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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-20
(54)【発明の名称】抗－ＰＤ－１抗体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20231213BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231213BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231213BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20231213BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231213BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231213BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231213BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20231213BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231213BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20231213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231213BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20231213BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/5386 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20231213BHJP
A61K 38/12 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/7064 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/18 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/16 20060101ALI20231213BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231213BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N5/10
C12N15/62 Z
C07K14/705
C07K16/28
A61K39/395 N
A61K39/395 L
A61K47/68
A61K47/65
A61K35/17
A61K35/15
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K39/395 D
A61P35/00
A61K38/05
A61K38/06
A61K31/5386
A61K31/4745
A61K31/519
A61K38/12
A61K31/7064
A61K31/18
A61K31/16
C12N15/09 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535601
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-06-09
(86)【国際出願番号】 KR2021018799
(87)【国際公開番号】W WO2022124866
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】63/123,705
(32)【優先日】2020-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519001408
【氏名又は名称】ユーティレックス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】クォン、ビョンエス．
(72)【発明者】
【氏名】ファン、ソンヒ
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ヒョンテ
(72)【発明者】
【氏名】パク、ヒョクジュン
(72)【発明者】
【氏名】ユ、ウンヘ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
4C206
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA19
4C084AA22
4C084BA44
4C084DA32
4C084DA43
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA25
4C085AA26
4C085BB41
4C085BB44
4C085CC22
4C085CC23
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4C085EE03
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4C085GG03
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4C086AA02
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4C086NA13
4C086ZB26
4C086ZC75
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4C087MA02
4C087NA05
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4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206GA02
4C206GA22
4C206JA11
4C206MA01
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4C206MA03
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4C206NA13
4C206ZB26
4C206ZC75
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045DA86
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、抗－ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）抗体またはその抗原結合断片、これをコーディングする核酸、前記核酸を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターに形質感染された宿主細胞、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体のｓｃＦｖおよび免疫細胞の活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む、免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）、前記抗－ＰＤ－１抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記免疫細胞を含む併用治療用組成物、前記抗体またはその抗原結合断片を含む併用治療用組成物、癌の治療用組成物、癌の治療方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次を含むＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片：配列番号１、８および１４で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、９および１５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３、４、１０、１６および５６で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５、１１、１７、５７および５８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６、１２および１８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号７、１３および１９で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
【請求項2】
前記抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｖ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、または
（ｖｉ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２０、２１、２３、２５、２７、２８、３０、３２、４８および５０で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２、２４、２６、２９、３１、３３、４９、５１、５４および５５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域と、
配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域と、
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域と、
配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３３の軽鎖可変領域と、
配列番号４８の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域と、
配列番号５０の重鎖可変領域および配列番号５１の軽鎖可変領域と、
配列番号５２の重鎖可変領域および配列番号５３の軽鎖可変領域と、または
配列番号５４の重鎖可変領域および配列番号５５の軽鎖可変領域と、を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗体またはその抗原結合断片は、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、ジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
前記ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域がリンカーを介して連結されたことを特徴とする、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸。
【請求項9】
請求項８の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項10】
請求項９の組換え発現ベクターに形質感染された宿主細胞。
【請求項11】
ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、またはＨＴ１０８０である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項12】
請求項１０の宿主細胞を培養して抗体を生成するステップと、および生成された抗体を分離および精製するステップとを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【請求項13】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体。
【請求項14】
ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つ以上に結合する抗体またはその抗原結合断片をパートナーとして含む、請求項１３に記載の二重または多重特異的抗体。
【請求項15】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体のｓｃＦｖおよび免疫細胞の活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む、免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体。
【請求項16】
前記免疫細胞の活性化抗原は、次に該当する、請求項１５に記載の二重特異的または多重特異的抗体：Ｔ細胞の活性化抗原として、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲξ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６と、
ＮＫ細胞の活性化抗原として、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａまたはＣＤ１６ｂ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＣＤ１６０と、
Ｂ細胞の活性化抗原として、ＯＸ４０、ＣＤ４０またはＣＤ７０と、
大食細胞の活性化抗原として、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＴＣＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＣＤ４７、ＳＴＩＮＧまたはＯＸ４０Ｌと、または
樹枝状細胞の活性化抗原は、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニスト。
【請求項17】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）。
【請求項18】
前記薬物は、マイタンシノイド、アウリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦを含む）、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロリドアセテート（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、タルアミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）およびタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素および細菌や動植物由来の毒素で構成された群より選ばれた一つ以上であることを特徴とする、請求項１７に記載の抗体－薬物接合体。
【請求項19】
前記抗体またはその抗原結合断片は、薬物とリンカーを介して結合されることを特徴とする、請求項１７に記載の抗体－薬物接合体。
【請求項20】
前記リンカーは、切断性リンカーまたは非切断性リンカーであることを特徴とする、請求項１９に記載の抗体－薬物接合体。
【請求項21】
前記切断性リンカーは、酸性不安定リンカー（ａｃｉｄ－ｌａｂｉｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）、二硫化リンカー、ペプチドリンカー、またはベータ－グルクロニド（ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）リンカーであり、または前記非切断性リンカーは、チオエーテル基またはマレイミドカプロイル基を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の抗体－薬物接合体。
【請求項22】
前記リンカーは、抗体の二硫化結合の還元時に露出されるシステイン残基または抗体に結合されたタグに存在するシステイン残基に結合されることを特徴とする、請求項１９に記載の抗体－薬物接合体。
【請求項23】
抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよび細胞内の信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体のｓｃＦｖであることを特徴とするキメラ抗原受容体。
【請求項24】
請求項２３に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入されている免疫細胞。
【請求項25】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞の毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、樹枝状細胞で構成された群より選ばれた一つ以上である、請求項２４に記載の免疫細胞。
【請求項26】
抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖが細胞外ドメインの抗原結合部位として含まれたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）がさらに導入されている、請求項２３に記載の免疫細胞。
【請求項27】
前記抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体は、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つ以上をターゲットする抗体またはその抗原結合断片である、請求項２６に記載の免疫細胞。
【請求項28】
請求項２４の免疫細胞および抗－ＰＤ－１抗体以外の薬物を含む併用治療用組成物。
【請求項29】
前記抗－ＰＤ－１抗体以外の薬物は、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つ以上をターゲットする抗体またはその抗原結合断片である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物：（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖを細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
【請求項31】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞の毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、樹枝状細胞で構成された群より選ばれた一つ以上である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項32】
前記抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体は、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つ以上をターゲットする抗体またはその抗原結合断片である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項33】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、またはＣＤ２００Ｒをターゲットにする薬物である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項34】
請求項１３に記載の二重特異的または多重特異的抗体、および次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物：（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
【請求項35】
前記抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体は、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つ以上をターゲットする抗体またはその抗原結合断片である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００またはＣＤ２００Ｒをターゲットにする薬物である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項37】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む癌の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗－ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）抗体またはその抗原結合断片、これをコーディングする核酸、前記核酸を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターに形質感染された宿主細胞、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体のｓｃＦｖおよび免疫細胞の活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む、免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）、前記抗－ＰＤ－１抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記免疫細胞を含む併用治療用組成物、前記抗体またはその抗原結合断片を含む併用治療用組成物、癌の治療用組成物、癌の治療方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
ＰＤ－１は免疫調節および末梢寛容の維持において重要な役割を果たすものとして認識される。活性化されたＴおよびＢ細胞上で主に発現される免疫阻害受容体である細胞予定死受容体１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １：ＰＤ－１；細胞予定死受容体１、細胞予定死タンパク質１、ＣＤ２７９）は、ＣＤ２８および細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質－４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２）に関わった免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員であって、ＰＤ－１は、リガンドに結合する細胞外Ｉｇ可変－類型（Ｖ－型）および信号伝達分子に結合する細胞質尾を含むＩ型膜貫通糖タンパク質である。Ｔ、ＢおよびＮＫＴ細胞上で中間程度で発現され、リンパ球、単核球および骨髄細胞上でＴ／Ｂ細胞受容体の信号伝達によって上向き－調節される（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７）；８：２３９－２４５）。
【0003】
ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ１）および／またはＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３、Ｂ７－ＤＣ）によって結合されるとき、Ｔ－細胞反応を弱化させる。ＰＤ－１に対するこれらのリガンドの結合は、Ｔ－細胞増殖、サイトカイン生産および細胞溶解機能を阻害する信号を伝達する。ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１結合遮断は、腫瘍－特異的なＣＤ８＋Ｔ－細胞免疫を向上させ、免疫係による腫瘍細胞の除去を容易にする。
【0004】
ＰＤ－１に対するリガンドであるＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ１）および／またはＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３、Ｂ７－ＤＣ）は、多様な組織で発生するヒトの癌から発現される。例えば、卵巣癌、腎癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝癌および黒色腫の大型サンプルのセットで、ＰＤ－Ｌ１の発現は、後続治療に関係なく不良な予後と関わり、全体生存を減少させる。
【0005】
ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞は、ＰＤ－１発現Ｔ細胞と相互作用してＴ細胞の活性化を減衰させて免疫監視を回避し、それによって腫瘍に対する損傷された免疫反応に寄与する。
【0006】
