(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-20
(54)【発明の名称】炎症性貧血の治療及び予防
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20231213BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20231213BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 35/18 20150101ALI20231213BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231213BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20231213BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231213BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231213BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/165 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/415 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/54 20060101ALI20231213BHJP
C07D 231/12 20060101ALI20231213BHJP
C07D 279/16 20060101ALI20231213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231213BHJP
C07C 233/11 20060101ALI20231213BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P7/06
A61P29/00
A61K35/18
A61P31/04
A61P31/12
A61P37/02
A61P37/06
A61P13/12
A61K31/165
A61K31/415
A61K31/54
C07D231/12 CSP
C07D279/16
A61P43/00 121
C07C233/11
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535627
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-08-02
(86)【国際出願番号】 NL2021050756
(87)【国際公開番号】W WO2022124900
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】20213523.2
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】522458631
【氏名又は名称】サンキン アイピー ビー．ブイ．
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン ブリュッヘン，ロビン
(72)【発明者】
【氏名】クレイ，トーマス ロベルト レオン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA55
4C084ZA81
4C084ZB07
4C084ZB11
4C084ZB26
4C084ZB33
4C084ZB35
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC36
4C086BC89
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA55
4C086ZA81
4C086ZB07
4C086ZB11
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZB35
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB36
4C087NA14
4C087ZA55
4C087ZA81
4C087ZB07
4C087ZB11
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZB35
4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206GA09
4C206GA22
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA55
4C206ZA81
4C206ZB07
4C206ZB11
4C206ZB26
4C206ZB33
4C206ZB35
4C206ZC75
4H006AA03
4H006AB24
4H006BJ50
4H006BM30
4H006BM71
4H006BV51
(57)【要約】
本発明は、炎症性貧血の治療又は予防のための方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の、Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、１つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤及び赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
炎症性貧血の治療又は予防のための方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の、－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法。
【請求項2】
炎症性貧血の治療又は予防のための方法で使用するための、－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物。
【請求項3】
前記化合物は、前記ガルドスチャネルの阻害剤である、請求項１又は２に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項4】
前記化合物は、senicapoc、TRAM-34又はNS6180である、請求項３に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項5】
前記化合物は、１つ以上のケモカインとＤＡＲＣとの相互作用の阻害剤である、請求項１又は２に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項6】
前記ケモカインは、インターロイキン８（ＩＬ－８、ＣＸＣＬ８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項7】
前記化合物は、ＤＡＲＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分である、請求項５又は６に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項8】
前記化合物は、赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物である、請求項１又は２に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項9】
赤血球において発現される前記接着分子は、Ｌｕ／ＢＣＡＭ及び／又はＣＤ４４である、請求項８に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項10】
前記治療又は予防は、赤血球脱水、赤血球の変形性の低下及び／又はＬｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４など、赤血球において発現される１つ以上の接着分子の活性化を抑える、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項11】
前記貧血は、溶血性貧血である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項12】
前記治療は、赤血球輸血をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項13】
前記治療又は予防は、炎症性疾患、例えば細菌若しくはウイルス感染、自己免疫疾患、癌、臓器移植後の拒絶又は慢性腎疾患に罹患している対象に前記化合物を投与することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項14】
慢性炎症に罹患している対象における赤血球脱水を軽減又は予防するための方法であって、前記対象に、－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法。
【請求項15】
慢性炎症に罹患している対象における赤血球脱水を軽減又は予防するための方法で使用するための、－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物。
【請求項16】
前記慢性炎症は、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌又は慢性腎疾患である、請求項１４又は１５に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項17】
前記炎症性疾患は、細菌又はウイルス感染である、請求項１６に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項18】
前記化合物は、ガルドスチャネル阻害剤である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項19】
前記化合物は、senicapoc、TRAM-34又はNS6180である、請求項１８に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項20】
前記化合物は、赤血球において発現されるダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）へのケモカインの結合の阻害剤である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項21】
前記ケモカインは、インターロイキン８（ＩＬ－８、ＣＸＣＬ８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項22】
前記化合物は、ＤＡＲＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分である、請求項２０又は２１に記載の方法又は使用のための化合物。
【請求項23】
炎症性貧血に罹患している対象におけるＣａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）を介した赤血球からのカリウム流出を阻害するための方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の、－ 前記ガルドスチャネルの阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、特に炎症性貧血の治療法及び予防の分野に関する。
本発明は、特に炎症性貧血の治療法及び予防の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
