様では、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子を含む哺乳動物宿主細胞の進化させた集団を製造するための方法が提供される。一態様では、異種遺伝子は、宿主細胞ＤＮＡに安定して組み込まれている。一態様では、異種遺伝子は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントをコードする。一態様では、異種遺伝子は、二重特異性抗体をコードする。
【0028】
一態様では、哺乳動物宿主細胞の進化させた集団を製造するための方法が提供され、この中で細胞は浮遊培養されるとき、非進化対照と比較して、改善された性能を有する。
【0029】
一態様では、進化させた細胞の集団は、少なくとも約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、若しくは約１００、且つ最大約１２０の細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）後に、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させたときに生存することができる。
【0030】
一態様では、細胞培養基は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ～約８ｍＭ、又は約４ｍＭ～約６ｍＭのＬ－グルタミンを含む。
【0031】
一態様では、本明細書に記載される方法によって製造される進化させた宿主細胞が提供される。
【0032】
一態様では、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子で安定してトランスフェクトされるＨ２Ｏ２進化型宿主細胞が提供され、ここでは宿主細胞はトランスフェクション後、約９～約１２日以内に、約７０％～約８５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞はトランスフェクション後、少なくとも約９日、約１０日、約１１日、又は約１２日で、約７０％～約８５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞はトランスフェクション後、少なくとも９日、１０日、１１日、又は１２日で、約１．０×１０６細胞／ｍｌ～約１．６×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度（ＶＣＤ）を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一態様では、安定的トランスフェクションには、エレクトロポレーション、それに続くメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）選択が含まれる。一態様では、異種遺伝子は、抗体をコードする。一態様では、異種遺伝子は、二重特異性抗体をコードする。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1A】Ｈ２Ｏ２宿主進化プロセス中の細胞回復を追跡する生存率プロットを示す（矢印はＨ２Ｏ２添加の日にち及び濃度を示し、黒丸は細胞生存率のカウントを表す）。
【図1B】３７ｍＭのＨ２Ｏ２によるチャレンジ後のＣＨＯ対照宿主及びＨ２Ｏ２進化型宿主についての生存率プロットを示す。Ｈ２Ｏ２進化型宿主及びＣＨＯ対照宿主を、６ｍＭのグルタミンで補充したＣＤ－ＣＨＯ中でそれぞれ９０ＰＤＬ及び７ＰＤＬに継代させ、その後両方の宿主を３７ｍＭのＨ２Ｏ２で再チャレンジさせて生存率を記録した（生存率は、１、２、４、７、１０、１１、及び１２日目に測定した）。
【図2A】ＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞の間のメナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）との７２時間のインキュベーション後の相対的宿主細胞生存率の比較を示すグラフである。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＝Ｐ＜０．０５。
【図2B】ＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞の間のブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）との７２時間のインキュベーション後の相対的宿主細胞生存率の比較を示すグラフである。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＝Ｐ＜０．０５。
【図2C】ＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞の間のメルカプトコハク酸（ＭＳ）との７２時間のインキュベーション後の相対的宿主細胞生存率の比較を示すグラフである。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＝Ｐ＜０．０５。
【図2D】ＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞の間の塩化コバルト（ＣｏＣｌ）との７２時間のインキュベーション後の相対的宿主細胞生存率の比較を示すグラフである。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図3A】非トランスフェクトＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主の間の総グルタチオンの比較を示すグラフである。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図3B】非トランスフェクトＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主の間の総グルタチオン：ＧＳＳＧ（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）の比較を示すグラフである。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定。
【図3C】非トランスフェクトＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞におけるグルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）の相対的ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図3D】非トランスフェクトＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞におけるガンマグルタミルシステインリガーゼ調節因子（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）サブユニット（ＧＣＬＭ）の相対的ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図3E】非トランスフェクトＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞におけるカタラーゼの相対的ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図3F】非トランスフェクトＣＨＯ対照及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞におけるｘＣＴの相対的ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図4A】７２時間の６μＭのＭＳＢ又はＨ２Ｏ処理に応答するＣＨＯ対照宿主Ａ及びＨ２Ｏ２進化型宿主Ａの生存率プロットである。Ｎ＝３、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びテューキーの多重比較検定を使用して統計的に決定、＊＝Ｐ＜０．０５（ＣＨＯ対照宿主Ａ＋６μＭのＭＳＢとＨ２Ｏ２進化型宿主Ａ＋６μＭのＭＳＢを比較）。
【図4B】７２時間の６μＭのＭＳＢ又はＨ２Ｏ処理に応答するＣＨＯ対照宿主Ｂ及びＨ２Ｏ２進化型宿主Ｂの生存率プロットである。Ｎ＝３、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びテューキーの多重比較検定を使用して統計的に決定、＊＝Ｐ＜０．０５（ＣＨＯ対照宿主Ａ＋６μＭのＭＳＢとＨ２Ｏ２進化型宿主Ａ＋６μＭのＭＳＢを比較）。
【図5A】ＣＨＯ対照宿主（Ａ）及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ａ）における総グルタチオンの比較を示す。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図5B】ＣＨＯ対照宿主（Ａ）及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ａ）における総グルタチオン：ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）の比較を示す。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図5C】ＣＨＯ対照宿主（Ａ）及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ａ）におけるグルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）の相対的ｍＲＮＡ発現の比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．００００５。
【図5D】ＣＨＯ対照宿主（Ａ）及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ａ）におけるガンマグルタミルシステインリガーゼ調節因子サブユニット（ＧＣＬＭ）の比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．００００５。
【図5E】ＣＨＯ対照宿主（Ａ）及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ａ）におけるカタラーゼの比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図5F】ＣＨＯ対照宿主（Ａ）及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ａ）におけるｘＣＴの比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図5G】ＣＨＯ対照宿主（Ａ）及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ａ）におけるグルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰｘ１）の比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図6A】ＣＨＯ対照宿主（Ｂ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ｂ）における総グルタチオンの比較を示す。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図6B】ＣＨＯ対照宿主（Ｂ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ｂ）における総グルタチオン：ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）の比較を示す。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図6C】ＣＨＯ対照宿主（Ｂ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ｂ）におけるＧＳＳの相対的ｍＲＮＡ発現の比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図6D】ＣＨＯ対照宿主（Ｂ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ｂ）におけるＧＣＬＭの比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＝Ｐ＜０．００５。
【図6E】ＣＨＯ対照宿主（Ｂ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ｂ）におけるカタラーゼの比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＝Ｐ＜０．０００５。
【図6F】ＣＨＯ対照宿主（Ｂ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ｂ）におけるｘＣＴの比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定。
【図6G】ＣＨＯ対照宿主（Ｂ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主（Ｂ）におけるＧＰｘ１の比較を示す。全てのｑＰＣＲデータを、ＭＭＡＤＨＣ ｍＲＮＡ発現に正規化させた。Ｎ＝３、対応のないｔ検定を用いて統計的に決定。
【図7A】ＣＨＯ対照宿主Ａ及びＢ、並びにＨ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢのトランスフェクション後に監視された場合の細胞生存率を示す。３つのプールを、各分子及び各宿主について生成した。
【図7B】ＣＨＯ対照宿主Ａ及びＢ、並びにＨ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢのトランスフェクション後に監視された場合の生細胞密度（ＶＣＤ）を示す。３つのプールを、各分子及び各宿主について生成した。
【図8A】ＣＨＯ対照Ａ及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ａの間の生細胞密度（ＶＣＤ）の比較を示す（１０６細胞／ｍＬ）。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。
【図8B】ＣＨＯ対照Ａ及びＨ２Ｏ２進化型宿主Ａの二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）の生存率（％）の比較を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。
【図8C】ＣＨＯ対照Ａ及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ａの間の乳酸（ｇ／Ｌ）の比較を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。
【図8D】ＣＨＯ対照Ａ及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ａの間の力価の比較を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．００００５。
【図8E】ＣＨＯ対照Ａ及び二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ａの間の細胞比生産性（ｑＰ）を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＝Ｐ＜０．０５。
【図9A】ＣＨＯ対照Ｂ及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ｂの間の生細胞密度（ＶＣＤ）の比較を示す（１０６細胞／ｍＬ）。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。
【図9B】ＣＨＯ対照Ｂ及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ｂの間の生存率（％）の比較を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。
【図9C】ＣＨＯ対照Ｂ及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ｂの間の乳酸（ｇ／Ｌ）の比較を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。
【図9D】ＣＨＯ対照Ｂ及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ｂの間の力価の比較を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。対応のないｔ検定を用いて統計的に決定、＊＝Ｐ＜０．０５。
【図9E】ＣＨＯ対照Ｂ及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主Ｂの間の細胞比生産性（ｑＰ）を示す。各分子を発現する合計で３つのプールを、各宿主について評価した。対応のないｔ検定を用いて統計的に決定。
【図10】過酸化水素進化型宿主細胞を生成するための指向性進化の方法のフローチャートである。
【図11】ＩｇＧモノクローナル抗体をコードする直線化ＤＮＡによるトランスフェクション後のＨ２Ｏ２進化型宿主及びＣＨＯ宿主のトランスフェクション回復を示すグラフである。
【図12A】ネズミＩｇＧ ｍＡｂを発現するＨ２Ｏ２進化型宿主及びＣＨＯ対照の生細胞密度を示す。
【図12B】ネズミＩｇＧ ｍＡｂを発現するＨ２Ｏ２進化型宿主及びＣＨＯ対照の生存％を示す。
【図12C】ネズミＩｇＧ ｍＡｂを発現するＨ２Ｏ２進化型宿主及びＣＨＯ対照の力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【図12D】ネズミＩｇＧ ｍＡｂを発現するＨ２Ｏ２進化型宿主及びＣＨＯ対照の乳酸プロファイル（ｇ／Ｌ）を示す。
【図12E】ネズミＩｇＧ ｍＡｂを発現するＨ２Ｏ２進化型宿主及びＣＨＯ対照の比生産性（ｑＰ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
Ａ．定義
特に定義されていない限り、本明細書で用いられる科学技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。更に、文脈で別段の定めがない限り、単数形の語には複数形が含まれ、複数形の語には単数形が含まれ、例えば、特に明記しない限り、「ａ」又は「ａｎ」は複数形、例えば、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」が含まれ、語「又は」は「及び／又は」を意味することができる。用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」は、限定するものではない。任意のタイプの本明細書に提供される範囲には、記載される特定の範囲内の全ての値及び特定の範囲の端点に関する値が含まれる。
特に定義されていない限り、本明細書で用いられる科学技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。更に、文脈で別段の定めがない限り、単数形の語には複数形が含まれ、複数形の語には単数形が含まれ、例えば、特に明記しない限り、「ａ」又は「ａｎ」は複数形、例えば、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」が含まれ、語「又は」は「及び／又は」を意味することができる。用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」は、限定するものではない。任意のタイプの本明細書に提供される範囲には、記載される特定の範囲内の全ての値及び特定の範囲の端点に関する値が含まれる。
【0035】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、例えば、本発明の説明に利用される組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、及びそれらの範囲を修飾するために使用される。「約」という用語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物又は製剤の製造に使用される典型的な測定及び取扱いの手順により；これらの手順での偶発的エラーにより；方法を実施するために使用される出発材料又は成分の製造、供給源又は純度及び他の類似の要件の差により生じる可能性のある数値量の変動を意味する。「約」という用語はまた、特定の初期濃度又は初期混合を有する製剤のエージングに起因して異なる量、及び特定の初期濃度又は初期混合を有する製剤の混合又は処理に起因して異なる量も包含する。「約」という用語により修飾された場合、本明細書に添付された特許請求の範囲は、そのような均等物を含む。
【0036】
一般的には、本明細書中に記載の細胞及び組織培養、分子生物学及び、タンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及び、ハイブリダイゼーションとの関連で用いられる命名法及びそれらの技術は、当技術分野で周知の通常用いられるものである。本明細書では、アミノ酸は、一般に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されている１文字記号の何れかにより言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより言及され得る。
【0037】
「細胞ストレス」は、宿主細胞の性能又は生産性に影響を及ぼし得る環境ストレス因子を指す。細胞ストレスには、トランスフェクションプロセス、例えば、一過性又は安定的トランスフェクションが含まれ得る。細胞ストレスは、例えば、二重特異性抗体などのタンパク質を発現することの難しさを含む異種タンパク質の組換え発現によって誘発され得る。細胞ストレスはまた、バッチ細胞培養プロセス又は流加細胞培養プロセスなどの細胞培養プロセスが含まれ得る。
