特表 2023-553422 ウイルスゲノムを切断するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-21

(54)【発明の名称】ウイルスゲノムを切断するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/04 20060101AFI20231214BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231214BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20231214BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20231214BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20231214BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20231214BHJP

   C12N 9/22 20060101ALN20231214BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20231214BHJP

【ＦＩ】

C12N7/04 ZNA

A61K48/00

A61K38/46

A61K31/7088

A61P31/20

A61P31/22

A61P31/18

C12N15/09 110

C12N9/16 Z

C12N9/22

C12N15/55

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023534383

(86)(22)【出願日】2021-12-01

(85)【翻訳文提出日】2023-07-14

(86)【国際出願番号】 US2021061398

(87)【国際公開番号】W WO2022119919

(87)【国際公開日】2022-06-09

(31)【優先権主張番号】63/120,089

(32)【優先日】2020-12-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518399047

【氏名又は名称】ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ リプレゼンテッド バイ ザ デパートメント オブ ベテランズ アフェアーズ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＡＳ ＲＥＰＲＥＳＥＮＴＥＤ ＢＹ ＴＨＥ ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＶＥＴＥＲＡＮＳ ＡＦＦＡＩＲＳ

(71)【出願人】

【識別番号】515147139

【氏名又は名称】トラスティーズ オブ ダートマス カレッジ

(71)【出願人】

【識別番号】523207881

【氏名又は名称】ダートマス－ヒッチコック クリニック アンド マリー ヒッチコック メモリアル ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】ハウエル アレクサンドラ

(72)【発明者】

【氏名】ヘイデン マシュー エス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065BD13

4B065BD35

4B065BD44

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC22

4C084MA02

4C084NA01

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB33

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA01

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB33

(57)【要約】

細胞内のウイルスを不活性化する方法であって、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物とを、ウイルスゲノムを含む細胞に投与することを含む方法が開示され、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列においてウイルスゲノムを切断する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内のウイルスを不活性化する方法であって、ウイルスゲノムを含む細胞に、
Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、
第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は前記第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、を投与することを含み、
前記Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼが、前記ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列において前記ウイルスゲノムを切断する、方法。

【請求項2】

前記第１のｇＲＮＡが、前記ウイルスゲノム内の前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列に相補的である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のｇＲＮＡが、前記ウイルスゲノム内の前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列にハイブリダイズして、前記ウイルスゲノム内の前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列においてＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ切断をもたらす、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

第２のｇＲＮＡを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のｇＲＮＡは、前記ウイルスゲノムの前記第１の標的配列に相補的であり、前記第２のｇＲＮＡは、前記ウイルスゲノム内の前記第２の標的配列に相補的である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のｇＲＮＡは、前記ウイルスゲノム内の前記第１の標的配列にハイブリダイズし、前記第２のｇＲＮＡは、前記ウイルスゲノム内の前記第２の標的配列にハイブリダイズして、前記ウイルスゲノム内の前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列においてＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ切断をもたらす、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列における前記切断は、前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列において５’一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オーバーハングをもたらす、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列における前記５’ｓｓＤＮＡオーバーハングが、相補的な重複配列を有する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列の前記５’ｓｓＤＮＡをハイブリダイズすることを更に含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列における前記５’ｓｓＤＮＡオーバーハングに隣接する配列が、相同配列を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列内の又はそれらに隣接する前記相同配列が、マイクロホモロジー媒介末端結合を促進する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第１の標的配列と前記第２の標的配列との間のウイルス配列、又はその一部は、前記ウイルス又はプロウイルスゲノムから除去される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞が細胞ゲノムを含み、前記ウイルスゲノムが前記細胞ゲノムに組み込まれている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ウイルスゲノムが、独立したゲノム要素として存在する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ゲノム又はｄｓＤＮＡからなるウイルス複製中間体を有する、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記ウイルスが、科Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅに由来する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ウイルスが、レトロウイルス科亜科Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ、Ｄｅｌｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅに由来する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ウイルスが、ＨＩＶ－１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、又はＨＴＬＶ－１である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ウイルスゲノムの少なくとも一部が、前記ウイルスゲノムの残りの部分から切除される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記細胞のＤＮＡが、Ｃａｓ１２ｄによって切断されない、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼが、修飾Ｃａｓ１２ｄである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

修飾Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅが、検出可能な標識を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記検出可能な標識が、蛍光タンパク質又は蛍光酵素である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記修飾Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅが、核局在化配列を含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞が、真核細胞である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

細胞に投与するステップが、宿主細胞を含む対象に投与することを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記第１のｇＲＮＡをコードする前記核酸構築物と前記第２のｇＲＮＡをコードする前記核酸構築物とが、同じ核酸構築物である、請求項４～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第１のｇＲＮＡをコードする前記核酸構築物と前記第２のｇＲＮＡをコードする前記核酸構築物とが、異なる核酸構築物である、請求項４～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸構築物が、前記第１のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードする同じ核酸構築物である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記投与するステップが、前記Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸構築物、前記第１のｇＲＮＡをコードする前記核酸構築物、及び前記第２のｇＲＮＡをコードする前記核酸構築物のうちの１つ以上を含むウイルスベクターを投与することを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記第１の標的配列又は第２の標的配列のうちの少なくとも１つが、表１からの配列である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記第１の標的配列及び第２の標的配列が、表２の標的配列のペアのうちの１つである、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記第１の標的配列及び第２の標的配列が、前記ウイルスゲノムの反対側の鎖上にある、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記第１のｇＲＮＡが第１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、前記第２のｇＲＮＡが第２のｃｒＲＮＡを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記第１のｃｒＲＮＡの少なくとも一部が、前記ウイルスゲノム内の第１の標的配列に相補的であり、前記第２のｃｒＲＮＡの少なくとも一部が、前記ウイルスゲノム内の第２の標的配列に相補的である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記第１のｇＲＮＡが、第１のｃｒＲＮＡ及び第１のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記第２のｇＲＮＡが、第２のｃｒＲＮＡ及び第２のｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記第１のｃｒＲＮＡの少なくとも一部が、前記第１のｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、前記第２のｃｒＲＮＡの少なくとも一部が、前記第２のｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的である、請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

第３のｇＲＮＡ、又は前記第３のｇＲＮＡをコードする核酸構築物を更に含み、前記第３のｇＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部が、前記第１のｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

第４のｇＲＮＡ、又は前記第４のｇＲＮＡをコードする核酸構築物を更に含み、前記第４のｇＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１～３８、４２又は４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部が、前記第２のｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

ウイルスゲノムを含む細胞を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、
Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又は前記Ｃａｓ１２ｄ若しくは前記Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、
第１のｇＲＮＡ、又は前記第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、前記第１のｇＲＮＡは、前記ウイルスの前記ウイルスゲノム内の第１の標的配列に相補的である、第１のｇＲＮＡ又は前記第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、
第２のｇＲＮＡ、又は前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、前記第２のｇＲＮＡは、前記ウイルスの前記ウイルスゲノム内の第２の標的配列に相補的である、第２のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、を投与することを含み、
前記第１のｇＲＮＡが前記ウイルスゲノム内の前記第１の標的配列にハイブリダイズし、前記第２のｇＲＮＡが前記ウイルスゲノム内の前記第２の標的配列にハイブリダイズして、前記ウイルスゲノム内の前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列においてＣａｓＸ又はＣａｓＹエンドヌクレアーゼ切断をもたらす、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／１２０，０８９号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、国立総合医科学研究所によって授与された１Ｒ４３ＧＭ１３３２８９－０１に基づく政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

ヒト細胞株に、ガイドＲＮＡを発現するプラスミドと、プラスミド上に運ばれるモデルプロウイルス配列内の単一領域を切断したＣａｓ９遺伝子とをトランスフェクトすることによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術はウイルス系に適用されている。同様の技術を使用して、プロウイルスの５’末端及び３’末端の両方を標的にする複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用が、細胞株中のプロウイルスゲノム全体を切除できる、又は変異の導入によってウイルスを不活性化することができることが実証された。これらの系において使用されるＣａｓ９及びｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ標的配列を破壊する小さな変異、欠失、又は挿入をもたらす、エラーを起こしやすいＤＮＡ修復機構によって作用する、両端における平滑末端切断をもたらす。

【0004】

先行技術の活用は課題を残した。具体的には、ウイルス又はプロウイルスゲノムの除去を達成する方法、並びにガイドＲＮＡ及びＣａｓ９遺伝子の送達、特にウイルスに感染した患者を治療するための治療手法としてのインビボ又はエクスビボのいずれかの静止白血球への送達において、課題が残っている。必要なのは、これらの先行技術の課題を克服する技術である。

【発明の概要】

【0005】

細胞内のウイルスを不活性化する方法であって、ウイルスゲノムを含む細胞に、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、を投与することを含み、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼが、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列においてウイルスゲノムを切断する、方法が開示される。

【0006】

細胞内のウイルスを不活性化する方法であって、ウイルスゲノムを含む細胞に、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、第１のｇＲＮＡ、又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、第１のｇＲＮＡは、ウイルスのウイルスゲノム内の第１の標的配列に相補的である、第１のｇＲＮＡ又は核酸構築物と、第２のｇＲＮＡ、又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、第２のｇＲＮＡは、ウイルスのウイルスゲノム内の第２の標的配列に相補的である、第２のｇＲＮＡ又は核酸構築物と、を投与することを含む、方法が開示され、第１のｇＲＮＡがウイルスゲノム内の第１の標的配列にハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡがウイルスゲノム内の第２の標的配列にハイブリダイズして、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列においてＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ切断をもたらす。