炎症性貧血（ＡＩ）又は慢性疾患に伴う貧血は、自己免疫疾患、感染症及び癌を含む様々な疾患に罹患している多くの患者を侵す。ＡＩは、全身性炎症の結果としての悪化した赤血球（ＲＢＣ）分解及び減少した赤血球産生によって特徴付けられる。敗血症を含む細菌及びウイルス感染などの多くの炎症性疾患だけでなく、自己免疫疾患及び癌もＡＩを引き起こし得る。現在、ＡＩは、主に赤血球（ＲＢＣ）を輸血することによって治療される。輸血は、ヘモグロビン値を回復させるが、その有効性は、輸血されたものを含む全ての循環ＲＢＣの分解の増加によって損なわれ、この群の患者を血液製剤の最大の消費者の１つにしている。したがって、ＡＩに罹患している患者におけるＲＢＣの分解の増加及び赤血球産生の阻害が防止され得る場合、患者のケア及び輸血実施を大きく改善するであろう。したがって、それを考慮すると、赤血球産生の改善をもたらし、ＡＩ中のＲＢＣ分解を防止する手法を開発することが非常に重要である。
炎症性貧血（ＡＩ）又は慢性疾患に伴う貧血は、自己免疫疾患、感染症及び癌を含む様々な疾患に罹患している多くの患者を侵す。ＡＩは、全身性炎症の結果としての悪化した赤血球（ＲＢＣ）分解及び減少した赤血球産生によって特徴付けられる。敗血症を含む細菌及びウイルス感染などの多くの炎症性疾患だけでなく、自己免疫疾患及び癌もＡＩを引き起こし得る。現在、ＡＩは、主に赤血球（ＲＢＣ）を輸血することによって治療される。輸血は、ヘモグロビン値を回復させるが、その有効性は、輸血されたものを含む全ての循環ＲＢＣの分解の増加によって損なわれ、この群の患者を血液製剤の最大の消費者の１つにしている。したがって、ＡＩに罹患している患者におけるＲＢＣの分解の増加及び赤血球産生の阻害が防止され得る場合、患者のケア及び輸血実施を大きく改善するであろう。したがって、それを考慮すると、赤血球産生の改善をもたらし、ＡＩ中のＲＢＣ分解を防止する手法を開発することが非常に重要である。
【0003】
したがって、ＡＩの新規な治療法、特にＲＢＣを輸血する現在使用されている治療法に関連する欠点を伴わない治療法が当技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
発明の概要
本発明の目的は、赤血球産生の改善と、ＡＩ中のＲＢＣ分解の防止とを組み合わせた、ＡＩの治療又は予防のための方法を提供することである。
本発明の目的は、赤血球産生の改善と、ＡＩ中のＲＢＣ分解の防止とを組み合わせた、ＡＩの治療又は予防のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
したがって、本発明は、炎症性貧血の治療又は予防のための方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法を提供する。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法を提供する。
【0006】
さらなる態様では、本発明は、炎症性貧血の治療又は予防のための方法で使用するための、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を提供する。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を提供する。
【0007】
さらなる態様では、本発明は、炎症性貧血の治療又は予防のための薬剤の製造における、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物の使用を提供する。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物の使用を提供する。
【0008】
好ましい実施形態では、本発明に従って治療される対象は、鎌状赤血球病に罹患していない。さらなる好ましい実施形態では、対象は、遺伝性球状赤血球症又は遺伝性乾燥赤血球症に罹患していない。
【0009】
さらなる態様では、本発明は、慢性炎症及び／又は慢性疾患に罹患している対象における赤血球脱水を軽減又は予防するための方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法を提供する。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法を提供する。
【0010】
さらなる態様では、本発明は、慢性炎症及び／又は慢性疾患に罹患している対象における赤血球脱水を軽減又は予防するための方法で使用するための、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物を提供する。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物を提供する。
【0011】
前記対象は、さらに好ましくは、炎症性疾患、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症、敗血症、癌、自己免疫疾患（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、脈管炎、サルコイドーシス及び炎症性腸疾患など）、臓器移植後の拒絶及び慢性腎疾患からなる群から選択される疾患に罹患している。対象は、鎌状赤血球病に罹患していないことがさらに好ましい。さらなる好ましい実施形態では、対象は、鎌状赤血球病、遺伝性球状赤血球症又は遺伝性乾燥赤血球症のいずれの１つにも罹患していない。
【0012】
さらなる態様では、本発明は、炎症性貧血に罹患している対象においてガルドスチャネルを介した赤血球からのカリウム流出を阻害するための方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法を提供する。前記対象は、さらに好ましくは、炎症性疾患、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症、敗血症、癌、自己免疫疾患（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、脈管炎、サルコイドーシス及び炎症性腸疾患など）、臓器移植後の拒絶及び慢性腎疾患からなる群から選択される疾患に罹患している。対象は、鎌状赤血球病に罹患していないことがさらに好ましい。さらなる好ましい実施形態では、対象は、鎌状赤血球病、遺伝性球状赤血球症又は遺伝性乾燥赤血球症のいずれの１つにも罹患していない。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を投与することを含む方法を提供する。前記対象は、さらに好ましくは、炎症性疾患、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症、敗血症、癌、自己免疫疾患（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、脈管炎、サルコイドーシス及び炎症性腸疾患など）、臓器移植後の拒絶及び慢性腎疾患からなる群から選択される疾患に罹患している。対象は、鎌状赤血球病に罹患していないことがさらに好ましい。さらなる好ましい実施形態では、対象は、鎌状赤血球病、遺伝性球状赤血球症又は遺伝性乾燥赤血球症のいずれの１つにも罹患していない。
【0013】
詳細な説明
ＡＩにおけるＲＢＣの分解は、健康なＲＢＣの破壊をもたらす増加したマクロファージ活性化の結果であると常に見なされてきた。本発明者らは、健康なＲＢＣにおけるダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）への、ＡＩ関連の炎症性ケモカイン、例えばＩＬ－８の結合が、本質的に調節されるアポトーシス様プロセスを誘導することを見出した。最終的に、これにより、ＲＢＣがヒト脾臓の赤髄マクロファージによる食作用の標的とされる。本発明者らは、ＩＬ－８が健康な赤血球におけるＣａ２＋流入を誘導することを見出した。これは、Ｃａ２＋イオノフォアを必要とせずに、Ｋ＋流出による赤血球脱水をもたらす。上記に引用される文献と対照的に、これらの発見は、炎症性貧血に罹患している患者におけるケモカイン媒介性赤血球脱水の防止に生理科学的根拠を与える。この疾患では、それ以外には健康な赤血球は、炎症状態によって誘導される高レベルのケモカインに連続して曝される。赤血球脱水が健康な状態及び罹患状態の両方でそれらの破壊に関連するとき、ケモカインに応答して赤血球脱水を防止することは、炎症性貧血における貧血を予防するのに役立ち得る。さらに、本発明者らは、ＤＡＲＣが赤芽球で発現されることを確立しており、炎症性ケモカインがＤＡＲＣ媒介性シグナル伝達を介して赤芽球増殖及び／又は分化を阻害すると考える。したがって、ＤＡＲＣへの炎症性ケモカインの結合は、ＲＢＣ分解を誘導するだけでなく、赤血球産生に影響も与える。最後に、本発明者らは、ＤＡＲＣに結合するＩＬ－８の刺激により、健康な赤血球がラミニン－α５への増加した接着を示し、これがＲＢＣの表面におけるそのリガンドＬｕ／ＢＣＡＭの活性化に起因することを示した。以前に実証されているように（Klei et al. 2020, Blood）、ラミニン－α５とＬｕ／ＢＣＡＭとの間の相互作用は、Ｃａ２＋流入誘導性脱水後、溶血及びその後のＲＢＣの分解を誘導する。ラミニン－α５へのＲＢＣの増加した接着は、ガルドスチャネルの阻害剤（TRAM34）の添加によって抑えられた。したがって、ラミニン－α５への接着は、ガルドス効果によって媒介される溶血の直接的尺度である。重要なことに、炎症性サイトカイン及びケモカインを含有する敗血症患者の血清と共にインキュベートされたＲＢＣは、Ｌｕ／ＢＣＡＭの活性化及びラミニン－α５への接着も増加させ、これもTRAM34によって阻害され得る（図８）。
ＡＩにおけるＲＢＣの分解は、健康なＲＢＣの破壊をもたらす増加したマクロファージ活性化の結果であると常に見なされてきた。本発明者らは、健康なＲＢＣにおけるダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）への、ＡＩ関連の炎症性ケモカイン、例えばＩＬ－８の結合が、本質的に調節されるアポトーシス様プロセスを誘導することを見出した。最終的に、これにより、ＲＢＣがヒト脾臓の赤髄マクロファージによる食作用の標的とされる。本発明者らは、ＩＬ－８が健康な赤血球におけるＣａ２＋流入を誘導することを見出した。これは、Ｃａ２＋イオノフォアを必要とせずに、Ｋ＋流出による赤血球脱水をもたらす。上記に引用される文献と対照的に、これらの発見は、炎症性貧血に罹患している患者におけるケモカイン媒介性赤血球脱水の防止に生理科学的根拠を与える。この疾患では、それ以外には健康な赤血球は、炎症状態によって誘導される高レベルのケモカインに連続して曝される。赤血球脱水が健康な状態及び罹患状態の両方でそれらの破壊に関連するとき、ケモカインに応答して赤血球脱水を防止することは、炎症性貧血における貧血を予防するのに役立ち得る。さらに、本発明者らは、ＤＡＲＣが赤芽球で発現されることを確立しており、炎症性ケモカインがＤＡＲＣ媒介性シグナル伝達を介して赤芽球増殖及び／又は分化を阻害すると考える。したがって、ＤＡＲＣへの炎症性ケモカインの結合は、ＲＢＣ分解を誘導するだけでなく、赤血球産生に影響も与える。最後に、本発明者らは、ＤＡＲＣに結合するＩＬ－８の刺激により、健康な赤血球がラミニン－α５への増加した接着を示し、これがＲＢＣの表面におけるそのリガンドＬｕ／ＢＣＡＭの活性化に起因することを示した。以前に実証されているように（Klei et al. 2020, Blood）、ラミニン－α５とＬｕ／ＢＣＡＭとの間の相互作用は、Ｃａ２＋流入誘導性脱水後、溶血及びその後のＲＢＣの分解を誘導する。ラミニン－α５へのＲＢＣの増加した接着は、ガルドスチャネルの阻害剤（TRAM34）の添加によって抑えられた。したがって、ラミニン－α５への接着は、ガルドス効果によって媒介される溶血の直接的尺度である。重要なことに、炎症性サイトカイン及びケモカインを含有する敗血症患者の血清と共にインキュベートされたＲＢＣは、Ｌｕ／ＢＣＡＭの活性化及びラミニン－α５への接着も増加させ、これもTRAM34によって阻害され得る（図８）。
【0014】
現在、脾臓におけるＲＢＣ保持は、主に脱水による変形性の減少に起因することが提示されている。本発明者らは、ＲＢＣ老化中、貯蔵中及び鎌状赤血球病で発生するようなＲＢＣ脱水が接着分子の活性化をもたらし、これらが一緒に循環からのＲＢＣクリアランスをもたらすことを見出した（Klei et al. 2020, Blood）。
【0015】