【0038】
「酸化ストレス」は、細胞によって産生される活性酸素種（ＲＯＳ）と細胞の抗酸化能との間の不均衡を指す。ＲＯＳは嫌気性代謝の自然な副産物であるが、それらは高レベルで細胞の健康状態及び生産性に悪影響を及ぼし得る。酸化ストレスに対して、用語「耐性である」又は「耐性」は、酸化ストレスの条件下で、例えば、参照細胞又は細胞の集団と比較すると、活性酸素種（ＲＯＳ）の存在下で生存するための細胞又は細胞の集団の改善された能力を指す。
【0039】
「宿主細胞」は、目的のタンパク質を産生するように操作され得るか、又は操作された細胞を指す。一態様では、宿主細胞は、目的のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされる。一態様では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。一態様では、目的のタンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。一態様では、目的のタンパク質は、二重特異性抗体である。「宿主細胞」は、組換えベクターが導入されている細胞を指すだけではなく、そのような細胞の後代も含む。例えば、環境の影響により改変が後の世代に発生する場合があるため、そのような後代は、親細胞と同一ではない場合があるが、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、宿主細胞の集団又は細胞株を含む。宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ネズミ骨髄腫（ＮＳＯ若しくはＳＰ２）、又はラット骨髄腫（ＹＢ２／０）細胞が挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物宿主細胞が含まれ得る。一態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【0040】
「過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型宿主細胞」は、同じ培養条件下で培養されるとき、非進化型又は親の宿主細胞と比較すると、改善された細胞培養性能によって特徴付けされる、過酸化水素の存在下で培養された宿主細胞を指す。一態様では、培養条件は、例えば、過酸化水素又は活性酸素種（ＲＯＳ）の存在に起因する、酸化ストレスの条件を含む。改善された性能は、１つ以上の細胞性能パラメーターを測定することによって決定することができる。「細胞性能パラメーター」は、細胞生存率、細胞増殖及び／又は生産性の指標である測定され得る任意のパラメーターを指す。細胞性能パラメーターの例としては、生存率、生細胞密度、使用済み培地中の乳酸レベル、タンパク質力価、比生産性（ｑＰ）、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、改善された性能は、１つ以上の細胞性能パラメーターにおける統計的に有意な（ｐ＜０．０５）改善をもたらす。細胞性能パラメーターにおける変化が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0041】
「親」又は「親対照」は、細胞培養性能を改善するために、過酸化水素の存在下で培養されていない非進化型宿主細胞を指す。一態様では、親又は親対照は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ネズミ骨髄腫（ＮＳＯ若しくはＳＰ２）、又はラット骨髄腫（ＹＢ２／０）細胞などの非進化型哺乳動物宿主細胞である。一態様では、親又は親対照は、非進化型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0042】
「生存率」は、生きており、増殖することができる細胞の数の尺度を指す。細胞生存率を決定するためのアッセイは当該技術分野において周知であり、例えば、ＡＴＰレベル、生きている細胞に固有の基質及び酵素、若しくはプロテアーゼ活性を低減させる能力などの代謝活性細胞の指標であるマーカーのアッセイを含む。一態様では、細胞生存率は、生存不能な細胞若しくは死細胞の数を引いた総細胞数を決定することによって計算される。一態様では、細胞生存率は、例えば、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を含む市販の自動化細胞培養分析システムを使用して決定することができる。
【0043】
「改善された」又は「増加された」生存率は、細胞の集団、例えば、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、参照集団、例えば、非進化型細胞又は親対照細胞と比べて、同様な培養条件下で生細胞の増加した数を示す状態を指す。
【0044】
「細胞密度」は、培養基の単位体積当たりの生細胞の数を指す。「生細胞密度」又はＶＣＤは、一連の培養条件下での細胞培養基の単位体積当たりの生きた細胞の数を指す。生細胞密度を決定するためのアッセイは知られており、例えば、トリパンブルー染料排除法が挙げられる。一態様では、生細胞密度は、市販の自動化システムを使用して決定される。改善された生細胞密度は、細胞の集団、例えば、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、参照集団、例えば、非進化型細胞若しくは親対照細胞と比べて、同様な培養条件下で生細胞の増加した数を示す状態を指す。
【0045】
乳酸は、哺乳動物細胞培養中に産生される副産物である。高い乳酸レベルは、ワールブルク（Ｗａｒｂｕｒｇ）効果として知られる高い好気性解糖によって引き起こされ得、多くの場合、細胞培養性能の低下と関連している。乳酸の蓄積は、細胞培養基の緩衝能力に影響を与える可能性があり、これはｐＨの低下をもたらし得る。「乳酸蓄積」は、細胞培養プロセス中、特に高細胞密度の細胞培養における制限因子であり得る。細胞培養中に乳酸蓄積を低下させることは、増殖、生産性、及び細胞培養プロセスのロバスト性を改善することができる。
【0046】
「力価」は、生成物、例えば、溶液中、例えば、細胞培養基中の組換え的に産生された目的のタンパク質の体積濃度を指し、ｍｇ／Ｌ又はｇ／Ｌと表すことができる。本明細書で使用される場合、「増加された力価」は、参照細胞株、例えば、親細胞株の力価よりも少なくとも約１．５倍高い力価を指す。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞株は、非進化型親対照と比較して、約１．５倍～約３．５倍である力価を有する。
【0047】
「比生産性」又は「ｑＰ」は、細胞培養中で異種タンパク質を産生する細胞株の生産性を指し、例えば、細胞当たりの、又は細胞の質量若しくは体積の尺度当たりの産物発現率を指す。比生産性は、最終収率を生細胞で割ることによって計算することができ、ｐｇ／細胞／日の単位で表すことができる。一態様では、比生産性は、異種タンパク質を産生する細胞株の生産性を指す。一態様では、比生産性は、異種二重特異性抗体を産生する細胞株の生産性を指す。
【0048】
「発現」は、宿主細胞内の遺伝子の転写及び翻訳を指す。発現のレベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量又は細胞によって産生される遺伝子によってコードされるタンパク質の量に基づいて決定することができる。ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するための方法は既知である。例えば、ｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって検出することができ、遺伝子によってコードされるタンパク質は、ウェスタンブロット又はラジオイムノアッセイを使用して、生物学的活性についてアッセイすることによって検出することができる。
【0049】
「増加された発現」は、対照細胞又は生物と比べて増加された細胞又は生物中の特定の遺伝子配列の発現レベルを指す。一態様では、遺伝子発現の増加されたレベルは、統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。対照と比べて発現の増加が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0050】
「減少された発現」は、対照細胞又は生物と比べて減少された細胞又は生物中の特定の遺伝子配列の発現レベルを指す。一態様では、遺伝子発現の減少されたレベルは、統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。対照と比べて発現の減少が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0051】
「細胞培養」は、細胞の増殖、維持、分化、トランスフェクション、又は繁殖に好適な条件下で培養された細胞の集団を指す。「細胞培養」はまた、細胞の集団及びそれらが維持されている細胞培養基を指してもよい。一態様では、用語「細胞培養」は、目的の組換えタンパク質を産生することができる宿主細胞の集団を指す。接着培養は、細胞が人工基質上で単層として増殖される培地を指す。浮遊培養は、細胞が培養基中で浮遊している培養を指す。一態様では、宿主細胞は接着細胞培養で増殖される。一態様では、宿主細胞は浮遊細胞培養で増殖される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、浮遊細胞培養で増殖される。細胞培養プロセスは既知であり、例えば、バッチ細胞培養プロセス、流加細胞培養プロセス、又は灌流プロセスが挙げられる。
【0052】
「培養基」は、栄養素、例えば、ビタミン、アミノ酸、必須栄養素、及び塩類、並びに条件、例えば、生きている細胞を維持し、それらの増殖及び繁殖を支援するための緩衝化を提供する溶液を指す。典型的には、培養基は以下の成分：エネルギー源、例えば、グルコースなどの炭水化物；アミノ酸、例えば、基本的な２０種類のアミノ酸に加えてシステイン；ビタミン及び／又は他の有機化合物；遊離脂肪酸；並びに微量元素のうちの１つ以上を含む。栄養素溶液は、任意選択でホルモン又は増殖因子；塩類及び緩衝液；ヌクレオシド及び塩基；タンパク質又は組織加水分解物；若しくはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の追加の成分で補充されてもよい。
【0053】
「条件培養基」は、培養された細胞と共にインキュベートされ、培養された細胞によって培地中に分泌された代謝産物、増殖因子、及びタンパク質を含む培養基を指す。
【0054】
細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）は、細胞株の特定の培養の時期の尺度であり、集団中の細胞が倍加するのに要した合計回数を指す。一態様では、ＰＤＬは、マスターセルバンクが倍加するのに要した回数を指す。一態様では、マスターセルバンク中の細胞は、本明細書に記載されるようなＨ２Ｏ２進化型細胞である。一態様では、マスターセルバンク中の細胞は、図１０に概略的に示したプロセスに従って進化させた細胞を含む。一態様では、マスターセルバンク中の細胞は、図１Ａに示したプロセスに従って進化させた細胞である。
【0055】
継代数は、培養中の細胞が継代培養された回数を指す。
【0056】
「バッチ」培養は不連続なプロセスであり、ここでは一定量の培養基に宿主細胞が接種され、追加の増殖培地は添加されない。典型的には、バッチ培養プロセス中に添加及び除去される唯一の材料は、空気／ガス交換、消泡剤及びｐＨ調整剤である。多くの場合、バッチ培養は望ましい均質度を維持し、酸素移動を改善するために、振盪又は撹拌される。細胞数は、最大値に達するまで、通常、指数関数的に増加し、その後増殖が停止し、細胞が死滅する。産物を回収するために、細胞は培地から除去される。一般に、バッチ培養は一定の期間、一定の量で進行し、プロセスの最後に細胞が死滅するか廃棄される状態で１回の採取が行われる。
【0057】
「流加」培養は、プロセス中に定期的又は連続的に供給物が添加されるバッチ培養の変形型である。流加培養は、通常、一定の期間、実質的に一定の量で進行し、細胞が死滅した場合、又はより早い所定の時点のいずれかで１回の採取が行われる。
【0058】
「灌流」培養では、細胞が保持されるか又は沈殿、遠心分離若しくは濾過によって反応器にリサイクルされながら、培養基が高速で細胞培養を通して灌流される。灌流培養では、灌流培地は乳酸などの代謝産物を培養基から除去するのを助ける。
【0059】
「トランスフェクトする」又は「トランスフェクション」は、異種ポリヌクレオチドを含む構築物が宿主細胞中に導入され、遺伝子改変された細胞又はトランスジェニック細胞を生成する方法を指す。トランスフェクション法は既知であり、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ポリカチオン（ＤＥＡＥ－デキストランなど）媒介トランスフェクション、原形質融合、ウイルス感染及びマイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクションは一過性又は安定性であり得る。一過性トランスフェクションでは、異種ポリヌクレオチドを含有する構築物は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれない。安定なトランスフェクションでは、異種ポリヌクレオチドを含有する構築物は宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、例えば、構築物は核若しくは細胞小器官ゲノム中に組み込むことができるか、又はエピソーム内に位置することができ、ここではポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム内で維持され、将来の世代に受け継がれる。
【0060】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの共有結合サブユニットを含むポリマー化合物を指すために、互換的に使用することができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドとしては、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡとしては、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡとしては、限定されるものではないが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用され、複数のポリペプチド鎖を含む複合体を指すことができる。アミノ酸ポリマーは、直鎖状、分岐状又は環状であり得る。アミノ酸は、天然に存在するか、若しくは天然に存在しないアミノ酸、又は変異体アミノ酸であってもよい。タンパク質は、天然型であるか、又は組換え生成され得る。タンパク質は、分泌型、膜結合型、又は細胞内であり得る。タンパク質は、治療用タンパク質、又は商業的利益をもたらす他のタンパク質を含み得る。
【0062】
「単離された」は、分離されている及び／又はその天然環境の構成要素から除去されているポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞を指す。例えば、単離された細胞は動物から取り出され、培養皿又は別の動物中に配置することができる。単離されるとは、細胞が全ての他の細胞から除去されることを意味するものではない。細胞の一群もまた単離され得る。ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは、それが典型的にポリヌクレオチド若しくはポリペプチドと結び付いた細胞材料から除去される場合、又は化学合成されるときの化学的前駆体若しくは化学薬品を実質的に含まない場合に単離されている。「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたポリペプチド」は、それぞれ実質的に生成されたポリヌクレオチド又はポリペプチドを指すことができる。一態様では、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、非天然環境、例えば、異種細胞、組織、又は動物中に存在する。
【0063】
「異種」は、例えば、組換え分子生物学技術を使用して導入された、生物中に天然には存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。異種ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、生物中の天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドと同じであるか、又は異なるポリヌクレオチド又はポリペプチドを含み得る。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、組換え法を介して細胞中に導入された、例えば、プラスミド上に導入された遺伝子を指すことができ、「異種ポリペプチド」は、組換え分子生物学技術によって導入されるポリヌクレオチドから発現される、生物によって天然では合成されないポリペプチドを指すことができる。「組換え」は、細胞、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はベクターに関連して用いられる場合、細胞、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はベクターが、異種ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの導入によって、又は天然ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの改変によって修飾されていること、或いは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。
【0064】
「目的のタンパク質」は、宿主細胞によって発現され得るタンパク質、ポリペプチド、フラグメント、及びペプチドを含む。目的のタンパク質としては、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体及びそれらの誘導体若しくはフラグメントが挙げられる。一態様では、目的のタンパク質は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。一態様では、目的のタンパク質は、二重特異性抗体である。
【0065】
「抗体」及び「免疫グロブリン」は、互換的に使用することができ、これらにはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、イントラボディ、及びそれらの抗原結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、抗体又はその一部とのペプチド融合体、例えばＦｃドメインとの融合タンパク質も含み得る。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えばＧ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、若しくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、若しくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２、若しくは３））であり得る。抗体は、以下に限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含む任意の哺乳動物、又は例えばトリ（例えば、ニワトリ）などの他の動物に由来するものであってもよい。
【0066】
天然に存在するＩｇＧ抗体は、典型的には、４つのポリペプチド鎖：ジスルフィド結合によって相互連結されている２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインからなる重鎖定常領域とを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、１つのドメイン、ＣＬを含む軽鎖定常領域とを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域に更に細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域がその中に散在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略され、軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略される。
【0067】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は、異なるエピトープに対して向けられる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、単一のエピトープに対して向けられる。用語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られ、任意の特定の方法による抗体の操作を必要としない抗体の性質を示す。
【0068】
一態様では、抗体は、多重特異性抗体又は二重特異性抗体である。本明細書で使用される場合、「多重特異性」又は「二重特異性」抗体は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体である。一態様では、抗体は、２つの異なる重鎖可変ドメインを有する二重特異性抗体であり、各重鎖可変ドメインは異なるエピトープに特異的に結合する。一態様では、抗体は、２つの異なる重鎖可変ドメイン及び２つの異なる軽鎖可変ドメインを有する二重特異性抗体である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ又は異なる標的上にあることができ、例えば、エピトープは同じ又は異なるタンパク質上にあることができる。一態様では、二重特異性抗体は、同じ抗原上の異なるエピトープを認識する。一態様では、二重特異性抗体は、異なる抗原上の異なるエピトープを認識する。
