ホーム > 特許ランキング > アーミューン リミテッド
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-20
(54)【発明の名称】Ｔリンパ球結合アプタマー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20231213BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231213BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231213BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61P35/00
A61P35/02
A61K31/7088
A61K47/68
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K39/395 N
A61K39/395 T
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557840
(86)(22)【出願日】2021-12-03
(85)【翻訳文提出日】2023-08-01
(86)【国際出願番号】 IB2021000849
(87)【国際公開番号】W WO2022118077
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】63/121,080
(32)【優先日】2020-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/257,402
(32)【優先日】2021-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523209542
【氏名又は名称】アーミューン リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ニーヴ， ガイ
(72)【発明者】
【氏名】カルミ－レヴィ， イリット
(72)【発明者】
【氏名】ラヴィ， エレズ
(72)【発明者】
【氏名】ジロニー－ハニン， ネタ
(72)【発明者】
【氏名】ポード， ゾハール
(72)【発明者】
【氏名】レイス， ネリア
(72)【発明者】
【氏名】グレイチ， オハッド
(72)【発明者】
【氏名】ファーリ， ロニット
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076CC27
4C076EE59
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA16
4C084MA17
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE03
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA16
4C086MA17
4C086MA55
4C086MA56
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC75
(57)【要約】
本明細書では、Ｔリンパ球を標的とするアプタマーおよびその使用方法が提供される。ある特定の態様では、アプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一）の配列を含む核酸を合成すること（例えば、化学的に合成すること）を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも８０％同一の核酸配列を含むアプタマー。
【請求項2】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項3】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項4】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも９８％同一の核酸配列を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項5】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１の核酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項6】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１の核酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項7】
配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むアプタマー。
【請求項8】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項9】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも４０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７または８に記載のアプタマー。
【請求項10】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７から９のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項11】
前記アプタマーが、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含むか、または、配列番号１～２１の少なくとも６４個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７から１０のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項12】
前記アプタマーが、１００ヌクレオチド長以下である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項13】
前記アプタマーが、９０ヌクレオチド長以下である、請求項１から１２のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項14】
前記アプタマーが、８０ヌクレオチド長以下である、請求項１から１３のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項15】
前記アプタマーが、７３ヌクレオチド長以下である、請求項１から１４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項16】
前記アプタマーがＴ細胞に結合する、請求項１から１５のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項17】
前記アプタマーがＴ細胞に結合する、請求項１から１６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項18】
前記アプタマーがＴ細胞抗原ＣＤ３に結合する、請求項１から１７のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項19】
前記アプタマーが、（ａ）Ｔ細胞媒介性細胞傷害；および／または
（ｂ）Ｔ細胞媒介性細胞傷害による癌細胞の細胞死
を誘導する、請求項１から１８のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項20】
前記アプタマーが、（ａ）サイトカイン分泌；および／または
（ｂ）Ｔ細胞活性化
を誘導する、請求項１から１９のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項21】
前記アプタマーがインビトロで癌細胞の細胞死を誘導する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記アプタマーがインビボで癌細胞の細胞死を誘導する、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞死がアポトーシスである、請求項２０から２２のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項24】
前記癌細胞が患者由来の癌細胞である、請求項２０から２３のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項25】
前記癌細胞が固形腫瘍細胞である、請求項２０から２４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項26】
前記癌細胞が乳癌細胞または結腸直腸癌細胞である、請求項２５に記載のアプタマー。
【請求項27】
前記アプタマーが化学修飾を含む、請求項１から２６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項28】
前記アプタマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学修飾されている、請求項２７に記載のアプタマー。
【請求項29】
前記ＰＥＧが前記アプタマーの前記５’末端に結合している、請求項２８に記載のアプタマー。
【請求項30】
前記アプタマーが５’末端キャップを含む、請求項２７から２９のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項31】
前記アプタマーが３’末端キャップを含む、請求項２７から３０のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項32】
前記３’末端キャップが反転チミジンである、請求項３１に記載のアプタマー。
【請求項33】
前記３’末端キャップがビオチンを含む、請求項３１に記載のアプタマー。
【請求項34】
前記アプタマーが２’糖置換を含む、請求項２７から３３のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項35】
前記２’糖置換が２’－フルオロ、２’－アミノ、または２’－Ｏ－メチル置換である、請求項３４に記載のアプタマー。
【請求項36】
前記アプタマーが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）および／または２’デオキシ（ｄｅｏｚｙ）－２’フルオロ－Ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）糖をその骨格に含む、請求項２７から３５のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項37】
メチルホスホネートヌクレオチド間結合および／またはホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む、請求項２７から３６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項38】
前記アプタマーが、トリアゾールヌクレオチド間結合を含む、請求項２７から３７のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項39】
コレステロールまたはジアルキル脂質で修飾されている、請求項２７から３８のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項40】
前記コレステロールまたはジアルキル脂質が、前記アプタマーの５’末端に連結されている、請求項３９に記載のアプタマー。
【請求項41】
前記アプタマーが、５’ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合および３’末端キャップ反転チミジンを含む、請求項２７に記載のアプタマー。
【請求項42】
前記アプタマーが修飾された塩基を含む、請求項２７から４１のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項43】
前記アプタマーがＤＮＡアプタマーである、請求項１から４２のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項44】
前記アプタマーがＤ－ＤＮＡアプタマーである、請求項４３に記載のアプタマー。
【請求項45】
前記アプタマーがエナンチオマーＬ－ＤＮＡアプタマーである、請求項４３に記載のアプタマー。
【請求項46】
前記アプタマーがＲＮＡアプタマーである、請求項１から４２のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項47】
前記アプタマーがＤ－ＲＮＡアプタマーである、請求項４６に記載のアプタマー。
【請求項48】
前記アプタマーがエナンチオマーＬ－ＲＮＡアプタマーである、請求項４６に記載のアプタマー。
【請求項49】
癌細胞結合部分に連結されている、請求項１から４８のいずれか１項に記載のアプタマーを含むアプタマーコンジュゲート。
【請求項50】
前記アプタマーが前記癌細胞結合部分に共有結合している、請求項４８に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項51】
前記アプタマーが前記癌細胞結合部分に非共有結合している、請求項４９に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項52】
前記アプタマーが前記癌細胞結合部分に直接連結されている、請求項４９から５１のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項53】
前記アプタマーがリンカーを介して前記癌細胞結合部分に連結されている、請求項４９から５１のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項54】
前記癌細胞結合部分が、癌細胞に発現した抗原に結合する、請求項４９から５３のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項55】
前記癌細胞結合部分が、癌細胞と接触すると細胞死を誘導する、請求項４９から５４のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項56】
前記細胞死がアポトーシスである、請求項４９から５５のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項57】
前記癌細胞が固形腫瘍細胞である、請求項４９から５６のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項58】
前記癌細胞が乳癌細胞または結腸直腸癌細胞である、請求項５７に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項59】
前記癌細胞結合部分が、インビトロで前記癌細胞と接触すると細胞死を誘導する、請求項４９から５８のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項60】
前記癌細胞結合部分が、インビボで前記癌細胞と接触すると細胞死を誘導する、請求項４９から５９のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項61】
前記癌細胞結合部分が、アプタマー、小分子、ポリペプチド、核酸、タンパク質、または抗体である、請求項４９から６０のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
【請求項62】
請求項１から４８のいずれか１項に記載のアプタマーを含む医薬組成物。
【請求項63】
請求項４９から６２のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項64】
薬学的に許容され得る担体をさらに含む、請求項６２または６３に記載の医薬組成物。
【請求項65】
前記医薬組成物が非経口投与用に製剤化されている、請求項６２から６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項66】
癌の処置に使用するための、請求項６２から６５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項67】
前記癌が固形腫瘍である、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項68】
前記癌が、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、腺様嚢胞癌、膀胱癌、膵臓癌、肝細胞癌、黒色腫、メルケル細胞癌、または結腸直腸癌である、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項69】
癌を処置する方法であって、前記方法が、請求項１から４８のいずれか１項に記載のアプタマーを対象に投与することを含む方法。
【請求項70】
癌を処置する方法であって、前記方法が、請求項４９から６２のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲートを対象に投与することを含む方法。
【請求項71】
癌を処置する方法であって、前記方法が、６２から６８のいずれか１項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項72】
前記投与が非経口投与である、請求項６９から７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
前記投与が腫瘍内注射である、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記癌が固形腫瘍である、請求項６９から７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項75】
前記癌が、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、腺様嚢胞癌、膀胱癌、膵臓癌、肝細胞癌、黒色腫、メルケル細胞癌、または結腸直腸癌である、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記対象が化学療法を受けたことがある対象である、請求項６９から７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
前記対象が腫瘍を外科的に除去したことがある、請求項６９から７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項78】
前記対象に追加の癌治療を投与することをさらに含む、請求項６９から７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項79】
前記追加の癌治療が化学療法を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記追加の癌治療が放射線治療を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項81】
前記追加の癌治療が腫瘍の外科的除去を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項82】
前記追加の癌治療が前記対象への免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項83】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項８２に記載の方法。
【請求項84】
癌細胞を死滅させる方法であって、前記方法が、ＣＴＬを請求項１から４８のいずれか１項に記載のアプタマーと接触させることによってＣＴＬ活性を誘導することを含む方法。
【請求項85】
癌細胞を死滅させる方法であって、前記方法が、前記癌細胞を請求項４９から６２のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲートと接触させることを含む方法。
【請求項86】
前記癌細胞がアポトーシスによって死滅する、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項87】
前記癌細胞が固形腫瘍細胞である、請求項８４から８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項88】
前記癌細胞が結腸直腸癌細胞である、請求項８７に記載の方法。
【請求項89】
前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項８７に記載の方法。
【請求項90】
アプタマーを作製する方法であって、前記方法が、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも８０％同一の配列を含む核酸分子を合成することを含む方法。
【請求項91】
前記核酸分子が、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記核酸分子が、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項93】
前記核酸分子が、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも９８％同一の核酸配列を含む、請求項９０から９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項94】
前記核酸分子が、配列番号１～２１のいずれか１つの核酸配列を含む、請求項９０から９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項95】
前記核酸分子が、配列番号１～２１のいずれか１つの核酸配列を含む、請求項９０から９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項96】
請求項１～１８または２１～４８のいずれか１項に記載のアプタマーを対象に投与することを含む、前記対象の自己免疫障害を処置する方法。
【請求項97】
請求項１～１８または２１～４８のいずれか１項に記載のアプタマーを対象に投与することを含む、前記対象の炎症性疾患を処置する方法。
【請求項98】
請求項１～１８または２１～４８のいずれか１項に記載のアプタマーを対象に投与することを含む、前記対象の移植拒絶反応を処置する方法。
【請求項99】
請求項６２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の自己免疫障害を処置する方法。
【請求項100】
請求項６２に記載のアプタマーを対象に投与することを含む、前記対象の炎症性疾患を処置する方法。
【請求項101】
請求項６２に記載のアプタマーを対象に投与することを含む、前記対象の移植拒絶反応を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２１，０８０号および２０２１年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２５７，４０２号に基づく優先権の利益を主張し、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２１，０８０号および２０２１年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２５７，４０２号に基づく優先権の利益を主張し、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
背景
