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特表2023-553355ヒトサイトメガロウイルスとの宿主細胞表面相互作用を調節するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-21
(54)【発明の名称】ヒトサイトメガロウイルスとの宿主細胞表面相互作用を調節するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20231214BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20231214BHJP
C07K 14/71 20060101ALI20231214BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231214BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231214BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231214BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231214BHJP
C07K 14/045 20060101ALI20231214BHJP
C12N 15/38 20060101ALI20231214BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20231214BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20231214BHJP
A61K 39/245 20060101ALN20231214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
C07K16/08
C07K14/71
C12N15/13
C12N15/12
C07K16/28
C07K16/46
C07K14/045
C12N15/38
A61K38/17
A61P31/22
A61K39/245
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023532266
(86)(22)【出願日】2021-11-26
(85)【翻訳文提出日】2023-07-24
(86)【国際出願番号】 US2021060887
(87)【国際公開番号】W WO2022115652
(87)【国際公開日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】63/118,859
(32)【優先日】2020-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】シフェリ， クラウディオ
(72)【発明者】
【氏名】クションサク， マルク
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA44
4C084DC50
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA02
4C085BA83
4C085BB12
4C085CC08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染を処置又は予防する方法であって、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体と原形質膜発現宿主細胞タンパク質との間の相互作用を調節することを含む方法、及びそのような相互作用のモジュレーターを同定する方法が本明細書で提供される。
【選択図】図２Ｃ
【選択図】図２Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、前記ｇＯサブユニットのグリコシル化フリー表面に結合し、ＰＤＧＦＲαへの前記ｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こす、モジュレーター。
【請求項2】
前記モジュレーターが、（ａ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ以上；
（ｂ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ以上；並びに
（ｃ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ以上
に結合する、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項3】
ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ以上；
（ｂ）前記ｇＯサブユニットのＮ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３；並びに
（ｃ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ以上
に結合し、ＰＤＧＦＲαへの前記ｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こす、モジュレーター。
【請求項4】
前記モジュレーターが、前記ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７、Ｙ２３８、Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１、Ｖ１２３、Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８の２３個全てに結合する、請求項２又は３に記載のモジュレーター。
【請求項5】
前記モジュレーターが、ＨＣＭＶのｇＨサブユニットの残基Ｒ４７、Ｙ８４及びＮ８５のうちの１つ以上に更に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項6】
前記モジュレーターが、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸である、請求項１～５のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項7】
前記阻害性核酸が、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡである、請求項６に記載のモジュレーター。
【請求項8】
前記抗原結合断片が、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項６に記載のモジュレーター。
【請求項9】
前記抗体が、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、請求項６に記載のモジュレーター。
【請求項10】
前記二重特異性抗体又は多重特異性抗体が、前記ｇＯサブユニットの少なくとも３つの別個のエピトープに結合する、請求項９に記載のモジュレーター。
【請求項11】
前記少なくとも３つの別個のエピトープが、（ａ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ以上を含む第１のエピトープと、
（ｂ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ以上を含む第２のエピトープと、
（ｃ）前記ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ以上を含む第３のエピトープと、
を含む、請求項１０に記載のモジュレーター。
【請求項12】
前記モジュレーターが、ＰＤＧＦＲαの模倣物である、請求項６に記載のモジュレーター。
【請求項13】
ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、ＰＤＧＦＲαのＤ１（配列番号１１）ドメイン、Ｄ２（配列番号１２）ドメイン、及びＤ３（配列番号１３）ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲαへの前記ｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こす、モジュレーター。
【請求項14】
前記モジュレーターが、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上；
（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上；並びに
（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうちの１つ以上、
に結合する、請求項１３に記載のモジュレーター。
【請求項15】
ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上；
（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上；並びに
（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうちの１つ以上、
に結合して、ＰＤＧＦＲαへの前記ｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こす、モジュレーター。
【請求項16】
前記モジュレーターが、ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８、Ｅ１０９、Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６、Ｌ２０８、Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５の１９個全てに結合する、請求項１４又は１５に記載のモジュレーター。
【請求項17】
前記モジュレーターが、ＰＤＧＦＲαの残基Ｅ５２、Ｓ７８及びＬ８０のうちの１つ以上に更に結合する、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項18】
前記モジュレーターが、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項19】
前記阻害性核酸が、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡである、請求項１８に記載のモジュレーター。
【請求項20】
前記抗原結合断片が、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項１８に記載のモジュレーター。
【請求項21】
前記抗体が、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、請求項１８に記載のモジュレーター。
【請求項22】
前記二重特異性抗体又は多重特異性抗体が、ＰＤＧＦＲαの少なくとも３つの別個のエピトープに結合する、請求項２１に記載のモジュレーター。
【請求項23】
前記少なくとも３つの別個のエピトープが、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上を含む第１のエピトープと、
（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上を含む第２のエピトープと、
（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうちの１つ以上を含む第３のエピトープと、
を含む、請求項２２に記載のモジュレーター。
【請求項24】
前記モジュレーターが、前記ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの模倣物である、請求項１８に記載のモジュレーター。
【請求項25】
前記モジュレーターが、前記ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも５０％減少させる、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項26】
前記モジュレーターが、ＨＣＭＶ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも９０％減少させる、請求項２５に記載のモジュレーター。
【請求項27】
前記モジュレーターが、前記ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも５０％減少させる、請求項１～２６のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項28】
結合の前記減少が、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項29】
前記モジュレーターが、下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域と最小限の結合を有する、請求項１～２８のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項30】
前記モジュレーターが、下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域に結合しない、請求項１～２８のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項31】
下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの前記領域が、ＰＤＧＦの結合部位である、請求項２９又は３０に記載のモジュレーター。
【請求項32】
前記モジュレーターが、前記モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達の２０％未満の減少を引き起こす、請求項１～３１のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項33】
前記モジュレーターが、前記モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達の減少を引き起こさない、請求項３２に記載のモジュレーター。
【請求項34】
前記モジュレーターが、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす、請求項１～３３のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項35】
偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染が少なくとも４０％減少する、請求項３４に記載のモジュレーター。
【請求項36】
薬学的に許容され得る担体を更に含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項37】
個体におけるＨＣＭＶ感染を処置するための方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～３６のいずれか一項に記載のモジュレーターを前記個体に投与し、それにより前記個体を処置することを含む、方法。
【請求項38】
ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度が、前記モジュレーターを投与されていない個体と比較して少なくとも４０％減少する、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～３６のいずれか一項に記載のモジュレーターを前記個体に投与し、それにより前記個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む、方法。
【請求項40】
個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～３６のいずれか一項に記載のモジュレーターを前記個体に投与し、それにより前記個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む、方法。
【請求項41】
前記二次感染が、非感染組織のＨＣＭＶ感染である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記個体が、免疫無防備状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２７日に出願された米国特許出願第６３／１１８，８５９号の優先権を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１１月２７日に出願された米国特許出願第６３／１１８，８５９号の優先権を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２１年１１月１５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は５０４７４－２４７ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１＿１５＿２０２１＿ＳＴ２５であり、サイズは２６，１８０バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２１年１１月１５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は５０４７４－２４７ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１＿１５＿２０２１＿ＳＴ２５であり、サイズは２６，１８０バイトである。
【0003】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染を処置又は予防する方法であって、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体と原形質膜発現宿主細胞タンパク質との間の相互作用を調節することを含む方法、及びそのような相互作用のモジュレーターを同定する方法が本明細書で提供される。
【背景技術】
【0004】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス科のベータヘルペスウイルス亜科のメンバーであり、ヒト集団の７０％超において生涯感染を確立する。一次感染後、ＨＣＭＶは潜在性になり、その再活性化は、免疫抑制されているか、又は臓器若しくは造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を受けている個体において重篤な罹患率及び死亡率を引き起こす。ＨＣＭＶは、胎盤関門を通過して胎児に感染する能力のために、妊娠中に特に脅威となる。ＨＣＭＶ感染は、新生児の０．３％～２．３％が罹患し、脳損傷、難聴、学習障害、心疾患及び精神遅滞を含む先天性出生時欠損の主要なウイルス原因となる。これらの理由から、ＨＣＭＶは、医学研究所によって最優先の疾患標的として特定されている。有効な抗ウイルス治療薬又はワクチンは、宿主細胞へのウイルス侵入を含むＨＣＭＶ感染サイクルの初期段階を標的とすべきである。ＨＣＭＶは、２つのｇＨｇＬエンベロープ糖タンパク質複合体、ｇＨｇＬｇＯ（三量体）及びｇＨｇＬｐＵＬ１２８－１３１Ａ（五量体）、並びに糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を含むいくつかのエンベロープ糖タンパク質複合体を使用して、異なる細胞株に入る。細胞宿主受容体へのＨＣＭＶ三量体又は五量体結合は、まだ同定されていない機構を介して、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＢがウイルスと感染細胞との間の膜融合を触媒するためのトリガーシグナルを提供する。この融合は、ＨＣＭＶが細胞に侵入し、複製し、その潜伏期間を確立することを可能にする。
【0005】
ＨＣＭＶは、構造的及び機能的に別個の受容体タンパク質との相互作用を介して、線維芽細胞、単球、マクロファージ、ニューロン、上皮細胞及び内皮細胞を含む広範な向細胞性を示す。最近の証拠は、全ての細胞型の感染に対する三量体複合体の主要な役割を示唆した。線維芽細胞の三量体媒介感染は最もよく研究されており、三量体と受容体チロシンキナーゼ３（ＲＴＫ３）ファミリーのメンバーであるＰＤＧＦＲαとの相互作用を伴う。ＴＧＦβＲ３はまた、ＨＣＭＶ三量体に高親和性で結合することが見出され、ＨＣＭＶの広範な向細胞性を説明し得る更なる推定細胞受容体を表す。
【0006】
過去数十年の間に、ＨＣＭＶ感染に対するワクチン候補を開発するための重要な努力が確立されてきた。しかしながら、最近の臨床試験からの結果は、ＨＣＭＶワクチンがウイルス感染の予防において中程度の有効性しか示さなかったことを示した。したがって、ＨＣＭＶに対する有効な治療薬の開発は、重要な満たされていない医学的必要性を表す。
【発明の概要】
【0007】
一態様では、本開示は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、ｇＯサブユニットのグリコシル化フリー表面に結合してＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0008】
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ以上、（ｂ）ｇＯサブユニットの残基Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３の１つ以上、並びに（ｃ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８の１つ以上に結合する。
【0009】
別の態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ以上、（ｂ）ｇＯサブユニットのＮ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３；並びに（ｃ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ以上に結合し、ＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0010】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７、Ｙ２３８、Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１、Ｖ１２３、Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８の２３個全てに結合する。
【0011】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶのｇＨサブユニットの残基Ｒ４７、Ｙ８４及びＮ８５のうちの１つ以上に更に結合する。
【0012】
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸である。いくつかの態様では、阻害性核酸はＡＳＯ又はｓｉＲＮＡである。
【0013】
いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
【0014】
いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。いくつかの態様では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、ｇＯサブユニットの少なくとも３つの別個のエピトープに結合する。いくつかの態様では、少なくとも３つの別個のエピトープは、（ａ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ以上を含む第１のエピトープと、（ｂ）ｇＯサブユニットの残基Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ以上を含む第２のエピトープと、（ｃ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ以上を含む第３のエピトープとを含む。
【0015】
いくつかの態様では、モジュレーターはＰＤＧＦＲαの模倣物である。
【0016】
別の態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、ＰＤＧＦＲαのＤ１（配列番号１１）ドメイン、Ｄ２（配列番号１２）ドメイン、及びＤ３（配列番号１３）ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0017】
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上、（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上、並びに（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうち１つに結合する。
【0018】
別の態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上、（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上；並びに（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうちの１つ以上に結合し、ＰＤＧＦＲαに対するｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0019】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤＧＦＲαの残基Ｔ１０７、Ｅ１０８、Ｅ１０９、Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｙ２０６、Ｌ２０８、Ｅ２６３及びＫ２６５の１０個全てに結合する。
【0020】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤＧＦＲαの残基Ｅ５２、Ｓ７８及びＬ８０のうちの１つ以上に更に結合する。
【0021】
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸である。いくつかの態様では、阻害性核酸はＡＳＯ又はｓｉＲＮＡである。
【0022】
いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
【0023】
いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。いくつかの態様では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、ＰＤＧＦＲαの少なくとも３つの別個のエピトープに結合する。いくつかの態様では、少なくとも３つの別個のエピトープは、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上を含む、第１のエピトープと、（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上を含む第２のエピトープと、（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５の１つ以上を含む第３のエピトープ、を含む。
【0024】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットの模倣物である。
【0025】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットのＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ三量体のｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも９０％減少させる。
【0026】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも５０％減少させる。
【0027】
いくつかの態様では、結合の減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される。
【0028】
いくつかの態様では、モジュレーターは、下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域と最小限の結合を有する。
【0029】
いくつかの態様では、モジュレーターは、下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域に結合しない。
【0030】
いくつかの態様では、下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域はＰＤＧＦの結合部位である。
【0031】
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達の２０％未満の減少を引き起こす。
【0032】
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達の減少を引き起こさない。
【0033】
いくつかの態様では、モジュレーターは、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。
【0034】
いくつかの態様では、モジュレーターは、薬学的に許容され得る担体を更に含む。
【0035】
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を処置する方法であって、有効量の本明細書に提供されるモジュレーターを個体に投与し、それにより個体を処置することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度は、モジュレーターを投与されていない個体と比較して少なくとも４０％減少する。
【0036】
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防する方法であって、有効量の本明細書に提供されるモジュレーターを個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。
【0037】
別の態様では、本開示は、個体における二次ＨＣＭＶ感染の予防方法であって、有効量の本明細書に提供されるモジュレーターを個体に投与し、それにより個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、二次感染は、非感染組織のＨＣＭＶ感染である。いくつかの態様では、個体は、免疫無防備状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1A】図１Ａは、中和Ｆａｂ １３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９に結合したヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨｇＬｇＯ糖タンパク質三量体複合体を示す全体的な低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）マップである。赤色：ｇＯサブユニット。ピンク色：ｇＬサブユニット。青色：ｇＨサブユニット。灰色（左）：Ｆａｂ １３Ｈ１１。灰色（右）：Ｆａｂ Ｍｓｌ－１０９。
【図2C】図２Ｃは、ｇＨのＮ末端、ｇＬ及びｇＯを示すＨＣＭＶの三量体の遠位領域の正面図（上のパネル）並びに残基Ａ１３１とＶ１５１との間のｇＬループ、及びｇＬ残基Ｃ１４４とｇＯ残基Ｃ３４３との間のジスルフィド結合を強調するｇＬ－ｇＯ相互作用領域の拡大図（下のパネル）を示す一対の図である。赤色：ｇＯサブユニット。ピンク色（上のパネル）：ｇＬサブユニット。青色：ｇＨサブユニット。
【図2D】図２Ｄは、ｇＨのＮ末端、ｇＬ、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１及びＵＬ１２８を示すＨＣＭＶ五量体の遠位領域の正面図（上のパネル）、並びに残基Ａ１３１とＶ１５１との間のｇＬヘリックス、及びｇＬ残基Ｃ１４４とＵＬ１２８残基Ｃ１６２との間のジスルフィド結合を強調するｇＬ－ＵＬ１２８相互作用領域の拡大図（下のパネル）を示す一対の図である。ピンク色（上のパネル）：ｇＬサブユニット。青色：ＵＬ１３１。緑色：ＵＬ１２８。オレンジ色：ＵＬ１３０。
【図3A】図３Ａは、中和Ｆａｂ １３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９に結合したＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体複合体の正面図を示す図である。赤色：ｇＯサブユニット。ピンク色：ｇＬサブユニット。青色：ｇＨサブユニット。緑色及び薄緑色：１３Ｈ１１。オレンジ色及び薄いオレンジ色：Ｍｓｌ－１０９。
【図3B】図３Ｂは、ｇＨのＣ末端領域に結合した１３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９の可変Ｆａｂ領域を示す図である。挿入パネル１～３は、１３Ｈ１１とＨＣＭＶ三量体ｇＨサブユニットとの間の重要な相互作用部位の拡大図を示す。挿入パネル４は、Ｍｓｌ－１０９とＨＣＭＶ三量体ｇＨサブユニットとの間の重要な相互作用領域の拡大図を示す。ｇＨ上のＦａｂ接触領域はピンク色で強調されている。緑色：１３Ｈ１１。オレンジ色：Ｍｓｌ－１０９。
【図3C】図３Ｃは、ｇＨ（左）上の１３Ｈ１１の重鎖（暗緑色）及び軽鎖（薄緑色）についての１３Ｈ１１の可変Ｆａｂ領域及び強調された相互作用面、並びにｇＨ（右）上のＭｓｌ－１０９の重鎖（濃いオレンジ色）及び軽鎖（薄いオレンジ色）についてのＭｓｌ－１０９の可変Ｆａｂ領域及び強調された相互作用面の拡大図を示す図のセットである。
【図4B】図４Ｂは、示された二次構造要素を有するＨＣＭＶ ｇＯサブユニットのドメイン構成を示す概略図である。ドメイン１～５：Ｎ末端ベータ鎖。ドメイン６、９～１０、１２：中央アルファヘリックス。ドメイン１６～１７：Ｃ末端アルファヘリックス。
【図4C】図４Ｃは、構造比較のためのＨＣＭＶ ｇＯサブユニットのＣ末端ドメイン（左）、及びＦＬＴ３リガンドの短鎖サイトカインフォールド（右；ＰＤＢコード：３ＱＳ７）を示す一対の図である。ピンク色で示されるヘリックスは、サイトカインドメインに折り畳まれるｇＯ及びＦＬＴ３の領域を表す。
【図5A】図５Ａは、細胞表面受容体発見プラットフォームの結果の示されたヒト受容体タンパク質とのＨＣＭＶ三量体（株：Ｍｅｒｌｉｎ及びＶＲ１８１４）結合（最大シグナルのパーセントとして表される、ＨＣＭＶ三量体の正規化された結合シグナル）のレベルを示すグラフである。
【図5C】図５Ｃは、ＰＤＧＦＲαドメインＤ１～Ｄ３に結合したＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体複合体の正面図を示す図である。緑色：ＰＤＧＦＲα。赤色：ｇＯサブユニット。ピンク色：ｇＬサブユニット。青色：ｇＨサブユニット。
【図5D】図５Ｄは、ｇＯ、ｇＬ及びｇＨのＮ末端及びＰＤＧＦα Ｄ１～Ｄ４を含むＨＣＭＶ三量体遠位領域の図を示す図のセットである。ＰＤＧＦＲα Ｄ４は、宿主細胞膜に対する受容体の配向を示すために低い不透明度で示されている。下のパネルは、部位１～４の残基相互作用を示す。緑色：ＰＤＧＦＲαのＤ１～Ｄ４。赤色：ｇＯサブユニット。ピンク色：ｇＬサブユニット。青色：ｇＨサブユニット。
【図5F】図５Ｆは、ｇＯ及びｇＨについては９３種のヘルペスウイルス５株、ｇＬについては５９種のヘルペスウイルス５株の配列に基づくＨＣＭＶ ｇＯ－ｇＬ＋ｇＨのＮ末端の保存分析の結果を示す図である。保存範囲：低～高（緑色～紫色）。
【図5G】図５Ｇは、表２に記載の単一グリコシル化部位、又は電荷変異の組み合わせ（Ｅ５２Ｒ、Ｌ８０Ｒ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１１１Ｒ、Ｌ１３７Ｅ、Ｉ１３９Ｅ、Ｌ２０８Ｒ、Ｍ２６０Ｅ、Ｌ２６１Ｒ、Ｅ２６３Ｒ、Ｋ２６５Ｅ）が導入されたＰＤＧＦＲα－Ｆｃタンパク質に対するＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合レベル（野生型（ＷＴ）ＰＤＧＦＲαと比較したパーセント結合として表される）を示す棒グラフである。
【図6A】図６Ａは、細胞表面受容体発見プラットフォームの結果の示されたヒト受容体タンパク質とのＨＣＭＶ三量体（株：Ｍｅｒｌｉｎ及びＶＲ１８１４）結合（最大シグナルのパーセントとして表される、ＨＣＭＶ三量体の正規化された結合シグナル）のレベルを示すグラフである。
【図6B】図５Ｂは、ヒトＴＧＦβＲ３のドメイン構成を示す概略図である。ドメイン：オーファンドメイン２（ＯＤ２）、オーファンドメイン１（ＯＤ１）、Ｎ末端透明帯ドメイン（ＺＰ－Ｎ）、Ｃ末端透明帯ドメイン（ＺＰ－Ｃ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）。
【図6C】図６Ｃは、溶出したｇＨｇＬｇＯ－ＴＧＦβＲ３－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体についての２８０ｎｍでの吸光度を示すサイズ排除クロマトグラム（上のパネル）、及び示されたＳＥＣ画分中のｇＨｇＬｇＯ－ＴＧＦβＲ３－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の成分を示す対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像（下のパネル）である。クロマトグラム上及びＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像の横の点線は、等価なＳＥＣ溶出画分を示す。
【図6D】図６Ｄは、ＴＧＦβＲ３ ＯＤ２に結合したＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体複合体の正面図を示す図である。暗緑色：ＴＧＦβＲ３。赤色：ｇＯサブユニット。ピンク色：ｇＬサブユニット。青色：ｇＨサブユニット。
【図6F】図６Ｆは、ｇＯ及びｇＨについては９３種のヘルペスウイルス５株、ｇＬについては５９種のヘルペスウイルス５株の配列に基づくＨＣＭＶ ｇＯ－ｇＬ＋ｇＨのＮ末端の保存分析の結果を示す図である。保存範囲：低～高（緑色～紫色）。
【図6G】図６Ｇは、ＴＧＦβＲ３ ＯＤ１～ＯＤ２、ｇＯ、ｇＬ及びｇＨ Ｎ末端を示す、ＨＣＭＶ三量体遠位領域を拡大図で示す図のセットである。ＴＧＦβＲ３ ＯＤ１は、宿主細胞膜に対する受容体の配向を示すために低い不透明度で示されている。挿入パネルは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体とＴＧＦβＲ３との間の重要な相互作用部位（部位１～３）の拡大図を示す。赤色：ｇＯサブユニット。ピンク色：ｇＬサブユニット。青色：ｇＨサブユニット。緑色：ＴＧＦβＲ３ ＯＤ２。
【図6H】図６Ｈは、ＴＧＦβＲ３のＯＤ２ドメインとエンドグリン（ＰＤＢコード：５Ｉ０４）との構造比較を示す図のセットである。右パネルは、ＴＧＦβＲ３ α１及びエンドグリンのβ６とβ７との間の対応するループ領域の拡大図を示す。
【図7B】図７Ｂは、溶出されたｇＨｇＬｇＯ－ＴＧＦβＲ３及びｇＨｇＬｇＯ－ＰＤＧＦＲα－ＴＧＦβＲ３複合体についての２８０ｎｍでの吸光度を示すサイズ排除クロマトグラム（上のパネル）、並びに示されたＳＥＣ画分中のｇＨｇＬｇＯ－ＴＧＦβＲ３及びｇＨｇＬｇＯ－ＰＤＧＦＲα－ＴＧＦβＲ３複合体の成分を示す対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像（下のパネル）である。
【図7C】図７Ｃは、構造比較におけるＨＭＣＶ ｇＨｇＬｇＯ（赤色）に結合したＰＤＧＦＲα（緑色）、及びＰＤＧＦＢ－ＰＤＧＦＲβ共結晶構造に基づくＰＤＧＦＲαに結合したＰＤＧＦのモデル（ＰＤＧＦＢは図示せず；ＰＤＢコード：３ＭＪＧ）とを示す図である。
【図7D】図７Ｄは、ＰＤＧＦＲα－Ｆｃと接触させた野生型ｇＯ（三量体ＷＴ）及び又は変異型ｇＯ（三量体ＭＵＴ；Ｍ８４Ｒ、Ｆ１１１Ｒ、Ｒ１１７Ｅ、Ｆ１３６Ｒ、Ｒ２１２Ｅ、Ｒ２３０Ｅ、Ｒ２３４Ｅ、Ｒ３３６Ｅ、Ｆ３４２Ｅ、Ａ３５１Ｒ及びＮ３５８Ｒアミノ酸置換変異を有するｇＯ）のいずれかを有するＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体についてのＢＬＩ結合曲線を示すグラフのセットである。
【図7E】図７Ｅは、ＭＲＣ－５細胞における示されたＰＤＧＦＲα細胞シグナル伝達成分のレベルを示すウエスタンブロット分析である。ＨＭＣＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の非存在下（－）又は存在下（＋）で、野生型又は変異型ｇＯを用いて、増殖因子ＰＤＧＦ－ＡＡの添加後に、ＰＤＧＦＲαリン酸化（ｐＹ７６２、ｐＹ８４９）及び下流のシグナル伝達活性を評価した。（図７Ｄのように）
【図8A】図８Ａは、Ｆａｂ １３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９を用いたＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯの精製及び再構成プロセスを示す概略図である。ヒスチジン（ＨＩＳ）；ストレプトアビジン（ＳＴＲＥＰ）；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。
【図8B】図８Ｂは、溶出したｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体についての２８０ｎｍでの吸光度を示すサイズ排除クロマトグラム（上のパネル）、及び示されたＳＥＣ画分中のｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の成分を示す対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像（下のパネル）である。クロマトグラム上及びＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像の横の点線は、等価なＳＥＣ溶出画分を示す。
【図8G】図８Ｇは、ウィンドウイングされたフーリエシェル相関（ＦＳＣ）によって推定された局所解像度に応じた表面着色を用いた収束リファインメント前のｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９ ３Ｄマップの等値面レンダリングを示す図である。分解能範囲：２．７から＞４．７Å（青色～赤色）。
【図10】図１０は、ｇＨのＤＩＩ－ＤＩＶ領域に結合した１３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９の可変Ｆａｂ領域の拡大図を示す図である。水素交換質量分析によって以前に同定されたｇＨ上のＦａｂ接触領域が強調されている。
【図11A】図１１Ａは、溶出したｇＨｇＬｇＯ－ＰＤＧＦＲα－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体についての２８０ｎｍでの吸光度を示すサイズ排除クロマトグラム（上のパネル）、及び示されたＳＥＣ画分中のｇＨｇＬｇＯ－ＰＤＧＦＲα－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の成分を示す対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像（下のパネル）である。クロマトグラム上及びＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像の横の点線は、等価なＳＥＣ溶出画分を示す。
【図11E】図１１Ｅは、ウィンドウイングされたＦＳＣによって推定された局所解像度に応じた表面着色を用いた収束リファインメント前のｇＨｇＬｇＯ－ＰＤＧＦＲα－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９ ３Ｄマップの等値面レンダリングを示す図である。
【図12A】図１２Ａは、ＰＤＧＦＲα（三量体委結合）及びＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦβは図示せず；ＰＤＢコード：３ＭＪＧ）、Ｋｉｔ（ＳＣＦは図示せず；ＰＤＢコード：２Ｅ９Ｗ）又はＦＭＳ（Ｍ－ＣＳＦは図示せず；ＰＤＢコード：３ＥＪＪ）のＤ１～Ｄ３の構造比較を示す図である。
【図12B】図１２Ｂは、ＰＤＧＦＲα（三量体結合）及びＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＢは図示せず；ＰＤＢコード：３ＭＪＧ）の個々のＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及びＤ３ドメインの構造比較を示す一連のリボン図である。
【図12E】図１２Ｅは、Ｄ１～Ｄ３領域のＰＤＧＦＲα構造に基づくＰＤＧＦＲβ配列への配列アラインメントを示す配列アラインメント図である。ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯとの相互作用部位（部位１～４）及びＰＤＧＦβとの相互作用部位は、赤色のボックスで強調されている。
【図13D】図１３Ｄは、ウィンドウイングされたＦＳＣによって推定された局所解像度に応じた表面着色を用いた収束リファインメント前のｇＨｇＬｇＯ－ＴＧＦβＲ３－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９ ３Ｄマップの等値面レンダリングを示す図である。分解能範囲：２．５から＞５Å（青色から赤色）。
【図13H】図１３Ｈは、エンドグリンＯＤ２配列に対するＯＤ２領域のＴＧＦβＲ３構造に基づく配列アラインメントを示す配列アラインメント図である。ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯとの相互作用部位（部位１～３）を赤色のボックスで強調している。
【図14A】図１４Ａは、溶出したＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３について２８０ｎｍでの吸光度を示す一対のサイズ排除クロマトグラム（左パネル）、並びに示されたＳＥＣ画分中のＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３を示す対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像（右パネル）である。
【発明を実施するための形態】
【0039】
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及び他の科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図する。場合によっては、一般的に理解されている意味を有する用語が、明確にするため及び／又は参照しやすいようにするために本明細書において定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及び他の科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図する。場合によっては、一般的に理解されている意味を有する用語が、明確にするため及び／又は参照しやすいようにするために本明細書において定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
【0040】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、この技術分野の当業者であれば容易に理解する、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書において、値又はパラメータについての「約」の参照は、それ自体がその値又はパラメータに向けられた側面を含む（及び説明する）。
【0041】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「単離されたペプチド」とは、１つ以上の単離されたペプチドを意味する。
【0042】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載された整数又は整数のグループの包含を意味するが、いかなる他の整数又は整数のグループの除外をも意味しないことが理解されるであろう。
【0043】
本明細書で互換的に使用される、「患者」、「対象」又は「個体」という用語は、ヒト患者を指す。
【0044】
薬物の「静脈内」すなわち「ｉｖ」用量、投与又は製剤は、静脈を介して、例えば点滴によって投与される。
【0045】
薬物の「皮下」すなわち「ｓｃ」用量、投与又は製剤は、例えば、プレフィルドシリンジ、自動注射器、又は他の装置を介して、皮膚の下に投与される。
【0046】
本明細書の目的のために、「臨床状態」とは、患者の健康状態をいう。それは例えば、患者の状態が良くなっている、又は悪くなっていることである。一実施形態では、臨床状態は、臨床状態の順序尺度に基づく。一実施形態では、臨床状態は、患者が熱を有するか否かに基づいていない。
【0047】
「有効量」は、不要な／望ましくない副作用を上回らない治療的／予防的利益（例えば、本明細書に記載される）をもたらすのに有効な薬剤（例えば、治療剤）の量を指す。
【0048】
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できないほどに有毒な更なる成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は無菌である。一実施形態では、製剤は静脈（ｉｖ）投与用である。別の実施形態では、製剤は皮下（ｓｃ）投与用である。
【0049】
本明細書における「天然配列」タンパク質は、天然に存在するタンパク質のバリアントを含む、天然に見られるタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。本明細書で使用される用語は、その天然源から単離されるタンパク質、又は組換え作製されるタンパク質を含む。
【0050】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理から生じるあらゆる形態のタンパク質を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアント、例えば、アミノ酸置換変異又はアミノ酸欠失変異を包含する。この用語はまた、タンパク質の単離された領域又はドメイン、例えば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
【0051】
「単離された」タンパク質又はペプチドは、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様では、タンパク質又はペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。
【0052】
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0053】
本明細書で使用される場合、「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）三量体」、「ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体」、及び「ＨＣＭＶ三量体」という用語は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のウイルスエンベロープの外面に位置し、ｇＨ、ｇＬ、及びｇＯ糖タンパク質サブユニットから構成される糖タンパク質複合体を指す。
【0054】
本明細書で使用される場合、「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＯサブユニット」、「ｇＯサブユニット」及び「ｇＯ」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源由来の任意の天然ｇＯを広く指す。この用語は、完全長ｇＯ及びｇＯの単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ｇＯの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトｇＯのアミノ酸配列は、配列番号１として提供される。軽微な配列バリエーション、特にｇＯの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないｇＯの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
【0055】
本明細書で使用される場合、「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨサブユニット」、「ｇＨサブユニット」及び「ｇＨ」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源由来の任意の天然ｇＨを広く指す。この用語は、完全長ｇＨ及びｇＨの単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ｇＨの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトｇＨのアミノ酸配列は、配列番号２として提供される。軽微な配列バリエーション、特にｇＨの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないｇＨの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
