特表 2023-553113 尿及び他のＤＮＡの特徴を使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-20

(54)【発明の名称】尿及び他のＤＮＡの特徴を使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20231213BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20231213BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20231213BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12M1/34 B

G01N33/50 P

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023534991

(86)(22)【出願日】2021-12-07

(85)【翻訳文提出日】2023-06-30

(86)【国際出願番号】 CN2021136087

(87)【国際公開番号】W WO2022121894

(87)【国際公開日】2022-06-16

(31)【優先権主張番号】63/122,669

(32)【優先日】2020-12-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/193,508

(32)【優先日】2021-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＪＡＶＡ

２．ＳＷＩＦＴ

３．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】512037244

【氏名又は名称】ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン

(71)【出願人】

【識別番号】522380594

【氏名又は名称】グレイル，リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】ロー ユク－ミン デニス

(72)【発明者】

【氏名】チャン クァン チー

(72)【発明者】

【氏名】チアン ペイヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョン ソク ハン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ツォー

(72)【発明者】

【氏名】シエ ティンティン

(72)【発明者】

【氏名】ワン コアンヤー

(72)【発明者】

【氏名】ティン チェン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA16

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB03

2G045CB07

2G045DA12

2G045DA13

4B029AA07

4B029BB20

4B029FA15

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS28

4B063QX02

(57)【要約】

無細胞ＤＮＡ断片の末端は、生体試料の分析のために使用され得る。いくつかの実施形態では、尿試料からのＤＮＡが分析され得る。無細胞ＤＮＡ断片は、多くの場合、不揃い末端を含み、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の一方の末端が他方の鎖の他方の末端を超えて伸長する。これらの不揃い末端の長さ及び量は、個体の状態のレベルを判定するように使用され得る。ある特定の領域における断片の末端の密度もまた、状態のレベルを分類する際に使用され得る。更に、ＤＮＡ断片は、オーバーハングの長さに対応するＤＮＡ断片の量を有する周期的パターンを示し得る。周期性は、生体試料の特性を判定するように分析され得る。不揃い末端はまた、二本鎖ＤＮＡのオーバーハング３’末端をトリミングするのを回避する技術を用いて分析され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

尿試料を分析する方法であって、前記方法が、
個体の前記尿試料からの無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子の特徴を測定することであって、前記無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり、前記無細胞の複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からオーバーハングしており、前記特徴が、前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖の長さに相関する、測定することと、
前記無細胞の複数の核酸分子の前記測定された特徴を使用して、不揃い指数値を判定することと、
前記不揃い指数値を使用して前記個体の状態のレベルを判定することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記状態が、疾患、障害、又は妊娠を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記状態が、がん、自己免疫疾患、又は妊娠関連状態である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記測定することが、各核酸分子について、第１の鎖、第２の鎖、又は第１の鎖及び第２の鎖の特徴を測定することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の部分が、前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記第１の末端が、５’末端である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

核酸分子のサイズを測定することであって、前記無細胞の複数の核酸分子が、指定された範囲内のサイズを有する、測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記指定された範囲が、１４０～１６０ｂｐである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記無細胞の複数の核酸分子が、第１の複数の核酸分子であり、
前記指定された範囲が、第１の指定された範囲であり、
前記方法が、
第２の無細胞の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の鎖の前記特徴を測定することであって、前記第２の無細胞の複数の核酸分子が、第２の指定された範囲を有するサイズを有する、測定することを更に含み、
前記不揃い指数値を判定することが、前記第１の複数の核酸分子の前記測定された特徴及び前記第２の無細胞の複数の核酸分子の前記測定された特徴を使用して比を計算することを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記特徴が、前記無細胞の複数の核酸分子の各々の前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の末端部分における１つ以上の部位におけるメチル化状態であり、前記不揃い指数値が、前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における前記無細胞の複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記特徴が、長さである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

より高いメチル化レベルが、前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖のより長い長さと相関している、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

核酸分子を分析して、リードを生成することと、
前記リードを参照ゲノムにアライメントすることと、を更に含み、
前記無細胞の複数の核酸分子が、転写開始部位に対して、ある特定の距離範囲内のリードを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

核酸分子を分析して、リードを生成することと、
前記リードを参照ゲノムにアライメントすることと、を更に含み、
前記無細胞の複数の核酸分子が、ＣＴＣＦ部位、又はＤＮＡＳＥ１高感受性部位に対して、ある特定の距離範囲内のリードを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記状態の前記レベルを判定することが、前記不揃い指数値を参照値と比較することに基づく、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記参照値が、前記状態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して判定される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記参照値が、前記状態を有しない対象の１つ以上の参照試料を使用して判定される、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

機械学習モデルを使用して、前記不揃い指数値の前記参照値との前記比較、及び前記個体の前記状態の前記レベルの前記判定を実行する、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

移植状態を判定する方法であって、前記方法が、
個体の生体試料からの無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子の特徴を測定することであって、個体が、第１の組織の移植のレシピエントであり、前記無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり、前記無細胞の複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からオーバーハングしており、前記特徴が、前記第２の鎖からオーバーハングする前記第１の鎖の長さに相関する、測定することと、
前記無細胞の複数の核酸分子の前記測定された特徴を使用して、不揃い指数値を判定することと、
前記不揃い指数値を使用することに基づいて、前記個体に移植された前記第１の組織の前記移植状態を判定することと、を含む、方法。

【請求項19】

前記移植が、腎臓、１つ以上の造血幹細胞、又は肝臓である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記移植状態が、拒絶、移植片機能不全、感染、又はそれらの組み合わせの可能性を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記個体に移植された前記第１の組織における前記移植状態を判定することが、前記不揃い指数値を参照値と比較することを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記不揃い指数値が前記参照値よりも大きい場合に、前記移植状態が、拒絶されるか又は拒絶される可能性が高いとして分類される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記第１の組織が、１つ以上の造血幹細胞又は肝臓である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記不揃い指数値が前記参照値未満である場合に、前記移植状態が、拒絶されるか又は拒絶される可能性が高いとして分類される、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

前記第１の組織が、腎臓からのものである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記参照値が、前記第１の組織の移植を拒絶した対象の１つ以上の参照試料を使用して、又は前記第１の組織の移植を拒絶しなかった対象の１つ以上の参照試料を使用して判定される、請求項２１に記載の方法。

【請求項27】

前記参照値が、前記生体試料が前記個体から得られる前に前記個体から得られた１つ以上の参照試料を使用して判定される、請求項２１に記載の方法。

【請求項28】

前記移植状態を判定することが、前記移植が拒絶されていると判定することを含み、
前記方法が、前記移植の急性拒絶に対して、前記個体を治療することを更に含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項29】

前記生体試料が、血液、血漿、血清、尿、又は唾液を含む、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記生体試料が、尿を含む、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

生体試料を分析する方法であって、前記方法が、
個体の生体試料からの無細胞の複数の核酸分子を配列決定して配列リードを生成することであって、前記無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり、前記無細胞の複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からオーバーハングしている、生成することと、
前記配列リードを参照ゲノムにアライメントさせて、前記無細胞の複数の核酸分子のゲノム位置を判定することと、
前記無細胞の複数の核酸分子の核酸分子のセットを識別することであって、前記核酸分子のセットの各核酸分子の前記ゲノム位置が、所定のタイプのゲノム部位から特定の距離にある、識別することと、
前記核酸分子のセットの各核酸分子の特徴を測定することであって、前記特徴が、前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖の長さに相関する、測定することと、
前記核酸分子のセットの前記測定された特徴を使用して、不揃い指数値を判定することと、
前記不揃い指数値を使用して、前記個体の状態のレベルを判定することと、を含む、方法。

【請求項32】

前記生体試料が、血液、血漿、血清、尿、又は唾液を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記特定の距離が、ある範囲である、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項34】

前記特定の距離が、０ｎｔである、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項35】

前記ゲノム部位が、ＣＴＣＦ結合部位、ＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＨＳ）、又はヒストン修飾を有する領域である、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ゲノム部位が、前記ヒストン修飾を有する領域である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ヒストン修飾が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ４Ｋ１６Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、又はＨ３Ｋ９ｍｅ３を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記個体の前記状態を判定することが、前記不揃い指数値を参照値と比較することを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

生体試料を分析する方法であって、前記方法が、
前記生体試料から無細胞の複数の核酸分子内の核酸分子のサブセットを選択することであって、
前記無細胞の複数の核酸分子が、前記臨床的に関連する核酸分子及び他の核酸分子を含み、
前記無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり、
前記無細胞の複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からオーバーハングしており、
前記核酸分子のサブセットの各核酸分子に対して、
前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖の長さが、閾値よりも大きい、選択することと、
前記核酸分子のサブセットを分析して、前記臨床的に関連する核酸分子の特性を判定することと、を含む、方法。

【請求項40】

前記核酸分子のサブセットを選択することが、
前記無細胞の複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の特徴を測定することであって、前記特徴が、前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖の前記長さに相関する、測定することと、
コンピュータシステムによって、カットオフ値よりも大きい前記特徴を有する核酸分子を選択して、前記核酸分子のサブセットを得ることと、を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記核酸分子のサブセットを選択することが、
前記核酸分子のサブセットを、前記無細胞の複数の核酸分子の残りから物理的に分離することを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

前記核酸分子のサブセットを物理的に分離することが、前記核酸分子のサブセットの不揃い末端へのプローブのハイブリダイゼーションを含み、前記プローブが、前記閾値よりも大きい前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖の前記長さを有する前記不揃い末端にハイブリダイズするように設計されている、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ハイブリダイゼーションが、磁気ビーズベースのハイブリダイゼーションアッセイにより達成される、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

ゲル電気泳動又はマイクロ流体力学を使用して、前記プローブにハイブリダイズした前記核酸分子を分離することを更に含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

オリゴヌクレオチドを前記第１の鎖の前記長さにハイブリダイズさせることを更に含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項46】

前記オリゴヌクレオチドの特徴を測定することであって、前記オリゴヌクレオチドの前記特徴が、前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖の前記長さに相関する、測定することと、
カットオフ値よりも大きい前記特徴を有する核酸分子を選択して、前記核酸分子のサブセットを得ることと、を更に含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記オリゴヌクレオチドが、カットオフ長さを超えるオリゴヌクレオチドについてのマーカーに結合しており、
前記方法が、
前記マーカーを有する核酸分子を捕捉して、前記核酸分子のサブセットを得ることを更に含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記核酸分子のサブセットを増幅して、核酸分子の増幅されたサブセットを得ることを更に含み、
前記核酸分子のサブセットを分析することが、前記核酸分子の増幅されたサブセットを使用することを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記核酸分子のサブセットを分析することが、前記核酸分子のサブセットのパラメータの値を判定することを含み、
状態の分類を判定することが、前記パラメータの前記値を使用することを含む、請求項３９～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記分類を判定することが、前記パラメータの前記値を参照値と比較することを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記パラメータの前記値が、核酸分子の量又はサイズプロファイルの統計的尺度である、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

前記状態が、疾患、障害、妊娠、又は移植状態を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記状態が、がん、自己免疫疾患、妊娠関連状態、又は移植拒絶である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

生体試料を分析する方法であって、前記方法が、
個体の前記生体試料から無細胞の複数の核酸分子の核酸分子のセットを検出することであって、前記核酸分子のセットの各核酸分子が、所定のタイプのゲノム部位から特定の距離にゲノム位置を有する少なくとも１つの末端を含む、検出することと、
前記核酸分子のセットの各核酸分子の両方の末端に対して、
一方の末端を上流末端として、かつ他方の末端を下流末端として識別することと、
前記特定の距離に上流末端を有する核酸分子の第１の量を判定することと、
前記特定の距離に下流末端を有する核酸分子の第２の量を判定することと、
前記第１の量及び前記第２の量を使用して、分離値を判定することと、
前記分離値を使用して、前記個体の状態のレベルを判定することと、を含む、方法。

【請求項55】

一方の末端を上流末端として、かつ他方の末端を下流末端として分類することが、上流末端よりも前記ゲノム位置についてより高い値を有するとして下流末端を識別することを含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ゲノム部位が、ＣＴＣＦ結合部位又はＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＨＳ）である、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記個体の前記状態の前記レベルを判定することが、前記分離値を参照値と比較することを含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項58】

前記参照値が、前記状態を有しない対象からの１つ以上の対照試料から、又は前記状態を有する対象由来の１つ以上の対照試料から判定される、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記状態が、疾患、障害、妊娠、又は移植状態を含む、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記状態が、がん、自己免疫疾患、妊娠関連状態、又は移植拒絶である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記状態が、膀胱がんである、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記状態のより重度のレベルが、より大きい分離値と関連付けられる、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記生体試料が、血液、血漿、血清、尿、又は唾液を含む、請求項５４～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記核酸分子のセットを識別することが、
前記核酸分子のセットの各核酸分子に対して、
前記核酸分子を配列決定して１つ以上のリードを生成することと、
前記１つ以上のリードを参照ゲノムにアライメントさせて、前記核酸分子のゲノム位置を判定することと、を含む、請求項５４～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

生体試料を分析する方法であって、前記方法が、
前記生体試料における第１の無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子であって、前記第１の無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり、各第１の鎖が、前記第２の鎖からオーバーハングしている第１の部分を含み、各第１の部分が、前記第１の鎖の５’末端に存在する、各核酸分子について、
１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物を前記第１の鎖の前記第１の部分にハイブリダイズさせて、伸長された核酸分子を形成することであって、前記第１の化合物が前記第２の鎖の３’末端に結合して、前記第１の化合物を含む３’末端を有する細長い第２の鎖を形成し、前記第１の化合物が前記第２の鎖と接触しない３’末端を有し、前記第１の化合物における各第１のタイプのヌクレオチドが、前記第２の鎖における前記第１のタイプのヌクレオチドの各々と反対のメチル化状態を有する、形成することと、
前記生体試料において、前記第１の化合物における前記第１のタイプのヌクレオチド又は前記第２の鎖における前記第１のタイプのヌクレオチドのいずれかを第２のタイプのヌクレオチドに変換することであって、前記生体試料が、変換後に第２の無細胞の複数の核酸分子を含み、前記第２の無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子が二本鎖であり、第３の鎖及び第４の鎖を含み、各第３の鎖が、前記第４の鎖からオーバーハングしている第１の部分を含み、各第１の部分が、前記第３の鎖の３’末端に存在する、変換することと、
前記第１の化合物における前記第１のタイプのヌクレオチドに対応する１つ以上の部位の各々について第１のメチル化状態を判定することと、を含む、方法。

【請求項66】

前記第２の無細胞の複数の核酸分子の核酸分子の前記第１の部分を除去するように構成された酵素が、前記生体試料に添加されない、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

エキソヌクレアーゼが、前記生体試料に添加されない、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記生体試料が、前記第２の無細胞の複数の核酸分子における前記核酸分子以外の他の鎖からオーバーハングしている１つの鎖の３’末端を有する二本鎖核酸分子を含まず、
前記第２の無細胞の複数の核酸分子の数が、前記第１の無細胞の複数の核酸分子の数の少なくとも５０％である、請求項６５に記載の方法。

【請求項69】

前記第１のタイプのヌクレオチドが、シトシンである、請求項６５に記載の方法。

【請求項70】

前記第１の無細胞の複数の核酸分子の各第１の化合物の長さを、前記第２のタイプのヌクレオチドに隣接する前記第１のタイプのヌクレオチドを識別することによって判定することを更に含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項71】

前記第１のメチル化状態を使用してメチル化レベルを計算することと、
前記メチル化レベルを使用して不揃い指数値を判定することと、を更に含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項72】

前記第１の化合物における前記第１のタイプのヌクレオチド又は前記第２の鎖における前記第１のタイプのヌクレオチドのいずれかを変換することが、前記第１の化合物における前記第１のタイプのヌクレオチドを変換することを含み、
前記第１のメチル化状態を判定することが、前記第２のタイプのヌクレオチドの同一性を判定することを含み、
前記第１のメチル化状態が、メチル化されていないと判定される、請求項６５に記載の方法。

【請求項73】

前記複数の伸長された核酸分子をリン酸化することと、
前記第２の無細胞の複数の核酸分子をリン酸化することと、
前記伸長された核酸分子にアダプタを加えることと、を更に含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項74】

前記第１の化合物における前記第１のタイプのヌクレオチド又は前記第２の鎖における前記第１のタイプのヌクレオチドのいずれかを変換することが、前記第１の化合物における前記第１のタイプのヌクレオチド又は前記第２の鎖における前記第１のタイプのヌクレオチドのいずれかのバイサルファイト処理を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項75】

前記第１の化合物における前記第１のタイプのヌクレオチド又は前記第２の鎖における前記第１のタイプのヌクレオチドのいずれかを変換することが、前記第２の鎖における前記第１のタイプのヌクレオチドを変換することを含み、
前記方法が、
前記第２の無細胞の複数の核酸分子における前記第１のタイプのヌクレオチドを変換することを更に含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項76】

尿試料を分析する方法であって、前記方法が、
個体の前記尿試料からの無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子の特徴を測定することであって、前記無細胞の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり、前記無細胞の複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からオーバーハングしており、前記特徴が、前記第２の鎖からオーバーハングしている前記第１の鎖の長さに相関する、測定することと、
前記測定された特徴の複数の値の各々を有する核酸分子の量を測定することによってヒストグラムを作成することと、
前記ヒストグラムを使用して、複数のピーク量及び複数の局所的最小量を識別することと、
前記複数のピーク量及び前記複数の局所的最小量を使用して不揃い指数値を判定することと、
前記不揃い指数値を使用して、前記個体の状態のレベルを判定することと、を含む、方法。

【請求項77】

測定することが、各核酸分子について、前記第１の鎖、前記第２の鎖、又は前記第１の鎖及び前記第２の鎖の特徴を測定することを含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記不揃い指数値が、前記ピーク量の、前記局所的最小量に対する集合的尺度を含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

前記ヒストグラムが、表形式にある、請求項７６に記載の方法。

【請求項80】

前記特徴が、長さである、請求項７６に記載の方法。

【請求項81】

前記状態が、がんである、請求項７６に記載の方法。

【請求項82】

前記状態が、腎臓がんである、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記不揃い指数値が、前記複数の局所的最小量を使用して判定され、前記不揃い指数値が、前記複数のピーク量と前記複数の局所的最小量との間の差の集合的尺度を提供する、請求項７６に記載の方法。

【請求項84】

前記不揃い指数値が、前記複数のピーク量の各ピーク量の、少なくとも１つの隣接する局所的最小量との比較を使用して判定される、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記複数のピーク量が、前記測定された特徴の周期的間隔で現れ、
前記複数の局所的最小量が、前記測定された特徴の周期的間隔で現れる、請求項７６に記載の方法。

【請求項86】

前記測定された特徴の前記周期的間隔が、９～１１ｎｔの長さに対応する、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記無細胞の複数の核酸分子が、５０～１７０ｎｔの範囲内のサイズを有する、請求項７６に記載の方法。

【請求項88】

前記状態の前記レベルを分類することが、前記不揃い指数値を参照値と比較することを含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項89】

前記参照値が、前記状態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して判定されるか、又は前記参照値が、前記状態を有しない対象の１つ以上の参照試料を使用して判定される、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

コンピュータ製品であって、複数の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含み、実行されると、コンピュータシステムを制御して、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法を実施する、コンピュータ製品。

【請求項91】

システムであって、
請求項９０に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサと、を含む、システム。

【請求項92】

請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法を実行するための手段を含む、システム。

【請求項93】

請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法を実行するように構成された１つ以上のプロセッサを含む、システム。

【請求項94】

請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法のステップをそれぞれ実行するモジュールを含む、システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年５月２６日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＵＳＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ ＯＦ ＵＲＩＮＡＲＹ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤＮＡ」と題された米国仮出願第６３／１９３，５０８号、及び２０２０年１２月８日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＵＳＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ ＯＦ ＵＲＩＮＡＲＹ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤＮＡ」と題された米国仮出願第６３／１２２，６６９号からの優先権を主張し、それらの非仮出願であり、それらの各々は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

無細胞ＤＮＡは、分子診断及びモニタリングに特に有用であることが証明されている。無細胞ベースの適用としては、以下が挙げられる：非侵襲的出生前検査（Ｃｈｉｕ ＲＫＷ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８；１０５：２０４５８－６３）、がん検出及びモニタリング（Ｃｈａｎ ＫＣＡ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２０１３；５９：２１１－２４、Ｃｈａｎ ＫＣＡ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３；１１０：１８７６－８、Ｊｉａｎｇ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１５；１１２：Ｅ１３１７－２５）、移植モニタリング（Ｚｈｅｎｇ ＹＷ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２０１２；５８：５４９－５８）及び原発組織の追跡（Ｓｕｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１５；１１２：Ｅ５５０３－１２；Ｃｈａｎ ＫＣＡ、Ｓｎｙｄｅｒ ＭＷ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６４：５７－６８）。これまでに開発された無細胞核酸分析手法としては、一塩基変位（single nucleotide variant、ＳＮＶ）、コピー数異常（copy number aberrations、ＣＮＡ）、ヒトゲノムの無細胞ＤＮＡ末端位置、又はメチル化マーカーの分析に基づくものが挙げられる。新しい特性を検出するための新しい核酸分析手法を識別し、既存の処方に精度を追加することは有益であると考えられる。

【発明の概要】

【0003】

二本鎖無細胞ＤＮＡ断片は、しばしば、互いに正確に相補的ではない２本の鎖を有し得る。一方の鎖は、他方の鎖を超えて伸長し、オーバーハングを発生させ得る。これらのオーバーハングは、しばしば、分析で平滑末端（blunt end）を形成するために修復される。しかしながら、これらのオーバーハングによって作成された「不揃い（jagged）末端」は、生体試料の分析に有用であり得る。この文書では、不揃い末端を分析に使用し得る方法、及び不揃い末端を測定する方法について説明する。一例として、尿試料からの無細胞ＤＮＡにおける不揃い末端は、非侵襲的かつ正確に状態を診断又は検出するために、使用され得る。