Ｔ細胞は、特にそれらの存在量、殺傷効果および増殖能力のために、癌免疫療法の中心的なエフェクターとして確立されている。Ｔ細胞エンゲージャーは、一端がＴ細胞／ＣＤ３複合体の定常成分、もう一端が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する二重特異性分子である。この構造および特異性により、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞を腫瘍細胞に物理的に連結させ、最終的にＴ細胞活性化とそれに続く腫瘍の殺傷を刺激することができる。（Ｈｕｅｈｌｓ ＡＭら（２０１５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９３（３）：２９０－２９６；Ｅｌｌｅｒｍａｎ Ｄ（２０１９）Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４：１０２－１１７）したがって、Ｔ細胞を利用して腫瘍細胞に向け直す二重特異性分子は、有望な治療薬である。過去３０年の間に、無数のＴ二重特異性抗体が開発されてきた。現在までに、癌治療のための他の約３０種のＩｇＧベースの抗体薬物と比較して、Ｔ二重特異性抗体のブリナツモマブ１種類だけが、ヒトでの臨床使用について承認されている。この遅れは主に、これらの抗体の製造時のタンパク質工学の難しさと、これらの新規構築物の臨床毒性が不確実であることに起因する（Ｗｕ ａｎｄ Ｃｈｅｕｎｇ（２０１８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８２：１６１－１７５）。
Ｔ細胞は、特にそれらの存在量、殺傷効果および増殖能力のために、癌免疫療法の中心的なエフェクターとして確立されている。Ｔ細胞エンゲージャーは、一端がＴ細胞／ＣＤ３複合体の定常成分、もう一端が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する二重特異性分子である。この構造および特異性により、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞を腫瘍細胞に物理的に連結させ、最終的にＴ細胞活性化とそれに続く腫瘍の殺傷を刺激することができる。（Ｈｕｅｈｌｓ ＡＭら（２０１５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９３（３）：２９０－２９６；Ｅｌｌｅｒｍａｎ Ｄ（２０１９）Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４：１０２－１１７）したがって、Ｔ細胞を利用して腫瘍細胞に向け直す二重特異性分子は、有望な治療薬である。過去３０年の間に、無数のＴ二重特異性抗体が開発されてきた。現在までに、癌治療のための他の約３０種のＩｇＧベースの抗体薬物と比較して、Ｔ二重特異性抗体のブリナツモマブ１種類だけが、ヒトでの臨床使用について承認されている。この遅れは主に、これらの抗体の製造時のタンパク質工学の難しさと、これらの新規構築物の臨床毒性が不確実であることに起因する（Ｗｕ ａｎｄ Ｃｈｅｕｎｇ（２０１８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８２：１６１－１７５）。
【0003】
アプタマーは、タンパク質、糖、および低分子有機化合物を含む様々な標的に特異的に結合することができる一本鎖オリゴヌクレオチドである。治療薬と診断薬の両方の開発のためにアプタマーを使用することに対する関心が高まっている。
【0004】
アプタマーは、抗体と同様に目的の標的を認識して結合するが、生成時間が短い、製造コストが低い、バッチ間の変動性が低い、修飾性が高い、熱安定性が良好である、免疫原性が低いなどの多くの利点を有する（Ｚｈａｎｇ、Ｌａｉ、ａｎｄ Ｊｕｈａｓ（２０１９）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２４：ｐｉｉ：Ｅ９４１．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２４０５０９４１）。
【0005】
したがって、Ｔ細胞を標的にすることができるアプタマーは、抗癌治療薬として使用できる大きな可能性を有するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｈｕｅｈｌｓ ＡＭら（２０１５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９３（３）：２９０－２９６
【非特許文献2】Ｅｌｌｅｒｍａｎ Ｄ（２０１９）Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４：１０２－１１７
【非特許文献3】Ｗｕ ａｎｄ Ｃｈｅｕｎｇ（２０１８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８２：１６１－１７５
【非特許文献4】Ｚｈａｎｇ、Ｌａｉ、ａｎｄ Ｊｕｈａｓ（２０１９）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２４：ｐｉｉ：Ｅ９４１．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２４０５０９４１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
要旨
ある特定の態様では、Ｔ細胞に結合するアプタマー、ならびに／あるいはＴ細胞刺激および／またはＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの態様では、そのようなアプタマーを含む医薬組成物、そのようなアプタマーを用いて癌を処置する方法および／または癌細胞を死滅させる方法および／またはＴリンパ球を刺激する方法、ならびにそのようなアプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。
ある特定の態様では、Ｔ細胞に結合するアプタマー、ならびに／あるいはＴ細胞刺激および／またはＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの態様では、そのようなアプタマーを含む医薬組成物、そのようなアプタマーを用いて癌を処置する方法および／または癌細胞を死滅させる方法および／またはＴリンパ球を刺激する方法、ならびにそのようなアプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。
【0008】
特定の態様では、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一）である核酸配列を含むアプタマーが本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも２０（例えば、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、または少なくとも５０）の連続したヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも４０（例えば、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３）の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０または２１のいずれか１つ）から本質的になる配列を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０または２１のいずれか１つ）からなる配列を有する。
【0009】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、１００ヌクレオチド長以下（例えば、９０ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７３ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、長さ６３以下、６５ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、５９ヌクレオチド長以下、５８ヌクレオチド長以下、５７ヌクレオチド長以下、５６ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、５４ヌクレオチド長以下、５３ヌクレオチド長以下、５２ヌクレオチド長以下、５１ヌクレオチド長以下、または５０ヌクレオチド長以下）である。
【0010】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、Ｔ細胞に結合することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、Ｔ細胞表面タンパク質ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ｅ）に結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導することができる。いくつかの実施形態では、アプタマーは、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を介して癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）の細胞死を誘導することができる。いくつかの実施形態では、癌細胞は、患者由来癌細胞である。一部の実施形態では、癌細胞は固形腫瘍細胞である。ある特定の実施形態では、癌細胞は、結腸直腸癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は肺癌細胞である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、インビトロで癌細胞の細胞死を誘導する。ある特定の実施形態では、アプタマーは、インビボで（例えば、ヒトおよび／または動物モデルで）癌細胞の細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、アプタマーはＴ細胞刺激を誘導することができる。いくつかの実施形態では、アプタマーはＴ細胞増殖を誘導することができる。
【0011】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、１またはそれを超える化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、アプタマーの５’末端に結合する）で化学修飾されている。いくつかの実施形態では、アプタマーは５’末端キャップを含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは３’末端キャップを含む（例えば、反転したチミジン、ビオチンである）。いくつかの実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４の）２’糖置換（例えば、２’－フルオロ、２’－アミノ、または２’－Ｏ－メチル置換）を含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）および／または２’デオキシ（ｄｅｏｚｙ）－２’フルオロ－Ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）糖をその骨格に含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）メチルホスホネートヌクレオチド間結合および／またはホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）トリアゾールヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、コレステロールまたはジアルキル脂質で（例えば、それらの５’末端で）修飾されている。いくつかの実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える修飾された塩基を含む。
【0012】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、ＤＮＡアプタマー（例えば、Ｄ－ＤＮＡアプタマーまたはエナンチオマーＬ－ＤＮＡアプタマー）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、ＲＮＡアプタマー（例えば、Ｄ－ＲＮＡアプタマーまたはエナンチオマーＬ－ＲＮＡアプタマー）である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む。
【0013】
ある特定の態様では、癌細胞結合部分（例えば、小分子、別のアプタマー、ポリペプチド、核酸、タンパク質、および／または抗体）に連結された本明細書に提供されるアプタマーを含むアプタマーコンジュゲートが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に共有結合している。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に非共有結合している。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に直接連結されている。いくつかの実施形態では、アプタマーは、リンカーを介して癌細胞結合部分に連結されている。いくつかの実施形態では、癌細胞結合部分は、癌細胞上に発現した抗原に結合する。いくつかの実施形態では、癌細胞で発現される抗原は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌抗原１５－３（ＣＡ－１５－３）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ－１２５）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ－Ａ３、ＷＴ１、ｈＴＥＲＴ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、メランＡ、Ｂカテニン、ＣＤＣ２７、ＨＳＰ７０－２－ｍ、ＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７ＯＪ、ＡＦＰ、ＥＢＶ－ＥＢＮＡ、ＨＰＶ１６－Ｅ７、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、マンマグロビンＡまたはＭＨＣ－ＴＡＡペプチド複合体から選択される。いくつかの実施形態では、癌細胞結合部分は、癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）と接触すると、細胞死（例えば、アポトーシス）を誘導する。いくつかの実施形態では、癌細胞は、患者由来癌細胞である。一部の実施形態では、癌細胞は固形腫瘍細胞である。ある特定の実施形態では、癌細胞は、結腸直腸癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞結合部分は、インビトロで癌細胞に接触すると細胞死を誘導する。ある特定の実施形態では、癌細胞結合部分は、インビボで（例えば、ヒトおよび／または動物モデルで）癌細胞と接触させると細胞死を誘導する。
【0014】
ある特定の態様では、本明細書に提供されるアプタマー（例えば、治療有効量のアプタマー）を含む医薬組成物が本明細書で提供される。ある特定の態様では、本明細書に提供されるアプタマーコンジュゲート（例えば、治療有効量のアプタマーコンジュゲート）を含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、非経口投与用に製剤化されている。
【0015】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、癌の処置に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌である。
【0016】
ある特定の態様では、対象の癌を処置する方法が本明細書において提供され、該方法は、本明細書で提供されるアプタマー（例えば、治療有効量のアプタマー）または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の態様では、対象の癌を処置する方法が本明細書において提供され、該方法は、本明細書で提供されるアプタマーコンジュゲート（例えば、治療有効量のアプタマーコンジュゲート）または医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、投与は非経口投与（例えば、皮下投与）である。投与は、腫瘍内注射、皮下注射または膀胱内注入であってよい。
【0017】
いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、腺様嚢胞癌、基底細胞癌、膀胱癌、膵臓癌、肝細胞癌、黒色腫、またはメルケル細胞癌である。ある特定の実施形態では、対象は、化学療法を受けたことがある対象である。ある特定の実施形態では、対象は、腫瘍を外科的に除去した（例えば、乳癌腫瘍を外科的に切除した）対象である。
【0018】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療方法は、対象に追加の癌治療を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の癌治療は化学療法を含む。ある特定の実施形態では、追加の癌治療は、放射線治療を含む。いくつかの実施形態では、追加の癌治療は、腫瘍の外科的除去を含む。ある特定の実施形態では、追加の癌治療は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＶＲ抗体または抗ネクチン抗体）の対象への投与を含む。
【0019】
ある特定の態様では、癌細胞を死滅させる方法が本明細書において提供され、該方法は、癌細胞を本明細書に提供されるアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、癌細胞はアポトーシスによって死滅する。一部の実施形態では、癌細胞は固形腫瘍細胞である。ある特定の実施形態では、癌細胞は、結腸直腸癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、インビトロで癌細胞と接触すると死滅する。ある特定の実施形態では、癌細胞は、インビボで（例えば、ヒトおよび／または動物モデルで）癌細胞と接触すると死滅する。
【0020】
ある特定の態様では、アプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一）の配列を含む核酸を合成すること（例えば、化学的に合成すること）を含む。ある特定の実施形態では、この方法は、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）の少なくとも２０（例えば、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、または少なくとも５０）の連続したヌクレオチドを含む配列を含む核酸を合成することを含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）の少なくとも４０（例えば、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、または少なくとも７３）の連続したヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、配列番号１～２１のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）の配列を含む核酸を合成することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、配列番号１～２１（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）から本質的になる配列を有する核酸を合成することを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、配列番号１～２１（例えば、配列番号１、２０および２１のいずれか１つ）からなる配列を有する核酸を合成することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図2A】図２Ａおよび２Ｂは、結合ＳＥＬＥＸ比較アッセイを示す。結合アッセイは、標的タンパク質ＣＤ３εビーズ複合体（黒色）または対照タンパク質ＩｇＧｌ（灰色）で、初期ランダムライブラリー（Ｒｎｄ Ｌｉｂ）およびラウンド３（Ｒ３）、６（Ｒ６）、９（Ｒ９）、および１１（Ｒ１１）からのライブラリー濃縮プールを用いて実施された。インキュベーションおよび洗浄後、ライブラリーＤＮＡを溶出し、上清中の濃度をリアルタイムＰＣＲによって評価した。標準曲線は、ランダムライブラリー（上）を用いて行った。（Ｂ）Ｃｙ５蛍光標識ライブラリーのジャーカットＴ細胞株およびＰａｎ Ｂ細胞への結合はフローサイトメトリーで実証された。ドットプロットおよびヒストグラムグラフが示されている。Ｃｙ５蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のフローデータ定量化。
【図2B】図２Ａおよび２Ｂは、結合ＳＥＬＥＸ比較アッセイを示す。結合アッセイは、標的タンパク質ＣＤ３εビーズ複合体（黒色）または対照タンパク質ＩｇＧｌ（灰色）で、初期ランダムライブラリー（Ｒｎｄ Ｌｉｂ）およびラウンド３（Ｒ３）、６（Ｒ６）、９（Ｒ９）、および１１（Ｒ１１）からのライブラリー濃縮プールを用いて実施された。インキュベーションおよび洗浄後、ライブラリーＤＮＡを溶出し、上清中の濃度をリアルタイムＰＣＲによって評価した。標準曲線は、ランダムライブラリー（上）を用いて行った。（Ｂ）Ｃｙ５蛍光標識ライブラリーのジャーカットＴ細胞株およびＰａｎ Ｂ細胞への結合はフローサイトメトリーで実証された。ドットプロットおよびヒストグラムグラフが示されている。Ｃｙ５蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のフローデータ定量化。
【図3A-3B】図３Ａ～３Ｃは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析結果を示す。図３Ａは、実施例２で定義されるように、８回目、９回目、１０回目、および１１回目のＳＥＬＥＸラウンドの濃縮ライブラリーからの単一アプタマー配列の分析をドットプロットで示す。Ｘ軸は平均Ｐ陰性を表し、Ｙ軸は平均Ｐ陽性を表す。対角線は、特異的な結合アプタマーと結合性の低い非特異的アプタマー配列との間の閾値を表す。さらなる調査のために選択された上位５つの候補を名称とともに示す。 図３Ｂは、上位１４の特異的結合アプタマー（上）と上位４の選択されたアプタマー（下）の共有モチーフ（ＧＬＡＭ２ソフトウェアを使用）の配列ＬＯＧＯディスプレイを示す。図３Ｃは、選択された５つの候補の二次構造解析（ｍｆｏｌｄ）を示す。モチーフヌクレオチドの位置は赤色のアスタリスクで示されている。
【図3C】図３Ａ～３Ｃは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析結果を示す。図３Ａは、実施例２で定義されるように、８回目、９回目、１０回目、および１１回目のＳＥＬＥＸラウンドの濃縮ライブラリーからの単一アプタマー配列の分析をドットプロットで示す。Ｘ軸は平均Ｐ陰性を表し、Ｙ軸は平均Ｐ陽性を表す。対角線は、特異的な結合アプタマーと結合性の低い非特異的アプタマー配列との間の閾値を表す。さらなる調査のために選択された上位５つの候補を名称とともに示す。 図３Ｂは、上位１４の特異的結合アプタマー（上）と上位４の選択されたアプタマー（下）の共有モチーフ（ＧＬＡＭ２ソフトウェアを使用）の配列ＬＯＧＯディスプレイを示す。図３Ｃは、選択された５つの候補の二次構造解析（ｍｆｏｌｄ）を示す。モチーフヌクレオチドの位置は赤色のアスタリスクで示されている。
【図4】図４は、標的タンパク質に結合するアプタマー配列をＨＰＬＣで示す。折り畳まれ、Ｃｙ５標識されたアプタマー候補を、組換えヒトＣＤ３ε（ｈＣＤ３ε）結合についてアッセイした。アプタマーをｈＣＤ３ｅまたは陰性対照ＩＩｇＧ１とともに３７℃で１時間インキュベートした。ポリＴを陰性対照配列として使用した。