【0056】
本明細書で使用される場合、「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＬサブユニット」、「ｇＬサブユニット」及び「ｇＬ」という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源由来の任意の天然ｇＬを広く指す。この用語は、完全長ｇＬ及びｇＬの単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ｇＬの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトｇＬのアミノ酸配列は、配列番号３として提供される。軽微な配列バリエーション、特にｇＬの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないｇＬの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
【0057】
本明細書で使用される場合、「モジュレーター」は、所与の生物学的活性、例えば、相互作用又は相互作用から生じる下流活性を調節する（例えば、増加させる、減少させる、活性化する、又は阻害する）薬剤である。モジュレーター又は候補モジュレーターは、例えば、小分子、抗体（例えば、二重特異性又は多重特異性抗体）、抗原結合断片（例えば、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメイン）、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））であり得る。
【0058】
「増加させる」又は「活性化する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、又は９５％以上の全体的な増加を引き起こす能力を意味する。特定の態様では、増加させる又は活性化するとは、タンパク質間相互作用の下流活性を指すことができる。
【0059】
「減少させる」又は「阻害する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。特定の態様では、減少させる又は阻害するとは、タンパク質間相互作用の下流活性を指すことができる。
【0060】
「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、特に指示されない限り、結合対（例えば、受容体及びリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）によって表される。親和性は、本明細書に記載のものを含む当技術分野で一般的な方法により測定することができる。
【0061】
本明細書で使用される場合、「複合体」又は「複合体型」は、ペプチド結合ではない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性力）を介して互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一態様では、複合体はヘテロ多量体である。本明細書で使用される場合、「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」という用語は、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質実体（例えば、限定しないが、毒素又は検出剤などの化学分子を含む）を有する複合体が含まれることを理解するべきである。
【0062】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「トランスフェクトされた細胞」、「形質転換された細胞」、及び「形質転換体」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。いくつかの態様では、宿主細胞は、外因性核酸で安定して形質転換される。他の態様では、宿主細胞は、外因性核酸で一過性に形質転換される。
【0063】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【0064】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（例えば、ｂｉｓ－Ｆａｂ）を含めた、様々な抗体構造を包含する。
【0065】
「抗原結合断片」又は「抗体断片」とは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗原結合断片の例としては、限定されないが、ｂｉｓ－Ｆａｂ；Ｆｖ；Ｆａｂ；Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【0066】
「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、あるいは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片を指す。特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（例えば、米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照）。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨＨが含まれるが、これに限定されない。
【0067】
「Ｆａｂ」断片は、抗体のパパイン消化によって生成される抗原結合断片であり、Ｌ鎖全体と、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のパパイン消化により、２つの同一のＦａｂ断片を生成する。抗体のペプシン処理により単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは二価の抗原結合活性を有するジスルフィドで連結された２つのＦａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
【0068】
本明細書において「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって取り除かれ得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＬｙｓ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｌｙｓ４４７残基が除かれていない抗体集団、及びＬｙｓ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。
【0069】
「Ｆｖ」は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、かつ抗原結合特異性を抗体に与える６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各３つのループ）が生じる。ただし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であることが多いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【0070】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、交換可能に使用される。
【0071】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖中に接続するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖのレビューについては、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；Ｍａｌｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：７－１３，１９９５を参照されたい。
【0072】
用語「小分子」とは、分子量約２０００ダルトン以下、例えば約１０００ダルトン以下の任意の分子を指す。いくつかの態様では、小分子は小さな有機分子である。
【0073】
本明細書で使用される場合、「模倣物」又は「分子模倣物」という用語は、コンホメーション及び／又は結合能力において、所定のポリペプチドに対して又は前記ポリペプチドの結合パートナーに結合するための部分に対して十分な類似性（例えば、二次構造、三次構造）を有するポリペプチドを指す。模倣物は、それが模倣するポリペプチドと等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。分子模倣物は、それが模倣するポリペプチドと明らかなアミノ酸配列類似性を有していても、有していなくてもよい。模倣物は、自然に発生することもあれば、操作されることもある。いくつかの態様では、模倣物は、結合対のメンバーの模倣物である。更に他の態様では、模倣物は、結合対のメンバーに結合する別のタンパク質の模倣物である。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。
【0074】
本明細書で使用される場合、２つ以上のタンパク質の相互の「結合を可能にする条件」という用語は、２つ以上のタンパク質がモジュレーター又は候補モジュレーターの非存在下で相互作用するであろう条件（例えば、タンパク質濃度、温度、ｐＨ、塩濃度）を指す。結合を可能にする条件は個々のタンパク質によって異なり、タンパク質間相互作用アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイ、バイオレイヤー干渉法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、細胞外相互作用アッセイ、及び細胞表面相互作用アッセイ）の間で異なる可能性がある。
【0075】
基準となるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性最大パーセントが得られるように、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、基準となるポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。
【0076】
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
この場合、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
１００×分数Ｘ／Ｙ
この場合、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【0077】
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、処置される個体の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の望ましい効果には、限定するものではないが、疾患の発生又は再発の予防（例えば、ＨＣＭＶ感染又はその症状の予防）、感染症を有する患者における二次感染の低減又は予防（例えば、神経組織、免疫細胞、リンパ組織、及び／又は肺組織の二次感染の低減又は予防）、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解又は予後の改善が含まれる。
【0078】
疾患又は病態の「病理学」は、患者の健康を損なう全ての現象を含む。
【0079】
「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」、「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」、「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）」、「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」、又はそれらの同等物は、治療的処置及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指し、ここでその目的は、疾患又は病態、ＨＣＭＶ感染を改善する、予防する、減速させる（和らげる）、減少させる又は阻害することである。処置を必要とする者としては、疾患若しくは状態を既に有する者、並びに疾患若しくは状態を有する傾向にある者、又は疾患若しくは状態を予防する必要がある者が挙げられる。
【0080】
ＩＩ．タンパク質間相互作用のモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用の単離されたモジュレーターを特徴とし、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での結合と比較して、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３への結合の減少を引き起こす。
いくつかの態様では、本開示は、ＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用の単離されたモジュレーターを特徴とし、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での結合と比較して、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３への結合の減少を引き起こす。
【0081】
Ａ．ＰＤＧＦＲαとＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用のモジュレーター
ｉ．ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合するモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、ｇＯサブユニットのグリコシル化フリー表面に結合してＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
ｉ．ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合するモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、ｇＯサブユニットのグリコシル化フリー表面に結合してＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0082】
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ条（例えば、Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全て）、（ｂ）ｇＯサブユニットの残基Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ以上（例えば、Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又は１１個全て）、並びに（ｃ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ（例えば、Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ全て）に結合する。
【0083】
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ条（例えば、Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全て）、（ｂ）ｇＯサブユニットの残基Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ以上（例えば、Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又は１１個全て）、並びに（ｃ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ（例えば、Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ全て）に結合し、ＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0084】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７、Ｙ２３８、Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１、Ｖ１２３、Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８の２３個全てに結合する。
【0085】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶのｇＨサブユニットの残基Ｒ４７、Ｙ８４及びＮ８５のうちの１つ以上（例えば、Ｒ４７、Ｙ８４及びＮ８５のうちの１つ、２つ又は３つ全て）に更に結合する。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤＧＦＲαへのｇＨサブユニットの結合の減少を更に引き起こす。
【0086】
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸（例えば、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡ）である。モジュレーターについては、以下で更に説明する。
【0087】
いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。いくつかの態様では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、ｇＯサブユニットの少なくとも３つの別個のエピトープに結合する。いくつかの態様では、少なくとも３つの別個のエピトープは、（ａ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ２３０、Ｒ２３４、Ｖ２３５、Ｋ２３７及びＹ２３８のうちの１つ以上を含む第１のエピトープと、（ｂ）ｇＯサブユニットの残基Ｎ８１、Ｌ８２、Ｍ８４、Ｍ８６、Ｆ１０９、Ｆ１１１、Ｔ１１４、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｋ１２１及びＶ１２３のうちの１つ以上を含む第２のエピトープと、（ｃ）ｇＯサブユニットの残基Ｒ３３６、Ｙ３３７、Ｋ３４４、Ｄ３４６、Ｎ３４８、Ｅ３５４及びＮ３５８のうちの１つ以上を含む第３のエピトープとを含む。
【0088】
いくつかの態様では、モジュレーターはＰＤＧＦＲαの模倣物である。
【0089】
ｉｉ．ＰＤＧＦＲαを結合するモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、ＰＤＧＦＲαのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、及びＤ３ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、ＰＤＧＦＲαのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、及びＤ３ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲαへのｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0090】
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上（例えば、Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全て）、（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上（例えば、Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）；並びに（ｃ）ＰＤＧＦＲαのＮ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５の１つ以上（例えば、Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ全て）に結合する。
【0091】
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットと、ＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上（例えば、Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全て）、（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上（例えば、Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）；並びに（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうちの１つ以上（例えば、Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ全て）に結合し、ＰＤＧＦＲαに対するｇＯサブユニットの結合の減少を引き起こすモジュレーターを特徴とする。
【0092】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８、Ｅ１０９、Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６、Ｌ２０８、Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５の１９個全てに結合する。
【0093】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤＧＦＲαの残基Ｅ５２、Ｓ７８及びＬ８０のうちの１つ以上に更に結合する。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤＧＦＲαへのｇＨサブユニットの結合の減少を更に引き起こす。
【0094】
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸（例えば、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡ）である。モジュレーターについては、以下で更に説明する。
【0095】
いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。いくつかの態様では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、ＰＤＧＦＲαの少なくとも３つの別個のエピトープに結合する。いくつかの態様では、少なくとも３つの別個のエピトープは、（ａ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ１０３、Ｑ１０６、Ｔ１０７、Ｅ１０８及びＥ１０９のうちの１つ以上を含む、第１のエピトープと、（ｂ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｅ１４１、Ｉ１４７、Ｓ１４５、Ｙ２０６及びＬ２０８のうちの１つ以上を含む第２のエピトープと、（ｃ）ＰＤＧＦＲαの残基Ｎ２４０、Ｄ２４４、Ｑ２４６、Ｔ２５９、Ｅ２６３及びＫ２６５の１つ以上を含む第３のエピトープ、を含む。
【0096】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットの模倣物である。
【0097】
ｉｉｉ．結合及び／又は感染の減少
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ三量体のｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも９０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも５０％である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ三量体のｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも９０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも５０％である。
【0098】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ三量体のｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも９０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも５０％である。
【0099】
いくつかの態様では、モジュレーターは、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。いくつかの態様では、減少は、少なくとも ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％であるか、又は１００％（すなわち、感染は起こらない）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％）である。
【0100】
いくつかの態様では、モジュレーターは、下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域との結合が最小限であるか、又は下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域に結合しない。いくつかの態様では、下流シグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域はＰＤＧＦの結合部位である。いくつかの態様では、モジュレーターは、下流のシグナル伝達を誘発するＰＤＧＦＲαの領域へのＰＤＧＦＲαリガンドの結合を立体的に妨害しないか、又は立体障害は最小であり、例えばＰＤＧＦＲαへのＰＤＧＦの結合を立体的に妨害しないか、又は立体障害は最小である。
【0101】