【0004】

試料内の不揃い末端の程度（不揃い末端の量又は長さであり得る）は、個体の状態のレベルを反映し得る。例えば、不揃い末端の程度は、疾患（例えば、がん）、障害、妊娠関連の状態、又は移植状態に関連し得る。いくつかの実施形態では、不揃い末端の程度は、移植の拒絶の可能性を判定し得る。いくつかの実施形態では、特定のゲノム位置における不揃い末端は、状態のレベルを分類するのに有用であり得る。例えば、部位（例えば、ＣＴＣＦ結合部位又はＤＮＡＳＥ１高感受性部位［ＤＨＳ］）からある特定の距離にある不揃い末端は、状態のレベルを分類する際に使用され得る。

【0005】

いくつかの実施形態では、断片の末端の密度は、状態のレベルを分類する際に使用され得る。断片は、ゲノム座標に基づいて、上流にある末端及び下流にある別の末端を有し得る。ある特定のゲノム位置（例えば、特定の部位から特定の距離）では、上流末端の数及び下流末端の数が、状態のレベルを分類する際に使用され得る。上流末端の量と下流末端の量の差が、使用され得る。

【0006】

いくつかの実施形態では、不揃い末端は、改善された技術によって分析され得る。その技術は、二本鎖ＤＮＡのオーバーハング３’末端をトリミングするのを回避する。オーバーハング３’末端をトリミングするのを回避することによって、５’オーバーハング末端、特に、短い突出末端の分析が予想外に改善される。短い突出末端のより正確なカウントによって、不揃い末端長さの分析は、より正確になり、生体試料の改善された分析を提供することができる。

【0007】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、オーバーハングの長さに対応するＤＮＡ断片の量を有する周期的パターンを示す。異なる不揃い末端長さでのＤＮＡの量の周期性を分析して、生体試料の特性を判定することができる。例えば、周期性は、状態のレベルを判定するように使用され得る。

【0008】

本発明の実施形態の性質及び利点に関するより良好な理解は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照して得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の実施形態による、尿ＤＮＡの不揃い末端分析のためのワークフローの概略図を示す。

【図2】本発明の実施形態による、血漿ＤＮＡの不揃い末端の直接評価を示す。

【図3A】本発明の実施形態による、血漿ＤＮＡと尿ＤＮＡとの間の不揃い状態の比較を示す。

【図3B】本発明の実施形態による、血漿ＤＮＡと尿ＤＮＡとの間の不揃い状態の比較を示す。

【図4A】本発明の実施形態による、血漿ＤＮＡと尿ＤＮＡとの間の断片化パターンを示す。

【図4B】本発明の実施形態による、血漿ＤＮＡと尿ＤＮＡとの間の断片化パターンを示す。

【図5A】本発明の実施形態による、尿ＤＮＡにおける不揃い指数－非メチル化（ＪＩ－Ｕ）値の膀胱がんとの関係を示す。

【図5B】本発明の実施形態による、尿ＤＮＡにおける不揃い指数－非メチル化（ＪＩ－Ｕ）値の膀胱がんとの関係を示す。

【図5C】本発明の実施形態による、尿ＤＮＡにおける不揃い指数－非メチル化（ＪＩ－Ｕ）値の膀胱がんとの関係を示す。

【図5D】本発明の実施形態による、尿ＤＮＡにおける不揃い指数－非メチル化（ＪＩ－Ｕ）値の膀胱がんとの関係を示す。

【図6】本発明の実施形態による、尿試料を分析するように不揃い末端指数値を使用する方法を示す。

【図7A】本発明の実施形態による、末端密度とヌクレオソームトラックとの間の関係を示す。

【図7B】本発明の実施形態による、末端密度とヌクレオソームトラックとの間の関係を示す。

【図8】本発明の実施形態による、ＣＴＣＦ結合部位に対する尿ＤＮＡについての末端密度のグラフである。

【図9】本発明の実施形態による、異なる膀胱がん状態にわたる末端密度の累積差の箱ひげ図である。

【図10A】本発明の実施形態による、末端密度メトリックを使用して、がんを有する患者と有しない患者とを差別化するためのＲＯＣ曲線を示す。

【図10B】本発明の実施形態による、末端密度メトリックを使用して、がんを有する患者と有しない患者とを差別化するためのＲＯＣ曲線を示す。

【図11】本発明の実施形態による、末端密度情報を使用して、個体から得られた生体試料を分析して、状態のレベルを分類する方法を示す。

【図12】本発明の実施形態による、妊婦の母体由来尿ＤＮＡと胎児由来尿ＤＮＡとの間のＪＩ－Ｕ値を示す。

【図13A】本発明の実施形態による、腎臓移植、造血幹細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation、ＨＳＣＴ）、及び肝臓移植による患者におけるレシピエント由来のＤＮＡとドナー由来のＤＮＡとの間のＪＩ－Ｕ値を示す。

【図13B】本発明の実施形態による、腎臓移植、造血幹細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation、ＨＳＣＴ）、及び肝臓移植による患者におけるレシピエント由来のＤＮＡとドナー由来のＤＮＡとの間のＪＩ－Ｕ値を示す。

【図13C】本発明の実施形態による、腎臓移植、造血幹細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation、ＨＳＣＴ）、及び肝臓移植による患者におけるレシピエント由来のＤＮＡとドナー由来のＤＮＡとの間のＪＩ－Ｕ値を示す。

【図14】本発明の実施形態による、ある特定の不揃い指数値を有するＤＮＡを選択することによって生体試料を濃縮する方法を示す。

【図15】本発明の実施形態による、急性拒絶を有する及び有しない腎臓移植患者間の尿ＤＮＡのＪＩ－Ｕ値を示す。

【図16】本発明の実施形態による、個体からの生体試料を分析して移植状態を分類する方法を示す。

【図17A】本発明の実施形態による、不揃い末端とヌクレオソームトラックとの間の関係を示す。

【図17B】本発明の実施形態による、不揃い末端とヌクレオソームトラックとの間の関係を示す。

【図18】本発明の実施形態による、ＭＩＢＣを有する患者と膀胱がんを有しない患者とを差別化するための受信者操作特徴（receiver operating characteristic、ＲＯＣ）プロットを示す。

【図19A】本発明の実施形態による、これらのヒストン修飾に関連するゲノム領域に由来する尿ＤＮＡの不揃い末端を分析することからの結果を示す。

【図19B】本発明の実施形態による、これらのヒストン修飾に関連するゲノム領域に由来する尿ＤＮＡの不揃い末端を分析することからの結果を示す。

【図20】本発明の実施形態による、ある特定のゲノム位置でのＪＩ－Ｕ値を使用して、個体から得られた生体試料を分析して、状態のレベルを分類する方法を示す。

【図21A】本発明の実施形態による、以前のＪａｇ－ｓｅｑ方法及び新しいＪａｇ－ｓｅｑＩＩ方法を示す。

【図21B】本発明の実施形態による、以前のＪａｇ－ｓｅｑ方法及び新しいＪａｇ－ｓｅｑＩＩ方法を示す。

【図22A】本発明の実施形態による、５’突出不揃い末端を有するスパイクイン分子に対するＪａｇ－ｓｅｑ技術及びＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術の使用の効果を示す。

【図22B】本発明の実施形態による、５’突出不揃い末端を有するスパイクイン分子に対するＪａｇ－ｓｅｑ技術及びＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術の使用の効果を示す。

【図22C】本発明の実施形態による、５’突出不揃い末端を有するスパイクイン分子に対するＪａｇ－ｓｅｑ技術及びＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術の使用の効果を示す。

【図22D】本発明の実施形態による、５’突出不揃い末端を有するスパイクイン分子に対するＪａｇ－ｓｅｑ技術及びＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術の使用の効果を示す。

【図22E】本発明の実施形態による、５’突出不揃い末端を有するスパイクイン分子に対するＪａｇ－ｓｅｑ技術及びＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術の使用の効果を示す。

【図22F】本発明の実施形態による、５’突出不揃い末端を有するスパイクイン分子に対するＪａｇ－ｓｅｑ技術及びＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術の使用の効果を示す。

【図23】本発明の実施形態による、尿ｃｆＤＮＡにおける異なるサイズ範囲にわたるリード２（ＪＩ－Ｍ）におけるＣＨメチル化レベルのプロファイルのグラフを示す。

【図24A】本発明の実施形態による、尿ｃｆＤＮＡにおける異なるサイズ範囲にわたる平均及び中央不揃い末端長さを示す。

【図24B】本発明の実施形態による、尿ｃｆＤＮＡにおける異なるサイズ範囲にわたる平均及び中央不揃い末端長さを示す。

【図25A】本発明の実施形態による、膀胱がん対象及び対照対象についてのＪＩ－Ｍ及び平均不揃い末端長さについての箱ひげ図を示す。

【図25B】本発明の実施形態による、膀胱がん対象及び対照対象についてのＪＩ－Ｍ及び平均不揃い末端長さについての箱ひげ図を示す。

【図26】本発明の実施形態による、試料における断片の３’末端をトリミングすることなく、個体から得られた生体試料を分析する方法である。

【図27】本発明の実施形態による、尿中にＣＣタグ技術によって推定される不揃い末端長さの分布のグラフを示す。

【図28】本発明の実施形態による、異なる断片サイズにわたる不揃い末端長さの周期性指数のグラフを示す。

【図29A】本発明の実施形態による、腎臓細胞がん（renal cell cancer、ＲＣＣ）を有する対象から対照対象を区別する際に周期性指数及び平均不揃い末端長さを使用することからの結果を示す。

【図29B】本発明の実施形態による、腎臓細胞がん（renal cell cancer、ＲＣＣ）を有する対象から対照対象を区別する際に周期性指数及び平均不揃い末端長さを使用することからの結果を示す。

【図29C】本発明の実施形態による、腎臓細胞がん（renal cell cancer、ＲＣＣ）を有する対象から対照対象を区別する際に周期性指数及び平均不揃い末端長さを使用することからの結果を示す。

【図30】本発明の実施形態による、ヘパリンインキュベーション処理を用いた尿ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを示す。

【図31】本発明の実施形態による、ヘパリンインキュベーション処理を用いた尿ｃｆＤＮＡにおける不揃い末端長さ分布を示す。

【図32A】本発明の実施形態による、尿中の異なるＥＤＴＡ及びヘパリン処理についてのＪＩ－Ｍ、平均不揃い末端長さ、及び周期性指数の分析を示す。

【図32B】本発明の実施形態による、尿中の異なるＥＤＴＡ及びヘパリン処理についてのＪＩ－Ｍ、平均不揃い末端長さ、及び周期性指数の分析を示す。

【図32C】本発明の実施形態による、尿中の異なるＥＤＴＡ及びヘパリン処理についてのＪＩ－Ｍ、平均不揃い末端長さ、及び周期性指数の分析を示す。

【図33】本発明の実施形態による、ＤＮＡ断片における不揃い末端長さの周期性を使用した生体試料を分析する方法である。

【図34】本発明の実施形態による、測定システムを示す。

【図35】本発明の実施形態による、システム及び方法によって使用可能な例示的なコンピュータシステムのブロック図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

用語
「組織」は、機能単位としてともにグループ化する細胞の群に対応する。２つ以上のタイプの細胞が、単一の組織内に見出され得る。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞又は血球）からなり得るが、異なる生物（母親対胎児）からの組織又は健常細胞対腫瘍細胞に対応し得る。「参照組織」は、組織特異的メチル化レベルを判定するように使用される組織に対応し得る。異なる個体からの同じ組織タイプの複数の試料を使用して、その組織タイプの組織特異的メチル化レベルを判定することができる。

【0011】

「器官」は、同様の機能を有する組織の群に対応する。１つ以上のタイプの組織が、単一の器官内に見出され得る。器官は、心血管系、消化器系、内分泌系、排泄系、リンパ系、外皮系、筋肉系、神経系、生殖系、呼吸器系、及び骨格系を含む、異なる器官系の一部であり得る。

【0012】

「生体試料」は、対象（例えば、妊婦、がんを有する人、若しくはがんを有すると疑われる人、臓器移植レシピエント）、又は器官が関与する疾患過程（例えば、心筋梗塞における心臓、卒中における脳、若しくは貧血における造血系）を有すると疑われる対象から採取され、目的の１つ以上の核酸分子を含有する何らかの試料を指す。生体試料は、血液、血漿、血清、尿、膣液、陰のう水腫からの（例えば、精巣の）流体、膣洗浄流体、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの分泌液、体の異なる部分（例えば、甲状腺、乳房）からの吸引液などの体液であり得る。便試料もまた、使用され得る。様々な実施形態では、無細胞ＤＮＡについて濃縮された生体試料（例えば、遠心分離プロトコルを介して取得された血漿試料）におけるＤＮＡの大部分は、無細胞であり得、例えば、ＤＮＡの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、又は９９％超は、無細胞であり得る。遠心分離プロトコルは、例えば、３，０００ｇ×１０分で流体部分を取得することと、残留細胞を除去するために３０，０００ｇで更に１０分間再遠心分離することと、を含み得る。

【0013】

「配列リード」は、核酸分子の任意の部分又は全部から配列決定されたヌクレオチドの鎖を指す。例えば、配列リードは、核酸断片から配列決定されたヌクレオチドの短鎖（例えば、約２０～１５０個）、核酸断片の一方又は両方の末端におけるヌクレオチドの短鎖、又は生体試料中に存在する核酸断片全体の配列決定であり得る。配列リードは、例えば、配列決定技術を使用した、又はプローブを使用した種々の方法で、例えば、ハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブで、又は単一プライマー若しくは等温増幅を使用した、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）若しくは線形増幅などの増幅技術で、取得され得る。

【0014】

「部位」（「ゲノム部位」とも呼ばれる）は、単一の塩基位置、又は相関する塩基位置の群、例えば、ＣｐＧ部位、又は相関する塩基位置のより大きい群であり得る、単一の部位に対応する。「遺伝子座」は、複数の部位を含む領域に対応し得る。遺伝子座は、遺伝子座をその文脈における部位と等価にするただ１つの部位を含み得る。

【0015】

各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位）に対する「メチル化指数」又は「メチル化状態」は、その部位におけるメチル化を、その部位を覆う総リード数にわたって示す、ＤＮＡ断片の割合（例えば、配列リード又はプローブから判定される）を指し得る。「リード」は、ＤＮＡ断片から取得された情報（例えば、部位におけるメチル化状態）に対応し得る。特定のメチル化状態のＤＮＡ断片と優先的にハイブリッド形成する試薬（例えば、プライマー又はプローブ）を用いて、読み取りを得ることができる。典型的には、そのような試薬は、ＤＮＡ分子のメチル化状態、例えば、バイサルファイト変換、又はメチル化感受性制限酵素、又はメチル化結合タンパク質、又は抗メチルシトシン抗体、又はメチルシトシン及びヒドロキシメチルシトシンを認識する一分子配列決定技術に応じて、ＤＮＡ分子を差別的に修飾するか、又は差別的に認識するプロセスにより処理後に適用される。

【0016】

領域の「メチル化密度」は、この領域における部位をカバーする総リード数で除算した、メチル化を示す領域内の部位でのリード数を指し得る。この部位は、具体的な特徴、例えば、ＣｐＧ部位、を有し得る。したがって、領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、この領域におけるＣｐＧ部位（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内又はそれより大きい領域内のＣｐＧ部位）をカバーする総リード数で除算したＣｐＧメチル化を示すリード数を指し得る。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂビンについてのメチル化密度は、１００ｋｂ領域にマッピングされた配列リードによってカバーされた全てのＣｐＧ部位の割合として、ＣｐＧ部位においてバイサルファイト処理後に変換されていないシトシン（メチル化されたシトシンに対応する）の総数から判定され得る。この分析はまた、例えば、５００ｂｐ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又は１Ｍｂなどの他のビンサイズに対して実施され得る。領域は、全ゲノム、又は染色体若しくは染色体の一部（例えば、染色体腕）であり得る。ＣｐＧ部位のメチル化指数は、領域がそのＣｐＧ部位のみを含む場合に、その領域についてのメチル化密度と同じである。「メチル化シトシンの割合」は、領域において、分析されたシトシン残基の総数にわたって、メチル化されている（例えば、バイサルファイト変換後に変換されていない）、すなわち、ＣｐＧコンテキスト外のシトシンを含む、ことが示されるシトシン部位の数、「Ｃ」、を指し得る。メチル化指数、メチル化密度及びメチル化シトシンの割合は、「メチル化レベル」の例である。バイサルファイト変換とは別に、当業者に既知の他のプロセス（メチル化状態に感受性のある酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）、メチル化結合タンパク質、メチル化状態に感受性のあるプラットフォームを使用する（例えば、ナノポア配列決定（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１３；１１０：１８９１０－１８９１５）、及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子配列決定による（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１０；７：４６１－４６５））を含むが、それらに限定されない）を使用して、ＤＮＡ分子のメチル化状態を調べることができる。

【0017】

「配列決定深度」という用語は、遺伝子座が、その遺伝子座にアライメントされた配列リードによってカバーされる回数を指す。遺伝子座は、ヌクレオチドの小ささ、又は染色体腕の大きさ、又はゲノム全体の大きさであり得る。配列決定深度は、５０ｘ、１００ｘなどと表され得、「ｘ」は、遺伝子座が配列リードでカバーされる回数を指す。配列決定深度はまた、複数の遺伝子座、又はゲノム全体に適用することもでき、この場合、ｘは、それぞれ、遺伝子座若しくはハプロイドゲノム、又はゲノム全体が配列決定される平均回数を指し得る。ウルトラディープ配列決定は、少なくとも１００ｘの配列決定深度を指し得る。

【0018】

「分離値」は、２つの値を伴う差又は比、例えば、２つの分率寄与又は２つのメチル化レベルに対応する。分離値は、単純な差又は比であり得る。例としては、ｘ／ｙの正比は、ｘ／（ｘ＋ｙ）と同様に、分離値である。分離値は、他の係数、例えば、乗算係数を含み得る。他の例としては、値の関数の差又は比、例えば、２つの値の自然対数（ｌｎ）の差又は比が使用され得る。分離値は、差及び比を含み得る。

【0019】

本明細書で使用される「分類」という用語は、試料の特定の特性と関連付けられた任意の数又は他の特徴を指す。例えば、「＋」という記号（又は「陽性」という単語）は、試料が欠失又は増幅を有するとして分類されることを意味し得る。分類は、二者択一（例えば、陽性若しくは陰性）であり得、又はより多くのレベルの分類（例えば、１～１０若しくは０～１のスケール）を有し得る。「カットオフ」及び「閾値」という用語は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、断片が除外されるサイズ超のサイズを指し得る。閾値は、特定の分類が適用されるのを上回る又は下回る値であり得る。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれかにおいて使用され得る。

【0020】

ＤＮＡ分子を記載する場合の「損傷」という用語は、ＤＮＡニック、二本鎖ＤＮＡ中に存在する一本鎖、二本鎖ＤＮＡのオーバーハング、酸化グアニンによる酸化的ＤＮＡ修飾、脱塩基部位、チミジン二量体、酸化ピリミジン、ブロックされた３’末端、又は不揃い末端を指し得る。

【0021】

「不揃い末端」という用語は、ＤＮＡの粘着性末端、ＤＮＡのオーバーハング、又は二本鎖ＤＮＡがＤＮＡの他の鎖にハイブリダイズしていないＤＮＡの鎖を含む場合を指し得る。「不揃い末端値」又は「不揃い指数」は、不揃い末端の範囲の尺度である。不揃い末端値は、二本鎖ＤＮＡにおいて第２の鎖からオーバーハングした１本の鎖の平均長さに相関（例えば、比例）し得る。複数のＤＮＡ分子の不揃い末端値は、ＤＮＡ分子間の平滑末端の考慮を含み得る。

【0022】

いくつかの例では、不揃い指数値は、ある鎖が複数の無細胞ＤＮＡ分子において別の鎖にオーバーハングする集合的尺度を提供し得る。不揃い状態の集合的尺度は、複数の無細胞ＤＮＡ分子におけるオーバーハングの推定長さ、例えば、無細胞ＤＮＡ分子の各々の個々の測定値の平均、中央値、又は他の集合的尺度に基づいて判定され得る。いくつかの例では、不揃い状態の集合的尺度は、特定の断片サイズ範囲（例えば、１３０～１６０ｂｐｓ、２００～３００ｂｐｓ）について判定される。いくつかの例では、不揃い状態の集合的尺度は、複数の無細胞ＤＮＡ分子の末端に近接するメチル化シグナル変化に基づいて判定され得る。

【0023】

「アライメント」という用語及び関連する用語は、配列を参照配列に一致させることを指し得る。参照配列は、参照ゲノム（例えば、ヒトゲノム）又は特定の分子の配列であり得る。そのような参照配列は、少なくとも１００ｋｂ、１Ｍｂ、１０Ｍｂ、５０Ｍｂ、１００Ｍｂ、及びそれ以上を含み得る。そのようなアライメント方法は、手動で実施され得ず、専門のコンピュータソフトウェアによって実施される。アライメントは、長く多数の配列（例えば、少なくとも１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、又は１００，０００，０００個の配列）を伴い得る。更に、アライメントは、配列自体内の可変性又は配列リード内のエラーを伴い得る。したがって、そのような変動性又はエラーを伴うアライメントは、参照配列との正確な一致を必要としない場合がある。

【0024】

「リアルタイム」という用語は、ある特定の時間制約内で完了されるコンピューティング動作又はプロセスを指し得る。時間制約は、１分、１時間、１日、又は７日であり得る。

【0025】

無細胞ＤＮＡは、非ランダムに断片化されることが報告されている（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０；２：６１ｒａ９１）。ごく最近では、二本鎖血漿無細胞ＤＮＡが、不揃い末端と呼ばれる一本鎖末端を担持することが見出された。血漿ＤＮＡ不揃い末端の特徴は、非侵襲性出生前検査及びがん検出のためのバイオマーカーとして役立ち得る。血漿ＤＮＡ及び尿ＤＮＡの断片化パターンは異なる。例えば、尿ＤＮＡ分子は、血漿ＤＮＡ分子よりも短い（Ｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７：ｅ４８３１９）。更に、更なる調査のための尿ＤＮＡ分子の態様には、（１）尿ＤＮＡ中の不揃い末端の程度、（２）バイオマーカー（例えば、膀胱がん検出のための）としての尿ＤＮＡ不揃い末端の使用、（３）更なる臨床状況における尿ＤＮＡ不揃い末端の実装、が含まれる。任意の特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、不揃い末端は、無細胞ＤＮＡがどのように断片化されるかに関連し得ると考えられる。例えば、ＤＮＡは段階的に断片化する場合があり、不揃い末端のサイズは、断片化の段階を反映し得る。不揃い末端の数及び／又は不揃い末端のオーバーハングのサイズを使用して、無細胞ＤＮＡを有する生物学的試料を分析し、試料及び／又は試料が得られた個体に関する情報を提供し得る。