【図5A】図５Ａ～５Ｃは、フローサイトメトリーによって実証されたＴ細胞へのＣＳ６結合を示す。ジャーカット細胞とＫａｍｉ－１細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８ｃとともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。（図５Ａ）。ジャーカット細胞とＤａｕｄｉ細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８ｃとともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。ＭＦＩ定量化を以下に示す（図５Ｂ）。単離したｐａｎ Ｔ細胞とｐａｎ Ｂ細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６とともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。Ｔ細胞およびＢ細胞のＣｙ５（Ｘ軸）／ＳＳＣ（Ｙ軸）によるドットプロットの表示、ならびにＭＦＩ定量化を示す（図５Ｃ）。
【図5B】図５Ａ～５Ｃは、フローサイトメトリーによって実証されたＴ細胞へのＣＳ６結合を示す。ジャーカット細胞とＫａｍｉ－１細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８ｃとともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。（図５Ａ）。ジャーカット細胞とＤａｕｄｉ細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８ｃとともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。ＭＦＩ定量化を以下に示す（図５Ｂ）。単離したｐａｎ Ｔ細胞とｐａｎ Ｂ細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６とともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。Ｔ細胞およびＢ細胞のＣｙ５（Ｘ軸）／ＳＳＣ（Ｙ軸）によるドットプロットの表示、ならびにＭＦＩ定量化を示す（図５Ｃ）。
【図5C】図５Ａ～５Ｃは、フローサイトメトリーによって実証されたＴ細胞へのＣＳ６結合を示す。ジャーカット細胞とＫａｍｉ－１細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８ｃとともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。（図５Ａ）。ジャーカット細胞とＤａｕｄｉ細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８ｃとともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。ＭＦＩ定量化を以下に示す（図５Ｂ）。単離したｐａｎ Ｔ細胞とｐａｎ Ｂ細胞をＣｐＧ’－Ｃｙ５標識ＣＳ６とともにインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。Ｔ細胞およびＢ細胞のＣｙ５（Ｘ軸）／ＳＳＣ（Ｙ軸）によるドットプロットの表示、ならびにＭＦＩ定量化を示す（図５Ｃ）。
【図7】図７は、アプタマーコンジュゲートとしてのＴ細胞エンゲージャーアプタマーの例示的な使用の概略図を提供する。この例では、Ｔ細胞結合アプタマーを、癌を標的とする第２のアプタマーと連結して、二重特異性アプタマー実体が得られる。治療剤の３つの異なるドメインが示されている。
【図8A-8B】図８Ａおよび図８Ｂは、ＨＣＴ１１６にハイブリダイズされたＣＳ６アプタマー（配列番号２１）、結腸癌細胞株標的化アプタマー配列（ＶＳ１２と命名、配列番号２２）で構成される、例示的な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーアプタマーのインビボ有効性を示す。雌ＮＳＧマウスに、ヒトＰＢＭＣと混合したＨＣＴ－１１６腫瘍細胞を皮下移植し、続いてＴ細胞エンゲージャー二重特異性個別化アプタマーによる処置を合計１０用量皮下投与した。ＨＣＴ１１６の腫瘍体積を、ＣＳ６－ＶＳ１２処置群、ポリＴ－ポリＴｑ（非特異ｐ的ＤＮＡアプタマー）群およびビヒクルマウス群についてモニターした（Ａ）。個々のマウス成長曲線を図８Ｂに示す。＊＊＊は、有意差（ｐ≦０．００１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
詳細な説明
一般
特定の態様では、Ｔ細胞に選択的に結合するアプタマー、ならびに／あるいはＴ細胞刺激および／またはＴ細胞媒介性細胞傷害を選択的に誘導するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの態様では、そのようなアプタマーを含む医薬組成物、そのようなアプタマーを用いて癌を処置する方法および／または癌細胞を死滅させる方法、ならびにそのようなアプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。
一般
特定の態様では、Ｔ細胞に選択的に結合するアプタマー、ならびに／あるいはＴ細胞刺激および／またはＴ細胞媒介性細胞傷害を選択的に誘導するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの態様では、そのようなアプタマーを含む医薬組成物、そのようなアプタマーを用いて癌を処置する方法および／または癌細胞を死滅させる方法、ならびにそのようなアプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。
【0023】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに収載する。
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに収載する。
【0024】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は本明細書において、冠詞の文法的対象の１または２以上（例えば、少なくとも１つ）をさすために使用される。例として、「１つの（ａｎ）要素」とは、１つの要素または１よりも多い要素を意味する。
【0025】
「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、既知または未知のどんな機能を果たしてもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される１または複数の遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構築の前後に与えられてよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることがある。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、さらに修飾されていてもよい。
【0026】
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、標的分子、例えばタンパク質もしくはペプチドに、または標的細胞のトポグラフィーの特徴に特異的に結合することができる短い（例えば、２００塩基未満の）一本鎖核酸分子（ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび／またはｓｓＲＮＡ）を指す。
【0027】
「結合」または「相互作用」という用語は、２つの分子間、例えばアプタマーとターゲットの間の、例えば生理学的条件下での静電相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用、πスタッキング相互作用、配位相互作用、ファンデルワールス相互作用、共有結合相互作用、および／または水素結合相互作用による、安定した会合であり得る会合を指す。
【0028】
本明細書で使用される場合、２つの核酸配列が各位置で互いに塩基対を形成する場合、それらは互いの「補体」であるか、または互いに「相補的」である。
【0029】
「調節」または「調節する」という用語は、機能的特性または生物学的活性もしくはプロセス（例えば、酵素活性または受容体結合）に関して使用される場合、アップレギュレートする（例えば、活性化または刺激する）か、ダウンレギュレートする（例えば、阻害または抑制する）か、またはそうでなければそのような特性、活性もしくはプロセスの品質を変化させる能力を指す。ある特定の例では、そのような調節は、シグナル伝達経路の活性化などの特定の事象の発生を条件とする可能性があり、かつ／または特定の細胞型においてのみ発現する可能性がある。
【0030】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」は、アプタマーが所定の標的に結合する能力を指す。典型的には、アプタマーは、約１０－７Ｍまたはそれ未満、約１０－８Ｍまたはそれ未満、または約１０－９Ｍまたはそれ未満のＫＤに対応する親和性でその標的に特異的に結合し、非特異的で無関係な標的（例えば、ＩｇＧ１グロブリン、ＢＳＡ、カゼイン、または無関係な細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞もしくは大腸菌細胞）への結合に対する親和性または同族標的に対する異なるアプタマー配列の親和性よりも有意に低い（例えば、少なくとも２倍未満、少なくとも５倍未満、少なくとも１０倍未満、少なくとも５０倍未満、少なくとも１００倍未満、少なくとも５００倍未満、または少なくとも１０００倍未満の）ＫＤで標的に結合する。
【0031】
アプタマー
ある特定の態様では、Ｔ細胞に結合するアプタマー、ならびに／あるいはＴ細胞刺激を誘導し、および／またはＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの態様では、そのようなアプタマーを含む医薬組成物、そのようなアプタマーを用いて癌を処置する方法および／または癌細胞を死滅させる方法、ならびにそのようなアプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。
ある特定の態様では、Ｔ細胞に結合するアプタマー、ならびに／あるいはＴ細胞刺激を誘導し、および／またはＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの態様では、そのようなアプタマーを含む医薬組成物、そのようなアプタマーを用いて癌を処置する方法および／または癌細胞を死滅させる方法、ならびにそのようなアプタマーを作製する方法が本明細書で提供される。
【0032】
ある特定の態様では、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一）である核酸配列を含むアプタマーが本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも２０（例えば、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０）の連続したヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも４０（例えば、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、または少なくとも７３）の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つから本質的になる配列を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、配列番号１～２１のいずれか１つからなる配列を有する。
【0033】
２またはそれを超える核酸の文脈における「同一」または「同一性パーセント」という用語は、以下に記載されるデフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アライメントおよび目視検査によって測定した場合に（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照）、同じであるか、または指定された百分率の同じヌクレオチド（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大の一致を得るように比較し整列させた場合、指定された領域で約６０％の同一性、好ましくは ６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性）を有する２またはそれを超える配列または部分配列を指す。
【0034】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、１００ヌクレオチド長以下（例えば、９０ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、５９ヌクレオチド長以下、５８ヌクレオチド長以下、５７ヌクレオチド長以下、５６ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、５４ヌクレオチド長以下、５３ヌクレオチド長以下、５２ヌクレオチド長以下、５１ヌクレオチド長以下、または５０ヌクレオチド長以下である。
【0035】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、Ｔ細胞に結合することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、分化３（ＣＤ３）（例えば、ＣＤ３ε鎖）のクラスターに結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーはＴ細胞刺激を誘導することができる。いくつかの実施形態では、アプタマーは、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導することができる。いくつかの実施形態では、アプタマーは、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を介して癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）の細胞死を誘導することができる。いくつかの実施形態では、癌細胞は、患者由来癌細胞である。一部の実施形態では、癌細胞は固形腫瘍細胞である。ある特定の実施形態では、癌細胞は、結腸直腸癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、肺癌細胞である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、インビトロで癌細胞の細胞死を誘導する。ある特定の実施形態では、アプタマーは、インビボで（例えば、ヒトおよび／または動物モデルで）癌細胞の細胞死を誘導する。
【0036】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、１またはそれを超える化学修飾を含む。例示的な修飾を表１に示す。
【0037】
【表1】
【0038】
ある特定の実施形態では、アプタマーは末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、０．５～４０ｋＤａ）で化学修飾されている（例えば、アプタマーの５’末端に結合する）。いくつかの実施形態では、アプタマーは５’末端キャップ（例えば、反転チミジン、ビオチン、アルブミン、キチン、キトサン、セルロース、末端アミン、アルキン、アジド、チオール、マレイミド、ＮＨＳである）を含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは３’末端キャップ（例えば、反転チミジン、ビオチン、アルブミン、キチン、キトサン、セルロース、末端アミン、アルキン、アジド、チオール、マレイミド、ＮＨＳである）を含む。
【0039】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）修飾糖を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える２’糖置換（例えば、２’－フルオロ、２’－アミノ、または２’－Ｏ－メチル置換）を含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）および／または２’デオキシ（ｄｅｏｚｙ）－２’フルオロ－Ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）糖をその骨格に含む。
【0040】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ ３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）メチルホスホネートヌクレオチド間結合および／またはホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を（例えば、その５’末端に）含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）トリアゾールヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、コレステロールまたはジアルキル脂質で修飾されている。
【0041】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える修飾された塩基（例えば、ＢｚｄＵ、ナフチル、トリプタミノ、イソブチル、５－メチルシトシン、アルキン（ジベンゾシクロオクチン）、アジド、マレイミド）を含む。
【0042】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、ＤＮＡアプタマー（例えば、Ｄ－ＤＮＡアプタマーまたはエナンチオマーＬ－ＤＮＡアプタマー）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、ＲＮＡアプタマー（例えば、Ｄ－ＲＮＡアプタマーまたはエナンチオマーＬ－ＲＮＡアプタマー）である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む。
【0043】
アプタマーは、当業者に周知の方法によって合成することができる。例えば、アプタマーは、例えば固体支持体上で化学的に合成することができる。固相合成は、ホスホラミダイト化学を使用することができる。手短に言えば、合成サイクルは、有機酸によるＵＶ制御処置によって、末端の支持体結合ヌクレオシドのヒドロキシル官能基から酸に不安定な５’－ジメトキシトリチル保護基（ＤＭＴ、「トリチル」）を除去することから始まる。次いで、露出した高反応性ヒドロキシル基は、カップリング段階で次の保護されたヌクレオシドホスホラミダイト構成要素と反応するために利用可能であり、亜リン酸トリエステル骨格を形成する。次に、酸に不安定な亜リン酸トリエステル骨格が酸化されて安定な５価のリン酸トリエステル（ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ）になる。特定の骨格位置でホスホロチオエート修飾が望まれる場合は、酸に不安定な亜リン酸トリエステル（ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ）骨格を酸化プロセスの代わりにこの段階で硫化して、Ｐ＝ＯではなくＰ＝Ｓ結合を生成する。続いて、次のカップリング段階中にこれらの部位をブロックし、内部ミスマッチ配列を回避するために、すべての未反応の５’－ヒドロキシル基はアセチル化される（「キャップされる」）。キャッピング段階の後、ＤＭＴ保護基の除去および所望の配列に従った次の塩基の連続的なカップリングによってサイクルを再び開始する。最後に、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し、全ての保護基を骨格および塩基から除去する。
【0044】
アプタマーコンジュゲート
特定の態様では、癌細胞結合部分に連結された本明細書に提供されるアプタマーを含むアプタマーコンジュゲートが本明細書に提供される。癌細胞結合部分は、例えば、アプタマー、小分子、ポリペプチド、核酸、タンパク質または抗体であってよい。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に共有結合している。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に非共有結合している。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に直接連結されている。いくつかの実施形態では、アプタマーは、リンカーを介して癌細胞結合部分に連結されている。
特定の態様では、癌細胞結合部分に連結された本明細書に提供されるアプタマーを含むアプタマーコンジュゲートが本明細書に提供される。癌細胞結合部分は、例えば、アプタマー、小分子、ポリペプチド、核酸、タンパク質または抗体であってよい。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に共有結合している。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に非共有結合している。いくつかの実施形態では、アプタマーは、癌細胞結合部分に直接連結されている。いくつかの実施形態では、アプタマーは、リンカーを介して癌細胞結合部分に連結されている。
【0045】
いくつかの実施形態では、癌細胞結合部分は、癌細胞上に発現した抗原に結合する。いくつかの実施形態では、癌細胞結合部分は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌抗原１５－３（ＣＡ－１５－３）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ－１２５）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ－Ａ３、ＷＴ１、ｈＴＥＲＴ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、メランＡ、Ｂカテニン、ＣＤＣ２７、ＨＳＰ７０－２－ｍ、ＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７ＯＪ、ＡＦＰ、ＥＢＶ－ＥＢＮＡ、ＨＰＶ１６－Ｅ７、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、マンマグロビンＡまたはＭＨＣ－ＴＡＡペプチド複合体から選択される癌抗原に結合する。
【0046】
いくつかの実施形態では、癌細胞結合部分は、癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）と接触すると、細胞死（例えば、アポトーシス）を誘導する。いくつかの実施形態では、癌細胞は、患者由来癌細胞である。一部の実施形態では、癌細胞は固形腫瘍細胞である。ある特定の実施形態では、癌細胞は、結腸直腸癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞結合部分は、インビトロで癌細胞に接触すると細胞死を誘導する。ある特定の実施形態では、癌細胞結合部分は、インビボで（例えば、ヒトおよび／または動物モデルで）癌細胞と接触させると細胞死を誘導する。
【0047】
二重特異性個別化アプタマー
ある特定の態様では、（ａ）癌細胞に発現した抗原に特異的に結合する癌細胞結合鎖；（ｂ）ＣｐＧモチーフ；および（ｃ）ＣＤ３結合鎖（例えば、本明細書に開示のＣＤ３結合アプタマー）含み、癌細胞結合鎖がＣｐＧモチーフによってＣＤ３結合鎖に連結されている二重特異性個別化アプタマーが本明細書で提供される。
ある特定の態様では、（ａ）癌細胞に発現した抗原に特異的に結合する癌細胞結合鎖；（ｂ）ＣｐＧモチーフ；および（ｃ）ＣＤ３結合鎖（例えば、本明細書に開示のＣＤ３結合アプタマー）含み、癌細胞結合鎖がＣｐＧモチーフによってＣＤ３結合鎖に連結されている二重特異性個別化アプタマーが本明細書で提供される。
【0048】