炎症性貧血（ＡＩ）では、赤血球産生が減少し、ＲＢＣ破壊が悪化する。本発明者らは、健康なＲＢＣがＤＡＲＣへのＩＬ－８の結合時に破壊の標的とされ、それによりＡＩで観察されるような循環ＲＢＣの急速な減少をもたらすことを見出した。さらに、ＤＡＲＣは、様々なケモカインに同時に結合することが可能であるだけでなく、ＲＢＣの変形性及び分解に対する大きい影響と共に、ＲＢＣにおけるシグナル伝達応答にも強く影響を与えることも示された。理論によって制約されるものではないが、健康なＲＢＣで誘発されるＩＬ－８依存的シグナル伝達応答が赤芽球で同様に発生し、それにより慢性炎症がＤＡＲＣ媒介性シグナル伝達を介して赤血球産生にかなり影響し得ると考えられる。要約すると、ＤＡＲＣ媒介性シグナル伝達は、ＲＢＣの増加した分解及びＡＩにおける赤血球産生の阻害をもたらすと考えられる。
【0016】
上記を考慮して、本発明者らは、ＡＩにおけるそれ以外には健康な赤血球でのガルドス効果の阻害が魅力的な治療法を提供し、ＡＩ中に起こる複数の有害な機構を抑え、特にＲＢＣの増加した分解及び赤血球産生の阻害をもたらす接着分子の活性化を抑えることを確立した。
【0017】
したがって、本発明は、炎症性貧血の治療又は予防のための方法で使用するための、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を提供する。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤、及び
－ 赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物
からなる群から選択される化合物を提供する。
【0018】
慢性炎症及び／又は慢性疾患に罹患している対象における赤血球脱水を軽減又は予防するための方法で使用するための、
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物も提供される。
－ Ｃａ２＋活性化カリウムチャネル（ガルドスチャネル）の阻害剤、及び
－ １つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤
からなる群から選択される化合物も提供される。
【0019】
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒト及び動物、好ましくは哺乳動物を包含する。好ましくは、対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【0020】
本明細書で使用されるとき、「治療有効量」という用語は、治療される疾患又は病態の症状の１つ以上をある程度軽減するのに十分である、投与される化合物の量を指す。これは、症状の軽減若しくは緩和、疾患若しくは病態の原因の軽減若しくは緩和又は任意の他の所望の治療効果であり得る。
【0021】
本明細書で使用されるとき、「予防」という用語は、疾患の臨床症状を依然として生じていない対象における、疾患若しくは病態、例えば炎症性貧血若しくは赤血球脱水の発生及び／又は疾患若しくは病態の臨床症状の出現を防止するか又は遅らせることを指す。「治療」という用語は、疾患又は病態、例えば炎症性貧血を阻害すること、すなわちその発生又は疾患若しくは病態の少なくとも１つの臨床症状を停止若しくは軽減すること及び／又は疾患若しくは病態の症状を軽減することを指す。
【0022】
本明細書で使用されるとき、「減少された」は、示される活性（例えば、赤血球脱水）が、本発明に従って使用される化合物の投与前と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少されることを意味する。
【0023】
本明細書で使用されるとき、慢性疾患に伴う貧血（ＡＣＤ）とも呼ばれる炎症性貧血（ＡＩ）は、炎症を引き起こす疾患に罹患している対象を侵す貧血のタイプを指す。特に、ＡＩは、全身性炎症に関連する疾患に罹患している対象を侵す貧血を指す。
【0024】
本明細書で使用されるとき、「貧血」は、血液中のＲＢＣ若しくはヘモグロビンの総量の減少又は酸素を運ぶ血液の能力の低下を指す。貧血の症状は、疲労感、脱力感、息切れ、頭痛、精神錯乱及び意識消失を含む。重症貧血は、生命に関わり得る。好ましい一実施形態では、貧血は、溶血性貧血である。本明細書で使用されるとき、「溶血性貧血」という用語は、対象におけるＲＢＣの総量の減少を指す。
【0025】
炎症性貧血は、炎症性疾患、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症、敗血症、癌、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶又は慢性腎疾患及び炎症によって誘導され得る。本発明に係る自己免疫疾患の例としては、限定されないが、関節炎疾患、例えば関節リウマチ、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、ベーチェット病、シェーグレン症候群、慢性肝炎及び糸球体腎炎が挙げられる。癌の場合、ＡＩは、癌自体又は化学療法などの癌治療によって引き起こされ得る。ＡＩに関連する癌の例としては、限定されないが、癌様白血病、リンパ腫及び骨髄腫並びに消化管癌、尿路癌、男性生殖器癌、頭頸部癌及び子宮頸部癌及び膣癌が挙げられる。
【0026】
したがって、好ましい実施形態では、対象は、慢性疾患及び／又は慢性炎症に罹患している。本明細書で使用されるとき、「慢性」は、例えば、少なくとも６か月間、好ましくは少なくとも１年間にわたる持続性の又は持続的な疾患又は病状を指す。好ましい実施形態では、前記慢性炎症及び／又は慢性疾患は、炎症性疾患、例えば細菌若しくはウイルス感染、自己免疫疾患癌又は慢性腎疾患である。
【0027】
さらなる好ましい実施形態では、対象は、炎症性疾患、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症、敗血症、癌、自己免疫疾患（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、脈管炎、サルコイドーシス及び炎症性腸疾患など）、臓器移植後の拒絶及び慢性腎疾患からなる群から選択される疾患に罹患している。
【0028】
さらなる実施形態では、対象は、炎症性貧血に罹患している。
【0029】
一実施形態では、対象は、炎症性貧血に罹患しており、炎症性疾患、例えばウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症、敗血症、癌、自己免疫疾患（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、脈管炎、サルコイドーシス及び炎症性腸疾患など）、臓器移植後の拒絶及び慢性腎疾患からなる群から選択される疾患に罹患している。
【0030】
好ましい実施形態では、対象は、鎌状赤血球病に罹患していない。さらなる好ましい実施形態では、対象は、遺伝性球状赤血球症又は遺伝性乾燥赤血球症に罹患していない。
【0031】
実施例で実証され、本明細書で上述されるように、本明細書に記載される方法に関して考えられるガルドス効果の阻害は、赤血球に対していくつかの影響を与える。特に、赤血球脱水、赤血球の変形性の低下及び赤血球において発現される接着分子の活性化の１つ以上が考えられる。したがって、治療又は予防は、好ましくは、赤血球脱水、赤血球の変形性の低下及び／又はＬｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４など、赤血球において発現される１つ以上の接着分子の活性化を抑え、好ましくは赤血球脱水、赤血球の変形性の低下並びにＬｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４など、赤血球において発現される１つ以上の接着分子の活性化の全てを抑える。
【0032】
本明細書で使用されるとき、「抑える」は、示される影響が減少されること又はその進行が停止若しくは減速されることを意味する。例えば、赤血球脱水を抑えることは、脱水が減少されること又は脱水の進行が停止若しくは減速されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「減少された」は、示される活性が、本発明に従って使用される化合物の投与前と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「進行が停止される」は、関連する影響が、本発明に従って使用される化合物の投与前と比較してほぼ同じレベルに維持されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「進行が減速される」は、関連する影響が、本発明に従って使用される化合物の投与前と比較して、より低い程度であるが、依然として増加していることを意味する。
【0033】
本明細書で使用されるとき、「赤血球の変形性」は、溶血せずに形状を変化させる赤血球の能力を指す。変形性は、毛細血管及び脾洞内の通過の成功に不可欠である。「赤血球の変形性の低下」は、赤血球が変形する、すなわちその形状を変化させる能力の低下を指す。赤血球の変形性及び本発明に従って使用される化合物が変形性の低下を抑えるか又は阻害するか否かは、当技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて、例えば化合物の存在下及び非存在下において、Van Zwieten et al.（参照により本明細書に援用される）によって記載されるように、３０ダイン／ｃｍ２（３Ｐａ）のせん断応力で自動化検流器及び細胞分析装置（ＡＲＣＡ）を用いて測定され得る。
【0034】
本明細書で使用されるとき、「赤血球脱水」は、細胞内脱水、特に細胞内へのＣａ２＋の漏出並びにＫ＋及びＨ２Ｏの流出を指す。脱水は、典型的には、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）の増加及び赤血球の密度の増加をもたらす。化合物が赤血球の脱水を阻害することができるか否かは、当技術分野で公知の任意の方法によって決定され得る。例えば、赤血球からのカリウム流出は、赤血球脱水の尺度として決定され得る。例えば、細胞アッセイを用いて、検出可能な形態又は８６Ｒｂなどのカリウムの類似体が測定される。例えば、赤血球は、８６Ｒｂに曝され、化合物の存在下及び非存在下におけるその取り込みが測定され得る。代わりに、赤血球中のＫ＋含量は、イオン選択性電極を用いて決定され得る。
【0035】
赤血球（ＲＢＣ）脱水は、鎌状赤血球貧血、遺伝性乾燥赤血球症（ＨＸ）及び球状赤血球症（ＨＳ）を含むいくつかの血液疾患に特有の特徴であるが、健康なＲＢＣと以前には関連付けられていなかった。鎌状赤血球貧血は、赤血球の鎌状赤血球化、慢性溶血性貧血及び微小循環の閉塞によって特徴付けられる。鎌状赤血球病では、ヘモグロビンのβ－グロビンサブユニットにおける点突然変異は、鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）として知られているものをもたらす。低い酸素圧でＨｂＳが重合し、線維性沈殿物を形成し、これが血管閉塞性発作の発生を引き起こし得る。脱水された鎌状赤血球は、特に酸素圧も低い条件下でさらに鎌状になりやすい。Ｃａ２＋活性化Ｋ＋流出チャネル（ガルドスチャネル）の活性化は、鎌状赤血球脱水の主な原因である。したがって、ガルドスチャネルの遮断は、鎌状赤血球病における血管閉塞性発作を防止するための可能な治療手法として提示されている（例えば、Rivera et al. 2020）。しかしながら、Rivera et al.は、流出の代わりに、Ｃａイオノフォア依存性Ｋ＋流入を測定している。Ｋ＋流入は、ガルドスチャネルを介して調節されず、赤血球脱水の原因ではない。さらに、ガルドスチャネル阻害剤Senicapocによる鎌状赤血球患者の治療を示したAtaga et al.は、血管閉塞性イベントの減少をもたらさなかった。鎌状赤血球でも、ＩＬ－８及びＲＡＮＴＥＳの存在下におけるＤＡＲＣ陽性鎌状赤血球の脱酸素時の細胞内Ｋ＋の損失が記載されている（Durpes et al. 2010）。
