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特表2023-553195造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-20
(54)【発明の名称】造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231213BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20231213BHJP
C12N 5/0781 20100101ALI20231213BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20231213BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20231213BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231213BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20231213BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231213BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20231213BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20231213BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20231213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231213BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20231213BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231213BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20231213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/867 Z
C12N5/0781
C12N5/078
C12N5/0789
C12N15/12
C12Q1/02
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/12
A61P7/00
A61P43/00 105
A61K35/15
A61K35/17
A61K35/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557851
(86)(22)【出願日】2021-12-07
(85)【翻訳文提出日】2023-07-31
(86)【国際出願番号】 IL2021051455
(87)【国際公開番号】W WO2022123559
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】63/122,017
(32)【優先日】2020-12-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/147,956
(32)【優先日】2021-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/492,637
(32)【優先日】2021-10-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523215288
【氏名又は名称】ノガ セラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】エルコビー，リロン
(72)【発明者】
【氏名】ディアマント，ノーム
(72)【発明者】
【氏名】シャチナイ‐ピンカス，リアット
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA29
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA51
4C084ZC01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA51
4C086ZC01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB43
4C087BB44
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA51
4C087ZC01
(57)【要約】
本出願は、いくつかの実施形態では、（ａ）ヒト内因性ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）プロモーターの配列を含む第１の核酸分子と；（ｂ）ＢＴＫまたはその機能的類似体をコードするコドン最適化配列を含む第２の核酸分子とを含むポリヌクレオチドに関する。その全てが本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、細胞、および組成物、ならびに例えばそれを必要とする対象のＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）を処置するために、これらを使用する方法がさらに提供される。
【図９Ｂ】
【図９Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．ヒト内因性ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）プロモーターの７９９～１，５３３個の間のヌクレオチドの配列を含む第１の核酸分子と；ｂ．ＢＴＫまたはその機能的類似体をコードするコドン最適化配列を含む第２の核酸分子と
を含むポリヌクレオチドであって、
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子が作動可能に連結されており、前記コドン最適化が、対象、それに由来する細胞、またはその両方におけるＢＴＫ発現のためのものである、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
少なくとも１つの発現調節エレメントの配列を含む第３の核酸分子をさらに含み、前記第３の核酸分子が前記第１の核酸分子に隣接している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記第３の核酸分子が、前記第１の核酸分子と前記第２の核酸分子との間に位置する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記発現が転写、翻訳、またはその両方を含む、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記調節エレメントが、ヒトＢＴＫ転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）に由来する配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記第１の核酸分子が、配列番号１～７のいずれか１つに示される核酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記第２の核酸分子が、配列番号８～１３のいずれか１つに示される核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記ヒトＢＴＫ転写物のＵＴＲに由来する配列が配列番号１４に示される核酸配列を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
配列番号１９～３０、および３２～３３に示される核酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項11】
レンチウイルスベースの発現ベクターである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項12】
ａ．請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；およびｂ．請求項１０または１１に記載の発現ベクター
のいずれか１つを含む細胞。
【請求項13】
Ｂ細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項14】
骨髄細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項15】
造血幹細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項16】
ａ．請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；ｂ．請求項１０または１１に記載の発現ベクター；および
ｃ．請求項１２～１５のいずれか一項に記載の細胞
のいずれか１つと、許容される担体とを含む組成物。
【請求項17】
それを必要とする対象への移植に使用するための、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記対象が、Ｂ細胞生存率の低下、Ｂ細胞増殖および／もしくは分化速度の低下、またはこれらの任意の組み合わせを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記対象がＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）に罹患している、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項20】
それを必要とする対象において、Ｂ細胞の発達、生存力または活性を増強する方法であって、前記対象に由来するかまたは前記対象から得られる細胞を請求項１０または１１に記載の発現ベクターで形質導入し、それによって、前記対象におけるＢ細胞の発達、生存力または活性を増強することを含む方法。
【請求項21】
前記形質導入が、前記細胞を請求項１０または１１に記載の発現ベクターとエキソビボで接触させることを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
Ｂ細胞の発達、生存力または活性の増強を必要とする対象を選択するステップをさらに含み、前記選択が、前記対象におけるＢ細胞生存、前記対象におけるＢ細胞増殖、前記対象におけるＢ細胞分化、およびこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを決定することを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項23】
前記生存力または活性が、生存、増殖、分化、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