【0026】

特定の器官又は組織で細胞死を引き起こす異なる病原性の理由により、無細胞ＤＮＡ分子に存在するＤＮＡ損傷の相対的な表現が変化することがある。例えば、二本鎖ＤＮＡのオーバーハングは、原発組織との関係を有する。したがって、無細胞ＤＮＡ損傷を分析するための本発明の実施形態は、がん検出、器官損傷、免疫疾患、及び移植状態（これらに限定されないが）を検出又はモニタするため、並びに非侵襲的出生前検査を実施するための新たな可能性を提供する。

【0027】

実施形態は、生体試料を分析するために、不揃い末端の程度、不揃い末端の密度、及び／又は不揃い末端の周期性を使用することを含む。不揃い末端は、ある特定のゲノム部位、又はある特定のゲノム部位からのある特定の距離であり得るある特定の位置で分析され得る。ゲノム部位は、クロマチン中のタンパク質の改変に関連付けられるか、又はタンパク質相互作用に関連付けられる部位であり得る。不揃い末端のこれらの分析は、個体の状態のレベルを判定する際の精度を改善し得る。

【0028】

非従来技術は、生体試料の分析において不揃い末端を測定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ＤＮＡ末端修復を使用して、非メチル化シトシン又はメチル化シトシンがＤＮＡ末端修復措置において使用されたかどうかに依存して、元の配列と不揃い末端との間に差別的メチル化シグナルを導入し、その後、バイサルファイト配列決定を行った。

【0029】

いくつかの実施形態では、オーバーハング５’末端が分析される場合、オーバーハング３’末端は、平滑末端化されない場合がある。予想外に、３’末端の平滑末端化を回避することにより、分析するのに利用可能なオーバーハング５’末端の量が増加される。その結果、生体試料の分析が改善され得る。

【0030】

Ｉ．不揃い末端の検出
尿ＤＮＡの不揃い末端は、間接的に及び直接的に含むいくつかの様式で検出され得る。尿ＤＮＡは、ヌクレオチドにおいて意図的にメチル化又は非メチル化され得る。不揃い末端は、末端修復を伴わないＤＮＡ断片とは反対のメチル化状態を有するヌクレオチドを使用して修復され得る。次いで、メチル化レベルは、尿ＤＮＡ断片についての不揃い末端の程度の指標を与える。断片中のある特定の長さの既知の配列にハイブリダイズする合成プローブが使用され得る。更に、不揃い長さは、二本鎖ＤＮＡの末端にアダプタを加え、二本鎖ＤＮＡの一本鎖を配列判定し、次いで、一方の鎖の配列を他方の鎖にアライメントさせてオーバーハングを判定することによって、直接判定され得る。

【0031】

Ａ．メチル化の使用
図１は、尿ＤＮＡ不揃い末端分析についてのワークフローの概略図を示す。一実施形態では、尿ＤＮＡの５’オーバーハング不揃い末端は、不揃い末端の末端修復プロセス中に組み込まれた非メチル化シトシンに基づいて推定され得る。いくつかの実施形態では、３’末端は、突出不揃い末端であり得る。不揃い末端はまた、オーバーハング末端又は粘着性末端とも呼ばれる。

【0032】

ステージ１１０では、不揃い末端を有するＤＮＡ分子は、尿試料を含む生体試料から抽出され得る。生体試料は、個体から得られ得る。塗りつぶされたロリポップは、メチル化されたＣｐＧ部位を表す。

【0033】

ステージ１２０では、ＤＮＡ分子は、末端修復を受け得る。不揃い末端は、ヌクレオチド（すなわち、ｄＮＴＰ）で充填された。塗りつぶされていないロリポップは、非メチル化ＣｐＧ部位を表す。破線は、新たに充填されたヌクレオチドを表す。末端修復されたＤＮＡ分子は更に、バイサルファイト配列決定に供された。新たに充填されたヌクレオチド中の非メチル化Ｃは、ＴとしてＰＣＲによって増幅されるウラシル（Ｕ）に変換され得るが、分子内に存在する元のメチル化Ｃは未修飾のままである。したがって、元のＤＮＡ分子中のＣｐＧシトシンは、概して、メチル化され得るが、尿ＤＮＡの３’末端（又は他の実施形態では、５’末端）に近接する新たに合成された鎖に末端修復プロセスによって組み込まれたＣｐＧシトシンはメチル化されていない場合がある。したがって、不揃い末端の修復は、３’末端（又は他の実施形態では、５’末端）に近い領域におけるメチル化レベルを低下させる。末端修復分子のバイサルファイト配列決定は、両端におけるメチル化レベルの尺度を提供して、不揃い末端の長さの尺度を提供することができる。

【0034】

いくつかの実施形態では、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子が修復される。他の実施形態では、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い無細胞ＤＮＡ分子が修復され得る。

【0035】

ステージ１３０では、ＤＮＡの不揃い状態が分析される。ＣｐＧメチル化シグナルに基づいて不揃い状態を定量化するために、本発明者らは、ＣｐＧ部位にわたる非メチル化シトシンにおけるリード１とリード２との間の差を利用して、不揃い指数－非メチル化（ＪＩ－Ｕ）と称される不揃い状態を反映させた。リード１は、ステージ１２０における上部の鎖の青色の末端に対応する。リード２は、ステージ１２０における上部の鎖の破線の赤色の末端に対応する。ＪＩ－Ｕは、以下の式により計算され、

【0036】

【数1】

【0037】

式中、Ｍ_１は、断片中の位置から、５’尿ＤＮＡ末端に近接する、３０個の塩基が寄与するメチル化密度を表し、Ｍ_２は、断片中の位置から、３’尿ＤＮＡ末端に近接する、３０個の塩基が寄与するメチル化密度を表す。
いくつかの実施形態では、尿不揃い末端、並びにそれらの組み合わせを評価するために、３’尿ＤＮＡ末端に近接する、１個の塩基、２個の塩基、３個の塩基、４個の塩基、５個の塩基、１０個の塩基、２０個の塩基、４０個の塩基、５０個の塩基など（それらに限定されない）を使用することができる。メチル化密度Ｍ_１及びＭ_２は、異なるＤＮＡ断片にわたるメチル化密度の統計値（例えば、平均値、中央値、最頻値、又はパーセンタイル）であり得る。より高いＪＩ－Ｕは、リード１とリード２との間のメチル化の差の増加に対応する。より高いＪＩ－Ｕは、ＤＮＡ断片についてより多くの不揃い末端を示し得る。

【0038】

ステージ１４０では、ＪＩ－Ｕパターンが分析される。例として、本発明者らは、膀胱がんを有する患者（ｎ＝４６）と膀胱がんを有しない患者（対照、ｎ＝３９）との間の尿ＤＮＡのＪＩ－Ｕ分布、及びＣＴＣＦ結合部位周辺のＪＩ－Ｕパターンを試験した。ＪＩ－Ｕは、ＣＴＣＦ結合部位までの距離とともに変化することが理解される。ＪＩ－Ｕと結合部位との間の関係は、本開示において後に考察される。更に、ＪＩ－Ｕは、生体試料のタイプ（例えば、血漿対尿）に依存することが観察される。移植された組織を有する対象では、ＪＩ－Ｕは、移植される組織のタイプ及び拒絶の可能性に基づいて変化する。

【0039】

いくつかの実施形態では、元のＤＮＡ断片のヌクレオチド（例えば、シトシン）は、メチル化されていない場合がある。不揃い末端は、メチル化されたヌクレオチド（例えば、シトシン）で充填され得る。これらの条件下で、不揃い指数メチル化（Jagged Index－Methylated、ＪＩ－Ｍ）を使用することができる。ステージ１３０では、リード１はメチル化されておらず、したがって、Ｍ_１は０であるか又は０に近い。リード２は、メチル化されており、非０であるか又は０を有意に上回る。したがって、ＪＩ－Ｍは、リード２のメチル化レベルと等価（又は比例）であり得る。

【0040】

Ｂ．プローブの使用
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの不揃い状態は、メチル化シグナルを使用することなく判定され得る。例えば、合成プローブを使用することができる。合成プローブは、断片中の既知の配列のある特定の長さにハイブリダイズする部分を含み得る。様々な長さの相補的部分を有する複数のプローブを使用することができる。プローブは、相補的部分の長さ、したがって、プローブにハイブリダイズした不揃い末端の長さを識別する分子タグを含み得る。分子タグを配列決定して、不揃い末端のサイズを判定することができる。

【0041】

例として、不揃い末端は、Ａｌｕの２４ｂｐの共通配列に存在するものとして認識され得る。異なる長さのプローブは、共通配列の少なくとも一部分に相補的であるように設計され得る。例えば、１つのプローブは、共通配列の１３個の連続したヌクレオチドに相補的な配列を含み得、別のプローブは、共通配列の２２個の連続したヌクレオチド（１３個の連続したヌクレオチドを含む２２個の連続したヌクレオチドを有する）に相補的な配列を含み得る。１～２４個のヌクレオチドの他のプローブの長さが使用され得る。これらの相補的配列は、更に、分子タグと連結され得る。分子タグは、バーコードと同様に、１３ｎｔの不揃い末端を有する合成ＤＮＡを２２ｎｔの不揃い末端を有する合成ＤＮＡから差別化することを可能にする多数のヌクレオチド（例えば、６個）の鎖であり得る。ハイブリダイズしたＤＮＡは、配列決定され、かつアライメントされ得る。各分子タグに関連付けられるリードの数は、ある特定の長さの不揃い末端を有する断片の数を示し得る。

【0042】

Ｃ．アダプタのアライメント
いくつかの実施形態では、不揃い末端の長さは、直接判定され得る。不揃い末端の長さを直接判定することは、二本鎖ＤＮＡの末端にアダプタを加えること、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡを形成すること、得られた一本鎖ＤＮＡを配列決定すること、次いで、一方の鎖の配列を他方の鎖にアライメントさせることを含み得る。アダプタのアライメントを使用して、不揃い末端におけるオーバーハングの量を判定することができる。

【0043】

図２は、血漿ＤＮＡの環状化による血漿ＤＮＡ粘着性末端／オーバーハングの直接評価の実施形態を示す。血漿ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを介して一本鎖ＤＮＡアダプタ（黄色）でライゲーションされる。バイサルファイト処理により、ワトソン（上部の鎖）及びクリック鎖（下部の鎖）はもはや相補的ではなくなり、これは、両方の鎖における非ＣｐＧ部位からのほとんど全てのシトシンがウラシルに変換され、環状の一本鎖ＤＮＡ分子が形成されるためである。このような環状化一本鎖ＤＮＡは、３’配列決定アダプタ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７、青色）でタグ付けされたランダムプライマー（例えば、５－ｍｅｒ）を使用して増幅され得、一本鎖ＤＮＡアダプタ（黄色）を含み得る多数の線状ＤＮＡ分子を生成する。最初にライゲーションされた一本鎖アダプタに隣接するＤＮＡ配列は、不揃い末端を推測することを可能にする。線状ＤＮＡ分子を配列決定に適したものにするために、５’配列決定アダプタ（赤色、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５、赤色）がアニーリング及びＰＣＲベースの伸長によって組み込まれる。次に、Ｐ５及びＰ７アダプタでタグ付けされた分子が増幅され、配列決定される。元の一本鎖アダプタ（黄色）に隣接する配列（「ａ」及び「ｂ」は赤い矢印で示されている）は、概略図に示されているように「ａ」及び「ｂ」配列の相対的な位置を調べることにより、アライメント又は自己相補性分析によって判定される。環状分子の「ｃ」及び「ｄ」配列は、「ａ」及び「ｂ」配列の分析に使用されるのと同様の戦略で分析することができる。ＤＮＡを環状化し、自己相補性分析を使用する他の技術も可能である。

【0044】

メチル化レベルの測定を伴わない実施形態では、不揃い末端の長さを使用して、指数を判定することができる。長さの統計値は、平均値、中央値、最頻値、又はパーセンタイルを含む指数として使用され得る。

【0045】

ＩＩ．血漿ＤＮＡと尿ＤＮＡとの間の不揃い状態における差
尿ＤＮＡは、血漿ＤＮＡとは異なる不揃い状態を示すことが観察される。尿ＤＮＡは、概して、血漿ＤＮＡよりも高い不揃い状態を示した。更に、尿ＤＮＡは、ほとんどのサイズのＤＮＡ断片において、血漿中ＤＮＡよりも多い不揃い状態を示した。尿ＤＮＡはまた、異なるサイズについて不揃い状態の周期性を示すことが観察された。

【0046】

Ａ．Ｊａｇｇｅｄ末端及びメチル化レベルの比較
図３Ａ及び図３Ｂは、血漿ＤＮＡと尿ＤＮＡとの間の不揃い状態の比較を示す。図３Ａは、妊婦の血漿中ＤＮＡと血尿を有する対照対象の尿ＤＮＡとの間のＪＩ－Ｕ値をグラフで示す。ｙ軸は、不揃い指数－非メチル化（jagged index－unmethylated、ＪＩ－Ｕ）である。ｘ軸は、血漿中ＤＮＡ（３０人の対象）及び尿ＤＮＡ（３９人の対象）についての結果を示す。図３Ａは、血尿を有する対照対象の尿ＤＮＡのＪＩ－Ｕ値（中央値：３５．８、範囲：２１．３～６０．０）が、妊婦の血漿ＤＮＡのＪＩ－Ｕ値（中央値：２１．７、範囲：１４．７～２６．２）（Ｐ値＜０．０００１、マン－ホイットニーＵ検定）よりも１．６倍高かったことを示す。

【0047】

図３Ｂは、無細胞ＤＮＡ断片の最初の３０個のヌクレオチド及び最後の３０個のヌクレオチドにおける異なる遺伝子座にわたる血漿中（青色三角）ＤＮＡと尿（赤色丸）ＤＮＡとの間のメチル化レベルをグラフで示す。ｙ軸は、メチル化レベルを全てのＣｐＧ部位のパーセンテージとして示す。ｘ軸は、断片の鎖の５’末端及び３’末端両方のヌクレオチド位置を示す。「ｎｔ」は、ヌクレオチドを表す。本出願において、「ｎｔ」及びヌクレオチドは、塩基と互換的に使用され得る。「５’末端に対して３０ｎｔ近位」については、より高いヌクレオチド数は、より低いヌクレオチド数よりも５’末端から遠い。「３’末端に対して３０ｎｔ近位」については、より低いヌクレオチド数は、より高いヌクレオチド数よりも３’末端から遠い。全てのアライメントされたペアエンドリードをプールした後に、リード１及びリード２において異なるＣｐＧ部位にわたるメチル化レベルを分析することによって、本発明者らは、尿ＤＮＡ分子の３’末端に近位のメチル化レベルが、血漿ＤＮＡ分子のメチル化レベルよりも低下したことを観察した。これらの結果は、尿ＤＮＡが、血漿中ＤＮＡと比較した場合に、より不揃い末端を有することを示した。

【0048】

Ｂ．不揃い末端によるサイズ分析
図４Ａ及び図４Ｂは、血漿ＤＮＡ及び尿ＤＮＡ間の断片化パターンを示す。図４Ａは、妊婦の血漿ＤＮＡ（青色線４０４）及び対照対象の尿ＤＮＡ（赤色線４０８）のサイズ分布を示す。対象は、図３Ａ及び図３Ｂにおいて分析された同じ対象である。ｘ軸は、断片のサイズを塩基対で示す。断片のサイズは、文脈上特に指示がない限り、末端修復後の分子の最も外側のヌクレオチドに基づき得る。ｙ軸は、特定のサイズの断片の頻度を示す。図４Ａは、尿ＤＮＡ及び血漿ＤＮＡ間のサイズプロファイルが顕著に異なっていたことを示す。尿ＤＮＡは、血漿中ＤＮＡよりも断片化されていた。

【0049】

図４Ｂは、複数の断片サイズにわたるＪＩ－Ｕ値を示す。ｘ軸は、断片のサイズを塩基対で示す。ｙ軸は、ＪＩ－Ｕを示す。６０～６００ｂｐの範囲にある各サイズにわたる尿ＤＮＡ（赤色線４１２）のＪＩ－Ｕ値はほぼ全て、血漿ＤＮＡ（青色線４１６）のＪＩ－Ｕ値よりも高かった。興味深いことに、血漿ＤＮＡのＪＩ－Ｕプロファイルは、小分子について、約１６５ｂｐ間隔（すなわち、およそ１ヌクレオソーム単位）でのいくつかの強く振動する主要ピーク及び約１０ｂｐ周期性での一連の弱く振動するマイナーピークを示し、一方、尿ＤＮＡは、弱く振動する主要ピークを示したが、強く振動するマイナーピークが存在した。この異なる挙動は、尿ＤＮＡの不揃い末端及び血漿ＤＮＡの不揃い末端が臨床的に異なる様式で実施され得ることを示唆し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ある特定のサイズ範囲の不揃い末端の選択的分析は、尿ＤＮＡ不揃い末端に基づく試験についての性能を向上させ得る。

【0050】

ＩＩＩ．がん及び非がん間の差別的不揃い状態
膀胱腫瘍ＤＮＡ分子は、膀胱がんを有する患者からの尿ＤＮＡに存在し（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２０１９；６５：９２７－９３６）、本発明者らは、膀胱がんを有する患者を評価するために尿ＤＮＡの不揃い状態を使用することの実現可能性を調査した。尿ＤＮＡの不揃い状態は、ＤＮＡ断片の異なるサイズ範囲を含む、膀胱がんの異なるレベルにわたって変動することが見出された。結果は、異なるレベルの障害が不揃い状態の尺度を使用して分類され得ることを示す。更に、断片の特定のサイズ又は断片の特定の位置を見ることにより、障害のレベルを判定する感受性及び／又は特異性を改善することができる。

【0051】

Ａ．指数値の差を示す結果
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ及び図５Ｄは、膀胱がんを有する患者の尿ＤＮＡにおけるＪＩ－Ｕ値を示す。図５Ａは、血尿を有するが膀胱がん、低悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（non－muscle invasive bladder cancer、ＮＭＩＢＣ ＬＧ）、高悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ ＨＧ）、及び筋肉浸潤性膀胱がん（muscle invasive bladder cancer、ＭＩＢＣ）を有しない対照対象にわたるＪＩ－Ｕの箱ひげ図を示す。図５Ａのｘ軸は、対照対象及び膀胱がんを有する対象を示す。各群における対象の数を、ｘ軸ラベルに示す。ＪＩ－Ｕは、ｙ軸上に示されている。図５Ａに示すように、血尿を有するがんのない対照（中央値：３３．９、範囲２１．３～５０．７）と比較すると、尿ＤＮＡの不揃い末端指数（ＪＩ－Ｕ）は、血尿を頻繁に呈した膀胱がんを有する患者において有意に低かった（中央値：２６．６、範囲：３．５～５０．７）（Ｐ値＜０．０００１、マン－ホイットニーＵ検定）。ＭＩＢＣを有する患者は、最も低い中央値ＪＩ－Ｕ値を示した。

【0052】

図５Ｂは、異なるタイプの試料について異なるサイズにわたって変化するＪＩ－Ｕ値を示す。図５Ｂは、ｙ軸上にＪＩ－Ｕを、ｘ軸上に塩基対における断片のサイズを示す。青色線５０４は、血尿を有するが膀胱がんを有しない対照対象を示す。緑色線５０８は、低悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ ＬＧ）を示す。黄色線５１２は、高悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ ＨＧ）を示す。赤色線５１６は、筋肉浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）を示す。膀胱がんを有する患者における尿ＤＮＡの不揃い状態の低減は、異なるサイズの範囲にわたって規則的に現れる。

【0053】

図５Ｃは、図５Ａと同様に、血尿を有するが膀胱がん、低悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ ＬＧ）、高悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ ＨＧ）、及び筋肉浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）を有しない対照対象にわたるＪＩ－Ｕの箱ひげ図を示す。しかしながら、図５Ｃは、１３０～１６０ｂｐの断片、及びＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＮＡＳＥ１ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅ、ＤＨＳ）との重複についての結果を示す。図５Ａのｘ軸は、対照対象及び膀胱がんを有する対象を示す。各群における対象の数を、ｘ軸ラベルに示す。ＪＩ－Ｕは、ｙ軸上に示されている。図５Ｃは、図５Ａと比較して、対照対象及び膀胱がんを有する対象についてのＪＩ－Ｕ間のより大きな分離を示す。図５Ｃはまた、１３０～１６０ｂｐについてのＪＩ－Ｕが、図５Ａに示される結果と比較して、異なる膀胱がんグレード間でより多い差別性を示すことを示す。

【0054】

尿中のＤＮＡＳＥ１活性が血漿中よりもはるかに高かったという事実（Ｎａｄａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．１９９３；３９：４４８－５２）に基づいて、一実施形態では、不揃い末端分析のためにＤＨＳと重複する尿ＤＮＡ分子を用いることができる。ＤＨＳは、ＤＮＡＳＥ Ｉ切断部位の過剰発現を示すゲノム領域として定義された。ＤＨＳを、ＥＮＣＯＤＥ（ＤＮＡエレメントの百科事典）データベース（ｅｎｃｏｄｅｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）からダウンロードした。ＤＨＳと重複した１３０～１６０ｂｐの断片を使用してがんを差別化することは、全ての断片で差別化することと比較して改善された（Ｐ値：０．０２、ＤｅＬｏｎｇ検定）。