【0036】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用される化合物は、ガルドスチャネルとも呼ばれるＣａ２＋活性化カリウムチャネルの阻害剤である。ガルドスチャネルは、ヒト赤血球からのＣａ２＋依存的Ｋ＋流出に関与し、これは、そのため、ガルドス効果としても知られている。本明細書で使用されるとき、「ガルドスチャネルの阻害剤」は、好ましくは、炎症性貧血におけるこのチャネルを介した赤血球からのカリウム流出を阻害することができる化合物を指す。本明細書で使用されるとき、「阻害する」は、好ましくは、赤血球脱水が減少されるようにカリウム流出が減少されることを意味する。好ましくは、カリウム流出は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％減少される。一実施形態では、ガルドスチャネルを介したカリウム流出は、本質的にブロックされるか又はブロックされる。
【0037】
いずれのガルドスチャネル阻害剤も本発明に係る使用のために好適である。このような阻害剤の多くは、当技術分野で現在知られており、これらは、全て本発明で使用するのに好適である。ガルドスチャネル阻害剤の非限定的な例は、カリブドトキシン、イミダゾール及びトリアゾール誘導体、例えばクロトリマゾール（ＣＬＴ）及びTRAM-34（１－［（２－クロロフェニル）ジフェニルメチル］－１Ｈ－ピラゾール）などの類似体、ミコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール及びスルコナゾール、ICA-17043（senicapoc（登録商標）としても知られている４－フルオロ－α－（４－フルオロフェニル）－α－フェニル－ベンゼンアセトアミド）、NS6180（４－［［３－（トリフルオロメチル）フェニル］メチル］－２Ｈ－１，４－ベンゾチアジン－３（４Ｈ）－オン）、１１－フェニル－ジベンザゼピン、ジフェニルインダノン、スルホンアミド、ニフェジピン、４－フェニル－４Ｈ－ピラン及びシクロヘキサジエン及び（二環式）シクロヘキサジエンラクトンである。好適なガルドスチャネル阻害剤は、米国特許第６０２８１０３号、米国特許出願公開第２００７１８５２０９号、米国特許出願公開第２００９０３６５３８号、米国特許出願公開第２０１００５６６３７号、米国特許第６２８８１２２号、米国特許第５４４１９５７号、米国特許第５２７３９９２号、米国特許第７７０９５３３号、欧州特許第０７８１１２８号、国際公開第９６／０８２４２号、国際公開第２００５／００３１４３号、国際公開第９７／３４５８９号、国際公開第００／５００２６号、国際公開第９９／２４０３４号、米国特許第７１１９１１２号、国際公開第２００４／０１６２２１号、米国特許出願公開第２００３０１３４８４２号、国際公開第９９／０２６６２８号、米国特許出願公開第２００２０１１９９５３号、米国特許出願公開第２００９００７６１５７号、米国特許出願公開第２００９１８６８１０号及びWulff and Castle (2012)にさらに記載されており、これらの文献は、参照により本明細書に援用される。ガルドスチャネル阻害剤のさらに別の例は、ガルドスチャネルを介したカリウム流出をブロックする抗体又はその抗原結合部分である。
【0038】
好ましい実施形態では、ガルドスチャネル阻害剤は、クロトリマゾール、TRAM-34、Senicapoc、NS6180からなる群、より好ましくはクロトリマゾール、TRAM-34及びSenicapocからなる群から選択され、より好ましくは、阻害剤は、TRAM-34又はSenicapocである。
【0039】
別の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される化合物は、好ましくは、赤血球における１つ以上のケモカインとダッフィー抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）との相互作用の阻害剤である。このような阻害剤は、本明細書で「ＤＡＲＣ阻害剤」とも呼ばれる。好ましくは、インターロイキン－８（ＩＬ－８、ＣＸＣＬ８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１３からなる群から選択される１つ以上のケモカインの少なくとも結合が阻害される。最も好ましくは、ＤＡＲＣとのＩＬ－８及びＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの相互作用が阻害され、最も好ましくはＩＬ－８及びＲＡＮＴＥＳの両方の相互作用が阻害される。相互作用は、好ましくは、ガルドスチャネルを介したカリウム流出をもたらす１つ以上のプロセスが阻害されるように阻害される。
【0040】
本明細書で使用されるとき、「１つ以上のケモカインとＤＡＲＣとの相互作用の阻害剤」は、好ましくは炎症性貧血において、赤血球におけるＤＡＲＣへの１つ以上のケモカインの結合を阻害することができる化合物を指す。本明細書で使用されるとき、「阻害する」は、好ましくは、赤血球脱水が減少されるように結合が減少されることを意味する。好ましくは、１つ以上のケモカインの結合、より好ましくはカリウムの流出は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％減少される。一実施形態では、ＤＡＲＣへの１つ以上のケモカインの結合は、本質的にブロックされるか又はブロックされる。さらなる好ましい実施形態では、ガルドスチャネルを介したカリウム流出は、本質的にブロックされるか又はブロックされる。
【0041】
ＤＡＲＣへの少なくとも１つのケモカインの結合を阻害するいずれの化合物も本発明の方法で有用である。結合をブロックするいずれの機構も用いられ得る。化合物は、好ましくは、ＤＡＲＣへの結合によってＤＡＲＣへのケモカインの結合をブロックする。
【0042】
好ましい実施形態では、１つ以上のケモカインとＤＡＲＣとの相互作用の阻害剤は、ＤＡＲＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分である。本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」及び「に特異的な」という用語は、抗体又はその抗原結合部分とそのエピトープとの間の相互作用を指す。これらの用語は、前記抗体又はその部分が他のアミノ酸配列若しくは抗原の部分又は他の抗原よりも前記エピトープに優先的に結合することを意味する。抗体又は部分は、他の部分、アミノ酸配列又は抗原に非特異的に結合し得るが、そのエピトープに対する前記抗体又は部分の結合親和性は、他の部分、アミノ酸配列又は抗原に対する前記抗体又は部分の非特異的な結合親和性よりかなり高い。好ましくは、抗体又はその部分は、ブロッキング抗体又はその部分である。一実施形態では、その部分の抗体は、ＤＡＲＣ Ｆｙ６エピトープに結合し、これは、ＩＬ－８などのケモカインによって結合されたエピトープである。好ましくは、抗体又はその部分は、ヒト若しくはヒト化抗体又はその部分である。当技術分野で公知のＤＡＲＣへのケモカインの結合を阻害する、ヒト又はヒト化マウス抗体を含むいずれの抗ＤＡＲＣ抗体又は抗Ｆｙ６抗体も本発明に従って使用され得る。本発明で使用するための例示的なＤＡＲＣ抗体は、抗ＤＡＲＣ抗体 Ｆｙ６、欧州特許出願公開第１８７７０３０号若しくはPatterson et al., (2002)によって記載される抗体（これらの文献は、両方とも参照により本明細書に援用される）、抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体及び／又は抗Ｆｙ３抗体である。これらの抗体は、好ましくは、ヒト又はヒト化抗体である。本発明で使用するための好適な抗ＤＡＲＣ抗体は、例えば、ドナーの血液に由来し得、好ましくはドナー血漿から単離される。したがって、好ましい実施形態では、１つ以上のケモカインとＤＡＲＣとの相互作用の阻害剤は、抗Ｆｙａ抗体又はその抗原結合部分、抗Ｆｙｂ抗体又はその抗原結合部分、抗Ｆｙ３抗体又はその抗原結合部分、抗Ｆｙ６抗体又はその抗原結合部分及びそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｆｙ３抗体、抗Ｆｙ６抗体及びそれらの組合せからなる群から選択される。このような抗体は、例えば、Sanquin（Amsterdam, the Netherlands）から市販されている。
【0043】
別の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される化合物は、赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物である。本明細書で使用されるとき、「赤血球において発現される接着分子の活性化」は、赤血球の表面における任意の接着分子の活性化の増加を指す。このような接着分子の非限定的な例は、Ｌｕ／ＢＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ１４７、ＬＷ／ＩＣＡＭ－４）である。好ましい実施形態では、赤血球において発現される少なくともＬｕ／ＢＣＡＭ及び／又はＣＤ４４の活性化が考えられる。接着分子の活性化及び化合物がこのような活性化を阻害するか否かは、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定され得る。これは、例えば、本明細書における実施例で実証されるように、Ｌｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４のそれぞれのリガンドである、ラミニン－α５及びヒアルロン酸などの基質への赤血球の接着を定量することによって行われる。したがって、好ましくは、「赤血球において発現される接着分子の活性化」は、ラミニン－α５及び／又はヒアルロン酸（ＨＡ）への赤血球の増加した接着によって決定される、Ｌｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４接着分子の増加した活性化を指す。
【0044】
本明細書で使用されるとき、「赤血球において発現される接着分子の活性化を阻害する化合物」は、炎症性貧血における赤血球の分解が減少されるように、接着分子の活性化を阻害することができる化合物を指す。したがって、本明細書で使用されるとき、「阻害する」は、好ましくは、赤血球分解が減少されるように、赤血球における接着分子の活性化が減少されることを意味する。好ましくは、赤血球における接着分子の活性化は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％減少される。一実施形態では、赤血球における少なくとも１つの接着分子の活性化は、本質的にブロックされるか又はブロックされる。
【0045】
活性化が本発明に従って阻害され得るこのような接着分子の非限定的な例は、Ｌｕ／ＢＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ１４７及びＬＷ／ＩＣＡＭ－４である。好ましい実施形態では、赤血球において発現される少なくともＬｕ／ＢＣＡＭ及び／又はＣＤ４４の活性化が阻害される。
【0046】
赤血球における接着分子の活性化を阻害するいずれの化合物も本発明の方法で有用である。好適な例としては、抗Ｌｕ／ＢＣＡＭ、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ１４７及び／又は抗ＬＷ／ＩＣＡＭ－４抗体など、接着分子に対する抗体が挙げられる。当業者は、例えば、接着分子によって特異的に認識されるリガンドへの赤血球の接着の頻度を測定することにより、化合物が赤血球における前記接着分子の活性化を阻害するかどうかを決定することが十分に可能である。このような測定のための好適な実験は、本明細書で実施例に記載されるフローアッセイであり、ここで、例えば敗血症患者のＩＬ－８又は血清に応答してラミニン－α５又はヒアルロン酸への赤血球接着が増加される。化合物が赤血球における接着分子の活性化を阻害することが可能であるか否かは、このような化合物が、敗血症患者のＩＬ－８又は血清に応答して赤血球の増加した接着を阻害することが可能であるか否かを判断することによって評価され得る。
【0047】
本発明に従って使用される化合物は、好ましくは、化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物において投与される。「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤又は賦形剤が製剤の他の成分と適合しなければならず、そのレシピエントに有害でないことを意味する。一般に、活性化合物の機能を妨げない任意の薬学的に好適な添加剤が使用され得る。本発明に従って使用される医薬組成物は、好ましくは、ヒト使用に好適である。