いくつかの実施形態では、癌細胞結合鎖は、癌細胞（例えば、ヒト癌細胞）と接触すると、癌細胞の細胞死（例えば、アポトーシス）を誘導することができる。いくつかの実施形態では、癌細胞は、患者由来癌細胞である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、固形腫瘍細胞（例えば、乳癌細胞）である。ある特定の実施形態では、癌細胞は、癌細胞（例えば、結腸直腸癌細胞）である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、インビトロで癌細胞に接触すると細胞死を誘導する。ある特定の実施形態では、アプタマーは、インビボで（例えば、ヒトおよび／または動物モデルで）癌細胞と接触すると細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、癌細胞結合鎖は、前立腺膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌抗原１５－３（ＣＡ－１５－３）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ－１２５）、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－ｌ／メランＡ、ＨＳＰ７０－２－ｍ、ＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７ＯＪ、ＨＰＶ１６－Ｅ７、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、マンマグロビンＡまたはＭＨＣ－ＴＡＡペプチド複合体から選択される癌抗原に結合する。
【0049】
ある特定の実施形態では、癌細胞結合鎖は、配列番号６４～８７のいずれか１つと少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一）である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、癌細胞結合鎖は、配列番号６４～８７のいずれか１つの核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、癌細胞結合鎖は、配列番号６４～８３のいずれか１つの少なくとも３０（例えば、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９）の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、癌細胞結合鎖は、配列番号６４～８７から本質的になる配列を有する。ある特定の実施形態では、癌細胞結合鎖は、配列番号６４～８７からなる配列を有する。
【0050】
【表2-1】
【表2-2】
【0051】
２またはそれを超える核酸の文脈における「同一」または「同一性パーセント」という用語は、以下に記載されるデフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アライメントおよび目視検査によって測定した場合に（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照）、同じであるか、または指定された百分率の同じヌクレオチド（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大の一致を得るように比較し整列させた場合、指定された領域で約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性）を有する２またはそれを超える配列または部分配列を指す。
【0052】
ある特定の実施形態では、癌細胞結合鎖は、１２０ヌクレオチド長以下（例えば、１１５ヌクレオチド長以下、１１０ヌクレオチド長以下、１０５ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、９５ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、６９ヌクレオチド長以下、６８ヌクレオチド長以下、６７ヌクレオチド長以下、６６ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下、６４ヌクレオチド長以下、または６３ヌクレオチド長以下）である。ある特定の実施形態では、癌細胞結合鎖は約６３ヌクレオチド長である。
【0053】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合鎖は、配列番号１～２１のいずれか１つと少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一）である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合鎖は、配列番号１～２１のいずれか１つの核酸配列を含む。
【0054】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３結合鎖は、配列番号１～２１のいずれか１つの少なくとも２０（例えば、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３）の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＤ３結合鎖は、配列番号１～２１から本質的になる配列を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるＣＤ３結合鎖は、配列番号１～２１からなる配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３結合は、１２０ヌクレオチド長以下（例えば、１１５ヌクレオチド長以下、１１０ヌクレオチド長以下、１０５ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、９５ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７４ヌクレオチド長以下、または７３ヌクレオチド長以下）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３結合鎖は、約７３ヌクレオチド長である。
【0055】
癌細胞結合鎖とＣＤ３結合鎖は、癌細胞結合鎖の５’配列とＣＤ３結合鎖の５’配列のハイブリダイゼーションによって互いに連結することができる。ある特定の実施形態では、癌細胞結合鎖の５’配列は、ＣＤ３結合鎖の５’配列にハイブリダイズして、ＣｐＧリッチモチーフ、ＴＬＲ９アゴニスト配列を形成する。癌細胞結合鎖およびＣＤ３結合鎖は、二本鎖配列の２つの末端（例えば、５’末端）のそれぞれに直接ライゲーションすることによって互いに連結することができる。ある特定の実施形態では、二本鎖配列は、ＴＬＲ９アゴニスト配列であるＣｐＧモチーフである。
【0056】
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ９アゴニスト配列は、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０の）ＣｐＧモチーフヌクレオチドを含む二本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧモチーフは、ＴＬＲ９媒介性抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激および／または腫瘍抗原の取込み増加を誘導する。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニスト配列は、抗腫瘍応答を誘導する。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニスト配列は、サイトカイン産生を誘導する。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＣＰＧモチーフ配列は、配列番号８８～９１のいずれか１つと少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一）である配列を含む二本鎖核酸配列である。いくつかの実施形態では、ＣＰＧモチーフ配列は、配列番号８８～９１のいずれか１つの配列を含む二本鎖核酸配列である。
【0058】
ある特定の実施形態では、ＣｐＧモチーフ配列は、配列番号８８～９１のいずれか１つの少なくとも１２（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２）の連続したヌクレオチドを含む二本鎖核酸配列である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣｐＧモチーフ配列は、配列番号８８～９１から本質的になる配列を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるＣｐＧモチーフ配列は、配列番号８８～９１からなる配列を有する。
【0059】
ある特定の実施形態では、ＣｐＧモチーフ配列は、３５ヌクレオチド長以下（例えば、３４ヌクレオチド長以下、３３ヌクレオチド長以下、３２ヌクレオチド長以下、３１ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、２９ヌクレオチド長以下、２８ヌクレオチド長以下、２７ヌクレオチド長以下、２６ヌクレオチド長以下、２５ヌクレオチド長以下、２４ヌクレオチド長以下、２３ヌクレオチド長以下、または２２ヌクレオチド長以下）である。
【0060】
本明細書に提供される二重特異性個別化アプタマーは、本明細書に記載の癌細胞結合鎖とＣＤ３結合鎖の任意の組み合わせを含み得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二重特異性個別化アプタマーは、１またはそれを超える化学修飾を含む。例示的な修飾を表３に示す。
【0062】
【表3】
【0063】
ある特定の実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、０．５～４０ｋＤａ）で化学修飾されている（例えば、アプタマーの５’末端に結合する）。いくつかの実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは５’末端キャップ（例えば、反転チミジン、ビオチン、アルブミン、キチン、キトサン、セルロース、末端アミン、アルキン、アジド、チオール、マレイミド、ＮＨＳである）を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは３’末端キャップ（例えば、反転チミジン、ビオチン、アルブミン、キチン、キトサン、セルロース、末端アミン、アルキン、アジド、チオール、マレイミド、ＮＨＳである）を含む。
【0064】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される二重特異性個別化アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）修飾糖を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは、１またはそれを超える２’糖置換（例えば、２’－フルオロ、２’－アミノ、または２’－Ｏ－メチル置換）を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）および／または２’デオキシ（ｄｅｏｚｙ）－２’フルオロ－Ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）糖をその骨格に含む。
【0065】
ある特定の実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）メチルホスホネートヌクレオチド間結合および／またはホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。
【0066】
特定の実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは、二本鎖領域内にＰＳ修飾を含み得る（例えば、ＣｐＧモチーフ配列）。例えば、二重特異性個別化アプタマーの二本鎖領域（例えば、ＣｐＧモチーフ配列）は、一方または両方の鎖に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個のホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、二重特異性個別化アプタマーの二本鎖領域（例えば、ＣｐＧモチーフ配列）は、部分的なＰＳ修飾を含み得る。特定の実施形態では、二本鎖ＣｐＧモチーフ配列の５’末端から５ヌクレオチドが修飾される。他の実施形態では、二本鎖ＣｐＧモチーフ配列の５’および３’末端から５ヌクレオチドが修飾される。ある特定の実施形態では、二本鎖ＣｐＧモチーフ配列は、完全なＰＳ修飾を含む。
【0067】
ある特定の実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ ３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４個の）トリアゾールヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、アプタマーは、コレステロールまたはジアルキル脂質で（例えば、それらの５’末端で）修飾されている。
【0068】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、１またはそれを超える修飾された塩基（例えば、ＢｚｄＵ、ナフチル、トリプタミノ、イソブチル、５－メチルシトシン、アルキン（ジベンゾシクロオクチン）、アジド、マレイミド）を含む。
【0069】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、ＤＮＡアプタマー（例えば、Ｄ－ＤＮＡアプタマーまたはエナンチオマーＬ－ＤＮＡアプタマー）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアプタマーは、ＲＮＡアプタマー（例えば、Ｄ－ＲＮＡアプタマーまたはエナンチオマーＬ－ＲＮＡアプタマー）である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む。
【0070】
薬学的組成物
ある特定の態様では、本明細書に提供されるアプタマー（例えば、治療有効量のアプタマー）を含む医薬組成物が本明細書で提供される。ある特定の態様では、本明細書に提供されるアプタマーコンジュゲート（例えば、治療有効量のアプタマーコンジュゲート）を含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、非経口投与（例えば、皮下投与）用に製剤化されている。投与は、腫瘍内注射または皮下注射または膀胱内注入であってよい。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるアプタマー（例えば、治療有効量のアプタマー）を含む医薬組成物が本明細書で提供される。ある特定の態様では、本明細書に提供されるアプタマーコンジュゲート（例えば、治療有効量のアプタマーコンジュゲート）を含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、非経口投与（例えば、皮下投与）用に製剤化されている。投与は、腫瘍内注射または皮下注射または膀胱内注入であってよい。
【0071】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、癌の処置に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、癌は、癌腫（例えば、結腸直腸癌）である。一部の実施形態では、癌は肺癌である。
【0072】
「薬学的に許容され得る担体」とは、対象への活性薬剤の投与および対象による吸収を補助し、患者に重大な有害な毒性作用を引き起こすことなく本明細書に記載の組成物に含めることができる物質を指す。薬学的に許容され得る賦形剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、乳酸リンゲル液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、香料、塩溶液（リンゲル液など）、アルコール、油、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼまたはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、脂質、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、および着色料などが挙げられる。そのような調製物は、滅菌し、必要に応じて、本明細書に記載の組成物と有害に反応しない潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、および／または芳香物質などの補助剤と混合することができる。当業者は、他の医薬賦形剤が有用であることを認識するであろう。
【0073】
治療方法
いくつかの態様では、本明細書に提供される１またはそれを超えるアプタマーを含む医薬組成物の投与を含む、癌を処置する方法が本明細書で提供される。
いくつかの態様では、本明細書に提供される１またはそれを超えるアプタマーを含む医薬組成物の投与を含む、癌を処置する方法が本明細書で提供される。
【0074】
いくつかの態様では、本明細書に提供される１またはそれを超えるアプタマーコンジュゲートを含む医薬組成物の投与を含む、癌を処置する方法が本明細書で提供される。
【0075】
いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。一部の実施形態では、癌は肺癌である。したがって、特定の態様では、本明細書に記載のアプタマー、アプタマーコンジュゲート、および／または医薬組成物を対象に送達する方法が本明細書で提供される。
【0076】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物、アプタマーおよびアプタマーコンジュゲートは、例えば、放射線治療および腫瘍の外科的切除などの任意の他の従来の抗癌処置と併せて投与することができる。これらの処置は、必要に応じておよび／または示されるように適用されてよく、本明細書に記載の医薬組成物、アプタマー、アプタマーコンジュゲート、剤形、およびキットの投与前、投与と同時、または投与後に行うことができる。
【0077】
ある特定の実施形態では、本方法は、アプタマーまたはアプタマーコンジュゲートの複数回用量の投与を含む。別々の投与には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２１、２２、２３、２４、または２５回の投与を含む任意の数の２回またはそれを超える投与（例えば、用量）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５回の投与が含まれる。当業者であれば、治療方法をモニタリングするための当技術分野で公知の方法および本明細書に提供される他のモニタリング方法に従って、実施すべき投与回数、または１またはそれを超える追加の投与を実施することの望ましさを容易に決定することができる。したがって、本明細書に提供される方法は、本明細書に記載のアプタマー、アプタマーコンジュゲートおよび／または医薬組成物の１またはそれを超える投与を対象に提供する方法を含み、投与回数は、対象をモニタリングし、モニタリングの結果に基づいて、１またはそれを超える追加投与を提供するかどうかを決定することによって決定することができる。１またはそれを超える追加投与を提供するかどうかの決定は、限定されるものではないが、Ｔ細胞の刺激、Ｔ細胞の細胞傷害活性、腫瘍増殖の指示または腫瘍増殖の抑制、新たな転移の出現または転移の抑制、対象の抗腫瘍抗体価、対象の全体的な健康状態および／または対象の体重を含む、多様なモニタリング結果に基づいて行うことができる。
【0078】
投与と投与の間の期間は、様々な期間のいずれであってもよい。いくつかの態様では、投与は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日、あるいは１、２、３、または４週間の間隔を空けて行うことができる。投与と投与の間の期間は、投与回数、対象が免疫応答を開始するまでの期間および／または対象がアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートを正常組織から除去するための時間に関連して記載されるように、モニタリング段階をはじめとする多様な因子のいずれかの関数であり得る。一例では、この期間は、対象が免疫応答を開始するまでの期間の関数であり得る；例えば、この期間は、対象が免疫応答を開始するまでの期間より長くてもよく、例えば約１週間超、約１０日超、約２週間超、または約１か月超であってもよく；別の例では、この期間は、対象が免疫応答を開始するまでの期間よりも短くてよく、例えば約１週間未満、約１０日未満、約２週間未満、または約１か月未満であってよい。別の例では、この期間は、対象が正常組織からアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートを除去するための期間の関数であり得る；例えば、この期間は、対象がアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートを正常組織から除去するための期間より長くてもよく、例えば、約１時間超、約１日超、約２日超、約３日超、約５日超、または約１週間超であってよい。別の例では、この期間は、対象が正常組織からアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートを除去するための期間よりも短くてよく、例えば約１時間未満、約１日未満、約２日未満、約３日未満、約５日未満、または約１週間未満であってよい。
【0079】
本明細書に記載のアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートの投与用量は、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効なアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートの量であり、患者に対する毒性は最小であるか、または実現可能な最大用量である。有効投与量レベルは、本明細書に記載の方法を使用して同定することができ、投与される特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排出速度、処置の期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、全体的な健康状態および以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子をはじめとする様々な薬物動態的および薬力学的因子に依存する。一般に、癌治療薬の有効量は、治療効果をもたらすのに有効な最小用量である治療薬の量である。そのような有効量は、一般に、上記の因子に依存する。
【0080】
投与経路の例としては、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入（経鼻）または注射が挙げられる。注射による投与には、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内、腫瘍周囲、筋肉内（ＩＭ）および皮下（ＳＣ）投与が含まれる。本明細書に記載の組成物は、限定されるものではないが、経口、非経口、経腸、静脈内、腫瘍内、腹腔内、局所、経皮（例えば、任意の標準的なパッチを使用）、皮内、眼、経鼻（鼻腔内）、局所、非経口、例えばエアロゾル、吸入、皮下、筋肉内、頬側、舌下、（経）直腸、膣、動脈内、および髄腔内、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬、（経）尿道、膣（例えば、経膣および膣周囲）、埋め込み、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、および気管支内を含む任意の有効な経路によって任意の形態で投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートは、経口に、直腸に、局所に、膀胱内に、排出リンパ節内またはそれの近くの注射により、静脈内に、吸入もしくはエアロゾルにより、または皮下に投与される。いくつかの態様において、投与は非経口投与（例えば、皮下投与）である。投与は、腫瘍内注射または腫瘍周囲注射であり得る。