【0055】

Ｂ．分類精度
図５Ｄは、膀胱がんを判定するＪＩ－Ｕを使用するための受信者操作特徴（ＲＯＣ）曲線を示す。感受性は、ｙ軸にプロットされ、特異性は、ｘ軸にプロットされている。赤色曲線５２０は、全ての断片サイズでＪＩ－Ｕを使用するためのものである。青色曲線５２４は、１３０～１６０ｂｐの範囲内の断片サイズでＪＩ－Ｕを使用し、ＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＨＳ）と重複するためのものである。ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、全ての断片を使用した場合に０．７５であった。これらの結果は、尿ＤＮＡの不揃い末端が膀胱がんのバイオマーカーとして役立ち得ることを示唆した。膀胱がんを有する患者における尿ＤＮＡの不揃い状態についての観察は、血漿ＤＮＡ不揃い末端について観察されたものとは反対であった。ＨＣＣを有する患者の血漿中の腫瘍ＤＮＡの不揃い状態は、造血起源のそのＤＮＡよりも高く（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０２０；３０：１１４４－１１５３）、血漿及び尿ＤＮＡ分子の不揃い末端の異なる特性を更に示唆している。

【0056】

その結果、本発明者らは、膀胱がんを有する患者と膀胱がんを有しない患者とを差別化する能力の増強を観察した（ＡＵＣ：０．８３）（図５Ｄ）。いくつかの実施形態では、４０～７０ｂｐ、７０～１００ｂｐ、１００～１３０ｂｐ、１３０～１６０ｂｐ、１６０～１９０ｂｐなどのサイズ範囲、及び／又はこれらのサイズ範囲の組み合わせを含むサイズ範囲を使用することができるが、それらに限定されない。

【0057】

Ｃ．例示的な方法
図６は、不揃い末端指数値を使用して生体試料を分析する方法６００を示している。

【0058】

ブロック６０１では、尿試料が受け取られ得る。尿試料は、個体から得られ得る。尿試料は、無細胞である複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖からオーバーハングする場合があり、第２の鎖にハイブリダイズしない場合がある。第１の部分は、第１の鎖の第１の末端にあり得る。第１の末端は、３’末端又は５’末端であり得る。

【0059】

統計的に有意な数の無細胞核酸分子は、第１の組織タイプからの比例的寄与の正確な判定を提供するために分析され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１，０００個の無細胞核酸分子が分析される。他の実施形態では、少なくとも１０，０００個又は５０，０００個又は１００，０００個又は５００，０００個又は１，０００，０００個又は５，０００，０００個、又はそれより多い無細胞核酸分子が分析され得る。更なる例として、少なくとも１０，０００又は５０，０００又は１００，０００又は５００，０００又は１，０００，０００又は５，０００，０００の配列リードを生成することができる。分析される無細胞核酸分子の数は、本明細書に記載される任意の方法に適用され得る。

【0060】

ブロック６０２では、方法６００は、複数の核酸分子の各核酸分子の特徴を測定することを含み得る。測定することは、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さに相関する（例えば、比例する）第１の鎖、第２の鎖、又は第１の鎖及び第２の鎖の特徴を測定することを含み得る。特徴はまた、第２の鎖にオーバーハングする第１の鎖の長さに相関し得る。特徴は、複数の核酸のうちの各核酸について測定され得る。特徴は、複数の核酸分子の各々の第１及び／又は第２の鎖の末端部分における１つ以上の部位におけるメチル化状態であり得る。特徴は、記載される任意の技術によって測定され得る。いくつかの実施形態では、特徴は、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さであり得る。長さは、直接判定され得る。

【0061】

いくつかの実施形態では、方法６００は、核酸分子のサイズを測定することを含み得る。複数の核酸分子は、特定の範囲内のサイズを有し得る。指定された範囲は、４０～７０ｂｐ、７０～１００ｂｐ、１００～１３０ｂｐ、１３０～１６０ｂｐ、１６０～１９０ｂｐ、１９０～２５０ｂｐ、２５０ｂｐ超、生体試料中に存在するサイズの全範囲未満の任意の範囲、本明細書に記載される任意の範囲、又は本明細書に記載される範囲の任意の組み合わせ（不連続な範囲を含む）であり得る。指定された範囲は、異なる状態レベル間の統計的に有意な分離を示す以前のデータに基づき得る。サイズ範囲は、より短い鎖又はより長い鎖のサイズに基づき得る。サイズ範囲は、末端修復後の分子の最も外側のヌクレオチドに基づき得る。５’末端が突出している場合、５’から３’までのポリメラーゼを介した伸長が起こり、サイズはより長い鎖になり得るであろう。３’から５’までの合成機能を持つＤＮＡポリメラーゼなしで、３’末端が突出している場合、３’末端の突出した一本鎖がトリミングされ、サイズがより短い鎖になり得る。

【0062】

実施形態では、方法６００は、リードを生成する核酸分子を分析することを含み得る。リードは、参照ゲノムにアライメントされ得る。複数の核酸分子は、ＣＴＣＦ部位又はＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＨＳ）部位を含む、転写開始部位又は結合部位に対して、ある特定の距離範囲内のリードであり得る。ある特定の部位からの距離に関連する方法は、本開示における他の箇所で更に詳細に考察される。

【0063】

ブロック６０４では、不揃い指数値が、複数の核酸分子の測定された特徴を使用して、判定され得る。不揃い指数値は、後述するように、不揃い指数－非メチル化（ＪＩ－Ｕ）又は不揃い指数－メチル化（ＪＩ－Ｍ）を含む、不揃い末端値であり得る。不揃い指数値は、第１及び／又は第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを含み得る。いくつかの実施形態では、不揃い指数値は、複数の核酸分子の不揃い末端の長さの統計値（例えば、平均値、中央値、最頻値、パーセンタイル）であり得る。

【0064】

第１の複数の核酸分子が指定されたサイズ範囲にある場合、方法は、第２の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の特徴を測定することを含み得る。第２の複数の核酸分子は、第２の指定されたサイズ範囲を有するサイズを有し得る。不揃い指数値を判定することは、第１の複数の核酸分子の測定された特徴及び第２の複数の核酸分子の測定された特徴を使用して、比を計算することを含み得る。

【0065】

不揃い指数値は、参照値と比較され得る。参照値又は比較は、トレーニングデータセットを用いた機械学習を使用して判定され得る。

【0066】

ブロック６０６では、個体の状態のレベルが、不揃い指数値を使用して判定され得る。いくつかの実施形態では、状態のレベルは、不揃い指数値の参照値に対する比較に基づいて判定され得る。状態のレベルは、不揃い指数値が参照値を超える場合に、存在する、可能性が高い、又は重度であるとして分類され得る。状態には、疾患、障害、又は妊娠が含まれ得る。状態には、がん、自己免疫疾患、妊娠関連状態、又は本明細書に記載の任意の状態が含まれ得る。例として、がんには、膀胱がん、肝細胞がん（hepatocellular carcinoma、ＨＣＣ）、大腸直腸がん（colorectal cancer、ＣＲＣ）、白血病、肺がん、又は咽頭がんが含まれ得る。自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus、ＳＬＥ）を挙げることができる。いくつかの実施形態では、疾患には、泌尿器問題、尿路感染症、腎臓の炎症、又は膀胱の炎症（すなわち、膀胱炎）が含まれ得る。以下の様々なデータは、状態のレベルを判定するための例を提供する。

【0067】

方法は、患者における疾患又は状態のレベルを判定した後に、患者における疾患又は状態を治療することを更に含み得る。治療は、判定されたがんのレベル、識別された変異、及び／又は原発組織によって提供され得る。例えば、（例えば、多型実装例の）識別された変異は、特定の薬物又は化学療法によって標的化され得る。原発組織を使用して、手術又は任意の他の形態の治療を誘導することができる。また、がんのレベルを使用して、任意のタイプの治療においてどれほど積極的になるべきかを判定することができ、これもまた、がんのレベルに基づいて判定され得る。がんは、化学療法、薬物、食事療法、療法、及び／又は手術によって治療され得る。いくつかの実施形態では、パラメータの値が参照値を超えるほど、治療はより積極的になり得る。

【0068】

治療には、経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）が含まれ得る。この措置は、診断、病期分類、及び治療に使用される。ＴＵＲＢＴ中、外科医は、膀胱鏡を尿道から膀胱に挿入する。次いで、小型ワイヤーループ、レーザー、又は高エネルギー電気を備えたツールを使用して、腫瘍が切除される。ＮＭＩＢＣを有する患者の場合、がんの治療又は除去のためにＴＵＲＢＴが使用され得る。別の治療には、根治的膀胱切除術及びリンパ節郭清が含まれ得る。根治的膀胱切除術は、膀胱全体、並びに場合によっては周囲の組織及び器官の除去である。治療はまた、尿路変更術を含み得る。尿路変更術は、膀胱が治療の一部として除去された場合に、医師が、尿が体外に出るための新しい経路を作り出す場合である。

【0069】

治療には、化学療法が含まれ得、これは、通常がん細胞の成長及び分裂を防ぐことによって、がん細胞を破壊するための薬物の使用である。薬物は、例えば、膀胱内化学療法のためのマイトマイシン－Ｃ（ジェネリック医薬品として入手可能）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、及びチオテパ（Ｔｅｐａｄｉｎａ）を伴い得るが、これらに限定されない。全身化学療法は、例えば、シスプラチンゲムシタビン、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｔｒｅｘａｌｌ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）、ドキソルビシン、及びシスプラチンを伴い得るが、これらに限定されない。

【0070】

いくつかの実施形態において、治療には、免疫療法が含まれ得る。免疫療法には、ＰＤ－１と呼ばれるタンパク質をブロックする免疫チェックポイント阻害剤が含まれ得る。阻害剤には、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、及びペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0071】

治療の実施形態はまた、標的療法を含み得る。標的療法は、がんの成長及び生存に寄与するがんの特定の遺伝子及び／又はタンパク質を標的とする治療である。例えば、エルダフィチニブは、がん細胞の成長又は拡散を続けているＦＧＦＲ３又はＦＧＦＲ２遺伝子変異を伴う局所進行性又は転移性尿路上皮がんを有する人々を治療するために承認された、経口投与される薬物である。

【0072】

一部の治療法には、放射線療法が含まれ得る。放射線療法は、がん細胞を破壊するために高エネルギーＸ線又は他の粒子を使用することである。各個々の治療に加えて、本明細書に記載のこれらの治療の組み合わせが使用され得る。いくつかの実施形態において、パラメータの値が閾値を超え、閾値自体が参照値を超える場合、治療の組み合わせが使用され得る。参考文献における治療に関する情報は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0073】

状態の分類はまた、他の臨床因子に基づき得る。例えば、個体は、遺伝的要因のために又は年齢のために特定の状態のリスクにあるとみなされ得る。いくつかの例では、個体は、状態の症状を示している場合がある。

【0074】

ブロック６０６が実施されるとき、参照値は、状態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して判定され得る。別の例として、参照値は、状態を有しない対象の１つ以上の参照試料を使用して判定される。参照試料から複数の参照値を判定でき、異なる参照値は、状態の異なるレベルを識別する可能性がある。参照値は、本明細書に記載される任意の参照値であり得る。

【0075】

いくつかの実施形態では、参照との比較は、例えば、教師あり学習を使用して訓練された機械学習モデルを伴うことができる。不揃い指数値（並びにコピー数、ＤＮＡ断片のサイズ、及びメチル化レベルなどの可能性がある他の基準）、並びにトレーニング試料を取得した対象をトレーニングする既知の状態は、トレーニングデータセットを形成することができる。機械学習モデルのパラメータは、トレーニングセットに基づいて最適化され、状態のレベルを分類する際の最適化された精度を提供することができる。機械学習モデルの例としては、ニューラルネットワーク、決定木、クラスタリング、サポートベクターマシンが挙げられる。

【0076】

ＩＶ．末端密度によるヌクレオソームフットプリント
ＣＴＣＦ結合部位付近の末端密度を調べた。末端密度は、ＤＮＡ断片のＵ末端とＤ末端との間で相殺され得る。本発明者らは、異なる末端の密度間の差が状態のレベルを判定するために使用され得るかどうかを調査した。尿ＤＮＡの異なる末端の密度の差を使用して、膀胱がんの異なるレベルを正確に判定した。

【0077】

Ａ．末端密度の差
図７Ａは、血漿及び尿ＤＮＡ分子についてのＣＴＣＦ結合部位付近のＵ末端密度及びＤ末端密度を示す。ｙ軸は、血漿ＤＮＡ末端密度である。末端密度は、ＣＴＣＦ結合部位に対して１ｋｂ上流／下流にわたる遺伝子座にわたるそれらの値の中央値によって正規化された末端発生の値である。上のグラフは、血漿ＤＮＡについての末端密度を示す。紫色線７０４は、上流末端を表す。青色線７０８は、下流末端を表す。下のグラフは、尿ＤＮＡの末端密度を示す。紫色線７１２は、上流末端を表す。青色線７１６は、下流末端を表す。ｘ軸は、ＣＴＣＦ結合部位からの塩基対における距離である。正の数は、ＣＴＣＦ結合部位の下流である。負の数は、ＣＴＣＦ結合部位の上流である。上のグラフの上の漫画は、血漿中ＤＮＡでの及び尿ＤＮＡでの末端密度についての結果に関連する可能なヌクレオソーム構造を示す。図７Ａについてのデータは、がんを有する対象及びがんを有しない対象の両方からのものである。

【0078】

図７Ａに見られるように、ワトソン鎖（すなわち、参照ゲノムに示される鎖と同一の鎖）に由来する血漿ＤＮＡ分子については、ＣＴＣＦ結合部位付近のＵ末端密度及びＤ末端密度の両方が、ヌクレオソームアレイのよく組織化されたパターンに似た、約１８０ｂｐ間隔の周期的シグナルを示した。末端密度の２つの連続するピーク間の距離は、ヌクレオソームフットプリントの判定を容易にし得る。末端密度のピークは、血漿ＤＮＡ生成中の好ましい切断を示唆していた。Ｕ末端密度及びＤ末端密度の配向パターンはまた、ＣＴＣＦ結合部位付近（上流／下流３００）でも観察され、これは以前の報告（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１９；２９；４１８：２７）と一貫性があった。ＣＴＣＦ結合部位の上流及び下流３００ｂｐの範囲外のＵ末端密度及びＤ末端密度トラック間の小さなオフセット（約２０ｂｐ）は、リンカーＤＮＡの部分分解による可能性が高かった。対照的に、尿ＤＮＡ分子については、ヌクレオソームアレイのパターンはあまり明らかにならず、オフセットはより広くなり、高い可能性で、血漿ＤＮＡ生成と比較して、尿ＤＮＡ断片の生成中に更なるＤＮＡ分解があったことを示唆している。

【0079】

図７Ｂのグラフの末端密度及びＪＩ－Ｕ値は、ヌクレオソーム中心に対して遺伝子座にわたって分布されている。両方のグラフのｘ軸は、ヌクレオソーム中心までの距離である。上のグラフは、ｙ軸上に末端密度を示す。上のグラフは、血漿ＤＮＡ分子に基づくＵ末端（紫色線７２０）及びＤ末端（青色線７２４）の末端密度をプロットしている。下のグラフは、血漿ＤＮＡ（青色線７２８）及び尿ＤＮＡ（赤色線７３２）の両方についてのＪＩ－Ｕ値を示す。上のグラフの上の漫画は、ｘ軸に対するヌクレオソーム中心の位置を示す。上のグラフは、Ｕ末端密度及びＤ末端密度がリンカー領域に近位の領域において濃縮されたことを示し、これは以前の報告（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１８；１１５：Ｅ５１０６－１４）と合致している。下のグラフは、ＪＩ－Ｕ値が、他の位置よりもリンカー領域に近位の領域において比較的高いことが観察されたことを示す。血漿ＤＮＡの平均ＪＩ－Ｕにおける２２．４％の上昇が、ヌクレオソームコア領域と比較して、リンカーＤＮＡ領域において観察された。尿ＤＮＡについては、リンカーＤＮＡ領域における平均ＪＩ－Ｕは、１３．１％増加した。

【0080】

図８は、ＣＴＣＦ結合部位についての尿ＤＮＡの末端密度のグラフである。ｙ軸は、尿ＤＮＡ末端の発生（すなわち、末端密度）を示す。ｘ軸は、ＣＴＣＦ結合部位からの塩基対における距離を示す。末端密度は、ＣＴＣＦ結合部位に対して１ｋｂ上流／下流にわたる遺伝子座にわたるそれらの値の中央値によって正規化された末端発生の値であった。紫色線８０４は、上流末端を表す。青色線８０８は、下流末端を表す。グラフ中の縦のカラムは、－８０±２０ｂｐ及び＋８０±２０ｂｐの距離範囲を強調している。尿ＤＮＡのＵ末端密度及びＤ末端密度は、ＣＴＣＦ結合部位の周囲の周期的なシグナルを示す。Ｕ末端及びＤ末端の密度は、オープンクロマチン領域内の病態生理学的状態を知らせるためのバイオマーカーとして使用され得る。図８のデータは、がんを有しない対象に基づく。

【0081】

本発明者らは、－８０±２０ｂｐの距離範囲内のＤ末端とＵ末端との間の末端密度における累積差（ΔＣ１）及び＋８０±２０ｂｐの距離範囲内のＵ末端とＤ末端との間の末端密度における累積差（ΔＣ２）を測定値として使用した。一実施形態では、ΔＣ１とΔＣ２の和（ΔＣ）は、患者ががんを有し得るかどうかを評価するための分子指標として使用され得る。－８０±２０ｂｐ及び＋８０±２０ｂｐのサイズ範囲は、Ｕ末端密度とＤ末端密度との間のオフセットを示した。他の実施形態では、サイズ範囲は、－４０±２０ｂｐ、－５０±２０ｂｐ、－６０±２０ｂｐ、－７０±２０ｂｐ、－１００±２０ｂｐ、＋４０±２０ｂｐ、＋５０±２０ｂｐ、＋６０±２０ｂｐ、＋７０±２０ｂｐ、＋１００±２０ｂｐ（これらに限定されないが）、又はこれらの範囲の組み合わせを含み得る。

【0082】

図９は、血尿を有する対照対象、並びに低悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ－ＬＧ）、高悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ－ＨＧ）及び筋肉浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）を有する患者にわたる末端密度の累積差（ΔＣ）の箱ひげ図を示す。ｙ軸は、末端密度の累積差（ΔＣ）を示す。ｘ軸は、対象の異なる群を示す。尿ＤＮＡのΔＣ値は、がんを有しない対象（中央値：７．２；範囲：－４．９～２２．７７）（Ｐ値＜０．０００１、マン－ホイットニーＵ検定）と比較して、膀胱がんを有する患者において有意により高かった（中央値：１２．８；範囲：－３６．１～２５．９）。結果は、ΔＣが非侵襲的な様式でがんを検出するために使用され得ることを示唆した。

【0083】

Ｂ．分類精度
図１０Ａ及び図１０Ｂは、ΔＣ測定基準を使用してがんを有する患者とがんを有しない患者とを差別化するためのＲＯＣ曲線を示す。両方のグラフは、ｙ軸上に感受性を、ｘ軸上に特異性を有する。図１０Ａは、任意のレベルの膀胱がんを有する全ての患者対対照対象を使用したＲＯＣ曲線である。ＡＵＣは、任意のレベルの膀胱がんを有する対象を対照対象から区別するための０．７５である。図１０Ｂは、筋肉浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）を有する患者対対照対象を使用したＲＯＣ曲線である。ＡＵＣは、ＭＩＢＣを有する対象を対照対象から区別するための０．８８である。これらのデータは、がん検出のためのΔＣメトリックのべき乗ががんステージに基づいて変化し得ることを示唆している。より進行したステージのがんは、より大きなΔＣメトリック及びより高いＡＵＣをもたらし得る。これらのデータはまた、がんの異なるステージがΔＣメトリックに基づいて区別され得ることを示唆している。

【0084】

Ｃ．例示的な方法
図１１は、個体から得られた生体試料を分析する方法１１００を示す。生体試料は、本明細書に記載の任意の生体試料であり得る。いくつかの実施形態では、生体試料は、尿試料であり得る。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞である。

【0085】

ブロック１１０２では、複数の核酸分子の核酸分子のセットが、検出され得る。核酸分子のセットの各核酸分子は、所定のタイプのゲノム部位からの特定の距離にゲノム位置を有する少なくとも１つの末端によって特徴付けられ得る。所定のタイプは、ゲノム部位におけるクロマチン中のタンパク質の改変又はゲノム部位におけるタンパク質相互作用に関連し得る。所定のとは、部位のタイプが配列決定及び／又はアライメントの前に判定されることを意味し得る。ゲノム部位は、ＣＴＣＦ結合部位又はＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＨＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、ゲノム部位は、ヌクレオソーム中心、ヌクレオソームの末端、又はヌクレオソームに対応する領域であり得る。

【0086】

核酸分子のセットを識別することは、核酸分子のセットの各核酸分子を配列決定して、１つ以上のリードを生成することを含み得る。配列決定は、例えば本明細書に記載されるような様々な方法で実施することができる。１つ以上のリードは、参照ゲノム（例えば、ヒト参照ゲノム）に対してアライメントされ得る。核酸分子のゲノム位置は、１つ以上のリードから判定され得る。

【0087】

ブロック１１０４では、核酸分子のセットの各核酸分子の一方の末端は、上流末端として分類され得、他方の末端は、下流末端として分類され得る。分類は、各核酸分子をアライメントさせることを含み得る。アライメントにより、核酸分子の末端で又はその付近でゲノム座標の判定がもたらされ得る。下流末端は、ゲノム位置についてより高い値（例えば、より高いゲノム座標）を有する末端に基づいて、識別され得る。いくつかの実施形態では、５’末端は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長方向の上流にあることによって判定され得る（すなわち、５’→３’ＤＮＡ合成）。いくつかの実施形態では、５’末端及び３’末端は、ヌクレオチドの化学構造によって判定され得る。例えば、デオキシリボース環の５番目の炭素は、概して、リン酸基（すなわち、５’末端）を担持し、デオキシリボース環の３番目の炭素は、概して、ヒドロキシル基（すなわち、３’末端）を担持する。その結果、両方の末端が分類され得る。