【0048】
好適な担体の例は、溶液、ラクトース、でんぷん、セルロース誘導体など、又はそれらの混合物を含む。好ましい実施形態では、前記好適な担体は、溶液、例えば生理食塩水である。投与単位、例えば錠剤を作製するために、充填剤、着色剤、ポリマーバインダーなどの従来の添加剤の使用が考えられる。錠剤、カプセルなどに組み込まれ得る賦形剤の例は、ゴムトラガカント、アカシア、トウモロコシでんぷん又はゼラチンなどのバインダー；微結晶性セルロースなどの賦形剤；トウモロコシでんぷん、アルファでんぷん、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；スクロース、ラクトース又はサッカリンなどの甘味料；ペパーミント、ウィンターグリーン又はチェリーの油などの香味剤である。投薬単位形態がカプセルである場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有し得る。コーティングとして又は他に投薬単位の物理的形態を改変するために、様々な他の材料が存在し得る。例えば、錠剤は、シェラック、糖又は両方で被覆され得る。シロップ又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素及びチェリー又はオレンジ香料などの香味料を含有し得る。静脈内投与用の組成物は、例えば、滅菌等張水性緩衝液中の本発明の化合物の溶液であり得る。必要に応じて、静脈内組成物は、例えば、可溶化剤、安定剤及び／又は注射部位における疼痛を軽減するための局所麻酔薬を含み得る。
【0049】
化合物の好適な投与経路は、当業者の能力の範囲内である。本発明に従って使用される化合物は、様々な経路によって対象に投与され得る。例えば、化合物は、例えば、局所（例えば、クリーム、軟膏、点眼剤）又は鼻腔内（例えば、溶液、懸濁液）を含む任意の好適な非経口又は経口経路によって投与され得る。非経口投与は、例えば、関節内、筋肉内、静脈内、脳室内、動脈内、髄腔内、皮下又は腹腔内投与を含み得る。さらに、化合物は、病院内で医療従事者から注入又は注射によって対象に投与され得る。特に、小分子は、経口又は非経口経路によって投与され得る。抗体及びその部分を含むタンパク性分子も経口又は非経口経路によって対象に投与され得るが、好ましくは注射又は注入、好ましくは静脈注射又は注入によって投与される。
【0050】
これらの化合物及びその組成物の正確な用量及びレジメンは、化合物自体の生物学的活性、対象の年齢、体重及び性別、薬剤が投与される個々の対象の要求、苦痛の程度又は医師の要求及び判断に依存するであろう。一般に、非経口投与は、吸着により依存する投与の他の方法より少ない投与量を必要とする。しかしながら、ヒト用の投与量は、好ましくは、体重１ｋｇ当たり０．００１～１０ｍｇである。一般に、腸内及び非経口投与量は、総有効成分の１日当たり０．１～１．０００ｍｇの範囲であろう。
【0051】
本明細書で上述されるように、炎症性貧血の現在の治療は、赤血球の損失を補うために、全血又はその分画を含有する赤血球のいずれかの輸血を含む。しかしながら、輸血の有効性は、内因性赤血球の分解に加えて、輸血された赤血球の増加した分解によって損なわれる。本発明者らは、炎症性貧血における赤血球脱水及び分解を抑える可能性を確認したため、両方の治療を組み合わせることにより、輸血された赤血球の脱水及び／又は分解を抑えることも可能になった。したがって、本発明の一実施形態では、本発明に係る化合物による炎症性貧血の治療又は予防は、赤血球輸血と組み合わされる。これは、患者に、全血の輸血又は赤血球を含有するか若しくは含む血液分画の輸血など、赤血球を輸血するための任意のタイプの輸血であり得る。このように、内因性赤血球及び輸血された赤血球の脱水及び分解の両方が抑えられる。このような組合せ療法は、その場合、赤血球数が、炎症性貧血に罹患している対象で典型的に既に低下しているため、炎症性貧血の治療で特に有利である。
【0052】
特徴は、明確さ及び簡潔な説明のために、本発明の同じ又は別個の態様又は実施形態の一部として本明細書に記載され得る。本発明の範囲は、同じ又は別個の実施形態の一部として本明細書に記載される特徴の全て又はいくつかの組合せを有する実施形態を含み得ることが当業者によって理解されるであろう。
【0053】
本発明は、以下の非限定的な例でより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0054】
図面の簡単な説明
【図1A】脾臓における老化ＲＢＣは、変形しにくく、活性化された接着分子を発現する。ヒト脾臓組織をコラゲナーゼ緩衝液で処理して、ＲＢＣを単離する単一細胞懸濁液を生成した。ヒト脾臓及び循環に由来するＲＢＣを溶解させ、細胞内カリウムをイオン選択性電極（脾臓ＲＢＣ ｎ＝２）によって測定した。
【図1B】脾臓における老化ＲＢＣは、変形しにくく、活性化された接着分子を発現する。自動化検流器及び細胞分析装置を用いて、循環及び脾臓に由来するＲＢＣの変形性を測定した。ＲＢＣを１０ダイン／ｃｍ２のせん断応力にかけ、その後、ＲＢＣが変形する能力（幅に対する長さの比率）を自動的に測定した。黒色の棒のある線は、５人の健康な対照の変形性を示し、灰色は、２人の脾臓試料からのＲＢＣの変形性を示す。
【図1C】脾臓における老化ＲＢＣは、変形しにくく、活性化された接着分子を発現する。循環及び脾臓に由来するＲＢＣを０．２ダイン／ｃｍ２のせん断応力下でヒアルロン酸又はラミニン－α５被覆チャンバーに流した。ＲＢＣがラミニン－α５に確実に接着するが、代わりにヒアルロン酸の上を転がるとき、これらの２つのパラメータがEVOS顕微鏡法によって定量され、接着分子活性化４、５についての読み取りである（Ｎ＝４～５、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５）。
【図2A】ＲＢＣ脱水は、接着分子活性化に関連している。ＲＢＣを密度遠心分離によって単離して、古いＲＢＣを得るか、又は鎌状赤血球患者の全血から若しくはＲＢＣ貯蔵培地生理食塩水アデニングルコースマンニトール（ＳＡＧＭ）中で４週間にわたる貯蔵後に単離し、その後、細胞内カリウムをイオン選択性電極によって測定した（ｎ＝３～８、一元配置ＡＮＯＶＡ；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図2B】ＲＢＣ脱水は、接着分子活性化に関連している。合計で１ｅ７個の対照ＲＢＣ、古いＲＢＣ、貯蔵ＲＢＣ及び鎌状ＲＢＣを０．２ダイン／ｃｍ２でラミニン－α５ IBIDIチャンバーに流し、接着頻度を顕微鏡法によって評価した（ｎ＝３～７、一元配置ＡＮＯＶＡ、±ＳＥＭ）。
【図2C】ＲＢＣ脱水は、接着分子活性化に関連している。同じフロー実験をヒアルロン酸について行った。ここで、ローリング頻度を接着頻度の代わりに定量した（ｎ＝３～７、ｔ検定、±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【図3】炎症性貧血のマウスモデル。ＡＩを誘導するために、動物に熱殺菌Ｂアボルツス（B abortus）（菌株１１１９－３）の、１マウス当たり５×１０８個の粒子を腹腔内注射した。対照マウスに生理食塩水を腹腔内注射した。
【図4A】ＲＢＣへのＩＬ－８の結合は、ＲＢＣの脱水及び接着分子活性化をもたらす。合計で１×１０６個のＲＢＣを３７Ｃで３０分間にわたって５０ｎＭのＩＬ－８と共にインキュベートした。この期間中、Ｃａ２＋流入（Fluo4）をフローサイトメトリーによって測定した（ｎ＝４、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５）。
【図4B】ＲＢＣへのＩＬ－８の結合は、ＲＢＣの脱水及び接着分子活性化をもたらす。合計で１×１０６個のＲＢＣを３７Ｃで３０分間にわたって５０ｎＭのＩＬ－８と共にインキュベートした。この期間中、Ｃａ２＋流入（Fluo4）をフローサイトメトリーによって測定した（ｎ＝４、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５）。
【図4C】ＲＢＣへのＩＬ－８の結合は、ＲＢＣの脱水及び接着分子活性化をもたらす。５０ｎＭのＩＬ－８に曝されたＲＢＣの変形性をＡＲＣＡによって評価した。
【図5A】赤血球前駆体は、ＤＡＲＣ依存的にＳＤＦ－１に結合する。合計で１×１０６個のＲＢＣを３７Ｃで３０分間にわたって５０ｎＭのＩＬ－８と共にインキュベートした。この期間中、Ｃａ２＋流入（Fluo4）をフローサイトメトリーによって測定した（ｎ＝４、ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５）。
【図5B】赤血球前駆体は、ＤＡＲＣ依存的にＳＤＦ－１に結合する。Ｆｙ６ ＤＡＲＣエピトープをモノクローナル抗体によって染色し、フローサイトメトリーによって定量した。データをＲＢＣに対して正規化した（ｎ＝６、一元配置ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図6A】ＩＬ－８は、ＲＢＣへのＳＤＦ－１結合を促進し、これがＲＢＣの脱水をもたらす。ＳＤＦ－１を５０ｎＭのＩＬ－８の非存在下又は存在下で網状赤血球又はＲＢＣに加えた。網状赤血球へのＳＤＦ－１結合をフローサイトメトリーによって定量した（Ｎ＝４、一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図6B】ＩＬ－８は、ＲＢＣへのＳＤＦ－１結合を促進し、これがＲＢＣの脱水をもたらす。ＳＤＦ－１を５０ｎＭのＩＬ－８の非存在下又は存在下で網状赤血球又はＲＢＣに加えた。網状赤血球へのＳＤＦ－１結合をフローサイトメトリーによって定量した（Ｎ＝４、一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図6C】ＩＬ－８は、ＲＢＣへのＳＤＦ－１結合を促進し、これがＲＢＣの脱水をもたらす。５０ｎＭのＩＬ－８をＳＤＦ－１の存在下又は非存在下でＲＢＣに加え、Ｃａ２＋流入をフローサイトメトリー（Fluo-4）によって定量した。
【図6D】ＩＬ－８は、ＲＢＣへのＳＤＦ－１結合を促進し、これがＲＢＣの脱水をもたらす。ＡＲＣＡによって評価したときの、対照並びに５０ｎＭのＩＬ－８及び１μＭのＳＤＦ－１で処理されたＲＢＣの変形性。
【図6E】ＩＬ－８は、ＲＢＣへのＳＤＦ－１結合を促進し、これがＲＢＣの脱水をもたらす。合計で１ｅ７個の対照、ＩＬ－８刺激及び脾臓ＲＢＣをラミニン－α５及びヒアルロン酸被覆IBIDIチャンバーに流した。接着及びローリング頻度を上述のように定量した。
【図6F】ＩＬ－８は、ＲＢＣへのＳＤＦ－１結合を促進し、これがＲＢＣの脱水をもたらす。ＳＤＦ－１を、培養された赤芽球に加えた。分化の様々な段階をＣＤ７１及びＣＤ２３５ａ発現に基づいて確認した。ＳＤＦ－１結合をフローサイトメトリーによって定量した（ｎ＝４、一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図7】炎症性貧血におけるＤＡＲＣの役割のモデル。炎症性貧血の病態生理学におけるＤＡＲＣの仮定された役割がＲＢＣ破壊のレベル及び赤血球産生の阻害の両方について示される。
【図8A】敗血症患者からのＩＬ－８及び血清に応答したラミニン－α５へのドナーＲＢＣの接着。ドナーＲＢＣを接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたってＩｌ－８と共にインキュベートした。
【図8B】敗血症患者からのＩＬ－８及び血清に応答したラミニン－α５へのドナーＲＢＣの接着。ドナーＲＢＣをまず３０分間にわたってTRAM34と共に、次に接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたってＩＬ－８と共にインキュベートした。
【図8C】敗血症患者からのＩＬ－８及び血清に応答したラミニン－α５へのドナーＲＢＣの接着。ドナーＲＢＣをまず３０分間にわたって抗ＤＡＲＣ抗体と共に、次に接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたってＩＬ－８と共にインキュベートした。