【0069】
「発現困難」又は「ＤＴＥ」は、組換え生産が難しいタンパク質、例えば、臨床的又は治療的使用に十分な力価で発現することが難しいタンパク質を指す。例えば、ＤＴＥタンパク質の生産は、そのタンパク質がミスフォールディング、分解又は凝集を受けやすい傾向にあるため、困難であり得る。時には、タンパク質はそれが細胞傷害性であるため、発現が困難であり得る。抗体などの多数のポリペプチド鎖を含むタンパク質は、発現するのが難しい場合もある。特に、二重特異性抗体は、発現が困難であり得る。発現困難なタンパク質は、酸化ストレスの増加されたレベルと関連し得る。例えば、発現困難なタンパク質は、小胞体（ＥＲ）中で発生するタンパク質フォールディングプロセスの副産物としての活性酸素種の生成をもたらし得る。酸化ストレスの増加されたレベルは、酸化還元（レドックス）バランスの低下につながり、酸化ストレスをもたらし得る。
【0070】
語句「薬学的に許容される」とは、連邦政府又は州政府の規制当局の承認を受けていること、又は動物で使用するために、例えば、ヒトで使用するために、米国薬局方、欧州薬局方若しくは他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。
【0071】
Ｂ．概要
本明細書に提供されるのは、目的のタンパク質を製造するための宿主細胞並びにそれの作製及び使用方法である。一態様では、宿主細胞又は細胞株は、性能を改善するために、及び目的のタンパク質の製造についての生産性を増強させるために、指向性進化を使用して得られる。一態様では、改善された性能には、増加された生細胞密度、増加された生存率、減少された乳酸レベル、増加された力価、及び増加された比生産性（ｑＰ）などの１つ以上の性能パラメーターが含まれる。一態様では、改善された性能は、１つ以上の細胞性能パラメーターにおける統計的に有意な（ｐ＜０．０５）改善をもたらす。細胞性能パラメーターにおける変化が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
本明細書に提供されるのは、目的のタンパク質を製造するための宿主細胞並びにそれの作製及び使用方法である。一態様では、宿主細胞又は細胞株は、性能を改善するために、及び目的のタンパク質の製造についての生産性を増強させるために、指向性進化を使用して得られる。一態様では、改善された性能には、増加された生細胞密度、増加された生存率、減少された乳酸レベル、増加された力価、及び増加された比生産性（ｑＰ）などの１つ以上の性能パラメーターが含まれる。一態様では、改善された性能は、１つ以上の細胞性能パラメーターにおける統計的に有意な（ｐ＜０．０５）改善をもたらす。細胞性能パラメーターにおける変化が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0072】
一態様では、指向性進化は、宿主細胞を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で培養して、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞又は細胞株を生成することによって、改善された性能を有する宿主細胞株を生成するために使用される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が提供される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞を作製及び使用する方法が提供される。一態様では、宿主細胞は、細胞ストレスの条件下で改善された性能を有する。一態様では、細胞ストレスには、トランスフェクション、例えば、安定的トランスフェクションが含まれる。一態様では、細胞ストレスには、異種タンパク質の組換え発現が含まれる。一態様では、細胞ストレスには、発現困難なタンパク質の発現が含まれる。一態様では、細胞ストレスには、抗体の発現が含まれる。一態様では、細胞ストレスには、二重特異性抗体の発現が含まれる。一態様では、細胞ストレスには、バッチ培養又は流加細胞培養プロセスなどの細胞培養プロセスが含まれる。一態様では、宿主細胞は、酸化ストレスに対して耐性である。一態様では、細胞株は、哺乳動物細胞株である。一態様では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。一態様では、細胞株は、浮遊培養適応化ＣＨＯ細胞株である。
【0073】
一態様では、宿主細胞は、目的のタンパク質を発現するとき、改善された性能を有する哺乳動物宿主細胞である。一態様では、宿主細胞又は細胞株は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントを産生するために改善された性能を有する哺乳動物宿主細胞である。一態様では、宿主細胞又は細胞株は、二重特異性抗体を産生するために改善された性能を有する哺乳動物宿主細胞である。
【0074】
一態様では、宿主細胞は、発現困難（ＤＴＥ）である目的のタンパク質を発現するとき、改善された性能を有する哺乳動物宿主細胞である。一態様では、ＤＴＥタンパク質は、二重特異性抗体である。
【0075】
二重特異性抗体の製造は、多くの場合、モノクローナル抗体に対して得られる収率と比較すると、より低い生産収率によって妨害される。活性酸素種（ＲＯＳ）が、細胞培養中の抗体産生に悪影響を及ぼし得ること、及び細胞抗酸化能を促進する戦略がタンパク質発現に有益に思われることが示されている。理論によって束縛されることを望むものではないが、二重特異性抗体の細胞内産生は、酸化ストレスを引き起こし得ると考えられる。一態様では、非進化型親宿主細胞と比較して、より高い生産収率で二重特異性抗体を発現する進化させた宿主細胞が提供される。一態様では、進化させた宿主細胞は、非進化型宿主細胞よりも統計的に有意に（ｐ＜０．０５）高い力価で目的のタンパク質を発現する。発現の変化が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0076】
本明細書に提供されるのは、多くの世代にわたって過酸化水素に対する遺伝的耐性を有する、指向性進化を使用して生成された進化させた宿主細胞である。Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、グルタチオン（ＧＳＨ）などの抗酸化物質の増加、及びグルタチオン（ＧＳＨ）生合成及び代謝回転に関与するものが含まれるいくつかの多様な抗酸化防御遺伝子のアップレギュレーション、並びにＨ２Ｏ２排除のために、増強された抗酸化能を示す。一態様では、進化させた宿主細胞は、非進化型宿主細胞よりも、１つ以上の抗酸化防御遺伝子の統計的に有意な（ｐ＜０．０５）増加した発現を有する。発現の増加が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0077】
抗酸化経路におけるグローバルな変化は、酸化ストレス因子の多様なサブセットに対して耐性を付与する。しかしながら、改善された性能を観察するために、細胞が酸化ストレス下にある必要はない。更に、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、優れたトランスフェクション回復時間を有し、流加培養製造プロセスにおいて改善された増殖並びに生存率を実証し、非進化型ＣＨＯ対照細胞と比較して、二重特異性抗体などの発現困難なタンパク質について上昇した発現レベルを有する。
【0078】
Ｃ．活性酸素種（ＲＯＳ）
活性酸素種（ＲＯＳ）は、酸素に由来する分子のグループであり、それらの酸素含有量又は不対電子の存在に起因して、多数の生体分子に対して高い反応性を示す。組換えタンパク質の高レベルの発現を支援するために必要とされる代謝適応は、ＲＯＳの発生をもたらすことができる。例えば、組換えタンパク質の産生で使用される哺乳動物細胞培養は、より高いレベルのタンパク質フォールディング及び分泌を必要とする。これが、小胞体内の活性を増加させ、ＲＯＳの産生における増加をもたらし得る。更に、培地成分は、酸素、光、及び他の成分と反応してＲＯＳを生成し得る。（Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（４）：１１７２－１１８６）。
活性酸素種（ＲＯＳ）は、酸素に由来する分子のグループであり、それらの酸素含有量又は不対電子の存在に起因して、多数の生体分子に対して高い反応性を示す。組換えタンパク質の高レベルの発現を支援するために必要とされる代謝適応は、ＲＯＳの発生をもたらすことができる。例えば、組換えタンパク質の産生で使用される哺乳動物細胞培養は、より高いレベルのタンパク質フォールディング及び分泌を必要とする。これが、小胞体内の活性を増加させ、ＲＯＳの産生における増加をもたらし得る。更に、培地成分は、酸素、光、及び他の成分と反応してＲＯＳを生成し得る。（Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（４）：１１７２－１１８６）。
【0079】
一態様では、対照と比較するとき、酸化ストレスに対する増加した耐性を有する宿主細胞が提供される。一態様では、親対照と比較するとき、酸化ストレスに対する増加した耐性を有する、目的のタンパク質を発現することができる哺乳動物宿主細胞が提供される。一態様では、親対照と比較するとき、酸化ストレスに対する増加した耐性を有する、目的のタンパク質を発現することができる過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型哺乳動物宿主細胞が提供される。
【0080】
本明細書で使用される場合、「酸化ストレスに対する耐性」は、酸化ストレスの存在下で生存するための細胞の能力を指す。一態様では、「酸化ストレスに対する耐性」は、活性酸素種（ＲＯＳ）の存在下で生存するための細胞の能力を指す。一態様では、「酸化ストレスに対する耐性」は、活性酸素種（ＲＯＳ）の増加されたレベルの存在下で生存するための細胞の能力を指す。一態様では、「酸化ストレスに対する耐性」は、細胞培養中に改善された性能を有する細胞を指す。一態様では、ＲＯＳレベルの増加が観察されない場合であっても、細胞培養中に改善された性能が観察される。一態様では、「酸化ストレスに対する耐性」は、流加細胞培養において改善された性能を有する細胞を指す。一態様では、「酸化ストレスに対する耐性」は、細胞培養中に改善された生産収率を伴う細胞を指す。
【0081】
一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、遺伝子発現パターンにおける変化、例えば、細胞抗酸化防御系に関与する遺伝子の発現における変化に関連する。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされた細胞の、細胞培養中に目的の異種タンパク質を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされた細胞の、細胞培養中に目的の異種タンパク質の高力価を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされた細胞の、細胞培養中の発現困難な異種タンパク質の高力価を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の、細胞培養中の異種抗体の高力価を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の、細胞培養中の異種二重特異性抗体の高力価を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の、細胞培養中の異種抗体の高力価を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の、流加細胞培養中の異種抗体の高力価を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の、細胞培養中の異種二重特異性抗体の高力価を効率的に産生するための能力を指す。一態様では、酸化ストレスに対する耐性は、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の、流加細胞培養中の異種二重特異性抗体の高力価を効率的に産生するための能力を指す。本明細書で使用される場合、高力価は、１リットル当たりのグラム数（ｇ／Ｌ）スケールでの力価を指す。一態様では、「高力価」は、非進化型宿主細胞から観察された力価を超えて、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）増加である力価を指す。力価の変化が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。一態様では、「高力価」は、親対照の力価よりも少なくとも約１．５倍高い力価を指す。
【0082】
Ｄ．抗酸化防御系
例えば、正常な細胞活性の副産物として形成されるＲＯＳを含む活性酸素種（ＲＯＳ）の影響を相殺するために、哺乳動物細胞は、ＲＯＳによる細胞内損傷を防止するための様々な酵素的及び非酵素的防御メカニズムを含む一連の「抗酸化防御系」を発達させてきた。（Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（４）：１１７２－１１８６）。抗酸化防御系は、２つのカテゴリー：酵素的及び非酵素的抗酸化物質に分類することができる。
例えば、正常な細胞活性の副産物として形成されるＲＯＳを含む活性酸素種（ＲＯＳ）の影響を相殺するために、哺乳動物細胞は、ＲＯＳによる細胞内損傷を防止するための様々な酵素的及び非酵素的防御メカニズムを含む一連の「抗酸化防御系」を発達させてきた。（Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（４）：１１７２－１１８６）。抗酸化防御系は、２つのカテゴリー：酵素的及び非酵素的抗酸化物質に分類することができる。
【0083】
酵素的抗酸化物質としては、限定されないが、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ－１）が挙げられ、これらは一緒に作用して活性酸素種を酵素的に除去する：ＳＯＤは、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２
－・）を過酸化水素及び分子状酸素に変換し；カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ－１）は、過酸化水素を分解して酸素及び水を形成する。
【0084】
非酵素的抗酸化物質としては、限定されないが、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びグルタチオン（ＧＳＨ）などの低分子量化合物が挙げられる。（Ｖａｌｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）“Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３９（１）：４４－８４）。グルタチオンは、全ての細胞型でミリモル濃度で存在し、広範囲の細胞内システムに影響を及ぼす主要なレドックス緩衝液として作用するシステイン、グリシン、及びグルタミン酸のトリペプチド（γ－Ｌ－グルタミル－Ｌ－システミルグリシン）である（Ｆｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）“Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅｓ，ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ａｎｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”．Ｍｏｌ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ．３０（１－２）：１－１２）。
【0085】
グルタチオンは、還元型（ＧＳＨ）及び酸化型のグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）で存在する。（Ｐｉｚｚｏｒｎｏ，Ｊ．（２０１４）“Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ！”Ｉｎｔｅｇｒ．Ｍｅｄ（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ）．１３（１）：８－１２）。本明細書で使用される場合、総グルタチオンは、細胞中で見出されるＧＳＨとＧＳＳＧとの合計を指す。総グルタチオン対グルタチオンジスルフィドの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は、細胞の細胞レドックス状態を決定し、酸化ストレスの指標であり得る。
【0086】
ＧＳＨの還元型の枯渇は、細胞株製造の減少した比生産性（ｑＰ）に結び付いており（Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｎｌｉｎｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｄｏｘ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（５）：１３２９－１３３６）、Ｏｒｅｌｌａｎａらによるプロテオミクスの研究は、高抗体産生ＣＨＯ細胞株がＧＳＨ生合成経路をアップレギュレートすることを実証した（Ｏｒｅｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｈｉｇｈ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１４（２）：６０９－１８）。これらのデータは、高産生細胞株が増加した細胞内ＧＳＨ含有量を有していたという観察によって裏付けられる（Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“ＬＣ－ＭＳ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（１２）：３１０３－１１）。これと一致して、標的化遺伝子過剰発現を通してのＧＳＨ合成酵素の調節は、ｍＡｂ力価を改善することが示されている（Ｏｒｅｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｉｇａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１４（８）：１８２５－３６）。
【0087】
ＧＳＨは構成アミノ酸から二段階で合成される。第１の段階では、γ－グルタミルシステインがグルタミン酸及びシステインから形成され、第２の段階では、グルタチオン（ＧＳＨ）がγ－グルタミルシステイン及びグリシンから形成される。ＧＳＨ生合成の第１の段階は、グルタミン酸システインリガーゼ（ＧＣＬ）、重鎖若しくは触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）及び軽鎖若しくは調節サブユニット（ＧＣＬＭ）のヘテロ二量体によって触媒される。ＧＣＬＣサブユニットは、酵素の触媒活性の全てを示し、ＧＣＬＭは酵素的に不活性である。グルタチオンシンテターゼ（ＧＳ）は、γ－グルタミルシステインとグリシンとの連結反応を触媒し、グルタチオン（ＧＳＨ）を生成するホモ二量体酵素である。
【0088】
ＧＳＨは、その電子を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に供与して、Ｈ２Ｏ２を酸素（Ｏ２）及び水（Ｈ２Ｏ）に還元して、プロセスにおいて酸化型グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）を生成する。この反応は、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ－１）によって触媒される。次いで、ＧＳＳＧは、グルタチオンレダクターゼによって還元されてＧＳＨを生成する。酸化ストレスの増加されたレベルは、細胞内ＧＳＳＧの蓄積をもたらし、それによって総グルタチオン：ＧＳＳＧ（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）比を低下させる。酸化ストレスに曝された細胞は、一般に、約１～約１０の総グルタチオン：ＧＳＳＧ（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）比を有する。酸化ストレスによるＧＳＳＧの蓄積は、細胞にとって有毒であり得る。
【0089】
アンチポーター系ｘｃ
－は、アミノ酸システイン（システインの酸化型）を、グルタミン酸の１：１対向輸送で細胞中に運び入れる。システインは、グルタチオン（ＧＳＨ）に対する律速基質であると共に、システインはレドックス対を形成する。（Ｌｅｗｅｒｎｚ ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｘｃ
－ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ：ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．”Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．１８（５）：５２２－５５５）。本明細書で使用される場合、ｘＣＴは、システイン／グルタミン酸アンチポーターをコードする遺伝子を指す。
【0090】
他の抗酸化物質には、チオレドキシンレダクターゼ１及びペルオキシレドキシン６が含まれ、これらは改善された組換えタンパク質発現に結び付いている（Ｋｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｒｅ－ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｕｓｉｎｇ ｍｉＲ－２３ ｔｉｐｓ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．１０（７）：１０２９－４０）。転写因子Ｆｏｒｋｈｅａｄ ＢｏｘＡ１（Ｆｏｘａ１）もまた、低下された酸化ストレスに関与するメカニズムを通して、発現困難（ＤＴＥ）抗体の改善された発現と結び付いている（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｆｏｘａ１ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｒｅｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（４）：１１０１－１６）。理論によって束縛されることを望むものではないが、抗酸化物質のアップレギュレーションは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞中の組換えタンパク質の発現に有益であると考えられる。