【0088】

ブロック１１０６では、指定された距離に上流末端を有する核酸分子の第１の量が判定され得る。第１の量は、核酸分子の数、全長、又は全質量であり得る。

【0089】

ブロック１１０８では、特定の距離に下流末端を有する核酸分子の第２の量が判定され得る。第２の量は、核酸分子の数、全長、又は全質量であり得る。

【0090】

ブロック１１１０では、第１の量及び第２の量を使用する分離値が判定され得る。分離値は、それらの量の差又は比であり得る。

【0091】

分離値は、カットオフ値と比較され得る。参照値は、状態を有しない対象からの１つ以上の対照試料から、又は状態を有する対象からの１つ以上の対照試料から判定され得る。参照値は、本明細書に記載される任意の参照値として判定され得る。

【0092】

ブロック１１１２では、個体の状態のレベルは、分離値を使用して判定され得る。その判定は、分離値を参照値と比較することに基づき得る。状態は、本明細書に記載される任意の状態であり得る。より深刻なレベルの状態は、より大きな分離値に関連付けられ得る。分離値が参照値を超える場合、個体は、状態を有するか、又は状態の高い可能性を有するとして分類され得る。方法は、本明細書に記載される治療で状態を治療することを含み得る。

【0093】

いくつかの実施形態では、分類は、例えば、図６のブロック６０６について記載されるように、機械学習モデルを使用して実施され得る。

【0094】

Ｖ．臨床的に関連するＤＮＡの濃縮
ある特定のタイプの組織又は試料は、他のものとは異なる不揃い状態特性を有し得る。例えば、胎児ＤＮＡは、母体ＤＮＡよりも不揃いであり得る。移植組織のレシピエントについて、レシピエントのＤＮＡは、ドナーのＤＮＡとは異なる不揃い状態を有し得る。したがって、ある特定の量又は範囲の不揃い状態についてＤＮＡを（物理的に若しくはインシリコで）濃縮又はフィルタリングすることを使用して、特定のタイプの組織のシグナルを増強することができる。次いで、濃縮されたＤＮＡを、異なる分析のために使用することができる。

【0095】

Ａ．妊婦の母体尿ＤＮＡ分子及び胎児尿ＤＮＡ分子間の不揃い末端
本発明者らはまた、妊婦の尿ＤＮＡ中の母体由来分子及び胎児由来分子間の不揃い状態の差異を試験した。本発明者らは、マイクロアレイプラットフォーム（Ｈｕｍａｎ Ｏｍｎｉ２．５、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、母体バフィーコート及び胎盤組織の遺伝子型を特定した。５人の妊婦から排泄された尿試料を収集した。

【0096】

母親がホモ接合性（すなわち、ＡＡ）であり、かつ胎児がヘテロ接合性（すなわち、ＡＢ）である、胎児特異的対立遺伝子を既定することを可能にした、１９１，１４３の有益な一塩基多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）遺伝子座（範囲：３１１～２０７，３６３）の中央値が存在していた。本発明者らは、母親がヘテロ接合体（ＡＢ）であり、胎児がホモ接合体（ＡＡ）である、母体特異的対立遺伝子を既定することを可能にした、１９１，６５５の有益なＳＮＰ遺伝子座（範囲：８，７６４～２１４，８１５）の中央値を得た。母体特異的対立遺伝子及び胎児特異的対立遺伝子を担持する尿ＤＮＡ分子は、母体由来の尿ＤＮＡ分子及び胎児由来の尿ＤＮＡ分子とみなされた。

【0097】

中央値４５００万（範囲：２５００万～９３００万）のマッピングされた対をなす尿ＤＮＡリードが、各妊娠血漿対象から得られた。それらの試料間の中央値の胎児ＤＮＡ画分は、０．５％（範囲：０．４％～０．９％）であった。全ての母体特異的ＤＮＡ分子及び胎児特異的ＤＮＡ分子が、それぞれプールされ、本開示の実施形態による不揃い末端指数（ＪＩ－Ｕ）を計算するために使用された。

【0098】

図１２は、妊婦の母体由来尿ＤＮＡ及び胎児由来尿ＤＮＡ間のＪＩ－Ｕ値を示す。ｙ軸は、ＪＩ－Ｕを示す。ｘ軸は、母体由来ＤＮＡ及び胎児由来ＤＮＡを示す。図１２に示すように、胎児尿ＤＮＡ（ＪＩ－Ｕ：３０．１）のＪＩ－Ｕは、妊婦の尿中の母体ＤＮＡ（ＪＩ－Ｕ：２８．９）のＪＩ－Ｕよりも高い。言い換えれば、胎児由来尿ＤＮＡでは、母体由来尿ＤＮＡと比較して、４．１％のＪＩ－Ｕ値の増加が認められた。これらの結果は、尿ＤＮＡの不揃い末端が原発組織を反映し得ることを示唆した。尿ＤＮＡの不揃い状態は、非侵襲性出生前検査に有用であり得る。例えば、より高い不揃い状態指数を有するＤＮＡ分子は、胎児ＤＮＡを濃縮する。尿ＤＮＡ不揃い末端に基づくそのような選択は、尿ＤＮＡプールにおける胎児ＤＮＡ画分が高いほど、尿ＤＮＡを使用する胎児障害の検出がより感受性であるために、尿ＤＮＡ分子を使用する胎児障害の検出を容易にする。

【0099】

Ｂ．移植を受けた患者における不揃い末端
本発明者らは、腎臓移植（ｎ＝１０）、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ、ｎ＝１）及び肝臓移植（ｎ＝１）を含む、移植を受けた１２人の患者における尿ＤＮＡのＪＩ－Ｕを分析した。本発明者らは、超並列バイサルファイト配列決定を使用して、中央値５４００万の対をなす末端リード（範囲：２９００万～２億９６００万）を得た。レシピエントがホモ接合性（すなわち、ＡＡ）であり、かつドナーがヘテロ接合性（すなわち、ＡＢ）であるか、又はレシピエント及びドナーの両方がホモ接合性であるが異なる遺伝子型（すなわち、ＡＡ対ＢＢ）にある、ドナー特異的対立遺伝子を既定することを可能にする、ドナー特異的情報提供的ＳＮＰ遺伝子座の中央値２０１，４９９（範囲：１４，０９１～３２８，８６１）が存在した。レシピエントがヘテロ接合性（すなわち、ＡＢ）であり、かつドナーがホモ接合性（すなわち、ＡＡ）であるか、又はレシピエント及びドナーの両方がホモ接合性であるが異なる遺伝子型（すなわち、ＡＡ対対ＢＢ）にある、レシピエント特異的対立遺伝子を既定することを可能にした、レシピエント特異的情報提供的ＳＮＰ遺伝子座の中央値１９５，４７５（範囲：２，９１３～３３４，１２２）が存在した。レシピエント特異的対立遺伝子及びドナー特異的対立遺伝子を担持する尿ＤＮＡ分子は、レシピエント由来尿ＤＮＡ分子及びドナー由来尿ＤＮＡ分子とみなされた。それらの試料間の胎児ＤＮＡ画分中央値は、３２．９％（範囲：２．５％～９４．０％）であった。尿中のレシピエント由来ＤＮＡ分子及びドナー由来ＤＮＡ分子についてのＪＩ－Ｕパターンが、本開示の実施形態に従って各試料についてそれぞれ推定された。

【0100】

図１３Ａ、図１３Ｂ、及び図１３Ｃは、異なる移植患者におけるレシピエント由来ＤＮＡ及びドナー由来ＤＮＡのＪＩ－Ｕ値を示す。図１３Ａは、腎臓移植を受けた患者を示す。図１３Ｂは、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けた患者を示す。図１３Ｃは、肝臓移植を受けた患者を示す。３つの図の各々のｙ軸は、ＪＩ－Ｕを示す。３つの図の各々のｘ軸は、レシピエント由来ＤＮＡ及びドナー由来ＤＮＡを示す。

【0101】

図１３Ａは、腎臓移植を受けた患者の尿中のレシピエントＤＮＡ（中央値：３２．２）と比較して、ドナーＤＮＡ（中央値：３０．１）でＪＩ－Ｕの６．５％の減少を示す。対照的に、図１３Ｂ及び図１３Ｃは、ドナーＤＮＡにおけるＪＩ－Ｕの増加を示す。

【0102】

図１３Ｂは、ＨＳＣＴにおけるレシピエントＤＮＡ（ＪＩ－Ｕ：３３．４）と比較して、ドナーＤＮＡ（ＪＩ－Ｕ：３９．３）におけるＪＩ－Ｕの１７．６％の増加を示す。

【0103】

図１３Ｃは、肝臓移植の患者の尿中のレシピエントＤＮＡ（３８．７）と比較して、ドナーＤＮＡ（４２．６）におけるＪＩ－Ｕの増加（上昇：約１０．０％）を示す。

【0104】

これらの結果は、経腎性ＤＮＡ分子が、腎後性ＤＮＡ分子よりも大きい不揃い状態によって特徴付けられ得ることを示唆した。したがって、一実施形態では、不揃い状態マーカーを使用して、長い不揃い末端を有する尿ＤＮＡ分子を選択的に分析することによって経腎性ＤＮＡ分子を濃縮することができ、それによって、尿ＤＮＡを使用した泌尿器系外の器官損傷（例えば、血球、肝臓、肺、及び結腸など）のモニタリングの性能を改善することができる。選択的分析は、所望の尿ＤＮＡ分子のインシリコ選択及び物理的選択を伴い得る。物理的選択としては、ＤＮＡプローブによって媒介される磁気ビーズベースのハイブリダイゼーションアッセイ、ゲル電気泳動、及びマイクロ流体力学（それらに限定されない）が挙げられ得る。

【0105】

Ｃ．例示的濃縮方法
図１４は、臨床的に関連する核酸分子について個体から得られた生体試料を濃縮する方法１４００を示す。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子は、臨床的に関連する核酸分子及び他の核酸分子を含み得る。第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖からの相補的な部分を有しない。第１の部分は、第２の鎖にハイブリダイズしない場合がある。第１の部分は、第１の鎖の第１の末端に存在し得る。第１の部分は、第２の鎖からオーバーハングし得る。臨床的に関連する核酸分子は、胎児ＤＮＡ、腫瘍由来ＤＮＡ、移植ＤＮＡ、又は障害に関連するＤＮＡを含み得る。

【0106】

ブロック１４０２では、第１の複数の核酸分子内の核酸分子のサブセットが選択され得る。核酸分子のサブセットの各核酸分子について、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さは、閾値よりも大きくあり得る。第１の鎖の長さは、第２の鎖からオーバーハングし得る。核酸分子のサブセットは、複数の核酸分子よりも少ない核酸分子を含み得る。

【0107】

いくつかの実施形態では、核酸分子のサブセットを選択することは、第１の鎖及び／又は第２の鎖の特徴を測定することを含み得る。特徴は、複数の核酸分子の各核酸分子について、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さに相関し得る（例えば、比例し得る）。特徴は、第２の鎖からオーバーハングした第１の鎖の長さに比例し得る。特徴は、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さを含む、本明細書に記載される任意の特徴であり得る。核酸分子のサブセットを識別することは、コンピュータシステムによって、カットオフ値よりも大きい特徴を有する核酸分子を選択して、第２の複数の核酸分子を得ることを含み得る。カットオフ値は、オーバーハングの最小長さであり得る。例えば、その最小長さは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１０～１５個、１５～２０個、又は２０個以上のヌクレオチドであり得る。

【0108】

いくつかの実施形態では、核酸分子のサブセットを選択することは、最小長さのオーバーハングを有する分子の物理的選択を含み得る。核酸分子のサブセットを選択することは、複数の核酸分子の残りから核酸分子のサブセットを物理的に分離することを含み得る。例えば、方法は、オリゴヌクレオチドを、第１の複数の核酸分子の各核酸分子についての第１の鎖の長さにハイブリダイズさせることを含み得る。オリゴヌクレオチドの特徴は、測定され得る。オリゴヌクレオチドの特徴は、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さに比例し得る。カットオフ値よりも大きい特徴を有する核酸分子を選択して、第２の複数の核酸分子を得ることができる。オリゴヌクレオチドは、１つ以上の蛍光マーカーを含み得る。特徴は、蛍光であり得る。オリゴヌクレオチドは、蛍光に基づいて選別され得る。一部の実施形態では、物理的選択は、ＤＮＡプローブによって媒介される磁気ビーズベースのハイブリダイゼーションアッセイ、ゲル電気泳動、及びマイクロ流体力学を含み得る。

【0109】

他のハイブリダイゼーションベースの捕捉濃縮技術とは異なり、ハイブリダイゼーション技術は、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを容易にするために、二本鎖ＤＮＡを変性させて一本鎖ＤＮＡを形成することを伴わない。二本鎖ＤＮＡ分子の不揃い末端は、すでに一本鎖ＤＮＡであり、不揃い末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子を変性させることは、不揃い末端の長さを判定することをより困難にすることがある。

【0110】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、カットオフ長さを超えるオリゴヌクレオチドのマーカーに結合され得る。方法は、マーカーを有する核酸分子を捕捉して、第２の複数の核酸分子を得ることを含み得る。マーカーは、選択的に捕捉され得る構造を有するビオチン又は他の分子を含み得る。核酸分子は、マーカーを結合することによって捕捉され得る。捕捉された核酸分子を増幅して、核酸分子の増幅されたサブセットを得ることができる。

【0111】

核酸分子の増幅されたサブセットは、他の領域よりも多い不揃い末端を有するゲノム領域を表し得る。例として、がんを有しない対象よりもがん（例えば、膀胱がん）を有する対象において、より長い不揃い末端を有するより多い分子を生成するゲノム領域が識別され得る。長い不揃い末端（例えば、１０ｎｔより長い）を標的とするプローブが設計され得る。プローブは、より短い不揃い末端よりも長い不揃い末端に優先的に結合し得る。ある特定の長さより長いプローブは、そのある特定の長さより短い不揃い末端にハイブリダイズするのが困難である。加えて、プローブがより短い長さにハイブリダイズすることができた場合であっても、プローブとより短い末端との間の親和性は、プローブとより長い長さとの間よりも低い。その結果、ハイブリダイズしたプローブ及びより短い不揃い末端は、安定でない可能性があり、ある特定の温度（インキュベーション温度など）では、ハイブリダイゼーションが変性することがある。

【0112】

様々なハイブリダイゼーションアッセイが使用され得る。ハイブリダイゼーションは、液体溶液中か又は固体支持体上のいずれかで達成され得る。液体溶液では、アッセイには、ハイブリッド生成物を単離する分離ステップが後続し得る。分離ステップは、磁場中に磁性粒子を伴い得る。ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズは、標的化された長い不揃い末端を選択的に収集し得る。いくつかの実施形態では、分離のために、吸収クロマトグラフィー、分別沈殿、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は免疫沈降を使用することができる。固体支持体を用いる場合、支持体は、ポリマービーズ、ガラススライド、樹脂を有するカラム、又は膜を含み得る。タグ付けされた長い不揃い末端は、支持基材に結合され得、非結合断片は、洗い流され得る（例えば、流体工学を使用して）。

【0113】

ブロック１４０４では、核酸分子のサブセットを分析して、臨床的に関連する核酸分子の特性を判定することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子のサブセットを分析することは、核酸分子の増幅されたサブセットを使用することを含み得る。

【0114】

核酸分子のサブセットを分析することは、第２の複数の核酸分子を使用してパラメータの値を判定することを含み得る。パラメータの値を判定することは、核酸分子の増幅されたサブセットを使用し得る。パラメータは、平均値、中央値、最頻値、パーセンタイル、最小値、又は最大値を含むサイズプロファイルの統計的尺度であり得る。いくつかの実施形態では、パラメータの値は、核酸分子の量であり得る。いくつかの実施形態では、パラメータの値は、ある特定の領域における核酸分子の量を使用して判定され得る。例えば、核酸分子の量を使用して、欠失及び増幅を含むコピー数異常の数を判定することができる。

【0115】

パラメータの値を使用した状態のレベルの分類が判定され得る。状態のレベルの分類を判定することは、パラメータの値を参照値と比較することを含み得る。状態のレベルは、パラメータの値が参照値を超える場合に、存在する、可能性が高い、又は重度であるとして分類され得る。参照値は、本明細書に記載される任意の参照値であり得る。状態には、疾患、障害、妊娠、又は移植状態が含まれ得る。状態には、がん、自己免疫疾患、妊娠関連状態、又は移植拒絶が含まれ得る。状態には、本明細書に記載の任意のメチル化が含まれ得る。方法は、状態が存在するか又は重篤であると分類することに続く治療を更に含み得る。その治療は、本明細書に記載される任意の治療を含み得る。

【0116】

状態の分類はまた、他の臨床因子に基づき得る。例えば、個体は、遺伝的要因のために又は年齢のために特定の状態のリスクにあるとみなされ得る。いくつかの例では、個体は、状態の症状を示している場合がある。

【0117】

いくつかの実施形態では、分類は、例えば、図６のブロック６０６について記載されるように、機械学習モデルを使用して実施され得る。

【0118】

ＶＩ．移植条件
本発明者らは更に、２つの腎臓移植試料（ＲＴ０１及びＲＴ０２）を、それぞれ７２００万及び７９００万の対をなすリードを用いて分析した。ドナーＤＮＡ画分は、ＲＴ０１及びＲＴ０２について、それぞれ、３２．９％及び５３．２％であることが見出された。

【0119】

図１５は、急性拒絶を有する腎臓移植患者及び急性拒絶を有しない腎臓移植患者の尿ＤＮＡのＪＩ－Ｕ値を示す。ｙ軸は、ＪＩ－Ｕ値を示す。ｘ軸は、異なる試料、拒絶のない試料及び２つの腎臓移植試料（ＲＴ０１及びＲＴ０２）についてのカテゴリーを示す。

【0120】

図１５に示されるように、本発明者らは、拒絶のない１０人の腎臓移植患者（ＪＩ－Ｕ中央値：３０．９）と比較して、急性拒絶を有する腎臓移植患者ＲＴ０１（ＪＩ－Ｕ：２４．７）においてＪＩ－Ｕの２０．０％の減少を観察した。本発明者らは、拒絶のない１０人の腎臓移植患者（ＪＩ－Ｕ中央値：３０．９）と比較して、急性拒絶を有する腎臓移植患者ＲＴ０１（ＪＩ－Ｕ：２４．６）においてＪＩ－Ｕの２０．４％の減少を観察した。これらのデータにより、尿ＤＮＡ分子のＪＩ－Ｕを使用して、臓器移植を有する患者をモニタし得ることが示唆された。

【0121】

レシピエント由来ＤＮＡよりもドナー由来ＤＮＡについてより高いＪＩ－Ｕ値を示す図１３Ｂ及び図１３Ｃに基づいて、本発明者らは、ＨＳＣＴ及び肝臓移植拒絶試料が、拒絶のない試料よりも高いＪＩ－Ｕ値を有することを予想する。

【0122】

図１６は、個体から得られた生体試料を分析する方法１６００を示す。個体は、第１の組織の移植のレシピエントであり得る。移植された第１の組織は、腎臓、造血幹細胞、又は肝臓からのものであり得る。いくつかの実施形態では、移植された組織は、心臓、肺、膵臓、又は腸を含む器官からのものであり得る。移植された組織は、器官とともに移植され得る。いくつかの実施形態では、移植は、角膜、皮膚、血液、骨、又は肢を含み得る。

【0123】

生体試料は、血液、血漿、尿、若しくは唾液を含み得るか、又は本明細書に開示される任意の生体試料であり得る。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子の各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖からの相補的な部分を有しない場合がある。第１の部分は、オーバーハングであり得るか、又は第２の鎖にハイブリダイズしていない場合がある。第１の部分は、第１の鎖の第１の末端に存在し得る。

【0124】

ブロック１６０２では、第１の鎖及び／又は第２の鎖の特徴は、複数の核酸分子の各核酸分子について測定され得る。特徴は、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さに相関し得る（例えば、比例し得る）。特徴は、不揃い末端の長さを含む、本明細書に記載される任意の特徴であり得る。

【0125】

ブロック１６０４では、複数の核酸分子の測定された特徴を使用して、不揃い指数値が判定され得る。不揃い指数値は、複数の核酸分子中の別の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない鎖の長さの集合的尺度を提供し得る。不揃い指数値は、不揃い末端値（例えば、不揃い指数－非メチル化［ＪＩ－Ｕ］）であり得る。不揃い指数値は、複数の核酸分子の不揃い末端の長さの統計値を含む、本明細書に記載される任意の不揃い指数値であり得る。

【0126】

不揃い指数値は、参照値と比較され得る。参照値は、移植を拒絶した対象の１つ以上の参照試料を使用して判定され得る。一部の実施形態では、参照値は、移植を拒絶しなかった対象の１つ以上の参照試料を使用して判定され得る。参照値は、生体試料が個体から得られる前に個体から得られた１つ以上の参照試料を使用して判定され得る。例えば、参照値は、個体が移植を受ける前に得られた１つ以上の参照試料から判定され得る。別の例として、参照値は、移植後であるが現在の生体試料の前に個体から得られた１つ以上の参照試料から判定され得る。不揃い指数値は、参照値としての役割を果たす過去の不揃い指数値を、移植のレシピエントにおいて経時的にモニタリングされ得る。

【0127】

ブロック１６０６では、個体に移植された第１の組織の移植状態は、不揃い指数値を使用して判定され得る。この判定は、不揃い指数値の参照値との比較に基づき得る。移植状態は、拒絶、移植片機能不全、又は感染の可能性を含み得る。いくつかの実施形態では、移植状態は、不揃い指数値が参照値よりも大きい場合に、拒絶された、拒絶された可能性が高い、移植片機能不全を有する、移植片機能不全を有する可能性が高い、感染した、又は感染した可能性が高いとして分類され得る。例えば、第１の組織は、１つ以上の造血幹細胞であり得るか、又は肝臓からのものであり得る。他の実施形態では、移植状態は、不揃い指数値が参照値未満である場合に、拒絶された、拒絶された可能性が高い、移植片機能不全を有する、移植片機能不全を有する可能性が高い、感染した、又は感染した可能性が高いと判定され得る。例えば、移植は、腎臓からのものであり得る。