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達の２０％未満の減少を引き起こす。いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達において５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満の減少を引き起こす（例えば、モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達の０％～５％、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、又は８５～９５％の減少を引き起こす）。いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＰＤＧＦＲαによるシグナル伝達の減少を引き起こさない。
【0102】
いくつかの態様では、モジュレーターは、薬学的に許容され得る担体を含む。
【0103】
Ｂ．ＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用のモジュレーター
ｉ．ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合するモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体と、（ａ）ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットの残基Ｑ１１５、Ｌ１１６、Ｒ１１７及びＫ１１８のうちの１つ以上（例えば、Ｑ１１５、Ｌ１１６、Ｒ１１７及びＫ１１８のうちの１つ、２つ、３つ又は４つ全て）、（ｂ）ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットの残基Ｙ１８８及びＰ１９１の一方又は両方、並びにＨＣＭＶ三量体のｇＬサブユニットの残基Ｎ９７；（ｃ）ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＬサブユニットの残基Ｔ９２及びＥ９４の一方又は両方に結合し、ＴＧＦβＲ３に対するＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合の減少を引き起こす、ＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーターを特徴とする。
ｉ．ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合するモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体と、（ａ）ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットの残基Ｑ１１５、Ｌ１１６、Ｒ１１７及びＫ１１８のうちの１つ以上（例えば、Ｑ１１５、Ｌ１１６、Ｒ１１７及びＫ１１８のうちの１つ、２つ、３つ又は４つ全て）、（ｂ）ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットの残基Ｙ１８８及びＰ１９１の一方又は両方、並びにＨＣＭＶ三量体のｇＬサブユニットの残基Ｎ９７；（ｃ）ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＬサブユニットの残基Ｔ９２及びＥ９４の一方又は両方に結合し、ＴＧＦβＲ３に対するＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合の減少を引き起こす、ＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーターを特徴とする。
【0104】
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸（例えば、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡ）である。いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
【0105】
ｉｉ．ＴＧＦβＲ３を結合するモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体と、（ａ）ＴＧＦβＲ３の残基Ｖ１３５、Ｑ１３６、Ｆ１３７及びＳ１４３のうちの１つ又は複数（例えば、Ｖ１３５、Ｑ１３６、Ｆ１３７、及びＳ１４３のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つ全て）、（ｂ）ＴＧＦβＲ３の残基Ｒ１５１、Ｎ１５２及びＥ１６７のうちの１つ以上；並びに（ｃ）ＴＧＦβＲ３の残基Ｗ１６３及びＫ１６６の一方又は両方に結合し、ＴＧＦβＲ３に対するＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合の減少を引き起こすＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体と、（ａ）ＴＧＦβＲ３の残基Ｖ１３５、Ｑ１３６、Ｆ１３７及びＳ１４３のうちの１つ又は複数（例えば、Ｖ１３５、Ｑ１３６、Ｆ１３７、及びＳ１４３のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つ全て）、（ｂ）ＴＧＦβＲ３の残基Ｒ１５１、Ｎ１５２及びＥ１６７のうちの１つ以上；並びに（ｃ）ＴＧＦβＲ３の残基Ｗ１６３及びＫ１６６の一方又は両方に結合し、ＴＧＦβＲ３に対するＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合の減少を引き起こすＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーターを特徴とする。
【0106】
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は阻害性核酸（例えば、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡ）である。いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
【0107】
ｉｉｉ．結合及び／又は感染の減少
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ三量体のｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも９０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも５０％である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ三量体のｇＯサブユニットの、ＴＧＦβＲ３への結合を少なくとも９０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも５０％である。
【0108】
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の前記ｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ三量体のｇＯサブユニットの、ＰＤＧＦＲαへの結合を少なくとも９０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも５０％である。
【0109】
いくつかの態様では、モジュレーターは、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。いくつかの態様では、減少は、少なくとも ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％であるか、又は１００％（すなわち、感染は起こらない）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％）である。
【0110】
いくつかの態様では、モジュレーターは、薬学的に許容され得る担体を含む。
【0111】
Ｃ．小分子
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは小分子である。小分子は、ＰＤＧＦＲα（例えば、そのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及び／又はＤ３ドメイン）、ＴＧＦβＲ３又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）に好ましくは特異的に結合し得る、本明細書で定義される結合ポリペプチド又は抗体以外の分子である。結合する小分子は、既知の方法論を使用して同定され、化学的に合成され得る（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。結合する小分子のサイズは、通常約２０００ダルトン未満（例えば、サイズが約２０００、１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満）であり、ここで、本明細書に記載のポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、既知の技術を使用して、過度の実験をすることなく同定され得る。この点については、ポリペプチド標的に結合することができる分子について小分子ライブラリをスクリーニングするための技術が当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照）。結合小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ－置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは小分子である。小分子は、ＰＤＧＦＲα（例えば、そのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及び／又はＤ３ドメイン）、ＴＧＦβＲ３又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）に好ましくは特異的に結合し得る、本明細書で定義される結合ポリペプチド又は抗体以外の分子である。結合する小分子は、既知の方法論を使用して同定され、化学的に合成され得る（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。結合する小分子のサイズは、通常約２０００ダルトン未満（例えば、サイズが約２０００、１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満）であり、ここで、本明細書に記載のポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、既知の技術を使用して、過度の実験をすることなく同定され得る。この点については、ポリペプチド標的に結合することができる分子について小分子ライブラリをスクリーニングするための技術が当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照）。結合小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ－置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【0112】
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、ｏｒ ９５％～１００％減少）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％を超えて増加、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％を超えて増加）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少）。
【0113】
Ｄ．抗体及び抗原結合断片
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合する抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合する抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
【0114】
いくつかの態様では、モジュレーターは多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の複数のエピトープ、ＰＤＧＦＲαの複数のエピトープ、又はＴＧＦβＲ３の複数のエピトープに結合する二重特異性又は多重特異性抗体である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３のうちの２つ又は３つ全てに結合する二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
【0115】
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、抗体又は抗原結合断片の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、ｏｒ ９５％～１００％減少）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ ３の結合は、抗体又は抗原結合断片の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％を超えて増加、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％を超えて増加）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、抗体又は抗原結合断片の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少）。
【0116】
Ｅ．ペプチド
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合するペプチドである。ペプチドは、天然に存在するペプチドであり得るか、又は操作され得るペプチドであり得る。いくつかの態様では、ペプチドは、ＰＤＧＦＲα（例えば、そのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及び／又はＤ３ドメイン）、ＴＧＦβＲ３、若しくはＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）の断片、又はＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合する別のタンパク質である。ペプチドは、完全長タンパク質と等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。いくつかの態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行する。他の態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合するペプチドである。ペプチドは、天然に存在するペプチドであり得るか、又は操作され得るペプチドであり得る。いくつかの態様では、ペプチドは、ＰＤＧＦＲα（例えば、そのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及び／又はＤ３ドメイン）、ＴＧＦβＲ３、若しくはＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）の断片、又はＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合する別のタンパク質である。ペプチドは、完全長タンパク質と等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。いくつかの態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行する。他の態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行するわけではない。
【0117】
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、ｏｒ ９５％～１００％減少）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ ３の結合は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％を超えて増加、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％を超えて増加）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少）。
【0118】
Ｆ．模倣物
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）に結合する模倣物、例えば分子模倣物である。模倣物は、ＰＤＧＦＲα（例えば、そのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及び／又はＤ３ドメイン）、ＴＧＦβＲ３若しくはＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）の分子模倣物、又はＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３若しくはＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合する別のタンパク質（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）であり得る。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）に結合する模倣物、例えば分子模倣物である。模倣物は、ＰＤＧＦＲα（例えば、そのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及び／又はＤ３ドメイン）、ＴＧＦβＲ３若しくはＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）の分子模倣物、又はＰＤＧＦＲα、ＴＧＦβＲ３若しくはＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体に結合する別のタンパク質（例えば、ｇＯ及び／又はｇＨ）であり得る。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。
【0119】
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、ｏｒ ９５％～１００％減少）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％を超えて増加、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％を超えて増加）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体へのＰＤＧＦＲα及び／又はＴＧＦβＲ３の結合は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少）。
【0120】
Ｇ．タンパク質間相互作用の調節のためのアッセイ
いくつかの態様では、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でのＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３及びＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合が、タンパク質－タンパク質相互作用についてのアッセイで評価される。相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の増加、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％超）の増加として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の減少、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％）の減少として同定され得る。タンパク質間相互作用のアッセイは、例えば、ＳＰＲアッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、細胞外相互作用アッセイ、又は細胞表面相互作用アッセイであり得る。
いくつかの態様では、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でのＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３及びＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合が、タンパク質－タンパク質相互作用についてのアッセイで評価される。相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の増加、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％超）の増加として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の減少、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％）の減少として同定され得る。タンパク質間相互作用のアッセイは、例えば、ＳＰＲアッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、細胞外相互作用アッセイ、又は細胞表面相互作用アッセイであり得る。
【0121】
タンパク質－タンパク質相互作用のモジュレーター、並びにそのような相互作用を調節し得る薬剤を同定するための例示的な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２５４７１に記載されている。
【0122】
ＩＶ．ＨＣＭＶ感染を処置又は予防する方法
Ａ．ＨＣＭＶ感染を有する個体を処置する方法
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を処置する方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーター及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体とＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体を処置することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、個体は、免疫無防備状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
Ａ．ＨＣＭＶ感染を有する個体を処置する方法
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を処置する方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーター及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体とＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体を処置することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、個体は、免疫無防備状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
【0123】
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度は、モジュレーターを投与されていない個体と比較して少なくとも４０％減少する。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％）減少する。
【0124】
Ｂ．ＨＣＭＶ感染又は二次感染を予防する方法
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防する方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーター及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体とＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防する方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーター及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体とＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。
【0125】
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での感染と比較して、個体におけるＨＣＭＶ感染の可能性を低下させる。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の可能性、程度、又は重症度は、未処置患者と比較して、又は対照方法（例えば、ＳＯＣ）を使用して処置された患者と比較して、上述の方法に従って処置された患者において、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少）減少する。
【0126】
いくつかの態様では、本開示は、個体（例えば、ＨＣＭＶ感染を有する個体）における二次ＨＣＭＶ感染の予防方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のｇＯサブユニットとＰＤＧＦＲαとの間の相互作用のモジュレーター及び／又はＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体とＴＧＦβＲ３との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、二次感染は、非感染組織のＨＣＭＶによる感染である。
【0127】