【0007】

開示される方法及び組成物の追加の利点は、一部は以下の説明に記載され、一部はその説明から理解されるか、又は開示の方法及び組成物の実践によって学習され得る。開示された方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。前述の概要及び以下の発明を実施するための形態の両方は、単に例示的及び説明的であり、特許請求される発明を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、説明とともに、開示された方法及び組成物のいくつかの実施形態を示し、開示された方法及び組成物の原理を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】ヒト細胞株におけるＨＢＶの非常に効率的な標的切除を示す。

【図2】ＨＢＶ及びＣａｓＸ２に対して指向される単一ｓｇＲＮＡを使用する、インビトロでのＨＢＶゲノムの部分の切断を示す。

【図3】ＨＢＶを標的とするＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ及びＣａｓＸ２／ｓｇＲＮＡを用いるオフターゲット切断事象のインビトロ解析を示す。配列番号１７３は最上位配列（ｔｏｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。配列番号１７４は最下位配列（ｂｏｔｔｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。

【図4】ＣａｓＸ１及びＨＢｘ ｓｇＲＮＡ１を使用する、ヒト細胞株におけるＨＢＶ ＨＢｘ遺伝子の破壊を示す。ＰＣＲ増幅したＨＢｘ遺伝子の領域を、Ｔ７エンドヌクレアーゼの有無にかかわらず処理して、変異又はＩＮＤＥＬの存在を検出した。配列番号１７５が最上位配列であり、配列番号１７６が最下位配列である。

【図5】ＣａｓＸと、マッチしたｇＲＮＡのペアとを使用するヒト細胞株におけるＨＢＶゲノムの部分の切除を示す。

【図6】ＨＢＶゲノムＤＮＡの標的切除を実証するサンガー配列決定の結果を示す。ｓｇＲＮＡ標的部位、続いてＨＢＶゲノムを含み、示されたＣａｓＸ及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から単離されたＤＮＡのＰＣＲ後に得られた個々の配列のサンガー配列決定によって得られた配列。ＰｒｅＳ遺伝子の場合、最上位配列は、配列番号１７７であり、最下位配列は配列番号１７８である。Ｘ遺伝子の場合、最上位配列は配列番号１７９であり、最下位配列は配列番号１８０である。最上位から最下位へ、残りの配列は、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、及び配列番号１９２である。

【図7】特異的ｇＲＮＡを使用するＴ７アッセイである。

【図8】Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイの前に実施される定量的ＰＣＲを示す。

【図9】新しいｇＲＮＡを用いる共トランスフェクション実験を示す。

【図10A-10B】制限マップを示す。Ａ）は、親ベクターの各々から増幅される断片を示す。Ｂ）は、Ａ）からの２種の断片が一緒になった後の最終ベクターを示す。

【図11】クローニング戦略を示す。

【図12】クローニング戦略を示す。

【図13】本明細書の実験に使用したｇＲＮＡを示す。上から下への配列は、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９である。

【図14】図２の実験で使用したｇＲＮＡを示す。上ら下への配列は、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４である。

【図15】ＣａｓＸ１及びＣａｓＸ２の例示的な配列を示す。

【図16】ＣａｓＹ１５の例示的な配列を示す。

【図17】ＣａｓＸ２を担持する例示的な構築物を示す。

【図18A-D】ＨＩＶ－１（Ａ）、ＨＢＶ（Ｂ）、ＨＴＬＶ－１（Ｃ）、及びＪＣＶ（Ｄ）Ｃａｓ１２ｄ ｇＲＮＡペアの例を示す。各ウイルスについて示される２種のｇＲＮＡ間で共有されるマイクロホモロジー（ＭＨ）のｇＲＮＡ標的部位（プロトスペーサー）及び隣接する又は重複する領域が、示される。Ａ）左上の配列番号２２８、左下の配列番号２２９、右上の配列番号２３０、右下の配列番号２３１、Ｂ）左上の配列番号 ２３２、左下の配列番号２３３、右上の配列番号２３４、右下の配列番号２３５、Ｃ）左上の配列番号２３６、左下の配列番号２３７、右上の配列番号２３８、右下の配列番号２３９、Ｄ）左上の配列番号２４０、左下の配列番号２４１、右上の配列番号２４２、右下の配列番号２４３。

【発明を実施するための形態】

【0009】

開示された方法及び組成物は、以下の特定の実施形態の詳細な説明及びそこに含まれる実施例、並びに図及びそれらの前後の説明を参照することによって、より容易に理解され得る。

【0010】

開示された方法及び組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、又は特定の試薬に限定されず、特に指定がない限り、そのように、変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0011】

開示された方法及び組成物に使用できる、開示された方法及び組成物とともに使用できる、開示された方法及び組成物の調製に使用できる、又は開示された方法及び組成物の生成物である、材料、組成物、及び成分が開示される。これらの材料及び他の材料は本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されている場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個別及び集団の組み合わせ並びに変更への具体的な言及が明確に開示されていない場合があるが、それぞれが具体的に想定され本明細書に記載されていると理解されたい。したがって、分子Ａ、Ｂ、Ｃのクラスと、分子Ｄ、Ｅ、Ｆのクラスと、組み合わせ分子の例であるＡ～Ｄとが開示されている場合、それぞれが個別に記載されていなくても、それぞれが個別に、かつ集団的に想定されている。したがって、この例では、Ａ～Ｅ、Ａ～Ｆ、Ｂ～Ｄ、Ｂ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、Ｃ～Ｄ、Ｃ～Ｅ、Ｃ～Ｆの各組み合わせは、具体的に想定されており、Ａ、Ｂ、Ｃ；Ｄ、Ｅ、Ｆ；及び例示的組み合わせＡ～Ｄの開示から、開示したと考えるべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも、具体的に想定され、開示されている。したがって、例えば、Ａ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、及びＣ～Ｅのサブグループは、具体的に想定されており、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；及び例示的組み合わせＡ～Ｄの開示から、開示されていると考えるべきである。この概念は、開示された組成物を製造及び使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されず、本願の全ての態様に適用される。したがって、実行可能な様々な追加ステップがある場合、これらの追加ステップの各々は、開示された方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせで実行可能であり、そのような組み合わせの各々は、具体的に想定され、開示されたとみなされるべきであることが理解される。

【0012】

Ａ．定義
開示された方法及び組成物は、これらが変動し得るため、記載された特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図していないことも理解されたい。

【0013】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｇＲＮＡ」への言及は、そのようなｇＲＮＡの複数を含み、「標的配列」への言及は、当業者に知られている１つ以上の標的配列及びその均等物への言及、などである。

【0014】

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、本明細書に開示される方法の対象は、哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、又は両生類などの脊椎動物であり得る。用語「対象」は、飼育動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含まれる。一態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、対象はヒトである。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。したがって、雌雄を問わず、成人、子供、青年及び新生児の対象、並びに胎児も対象となることが意図されている。

【0015】

本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するものである。いくつかの態様において、「治療」は、疾患若しくは状態を有するヒト又は他の哺乳動物（例えば、動物モデル）などの対象に、疾患若しくは状態の悪化を予防又は遅延させるために、又は疾患若しくは状態の影響を部分的若しくは完全に逆転させるために、本明細書に記載のｇＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ又は組成物を投与することを意味する。いくつかの態様において、疾患は、がんである。治療は、疾患、障害、及び／又は状態の兆候を示さない対象に、及び／又は疾患、障害、及び／又は状態の初期兆候のみを示す対象に、疾患、障害、及び／又は状態に関連する病態の発症リスクを減少させる目的で投与され得る。いくつかの実施形態において、治療は、開示されたｇＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ又は組成物のうちの１つ以上を対象に送達することを含む。

【0016】

本明細書で使用される場合、「予防」は、疾患、障害又は状態を発症する感受性が増加した対象が疾患、障害又は状態を発症する可能性を最小限に抑えることを意味する。例えば、本明細書で使用される予防は、ウイルス感染を発症する感受性が増加した対象が感染する可能性を最小限に抑えることを意味することができる。

【0017】

本明細書で使用する場合、用語「投与する」及び「投与」は、開示されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、又は医薬品を対象に与える任意の方法を意味する。そのような方法は、当業者に周知であり、例えば、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、点眼、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、並びに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与を含む注射可能な非経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、連続的又は間欠的であり得る。様々な態様において、調製物は、治療的に投与することができる、すなわち、既存の疾患又は状態を治療するために投与される。更なる様々な態様において、調製物は、予防的に投与され得る、すなわち、疾患又は状態の予防のために投与される。ある態様において、当業者は、対象を治療する、又はアポトーシスを誘導するために、開示される組成物又は開示される複合体の有効な用量、有効なスケジュール、又は有効な投与経路を決定することができる。ある態様において、当業者は、開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、又は医薬品の有効性を改善するように、投与ステップの態様を変更又は修正することができる。

【0018】

本明細書で互換的に使用される用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの重合体であって、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかを指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、若しくは多本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基、又は他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然、若しくは誘導されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、記載される実施形態に適用可能な場合、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。

【0019】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコード化されたアミノ酸及び非遺伝的にコード化されたアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。この用語には、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種及び同種のリーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する又は有さない融合タンパク質、免疫学的にタグ付けされたタンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。

【0020】

核酸、タンパク質、細胞、又は生物に適用され、本明細書で使用される用語「天然に存在する」は、自然界に存在する核酸、細胞、タンパク質、又は生物を意味する。いくつかの態様において、用語「天然に存在する」は、「野生型」を意味し得る。

【0021】

本明細書で使用される「組換え」は、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、クローニング、制限、及び／又はライゲーションステップの種々の組み合わせの産物であり、天然のシステムに見られる内因性核酸とは区別可能な構造的コード又は非コード配列を有する構築物を得ることを意味する。一般に、構造コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーから、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから、細胞又は無細胞転写・翻訳系に含まれる組換え転写単位から発現可能な合成核酸を得るために組み立てることができる。そのような配列は、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部の非翻訳配列又はイントロンによっては中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供され得る。関連する配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子又は転写単位の形成に使用することもできる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’が存在してもよく、このような配列は、コード領域の操作又は発現を妨げず、様々なメカニズムによって所望の生成物の産生を調節するように実際に作用してもよい（以下の「ＤＮＡ調節配列」を参照）。