【0128】

移植状態は、移植が拒絶されているか、又は拒絶される可能性が高いときに判定され得る。方法は、移植の急性拒絶に対して、個体を治療することを含み得る。例えば、移植は、個体から除去され得る。いくつかの実施形態では、個体は、免疫抑制薬を投与され得る。いくつかの実施形態では、個体は、抗体、血液移入、骨髄移植、又は遺伝子療法で治療され得る。

【0129】

いくつかの実施形態では、判定は、例えば、図６のブロック６０６について説明したように、機械学習モデルを使用して実施され得る。

【0130】

ＶＩＩ．ゲノム部位周辺の差別的不揃い状態
本発明者らは更に、不揃い末端が、ヌクレオソーム構造に関連するかどうかを調査した。不揃い末端を、ゲノム部位におけるクロマチン中のタンパク質の改変又はゲノム部位におけるタンパク質相互作用に関連し得る部位に対するそれらの位置に基づいて試験した。本発明者らは、最初に、ヌクレオソームアレイと呼ばれる一連の良好に整列されたヌクレオソームが存在するゲノム領域を特定した。例えば、ＣＴＣＦ（ＣＴＣＦ遺伝子によってコードされる転写因子）結合部位付近のゲノム領域に位置するヌクレオソームは、十分に組織化されていることが知られていた（Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６４：５７－６８、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１９；２９：４１８－２７）。本発明者らは、ＣＴＣＦ結合部位に対して１ｋｂ上流／下流内の尿ＤＮＡ及び血漿ＤＮＡの不揃い状態を分析した。本発明者らは、ＣＴＣＦ結合部位周辺での血漿ＤＮＡ末端の発生（すなわち、末端密度）を計算した。末端密度は、ＣＴＣＦ結合部位に対して１ｋｂ上流／下流にわたる遺伝子座にわたるそれらの値の中央値によって正規化された末端発生の値であった。断片末端シグナルは、参照ゲノムに関する血漿ＤＮＡ断片の上流末端及び下流末端（すなわち、Ｕ末端及びＤ末端）の配向に従って末端を別々に分析する場合に、オープンクロマチン領域周辺で差次的に段階分けされた（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１９；２９：４１８－２７）。言い換えれば、配列決定された断片をヒト参照ゲノムにアライメントした後、断片のＵ末端は、ゲノム座標においてより小さい値を有する末端を表し、一方、Ｄ末端は、ゲノム座標においてより大きい値を有する末端を表した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１９；２９；４１８：２７）。

【0131】

ＣＴＣＦ部位に対する位置に加えて、不揃い状態は、ヒストン修飾及びＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＨＳ）を含む他の部位に対して変化することが見られた。これらの部位に対するある特定の位置でのＤＮＡ断片についての不揃い指数値は、状態（例えば、がん）のレベルを判定するように使用され得る。

【0132】

Ａ．特定の部位での不揃い状態の差を示す結果
図１７Ａ及び図１７Ｂは、不揃い末端とヌクレオソームトラックとの間の関係を示す。

【0133】

図１７Ａは、非がん性対象におけるワトソン鎖に由来するプールされた血漿及び尿ＤＮＡ分子についてのＣＴＣＦ結合部位周囲のＪＩ－Ｕ値を示す。ｙ軸は、血漿ＤＮＡ末端密度である。ｘ軸は、ＣＴＣＦ結合部位からの塩基対における距離である。赤色線１７０４は、尿ＤＮＡを表す。青色線１７０８は、尿ＤＮＡを表す。興味深いことに、ＣＴＣＦ結合部位に関する尿ＤＮＡのＪＩ－Ｕシグナルもまた、末端密度から推定されるヌクレオソームアレイのパターンに段階的に実行された。ＪＩ－Ｕシグナルのピーク位置は、リンカーＤＮＡ領域にほぼアライメントしており、ＤＮＡヌクレアーゼによるリンカーＤＮＡ切断が、場合により不揃い末端の生成を伴うことを示唆している。そのようなＪＩ－Ｕシグナルのヌクレオソームパターンは、ワトソン鎖に由来する血漿ＤＮＡ分子においても観察された。しかしながら、ＣＴＣＦ付近の尿ＤＮＡ ＪＩ－Ｕ波の振幅（中央値：３５．４）は、対照試料についての血漿ＤＮＡの振幅（中央値：２０．２）よりも高かったが、尿ＤＮＡ ＪＩ－Ｕシグナルと血漿ＤＮＡ ＪＩ－Ｕシグナルとの間の周期性の位置には感知できるほどの差がなかった。

【0134】

図１７Ｂは、対照対象及び膀胱がんの異なるステージを有する患者におけるワトソン鎖に由来する尿ＤＮＡ分子についてのＣＴＣＦ結合部位周囲のＪＩ－Ｕ値を示す。ｙ軸は、血漿ＤＮＡ末端密度である。ｘ軸は、ＣＴＣＦ結合部位からの塩基対における距離である。異なる色の線は、血尿を有するが膀胱がんを有しない対照対象（青色線１７１２）、低悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ ＬＧ）（緑色線１７１６）、高悪性度非筋肉浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ ＨＧ）（黄色線１７２０）、及び筋肉浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）（赤色線１７２４）を示す。図１７Ｂに示されるように、ＣＴＣＦ付近のＪＩ－Ｕ値はまた、膀胱がんを有しない患者と比較して、膀胱がんを有する患者の尿ＤＮＡにおいてより低く、典型的には、ＭＩＢＣ及び高悪性度ＮＭＩＢＣを有する患者において最も低いことが見出された。ワトソン鎖に由来する細胞ＤＮＡ分子によって測定されるＪＩ－Ｕ値のパターンは、クリック鎖からのそれらの値によって反映され得る。これらの結果は、ヌクレオソーム構造に沿ったＪＩ－Ｕ値ががん検出のために使用され得ることを示唆した。

【0135】

上記のように、図７Ｂは、ヌクレオソーム中心についての距離に対する血漿ＤＮＡ及び尿ＤＮＡの両方についてのＪＩ－Ｕ値を示す。ＪＩ－Ｕ値は、ヌクレオソーム中心までの同じ距離について、血漿ＤＮＡと比較して、尿ＤＮＡについてより高いことが観察された。

【0136】

不揃い末端がヌクレオソームリンカーＤＮＡ領域において優先的に生じるかどうかを更に検証するために、本発明者らは、各ヌクレオソームトラックの中心に対する断片を使用してＪＩ－Ｕ値を計算した。ヌクレオソームトラック（１，０３７，９６１領域）は、以前に公開された試験から得られた（Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１２；８：ｅ１００３０３６）。

【0137】

Ｂ．ＣＴＣＦ部位での不揃い状態を使用した条件を差別化する際の精度
図１８は、ＣＴＣＦ部位に対して０～５００の範囲の位置についてのＪＩ－Ｕの累積ＪＩ－Ｕ値を使用して、ＭＩＢＣを有する患者と膀胱がんを有しない患者とを差別化するためのＲＯＣプロットを示す。感受性を、ｙ軸上に示す。特異性を、ｘ軸上に示す。図１７ＢにおけるＣＴＣＦ部位に対して０～５００の範囲の位置に沿ったＪＩ－Ｕの累積ＪＩ－Ｕ値は、ＭＩＢＣを有する患者と膀胱がんを有しない患者とを差別化する際に０．８５のＡＵＣを達成した。これらの結果は、ヌクレオソーム構造に沿った尿ＤＮＡのＪＩ－Ｕ値ががん検出のために使用され得ることを示す。

【0138】

Ｃ．ヒストン修飾を有する領域での不揃い状態を使用した条件を差別化する際の精度
特定の領域における不揃い状態は、がん検出のために使用され得る。例えば、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ４Ｋ１６Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、及びＨ３Ｋ９ｍｅ３を含む特定のヒストン修飾が使用され得る。Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ４ｍｅ３が分析される。Ｈ３Ｋ４ｍｅ１は、ＤＮＡパッケージングタンパク質ヒストンＨ３に作用するエピジェネティック修飾であり、ヒストンＨ３タンパク質の４番目のリジン残基でのモノメチル化を伴う。Ｈ３Ｋ４ｍｅ１は、遺伝子エンハンサーに関連することが報告された。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、ＤＮＡパッケージングタンパク質ヒストンＨ３に作用するエピジェネティック修飾であり、ヒストンＨ３タンパク質の４番目のリジン残基でのトリメチル化を伴った。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、遺伝子発現を活性化することに関連することが報告された。

【0139】

図１９Ａ及び図１９Ｂは、これらのヒストン修飾に関連するゲノム領域に由来する尿ＤＮＡ不揃い末端を分析することからの結果を示す。図１９Ａ及び図１９Ｂは、累積ＪＩ－Ｕ値を使用して、ＭＩＢＣを有する患者と膀胱がんを有しない患者とを差別化するためのＲＯＣプロットを示す。図１９Ａは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１ヒストン修飾に関連するゲノム領域を使用することについての結果を示す。図１９Ｂは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾に関連するゲノム領域を使用することについての結果を示す。感受性は、両方のグラフにおけるｙ軸上に示され、特異性は、両方のグラフにおけるｘ軸上に示される。両図から分かるように、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３によってマークされたゲノム領域から推定されたＪＩ－Ｕ値は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１に関連するＪＩ－Ｕ値（ＡＵＣ：０．７７）と比較して、膀胱がんを有する患者を、がんを有しない患者から差別化することにおいてより良好な性能（ＡＵＣ：０．８０）を生じた。この結果は、特定のエピジェネティック修飾に関連する不揃い末端の選択的分析が診断力を増強し得ることを示唆した。

【0140】

Ｄ．例示的な方法
図２０は、個体から得られた生体試料を分析する方法２０００を示す。生体試料は、本明細書に記載される任意の生体試料であり得る。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子の各核酸分子は、末端で第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖からの相補的な部分を有しない場合がある。第１の部分は、第２の鎖にハイブリダイズしない場合がある。第１の部分はまた、第１の鎖の第１の末端に存在し得る。第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖からオーバーハングし得る。

【0141】

ブロック２００２では、複数の核酸分子を配列決定して、配列リードを生成することができる。配列決定は、本明細書に開示される任意の技術によるものであり得る。

【0142】

ブロック２００４では、配列リードを参照ゲノムに対してアライメントさせて、複数の核酸分子のゲノム位置を判定することができる。参照配列は、ヒト参照ゲノムであり得る。

【0143】

ブロック２００６では、複数の核酸分子の核酸分子のセットが識別され得る。核酸分子のセットの各核酸分子は、ゲノム部位から特定の距離にゲノム位置を有し得る。ゲノム部位は、所定のタイプの部位であり得る。ゲノム部位は、ゲノム部位におけるクロマチン中のタンパク質の改変又はゲノム部位におけるタンパク質相互作用と関連し得る。ゲノム部位は、ＣＴＣＦ結合部位又はＤＮＡＳＥ１高感受性部位（ＤＨＳ）であり得る。ゲノム部位は、単一のゲノム座標に限定されるのではなく、ゲノム領域を指す場合がある。加えて、ゲノム部位は、特定のヒストン修飾を有する領域、例えば、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ４Ｋ１６Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、及びＨ３Ｋ９ｍｅ３を含み得る。いくつかの実施形態では、ゲノム部位は、ヌクレオソーム中心、ヌクレオソームの末端、又はヌクレオソームに対応する領域であり得る。核酸分子のセットを識別することは、核酸分子のセットの各核酸分子を配列決定して、１つ以上のリードを生成することを含み得る。配列決定は、例えば本明細書に記載されるような様々な方法で実施することができる。例示的な技法は、プローブ、合成による配列決定、ライゲーション、及びナノポアを使用し得る。１つ以上のリードは、参照ゲノム（例えば、ヒト参照ゲノム）に対してアライメントされ得る。核酸分子のゲノム位置は、１つ以上のリードから判定され得る。

【0144】

ゲノム部位からの特定の距離は、ある範囲であり得る。例えば、この範囲は、０～４０ｎｔ、４０～７０ｎｔ、７０～１００ｎｔ、１００～１３０ｎｔ、１３０～１６０ｎｔ、１６０～１９０ｎｔ、１９０～２００ｎｔ、２００～２５０ｎｔ、２５０～３００ｎｔ、３００～３５０ｎｔ、３５０～４００ｎｔ、４００～５００ｎｔ、５００～７５０ｎｔ、７５０～１，０００ｎｔ、又は１，０００ｎｔ超であり得る。いくつかの実施形態では、指定された距離は、０ｎｔであり得る。

【0145】

ブロック２００８では、核酸分子のセットの各核酸分子についての第１の鎖及び／又は第２の鎖の特徴が測定され得る。特徴は、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さに相関し得る（例えば、比例し得る）。特徴は、直接判定された長さを含む、本明細書に記載される任意の特徴であり得る。

【0146】

ブロック２０１０では、核酸分子のセットの測定された特徴を使用した不揃い指数値が判定され得る。不揃い指数値は、核酸分子のセットにおける別の鎖にハイブリダイズしていない鎖の長さの集合的尺度を提供し得る。不揃い指数値は、核酸分子のセットの不揃い末端の長さの統計値を含む、本明細書に記載される任意の不揃い指数値であり得る。

【0147】

不揃い指数値は、参照値と比較され得る。参照値は、状態を有する対象又は状態を有しない対象からの参照試料から判定され得る。参照値は、例えば本明細書に記載される任意の様式で判定され得る。

【0148】

ブロック２０１２では、個体の状態のレベルは、不揃い指数値に基づいて判定され得る。この判定は、不揃い末端値の参照値との比較に基づき得る。状態は、本明細書に記載される任意の状態であり得る。不揃い指数値が参照値を超える場合、状態は、存在する、可能性が高い、又は重度であると判定され得る。方法は、状態を治療することを含み得る。この治療は、本明細書に記載される任意の治療であり得る。

【0149】

いくつかの実施形態では、その判定は、例えば、図６のブロック６０６について記載されるように、機械学習モデルを使用して実施され得る。

【0150】

ＶＩＩＩ．３’末端のトリミングを有しない不揃い末端分析技術
本明細書における開示は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の豊富な一本鎖オーバーハングが血漿中だけでなく尿中にも存在することを示す。本発明者らの以前の研究は、配列決定（Ｊａｇ－ｓｅｑ）による不揃い末端分析が不揃い末端の特徴を試験することを可能にすることを示しており、本発明者らは、血漿ＤＮＡ中の不揃い末端が分子診断におけるバイオマーカーとして使用され得るという証拠を見出した（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。しかしながら、尿ｃｆＤＮＡ中の不揃い末端の分子特徴に関する情報は少ない。したがって、本発明者らは、Ｊａｇ－ｓｅｑの改変バージョン（Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩ）を尿ｃｆＤＮＡに適用して、不揃い末端の性質、特に、尿中の不揃い末端の長さ及び尿ＤＮＡにおける不揃い末端分析の適用について更に調査する。新しいバージョンであるＪａｇ－ｓｅｑＩＩは、予想外に、不揃い末端の長さのより正確な判定、及び不揃い末端の長さの分析からもたらされる状態のレベルのより正確な判定を可能にする。オーバーハング５’末端は、オーバーハング３’末端をトリミングする処理なしで分析される。３’末端のトリミングを回避することにより、分析されるオーバーハング５’末端、特に、より短い５’末端オーバーハングの量を増加させる。

【0151】

Ａ．ｃｆＤＮＡ分子のオーバーハングを調べるための酵素処理
図２１Ａは、不揃い末端の長さを判定するための以前のＪａｇ－ｓｅｑアプローチを示す。Ｊａｇ－ｓｅｑアプローチは、主に、５’突出末端及び平滑末端（例えば、断片２３０４）を判定することに適用された。ステージ２１１０は、５’突出末端を有する断片２１０４、及び３’突出末端を有する断片２１０８を示す。断片中のシトシンは、ほとんどメチル化されていない。

【0152】

ステージ２１２０は、３’突出末端がエキソヌクレアーゼであるＥｘｏＴで除去された後の断片を示す。断片２１０８は、断片２１１２になる。断片２１０４は、影響を受けない。

【0153】

ステージ２１３０は、５’突出末端をクレノウ（ｅｘｏ－）で充填した後の断片２１０４の結果を示す。青色破線（例えば、線２１１６及び２１１８）は、平滑末端断片の新たに充填されたヌクレオチドを表している。５’オーバーハング分子中の３’末端を、ｄＡＴＰ（Ａ）、ｄＴＴＰ（Ｔ）、ｄＧＴＰ（Ｇ）、及びｍｄＣＴＰ（ｍＣ）で充填して、平滑末端を形成した。新たに充填されたヌクレオチドのシトシンはメチル化されているが、元の断片のシトシンはメチル化されていない。新たに充填されたヌクレオチドと元の断片との間のメチル化の差異は、メチル化プロファイルが不揃い末端の長さを示すことを可能にする。断片２１１２は、試料中に依然として存在し得るが、断片は後の不揃い末端分析に影響を及ぼさないので、もはや示されていない。

【0154】

ステージ２１４０は、ＰＮＫによる５’リン酸化後の平滑末端化断片を示す。ステージ２１５０は、配列決定アダプタ（例えば、アダプタ２１２２及び２１２４）とのライゲーション後の平滑末端断片を示す。

【0155】

ステージ２１５０の後、断片には、バイサルファイト処理が後続し得る。不揃い末端分析は、図１におけるステージ１２０で記載されるように進み得る。３’オーバーハングを元々有していた断片（例えば、断片２３０８）は、これらの断片が不揃い末端を充填する新たなヌクレオチドを受容しないので、不揃い末端分析の考慮に入れない。

【0156】

図２１Ｂは、ｃｆＤＮＡの断片化をよりよく理解するための不揃い末端検出のための、Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩと呼ばれる改善された方法を示す。本発明者らは、３’突出末端に対するトリミング処理ステップを省略することによってＪａｇ－ｓｅｑ法を精緻化した。これは、３’オーバーハング分子中の３’突出末端が末端修復措置中に洗練化されなかったことを意味する。

【0157】

ステージ２１６０では、５’突出末端（断片２１０４）及び３’突出末端（断片２１０８）を有する両方の断片が存在する。ステージ２１６０は、ステージ２１１０と同等であり得る。次いで、断片は、Ｈｅｍｏ Ｋｌｅｎ Ｔａｑで処理されて、５’突出末端を充填するが、３’トリム処理は、加えられない。

【0158】

ステージ２１７０は、５’突出末端が充填されて平滑末端断片を形成した後の断片を示す。断片２１０４は、断片２１６４になる。青色破線は、平滑末端断片の新たに充填されたヌクレオチドに対応する。新たに充填されたヌクレオチドのシトシンはメチル化されているが、元の断片のシトシンはメチル化されていない。他の実施形態では、新たに充填されたヌクレオチドは、メチル化されない場合があるが、一方、元の断片のヌクレオチドは、メチル化される。断片２１０８は、変化しないままである。

【0159】

ステージ２１８０は、ＰＮＫによる５’リン酸化後の断片を示す。断片２１６４は、リン酸化されて断片２１６８になる。断片２１０８は、リン酸化されて断片２１７２になる。

【0160】

ステージ２１９０は、配列決定アダプタ（例えば、アダプタ２１８２及び２１８４）とのライゲーション後の断片を示す。配列決定アダプタは、平滑末端断片に加えられて、断片２１７６になる。次いで、断片２１７６は、バイサルファイト配列決定を受け得、図１におけるステージ１２０で記載されるように、不揃い末端について分析され得る。断片２１７２は、平滑末端ではなく、配列決定アダプタは、この断片に連結されない。その結果、断片２１７２は、バイサルファイト配列決定を受けない（赤色Ｘによって示されている）。

【0161】

この改善されたアプローチは、酵素トリミングによる人工的な改変なしに、突出３’末端の立体配置を保存する。この新しいアプローチは、特に、短い５’突出末端又は平滑末端を含有する分子について、先のアプローチよりも、不揃い末端長さの推定に対してより正確な性能を達成する。短い５’突出末端による改善は、以下により詳細に記載され、突出末端の分析における数個のヌクレオチドエラーは、不揃い末端の長さにおいてより大きいパーセンテージ差を生じる。３’突出末端のトリミングを回避することは、バイサルファイト配列決定後に判定される平滑末端のカウントを人為的に増加させない。

【0162】

図２２Ａ～図２２Ｆは、５’突出不揃い末端を有するスパイクイン分子に対するＪａｇ－ｓｅｑ技術及びＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術を使用する効果を示す。スパイクインＤＮＡ分子は、既知の配列のＤＮＡ分子である。図２２Ａは、１ｎｔのスパイクイン不揃い末端の配列構造を示す。図２２Ｂは、１４ｎｔのスパイクイン不揃い末端の配列構造を示す。太字で下線を引いた塩基は、５’突出末端を表す。

【0163】

２つの分子は、より短い不揃い末端を含有する分子が、Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩではなくＪａｇ－ｓｅｑにおいて使用される３’末端トリミングステップによってより深刻な影響を受けるかどうかを試験するために設計された。両方の分子は、５’突出末端を有する鎖にハイブリダイズした鎖の３’末端にＣヌクレオチドを含む。図２２Ａは、末端における単一のＣヌクレオチドを示す。

【0164】

図２２Ｂに示すように、本発明者らは、短い方の鎖の３’末端に４つの連続したＣを有する１４ｎｔの５’突出末端を有する４６ｂｐの分子を設計した。更に、より長い鎖の第１のオーバーハング塩基はＧであり、これは、Ｇの相補的塩基であるｍＣが、末端修復ステップ中に第１の塩基として組み込まれることを可能にした。したがって、この特別な配列塩基組成を通して、本発明者らは、ライブラリー調製の間に作製された任意の人為的な不揃い末端を検出することができた。本発明者らは、図２２Ｄに示されるように、この分子をライブラリー調製中に内部対照として加えた。この分子により、本発明者らは、新しい配列決定プロトコルが末端修復プロセス中に不揃い末端を充填することを確認することができる。