請求項１０または１１に記載の発現ベクターで形質導入した前記細胞を前記対象に移植するステップをさらに含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞がＢ細胞である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞が骨髄細胞である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記造血幹細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記対象がＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）に罹患している、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記対象が、Ｂ細胞生存率の低下、Ｂ細胞増殖および／もしくは分化速度の低下、またはこれらの任意の組み合わせを特徴とする、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月７日に出願された「造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター」と題する米国仮特許出願第６３／１２２，０１７号、２０２１年２月１０日に出願された「造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター」と題する米国仮特許出願第６３／１４７，９５６号、および２０２１年１０月３日に出願された「造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター」と題する米国特許出願第１７／４９２，６３７号の優先権の利益を主張する。これらの全ての出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月７日に出願された「造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター」と題する米国仮特許出願第６３／１２２，０１７号、２０２１年２月１０日に出願された「造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター」と題する米国仮特許出願第６３／１４７，９５６号、および２０２１年１０月３日に出願された「造血細胞におけるＢＴＫの治療的発現のためのレンチウイルスベクター」と題する米国特許出願第１７／４９２，６３７号の優先権の利益を主張する。これらの全ての出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、最適化ＢＴＫレンチウイルスベクターおよびＸ連鎖無ガンマグロブリン血症の遺伝子治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子の突然変異に起因する原発性免疫不全症である。これらの突然変異は、罹患した個体が成熟Ｂ細胞を生成できないことならびにＮＫ細胞および骨髄細胞などの他の免疫学的機能不全をもたらす。現在の治療は、５０年以上にわたって変化しておらず、免疫グロブリン補充および標的化抗微生物剤からなる。この治療は不十分であり、処置されたＸＬＡ患者は、持続的な微生物感染症に起因する低い生活の質および再発性合併症に苦しみ続けている。
【0004】
過去１０年間にわたって、第３世代自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）が、様々な原発性免疫不全疾患を処置するための遺伝子治療ベクターとして使用されてきた。自己改変造血幹細胞に基づく治療は、いくつかの適応症にわたって処置された３００人を超える対象で安全かつ有効な処置様式であることが証明されている。これまでのところ、重篤な有害事象（ＳＡＥ）はほとんど記録されておらず、ほとんどの患者が、かなりの割合の遺伝子改変細胞で安全な確立および安定した長期造血再構築を実証した。
【0005】
過去１０年間に、Ｂｔｋ発現を治療レベルまで上昇させることに焦点を当てて、様々なＢＴＫ ＬＶＶが開発された。これらの構築物は合成プロモーターを含み、一部は内因性ＢＴＫプロモーターおよび追加のシス作用性転写調節エレメントに基づく。さらに、ＢＴＫ導入遺伝子をコドン最適化に供し、これが、場合によっては、Ｂｔｋタンパク質レベルの有意な上昇をもたらした。
【0006】
Ｂｔｋ発現は、Ｂ細胞分化の異なる段階にわたって、および成熟Ｂ細胞におけるＢＣＲ活性化に応答して変化する。Ｂｔｋはまた、ＮＫ細胞および骨髄細胞において発現され、それらの機能に必要である。驚くべきことに、Ｂｔｋ発現特異性の問題は、過去の研究の多くの焦点ではなかった。したがって、未解決のままの主な課題は、もっぱら標的細胞で産生されるＢｔｋのレベルを厳密に制御する能力である。一方では、表現型の矯正に十分なＢｔｋレベルを生成する必要がある。他方では、高レベルのＢｔｋが自己免疫および発癌性に関連し得ることが示されている。
【0007】
内因性プロモーターは以前にＬＶＶ遺伝子治療臨床試験で使用されており、これは生理学的発現パターンを模倣する発現カセットを設計するための一般的なアプローチである。しかしながら、非改変ＢＴＫ内因性プロモーターを使用する初期の試みは、ＣＤ３４＋細胞における不十分なＢｔｋ発現のために失敗している。これらの研究の結果として、現在の一般的な考えは、ＢＴＫ内因性プロモーターを、一般的調節エレメントまたはＢ細胞特異的調節エレメントの付加によって改善して、治療的Ｂｔｋレベルに達しなければならないというものである。この一般的概念は最近、Ｓｅｙｍｏｕｒら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０２１））によって再確認され、専ら内因性ＢＴＫプロモーターＬＶＶを用いた遺伝子治療はＢＴＫ－／ＴＥＣ－マウスにおいてＩｇＭまたはＩｇＧの血清濃度を上昇させることができないが、改変ＢＴＫプロモーター構築物を使用した遺伝子治療は抗体産生および分泌の増加をもたらすことが示された。しかしながら、一般的調節エレメントを発現カセットの一部として含めることは、厳密なＢｔｋ調節の維持におけるリスクを保持する。
【0008】
有効かつ安全な発現パターンを有するＢｔｋ産生を確実にするＢＴＫ発現ベクター（例えば、ＬＶＶ）に対する満たされていない必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｓｅｙｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０２１）
【発明の概要】
【0010】
第１の態様によると、（ａ）ヒト内因性ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）プロモーターの７９９～１，５３３個の間のヌクレオチドの配列を含む第１の核酸分子と；（ｂ）ＢＴＫまたはその機能的類似体をコードするコドン最適化配列を含む第２の核酸分子とを含むポリヌクレオチドであって、第１の核酸分子および第２の核酸分子が作動可能に連結されており、コドン最適化が、対象、それに由来する細胞、またはその両方におけるＢＴＫ発現のためのものである、ポリヌクレオチドが提供される。
【0011】
別の態様によると、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【0012】
別の態様によると、（ａ）本明細書に開示されるポリヌクレオチド；および（ｂ）本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つを含む細胞が提供される。
【0013】
別の態様によると、（ａ）本明細書に開示されるポリヌクレオチド；（ｂ）本明細書に開示される発現ベクター；および（ｃ）本明細書に開示される細胞のいずれか１つと、許容される担体とを含む組成物が提供される。
【0014】
別の態様によると、それを必要とする対象においてＢ細胞の発達、生存力または活性を増強する方法であって、対象に由来するかまたは対象から得られる細胞を本明細書に開示される発現ベクターで形質導入し、それによって、対象におけるＢ細胞の発達、生存力または活性を増強するステップを含む方法が提供される。
【0015】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの発現調節エレメントの配列を含む第３の核酸分子をさらに含み、第３の核酸分子が第１の核酸分子に隣接している。
【0016】
いくつかの実施形態では、第３の核酸分子が、第１の核酸分子と第２の核酸分子との間に位置する。
【0017】
いくつかの実施形態では、発現が転写、翻訳、またはその両方を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、調節エレメントが、ヒトＢＴＫ転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）に由来する配列を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子が、配列番号１～７のいずれか１つに示される核酸配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、第２の核酸分子が、配列番号８～１３のいずれか１つに示される核酸配列を含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、ヒトＢＴＫ転写物のＵＴＲに由来する配列が、配列番号１４に示される核酸配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９～３０、および３２～３３に示される核酸配列を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、発現ベクターがレンチウイルスベースの発現ベクターである。
【0024】
いくつかの実施形態では、細胞がＢ細胞である。
【0025】
いくつかの実施形態では、細胞が骨髄細胞である。
【0026】
いくつかの実施形態では、細胞が造血幹細胞である。
【0027】
いくつかの実施形態では、造血幹細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、組成物が、それを必要とする対象への移植に使用するための、本明細書に開示される細胞と、薬学的に許容される担体とを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、対象が、Ｂ細胞生存率の低下、Ｂ細胞増殖および／もしくは分化速度の低下、またはこれらの任意の組み合わせを特徴とする。
【0030】
いくつかの実施形態では、対象がＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）に罹患している。
【0031】
いくつかの実施形態では、形質導入が、細胞を本明細書に開示される発現ベクターとエキソビボで接触させることを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、方法が、Ｂ細胞の発達、生存力または活性の増強を必要とする対象を選択するステップをさらに含み、選択が、対象のＢ細胞生存、対象のＢ細胞増殖、対象のＢ細胞分化、およびこれらの任意の組み合わせのいずれか１つを決定することを含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、生存力または活性が、生存、増殖、分化、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、方法が、本明細書に開示される発現ベクターで形質導入した細胞を対象に投与するステップをさらに含む。
【0035】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。
【0036】
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、単なる例示として与えられていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1A】図１Ａ－１Ｄは、ＢＴＫコドン最適化発現カセットの比較を示すグラフを含む。導入遺伝子および転写物レベルを、２人の健康なドナーに由来するＣＤ３４＋細胞における多重感染度（ＭＯＩ）１００での形質導入の５日後に測定した。図１Ａは、試験したベクターの概略図である。
【図1D】図１Ｄは、未形質導入細胞に対するＢＴＫ平均蛍光強度を示す縦棒グラフである。ＢＴＫ、ブルトン型チロシンキナーゼ；５’ＵＴＲ、５’非翻訳領域；タグ、ＦＬＡＧタグ；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＣＯ、コドン最適化；２Ａ、Ｔ２Ａ切断部位およびＵＮ、未形質導入。
【図2A】図２Ａ－２Ｄは、ＢＴＫ最小プロモーター下のコドン最適化ＢＴＫ発現カセットの比較を含む。形質導入の６日後（ＭＯＩ２５）にＧＦＰおよびＢｔｋ導入遺伝子レベルを測定した。図２Ａは、試験したベクターの概略図である。
【図3A】図３Ａ－３Ｄは、２人の健康なドナーに由来するＣＤ３４＋細胞における異なるＢＴＫ最小プロモーターに由来するＢＴＫ発現カセットの比較を示すグラフを含む。形質導入の５日後（ＭＯＩ１００）に導入遺伝子発現レベルを測定した。図３Ａは、試験したベクターの概略図である。
【図4A】図４Ａ－４Ｄは、２人の異なるドナーに由来するＣＤ３４＋細胞における異なるＢＴＫ最小プロモーター下のコドン最適化ＢＴＫ発現カセットの比較を含む。形質導入の６日後（ＭＯＩ１２．５）に導入遺伝子および転写物発現レベルを測定した。図４Ａは、試験したベクターの概略図である。
【図5A】図５Ａ－５Ｅは、２人の異なるドナーの異なるＢＴＫ ５’ＵＴＲ下のコドン最適化ＢＴＫ発現カセットの比較を含む。形質導入の６日後（ＭＯＩ１２．５）に導入遺伝子および転写物発現レベルを測定した。図５Ａは、試験したベクターの概略図である。
【図6A】図６Ａ－６Ｃは、２人の健康なドナーに由来するＣＤ３４＋細胞における国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８３３１に開示されている先行技術とのコドン最適化ＢＴＫ発現カセットの比較を含む。図６Ａは、試験したベクターの概略図である。