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での二次感染と比較して、個体における二次ＨＣＭＶ感染の可能性を低下させる。いくつかの態様では、二次ＨＣＭＶ感染の可能性、程度、又は重症度は、未処置患者と比較して、又は対照方法（例えば、ＳＯＣ）を使用して処置された患者と比較して、上述の方法に従って処置された患者において、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少）減少する。
【0128】
Ｃ．併用療法
上記の処置及び予防方法のいくつかの態様では、方法は、個体に少なくとも１つの追加の治療法（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は４つを超える追加の治療法）を投与することを含む。ＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用のモジュレーターは、少なくとも１つの追加の治療法の前、少なくとも１つの追加の治療法と同時に、又は少なくとも１つの追加の治療法の後に個体に投与され得る。
上記の処置及び予防方法のいくつかの態様では、方法は、個体に少なくとも１つの追加の治療法（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は４つを超える追加の治療法）を投与することを含む。ＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用のモジュレーターは、少なくとも１つの追加の治療法の前、少なくとも１つの追加の治療法と同時に、又は少なくとも１つの追加の治療法の後に個体に投与され得る。
【0129】
Ｄ．送達の方法
本明細書に記載の方法において利用される組成物（例えば、ＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用のモジュレーター、例えば、小分子、抗体、抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ）は任意の適切な方法で投与することができ、これには限定されないが、例えば、静脈内に、筋肉内に、皮下に、皮内に、経皮的に、動脈内に、腹腔内に、病変内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、髄腔内に、鼻腔内に、腟内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、眼窩内に、経口的に、経皮的に、硝子体内に（例えば、硝子体内注射により）、点眼により、吸入により、注射により、移植により、注入により、持続注入により、標的細胞を直接的に浸す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームに入れて、又は脂質組成物に入れて、を含む任意の好適な方法により投与され得る。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、全身的又は局所的に投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物又は組成物、及び処置される症状、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のモジュレーターは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口で、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に投与される。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが企図される。
本明細書に記載の方法において利用される組成物（例えば、ＰＤＧＦＲα又はＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用のモジュレーター、例えば、小分子、抗体、抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ）は任意の適切な方法で投与することができ、これには限定されないが、例えば、静脈内に、筋肉内に、皮下に、皮内に、経皮的に、動脈内に、腹腔内に、病変内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、髄腔内に、鼻腔内に、腟内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、眼窩内に、経口的に、経皮的に、硝子体内に（例えば、硝子体内注射により）、点眼により、吸入により、注射により、移植により、注入により、持続注入により、標的細胞を直接的に浸す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームに入れて、又は脂質組成物に入れて、を含む任意の好適な方法により投与され得る。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、全身的又は局所的に投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物又は組成物、及び処置される症状、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のモジュレーターは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口で、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に投与される。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが企図される。
【0130】
本明細書に記載されるタンパク質間相互作用のモジュレーター（及び任意の付加的治療剤）は、良好な医学的実践と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与され得る。この文脈において考慮すべき要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に公知な他の要因が含まれる。モジュレーターは、必要ではないが、任意に、問題の障害を予防又は処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化され、及び／又は同時に投与される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するモジュレーターの量、障害又は処置のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同投与量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投与量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投与量及び任意の経路で使用される。
【0131】
本明細書で引用された全ての特許、特許公報及び参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0132】
Ｖ．実施例
実施例１．ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯの構造
ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体構造の特徴付けは、その柔軟性、伸長性、及びその多数のグリコシル化部位のために過去に困難であることが証明されており、高解像度に回折する結晶の形成を妨げる可能性がある（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２：１７６７－１７７２，２０１５）。ｇＨｇＬｇＯ複合体とも呼ばれるＨＣＭＶ三量体の高分解能構造を決定するために、ｇＨｇＬｇＯ複合体の可溶性領域をＥｘｐｉ２９３細胞で組換え発現させ、複合体を高純度に精製した（図８Ａ）。以前の報告と一致して、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ及びｇＯをジスルフィド結合によって共有結合させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図８Ｂ）によって単一バンドとして泳動した（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２：１７６７－１７７２，２０１５）。ｇＨｇＬｇＯ複合体のサイズ、形状及び柔軟性による制限を克服するために、本発明者らは、ｇＨ特異的中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９（図８Ａ～８Ｉ）の断片抗原結合（Ｆａｂ）領域でｇＨｇＬｇＯを再構成した後のｃｒｙｏＥＭ及び単一粒子分析に注目した（Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８４：１００５－１０１３，２０１０；Ｆｏｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１１：８２０９－８２１４，２０１４）。両方のＦａｂの結合は、ｇＨｇＬｇＯ複合体のサイズ、安定性及び寸法を増加させ、高分解能ｃｒｙｏＥＭ調査を促進した（図８Ｃ及び図８Ｄ）。２Ｄクラス平均は、二次構造特徴及び異なる配向（図８Ｄ）における粒子整列を含む高度の詳細を示した。さらに、２Ｄクラス及び３Ｄ ａｂ－ｉｎｉｔｉｏ体積の二量体ｇＨｇＬｇＯ粒子の亜集団が認められた（図８Ｄ及び８Ｅ）。二量体ｇＨｇＬｇＯ粒子は、界面にわずかな小さな接触領域を有する対向する方向に頭尾部を配向させた。頭尾配向は、複合体の対向する末端におけるウイルス膜の位置決めを示唆しており、したがって生理学的に関連する可能性は低いと思われる。単量体ｇＨｇＬｇＯ複合体の周りにマスクを使用することにより、約２．９Åの分解能まで拡張したｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の高分解能構造を決定した（図１Ａ及び図８Ｆ～８Ｉ及び表１）。この複合体を３つの部分領域に分割して、収束ローカルリファインメントにおいて特異的マスクを使用してｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９分子全体にわたってマップ品質を更に改善した（図８Ｆ）。収束３Ｄ再構築の組み合わせにより、構造を構築し、配列をｇＨ、ｇＬ及びこれまで未知であったｇＯサブユニットの大部分、並びに両方のＦａｂの可変ドメイン（Ｆｖ）に割り当てることが可能になった（図１Ａ及び１Ｂ）。
実施例１．ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯの構造
ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体構造の特徴付けは、その柔軟性、伸長性、及びその多数のグリコシル化部位のために過去に困難であることが証明されており、高解像度に回折する結晶の形成を妨げる可能性がある（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２：１７６７－１７７２，２０１５）。ｇＨｇＬｇＯ複合体とも呼ばれるＨＣＭＶ三量体の高分解能構造を決定するために、ｇＨｇＬｇＯ複合体の可溶性領域をＥｘｐｉ２９３細胞で組換え発現させ、複合体を高純度に精製した（図８Ａ）。以前の報告と一致して、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ及びｇＯをジスルフィド結合によって共有結合させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図８Ｂ）によって単一バンドとして泳動した（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２：１７６７－１７７２，２０１５）。ｇＨｇＬｇＯ複合体のサイズ、形状及び柔軟性による制限を克服するために、本発明者らは、ｇＨ特異的中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９（図８Ａ～８Ｉ）の断片抗原結合（Ｆａｂ）領域でｇＨｇＬｇＯを再構成した後のｃｒｙｏＥＭ及び単一粒子分析に注目した（Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８４：１００５－１０１３，２０１０；Ｆｏｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１１：８２０９－８２１４，２０１４）。両方のＦａｂの結合は、ｇＨｇＬｇＯ複合体のサイズ、安定性及び寸法を増加させ、高分解能ｃｒｙｏＥＭ調査を促進した（図８Ｃ及び図８Ｄ）。２Ｄクラス平均は、二次構造特徴及び異なる配向（図８Ｄ）における粒子整列を含む高度の詳細を示した。さらに、２Ｄクラス及び３Ｄ ａｂ－ｉｎｉｔｉｏ体積の二量体ｇＨｇＬｇＯ粒子の亜集団が認められた（図８Ｄ及び８Ｅ）。二量体ｇＨｇＬｇＯ粒子は、界面にわずかな小さな接触領域を有する対向する方向に頭尾部を配向させた。頭尾配向は、複合体の対向する末端におけるウイルス膜の位置決めを示唆しており、したがって生理学的に関連する可能性は低いと思われる。単量体ｇＨｇＬｇＯ複合体の周りにマスクを使用することにより、約２．９Åの分解能まで拡張したｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の高分解能構造を決定した（図１Ａ及び図８Ｆ～８Ｉ及び表１）。この複合体を３つの部分領域に分割して、収束ローカルリファインメントにおいて特異的マスクを使用してｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９分子全体にわたってマップ品質を更に改善した（図８Ｆ）。収束３Ｄ再構築の組み合わせにより、構造を構築し、配列をｇＨ、ｇＬ及びこれまで未知であったｇＯサブユニットの大部分、並びに両方のＦａｂの可変ドメイン（Ｆｖ）に割り当てることが可能になった（図１Ａ及び１Ｂ）。
【表1】
【0133】
ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯの全体構造は、長さ１７０Å及び幅７０Åの相対寸法を有するブーツ様構造をとる（図１Ｂ）。３つのサブユニットは線形順序で相互作用し、ｇＨのＣ末端はＨＣＭＶウイルス膜の最も近位に配向し、ｇＯは受容体結合のための分子の遠位端を指す（図１Ａ及び１Ｂ）。ｇＬサブユニットは、複合体の中心でｇＨ及びｇＯサブユニットを架橋する（図１Ａ及び１Ｂ）。静電表面電荷は、複合体の近位ｇＨ領域に負電荷クラスタ及び遠位ｇＯ領域に正電荷クラスタを有するｇＨｇＬｇＯ複合体にわたって非対称に分布する（図１Ｃ）。同様に、観察された２２個のＮ結合型グリコシル化部位は、ｇＨ上に５個、ｇＬ上に１個及びｇＯ上に１６個を有するｇＨｇＬｇＯ複合体に沿って非対称に分布している。注目すべきことに、遠位ｇＯ領域、特に複合体全体の裏側に沿ってグリコシル化残基の濃縮が存在する（図１Ｄ）。対照的に、三量体複合体の前側は、３つ全てのサブユニットにおいてグリコシル化残基を欠いているようである（図１Ｄ）。このような表面電荷及びグリコシル化の非対称分布は、受容体相互作用及びｇＢのプレフュージョン立体配座との潜在的な相互作用に重要な意味を有し、したがって抗ウイルス戦略の設計を知らせるために使用することができる。
【0134】
タンパク質の発現及び精製。
ヒトヘルペスウイルス５、ｇＨ（１～７１６）、ｇＬ及びｇＯ（ｇＨ及びｇＬについてはＨＣＭＶ株Ｍｅｒｌｉｎ、並びにｇＯについてはＶＲ１８１４株）の最適化されたコードＤＮＡをそれぞれ、ＣＭＶプロモーターの後ろのｐＲＫベクターにクローニングした。Ｃ末端のＭｙｃ－Ａｖｉ－ＨｉｓタグをｇＨに付加し、Ｃ末端のＴｗｉｎ－ＳｔｒｅｐタグをｇＯに付加した。
ヒトヘルペスウイルス５、ｇＨ（１～７１６）、ｇＬ及びｇＯ（ｇＨ及びｇＬについてはＨＣＭＶ株Ｍｅｒｌｉｎ、並びにｇＯについてはＶＲ１８１４株）の最適化されたコードＤＮＡをそれぞれ、ＣＭＶプロモーターの後ろのｐＲＫベクターにクローニングした。Ｃ末端のＭｙｃ－Ａｖｉ－ＨｉｓタグをｇＨに付加し、Ｃ末端のＴｗｉｎ－ＳｔｒｅｐタグをｇＯに付加した。
【0135】
懸濁液中のＥｘｐｉ２９３細胞を、ＳＭＭ ２９３Ｔ－Ｉ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養し、細胞密度が４×１０６細胞／ｍｌに達したとき、ｇＨｇＬｇＯ発現のためＤＮＡを１：１：１の比で含むポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養した後、発現上清を回収した。
【0136】
ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯを以下のように精製した。３５ｌの発現体積に対応する発現上清をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって１～２ｌの体積に濃縮し、２０ｍｌのＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｅｘｃｅｌ（ｃｙｔｉｖａ）樹脂にロードし、１３カラム体積（ＣＶ）の洗浄緩衝液（３０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール）で洗浄し、５ ＣＶ溶出緩衝液（３０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、４００ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶離液を３ｍｌのＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴ高親和性樹脂（ＩＢＡ）に適用し、２時間結合させた。樹脂を１０ＣＶ Ｓｔｒｅｐ－ｗａｓｈ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で洗浄し、５０ ｍＭビオチンを補充したＳｔｒｅｐ－ｗａｓｈ緩衝液中でビーズから溶出した。溶出液をＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ））で濃縮し、三量体－ＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００又は１０／６０カラムにロードした。
【0137】
Ｆａｂ Ｍｓｌ－１０９の重鎖及び軽鎖を、リン酸制限培地（Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ）中、３０℃で２０時間、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３４Ｂ８細胞においてｐｈｏＡプロモーター下で共発現させた。１Ｌの発現量からのペレットを、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤の錠剤が補充された７０ｍｌの溶解緩衝液（１×ＰＢＳ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。溶解物を２５，０００×ｇで１時間の遠心分離によって清澄化し、続いて０．４５μｍフィルタにかけた。清澄化した溶解物を、溶解緩衝液中で平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ（ｃｙｔｉｖａ）カラムにロードした。カラムを１０－２０ ＣＶ溶解緩衝液で洗浄し、０．５８％（ｖ／ｖ）酢酸で溶出した。ＳＰ－Ａ緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）の添加によって溶出液のｐＨを直ちに調整し、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ｃｙｔｉｖａ）にロードした。ＳＰ－Ｂ緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）に対して線形２０ ＣＶ勾配でＦａｂを溶出した。溶出液をＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタデバイス（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）を用いて濃縮し、Ｆａｂ－Ｓ２００バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００カラムで更に精製した。精製したＦａｂをＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ遠心フィルタデバイス（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、液体窒素で凍結し、－８０℃で保存した。１３Ｈ１１抗体を前述のように精製した（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，１１：ｅ１００５２３０，２０１５）。
【0138】
ヒト受容体タンパク質によるＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の再構成及びＦａｂの中和
１８．３μＭのｇＨｇＬｇＯ（３００μｇ）と、３０μＭの過剰なＦａｂ １３Ｈ１１（１５０μｇ）及び３０μＭのＭｓｌ－１０９（１５０μｇ）とを氷上で３０分間インキュベートすることによって、ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を組み立てた。ＳＥＣ－ｒｅｃｏｎｓｔ－１緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムでの精製によって過剰のＦａｂを除去した。ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製のために、ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９の主ピーク画分をＳＥＣ－ｒｅｃｏｎｓｔ－１緩衝液で０．４ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。
１８．３μＭのｇＨｇＬｇＯ（３００μｇ）と、３０μＭの過剰なＦａｂ １３Ｈ１１（１５０μｇ）及び３０μＭのＭｓｌ－１０９（１５０μｇ）とを氷上で３０分間インキュベートすることによって、ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を組み立てた。ＳＥＣ－ｒｅｃｏｎｓｔ－１緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムでの精製によって過剰のＦａｂを除去した。ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製のために、ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９の主ピーク画分をＳＥＣ－ｒｅｃｏｎｓｔ－１緩衝液で０．４ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。
【0139】
Ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製及びデータ取得
ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、以下に記載されるようにして調製した。Ｓｏｌａｒｕｓ（商標）プラズマ洗浄器（Ｇａｔａｎ）を使用して、Ｈｏｌｅｙ ｃａｒｂｏｎ ｇｒｉｄ（Ａｕ／Ｐｄ ８０／２０で被覆されたＣ－Ｆｌａｔ ４５ｎｍ Ｒ １．２／１．３ ３００メッシュ；Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ）を１０秒間グロー放電させた。複合体を０．０２５％ＥＭグレードのグルタルアルデヒドで室温にて１０分間穏やかに架橋し、９ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５でクエンチした。３μｌの試料（ここでは約０．４ｍｇ／ｍｌ）をグリッドに適用した。グリッドを、湿度１００％の２．５秒のブロッティング時間を使用してＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中で急冷した。
ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、以下に記載されるようにして調製した。Ｓｏｌａｒｕｓ（商標）プラズマ洗浄器（Ｇａｔａｎ）を使用して、Ｈｏｌｅｙ ｃａｒｂｏｎ ｇｒｉｄ（Ａｕ／Ｐｄ ８０／２０で被覆されたＣ－Ｆｌａｔ ４５ｎｍ Ｒ １．２／１．３ ３００メッシュ；Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ）を１０秒間グロー放電させた。複合体を０．０２５％ＥＭグレードのグルタルアルデヒドで室温にて１０分間穏やかに架橋し、９ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５でクエンチした。３μｌの試料（ここでは約０．４ｍｇ／ｍｌ）をグリッドに適用した。グリッドを、湿度１００％の２．５秒のブロッティング時間を使用してＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中で急冷した。
【0140】
Ｋ２ Ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器カメラ（Ｇａｔａｎ）を備えた生物量子エネルギーフィルタを有する３００ｋｅＶで動作するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓで、ＳｅｒｉａｌＥＭを使用してムービースタックを収集した（Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．Ｏｃｔ；１５２（１）：３６－５１，２００５）。画像は、２０ｅＶのエネルギースリットを使用して、ピクセルあたり０．８２４Åに相当する１６５，０００倍の倍率で記録した。各画像スタックは、約５０ｅÅ－２の蓄積線量及び１０秒の総露光時間に対して０．２秒ごとに記録された５０個のフレームを含む。０．５～１．５μｍの設定された焦点ずれ範囲で画像を記録した。
【0141】
Ｃｒｙｏ－ＥＭデータ処理
ＲＥＬＩＯＮ（Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，１８０（３）：５１９－３０，２０１２）及びｃｉｓＴＥＭ（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，７（７）：ｅ３５３８３，２０１８）ソフトウェアパッケージの組み合わせを使用して、Ｃｒｙｏ－ＥＭデータを処理した。