【0091】
一態様では、抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが、親対照と比較するとき、増加されている宿主細胞が提供される。一態様では、抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルは、宿主細胞が異種タンパク質を発現しているとき増加される。しかしながら、抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルはまた、宿主細胞が異種タンパク質を発現していないときも増加され得る。一態様では、抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが、親対照と比較するとき、増加されているＨ２Ｏ２進化型宿主細胞が提供される。一態様では、抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが、親対照と比較するとき、増加されているＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ宿主細胞が提供される。一態様では、抗酸化防御系の成分としては、グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、グルタチオン（ＧＳＨ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルが、親対照と比較するとき、増加されている宿主細胞が提供される。一態様では、抗酸化防御系の１つ以上の成分のレベルにおける増加は、非進化型の対照におけるレベルと比較すると、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。抗酸化防御系の成分のレベルにおける増加が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0092】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照と比較するとき、ＧＳＨの増加されたレベルを有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照よりもＧＳＨの約１％～約２５％高いレベルを有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照よりもＧＳＨの約２％～約２０％高いレベルを有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照よりもＧＳＨの約３％～約１０％高いレベルを有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照よりもＧＳＨの少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、又は約２０％高いレベルを有する。
【0093】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照と比較するとき、総グルタチオン対酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の増加された比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）を有する。一態様では、総グルタチオン対ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は、親対照と比較すると、約１％～約１５％だけ増加されている。一態様では、総グルタチオン対ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は、親対照と比較すると、約２％～約１０％だけ増加されている。一態様では、総グルタチオン対ＧＳＳＧの比は、親対照と比較すると、少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、又は約１５％だけ増加されている。一態様では、総グルタチオン対ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は、約２．５：１～約３：１である。一態様では、総グルタチオン対ＧＳＳＧの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は、少なくとも約２．５：１、約２．６：１、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、又は約３：１である。
【0094】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞の１つ以上の抗酸化防御遺伝子は、親対照と比較して、アップレギュレートされている。一態様では、１つ以上の抗酸化防御遺伝子は：グルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）；グルタミン酸システインリガーゼ修飾子サブユニット（ＧＣＬＭ）；カタラーゼ；システイン／グルタミン酸アンチポーター軽鎖（ｘＣＴ）；グルタチオンペルオキシダーゼ－１（ＧＰｘ－１）；及びそれらの組合せから選択される。一態様では、１つ以上の抗酸化防御遺伝子の発現における増加は、非進化型の対照と比較すると、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。発現の増加が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0095】
一態様では、ＧＳＳ発現は、親対照と比較すると、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、且つ最大約１５０％、約２００％、約２５０％、若しくは３００％増加されている。一態様では、ＧＳＳ発現は、親対照と比較すると、約１０％～約３００％増加されている。一態様では、ＧＳＳ発現は、親対照と比較すると、約２５％～約２００％増加されている。
【0096】
一態様では、ＧＣＬＭ発現は、親対照と比較すると、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、又は約７５％増加されている。一態様では、ＧＣＬＭ発現は、親対称と比較すると、約１０％～約１００％増加されている。一態様では、ＧＣＬＭ発現は、親対称と比較すると、約２５％～約７５％増加されている。
【0097】
一態様では、カタラーゼ発現は、親対照と比較すると、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、又は約７５％増加されている。一態様では、カタラーゼ発現は、親対照と比較すると、約１０％～約１００％増加されている。一態様では、カタラーゼ発現は、親対照と比較すると、約２５％～約７５％増加されている。
【0098】
一態様では、ｘＣＴ発現は、親対照と比較すると、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％増加されている。一態様では、ｘＣＴ発現は、親対照と比較すると、約１０％～約５０％増加されている。
【0099】
一態様では、ＧＰｘ－１発現は、親対照と比較すると、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％増加されている。一態様では、ＧＰｘ－１発現は、親対照と比較すると、約１０％～約１００％増加されている。一態様では、ＧＰｘ－１発現は、親対照と比較すると、約１０％～約５０％増加されている。
【0100】
Ｅ．性能パラメーター
一態様では、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞が提供される。一態様では、対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞の集団が提供される。一態様では、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有する進化型宿主細胞の集団が提供される。一態様では、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型細胞の集団が提供される。一態様では、親対照ＣＨＯ細胞の集団と比較すると、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ細胞の集団が提供される。
一態様では、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞が提供される。一態様では、対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞の集団が提供される。一態様では、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有する進化型宿主細胞の集団が提供される。一態様では、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型細胞の集団が提供される。一態様では、親対照ＣＨＯ細胞の集団と比較すると、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ細胞の集団が提供される。
【0101】
一態様では、改善された性能は、限定されないが、生細胞密度、生存率、乳酸レベル、力価、比生産性（ｑＰ）又はそれらの組合せが含まれる１つ以上の性能パラメーターにおける改善によって実証される。一態様では、改善された性能は、以下の：増加された生細胞密度、増加された生存率、減少された乳酸レベル、増加された力価、増加された比生産性（ｑＰ）、又はそれらの組合せのうちの１つ以上によって実証される。一態様では、改善された性能は、非進化型対照と比較すると、１つ以上の性能パラメーターにおける統計的に有意な（ｐ＜０．０５）変化で反映される。性能パラメーターにおける変化が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定又は当業者に既知の他の統計的検定を使用して決定することができる。
【0102】
一態様では、バッチ細胞培養、流加細胞培養、灌流細胞培養、又は連続細胞培養プロセスで培養されるとき、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞が提供される。一態様では、バッチ細胞培養プロセスで培養されるとき、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞が提供される。一態様では、流加細胞培養プロセスで培養されるとき、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞が提供される。一態様では、灌流細胞培養プロセスで培養されるとき、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞が提供される。一態様では、連続細胞培養プロセスで培養されるとき、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する宿主細胞が提供される。
【0103】
一態様では、流加細胞培養プロセスで培養されるとき、対照細胞と比較すると、改善された性能を有する哺乳動物宿主細胞が提供される。一態様では、流加細胞培養プロセスで培養されるとき、対照細胞と比較すると、改善された性能を有するＣＨＯ細胞が提供される。一態様では、流加細胞培養プロセスで培養されるとき、親対照細胞と比較すると、改善された性能を有する進化型宿主細胞が提供される。一態様では、流加細胞培養プロセスで培養されるとき、非進化型親対照細胞と比較すると、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型宿主細胞が提供される。一態様では、流加細胞培養プロセスで培養されるとき、非進化型親対照細胞と比較すると、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ宿主細胞が提供される。
【0104】
一態様では、目的のタンパク質を発現するとき、親対照細胞の集団と比較すると、改善された性能を有するＨ２Ｏ２進化型細胞が提供される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞によって発現される目的のタンパク質は、発現困難タンパク質である。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞によって発現される目的のタンパク質は、２本以上のポリペプチド鎖を含む。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞によって発現される目的のタンパク質は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞によって発現される目的のタンパク質は、モノクローナル抗体である。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞によって発現される目的のタンパク質は、二重特異性抗体である。
【0105】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較すると、増加された生細胞密度を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約１５×１０６細胞／ｍＬ～約２５×１０６細胞／ｍＬのピーク生細胞密度を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、少なくとも約１５×１０６細胞／ｍＬ、約１６×１０６細胞／ｍＬ、約１７×１０６細胞／ｍＬ、約１８×１０６細胞／ｍＬ、若しくは約１９×１０６細胞／ｍＬ、且つ最大約約２０×１０６細胞／ｍＬのピーク生細胞密度を有する。
【0106】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較すると、増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較すると、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、少なくとも約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、且つ最大４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、増加された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭの過酸化水素でチャレンジされるとき、親対照細胞の集団と比較して、増加された生存率を有する。
【0107】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較すると、１つ以上の毒性代謝副産物の低減されたレベルをもたらす。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、親対照細胞の集団と比較すると、乳酸の低減されたレベルをもたらす。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、異種タンパク質を発現するとき、同じ異種タンパク質を発現する場合の親対照細胞の集団と比較すると、乳酸の低減されたレベルを作り出す。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、参照集団、例えば、非進化型親対照によって蓄積される乳酸と比較すると、低減された乳酸蓄積を示す。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団についての低減された乳酸蓄積は、非進化型親対照培養の乳酸蓄積の約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、又は約２０％未満である。一態様では、低減された乳酸蓄積は、より少ない乳酸を培養基に放出するＨ２Ｏ２進化型細胞に起因する。
【0108】
一態様では、親対照細胞の集団と比較すると、少なくとも約１．５倍～３．５倍増加されている力価で目的のタンパク質を発現するＨ２Ｏ２進化型細胞の集団が提供される。一態様では、親対照細胞の集団と比較すると、少なくとも約１．５倍、約１．７５倍、約２．０倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．２５倍、又は約３．５倍である力価で目的のタンパク質を発現するＨ２Ｏ２進化型細胞の集団が提供される。一態様では、目的のタンパク質は、発現困難タンパク質である。一態様では、目的のタンパク質は、２本以上のポリペプチド鎖を含む。一態様では、目的のタンパク質は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。一態様では、目的のタンパク質は、モノクローナル抗体である。一態様では、目的のタンパク質は、二重特異性抗体である。
【0109】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５０ｇ／Ｌ、約０．５５ｇ／Ｌ、約０．６０ｇ／Ｌ、約０．６５ｇ／Ｌ、約０．７０ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ、約０．８０ｇ／Ｌ、約０．８５ｇ／Ｌ、約０．９０ｇ／Ｌ、約０．９５ｇ／Ｌ、且つ最大約１．０ｇ／Ｌ、約１．１ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約１．３ｇ／Ｌ、約１．４ｇ／Ｌ、若しくは約１．５ｇ／Ｌの力価で目的のタンパク質を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの力価で目的のタンパク質を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．１ｇ／Ｌの力価で目的のタンパク質を発現する。
【0110】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５０ｇ／Ｌ、約０．５５ｇ／Ｌ、約０．６０ｇ／Ｌ、約０．６５ｇ／Ｌ、約０．７０ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ、約０．８０ｇ／Ｌ、約０．８５ｇ／Ｌ、約０．９０ｇ／Ｌ、約０．９５ｇ／Ｌ、且つ最大約１．０ｇ／Ｌ、約１．１ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約１．３ｇ／Ｌ、約１．４ｇ／Ｌ若しくは約１．５ ｇ／Ｌの力価で異種抗体を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの力価で異種抗体を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．１ｇ／Ｌの力価で抗体を発現する。
【0111】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５０ｇ／Ｌ、約０．５５ｇ／Ｌ、約０．６０ｇ／Ｌ、約０．６５ｇ／Ｌ、約０．７０ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ、約０．８０ｇ／Ｌ、約０．８５ｇ／Ｌ、約０．９０ｇ／Ｌ、約０．９５ｇ／Ｌ、且つ最大約１．０ｇ／Ｌ、約１．１ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約１．３ｇ／Ｌ、約１．４ｇ／Ｌ、若しくは約１．５ｇ／Ｌの力価で二重特異性抗体を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの力価で二重特異性抗体を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．１ｇ／Ｌの力価で二重特異性抗体を発現する。一態様では、二重特異性抗体の力価は、約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、又は約１．０ｇ／Ｌである。
【0112】
一態様では、細胞が親対照細胞の集団と比較すると、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８ｆｏｌｄ、若しくは約１．９倍、且つ最大約２．０倍増加されている比生産性（ｑＰ）を有するＨ２Ｏ２進化型細胞の集団が提供される。
【0113】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、親対照と比較すると、酸化ストレスの条件下で改善された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、酸化促進性化合物の存在下で培養された後に改善された生存率を有する。本明細書で使用される場合、用語「酸化促進性化合物」は、例えば、活性酸素種を生成することによって、又は細胞抗酸化防御系の１つ以上の成分を阻害することによって、酸化ストレスを引き起こす化合物を指す。酸化促進性化合物は既知であり、これらにはメナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、メルカプトコハク酸（ＭＳ）、及び塩化コバルト（ＣｏＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、約５μΜ～約１０μΜの酸化促進性化合物、又は少なくとも約５μΜ、約６μΜ、若しくは約７μΜ、且つ最大約８μΜ、９μΜ、若しくは１０μΜの酸化促進性化合物の存在下で、約２４時間～約９６時間の増殖後に改善された生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、約５μΜ～約１０μΜの酸化促進性化合物の存在下で、少なくとも約２４時間、３６時間、若しくは４８時間、且つ最大約６０時間、約７２時間、８４時間、若しくは９６時間の増殖後に改善された生存率を有する。