ＰＤ－１抑制抗体として、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社で開発したＫｅｙｔｒｕｄａ（成分名ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）またはＢＭＳ社のＯｐｄｉｖｏ（成分名ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）が市販中である。しかし、このような薬物は、腫瘍細胞を攻撃して癌を死滅させるＴリンパ球を活性化させてこそ薬効が示されるが、活性化の程度が微々に発現されるというなどの問題がある。よって、腫瘍または癌の成長の抑制に効果的な程度のＴリンパ球の活性化のための既存の抗体と区別される新規な抗－ＰＤ－１抗体の開発が要求される。
【0007】
このような技術的な背景下において、本発明者は、新規な抗－ＰＤ－１抗体を開発しようと鋭意努力した結果、優れた抗体の特性および効能などを確認し、目的とする癌の治療に用いられてもよいことを確認することで、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）に対する新規な抗体またはその抗原結合断片を提供するのにある。
【0009】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸を提供するのにある。
【0010】
本発明の他の目的は、前記核酸を含む組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターに形質感染された宿主細胞を提供するのにある。
【0011】
本発明の他の目的は、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供するのにある。
【0012】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体を提供するのにある。
【0013】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体を提供するのにある。
【0014】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）を提供するのにある。
【0015】
本発明の他の目的は、前記抗－ＰＤ－１抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記免疫細胞を含む併用治療用組成物を提供するのにある。
【0016】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片または前記免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体を含む併用治療用組成物を提供するのにある。
【0017】
本発明の他の目的は、抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体を含む癌の治療用組成物または癌の治療方法を提供するのにある。
【課題を解決するための手段】
【0018】
前記目的を達成するために、本発明は、次を含むＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する：
配列番号１、８および１４で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、９および１５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３、４、１０、１６および５６で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５、１１、１７、５７および５８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６、１２および１８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および
配列番号７、１３および１９で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
配列番号１、８および１４で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、９および１５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３、４、１０、１６および５６で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５、１１、１７、５７および５８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６、１２および１８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および
配列番号７、１３および１９で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
【0019】
本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸を提供する。
【0020】
本発明はまた、前記核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
【0021】
本発明はまた、前記組換え発現ベクターに形質感染された宿主細胞を提供する。
【0022】
本発明はまた、宿主細胞を培養して抗体を生成するステップと、および生成された抗体を分離および精製するステップとを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【0023】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体を提供する。
【0024】
本発明はまた、前記抗体のｓｃＦｖおよび免疫細胞の活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む、免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体を提供する。
【0025】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）を提供する。
【0026】
本発明はまた、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよび細胞内の信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、前記抗体のｓｃＦｖであることを特徴とするキメラ抗原受容体を提供する。
【0027】
本発明はまた、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞を提供する。
【0028】
本発明はまた、前記免疫細胞および抗－ＰＤ－１抗体以外の薬物を含む併用治療用組成物を提供する。
【0029】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片と、次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物を提供する：
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
本発明はまた、前記二重特異的または多重特異的抗体、および次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物を提供する：
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
本発明はまた、前記二重特異的または多重特異的抗体、および次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物を提供する：
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
【0030】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞を含む、癌の治療用組成物を提供する。
【0031】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、抗体－薬物接合体、キメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞または二重特異的な免疫細胞の結合体を投与するステップを含む、癌の治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0032】
本発明による抗－ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ－１に対する優れた結合力を示し、目的とする腫瘍または癌の予防または治療に有用に用いられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】免疫マウス（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ）のスクリーニングを示す。ｃＤＮＡとｒｈｐｒｏｔｅｉｎのｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎの間、各ｍｏｕｓｅのｓｅｒｕｍを分離してＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙの形成を確認した。２回のｃＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎの後に、＃２、４ｍｏｕｓｅにおいてＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙが形成され、ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｏｏｓｔｉｎｇの後にはすべてのｍｏｕｓｅにおいてＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙが形成されることを確認した。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔは、＃２、４ｍｏｕｓｅのｓｐｌｅｅｎｓを用いてＦｕｓｉｏｎを進めた。
【図2】ＥＬＩＳＡによるＨｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇを示す。Ｆｕｓｉｏｎの約２週間程度で十分なｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｌｏｎｅｓが形成され、そのｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓを用いてＥＬＩＳＡスクリーニングを進めた。その結果、＃２ｍｏｕｓｅのｆｕｓｉｏｎで１２ｃｌｏｎｅｓ、＃４ｍｏｕｓｅのｆｕｓｉｏｎで７ｃｌｏｎｅｓ、ｔｏｔａｌ １９個のｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓをｓｅｌｅｃｔｉｏｎし、このうちＯＤ＝４５０値が１．０以上であるｃｌｏｎｅｓは１１個であった。
【図3】Ｑ－ＥＬＩＳＡによるｈＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇを示す。各ｃｌｏｎｅは１×１０６ ｈｙｂｒｉｄｏｍａを２４ｈｒ培養した後、そのｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔを用いてＥＬＩＳＡを進めることで抗体の生産量を定量的に比較して選別した。その結果、２－２Ｂ３、２－３Ｃ３、２－５Ｆ１、２－７Ｃ５、２－９Ａ９、および４－８Ｄ４、４－８Ｈ１１、４－９Ｄ１２、４－９Ｆ１０の９ｃｌｏｎｅｓを選別した。
【図4A】図４Ａ乃至図４Ｃは、ｈＰＤ－１ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓの特性を示す。Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓはＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓｔａｉｎ（図４Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図４Ｂ）、ＳＰＲ（図４Ｃ）によりその特性を分析した。８ｃｌｏｎｅｓでｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１－Ｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＤ）との結合力で類似したｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを示し、そのうち４－９Ｄ１２、４－９Ｆ１０がもう少し高いｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを有する。
【図4B】図４Ａ乃至図４Ｃは、ｈＰＤ－１ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓの特性を示す。Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓはＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓｔａｉｎ（図４Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図４Ｂ）、ＳＰＲ（図４Ｃ）によりその特性を分析した。８ｃｌｏｎｅｓでｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１－Ｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＤ）との結合力で類似したｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを示し、そのうち４－９Ｄ１２、４－９Ｆ１０がもう少し高いｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを有する。
【図4C】図４Ａ乃至図４Ｃは、ｈＰＤ－１ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓの特性を示す。Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓはＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓｔａｉｎ（図４Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図４Ｂ）、ＳＰＲ（図４Ｃ）によりその特性を分析した。８ｃｌｏｎｅｓでｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１－Ｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＤ）との結合力で類似したｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを示し、そのうち４－９Ｄ１２、４－９Ｆ１０がもう少し高いｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを有する。
【図5】ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるｈＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓとｈＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓとの間のＢｉｎｄｉｎｇ ｔｅｓｔを示す。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙにおいて用いられたＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓの一部を用いてＰＤ－１に対する抗体のｂｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔをｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ分析した結果、２－２Ｂ３（４９．９％）、２－７Ｃ５（５０．４％）、４－８Ｄ４（２３．５％）を確認した。
【図6】ｈＰＤ－１ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに対するｈＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓａｙを示す。分析は二つのｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ、ＰＤ－１ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ ｃｅｌｌｓをｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅしたとき、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎはＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを抑制した。一方、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを選別された抗体のｆｕｎｃｔｉｏｎによりｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎされると、ＴＣＲ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎによりｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅが誘導される原理である。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅに選別された抗体を５ｕｇから２－ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎし、そのｂｌｏｃｋｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔを確認した結果、３個のｃｌｏｎｅｓ、２－２Ｂ３、２－７Ｃ５、４－８Ｄ４抗体でｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙと類似したｂｌｏｃｋｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔを示した。
【図7A】図７Ａ乃至図７Ｃは、選別された３ｃｌｏｎｅｓ抗体のヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）を示す。Ｋｅｙｔｒｕｄａと比較して抗体の特性を分析し、選別された抗体における結合力は２～８倍程度低かった。ｈＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇにおいて、ヒト化ＰＤ－１抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ＆Ｑ－ＥＬＩＳＡ（図７Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ＆ＳＰＲ（図７Ｂ）およびＢｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔの結果（図７Ｃ）を示した。
【図7B】図７Ａ乃至図７Ｃは、選別された３ｃｌｏｎｅｓ抗体のヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）を示す。Ｋｅｙｔｒｕｄａと比較して抗体の特性を分析し、選別された抗体における結合力は２～８倍程度低かった。ｈＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇにおいて、ヒト化ＰＤ－１抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ＆Ｑ－ＥＬＩＳＡ（図７Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ＆ＳＰＲ（図７Ｂ）およびＢｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔの結果（図７Ｃ）を示した。
【図7C】図７Ａ乃至図７Ｃは、選別された３ｃｌｏｎｅｓ抗体のヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）を示す。Ｋｅｙｔｒｕｄａと比較して抗体の特性を分析し、選別された抗体における結合力は２～８倍程度低かった。ｈＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇにおいて、ヒト化ＰＤ－１抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ＆Ｑ－ＥＬＩＳＡ（図７Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ＆ＳＰＲ（図７Ｂ）およびＢｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔの結果（図７Ｃ）を示した。
【図9A】図９Ａ乃至図９Ｃは、各候補抗体の抗原に対する親和度を増加させるためのｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの結果を示す。図９Ａは、２Ｂ３Ｗの親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｂは、７Ｃ５の親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｃは８Ｄ４の親和度を改善した２ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｄは、ライバル社の抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と比較して親和度がさらに高いＴ１４－０５（５．８ｎＭ）と親和度が類似したＴ１５－０１（９．７ｎＭ）抗体を選別した結果を示す。
【図9B】図９Ａ乃至図９Ｃは、各候補抗体の抗原に対する親和度を増加させるためのｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの結果を示す。図９Ａは、２Ｂ３Ｗの親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｂは、７Ｃ５の親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｃは８Ｄ４の親和度を改善した２ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｄは、ライバル社の抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と比較して親和度がさらに高いＴ１４－０５（５．８ｎＭ）と親和度が類似したＴ１５－０１（９．７ｎＭ）抗体を選別した結果を示す。
【図9C】図９Ａ乃至図９Ｃは、各候補抗体の抗原に対する親和度を増加させるためのｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの結果を示す。図９Ａは、２Ｂ３Ｗの親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｂは、７Ｃ５の親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｃは８Ｄ４の親和度を改善した２ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｄは、ライバル社の抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と比較して親和度がさらに高いＴ１４－０５（５．８ｎＭ）と親和度が類似したＴ１５－０１（９．７ｎＭ）抗体を選別した結果を示す。
【図9D】図９Ａ乃至図９Ｃは、各候補抗体の抗原に対する親和度を増加させるためのｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの結果を示す。図９Ａは、２Ｂ３Ｗの親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｂは、７Ｃ５の親和度を改善した５ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｃは８Ｄ４の親和度を改善した２ｃｌｏｎｅｓの抗体、図９Ｄは、ライバル社の抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と比較して親和度がさらに高いＴ１４－０５（５．８ｎＭ）と親和度が類似したＴ１５－０１（９．７ｎＭ）抗体を選別した結果を示す。
【図13】選別された最終候補抗体の種間Ｃｒｏｓｓ－Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙの分析結果を示す。