【0022】

したがって、例えば、用語「組換え」ポリヌクレオチド又は「組換え」核酸は、天然に存在しないもの、例えば、人為的な介入により２種の別個の配列セグメントが人工的に結合することによって作られるものを指す。この人工的な組み合わせは、化学合成手段、又は遺伝子工学技術などによる核酸の分離セグメントの人工的な操作のいずれかによって、達成されることが多い。これは通常、配列認識部位を導入又は除去しながら、コドンを同じアミノ酸又は保存的アミノ酸をコードする冗長コドンと置換するために行われる。代わりに、所望の機能の核酸セグメントを結合して、所望の機能の組み合わせを生成するために実施される。この人工的な組み合わせは、化学合成手段、又は遺伝子工学技術などによる核酸の分離セグメントの人工的な操作のいずれかによって、達成されることが多い。

【0023】

同様に、用語「組換え」ポリペプチドは、天然に存在しない、例えば、人為的な介入によりアミノ配列の２種の別個のセグメントが人工的に結合することによって作られるポリペプチドを指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むポリペプチドは、組換え体である。

【0024】

「構築物」又は「ベクター」とは、組換え核酸、一般的には組換えＤＮＡを意味し、これは、特定のヌクレオチド配列の発現及び／又は増殖の目的で生成され、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される。

【0025】

本明細書で使用される「宿主細胞」は、インビボ又はインビトロの真核細胞、原核細胞、又は単細胞実体として培養された多細胞生物（例えば、細胞株）からの細胞を意味し、真核細胞又は原核細胞は、核酸（例えば、発現ベクター）のレシピエントとして使用され得る、又は使用されており、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、自然、偶発的、又は意図的な変異によって、元の親と形態学的に又はゲノム又は全ＤＮＡ相補体において必ずしも完全に同一であるとは限らないことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子組換え宿主細胞」とも称される）は、異種核酸、例えば、発現ベクターが導入されている宿主細胞である。例えば、対象原核宿主細胞は、適切な原核宿主細胞への異種核酸、例えば、原核宿主細胞にとって外来性である（天然には通常見出されない）外因性核酸、又は原核宿主細胞において通常見出されない組換え核酸の導入によって、遺伝子改変された原核宿主細胞（例えば、細菌）であり、対象真核宿主細胞は、適切な真核宿主細胞への異種核酸、例えば、真核宿主細胞にとって外来性である外因性核酸、又は真核宿主細胞において通常見出されない組換え核酸の導入によって、遺伝子改変された真核宿主細胞である。

【0026】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対してある特定の割合の「配列同一性」を有し、すなわち、整列させたときに、塩基又はアミノ酸のパーセンテージが同じであり、２つの配列を比較したときに、同じ相対位置にあることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを使用して、配列を整列させることができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０を参照されたい。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡにあり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社であるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで入手可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡに記載されている。配列におけるギャップを許容するアラインメントプログラムが、特に興味深い。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して配列を整列させることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照。

【0027】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴヌクレオチドと相補的核酸配列との対合を意味する。そのような対合は、典型的には、オリゴヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）の相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）と標的核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチドが、標的核酸の対応する領域の逆相補的ヌクレオチド配列を含む）との間のワトソン－クリック型水素結合、フーグスティーン型水素結合又は逆フーグスティーン水素結合であり得る、水素結合を伴う。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に特異的にハイブリダイズする。用語「特異的にハイブリダイズする」及び「特異的にハイブリダイズ可能な」は、本明細書において互換的に使用され、オリゴヌクレオチドと標的核酸（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）との間に安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な相補性の程度を示す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことを理解されたい。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合が、標的核酸の正常な機能を妨害して、標的核酸の有用性又は発現の喪失又は変化をもたらす場合に、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であると考えられる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間には十分な相補性が存在し、特異的結合が所望される条件下（例えば、インビボアッセイ又は治療処置の場合には生理学的条件下、及びインビトロアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下）で、オリゴヌクレオチドの望ましくない非標的配列への非特異的結合を回避又は最小限に抑える。非特異的ハイブリダイゼーション事象を最小化し、かつ標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションに最適な条件を決定することは、十分にオリゴヌクレオチド分野の科学者の技術レベルの範囲内である。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、それが特異的にハイブリダイズする標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の領域の対応する相補配列と比較して、１、２、又は３個の塩基置換を含む。いくつかの実施形態において、非相補的核酸塩基の位置は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端にある。追加の実施形態において、非相補的核酸塩基は、オリゴヌクレオチドの内側位置に位置する。２個以上の非相補的核酸塩基がオリゴヌクレオチド中に存在する場合、それらは、連続的（すなわち、連結している）、非連続的、又はその両方であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸内のポリヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する。同一性パーセントは、比較されるオリゴヌクレオチドと、対応する核酸配列とが同一である塩基の数に従って計算される。この同一性は、オリゴマー化合物（すなわち、オリゴヌクレオチド）の全長にわたって、又はオリゴヌクレオチドの一部においてであってもよい（例えば、２７量体の１～２０の核酸塩基を２０量体と比較して、オリゴヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドの同一性パーセントを決定してもよい）。オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の同一性パーセントは、当該技術分野で既知のアラインメントプログラム及びＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所アラインメント検索ツール）を使用して日常的に決定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６を参照）。

【0028】

「任意選択的な」又は「任意選択的に」は、その後に記載される事象、状況又は材料が発生又は存在してもしなくてもよく、その記載が、事象、状況又は材料が発生又は存在する場合と、事象、状況又は材料が発生又は存在しない場合とを含み得ることを意味する。

【0029】

本明細書において、範囲は、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値まで、のように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、文脈が特に別に示さない限り、１つの特定の値から及び／又は他の特定の値までの範囲も具体的に想定され、開示されたものとみなされる。同様に、先行詞「約」を使用して値が近似値として表現される場合、文脈が特に別に示さない限り、特定の値が別の具体的に想定された実施形態を形成し、開示されたものとみなされることが理解されるであろう。更に、範囲のそれぞれの端点は、文脈が特に別に示さない限り、他の端点と関連して、及び他の端点から独立しての両方で重要であることが理解されるであろう。最後に、明確に開示された範囲内に含まれる個々の値及び値の部分範囲の全てもまた具体的に想定されており、文脈が特に別に示さない限り、開示されたものとみなされるべきであることが理解されるべきである。上記は、特定の場合において、これらの実施形態の一部又は全部が明確に開示されているか否かにかかわらず、適用される。

【0030】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される方法及び組成物が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は均等の任意の方法及び材料は、本方法及び組成物の実施又は試験において使用され得るが、特に有用な方法、デバイス、及び材料は、記載されている通りである。本明細書で引用した刊行物及びそれらで引用された資料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する権利を与えられないということを承認するものと解釈するべきではない。いずれの参考文献も先行技術を構成することを認めるものではない。参考文献の議論は、それらの著者が主張することを述べており、出願人は、引用された文書の正確さ及び妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。本明細書では、多くの刊行物が参照されているが、このような参照は、これらの文書のいずれも当該技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではないことが明確に理解されるだろう。

【0031】

本出願で使用される場合、語句「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びこの語句の変形語、例えば、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが限定されない」を意味し、他の付加物、構成要素、整数又はステップを除外することを意図しない。特に、１つ以上のステップ又は操作を含むと記載された方法においては、各ステップが記載されたものからなることが特に意図されており（そのステップが「からなる」などの限定語を含まない限り）、各ステップが、例えば、そのステップに記載されていない他の添加剤、成分、整数又はステップを除外することを意図しないことを意味する。

【0032】

本明細書で使用される場合、「ＣａｓＸ」は、Ｃａｓ１２ｅ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼファミリーと互換的に使用され、その逆もまた然りである。

【0033】

本明細書で使用される場合、「ＣａｓＹ」は、Ｃａｓ１２ｄ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼファミリーと互換的に使用され、その逆もまた然りである。
Ｂ．方法

【0034】

細胞内のウイルスを不活性化する方法であって、ウイルスゲノムを含む細胞に、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物を含む細胞に投与することを含む、方法が開示され、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列においてウイルスゲノムを切断する。いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物は、組成物に含まれる。したがって、いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物を含む組成物を、細胞に投与し得る。

【0035】

細胞内のウイルスを不活性化する方法であって、ウイルスゲノムを含む細胞に、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、第１のｇＲＮＡは、ウイルスのウイルスゲノム内の第１の標的配列に相補的である、第１のｇＲＮＡ、又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、第２のｇＲＮＡ、又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、第２のｇＲＮＡは、ウイルスのウイルスゲノム内の第２の標的配列に相補的である、第２のｇＲＮＡ、又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、を投与することを含む、方法が開示され、第１のｇＲＮＡがウイルスゲノム内の第１の標的配列にハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡがウイルスゲノム内の第２の標的配列にハイブリダイズして、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列においてＣａｓ１２ｅ又はＣａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ切断をもたらす。

【0036】

いくつかの態様において、細胞内のウイルスを不活性化する本開示の方法は、ウイルスゲノム内の第１及び第２の標的配列でウイルスゲノムを切断するために、少なくとも第１のｇＲＮＡと、しかしたびたび第１及び第２のｇＲＮＡと、作用するＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼを含む。第１及び第２の標的配列におけるウイルスゲノムの切断は、ウイルスの不活性化をもたらす。いくつかの態様において、１個以上のウイルス遺伝子の一部、１個以上のウイルス遺伝子の全体、又はウイルスゲノム全体を、エンドヌクレアーゼ切断によって除去することができ、この除去はウイルスの不活性化をもたらす。いくつかの態様において、１個以上のウイルス遺伝子の一部、１個以上のウイルス遺伝子の全体、又はウイルスゲノム全体の除去は、それを細胞ゲノムから除去することを指す。