【0114】
Ｆ．指向性進化
一態様では、本明細書に提供されるのは、哺乳動物宿主細胞の進化を方向付ける方法、及び指向性進化によって得られる進化型宿主細胞である。本明細書で使用される場合、「指向性進化」は、選択的圧力の条件に応答して、生物において所望の変化を選択するためのプロセスを指す。有利には、指向性進化は、所望の表現型を有する細胞の発生にゲノムワイドなアプローチを提供する。一態様では、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で、宿主細胞を進化させるための方法が提供される。
一態様では、本明細書に提供されるのは、哺乳動物宿主細胞の進化を方向付ける方法、及び指向性進化によって得られる進化型宿主細胞である。本明細書で使用される場合、「指向性進化」は、選択的圧力の条件に応答して、生物において所望の変化を選択するためのプロセスを指す。有利には、指向性進化は、所望の表現型を有する細胞の発生にゲノムワイドなアプローチを提供する。一態様では、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で、宿主細胞を進化させるための方法が提供される。
【0115】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が提供される。本明細書で使用される場合、用語「Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞」には、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞を含む宿主細胞、細胞株及び細胞培養物が含まれる。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、目的のタンパク質を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、治療用タンパク質を発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントを発現する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、二重特異性抗体を発現する。一態様では、宿主細胞は真核細胞である。一態様では、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。一態様では、宿主細胞はヒト又は齧歯類細胞である。一態様では、宿主細胞はマウス又はハムスター細胞である。哺乳動物宿主細胞としては、ｓｐ２０細胞、ネズミ骨髄腫（ＮＳＯ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６（商標）細胞、及びハイブリドーマが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【0116】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子を含む。一態様では、異種遺伝子は、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれている。一態様では、異種遺伝子は、宿主細胞ＤＮＡ中に安定して組み込まれている。一態様では、異種遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にある。一態様では、異種遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある。一態様では、異種遺伝子は、目的の治療用タンパク質をコードする。一態様では、異種遺伝子は、分泌タンパク質をコードする。一態様では、異種遺伝子は、細胞内タンパク質をコードする。一態様では、異種遺伝子は、膜貫通タンパク質をコードする。一態様では、異種遺伝子は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントをコードする。一態様では、抗体又は抗原結合抗体フラグメントは、異種遺伝子から構成的に発現される。一態様では、異種遺伝子は、二重特異性抗体をコードする。一態様では、二重特異性抗体は、異種遺伝子から構成的に発現される。
【0117】
一態様では、哺乳動物宿主細胞の進化型集団を作り出す方法が提供される。一態様では、哺乳動物宿主細胞の集団は、酸化ストレスに対する増加された耐性を有する。一態様では、本方法は、細胞の集団を、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、又は約１５ｍＭ～約２０ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で複数のラウンドで培養することと、細胞が約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下で生存できるようになるまで細胞を回復させることと、を含む。図１０に方法の概要が提供されている。簡単に言うと、本方法は下記を含む：
（ａ）細胞の集団を提供すること；
（ｂ）細胞培養基中で細胞の集団を培養すること；
（ｃ）細胞の集団を約５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、移行（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ）細胞の集団を提供すること；
（ｄ）移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な細胞培養基中に再浮遊させて、細胞が少なくとも約７０％の生存率に達するまで培養すること；
（ｅ）ステップ（ｃ）～（ｄ）を繰り返して、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、約３０分～約１時間インキュベートするときに生存することができるＨ２Ｏ２進化型細胞の集団を得ること。
（ａ）細胞の集団を提供すること；
（ｂ）細胞培養基中で細胞の集団を培養すること；
（ｃ）細胞の集団を約５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、移行（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ）細胞の集団を提供すること；
（ｄ）移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な細胞培養基中に再浮遊させて、細胞が少なくとも約７０％の生存率に達するまで培養すること；
（ｅ）ステップ（ｃ）～（ｄ）を繰り返して、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触させて、約３０分～約１時間インキュベートするときに生存することができるＨ２Ｏ２進化型細胞の集団を得ること。
【0118】
一態様では、本方法は下記を含む：
（ａ）哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞の集団を提供すること；
（ｂ）既知組成培養基中で細胞の集団を、少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の生存率まで培養すること；
（ｃ）細胞の集団を、約１０ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触させて一次移行細胞を提供すること。一態様では、細胞の集団は、約１０ｍＭ～約１５ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触される。一態様では、細胞の集団は、約１３．５ｍＭ、約１４ｍＭ、又は約１４．５ｍＭのＨ２Ｏ２と約１時間接触される；
（ｄ）一次移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な既知組成培養基中に再浮遊させて、少なくとも約６０％、約７０％、又は約８０％の生存率まで培養すること；
（ｅ）ステップ（ｃ）～（ｄ）を約３回～約５回繰り返すこと。一態様では、ステップ（ｃ）を繰り返すたびに同じ濃度のＨ２Ｏ２が使用される。一態様では、ステップ（ｃ）を繰り返すたびに使用されるＨ２Ｏ２の濃度間の差は、約０．５ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、又は約２ｍＭ未満である；
（ｆ）一次移行細胞の集団を、約１５ｍＭ～約２５ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触させて、二次移行細胞の集団を提供すること。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、約１５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触される。一態様では、ステップ（ｆ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度は、ステップ（ｃ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度より大きい。一態様では、ステップ（ｆ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度は、ステップ（ｃ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度より、少なくとも約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、若しくは５ｍＭ、且つ最大約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、若しくは１０ｍＭ大きい。一態様では、細胞の集団は、約１８ｍＭ、約１８．５ｍＭ、又は約１９ｍＭのＨ２Ｏ２と約１時間接触される；
（ｇ）二次移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な既知組成培養基中に再浮遊させ、細胞が少なくとも約９０％の生存率に達するまで培養すること；
（ｈ）二次移行細胞を、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間インキュベートして、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞の集団を得ること。一態様では、二次移行細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と約１時間インキュベートされる；並びに
（ｉ）Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な既知組成培養基中に再浮遊させ、細胞が少なくとも約９０％の生存率に達するまで培養すること。
（ａ）哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞の集団を提供すること；
（ｂ）既知組成培養基中で細胞の集団を、少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の生存率まで培養すること；
（ｃ）細胞の集団を、約１０ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触させて一次移行細胞を提供すること。一態様では、細胞の集団は、約１０ｍＭ～約１５ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触される。一態様では、細胞の集団は、約１３．５ｍＭ、約１４ｍＭ、又は約１４．５ｍＭのＨ２Ｏ２と約１時間接触される；
（ｄ）一次移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な既知組成培養基中に再浮遊させて、少なくとも約６０％、約７０％、又は約８０％の生存率まで培養すること；
（ｅ）ステップ（ｃ）～（ｄ）を約３回～約５回繰り返すこと。一態様では、ステップ（ｃ）を繰り返すたびに同じ濃度のＨ２Ｏ２が使用される。一態様では、ステップ（ｃ）を繰り返すたびに使用されるＨ２Ｏ２の濃度間の差は、約０．５ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、又は約２ｍＭ未満である；
（ｆ）一次移行細胞の集団を、約１５ｍＭ～約２５ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触させて、二次移行細胞の集団を提供すること。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型細胞の集団が、約１５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間接触される。一態様では、ステップ（ｆ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度は、ステップ（ｃ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度より大きい。一態様では、ステップ（ｆ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度は、ステップ（ｃ）で使用されるＨ２Ｏ２の濃度より、少なくとも約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、若しくは５ｍＭ、且つ最大約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、若しくは１０ｍＭ大きい。一態様では、細胞の集団は、約１８ｍＭ、約１８．５ｍＭ、又は約１９ｍＭのＨ２Ｏ２と約１時間接触される；
（ｇ）二次移行細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な既知組成培養基中に再浮遊させ、細胞が少なくとも約９０％の生存率に達するまで培養すること；
（ｈ）二次移行細胞を、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と約３０分～約２時間インキュベートして、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞の集団を得ること。一態様では、二次移行細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２と約１時間インキュベートされる；並びに
（ｉ）Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞を、Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な既知組成培養基中に再浮遊させ、細胞が少なくとも約９０％の生存率に達するまで培養すること。
【0119】
一態様では、細胞の集団を提供することは、浮遊培養適応化宿主細胞を提供することを含む。一態様では、浮遊培養適応化ＣＨＯ細胞が提供される。一態様では、浮遊培養適応化ＣＨＯ－Ｋ１細胞が提供される。
【0120】
一態様では、（ｂ）における細胞の集団を培養することは、細胞を既知組成細胞培養基中で浮遊させて培養することを含む。一態様では、既知組成細胞培養基は、グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、Ｌ－グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、約２ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、少なくとも約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、若しくは約５ｍＭ、且つ最大約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、若しくは約１０ｍＭのＬ－グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、若しくは約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、又は約１０ｍＭのＬ－グルタミンで補充されている。一態様では、（ｂ）における細胞の集団は、少なくとも約７０％、約８０％、又は約９０％の生存率まで培養される。
【0121】
一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、又は約１５～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、約１０ｍＭ、約１０．５ｍＭ、約１１ｍＭ、約１１．５ｍＭ、約１２ｍＭ、約１２．５ｍＭ、約１３ｍＭ、約１３．５ｍＭ、約１４ｍＭ、約１４．５ｍＭ、約１５ｍＭ、約１５．５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１６．５ｍＭ、約１７ｍＭ、約１７．５ｍＭ、約１８ｍＭ、約１８．５ｍＭ、約１９ｍＭ、若しくは約１９．５ｍＭ、且つ最大約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における接触させることは、細胞の集団をＨ２Ｏ２と少なくとも約３０分間、約４５分間、若しくは約６０分間、且つ最大約９０分間、若しくは約１２０分間インキュベートすることを含む。
【0122】
一態様では、（ｄ）における細胞の集団を培養することは、細胞を既知組成細胞培養基中で浮遊させて培養することを含む。一態様では、既知組成細胞培養基は、グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、Ｌ－グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、約２ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、少なくとも約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、若しくは約５ｍＭ、且つ最大約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、若しくは約１０ｍＭのＬ－グルタミンで補充されている。一態様では、既知組成細胞培養基は、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、若しくは約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、又は約１０ｍＭのＬ－グルタミンで補充されている。一態様では、（ｄ）における細胞の集団は、少なくとも約７０％、約８０％、又は約９０％の生存率まで培養される。
【0123】
一態様では、ステップ（ｃ）～（ｄ）は、少なくとも約３、４、又は５回繰り返される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が繰り返されるたびに同じ量のＨ２Ｏ２と同じ時間接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が繰り返される１回以上で異なる量のＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が繰り返される１回以上の異なる回数でＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が実施される前の回数の１回以上と比較して、ステップ（ｃ）が実施される最終回でより高い濃度のＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が実施される初回で、約１０ｍＭ～約１５ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が実施される初回で、約１０ｍＭ、約１０．５ｍＭ、約１１ｍＭ、約１１．５ｍＭ、約１２ｍＭ、約１２．５ｍＭ、約１３ｍＭ、約１３．５ｍＭ、約１４ｍＭ、約１４．５ｍＭ、又は約１５ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が実施される最終回で、約１５ｍＭ～約２０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、（ｃ）における細胞の集団は、ステップ（ｃ）が実施される最終回で、約１５ｍＭ、約１５．５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１６．５ｍＭ、約１７ｍＭ、約１７．５ｍＭ、約１８、約１８．５ｍＭ、約１９、約１９．５ ｍＭ、又は約２０ｍＭまでのＨ２Ｏ２と接触される。
【0124】
一態様では、ステップ（ｅ）後に得られる進化型細胞の集団は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２でチャレンジされるとき、少なくとも約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、若しくは１００、且つ最大約１２０の細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）後に生存することができる。一態様では、進化型細胞の集団は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２でチャレンジされるとき、少なくとも約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、若しくは１００、且つ最大約１２０の細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）後に生存することができる。一態様では、進化型細胞の集団は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２でチャレンジされるとき、少なくとも約２０、約３５、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、若しくは１００、且つ最大約１２０の細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）後に生存することができる。一態様では、細胞培養基は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ～約８ｍＭ、又は約４ｍＭ～約６ｍＭのＬ－グルタミンを含む。