【図7A】図７Ａ－７Ｄは、２人の健康なドナーに由来するＣＤ３４＋細胞におけるＮＴＸ１０９用量反応を含む。形質導入の６日後に導入遺伝子発現レベルを測定した。図７Ａは、異なるＭＯＩでのＧＦＰレベルのドットプロットである。
【図8A】図８Ａ－８Ｄは、ＮＴＸ１０１およびＮＴＸ１０９による形質導入後のＸｉｄマウスに由来するＬｉｎ－細胞のＦＡＣＳ分析の散布図および縦棒グラフを含む。形質導入の７日後にＧＦＰレベルを測定した。図８Ａは、フローサイトメトリーによって測定されるＧＦＰ陽性細胞の百分率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、いくつかの実施形態では、ヒト内因性ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）プロモーターの最適な配列を含む核酸分子の調節下でＢＴＫまたはその機能的類似体をコードする配列を含む核酸分子を含むポリヌクレオチドに関する。
【0039】
本発明はさらに、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、例えばウイルスベースの発現ベクター、およびこれを使用する方法であって、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）に罹患した対象を処置するために細胞を形質導入するステップを含む方法に関する。
【0040】
ＢＴＫの発現は、ＢＴＫ遺伝子座に由来する、非ＢＴＫ遺伝子座に由来する、またはこれらの組み合わせの１つまたは複数の転写調節配列の付加によって、ＢＴＫ調節をより良く模倣するように改善され得る。このようなエレメントは、本明細書に記載される発現モジュールを最適化するために、本明細書中に開示される最小プロモーターまたは最適プロモーターに隣接し得る。
【0041】
本発明は、内因性ＢＴＫプロモーターに基づくレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を利用すると、持続的かつ特異的なＢＴＫ発現を有するＸＬＡマウスモデルにおいて、ＣＤ３４＋ＨＳＣにおける生理学的Ｂｔｋ発現レベルおよびＢｔｋの機能的回復が得られるという知見に部分的に基づく。このアプローチは、処置されたＸＬＡ患者における調節されていないＢＴＫ発現に起因するリスクを最小限に抑えながら、治療上の利益を提供する。
【0042】
いくつかの実施形態では、方法が、対象から細胞を得るステップと、細胞をエキソビボまたはインビトロで形質導入するステップと、ベクターコピー数（ＶＣＮ）が選択された閾値未満であることを決定するステップと、形質導入細胞を、それを得た対象に再導入または移植して戻すステップとを含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、細胞が５～３０のＭＯＩで、本発明の発現ベクターで形質導入される。
【0044】
いくつかの実施形態では、形質導入細胞が、本発明のベクターの３以下のＶＣＮを特徴とする。
【0045】
いくつかの実施形態では、方法が、細胞を５～３０のＭＯＩで、本発明の発現ベクターでインビトロまたはエキソビボで形質導入するステップと、ＶＣＮが３以下であると決定するステップと、次いで、形質導入細胞を、それを得た対象に再導入または移植して戻すステップとを含む。
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド
【0046】
いくつかの実施形態によると、（ａ）ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）プロモーターに由来する配列を含む第１の核酸分子と；（ｂ）ＢＴＫ導入遺伝子またはその機能的類似体をコードする配列を含む第２の核酸分子とを含むポリヌクレオチドが提供される。
【0047】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子が作動可能に連結されている。
【0048】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわちＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りにクラスター化している転写制御モジュールの群を指す。プロモーターは、それぞれがおよそ７～２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子またはリプレッサータンパク質の１つまたは複数の認識部位を含有する、別々の機能的モジュールで構成される。
【0049】
本明細書で使用される「最適なＢＴＫプロモーター」という用語は、治療的ＢＴＫ発現レベルを誘発し、Ｔ細胞での発現を最小限に抑えながらＢ細胞および骨髄細胞で特異的発現を示す、ＢＴＫ遺伝子の転写開始部位に隣接するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、治療的ＢＴＫ発現レベルが、本明細書に開示される臨床的に関連するＶＣＮである。
【0050】
本明細書で使用される場合、「治療的ＢＴＫ発現」という用語は、ＸＬＡ患者の状態の改善を提供もしくは誘発するため、またはＸＬＡ患者の非病的状態を維持する、持続させる、保存する、もしくはこれらの任意の組み合わせに必要なＢＴＫの発現レベルを指す。
【0051】
いくつかの実施形態では、治療的ＢＴＫ発現が、過小発現、下方制御、非機能的ＢＴＫの発現もしくはＢＴＫの非発現を有するかまたはこれを特徴とする対象において必要とされる。
【0052】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される、必要とする対象が、過小発現、下方制御、非機能的ＢＴＫの発現またはＢＴＫの非発現を有することを特徴とする。
【0053】
いくつかの実施形態では、治療的ＢＴＫ発現が、本発明のベクターを含まない類似の細胞の内因性ＢＴＫ発現レベルよりも少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。いくつかの実施形態では、治療的ＢＴＫ発現が、ＣＤ３４＋またはＢ細胞などの特異的細胞型の平均健康集団の内因性ＢＴＫ発現レベルよりも少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。いくつかの実施形態では、治療的ＢＴＫ発現が、本発明のベクターを含まない類似の細胞の内因性ＢＴＫ発現レベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍を超えない。いくつかの実施形態では、治療的ＢＴＫ発現が、本発明のベクターを含まないＣＤ３４＋またはＢ細胞などの特異的細胞型の平均健康集団の内因性ＢＴＫ発現レベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍を超えない。
【0054】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療的ＢＴＫ発現が、１～１００、５～９５、１０～８０、１５～９０、１０～７０、１５～６５、２０～９５、１０～５０、５～５０、６～７０、１０～４０、５～３０、４～３５、１０～３５、または１０～３０のＭＯＩで形質導入される本発明の発現ベクターで形質導入した細胞によって提供される。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療的ＢＴＫ発現が、本明細書に開示されるように形質導入され、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、最大で１、またはこれらの間の任意の値および範囲のＶＣＮを有すると特性評価または決定される本発明の発現ベクターで形質導入した細胞によって提供される。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0056】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療的ＢＴＫ発現が、本明細書に開示されるように形質導入され、１～２、１～３、または２～３のＶＣＮを有すると特性評価または決定される本発明の発現ベクターで形質導入した細胞によって提供される。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0057】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療的ＢＴＫ発現が、１～１００、５～９５、５～８０、１５～９０、１０～７０、１５～６５、２０～９５、１０～５０、５～５０、６～７０、１０～４０、５～３０、４～３５、５～３５、または５～３０のＭＯＩで形質導入され、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、最大で１、またはこれらの間の任意の値および範囲のＶＣＮを有すると決定される本発明の発現ベクターで形質導入した細胞によって提供される。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0058】
いくつかの実施形態では、最適なＢＴＫプロモーターが治療的ＢＴＫ発現レベルを誘発する。いくつかの実施形態では、最適なＢＴＫプロモーターが、造血幹細胞（ＨＳＣ）、Ｂ細胞、骨髄細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて、ＢＴＫ発現を特異的にまたは優勢に指示する、誘導する、促進する、活性化する、これらの任意の等価物、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、最適なＢＴＫプロモーターが、Ｔ細胞における最小のＢＴＫ発現、無視できるＢＴＫ発現、または無ＢＴＫ発現を指示する、誘導する、促進する、活性化する、これらの任意の等価物、またはこれらの任意の組み合わせである。
【0059】
いくつかの実施形態では、最適なプロモーターが内因性ＢＴＫプロモーターからのヌクレオチドを含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、最適なＢＴＫプロモーターが内因性ＢＴＫプロモーターからのヌクレオチドからなる。
【0061】
いくつかの実施形態では、プロモーターが内因性ＢＴＫプロモーターの７９９～１５３３個の間のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターが内因性ＢＴＫプロモーターの１，０３３～１，５３３個の間のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターが、転写開始部位の上流の、内因性ＢＴＫプロモーターの少なくとも７８９個のヌクレオチド、少なくとも８００個ヌクレオチド、少なくとも１，０００個のヌクレオチド、少なくとも１，２５０個のヌクレオチド、少なくとも１，５００個のヌクレオチド、少なくとも２，０００個のヌクレオチド、少なくとも２，５００個のヌクレオチド、少なくとも２，７５０個のヌクレオチド、もしくは少なくとも２，９００個のヌクレオチド、またはこれらの間の任意の値および範囲を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、本発明のプロモーターが７９０～３，１００ヌクレオチド長を含むか、または７９０～３，１００ヌクレオチド長である。
【0062】
いくつかの実施形態では、プロモーターが、少なくとも１つの潜在的メチル化部位を排除することによってさらに最適化される。メチル化部位は、プロモーター配列中のＣまたはＧの置き換えによって排除される。
【0063】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子が、配列番号１～４、および６～７のいずれか１つに示される核酸配列を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプロモーターが、以下の表１に列挙される核酸配列を含む。
【表1】
【0065】
いくつかの実施形態では、より長いプロモーターの使用が遺伝子発現の調節を改善し得る。対照的に、レンチウイルスベクターのサイズの増加は、レンチウイルス産生効率を有意に低下させ、したがって、このようなレンチウイルスベクターの商業性（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｔｙ）に影響を及ぼし得る。したがって、リードＢＴＫレンチウイルスベクターの選択のためには両側面が最適化されるべきである。
【0066】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子が第２の核酸分子の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子の３’末端が第２の核酸分子の５’の前にある。