【図8D】敗血症患者からのＩＬ－８及び血清に応答したラミニン－α５へのドナーＲＢＣの接着。ドナーＲＢＣをまず３０分間にわたってTRAM34又は抗ＤＡＲＣ抗体と共に、次に接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたって敗血症患者の血清と共にインキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【0055】
実施例
実施例１
材料及び方法
血液試料並びに高密度及び低密度赤血球の単離
ヘパリン化静脈血をインフォームドコンセント後に健康なボランティアから得た。血液検査は、Medical Ethical Committee of Sanquin Researchによって承認され、the 2013 Declaration of Helsinkiに従って行われた。赤血球を１５分間にわたって２４０ｇで全血の遠心分離によって単離した。次に、血漿及び軟膜を除去し、赤血球を生理食塩水－アデニン－グルコース－マンニトール培地（ＳＡＧＭ培地、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのアデニン、５０ｍＭのグルコース、２９ｍＭのマンニトール、ｐＨ５．６；Fresenius SE）で２回洗浄した。次に、洗浄された赤血球を実験に使用するか、又は最大で４週間にわたってＳＡＧＭ中で貯蔵した。高密度及び低密度赤血球を、Percoll（GE Healthcare, Little Chalfont, UK）密度遠心分離を用いて単離した。簡潔に述べると、等張Percollを、１００ｍｌのPercoll当たり８．１ｍｌの１０×ＰＢＳを加えることによって調製した。次に、Percoll緩衝液（２６．３ｇ／ＬのＢＳＡ、１３２ｍＭのＮａＣｌ、４．６ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を用いて、等張Percollを１．０９６ｇ／ｍＬ（８０％）、１．０８７ｇ／ｍＬ（７１％）、１．０８３ｇ／ｍＬ（６７％）１．０８０ｇ／ｍＬ（６４％）及び１．０６０ｇ／ｍＬ（４０％）まで希釈した。Percoll希釈物を１５ｍＬ管中に積み重ね、２ｍＬの単離された赤血球を上部に加え、室温で１５分間にわたって２１００ｇで遠心分離した。１．０９６ｇ／ｍＬのPercollより高密度の分画から単離された赤血球を高密度の老化赤血球として定義した一方、１．０８０ｇ／ｍＬのPercollより低密度の赤血球を本明細書では低密度の若い赤血球として定義した。
実施例１
材料及び方法
血液試料並びに高密度及び低密度赤血球の単離
ヘパリン化静脈血をインフォームドコンセント後に健康なボランティアから得た。血液検査は、Medical Ethical Committee of Sanquin Researchによって承認され、the 2013 Declaration of Helsinkiに従って行われた。赤血球を１５分間にわたって２４０ｇで全血の遠心分離によって単離した。次に、血漿及び軟膜を除去し、赤血球を生理食塩水－アデニン－グルコース－マンニトール培地（ＳＡＧＭ培地、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのアデニン、５０ｍＭのグルコース、２９ｍＭのマンニトール、ｐＨ５．６；Fresenius SE）で２回洗浄した。次に、洗浄された赤血球を実験に使用するか、又は最大で４週間にわたってＳＡＧＭ中で貯蔵した。高密度及び低密度赤血球を、Percoll（GE Healthcare, Little Chalfont, UK）密度遠心分離を用いて単離した。簡潔に述べると、等張Percollを、１００ｍｌのPercoll当たり８．１ｍｌの１０×ＰＢＳを加えることによって調製した。次に、Percoll緩衝液（２６．３ｇ／ＬのＢＳＡ、１３２ｍＭのＮａＣｌ、４．６ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を用いて、等張Percollを１．０９６ｇ／ｍＬ（８０％）、１．０８７ｇ／ｍＬ（７１％）、１．０８３ｇ／ｍＬ（６７％）１．０８０ｇ／ｍＬ（６４％）及び１．０６０ｇ／ｍＬ（４０％）まで希釈した。Percoll希釈物を１５ｍＬ管中に積み重ね、２ｍＬの単離された赤血球を上部に加え、室温で１５分間にわたって２１００ｇで遠心分離した。１．０９６ｇ／ｍＬのPercollより高密度の分画から単離された赤血球を高密度の老化赤血球として定義した一方、１．０８０ｇ／ｍＬのPercollより低密度の赤血球を本明細書では低密度の若い赤血球として定義した。
【0056】
フローサイトメトリー及び染色手順
フローサイトメトリー分析をLSRII+HTS（BD Biosciences, Franklin Lakes, US）に対して行い、データをFACS Divaソフトウェア（BD Biosciences, Franklin Lakes, US）によって分析した。赤血球を、１μＭのFLUO-4（Invitrogen, Carlsbad, US）又は０．４％のpluronicを補充された０．１μＭのPBFI（Invitrogen, Carlsbad, US）のいずれかで染色し、５００ｕＭのプロプラノロール又は１０ｕＭのバリノマイシン（All Sigma-Aldrich, Spruce, US）で刺激した。ブロッキング実験を、２５μＭのBAPTA-AM、１０μＭのTRAM-34、２５μＭのカルパイン１阻害剤（Ａ６１８５）、１μｇ／ｍｌのＤＦＰ（All Sigma-Aldrich, Spruce, US）又は４０μＭのZVAD-FMK（R&D systems, Minneapolis, US）を用いて行った。α２，３－結合シアル酸を、ビオチン化イヌエンジュ（Maackia Amurensis）ＩＩ型レクチン（Vector Laboratories, Peterborough, UK）、続いてストレプトアビジンalexa fluor 488コンジュゲーション（ThermoFisher, Waltham, US）を用いたフローサイトメトリーによって定量した。赤血球におけるグリコホリン－Ａ及びグリコホリン－Ｃ発現を抗グリコホリン－Ａ－ＰＥ（M1732、Sanquin, Amsterdam, NL）及び抗ＧｐＣ（BRIC10及びBRIC4、IBRGL（Bristol）製の製品）によって定量した。本発明者らが赤血球及びその前駆体へのＳＤＦ－１結合を決定する、あらゆるフローサイトメトリー実験では、本発明者らは、補足の表１に列挙されるビオチン化ＳＤＦ－１抗体、続いてストレプトアビジン－６４７コンジュゲーションを使用した。その後、本発明者らは、核染色（hoechst）、抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１－ＦＩＴＣ）及びグリコホリン－Ａ染色（抗ＣＤ２３５ａ－ＰＥ）を伴って赤血球発生の様々な段階を区別した。ＳＤＦ相互作用及び非相互作用網状赤血球におけるＦｙエピトープ露出（例えば、Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｆｙ３又はＦｙ６）を決定する場合などでさらなる染色を行う必要があった場合、本発明者らは、順序を入れ替えて、抗原特異的染色を確実にした。簡潔に述べると、本発明者らは、まずＦｙエピトープについて、続いて二次抗ヒト－４０５（Ｆｙａ及びＦｙｂの場合）又は抗マウス－４０５（Ｆｙ３又はＦｙ６の場合）について染色し、その後、本発明者らは、ＳＤＦ、続いてストレプトアビジン－６４７コンジュゲーションについて染色し、その後、本発明者らは、抗ＣＤ７１－ＦＩＴＣ及び抗２３５ａ－ＰＥ）を伴った。抗原特異的染色をさらに確実にするために、本発明者らは、適切なＩｇＧアイソタイプコントロールを伴った。赤血球細胞へのＳＤＦ－１の外からの添加を３０分間にわたって３７℃で行った一方、染色を４℃で行った。
フローサイトメトリー分析をLSRII+HTS（BD Biosciences, Franklin Lakes, US）に対して行い、データをFACS Divaソフトウェア（BD Biosciences, Franklin Lakes, US）によって分析した。赤血球を、１μＭのFLUO-4（Invitrogen, Carlsbad, US）又は０．４％のpluronicを補充された０．１μＭのPBFI（Invitrogen, Carlsbad, US）のいずれかで染色し、５００ｕＭのプロプラノロール又は１０ｕＭのバリノマイシン（All Sigma-Aldrich, Spruce, US）で刺激した。ブロッキング実験を、２５μＭのBAPTA-AM、１０μＭのTRAM-34、２５μＭのカルパイン１阻害剤（Ａ６１８５）、１μｇ／ｍｌのＤＦＰ（All Sigma-Aldrich, Spruce, US）又は４０μＭのZVAD-FMK（R&D systems, Minneapolis, US）を用いて行った。α２，３－結合シアル酸を、ビオチン化イヌエンジュ（Maackia Amurensis）ＩＩ型レクチン（Vector Laboratories, Peterborough, UK）、続いてストレプトアビジンalexa fluor 488コンジュゲーション（ThermoFisher, Waltham, US）を用いたフローサイトメトリーによって定量した。赤血球におけるグリコホリン－Ａ及びグリコホリン－Ｃ発現を抗グリコホリン－Ａ－ＰＥ（M1732、Sanquin, Amsterdam, NL）及び抗ＧｐＣ（BRIC10及びBRIC4、IBRGL（Bristol）製の製品）によって定量した。本発明者らが赤血球及びその前駆体へのＳＤＦ－１結合を決定する、あらゆるフローサイトメトリー実験では、本発明者らは、補足の表１に列挙されるビオチン化ＳＤＦ－１抗体、続いてストレプトアビジン－６４７コンジュゲーションを使用した。その後、本発明者らは、核染色（hoechst）、抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１－ＦＩＴＣ）及びグリコホリン－Ａ染色（抗ＣＤ２３５ａ－ＰＥ）を伴って赤血球発生の様々な段階を区別した。ＳＤＦ相互作用及び非相互作用網状赤血球におけるＦｙエピトープ露出（例えば、Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｆｙ３又はＦｙ６）を決定する場合などでさらなる染色を行う必要があった場合、本発明者らは、順序を入れ替えて、抗原特異的染色を確実にした。簡潔に述べると、本発明者らは、まずＦｙエピトープについて、続いて二次抗ヒト－４０５（Ｆｙａ及びＦｙｂの場合）又は抗マウス－４０５（Ｆｙ３又はＦｙ６の場合）について染色し、その後、本発明者らは、ＳＤＦ、続いてストレプトアビジン－６４７コンジュゲーションについて染色し、その後、本発明者らは、抗ＣＤ７１－ＦＩＴＣ及び抗２３５ａ－ＰＥ）を伴った。抗原特異的染色をさらに確実にするために、本発明者らは、適切なＩｇＧアイソタイプコントロールを伴った。赤血球細胞へのＳＤＦ－１の外からの添加を３０分間にわたって３７℃で行った一方、染色を４℃で行った。
【0057】
赤血球変形性
若い及び老化赤血球の変形性を、上述されるように（van Zwieten et al.）、３０ダイン／ｃｍ２（３Ｐａ）のせん断応力で自動化検流器及び細胞分析装置（ＡＲＣＡ）を用いて測定した。
若い及び老化赤血球の変形性を、上述されるように（van Zwieten et al.）、３０ダイン／ｃｍ２（３Ｐａ）のせん断応力で自動化検流器及び細胞分析装置（ＡＲＣＡ）を用いて測定した。
【0058】
フローアッセイ
ラミニン－α５及びヒアルロン酸への赤血球接着を、非被覆IBIDI u-slideVI0.4又はibiTreatμ-slideVI0.4フローチャンバー（IBIDI）における受動吸着によって１レーン当たりＨＥＰＥＳ緩衝液（１３２ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＣａ２＋、全てSigma-Aldrich（Spruce,US）製）中で希釈された０．５μｇのラミニン－５１１（BioLamina, Sundyberg, Sweden）又は７．５ｕｇのヒアルロン酸（Sigma-Aldrich, Spruce, US）を被覆することによって評価した。特に記載されない限り、赤血球をＨＥＰＥＳ＋培地（０．５％のヒト血清アルブミン及び１ｍｇ／ｍｌのグルコースを補充された上記のＨＥＰＥＳ緩衝液）に流した。接着をEVOS顕微鏡法（ThermoFisher, Waltham, US）及び画像分析ソフトウェアVision4D（Arivis, Rostock, Germany）によって定量した。実験データを、Graphpad Prism 6ソフトウェアを用いて分析した。図の説明中に特に示されない限り、データは、平均±ＳＤとして示される。データは、正規分布を辿ると仮定された。