ＲＥＬＩＯＮ（Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，１８０（３）：５１９－３０，２０１２）及びｃｉｓＴＥＭ（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ，７（７）：ｅ３５３８３，２０１８）ソフトウェアパッケージの組み合わせを使用して、Ｃｒｙｏ－ＥＭデータを処理した。
【0142】
ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体について、合計１４，７１７本の動画を、ＲＥＬＩＯＮにおけるＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（４）：３３１－３３２，２０１７）実装を使用してフレーム動きについて補正し、コントラスト伝達関数パラメータを、ＣＴＦＦＩＮＤ－４（Ｒｏｈｏｕ ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，１９２（２）：２１６－２，２０１５）を用いてスペクトルの３０～４．５Å帯域を使用して適合させた。最初のａｂ－ｉｎｉｔｉｏ ３Ｄ再構成の生成のために、４Åよりも良好な検出された適合分解能に基づいて画像をフィルタにかけた。ｃｉｓＴＥＭ内のサーキュラーブロブ選別ツールを使用して、合計９７４，７６６個の粒子を選別した。粒子を２ラウンドのｃｉｓＴＥＭ ２Ｄ分類で選別して、最良に整列する粒子を選択し、３１３，１９６個の粒子を得た。これらの粒子を、３つの標的体積を有するｃｉｓＴＥＭ内でａｂ－ｉｎｉｔｉｏ生成に供した。単一のＨＣＭＶ三量体に対応する体積を、単一の（単量体）ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の周りにマスクを用い、マスクの外側にローパスフィルタ（ＬＰＦ）を適用することによって、ｃｉｓＴＥＭ自動リファイン及びマニュアルリファインメントの基準として使用した。このマップを、高解像度３Ｄリファインメントの３Ｄ基準として使用した。
【0143】
ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の高分解能３Ｄ再構成の生成のために、ＣＴＦ適合画像を、６Åより良好な検出された適合分解能に基づいてフィルタにかけた。３０ÅローパスフィルタにかけたｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体参照構造を用いて、ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）によるテンプレートマッチングによって合計１，４７８，６４０個の粒子を採取した。ＲＥＬＩＯＮ ２Ｄ分類中に粒子を選別し、選択した１，３５０，２１１個の粒子を３ＤリファインメントのためにｃｉｓＴＥＭにインポートした。ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９ ３Ｄ再構成は、単一（モノマー）ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の周りのマスクを用い、マスクの外側にローパスフィルタ（ＬＰＦ）を適用し（フィルタ分解能２０Å）、スコア閾値を０．２５にすることによって自動リファイン及びマニュアルリファインメントを行った後に得られた。これにより、外側重量は、反復的なマニュアルリファインメントメントラウンドで０．５から０．１５に徐々に減少した。三次元再構成は、２．９Å（フーリエシェル相関（ＦＳＣ）＝０．１４３、ｃｉｓＴＥＭで測定）のマップ分解能に収束した。マップの品質を改善するために、マスクを使用してマップを３つの別個の領域に分割した後に収束リファインメントを取得し、上述のようにマスクの外側のマニュアルリファインメントメントローパスフィルタ（ＬＰＦ）を取得した。以下のパラメータ：８Åの分解能からの平坦化、逆空間の原点から－９０Å２の事前カットオフＢ因子の適用、及び性能指数フィルタ（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３３３（４）：７２１－４５，２００３）の適用を用いて、集束マップをｃｉｓＴＥＭで鮮明にした。モデル構築及び図面作成のために、ｐｈｅｎｉｘ ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｆｏｃｕｓｅｄ＿ｍａｐｓを使用して、３つの個々の収束３Ｄマップから合成マップを生成した。
【0144】
モデル構築及び構造解析
ＨＣＭＶ五量体構造（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２：ｅａａｎ１４５７，２０１７）のｇＨ及びｇＬサブユニットを剛体としてｃｒｙｏ－ＥＭマップに当てはめた。ｇＯサブユニットを高解像度ｃｒｙｏ－ＥＭマップにｄｅ－ｎｏｖｏで構築した。得られたモデルを剛体としてｃｒｙｏ－ＥＭマップに当てはめた。広範な再構築及びマニュアル調整の後、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，７４（Ｐｔ ９）：８１４－８４０，２０１８）ツールを使用して複数回の実空間精密化を使用して、初期モデルとマップとの間のグローバル構造差を補正した。モデルの構築及びｐｈｅｎｉｘでの実空間のリファインメントの反復ラウンドを通して、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（Ｐｔ ４）：４８６－５０１，２０１０）でモデルをさらにマニュアルで調整した。モデルを、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙスコアリング（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：２９３－３１５，２０１８）を組み込んだｐｈｅｎｉｘ．ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ｃｒｙｏｅｍ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，７４（Ｐｔ ９）：８１４－８４０，２０１８）を使用して検証した。図は、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，ｖ．２．０７ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）、ＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｇｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：１４－２５，２０１８）を使用して作成した。３ Ｄ相同性構造解析を、ＤＡＬＩサーバ（Ｈｏｌｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２１１２：２９－４２，２０２０）を使用して行った。配列を、ＪａｌＶｉｅｗ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５（９）：１１８９－９１，２００９）内のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．，７：５３９，２０１１）を使用して整列させ、ＥＳＰｒｉｐｔ ３．０（Ｒｏｂｅｒｔ ａｎｄ Ｇｏｕｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ発行）：Ｗ３２０－４，２０１４）を用いて例示し、続いてＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９又はＴＧＦＲβ３－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９構造モデルからの考察に基づいて手動で調整した。
ＨＣＭＶ五量体構造（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２：ｅａａｎ１４５７，２０１７）のｇＨ及びｇＬサブユニットを剛体としてｃｒｙｏ－ＥＭマップに当てはめた。ｇＯサブユニットを高解像度ｃｒｙｏ－ＥＭマップにｄｅ－ｎｏｖｏで構築した。得られたモデルを剛体としてｃｒｙｏ－ＥＭマップに当てはめた。広範な再構築及びマニュアル調整の後、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，７４（Ｐｔ ９）：８１４－８４０，２０１８）ツールを使用して複数回の実空間精密化を使用して、初期モデルとマップとの間のグローバル構造差を補正した。モデルの構築及びｐｈｅｎｉｘでの実空間のリファインメントの反復ラウンドを通して、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（Ｐｔ ４）：４８６－５０１，２０１０）でモデルをさらにマニュアルで調整した。モデルを、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙスコアリング（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：２９３－３１５，２０１８）を組み込んだｐｈｅｎｉｘ．ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ｃｒｙｏｅｍ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，７４（Ｐｔ ９）：８１４－８４０，２０１８）を使用して検証した。図は、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，ｖ．２．０７ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）、ＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｇｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：１４－２５，２０１８）を使用して作成した。３ Ｄ相同性構造解析を、ＤＡＬＩサーバ（Ｈｏｌｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２１１２：２９－４２，２０２０）を使用して行った。配列を、ＪａｌＶｉｅｗ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５（９）：１１８９－９１，２００９）内のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．，７：５３９，２０１１）を使用して整列させ、ＥＳＰｒｉｐｔ ３．０（Ｒｏｂｅｒｔ ａｎｄ Ｇｏｕｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ発行）：Ｗ３２０－４，２０１４）を用いて例示し、続いてＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９又はＴＧＦＲβ３－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９構造モデルからの考察に基づいて手動で調整した。
【0145】
実施例２．ＨＣＭＶ三量体及び五量体特異的サブユニットのアセンブリの構造的基礎
ＨＣＭＶにおける三量体及び五量体特異的集合体を媒介する構造決定因子は、未知のままである。三量体及び五量体の両方は、それらのｇＨ及びｇＬサブユニットを共有するが、受容体認識を媒介する遠位サブユニットｇＯ及びＵＬ１２８～１３１の組成はそれぞれ異なる（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２：１７６７－１７７２，２０１５）。三量体では、４つのｇＨドメイン（ＤＩ～ＩＶ）は膜近位面から直線的に離れて延び、ｇＨ（ＤＩ）のＮ末端領域は、分子の膜遠位領域付近でｇＬを共に折り畳む（図１Ｂ及び９）。ＵＬ１３０特異的中和Ｆａｂ ８Ｉ２１に結合した三量体と五量体の結晶構造との間のｇＨｇＬサブユニットの構造比較（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２：ｅａａｎ１４５７，２０１７）は、両方の複合体（ＲＭＳＤ ０．７Å／５８２ Ｃａ）におけるｇＨ及びｇＬについてほぼ同一の構造を明らかにする（図２Ａ）。したがって、ｇＨ及びｇＬ上のほとんどのグリコシル化残基は、三量体構造のあまり分解されていない不規則なループ領域に見られる残基Ｎ６４１を除いて、三量体及び五量体について同じ方向を向いている（図２Ｂ）。
ＨＣＭＶにおける三量体及び五量体特異的集合体を媒介する構造決定因子は、未知のままである。三量体及び五量体の両方は、それらのｇＨ及びｇＬサブユニットを共有するが、受容体認識を媒介する遠位サブユニットｇＯ及びＵＬ１２８～１３１の組成はそれぞれ異なる（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２：１７６７－１７７２，２０１５）。三量体では、４つのｇＨドメイン（ＤＩ～ＩＶ）は膜近位面から直線的に離れて延び、ｇＨ（ＤＩ）のＮ末端領域は、分子の膜遠位領域付近でｇＬを共に折り畳む（図１Ｂ及び９）。ＵＬ１３０特異的中和Ｆａｂ ８Ｉ２１に結合した三量体と五量体の結晶構造との間のｇＨｇＬサブユニットの構造比較（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２：ｅａａｎ１４５７，２０１７）は、両方の複合体（ＲＭＳＤ ０．７Å／５８２ Ｃａ）におけるｇＨ及びｇＬについてほぼ同一の構造を明らかにする（図２Ａ）。したがって、ｇＨ及びｇＬ上のほとんどのグリコシル化残基は、三量体構造のあまり分解されていない不規則なループ領域に見られる残基Ｎ６４１を除いて、三量体及び五量体について同じ方向を向いている（図２Ｂ）。
【0146】
以前、ｇＯ及びＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａは、ｇＬ－Ｃｙｓ１４４とのジスルフィド結合の形成を通じてｇＨｇＬ上の同じ部位に結合することが確立されたが（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２：１７６７－１７７２，２０１５）、三量体及び五量体特異的タンパク質がどのようにして同じｇＬ界面に対して非常に安定な相互作用を形成することができるかについての詳細は不明のままであった。三量体と五量体との間の個々のｇＨドメイン及びｇＬサブユニットの詳細な構造比較により、予想される高度の構造類似性が確認される。この全体的な類似性にもかかわらず、本発明者らは、三量体中のｇＯ又は五量体中のＵＬ１２８及びＵＬ１３０サブユニットのいずれかと相互作用するｇＬサブユニットの最遠位端に重要な違いを観察した（図２Ｃ及び２Ｄ）。ｇＯは、ｇＬの周りのキャッピングクラウンとして結合し、その表面の約２４００Å２を覆う（図９Ｂ）。ｇＬとｇＯとの間の相互作用表面は、ＨＣＭＶ五量体におけるｇＬとＵｌ１２８（≒１０１８Å２）又はＵＬ１３０（≒９１０Å２）のいずれかとの間の対応する界面よりも広い領域に及ぶ（図９Ｂ）。三量体と五量体との比較は、ｇＬの全体的なフォールドは保存されているが、重要なＣｙｓ１４４残基を中心とする残基の構成に違いがあることを示す。特に、三量体では、この一連の残基がループ状構造をとる（図２Ｃ）のに対して、五量体では、この領域が規則的なアルファヘリックスに折り畳まれてＵＬ１２８結合を調整する（図２Ｄ）。したがって、ｇＬは、向細胞性及び向細胞性の決定に応じて、ｇＬ Ｃ１４４を中心とする構造スイッチを介してｇＯ又はＵＬ１２８／ＵＬ１３０タンパク質の両方を認識して、ＨＣＭＶウイルス表面に三量体又は五量体複合体をロードすることができるように進化した重要なアダプタータンパク質として現れる。
【0147】
実施例３．ＨＣＭＶ三量体及び五量体中和抗体の結合部位
ＨＣＭＶ研究の重要な目的は、広域中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の構造的基礎及び機構を理解することである。注目すべきことに、ＨＣＭＶ五量体及び三量体の立体配座依存的エピトープを標的とする健康なＨＣＭＶ血清陽性ドナーから単離されたｍＡｂが以前に報告されている（Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８４：１００５－１０１３，２０１０；Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２１８：８７６－８８５，２０１８；Ｎｏｋｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ，２４：１７－２６，１９９４）。これらのうち、Ｍｓｌ－１０９及び１３Ｈ１１は、ＨＣＭＶ三量体及び五量体複合体の両方においてｇＨを標的とし、広範なＨＣＭＶ中和が可能である（Ｎｏｋｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ，２４：１７－２６，１９９４）。ここで、ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の新しい構造は、ｇＨ上の両方のＦａｂ及びそれらの対応するエピトープのＦｖ領域を高分解能に分解する（図１Ａ、図３Ａ、図８Ｇ）。
ＨＣＭＶ研究の重要な目的は、広域中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の構造的基礎及び機構を理解することである。注目すべきことに、ＨＣＭＶ五量体及び三量体の立体配座依存的エピトープを標的とする健康なＨＣＭＶ血清陽性ドナーから単離されたｍＡｂが以前に報告されている（Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８４：１００５－１０１３，２０１０；Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２１８：８７６－８８５，２０１８；Ｎｏｋｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ，２４：１７－２６，１９９４）。これらのうち、Ｍｓｌ－１０９及び１３Ｈ１１は、ＨＣＭＶ三量体及び五量体複合体の両方においてｇＨを標的とし、広範なＨＣＭＶ中和が可能である（Ｎｏｋｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ，２４：１７－２６，１９９４）。ここで、ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体の新しい構造は、ｇＨ上の両方のＦａｂ及びそれらの対応するエピトープのＦｖ領域を高分解能に分解する（図１Ａ、図３Ａ、図８Ｇ）。
【0148】
１３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９は、ｇＨのねじれたＣ末端領域の対向する面に結合する。重鎖及び軽鎖の両方を使用して、１３Ｈ１１は、ｇＨ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインの大きなフットプリントを認識する（図３Ｂ及び３Ｃ）。具体的には、１３Ｈ１１重鎖は、極性相互作用を介してｇＨ ＤＩＩドメイン上の残基Ｒ２２３、Ｄ２４１、Ｄ２４３に係合する（図３Ｂ、パネル１）。１３Ｈ１１の軽鎖は、ｇＨ－ＤＩＩドメイン上のＲ３２９、Ｌ２１８及びＴ３８７残基並びにｇＨ－ＤＩＩＩドメイン上の残基Ｓ５５３、Ｓ５５６、Ｈ５３０及びＥ５７６と極性接触を確立する（図３Ｂ、パネル２及び３）。１３Ｈ１１とは対照的に、Ｍｓｌ－１０９は、その重鎖を利用してｇＨのヒール領域を認識し、ＤＩＩＩ－ＤＩＶドメインの比較的小さなフットプリントを認識する。Ｍｓｌ－１０９相互作用は、そのＣＤＲと、ｇＨ－ＤＩＩＩ及びＤＩＶドメインの残基Ｗ １６７、Ｍ １６８、Ｐ １７０及びＤ ４４５との間の極性接触を含む。特に、Ｍｓｌ－１０９が接触する残基は、準最適なＭＳＬ－１０９抗体濃度（Ｆｏｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１１：８２０９－８２１４，２０１４）下で上皮細胞又は線維芽細胞においてＨＣＭＶ ＶＲ１８１４ウイルスを増殖させることによって単離されたエスケープ変異位置（Ｗ１６７Ｃ／Ｒ、Ｐ１７０Ｓ／Ｈ、Ｄ４４５Ｎ）と同一である。ｇＨ上のＦａｂ接触領域を含む新たに確立された構造は、質量分析法（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，１１：ｅ１００５２３０，２０１５）によって以前に特徴付けられた１３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９エピトープの知識を著しく拡大する（図１０）。
【0149】
実施例４．ｇＯの構造は、新規な折り畳みを明らかにする
ｇＯの構造は、そのアミノ酸配列が以前に公開された構造とうまく整列しないため、最も不可解なＨＣＭＶ糖タンパク質の１つである。実施例１に記載のｃｒｙｏ－ＥＭ構造において、ｇＯは、１つのＮ末端ドメイン及び１つのＣ末端ドメイン（図４Ａ）から構成される爪状の形状をとる。Ｎ末端球状ドメインは５本のベータ鎖からなり、Ｃ末端ドメインは主にアルファヘリックスである。注目すべきことに、Ｃ末端ドメインの中心の４つのアルファヘリックスは、古典的なサイトカインフォールドと高い構造的類似性を共有しており、最も近いメンバーはＦＬＴ３である（図４Ａ～４Ｃ）。
ｇＯの構造は、そのアミノ酸配列が以前に公開された構造とうまく整列しないため、最も不可解なＨＣＭＶ糖タンパク質の１つである。実施例１に記載のｃｒｙｏ－ＥＭ構造において、ｇＯは、１つのＮ末端ドメイン及び１つのＣ末端ドメイン（図４Ａ）から構成される爪状の形状をとる。Ｎ末端球状ドメインは５本のベータ鎖からなり、Ｃ末端ドメインは主にアルファヘリックスである。注目すべきことに、Ｃ末端ドメインの中心の４つのアルファヘリックスは、古典的なサイトカインフォールドと高い構造的類似性を共有しており、最も近いメンバーはＦＬＴ３である（図４Ａ～４Ｃ）。
【0150】
ｇＯの２つのドメインは、Ｃｙｓ１６７－Ｃｙｓ２１８及びＣｙｓ１４９－Ｃｙｓ１４１（図４Ｄ）によって媒介される２つのジスルフィド架橋を介して一緒に保持され、Ｃｙｓ３４３（ｇＯ）－Ｃｙｓ１６７（ｇＬ）の間のジスルフィドを含むｇＯサブユニットを横切る１つの対角平面に整列する。ｇＯ中の全てのシステインは、全てのＨＣＭＶ株にわたって保存されており、この構成がＨＣＭＶ三量体の機能に重要であり、受容体認識に重要である可能性があることを示唆している。ＨＣＭＶサブユニットの一次配列の包括的な生物情報学的配列分析は、ｇＯが８１％に等しい保存度を有する最も保存されていないエンベロープ糖タンパク質の１つであることを示した（Ｆｏｇｌｉｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１０：１００５，２０１９）。注目すべきことに、新たに確立された構造へのｇＯ保存性のマッピングは、ｇＯの全体的な保存性は他のＨＣＭＶタンパク質よりも低いが、実際には、高度に保存されたｇＯの両方のドメイン上に大きな表面パッチが存在することを示す（図４Ｅ）。ｇＯの静電表面分析により、正電荷が豊富なＮ末端ドメインとＣ末端ドメインの両方を含む広い領域が同定された（図４Ｆ）。この領域は、保存されたｇＯ表面（図４Ｅ～４Ｆ）と重複する。注目すべきことに、ｇＯサブユニット上のグリコシル化部位は、三量体の一方の表面にのみ不均一に分布及びクラスター化されており、ｇＯの一方の面は完全に修飾されていない（図４Ｇ）。ｇＯのこの保存された荷電したグリコシル化フリー表面は、受容体結合に関与する主要領域であると予測された。
【0151】
実施例５．三量体はＰＤＧＦＲαとの複数の接触を確立する
ＰＤＧＦＲαは、最近、線維芽細胞へのウイルス侵入に必要なＨＣＭＶ三量体の受容体として同定されているが（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１ ｅ１９，２０１８；Ｋａｂａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１：１６０８２，２０１６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，１３：ｅ１００６２８１，２０１７；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１５：Ｅ９８８９－Ｅ９８９８，２０１８）、ＰＤＧＦＲα認識の構造的基礎は不明のままである。特に、ＨＣＭＶ三量体は、密接に関連するＰＤＧＦＲβ又はクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の他のメンバー又は関連するＶＥＧＦ受容体（ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４）に結合しないため、ＰＤＧＦＲαに対して高い親和性及び高い選択性で結合する（図５Ａ）。選択されたヒト受容体タンパク質とのこれらの相互作用データは、以前に公開されたＣｅｌｌ－Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍの結果（図５Ａ）からのものであった（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１ ｅ１９，２０１８）。クラスＩＩＩ ＲＴＫのメンバーには、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＫＩＴ、ＦＭＳ及びＦＬＴ３が含まれ、これらの受容体の構造は、５つの細胞外Ｉｇドメインセグメント（Ｄ１～Ｄ５ドメイン）、短いシングルスパン膜貫通ドメイン及び細胞内キナーゼドメイン（図５Ｂ）からなる。ＨＣＭＶ三量体をＦａｂ １３Ｈ１１／Ｍｓｌ－１０９及びＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ５細胞外領域との複合体で再構成し、ｃｒｙｏＥＭを使用して、その構造（図１１Ａ）を約２．８Åの全体分解能まで決定した（図５Ｃ及び１１Ａ～１１Ｇ）。ｃｒｙｏ－ＥＭマップの高解像度は、ＨＣＭＶ三量体－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ１０９複合体の大部分及びＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ３ドメインのアミノ酸配列の構築を可能にした（図１１Ｅ～１１Ｆ及び５Ｃ～５Ｄ）。ＰＤＧＦＲα Ｄ４及びＤ５ドメインの密度は非常に弱く、おそらくＨＣＭＶ三量体との直接接触がないためであった。おそらく、ＰＤＧＦＲα受容体相互作用は、立体構造変化を三量体に伝播して、他のＨＣＭＶ糖タンパク質（例えば、プレフュージョンｇＢなど）の結合を可能にするか又は不可能にし得る。しかしながら、ＰＤＧＦＲα結合の前後の構造を比較すると、三量体のほぼ同一の立体配座が観察され（図１２Ｄ）、異なる機構がＨＣＭＶ融合機構の活性化に関与している可能性があることを示唆した。