【図14A】図１４Ａ乃至図１４Ｃは、最終候補抗体のＩｎ ｖｉｖｏ効能の分析結果を示す。図１４Ａは、抗体投与による各グループの個体別のｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅの分析結果を示す。図１４Ｂは、各グループの腫瘍の大きさの平均値をグラフ化した結果を示す。図１４Ｃは、各グループのＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞の分布結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
別に定義されない限り、本明細書において用いられたすべての技術的および科学的な用語は、本発明の属する技術分野において熟練した専門家によって、通常、理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書において用いられた命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常用いられるものである。
【0035】
抗－ＰＤ－１抗体
Ｂａｌｂ／ｃ Ｍｏｕｓｅを利用してｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ ｇｅｎｅによるｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ ｐｒｏｔｅｉｎのｂｏｏｓｔｉｎｇによりｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後、そのｓｐｌｅｅｎをｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ、ｓｐ２／ｏとｆｕｓｉｏｎさせた。Ａｎｔｉ－ｈＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙを生産するｈｙｂｒｉｄｏｍａをｓｃｒｅｅｎｉｎｇしてｃｌｏｎｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎした。Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃｌｏｎｅｓをｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎしてその特性を分析し、ｈＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合をｂｌｏｃｋｉｎｇできる機能を有するｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを選別した。選別されたａｎｔｉ－ｈＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓのｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇしてｃｈｉｍｅｒｉｃ ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよび最終的にｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙを開発した。
Ｂａｌｂ／ｃ Ｍｏｕｓｅを利用してｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ ｇｅｎｅによるｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ ｐｒｏｔｅｉｎのｂｏｏｓｔｉｎｇによりｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後、そのｓｐｌｅｅｎをｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ、ｓｐ２／ｏとｆｕｓｉｏｎさせた。Ａｎｔｉ－ｈＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙを生産するｈｙｂｒｉｄｏｍａをｓｃｒｅｅｎｉｎｇしてｃｌｏｎｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎした。Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃｌｏｎｅｓをｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎしてその特性を分析し、ｈＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合をｂｌｏｃｋｉｎｇできる機能を有するｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを選別した。選別されたａｎｔｉ－ｈＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓのｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇしてｃｈｉｍｅｒｉｃ ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよび最終的にｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙを開発した。
【0036】
本発明は、一つの観点において、次を含むＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関するものである：配列番号１、８および１４で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、９および１５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３、４、１０、１６および５６で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；配列番号５、１１、１７、５７および５８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６、１２および１８で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７、１３および１９で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
【0037】
本明細書において用いられた用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＰＤ－１に特異的に結合する抗－ＰＤ－１抗体を意味する。本発明の範囲には、ＰＤ－１に特異的に結合する完全な抗体の形態だけではなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【0038】
完全な抗体は、２つの全体長さの軽鎖および２つの全体長さの重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合により連結されている。
【0039】
本明細書において用いられる用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む全体長さの重鎖およびこの断片をすべて意味する。また、本明細書において用いられる用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全体長さの軽鎖およびこの断片をすべて意味する。
【0040】
前記全体抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）を含み、特にＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【0041】
抗体の抗原結合断片または抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の第一の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ－ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点においてＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。
【0042】
Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体欠片に相当する。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合により重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合により連結されるか、またはＣ－末端ですぐに連結されていることから、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用するか（例えば、完全な形態の抗体をパパインで制限切断するとＦａｂが得られ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２が得られる）、または遺伝子組換え技術を利用して製作してもよい。
【0043】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識および結合部位を含む抗体断片である。このような領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが結合された二量体である。
【0044】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および不変ドメインと、重鎖の可変および第１の不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般的にＦａｂ’断片Ｃ－末端に存在するヒンジ領域のシステインにより共有的に連結された一対のＦａｂ’断片を含む。
【0045】
「単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む単一ポリペプチド鎖からなった構造体である。ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含んでもよい。
【0046】
一つの実施例において、本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド－結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）および抗－イディオタイプ（抗－Ｉｄ）抗体、または前記抗体のエピトープ－結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
【0047】
前記重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）のうちいずれか一つのイソタイプから選ばれてもよい。例えば、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖不変領域はカッパまたはラムダ型であってもよい。
【0048】
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的な抗体集団から修得した抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在できる可能な天然発生的突然変異を除いては同一のものを指称する。単一クローン抗体は高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に異なる決定因子（エピトープ）に対して異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、それぞれの単一クローン抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。
【0049】
「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗体が特異的に結合してもよいタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、通常化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸または糖側鎖で構成され、一般的に特定の３次元の構造的な特徴だけでなく、特定の電荷特性を有する。立体的なエピトープおよび非立体的なエピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しない点において区別される。
【0050】
前記「ヒト化」形態の非－ヒト（例：マウス）抗体は、非－ヒト免疫グロブリンに由来した最小配列を含むキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を目的とする特異性、親和性および能力を保有している非－ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非－ヒト霊長類の超可変領域からの残基に代替させたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。
【0051】
前記「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンに由来する分子であって、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成するアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されていることを意味する。
【0052】
重鎖および／または軽鎖の一部が特別な種に由来するか、または特別な抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか、またはこれと相同性であるのに対し、残りの鎖は、また他の種に由来するか、またはまた他の抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか、または相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）だけでなく、目的とする生物学的な活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
【0053】
本発明において用いられた抗体の「可変領域」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）および骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖部分を意味する。ＶＨは重鎖の可変ドメインを意味する。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを意味する。
【0054】
「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で確認された３つのＣＤＲ領域を有する。
【0055】
本発明による抗－ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、例えば、次を含んでもよい：
（ｉ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｖ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、または
（ｖｉ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
（ｉ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｖ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、または
（ｖｉ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【0056】
「骨格領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の４つのＦＲを有する。
【0057】
抗－ＰＤ－１抗体のＰＤ－１に対する結合親和性は１０－５Ｍ乃至１０－１２Ｍの範囲内にある。例えば、抗－ＰＤ－１抗体のＰＤ－１に対する結合親和性は、１０－６Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－９Ｍ乃至１０－１２Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－１０Ｍ乃至１０－１１Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－９Ｍ乃至１０－１０Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－８Ｍ乃至１０－９Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－８Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－８Ｍ、１０－７Ｍ乃至１０－８Ｍ、１０－５Ｍ乃至１０－７Ｍ、１０－６Ｍ乃至１０－７Ｍまたは１０－５Ｍ乃至１０－６Ｍである。
【0058】
前記ＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２０、２１、２３、２５、２７、２８、３０、３２、４８および５０で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含んでもよい。また、前記ＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２、２４、２６、２９、３１、３３、４９、５１、５４および５５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【0059】
本発明による具体的な実施例において、次を含んでもよい：
配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域と、
配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域と、
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域と、
配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３３の軽鎖可変領域と、
配列番号４８の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域と、
配列番号５０の重鎖可変領域および配列番号５１の軽鎖可変領域と、
配列番号５２の重鎖可変領域および配列番号５３の軽鎖可変領域と、または
配列番号５４の重鎖可変領域および配列番号５５の軽鎖可変領域。
配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域と、
配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域と、
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域と、
配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３３の軽鎖可変領域と、
配列番号４８の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域と、
配列番号５０の重鎖可変領域および配列番号５１の軽鎖可変領域と、
配列番号５２の重鎖可変領域および配列番号５３の軽鎖可変領域と、または
配列番号５４の重鎖可変領域および配列番号５５の軽鎖可変領域。
【0060】
ｓｃＦｖ
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む単一ポリペプチド鎖からなった構造体であって、抗体断片である。ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含んでもよい。
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む単一ポリペプチド鎖からなった構造体であって、抗体断片である。ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含んでもよい。
【0061】
一つの実施例において、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）でＶＨおよびＶＬドメインはリンカーを介して連結されてもよい。配列番号２０、２１、２３、２５、２７、２８、３０、３２、４８および５０で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域は、リンカーを介して配列番号２２、２４、２６、２９、３１、３３、４９、５１、５４および５５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と連結されてもよい。
【0062】
本発明による具体的な実施例において、次を含んでもよい：
配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域と、
配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域と、
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域と、
配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３３の軽鎖可変領域と、
配列番号４８の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域と、
配列番号５０の重鎖可変領域および配列番号５１の軽鎖可変領域と、
配列番号５２の重鎖可変領域および配列番号５３の軽鎖可変領域と、または
配列番号５４の重鎖可変領域および配列番号５５の軽鎖可変領域。
配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域と、
配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域と、
配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域と、
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号２９の軽鎖可変領域と、
配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域と、
配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３３の軽鎖可変領域と、
配列番号４８の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域と、
配列番号５０の重鎖可変領域および配列番号５１の軽鎖可変領域と、
配列番号５２の重鎖可変領域および配列番号５３の軽鎖可変領域と、または
配列番号５４の重鎖可変領域および配列番号５５の軽鎖可変領域。
【0063】
前記リンカーはペプチドリンカーであってもよく、約１０～２５ａａの長さを有してもよい。例えば、グリシンおよび／またはセリンのような親水性アミノ酸が含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
【0064】
具体的に、前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１乃至１０）を含んでもよく、前記リンカーは、例えば（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍは、それぞれ１乃至１０）であってもよい。具体的に、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳを含んでもよい。
【0065】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば、繊維状ファージ粒子の表面上に外被タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質でディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きなライブラリを対象として、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速且つ効率的に分類できるという事実にある。ペプチドおよびタンパク質ライブラリをファージ上にディスプレイすることは、特異的な結合特性を有したポリペプチドを検討するために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた。
【0066】
ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を生成および選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きなライブラリを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外被タンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質またはポリペプチドを暗号化する核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発された。１価ファージディスプレイシステムにおいては、遺伝子融合物が低水準で発現され、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質もまた発現されて粒子感染性が維持される。
【0067】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが抗体ファージディスプレイライブラリを開発するのにおいて重要である。抗体または抗原結合性ポリペプチドのライブラリは数多くの方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することで単一遺伝子を変更させる方法または関連遺伝子系列をクローニングする方法により製造した。ライブラリを対象として、目的とする特徴を伴う抗体または抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングしてもよい。
【0068】
ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を有した抗体を製造するための通常のハイブリドーマおよび組換え方法に比べて幾つかの利点を有している。このような技術は、動物を用いることなく短い時間に多様な配列を有した大きな抗体ライブラリを生成させることができるようにする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は数ヶ月の製造期間を要する可能性がある。また、免疫が全く要求されないため、ファージ抗体ライブラリは毒性や抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。ファージ抗体ライブラリをまた用いて新規の治療的な抗体を生成および確認することができる。
【0069】
ファージディスプレイライブラリを用いて免疫させた、非－免疫させたヒト、生殖細胞係配列、または未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いてもよい。各種リンパ系組織を用いて、未感作または非免疫抗原結合性ライブラリを製造してもよい。
【0070】
ファージディスプレイライブラリから高親和性の抗体を確認および分離できる技術は、治療用の新規な抗体分離に重要である。ライブラリから高親和性の抗体を分離することは、ライブラリの大きさ、細菌性細胞中での生産効率およびライブラリの多様性に左右される可能性がある。ライブラリの大きさは、抗体または抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的な生産により減少される。細菌性細胞における発現は、抗体または抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制されてもよい。発現は可変／不変界面の表面や選別されたＣＤＲ残基における残基を交代に突然変異させることで改善させてもよい。骨格領域の配列は、細菌性細胞で抗体ファージライブラリを生成させる場合、適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
【0071】
高親和性抗体の分離において抗体または抗原結合性タンパク質の多様なライブラリを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、これらがたびたび抗原結合に参加するものと明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、大きさ、配列および構造的な立体形態の面において相当多様であるので、これを利用して多様なライブラリを製造してもよい。
【0072】
また、各位置で２０個のアミノ酸をすべて用いて可変重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することで多様性を発生させてもよい。２０個のすべてのアミノ酸を用いると、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規な抗体を確認する機会が増加する可能性がある。
【0073】
本発明の抗体または抗体断片は、ＰＤ－１を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載した本発明の抗－ＰＤ－１抗体の配列だけでなく、その生物学的な均等物も含んでもよい。例えば、抗体の結合親和度および／またはその他の生物学的な特性をよりさらに改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形および種類に関する分析により、アルギニン、リシンとヒスチジンはいずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは類似した大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似した形を有するということが分かる。従って、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物と言える。
【0074】
上述の生物学的な均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体またはこれをコーディングする核酸分子は、配列番号に記載されている配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解析される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインし、当業界において、通常、利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメントの方法は、当業界に公知になっている。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、ＮＢＣＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＡＳＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／から接続可能である。このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【0075】
このことに基づいて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、明細書に記載されている明示された配列または全体と比べて９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の相同性を有してもよい。このような相同性は、当業界に公知になった方法による配列比較および／または整列によって決定されてもよい。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、目視検査を利用して本発明の核酸またはタンパク質のパーセント配列相同性を決定してもよい。
【0076】
本発明は、他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸に関するものである。本発明の抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸を分離して抗体またはその抗原結合断片を組換え的に生産してもよい。
【0077】
「核酸」はＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコーディングする核酸の配列は変形されうる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。
【0078】
前記ＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸は、配列番号３４乃至４７で構成された群より選ばれた重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコーディングする核酸を含んでもよい。
【0079】
本発明による具体的な実施例において、次を含んでもよい：
配列番号３４の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号３６の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号３５の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号３６の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号３７の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号３８の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号３９の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４０の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号４１の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４３の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号４２の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４３の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号４４の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４５の軽鎖可変領域コーディング核酸と、または
配列番号４６の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４７の軽鎖可変領域コーディング核酸。
配列番号３４の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号３６の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号３５の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号３６の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号３７の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号３８の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号３９の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４０の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号４１の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４３の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号４２の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４３の軽鎖可変領域コーディング核酸と、
配列番号４４の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４５の軽鎖可変領域コーディング核酸と、または
配列番号４６の重鎖可変領域コーディング核酸および配列番号４７の軽鎖可変領域コーディング核酸。
【0080】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の分子生物学的な手法を用いて（例えば、抗体と重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）容易に分離または合成することができ、核酸を分離し、これを複製可能なベクター内へ挿入してさらにクローニングするか（ＤＮＡの増幅）またはさらに発現させる。このことに基づいて、本発明はまた他の観点で、前記核酸を含む組換え発現ベクターに関するものである。
【0081】
本明細書において用いられる用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ－関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。ベクターの成分としては、一般的に、次のうちの一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上の抗生剤耐性マーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、転写終結配列。抗体をコーディングする核酸は、プロモーターおよび転写終結配列などのように作動的に連結されている。
【0082】
「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または解読を調節することになる。
【0083】
原核細胞を宿主とする場合には、転写を進めることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来のプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘログロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーターおよびロウスサコマウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用されてもよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【0084】
場合によって、ベクターは、それにより発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトス結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）および６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。
【0085】
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【0086】
本発明は、また他の観点において、前記組換え発現ベクターに形質感染された宿主細胞に関するものである。本発明の抗体を生成させるために用いられた宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞であるあるが、それに制限されるものではない。
【0087】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を利用してもよい。
【0088】
ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、またはＨＴ１０８０であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0089】
本発明は、また他の観点において、前記宿主細胞を培養して抗体を生成するステップと、および生成された抗体を分離および精製するステップとを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法に関するものである。
【0090】
前記宿主細胞は各種培地で培養することができる。市販用培地のうち制限なく培養培地として用いてもよい。当業者に公知になっているその他のすべての必須補充物が適当な濃度に含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に、既に用いられており、これは当業者に明白である。
【0091】
前記抗体またはその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離または限外ろ過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを利用して精製してもよい。追加のその他の精製技術、例えば、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが用いられてもよい。
【0092】
二重または多重特異的抗体
本発明は、他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体に関するものである。
本発明は、他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体に関するものである。
【0093】
二重特異的抗体は、一つ以上のターゲットに結合能または拮抗能を有する抗体を意味し、２個の互いに異なるターゲットに対する結合能または拮抗能を有する抗体が結合された形態または一ターゲットに対する結合能を有する抗体と他のターゲットに対する拮抗能を有する物質が結合されている抗体を意味する。
【0094】
多重特異的抗体は、少なくとも３以上の異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異的（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、三重特異的（Ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）以上の抗体、例えば、三重特異的（Ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、四重特異的（Ｔｅｔｒａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体またはそれ以上のターゲットを標的する抗体を含んでもよい。
【0095】
二重特異的または多重特異的抗体に属する抗体は、ｓｃＦｖ基盤抗体、Ｆａｂ基盤抗体およびＩｇＧ基盤抗体などに区分してもよい。二重特異的または多重特異的抗体の場合、２つ以上の信号を同時に抑制または増幅させることができるので、一つの信号を抑制／増幅する場合よりさらに効果的である可能性があり、それぞれの信号をそれぞれの信号抑制剤で処理した場合と比較すると、低用量投薬が可能であり、同一の時間および空間における２つ以上の信号を抑制／増幅させることができる。
【0096】
二重特異的または多重特異的抗体の製造方法は広く公知になっている。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生産は、２つ以上の重鎖が異なる特異性を有する条件で２つ以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共同発現を根幹とする。
【0097】
ｓｃＦｖに基づく二重特異的または多重特異的抗体の場合、異なるｓｃＦｖのＶＬとＶＨをそれぞれ互いに組み合わせて混成ｓｃＦｖをｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃの形態で製造してダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を作ってもよく、異なるｓｃＦｖを互いに連結してｔｅｎｄｅｍ ＳｃＦｖを製造してもよく、ＦａｂのＣＨ１とＣＬをそれぞれのｓｃＦｖの末端に発現させてｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）を製造してもよく、ＦｃのｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃドメインであるＣＨ３ドメインの一部アミノ酸を置換して‘ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ’の形態のｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ構造に変更させ、これらの変更されたＣＨ３ドメインを異なるそれぞれのｓｃＦｖ末端に発現させることでｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｓｃＦｖの形態のミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を製造してもよい。
【0098】
Ｆａｂに基づく二重特異的または多重特異的抗体の場合、特定抗原に対する個別Ｆａｂ’を二硫化結合または媒介体を利用して互いに組み合わせてｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆａｂの形態で製造してもよく、特定Ｆａｂの重鎖または軽鎖の末端に異なる抗原に対するｓｃＦｖを発現させることで抗原結合価（ｖａｌｅｎｃｙ）を２つにするか、ＦａｂとｓｃＦｖとの間にヒンジ部位（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を設けることで、ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃの形態で４つの抗原結合価を有するように製造してもよい。また、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に異なる抗原に対するｓｃＦｖを融合させることで、抗原に対する結合価を３つに作った二重標的バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に異なるｓｃＦｖをそれぞれ融合させることで、抗原に対する結合価を３つに有するようにした三重標的バイボディ、異なるＦａｂの３つを化学的に接合させることで修得することができる。
【0099】
ＩｇＧに基づく二重特異的または多重特異的抗体の場合、トリオンファーマ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）社によってマウスとラットハイブリドーマを再度交雑することで、ハイブリッドハイブリドーマ、一名クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ）を製造して二重特異的抗体を生産する方法が知られている。また、軽鎖部分は共有しつつ、異なる重鎖に対してＦｃのＣＨ３ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃドメインの一部アミノ酸を変形させてｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃの形態で製作した、いわゆる‘Ｈｏｌｅｓ ａｎｄ Ｋｎｏｂ’の形態で二重特異的抗体を製造してもよい。ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃの形態の二重特異的抗体以外に、異なる２種のｓｃＦｖをＩｇＧの軽鎖と重鎖の可変ドメインの代わりにｃｏｎｓｔａｎｔドメインにそれぞれ融合発現させてｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃの形態の（ｓｃＦｖ）４－ＩｇＧで製造してもよい。また、イムクローン（ＩｍＣｌｏｎｅ）社はヒトＶＥＧＦＲ－２に対するキメリック単クローン抗体であるＩＭＣ－１Ｃ１１に基づいて、この抗体の軽鎖アミノ末端にマウス血小板誘導成長因子受容体－アルファ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）に対するｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎのみを融合させて二重特異的抗体を製作して報告した。また、タンパク質キナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ、ＰＫＡ）Ｒサブユニットのｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＤＤＤ）とＰＫＡのａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎを利用した、いわゆる‘ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）’方法を通じてＣＤ２０に対する多数の抗原結合価を有する抗体で製作してもよい。
【0100】
非常に多様な組換え抗体フォーマット、例えば、２価以上、３価以上または４価以上の二重特異的または多重特異的抗体が開発された。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００１／０７７３４２号、第ＷＯ２００９／０８０２５１号、第ＷＯ２００９／０８０２５２号、第ＷＯ２００９／０８０２５３号、第ＷＯ２００９／０８０２５４号、第ＷＯ２０１０／１１２１９３号、第ＷＯ２０１０／１１５５８９号、第ＷＯ２０１０／１３６１７２号、第ＷＯ２０１０／１４５７９２号、第ＷＯ２０１０／１４５７９３号および第ＷＯ２０１１／１１７３３０号に記載されている２価以上、３価以上または４価以上の抗体も含む。２価以上、３価以上または４価以上の抗体は、それぞれ２つ以上の結合ドメイン、３つ以上の結合ドメインまたは４つ以上の結合ドメインが抗体分子に存在するということを表示する。