【0125】
一態様では、宿主細胞は、目的の異種タンパク質を発現するために、安定してトランスフェクトされるか、又は別の方法で操作される。一態様では、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で、改善された生存率を有する宿主細胞が提供される。一態様では、宿主細胞は、約２ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２、又は約３５ｍＭ～約４０ｍＭのＨ２Ｏ２に少なくとも３０分間、４５分間、若しくは１時間、且つ最大約１．５時間、若しくは約２時間曝露後約１～約１５日後に、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％の生存率の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、少なくとも約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、且つ最大約４０ｍＭ、４５ｍＭ、若しくは５０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、又は４０ｍＭのＨ２Ｏ２と接触される。
【0126】
一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約１０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約１５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約２０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約２５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約３０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約３５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約４０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約４５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約５０％の生存率を有する。
【0127】
一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約１０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約１５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約２０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約２５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約３０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約３５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約４０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約４５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３０ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約５０％の生存率を有する。
【0128】
一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約１０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約１５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約２０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約２５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約３０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約３５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約４０％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約４５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭに約３０分間～約２時間曝露後、約１日～約１５日後に少なくとも約５０％の生存率を有する。
【0129】
一態様では、本明細書に記載される方法によって作り出される進化型宿主細胞が提供される。一態様では、目的のタンパク質をコードする異種遺伝子で安定してトランスフェクトされたＨ２Ｏ２進化型宿主細胞が提供される。一態様では、宿主細胞は、トランスフェクション後、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、又は約１４日以内で、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、又は８５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、トランスフェクション後、少なくとも約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、又は約１４日で約５０％～約８５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、トランスフェクション後、約７日～約１４日以内で約５０％～約８５％の生存率を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、トランスフェクション後、少なくとも約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、又は約１４日で約７０％～約８５％の生存率を有する。一態様では、宿主細胞は、トランスフェクション後、約９日～約１２日以内で約７０％～約８５％の生存率を有する。
【0130】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、トランスフェクション後、少なくとも約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、又は約１４日で少なくとも約０．６×１０６細胞／ｍｌ、約０．７×１０６細胞／ｍｌ、約０．８×１０６細胞／ｍｌ、約０．９×１０６細胞／ｍｌ、約１．０×１０６細胞／ｍｌ、約１．１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．３×１０６細胞／ｍｌ、約１．４×１０６細胞／ｍｌ、約１．５×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．７×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約１．９５×１０６細胞／ｍｌ、又は約２．０×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度（ＶＣＤ）を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、トランスフェクション後、少なくとも約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、又は約１４日で約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約２．０×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度（ＶＣＤ）を有する。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、トランスフェクション後、少なくとも約９日、１０日、１１日、約１２日、約１３日、又は約１４日で約１．０×１０６細胞／ｍｌ～約１．６×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度（ＶＣＤ）を有する。
【0131】
Ｇ．細胞培養
一態様では、目的のタンパク質を産生するための方法が提供され、これは本明細書に記載されるようなＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を培養することと、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞を採取することと、目的のタンパク質を細胞又は細胞培養基から生成することと、を含む。
一態様では、目的のタンパク質を産生するための方法が提供され、これは本明細書に記載されるようなＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を培養することと、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞を採取することと、目的のタンパク質を細胞又は細胞培養基から生成することと、を含む。
【0132】
一態様では、宿主細胞を培養する方法が提供される。一態様では、進化型宿主細胞を培養する方法が提供される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞を培養する方法が提供される。一態様では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一態様では、宿主細胞は、Ｈ２Ｏ２進化型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一態様では、宿主細胞は、組換え宿主細胞である。一態様では、宿主細胞は、目的のタンパク質を組換え的に発現するように操作されている。一態様では、宿主細胞は、目的のタンパク質を組換え的に発現するように操作されているＨ２Ｏ２進化型宿主細胞である。一態様では、宿主細胞は、目的のタンパク質を組換え的に発現するように操作されているＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ細胞である。
【0133】
一態様では、宿主細胞は、目的のタンパク質を可能にする条件下で培養される。一態様では、宿主細胞は、異種タンパク質の発現を可能にする条件下で培養される。一態様では、宿主細胞は、異種抗体又は抗原結合抗体フラグメントの発現を可能にする条件下で培養される。一態様では、宿主細胞は、二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で培養される。
【0134】
一態様では、進化型宿主細胞は、非進化型対照と比較すると、細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるとき、改善された性能を実証する。一態様では、進化型宿主細胞は、非進化型対照と比較すると、細胞培養中で抗体又は抗原結合抗体フラグメントを発現させるとき、改善された性能を実証する。一態様では、進化型宿主細胞は、非進化型対照と比較すると、細胞培養中で発現困難タンパク質を発現させるとき、改善された性能を実証する。一態様では、進化型宿主細胞は、非進化型対照と比較すると、細胞培養中で二重特異性抗体を発現させるとき、改善された性能を実証する。一態様では、宿主細胞は、非進化型対照と比較すると、細胞培養中で改善された性能を実証するＨ２Ｏ２進化型宿主細胞である。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、非進化型対照と比較すると、酸化ストレスの条件下で改善された性能を実証する。
【0135】
一態様では、進化型宿主細胞は、目的のタンパク質を産生するために培養される。哺乳動物細胞に好適な培養条件は当該技術分野において既知であり、例えば、バッチ培養モード、流加培養モード、連続培養モード、半連続培養モード、及び灌流培養モードを挙げることができる。一態様では、宿主細胞は、浮遊状態で培養される。宿主細胞は、例えば、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、又は撹拌タンクバイオリアクターを含む任意の好適なバイオリアクター中で培養することができる。宿主細胞は、マイクロキャリアを伴って、又は伴わずに培養することができる。
【0136】
進化型宿主細胞は、個々のフラスコ及び振盪フラスコ、又はウェーブバッグから１リットルのバイオリアクターまで最大で大規模な工業用バイオリアクターにいたるまでのあらゆるスケールの培養で培養することができる。一態様では、進化型宿主細胞は、小規模培養、例えば、約１２５ｍｌ～５００ｍｌで培養される。一態様では、進化型宿主細胞は、大規模プロセス、例えば、約１００リットル～約２０，０００リットル以上の容量で培養される。例えば、治療用タンパク質の製造のための大規模又は商業用規模の細胞培養は、数日間又は数週間維持され得る。この期間、培養は、培養の過程で消費される栄養素及びアミノ酸などの成分を含有する濃縮フィード培地で補充され得る。一態様では、培地は、流加培養プロセスによる細胞培養中に一定間隔で補充される。
【0137】
細胞を細胞培養基から分離するための方法は既知であり、これらには限定されないが、濾過、細胞のカプセル化、マイクロキャリアへの細胞接着、細胞沈降又は遠心分離などの方法が挙げられる。一態様では、目的のタンパク質は、細胞又は細胞培養基から生成される。タンパク質生成戦略は既知である。例えば、抗体、抗体結合フラグメント及び二重特異性抗体などの可溶性タンパク質は、市販の濃縮フィルターを使用して精製され、その後親和性樹脂、イオン交換樹脂、クロマトグラフィーカラム、及びそれらの組合せなどの既知の方法を使用して、親和性精製され得る。
【0138】
Ｈ．目的のタンパク質
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、目的のタンパク質を産生するように操作される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、目的のタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる。本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチドが細胞中に導入される任意のプロセスを指す。Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、染色体、非染色体、及び合成核酸ベクターが挙げられるが、これらに限定されない任意の好適な発現ベクターでトランスフェクトすることができる。発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、並びにウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、ベクターは、抗体又は二重特異性抗体の１本以上のポリペプチド鎖をコードする１つ以上の遺伝子を含む。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、安定してトランスフェクトされる。
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、目的のタンパク質を産生するように操作される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、目的のタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる。本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチドが細胞中に導入される任意のプロセスを指す。Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、染色体、非染色体、及び合成核酸ベクターが挙げられるが、これらに限定されない任意の好適な発現ベクターでトランスフェクトすることができる。発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、並びにウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、ベクターは、抗体又は二重特異性抗体の１本以上のポリペプチド鎖をコードする１つ以上の遺伝子を含む。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、安定してトランスフェクトされる。
【0139】
一態様では、安定的トランスフェクションには、エレクトロポレーション、それに続くメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）選択が含まれる。
【0140】
一態様では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。一態様では、目的のタンパク質は、細胞内タンパク質である。一態様では、目的のタンパク質は、分泌型である。一態様では、目的のタンパク質は、膜貫通タンパク質である。一態様では、治療用タンパク質は、例えば、約１ｋＤａ～約１０ｋＤａのサイズを有するペプチド治療薬である。一態様では、目的のタンパク質は、例えば、約１０ｋＤａ超、例えば、約１０ｋＤａ～約２５０ｋＤａのサイズを有する高分子治療薬である。一態様では、目的のタンパク質は、１本のポリペプチド鎖を含む。一態様では、目的のタンパク質は、２本以上のポリペプチド鎖を含む。一態様では、目的のタンパク質は、「発現困難」（ＤＴＥ）である。治療用タンパク質の例としては、抗体、酵素、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、増殖因子、Ｆｃ融合タンパク質、及び受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0141】
一態様では、目的のタンパク質は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、若しくはテトラボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、二重特異性抗体である。
【0142】
多種多様な二重特異性抗体フォーマットが既知であり、Ｆｃ領域を含むか、又は含まない二重特異性抗体が挙げられる。二重特異性抗体は、対照又は非対照のアーキテクチャを含み得る。一態様では、二価の二重特異性抗体は、各抗原に対する１つの結合部位を含む。一態様では、二重特異性抗体は三価の二重特異性抗体であり、各抗原に対する２つの結合部位を含む。一態様では、二重特異性抗体は、第１の抗原に対する１つの結合部位、及び第２の他の抗原に対する２つ又は３つの結合部位を有する。（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７） “Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”ＭＡｂｓ．９（２）：１８２－２１２を参照されたい）。
【0143】
二重特異性抗体を作り出すために必要な鎖の数は、様々であり得る。一態様では、二重特異性抗体は、４本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性ＩｇＧである。一態様では、二重特異性抗体は、より少ない数の鎖、例えば、３本、２本、又は１本のポリペプチド鎖を含む。
【0144】
一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、抗体の産生に使用され得る。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、モノクローナル抗体又は抗原結合抗体フラグメントの産生に使用される。一態様では、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、二重特異性抗体の産生に使用される。一態様では、抗体は、治療用抗体である。
【0145】
一態様では、目的のタンパク質が提供される。一態様では、目的のタンパク質は、本明細書に記載されるＨ２Ｏ２進化型宿主細胞によって発現される。一態様では、本明細書に記載されるＨ２Ｏ２進化型宿主細胞によって発現される目的のタンパク質を含む医薬組成物が提供される。一態様では、医薬組成物は、治療有効量の目的のタンパク質と薬学的に許容される担体と、を含む。一態様では、目的のタンパク質は、抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。一態様では、目的のタンパク質は、二重特異性抗体である。
【0146】
Ｉ．参照による組込み
本明細書で引用される全ての参考文献（例えば、特許、特許出願、論文、教科書、及び同類のもの）、及びこれらで引用されている参考文献は、これらが既に引用されていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で引用される全ての参考文献（例えば、特許、特許出願、論文、教科書、及び同類のもの）、及びこれらで引用されている参考文献は、これらが既に引用されていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0147】