ＰＤＧＦＲαは、最近、線維芽細胞へのウイルス侵入に必要なＨＣＭＶ三量体の受容体として同定されているが（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１ ｅ１９，２０１８；Ｋａｂａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１：１６０８２，２０１６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，１３：ｅ１００６２８１，２０１７；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１５：Ｅ９８８９－Ｅ９８９８，２０１８）、ＰＤＧＦＲα認識の構造的基礎は不明のままである。特に、ＨＣＭＶ三量体は、密接に関連するＰＤＧＦＲβ又はクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の他のメンバー又は関連するＶＥＧＦ受容体（ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４）に結合しないため、ＰＤＧＦＲαに対して高い親和性及び高い選択性で結合する（図５Ａ）。選択されたヒト受容体タンパク質とのこれらの相互作用データは、以前に公開されたＣｅｌｌ－Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍの結果（図５Ａ）からのものであった（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１ ｅ１９，２０１８）。クラスＩＩＩ ＲＴＫのメンバーには、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＫＩＴ、ＦＭＳ及びＦＬＴ３が含まれ、これらの受容体の構造は、５つの細胞外Ｉｇドメインセグメント（Ｄ１～Ｄ５ドメイン）、短いシングルスパン膜貫通ドメイン及び細胞内キナーゼドメイン（図５Ｂ）からなる。ＨＣＭＶ三量体をＦａｂ １３Ｈ１１／Ｍｓｌ－１０９及びＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ５細胞外領域との複合体で再構成し、ｃｒｙｏＥＭを使用して、その構造（図１１Ａ）を約２．８Åの全体分解能まで決定した（図５Ｃ及び１１Ａ～１１Ｇ）。ｃｒｙｏ－ＥＭマップの高解像度は、ＨＣＭＶ三量体－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ１０９複合体の大部分及びＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ３ドメインのアミノ酸配列の構築を可能にした（図１１Ｅ～１１Ｆ及び５Ｃ～５Ｄ）。ＰＤＧＦＲα Ｄ４及びＤ５ドメインの密度は非常に弱く、おそらくＨＣＭＶ三量体との直接接触がないためであった。おそらく、ＰＤＧＦＲα受容体相互作用は、立体構造変化を三量体に伝播して、他のＨＣＭＶ糖タンパク質（例えば、プレフュージョンｇＢなど）の結合を可能にするか又は不可能にし得る。しかしながら、ＰＤＧＦＲα結合の前後の構造を比較すると、三量体のほぼ同一の立体配座が観察され（図１２Ｄ）、異なる機構がＨＣＭＶ融合機構の活性化に関与している可能性があることを示唆した。
【0152】
三量体に結合した場合、ＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ３は、クラスＩＩＩ ＲＴＫのＰＤＧＦＲβ及び他のＤ１～Ｄ３ドメインの以前に決定された構造と同様のねじれた立体配座をとった（図１２Ａ）。ＰＤＧＦＲαとＰＤＧＦＲβとの間の個々のＤ１～Ｄ３ドメインの構造比較（ＰＤＧＦとの複合体で決定）により、両受容体間の高い類似性が確認される（０．７～０．８ÅのＲＭＳＤ、図１２Ｂ）。しかしながら、Ｄ２ドメインに沿って整列したＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβ Ｄ１～Ｄ３ドメインの比較は、これら２つの構造間のＤ３ドメインの約１０５°の相対回転を示したが、Ｄ１の位置はほとんど変化しなかった（図１２Ｃ）。
【0153】
ＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ３ドメインは、ｇＯ及びｇＨのＮ末端にわたる４つの主要な保存表面で広範な相互作用を確立した（部位１～４；図５Ｄ～５Ｆ及び表３）。具体的には、第１の主要な相互作用表面（部位１）は、鎖Ｄ１－ｂとＤ１－ｃとの間、及び鎖Ｄ１－ｄとＤ１－ｅとの間のｇＨのＮ末端及びＰＤＧＦＲα Ｄ１のループ領域を含んでいた（図５Ｄ及び１２Ｅ）。部位１では、ＰＤＧＦＲα Ｅ５２は、それぞれｇＨ Ｒ４７並びにＰＤＧＦＲα Ｓ７８及びＬ８０接触残基ｇＨ Ｎ８５及びＹ８４と塩橋を形成した（図５Ｄ及び１２Ｅ）。部位２は、ｇＯ（図５Ｄ及び図１２Ｅ）のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の塩基性溝に結合したＰＤＧＦＲα Ｄ１－ｆとＤ１－ｇ（Ｅ１０８及びＥ１０９）との間の伸長ループ内の２つの酸性側鎖を有する静電的性質を有していた。部位３では、ＰＤＧＦＲα Ｄ２ドメインの疎水性残基（Ｍ１３３、Ｌ１３７、Ｉ１３９、Ｌ２０８、Ｙ２０６）が、ｇＯのＮ末端領域の疎水性溝に向かって配向していた（図５Ｄ）。部位４は、ＰＤＧＦＲα Ｄ３ドメインの鎖ｄ上のＥ２６３及びＫ２６５を伴い、ｇＯ上のＲ３３６、Ｙ３３７及びＮ３５８との荷電及び極性相互作用を確立した（図５Ｄ、部位４）。特に、これらの４つの主要な相互作用部位のそれぞれにおける微妙であるが独特の側鎖の違いは、まとめると、ＰＤＧＦＲαに結合するがＰＤＧＦＲβには結合しない三量体の高い特異性を合理的に説明し得る（図１２Ｅ）。ＰＤＧＦＲαは、構造中に観察された４つの大きな接触部位と一致して、三量体（表２及び図５Ｇ～５Ｈ）に対して低いナノモル親和性で結合した。興味深いことに、かさ高いＮ結合型グリカンをｇＨ又はｇＯ中の各個々の部位に付加することを意図した突然変異の導入は、ＰＤＧＦＲαの三量体への結合を有意に減少させなかった（表２及び図５Ｇ～５Ｈ）。しかしながら、変異を導入するＮ－グリカンの組み合わせ又は４つ全ての部位における電荷変異の導入により、ＰＤＧＦＲαと三量体との間の相互作用をほぼ完全に消失した（図５Ｇ）。したがって、三量体とＰＤＧＦＲαとの間の広範な相互作用界面は、ＰＤＧＦＲαの結合を介した線維芽細胞の表面への三量体の高親和性及び高選択的な結合を促進する多数の高度に保存された残基からなった。ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体のＰＤＧＦＲαへの結合に関与する残基を表３に示す。
単一部位点変異（部位１：Ｅ５２Ｎ、Ｅ５４Ｓ；部位２：Ｅ１０８Ｎ、Ｎ１１０Ｓ；部位３：Ｅ２０８Ｎ、Ｓ２１０Ｓ；部位４：Ｅ２６３Ｎ、Ｋ２６５Ｓ）。ＫＤ、解離定数；ＷＴ、野生型。
【表2】
【表3】
【0154】
タンパク質の発現及び精製
ヒトＰＤＧＦＲα（１～５２８）用に最適化されたコードＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターの後ろのｐＲＫベクターにクローニングした。Ｃ末端ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）タグをＰＤＧＦＲα構築物に付加した。懸濁液中のＥｘｐｉ２９３細胞を、ＳＭＭ ２９３Ｔ－Ｉ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養し、細胞密度が４×１０６細胞／ｍｌに達したとき、ｇＨｇＬｇＯ発現のためＤＮＡを１：１：１の比で含むポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養した後、発現上清を回収した。
ヒトＰＤＧＦＲα（１～５２８）用に最適化されたコードＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターの後ろのｐＲＫベクターにクローニングした。Ｃ末端ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）タグをＰＤＧＦＲα構築物に付加した。懸濁液中のＥｘｐｉ２９３細胞を、ＳＭＭ ２９３Ｔ－Ｉ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養し、細胞密度が４×１０６細胞／ｍｌに達したとき、ｇＨｇＬｇＯ発現のためＤＮＡを１：１：１の比で含むポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養した後、発現上清を回収した。
【0155】
Ｃ末端に５つのアミノ酸を有するＰＤＧＦＲα（１～５２４）（ＤＤＤＤＫ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を、ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製及びｉｎ ｖｉｔｒｏ競合実験に使用した。凍結乾燥粉末をｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、ＰＤＧＦＲα－ＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムで精製した後、ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯ及び中和Ｆａｂで再構成した。
【0156】
ＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体とＰＤＧＦＲα及び中和Ｆａｂとの再構成
ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、氷上で少なくとも３０分間、５μＭ（８３．３μｇ）のｇＨｇＬｇＯを過剰のＰＤＧＦＲαと共に６μＭ（３３．３μｇ）、Ｆａｂ １３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９をそれぞれ１８μＭ（５０μｇ）でインキュベートすることによって構築した。ＳＥＣ－ｒｅｃｏｎｓｔ－２緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムでの精製によって過剰のＦａｂを除去した。ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９の主ピーク画分を合わせ、ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製のために０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、氷上で少なくとも３０分間、５μＭ（８３．３μｇ）のｇＨｇＬｇＯを過剰のＰＤＧＦＲαと共に６μＭ（３３．３μｇ）、Ｆａｂ １３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９をそれぞれ１８μＭ（５０μｇ）でインキュベートすることによって構築した。ＳＥＣ－ｒｅｃｏｎｓｔ－２緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムでの精製によって過剰のＦａｂを除去した。ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９の主ピーク画分を合わせ、ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製のために０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【0157】
バイオレイヤー干渉法
ＰＤＧＦＲαタンパク質とＣＭＶ三量体との間の相互作用を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄシステムを使用するバイオレイヤー干渉法によって分析した。組換えＰＤＧＦＲαタンパク質を抗ヒトＦｃ被覆センサー（Ｆｏｒｔｅ Ｐａｌｌ）上に捕捉し、可溶性検体としてのＣＭＶ三量体への結合について試験し、ＰＢＳ中でアッセイした。データを、Ｆｏｒｔｅ Ｐａｌｌソフトウェアバージョン９．０を使用して取得した。ＷＴ三量体とＰＤＧＦＲα ＷＴ及び変異型タンパク質との相対的結合を比較するために、三量体を５０ ｎＭ又は１００ｎＭの濃度でアッセイし、会合の終わりの結合単位をプロットした。結合速度論の推定のために、低レベルのＰＤＧＦＲαタンパク質をセンサ上に捕捉した。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ機器を使用してデータを取得し、続いてＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を動力学的パラメータの計算に利用した。
ＰＤＧＦＲαタンパク質とＣＭＶ三量体との間の相互作用を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄシステムを使用するバイオレイヤー干渉法によって分析した。組換えＰＤＧＦＲαタンパク質を抗ヒトＦｃ被覆センサー（Ｆｏｒｔｅ Ｐａｌｌ）上に捕捉し、可溶性検体としてのＣＭＶ三量体への結合について試験し、ＰＢＳ中でアッセイした。データを、Ｆｏｒｔｅ Ｐａｌｌソフトウェアバージョン９．０を使用して取得した。ＷＴ三量体とＰＤＧＦＲα ＷＴ及び変異型タンパク質との相対的結合を比較するために、三量体を５０ ｎＭ又は１００ｎＭの濃度でアッセイし、会合の終わりの結合単位をプロットした。結合速度論の推定のために、低レベルのＰＤＧＦＲαタンパク質をセンサ上に捕捉した。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ機器を使用してデータを取得し、続いてＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を動力学的パラメータの計算に利用した。
【0158】
Ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製及びデータ取得
ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、以下に記載されるようにして調製した。Ｓｏｌａｒｕｓプラズマ洗浄器（Ｇａｔａｎ）を使用して、Ｈｏｌｅｙ ｃａｒｂｏｎ ｇｒｉｄ（Ａｕ／Ｐｄ ８０／２０で被覆されたＣ－Ｆｌａｔ ４５ｎｍ Ｒ １．２／１．３ ３００メッシュ；Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ）を１０秒間グロー放電させた。複合体を０．０２５％ＥＭグレードのグルタルアルデヒドで室温にて１０分間穏やかに架橋し、９ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）でクエンチした。３μｌの試料（ここでは約０．４ｍｇ／ｍｌ）をグリッドに適用した。グリッドを、湿度１００％の２．５秒のブロッティング時間を使用してＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）でブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中で急冷した。
ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、以下に記載されるようにして調製した。Ｓｏｌａｒｕｓプラズマ洗浄器（Ｇａｔａｎ）を使用して、Ｈｏｌｅｙ ｃａｒｂｏｎ ｇｒｉｄ（Ａｕ／Ｐｄ ８０／２０で被覆されたＣ－Ｆｌａｔ ４５ｎｍ Ｒ １．２／１．３ ３００メッシュ；Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ）を１０秒間グロー放電させた。複合体を０．０２５％ＥＭグレードのグルタルアルデヒドで室温にて１０分間穏やかに架橋し、９ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）でクエンチした。３μｌの試料（ここでは約０．４ｍｇ／ｍｌ）をグリッドに適用した。グリッドを、湿度１００％の２．５秒のブロッティング時間を使用してＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）でブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中で急冷した。
【0159】
Ｃｒｙｏ－ＥＭデータ処理
ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体について実施例１に記載したのと同様に処理した。ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（４）：３３１－３３２，２０１７）実装を使用してフレーム動きに対して合計３４，８２９個の動画を補正し、ＣＴＦＦＩＮＤ－４（Ｒｏｈｏｕ ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，．１９２（２）：２１６－２，２０１５）を用いてスペクトルの３０～４．５Å帯域を使用してコントラスト伝達関数パラメータを適合させた。ＣＴＦ適合画像を、８Åより良好な検出された適合分解能に基づいてフィルタにかけた。３０ÅローパスフィルタにかけたｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体参照構造を用いて、ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）によるテンプレートマッチングによって合計４，１５１，０８５個の粒子を採取した。ＲＥＬＩＯＮ ２Ｄ分類中に粒子を選別し、選択した３，５６０，６２０個の粒子を３ＤリファインメントのためにｃｉｓＴＥＭにインポートした。ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９ ３Ｄ再構成は、マスクによる自動リファイン及びマニュアルリファインメントの後、マスクの外側にローパスフィルタ（ＬＰＦ）を適用すること（フィルタ分解能２０Å）及び０．２５のスコア閾値によって得られた。これにより、外側重量は、反復的なマニュアルリファインメントメントラウンドで０．５から０．１５に徐々に減少した。三次元再構成は、２．８Å（フーリエシェル相関（ＦＳＣ）＝０．１４３、ｃｉｓＴＥＭで測定）のマップ分解能に収束した。マップの品質を改善するために、マスクを使用してマップを３つの別個の領域に分割した後に収束リファインメントを取得し、上述のようにマスクの外側のマニュアルリファインメントメントローパスフィルタ（ＬＰＦ）を取得した。収束したマップをｃｉｓＴＥＭで鮮明にし、実施例１で上述したようにｐｈｅｎｉｘ を使用して組み合わせた。
ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体について実施例１に記載したのと同様に処理した。ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（４）：３３１－３３２，２０１７）実装を使用してフレーム動きに対して合計３４，８２９個の動画を補正し、ＣＴＦＦＩＮＤ－４（Ｒｏｈｏｕ ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，．１９２（２）：２１６－２，２０１５）を用いてスペクトルの３０～４．５Å帯域を使用してコントラスト伝達関数パラメータを適合させた。ＣＴＦ適合画像を、８Åより良好な検出された適合分解能に基づいてフィルタにかけた。３０ÅローパスフィルタにかけたｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体参照構造を用いて、ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）によるテンプレートマッチングによって合計４，１５１，０８５個の粒子を採取した。ＲＥＬＩＯＮ ２Ｄ分類中に粒子を選別し、選択した３，５６０，６２０個の粒子を３ＤリファインメントのためにｃｉｓＴＥＭにインポートした。ＰＤＧＦＲα－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９ ３Ｄ再構成は、マスクによる自動リファイン及びマニュアルリファインメントの後、マスクの外側にローパスフィルタ（ＬＰＦ）を適用すること（フィルタ分解能２０Å）及び０．２５のスコア閾値によって得られた。これにより、外側重量は、反復的なマニュアルリファインメントメントラウンドで０．５から０．１５に徐々に減少した。三次元再構成は、２．８Å（フーリエシェル相関（ＦＳＣ）＝０．１４３、ｃｉｓＴＥＭで測定）のマップ分解能に収束した。マップの品質を改善するために、マスクを使用してマップを３つの別個の領域に分割した後に収束リファインメントを取得し、上述のようにマスクの外側のマニュアルリファインメントメントローパスフィルタ（ＬＰＦ）を取得した。収束したマップをｃｉｓＴＥＭで鮮明にし、実施例１で上述したようにｐｈｅｎｉｘ を使用して組み合わせた。
【0160】
モデル構築及び構造解析
ＰＤＧＦＲβの構造（ＰＤＢ：３ＭＪＧ）を、ＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ３のモデリングのための鋳型として使用した。実施例１と同様にモデル構築及び構造解析を行った。
実施例６．ＴＧＦβＲ３は、ｇＨ、ｇＬ及びｇＯの間の界面に結合する
ＰＤＧＦＲβの構造（ＰＤＢ：３ＭＪＧ）を、ＰＤＧＦＲα Ｄ１～Ｄ３のモデリングのための鋳型として使用した。実施例１と同様にモデル構築及び構造解析を行った。
実施例６．ＴＧＦβＲ３は、ｇＨ、ｇＬ及びｇＯの間の界面に結合する
【0161】
三量体は、内皮細胞及び上皮細胞（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８９：８９９９－９００９，２０１５；Ｗｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＢｉｏ，４：ｅ００３３２－１３，２０１３；Ｒｙｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８２：６０－７０，２００８）を含む全ての細胞型へのＨＣＭＶ向性に必要である。この要件は、三量体が複数の受容体と直接相互作用することによってＨＣＭＶ宿主向細胞性に直接寄与し得ることを示唆している。したがって、ＴＧＦβＲ３は、最近、三量体及び推定ＨＣＭＶ受容体に対する高親和性結合剤として同定された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１ ｅ１９，２０１８）。ＴＧＦβＲ３糖タンパク質は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路受容体スーパーファミリーのメンバーであり、大部分のヒト組織における細胞増殖、アポトーシス、分化及び細胞遊走の媒介において必須の役割を有する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ，９：ａ０２２１４５，２０１７）。ＴＧＦβＲ３の細胞外ドメインは、２つのＮ末端膜遠位オーファンドメイン（ＯＤ２及びＯＤ１）及び膜近位透明帯（ＺＰ）ドメイン（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２７：１４２７－１４４２ ｅ４，２０１９）から構成される。各ＯＤは、２つのβサンドイッチドメインから構成され、一方、ＺＰドメインは、古典的な免疫グロブリン様フォールド（図６Ｂ）をとる（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０８：５２３２－５２３６，２０１１）。ＴＧＦβＲ３とＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２又はエンドグリンとの間の相同性にもかかわらず、これらの更なるタンパク質とＨＣＭＶ三量体との間の結合は観察されず（図６Ａ）（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１ ｅ１９，２０１８）、これは、Ｃｅｌｌ－Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍの結果において以前に発表された。
【表4】
【0162】
三量体によるＴＧＦβＲ３認識への直接的な構造的洞察を得るために、ＨＣＭＶ三量体及びＦａｂ １３Ｈ１１及びＭｓｌ－１０９を有するＯＤ及びＺＰドメインを含むＴＧＦβＲ３の化学量論的複合体を再構成し、ｃｒｙｏ－ＥＭを使用して、約２．６Åの全体分解能までの構造を決定した（図６Ｃ～６Ｇ及び１３Ａ～１３Ｆ）。三量体はＰＤＧＦＲαのＩｇ様Ｄ１～Ｄ３ドメインと会合しているので、ＴＧＦβＲ３の結合はそのＩｇ様ドメインを介して起こると予想された。予想外にも、新たに明らかにされた構造は、ＴＧＦβＲ３が３つの主要部位（図６Ｄ～６Ｇ及び表４）でｇＯ及びｇＬ上の保存された残基に結合するためにＯＤ２ドメインを排他的に利用したが、ＴＧＦβＲ３ ＯＤ１ドメインの密度は、明らかに三量体との直接接触がないために弱く見えたことを示した。ＴＧＦβＲ３ ＯＤ１は、ＨＣＭＶ三量体と特異的に接触せず、ｃｒｙｏ－ＥＭマップにおいてほとんど分解されず、構造においてモデル化されなかった。注目すべきことに、ＴＧＦβＲ３の結合は、ＰＤＧＦＲαについて観察されたものと同様に、三量体上でのいかなる主要な構造的再配列も誘導しなかった（図１３Ｇ）。
【0163】
ヒトＴＧＦβＲ３ ＯＤ２ドメインは、１０本のβ鎖と、一方がβ６とβ７との間（α１）であり、他方がβ７とβ８との間（α２）である２つのαヘリックスとから構成され（図１３Ｈ）、両方のヘリックスを取り囲む領域がＨＣＭＶ三量体と重要な接触を形成した。具体的には、ＴＧＦβＲ３は、α１領域を取り囲むループ構造を利用して、ｇＯのＮ末端ドメインで、それぞれｇＯ側鎖Ｋ１１８およびＲ１１７に対してＳ１４３カルボニル及びＱ１３６側鎖で水素結合する（部位１、図６Ｇ及び１３Ｈ）。ＴＧＦβＲ３ Ｆ１３７とｇＯ Ｌ１１６との間の疎水性接触は、部位１での相互作用を更に支持した（図６Ｇ、部位１）。部位２では、鎖β７ｂのＴＧＦβＲ３ Ｒ１５１は、ｇＯ Ｙ１８８とπスタッキング相互作用を形成し、ｇＬ Ｎ９７に水素結合する（図６Ｇ、部位２）。部位３では、α２のＴＧＦβＲ３ Ｗ１６３及びＫ１６６のカルボニルが、それぞれｇＬ側鎖Ｅ９４及びＴ９２と水素結合を形成した（図６Ｇ、部位３）。
【0164】
ＴＧＦβＲ３及びエンドグリンのＯＤ２ドメインは、構造が非常に類似していた（図６Ｈ）。特に部位１及び２の重要な相互作用領域における詳細な図は、エンドグリンＯＤ２ドメインがα１にループ構造を欠き、β７ｂにβ鎖二次構造をとらないことを明らかにした（図１３Ｈ及び図６Ｈ）。全体として、対照的な特性を有する多数の相互作用残基は、ＴＧＦβＲ３とＨＣＭＶ三量体との間の強い相互作用を合理化し、部位１及び部位２のエンドグリンに対する重要な違いは、ＴＧＦβＲ３三量体相互作用の高い特異性及び選択性の説明を提供した。