【0101】
具体的な実施例において、本発明による二重または多重特異的抗体は、前記抗－ＰＤ－１抗体または抗原結合断片を、具体的に、ＩｇＧ完全な抗体またはその断片形態、例えば、単一鎖Ｆｖ、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２の形態で含んでもよい。
【0102】
また、前記ＰＤ－１をターゲットにする抗体と他のターゲットに結合する抗体またはその抗原結合断片、例えば、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つ以上を含んでもよい。前記抗体またはその抗原結合断片は、具体的に、ＩｇＧ完全な抗体またはその断片形態、例えば、単一鎖Ｆｖ、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２の形態で含んでもよい。
【0103】
本発明による二重または多重特異的抗体を通じてＰＤ－１以外に、他のターゲットによって誘導されるか、または媒介された追加的な結合特異性を確保可能である。
【0104】
例えば、本発明による二重特異的抗体は、ＰＤ－１とＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つを同時にターゲットにしてもよい。
【0105】
例えば、本発明による多重特異的抗体は、ＰＤ－１とＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた２つ以上を同時にターゲットにしてもよい。
【0106】
免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体
本発明は、また他の観点において、抗体のｓｃＦｖおよび免疫細胞の活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む、免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体に関するものである。
本発明は、また他の観点において、抗体のｓｃＦｖおよび免疫細胞の活性化抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを一つ以上含む、免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体に関するものである。
【0107】
前記免疫細胞エンゲージングの二重特異的または多重特異的抗体を通じて細胞毒性Ｔ細胞と癌ターゲット細胞との間の細胞溶解性シナプスを一時的に誘導して毒性物を放出するようにする。
【0108】
一つの実施例において、前記免疫細胞の活性化抗原は、例えば、次において選択されてもよく、これに結合する抗体またはその抗原結合断片が免疫細胞エンゲージャー（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）の役割を果たすことができる：
Ｔ細胞の活性化抗原は、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲξ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２またはＣＤ２２６と、
ＮＫ細胞の活性化抗原は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ｅ．ｇ．、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＣＤ１６０と、
Ｂ細胞の活性化抗原は、ＯＸ４０、ＣＤ４０またはＣＤ７０と、
大食細胞の活性化抗原は、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＴＣＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＣＤ４７、ＳＴＩＮＧまたはＯＸ４０Ｌと、または
樹枝状細胞の活性化抗原は、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニスト。
Ｔ細胞の活性化抗原は、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲξ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２またはＣＤ２２６と、
ＮＫ細胞の活性化抗原は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ｅ．ｇ．、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＣＤ１６０と、
Ｂ細胞の活性化抗原は、ＯＸ４０、ＣＤ４０またはＣＤ７０と、
大食細胞の活性化抗原は、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＴＣＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＣＤ４７、ＳＴＩＮＧまたはＯＸ４０Ｌと、または
樹枝状細胞の活性化抗原は、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニスト。
【0109】
免疫細胞エンゲージャー（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）は、米国特許出願公開第２０１７／０３６８１６９号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入されてもよい。
【0110】
具体的に、前記免疫細胞エンゲージングの二重特異的または多重特異的抗体は、直列ｓｃＦｖを含み、次の抗原および癌細胞上の表面抗原に結合してもよい。前記癌細胞上の表面抗原は、本発明による抗体が標的するＰＤ－１である：
ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲξ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６と、
ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ｅ．ｇ．、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＣＤ１６０と、
ＯＸ４０、ＣＤ４０またはＣＤ７０と、
ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＴＣＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＣＤ４７、ＳＴＩＮＧまたはＯＸ４０Ｌと、または
ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニスト。
ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲξ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６と、
ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（ｅ．ｇ．、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＣＤ１６０と、
ＯＸ４０、ＣＤ４０またはＣＤ７０と、
ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＴＣＲ（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＣＤ４７、ＳＴＩＮＧまたはＯＸ４０Ｌと、または
ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニスト。
【0111】
前記免疫細胞エンゲージングの二重特異的または多重特異的抗体は、例えば、ＶＬ（ＰＤ－１）－ＶＨ（ＰＤ－１）－ＶＨ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）、ＶＨ（ＰＤ－１）－ＶＬ（ＰＤ－１）－ＶＨ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）、ＶＨ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）－ＶＨ（ＰＤ－１）－ＶＬ（ＰＤ－１）またはＶＨ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＣＤ３またはＣＤ１６Ａ）－ＶＬ（ＰＤ－１）－ＶＨ（ＰＤ－１）の形態の構造を含んでもよい。
【0112】
前記ｓｃＦｖは、例えば、配列番号２０、２１、２３、２５、２７、２８、３０、３２、４８および５０で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域は、リンカーを介して配列番号２２、２４、２６、２９、３１、３３、４９、５１、５４および５５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域はリンカーにより連結されてもよい。
【0113】
前記リンカーはペプチドリンカーであってもよく、約１０～２５ａａの長さを有してもよい。例えば、グリシンおよび／またはセリンのような親水性アミノ酸が含まれてもよい。
【0114】
前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍはそれぞれ１乃至１０）を含んでもよいが、前記リンカーは、例えば（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍはそれぞれ１乃至１０）であってもよい。具体的に、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳを含んでもよい。
【0115】
前記免疫細胞エンゲージングの二重特異的または多重特異的抗体の例示として、ＣＤ３およびＣＤ１９に結合するブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（Ａｍｇｅｎ）；ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに結合するソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）（Ａｍｇｅｎ）；ＣＤ３およびＣＥＡに結合するＭＥＤＩ ５６５（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、Ａｍｇｅｎ）；およびＣＤ３およびＰＳＭＡに結合するＢＡＹ２０１０１１２（Ｂａｙｅｒ、Ａｍｇｅｎ）を含む。例示的なＤＡＲＴは、ＣＤ３およびＣＤ１２３に結合するＭＧＤ００６（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）；およびＣＤ３およびｇｐＡ３３に結合するＭＧＤ００７（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）を含む。例示的なＴａｎｄＡｂｓは、ＣＤ３およびＣＤ１９に結合するＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；およびＣＤ３０およびＣＤ１６Ａに結合するＡＦＭ１３（Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含んでもよい。
【0116】
抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）
本発明は、また他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）に関するものである。
本発明は、また他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）に関するものである。
【0117】
抗体－薬物接合体は、ターゲット癌細胞へ抗癌薬物を伝達する前まで抗癌薬物が抗体に安定的に結合されていなければならない。ターゲットへ伝達された薬物は、抗体から遊離されてターゲット細胞の死滅を誘導しなければならない。このためには、薬物が抗体に安定的に結合すると同時にターゲット細胞から遊離されるときは、ターゲット細胞の死滅を誘導する十分な細胞毒性を有さなければならない。
【0118】
一つの実施例において、前記抗体は、リンカーを介して薬物に結合されてもよい。前記リンカーは、抗－ＰＤ－１抗体と薬物との間を連結する部位であって、細胞内の条件で切断可能な形態、すなわち、細胞内環境で抗体から薬物が放出できるようにし、抗体の長い半減期を反映して抗体が全身循環中には安定し、リンカーと薬物の結合が抗体の安定性および薬物の動態に影響を与えてはならない。
【0119】
前記リンカーは、例えば、切断性リンカーまたは非切断性リンカーを含んでもよい。切断性リンカーの場合、ペプチドリンカーのように細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素、例えば、リソゾームまたはエンドソームプロテアーゼによって切断されてもよく、非切断性リンカーの場合、例えば、チオエーテルリンカーは、抗体が細胞内の加水分解によって非選択的に分解された後、薬物が放出されてもよい。
【0120】
一つの実施例において、前記切断性リンカーはペプチドリンカーを含んでもよい。前記ペプチドリンカーは、少なくとも２つ以上のアミノ酸の長さを有する。例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、またはＶａｌ－ＣｉｔのジペプチドまたはＰｈｅ－ＬｅｕまたはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙが含まれてもよい。リンカーの例示は、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０１０９５７号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入されてもよい。
【0121】
前記抗体－薬物接合体は、標的癌細胞の抗原にＡＤＣの抗体領域が結合してＡＤＣ－抗原複合体を形成した後、エンドソーム－リソゾームの経路で癌細胞の内部へ内包化される。この場合、細胞毒性薬物の細胞内の放出は、エンドソム／リソゾームの内部環境によって調節される。
【0122】
一つの実施例において、前記切断性リンカーはｐＨ敏感性であって、特定ｐＨ値で加水分解に敏感である可能性がある。一般的に、ｐＨ敏感性リンカーは、酸性条件で加水分解され得ることを示す。例えば、リソゾームで加水分解され得る酸性不安定リンカー、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニチックアミド（ｃｉｓ－ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、ケタルなどであってもよい。
【0123】
他の実施例において、前記リンカーは、還元条件で切断されてもよく、例えば、二硫化リンカーがこれに該当されうる。ＳＡＴＡ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）およびＳＭＰＴ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌ－ａｌｐｈａ－（２－ｐｙｒｉｄｙｌ－ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）を用いて多様な二硫化結合が形成されてもよい。このような二硫化リンカーは、細胞内のグルタチオンのチオールと二硫化交換によって分解されてもよい。
【0124】
前記薬物および／または薬物－リンカーは、抗体のリジンを通じて無作為に接合されるか、または二硫化結合鎖を還元したときに露出するシステインを通じて接合されてもよい。場合によって、遺伝工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチドまたはタンパク質に存在するシステインを通じてリンカー－薬物が結合されてもよい。前記遺伝工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチドまたはタンパク質は、例えば、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識することができるアミノ酸モチーフを含んでもよい。前記ペプチドまたはタンパク質はペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有するか、またはペプチドまたはタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にスペーサーユニットの共有結合を通じた付加を有する。
【0125】
前記ペプチドまたはタンパク質は、アミノ酸モチーフとすぐに共有結合されるかまたはスペーサーユニットと共有結合されてアミノ酸モチーフと連結されてもよい。前記アミノ酸スペーサーユニットは、１乃至２０個のアミノ酸で構成され、その中でグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）ユニットが好ましい。
【0126】
前記イソプレノイドトランスフェラーゼは、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ、ｆａｒｎｅｓｙｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）またはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ、ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であってもよく、ＦＴａｓｅおよびＧＧＴａｓｅ Ｉは先立って言及した化学式１のうちＣＡＡＸモチーフを認識することができ、ＧＧＴａｓｅ ＩＩはＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸモチーフ（ここで、Ｃはシステインであり、Ａは脂肪族アミノ酸であり、Ｘはイソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸である）を認識することができる。
【0127】
また他の実施例において、前記リンカーは、リソゾームで多数存在するか、またはいくつかの腫瘍細胞で過発現するベータ－グルクロニダーゼ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）によって認識されて加水分解されるベータ－グルクロニドリンカーを含んでもよい。ペプチドリンカーとは異なり、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が大きいことから疎水性の性質が高い薬物と結合時に、抗体－薬物複合体の溶解度を増加させ得るメリットを有する。
【0128】
これと関連して、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１８２９８４号に開示されているベータ－グルクロニドリンカー、例えば、自己－犠牲基（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）を含むベータ－グルクロニドリンカーを用いてもよく、上記文献は参照として導入される。
【0129】
場合によって、前記リンカーは、例えば、非切断性リンカーであってもよく、細胞内で抗体加水分解したステップのみを通じて薬物が放出され、例えば、アミノ酸－リンカー－薬物複合体を生産する。このような類型のリンカーは、チオエーテル基またはマレイミドカプロイル基（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）であってもよく、血液内の安定性を維持することができる。
【0130】
本発明の一実施例によると、抗体の二硫化結合鎖を還元したときに露出するシステインを通じてリンカー－薬物が無作為結合または配列ＧＧＧＧＧＧＧＣＶＩＭを有する抗体末端結合ペプチドを導入してリンカー－薬物が結合されてもよい。
【0131】
前記薬物（化学式（１）のＤを含む）は薬理学的な効果を示す製剤により抗体に結合されてもよく、具体的に、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは放射性同位元素であってもよい。前記化学療法剤は、例えば、細胞毒性製剤または免疫抑制剤であってもよい。具体的に、マイクロチューブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、またはＤＮＡインターカレータとして機能できる化学療法剤を含んでもよい。また、免疫調節化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤、駆虫剤またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【0132】
このような薬物には、例えば、マイタンシノイド、アウリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦを含む）、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロリドアセテート（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、タルアミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）およびタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素および細菌や動植物由来の毒素で構成された群より選ばれた一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0133】
場合によって、前記薬物は、リンカーおよびリンカー試薬上の親電子性基と共有結合を形成するために反応しうるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基で構成された群より選ばれた一つ以上の親核基を含んでもよい。
【0134】
本発明による具体的な実施例において、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢリンカーを介して、本発明による抗体またはその抗原結合断片を薬物、例えば、アウリスタチン（ＭＭＡＥ）と連結したＡＤＣを製作した。このようなＡＤＣは、目的とする細胞毒性を示すことを確認した。
【0135】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、他の観点において、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよび細胞内の信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、前記抗体のｓｃＦｖであることを特徴とするキメラ抗原受容体に関するものである。
本発明は、他の観点において、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよび細胞内の信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、前記抗体のｓｃＦｖであることを特徴とするキメラ抗原受容体に関するものである。
【0136】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原および該当抗原を発現する細胞に対して免疫反応を誘導できるように設計された合成コンストラクトである。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよび細胞内の信号伝達ドメインを含む。癌細胞の表面に特異的に発現される癌細胞の表面抗原を認識する受容体をコーディングする遺伝子を免疫細胞に導入して、癌細胞を死滅させてもよい。癌細胞で特異的に発現する抗原と結合する受容体を含む免疫細胞を通じて、癌細胞のみを標的して免疫反応を引き起こすことができる。前記ＣＡＲは、本発明による抗－ＰＤ－１抗体のｓｃＦｖを細胞外ドメインの抗原認識部位として含む。
【0137】
１世代ＣＡＲにおいては、癌細胞で特異的に発現する抗原認識部位を含む細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよび細胞内の信号伝達ドメインを含み、信号伝達ドメインとしてＣＤ３ζのみを利用したが、癌に対する治療効果が微々たるものであり、持続時間が短いという問題があった。このような１世代ＣＡＲは、米国登録特許第６，３１９，４９４号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
【0138】
免疫細胞に対する反応性向上のために補助刺激ドメイン（ＣＤ２８またはＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζを結合した２世代ＣＡＲが製造され、１世代ＣＡＲと比較して体内に残存するＣＡＲ含有免疫細胞の数が顕著に増加した。２世代ＣＡＲは、一つの補助刺激ドメインを利用したものであるのに対し、３世代ＣＡＲにおいては、２つ以上の補助刺激ドメインを利用した。生体内のＣＡＲを含む免疫細胞の拡張および持続性達成のために補助刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０などと結合させてもよい。２世代ＣＡＲは、米国登録特許第７，７４１，４６５号、第７，４４６，１９０号または第９，２１２，２２９号に具体的に記載されており、３世代ＣＡＲは、米国登録特許第８，８２２，６４７号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