【0037】

いくつかの態様において、細胞は宿主細胞と呼ばれ得る。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト細胞であり得る。いくつかの態様において、細胞は、細胞ゲノム及びウイルスゲノムの両方を含む。

【0038】

いくつかの態様において、細胞に投与することは、細胞を含む対象に投与することを含む。例えば、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物を投与することには、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物を、静脈内注射、筋肉内注射、頭蓋内注射又は皮下注射を介して、対象に投与することを含めることができるが、これらに限定されない。対象の中に入ると、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物は、細胞に入ることができる。

【0039】

ウイルスゲノムを含む細胞を有する対象を治療するための方法であって、対象に、Ｃａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｄ若しくはＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物と、第１のｇＲＮＡ、又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、第１のｇＲＮＡは、ウイルスのウイルスゲノム内の第１の標的配列に相補的である、第１のｇＲＮＡ又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、第２のｇＲＮＡ、又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物であって、第２のｇＲＮＡは、ウイルスのウイルスゲノム内の第２の標的配列に相補的である、第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、を投与することを含む、方法が開示され、第１のｇＲＮＡがウイルスゲノム内の第１の標的配列にハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡがウイルスゲノム内の第２の標的配列にハイブリダイズして、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列においてＣａｓ１２ｅ又はＣａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ切断をもたらす。いくつかの態様において、ウイルスゲノムを含む細胞を有する対象は、ウイルス感染した対象である。したがって、ウイルス感染を治療する方法が開示される。いくつかの態様において、対象を治療することは、ウイルスが複製、感染、又は疾患症状を引き起こし続けることができないように、対象の細胞ゲノムからウイルスゲノムを除去することを指すことができる。

【0040】

１．ガイドＲＮＡ
本明細書に記載の方法で使用できるｇＲＮＡを、本明細書で開示する。ｇＲＮＡの例としては、図、表２又は本明細書に示される実施例に開示されるｇＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。標的配列に特異的に結合するｇＲＮＡが本明細書に開示され、標的配列としては、本明細書に示される表１、図又は実施例の標的配列が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼに結合して、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、複合体を標的核酸（例えば、標的配列）内の特定の位置に標的化する核酸分子である。ある場合には、ｇＲＮＡがＲＮＡ塩基に加えてＤＮＡ塩基を含むように、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡを作成することができるが、用語「ｇＲＮＡ」は依然として、本明細書でそのような分子を包含するために使用されることを理解されたい。

【0042】

本明細書に記載される場合、ｇＲＮＡは、２つのセグメント、標的化セグメント（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ））及びタンパク質結合セグメント（トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ））を含むことができる。ｇＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）内の特異的配列（標的配列）に相補的である（したがって、それとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。タンパク質結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼと相互作用する（結合する）。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）、又はｓｔｅｍループを形成する、２つの相補的なヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む。標的核酸（例えば、ウイルスＤＮＡ）の部位特異的結合及び／又は切断は、ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡのガイド配列）と標的核酸の標的配列との間の塩基対相補性によって決定される位置（例えば、標的遺伝子座の標的配列）で生じ得る。

【0043】

ｇＲＮＡ及びＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼは、複合体を形成する（例えば、非共有結合相互作用を介して結合する）。ｇＲＮＡは、標的化セグメントを含むことによって、複合体に標的特異性を提供し、標的化セグメントは、ガイド配列（標的核酸の標的配列に相補的なヌクレオチド配列）を含む複合体のＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼは、部位特異的活性（例えば、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼによって提供される切断活性）を提供する。言い換えれば、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡとの会合により、標的核酸配列（例えば、標的配列）に誘導される。

【0044】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡハイブリダイゼーション（例えば、それらが相補的セグメントを有する）した後に形成され得、したがって、ｃｒＲＮＡの標的配列が標的配列に結合することを可能にし、一方、ｔｒａｃｒＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、エンドヌクレアーゼをもたらし、その後、エンドヌクレアーゼは標的配列を切断することができる。

【0045】

ｇＲＮＡの標的化セグメントは、ガイド配列（すなわち、標的化配列）を含み、これは、標的核酸中の配列（標的配列）に相補的なヌクレオチド配列である。言い換えれば、ｇＲＮＡの標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的様式で、標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）と相互作用できる。ｇＲＮＡのガイド配列は、標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）内で（例えば、ＰＡＭを考慮に入れながら、例えば、ｄｓＤＮＡ標的を標的とするときに）任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように修飾（例えば、遺伝子工学によって）／設計することができる。

【0046】

いくつかの実施形態において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは１００％である。

【0047】

いくつかの場合おいて、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１６個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続ヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１６個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続ヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続ヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９個以上（例えば、２０個以上、２１個以上、２２個以上）の連続ヌクレオチドにわたって１００％である。

【0048】

いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１６９～２５個の連続ヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１９～２５個の連続ヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１６～２５個の連続ヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。いくつかの場合において、ガイド配列と標的核酸の標的配列との間の相補性パーセントは、１６～２５個の連続ヌクレオチドにわたって１００％である。

【0049】

いくつかの場合において、ガイド配列は、１９～３０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１６～２５、１６～２２、１６～２０、２０～３０、２０～２５、又は２０～２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、１９～２５ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１６～２２、１６～２０、２０～２５、２０～２５、又は２０～２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、１６以上のｎｔ（例えば、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、又は２２以上のｎｔ；１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔなど）の長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、１６ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、１７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、１８ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、１９ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、２０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、２１ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、２２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、２３ｎｔの長さを有する。

【0050】

様々なＣａｓ９ガイドＲＮＡの例は、当該技術分野に見出され得、いくつかの場合において、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに導入されたものと同様の変異体を、本開示のＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅ ｇＲＮＡにも導入され得る。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－２１；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６－３７；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３Ｓｅｐ．２４；１１０（３９）：１５６４４－９；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１；Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３１（９）：８３９－４３；Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ．２８；１５２（５）：１１７３－８３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３Ｍａｙ９；１５３（４）：９１０－８；Ａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３Ｏｃｔ．３１；Ｃｈｅｎ ｅｔ． ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ．１；４１（２０）：ｅ１９；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３Ｏｃｔｏｂｅｒ；２３（１０）：１１６３－７１；Ｃｈｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１９５（３）：１１７７－８０；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３Ａｐｒｉｌ；４１（７）：４３３６－４３；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３Ｏｃｔｏｂｅｒ；１０（１０）：１０２８－３４；Ｅｂｉｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０；Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３Ｎｏｖ．１；４１（２０）：ｅ１８７；Ｈｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２３（１１）：１３２２－５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３Ｎｏｖ．１；４１（２０）：ｅ１８８；Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８（１１）：２１８０－９６；Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３Ｏｃｔｏｂｅｒ；１０（１０）：９５７－６３；Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５１（１２）：８３５－４３；Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８（１１）：２２８１－３０８；Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３Ｓｅｐ．１２；１５４（６）：１３８０－９；Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３Ｄｅｃ．９；３（１２）：２２３３－８；Ｗａｌｓｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３Ｓｅｐ．２４；１１０（３９）：１５５１４－５；Ｘｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３Ｏｃｔ．９；Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３Ｓｅｐ．１２；１５４（６）：１３７０－９；Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４Ｏｃｔ．２３；５６（２）：３３３－９、並びに米国特許及び特許出願：米国特許８，９０６，６１６、８，８９５，３０８、８，８８９，４１８、８，８８９，３５６、８，８７１，４４５、８，８６５，４０６、８，７９５，９６５、８，７７１，９４５、８，６９７，３５９、２０１４／００６８７９７、２０１４／０１７０７５３、２０１４／０１７９００６、２０１４／０１７９７７０、２０１４／０１８６８４３、２０１４／０１８６９１９、２０１４／０１８６９５８、２０１４／０１８９８９６、２０１４／０２２７７８７、２０１４／０２３４９７２、２０１４／０２４２６６４、２０１４／０２４２６９９、２０１４／０２４２７００、２０１４／０２４２７０２、２０１４／０２４８７０２、２０１４／０２５６０４６、２０１４／０２７３０３７、２０１４／０２７３２２６、２０１４／０２７３２３０、２０１４／０２７３２３１、２０１４／０２７３２３２、２０１４／０２７３２３３、２０１４／０２７３２３４、２０１４／０２７３２３５、２０１４／０２８７９３８、２０１４／０２９５５５６、２０１４／０２９５５５７、２０１４／０２９８５４７、２０１４／０３０４８５３、２０１４／０３０９４８７、２０１４／０３１０８２８、２０１４／０３１０８３０、２０１４／０３１５９８５、２０１４／０３３５０６３、２０１４／０３３５６２０、２０１４／０３４２４５６、２０１４／０３４２４５７、２０１４／０３４２４５８、２０１４／０３４９４００、２０１４／０３４９４０５、２０１４／０３５６８６７、２０１４／０３５６９５６、２０１４／０３５６９５８、２０１４／０３５６９５９、２０１４／０３５７５２３、２０１４／０３５７５３０、２０１４／０３６４３３３及び２０１４／０３７７８６８を参照、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0051】

いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、ウイルスゲノムにおける第１の標的配列及び第２の標的配列に相補的である。いくつかの態様において、単一ｇＲＮＡは、ウイルスゲノムが繰り返し配列を有するときに、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列に相補的であり得る。例えば、これは、ウイルスゲノムの各末端（５’及び３’）に末端反復配列（ＬＴＲ）を有するレトロウイルスで起こり得、ここで、ＬＴＲは、ウイルスゲノムの５’末端及びウイルスゲノムの３’末端で同じである。したがって、第１のｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、ウイルスゲノムの５’末端及びウイルスゲノムの３’末端の両方に存在する単一の配列に相補的であり得る。例えば、第１の標的配列及び第２の標的配列は、ＬＴＲ内の単一配列であり得る。第１の標的配列は、５’ＬＴＲに存在することができ、一方、第２の標的配列は、３’ＬＴＲに存在することができる。