【0081】
投与計画は、様々な方法および量のいずれであってもよく、公知の臨床因子に従って当業者によって決定されてよい。医学分野で知られているように、１人の患者に対する投与量は、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫能、腫瘍の大きさ、一般的な健康状態および特定のバイオマーカー、投与される特定の微生物、投与期間および投与経路、疾患の種類および病期（例えば腫瘍サイズ）、ならびに同時に投与される薬物などの他の化合物をはじめとする多くの因子に依存し得る。
【0082】
本明細書に記載の処置方法は、原発性腫瘍、続発性腫瘍または転移の処置、ならびに再発性腫瘍または癌の処置に適し得る。本明細書に記載の医薬組成物の用量は、剤形、投与経路、標的疾患の程度または病期等に応じて適宜設定または調整することができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、対象に投与される用量は、癌を予防する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅らせるもしくは停止させる、または癌の再発を予防する、腫瘍量を減少させる、または対象の無病生存期間、腫瘍増殖停止時間もしくは全生存期間に寄与するのに十分な量である。当業者は、投与量が、用いられる特定の化合物の強度、ならびに対象の年齢、種、症状および体重をはじめとする様々な因子に依存することを認識するであろう。また、用量のサイズも、投与の経路、タイミングおよび頻度、ならびに特定の化合物の投与および所望の生理学的効果に付随し得る有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【0084】
適切な用量および投与計画は、当業者に公知の従来の範囲設定技術によって決定することができる。一般に、処置は、化合物の最適用量よりも少ない少量で開始される。その後、その状況下で最適な効果に達するまで、投与量を少しずつ増加させる。有効な投薬量および処置プロトコルは、例えば、実験動物において低用量で開始し、次いで、効果をモニタリングしながら投薬量を増加させ、同様に投与計画を体系的に変化させる、日常的かつ従来の手段によって決定することができる。動物実験は、体重１キログラムあたりの生理活性剤の最大耐容量（「ＭＴＤ」）を決定するために一般的に使用されている。当業者は、ヒトを含む他の種において、毒性を回避しながら有効性について用量を定期的に外挿する。
【0085】
上記に従って、治療用途における、本明細書で提供されるアプタマーまたはアプタマーコンジュゲートの投与量は、選択された投薬量に影響を及ぼす他の因子の中でも、特定のアプタマーまたはアプタマーコンジュゲート、レシピエント患者の年齢、体重、および臨床症状、ならびに治療を投与する臨床医または開業医の経験および判断に応じて異なることがある。一般に、用量は、腫瘍の成長を遅らせ、好ましくは後退させ、最も好ましくは癌の完全な退縮を引き起こすのに十分でなければならない。
【0086】
本明細書に記載の方法によって処置され得る癌の例としては、限定されないが、血液悪性腫瘍、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球白血病、慢性顆粒球白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血病性白血病、白血球白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胚性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化細胞白血病、ヘアリーセル白血病、血液芽細胞性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、肝細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ原性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、微小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、Ｎａｅｇｅｌｉ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、腺房細胞癌、腺房癌、腺嚢胞癌、腺様嚢胞癌、腺腫癌、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底扁平細胞癌、気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛癌、コロイド癌、面皰癌、体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱癌、円柱細胞癌、腺管癌、デュラム癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｕｒｕｍ）、胚性癌、脳様癌、類表皮癌（ｅｐｉｅｎｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖癌、潰瘍癌、線維性癌、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿体癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｍ）、扁平上皮癌、有棘細胞癌、ストリング癌（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌、絨毛癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｌｌｏｓｕｍ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌、肝細胞癌、Ｈｕｒｔｈｌｅ細胞癌、ヒアリン癌、副腎様癌（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小児胎児性癌（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌、Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ癌、Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ細胞癌、大細胞癌、水晶体癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性癌、リンパ上皮癌、髄質癌、髄様癌、黒色癌、軟性癌、粘液性癌、ムシパルム癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌、粘表皮癌、粘膜癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ、ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、髄質様癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、スキルス癌、陰嚢癌、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、Ａｂｅｒｎｅｔｈｙ肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ、ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛膜肉腫（ｃｈｏｒｉｏ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血肉腫、Ｂ細胞の免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽細胞肉腫、Ｊｅｎｓｅ肉腫、カポジ肉腫、クップファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性肉腫、網状赤血球肉腫、横紋筋肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、血管拡張性骨肉腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、横紋筋肉腫、血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、Ｈａｒｄｉｎｇ－Ｐａｓｓｅｙ黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、Ｃｌｏｕｄｍａｎ黒色腫、Ｓ９１黒色腫、結節性メラノーマ、爪甲下黒色腫、表在拡大型黒色腫、形質細胞腫、結腸直腸癌、直腸癌が挙げられる。
【0087】
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法および組成物は、肉腫の処置に関する。「肉腫」という用語は、一般に、胚性結合組織のような物質で構成されており、線維性、不均一または均一な物質に埋め込まれた密集した細胞で一般に構成される腫瘍を指す。
【0088】
肉腫には、限定されるものではないが、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、Ａｂｅｒｎｅｔｈｙ肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ、ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛膜肉腫（ｃｈｏｒｉｏ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血肉腫、Ｂ細胞の免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽細胞肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クップファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性肉腫、網状肉腫、ラウス肉腫、漿膜肉腫、滑膜肉腫、および血管拡張性骨肉腫が含まれる。
【0089】
本明細書に記載の方法および組成物を使用して処置され得るさらなる例示的な新生物には、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、非尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、および副腎皮質癌が含まれる。
【0090】
いくつかの実施形態では、処置される癌は黒色腫である。用語「黒色腫」は、皮膚および他の器官のメラノサイト系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。黒色腫の非限定的な例は、ハーディング－パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、先端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、結節性黒色腫、乳腺下黒色腫、および表在拡大黒色腫である。
【0091】
本明細書に記載の方法および組成物を使用して処置され得る腫瘍の特定のカテゴリーには、リンパ増殖性障害、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、骨癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、皮膚癌、腎臓癌、ならびに上記のすべての転移が含まれる。特定の種類の腫瘍には、肝細胞癌、肝細胞腫、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、浸潤性乳管癌、乳頭状腺癌、黒色腫、肺扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌、腺癌（高分化型、中分化型、低分化型または未分化型）、細気管支肺胞上皮癌、腎細胞癌、グラヴィッツ腫瘍、副腎様腺癌（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｉｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、小細胞、非小細胞および大細胞肺癌を含む肺癌、膀胱癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、結腸癌、直腸癌、造血性悪性腫瘍（急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含むすべての種類の白血病およびリンパ腫を含む）が含まれる。
【0092】
特定の実施形態で処置される癌には、前癌性病変、例えば光線性角化症（日光角化症）、ほくろ（異形成母斑）、光線性口唇炎（農夫の唇）、皮角、バレット食道、萎縮性胃炎、先天性角化異常症、鉄欠乏性嚥下障害、扁平苔癬、口腔粘膜下線維症、光線性（日光）弾力線維症および子宮頸部異形成症も含まれる。
【0093】
いくつかの実施形態で処置される癌には、例えば、内胚葉、外胚葉または間葉起源の非癌性腫瘍または良性腫瘍が含まれ、それには、限定されるものではないが、胆管腫、結腸ポリープ、腺腫、乳頭腫、嚢胞腺腫、肝細胞腺腫、胞状奇胎、腎尿細管腺腫、扁平上皮乳頭腫、胃ポリープ、血管腫、骨腫、軟骨腫、脂肪腫、線維腫、リンパ管腫、平滑筋腫、横紋筋腫、星状細胞腫、母斑、髄膜腫、および神経節神経腫が含まれる。
【0094】
ある特定の実施形態では、癌は、固形腫瘍（例えば、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、腺様嚢胞癌、膀胱癌、膵臓癌、肝細胞癌、黒色腫、メルケル細胞癌、または結腸直腸癌）である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は腫瘍内投与に利用可能である。ある特定の実施形態において、癌は、肉腫（例えば、軟部組織肉腫）である。特定の実施形態では、癌は血液癌（例えば、リンパ腫）である。
【0095】
免疫障害の処置
特定の実施形態では、本明細書で提供されるアプタマーは、Ｔ細胞活性化を遮断することによって免疫応答を阻害することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供される１またはそれを超えるアプタマーを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、自己免疫または炎症性疾患を処置する方法および／または移植拒絶を阻害する方法が本明細書で提供される。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるアプタマーは、Ｔ細胞活性化を遮断することによって免疫応答を阻害することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供される１またはそれを超えるアプタマーを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、自己免疫または炎症性疾患を処置する方法および／または移植拒絶を阻害する方法が本明細書で提供される。
【0096】
本明細書に記載の方法は、処置を必要とする対象を処置するために使用することができる。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」には、炎症性疾患、免疫障害を有する、かつ／または臓器および／もしくは組織の移植を受けたことのある対象、ならびにそのような疾患もしくは障害を獲得する可能性またはそのような移植を受ける可能性が高い対象が含まれる。
【0097】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、自己免疫疾患、例えば慢性炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、マッカルウェルズ症候群、関節リウマチ、多発性硬化症、または橋本病など；アレルギー性疾患、例えば食物アレルギー、花粉症、または喘息など；感染症、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染；ＴＮＦ媒介性炎症性疾患などの炎症性疾患（例えば、回腸嚢炎などの胃腸管の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症などの心血管の炎症症状、または慢性閉塞性肺疾患などの炎症性肺疾患）に関連する炎症を予防または処置する（これらの有害事象を部分的にまたは完全に軽減する）ための医薬組成物として；臓器移植または組織拒絶が起こり得る他の状況において拒絶を抑制するためのための医薬組成物として；免疫機能を改善するためのサプリメント、食品、または飲料として；あるいは、免疫細胞の増殖もしくは機能を抑制するための試薬として使用することができる。
【0098】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、炎症の処置に有用である。ある特定の実施形態では、身体のあらゆる組織および器官の炎症には、筋骨格系の炎症、血管の炎症、神経の炎症、消化器系の炎症、眼球の炎症、生殖器系の炎症、および以下に論じるその他の炎症が含まれる。
【0099】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、筋骨格系の免疫障害に関連する炎症を予防または処置する（これらの有害事象を部分的にまたは完全に軽減する）ための医薬組成物として使用することができる。筋骨格系の免疫障害としては、限定されないが、手、手首、肘、肩、顎、脊椎、首、股関節、膝（ｋｎｅｗ）、足首、および足の関節を含む骨格関節に影響を及ぼす症状、ならびに腱などの筋肉と骨を繋ぐ組織に影響を及ぼす症状が含まれる。本明細書に記載の方法および組成物で処置することができるそのような免疫障害の例としては、限定されるものではないが、関節炎（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、急性および慢性感染性関節炎、痛風および偽痛風に関連する関節炎、および若年性特発性関節炎を含む）、腱炎、滑膜炎、腱滑膜炎、滑膜炎、滑液包炎、結合織炎（線維筋痛症）、上顆炎、筋炎および骨炎（例えば、パジェット病、恥骨骨炎、および嚢胞性線維性骨炎を含む）が挙げられる。
【0100】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、眼免疫障害に関連する炎症を予防または処置する（これらの有害事象を部分的にまたは完全に軽減する）ための医薬組成物として使用することができる。眼免疫障害とは、眼瞼を含む眼のあらゆる構造に影響を及ぼす免疫障害を指す。本明細書に記載の方法および組成物で処置することができる眼免疫障害の例としては、限定されるものではないが、眼瞼炎、眼瞼皮膚弛緩症、結膜炎、涙腺炎、角膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、強膜炎、睫毛乱生症、およびブドウ膜炎が挙げられる。
【0101】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、神経系免疫障害に関連する炎症を予防または処置する（これらの有害事象を部分的にまたは完全に軽減する）ための医薬組成物として使用することができる。本明細書に記載の方法および組成物で処置することができる神経系免疫障害の例としては、限定されるものではないが、脳炎、ギラン・バレー症候群、髄膜炎、神経性筋強直症、ナルコレプシー、多発性硬化症、脊髄炎および統合失調症が挙げられる。
【0102】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、血管系またはリンパ系に関連する炎症を予防または処置する（これらの有害事象を部分的にまたは完全に軽減する）ための医薬組成物として使用することができる。本明細書に記載の方法および組成物で処置することができる血管系またはリンパ系の炎症の例としては、限定されるものではないが、関節硬化症、関節炎、静脈炎、血管炎、およびリンパ管炎が挙げられる。
【0103】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、消化器系免疫障害に関連する炎症を予防または処置する（これらの有害事象を部分的にまたは完全に軽減する）ための医薬組成物として使用することができる。本明細書に記載の方法および組成物で処置することができる消化器系免疫障害の例としては、限定されるものではないが、胆管炎、胆嚢炎、小腸炎、小腸結腸炎、胃炎、胃腸炎、炎症性腸疾患、回腸炎、および直腸炎が挙げられる。炎症性腸疾患には、例えば、関連症状群の当該分野で認識されている特定の形態が含まれる。炎症性腸疾患にはいくつかの主要な形態が知られており、クローン病（局所腸疾患、例えば不活性型および活性型）および潰瘍性大腸炎（例えば、不活性型および活性型）がこれらの障害の中で最も一般的である。さらに、炎症性腸疾患は、過敏性腸症候群、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性－形質細胞性腸炎、セリアック病、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎および好酸球性腸炎を含む。他のあまり一般的でない形態のＩＢＤとしては、分類不能大腸炎、偽膜性大腸炎（壊死性大腸炎）、虚血性炎症性腸疾患、ベーチェット病、サルコイドーシス、強皮症、ＩＢＤ関連異形成、異形成に関連する腫瘤または病変、および原発性硬化性胆管炎が挙げられる。
【0104】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、生殖器系免疫障害に関連する炎症を予防または処置する（これらの有害事象を部分的にまたは完全に軽減する）ための医薬組成物として使用することができる。本明細書に記載の方法および組成物で処置することができる生殖系免疫障害の例としては、限定されるものではないが、子宮頸管炎、絨毛膜羊膜炎、子宮内膜炎、精巣上体炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、卵管炎、卵管卵巣膿瘍、尿道炎、膣炎、外陰炎および外陰痛が挙げられる。
【0105】
本明細書に記載の方法および医薬組成物は、自己免疫症状を処置するために使用することができる。そのような症状としては、限定されないが、急性汎発性脱毛症、ベーチェット病、シャーガス病、慢性疲労症候群、自律神経障害、脳脊髄炎、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、化膿性汗腺炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、セリアック病、クローン病、１型糖尿病、２型糖尿病、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、川崎病、紅斑性狼瘡、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発性動脈炎、混合組織病、マッカルウェルズ症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、結節性多発動脈炎、多発筋痛、関節リウマチ、ライター症候群、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、ウェジナー肉芽腫症、温自己免疫性溶血性貧血、間質性膀胱炎、ライム病、モルフェア、乾癬、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎および白斑が挙げられる。
【0106】
本明細書に記載の方法および医薬組成物は、Ｔ細胞媒介性過敏症疾患を処置するために使用することができる。そのような症状には、限定されるものではないが、接触過敏症、接触皮膚炎（ツタウルシによるものを含む）、蕁麻疹、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー（花粉症、アレルギー性鼻炎、ハウスダストダニアレルギー）およびグルテン過敏性腸症（セリアック病）が含まれる。
【0107】