【0139】
４世代ＣＡＲにおいては、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５のようなサイトカインを暗号化する追加遺伝子を含み、サイトカインのＣＡＲ基盤の免疫タンパク質がさらに発現できるようにし、５世代ＣＡＲは、免疫細胞強化のためにインターロイキンレセプターチェーン、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含む。４世代ＣＡＲは米国登録特許第１０，３１６，１０２号、５世代ＣＡＲは米国登録特許第１０，３３６，８１０号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
【0140】
一つの実施例において、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は抗体のｓｃＦｖである。抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖでＶＨおよびＶＬドメインはリンカーを介して連結されてもよい。配列番号２０、２１、２３、２５、２７、２８、３０、３２、４８および５０で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域は、リンカーを介して配列番号２２、２４、２６、２９、３１、３３、４９、５１、５４および５５で構成された群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と連結されてもよい。
【0141】
前記リンカーはペプチドリンカーであってもよく、約１０～２５ａａの長さを有してもよい。例えば、グリシンおよび／またはセリンのような親水性アミノ酸が含まれてもよい。
【0142】
前記リンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍはそれぞれ１乃至１０）を含んでもよいが、前記リンカーは、例えば（ＧｎＳ）ｍ（ｎ、ｍはそれぞれ１乃至１０）であってもよい。具体的に、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳを含んでもよい。
【0143】
前記トランスメンブレンドメインは、天然または合成供給源に由来されてもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合されたタンパク質またはトランスメンブレンタンパク質に由来されてもよい。前記トランスメンブレンドメインは、Ｔ－細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳのアルファ、ベータまたはゼータ鎖を含んでもよい。前記トランスメンブレンドメインを合成する場合、ロイシンとバリンのような疎水性残基を含むか、またはフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンを含むペプチドを各末端に含んでもよい。２個乃至１０個のアミノ酸の長さである短いオリゴ－またはポリペプチドリンカーがトランスメンブレンドメインとＣＡＲの細胞質信号伝達ドメインとの間に結合を形成してもよい。グリシン－セリンペプチドをリンカーとして利用されてもよい。
【0144】
前記信号伝達ドメインは、ＣＡＲが位置された免疫細胞の正常効果器の機能に対する活性化を誘導することができる。例えば、サイトカインの分泌を通じて細胞溶解活性化またはヘルパー活性化を誘導してもよい。前記信号伝達ドメインは効果器の機能信号を形質導入するのに十分な細胞内の信号伝達ドメインの切断された断片を含んでもよい。
【0145】
前記信号伝達ドメインにより抗原受容体関与後の信号伝達を開始するために協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共同－受容体の細胞質が含まれてもよい。
【0146】
ＴＣＲ単独を通じて生成された信号は、Ｔ細胞の完全な活性化のために不十分であり、共同－刺激信号が必要であるということもまた知られている。従って、Ｔ細胞の活性化にＴＣＲを通じて抗原－依存性一次活性化を開始すること、および二次または共同－刺激信号を提供するように抗原－依存性方式で作用することが関与できる。一次細胞質信号伝達配列は、刺激性方式でまたは抑制性方式でＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性方式で作用する一次細胞質信号伝達配列は、免疫受容体チロシン－基盤の活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知になっている信号伝達モチーフを含んでもよい。一次細胞質信号伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄを含んでもよい。
【0147】
場合によって、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共同刺激信号の伝達領域を含んでもよい。共同刺激信号の伝達領域は、共同刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を意味する。例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能－関連の抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれてもよい。ＣＡＲの細胞質信号伝達部分内の細胞質信号伝達配列は、２個乃至１０個のアミノ酸、例えば、グリシン－セリン含有ペプチドリンカーを介して連結されてもよい。
【0148】
本発明は、他の観点において、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された免疫細胞に関するものである。
【0149】
前記免疫細胞は、免疫を誘導して目的とする癌の治療効果を誘発することができるものであって、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞の毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、樹枝状細胞で構成された群より選ばれてもよいが、これに制限されるものではない。
【0150】
場合によって、前記抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖが細胞外ドメインの抗原結合部位として含まれたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）がさらに導入されてもよい。
【0151】
前記抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体は、例えば、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、またはＮＲＰ１をターゲットする抗体であってもよい。
【0152】
治療用組成物
本発明は、また他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む癌の治療用組成物に関するものである。
本発明は、また他の観点において、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む癌の治療用組成物に関するものである。
【0153】
本発明は、例えば、（ａ）本発明によるＰＤ－１に対する抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞の薬剤学的な有効量と、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物であってもよい。本発明はまた、本発明によるＰＤ－１に対する抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異的抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体－薬物接合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を癌患者に投与するステップを含む癌の予防または治療方法であってもよい。
【0154】
「予防」は、本発明による組成物の投与により疾病の臨床症状を抑制させるか、または進行を遅延させるすべての行為を意味し、「治療」は、疾病に対する臨床症状発展の抑制、疾病に対する臨床症状軽減または除去を意味する。
【0155】
前記癌は、例えば、ホジキンリンパ種、非－ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ種、びまん性巨大Ｂ細胞リンパ種、濾胞性リンパ種、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ種、辺縁区域Ｂ細胞リンパ種、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫、毛状細胞白血病）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄形成異常症候群、多発性骨髄腫、または急性リンパ球性白血病を含む。
【0156】
前記癌は、例えば、卵巣癌、直腸癌、胃癌、精巣癌、肛門部位癌、子宮癌、結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝癌、肺の非－小細胞癌腫、小腸癌、食道癌、黒色腫、カポシ肉腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、肌または眼内悪性黒色腫、子宮癌、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺癌、表皮状癌、子宮頸部扁平細胞癌の癌腫、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、膣癌腫、軟組織肉腫、尿道癌、外陰部癌腫、陰茎癌、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎盂癌腫、脊椎腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前記癌の転移病変、または前記癌の組み合わせを含む。
【0157】
前記癌は、例えば、膠芽腫、肺癌、膀胱癌、口腔癌、頭頸部扁平細胞癌、胆嚢癌または子宮頸部癌でありうる。特に、膠芽腫の場合、前記抗体またはその抗原結合断片が脳および脊椎とその周辺循環系との間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）によって形成された障壁である血液脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）を通過する必要がある。ＢＢＢ通過のために伝達体と連結されて用いられてもよい。ＢＢＢを介して薬物を伝達するために、例えば、ブラジキニン、またはＨＩＦＵ（Ｈｉｇｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｏｕｃｕｅｓ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）のような方法を用いてＢＢＢの浸透圧を瓦解させる方法がある。また、細胞に内在したグルコースおよびアミノ酸伝達体、インシュリンまたはトランスフェリンの受容体媒介のトランスサイトーシスのような伝達システムの使用または糖タンパク質の活性流出伝達（ｅｆｆｌｕｘ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）を遮断するものが含まれてもよい。
【0158】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。
【0159】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与してもよく、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与してもよい。
【0160】
経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、または胃での分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞へ移動可能な任意の装置によって投与されてもよい。
【0161】
本発明による組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様であり、通常の熟練された医師であれば、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１００mg／kgである。本明細書における用語「薬剤学的有効量」は、癌の予防または治療に十分な量を意味する。
【0162】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施可能な方法によって、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化することで、単位容量形態に製造するか、または多容量容器内に入れて製造されうる。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。
【0163】
併用治療
本発明は免疫細胞および抗－ＰＤ－１抗体以外の薬物を含む併用治療用組成に関するものである。
本発明は免疫細胞および抗－ＰＤ－１抗体以外の薬物を含む併用治療用組成に関するものである。
【0164】
一つの実施例において、前記抗－ＰＤ－１抗体以外の薬物は、化学療法剤または抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体を含んでもよい。
【0165】
前記薬物は、マイタンシノイド、アウリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦを含む）、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、リュープロリドアセテート（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、タルアミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ｂ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）およびタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素および細菌や動植物由来の毒素で構成された群より選ばれた一つ以上であってもよい。
【0166】
一つの実施例において、前記抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体は、例えば、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、ＮＲＰ１で構成された群より選ばれた一つ以上をターゲットする抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
【0167】
本発明は、抗体またはその抗原結合断片と、次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物に関するものである。
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖを細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
また、本発明は、前記免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体、および次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物に関するものである：
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖを細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
また、本発明は、前記免疫細胞エンゲージング（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅ）の二重特異的または多重特異的抗体、および次に構成された群より選ばれた一つ以上を含む併用治療用組成物に関するものである：
（ｉ）免疫細胞と、
（ｉｉ）抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体に対するｓｃＦｖ断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞と、および
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
【0168】
前記免疫細胞は免疫治療、例えば、免疫を誘導して目的とする癌の治療効果を誘発できるものであって、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ）、活性化細胞の毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、マクロファージ、腫瘍組織内浸透Ｔ細胞（Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、樹枝状細胞で構成された群より選ばれてもよいが、これに制限されるものではない。
【0169】
前記抗－ＰＤ－１抗体以外の抗体は、ＰＤ－１以外の標的をターゲットする抗体であって、例えば、ＦＧＦＲ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲａ、またはＮＲＰ１に結合する抗体またはその抗原結合断片であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0170】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）と免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が会う部位でＴ細胞抑制信号を遮断し、Ｔ細胞の活性化を誘導できる製剤を意味する。前記免疫チェックポイント抑制剤は、例えば、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ９６、ＣＤ２００、またはＣＤ２００Ｒをターゲットにする薬物であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0171】
前記併用投与対象の第１の成分および第２の成分のそれぞれは、同時に投与されてもよい。また、前記併用投与対象の第１の成分および第２の成分のそれぞれは、一定時間間隔を置いて別途に投与してもよい。前記併用投与対象のうちの第１の成分投与の前または後、第２の成分が別途に投与されてもよい。
【0172】
コンパニオン診断（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＣＤｘ）
コンパニオン診断は、特定の薬物治療に対する患者の反応性を予測するための分子診断技法の一種であって、薬物の適用において、適用対象患者の選別基準を提示し、これに符合する診断、予後および予測バイオマーカーの特異性および敏感性を考慮して、患者に適した薬物を処理できるようにする基準を提示することができる。
コンパニオン診断は、特定の薬物治療に対する患者の反応性を予測するための分子診断技法の一種であって、薬物の適用において、適用対象患者の選別基準を提示し、これに符合する診断、予後および予測バイオマーカーの特異性および敏感性を考慮して、患者に適した薬物を処理できるようにする基準を提示することができる。
【0173】
抗癌剤の場合、反応を示す患者にとっては高い効果を示すが、反応する患者の割合が低いため、効果を示す患者を選別し出すことが重要であり、コンパニオン診断を通じて抗癌剤に反応する患者を選別し、患者の治療効率を増大させることができる。
【0174】
前記サンプルは、患者の組織または体液から得られる生物学的な被検体を意味する。組織サンプルの供給源は、凍結されたおよび／または保存された器官、組織サンプル、生検または吸引物に由来するもののような固形組織と、血液または任意の血液構成成分（例、血清、血漿）と、骨髄または任意の骨髄構成成分と、尿、脳脊髄液、全血液、血漿および血清のような体液であってもよい。サンプルは、非－細胞分画（はい、尿、血漿、血清または他の非細胞体液）を含んでもよい。サンプルは、体液、例えば、血液（例、全血液）を含んでもよい。具体的に、前記サンプルは、患者から得られる全血液サンプル、全骨髄サンプル、全末梢血液サンプル、または全腫瘍サンプルであってもよい。前記「全」サンプルは、該当サンプルから除去されるか、または分離された成分（例、細胞）が実質的にないサンプルである。前記サンプル、例えば、血液サンプルは、用いられる前に希釈（例えば、生理的な融化性緩衝液または培地によって）されてもよい。他の具体例において、「全」サンプル、例えば、全組織サンプルまたは全腫瘍サンプルは、起源組織由来の微細環境を実質的に維持し、例えば、腫瘍または免疫微細環境の構造を実質的に維持することができる。具体的に、サンプル、例えば、腫瘍サンプルは、さらに小さな欠片に加工（例、磨砕、たたき、ブレンディング、粉砕など）されて希釈（例えば、生理的な融化性緩衝液または培地によって）されてもよい。
【0175】
前記遺伝子の発現確認は、該当遺伝子の存否と発現の程度を確認する過程であって、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われてもよく、場合によって、転写重合酵素反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、実時間逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップを用いて行われてもよい。
【0176】
重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は、プライマーを利用して遺伝子増幅反応を通じて行われてもよい。マルチプレックスＰＣＲ、実時間（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ、分別ディスプレイＰＣＲ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ＰＣＲ：ＤＤ－ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ：ＲＡＣＥ）、インバース重合酵素連鎖反応（ｉｎｖｅｒｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＩＰＣＲ）、ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）ＰＣＲおよびＴＡＩＬ－ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ）などが行われてもよい。
【0177】
遺伝子コーディングによるタンパク質の発現有無を検出することもできる。前記遺伝子から発現されたタンパク質の存否と発現の程度を確認する過程である。前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）またはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）などを利用してタンパク質の量を確認することができる。
【0178】
このための分析方法としては、ウエスタンブロット、エライザ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、流細胞分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）を利用した方法などが含まれてもよい。
【実施例】
【0179】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明しようとする。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解析されないことは、当業界における通常の知識を有した者にとって自明である。
【0180】
実施例１．候補クローンの製作および抗原結合力の分析