【0052】

いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、ウイルスゲノムにおける第１の標的配列及び第２の標的配列にハイブリダイズして、ウイルスゲノムにおける第１の標的配列及び第２の標的配列においてＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ切断をもたらす。

【0053】

したがって、いくつかの態様において、単一ｇＲＮＡを使用して、２つの異なる位置でウイルスゲノムを切断し得る。また、ウイルスゲノムを２つの異なる位置で切断するための、少なくとも２種のｇＲＮＡの使用も開示される。

【0054】

一部の態様において、開示される方法は、第２のｇＲＮＡを更に含むことができる。一部の態様において、第１のｇＲＮＡは、ウイルスゲノムの第１の標的配列に相補的であり、第２のｇＲＮＡは、ウイルスのウイルスゲノム内の第２の標的配列に相補的である。いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡはウイルスゲノム内の第１の標的配列にハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡはウイルスゲノム内の第２の標的配列にハイブリダイズして、ウイルスゲノム内の第１の標的配列及び第２の標的配列においてＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ切断をもたらす。

【0055】

いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物とは、同じ核酸構築物である。
いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物と、第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物とは、異なる核酸構築物である。

【0056】

いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物及び／又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物は、ウイルスベクターの一部である。したがって、いくつかの態様において、投与することは、第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物及び第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物のうちの１つ以上を含むウイルスベクターを投与することを含む。

【0057】

いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは第１のｃｒＲＮＡを含み、第２のｇＲＮＡは第２のｃｒＲＮＡを含む。いくつかの態様において、第１のｃｒＲＮＡの少なくとも一部は、ウイルスゲノムにおける第１の標的配列に相補的であり、第２のｃｒＲＮＡの少なくとも一部は、ウイルスゲノムにおける第２の標的配列に相補的である。

【0058】

いくつかの態様において、第１のｇＲＮＡは、第１のｃｒＲＮＡ及び第１のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方を含む。第１のｃｒＲＮＡ及び第１のｔｒａｃｒＲＮＡが単一の転写物として存在する場合、ｇＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称される。したがって、第１のｇＲＮＡは、第１のｓｇＲＮＡと称され得る。いくつかの態様において、第２のｇＲＮＡは、第２のｃｒＲＮＡ及び第２のｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む。したがって、第２のｇＲＮＡは、第２のｓｇＲＮＡと称され得る。

【0059】

いくつかの態様において、第１のｃｒＲＮＡの少なくとも一部は、第１のｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、第２のｃｒＲＮＡの少なくとも一部は、第２のｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。いくつかの態様において、第１のｃｒＲＮＡ及び第１のｔｒａｃｒＲＮＡの相補配列はハイブリダイズする。いくつかの態様において、第２のｃｒＲＮＡ及び第２のｔｒａｃｒＲＮＡの相補配列はハイブリダイズする。

【0060】

いくつかの態様において、本開示の方法は、第３のｇＲＮＡ、又は第３のｇＲＮＡをコードする核酸構築物を更に含む。いくつかの態様において、第３のｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部は、第１のｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。したがって、いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは第１のｔｒａｃｒＲＮＡである。いくつかの態様において、第１のｃｒＲＮＡ及び（第１の）ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ上に存在し、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、別個の転写産物上に存在し得る。

【0061】

いくつかの態様において、開示される方法は、第４のｇＲＮＡ、又は第４のｇＲＮＡをコードする核酸構築物を含む。いくつかの態様において、第４のｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部は、第２のｃｒＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。したがって、いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２のｃｒＲＮＡにハイブリダイズするため、第２のｔｒａｃｒＲＮＡである。第２のｃｒＲＮＡ及び（第２の）ｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡ上に存在する代わりに、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは別個の転写産物上に存在し得る。

【0062】

本明細書に開示される方法において、ｇＲＮＡは、ウイルス又はプロウイルスゲノムの介在領域の切除を促進するように設計することができる。Ｃａｓ１２ｄ及びＣａｓ１２ｅの切断パターンは、Ｃａｓ９に特徴的な平滑ＤＮＡ二本鎖切断ではなく５’オーバーハングを生成し、これは非相同末端切除のプロセスを促進する。いくつかの態様において、５’オーバーハング、及び２つ以上のＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅ切断部位に隣接する相同ＤＮＡ配列の短い配列の存在は、細胞のＤＮＡ修復プロセスを介して介在ＤＮＡの切除を促進できる。いくつかの態様において、プロセスは、互換性のあるオーバーハングの直接接合又は代替的な末端接合プロセスを含むことができる。５’オーバーハングによる末端切除の促進は、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）と呼ばれるプロセスを通じて代替末端結合を促進でき、これは代替末端結合、又は代替非相同末端結合、又はシータ媒介末端結合（ＴＭＥＪ）としても知られ得る。これらのプロセスは、２つの切断部位の間にある介在ＤＮＡ配列を効果的に切除することができる。

【0063】

いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ウイルスのゲノム又はプロウイルスゲノムにおける標的領域の同定を用いることができ、それのため、ｇＲＮＡ、いくつかの場合は第２のｇＲＮＡ、いくつかの場合は第３のｇＲＮＡは、２つ以上の切断部位を結合して、ウイルス複製又はウイルス遺伝子産物の産生を妨げるウイルスＤＮＡの領域の切除を生じるために、マイクロホモロジーとして知られる、ホモロジーの小さな領域を利用するＭＭＥＪ又は他の細胞ＤＮＡ修復機構を促進するように設計され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅ ｇＲＮＡは、ウイルスＤＮＡ配列に基づいて設計することができる。特定の配列、又は既知のウイルス配列に基づくコンセンサス配列のいずれかを使用することができる。ウイルス配列を手動又は計算ツールを使用してスキャンして、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の位置を同定できる。いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｅ酵素のためのＰＡＭは、Ｎが任意のヌクレオチドであるＴＴＣＮを含むことができる。いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ酵素のためのＰＡＭは、ＴＲを含むことができ、Ｒはプリンである。いくつかの態様において、ＰＡＭに対して３’側の１６～２３塩基対の配列は、プロトスペーサー又は潜在的標的配列の切除される配列の５’末端における切断部位に対して５’側、及び切除される配列の３’末端における切断部位に対して３’側を表す。

【0064】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡの選択は、ＰＡＭの必要性と、標的部位内、標的部位に隣接する、又は標的部位に近接するマイクロホモロジーの存在との両方を考慮する。マイクロホモロジーは、所与のウイルス配列において２回以上生じる３ヌクレオチド以上の長さであり得るホモロジーの領域からなる。いくつかの態様において、２種以上のｇＲＮＡが使用される場合、設計は、個々のｇＲＮＡ標的に存在する同一のホモロジーの領域の存在を考慮する。更に、切除されるＤＮＡに対するホモロジーの領域の位置を考慮できる。すなわち、同定されたホモロジーの領域は、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅ ｇＲＮＡ標的部位内に、又はそれに隣接して位置することができる。標的部位内の代替的な末端結合マイクロホモロジーを促進するために、プロトスペーサーは、切断部位に対して５’であり、切り出される配列の５’末端であり、かつ切断部位に対して３’であり、切り出される配列の３’末端であり得る。標的部位に隣接している場合、マイクロホモロジーは、標的部位に対して５’、切除される配列の５’末端にあり、標的部位に対して３’、切除される配列の３’末端にあることができる。いくつかの態様において、互換性のある５’オーバーハングを介した末端結合を促進するために、マイクロホモロジーは、各標的部位において鋳型鎖及び非鋳型鎖切断の領域内に存在し、各切断部位において相補的な５’オーバーハングを生成するべきである。

【0065】

２．Ｃａｓ１２ｄ及びＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ
Ｃａｓ１２ｄはＣａｓＹと呼ばれ得る。Ｃａｓ１２ｅはＣａｓＸと呼ばれ得る。いくつかの態様において、ＣａｓＸファミリーとしては、ＣａｓＸ１及びＣａｓＸ２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＣａｓＹファミリーとしては、ＣａｓＹ１～ＣａｓＹ１５が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＣａｓエンドヌクレアーゼは、切断後に、５’オーバーハングとも呼ばれ得る、付着端を生成する。

【0066】

Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅポリペプチド（この用語は、「Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ」という用語と互換的に使用される）は、標的核酸及び／又は標的核酸に関連するポリペプチド（例えば、ヒストン尾のメチル化又はアセチル化）に結合及び／又は修飾（例えば、切断、切れ目、メチル化、脱メチル化など）することができる（例えば、いくつかの場合において、ＣａｓＸタンパク質は、活性を有する融合パートナーを含み、いくつかの場合において、ＣａｓＸタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を示す）。いくつかの場合において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅタンパク質は、天然に存在するタンパク質である（例えば、原核細胞に天然に存在する）。他の場合において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅタンパク質は、天然に存在するポリペプチドではない（例えば、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅタンパク質は、変異型Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅタンパク質、キメラタンパク質などである）。

【0067】

天然に存在するＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅタンパク質は、標的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の特定の配列（例えば、標的配列）において二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。配列特異性は、標的ＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする、関連するガイドＲＮＡによって提供される。天然に存在するガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。

【0068】

いくつかの態様において、変異型Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅタンパク質は、対応する野生型Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅタンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１個のアミノ酸について異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）アミノ酸配列を有する。

【0069】

いくつかの場合において、開示されるＣａｓＸタンパク質は、野生型ＣａｓＸタンパク質配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ＣａｓＸタンパク質配列の例を図１５に示す。