【0165】

図２２Ｃ～図２２Ｆは、既知の不揃い末端を有するスパイクイン配列についてのＣの変換のグラフを示す。不揃い末端に充填するように加えられるＣは、メチル化され、かつＴに変換されない。元の分子の一部であるＣはメチル化されず、かつＴに変換される。１ｎｔ及び１４ｎｔの不揃い末端を有するスパイクイン配列の部分配列をｘ軸上に示す。大文字アルファベットで示されるヌクレオチドは、配列が二本鎖形態であることを示す。小文字アルファベット及び下線付きのヌクレオチドは、配列が末端修復中に新たに充填されることを示す。縦棒の網掛け部分は、Ｔ（変換されたＣ）の頻度を示す。縦棒の白い部分は、Ｃ（変換されていないＣ）の頻度を示す。図２２Ｃ及び図２２Ｄは、Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩ技術を使用した結果である。図２２Ｅ及び図２２Ｆは、Ｊａｇ－ｓｅｑ技術を使用した結果である。本発明者らは、取り込みステップにおいてメチル化Ｃを使用したために、末端修復前の元の配列に対応するヌクレオチドは、変換されたＣ（すなわち、Ｔ、灰色で示される）となり、一方、末端修復のためのヌクレオチドに対応するヌクレオチドは、変換されていないＣ（すなわち、Ｃ、白色で示される）となる。

【0166】

図２２Ｄに示されるように、バイサルファイト配列決定後のＪａｇ－ｓｅｑＩＩ技術を用いて、本発明者らは、ＤＮＡ分子の元の二本鎖部分に位置するＣの９９．９６％がＴに変換され、一方、本発明者らが組み込みステップにおいてメチル化Ｃを使用したために、新たに充填されたＣ（メチル化）の９８．３２％がＣとして残存したことを観察した。

【0167】

対照的に、図２２Ｆに示されるように、短い鎖中の最後の塩基におけるＣの１５．８５％は、Ｊａｇ－ｓｅｑにおいて変換されていないＣ（すなわち、バイサルファイト処理前にｍＣで充填された）であり、これは、不揃い末端長さ推定又は不揃い末端長さを用いたその後の分析に対する精度に影響を及ぼす可能性があり得る。二本鎖上のより短い３’末端でのｍＣにおける望ましくない充填が、より短い３’末端が突出末端ではない場合であっても、Ｊａｇ－ｓｅｑにおける３’末端トリミングプロセスによって引き起こされた。図２２ＦにおけるＪａｇ－ｓｅｑでの変換されていないＣであった短い鎖における最後の塩基中のＣの１５．８５％と比較して、図２２Ｄは、Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩでは、有意に少ない変換されていないＣを有することを示し、短い鎖における最後の塩基中のＣの約０．０４％のみが変換されていないＣであった。

【0168】

図２２Ｃは、Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩ技術を用いると、二本鎖の最後の塩基上のＣが、わずか０．１９％のみが変換されていなかったことを示す。対照的に、図２２Ｅは、Ｊａｇ－ｓｅｑ技術を用いると、最後の塩基上のＣが、９８．２３％が変換されていなかったことを示す。言い換えれば、断片の９９．８１％が、改変Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩプロトコルを用いて、元々設計された１ｎｔの不揃い末端の長さと一致すると判定され、一方、断片の１．７７％のみが、以前のＪａｇ－ｓｅｑプロトコルを用いて、１ｎｔの不揃い末端の長さと一致すると判定された。これらの結果は、洗練されたアプローチが分子末端の性質に影響を及ぼさないことを示し、したがって、本発明者らは、特に、短い５’不揃い末端について、正確な不揃い末端長推定の精度を首尾よく改善した。３’突出末端をトリミングする処理は、５’突出末端を有する断片の精度に影響を与えるとは予想されなかったことから、これらの改善された精度の結果は驚くべきものである。

【0169】

Ｂ．尿ｃｆＤＮＡにおける不揃い末端指数値及び平均不揃い末端長さ
不揃い末端分析におけるＪａｇ－ｓｅｑＩＩの使用を確認した。尿試料中の断片を、不揃い末端長さと相関する、不揃い末端長さ及びメチル化レベルについて分析した。

【0170】

図２３は、Ｊａｇ－ｓｅｑＩＩを使用した尿ｃｆＤＮＡにおける異なるサイズ範囲にわたるリード２（ＪＩ－Ｍ）におけるＣＨメチル化レベルのプロファイルのグラフを示す。ここで、ＣＨメチル化は、ＨがＡ、Ｃ、又はＴである任意のＣのメチル化を含むが、ＨがＧである場合は含まない。リード２は、５’突出末端を充填するように加えられたヌクレオチドを含むリードに対応する。この図では、リード２は、末端７５ヌクレオチドを含む。ＪＩ－Ｍは、Ｊａｇｇｅｄ Ｉｎｄｅｘ－Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄであり、これはリード２におけるＣＨメチル化レベルである。より高いＪＩ－Ｍは、より多いメチル化及びより長い不揃い末端を示す。異なる線は、異なる健康な個体からの異なる試料を表す。

【0171】

本発明者らは、健康な尿試料に対してＪａｇ－ｓｅｑＩＩを行って、尿不揃い末端の基本的特性を調べた。ｙ軸は、リード２（ＪＩ－Ｍ）におけるＣＨメチル化レベルをパーセントとして示す。ｘ軸は、断片サイズ（ｂｐ）を示す。１Ｕ～５Ｕについての異なる線は、異なる健康な個体を表す。ＪＩ－Ｍの値は、分子の異なるサイズにわたって変化し、波状パターンを示した。ＪＩ－Ｍは急速に増加し、断片サイズが約１３０ｂｐであるときに約５０％の小さなピークに達した。ＪＩ－Ｍは、２４０ｂｐの分子サイズ付近の６５％～８０％の第１の主要ピークまで連続的に増加した。続いて、第２の主要ピークが約４１０ｂｐの断片サイズで現れた。

【0172】

本発明者らの以前の試験（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０）は、非メチル化Ｃの隣のメチル化Ｃを使用して不揃い末端の開始を推測するＣＣタグ戦略が、正確な不揃い末端長さを推測するための解決策を提供することを見出した。例えば、元の断片の３’末端の最末端におけるＣはメチル化され得る。５’突出末端を有する他方の鎖上の次のヌクレオチドは、Ｇである。その結果、不揃い末端を充填するために新たに加えられるヌクレオチドは、メチル化されていないＣである。次いで、非メチル化Ｃに隣接するメチル化Ｃのパターンは、不揃い末端の正確な開始を識別し得る。本発明者らは、異なる分子サイズ下で平均及び中央不揃い末端長さを調べ、ＪＩ－Ｍのものと同様の波状パターンを観察した。

【0173】

図２４Ａ及び図２４Ｂは、尿ｃｆＤＮＡ中の異なる断片サイズにわたる平均及び中央不揃い末端長さを示す。ｘ軸は、両方の図において断片サイズ（ｂｐ）を示す。図２４Ａのｙ軸は、平均（ｍｅａｎ）不揃い末端長さを示す。図２４Ｂのｙ軸は、中央不揃い末端長さを示す。１Ｕ～５Ｕについての異なる線は、異なる健康な個体を表す。両方のグラフは、不揃い末端長さについての波状パターンを示す。２つのピーク間の距離は約１７０ｂｐであり、これはヌクレオソームフットプリント法に対応する。これらの図は、不揃い末端プロファイリングを使用して、ヌクレオソームパターンを判定及びモニタすることができることを示す。

【0174】

Ｃ．がんバイオマーカー
尿ｃｆＤＮＡの不揃い末端の特徴が、がん診断の更なる分野を提供するための新しいバイオマーカーとして役立ち得るかどうかを更に調べるために、本発明者らは、がん患者の尿ｃｆＤＮＡにＪａｇ－ｓｅｑＩＩを適用した。

【0175】

図２５Ａ及び図２５Ｂは、膀胱がん患者及び対照対象についてのＪＩ－Ｍ及び平均不揃い末端長さについての箱ひげ図を示す。平均不揃い末端長さは、ＣＣタグから判定された不揃い末端の全ての長さについての平均値である。グラフ中のｘ軸は、対照対象及び膀胱がん患者を示す。図２５Ａのｙ軸は、ＪＩ－Ｍ値を示す。図２５Ｂのｙ軸は、平均不揃い末端長さ（ｎｔ）を示す。明らかに、膀胱がん患者におけるＪＩ－Ｍ及び平均不揃い末端長さの両方（ＪＩ－Ｍ：中央値、４０．６９；範囲、３４．１１～４４．２５；平均不揃い末端長さ：中央値、２２．１０；範囲、１８．８３～２４．０１）は、健康な対照のもの（ＪＩ－Ｍ：中央値、４８．１４；範囲；範囲、３７．９４～５６．４６；平均不揃い末端長さ：中央値、２５．１６；範囲、２０．３０～２６．６３）と比較して、統計的に減少した。ＪＩ－Ｍ値又は平均不揃い末端長さは、膀胱がんについての可能性のあるバイオマーカーであることが示された。

【0176】

Ｄ．例示的な方法
図２６は、試料中の断片の３’末端をトリミングなしに個体から得られた生体試料を分析することに関連する例示的なプロセス２６００のフローチャートである。いくつかの実施態様では、図２６の１つ以上のプロセスブロックは、システム（例えば、図３４におけるシステム３４００）によって実行され得る。いくつかの実施態様では、図２６の１つ以上のプロセスブロックは、システムとは別個の又はシステムを含む別のデバイス又はデバイスの群によって実行され得る。追加的に、又は代替的に、図２６の１つ以上のプロセスブロックは、プロセッサ３４５０、メモリ３４３５、外部メモリ３４４０、記憶デバイス３４４５、試料ホルダ３４１０、検出器３４２０、及び／又は論理システム３４３０などのシステム３４００の１つ以上の構成要素によって実行され得る。

【0177】

生体試料は、第１の複数の核酸分子を含み、５’末端は３’末端からオーバーハングする。例えば、第１の複数の核酸分子は、図２１Ｂにおける断片２１０４を含み得る。第１の複数の核酸分子は、無細胞であり得る。第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖である。各第１の鎖は、第２の鎖にハイブリダイズしていない第１の部分を含む。各第１の部分は、第１の鎖の５’末端にある。生体試料は、本明細書に記載される任意の生体試料であり得る。

【0178】

生体試料は、第２の複数の核酸分子を含み得、３’末端は５’末端からオーバーハングする。例えば、第２の複数の核酸分子は、図２１Ｂの断片２１０８を含み得る。第２の複数の核酸分子は、無細胞であり得る。第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、第３の鎖及び第４の鎖を有する二本鎖である（第１の複数の核酸分子についての第１の鎖及び第２の鎖とは異なる条件である）。各第３の鎖は、第４の鎖にハイブリダイズしていない第１の部分を含む。各第１の部分は、第３の鎖の３’末端にある。生体試料は、第２の複数の核酸分子中の核酸分子以外の他方の鎖にハイブリダイズしていない一方の鎖の３’末端を有する二本鎖核酸分子を含まない場合がある。一部の実施形態では、第２の複数の核酸分子は、生体試料中のオーバーハング３’末端を有する全ての核酸分子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を含む。いくつかの実施形態では、第２の複数の核酸分子の数は、第１の複数の核酸分子の数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％であり得る。いくつかの実施形態では、第１の複数の核酸分子及び／又は第２の複数の核酸分子は、本明細書に記載される任意のサイズ範囲を含むある特定のサイズ範囲であり得る。

【0179】

第１の複数の核酸分子の核酸分子中の第１のタイプのヌクレオチドは、全てメチル化され得るか、又は全て非メチル化されない場合がある。第１のタイプのヌクレオチドは、シトシン又は本明細書に記載される任意のヌクレオチドであり得る。例えば、図２１Ｂでは、図２１Ｂの断片２１０４中の全てのシトシンがメチル化され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子中の第１のタイプのヌクレオチドは、ある特定のパーセンテージ（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）を超えてメチル化又は非メチル化され得る。

【0180】

ブロック２６０４では、１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物は、第１の複数の核酸分子の核酸分子の第１の鎖の第１の部分にハイブリダイズし得る。第１の化合物は、５’末端オーバーハングを充填し、不揃い末端を除去して平滑末端を形成することができる。例えば、第１の化合物は、図２１Ｂにおける断片２１６４内の青色破線であり得る。第１の化合物は、第２の鎖の３’末端に結合されて、伸長された核酸分子を形成する。伸長された核酸分子は、第１の化合物を含む３’末端を有する伸長された第２の鎖を有する。第１の化合物は、第２の鎖と接触しない３’末端を有する。例えば、図２１Ｂのステージ２１７０では、断片２１６４の青色破線の３’末端は、それが伸長する元の鎖と接触しない。第１の化合物は、第２の鎖とは異なるようにメチル化された第１のタイプのヌクレオチドを含み得る。例えば、第２の鎖における第１のタイプのヌクレオチドがメチル化される場合、第１の化合物における第１のタイプのヌクレオチドはメチル化されない。逆に、第２の鎖における第１のタイプのヌクレオチドがメチル化されない場合、第１の化合物における第１のタイプのヌクレオチドはメチル化される。第１の化合物中の各第１のタイプのヌクレオチドは、第２の鎖中の第１のタイプのヌクレオチドの各々とは反対のメチル化状態を有し得る。ブロック２６０４は、第１の複数の核酸分子の各核酸分子について反復され得る。

【0181】

生体試料は、ハイブリダイジング中、第２の複数の核酸分子を含み得る。例えば、第２の複数の核酸分子の核酸分子の第１の部分を除去するように構成された酵素は、生体試料に添加されない場合がある。例えば、エキソヌクレアーゼは、生体試料に添加されない。生体試料は、平滑末端核酸分子を形成するようにトリミングされた第２の複数の核酸分子のオーバーハング３’末端を有しない場合がある。第２の複数の核酸分子は、図２１Ｂにおける断片２１０８と同様に、トリミングされた３’突出末端を有するのではなく、３’オーバーハングを維持し得る。

【0182】

いくつかの実施形態では、方法２６００は、複数の伸長された核酸分子のサイズをリン酸化することを含み得る。プロセス２６００はまた、第２の複数の核酸分子をリン酸化することを含み得る。例えば、５’末端は、図２１Ｂのステージ２１８０におけるようにリン酸化され得る。アダプタが、伸長された核酸分子に加えられ得る。第２の複数の核酸分子は、アダプタが加えられていない場合がある。

【0183】

ブロック２６０６では、第１の化合物中の第１のタイプのヌクレオチドか、又は第２の鎖中の第１のタイプのヌクレオチドのいずれかが、第２のタイプのヌクレオチドに変換され得る。第２のタイプのヌクレオチドは、第１のタイプのヌクレオチドと異なり得る。変換は、バイサルファイト処理によるものであり得る。例えば、第２のタイプのヌクレオチドは、ウラシルであり得、一方、第１のタイプのヌクレオチドは、シトシンである。シトシン、特に、非メチル化シトシンは、バイサルファイト処理によってウラシルに変換され得る。変換は、生体試料中で起こり得、生体試料は、変換中に第２の複数の核酸分子を含み得る。

【0184】

いくつかの実施形態では、第２の鎖中の第１のタイプのヌクレオチドが変換され得る。次いで、この方法はまた、第２の複数の核酸分子中の第１のタイプのヌクレオチドを変換することを含み得る。例えば、第２の複数のヌクレオチドは、非メチル化シトシンを変換することから生じるウラシルを含み得る。

【0185】

ブロック２６０８では、第１のメチル化状態は、第１の化合物中の第１のタイプのヌクレオチドに対応する１つ以上の部位の各々について判定され得る。メチル化状態は、第２のタイプのヌクレオチドの同一性を判定することによって判定され得る。例えば、第１の化合物中の第１のタイプのヌクレオチドは、第２のタイプのヌクレオチドに変換され得る。第２のタイプのヌクレオチドは、第１のタイプのヌクレオチドと異なり得る。例えば、ウラシルは、第１の化合物中で識別され得、これは、ブロック２６０８におけるバイサルファイト処理の前にウラシルが非メチル化シトシンであり、第１のメチル化状態が非メチル化であることを意味する。ヌクレオチドの同一性は、本明細書に記載されるものを含む、任意の好適な配列決定技術によって判定され得る。

【0186】

別の例として、第２の鎖中の第１のタイプのヌクレオチドが第２のタイプのヌクレオチドに変換される場合、第１の化合物中のヌクレオチドはシトシンであると判定され得、これは、第１の化合物がメチル化シトシンを含むことを意味する。次いで、第１のメチル化状態がメチル化される。ブロック２６０８は、第１の複数の核酸分子の各核酸分子について反復され得る。

【0187】

いくつかの実施形態では、メチル化レベルは、第１のメチル化状態を使用して計算され得る。メチル化レベルは、第１の複数の核酸分子においてメチル化される（又はメチル化されない）部位のパーセンテージ、割合、又は数であり得る。

【0188】

いくつかの実施形態では、メチル化レベルを使用した不揃い指数値が判定され得る。不揃い指数値は、第１の複数の核酸分子中の別の鎖にハイブリダイズしていない鎖の長さの集合的尺度を提供し得る。不揃い指数値は、ＪＩ－Ｕ、ＪＩ－Ｍ、又は本明細書で記載される任意の指数値を含み得る。不揃い指数値は、ある特定の断片サイズについてのものであり得る。

【0189】

いくつかの実施形態では、プロセス２６００は、複数の第１のメチル化状態を使用して、第１の複数の核酸分子の各第１の化合物の長さを判定することを含み得る。長さは、メチル化の量に基づいて判定され得る。いくつかの実施形態では、正確な長さは、異なるメチル化状態を示す同じタイプの連続する部位に基づいて判定され得る（例えば、図２４Ａ及び図２４Ｂにおいて、ＣＣヌクレオチドを使用して、長さを測定する）。第１のタイプのヌクレオチドは、第２のタイプのヌクレオチドに隣接する。

【0190】

図２６は、プロセス２６００の例示的なブロックを示すが、いくつかの実装形態では、プロセス２６００は、図２６に示されるブロックに追加のブロック、それらよりもより少ないブロック、それらとは異なるブロック、又はそれらとは異なるように配置されたブロックを含み得る。追加的に、又は代替的に、プロセス２６００のブロックのうちの２つ以上が、並列して実行され得る。

【0191】

ＩＸ．尿ＣＦＤＮＡにおける不揃い末端長さの周期性パターン
尿中の無細胞ＤＮＡは、不揃い末端長さの頻度において周期的な挙動を示す。尿中の無細胞ＤＮＡ断片の周期性は、対象の状態のレベルを分類するのに役立ち得る。状態は、がん、例えば、腎臓がんを含み得る。

【0192】

図２７は、セクションＶＩＩＩ．Ｂに記載されるＣＣタグ技術を使用することによって推定される、尿中の不揃い末端長さの分布のグラフを示す。ｘ軸は、不揃い末端長さをヌクレオチドで示す。ｙ軸は、０～７４ｎｔの不揃い末端長さサイズの頻度（％）を示す。ＣＣタグ技術は、図２４Ａ及び図２４Ｂを用いて上述されている。

【0193】

図２７は、概して、不揃い末端がより長くなる場合、相対頻度はゆっくりと減少することを示す。例えば、４０ｎｔの不揃い末端を有する断片は、１０ｎｔの場合よりも少ない。この漸減に加えて、尿ｃｆＤＮＡの不揃い末端長さは、約１０ｎｔの周期性パターンを示し、これは血漿ＤＮＡ中の不揃い末端では見られなかった。周期性パターンをより詳細に見ることによって、不揃い末端の周期性の幅は、異なる個体間で変化するために、本発明者らの注目を集めた。不揃い末端の周期性の幅を分析するために、以下の式に示す数学的アプローチによって波の強度（例えば、合計７つのピークについて）を計算した。

【0194】

【数2】

【0195】

式中、ｐは特定のピークの頻度であり、ｖｌ／ｖｒは相対的な左（右）谷の頻度である。不揃い末端長さ周期性指数は、ピークと谷との間の差の尺度を提供する。
ピークと谷との間の差を定量化する他の指数がまた、使用され得る。

【0196】

より高い不揃い末端長さ周期性指数は、不揃い末端長さ分布のより強い１０ｎｔの周期性パターンを示す。本発明者らは、更に分析して、不揃い末端長さ周期性指数が断片の長さによって影響され得るかどうかを調べる。

【0197】

図２８は、異なる断片サイズにわたる周期性指数のグラフを示す。ｘ軸は、断片サイズを塩基対で示す。ｙ軸は、不揃い末端長さ周期性指数を示す。図２８に示されるように、不揃い末端長さの周期性指数により、断片長さが１７０ｂｐ未満である場合に、異なる断片サイズにわたる１０ｎｔの周期性パターンが明らかなった。例えば、本発明者らは、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１１ｂｐ、１２１ｂｐ、１３２ｂｐ、及び１４２ｂｐにおける不揃い末端長さの周期性指数の多数のピーク、並びに８５ｂｐ、９５ｂｐ、１０６ｂｐ、１１６ｂｐ、１２７ｂｐ、１３７ｂｐ、及び１４８ｂｐにおける不揃い末端長さの周期性指数の多数の谷を観察した。

【0198】

Ａ．腎細胞がんを判定するための不揃い末端長さ周期性指数
不揃い末端長さ周期性指数は、腎細胞がん（ＲＣＣ）を有する対象と健常対照対象とを差別化するために使用され得る。不揃い末端長さ周期性指数は、不揃い末端値を使用するよりも有効なバイオマーカーであり得る。