炎症性成分を有し、本方法および医薬組成物により処置され得る他の免疫障害としては、例えば、虫垂炎、皮膚炎、皮膚筋炎、心内膜炎、結合織炎、歯肉炎、舌炎、肝炎、化膿性汗腺炎、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、心筋炎、腎炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、間質性肺炎、前立腺炎、腎盂腎炎、および口内炎、移植拒絶反応（腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓（例えば、膵島細胞）、骨髄、角膜、小腸、皮膚同種移植片（ｓｋｉｎ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ，ｓｋｉｎ ｈｏｍｏｇｒａｆｔｓ）、および心臓弁移植片（ｘｅｎｇｒａｆｔｓ）などの臓器、血清病（ｓｅｗｒｕｍ ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、および移植片対宿主病を含む）、急性膵炎、慢性膵炎、急性呼吸窮迫症候群、セザリー症候群（Ｓｅｘａｒｙ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、先天性副腎過形成、非化膿性甲状腺炎、癌に関連する高カルシウム血症、天疱瘡、ヘルペス状水泡性皮膚炎、重度の多形性紅斑、剥離性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、季節性または通年性アレルギー性鼻炎、気管支喘息、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、薬剤過敏症反応、アレルギー性結膜炎、角膜炎、帯状疱疹眼炎、虹彩炎および虹彩毛様体炎（ｏｉｒｉｄｏｃｙｃｌｉｔｉｓ）、脈絡網膜炎、視神経炎、症候性サルコイドーシス、劇症または播種性肺結核化学療法、成人の特発性血小板減少性紫斑病、成人の続発性血小板減少症、後天性（自己免疫性）溶血性貧血、限局性腸炎、自己免疫性血管炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、固形臓器移植拒絶、敗血症が挙げられる。好ましい処置には、移植拒絶、関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、１型糖尿病、喘息、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、および感染症状に伴う炎症（例えば、敗血症）の処置が含まれる。
【実施例】
【0108】
実施例１－実施例２～３の材料および方法
Ａ．材料
ａ．ランダムライブラリー
ランダムライブラリー９．０（「Ｌｉｂ９．０」）はＩＤＴから購入した。このライブラリーは、ＳＥＬＥＸ手順中にＰＣＲ増幅のためのプライマーとして作用する３’および５’の２つの２０ｎｔの特有の配列が隣接する、約１０１５個の異なる４０ｎｔ長のランダム配列の膨大なレパートリーを含む。凍結乾燥したライブラリーを超純水（ＵＰＷ）中で再構成して、最終濃度を１ｍＭとした。ランダムライブラリー配列は、５’－ＴＣＡＣＴＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＧＴＡ－４０Ｎ－ＴＡＴＴＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＴＴＡＣ－３’（配列番号２３）であり、ここでＮは、等しく表されるＴ、Ａ、Ｃ、およびＧヌクレオチドの混合物（１：１：１：１の比）から選択されるランダムオリゴヌクレオチドを表す。
ＳＥＬＥＸの事前準備
再構成後、ライブラリーは、ＨＰＬＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓ カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してサイズ排除のＱＣ検証を受けた。
ｂ．ライブラリーのプライマーおよびキャップ
２０ｎｔのプライマーとキャップのセットをＩＤＴから購入した（表４）。細胞とのインキュベーション中に、プライマー配列がランダムな４０ｎｔ配列部位と相互作用する可能性を避けるために、キャップを使用してライブラリーのプライマー部位にハイブリダイズさせた。各ＳＥＬＥＸラウンドにおける３’キャップと５’キャップの混合物（表４）を、３：１のキャップ対ライブラリー比で使用した。
フォワードプライマーは、蛍光アッセイで検出された配列増幅のために、５’部位をＣｙ－５で標識したＩＤＴから購入した。凍結乾燥したプライマーを超純水（ＵＰＷ）中で再構成して、最終濃度を１００μＭとした。
ｃ．アプタマー・フォールディング緩衝液
リン酸緩衝生理食塩水（マグネシウムとカルシウムを除く）に１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を補充した。フォールディング緩衝液をＰＶＤＦ膜フィルターユニット０．２２μｍで滅菌し、４℃で維持した。
ｄ．ＰＢＭＣ
ＰＢＭＣは、フィコール（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配遠心分離を使用して、製造業者のプロトコルに従って単離した。
凍結されたカニクイザルのＰＢＭＣ（ＮＨＰ－ＰＣ００１）は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓより購入した。
ｅ．ヒトＰａｎ Ｔ細胞のヒトＰａｎ Ｔ細胞およびＢ細胞の単離は、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９６－５３５）を用いて、製造元のプロトコルに従って行った。ヒトＰａｎ Ｂ細胞の単離は、Ｐａｎ Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－１０１－６３８）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。
ｆ．抗体、タンパク質および酵素
αＣＤ３ε－ＦＩＴＣ（カタログ番号１３０－１１３－６９０）／ＡＰＣ（カタログ番号１３０－１１３－６８７）／ＶｉｏＢｌｕｅ（カタログ番号１３０－１１４－５１９）／ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０（カタログ番号１３０－１１３－６８８）、αＣＤ４－ＦＩＴＣ（カタログ番号１３０－１１４－５３１）、αＣＤ８－ＦＩＴＣ（カタログ番号１３０－１１３－７１９）／ＰＥ－Ｖｉｏ７７０（カタログ番号１３０－１１３－１５９）および一致するアイソタイプ対照は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入した。αＣＤ３εＯＫＴ３クローン（カタログ番号３１７３０２）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。
組換えヒトＣＤ３イプシロンタンパク質（ＦｃキメラＨｉｓタグ）（ａｂ２２０５９０）、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロンタンパク質（ＦｃキメラＨｉｓタグ）（ａｂ２２０５３１）、および組換えマウスＣＤ３イプシロンタンパク質（Ｈｉｓタグ）（ａｂ２４０８４１）は、Ａｂｅａｍから購入した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプを陰性カウンター選択として使用した（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ、ＢＥ０２９７）。
プロテインＧ磁気ビーズはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（８８８４７）から購入した。
非対称ＰＣＲ（Ａ－ＰＣＲ）に使用されるＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（６００６７５）は、Ａｇｉｌｅｎｔから購入し、リアルタイムＰＣＲ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（１７２５１２４）は、ＢＩＯ－ＲＡＤから購入した。
ｇ．細胞株
ジャーカット、ＤａｕｄｉおよびＫａｓｕｍｉ－１細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）およびＫａｓｕｍｉ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７２４）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）とを補充したＲＰＭＩ－１６４０で増殖させた。すべての細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
ｇ．アプタマー
各アプタマーをフォールディング緩衝液で所望の濃度に希釈した。アプタマーを９５℃で５分間加熱した後、氷上で１０分間急冷し、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。次いで、折り畳まれたアプタマーを培地懸濁細胞に添加した。
凍結乾燥したアプタマーは、ＲＴの暗所で保管した後、１００μＭの濃度になるように１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充したＰＢＳで再構成し、暗所で－２０℃で保存した。
Ａ．材料
ａ．ランダムライブラリー
ランダムライブラリー９．０（「Ｌｉｂ９．０」）はＩＤＴから購入した。このライブラリーは、ＳＥＬＥＸ手順中にＰＣＲ増幅のためのプライマーとして作用する３’および５’の２つの２０ｎｔの特有の配列が隣接する、約１０１５個の異なる４０ｎｔ長のランダム配列の膨大なレパートリーを含む。凍結乾燥したライブラリーを超純水（ＵＰＷ）中で再構成して、最終濃度を１ｍＭとした。ランダムライブラリー配列は、５’－ＴＣＡＣＴＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＧＴＡ－４０Ｎ－ＴＡＴＴＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＴＴＡＣ－３’（配列番号２３）であり、ここでＮは、等しく表されるＴ、Ａ、Ｃ、およびＧヌクレオチドの混合物（１：１：１：１の比）から選択されるランダムオリゴヌクレオチドを表す。
ＳＥＬＥＸの事前準備
再構成後、ライブラリーは、ＨＰＬＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓ カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してサイズ排除のＱＣ検証を受けた。
ｂ．ライブラリーのプライマーおよびキャップ
２０ｎｔのプライマーとキャップのセットをＩＤＴから購入した（表４）。細胞とのインキュベーション中に、プライマー配列がランダムな４０ｎｔ配列部位と相互作用する可能性を避けるために、キャップを使用してライブラリーのプライマー部位にハイブリダイズさせた。各ＳＥＬＥＸラウンドにおける３’キャップと５’キャップの混合物（表４）を、３：１のキャップ対ライブラリー比で使用した。
フォワードプライマーは、蛍光アッセイで検出された配列増幅のために、５’部位をＣｙ－５で標識したＩＤＴから購入した。凍結乾燥したプライマーを超純水（ＵＰＷ）中で再構成して、最終濃度を１００μＭとした。
【表4】
リン酸緩衝生理食塩水（マグネシウムとカルシウムを除く）に１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を補充した。フォールディング緩衝液をＰＶＤＦ膜フィルターユニット０．２２μｍで滅菌し、４℃で維持した。
ｄ．ＰＢＭＣ
ＰＢＭＣは、フィコール（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配遠心分離を使用して、製造業者のプロトコルに従って単離した。
凍結されたカニクイザルのＰＢＭＣ（ＮＨＰ－ＰＣ００１）は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓより購入した。
ｅ．ヒトＰａｎ Ｔ細胞のヒトＰａｎ Ｔ細胞およびＢ細胞の単離は、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９６－５３５）を用いて、製造元のプロトコルに従って行った。ヒトＰａｎ Ｂ細胞の単離は、Ｐａｎ Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－１０１－６３８）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。
ｆ．抗体、タンパク質および酵素
αＣＤ３ε－ＦＩＴＣ（カタログ番号１３０－１１３－６９０）／ＡＰＣ（カタログ番号１３０－１１３－６８７）／ＶｉｏＢｌｕｅ（カタログ番号１３０－１１４－５１９）／ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０（カタログ番号１３０－１１３－６８８）、αＣＤ４－ＦＩＴＣ（カタログ番号１３０－１１４－５３１）、αＣＤ８－ＦＩＴＣ（カタログ番号１３０－１１３－７１９）／ＰＥ－Ｖｉｏ７７０（カタログ番号１３０－１１３－１５９）および一致するアイソタイプ対照は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入した。αＣＤ３εＯＫＴ３クローン（カタログ番号３１７３０２）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。
組換えヒトＣＤ３イプシロンタンパク質（ＦｃキメラＨｉｓタグ）（ａｂ２２０５９０）、組換えカニクイザルＣＤ３イプシロンタンパク質（ＦｃキメラＨｉｓタグ）（ａｂ２２０５３１）、および組換えマウスＣＤ３イプシロンタンパク質（Ｈｉｓタグ）（ａｂ２４０８４１）は、Ａｂｅａｍから購入した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプを陰性カウンター選択として使用した（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ、ＢＥ０２９７）。
プロテインＧ磁気ビーズはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（８８８４７）から購入した。
非対称ＰＣＲ（Ａ－ＰＣＲ）に使用されるＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（６００６７５）は、Ａｇｉｌｅｎｔから購入し、リアルタイムＰＣＲ ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（１７２５１２４）は、ＢＩＯ－ＲＡＤから購入した。
ｇ．細胞株
ジャーカット、ＤａｕｄｉおよびＫａｓｕｍｉ－１細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）およびＫａｓｕｍｉ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７２４）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）とを補充したＲＰＭＩ－１６４０で増殖させた。すべての細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
ｇ．アプタマー
各アプタマーをフォールディング緩衝液で所望の濃度に希釈した。アプタマーを９５℃で５分間加熱した後、氷上で１０分間急冷し、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。次いで、折り畳まれたアプタマーを培地懸濁細胞に添加した。
凍結乾燥したアプタマーは、ＲＴの暗所で保管した後、１００μＭの濃度になるように１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充したＰＢＳで再構成し、暗所で－２０℃で保存した。
【0109】
Ｂ．実験方法
ａ．結合ＳＥＬＥＸプロトコル
結合ＳＥＬＥＸは、プロテインＧ磁気ビーズに結合したＣＤ３ε－Ｆｃタンパク質（陽性選択）、プロテインＧ磁気ビーズに結合したＩｇＧ１タンパク質、またはビーズのみ（陰性選択、ラウンド３以降から開始）を使用して、１１回の連続ラウンドで実施した。
ａ．結合ＳＥＬＥＸプロトコル
結合ＳＥＬＥＸは、プロテインＧ磁気ビーズに結合したＣＤ３ε－Ｆｃタンパク質（陽性選択）、プロテインＧ磁気ビーズに結合したＩｇＧ１タンパク質、またはビーズのみ（陰性選択、ラウンド３以降から開始）を使用して、１１回の連続ラウンドで実施した。
【0110】
Ａ．ビーズ－タンパク質複合体の調製
磁気プロテインＧビーズをボルテックスし、ＰＢＳで１回洗浄した後、穏やかな振盪条件下で１００ｕｌのタンパク質とＲＴで１０分間混合した。次に、ビーズを磁石で分離し、上清を廃棄し、２％ＢＳＡを含有する３５０ｕｌのフォールディング緩衝液（１倍）でビーズを再懸濁した。
ビーズ－タンパク質複合体形成を検証するために、少量のサンプル（ＤＮＡ添加前）をＦＣブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で処置し、αＣＤ３εで染色し、フローサイトメトリーで分析した。
磁気プロテインＧビーズをボルテックスし、ＰＢＳで１回洗浄した後、穏やかな振盪条件下で１００ｕｌのタンパク質とＲＴで１０分間混合した。次に、ビーズを磁石で分離し、上清を廃棄し、２％ＢＳＡを含有する３５０ｕｌのフォールディング緩衝液（１倍）でビーズを再懸濁した。
ビーズ－タンパク質複合体形成を検証するために、少量のサンプル（ＤＮＡ添加前）をＦＣブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で処置し、αＣＤ３εで染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【0111】
Ｂ．初期ライブラリーおよび濃縮ラウンドライブラリーの調製およびフォールディング・プロトコル
ライブラリーは最初に１ｍＭに再構成される。第１ラウンドの作業濃度は１４．３μＭであったが、第２～１１ラウンドでは、０．２５～０．５μＭの濃度の濃縮ライブラリーが使用された。各ラウンドでは、以下の成分を使用した。
ライブラリーを以下のプロトコルに従ってＤＮＡフォールディングに供した：９５℃で５分間加熱した後、氷上で１０分間急速冷却し、使用するまで４℃で維持した。
ライブラリーは最初に１ｍＭに再構成される。第１ラウンドの作業濃度は１４．３μＭであったが、第２～１１ラウンドでは、０．２５～０．５μＭの濃度の濃縮ライブラリーが使用された。各ラウンドでは、以下の成分を使用した。
【表5】
【0112】
Ｃ．ＳＥＬＥＸ
濃縮ライブラリーが折り畳まれたら、３５０ｕｌの濃縮ライブラリーラウンドを３５０ｕｌのＣＤ３ε－ＦＣ－ビーズ（陽性選択ラウンド１～１１）に添加するか、またはビーズのみ／ＩｇＧ１－ビーズ複合体（カウンター選択、ラウンド３～１１）に添加した。インキュベーション時間、タンパク質量および洗浄工程はＳＥＬＥＸラウンドによって異なっていた。
陽性選択では、「陽性に結合していない」画分の上清を除去し、ＮＧＳ調製まで－２０℃に保った。洗浄のために、ビーズを磁石で沈殿させ、上清を廃棄し、１ｍｌのフォールディング緩衝液（１倍）でビーズを再懸濁した。洗浄工程の後、ビーズを３００ｕｌの超純水（ＵＰＷ）に懸濁させ、ＤＮＡを９５℃で１０分間溶出させた。最後に、磁石をビーズで沈殿させ、「陽性に結合した」上清をＰＣＲ段階のために回収した。
陰性ＳＥＬＥＸラウンドを実施した場合、３５０ｕｌの濃縮ライブラリーラウンドを、３５０ｕｌのビーズのみ／ＩｇＧビーズ複合体に添加し、回収した上清画分を陽性選択段階に進めた。「陰性に結合した」と呼ばれる陰性試料への結合画分を溶出し、ＮＧＳ調製まで－２０℃に保った。
濃縮ライブラリーが折り畳まれたら、３５０ｕｌの濃縮ライブラリーラウンドを３５０ｕｌのＣＤ３ε－ＦＣ－ビーズ（陽性選択ラウンド１～１１）に添加するか、またはビーズのみ／ＩｇＧ１－ビーズ複合体（カウンター選択、ラウンド３～１１）に添加した。インキュベーション時間、タンパク質量および洗浄工程はＳＥＬＥＸラウンドによって異なっていた。
陽性選択では、「陽性に結合していない」画分の上清を除去し、ＮＧＳ調製まで－２０℃に保った。洗浄のために、ビーズを磁石で沈殿させ、上清を廃棄し、１ｍｌのフォールディング緩衝液（１倍）でビーズを再懸濁した。洗浄工程の後、ビーズを３００ｕｌの超純水（ＵＰＷ）に懸濁させ、ＤＮＡを９５℃で１０分間溶出させた。最後に、磁石をビーズで沈殿させ、「陽性に結合した」上清をＰＣＲ段階のために回収した。
陰性ＳＥＬＥＸラウンドを実施した場合、３５０ｕｌの濃縮ライブラリーラウンドを、３５０ｕｌのビーズのみ／ＩｇＧビーズ複合体に添加し、回収した上清画分を陽性選択段階に進めた。「陰性に結合した」と呼ばれる陰性試料への結合画分を溶出し、ＮＧＳ調製まで－２０℃に保った。
【0113】
Ｄ．ＰＣＲ増幅プロトコル
溶出したＤＮＡ画分（「結合」および「非結合」）は、それぞれ、非対称ＰＣＲ（Ａ－ＰＣＲ）増幅の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、ラウンドごとに調整された。ＰＣＲ成分および増幅プロトコルをそれぞれ表６および表７に示す。
溶出したＤＮＡ画分（「結合」および「非結合」）は、それぞれ、非対称ＰＣＲ（Ａ－ＰＣＲ）増幅の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、ラウンドごとに調整された。ＰＣＲ成分および増幅プロトコルをそれぞれ表６および表７に示す。
【表6】
【表7】
【0114】
Ｅ．ＰＣＲ ｓｓＤＮＡ精製
ＰＣＲ産物を、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０１０ＢＫ）で濃縮し、ＨＬＰＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓサイズ排除カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して精製した。精製後、ＤＮＡをｓｓＤＮＡクリーンキット（ＺＹＭＯ、Ｄ７０１１）で緩衝液交換し、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して濃度を測定し、ＤＮＡを新しいＳＥＬＥＸラウンド用に希釈した。
ＰＣＲ産物を、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０１０ＢＫ）で濃縮し、ＨＬＰＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓサイズ排除カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して精製した。精製後、ＤＮＡをｓｓＤＮＡクリーンキット（ＺＹＭＯ、Ｄ７０１１）で緩衝液交換し、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して濃度を測定し、ＤＮＡを新しいＳＥＬＥＸラウンド用に希釈した。
【0115】
ｂ．リアルタイムＰＣＲによる標的タンパク質に結合するライブラリープールの評価
磁気プロテインＧビーズをボルテックスし、ＰＢＳで１回洗浄した後、穏やかな振盪条件下でタンパク質（ＣＤ３εまたはＩｇＧ１）とともにＲＴで１０分間再懸濁した。次いで、ビーズを磁石で沈殿させ、上清を廃棄し、ビーズを１２５ｕｌのフォールディング緩衝液（１倍）および２％ＢＳＡで再懸濁した。次に、ラウンド３、６、９、１１からのライブラリープール、および最初のランダムライブラリーを折り畳んだ（９５℃５分、氷１０分、４℃で維持）。１２５ｕｌのそれぞれの折り畳まれたＤＮＡライブラリーを、ビーズ－タンパク質複合体と穏やかに振盪しながら４℃で１時間混合した。インキュベーションの後、ビーズを磁石で沈殿させ、１ｍｌのフォールディング緩衝液で３回洗浄した。最後に、ＤＮＡ結合画分を１００ｕｌ ＵＰＷを用いて９５℃で１０分間溶出し、その後ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いたリアルタイムＰＣＲで鋳型として使用した。