【0070】

いくつかの場合において、開示されるＣａｓＹタンパク質は、野生型ＣａｓＹタンパク質配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ＣａｓＹタンパク質配列の例を図１６に示す。

【0071】

いくつかの態様において、変異型Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼは、それぞれ、修飾Ｃａｓ１２ｄ又は修飾Ｃａｓ１２ｅである。いくつかの態様において、修飾Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅは、検出可能な標識を含む。いくつかの態様において、検出可能な標識は、化学発光標識、蛍光標識、又は酵素標識であり得る。本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」は、検出され得る、又は検出可能な応答をもたらし得る核酸、タンパク質、又は化合物である。本発明による検出可能な標識は、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅなどの核酸配列又はタンパク質に直接的又は間接的に連結することができ、放射性同位体、酵素、ハプテン、染料又は検出可能な色を付与する粒子などの発色団（例えば、ラテックスビーズ又は金属粒子）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光又は化学発光部分）、量子ドット、及び蛍光化合物を含む。

【0072】

適切な蛍光タンパクとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、Ｊ－Ｒｅｄ、ｄｉｍｅｒ２、ｔ－ｄｉｍｅｒ２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ、ウミシイタケＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質及びｋｉｎｄｌｉｎｇタンパク質、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉタンパク質及びフィコビリタンパク複合体（Ｂ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン及びアロフィコシアニンを含む）が含まれるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例としては、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ，ｍＢａｎａｎａ，ｍＯｒａｎｇｅ，ｄＴｏｍａｔｏ，ｔｄＴｏｍａｔｏ，ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ，ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ，ｍＣｈｅｒｒｙ，ｍＧｒａｐｅ１，ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ，ｍＧｒａｐｅ２，ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２：９０５－９０９）などが挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９－９７３に記載されるように、花虫類由来の様々な蛍光タンパク質及び着色タンパク質のいずれもが、使用に好適である。

【0073】

適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、β－グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0074】

いくつかの態様において、修飾Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅは、核局在化配列を含む。いくつかの態様において、核局在化配列の存在により、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅは修飾Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅとなる。いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅをコードする核酸配列は、核局在化配列を含む。いくつかの態様において、核局在化配列は、核酸配列又はアミノ酸配列であり得る。

【0075】

いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅの配列は変異し得る。いくつかの態様において、変異は、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅの機能ドメインにはない。いくつかの態様において、必要な機能を有するドメインは、標的鎖充填ドメイン（例えば、ＤｐｂＣａｓＸの８２５～９３４残基）及び非標的鎖結合ドメイン（例えば、１０１～１９１残基）からなるＤＮＡ結合ドメインを含む。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ，５６６，２１８－２２３（２０１９）は、参照により本明細書に組み込まれ、ＣａｓＸ酵素の機能的ドメインを記載する。ＣａｓＸ機能を特異的に破棄する変異には、ＲｕｖＣドメインを標的とする変異［例えば、Ｄ６７２Ａ／Ｅ７６９Ａ／Ｄ９３５Ａ］が含まれる。

【0076】

いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物は、第１のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードする同じ核酸構築物である。

【0077】

いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物は、ウイルスベクターの一部である。したがって、いくつかの態様において、投与は、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物、第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物、及び第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物のうちの１つ以上を含むウイルスベクターを投与することを含む。

【0078】

いくつかの態様において、細胞のＤＮＡ（例えば、細胞に内在するＤＮＡ）は、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅによって切断されない。したがって、例えば、いくつかの態様において、ウイルスゲノムのみが、開示された方法でＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅによって切断され、細胞のＤＮＡは無傷のままである。

【0079】

３．ウイルス
いくつかの態様において、細胞は細胞ゲノムを含み、ウイルスゲノムは細胞ゲノムに組み込まれる。したがって、いくつかの態様において、細胞は、細胞ゲノム及びウイルスゲノムの両方を含む、単一ゲノムを含むことができる。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、独立したゲノム要素として存在する。したがって、いくつかの態様において、細胞は、２つの別個のゲノム、細胞ゲノム及びウイルスゲノムを含むことができる。

【0080】

いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞であり得る。例えば、いくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。したがって、いくつかの態様において、ウイルスはヒト細胞に感染している。

【0081】

いくつかの態様において、ウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ゲノム又はｄｓＤＮＡからなるウイルス複製中間体を有する。例えば、ＲＮＡウイルス（ＲＮＡウイルスゲノムを有するウイルス）は、ＲＮＡをＤＮＡに変換することができ、ＤＮＡをｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓＤＮＡからなるウイルス複製中間体）にコピーすることができる。ＲＮＡウイルスには、亜科Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（例えばＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）、Ｄｅｌｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えばＨＴＬＶ－１及びＨＴＬＶ－２）を含むレトロウイルス科のもの、並びにＳｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ（例えばＨＦＶ）及びＧａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ（例えばＸＭＲＶ）のものが含まれるがこれに限定はされない。

【0082】

いくつかの態様において、本開示の方法は、ウイルスを不活性化し、ウイルスは、科Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅに由来する。いくつかの態様において、科Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を含み得る。いくつかの態様において、ウイルスは、科Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、及びＧａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅの病原性メンバーを含む、目Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒａｌｅｓに由来し得る。いくつかの態様において、ウイルスの例は、科Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒトアデノウイルスＡ～Ｇ種）、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒトパピローマウイルス）、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラポックスウイルス、オルソポックスウイルス、モルシポックスウイルス）、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒトポリオーマウイルス１～１４）、及びＡｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）のメンバーである。特に、いくつかの態様において、ウイルスは、ＨＩＶ－１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、又はＨＴＬＶ－１である。

【0083】

いくつかの態様において、ウイルスゲノムの少なくとも一部は、ウイルスゲノムの残りの部分から切除される。いくつかの態様において、ウイルス遺伝子の全ては、ウイルスゲノムから切除される。例えば、ｇＲＮＡがＬＴＲ領域内の標的配列で切断される場合、ウイルス遺伝子の全てを切除することができる。

【0084】

４．標的配列
いくつかの態様において、標的配列は、標的核酸（例えば、ウイルスゲノム）上の部位であって、切断のためにｇＲＮＡ及びＣａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅによって標的化される。

【0085】

いくつかの態様において、第１の標的配列又は第２の標的配列のうちの少なくとも１つは、表１からの配列である。
表１．ＨＢＶにおけるＣａｓ１２ｅ標的配列の例。ＨＢＶ ａｙｗ株（ＮＣ＿００３９７７）の位置と配列。配列は、ＰＡＭ配列の第１の塩基から始まり、ＰＡＭ（ＴＴＣＮ）、それに続く２０ｂｐのプロトスペーサー配列を含む。

【表1】

【0086】

いくつかの態様において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、表２に提供される標的配列のペアのうちの１つである。
表２：ウイルスゲノムの部分の切除のためのｇＲＮＡのペアの例。配列は、異なるウイルス内のプロトスペーサー配列を示す。

【表2】

【0087】

いくつかの態様において、第１の標的配列又は第２の標的配列のうちの少なくとも１つは、表２の配列である。

【0088】

表２は、ＨＢＶクレードＡコンセンサスにおけるＣａｓ１２ｅ標的配列の例を提供する。ＨＢＶクレードＡコンセンサス配列における位置及び配列を本明細書に提供する（図１８）。いくつかの態様において、配列は、ＰＡＭ配列の第１の塩基から開始することができ、ＰＡＭ（ＴＴＣＮ）に続く２０ｂｐのプロトスペーサー配列を含む。

【0089】

いくつかの態様において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、ウイルスゲノムの反対側の鎖上にある。

【0090】

いくつかの態様において、第１の標的配列及び第２の標的配列における切断は、第１の標的配列及び第２の標的配列で５’一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オーバーハングをもたらす。したがって、いくつかの態様において、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅによる切断は、平滑末端をもたらさない。

【0091】

いくつかの態様において、第１の標的配列及び第２の標的配列の５’ｓｓＤＮＡオーバーハングは、相補的な重複配列を有する。いくつかの態様において、本方法は、互いにハイブリダイズする、第１の標的配列及び第２の標的配列における５’ｓｓＤＮＡオーバーハングを更に含む。

【0092】

いくつかの態様において、第１の標的配列及び第２の標的配列における５’ｓｓＤＮＡオーバーハングに隣接する配列は、相同配列である。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、例えば、マイクロホモロジー媒介末端結合を含む、これらのホモロジーの領域を利用するＤＮＡ修復機構を介した、これらの短い相同性領域の結合を更に含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、マイクロホモロジー媒介末端接合を含む、これらのホモロジーの領域を利用する真核細胞に存在するＤＮＡ修復機構を介した、これらの短いホモロジーの領域の結合後に介在ＤＮＡ配列を除去することを更に含む。いくつかの態様において、マイクロ相同媒介末端結合（ＭＭＥＪ）は、結合前に壊れた末端に内部のマイクロホモロジー配列のアラインメントを伴うエラーが起こりやすい修復機構であり、元の壊れた部位をマークする欠失及び挿入、並びに染色体転座に関連する。

【0093】

Ｃ．組成物
ＣａｓＸ又はＣａｓＹ（例えば、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅ）を細胞に送達するために使用される構築物が、開示される。例えば、図１７は、ＣａｓＸ２を担持するベクターを示す。本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれかを細胞に送達するために使用される構築物が開示される。例えば、本明細書に記載のｇＲＮＡのいずれかは、単独で、又は第２のｇＲＮＡと組み合わせて、又はＣａｓＸ若しくはＣａｓＹエンドヌクレアーゼをコードする核酸と組み合わせて、構築物中に存在することができる。