【0199】

図２９Ａは、対照対象及びＲＣＣを有する対象についての不揃い末端長さ周期性指数のグラフを示す。ｘ軸は、対照対象及びＲＣＣ（すなわち、腎臓がん）を有する対象を示す。ｙ軸は、不揃い末端長さ周期性指数を示す。図２９Ａに示されるように、腎臓がん尿試料は、より高い不揃い末端長さ周期性指数値と関連付けられた。ＲＣＣ対象の不揃い末端長さ周期性指数値（中央値、０．４１；範囲（０．２１～０．５８）は、健常対照対象（中央値、０．２５；範囲、０．１２～０．４２）よりも有意に高いことが見出された。

【0200】

図２９Ｂは、対照対象及びＲＣＣを有する対象についての平均不揃い末端長さのグラフを示す。ｘ軸は、対照対象及びＲＣＣ（すなわち、腎臓がん）を有する対象を示す。縦軸は、平均不揃い末端長さ（ｎｔ）を示す。このグラフは、対照対象とＲＣＣ対象との間に平均不揃い末端長さについて統計的有意差が存在しないことを示す。対照対象及びＲＣＣ対象もまた、ＪＩ－Ｍで統計的に有意な差を示さなかった。

【0201】

図２９Ｃは、対照対象とＲＣＣを有する対象とを差別化するために周期性指数及び平均不揃い末端長さを使用するためのＲＯＣ曲線を示す。周期性指数を使用した場合の曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．８５７である。対照的に、平均不揃い末端長さを使用した場合のＡＵＣは、０．６２９であり、これは、平均不揃い末端長さが健常対照対象とＲＣＣを有する対象とを差別化するのに有効ではないことを示している。驚くべきことに、不揃い末端長さ周期性指数は、尿試料中の腎がん患者と非がん患者との識別を可能にするシグネチャーである。

【0202】

Ｂ．尿ｃｆＤＮＡにおける不揃い末端長さ周期性に対するヘパリン処理の効果
尿の不揃い末端長さに現れた特有の周期性パターンは、不揃い末端の生成の根底にある機構を更に調査する動機を本発明者らに与えた。

【0203】

不揃い長さ分布の１０ｂｐ周期性が、ヌクレオソーム立体構造に関連するかどうかは不明である。ＤＮＡ断片サイズの１０ｎｔの周期性切断パターンは、二本鎖ＤＮＡ上の単一切断を好むＤＮａｓｅＩの消化によって引き起こされる可能性が高く、同時に、ヒストン－ＤＮＡ結合構造に大きく依存することが報告された（Ｓｕｃｋ，１９９４）。以前の試験によりまた、ヘパリンが、ヒストン結合を弛緩させることによってクロマチン構造を破壊し得、したがって、ＤＮＡアクセス可能性を増加させ得ることが見出された（Ｖｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，１９９２）。したがって、この変化したヌクレオソーム立体構造は、主要なヌクレアーゼの１つであるＤＮａｓｅＩによる消化に対してより高い感受性を示した（Ｂｒｏｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。これらの試験に基づいて、本発明者らは、次いで、ヌクレオソーム構造が尿ｃｆＤＮＡにおける不揃い末端長さの１０ｎｔの周期性パターンの生成を伴い得るかどうかを理解することを目的とした一連のヘパリン処理実験を実行した。

【0204】

図３０は、ヘパリンインキュベーション処理による尿ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを示す。ｘ軸は、断片サイズ（ｂｐ）を示す。ｙ軸は、頻度（％）を示す。異なる線は、異なる処理を示す。赤色（線３００２）、青色（線３００４）、緑色（線３００６）、及び紫色（線３００８）の線は、それぞれ、ＥＤＴＡ０時間、ヘパリン０時間、ヘパリン０．５時間、及びヘパリン１時間処理を表す。時間は、室温でのインビトロインキュベーションの持続時間を表す。処理には、続いてＪａｇ－ｓｅｑＩＩが後続された。ＥＤＴＡによる処理は、不揃い末端長さ周期性を変化させると予想されず、ヘパリンによる処理と比較するための対照として役立つ。

【0205】

ＥＤＴＡ０時間処理（線３００２）と比較して、１０ｎｔの不揃い末端長さ周期性の振幅は、ヘパリンによって０時間処理した場合（線３００４）よりもわずかに弱かった。興味深いことに、ヘパリンのインキュベーション時間が増加するにつれて、周期性は徐々に消失し始めた。注目すべきことに、ヘパリンによる１時間の処理（線３００８）により、クロマチン構造の破壊の増加に起因して、尿ｃｆＤＮＡにおける１０ｂｐの不揃い末端長さ周期性パターンのほとんど全ての消失がもたらされた。

【0206】

図３１は、ヘパリンインキュベーション処理による尿ｃｆＤＮＡにおける不揃い末端長さ分布を示す。ｘ軸は、不揃い末端長さ（ｎｔ）を示す。ｙ軸は、頻度（％）を示す。赤色（線３１０２）、青色（線３１０４）、緑色（線３１０６）、及び紫色（線３１０８）の線は、それぞれ、ＥＤＴＡ０時間、ヘパリン０時間、ヘパリン０．５時間、及びヘパリン１時間処理を表す。図３１の場合の基礎となるデータは、図３０の場合と同じである。

【0207】

本発明者らは、ヘパリン処理が、クロマチン構造を変化させることにより尿の不揃い末端の生成及び分布に影響を及ぼすかどうかを調査した。図３１に示すように、１０ｎｔの不揃い末端長さ周期性パターンは、尿試料をヘパリンで０時間処理した場合には、著しく弱かった。ヘパリンインキュベーション時間が１時間に達すると、周期性パターンはほぼ消失した。図３１は、ヘパリン処理時間の増加が周期性を減少させるようであることを示す。

【0208】

図３２Ａ、図３２Ｂ、及び図３２Ｃは、ＥＤＴＡ及びヘパリンインキュベーションの異なる期間についてのＪＩ－Ｍ、平均不揃い末端長さ、及び不揃い末端長さ周期性指数の分析を示す。図３２Ａ～図３２Ｃでの基礎データは、図３０及び図３１におけるのと同じである。図３２Ａ～図３２Ｃでは、ｘ軸は、異なる処理（異なるインキュベーション時間に対するＥＤＴＡ又はヘパリン）を示す。

【0209】

図３２Ａでは、ｙ軸は、ＪＩ－Ｍ指数である。図３２Ｂでは、ｙ軸は、平均不揃い末端長さ（ｎｔ）である。図３２Ａ及び図３２Ｂでは、本発明者らは、ＪＩ－Ｍの値及び平均不揃い末端長さが、ＥＤＴＡ０時間処理とヘパリン０時間処理との間で有意に異ならないことを見出した。次いで、長期間（０．５時間又は１時間）のヘパリンインキュベーションとともに、ＪＩ－Ｍ及び平均不揃い末端長さは、徐々に減少した。

【0210】

図３２Ｃは、ｙ軸上の不揃い末端長さ周期性指数を示す。図３２Ｃは、ＥＤＴＡ０時間処理と比較して、ヘパリン０時間処理による周期性指数の大きな低減を示す。より長いヘパリン処理時間により、不揃い末端長さ周期性指数のより小さい低減がもたらされた。

【0211】

図３２Ａ～図３２Ｃをまとめると、これらの結果は、不揃い末端長さの１０ｎｔの周期性パターンが、ＤＮａｓｅＩの活性レベルと組み合わされた、ヒストン及び尿ｃｆＤＮＡ結合構造と密接に関連することを強く示唆した。

【0212】

Ｃ．例示的な方法
図３３は、無細胞ＤＮＡ断片の不揃い末端長さに関連する周期性を使用して、生体試料を分析して、状態のレベルを分類することに関連する例示的なプロセス３３００のフローチャートである。いくつかの実施態様では、図３３の１つ以上のプロセスブロックは、システム（例えば、図３４におけるシステム３４００）によって実行され得る。いくつかの実施態様では、図３３の１つ以上のプロセスブロックは、システムとは別個の又はシステムを含む別のデバイス又はデバイスの群によって実行され得る。追加的に、又は代替的に、図３３の１つ以上のプロセスブロックは、プロセッサ３４５０、メモリ３４３５、外部メモリ３４４０、記憶デバイス３４４５、試料ホルダ３４１０、検出器３４２０、及び／又は論理システム３４３０などのシステム３４００の１つ以上の構成要素によって実行され得る。

【0213】

生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態では、生体試料は、尿、血清、唾液、又は血漿以外の本明細書に記載される任意の試料であり得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子の各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖及び第２の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくともいくつかの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖からの相補的部分を有せず、第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ第１の鎖の第１の末端に存在する。複数の核酸分子は、５０～１７０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１４０ｎｔ、１４０～１７０ｎｔ、１７０～２００ｎｔ、２００～２４０ｎｔ、又は２４０ｎｔ超の範囲内にあるサイズを有する。複数の核酸分子は、分析のための統計的に有意な数であり得、これは、本明細書に記載される無細胞核酸分子について任意の数であり得る。

【0214】

ブロック３３０２では、複数の核酸分子の各核酸分子の特徴が測定される。特徴は、第２の鎖にオーバーハングするか又はハイブリダイズしない第１の鎖の長さに相関する（例えば、比例する）。特徴は、長さであり得る。いくつかの実施形態では、特徴は、メチル化レベルであり得る。特徴は、各核酸分子についての第１の鎖及び／又は第２の鎖について測定され得る。

【0215】

ブロック３３０４では、ヒストグラムが作成され得る。ヒストグラムは、測定された特徴の複数の値の各々を有する核酸分子の量を測定することによって作成され得る。ヒストグラムは、異なる不揃い末端長さに対して量（例えば、頻度）をプロットし得る。ヒストグラムの例は、図２７又は図３１を含む。ヒストグラムは、グラフとして提示されない場合がある。いくつかの実施形態では、ヒストグラムは、表形式であり得る。

【0216】

ブロック３３０６では、複数のピーク量及び複数の局所的最小量が、ヒストグラムを使用して識別され得る。ピーク量は、局所的最大量であり得る。ピーク量及び局所的最小量は、ヒストグラムから視覚的に判定され得る。いくつかの実施形態では、ピーク量及び局所的最小量は、数学的に判定され得る。例えば、ピーク量又は局所的最小量は、ヒストグラムの導関数が０であるときに判定され得る。ピーク量は、二次導関数が負であるときであり得る。局所的最小量は、二次導関数が正であるときであり得る。

【0217】

複数のピーク量が、測定された特徴の周期的間隔で現れる場合がある。例えば、ピーク量は、波状パターンの頂点に現れる場合がある。測定された特徴の周期的間隔は、９～１１ｎｔ、５～９ｎｔ、１２～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～２５ｎｔ、又はそれ以上の長さに対応し得る。局所的最小量は、測定された特徴の周期的間隔で現れ得る。例えば、複数の局所的最小量が、波状パターンの底部に現れ得る。複数のピーク量は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のピーク数であり得る。複数の局所的最小量の数が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、複数のピーク量及び複数の局所的最小量は、ヒストグラムに存在する全てのピーク量及び全ての局所的最小量を含まない場合がある。例えば、短い（例えば、５ｎｔ未満の）不揃い末端長さ又は長い不揃い末端長さでのピーク量及び局所的最小量は除外され得る。

【0218】

ブロック３３０８では、不揃い指数値が判定され得る。不揃い指数値は、複数のピーク量及び複数の局所的最小量を使用して判定され得る。不揃い指数値は、ピーク量の、局所的最小量に対する集合的尺度を提供し得る。いくつかの実施形態では、不揃い指数値は、複数のピーク量のみ又は複数の局所的最小量のみを使用して判定され得る。例えば、不揃い指数値は、複数のピーク量の頻度、周期、又は振幅を使用して判定され得る。いくつかの例では、不揃い指数値は、複数の局所的最小量の頻度、周期、又は振幅を使用して判定され得る。平均若しくは中央頻度、周期、又は振幅が使用され得る。

【0219】

不揃い指数値は、複数の局所的最小量の振幅を使用して判定され得る。不揃い指数値は、複数のピーク量の各ピーク量の、少なくとも１つの隣接する局所的最小量との比較を使用して判定され得る。比較は、差、和、比、又は積を含み得る。不揃い指数値は、上述した周期性指数であり得る。

【0220】

不揃い指数値は、参照値と比較され得る。参照値は、状態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して判定され得るか、又は参照値は、状態を有しない対象の１つ以上の参照試料を使用して判定され得る。参照値は、状態を有する対象又は状態を有しない対象についての期待値からの統計的有意差を示す閾値であり得る。例えば、参照値は、参照対象についての平均不揃い指数値からの１、２、又は３標準偏差に設定され得る。いくつかの実施形態では、参照値は、より早い時点での（例えば、がん治療の前又は健常なベースライン状態からの）同じ被験体からの不揃い指数値であり得る。

【0221】

ブロック３３１０では、個体の状態のレベルを、不揃い指数値を使用して判定され得る。この判定は、不揃い指数値を参照値と比較することに基づき得る。状態は、がんであり得る。例えば、状態は、腎臓がんであり得る。分類は、不揃い指数値が参照値を超える場合にがんが存在することであり得る。分類は、本明細書に記載される任意の分類であり得る。分類は、がんの重症度であり得、これは、がんのステージを含み得る。分類は、がんが多かれ少なかれ重篤になっていることであり得る。

【0222】

プロセス３３００は、状態を処置することを更に含み得、これは、方法６００を含む、本明細書に記載される任意の治療であり得る。

【0223】

図３３は、プロセス３３００の例示的なブロックを示すが、いくつかの実装形態では、プロセス３３００は、図３３に示されているブロックへの追加のブロック、それより少ないブロック、それとは異なるブロック、又はそれとは異なるように配置されたブロックを含み得る。追加的に、又は代替的に、プロセス３３００のブロックのうちの２つ以上が、並列に実行され得る。

【0224】

Ｘ．例示的なシステム
図３４は、本発明の実施形態による測定システム３４００を例示している。示されるシステムは、試料ホルダ３４１０内の無細胞ＤＮＡ分子などの試料３４０５を含み、試料３４０５は、アッセイ３４０８と接触して、物理的特徴３４１５の信号を提供し得る。試料ホルダの例は、アッセイのプローブ及び／若しくはプライマー、又はその中をドロップレットが（アッセイを含むドロップレットとともに）移動するチューブを含む、フローセルであり得る。試料からの物理的特徴３４１５（例えば、蛍光強度、電圧、又は電流）は、検出器３４２０によって検出される。検出器３４２０は、データ信号を構成するデータポイントを得るために、間隔（例えば、周期的間隔）を空けて測定を行うことができる。一実施形態では、アナログ－デジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形態へと、複数回、変換する。試料ホルダ３４１０及び検出器３４２０は、アッセイデバイス、例えば、本明細書に記載される実施形態に従って配列決定を実行する配列決定デバイスを形成し得る。データ信号３４２５は、検出器３４２０から論理システム３４３０に送信される。データ信号３４２５は、ローカルメモリ３４３５、外部メモリ３４４０、又は記憶デバイス３４４５に保存され得る。

【0225】

論理システム３４３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサなどであり得るか、又はそれらを含み得る。それはまた、ディスプレイ（例えば、モニタ、ＬＥＤディスプレイなど）、及びユーザ入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、ボタンなど）を含み得るか、又はそれらに連結され得る。論理システム３４３０及び他の構成要素は、スタンドアローン若しくはネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であり得るか、又は検出器３４２０及び／又は試料ホルダ３４１０を含むデバイス（例えば、配列決定デバイス）に直接取り付けられ得るか、又は組み込まれ得る。論理システム３４３０はまた、プロセッサ３４５０で実行するソフトウェアを含み得る。論理システム３４３０は、本明細書に記載される方法のいずれかを実行するようにシステム３４００を制御するための指示を記憶するコンピュータ可読媒体を含み得る。例えば、論理システム３４３０は、配列決定又は他の物理的動作が実行されるように、試料ホルダ３４１０を含むシステムにコマンドを提供し得る。そのような物理的動作は、特定の順序で実行され得、例えば、試薬は、特定の順序で添加及び除去される。そのような物理的動作は、試料を取得してアッセイを実行するように使用され得るように、例えば、ロボットアームを含む、ロボットシステムによって実行され得る。

【0226】

本明細書で言及されるコンピュータシステムのうちのいずれも、任意の好適な数のサブシステムを利用し得る。そのようなサブシステムの例は、図３５においてコンピュータシステム１０に示されている。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態では、コンピュータシステムは、各々がサブシステムであり、内部構成要素を備える、複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップコンピュータ及びラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、並びに他の携帯デバイスを含み得る。

【0227】

図３５に示されるサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンタ７４、キーボード７８、記憶デバイス７９、ディスプレイアダプタ８２に結合されたモニタ７６（例えば、ＬＥＤなどのディスプレイスクリーン）、及び他などの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ７１に結合する周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（input／output、Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などの当該技術分野において既知である任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート７７又は外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、Ｗｉ－Ｆｉなど）を使用して、Ｉｎｔｅｒｎｅｔなどの広域ネットワーク、マウス入力デバイス、又はスキャナに、コンピュータシステム１０を接続することができる。システムバス７５を介した相互接続は、中央プロセッサ７３が、各サブシステムと通信し、システムメモリ７２又は記憶デバイス７９（例えば、ハードドライブ又は光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令の実行、及びサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２及び／又は記憶デバイス７９は、コンピュータ可読媒体を具現化し得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、及び加速度計などのデータ収集デバイス８５である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、１つの構成要素から別の構成要素に出力され得、ユーザに対して出力され得る。

【0228】

コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１によって、内部インターフェースによって、又は１つの構成要素から別の構成要素に接続することができる取り外し可能な記憶デバイスを介してともに接続される、複数の同じ構成要素又はサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワーク上で通信することができる。そのような例においては、１つのコンピュータは、クライアント及び別のコンピュータをサーバとみなされ得、各々は、同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアント及びサーバは各々、複数のシステム、サブシステム、又は構成要素を含むことができる。

【0229】

実施形態の態様は、ハードウェア回路構成（例えば、アプリケーション特異的集積回路又はフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、及び／又はモジュール式若しくは統合様式で概してプログラム可能なプロセッサとともにコンピュータソフトウェアを使用して、制御論理の形態で実行され得る。本明細書で使用される場合、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ集積チップ上のマルチコアプロセッサ、又は単一の回路基板上の若しくはネットワーク化された複数の処理ユニット、並びに専用のハードウェアを含み得る。本開示及び本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、ハードウェア、及びハードウェアとソフトウェアとの組み合わせを使用して、本発明の実施形態を実装する他の様式及び／又は方法を認識かつ理解するであろう。

【0230】

本出願で記載されるソフトウェア構成要素又は機能のうちのいずれも、例えば、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、又は、例えば、従来の技術若しくは物体指向の技術を使用するＰｅｒｌ若しくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用する、プロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実装され得る。ソフトウェアコードは、保存及び／又は伝送のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令又はコマンドとして記憶され得る。好適な非一時的コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（random access memory、ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（read only memory、ＲＯＭ）、磁気媒体（ハードドライブ若しくはフロッピーディスクなど）、又は光学媒体（コンパクトディスク（compact disk、ＣＤ）若しくはＤＶＤ（digital versatile disk、デジタル多用途ディスク）など、又はブルーレイディスク、フラッシュメモリなどを含み得る。コンピュータ可読媒体は、そのような記憶デバイス又は伝送デバイスの任意の組み合わせであり得る。

【0231】

そのようなプログラムはまた、インターネットを含む様々なプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、及び／又は無線ネットワークを介した伝送に適合した搬送波信号を使用して、コード化されかつ伝送され得る。したがって、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムでコード化されたデータ信号を使用して作成され得る。プログラムコードでコード化されたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスでパッケージ化され得るか、又は他のデバイスとは別個に（例えば、インターネットダウンロードを介して）提供され得る。任意のそのようなコンピュータ可読媒体が、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、又はコンピュータシステム全体）上又は内に存在し得、システム又はネットワーク内の異なるコンピュータ製品上又は内に存在し得る。コンピュータシステムは、本明細書に記載の結果のうちのいずれかをユーザに提供するための、モニタ、プリンタ、又は他の好適なディスプレイを含み得る。

【0232】

本明細書に記載される方法のいずれも、ステップを実行するように構成することができる１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムを用いて全体的に又は部分的に実行され得る。プロセッサを用いて実行される任意の動作（例えば、アライメントさせること、判定すること、比較すること、コンピューティングすること、計算すること）が、リアルタイムで実行され得る。したがって、実施形態は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかのステップを実行するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得、潜在的には異なる構成要素がそれぞれのステップ又はそれぞれのステップの群を実行する。本明細書の方法のステップは、番号付けされたステップとして提示されているが、同時に若しくは異なる時間に、又は異なる順序で実行され得る。更に、これらのステップの部分は、他の方法からの他のステップの部分と使用され得る。また、あるステップの全て又は部分は、任意選択的であり得る。更に、方法のうちのいずれかのステップのいずれも、これらのステップを実行するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、又は他の手段で実行され得る。

【0233】

特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の趣旨及び範囲から逸脱することなく、任意の好適な様式で組み合わせられ得る。しかしながら、本発明の他の実施形態は、各個々の態様、又はこれらの個々の態様の特定の組み合わせに関する特定の実施形態を対象とし得る。

【0234】

本開示の例示的実施形態の上の記載は、例示及び記載の目的のために提示されている。網羅的であること、又は本開示を記載された正確な形態に限定することは意図されず、多くの修正及び変更が、上の教示に鑑みて可能である。

【0235】

「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」の記述は、それとは反対に具体的に示されない限り、「１つ以上」を意味することが意図される。「又は」の使用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「排他的な又は」ではなく「包括的な又は」を意味するように意図される。「第１」の構成要素への言及は、第２の構成要素が提供されることを必ずしも必要としない。更に、「第１」又は「第２」の構成要素への言及は、明示的に述べられていない限り、言及される構成要素を特定の場所に限定するものではない。「～に基づいて」という用語は、「少なくとも一部に基づいて」を意味することを意図している。

【0236】

本明細書で言及される全ての特許、特許出願、刊行物、及び明細書は、全ての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。いかなるものも、先行技術であるとは認められるものではない。
ＸＩ．参考文献
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【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図22E】

【図22F】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図33】

【図34】

【図35】

【国際調査報告】