磁気プロテインＧビーズをボルテックスし、ＰＢＳで１回洗浄した後、穏やかな振盪条件下でタンパク質（ＣＤ３εまたはＩｇＧ１）とともにＲＴで１０分間再懸濁した。次いで、ビーズを磁石で沈殿させ、上清を廃棄し、ビーズを１２５ｕｌのフォールディング緩衝液（１倍）および２％ＢＳＡで再懸濁した。次に、ラウンド３、６、９、１１からのライブラリープール、および最初のランダムライブラリーを折り畳んだ（９５℃５分、氷１０分、４℃で維持）。１２５ｕｌのそれぞれの折り畳まれたＤＮＡライブラリーを、ビーズ－タンパク質複合体と穏やかに振盪しながら４℃で１時間混合した。インキュベーションの後、ビーズを磁石で沈殿させ、１ｍｌのフォールディング緩衝液で３回洗浄した。最後に、ＤＮＡ結合画分を１００ｕｌ ＵＰＷを用いて９５℃で１０分間溶出し、その後ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いたリアルタイムＰＣＲで鋳型として使用した。
【0116】
ｃ．標的タンパク質に結合する個々のアプタマーの評価 ＨＰＬＣによるタンパク質－アプタマー結合アッセイ
１μＭの折りたたまれたＣｙ５標識アプタマーを５μＭのタンパク質と混合して最終体積を６０μｌとし、４℃または３７℃で１時間インキュベートした。次に、Ｃｙ標識アプタマーを検出するために、試料をＨＰＬＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓサイズ排除カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して５７０ｎｍの吸収で分析した。
１μＭの折りたたまれたＣｙ５標識アプタマーを５μＭのタンパク質と混合して最終体積を６０μｌとし、４℃または３７℃で１時間インキュベートした。次に、Ｃｙ標識アプタマーを検出するために、試料をＨＰＬＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓサイズ排除カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して５７０ｎｍの吸収で分析した。
【0117】
ｄ．フローサイトメトリーによる、細胞に結合する個々のアプタマーの評価
０．５～２×１０６個の細胞（単離されたＰａｎ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ｈＰＢＭＣ、カニクイザルＰＢＭＣ、ジャーカット、およびＤａｕｄｉ）を洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％ｔＲＮＡを含有する０．２～１ｍｌのフォールディング緩衝液に再懸濁した。
０．２５～１．２５ｕＭの単一のＤＮＡ候補を、ＣｐＧ’－Ｃｙ５タグ（１：１比）と混合することによって蛍光標識し、折り畳んだ（９５℃５分、氷１０分、４℃で維持）。次に、標識されたＤＮＡアプタマーを、Ｖ字型９６ウェルプレート中、穏やかな振盪条件下で細胞とともに４℃または３７℃で１時間インキュベートした（ｈＰＢＭＣおよびＣｙｎｏ ＰＢＭＣＳは、インキュベーションの最後の１５分間にαＣＤ８／αＣＤ４を添加した）。インキュベーション後、細胞をフォールディング緩衝液（１倍）で３回洗浄し、各洗浄後にフローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘ）を使用して分析した。
０．５～２×１０６個の細胞（単離されたＰａｎ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ｈＰＢＭＣ、カニクイザルＰＢＭＣ、ジャーカット、およびＤａｕｄｉ）を洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％ｔＲＮＡを含有する０．２～１ｍｌのフォールディング緩衝液に再懸濁した。
０．２５～１．２５ｕＭの単一のＤＮＡ候補を、ＣｐＧ’－Ｃｙ５タグ（１：１比）と混合することによって蛍光標識し、折り畳んだ（９５℃５分、氷１０分、４℃で維持）。次に、標識されたＤＮＡアプタマーを、Ｖ字型９６ウェルプレート中、穏やかな振盪条件下で細胞とともに４℃または３７℃で１時間インキュベートした（ｈＰＢＭＣおよびＣｙｎｏ ＰＢＭＣＳは、インキュベーションの最後の１５分間にαＣＤ８／αＣＤ４を添加した）。インキュベーション後、細胞をフォールディング緩衝液（１倍）で３回洗浄し、各洗浄後にフローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘ）を使用して分析した。
【0118】
ｅ．競合的ＣＤ３イプシロンエピトープ結合アッセイ
０．２５×１０６個のジャーカット細胞を１回洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％ｔＲＮＡを含有するフォールディング緩衝液（１倍）に再懸濁し、１：２０希釈のαＣＤ３クローンＯＫＴ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３１７３０２）またはαＣＤ３クローンＲＥＡ６１３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１１４－５１９）または緩衝液とともに１５分間インキュベートした。次に、０．２５ｕＭの折り畳まれたＣｙ５標識アプタマーを、穏やかな振盪条件下、３７℃で１時間、細胞とともにインキュベートした。インキュベーション後、細胞をフォールディング緩衝液（１倍）で３回洗浄し、各洗浄後にフローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘ）を使用して分析した。
０．２５×１０６個のジャーカット細胞を１回洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％ｔＲＮＡを含有するフォールディング緩衝液（１倍）に再懸濁し、１：２０希釈のαＣＤ３クローンＯＫＴ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３１７３０２）またはαＣＤ３クローンＲＥＡ６１３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１１４－５１９）または緩衝液とともに１５分間インキュベートした。次に、０．２５ｕＭの折り畳まれたＣｙ５標識アプタマーを、穏やかな振盪条件下、３７℃で１時間、細胞とともにインキュベートした。インキュベーション後、細胞をフォールディング緩衝液（１倍）で３回洗浄し、各洗浄後にフローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘ）を使用して分析した。
【0119】
ｆ．ＣＳ６有効濃度５０（ＥＣ５０）の定量化
５×１０４個のジャーカット細胞を洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％ｔＲＮＡを含有する１倍のフォールディング緩衝液に再懸濁した。０．１～８０ｎＭのＣＳ６アプタマーを、ＣｐＧ’－Ｃｙ５タグ（１：１比）で標識し、折り畳んだ（９５０℃５分、氷１０分、４０℃で維持）。次に、ＤＮＡアプタマーを細胞と混合し、穏やかな振盪条件下、Ｖ字型９６ウェルプレート中、３７０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をフォールディング緩衝液（１倍）で２回洗浄し、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘ）によって分析した。
５×１０４個のジャーカット細胞を洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％ｔＲＮＡを含有する１倍のフォールディング緩衝液に再懸濁した。０．１～８０ｎＭのＣＳ６アプタマーを、ＣｐＧ’－Ｃｙ５タグ（１：１比）で標識し、折り畳んだ（９５０℃５分、氷１０分、４０℃で維持）。次に、ＤＮＡアプタマーを細胞と混合し、穏やかな振盪条件下、Ｖ字型９６ウェルプレート中、３７０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をフォールディング緩衝液（１倍）で２回洗浄し、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦｌｅｘ）によって分析した。
【0120】
実施例２－結合ＳＥＬＥＸによるＣＤ３標的化アプタマーの同定
ＣＤ３結合アプタマーの選択は本明細書に記載されている。Ｔ細胞を標的とするアプタマーは、それぞれ組換えＣＤ３ｅタンパク質と組換えタンパク質＋Ｔ細胞を使用した、結合ＳＥＬＥＸおよびハイブリッド結合細胞－ＳＥＬＥＸによって同定された。最終的なリードは、その標的タンパク質およびＴ細胞への結合について特徴づけられた。
ＣＤ３結合アプタマーの選択は本明細書に記載されている。Ｔ細胞を標的とするアプタマーは、それぞれ組換えＣＤ３ｅタンパク質と組換えタンパク質＋Ｔ細胞を使用した、結合ＳＥＬＥＸおよびハイブリッド結合細胞－ＳＥＬＥＸによって同定された。最終的なリードは、その標的タンパク質およびＴ細胞への結合について特徴づけられた。
【0121】
本開示は、新規用途においてＳＥＬＥＸ方法論を使用して、１０１５個の潜在的アプタマーのランダムライブラリーからのＴ細胞係合アプタマーの同定および特徴付けを記載する。このアプタマー部分は、二重特異性治療実体の一部として、異なる患者間で一定となるように設計された。
【0122】
結合ＳＥＬＥＸは、組換えヒトＣＤ３イプシロンタンパク質Ｆｃキメラを使用して合計１１ラウンド実施した。カウンター陰性選択では、磁気ビーズまたは組換えタンパク質のＦｃ成分（図１）に非特異的に結合するすべてのアプタマーを取り除くために、ビーズのみ（ラウンド１～６）またはヒトＩｇＧ１にコンジュゲートしたビーズ（ラウンド７～１１）のいずれかを使用した。ラウンド１１のＳＥＬＥＸの後、濃縮されたアプタマーライブラリーを、配列決定および、特定のアルゴリズムによる分析に供する。単一候補が特定され、検証が行われる。
【0123】
図１Ｂは、ＳＥＬＥＸの段階を示す：カウンター選択は、（１）プロテインＧ磁気ビーズから始まり、（２）これをＩｇＧ１にコンジュゲートさせ、（３）前の段階からのＤＮＡアプタマーライブラリープールとともにインキュベートする。次に、（４）非結合ＤＮＡアプタマーをポジティブ選択のために収集し、（５）ここではＦＣ－ＣＤ３εにコンジュゲートしたビーズとともにインキュベートし、結合画分は、（６）次のラウンドのためにＰＣＲ増幅およびＨＰＬＣ精製を受ける。
【0124】
１．ＳＥＬＥＸラウンド比較アッセイ
オリジナルのランダムライブラリー「Ｎｏ．９．０」とラウンド３、６、９、および１１から溶出したライブラリープールを、ｈＣＤ３ａへの結合について試験した。Ｂｃａｄｓ－Ｆｃ－ＣＤ３ε複合体と共に４℃で１時間インキュベートした後、Ｃｙ－５で標識した５’プライマーを使用して、ＰＣＲによって各ラウンドを増幅した。陰性対照として、変異体プールをビーズ－ＩｇＧ１複合体とインキュベートした（図２Ａ）。標的タンパク質で沈殿した増幅ＤＮＡの量は、結合ＳＥＬＥＸで使用されたランダムな初期ライブラリーよりもラウンド６、９および１１のライブラリーではるかに高いことが分かった。結果は、初期ライブラリーと比較して、ラウンド６の時点で特異的かつ強い濃縮を示した。さらに、ラウンド１１で観察された特異的結合には別の増加があった。
組換えＣＤ３タンパク質を使用したラウンド間濃縮を実証した後、本発明者らは、そのような濃縮が全細胞の状況でも観察されるかどうかを試験した。ジャーカットＴ細胞を同じＣｙ５タグ付きライブラリープールとともにインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。陰性対照として、単離されたＰａｎ Ｂ細胞を使用した（図２Ｂ）。
タンパク質データと同様に、標的細胞の特異的かつ強力なラウンド間濃縮が実証された。
オリジナルのランダムライブラリー「Ｎｏ．９．０」とラウンド３、６、９、および１１から溶出したライブラリープールを、ｈＣＤ３ａへの結合について試験した。Ｂｃａｄｓ－Ｆｃ－ＣＤ３ε複合体と共に４℃で１時間インキュベートした後、Ｃｙ－５で標識した５’プライマーを使用して、ＰＣＲによって各ラウンドを増幅した。陰性対照として、変異体プールをビーズ－ＩｇＧ１複合体とインキュベートした（図２Ａ）。標的タンパク質で沈殿した増幅ＤＮＡの量は、結合ＳＥＬＥＸで使用されたランダムな初期ライブラリーよりもラウンド６、９および１１のライブラリーではるかに高いことが分かった。結果は、初期ライブラリーと比較して、ラウンド６の時点で特異的かつ強い濃縮を示した。さらに、ラウンド１１で観察された特異的結合には別の増加があった。
組換えＣＤ３タンパク質を使用したラウンド間濃縮を実証した後、本発明者らは、そのような濃縮が全細胞の状況でも観察されるかどうかを試験した。ジャーカットＴ細胞を同じＣｙ５タグ付きライブラリープールとともにインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。陰性対照として、単離されたＰａｎ Ｂ細胞を使用した（図２Ｂ）。
タンパク質データと同様に、標的細胞の特異的かつ強力なラウンド間濃縮が実証された。
【0125】
２．ＮＧＳ結果
ラウンド８、９、１０、および１１で溶出した濃縮ライブラリー（「結合」）、ならびに陽性選択ラウンドの上清（「非結合」）を、ハイスループットＮＧＳ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００を使用した配列決定に供した。
配列決定後、下流結合アッセイに単一候補を割り当てるアルゴリズムによってデータを解析した。このアルゴリズムは、統計的推定量、試験、およびメトリクスを利用する。
最後のラウンドで最も豊富だった上位１００のアプタマーの平均Ｐ陽性スコアとＰ陰性スコアをプロットし（図３Ａ）、＃６で上述したように有意な結合対非結合比（ｐ＜０．０５；ポアソン検定、すべてのラウンドで一致）をもつアプタマーを強調表示し、実験的検証に選択した（ＣＤ３－ＣＳ６－９、配列番号１～５と呼ぶ）。高い平均Ｐ陽性値（Ｐ陽性＞０．５）を有するさらに９つのアプタマーに識別子（ＣＤ３＿Ｐｐｏｓ１０～１８ 配列番号６～１４）が割り当てられた。同定されたＣＤ３結合アプタマーを表８に列挙する。
次に、高い平均Ｐ陽性値（Ｐ陽性＞０．５）を有する１４個のアプタマー（表８参照）に多重配列アラインメントを行い、共通モチーフを見出した（図３Ｂ上側）。比較すると、強調表示された候補（ＣＳ６～９）も整列され、より堅牢なモチーフが発見された（図３Ｂ下側）。さらに、解析ソフト（ｍｆｏｌｄ、ＮＵＰＡＣＫ）により、構造予測解析を行った（図３Ｃ）。この解析は、候補が主にモチーフ領域の周りで複雑な二次構造に折り畳まれることを実証した。この結果を受け、最適化の試みとして、ＣＳ＿ＣＤ８で提示されたモチーフの周りの二次構造の形成に無関係と思われる最初の９ヌクレオチド（ＣＤ３＿ＣＳ８ｃｕｔと表記）をトリミングすることによってＣＤ３ ＣＳ８をさらに編集した。上位５つの候補は、負のΔＧスコアを有することがさらに確認され、個々の結合アッセイに選択された。
上記の結合ＳＥＬＥＸに加えて、プロセスに全細胞のＳＥＬＥＸラウンドも含まれるハイブリッド方法論が実施された。
ラウンド８、９、１０、および１１で溶出した濃縮ライブラリー（「結合」）、ならびに陽性選択ラウンドの上清（「非結合」）を、ハイスループットＮＧＳ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００を使用した配列決定に供した。
配列決定後、下流結合アッセイに単一候補を割り当てるアルゴリズムによってデータを解析した。このアルゴリズムは、統計的推定量、試験、およびメトリクスを利用する。
最後のラウンドで最も豊富だった上位１００のアプタマーの平均Ｐ陽性スコアとＰ陰性スコアをプロットし（図３Ａ）、＃６で上述したように有意な結合対非結合比（ｐ＜０．０５；ポアソン検定、すべてのラウンドで一致）をもつアプタマーを強調表示し、実験的検証に選択した（ＣＤ３－ＣＳ６－９、配列番号１～５と呼ぶ）。高い平均Ｐ陽性値（Ｐ陽性＞０．５）を有するさらに９つのアプタマーに識別子（ＣＤ３＿Ｐｐｏｓ１０～１８ 配列番号６～１４）が割り当てられた。同定されたＣＤ３結合アプタマーを表８に列挙する。
【表8】
上記の結合ＳＥＬＥＸに加えて、プロセスに全細胞のＳＥＬＥＸラウンドも含まれるハイブリッド方法論が実施された。
【表9】
【0126】
実施例３－個々のＣＤ３結合アプタマーの検証
ａ．アプタマー候補は、ＨＰＬＣを介してヒトＣＤ３ａへの結合を実証する
上位５つの候補（ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８、ＣＳ８ｃ、およびＣＳ９、配列番号１～５）を、５（５’）ホスホロチオエート化ＣｐＧモチーフを用いて合成し、ＨＰＬＣサイズ排除カラムを介してヒトＣＤ３ε（ｈＣＤ３ε）結合についてアッセイした。この方法では、アプタマーをＣｐＧ部位に相補的なＣｙ５配列で標識した（Ｃｙ５－ＣｐＧ’）。次に、折り畳まれて標識された候補を、ＣＤ３ε－組換えタンパク質とともに、または陰性対照ＩｇＧ１とともにインキュベートし（３７℃および４℃で１時間）、ＨＰＬＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓサイズ排除カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって５７０ｎｍの吸収で分析する。タンパク質が結合すると、アプタマー－タンパク質複合体は遊離アプタマーよりも大きな質量を有し、その結果、カラムでの保持時間（ＲＴ）が短くなることが予想される。逆に、非結合アプタマーの場合、タンパク質の存在下でのＲＴは、タンパク質の非存在下でのＲＴと同じになる。対照として、ポリＴ配列を使用した。５つの候補はすべて、様々なレベルでＣＤ３イプシロン標的タンパク質への結合を実証した（図４）。
ａ．アプタマー候補は、ＨＰＬＣを介してヒトＣＤ３ａへの結合を実証する
上位５つの候補（ＣＳ６、ＣＳ７、ＣＳ８、ＣＳ８ｃ、およびＣＳ９、配列番号１～５）を、５（５’）ホスホロチオエート化ＣｐＧモチーフを用いて合成し、ＨＰＬＣサイズ排除カラムを介してヒトＣＤ３ε（ｈＣＤ３ε）結合についてアッセイした。この方法では、アプタマーをＣｐＧ部位に相補的なＣｙ５配列で標識した（Ｃｙ５－ＣｐＧ’）。次に、折り畳まれて標識された候補を、ＣＤ３ε－組換えタンパク質とともに、または陰性対照ＩｇＧ１とともにインキュベートし（３７℃および４℃で１時間）、ＨＰＬＣ ＰｒｏＳＥＣ ３００Ｓサイズ排除カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって５７０ｎｍの吸収で分析する。タンパク質が結合すると、アプタマー－タンパク質複合体は遊離アプタマーよりも大きな質量を有し、その結果、カラムでの保持時間（ＲＴ）が短くなることが予想される。逆に、非結合アプタマーの場合、タンパク質の存在下でのＲＴは、タンパク質の非存在下でのＲＴと同じになる。対照として、ポリＴ配列を使用した。５つの候補はすべて、様々なレベルでＣＤ３イプシロン標的タンパク質への結合を実証した（図４）。
【0127】
ｂ．アプタマー候補はジャーカットＴ細胞株および初代ヒトＰａｎ Ｔ細胞への特異的結合をフローサイトメトリーによって実証する。
ＣＳ６、ＣＳ７およびＣＳ８ｃ候補がＣＤ３ｅ組換えタンパク質への特異的結合を示した後、未変性の全細胞の状況でＴ細胞表面でのそれらの標的への結合について、これらをフローサイトメトリーによってアッセイした。この目的のために、ＴＣＲ発現を示すことが以前に報告されているジャーカットＴリンパ球細胞株（急性Ｔ細胞白血病、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）を使用した。細胞を用いた最初の結合アッセイは、４℃で１時間行った。陰性対照として、骨髄芽球Ｋａｓｕｍｉ－１細胞株を使用した（急性骨髄芽球性白血病、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７２４）。３つの候補はすべて、対照細胞と比較して標的細胞に示差的に結合することが見出されたが、ＣＳ６およびＣＳ７はＣＳ８ｃよりも良好な特異性を示した。（図５Ａ）
次に、生理学的条件をよりよく模倣するために、３つの候補を３７℃でジャーカットへの結合についてアッセイした。ここでは、陰性対照として、Ｂリンパ芽球Ｄａｕｄｉ細胞株（リンパ芽球、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）を使用した（図５Ｂ）。この実験では、ＣＳ６が最も高い結合レベルを示したときに、３つの候補が標的細胞に結合した。
ＣＳ６を、さらなる調査および特徴づけのために選択した。それは、ブロッキング条件下、３７℃で正常な初代Ｐａｎ Ｔ細胞に結合し、Ｐａｎ Ｂ細胞には結合しないことが分かった（図５Ｃ）。
続いて、ＣＳ６有効濃度５０（ＥＣ５０）を評価した。－Ｃｙ５標識アプタマーの段階希釈を、Ｊｕｒｋａｔ細胞とともに３７℃で１時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより結合について評価した（図６）。計算されたＥＣ５０値は１９．６５ｎＭであった。
ＣＳ６、ＣＳ７およびＣＳ８ｃ候補がＣＤ３ｅ組換えタンパク質への特異的結合を示した後、未変性の全細胞の状況でＴ細胞表面でのそれらの標的への結合について、これらをフローサイトメトリーによってアッセイした。この目的のために、ＴＣＲ発現を示すことが以前に報告されているジャーカットＴリンパ球細胞株（急性Ｔ細胞白血病、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）を使用した。細胞を用いた最初の結合アッセイは、４℃で１時間行った。陰性対照として、骨髄芽球Ｋａｓｕｍｉ－１細胞株を使用した（急性骨髄芽球性白血病、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７２４）。３つの候補はすべて、対照細胞と比較して標的細胞に示差的に結合することが見出されたが、ＣＳ６およびＣＳ７はＣＳ８ｃよりも良好な特異性を示した。（図５Ａ）
次に、生理学的条件をよりよく模倣するために、３つの候補を３７℃でジャーカットへの結合についてアッセイした。ここでは、陰性対照として、Ｂリンパ芽球Ｄａｕｄｉ細胞株（リンパ芽球、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）を使用した（図５Ｂ）。この実験では、ＣＳ６が最も高い結合レベルを示したときに、３つの候補が標的細胞に結合した。
ＣＳ６を、さらなる調査および特徴づけのために選択した。それは、ブロッキング条件下、３７℃で正常な初代Ｐａｎ Ｔ細胞に結合し、Ｐａｎ Ｂ細胞には結合しないことが分かった（図５Ｃ）。
続いて、ＣＳ６有効濃度５０（ＥＣ５０）を評価した。－Ｃｙ５標識アプタマーの段階希釈を、Ｊｕｒｋａｔ細胞とともに３７℃で１時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより結合について評価した（図６）。計算されたＥＣ５０値は１９．６５ｎＭであった。
【0128】
実施例４－実施例５の材料および方法
Ａ．材料
ａ．動物
７～８週齢の雌ＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。
ｂ．細胞株および末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）
ＨＣＴ－１１６ヒト結腸直腸細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））をＡＴＣＣの説明書に従って培養した。
ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）を製造業者のプロトコルに従って使用し、健康なドナーの末梢血からフィコール密度勾配遠心分離によって単離された。単離したＰＢＭＣをＦＢＳ＋２０％ＤＭＳＯの培地で凍結させた。
細胞生存力試験とリンパ球部分集団（ＤｕｒａＣｌｏｎｅ）および活性化マーカーの免疫表現型検査は、単離後および注射日の解凍時に実施した。
ｃ．アプタマー
癌標的化アプタマーアームである可変鎖１２（ＶＳ１２、配列番号２２）は、ＨＣＴ－１１６結腸癌細胞株を標的細胞として使用して、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ１９／０１０８２号に記載されているような機能的濃縮プロセスから誘導した。ＣＳ６Ｔ細胞エンゲージャー配列（配列番号２１）は、実施例２～３に記載されるようなＳＥＬＥＸ結合プロセスから誘導した。アプタマーを１つのオリゴヌクレオチド鎖として合成し、カラム精製した。相補的なＣｐＧモチーフ配列を、癌標的化アプタマーと免疫エンゲージャーアプタマーの両方に付加して、ハイブリダイゼーションと二重特異性アプタマーコンジュゲートの生成を可能にした。