細胞株を製造することによる二重特異性抗体の産生は、多くの場合、低い生産収率によって妨害される（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２ Ｐｔ Ａ）：９５－１０６）。場合によっては、低い生産収率は、細胞ストレスと関連している。例えば、細胞レドックス状態は、小胞体（ＥＲ）とミトコンドリアとの間の複雑な相互採用に起因し得る活性酸素種（ＲＯＳ）の生成のために変化し得る（Ｔｕｒｒｅｎｓ ＪＦ．（２００３）“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ”．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５２（Ｐｔ ２）：３３５－４４；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｐｅａｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１０（７）：２０１３－２４；Ｔｕ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ（２００４）“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６４（３）：３４１－６）。バイオリアクター条件における変動は、溶存酸素濃度における変化（Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）“Ｏｎｌｉｎｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｄｏｘ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１７（５）：１３２９－１３３６；Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ．１３３：１２－２０）及び細胞培養基成分の変化（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｂ．（２０１４）“Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ：ａｖｏｉｄｉｎｇ ｐｉｔｆａｌｌｓ”．Ｂｉｏｍｅｄ Ｊ．３７（３）：９９－１０５；Ｋｅｌｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ａｌｔｅｒｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＯＳ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＯＳ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”．Ｓｐｒｉｎｇｅｒｐｌｕｓ．４：２６９；Ｓｃｈｎｅｌｌｂａｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）“Ｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１６（６）：１５３７－５５）をもたらし得る。ＲＯＳの蓄積は、細胞を損傷する場合があり、不良な細胞性能及び抗体力価の低下をもたらす。本明細書に記載されるのは、２つの産業的に関連する二重特異性抗体（ＢｉｓＡｂ）の発現のために生成され、評価された新規の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）進化型宿主細胞である。
【0148】
実施例１．過酸化水素を使用するＣＨＯ宿主細胞の進化
連続的なＨ２Ｏ２曝露の複数のラウンド、その後の宿主細胞が３７ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下での生存を実証するまでの回復を通しての酸化ストレスに対する耐性を改善するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を進化させた（図１Ａ）。具体的には、浮遊培養で増殖するように適応させたＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ対照）を、６ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で補充した既知組成（ＣＤ）ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で復活させ、３０ｍｌの培地容量中で０．２×１０６細胞／ｍｌにて３回継代させた。細胞が９９％の生存率に達したとき、それらを１４ｍＭのＨ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）と共に１時間インキュベートし、その後１３０ｇで５分間遠心分離し、６ｍＭ Ｌ－グルタミンで補充した３０ｍｌの新鮮なＣＤ ＣＨＯ中に再浮遊させた。ＣＨＯ細胞を、細胞が７０％の生存率に達するまでそのまま回復させた。このプロセスを更に３回繰り返して、１４ｍＭのＨ２Ｏ２に合計で４回曝露させ、細胞が７０％の生存率に達するまで培地を定期的に補充しながら１０～２０日の期間にわたって細胞を徐々に回復させた。次いで、細胞が９０％の生存率に達するまで、細胞を上記の方法に従って、１ラウンドの１８．５ｍＭのＨ２Ｏ２処理にかけた。最終的に、細胞を３７ｍＭのＨ２Ｏ２に１時間曝露させて、その後１３０ｇで５分間遠心分離し、６ｍＭのＬ－グルタミンで補充した３０ｍｌの新鮮なＣＤ ＣＨＯ中で再浮遊させて、＞９０％の生存率になるまでインキュベートした。このインキュベーションの期間、以下に詳述するように、１２日目に１回交換し、２１日目に細胞を新鮮な培地で０．３×１０６細胞／ｍｌまで希釈し、回復を補助した。
連続的なＨ２Ｏ２曝露の複数のラウンド、その後の宿主細胞が３７ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下での生存を実証するまでの回復を通しての酸化ストレスに対する耐性を改善するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を進化させた（図１Ａ）。具体的には、浮遊培養で増殖するように適応させたＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ対照）を、６ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で補充した既知組成（ＣＤ）ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で復活させ、３０ｍｌの培地容量中で０．２×１０６細胞／ｍｌにて３回継代させた。細胞が９９％の生存率に達したとき、それらを１４ｍＭのＨ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）と共に１時間インキュベートし、その後１３０ｇで５分間遠心分離し、６ｍＭ Ｌ－グルタミンで補充した３０ｍｌの新鮮なＣＤ ＣＨＯ中に再浮遊させた。ＣＨＯ細胞を、細胞が７０％の生存率に達するまでそのまま回復させた。このプロセスを更に３回繰り返して、１４ｍＭのＨ２Ｏ２に合計で４回曝露させ、細胞が７０％の生存率に達するまで培地を定期的に補充しながら１０～２０日の期間にわたって細胞を徐々に回復させた。次いで、細胞が９０％の生存率に達するまで、細胞を上記の方法に従って、１ラウンドの１８．５ｍＭのＨ２Ｏ２処理にかけた。最終的に、細胞を３７ｍＭのＨ２Ｏ２に１時間曝露させて、その後１３０ｇで５分間遠心分離し、６ｍＭのＬ－グルタミンで補充した３０ｍｌの新鮮なＣＤ ＣＨＯ中で再浮遊させて、＞９０％の生存率になるまでインキュベートした。このインキュベーションの期間、以下に詳述するように、１２日目に１回交換し、２１日目に細胞を新鮮な培地で０．３×１０６細胞／ｍｌまで希釈し、回復を補助した。
【0149】
Ｈ２Ｏ２処理によって誘導される進化的変化が維持されることを確実にするために、細胞を９０の細胞集団倍加回数（ＰＤＬ）まで継代させ、３７ｍＭのＨ２Ｏ２による再チャレンジに供した。Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、Ｈ２Ｏ２で同様にチャレンジされたＣＨＯ対照細胞と比較して、改善された生存率（約５０％の生存率）を実証し（図１Ｂ）、Ｈ２Ｏ２の高濃度に対する長期の遺伝的耐性を示す。
【0150】
Ｈ２Ｏ２処理ＣＨＯ細胞を冷凍保存した。全ての実験は、この凍結保存された細胞ストックを使用して実施した。
【0151】
実施例２．レドックス化学的ストレス因子の存在下で増殖させた場合のＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ細胞の生存
Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞の酸化ストレスに抵抗する能力を確認するために、バイオリアクターストレス因子を模倣するように選択されたいくつかの酸化促進性化合物：メナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、メルカプトコハク酸（ＭＳ）、及び塩化コバルト（ＣｏＣｌ）に応答する生存性について、細胞を評価した。これらの化学物質は、ＧＳＨ生合成及び代謝回転（ＢＳＯ及びＭＳ）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ， ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｔｏｍａｃｈ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ”．Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．７（２）：１１１－７；Ｄｕｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｓｅｒｖｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ”．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１８３２（１２）：２０２７－３４）、細胞内ＲＯＳ生成（ＭＳＢ）（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）“Ａｓｃｏｒｂａｔｅ／ｍｅｎａｄｉｏｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｋｉｌｌｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｎｏｒｍａｌ ｏｒ ｍｕｔａｔｅｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｃｒ－Ａｂｌ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｔｕｄｙ”．Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ．２９（５）：８９１－９００）及び低酸素誘導ＲＯＳ産生（ＣｏＣｌ）（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ｃｏｂａｌｔ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ＡＰ－１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．６４（６）：６４６－５３）に関与するものなどの細胞内レドックス経路の多様なサブセットに影響を及ぼす。
Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞の酸化ストレスに抵抗する能力を確認するために、バイオリアクターストレス因子を模倣するように選択されたいくつかの酸化促進性化合物：メナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、メルカプトコハク酸（ＭＳ）、及び塩化コバルト（ＣｏＣｌ）に応答する生存性について、細胞を評価した。これらの化学物質は、ＧＳＨ生合成及び代謝回転（ＢＳＯ及びＭＳ）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ， ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｔｏｍａｃｈ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ”．Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．７（２）：１１１－７；Ｄｕｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｓｅｒｖｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ”．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１８３２（１２）：２０２７－３４）、細胞内ＲＯＳ生成（ＭＳＢ）（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）“Ａｓｃｏｒｂａｔｅ／ｍｅｎａｄｉｏｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｋｉｌｌｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｎｏｒｍａｌ ｏｒ ｍｕｔａｔｅｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｃｒ－Ａｂｌ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｔｕｄｙ”．Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ．２９（５）：８９１－９００）及び低酸素誘導ＲＯＳ産生（ＣｏＣｌ）（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ｃｏｂａｌｔ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ＡＰ－１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．６４（６）：６４６－５３）に関与するものなどの細胞内レドックス経路の多様なサブセットに影響を及ぼす。
【0152】
化学ストレスアッセイを製造元の指示（ＣｈｅｍＳｔｒｅｓｓ（登録商標），Ｖａｌｉｔａｃｅｌｌ Ｌｔｄ，Ｉｒｅｌａｎｄ）に従って実施した。簡単に言うと、ＣＨＯ又はＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を、Ｖａｌｉｔａｃｅｌｌ ＣｈｅｍＳｔｒｅｓｓプレート（ＣｈｅｍＳｔｒｅｓｓ（登録商標），Ｖａｌｉｔａｃｅｌｌ Ｌｔｄ，Ｉｒｅｌａｎｄ）に６ｍＭのＬ－グルタミンで補充した９０μｌの独自の培地中１８，０００細胞／ウェルで播種した。対照のウェルを、培地単独でインキュベートした。プレートを、静的インキュベーター内で３６．５℃、６％ＣＯ２にて、７２時間インキュベートした。その後、１０μｌの未希釈ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）を全てのウェルに添加し、その後プレートを２０秒間混合して、３６．５℃、６％ＣＯ２で更に３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ，Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、事前設定されたプロトコル（励起５６０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）を用いて分析した。データを、ＶａｌｉｔａＡＰＰソフトウェア（Ｖａｌｉｔａｃｅｌｌ Ｌｔｄ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して分析した。
【0153】
Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、ＣＨＯ対照細胞と比較して、ＭＳＢ、ＢＳＯ、ＭＳ及びＣｏＣｌの存在下で、７２時間の増殖後に有意に改善された生存率を実証し（図２Ａ～２Ｄ）、Ｈ２Ｏ２進化型細胞が多様なレドックスストレス因子に対して、耐性を生じたことを示している。
【0154】
実施例３．Ｈ２Ｏ２進化型細胞の抗酸化能
Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞のいくつかのレドックスストレス因子の存在下で生存するための能力は、Ｈ２Ｏ２誘導進化が細胞内の抗酸化防御経路を増強し得ることを示差している。したがって、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞及びＣＨＯ対照細胞を、ＧＳＨ合成（ＧＳＳ及びＧＣＬＭ）、Ｈ２Ｏ２排除（カタラーゼ）及び細胞システインインポート（ｘＣＴ）に関与する遺伝子を含む抗酸化防御遺伝子のパネルにおけるグルタチオン（ＧＳＨ）含有量及び転写変化に基づいて評価した。
Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞のいくつかのレドックスストレス因子の存在下で生存するための能力は、Ｈ２Ｏ２誘導進化が細胞内の抗酸化防御経路を増強し得ることを示差している。したがって、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞及びＣＨＯ対照細胞を、ＧＳＨ合成（ＧＳＳ及びＧＣＬＭ）、Ｈ２Ｏ２排除（カタラーゼ）及び細胞システインインポート（ｘＣＴ）に関与する遺伝子を含む抗酸化防御遺伝子のパネルにおけるグルタチオン（ＧＳＨ）含有量及び転写変化に基づいて評価した。
【0155】
細胞内総グルタチオン及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）における相対的変化を、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ－Ｇｌｏ（商標）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＫ）を使用して、製造元の指示に従って決定した。簡単に言うと、培養中のＣＨＯ対照又はＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を採取し、６ｍＭのＬ－グルタミン（非トランスフェクト宿主）又は５０μＭのＭＳＸ（トランスフェクトされたプール）で補充した新鮮な独自の培地中に再浮遊させた。細胞を、白色９６ウェルルミノメーター適応型プレート内に１０，０００細胞／ウェルで播種した（バックグラウンドルミネッセンス検出のために、培地だけのウェルを使用した）。２５μｌの容量の総グルタチオン溶解試薬又は酸化型グルタチオン溶解試薬のいずれかを、細胞を含むウェルに添加し、プレート振盪器上、室温で５分間インキュベートした。５０μｌの新たに調製したルシフェリン生成試薬を全てのウェルに添加し、続いて室温で３０分間インキュベートした。最終的に、１００μｌのルシフェリン検出試薬を各ウェルに添加し、１５分間インキュベートした。ルミネッセンスを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートルミノメーターを使用して測定した。分析を、製造元の指示に従って実施した。
【0156】
ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ単離キットを使用して、製造元の指示に従って、ＣＨＯ対照又はＨ２Ｏ２進化型宿主細胞（非トランスフェクト及びトランスフェクトされたものの両方）から抽出した。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）を使用して、製造元の指示に従って、３μｇのＲＮＡを逆転写することによって生成した。ｑＰＣＲプローブを、表１に詳述する。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）で、ＴａｑＭａｎアッセイシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）を使用して、ｑＰＣＲを実施した。相対的遺伝子発現を、デルタＣｔ法を使用して計算した。
【0157】
【表1】
【0158】
初期継代Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、ＣＨＯ対照細胞に対して、有意に上昇した総グルタチオン含有量を有することを示したが、総グルタチオン対酸化型ＧＳＨの比（ＧＳＨ：ＧＳＳＧ）は変化しないままであった（図３Ａ及び３Ｂ）。Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、ＧＳＳ及びＧＣＬＭの著しく上昇した発現を示し（図３Ｃ及び３Ｄ）、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞の上昇した総グルタチオン含有量と一致する観察であった。更に、Ｈ２Ｏ２進化型宿主は、カタラーゼ（図３Ｅ）及びｘＣＴ（図３Ｆ）の著しく上昇した発現を実証し、抗酸化能における更なる改善を示している。
【0159】
酸化ストレスに抵抗するこの改善された能力と一致して、Ｈ２Ｏ２進化型宿主はまた、多数のメカニズムを通して、ＲＯＳと闘ういくつかの中心的抗酸化防御遺伝子を著しくアップレギュレートすることが見出された（図３Ｃ～３Ｆ）。これらの遺伝子としては、Ｈ２Ｏ２スカベンジャー、カタラーゼ、これと共にＧＳＨ産生及び活性化と関連するいくつかの酵素（ＧＣＬＭ、ＧＳＳ及びｘＣＴ）が挙げられる。ＧＳＨ合成に関与する遺伝子におけるアップレギュレーションは、Ｈ２Ｏ２進化型宿主における総グルタチオン含有量のレベルの顕著な増加と相関した（図３Ａ）。Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞及びＣＨＯ対照細胞の両方は、非発現状態にあるとき、保存されたＧＳＨ：ＧＳＳＧ比を通してレドックス恒常性を維持することができ、これは恐らく酸化ストレス因子の不在によるものである。