【0067】
いくつかの実施形態では、第２の核酸分子が、ＢＴＫタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子が、宿主細胞またはこれを含む対象における発現のために最適化されるＢＴＫ導入遺伝子をコードする核酸配列を含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、コドン最適化が、部分的、限定的、指向的、または調整されたコドン最適化である。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子全体がコドン最適化される。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子の一部がコドン最適化される。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子が、核酸配列レベルで調節されているか、または核酸配列レベルでの調節のために構成されている配列が、例えば野生型対立遺伝子としてコドン最適化されないようにコドン最適化される。
【0069】
宿主細胞のコドン選好性に従ってコドンを最適化する方法は一般的であり、当業者に明らかであろう。コドン最適化は、導入遺伝子発現を増加させるのに有用であり得るが、元の配列に対する塩基変化も導入する。このような変化は、導入遺伝子内の重要な調節配列を排除するおそれがあり、慎重に設計されるべきである。選択されたコドン最適化ＢＴＫ配列は、ＷＴ ＢＴＫヌクレオチド配列との高い類似度を保持すべきである。いくつかの実施形態では、本発明のコドン最適化ＢＴＫが、ＷＴ ＢＴＫヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％またはその間の任意の値を保持する。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子が、配列番号８～１２のいずれか１つに示される核酸配列を含む。
【表2】
【0070】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが第３の核酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の核酸分子が少なくとも１つの発現調節エレメントの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子が第３の核酸分子の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、５’から３’に以下の順序で互いに隣接する核酸分子を含む：第３の核酸分子の５’末端に隣接する第１の核酸分子の３’末端、および第２の核酸分子の５’末端に隣接する第３の核酸分子の３’末端。
【0071】
いくつかの実施形態では、第３の核酸分子が、第１の核酸分子と第２の核酸分子との間に位置する。
【0072】
本明細書で使用される場合、「発現調節エレメント」 という用語は、遺伝子の発現を修正することができ、したがって、そこからコードされるタンパク質産物の量に影響を及ぼす、内因性であろうと外因性であろうと、任意の化合物または作用因子を指す。いくつかの実施形態では、修正が増加または減少である。いくつかの実施形態では、発現が、遺伝子転写（例えば、ＲＮＡに）、ｍＲＮＡ翻訳（例えば、ペプチドに）、またはその両方を含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、調節エレメントが、ＢＴＫ転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントが、ＢＴＫ転写物の５’ＵＴＲに由来する配列、ＢＴＫ転写物の３’ＵＴＲに由来する配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントが、配列番号１４に示される完全長天然ＢＴＫ転写物に由来する５’ＵＴＲに由来する配列であるか、またはその部分配列が、配列番号１５～１６のいずれか１つに示される核酸配列を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、ヒトＢＴＫ転写物のＵＴＲに由来する配列が、配列番号１４～１７に示される核酸配列を含む。
【表3】
【0075】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドが第４の核酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、第４の核酸分子がタンパク質翻訳開始モチーフの配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質翻訳開始モチーフが、哺乳動物、例えばヒトのタンパク質翻訳開始モチーフを含む。
【0076】
タンパク質翻訳開始モチーフのタイプは、それらの配列を回収または取得するための手段を含めて、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、タンパク質翻訳開始モチーフがコザックコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、第４の核酸分子が、コザックコンセンサス配列またはその任意の機能的等価物を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドが、コザックコンセンサス配列またはその任意の機能的等価物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるコザックコンセンサス配列が、核酸配列：ＧＣＣＲＣＣＡＵＧ（配列番号３４）（式中、ＲはＡまたはＧである）を含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、第４の核酸分子が、第３の核酸分子と第２の核酸分子との間に位置する。いくつかの実施形態では、第４の核酸分子が第３の核酸分子に隣接している。いくつかの実施形態では、第４の核酸分子が第２の核酸分子の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、第４の核酸分子が第２の核酸分子の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、５’から３’に以下の順序で核酸分子を含む：第１の核酸分子、第３の核酸分子、第４の核酸分子、および第２の核酸分子。
【0078】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子の３’末端が第３の核酸分子の５’の前にある。いくつかの実施形態では、第３の核酸分子の３’末端が第４の核酸分子の５’の前にある。いくつかの実施形態では、第４の核酸分子の３’末端が第２の核酸分子の５’の前にある。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子が第４の核酸分子に隣接している。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、５’から３’に以下の順序で互いに隣接する核酸分子を含む：第３の核酸分子の５’末端に隣接する第１の核酸分子の３’末端、第４の核酸分子の５’末端に隣接する第３の核酸分子の３’末端、および第２の核酸分子の５’末端に隣接する第４の核酸分子の３’末端。
【0079】
いくつかの実施形態では、第３の核酸分子が第１の核酸分子に隣接している。いくつかの実施形態では、第３の核酸分子が第２の核酸分子の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、第３の核酸分子が第１の核酸分子の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、５’から３’に以下の順序で核酸分子を含む：第１の核酸分子、第３の核酸分子、および第２の核酸分子。
【0080】
いくつかの実施形態では、第１の核酸分子の３’末端が第３の核酸分子の５’の前にある。いくつかの実施形態では、第３の核酸分子の３’末端が第２の核酸分子の５’の前にある。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子が第３の核酸分子に隣接している。
【0081】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドが、配列番号１９～３３のいずれか１つに示される核酸配列を含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドがＢＴＫ発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットが、最適なＢＴＫプロモーターおよびＢＴＫコード配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットが、最適なＢＴＫプロモーターおよびＢＴＫコード配列からなる。
【0083】
いくつかの実施形態によると、最適なＢＴＫプロモーターおよびコドン最適化ＢＴＫコード配列を含む発現カセットが提供される。いくつかの実施形態では、発現カセットが、発現調節エレメント、タンパク質翻訳開始モチーフの配列、またはその両方をさらに含む。いくつかの実施形態では、調節配列がＢＴＫ転写物５’ＵＴＲに由来する。いくつかの実施形態では、調節が完全なＢＴＫ転写物５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットが、最適なＢＴＫプロモーター、コドン最適化ＢＴＫコード配列、発現調節エレメント、およびタンパク質翻訳開始モチーフの配列からなる。いくつかの実施形態では、発現カセットが、５’から３’に以下の順序の以下のエレメント：最適なＢＴＫプロモーター（例えば、ヒト内因性ＢＴＫプロモーター）、発現調節エレメント、タンパク質翻訳開始モチーフの配列、およびコドン最適化ＢＴＫコード配列からなる。
【0084】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＢＴＫ発現カセットが本明細書の以下の表４に列挙される。
【表4】
【0085】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、ウイルスベクターの配列を含むかまたはウイルスベクターに由来する第５の核酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレンチウイルスベクター骨格を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが第３世代レンチウイルスベクター骨格を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが自己不活性化レンチウイルスベクター骨格を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが第３世代自己不活性化レンチウイルスベクター骨格を含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドが、ＢＴＫ遺伝子座に由来しない一般的な調節エレメントを欠いている。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドが、ユビキタスクロマチンオープニングエレメント（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）を欠いている。
発現ベクター
発現ベクター
【0087】
いくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチド本発明を含む発現ベクターが提供される。
【0088】
いくつかの実施形態では、発現ベクターがウイルスベクターであるか、またはウイルスベクターを含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、発現ベクターがレンチウイルスベースの発現ベクターであるか、またはレンチウイルスベースの発現ベクターを含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベースのベクターが第３世代レンチウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベースのベクターが自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベースのベクターが、転写のトランス活性化因子をコードする遺伝子（Ｔａｔ）を欠いている。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベースのベクターが、１つまたは複数のウイルスアクセサリータンパク質を欠いている。いくつかの実施形態では、ウイルスアクセサリータンパク質が、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベースのベクターが、ヒト治療に適した任意のレンチウイルスベースのベクターを含む。いくつかの実施形態では、適切なものが、ヒトの健康に安全なものを含む。