ラミニン－α５及びヒアルロン酸への赤血球接着を、非被覆IBIDI u-slideVI0.4又はibiTreatμ-slideVI0.4フローチャンバー（IBIDI）における受動吸着によって１レーン当たりＨＥＰＥＳ緩衝液（１３２ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＣａ２＋、全てSigma-Aldrich（Spruce,US）製）中で希釈された０．５μｇのラミニン－５１１（BioLamina, Sundyberg, Sweden）又は７．５ｕｇのヒアルロン酸（Sigma-Aldrich, Spruce, US）を被覆することによって評価した。特に記載されない限り、赤血球をＨＥＰＥＳ＋培地（０．５％のヒト血清アルブミン及び１ｍｇ／ｍｌのグルコースを補充された上記のＨＥＰＥＳ緩衝液）に流した。接着をEVOS顕微鏡法（ThermoFisher, Waltham, US）及び画像分析ソフトウェアVision4D（Arivis, Rostock, Germany）によって定量した。実験データを、Graphpad Prism 6ソフトウェアを用いて分析した。図の説明中に特に示されない限り、データは、平均±ＳＤとして示される。データは、正規分布を辿ると仮定された。
【0059】
赤芽球培養
混合段階の赤芽球及び網状赤血球を上述のように培養した（van den Akker et al.；Leberbauer et al.、Heideveld et al.）。
混合段階の赤芽球及び網状赤血球を上述のように培養した（van den Akker et al.；Leberbauer et al.、Heideveld et al.）。
【0060】
敗血症患者からのＩＬ－８及び血清に応じたラミニン－α５へのドナーＲＢＣの接着。
ラミニン－α５及びヒアルロン酸への赤血球接着を、非被覆IBIDI u-slideVI0.4又はibiTreatμ-slideVI0.4フローチャンバー（IBIDI）における受動吸着によって１レーン当たりＨＥＰＥＳ緩衝液（１３２ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＣａ２＋、全てSigma-Aldrich（Spruce, US）製）中で希釈された０．５μｇのラミニン－５１１（BioLamina, Sundyberg, Sweden）又は７．５ｕｇのヒアルロン酸（Sigma-Aldrich, Spruce, US）を被覆することによって評価した。特に記載されない限り、赤血球をＨＥＰＥＳ＋培地（０．５％のヒト血清アルブミン及び１ｍｇ／ｍｌのグルコースを補充された上記のＨＥＰＥＳ緩衝液）に流した。接着をEVOS顕微鏡法（ThermoFisher, Waltham, US）及び画像分析ソフトウェアVision4D（Arivis, Rostock, Germany）によって定量した。実験データを、Graphpad Prism 6ソフトウェアを用いて分析した。図の説明中に特に示されない限り、データは、平均±ＳＤとして示される。データは、正規分布を辿ると仮定された。
ラミニン－α５及びヒアルロン酸への赤血球接着を、非被覆IBIDI u-slideVI0.4又はibiTreatμ-slideVI0.4フローチャンバー（IBIDI）における受動吸着によって１レーン当たりＨＥＰＥＳ緩衝液（１３２ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＣａ２＋、全てSigma-Aldrich（Spruce, US）製）中で希釈された０．５μｇのラミニン－５１１（BioLamina, Sundyberg, Sweden）又は７．５ｕｇのヒアルロン酸（Sigma-Aldrich, Spruce, US）を被覆することによって評価した。特に記載されない限り、赤血球をＨＥＰＥＳ＋培地（０．５％のヒト血清アルブミン及び１ｍｇ／ｍｌのグルコースを補充された上記のＨＥＰＥＳ緩衝液）に流した。接着をEVOS顕微鏡法（ThermoFisher, Waltham, US）及び画像分析ソフトウェアVision4D（Arivis, Rostock, Germany）によって定量した。実験データを、Graphpad Prism 6ソフトウェアを用いて分析した。図の説明中に特に示されない限り、データは、平均±ＳＤとして示される。データは、正規分布を辿ると仮定された。
【0061】
ドナーＲＢＣを接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたってＩｌ－８と共にインキュベートした。TRAM34の効果を決定するために、ドナーＲＢＣをまず３０分間にわたってTRAM34（Sigma-Aldrich, Inc）と共に、次に接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたってＩＬ－８と共にインキュベートした。抗ＤＡＲＣ抗体の効果を決定するために、ドナーＲＢＣをまず３０分間にわたって抗ＤＡＲＣ抗体（ヒトドナー血漿から単離された、Sanquin（Amsterdam, the Netherlands）から市販されている）と共に、次に接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたってＩＬ－８と共にインキュベートした。敗血症患者の血清の効果を決定するために、ドナーＲＢＣをまず３０分間にわたってTRAM34又は抗ＤＡＲＣ抗体と共に、次に接着アッセイ前に３７℃で３０分間にわたって敗血症患者の血清と共にインキュベートした。
【0062】
結果
毎日、数十億もの老化ＲＢＣが定常状態ＲＢＣターンオーバー中に脾臓で分解される。脾臓の赤髄マクロファージは、老化ＲＢＣを認識し、それを除去し、ＲＢＣを分解し、赤血球産生のために鉄を再利用する機構を備えている。しかしながら、老化ＲＢＣが認識され、捕捉され、最終的に分解される正確な機構は、大部分が不明なままである。現在、脾臓におけるＲＢＣ保持は、主に脱水による変形性の低下によって引き起こされることが提示されている。脾臓内において、ＲＢＣは、再循環するために内皮細胞小孔を横断する必要がある。健康な変形性ＲＢＣは、これらの細胞小孔を通過することができるが、非変形性の老化ＲＢＣは、捕捉され、それにより赤髄マクロファージがこれらの細胞を認識し、貪食することが可能になる。脱水による変形性の低下の次に、古いＲＢＣは、それらの表面におけるＬｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４を含む接着分子を活性化し、これは、この器官におけるラミニン－α５及びヒアルロン酸に結合することによって脾臓における老化ＲＢＣの保持をもたらす。実際に、ヒト脾臓から単離されたＲＢＣを調べると、低下された変形性（図１ｂ）を示す脱水されたＲＢＣの大きい亜集団（図１ａ）があることが分かった。さらに、これらのＲＢＣは、接着分子Ｌｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４を活性化し、これにより、それらは、はるかに高い頻度でラミニン－α５及びヒアルロン酸に接着される（図１ｃ）。したがって、分解されることが運命付けられたＲＢＣは、脱水、低下した変形性及び接着分子活性化によって特徴付けられる。
毎日、数十億もの老化ＲＢＣが定常状態ＲＢＣターンオーバー中に脾臓で分解される。脾臓の赤髄マクロファージは、老化ＲＢＣを認識し、それを除去し、ＲＢＣを分解し、赤血球産生のために鉄を再利用する機構を備えている。しかしながら、老化ＲＢＣが認識され、捕捉され、最終的に分解される正確な機構は、大部分が不明なままである。現在、脾臓におけるＲＢＣ保持は、主に脱水による変形性の低下によって引き起こされることが提示されている。脾臓内において、ＲＢＣは、再循環するために内皮細胞小孔を横断する必要がある。健康な変形性ＲＢＣは、これらの細胞小孔を通過することができるが、非変形性の老化ＲＢＣは、捕捉され、それにより赤髄マクロファージがこれらの細胞を認識し、貪食することが可能になる。脱水による変形性の低下の次に、古いＲＢＣは、それらの表面におけるＬｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４を含む接着分子を活性化し、これは、この器官におけるラミニン－α５及びヒアルロン酸に結合することによって脾臓における老化ＲＢＣの保持をもたらす。実際に、ヒト脾臓から単離されたＲＢＣを調べると、低下された変形性（図１ｂ）を示す脱水されたＲＢＣの大きい亜集団（図１ａ）があることが分かった。さらに、これらのＲＢＣは、接着分子Ｌｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４を活性化し、これにより、それらは、はるかに高い頻度でラミニン－α５及びヒアルロン酸に接着される（図１ｃ）。したがって、分解されることが運命付けられたＲＢＣは、脱水、低下した変形性及び接着分子活性化によって特徴付けられる。
【0063】
脱水によるＲＢＣの変形性の低下は、ＲＢＣ老化中に起こるだけでなく、輸血のためのＲＢＣ貯蔵中及び鎌状赤血球病でも起こり（図２ａ）、これは、悪化したＲＢＣクリアランスが観察される２つの状況である。特に、これらの状況では接着分子活性化も観察され（図２ｂ～ｃ）、これは、増加したＲＢＣ分解の条件下において、ＲＢＣの同じ固有の変化が通常の生理的老化下でそれらの破壊をもたらすことを強く示唆している。
【0064】
ＲＢＣ脱水及び同時に起こる変形性の低下は、ＲＢＣが細胞内恒常性を維持することができない場合に起こる。これは、Ｈ２Ｏ流出を伴うガルドスチャネルとして知られているＣａ２＋依存的Ｋ＋流出チャネルの活性化を引き起こす、細胞内のＣａ２＋への一時的な漏出によって特徴付けられる。この現象は、ガルドス効果と呼ばれ、ＲＢＣ老化の特徴であると見なされる。本発明者らは、老化ＲＢＣにおけるガルドス効果が、貯蔵された赤血球だけでなく、老化赤血球及び鎌状赤血球でも変形性の低下並びにＲＢＣ接着分子Ｌｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４の活性化を直接引き起こすことを以前に発見した（Klei et al. 2020, Blood Advances）。これは、脾臓における赤血球の保持をもたらすことを本発明者らが発見したＲＢＣ脱水及び接着分子活性化が複雑に結び付いていることを示す。
【0065】
炎症性貧血（ＡＩ）では、赤血球産生が減少し、ＲＢＣ破壊が悪化する。これは、例えば、活発な出血を伴わずに、ヘモグロビンレベルが時間と共に急速に低下するＩＣＵの患者で示される。さらに、熱殺菌Ｂ．アボルツス（B. abortus）を用いて炎症を誘導するＡＩのマウスモデルにおいて、ＲＢＣ破壊及び赤血球産生に対する同じ影響が観察され得る（図３）。
【0066】
ＡＩにおける増加したＲＢＣ破壊は、脾臓マクロファージの炎症媒介性過剰活性化に起因するとされてきた。しかしながら、高感度のフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、本発明者らは、ＩＬ－８を伴うＲＢＣのインキュベーションがＲＢＣのサブセットにおける細胞内カルシウムレベルの一時的なＤＡＲＣ依存的上昇を誘導するのに十分であったことを見出した（図４ａ～ｂ）。ＲＢＣのサブセットのみがＩＬ－８処理に応答したが、これは、全集団の変形性に対して影響を与えることが分かった（図４ｃ）。これらの結果は、ＲＢＣの分解に寄与し得る、ＲＢＣの完全性に対するこの炎症性ケモカインの直接の影響を示す。本明細書に示されるように、ＲＢＣへのケモカイン結合の短期の影響は、ＲＢＣへの長期のケモカイン結合がＡＩの場合と同様にＲＢＣ水和状態にどのように影響を与え得るかの提示不足である可能性が大いにある（図６を参照されたい）。
【0067】