【0160】
実施例４．二重特異性抗体を発現するＨ２Ｏ２進化型宿主細胞は、酸化ストレスに対する耐性を維持する
発現プールを、広く使用されている酸化促進剤であるメナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）の存在下での生存率について比較した。簡単に言うと、ＣＨＯ対照又はＢｉｓＡｂ Ａ又若しくはＢｉｓＡｂ Ｂを発現するＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を、５０μＭのＭＳＸで補充した３０ｍｌの独自の培地に０．３×１０６細胞／ｍｌで播種した。合計で６μＭのメナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）又は水を、それぞれ試験培養及び対照培養に添加した。ＭＳＢ又は水の添加後２４、４８及び７２時間で、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ Ｃｅｌｌ生存率アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、細胞を生存率及び生細胞密度（ＶＣＤ）について評価した。
発現プールを、広く使用されている酸化促進剤であるメナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）の存在下での生存率について比較した。簡単に言うと、ＣＨＯ対照又はＢｉｓＡｂ Ａ又若しくはＢｉｓＡｂ Ｂを発現するＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を、５０μＭのＭＳＸで補充した３０ｍｌの独自の培地に０．３×１０６細胞／ｍｌで播種した。合計で６μＭのメナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）又は水を、それぞれ試験培養及び対照培養に添加した。ＭＳＢ又は水の添加後２４、４８及び７２時間で、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ Ｃｅｌｌ生存率アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、細胞を生存率及び生細胞密度（ＶＣＤ）について評価した。
【0161】
ＭＳＢで処理したＨ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢは、Ｈ２Ｏで処理した対照と比較して、生存率を保持した。これとは対照的に、ＭＳＢで処理したＣＨＯ対照宿主Ａ及びＢは、処理後３日目でそれぞれ６５％及び８２％までの生存率における減少を示し（図４Ａ及び４Ｂ）、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞のＢｉｓＡｂの改善された発現を支援するための能力が、増強された抗酸化能に結び付き得ることを示している。
【0162】
実施例５．Ｈ２Ｏ２進化型二重特異性抗体発現細胞は、上昇した抗酸化能を維持する
Ｈ２Ｏ２進化型細胞が二重特異性抗体を発現するとき、酸化ストレスに対する耐性を維持するかどうかを調べるために、実施例１に記載されるように生成したＣＨＯ対照宿主細胞及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を、２つの産業的に関連する二重特異性抗体－二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）についての安定的発現プラスミドで安定的にトランスフェクトした。ＢｉｓＡｂ Ａ及びＢｉｓＡｂ Ｂ発現プラスミドを、一過性発現プラスミドから改変し（Ｄａｒａｍｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）“Ａ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄｉｎｇ ＣＨＯ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ：ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＥＢＮＡ－１ ａｎｄ ＧＳ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３０（１）：１３２－４１；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｒ ｔｈｅｉｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”．Ｇｅｎｅ．１８７（１）：９－１８）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）選択性マーカー（Ｌｏｎｚａ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）に加えて、ＢｉｓＡｂ重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の両方をコードするようにした。プラスミドを、標準的な制限酵素消化とライゲーションの方法を使用して構築し、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ及び試薬（Ｌｏｎｚａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してトランスフェクトした。
Ｈ２Ｏ２進化型細胞が二重特異性抗体を発現するとき、酸化ストレスに対する耐性を維持するかどうかを調べるために、実施例１に記載されるように生成したＣＨＯ対照宿主細胞及びＨ２Ｏ２進化型宿主細胞を、２つの産業的に関連する二重特異性抗体－二重特異性抗体Ａ（ＢｉｓＡｂ Ａ）及び二重特異性抗体Ｂ（ＢｉｓＡｂ Ｂ）についての安定的発現プラスミドで安定的にトランスフェクトした。ＢｉｓＡｂ Ａ及びＢｉｓＡｂ Ｂ発現プラスミドを、一過性発現プラスミドから改変し（Ｄａｒａｍｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）“Ａ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄｉｎｇ ＣＨＯ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ：ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＥＢＮＡ－１ ａｎｄ ＧＳ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３０（１）：１３２－４１；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｒ ｔｈｅｉｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”．Ｇｅｎｅ．１８７（１）：９－１８）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）選択性マーカー（Ｌｏｎｚａ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）に加えて、ＢｉｓＡｂ重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の両方をコードするようにした。プラスミドを、標準的な制限酵素消化とライゲーションの方法を使用して構築し、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ及び試薬（Ｌｏｎｚａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してトランスフェクトした。
【0163】
トランスフェクトした細胞を、５０μＭのメチオニンスルホキサミン（ＭＳＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）で補充したＣＤ ＣＨＯ又は独自の培地中、３６．５℃、６％ＣＯ２での加湿インキュベーター内で、必要に応じて１４０ｒｐｍで撹拌しながら維持し、安定なプールを得た（得られたトランスフェクトした細胞集団を次のように表示する：Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａ又はＢ及びＣＨＯ対照宿主Ａ又はＢ）。トランスフェクション回復中に、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ Ｃｅｌｌ生存率アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用してプールを定期的にカウントし、独自の培地を使用する１２日間の流加培養プロセスにおけるＢｉｓＡｂ Ａ及びＢｉｓＡｂ Ｂの産生で使用するために増殖させた。培地を、培養期間にわたって添加される独自の栄養素供給物のボーラス添加によって補充した。
【0164】
非トランスフェクトＨ２Ｏ２進化型宿主細胞で観察された上昇した抗酸化表現型が、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢにおいて維持されるかどうかを調べるために、ＧＳＨ含有量及び抗酸化防御遺伝子発現の両方を評価した。Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、ＢｉｓＡｂの発現によって誘導されるものなどのストレスの多い条件下に置かれるとき、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢの両方は、ＣＨＯ対照細胞と比較すると、総ＧＳＨ含有量における著しいアップレギュレーション並びに総グルタチオン：ＧＳＳＧの改善された比を示した（図５Ａ及び５Ｂ；６Ａ及び６Ｂ）が、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ｂでは、増加はあまり明確ではなかった。
【0165】
次いで、Ｈ２Ｏ２進化型宿主プールを、いくつかの抗酸化防御遺伝子の発現について評価した。Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａは、ＣＨＯ対照宿主Ａと比較して、ＧＳＳ、ＧＣＬＭ、カタラーゼ及びｘＣＴ、並びにグルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰｘ１）における有意な上昇を示した（図５Ｃ～５Ｇ）。Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ｂもまた、ＧＳＳ、ＧＣＬＭ及びカタラーゼにおける有意な上昇を示した（図６Ｃ～６Ｅ）。しかしながら、ｘＣＴ及びＧＰｘ１は、ＣＨＯ対照宿主Ｂに対して変化しないままであった（図６Ｆ及び６Ｇ）。
【0166】
まとめると、データは、ＣＨＯ宿主のＨ２Ｏ２指向性進化が、宿主を多数の酸化ストレス源に耐えることができるようにさせる多数の抗酸化防御遺伝子の多様な発現をもたらしたことを示唆している。
【0167】
Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は、非発現状態及び発現状態の両方で著しく上昇したカタラーゼ発現を示した（図３Ｅ、５Ｅ及び６Ｅ）。カタラーゼ活性は測定されなかったが、以前の研究は指向性宿主細胞進化を使用して増強され得ることを実証しており（Ｓｐｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８８）“Ｓｔａｂｌｅ Ｈ２Ｏ２－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｃａｔａｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ．１１４（１）：１１４－２４）、酸化ストレスを防止するために、過剰なＨ２Ｏ２産生の排除を容易にすることができる。
【0168】
まとめると、これらのデータは、非トランスフェクトＨ２Ｏ２進化型宿主において、観察された抗酸化能における改善（図３Ａ～３Ｆ）が両方の二重特異性抗体の発現時に維持されること、Ｈ２Ｏ２進化型宿主が過剰なＨ２Ｏ２産生と闘う耐性がより整っていること、及びＨ２Ｏ２によって誘発された進化が、上昇された抗酸化物質の発現を通して細胞性能を改善することができることを示している。
【0169】
実施例６．Ｈ２Ｏ２進化型宿主は、ＣＨＯ対照細胞と比較して、改善された性能を実証した
Ｈ２Ｏ２進化型宿主の増強された抗酸化能が、改善された細胞性能に変換されるかどうかを調べるために、上昇した細胞ストレスと関連する細胞株生成プロセスの２つの段階：エレクトロポレーションによる安定的なトランスフェクションからの回復及び流加培養プロセス中において、宿主細胞を評価した。
Ｈ２Ｏ２進化型宿主の増強された抗酸化能が、改善された細胞性能に変換されるかどうかを調べるために、上昇した細胞ストレスと関連する細胞株生成プロセスの２つの段階：エレクトロポレーションによる安定的なトランスフェクションからの回復及び流加培養プロセス中において、宿主細胞を評価した。
【0170】
ａ．トランスフェクション回復中のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞性能
トランスフェクション回復中のＨ２Ｏ２宿主性能を評価するために、トランスフェクション後に細胞生存率及び生細胞密度（ＶＣＤ）を監視した。ＢｉｓＡｂ ＡをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨ２Ｏ２進化型宿主は、トランスフェクション後１１日目に、８２～８４％の生存率及び１．２～１．５０×１０６細胞／ｍｌのＶＣＤに到達し、振盪培養に移された。対照的に、ＢｉｓＡｂ ＡでトランスフェクトされたＣＨＯ対照宿主は、トランスフェクション後１４日目に同様のレベルの回復（ＶＣＤ １．４～１．６×１０６細胞／ｍｌと７１～７８％の生存率、図７Ａ）に到達する。同じ傾向性はＢｉｓＡｂ Ｂでも見られ、ここではＨ２Ｏ２進化型宿主のトランスフェクトされたプールは、トランスフェクション後１１日目に７１～８２％の生存率及び０．８８～１．３５×１０６細胞／ｍｌのＶＣＤに到達し、同等のＣＨＯ対照宿主のトランスフェクトされたプールは、１４日目に６０～７０％の生存率及び０．６５～１．１８×１０６細胞／ｍｌに到達し、その後振盪培養に移された（図７Ｂ）。データは、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、２つ別個の二重特異性抗体をコードするプラスミドＤＮＡによる安定的なトランスフェクション後に、生存率及びＶＣＤの両方に関して、ＣＨＯ対照宿主細胞（トランスフェクション後１４日）と比較して、より早い回復（トランスフェクション後１１日）を実証したことを示しており（図７Ａ及び７Ｂ）、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞がＣＨＯ対照細胞と比較して、細胞ストレスに対する増加された耐性を有することを示している。
トランスフェクション回復中のＨ２Ｏ２宿主性能を評価するために、トランスフェクション後に細胞生存率及び生細胞密度（ＶＣＤ）を監視した。ＢｉｓＡｂ ＡをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨ２Ｏ２進化型宿主は、トランスフェクション後１１日目に、８２～８４％の生存率及び１．２～１．５０×１０６細胞／ｍｌのＶＣＤに到達し、振盪培養に移された。対照的に、ＢｉｓＡｂ ＡでトランスフェクトされたＣＨＯ対照宿主は、トランスフェクション後１４日目に同様のレベルの回復（ＶＣＤ １．４～１．６×１０６細胞／ｍｌと７１～７８％の生存率、図７Ａ）に到達する。同じ傾向性はＢｉｓＡｂ Ｂでも見られ、ここではＨ２Ｏ２進化型宿主のトランスフェクトされたプールは、トランスフェクション後１１日目に７１～８２％の生存率及び０．８８～１．３５×１０６細胞／ｍｌのＶＣＤに到達し、同等のＣＨＯ対照宿主のトランスフェクトされたプールは、１４日目に６０～７０％の生存率及び０．６５～１．１８×１０６細胞／ｍｌに到達し、その後振盪培養に移された（図７Ｂ）。データは、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞が、２つ別個の二重特異性抗体をコードするプラスミドＤＮＡによる安定的なトランスフェクション後に、生存率及びＶＣＤの両方に関して、ＣＨＯ対照宿主細胞（トランスフェクション後１４日）と比較して、より早い回復（トランスフェクション後１１日）を実証したことを示しており（図７Ａ及び７Ｂ）、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞がＣＨＯ対照細胞と比較して、細胞ストレスに対する増加された耐性を有することを示している。
【0171】
ｂ．流加培養プロセスにおけるＨ２Ｏ２進化型宿主細胞性能
ＢｉｓＡｂ産生中の宿主細胞性能を評価するために、１２日間の流加培養プロセスをＨ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢと共にＣＨＯ対照宿主Ａ及びＢで実施した。
ＢｉｓＡｂ産生中の宿主細胞性能を評価するために、１２日間の流加培養プロセスをＨ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢと共にＣＨＯ対照宿主Ａ及びＢで実施した。
【0172】
ＹＳＩアナライザー（２９００Ｄ、ＹＳＩ Ｉｎｃ）を使用して、グルコース及び乳酸を流加培養プロセス全体を通して監視した。細胞培養基を遠心分離によって清澄化させ、ＢｉｓＡｂを、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）でのプロテインＡ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）親和性クロマトグラフィーを使用して、各試料からのピークサイズを検量線と比較することによって定量化した。
【0173】
Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢの増殖速度は、発現されるＢｉｓＡｂとは無関係にＣＨＯ対照プールと比較して劇的に改善された（図８Ａ及び９Ａ）。Ｈ２Ｏ２進化型宿主ＡについてのピークＶＣＤは、ＣＨＯ対照宿主Ａについての７×１０６細胞／ｍｌと比較して、２０×１０６細胞／ｍｌであった。同様の傾向性は、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ｂについても観察された。加えて、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢについての生存率は、ＣＨＯ対照宿主Ａ及びＢと比較して有意に高いままであったが、１２日目での生存率は両方の宿主間で比較的低かった（図８Ｂ及び９Ｂ）。
【0174】
全ての宿主は好ましい乳酸プロファイルを示し、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａ及びＢは、流加培養プロセスの大部分を通してより低い乳酸レベルを有する状態であった（図８Ｃ及び９Ｃ）。
【0175】
ＢｉｓＡｂ Ａの力価は、ＣＨＯ対照宿主と比較して、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａで３．５倍高かった（図８Ｄ）。力価における改善はＢｉｓＡｂ Ｂでも見られ、ここではＨ２Ｏ２進化型宿主からの力価はＣＨＯ対照宿主よりも１．７５倍高かった（図９Ｄ）。興味深いことに、Ｈ２Ｏ２進化型宿主Ａは、ＣＨＯ対照Ａと比較して、１．７倍の比生産性（ｑＰ）における有意な増加を実証した（図８Ｅ）。実際に、ＢｉｓＡｂ Ａについて観察された体積力価の増加は、改善されたｑＰ並びに細胞増殖及び生存率の組合せから引き出された可能性が高い。対照的に、ＢｉｓＡｂ Ｂについて見られた改善された力価は、ｑＰが宿主間で有意に差がなかったので（図９Ｅ）、改善された増殖及び生存率に起因すると考えられる。
【0176】
実施例７．モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＨ２Ｏ２進化型宿主の発現
実施例１に記載されるように生成したＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ宿主細胞及びＣＨＯ親対照を、ネズミＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をコードする直線化ＤＮＡでトランスフェクトして、各１プールを生成した。図１１に示すように、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は１４日目までに回復したが、一方、親対照は１７日目までに回復しなかった。
実施例１に記載されるように生成したＨ２Ｏ２進化型ＣＨＯ宿主細胞及びＣＨＯ親対照を、ネズミＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をコードする直線化ＤＮＡでトランスフェクトして、各１プールを生成した。図１１に示すように、Ｈ２Ｏ２進化型宿主細胞は１４日目までに回復したが、一方、親対照は１７日目までに回復しなかった。
【0177】
ｍＡｂの産生中のＨ２Ｏ２進化型宿主細胞の性能を、ＡＭＢＲ（登録商標）ハイスループット自動化バイオリアクターを使用して決定した。各プールを２つの容器に接種し、２つの技術的反復を生成した。実施例６（ｂ）に記載された方法に従って、性能パラメーターを１４日間監視した。図１２に示すように、Ｈ２Ｏ２進化型宿主は、ＣＨＯ対照と同様な増殖（図１２Ａ）、ＣＨＯ対照と比較して改善された生存率（図１２Ｂ）、ＣＨＯ対照と比較して力価における増加（図１２Ｃ）、ＣＨＯ対照と比較して改善された乳酸プロファイル（図１２Ｄ）、及びＣＨＯ対照と比較して比生産性における増加（図１２Ｅ）を示した。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【国際調査報告】