【0091】
レンチウイルスベースのベクター、具体的には、ヒト対象の治療に使用するのに安全なレンチウイルスベースのベクターは一般的であり、当業者に明らかであろう。
【0092】
いくつかの実施形態では、遺伝子がプロモーターに作動可能に連結している。「作動可能に連結した」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように１つまたは複数の調節エレメントに連結されていることを意味することを意図している。
【0093】
挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写および翻訳に必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物が、発現されたポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するように操作された配列も含み得ることが理解されるであろう。
【0094】
核酸の増幅（例えば、ＰＣＲ、等温法、ローリングサークル法等）または定量的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどによって１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを測定するための多数の方法が当技術分野で公知である。特定の遺伝子を増幅するためのプライマーの設計は、当技術分野で周知である。
【0095】
ＲＴ－ｑＰＣＲ：ＲＮＡ存在量を測定するために使用される一般的な技術は、逆転写（ＲＴ）の後にリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が続くＲＴ－ｑＰＣＲである。逆転写が、最初にＲＮＡからＤＮＡ鋳型を生成する。この一本鎖鋳型はｃＤＮＡと呼ばれる。次いで、ｃＤＮＡ鋳型を定量ステップで増幅し、その間、標識ハイブリダイゼーションプローブまたはインターカレーティング色素によって発せられる蛍光が、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて変化する。定量的ＰＣＲは、元のＲＮＡのコピーの増加または減少の測定値を提供し、同等の健康な組織と比較したがん組織における遺伝子発現の変化を定義しようと試みるために使用されている。
【0096】
ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）：標的ＤＮＡの絶対的かつ直接的な定量化を提供する技術。ｄｄＰＣＲは、油滴区画中の２０，０００の水に封入された核酸分子を計数することによって絶対量を測定する。ＰＣＲ増幅は、熱サイクルを使用して各ドロップレット内で行われる。ＰＣＲの後、ドロップレットがドロップレットリーダー上に単一ファイルでストリーミングされ、蛍光陽性ドロップレットおよび蛍光陰性ドロップレットを計数して標的ＤＮＡ濃度を計算する。
細胞
細胞
【0097】
いくつかの実施形態によると、（ａ）本発明のポリヌクレオチド；（ｂ）本明細書に開示される発現ベクター（例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む）；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の任意の組み合わせを含む細胞が提供される。
【0098】
いくつかの実施形態では、細胞が幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞が造血幹細胞または前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞が免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞が骨髄細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞がＢ細胞、Ｂリンパ球、または形質細胞を含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、細胞がＣＤ３４＋細胞である。
【0100】
いくつかの実施形態では、細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞であるか、またはＣＤ３４＋造血幹細胞を含む。
【0101】
細胞の型を決定する方法ならびに特定の細胞、例えばＣＤ３４＋を単離する方法は一般的であり、当業者に明らかであろう。このような方法の非限定的な例としては、それだけに限らないが、親和性精製およびフローサイトメトリーセルソーティング（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ））が挙げられる。
【0102】
いくつかの実施形態では、細胞が対象から得られるか、または対象に由来する。いくつかの実施形態では、細胞が細胞株もしくは培養物から得られるか、または細胞株もしくは培養物に由来する。いくつかの実施形態では、細胞が、本発明のポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを増殖および／または増加させるために使用される。いくつかの実施形態では、細胞が、本発明のポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターの発現に使用される。
【0103】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはこれを含む組成物を含む細胞が、対照細胞における内因性ＢＴＫ発現レベルと同等または等価のＢＴＫ発現レベルを有することを特徴とする。
【0104】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはこれを含む組成物を含む細胞が、内因性ＢＴＫレベルと類似のＢＴＫ発現レベルを有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞が、本発明のポリヌクレオチドもこれを含む発現ベクターも含まない類似の細胞における内因性ＢＴＫ発現レベルよりも１～２倍、１～３倍、１～４倍、１～５倍、１～６倍、１～７倍、１～８倍、１～９倍、もしくは１～１０倍の間高いＢＴＫ発現レベル、またはそれらの間の任意の値および範囲を有することを特徴とする。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0105】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、またはこれを含む組成物を含む細胞が、本発明のポリヌクレオチドを含まない類似の細胞における内因性ＢＴＫ発現レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは類似のレベルのＢＴＫ発現レベル、またはそれらの間の任意の値および範囲を有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはこれを含む組成物を含む細胞が、最大１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％または１，０００％のＢＴＫ発現レベルを有することを特徴とする。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞中の本発明のポリヌクレオチドを含む本明細書に開示されるベクターのベクターコピー数（ＶＣＮ）が、最大で１０、最大で９、最大で８、最大で７、最大で６、最大で５、最大で４、最大で３、最大で２、もしくは最大で１、またはそれらの間の任意の値および範囲である。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0107】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞中の本発明のポリヌクレオチドを含む本明細書に開示されるベクターのＶＣＮが、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２である。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0108】
いくつかの実施形態では、対照細胞が正常Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態では、対照細胞が正常骨髄細胞を含む。いくつかの実施形態では、対照細胞が正常造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、対照細胞が、健康な対象から得られたまたは健康な対象に由来するＢ細胞を含む。いくつかの実施形態では、対照細胞が、健康な対象から得られたまたは健康な対象に由来する骨髄細胞を含む。いくつかの実施形態では、対照細胞が、Ｂ細胞、骨髄細胞、およびその両方のいずれか１つを含み、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）に罹患していない対象から得られるか、またはＸＬＡに罹患していない対象に由来する。
組成物
組成物
【0109】
いくつかの実施形態によると、（ａ）本発明のポリヌクレオチド；（ｂ）本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；（ｃ）本発明のポリヌクレオチド；これを含む発現ベクター、およびこれらの任意の組み合わせのいずれか１つを含む細胞；またはこれらの任意の組み合わせを含む組成物が提供される。
【0110】
いくつかの実施形態では、組成物が許容される担体をさらに含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、担体が薬学的に許容される担体を含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
【0113】
いくつかの実施形態では、細胞が形質導入細胞である。
【0114】
いくつかの実施形態では、形質導入が本発明の発現ベクターで形質導入されることを含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、形質導入細胞が、１～２のＶＣＮを有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞が、２未満、または３未満のＶＣＮを有することを特徴とする。
【0116】
いくつかの実施形態では、医薬組成物が、それを必要とする対象への移植に使用するためのものである。
【0117】
いくつかの実施形態では、医薬組成物が、ＢＴＫ遺伝子の機能喪失型変異、Ｂ細胞活性化率の低下、Ｂ細胞増殖および／もしくは分化速度の低下、またはこれらの任意の組み合わせを特徴とする対象への移植に使用するためのものである。
【0118】
いくつかの実施形態では、低下が対照と比較される。いくつかの実施形態では、対照が健康な対象を含む。いくつかの実施形態では、対照が、変異ＢＴＫ遺伝子関連疾患に罹患していない対象、またはＢＴＫ遺伝子の機能喪失型変異を有する対象を含む。いくつかの実施形態では、対照が、ＢＴＫ遺伝子の機能喪失型変異に罹患していない対象を含む。いくつかの実施形態では、対照が、変異ＢＴＫ遺伝子関連疾患に罹患していない対象を含む。いくつかの実施形態では、対照が、特定の細胞型におけるＢＴＫ発現に関する公開データに基づく。いくつかの実施形態では、対照が、数人の健康な対象からの細胞集団で測定され、ベースラインとして設定された平均ＢＴＫ発現に基づく。
【0119】
いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ遺伝子関連疾患が、その発病および／または病態生理学の一部として変異ＢＴＫ遺伝子を伴う任意の疾患を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ遺伝子関連疾患が、減少した、阻害された、微小な、存在しないＢ細胞、骨髄細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、もしくはこれらの任意の組み合わせ、生存力および／もしくは活性、またはこれらの任意の組み合わせを特徴とする。
【0120】
いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ遺伝子関連疾患がＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）を含むか、またはＸＬＡである。いくつかの実施形態では、ＸＬＡ罹患対象がＢＴＫ遺伝子に機能喪失型変異を有する。
【0121】
いくつかの実施形態では、「減少した」 または 「減少」 が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％の減少、またはそれらの間の任意の値および範囲を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、「減少した」 または 「減少」が、１～２０％、１０～５０％、３５～７５％、２０～９７％、１５～８０％、１～７５％、または１０～１００％の減少を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0122】
いくつかの実施形態では、所定の閾値以下の細胞中のＢＴＫ発現カセットＶＣＮが、細胞が対象への移植に適していることを示す。いくつかの実施形態では、所定の閾値を上回るＢＴＫ発現カセットＶＣＮが、細胞が対象への移植に適していないことを示す。いくつかの実施形態では、ＶＣＮが細胞集団（ｐＶＣＮ）の平均として測定される。いくつかの実施形態では、ＶＣＮが単一細胞レベル（ｓＶＣＮ）で測定される。
【0123】
いくつかの実施形態では、ＶＣＮの所定の閾値が、最大で１、最大で２、最大で３、または最大で５のＶＣＮであり、それらの間の任意の値および範囲を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0124】
いくつかの実施形態では、所定の閾値以上のＢＴＫ発現が、細胞が対象への移植に適していることを示す。いくつかの実施形態では、所定の閾値未満のＢＴＫ発現が、細胞が対象への移植に適していないことを示す。
【0125】
いくつかの実施形態では、所定の閾値が、対象への移植に適している導入遺伝子由来ＢＴＫ（ｔｒＢＴＫ）発現の内因性ＢＴＫ（ｅｎＢＴＫ）発現に対する比を含む。いくつかの実施形態では、細胞が対象への移植に適していることを示すｔｒＢＴＫ／ｅｎＢＴＫ発現比が、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、またはそれらの間の任意の値および範囲のｔｒＢＴＫ／ｅｎＢＴＫ発現比を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、細胞が対象への移植に適していることを示すｔｒＢＴＫ／ｅｎＢＴＫ発現比が、２：１～５：１、２：１～３：１、２：１～１０：１のｔｒＢＴＫ／ｅｎＢＴＫ発現比を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0126】
いくつかの実施形態では、所定の閾値が、対象への移植に適しているＢ細胞における導入遺伝子の発現（ｂｃＢＴＫ）のＴ細胞における導入遺伝子の発現（ｔｃＢＴＫ）に対する比を含む。いくつかの実施形態では、細胞が対象への移植に適していることを示すｂｃＢＴＫ／ｔｃＢＴＫ発現比が、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８５０：１、少なくとも１，０００：１、またはそれらの間の任意の値および範囲のｂＢＴＫ／ｔＢＴＫ発現比を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
使用方法
使用方法
【0127】
いくつかの実施形態によると、それを必要とする対象において細胞生存力または活性を増強する方法であって、対象に由来するかまたは対象から得られる細胞を本発明のＬＶＶと接触させ、それによって、対象における細胞生存力または活性を増強するステップを含む方法が提供される。
【0128】
いくつかの実施形態では、細胞が造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞が骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞がＢ細胞である。
【0129】
いくつかの実施形態によると、細胞のＢＴＫ活性または機能性を提供または回復する方法であって、細胞を本発明のＬＶＶと接触させ、それによって、細胞のＢＴＫ活性または機能性を提供または回復するステップを含む方法が提供される。
【0130】
いくつかの実施形態では、方法が、形質導入細胞におけるＢＴＫの発現レベルを決定することを含むステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、形質導入細胞におけるＢＴＫの発現レベルを決定することを含むステップが、対象への細胞の移植の前にある。
【0131】
いくつかの実施形態では、方法が、それを必要とする対象のＸＬＡを処置または予防するためのものである。
【0132】
いくつかの実施形態では、方法が、ＸＬＡを負う対象に由来するかまたはＸＬＡを負う対象から得られる細胞を用意するステップをさらに含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、方法が、ＸＬＡを負う対象から細胞を得るステップをさらに含む。
【0134】
いくつかの実施形態では、接触がエキソビボで接触させることを含むか、またはエキソビボで接触させることである。
【0135】
本明細書で使用される場合、「エキソビボ」 という用語は、細胞が生物から取り出され、生物の外部で増殖および／または操作されるプロセスを指す。
【0136】
いくつかの実施形態では、接触が、細胞を本発明のＬＶＶで形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、接触が、本発明のＬＶＶを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、形質導入が、本発明のＬＶＶを細胞に導入することを含む。
【0137】
いくつかの実施形態では、形質導入および／または導入が、ポリヌクレオチド分子を含むＬＶＶを標的細胞に移入することを含む。
【0138】
いくつかの実施形態では、形質導入および／または導入が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれらの間の任意の値および範囲の多重感染度（ＭＯＩ）である。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0139】
いくつかの実施形態では、形質導入および／または導入が、５～５０、１０～５０、５～４０、５～３０、５～２５、１５～５０、１５～４０、１５～３５、２０～４０、１５～３０、または２０～３０のＭＯＩである。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0140】
いくつかの実施形態では、方法が、用量決定のステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、用量選択が、ＸＬＡ患者細胞、例えばＨＳＣにおけるＢｔｋ発現を測定することによって、またはＸＬＡ患者ＨＳＣにおけるＶＣＮを測定することによって、または形質導入ＨＳＣのインビトロＢ細胞発達を測定することによって行われる。
【0141】
Ｂ細胞の機能、増殖および／または分化を決定する方法は一般的であり、当業者に明らかであろう。このような方法の非限定的な例としては、それだけに限らないが、ＦＡＣＳ、抗体特異的染色（例えば、抗ＣＤ３４＋抗体を用いる）、ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、刺激に応答したＩｇＭ分泌が挙げられ、これらのいくつかは本明細書に例示される。
【0142】
いくつかの実施形態では、方法が、形質導入細胞におけるＢＴＫ発現カセットのベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定することを含むステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、形質導入細胞におけるＢＴＫのＶＣＮを決定することを含むステップが、対象への細胞の移植の前にある。
【0143】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象を処置する方法であって、対象に由来する複数の細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、細胞が、本明細書に開示される方法に従って処置される前の対象のｂｃＢＴＫ／ｔｃＢＴＫと比較して、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８５０：１、少なくとも１，０００：１、またはそれらの間の任意の値および範囲のｂｃＢＴＫ／ｔｃＢＴＫ発現比を有することを特徴とするように、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで操作される、方法が提供される。
【0144】
いくつかの実施形態では、投与が移植であるか、または移植を含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、所定の閾値が、対象への移植に適しているＢ細胞における導入遺伝子の発現（ｂｃＢＴＫ）の骨髄細胞における導入遺伝子の発現（ｍｃＢＴＫ）に対する比を含む。いくつかの実施形態では、細胞が対象への移植に適していることを示すｂｃＢＴＫ／ｍｃＢＴＫ発現比が、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８５０：１、少なくとも１，０００：１、またはそれらの間の任意の値および範囲のｂｃＢＴＫ／ｍｃＢＴＫ発現比を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0146】
いくつかの実施形態では、対象が変異ＢＴＫ遺伝子関連疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、対象が、免疫不全または免疫不全疾患もしくは障害に罹患している。いくつかの実施形態では、対象がＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）に罹患している。
【0147】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＢＴＫ遺伝子の変異が機能喪失型変異である。いくつかの実施形態では、変異がナンセンス変異である。いくつかの実施形態では、変異がミスセンス変異である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるナンセンス変異またはミスセンス変異のいずれか１つが、変異ＢＴＫ遺伝子の部分的、非機能的、またはその両方のタンパク質産物をもたらす。
【0148】
いくつかの実施形態では、処置が、対象においてＢＴＫの発現を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、処置が、対象のＢ細胞においてＢＴＫの発現レベルを誘導することを含む。いくつかの実施形態では、処置が、対象の骨髄細胞においてＢＴＫの発現レベルを誘導することを含む。いくつかの実施形態では、対象が、ＢＴＫ発現なしまたは無視できるＢＴＫ発現を特徴とする。いくつかの実施形態では、対象、非機能的ＢＴＫ遺伝子またはそのタンパク質産物を有することを特徴とする。
【0149】
いくつかの実施形態では、発現を増加させることが、対照Ｂ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または対照骨髄細胞における内因性ＢＴＫ発現と比較して、１０１％ ～１５０％、１５０～２００％、２００～３００％、１０１～３００％、１０１～５００％、１０１～１０００％、２００～１０００％のレベル、またはそれらの間の任意の値および範囲までである。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
実施例
実施例
【0150】
上記で本明細書に描写され、以下の特許請求の範囲の節で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。ここで、上記の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的に示す以下の実施例を参照する。
【0151】