ＤＡＲＣは、循環ＲＢＣにおけるケモカインシンクとして機能するに過ぎない非シグナル伝達受容体であることが示唆されている。しかしながら、ＤＡＲＣへのケモカイン結合は、詳細に調べられておらず、ＤＡＲＣへのケモカイン結合の多くの側面は、依然として明らかになっていない。これは、ＳＤＦ－１、好中球を骨髄に制限するケモカインが赤血球前駆細胞で特異的にＤＡＲＣに結合することが分かったという、本発明者らが確認した最近の発見によって強調される（Klei et al., 2019 Sci Rep.）。本発明者らは、ＲＢＣと対照的に、赤血球前駆細胞がＤＡＲＣ依存的にＳＤＦ－１に結合することを見出した（図５ａ）。本発明者らは、ＤＡＲＣが、ＳＤＦ－１相互作用網状赤血球（図５ｂ）におけるいわゆるＦｙ６エピトープ（図６ｂ）の比較的高いアクセス性／露出によって反映されるように、異なる立体配置でＲＢＣ膜上に存在し得ることを確立した。
【0068】
ＩＬ－８がＳＤＦ－１と同様にＤＡＲＣ Ｆｙ６エピトープに結合することが記載されているため、本発明者らは、ＩＬ－８によってＤＡＲＣへのＳＤＦ－１結合をブロックすることを最初に目的とした。驚くべきことに、ＩＬ－８の存在下において、網状赤血球は、少なく結合する代わりにはるかに多くＳＤＦ－１に結合していた（図６ａ）。さらに特筆すべきは、ＩＬ－８が、ＳＤＦ－１が成熟ＲＢＣに結合することを可能にしたという発見であった（図６ｂ）。ＳＤＦ－１は、恒常性ケモカインであるため、本発明者らは、ＲＢＣにおけるＤＡＲＣへのＳＤＦ－１のＩＬ－８誘導性結合が、ＩＬ－８に関連するＲＢＣ脱水を抑え得るかどうか疑問を呈した（図５）。しかしながら、ＳＤＦ－１の存在下において、ＩＬ－８は、さらにより強力なＣａ２＋流入を誘導し（図６ｃ）、ＲＢＣ変形性の悪化した低下を引き起こした（図６ｄ）。これは、Ｌｕ／ＢＣＡＭ及びＣＤ４４接着分子の著しい活性化をもたらすことが分かった（図６ｅ）。
【0069】
最後に、それ以外には健康なＲＢＣの促進された分解の次に、ＡＩは、減少した赤血球産生によっても特徴付けられる。本発明者らは、赤芽球が赤血球と対照的にＳＤＦ－１に結合することを見出した（図６ｆ）。
【0070】
総合すると、これらのデータは、健康なＲＢＣがＤＡＲＣへのＩＬ－８の結合時に破壊の標的とされ、それによりＡＩで観察されるような循環ＲＢＣの急速な減少をもたらすことを示す。さらに、本発明者らは、ＤＡＲＣが様々なケモカインに同時に結合することが可能であることを示すだけでなく、本発明者らは、これが、ＲＢＣの変形性及び分解に対する大きい影響と共に、ＲＢＣにおけるシグナル伝達応答に強く影響を与えることも決定した。本発明者らは、ＲＢＣで誘発されるＩＬ－８依存的シグナル伝達応答が赤芽球で同様に起こり、それにより慢性炎症がＤＡＲＣ媒介性シグナル伝達を介して赤血球産生にかなり影響し得ると仮定する（図７）。要約すると、本発明者らは、ＤＡＲＣ媒介性シグナル伝達がＲＢＣの増加した分解及びＡＩにおける赤血球産生の阻害をもたらすと仮定する。
【0071】
次に、炎症性ケモカインに応答したガルドスチャネルの阻害剤の効果を評価した。本発明者らによって実証されるように（Klei et al 2020、出版が決定された）、老化赤血球及び他に循環からクリアランスされやすい赤血球は、Ｃａ２＋流入誘導性脱水（ガルドス効果）に応答して、ＲＢＣの表面におけるラミニン－α５（Ｌｕ／ＢＣＡＭのリガンド）及びヒアルロン酸（ＣＤ４４のリガンド）への増加した接着を示す。したがって、接着分子とラミニン－α５（Ｌｕ／ＢＣＡＭのリガンド）及び／又はヒアルロン酸との間のこの相互作用は、ＲＢＣ脱水の尺度として評価される。
【0072】
したがって、敗血症患者のＩＬ－８及び血清に応答したラミニン－α５及びヒアルロン酸への赤血球接着をTRAM34、ガルドスチャネルの阻害剤の非存在下及び存在下で評価した。
【0073】
図８Ａで実証されるように、ドナーＲＢＣの接着は、ＩＬ－８インキュベーションによって促進される。ＩＬ－８インキュベーションに応答したドナーＲＢＣの接着は、ガルドスチャネルの阻害剤、TRAM34（図８Ｂ）及び抗ＤＡＲＣ抗体（図８Ｃ）によって阻害される。重要なことに、敗血症患者の血清に応答したドナーＲＢＣの接着もガルドスチャネルの阻害剤、TRAM34及び抗ＤＡＲＣ抗体によって阻害される（図８Ｄ）。
【0074】
実施例２
この実施例では、炎症性貧血（ＡＩ）におけるＲＢＣガルドスチャネルの阻害剤であるSenicapocの有効性を試験するときのマウスモデルの使用が記載される。マウスモデルにおいて、ＡＩは、熱殺菌Ｂ．アボルツス（B. abortus）（ＢＡ）の注射によって誘導され得る。このモデルは、ヒトにおけるＡＩに酷似しており、ＲＢＣ分解は、実際に、循環におけるＲＢＣの増加したアポトーシスの結果として起こることが分かった。このプロトコルにおいて、インビボでＡＩを制限するSenicapocの有効性、ＲＢＣガルドスチャネルの阻害剤であるSenicapocを調べた。Senicapocは、全身性炎症中の貧血の発生を制限することが予想される。インビトロで、本発明者らは、SenicapocがＲＢＣのＡＩ媒介性分解を抑えるという強力な証拠を得た（実施例１を参照されたい）。Senicapocは、忍容性良好であることが示されている。要約すると、この実施例からの結果は、全身性炎症中の貧血の可能な治療としてのSenicapocの使用を示すであろう。
この実施例では、炎症性貧血（ＡＩ）におけるＲＢＣガルドスチャネルの阻害剤であるSenicapocの有効性を試験するときのマウスモデルの使用が記載される。マウスモデルにおいて、ＡＩは、熱殺菌Ｂ．アボルツス（B. abortus）（ＢＡ）の注射によって誘導され得る。このモデルは、ヒトにおけるＡＩに酷似しており、ＲＢＣ分解は、実際に、循環におけるＲＢＣの増加したアポトーシスの結果として起こることが分かった。このプロトコルにおいて、インビボでＡＩを制限するSenicapocの有効性、ＲＢＣガルドスチャネルの阻害剤であるSenicapocを調べた。Senicapocは、全身性炎症中の貧血の発生を制限することが予想される。インビトロで、本発明者らは、SenicapocがＲＢＣのＡＩ媒介性分解を抑えるという強力な証拠を得た（実施例１を参照されたい）。Senicapocは、忍容性良好であることが示されている。要約すると、この実施例からの結果は、全身性炎症中の貧血の可能な治療としてのSenicapocの使用を示すであろう。
【0075】
簡潔に述べると、マウスに、熱殺菌ＢＡを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、その後、対照マウスは、１４日の期間にわたって貧血を発生した。実験群にも熱殺菌ＢＡを注射したが、それらは、実験中にSenicapocで処置されていた。６匹の動物が各条件について使用されていた。担体のみを投与された非感染動物について、これらのマウスが群内で大きいばらつきを示さないという仮定に基づき、１実験当たり３匹のマウスを使用した。
【0076】
本発明者らは、検出力分析を基準にするために、ＢＡが全身性炎症を誘導した後に対照及びSenicapoc処置マウスを比較することを目的とするこの実験設備を使用した。本発明者らは、ＢＡ注射後の群のヘマトクリット値が主要な読み取りであることを確認した。ヘマトクリット値を読み取りとして用いて、検出力分析は、ヘマトクリット値の差がSenicapoc処置動物で少なくとも１０％であることを本発明者らが予測する手段によるものである。本発明者らは、αを０．０５に、及び９０％の検出力を設定した。ヘマトクリット値の減少は、ＢＡ注射後のＷＴマウスにおけるＨｔの４５％の減少と共にKautz et al. (2014)から推定される。この検出力分析は、１群当たり６匹のマウスの推定をもたらした。
【0077】
参照文献
・van den Akker, E., et al. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica 95, 1594-1598, doi:10.3324/haematol.2009.019828 (2010).
・Ataga KI, et al. Efficacy and safety of the Gardos channel blocker, senicapoc (ICA-17043), in patients with sickle cell anemia. Blood 2008;111:3991-7.
・Durpes MC, et al. Effect of interleukin-8 and RANTES on the Gardos channel activity in sickle human red blood cells: role of the Duffy antigen receptor for chemokines. Blood Cells Mol Dis. 2010;44:219-23.
・Heideveld, E. et al. CD14+ cells from peripheral blood positively regulate hematopoietic stem and progenitor cell survival resulting in increased erythroid yield. Haematologica 100, 1396-1406, doi:10.3324/haematol.2015.125492 (2015).
・Klei TRL et al. Differential interaction between DARC and SDF-1 on erythrocytes and their precursors. Sci Rep. 2019 Nov 7;9(1):16245. doi: 10.1038/s41598-019-52186-6.Klei TRL. et al. Hemolysis in the spleen drives erythrocyte turnover. Blood. 2020 Oct 1;136(14):1579-1589. doi: 10.1182/blood.2020005351.
・Klei TRL. et al. The Gardos effect drives erythrocyte senescence and leads to Lu/BCAM and CD44 adhesion molecule activation; 2020 accepted for publication in Blood Advances.
・Leberbauer, C. et al. Different steroids co-regulate long-term expansion versus terminal differentiation in primary human erythroid progenitors. Blood 105, 85-94, doi:10.1182/blood-2004-03-1002 (2005).
・Patterson et al.,“Expression of the Duffy Antigen/Receptor for Chemokines (DARC) by the Inflamed Synovial Endothelium,”J. Pathol. 197(1): 108-116 (2002)
・Rivera A, et al. Modulation of Gardos channel activity by cytokines in sickle erythrocytes. Blood. 2002;99(1):357-603.
・Wulff and Castle. Therapeutic potential of KCa3.1 blockers: an overview of recent advances, and promising trends. Expert Rev Clin Pharmacol. 2010 May; 3(3): 385-396.
・van Zwieten, R. et al. Partial pyruvate kinase deficiency aggravates the phenotypic expression of band 3 deficiency in a family with hereditary spherocytosis. Am J Hematol 90, E35-39, doi:10.1002/ajh.23899 (2015).
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【国際調査報告】