【0094】

ＨＢＶゲノム内の配列を標的にするために使用されるｇＲＮＡが開示される。以下を含むがこれらに限定されない、ＨＢＶゲノムを標的とするｇＲＮＡが本明細書に開示される：Ｈｂｖ ３５３－ｔｃｔａｇｇｇｇａｃｃｔｇｃｃｔｃｇｔｃ（配列番号１４２）；Ｈｂｖ ４５７－ｃｃａｃｃｔｔａｔｇａｇｔｃｃａａｇｇａ（配列番号１４３）；Ｈｂｖ ６８８－ｇｇｔａｔｔａａａｃｃｔｔａｔｔａｔｃｃ（配列番号１４４）；Ｈｂｖ ８３５－ｃａａｇａｔｃｔａｃａｇｃａｔｇｇｇｇｃ（配列番号１４４）；Ｈｂｖ １４４６－ｃｃｃｔａｇａａａａｔｔｇａｇａｇａａｇ（配列番号１４５）；Ｈｂｖ１７０４－ｔｔｇａｇｃａｇｔａｇｔｃａｔｇｃａｇｇ（配列番号１４６）；Ｈｂｖ １７９１－ｇａａａｇｃｃｃａｇｇａｔｇａｔｇｇｇａ（配列番号１４７）；Ｈｂｖ ２１０１－ｔｔｇａｔｔｔｔｔｔｇｔａｔｇａｔｇｔｇ（配列番号１４８）；Ｈｂｖ ２６６５－ｃｇｇｇｇｔｃｇｃｔｔｇｇｇａｃｔｃｔｃ（配列番号１４９）；Ｈｂｖ ２７８９－ｃｔｔｃａｃｃｔｃｔｇｃａｃｇｔｃｇｃａ（配列番号１５０）；Ｈｂｖ ２７９４（Ｈｂｘ２１６）－ｃｃｔｃｔｇｃａｃｇｔｃｇｃａｔｇｇａｇ（配列番号１５１）；Ｈｂｖ ２９１１（Ｈｂｘ３３３）－ａａｇａｃｔｇｔｔｔｇｔｔｔａａａｇａｃ（配列番号１５２）；Ｈｂｖ ３１６４－ｇａｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔｔｃａｇｔａｃｇ（配列番号１５３）；Ｈｂｘ ９１（Ｈｂｖ ２６６５）－ｃｇｇｇｇｔｃｇｃｔｔｇｇｇａｃｔｃｔｃ（配列番号１５４）；Ｈｂｘ １１９（Ｈｂｖ ２６９７）－ｃｃｇｔｃｔｇｃｃｇｔｔｃｃｇａｃｃｇａ（配列番号１５５）；Ｈｂｘ １３７（Ｈｂｖ ２７１１）－ｇａｃｃｇａｃｃａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃ（配列番号１５６）；Ｈｂｘ １８６（Ｈｂｖ ２７６４）－ｃａｔｃｔｇｃｃｇｇａｃｃｇｔｇｔｇｃａ（配列番号１５７）；Ｈｂｖ ９９－ｃｔｇａｔｇａｃｇｇａｇａｇｇｇａａｔａ（配列番号１５８）；Ｈｂｖ １３１－ｇｃｔｃｃｔａａｃｃｃｃｔｇｇｇａｃｇｃ（配列番号１５９）；ｈｂｖ １８２－ａｔｃｃｔｇｇｇｇａａｇａｇｃａｃａａｔ（配列番号１６０）；ｈｂｖ １９５－ｇｃａｃａａｔｇｔｃｃｇｃｃｃｃａａａａ（配列番号１６１）；ｈｂｖ １４９９－ｃｃｇｔｃｔｇｃｃｇｔｔｃｃｇａｃｃｇａ（配列番号１６２）；ｈｂｖ １５１３－ｇａｃｃｇａｃｃａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃ（配列番号１６３）；ｈｂｖ １５６６－ｃａｔｃｔｇｃｃｇｇａｃｃｇｔｇｔｇｃａ（配列番号１６４）；ｈｂｖ １５９６－ｃｃｔｃｔｇｃａｃｇｔｃｇｃａｔｇｇａｇ（配列番号１６５）；ｈｂｖ １７１３－ａａｇａｃｔｇｔｔｔｇｔｔｔａａａｇａｃ（配列番号１６６）；ｈｂｖ １９０３－ａａｔａｔｔｃｃｃａｇｃｔａｃａｇｇｔａ（配列番号１６７）；ｈｂｖ １９６６－ｃｔｇａａｇａａａｇｇａａｇｔｃａｔｇｃ（配列番号１６８）；ｈｂｖ １９７３－ａａｇｇａａｇｔｃａｔｇｃｔｃｔａｇａａ（配列番号１６９）；ｈｂｖ １９７７－ａａｇｔｃａｔｇｃｔｃｔａｇａａｇａｔｃ（配列番号１７０）；ｈｂｖ １９８１－ｃａｔｇｃｔｃｔａｇａａｇａｔｃｔａｔｇ（配列番号１７１）；ｈｂｖ １９９５－ｔｃｔａｔｇｇｃｇｇａｇｔｃｇａｇａｃａ（配列番号１７２）。

【0095】

ＣａｓＸタンパク質は、標的配列で標的ＤＮＡに結合し、標的配列は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と標的ＤＮＡとの間の相補性領域によって画定される。多くのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合と同様に、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的結合（及び／又は切断）は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）の両方によって決定される位置で生じる。

【0096】

いくつかの実施形態において、ＣａｓＸタンパク質のＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列のすぐ５’側にある（相補鎖はガイドＲＮＡのガイド配列にハイブリダイズするが、非相補鎖はガイドＲＮＡと直接ハイブリダイズせず、非相補鎖の逆相補である）。いくつかの場合において、異なるＣａｓＸタンパク質（すなわち、様々な種由来のＣａｓＸタンパク質）は、異なるＣａｓＸタンパク質の様々な酵素特性を利用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列選択性について；酵素活性の増加又は減少について；細胞毒性レベルの増加又は減少について；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断などの間のバランスを変化させるため；短い全配列を利用するためなど）、様々な所与の方法において使用するのに有利であり得る。異なる種由来のＣａｓＸタンパク質は、標的ＤＮＡにおいて異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。適切なＰＡＭ配列を同定するための様々な方法（シリコ法及び／又はウェットラボ法を含む）が当該技術分野で既知であり、日常的であり、任意の便利な方法を使用することができる。

【0097】

１．医薬組成物
Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄ又はＣａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼをコードする核酸構築物、第１のｇＲＮＡ、第１のｇＲＮＡをコードする核酸構築物、第２のｇＲＮＡ、及び／又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸構築物を含む組成物が開示される。

【0098】

いくつかの態様において、開示される組成物は、医薬組成物であり得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちの１つ以上を含む組成物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が開示される。「薬学的に許容され得る」とは、当業者に周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるように選択される材料又は担体を意味する。担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝生理食塩水又は多小胞リポソームが挙げられる。例えば、本発明では、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチド又はＰＣ：ペプチドを担体として使用し得る。他の適切な薬学的に許容され得る担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１９９５に記載されている。通常、製剤を等張性にするために、製剤に適切な量の薬学的に許容され得る塩が使用される。薬学的に許容され得る担体の他の例としては、生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約５～約８であり、又は約７～約７．５であり得る。更なる担体としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放性調製物が挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム、ステント（血管形成術中に血管に移植される）、リポソーム又は微粒子の形態である。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度、並びに治療のために標的化される器官又は細胞型に依存して、特定の担体がより好ましくなり得ることは、当業者には明らかである。これらの最も典型的なものは、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体であり、滅菌水、生理食塩水、生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む。

【0099】

本発明のポリペプチド、ペプチド、又は複合体の意図される活性が損なわれない限り、医薬組成物は、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤なども含み得る。医薬組成物は、１つ以上の活性成分（本発明の組成物に加えて）、例えば、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔薬などを含んでもよい。

【0100】

本明細書に開示される医薬組成物は、経口投与又は非経口投与のために調製することができる。非経口投与のために調製される医薬組成物としては、静脈内（又は動脈内）、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜（例えば、鼻腔内、膣内、又は直腸）、又は経皮（例えば、局所）投与のために調製される医薬組成物が挙げられる。エアロゾル吸入は、融合タンパク質を送達するためにも使用することができる。したがって、非経口投与用の組成物を調製でき、この組成物は、許容される担体に溶解又は懸濁した融合タンパク質を含み、許容される担体は、水、緩衝水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）などの水性担体を含むがこれらに限定されない。含まれる賦形剤のうちの１つ以上は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張力調整剤、湿潤剤、界面活性剤などように、生理学的状態の近似を助けることができる。組成物が固体成分を含む場合（経口投与のために）、賦形剤のうちの１つ以上が結合剤又は充填剤として機能し得る（例えば、錠剤、カプセルなどの製剤化のため）。皮膚又は粘膜表面に適用するために組成物が製剤化される場合、賦形剤のうちの１つ以上は、クリーム、軟膏などを製剤するための溶媒又は乳化剤であり得る。

【0101】

非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含み、生理食塩水及び緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などを含む。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在し得る。

【0102】

光学投与用の製剤には、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、座薬、噴霧剤、液剤、及び粉剤が含まれてもよい。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要である又は望ましい場合がある。

【0103】

経口投与のための組成物は、粉剤又は顆粒剤、水又は非水媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル剤、サシェ剤、又は錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。本組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸などの有機酸との反応によって、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、並びにモノ、ジ、トリアルキル、及びアリールアミン、及び置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容され得る酸付加塩又は塩基付加塩として潜在的に投与され得る。

【0104】

薬学的組成物は、無菌であり得、従来の滅菌技術によって滅菌され得る、又は滅菌濾過され得る。水溶液は、そのまま使用するために包装され得る、又は凍結乾燥され得、本開示によって包含される凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わせ得る。医薬組成物のｐＨは、通常、３～１１（例えば、約５～９）又は６～８（例えば、約７～８）である。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封包装など、それぞれが固定量の上記薬剤を含有する複数の単回用量単位で包装できる。固体形態の組成物は、局所的に適用可能なクリーム又は軟膏のために設計された絞り出しチューブなどの、柔軟な量のための容器にも包装できる。