非特異的なポリＴオリゴヌクレオチドを対照として使用した。２本のポリＴ鎖もハイブリダイズして二重鎖を形成したが、この場合、ハイブリダイゼーションドメインは機能性ドメインではない。全長配列を表１０に示す。
ｃ．製剤緩衝液／ビヒクル
１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（マグネシウムとカルシウムを除く）。フォールティング緩衝液は、濾過によって滅菌され、直ちに使用される。
Ａ．材料
ａ．動物
７～８週齢の雌ＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。
ｂ．細胞株および末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）
ＨＣＴ－１１６ヒト結腸直腸細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））をＡＴＣＣの説明書に従って培養した。
ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）を製造業者のプロトコルに従って使用し、健康なドナーの末梢血からフィコール密度勾配遠心分離によって単離された。単離したＰＢＭＣをＦＢＳ＋２０％ＤＭＳＯの培地で凍結させた。
細胞生存力試験とリンパ球部分集団（ＤｕｒａＣｌｏｎｅ）および活性化マーカーの免疫表現型検査は、単離後および注射日の解凍時に実施した。
ｃ．アプタマー
癌標的化アプタマーアームである可変鎖１２（ＶＳ１２、配列番号２２）は、ＨＣＴ－１１６結腸癌細胞株を標的細胞として使用して、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ１９／０１０８２号に記載されているような機能的濃縮プロセスから誘導した。ＣＳ６Ｔ細胞エンゲージャー配列（配列番号２１）は、実施例２～３に記載されるようなＳＥＬＥＸ結合プロセスから誘導した。アプタマーを１つのオリゴヌクレオチド鎖として合成し、カラム精製した。相補的なＣｐＧモチーフ配列を、癌標的化アプタマーと免疫エンゲージャーアプタマーの両方に付加して、ハイブリダイゼーションと二重特異性アプタマーコンジュゲートの生成を可能にした。
非特異的なポリＴオリゴヌクレオチドを対照として使用した。２本のポリＴ鎖もハイブリダイズして二重鎖を形成したが、この場合、ハイブリダイゼーションドメインは機能性ドメインではない。全長配列を表１０に示す。
【表10】
１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（マグネシウムとカルシウムを除く）。フォールティング緩衝液は、濾過によって滅菌され、直ちに使用される。
【0129】
Ｂ．実験方法
ａ．二重特異性個別化アプタマー製剤
製剤化手順には以下のステップが含まれる；
１．再構成
それぞれの鎖を製剤緩衝液中で所望の濃度に希釈／再構成する（凍結乾燥する場合）。
２．アプタマーの折り畳み：
ａ．鎖を９５℃で５分間加熱する。
ｂ．氷上で１０分間急冷する。
ｃ．ＲＴで１０分間インキュベートする。
３．二重特異性実体の形成
ｂ．次いで、２本鎖（癌標的化可変鎖および免疫エンゲージャー鎖）を一緒に混合し、回転装置内でＲＴで３０分間インキュベートする。
ａ．二重特異性個別化アプタマー製剤
製剤化手順には以下のステップが含まれる；
１．再構成
それぞれの鎖を製剤緩衝液中で所望の濃度に希釈／再構成する（凍結乾燥する場合）。
２．アプタマーの折り畳み：
ａ．鎖を９５℃で５分間加熱する。
ｂ．氷上で１０分間急冷する。
ｃ．ＲＴで１０分間インキュベートする。
３．二重特異性実体の形成
ｂ．次いで、２本鎖（癌標的化可変鎖および免疫エンゲージャー鎖）を一緒に混合し、回転装置内でＲＴで３０分間インキュベートする。
【0130】
異種移植モデルの導入および介入
雌ＮＳＧマウスに、２×１０６個のＨＣＴ－１１６腫瘍細胞と０．５×１０６個の解凍ヒトＰＢＭＣをＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）で１：４の割合で混和したものを、マウスの右脇腹に皮下（ＳＣ）注射した。７日目に、同じドナーのＰＢＭＣのＩＶ再ブーストを行い、８×１０５細胞を各マウスに注射した。
ＳＣ介入のレジメンを表１１に詳述する。
雌ＮＳＧマウスに、２×１０６個のＨＣＴ－１１６腫瘍細胞と０．５×１０６個の解凍ヒトＰＢＭＣをＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）で１：４の割合で混和したものを、マウスの右脇腹に皮下（ＳＣ）注射した。７日目に、同じドナーのＰＢＭＣのＩＶ再ブーストを行い、８×１０５細胞を各マウスに注射した。
ＳＣ介入のレジメンを表１１に詳述する。
【表11】
【0131】
ａ．腫瘍体積の評価方法
腫瘍体積の変化を週に３回ノギスによってモニターした。腫瘍体積は、を以下のように推定した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２
腫瘍体積の変化を週に３回ノギスによってモニターした。腫瘍体積は、を以下のように推定した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２
【0132】
ｂ．統計的手法
すべての定量的データは平均±ＳＥＭとして表される。群間の差の有意性を評価するために、必要に応じて、分散分析またはスチューデントｔ検定のいずれかを使用した。
すべての定量的データは平均±ＳＥＭとして表される。群間の差の有意性を評価するために、必要に応じて、分散分析またはスチューデントｔ検定のいずれかを使用した。
【0133】
実施例５－新規な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの効果に関する概念実証（ＰＯＣ）
１．二重特異性コンジュゲートアプタマーの代表的な構造
いくつかの態様では、本明細書に記載の個別化癌治療薬は、３つの別個のドメインを有するヘテロ二量体構造で構成される（図７）。
いくつかの実施形態では、二重特異性個別化コンジュゲートアプタマーは、患者の癌細胞によって提示される特異的ネオ抗原および表面分子を標的とし、癌細胞の直接的致死性ならびに免疫関連応答の両方を促進するように設計されている。いくつかの実施形態では、有効性は、以下に記載されるように、単一の治療実体に組み込まれた３つの別個の作用様式（ＭｏＡ）によって達成される。
１．二重特異性コンジュゲートアプタマーの代表的な構造
いくつかの態様では、本明細書に記載の個別化癌治療薬は、３つの別個のドメインを有するヘテロ二量体構造で構成される（図７）。
いくつかの実施形態では、二重特異性個別化コンジュゲートアプタマーは、患者の癌細胞によって提示される特異的ネオ抗原および表面分子を標的とし、癌細胞の直接的致死性ならびに免疫関連応答の両方を促進するように設計されている。いくつかの実施形態では、有効性は、以下に記載されるように、単一の治療実体に組み込まれた３つの別個の作用様式（ＭｏＡ）によって達成される。
【0134】
Ａ．可変鎖：個別化されたアプタマーによる癌細胞の直接殺傷
いくつかの実施形態では、この部分は、１０１５個の潜在的なリードのランダムプールから開始するプロセスを通じて選択され、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ１９／０１０８２号に詳細に記載されている。手短に言えば、個別化プロセスは、健康な細胞に害を及ぼさずに癌細胞の標的化殺傷を最も促進するアプタマーを同定するように設計されている。患者特異的鎖は、結合および機能強化プロセス（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＳＥＬＥＸ）を実施し、ハイスループット顕微鏡法で候補をスクリーニングし、選択性試験を含めてオフターゲット効果を除外することを試みながら、上位候補の活性および特異性を確認することによって同定される。
いくつかの実施形態では、この部分は、１０１５個の潜在的なリードのランダムプールから開始するプロセスを通じて選択され、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ１９／０１０８２号に詳細に記載されている。手短に言えば、個別化プロセスは、健康な細胞に害を及ぼさずに癌細胞の標的化殺傷を最も促進するアプタマーを同定するように設計されている。患者特異的鎖は、結合および機能強化プロセス（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＳＥＬＥＸ）を実施し、ハイスループット顕微鏡法で候補をスクリーニングし、選択性試験を含めてオフターゲット効果を除外することを試みながら、上位候補の活性および特異性を確認することによって同定される。
【0135】
Ｂ．定常鎖：Ｔ細胞エンゲージャーアプタマー
いくつかの実施形態では、このアプタマーアームはＴ細胞を標的とし、免疫細胞と係合することによって標的癌細胞の溶解を媒介するように設計されている。
いくつかの実施形態では、このアプタマーアームはＴ細胞を標的とし、免疫細胞と係合することによって標的癌細胞の溶解を媒介するように設計されている。
【0136】
Ｃ．ＴＬＲ９－アゴニスト活性をもつＣｐＧモチーフ
二重特異性構造の２本のアプタマーアームは、相補的配列の一本鎖オーバーハングの核酸－塩基ハイブリダイゼーションによって互いに架橋される。このハイブリダイゼーションドメインは、ＣｐＧに富み、ＴＬＲ９媒介性抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激および腫瘍抗原の取り込み増加を誘導するように設計されている。刺激されたＡＰＣはその後、腫瘍排出リンパ節に移動し、貪食された腫瘍抗原を細胞傷害性Ｔリンパ球に交差提示し、適応的な全身性の抗腫瘍免疫応答をもたらす。
二重特異性構造の２本のアプタマーアームは、相補的配列の一本鎖オーバーハングの核酸－塩基ハイブリダイゼーションによって互いに架橋される。このハイブリダイゼーションドメインは、ＣｐＧに富み、ＴＬＲ９媒介性抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激および腫瘍抗原の取り込み増加を誘導するように設計されている。刺激されたＡＰＣはその後、腫瘍排出リンパ節に移動し、貪食された腫瘍抗原を細胞傷害性Ｔリンパ球に交差提示し、適応的な全身性の抗腫瘍免疫応答をもたらす。
【0137】
２．ＨＣＴ１１６腫瘍異種移植モデルにおけるＣＤ３を標的とする二重特異性アプタマーコンジュゲートのインビボＰＯＣ
ＨＣＴ－１１６細胞およびヒトＰＢＭＣミックス（Ｅ：Ｔ １：４比）を混合方式で共注射し、続いて二重特異性個別化アプタマー（ＣＳ６－ＶＳ１２、配列番号２１および２２）、ポリＴ二重鎖またはビヒクルを投与した。
図８Ａは、ＨＣＴ１１６腫瘍増殖動態を説明する。二重特異性アプタマーＣＳ６－ＶＳ１２による処置では、合計１０回の介入後にＨＣＴ１１６腫瘍の増殖が大幅に減弱したが、非特異的オリゴヌクレオチドポリＴによる処置では減弱しなかった。３０日目の時点で、エンドポイントの倫理的量のためにマウスは屠殺され始めた。
個々のマウスの腫瘍体積は、４１日目（最後の介入から３１日後）まで表示される。腫瘍増殖の阻害は、全てのＣＳ６－ＶＳ１２処置マウスで実証された（図８Ｂ）。
腫瘍増殖の低下は、ビヒクルと比較して、二重特異性処置群の生存期間の利益に変換された。
図９は、実験の４１日目まで、ＣＳ６－ＶＳ１２群の８匹のマウスのうち８匹が生存したのに対し、ビヒクル群およびポリＴ群ではそれぞれ９匹のマウスのうち２匹（２２．２％）および８匹のマウスのうち３匹（３７．５％）であったことを示す。
総合すると、このモデルのインビボ結果は、ＣＳ６－ＶＳ１２処置の有効性および効力を示している。
ＨＣＴ－１１６細胞およびヒトＰＢＭＣミックス（Ｅ：Ｔ １：４比）を混合方式で共注射し、続いて二重特異性個別化アプタマー（ＣＳ６－ＶＳ１２、配列番号２１および２２）、ポリＴ二重鎖またはビヒクルを投与した。
図８Ａは、ＨＣＴ１１６腫瘍増殖動態を説明する。二重特異性アプタマーＣＳ６－ＶＳ１２による処置では、合計１０回の介入後にＨＣＴ１１６腫瘍の増殖が大幅に減弱したが、非特異的オリゴヌクレオチドポリＴによる処置では減弱しなかった。３０日目の時点で、エンドポイントの倫理的量のためにマウスは屠殺され始めた。
個々のマウスの腫瘍体積は、４１日目（最後の介入から３１日後）まで表示される。腫瘍増殖の阻害は、全てのＣＳ６－ＶＳ１２処置マウスで実証された（図８Ｂ）。
腫瘍増殖の低下は、ビヒクルと比較して、二重特異性処置群の生存期間の利益に変換された。
図９は、実験の４１日目まで、ＣＳ６－ＶＳ１２群の８匹のマウスのうち８匹が生存したのに対し、ビヒクル群およびポリＴ群ではそれぞれ９匹のマウスのうち２匹（２２．２％）および８匹のマウスのうち３匹（３７．５％）であったことを示す。
総合すると、このモデルのインビボ結果は、ＣＳ６－ＶＳ１２処置の有効性および効力を示している。
【0138】
実施例６－二重特異性個別化アプタマー
Ｆ．二重特異性個別化アプタマーの代表的構造
いくつかの態様では、本明細書に記載の個別化癌治療薬は、３つの別個のドメインを有するヘテロ二量体構造で構成される（図７）。
ある特定の態様では、本明細書に記載のプラットフォームは、患者の腫瘍の新鮮な試料組織に反映されるように、それぞれの患者が提示する固有の一連の症状および潜在的な薬物標的に対して最適化された、個別化された解決策で患者を処置する、患者に合わせた癌治療薬が得られるように設計されている。いくつかの実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは、患者の癌細胞によって提示される特異的ネオ抗原および表面分子を標的とし、癌細胞の直接的致死性ならびに免疫関連応答の両方を促進するように設計されている。いくつかの実施形態では、有効性は、以下に記載されるように、単一の治療実体に組み込まれた３つの別個の作用様式（ＭｏＡ）によって達成される。
Ｆ．二重特異性個別化アプタマーの代表的構造
いくつかの態様では、本明細書に記載の個別化癌治療薬は、３つの別個のドメインを有するヘテロ二量体構造で構成される（図７）。
ある特定の態様では、本明細書に記載のプラットフォームは、患者の腫瘍の新鮮な試料組織に反映されるように、それぞれの患者が提示する固有の一連の症状および潜在的な薬物標的に対して最適化された、個別化された解決策で患者を処置する、患者に合わせた癌治療薬が得られるように設計されている。いくつかの実施形態では、二重特異性個別化アプタマーは、患者の癌細胞によって提示される特異的ネオ抗原および表面分子を標的とし、癌細胞の直接的致死性ならびに免疫関連応答の両方を促進するように設計されている。いくつかの実施形態では、有効性は、以下に記載されるように、単一の治療実体に組み込まれた３つの別個の作用様式（ＭｏＡ）によって達成される。
【0139】
１．個別化鎖：個別化アプタマーによる癌細胞の直接殺傷
いくつかの実施形態では、この部分は、１０１５個の潜在的なリードのランダムプールから開始するプロセスを通じて選択され、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ１９／０１０８２号に詳細に記載されている。手短に言えば、個別化プロセスは、健康な細胞に害を及ぼさずに癌細胞の標的化殺傷を最も促進するアプタマーを同定するように設計されている。患者特異的鎖は、結合および機能強化プロセス（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＳＥＬＥＸ）を実施し、ハイスループット顕微鏡法で候補をスクリーニングし、選択性試験を含めてオフターゲット効果を除外することを試みながら、上位候補の活性および特異性を確認することによって同定される。（図１０Ａ）。
いくつかの実施形態では、この部分は、１０１５個の潜在的なリードのランダムプールから開始するプロセスを通じて選択され、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ１９／０１０８２号に詳細に記載されている。手短に言えば、個別化プロセスは、健康な細胞に害を及ぼさずに癌細胞の標的化殺傷を最も促進するアプタマーを同定するように設計されている。患者特異的鎖は、結合および機能強化プロセス（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＳＥＬＥＸ）を実施し、ハイスループット顕微鏡法で候補をスクリーニングし、選択性試験を含めてオフターゲット効果を除外することを試みながら、上位候補の活性および特異性を確認することによって同定される。（図１０Ａ）。
【0140】
２．免疫調節鎖：ＴまたはＮＫ細胞媒介性細胞毒性による癌細胞の溶解
いくつかの実施形態では、このアプタマーアームは、本明細書に開示されるＣＤ３結合アプタマー（例えば、配列番号１～２１のいずれか１つの配列を含む）である（図１０Ｂ）。この免疫調節アームは、異なる患者間で共有されるように設計され得る。
いくつかの実施形態では、このアプタマーアームは、本明細書に開示されるＣＤ３結合アプタマー（例えば、配列番号１～２１のいずれか１つの配列を含む）である（図１０Ｂ）。この免疫調節アームは、異なる患者間で共有されるように設計され得る。
【0141】
３．ＴＬＲ９－アゴニスト活性をもつＣｐＧモチーフ
いくつかの実施形態では、二重特異性構造の２本のアプタマーアームは、相補的配列の一本鎖オーバーハングの核酸－塩基ハイブリダイゼーションによって互いに架橋される。このハイブリダイゼーションドメインは、ＣｐＧに富み、ＴＬＲ９媒介性抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激および腫瘍抗原の取り込み増加を誘導するように設計されている（図１０Ｃ）。刺激されたＡＰＣはその後、腫瘍排出リンパ節に移動し、貪食された腫瘍抗原を細胞傷害性Ｔリンパ球に交差提示し、適応的な全身性の抗腫瘍免疫応答をもたらす（図１０Ｄ）。
いくつかの実施形態では、二重特異性構造の２本のアプタマーアームは、相補的配列の一本鎖オーバーハングの核酸－塩基ハイブリダイゼーションによって互いに架橋される。このハイブリダイゼーションドメインは、ＣｐＧに富み、ＴＬＲ９媒介性抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激および腫瘍抗原の取り込み増加を誘導するように設計されている（図１０Ｃ）。刺激されたＡＰＣはその後、腫瘍排出リンパ節に移動し、貪食された腫瘍抗原を細胞傷害性Ｔリンパ球に交差提示し、適応的な全身性の抗腫瘍免疫応答をもたらす（図１０Ｄ）。
【0142】
Ｇ．それぞれの患者に個別化されたプロセス
いくつかの実施形態では、癌治療プラットフォームとして、個別化されたプロセスは、いくつかの重要なステップを含む（図１１）：
１．２種類の一次適合試料を対象から入手
ａ．腫瘍生検
ｂ．生検部位の正常組織または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のいずれかからなる、陰性対照として使用される健康な組織。
２．健康な細胞を無傷のまま残しながら腫瘍細胞死を誘導する個別化アプタマーを同定するための、本明細書に記載の選択プロセスの実施；
３．二重特異性個別化アプタマーを得るための両方の鎖の製造およびハイブリダイゼーション；
４．二重特異性個別化アプタマーは、それぞれの個々の対象に投与される。
いくつかの実施形態では、癌治療プラットフォームとして、個別化されたプロセスは、いくつかの重要なステップを含む（図１１）：
１．２種類の一次適合試料を対象から入手
ａ．腫瘍生検
ｂ．生検部位の正常組織または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のいずれかからなる、陰性対照として使用される健康な組織。
２．健康な細胞を無傷のまま残しながら腫瘍細胞死を誘導する個別化アプタマーを同定するための、本明細書に記載の選択プロセスの実施；
３．二重特異性個別化アプタマーを得るための両方の鎖の製造およびハイブリダイゼーション；
４．二重特異性個別化アプタマーは、それぞれの個々の対象に投与される。
【0143】
実施例７－二重特異性アプタマーのインビボ有効性
二重特異性アプタマーの腫瘍内投与を試験した。２つの腫瘍細胞株を使用して、本明細書に開示のアプタマー同定プロセスを使用して可変鎖として機能する腫瘍特異的アプタマーを同定した。具体的には、ヒト肺胞腺癌Ａ５４９細胞を用いて殺腫瘍性アプタマーＶＳ２０およびＶＳ４５を同定し、マウストリプルネガティブ乳癌４Ｔ１細胞を用いて殺腫瘍性アプタマーＶＳ３２を同定した。続いて、ＣＳ６ ＣＤ３ｅ標的化アプタマーを各殺腫瘍アプタマーにハイブリダイズさせた。これらのアプタマーのそれぞれの配列を表１２に示す。これらの３の二重特異性化合物のそれぞれを、図１２に例示されるプロセスを使用してインビボで機能性について試験した。
図１３に例示されるように、試験した二重特異性実体（ＣＳ６－ＶＳ２０、ＣＳ６－ＶＳ４５、およびＣＳ６－ＶＳ３２）の各々は、確立された腫瘍（５０～１００ｍｍ３）に２ｍｇの総用量で腫瘍内投与されると、インビボで対応する腫瘍増殖の有意な減弱を効果的にもたらした。
４Ｔ１同系免疫担当マウスモデルでは、ＣＳ６－ＶＳ３２（２ｍｇ）の腫瘍内投与は、注射された腫瘍病変の局所増殖阻害を超える効果をさらに実証した。４Ｔ１腫瘍は、肝臓および肺を含む様々な臓器に自然に転移する能力を有する。４Ｔ１細胞は６－チオグアニン耐性があるため、クローン原性アッセイを使用して、処置マウスの肺の転移巣を測定した。「エラー！参照元が見つかりません。Ａ」、に見られるように、肺転移の減少が観察された。
さらに、ＣｐＧモチーフ／ＴＬＲ９活性化の適応症を評価し、循環ＩＬ－６および脾臓重量のわずかな増加が処置マウス群についても報告された（図１４Ｂ）。
二重特異性アプタマーの腫瘍内投与を試験した。２つの腫瘍細胞株を使用して、本明細書に開示のアプタマー同定プロセスを使用して可変鎖として機能する腫瘍特異的アプタマーを同定した。具体的には、ヒト肺胞腺癌Ａ５４９細胞を用いて殺腫瘍性アプタマーＶＳ２０およびＶＳ４５を同定し、マウストリプルネガティブ乳癌４Ｔ１細胞を用いて殺腫瘍性アプタマーＶＳ３２を同定した。続いて、ＣＳ６ ＣＤ３ｅ標的化アプタマーを各殺腫瘍アプタマーにハイブリダイズさせた。これらのアプタマーのそれぞれの配列を表１２に示す。これらの３の二重特異性化合物のそれぞれを、図１２に例示されるプロセスを使用してインビボで機能性について試験した。
【表12】
４Ｔ１同系免疫担当マウスモデルでは、ＣＳ６－ＶＳ３２（２ｍｇ）の腫瘍内投与は、注射された腫瘍病変の局所増殖阻害を超える効果をさらに実証した。４Ｔ１腫瘍は、肝臓および肺を含む様々な臓器に自然に転移する能力を有する。４Ｔ１細胞は６－チオグアニン耐性があるため、クローン原性アッセイを使用して、処置マウスの肺の転移巣を測定した。「エラー！参照元が見つかりません。Ａ」、に見られるように、肺転移の減少が観察された。
さらに、ＣｐＧモチーフ／ＴＬＲ９活性化の適応症を評価し、循環ＩＬ－６および脾臓重量のわずかな増加が処置マウス群についても報告された（図１４Ｂ）。
【0144】
参照による組み込み
本明細書で言及されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書中の定義を含む本出願が優先する。
本明細書で言及されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書中の定義を含む本出願が優先する。
【0145】
等価物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確認できるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確認できるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A-3B】
【図3C】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8A-8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】