一般に、本明細書で使用される命名法、および本発明で利用される実験室手順には、化学、分子、生化学、および細胞生物学の技術が含まれる。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ～ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ～ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ Ｊｏｈｎ ＭｃＭｕｒｒｙ ａｎｄ Ｔａｄｈｇ Ｂｅｇｌｅｙ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、２００５）；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００２）；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第６版）Ｌｅｒｏｙ “Ｓｋｉｐ” Ｇ Ｗａｄｅ；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔ．Ｗ．Ｇｒａｈａｍ ＳｏｌｏｍｏｎｓおよびＣｒａｉｇ Ｆｒｙｈｌｅを参照されたい。
【実施例1】
【0152】
健康なドナーに由来するヒト造血幹細胞におけるＢＴＫおよびＧＦＰ発現に基づくベクター候補のスクリーニング
【0153】
スクリーニング系は、動員末梢血細胞（ＭＰＢＣ）に由来するＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を利用する。これらの細胞は、ＨＳＣが臨床設定における標的細胞集団であるので、最も関連性のある発現系である。ＢＴＫがＣＤ３４＋細胞で発現されることが以前に示された（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈら、２０１４）。したがって、ＢＴＫ ＬＶＶによる形質導入は、この細胞集団においてＢＴＫ発現をもたらすはずである。最初に、全ての発現カセットのコード配列はＢＴＫ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ配列を含む。形質導入ＣＤ３４＋細胞および未形質導入ＣＤ３４＋細胞のＢＴＫ ｍＲＮＡレベルおよびＧＦＰタンパク質レベルの比較は、さらなるスクリーニング系によってさらに評価される候補発現カセットの初期設定の選択を可能にする。
【0154】
Ｇ－ＣＳＦ ＭＰＢＣを、Ｅｚｅｒ Ｍｉｚｉｏｎ骨髄採取部位で健康なドナーからアフェレーシスによって採取した。ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４陽性選択マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって精製し、選択プロセスの純度を、フローサイトメトリーを使用して決定した。
【0155】
形質導入のために、ヒトＧ－ＣＳＦ ＭＰＢＣ由来ＣＤ３４＋細胞を、サイトカイン：ＩＬ－３、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ－３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）のカクテルを補充した無血清ＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）中で、形質導入前に１６～２４時間前培養する。ウイルスをＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（Ｓｉｒｉｏｎ）形質導入エンハンサーと適切な組織培養皿に混合することによって、形質導入を行う。ＣＤ３４＋細胞を０．５～１×１０６細胞／ｍｌの高濃度でウェルに添加する。２４時間後、細胞を洗浄して培地中に残っているビリオンを除去する。細胞を維持し、形質導入後５～１５日目に分子および生化学試験のために回収する。
【0156】
ＢＴＫ ｍＲＮＡレベルについては、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ ｍｉｎｉキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して０．５×１０６個のＣＤ３４形質導入細胞から全ＲＮＡを抽出し、引き続いてＨｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＴ反応を行う。５ ｎｇのｃＤＮＡをリアルタイムｑＰＣＲ反応（ＣＦＸ９６タッチディープウェル、Ｂｉｏ－ｒａｄ）に使用する。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を参照遺伝子として使用する。異なる転写物を特定するために使用されるプライマー配列を表５に記載する。
【表5】
【0157】
ＧＦＰタンパク質レベルについては、０．１～０．５×１０６個の細胞を回収し、７ＡＡＤ生存色素（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ）とインキュベートして死細胞を除去した。細胞を濾過し、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメトリーを使用してＧＦＰレベルについてスクリーニングした。ＣｙｔＥｘｐｅｒｔを使用してフローサイトメトリー分析を行った。ベクターコピー数（ＶＣＮ）レベルについては、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＣＤ３４形質導入細胞からｇＤＮＡを抽出する。各ｄｄＰＣＲ反応については、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）で標識された１つのレンチウイルス標的、およびＨＥＸで標識されたＰＣＢＰ２ヒト／マウス参照遺伝子を含むマルチプレックスアッセイ反応として６０ ｎｇのＤＮＡを使用する。特注のプライマーを、プライマーについては９００ ｎＭ、加水分解プローブについては２５０ ｎＭの濃度に相当する２０倍濃度でストックする。異なる転写物を特定するために使用される配列を表６に記載する。
【表6】
【0158】
各ＬＶＶについて、ＢＴＫ発現レベルを、数人の健康なドナーのＨＳＣにおいて測定した。ＣＤ３４＋細胞において高い発現レベルを示すＬＶＶ候補を、さらなる特性評価のために選択した。さらに、導入遺伝子由来ＢＴＫ（ｔｒＢＴＫ）発現の内因性ＢＴＫ（ｅｎＢＴＫ）発現に対する比を測定し、最適なＬＶＶ候補の選択に使用する。異なる細胞型におけるＢＴＫレベルを測定するために、ヒトＢＴＫ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを使用した（Ａｂｃａｍ）。抽出緩衝液に希釈した５０μｌの細胞溶解物および５０μｌの抗体カクテルをプレコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートした。プレートを１×ＰＴ洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＴＭＢ展開溶液を１０分間添加した。反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＯＤを４５０ ｎｍで読み取った。滴定されたＢＴＫ標準との比較によってＢＴＫレベルを定量化した。
【0159】
本発明者らは、配列番号９～１２に示される配列を有するいくつかのコドン最適化ＢＴＫコード配列を試験した。配列番号１３（さらなる特徴を発現ベクターの一部として含む場合、本明細書中でＮＴＸ１１２と呼ばれる；配列番号２６）は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８３３１に開示されるコドン最適化ＢＴＫ ＯＲＦである。配列番号１２は、ｗｔ ＢＴＫ配列と高い相同性（相同性９０．９％）を有するコドン最適化ＢＴＫである。比較のために、配列番号９に対するｗｔ ＢＴＫの相同性は７７．７％であり、配列番号１３については７８．５％である。これらの配列を１，０３３ ｂｐのＢＴＫプロモーターの制御下でクローニングし、発現レベルをＷＴ ＢＴＫコード配列（配列番号８）を有する構築物の発現レベルと比較した。ＷＴ ＢＴＫコード配列と異なるコドン最適化発現カセットを比較するために、ヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＯＩ １００で、異なるＢＴＫ ＬＶＶで形質導入した。形質導入の５日後、リアルタイムｑＰＣＲを使用してＧＦＰ ｍＲＮＡレベルを比較し、フローサイトメトリーを使用してＢＴＫおよびＧＦＰタンパク質レベルを測定した（図１Ａ～図１Ｄ）。１，０３３ ｂｐのＢＴＫプロモーター下のＮＴＸ１４３を、２５のＭＯＩでヒトＣＤ３４＋細胞中のＮＴＸ１０９と比較した。形質導入の６日後、ＧＦＰおよびＢｔｋタンパク質レベルを、それぞれフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡを使用して比較した（図２Ａ～図２Ｃ）。
【0160】
本明細書でＮＴＸ１０９とも呼ばれる配列番号２３は、全ての試験対象（２人のヒトドナー）にわたって配列番号２２よりも高いＢＴＫレベルを示した。この試験の相対的ＶＣＮは、様々な構築物間で１～２倍の差を示した。これらの結果は、ＮＴＸ１０９がＸＬＡ遺伝子治療のための発現カセットとしての使用に適し得ることを示唆している。
【0161】
この目的のために、２００～３００ ｂｐの最小プロモーターが遺伝子転写を誘導するのに十分であることが一般に受け入れられる。さらに、これまでに報告されている最も長い組換えＢＴＫプロモーターである７９８ ｂｐ長のＢＴＫプロモーターがＢＴＫ遺伝子の発現には必要であることが以前に報告されている。
【0162】
この点に関して、本発明者らは、配列番号１～４に示される配列を有する４つの最小ＢＴＫプロモーターおよび配列番号８に示される配列を有するＢＴＫコード配列を含むＬＶＶのセットを設計および試験した。最小ＢＴＫプロモーター発現カセットから誘導される発現レベルを特性評価するために、ヒトＣＤ３４細胞を、ＭＯＩ １００で、異なるＬＶ＿ＮＴＸで形質導入した。リアルタイムｑＰＣＲを使用して相対的ＶＣＮを決定したところ、様々な構築物間で１～２倍の差を示した。形質導入の６日後、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰタンパク質レベルを測定した（図３）。本明細書でＮＴＸ１０１とも呼ばれる配列番号２２は、２人の健康なヒトドナーにおいて配列番号１９～２１よりも高いＢＴＫレベルを示した。ＢＴＫプロモーターの特性評価を拡大するために、１，０３３ ｂｐプロモーターを配列番号５～７の様々な長さの他のＢＴＫプロモーターとさらに比較した。プロモーター設計には、長いバージョンのＢＴＫプロモーター（１，５３３ ｂｐ）、開示された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８３３１で使用されたような７９８ ｂｐの中間サイズバージョン、および内部の４０９ ｂｐが除去された合成プロモーターが含まれる。この記載の場合、コドン最適化ＢＴＫ導入遺伝子から誘導される発現を測定した（ＮＴＸ １３２～ＮＴＸ １３４）。これらの構築物について測定された組み込み事象は、細胞１個当たり０．４～１ ＶＣＮの間であった。以前の結果と同様に、１，０３３ ｂｐプロモーター長から誘導される発現レベルは、試験した２人の健康なヒトドナーにおいて他の試験したプロモーターと比較して高かった（図４）。
【0163】
これらの結果は、１，０３３ ｂｐの配列番号４のプロモーターが、ＢＴＫ発現レベルに関して最適なＢＴＫプロモーターとして配列番号１～３および５～７を上回ることを示唆している。
【0164】
したがって、本発明者らは、出願時の先行技術とは対照的に、内因性ＢＴＫ発現レベルと比較して２～３倍高い発現レベルを提供するように、本明細書に開示されるコドン最適化ＢＴＫ構築物（ＮＴＸ１０９を使用して本明細書に例示される；配列番号２３）の発現を制御するためには、より長いバージョンのＢＴＫプロモーター、例えば１，０３３ ｂｐ長が必要であることを示した。発現のこの２～３倍の上昇が、治療目的に最適であることがさらに見出された。この目的のために、このようなＢＴＫ発現レベルの上昇は前例がなく、内因性プロモーターを使用した場合、以前に報告されていなかった。
【0165】