【0165】
タンパク質の発現及び精製
ヒトＴＧＦβＲ３（１～７８７）用に最適化されたコードＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターの後ろのｐＲＫベクターにクローニングした。Ｃ末端ＦＬＡＧタグをＴＧＦβＲ３構築物に付加した。懸濁液中のＥｘｐｉ２９３細胞を、ＳＭＭ ２９３Ｔ－Ｉ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養し、細胞密度が４×１０６細胞／ｍｌに達したとき、ｇＨｇＬｇＯ発現のためＤＮＡを１：１：１の比で含むポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養した後、発現上清を回収した。
ヒトＴＧＦβＲ３（１～７８７）用に最適化されたコードＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターの後ろのｐＲＫベクターにクローニングした。Ｃ末端ＦＬＡＧタグをＴＧＦβＲ３構築物に付加した。懸濁液中のＥｘｐｉ２９３細胞を、ＳＭＭ ２９３Ｔ－Ｉ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養し、細胞密度が４×１０６細胞／ｍｌに達したとき、ｇＨｇＬｇＯ発現のためＤＮＡを１：１：１の比で含むポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養した後、発現上清を回収した。
【0166】
ヒトＴＧＦβＲ３－Ｆｌａｇを１０ｌの発現上清から精製した。上清を１０ｍｌのＭ２アガロースＦｌａｇ樹脂（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、４℃で２０時間インキュベートした。樹脂を１０ＣＶ ＦＬＡＧ洗浄緩衝液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で洗浄し、０．２ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチドを補充したＦＬＡＧ洗浄緩衝液で溶出した。溶出液をＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタデバイス（３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、ＴＧＦβＲ－ＳＥＣ－１バッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／６０カラムにロードした。
【0167】
Ｃ末端ＨＩＳタグ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を有するＴＧＦβＲ３（１－７８１）をｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製に使用した。凍結乾燥粉末をｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタデバイス（３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、ＴＧＦβＲ－ＳＥＣ－２緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ３．２／３００カラムで精製した後、ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯ及び中和Ｆａｂと集合させた。
ヒトＴＧＦβＲ３及び中和ＦａｂによるＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の再構成
ヒトＴＧＦβＲ３及び中和ＦａｂによるＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の再構成
【0168】
７．６μＭ（８５．５μｇ）のＴＧＦβＲ３－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、９．２μＭ（５４μｇ）の過剰のＴＧＦβＲ３、２２．６μＭ（７８μｇ）のＦａｂ １３Ｈ１１及び６１μＭ（２１０μｇ）のＭｓｌ－１０９と氷上で少なくとも３０分間インキュベーションすることによって構築した。ＳＥＣ－ｒｅｃｏｎｓｔ－２緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムでの精製によって過剰のＦａｂを除去した。ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９の主ピーク画分を合わせ、ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製のために０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【0169】
Ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製及びデータ取得
ＴＧＦβＲ３－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、以下のようにして調製した。Ｓｏｌａｒｕｓプラズマ洗浄器（Ｇａｔａｎ）を使用して、ホーリーカーボングリッド（Ｕｌｔｒａｆｏｉｌ ２５ｎＭ Ａｕ Ｒ １．２／１．３ ３００メッシュ；Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）を１０秒間グロー放電させた。３μｌの試料をグリッドに適用し、１００％の湿度で３．５秒のブロッティング時間を使用してＬｅｉｃａ ＥＭ ＧＰ（Ｌｅｉｃａ）で片面にブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中で冷却した。
ＴＧＦβＲ３－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、以下のようにして調製した。Ｓｏｌａｒｕｓプラズマ洗浄器（Ｇａｔａｎ）を使用して、ホーリーカーボングリッド（Ｕｌｔｒａｆｏｉｌ ２５ｎＭ Ａｕ Ｒ １．２／１．３ ３００メッシュ；Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）を１０秒間グロー放電させた。３μｌの試料をグリッドに適用し、１００％の湿度で３．５秒のブロッティング時間を使用してＬｅｉｃａ ＥＭ ＧＰ（Ｌｅｉｃａ）で片面にブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中で冷却した。
【0170】
ＴＧＦβＲ３－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体を、ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体について実施例１で上述したのと同様に処理した。ＲＥＬＩＯＮのＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（４）：３３１－３３２，２０１７）実装を使用してフレーム動きに対して合計１９，９９３個の動画を補正し、ＣＴＦＦＩＮＤ－４（Ｒｏｈｏｕ ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，．１９２（２）：２１６－２，２０１５）を用いてスペクトルの３０～４．５Å帯域を使用してコントラスト伝達関数パラメータを適合させた。３０ÅローパスフィルタにかけたｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９複合体参照構造を用いて、ｇａｕｔｏｍａｔｃｈを用いたテンプレートマッチングによって合計２，７８０，５１９個の粒子を採取した。ＲＥＬＩＯＮ ２Ｄ分類中に粒子を選別し、選択した２，７８０，５１９個の粒子を３ＤリファインメントのためにｃｉｓＴＥＭにインポートした。ＴＧＦβＲ３－ｇＨｇＬｇＯ－１３Ｈ１１－Ｍｓｌ－１０９ ３Ｄ再構成は、マスクによる自動リファイン及びマニュアルリファインメントの後、マスクの外側にローパスフィルタ（ＬＰＦ）を適用すること（フィルタ分解能２０Å）及び０．２５のスコア閾値によって得られた。これにより、外側重量は、反復的なマニュアルリファインメントメントラウンドで０．５から０．１５に徐々に減少した。三次元再構成は、２．６Å（フーリエシェル相関（ＦＳＣ）＝０．１４３、ｃｉｓＴＥＭで測定）のマップ分解能に収束した。マップの品質を改善するために、マスクを使用してマップを２つの別個の領域に分割した後に収束リファインメントを取得し、上述のようにマスクの外側のマニュアルリファインメントメントローパスフィルタ（ＬＰＦ）を取得した。収束したマップをｃｉｓＴＥＭで鮮明にし、上記のようにｐｈｅｎｉｘ を使用して組み合わせた。局所解像度は、ブロクレスアルゴリズムの社内再実施を使用してｃｉｓＴＥＭで決定した（Ｃａｒｄｏｎｅ ｅｔ ａｌ ２０１３）。
【0171】
モデル構築及び構造解析
ゼブラフィッシュＴＧＦβＲ３（ＰＤＢ：６ＭＺＮ）の構造を、ヒトＴＧＦβＲ３ ＯＤ２をモデル化するための鋳型として使用した。実施例１と同様にモデル構築及び構造解析を行った。
ゼブラフィッシュＴＧＦβＲ３（ＰＤＢ：６ＭＺＮ）の構造を、ヒトＴＧＦβＲ３ ＯＤ２をモデル化するための鋳型として使用した。実施例１と同様にモデル構築及び構造解析を行った。
【0172】
実施例７．ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３はＨＣＭＶ三量体結合と競合する
ＨＣＭＶ三量体は、多様な受容体上に存在する２つの完全に異なるドメイン構造、すなわちＰＤＧＦＲαのＩｇ様Ｄ１～Ｄ３ドメイン及びＴＧＦβＲ３のＯＤ２ドメインに高親和性で結合することができた（図５及び６）。両方の受容体が三量体の膜遠位領域で相互作用したが、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３は、異なる相互作用表面を介して三量体に結合した（図５Ｅ及び６Ｅ）。これにもかかわらず、三量体－ＰＤＧＦＲα及び三量体－ＴＧＦβＲ３複合体構造の重ね合わせは、これらの受容体が、ｇＨ、ｇＬ及びｇＯの間の界面において部分的に重複する結合部位を共有し、したがって、三量体を同時に結合することができないことを示唆した（図７Ａ）。さらに、ＰＤＧＦＲα Ｎ１７９上のＮ結合グリカン鎖は、ＴＧＦβＲ３結合部位の方向を指し示すことが見出され、これは同時受容体結合を更に制限し得る（図７Ａ）。
ＨＣＭＶ三量体は、多様な受容体上に存在する２つの完全に異なるドメイン構造、すなわちＰＤＧＦＲαのＩｇ様Ｄ１～Ｄ３ドメイン及びＴＧＦβＲ３のＯＤ２ドメインに高親和性で結合することができた（図５及び６）。両方の受容体が三量体の膜遠位領域で相互作用したが、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３は、異なる相互作用表面を介して三量体に結合した（図５Ｅ及び６Ｅ）。これにもかかわらず、三量体－ＰＤＧＦＲα及び三量体－ＴＧＦβＲ３複合体構造の重ね合わせは、これらの受容体が、ｇＨ、ｇＬ及びｇＯの間の界面において部分的に重複する結合部位を共有し、したがって、三量体を同時に結合することができないことを示唆した（図７Ａ）。さらに、ＰＤＧＦＲα Ｎ１７９上のＮ結合グリカン鎖は、ＴＧＦβＲ３結合部位の方向を指し示すことが見出され、これは同時受容体結合を更に制限し得る（図７Ａ）。
【0173】
三量体へのＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３の結合が相互に排他的であるという仮説を試験するために、ＴＧＦβＲ３に結合したＨＣＭＶ三量体を等モル量のＰＤＧＦＲα（図７Ｂ及び図１４）と共にインキュベートすることによって競合実験を行った。結果は、ＰＤＧＦＲαが結合したＴＧＦβＲ３を完全に置換できることを示し（図７Ｂ）、ＴＧＦβＲ３と比較してＨＣＭＶ三量体とＰＤＧＦＲαとの間の報告されたより高い親和性と一致した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１１５８－１１７１ ｅ１９，２０１８）。まとめると、これらの構造的及び生物物理学的データは、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３が共受容体として機能せず、むしろ独立した受容体として作用するＨＣＭＶ向性を媒介する可能性が高いことを示唆している。
【0174】
ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯに対するＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３の結合競合実験
ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯ、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３を単独で、又はｇＨｇＬｇＯ＋ＰＤＧＦＲα、ｇＨｇＬｇＯ＋ＴＧＦβＲ３又はｇＨｇＬｇＯ＋ＰＤＧＦＲα＋ＴＧＦβＲ３の組み合わせを、ＳＥＣ競合緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中３μＭの濃度で氷上で少なくとも６０分間共インキュベートし、ＳＥＣ競合緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムにロードした。
ＨＣＭＶ三量体ｇＨｇＬｇＯ、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３を単独で、又はｇＨｇＬｇＯ＋ＰＤＧＦＲα、ｇＨｇＬｇＯ＋ＴＧＦβＲ３又はｇＨｇＬｇＯ＋ＰＤＧＦＲα＋ＴＧＦβＲ３の組み合わせを、ＳＥＣ競合緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中３μＭの濃度で氷上で少なくとも６０分間共インキュベートし、ＳＥＣ競合緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムにロードした。
【0175】
実施例８．ＨＣＭＶ三量体は、ＰＤＧＦＲαへの結合について成長因子ＰＤＧＦと競合する
実施例４～６では、三量体、三量体－ＰＤＧＦＲα及び三量体－ＴＧＦβＲ３のｃｒｙｏ－ＥＭ構造は、受容体結合及び強力な中和抗体の可能性のある標的に関与する三量体上の機能的に重要で高度に保存された表面を明らかにした（図４、５及び６）。したがって、ＰＤＧＦＲαとの三量体相互作用が重要な細胞シグナル伝達経路に干渉し得るかどうかを調べた。ＰＤＧＦＲαの場合、ＰＤＧＦ成長因子の結合は、受容体を二量体化し、細胞内キナーゼドメインを活性化してシグナル伝達カスケードを誘導する（Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０７：１１３０７－１１３１２，２０１０）。三量体－ＰＤＧＦＲα複合体と二量体（シグナル伝達活性）ＰＤＧＦＲα－ＰＤＧＦ複合体の相同性モデルとの構造的重ね合わせは、ＰＤＧＦＲα Ｄ２及びＤ３相互作用界面でのｇＯ及びＰＤＧＦの複数の立体的衝突を示した（図７Ｃ及び１２Ｅ）。低ナノモル親和性（Ｋａｂａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１：１６０８２，２０１６）での三量体とＰＤＧＦＲαとの強い相互作用（表２）、及び３桁のナノモル親和性（Ｍａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，７：１６４３９，２０１７）を特徴とするＰＤＧＦＲαに対するＰＤＧＦ－ＡＡの中程度の結合親和性を考慮して、三量体がＰＤＧＦＲαへの結合についてＰＤＧＦと競合し、それによってシグナル伝達カスケードの誘導を妨げることができるという仮説を試験した。この仮説を試験するために、ＨＣＭＶ三量体を最初にｇＯの電荷変異で精製し（三量体ｍｕｔ；部位２～４：Ｍ８４Ｒ、Ｆ１１１Ｒ、Ｒ１１７Ｅ、Ｆ１３６Ｒ、Ｒ２１２Ｅ、Ｒ２３０Ｅ、Ｒ２３４Ｅ、Ｒ３３６Ｅ、Ｆ３４２Ｅ、Ａ３５１Ｒ、Ｎ３５８Ｒ）、ＰＤＧＦＲαへのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合のおよそ１０，０００倍の減少が観察された（ＫＤ三量体－ＷＴ：２．２５×１０－９＋／－１．１Ｍ対ＫＤ三量体－ｍｕｔ：４．２５×１０－５＋／－０．５Ｍ）（図７Ｄ）。次に、自己リン酸化ＰＤＧＦＲα残基Ｙ７６２及びＹ８４９並びにリン酸化ＡＫＴを下流基質として検出することによって、ＰＤＧＦ－ＡＡ及び三量体ＷＴ又は三量体ｍｕｔの添加時のＭＲＣ－５線維芽細胞におけるＰＤＧＦＲα活性化及びシグナル伝達を評価した。ＰＤＧＦ－ＡＡ単独ではＰＤＧＦＲα及びＡＫＴで強い活性化シグナルを誘導したが、三量体ＷＴの滴定はＰＤＧＦＲαのＰＤＧＦ－ＡＡ誘導活性を強く低下させた（図７Ｅ）。対照的に、ＰＤＧＦＲα結合欠損三量体Ｍｕｔの添加は、ＰＤＧＦ－ＡＡの存在下でＰＤＧＦＲαの活性を低下させなかった（図７Ｅ）。したがって、ＨＣＭＶ三量体は、ＰＤＧＦＲαへの結合についてＰＤＧＦ－ＡＡと直接競合し、ＰＤＧＦＲαシグナル伝達を妨害し、これは、有効かつ安全な三量体ベースの抗ウイルス戦略の設計の重要な考慮事項である。
実施例４～６では、三量体、三量体－ＰＤＧＦＲα及び三量体－ＴＧＦβＲ３のｃｒｙｏ－ＥＭ構造は、受容体結合及び強力な中和抗体の可能性のある標的に関与する三量体上の機能的に重要で高度に保存された表面を明らかにした（図４、５及び６）。したがって、ＰＤＧＦＲαとの三量体相互作用が重要な細胞シグナル伝達経路に干渉し得るかどうかを調べた。ＰＤＧＦＲαの場合、ＰＤＧＦ成長因子の結合は、受容体を二量体化し、細胞内キナーゼドメインを活性化してシグナル伝達カスケードを誘導する（Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０７：１１３０７－１１３１２，２０１０）。三量体－ＰＤＧＦＲα複合体と二量体（シグナル伝達活性）ＰＤＧＦＲα－ＰＤＧＦ複合体の相同性モデルとの構造的重ね合わせは、ＰＤＧＦＲα Ｄ２及びＤ３相互作用界面でのｇＯ及びＰＤＧＦの複数の立体的衝突を示した（図７Ｃ及び１２Ｅ）。低ナノモル親和性（Ｋａｂａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１：１６０８２，２０１６）での三量体とＰＤＧＦＲαとの強い相互作用（表２）、及び３桁のナノモル親和性（Ｍａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，７：１６４３９，２０１７）を特徴とするＰＤＧＦＲαに対するＰＤＧＦ－ＡＡの中程度の結合親和性を考慮して、三量体がＰＤＧＦＲαへの結合についてＰＤＧＦと競合し、それによってシグナル伝達カスケードの誘導を妨げることができるという仮説を試験した。この仮説を試験するために、ＨＣＭＶ三量体を最初にｇＯの電荷変異で精製し（三量体ｍｕｔ；部位２～４：Ｍ８４Ｒ、Ｆ１１１Ｒ、Ｒ１１７Ｅ、Ｆ１３６Ｒ、Ｒ２１２Ｅ、Ｒ２３０Ｅ、Ｒ２３４Ｅ、Ｒ３３６Ｅ、Ｆ３４２Ｅ、Ａ３５１Ｒ、Ｎ３５８Ｒ）、ＰＤＧＦＲαへのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合のおよそ１０，０００倍の減少が観察された（ＫＤ三量体－ＷＴ：２．２５×１０－９＋／－１．１Ｍ対ＫＤ三量体－ｍｕｔ：４．２５×１０－５＋／－０．５Ｍ）（図７Ｄ）。次に、自己リン酸化ＰＤＧＦＲα残基Ｙ７６２及びＹ８４９並びにリン酸化ＡＫＴを下流基質として検出することによって、ＰＤＧＦ－ＡＡ及び三量体ＷＴ又は三量体ｍｕｔの添加時のＭＲＣ－５線維芽細胞におけるＰＤＧＦＲα活性化及びシグナル伝達を評価した。ＰＤＧＦ－ＡＡ単独ではＰＤＧＦＲα及びＡＫＴで強い活性化シグナルを誘導したが、三量体ＷＴの滴定はＰＤＧＦＲαのＰＤＧＦ－ＡＡ誘導活性を強く低下させた（図７Ｅ）。対照的に、ＰＤＧＦＲα結合欠損三量体Ｍｕｔの添加は、ＰＤＧＦ－ＡＡの存在下でＰＤＧＦＲαの活性を低下させなかった（図７Ｅ）。したがって、ＨＣＭＶ三量体は、ＰＤＧＦＲαへの結合についてＰＤＧＦ－ＡＡと直接競合し、ＰＤＧＦＲαシグナル伝達を妨害し、これは、有効かつ安全な三量体ベースの抗ウイルス戦略の設計の重要な考慮事項である。
【0176】
ＰＤＧＦＲαの活性化及びシグナル伝達
線維芽細胞株ＭＲＣ－５を使用して、受容体リン酸化及び下流シグナル伝達を研究した。ＭＲＣ－５を、１０％ＦＢＳ、グルタミン及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ培地中で増殖させた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。細胞をＭ６ウェルプレートに播種し、約７５％コンフルエントまで増殖させ、刺激前に一晩飢餓状態にした。アッセイの当日、細胞を、ＰＤＧＦ－ＡＡ（３．７ｎＭ濃度）、ＣＭＶ三量体、又はＰＤＧＦ－ＡＡ：ＣＭＶ三量体で、モル比を漸増させて刺激した。刺激を、無血清培地中、３７℃で１０分間行った。処理後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、溶解した（溶解緩衝液：プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を補充した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０）。試料を、変性条件を使用してローディングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）装置を使用してウェスタンブロッティングによって分析した。
線維芽細胞株ＭＲＣ－５を使用して、受容体リン酸化及び下流シグナル伝達を研究した。ＭＲＣ－５を、１０％ＦＢＳ、グルタミン及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ培地中で増殖させた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。細胞をＭ６ウェルプレートに播種し、約７５％コンフルエントまで増殖させ、刺激前に一晩飢餓状態にした。アッセイの当日、細胞を、ＰＤＧＦ－ＡＡ（３．７ｎＭ濃度）、ＣＭＶ三量体、又はＰＤＧＦ－ＡＡ：ＣＭＶ三量体で、モル比を漸増させて刺激した。刺激を、無血清培地中、３７℃で１０分間行った。処理後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、溶解した（溶解緩衝液：プロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を補充した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０）。試料を、変性条件を使用してローディングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）装置を使用してウェスタンブロッティングによって分析した。
【0177】
抗体及び組換えタンパク質
これらの実施例で使用される全ての一次抗体を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）から購入した。検出に使用した二次抗体（ＩＲＤＹＥＳ（登録商標））は、ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。全ての抗体を製造業者によって推奨される希釈で使用し、インキュベーションを一晩（一次抗体）、又は室温で１時間（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）抗体）行った。
これらの実施例で使用される全ての一次抗体を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）から購入した。検出に使用した二次抗体（ＩＲＤＹＥＳ（登録商標））は、ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。全ての抗体を製造業者によって推奨される希釈で使用し、インキュベーションを一晩（一次抗体）、又は室温で１時間（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）抗体）行った。
【0178】
細胞刺激に使用されるヒトＰＤＧＦ－ＡＡを、ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。他の全ての組換えタンパク質を社内で作製した。
【0179】
結論
これらの実施例は、三量体複合体の構造、広域中和抗体の結合、三量体媒介ＨＣＭＶ受容体相互作用の機構、及び細胞シグナル伝達経路に対する結果に対する前例のない洞察を明らかにするＨＣＭＶ三量体の構造を提示する。これらの結果は、三量体ベースのワクチン及び抗ウイルス治療薬の設計に重要な結果をもたらす。
これらの実施例は、三量体複合体の構造、広域中和抗体の結合、三量体媒介ＨＣＭＶ受容体相互作用の機構、及び細胞シグナル伝達経路に対する結果に対する前例のない洞察を明らかにするＨＣＭＶ三量体の構造を提示する。これらの結果は、三量体ベースのワクチン及び抗ウイルス治療薬の設計に重要な結果をもたらす。
【0180】
重要なことに、これらの実施例は、ｇＯのグリカンを含まない表面が新規な広域中和抗体の開発の標的となり得る可能性を直接示している。さらに、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３に対する三量体相互作用の遮断はまた、ＨＣＭＶ侵入を標的化するための新しい戦略を提供するであろう。注目すべきことに、三量体は、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３との複数の相互作用部位にわたって広範な接触を形成し、単一部位での結合を破壊しようとすると、ＰＤＧＦＲα結合を完全に消失することはできなかった（図５）。代わりに、ｇＯ中の複数の相互作用部位が実証され、ＨＣＭＶ三量体とＰＤＧＦＲαとの相互作用を遮断するために同時に標的化される必要があった（図５Ｇ）。したがって、例えば多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を含む、ｇＯに対する十分に大きな相互作用フットプリントを有する広域中和抗体を使用して、ＰＤＧＦＲα及びＴＧＦβＲ３受容体タンパク質の両方の相互作用を置換することができる。あるいは、抗ウイルス治療薬の開発のために、ＰＤＧＦＲαのＤ１～Ｄ３ドメインを利用して、内因性宿主受容体への三量体結合を遮断することが可能である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図8I】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図13H】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【配列表】
【国際調査報告】