図１でのように、ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＰＤ－１ ＤＮＡ配列をｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒにクローニングしてＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎとして用い、組換えヒトＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質と併合してマウスをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎし、また安定的にヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞株を製作した。Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎの前と後に血液を採取してｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎの程度を確認した。２次ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎの後、血清を分離してヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞株に結合させて分析した結果、１番、２番、４番マウスの血清に抗－ＰＤ－１抗体が生成されたことが確認できた。３次タンパク質でｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後、血清を分離してヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞株に結合させて分析した結果、５匹のすべてのマウスの血清に抗－ＰＤ－１抗体が生成されたことが確認できた。以後のＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎとタンパク質ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎを各一度ずつさらに投与した後、２番と４番マウスのｓｐｌｅｅｎをＳＰ２／０ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓとｆｕｓｉｏｎしてｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｌｏｎｅｓを生成した。
図１でのように、ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＰＤ－１ ＤＮＡ配列をｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒにクローニングしてＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎとして用い、組換えヒトＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質と併合してマウスをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎし、また安定的にヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞株を製作した。Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎの前と後に血液を採取してｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎの程度を確認した。２次ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎの後、血清を分離してヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞株に結合させて分析した結果、１番、２番、４番マウスの血清に抗－ＰＤ－１抗体が生成されたことが確認できた。３次タンパク質でｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後、血清を分離してヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞株に結合させて分析した結果、５匹のすべてのマウスの血清に抗－ＰＤ－１抗体が生成されたことが確認できた。以後のＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎとタンパク質ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎを各一度ずつさらに投与した後、２番と４番マウスのｓｐｌｅｅｎをＳＰ２／０ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓとｆｕｓｉｏｎしてｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｌｏｎｅｓを生成した。
【0181】
図２でのように候補抗体は、ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培養液を用いて組換えヒトＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質に結合力を有するｃｌｏｎｅｓをＥＬＩＳＡ方法によって１次１１個のｃｌｏｎｅｓを選別した。
【0182】
図３でのように１１個のｈｙｂｒｉｄｏｍａの各ｃｌｏｎｅを１×１０６細胞を２４時間培養した後、その培養液を用いてＥＬＩＳＡを進めることで定量的に抗体の結合力を比べた。ＥＬＩＳＡは組換えヒトＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質を９６－ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅで４℃、Ｏ／Ｎ ｃｏａｔｉｎｇし、５％のｎｏｎ－ｆａｔ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋでＲＴで１ｈｒの間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。抗体は、各ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培養液を１００ｕｌから１／２ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎしてＲＴで２ｈｒ処理し、ａｎｔｉ－ｍＩｇＧ－ＨＲＰでｄｅｔｅｃｔｉｏｎした。その結果、１次選別された候補抗体のなかから２－２Ｂ３、２－３Ｃ３、２－５Ｆ１、２－７Ｃ５、２－９Ａ９、および４－８Ｄ４、４－８Ｈ１１、４－９Ｄ１２、４－９Ｆ１０の９個の２次候補抗体を選別した。
【0183】
実施例２．選別されたクローンの特性
図４でのように、ｈｙｂｒｉｄｏｍａの培養液から選別された９個の候補抗体を精製してＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（４Ｂ）、ＳＰＲ（４Ｃ）によってその特性を分析した。９個のｃｌｏｎｅｓは組換えヒトＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質との結合力において類似したｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを示し、そのうち、４－９Ｄ１２、４－９Ｆ１０ ｃｌｏｎｅｓが相対的にさらに高いｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを示した。
図４でのように、ｈｙｂｒｉｄｏｍａの培養液から選別された９個の候補抗体を精製してＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４Ａ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（４Ｂ）、ＳＰＲ（４Ｃ）によってその特性を分析した。９個のｃｌｏｎｅｓは組換えヒトＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質との結合力において類似したｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを示し、そのうち、４－９Ｄ１２、４－９Ｆ１０ ｃｌｏｎｅｓが相対的にさらに高いｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙを示した。
【0184】
図５および図６でのように、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙにおいて用いたＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓの一部を用いて精製された候補抗体の結合力をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ方法によって分析した結果、２－２Ｂ３（４９．９％）、２－７Ｃ５（５０．４％）、４－８Ｄ４（２３．５％）などと確認した。
【0185】
図６でのように、精製された候補抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能分析のために二つの遺伝的にｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓであるＰＤ－１を発現するｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓとＰＤ－Ｌ１を発現するａＡＰＣ ｃｅｌｌｓを共同培養したとき、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合は、ＴＣＲ信号を妨害することでｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ発光が抑制され、これに対し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を選別された候補抗体の効能によってｂｌｏｃｋすることになれば、ＴＣＲ信号活性化によってｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ発光が誘導される原理を試用した。選別された抗体は、５ｕｇから２－ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎし、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合に対するｂｌｏｃｋｉｎｇ効果を確認した結果、２－２Ｂ３、２－７Ｃ５、４－８Ｄ４ ｃｌｏｎｅｓで陽性対照群ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）と類似した抑制効果を示した。
【0186】
従って、以上の結果によって３つの候補抗体を選別し、選別された抗体は、ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇのために各ｈｙｂｒｉｄｏｍａからＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成した。各抗体のａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓであるＶＨとＶＬはＲＡＣＥ ＰＣＲによって増幅され、増幅されたＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔをｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒにｃｌｏｎｉｎｇした後、その配列を分析した。その結果、選別された３ ｃｌｏｎｅｓはそれぞれ異なる塩基、アミノ酸配列を有する抗体であり、この３つの抗体をヒト化した。
【0187】
実施例３．選別された個別クローンの配列の分析
選別されたクローンのＶＨとＶＬおよびＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎシーケンスの分析結果は、表１に整理した。選別されたクローンのうち２－２Ｂ３の二つのクローンを２－２Ｂ３Ｗおよび２－２Ｂ３Ｒで示した。
選別されたクローンのＶＨとＶＬおよびＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎシーケンスの分析結果は、表１に整理した。選別されたクローンのうち２－２Ｂ３の二つのクローンを２－２Ｂ３Ｗおよび２－２Ｂ３Ｒで示した。
【0188】
２－２Ｂ３Ｗの場合、配列番号２０の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＶＦＳＮＹＤ（配列番号１）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号２）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＷＶＹＤＰＬＹＡＭＤＹ（配列番号３）、ＶＬ ＣＤＲ１はＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ（配列番号５）、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＡＳ（配列番号６）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７）であり；
２－２Ｂ３Ｒの場合、配列番号２１の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＶＦＳＮＹＤ（配列番号１）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号２）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＲＶＹＤＰＬＹＡＭＤＹ（配列番号４）、ＶＬ ＣＤＲ１はＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ（配列番号５）、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＡＳ（配列番号６）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７）であり；
２－７Ｃ５の場合、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧ（配列番号８）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤＹＴ（配列番号９）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＹＹＧＮＹＧＧＹＦＤＹ（配列番号１０）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１１）、ＶＬ ＣＤＲ２はＹＡＳ（配列番号１２）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＤＹＳＳＰＰＴ（配列番号１３）であり；
４－８Ｄ４の場合、配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２６の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号１４）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号１５）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＧＶＲＹＹＦＤＹ（配列番号１６）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＬＬＤＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１７）、ＶＬ ＣＤＲ２はＷＡＳ（配列番号１８）およびＶＬ ＣＤＲ３はＫＱＳＹＮＬＩＴ（配列番号１９）である。
２－２Ｂ３Ｒの場合、配列番号２１の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＶＦＳＮＹＤ（配列番号１）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号２）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＲＶＹＤＰＬＹＡＭＤＹ（配列番号４）、ＶＬ ＣＤＲ１はＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ（配列番号５）、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＡＳ（配列番号６）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７）であり；
２－７Ｃ５の場合、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧ（配列番号８）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤＹＴ（配列番号９）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＹＹＧＮＹＧＧＹＦＤＹ（配列番号１０）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１１）、ＶＬ ＣＤＲ２はＹＡＳ（配列番号１２）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＤＹＳＳＰＰＴ（配列番号１３）であり；
４－８Ｄ４の場合、配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２６の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号１４）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号１５）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＧＶＲＹＹＦＤＹ（配列番号１６）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＬＬＤＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１７）、ＶＬ ＣＤＲ２はＷＡＳ（配列番号１８）およびＶＬ ＣＤＲ３はＫＱＳＹＮＬＩＴ（配列番号１９）である。
【0189】
【表1-1】
【表1-2】
【0190】
シグナルペプチドはイタリック体で示した。各クローンのＶＨ ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎおよびＶＬ ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎは太字で示した。
【0191】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0192】
実施例４．ヒト化抗体の製造
前記実施例１乃至３の結果から、クローン２－２Ｂ３Ｗ、２－２Ｂ３Ｒ、２－７Ｃ５および４－８Ｄ４に対するヒト化抗体である２Ｂ３Ｗ、２Ｂ３Ｒ、７Ｃ５および８Ｄ４を製作した。製作されたヒト化抗体の配列を分析した結果は、表３に示した。
前記実施例１乃至３の結果から、クローン２－２Ｂ３Ｗ、２－２Ｂ３Ｒ、２－７Ｃ５および４－８Ｄ４に対するヒト化抗体である２Ｂ３Ｗ、２Ｂ３Ｒ、７Ｃ５および８Ｄ４を製作した。製作されたヒト化抗体の配列を分析した結果は、表３に示した。
【0193】
２Ｂ３Ｗの場合、配列番号２７の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＶＦＳＮＹＤ（配列番号１）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号２）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＷＶＹＤＰＬＹＡＭＤＹ（配列番号３）、ＶＬ ＣＤＲ１はＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ（配列番号５）、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＡＳ（配列番号６）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７）であり；
２Ｂ３Ｒの場合、配列番号２８の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＶＦＳＮＹＤ（配列番号１）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号２）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＲＶＹＤＰＬＹＡＭＤＹ（配列番号４）、ＶＬ ＣＤＲ１はＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ（配列番号５）、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＡＳ（配列番号６）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７）であり；
７Ｃ５の場合、配列番号３０の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号３１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧ（配列番号８）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤＹＴ（配列番号９）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＹＹＧＮＹＧＧＹＦＤＹ（配列番号１０）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１１）、ＶＬ ＣＤＲ２はＹＡＳ（配列番号１２）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＤＹＳＳＰＰＴ（配列番号１３）であり；
８Ｄ４の場合、配列番号３２の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号３３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号１４）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号１５）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＧＶＲＹＹＦＤＹ（配列番号１６）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＬＬＤＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１７）、ＶＬ ＣＤＲ２はＷＡＳ（配列番号１８）およびＶＬ ＣＤＲ３はＫＱＳＹＮＬＩＴ（配列番号１９）である。
２Ｂ３Ｒの場合、配列番号２８の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＶＦＳＮＹＤ（配列番号１）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号２）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＲＶＹＤＰＬＹＡＭＤＹ（配列番号４）、ＶＬ ＣＤＲ１はＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ（配列番号５）、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＡＳ（配列番号６）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７）であり；
７Ｃ５の場合、配列番号３０の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号３１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧ（配列番号８）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤＹＴ（配列番号９）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＹＹＧＮＹＧＧＹＦＤＹ（配列番号１０）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１１）、ＶＬ ＣＤＲ２はＹＡＳ（配列番号１２）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＤＹＳＳＰＰＴ（配列番号１３）であり；