ＢＴＫ発現に対するＢＴＫ ５’ＵＴＲの調節効果を試験するために、本発明者らは、完全長（合計１６０ ｂｐ）を、３１ｂｐのみを含むＢＴＫ ５’ＵＴＲの解体バージョンと比較した。参照として、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８３３１では、使用した５’ＵＴＲの長さは４１ ｂｐであった。また、変更された熱力学的特性を有する改変５’ＵＴＲが含まれた。このバージョンは、ｗｔ ５’ＵＴＲと比較して１４個のミスマッチ変異を含有し、ＲＮＡｆｏｌｄ熱力学的アンサンブル予測因子（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）に基づいて設計された。全ての構築物は、１，０３３ ｂｐのＢＴＫプロモーター、ならびにＴ２Ａによって分離されたＧＦＰおよびコドン最適化ＢＴＫ導入遺伝子を含有していた。ＣＤ３４細胞への形質導入の６日後、ＧＦＰタンパク質レベルおよびｍＲＮＡ転写物レベルを測定した（図５）。短い５’ＵＴＲバージョンを含有するＮＴＸ１３７から誘導される発現は、ＮＴＸ１０９よりも低かった（タンパク質レベルで０．７倍および転写物レベルで０．４倍）。５’ＵＴＲをミスセンス変異で改変した場合、発現の有意な低下が測定された（ＮＴＸ１０９と比較してタンパク質レベルで０．１９倍および転写物レベルで０．０６倍）。ＮＴＸ１０９、ＮＴＸ１３７およびＮＴＸ１４２の組み込み事象を形質導入の１５日後に測定したところ、それぞれ１、０．５および０．１ ＶＣＮ／細胞に対応していた。この試験は、ＢＴＫ発現レベルおよび調節を維持するために完全長ＢＴＫ ５’ＵＴＲを含めることの重要性を実証する。
【0166】
最後に、本発明者らは、本明細書でＮＴＸ１０９とも呼ばれる配列番号２３を、本明細書でＮＴＸ１４１とも呼ばれる配列番号３１の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２８３３１に開示される発現カセットと比較した。ＣＤ３４細胞への形質導入の６日後、ＧＦＰタンパク質レベルをＭＯＩ（５～５０）の範囲で測定した（図６Ａ～図６Ｃ）。２５のＭＯＩでは、ＮＴＸ１４１から誘導される発現がＮＴＸ１０９よりも低かった（陽性ＧＦＰレベルの百分率で０．６倍および平均蛍光強度で０．２３倍）。ＮＴＸ１０９およびＮＴＸ１４１の組み込み事象を形質導入の１３日後に測定したところ、それぞれ平均２．６および１．１５に対応していた。
【実施例2】
【0167】
ヒトＨＳＣにおけるＮＴＸ１０９の用量反応試験
【0168】
安全性の観点から、治療効果に必要な形質導入ビリオンの最小数を定義することが重要である。この試験では、本発明者らは、１００、５０、２５、１２．５および５の減少するＭＯＩで、ヒトＣＤ３４＋細胞をＮＴＸ１０９で形質導入した。この試験で測定されたＶＣＮ／細胞は、用量反応設計との一貫性を示し、最低用量（ＭＯＩ ５）では０．３±０．１５であり、最高用量（ＭＯＩ １００）では最大１．５±０．１６に達した（図７Ｂ）。形質導入の６日後、ＧＦＰおよびＢｔｋ導入遺伝子タンパク質レベルを、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡを使用して比較した（図７Ａ、図７Ｃおよび図７Ｄ）。これらの結果は、２５のＭＯＩで、ＮＴＸ１０９で形質導入されたＣＤ３４＋細胞が、陽性導入遺伝子細胞の数と総ＢＴＫの量の両方においてほぼ飽和レベルに達したことを実証した。
【実施例3】
【0169】
Ｘ連鎖免疫不全（Ｘｉｄ）マウスに由来するＢＴＫ欠損細胞におけるＢＴＫ機能回復に基づく選択
【0170】
ＬＶＶ候補を、いくつかのアッセイを使用してＢｔｋ機能回復について試験することができる。例えば、Ｂ細胞受容体刺激は、インビトロでのＢ細胞の発達および成熟の回復、培養中のＢ細胞増殖、Ｃａ２＋流動の測定、ならびに下流エフェクターのリン酸化によって評価される。
【0171】
さらに、さらなる選択が、Ｂｔｋ欠損細胞におけるＢｔｋ発現および機能を試験することによって行われる。マウスＸ連鎖免疫不全（Ｘｉｄ；ＣＢＡ／ＣａＨＮ－Ｂｔｋ ｘｉｄ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の骨髄に由来する系統陰性ＨＳＰＣ（Ｌｉｎ－）をこれらの試験のために選択した。
【0172】
Ｘｉｄマウスは、ＰＨドメインに自然ミスセンス変異を有する。変異タンパク質は、原形質膜に非効率的に動員され、ＢＣＲシグナロソームに進入することができない。ＸｉｄとＢＴＫ－／－の両方のマウスの表現型は、おそらく他のＴｅｃキナーゼの冗長性のために、ＸＬＡの表現型よりも重症度が低い。Ｘｉｄマウスは、いくつかのタンパク質抗原に応答して正常量の抗体を産生するが、胸腺非依存性ＩＩ型抗原に対する抗体応答を開始することができない。これらのマウスは、血清ＩｇＭおよびＩｇＧ３が低く、Ｂ細胞の数が減少している。さらに、存在するＢ細胞は、表面ＩｇＭ対ＩｇＤ比が低下しており、Ｂ細胞成熟の障害を示唆している。ＢＴＫ欠損移行期２（Ｔ２）未成熟Ｂ細胞は、成熟Ｂ細胞を産生するのに必要なＢＣＲ依存性、生存促進性、増殖、および分化シグナルを生成することができない。これらの知見と一致して、ＢＣＲ依存性カルシウムシグナルは、ＢＴＫ欠損Ｂ細胞では著しく低下する（Ｎｇら、２０１０；Ｙｕら、２００４）。
【0173】
Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞におけるＢｔｋの発現と機能の両方を回復させるＬＶＶ候補をスクリーニングするために、ＬＶＶ形質導入細胞を、Ｂ細胞分化を支持する条件で培養する。Ｂ細胞サブタイプ発達の免疫表現型検査分析をフローサイトメトリーによって行う。これらの細胞のＢ細胞活性を実証するために、分化Ｂ細胞をインビトロで、リポ多糖（ＬＰＳ）で３～４日間刺激し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して培地へのＩｇＭ抗体の分泌を検出する。これらの細胞アッセイは、これらの結果が遺伝子改変細胞から必然的に生じるので、Ｂｔｋ機能およびＢ細胞分化能力を正確に測定することを可能にするので、ＬＶＶ候補のさらなる評価のための手段を提供する。
【0174】
ＢＴＫ ＬＶＶ候補ＮＴＸ１０１およびＮＴＸ１０９を、インビトロでＸｉｄ Ｌｉｎ－細胞におけるＢ細胞発達欠陥を修正するそれらの能力について上記のようにアッセイした。ＮＴＸ１０１とＮＴＸ１０９の両方が、図８Ａ～図８Ｂに示されるように、Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞におけるＧＦＰ発現を駆動し、ＮＴＸ１０９は、より高い百分率の細胞で、より高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）で発現した。さらに、図８Ｃに示されるように、ＮＴＸ１０１とＮＴＸ１０９の両方が、Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞のＢ細胞へのインビトロ分化速度を改善し、Ｂ細胞の百分率を、未形質導入Ｘｉｄにおける５．２％から、ＸｉｄＮＴＸ１０１において２８．４％およびＸｉｄＮＴＸ１０９において４２．６％にした。さらに、図８Ｄに示されるように、ＩｇＭ陽性細胞が、ＸｉｄＮＴＸ１０１形質導入細胞およびＸｉｄＮＴＸ１０９形質導入細胞において、未形質導入細胞における２．２％からそれぞれ１９．８％および２５．６％に上昇し、ＮＴＸ１０９がＸｉｄマウスのＢ細胞分化欠損を修正する能力をさらに証明した。
【実施例4】
【0175】
インビボでのマウスＸｉｄモデルにおけるＢＴＫ活性の機能回復に基づく最適化ＬＶ＿ＮＴＸベクターの効力試験
【0176】
Ｘｉｄマウスモデルを使用して、本明細書に開示されるリードＬＶＶ候補ＮＴＸ１０９がＢＴＫ機能を回復させるインビボ能力を評価した。重要なことに、この試験は、形質導入ＬＶＶの有効性および特異性の測定を容易にした。ＮＴＸ１０９を、Ｘｉｄドナーマウスのコホートの骨髄に由来するＨＳＰＣ（Ｌｉｎ－）にエキソビボで形質導入した。形質導入細胞を、致死線量照射Ｘｉｄレシピエントマウスの第２のコホートに移植した。
【0177】
ＮＴＸ１０９の機能をＸｉｄマウスにおいてインビボで試験するために、ＸｉｄＮＴＸ１０９ Ｌｉｎ－細胞を８匹の致死線量照射Ｘｉｄマウスに移植した。試験を移植後１４週間で終了し、血液、ＢＭおよび脾臓からの細胞単離物を各移植マウスおよび対照動物から回収した（図９Ａ）。陰性対照については、Ｘｉｄマウスに、ＢＴＫを含まないＬＶＶで形質導入したＸｉｄ細胞を移植した。ＣＢＡ／Ｃａナイーブマウスを陽性対照とした。造血系統（Ｂ、Ｔおよび骨髄）の再構成ならびにこれらの系統におけるＢｔｋ導入遺伝子の発現を評価した。ＶＣＮ／細胞を形質導入の６日後にエキソビボで測定したところ、１．１７±０．２であることが分かった。終了時に、骨髄中のＶＣＮ／細胞は、２．３±０．５ ＶＣＮ／細胞に達する中程度の増加を示した（図９Ｂ）。この臨床的に関連するＶＣＮ値は、治療の安全性を実証する。
【0178】
Ｂｔｋ導入遺伝子発現は、ＧＦＰ発現細胞の百分率によって提示され、図９Ｃおよび図９Ｄから分かるように、ＧＦＰ発現は、移植後１５週目でＢＭおよび脾臓において検出された。ＮＴＸ１０９発現パターンの特異性は、骨髄細胞およびＢ細胞で測定された高いＧＦＰレベルに基づいて決定されたように内因性Ｂｔｋ発現パターンと一致したが、Ｔ細胞はＧＦＰ陽性細胞の百分率が非常に低かった。ＧＦＰを発現するＴ細胞対ＧＦＰを発現するＢ細胞の比（Ｔ／Ｂ ＧＦＰ＋）は、脾臓において０．１であることが分かった。この低い値は、ＮＴＸ１０９がＸｉｄマウスにおいてＢＴＫ発現を生理学的に調節することを示す（図９Ｃ～図９Ｅ）。
【0179】
以前公開されたように、Ｘｉｄ脾臓Ｂ細胞は、Ｂ細胞成熟の遮断を示し、成熟Ｂ細胞の有意な減少および移行期細胞（Ｔ２）の増加を伴う。したがって、Ｂ細胞機能性の回復を、プロＢ細胞とプレＢ細胞との間ならびに未成熟Ｂ細胞と成熟Ｂ細胞との間の比を比較することによって試験した。実際、ＸｉｄＮＴＸ１０９ Ｌｉｎ－細胞の移植がＴ２期の遮断を除去し、Ｂ細胞集団を成熟状態に移行させたので、ＮＴＸ１０９はこの表現型を救済する能力を有する（図９Ｆ～図９Ｇ）。
【0180】
最終的に、抗体分泌を試験するために、脾細胞を形質導入の１４週間後に単離し、リポ多糖（ＬＰＳ）を使用してインビトロで刺激した。ＩｇＭレベルを刺激前および後に測定した（図１０ Ａ）。血清中の総ＩｇＭレベルを測定するために、ＭＡＢＴＥＣＨ ＩｇＭ ＥＬＩＳＡキットを使用した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｄａｎｙｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１００μｌの捕捉抗マウスＩｇＭでコーティングし、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。次に、ＥＬＩＳＡプレートを、ＲＴで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０＋０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ（インキュベーション緩衝液）中で１時間ブロッキングし、０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（洗浄緩衝液）中で５回洗浄した。血清を新たなインキュベーション緩衝液に添加し、ＲＴで２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、検出ビオチン化抗体を添加し、引き続いてインキュベーション緩衝液中１：１，０００に希釈したストレプトアビジンＨＲＰを添加した。ＲＴで１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を添加した（Ｍａｂｔｅｃｈ）。０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＯＤを４５０ ｎｍで読み取った。滴定されたＩｇＭ標準との比較によってＩｇＭレベルを定量化した。ＬＰＳ刺激に応答したＸｉｄＮＴＸ１０９ Ｌｉｎ－細胞の移植後の抗体分泌活性が、全臓器レベルで部分的に救済された（図１０Ｂ～図１０Ｃ）。Ｘｉｄ動物におけるこの部分的救済は、ＸｉｄマウスがＸＬＡをモデル化するのに役立った以前の刊行物と一致した。この部分的救済は、ＸＬＡ患者とは対照的に、Ｘｉｄマウスがほぼ正常な初期Ｂ細胞発達を示し、したがって初期Ｂ細胞選択的利点を欠くという事実によって説明することができるだろう。その理由から、細胞レベルで抗体分泌について試験することが重要である。この計算のために、ＮＴＸ１０９応答性Ｂ細胞（細胞の６７％）のみを考慮に入れ、Ｘｉｄｍｏｃｋ処置動物よりも有意に高い抗体分泌活性およびｗｔに匹敵する分泌を実証した（図１０Ｄ）。これらの測定に基づいて、本発明者らは、ＮＴＸ１０９が治療域に達し、ＸＬＡ患者の治療として使用される可能性を有すると結論付けた。
【0181】
本発明のある特定の特徴を本明細書で例示および説明してきたが、多くの修正、置換、変更、および等価物がここで当業者に思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の精神の範囲内に入る全てのこのような修正および変更を網羅することを意図していることを理解すべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【国際調査報告】