８Ｄ４の場合、配列番号３２の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号３３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＴＹＷ（配列番号１４）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号１５）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＧＶＲＹＹＦＤＹ（配列番号１６）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＬＬＤＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１７）、ＶＬ ＣＤＲ２はＷＡＳ（配列番号１８）およびＶＬ ＣＤＲ３はＫＱＳＹＮＬＩＴ（配列番号１９）である。
【0194】
【表3-1】
【表3-2】
【0195】
各クローンのＶＨ ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎおよびＶＬ ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎは太字で示した。各クローンのエンジニアリングされたアミノ酸残基は下線で示した。
【0196】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【0197】
実施例５．特成の分析
図７でのように、３つのヒト化抗体は、Ｅｘｐｉ２９３ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いてヒト化抗体を生産および精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（７Ａ）とＥＬＩＳＡ方法によって精製された各ヒト化抗体の定量的結合力を分析し、このうち２Ｂ３Ｒ ｃｌｏｎｅは結合力を示さなかった。ＥＬＩＳＡは図３の実施例と類似した方法により実施し、抗体は各５００ｎｇ濃度から１／２ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎして処理した。ヒト化候補抗体の純度と結合力はＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＳＰＲ（７Ｂ）によってその特性を分析し、陽性対照群としてライバル社Ｋｅｙｔｒｕｄａ抗体と比べた。また精製された各ヒト化抗体は、ヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞に結合させてｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによって分析した結果、３つのヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５および８Ｄ４で高い結合力を示すことで、以降、ｉｎ ｖｉｖｏ、抗癌効能分析のための候補抗体として選別した。
図７でのように、３つのヒト化抗体は、Ｅｘｐｉ２９３ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いてヒト化抗体を生産および精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（７Ａ）とＥＬＩＳＡ方法によって精製された各ヒト化抗体の定量的結合力を分析し、このうち２Ｂ３Ｒ ｃｌｏｎｅは結合力を示さなかった。ＥＬＩＳＡは図３の実施例と類似した方法により実施し、抗体は各５００ｎｇ濃度から１／２ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎして処理した。ヒト化候補抗体の純度と結合力はＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＳＰＲ（７Ｂ）によってその特性を分析し、陽性対照群としてライバル社Ｋｅｙｔｒｕｄａ抗体と比べた。また精製された各ヒト化抗体は、ヒトＰＤ－１を発現する２９３細胞に結合させてｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによって分析した結果、３つのヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５および８Ｄ４で高い結合力を示すことで、以降、ｉｎ ｖｉｖｏ、抗癌効能分析のための候補抗体として選別した。
【0198】
実施例６．候補抗体のＩｎ ｖｉｖｏ効能の分析
本発明者は、前記実施例５において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５および８Ｄ４候補抗体のＩｎ ｖｉｖｏ効能を分析した。
本発明者は、前記実施例５において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５および８Ｄ４候補抗体のＩｎ ｖｉｖｏ効能を分析した。
【0199】
簡略には、次のとおりである：ヒト化候補抗体のＩｎ ｖｉｖｏ効能の分析のために、ｈＰＤ－１を発現するＣ５７ＢＬ／６ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｍｉｃｅにｈＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８癌細胞株（ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）で腫瘍モデルを作り、抗癌効能および血清内肝毒性に対するマーカーを測定した。ヒト化候補抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５、８Ｄ４を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で３日置きで５回投与し、各ヒト化抗体あたり５匹をグループにした。
【0200】
その結果、図８Ａに示したように、各グループで個体別にｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅを測定したとき、ライバル社の抗体であるｋｅｙｔｒｕｄａと類似に、すべての候補抗体の投与により顕著に癌の成長が抑制された。これを各グループ別にその結果値の平均値をグラフ化した。腫瘍内ＴＩＬ（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の分析は、腫瘍がほぼ除去されて分析することができなかった。
【0201】
また、図８Ｂに示したように、実験終了と同時に各グループの動物から血液を採取して肝毒性の有無を分析し、本発明の抗体処理群で肝毒性の症状は観察することができなかった。
【0202】
前記データは、本発明のヒト化候補抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５および８Ｄ４が優れた抗癌効果を示すだけでなく、肝毒性がないことから生体に安全であることを確認することができた。
【0203】
実施例７．候補抗体のｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの評価
本発明者は、前記実施例５において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５および８Ｄ４候補抗体の抗原に対する親和度を増加させるためにｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを実施し、各候補抗体を得た。各抗体の特性をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＰＲ分析して陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａと比べた。
本発明者は、前記実施例５において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５および８Ｄ４候補抗体の抗原に対する親和度を増加させるためにｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを実施し、各候補抗体を得た。各抗体の特性をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＰＲ分析して陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａと比べた。
【0204】
その結果、図９Ａに示したように、２Ｂ３Ｗの親和度が改善された５つのクローン（ｃｌｏｎｅｓ）の抗体Ｔ１４－０１、Ｔ１４－０２、Ｔ１４－０３、Ｔ１４－０４およびＴ１４－０５を獲得し、陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と比較したとき、２Ｂ３Ｗから親和度の改善されたＴ１４－０５（５．８ｎＭ）の場合、抗原親和度がｋｅｙｔｒｕｄａより高いものと示された。
【0205】
また、図９Ｂに示したように、７Ｃ５の親和度が改善された５つのクローンの抗体Ｔ１５－０１、Ｔ１５－０２、Ｔ１５－０３、Ｔ１５－０４およびＴ１５－０５を獲得し、陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と比較したとき、７Ｃ５から親和度の改善されたＴ１５－０１（９．７ｎＭ）の場合、抗原親和度がｋｅｙｔｒｕｄａと類似した抗原結合力を有したものと示された。
【0206】
一方、図９Ｃに示したように、８Ｄ４の親和度が改善された２つのクローンの抗体Ｔ１６－０１およびＴ１－０２を獲得し、陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と比較したとき、これらの抗原親和度は改善されないものと示された。
【0207】
前記のように製造されたヒト化抗体のｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇされた抗体の配列は、前記の表３にともに示した。
【0208】
また、図９Ｄに示したように、親和度の改善された候補抗体の中で選別されたＴ１４－０５（５．８ｎＭ）とＴ１５－０１（９．７ｎＭ）抗体をライバル社の抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）と最終的に比較したＳＥＣ－ＨＰＬＣ－純度とＳＰＲ－親和度を示した。
【0209】
前記結果から抗原親和度が高いと判断されたクローン２Ｂ３Ｗ－Ｔ１４－０５（Ｔ１４－０５）および７Ｃ５－Ｔ１５－０１（Ｔ１５－０１）をさらに選別した。
【0210】
実施例８．候補抗体の目的細胞に対する結合力の評価
本発明者は、前記実施例において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５、８Ｄ４、Ｔ１４－０５およびＴ１５－０１のｈＰＤ－１－過発現細胞に対する結合力をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより分析した。
本発明者は、前記実施例において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５、８Ｄ４、Ｔ１４－０５およびＴ１５－０１のｈＰＤ－１－過発現細胞に対する結合力をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより分析した。
【0211】
その結果、図１０Ａに示したように、すべての候補抗体は細胞の表面に発現されるｈＰＤ－１に対して優れた結合力を示した。
【0212】
また、図１０Ｂに示したように、ヒト血液から分離したａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈＣＤ８ Ｔ細胞で候補抗体の結合力をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより分析したとき、各クローンごとに結合力の割合的な差を示し、Ｔ１４－０５とＴ１５－０１抗体が相対的に高い結合力を示した。
【0213】
実施例９．候補抗体のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１細胞基盤のｂｌｏｃｋａｄｅ ａｓｓａｙの評価および配列の分析
本発明者は、前記実施例において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５、８Ｄ４、Ｔ１４－０５およびＴ１５－０１が、ｈＰＤ－１を発現するｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞と、そのｒｅｃｅｐｔｏｒであるｈＰＤ－Ｌ１を発現するＡＰＣ細胞との結合を阻害できるかについて細胞水準で分析した。
本発明者は、前記実施例において選別されたヒト化抗体２Ｂ３Ｗ、７Ｃ５、８Ｄ４、Ｔ１４－０５およびＴ１５－０１が、ｈＰＤ－１を発現するｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞と、そのｒｅｃｅｐｔｏｒであるｈＰＤ－Ｌ１を発現するＡＰＣ細胞との結合を阻害できるかについて細胞水準で分析した。
【0214】
前記実験は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ｋｉｔを用い、ヒトＰＤ－１を発現してｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒを有するＪｕｒｋａｔ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓとヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１ ａＡＰＣをｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅしたとき、候補抗体の処理の際に抗体がｈＰＤ－１に結合してｈＰＤ－Ｌ１との結合をｂｌｏｃｋすると、ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌがａｃｔｉｖａｔｉｏｎされることでｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現の程度を測定できる方法を用いた。各候補抗体と親和度の改善された候補抗体を比べた。
【0215】
その結果、図１１Ａおよび１１Ｂに示したように、ＰＤ－Ｌ１に対する候補抗体のＰＤ－１のｂｌｏｃｋｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔはＴ１４－０５とＴ１５－０１抗体で陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａと類似した効能を示すことを確認した。
【0216】
これに対し、前記の結果に基づいてクローンＴ１４－０５およびＴ１５－０１を最終候補抗体として選別してシークエンシングした。前記クローンＴ１４－０５およびＴ１５－０１の配列を分析した結果は、前記表３にともに示した。
【0217】
２Ｂ３Ｗから親和度の改善されたＴ１４－０５（２Ｂ３Ｗ－Ｔ１４－０５）の場合、配列番号４８の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号４９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＶＦＳＮＹＤ（配列番号１）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号２）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＷＲＹＤＰＬＦＡＭＤＹＷ（配列番号５６）、ＶＬ ＣＤＲ１はＥＳＶＴＤＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号５７）、ＶＬ ＣＤＲ２はＡＡＳ（配列番号６）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号７）であり；
７Ｃ５から親和度の改善されたＴ１５－０１（７Ｃ５－Ｔ１５－０１）の場合、配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧ（配列番号８）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤＹＴ（配列番号９）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＹＹＧＮＹＧＧＹＦＤＹ（配列番号１０）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＶＷＤＤＬＴ（配列番号５８）、ＶＬ ＣＤＲ２はＹＡＳ（配列番号１２）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＤＹＳＳＰＰＴ（配列番号１３）である。
７Ｃ５から親和度の改善されたＴ１５－０１（７Ｃ５－Ｔ１５－０１）の場合、配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ＶＨ ＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧ（配列番号８）、ＶＨ ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤＹＴ（配列番号９）、ＶＨ ＣＤＲ３はＡＲＹＹＧＮＹＧＧＹＦＤＹ（配列番号１０）、ＶＬ ＣＤＲ１はＱＳＶＷＤＤＬＴ（配列番号５８）、ＶＬ ＣＤＲ２はＹＡＳ（配列番号１２）およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＱＤＹＳＳＰＰＴ（配列番号１３）である。
【0218】
図１２Ａに示したように、各ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎは太字で標記し、親和度の改善のためにｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇされた配列は下線で標記した。候補抗体Ｔ１４－０５は、ＶＨのＣＤＲ３で２つのアミノ酸が変わったＴ１４－０４のＶＨ配列と同一であり、ＶＬはＣＤＲ１で２つのアミノ酸が変わった。
【0219】
また、図１２Ｂに示したように、各ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎは太字で標記し、親和度の改善のためにｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇされた配列は下線で標記した。候補抗体Ｔ１５－０１は、７Ｃ５のＶＨ ｓｅｑｕｅｎｃｅは同一であり、ＶＬのＣＤＲ１で４つのアミノ酸が変わった。
【0220】
また、図１２Ｃに示したように、各ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎは太字で標記し、親和度の改善のためにｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇされた配列は下線で標記し、８Ｄ４およびそのクローンＴ１６－０１およびＴ１６－０２配列を分析した結果を示した。
【0221】
また、図１２Ｄに示したように、最終的に選別されたＴ１４－０５とＴ１５－０１のアミノ酸配列を、陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａのアミノ酸配列と比較した結果、各ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎを含めて互いに異なる配列を有する新規な抗体であることを確認した。抗体は、ヒトＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅのヒンジ部分を抗体構造の安定化を増加することができるＣＰＰＣＰアミノ酸配列を用いた。
【0222】
実施例１０．候補抗体の種間Ｃｒｏｓｓ－Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙの分析
本発明者は、前記実施例において最終的に選別されたヒト化抗体Ｔ１４－０５およびＴ１５－０１のｈｕｍａｎ、ｍｏｎｋｅｙ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｒｈｅｓｕｓ）、ｃａｎｉｎｅ、ｍｏｕｓｅでの結合力を各種のＰＤ－１抗原を利用してＥＬＩＳＡにより分析した。
本発明者は、前記実施例において最終的に選別されたヒト化抗体Ｔ１４－０５およびＴ１５－０１のｈｕｍａｎ、ｍｏｎｋｅｙ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｒｈｅｓｕｓ）、ｃａｎｉｎｅ、ｍｏｕｓｅでの結合力を各種のＰＤ－１抗原を利用してＥＬＩＳＡにより分析した。
【0223】
その結果、図１３に示したように、最終選別されたＴ１４－０５とＴ１５－０１の二つのヒト化候補抗体は、ｍｏｎｋｅｙにｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙを有し、ｃａｎｉｎｅとｍｏｕｓｅでは結合力を有さなかった。
【0224】
実施例１１．最終候補抗体のＩｎ ｖｉｖｏ効能の分析
本発明者は、前記実施例において確認されたように、親和度が改善されたヒト化候補抗体の中でも陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）より親和度が高いものと示されたＴ１４－０５（５．８ｎＭ）を代表的な抗体として利用してｉｎ ｖｉｖｏの抗癌効能を分析した。
本発明者は、前記実施例において確認されたように、親和度が改善されたヒト化候補抗体の中でも陽性対照群であるｋｅｙｔｒｕｄａ（９ｎＭ）より親和度が高いものと示されたＴ１４－０５（５．８ｎＭ）を代表的な抗体として利用してｉｎ ｖｉｖｏの抗癌効能を分析した。
【0225】
Ｉｎ ｖｉｖｏの効能分析のために、ｈＰＤ－１を発現するＣ５７ＢＬ／６ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｍｉｃｅにｈＰＤ－Ｌ１を発現するｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ＭＣ３８細胞株を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ投与して腫瘍モデルを作り、抗癌効能を分析した。Ｔ１４－０５抗体（ＥＵ１３５－Ｔ１４．０５）は１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇの３種類の濃度を３日置きに６回投与し、各抗体投与濃度あたり６匹をグループした。陽性対照群としてライバル社の抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａを５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して比較分析した。Ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅの測定は、１次投与日から一週間に２回ずつ測定した。マウスの腫瘍の大きさ１００～１５０ｍｍ３で平均サイズに基づいて各グループを分け、マウス個体別の数字しっぽ標識を作って、抗体投与による腫瘍の大きさを追跡した。
【0226】
その結果、図１４Ａに示したように、各グループで個体別にｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅを分析したとき、すべての抗体投与群で腫瘍の成長率は２次抗体投与後から遅延し始め、３次抗体投与後には、腫瘍の大きさの減少および壊死現象が始まり、顕著に癌の成長が抑制される現象を観察した。このような抗癌効能は抗体の濃度によって程度の差を示した。
【0227】
また、各グループで腫瘍の大きさの結果値の平均値をグラフ化した。その結果、図１４Ｂに示したように、対照群ＰＢＳの持続的な腫瘍の成長と比較して抗体投与群においては癌の成長の減少を示し、特に、５ｍｇ／ｋｇ濃度の投与群においては、ライバル社の抗体であるｋｅｙｔｒｕｄａよりさらによい抗癌効果を示した。また、Ｔ１４－０５投与群においては、抗体投与濃度に依存して抗癌効能を示した。
【0228】
また、３次抗体投与後、各グループのすべての個体から血液を採取してマウスＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞の分布率を調査した。１００ｕｌの眼窩採血された血液は１：１の割合で１００ｕｌのＰＢＳを添加して希釈し、これを１００ｕｌのＦｉｃｏｌｌの上に載せて遠心分離することで密度勾配によるＰＢＭＣを分離した。分離されたＰＢＭＣはマウスＣＤ４５、マウスＣＤ８、そしてマウスＣＤ４抗体を用い、その割合をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより分析した。
【0229】
その結果、図１４Ｃに示したように、ＰＢＳ投与対照群（Ｇ１）と比較したとき、抗体を投与したすべてのグループで癌細胞の死滅のためのマウスＣＤ８ Ｔ細胞の割合は増加したのに対し、マウスＣＤ４ Ｔ細胞の割合は減少した。
【0230】
前記結果により、抗体投与群で免疫殺害細胞であるＣＤ８ Ｔ細胞の増加によって抗癌効能が示されることを意味することができる。
【0231】
以上に本発明内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有した者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施様態であるだけであって、これにより本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【配列表】
【国際調査報告】