【0105】

上記の医薬組成物は、治療有効量の本明細書に開示される組成物を含むように製剤化することができる。いくつかの態様において、治療的投与は、予防的用途を包含する。遺伝子検査及び他の予後診断方法に基づいて、患者と相談している医師は、患者が１つ以上の自己免疫疾患に対する臨床的に決定された素因若しくは増加した感受性（いくつかの場合おいては、大幅に増加した感受性）を有する場合、又は患者ががんに対する臨床的に決定された素因若しくは増加した感受性（いくつかの場合おいては、大幅に増加した感受性）を有する場合、予防的投与を選択できる。

【0106】

本明細書に記載の医薬組成物は、臨床疾患の発症を遅延、低下、又は好ましくは予防するのに十分な量で、対象（例えば、ヒト対象又はヒト患者）に投与することができる。その結果、いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。治療用途において、組成物は、既に疾患を有する、又は疾患と診断された対象（例えば、ヒト対象）に、兆候若しくは症状を少なくとも部分的に改善する、又は状態、その合併症、及び結果の兆候の進行を抑制する（及び好ましくは停止する）のに十分な量で、投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」として定義される。医薬組成物の治療有効量は、治癒を達成する量であり得るが、その成果は、達成され得るいくつかの成果のうちの１つにすぎない。記載したように、治療有効量は、がんの発症若しくは進行が遅延、妨害若しくは予防される、又は自己免疫疾患若しくは自己免疫疾患の症状が改善される治療を提供する量を含む。症状のうちの１つ以上は、重症度が低くてもよい。治療を受けた人は、回復が早まり得る。

【0107】

本明細書に開示される医薬組成物中の複合体の総有効量は、単回用量として、急速静注若しくは比較的短期間にわたる注入によってのいずれかで、哺乳動物に投与され得るか、又は複数回用量がより長期間にわたって投与される分割治療プロトコル（例えば、４～６、８～１２、１４～１６、若しくは１８～２４時間ごと、又は２～４日ごと、１～２週間ごと、又は１ヶ月に１回の投与）を使用して投与され得る。その代わりに、治療上有効な血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入も、本開示の範囲内である。

【0108】

医薬組成物は、局所又は全身治療が望ましいかどうか、及び治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与し得る。

【0109】

Ｄ．キット
上記の材料及び他の材料は、開示された方法を実行するのに有用な、又はその実施を補助するキットとして、任意の適切な組み合わせで一緒に包装され得る。所与のキット内のキット構成要素が、開示された方法で一緒に使用されるように設計及び適合される場合には有用である。例えば、開示されたｇＲＮＡ、Ｃａｓ１２ｄ、又はＣａｓ１２ｅのうちの１つ以上を含むキットが開示されており、キットはベクター（例えば、核酸構築物）も含み得る。

【実施例】

【0110】

Ａ．実施例１
Ｃａｓ１２ｅ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼのファミリーとしても知られるＣａｓＸの切断メカニズムを利用して、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムの一部の標的破壊又は欠失を媒介するアプローチが開発されている。これらの方法は、宿主若しくはモデルシステムゲノムＤＮＡ内に組み込まれた、又は共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）などの独立したゲノム要素として細胞内に存在するＨＢＶゲノムの部分の欠失に適用される。トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣＲＩＰＳＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、又はｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡからなる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のいずれかからなるＲＮＡベースのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とともに使用される、修飾ＣａｓＸ酵素が、本明細書に開示される。ＣａｓＸ及び２種以上のｇＲＮＡによって誘導されるＤＮＡ切断部位に存在する配列を考慮することによって、介在するＨＢＶ ＤＮＡ配列の切除を促進するｇＲＮＡ又はｇＲＮＡの組み合わせの使用が更に記載される。この実施例は、ＨＢＶゲノムの必須部分の効率的で標的化された切除を達成する、いくつかのＣａｓＸ及びｇＲＮＡの組み合わせを記載する。Ｃａｓ１２ｄも使用することができ、ＨＢＶに加えて他のウイルスゲノムも標的にすることができることを認識すべきである。

【0111】

ＣａｓＸは、最近発見されたＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼのグループを含み、これはｄｓＤＮＡの互い違いの切断を媒介する。平滑末端ＤＮＡをもたらすｄｓＤＮＡ切断を産生するＣａｓ９とは対照的に、ＣａｓＸは、５ｂｐ以上のｓｓＤＮＡからなる５’ｓｓＤＮＡオーバーハングをもたらす互い違いの切断を産生する。

【0112】

Ｃａｓ９ベースの戦略は、ＨＢＶゲノムの切除を媒介するために探索されている。ＳａＣａｓ９又はＳｐＣａｓ９を使用するかどうかにかかわらず、これらのアプローチは、これらの酵素に対する既存のヒト免疫によって、及びプロトスペーサー配列又はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）内の部位の変異を介して、Ｃａｓ９ｇＲＮＡアプローチに対する耐性を進化させるウイルスの能力によっても、制限される。既存のアプローチのこれらの主要な制限に対処するＣａｓＸベースの戦略が開発された。ＣａｓＸは、比較的小さいサイズ及び既存の免疫の推定欠如を含む明確な利点を提供する。

【0113】

ＨＢＶを標的とする適切に対合したＣａｓＸ ｓｇＲＮＡの設計及び使用により、このアプローチは、ＨＢＶプロウイルスゲノムの大部分の効率的で標的化された切除を達成する（表１）。

【0114】

複数のＣａｓＸ標的部位（標的配列）が、ＨＢＶゲノム内で同定されている（表１に示される）。

【0115】

インビトロでＨＢＶ ｄｓＤＮＡ配列を切断するためにＣａｓＸとともに機能し得る複数のｓｇＲＮＡを作成して利用するためのツールが特定されている（図２）。これらのツールには、ヒト又はＥ．ｃｏｌｉに最適化されたコドン使用を伴う様々な形態のＣａｓＸ１又はＣａｓＸ２、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質の発現、タンパク質の折り畳み及び発現後のタンパク質の精製を強化するための様々なタグをコードするベクターを含む。ＣａｓＸ１及びＣａｓＸ２は、開示された方法において同じｇＲＮＡを使用することができる、異なったエンドヌクレアーゼである。

【0116】

宿主ゲノムＤＮＡの検出可能な切断を伴わない、ＨＢＶ ｄｓＤＮＡの高度に特異的な切断（図３）は、核局在化配列Ｓｖ４０と核質及びエピトープタグの組み合わせを含有する、修飾型のＣａｓＸ１又はＣａｓＸ２を使用して達成され、ヒト又は他の哺乳類細胞中で発現されるＣａｓＸタンパク質の発現及び細胞内局在化に続く。

【0117】

ヒト細胞において、ＨＢＶを標的とするｓｇＲＮＡとともにＣａｓＸコード化構築物を送達するためのツールが開発されている。これらを用いて、ヒトゲノムに組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡを破壊した（図５参照）。

【0118】

ＨＢＶゲノムの反対側の鎖上の配列を標的とするペアｓｇＲＮＡが開発されており（表２）、これは、ヒト細胞内のＨＢＶ ＤＮＡの介在セグメントの除去を伴う効率的な標的切断をもたらす（図５及び図６）。

【0119】

図７は、ｓｇＲＮＡによる切断を評価するためのＴ７アッセイの例を示す。個々のガイドを使用してＨＢＶの切断を決定し、Ｔ７アッセイ（＋／－Ｔ７エンドヌクレアーゼ）によって評価した。ガイドを含まないｐＤＧ４５９ＣａｓＸ２プラスミドを陰性対照として使用した。ＣａｓＸ２を有する個々のガイドをｐＢＬＯプラスミドにクローニングして、ＣａｓＸ１を有する個々のガイドをｐＤＧ４５９プラスミドにクローニングした。ガイド３５３は、ＨＢＶ標的の切断を実証する予想されるバンドを有し、ガイド１７０４及び１７９１は、予想されるサイズのかすかなバンドを有し、ガイド１１９、１８６及び２１６は、予想されるバンドを有する。ｐＤＧ４５９ＣａｓＸ１プラスミドを使用するガイドＲＮＡ切断は、ｐＢＬＯＣａｓＸ２プラスミドにクローニングされたガイドＲＮＡよりも、効果的であるようである。

【0120】

図８は、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイの前に行われたアッセイである、予想される切断部位周辺のプライマーを使用するＰＣＲを示す。

【0121】

図９は、ｐＤＧ４５９－Ｘ１（レーン３～８）及びｐＤＧ４５９－Ｘ２（レーン１０～１２）におけるＨＢＶを標的とするガイドを用いる共トランスフェクション実験を示す。共トランスフェクション後、細胞ＤＮＡを単離し、ＨＢＶプラスミドＤＮＡの切除を、ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動によって調べた（示す）。クローニングしたガイド配列を有しない、ｐＤＧ４５９－Ｘ１（レーン２）及びｐＤＧ４５９－Ｘ２（レーン９）プラスミドの共トランスフェクションを対照として使用した。ＨＢＶゲノムの介在するＤＮＡ配列の有効な切断及び切除が、ＣａｓＸ１とｇＲＮＡ対６８８／２７９４及び４５７／２７８９について示される。

【0122】

図１０は、断片をベクターにクローニングするための制限マップを示す。

【0123】

図１１は、ＰＣＲ生成物を鋳型として使用する、ＨＢＶ／Ｔｏｐｏ中の３，１８３ｂｐに対するプライマーＨｂｖフォワード／Ｈｂｖリバースを示す。図１１は、ベクターにクローニングされる断片を作成することができるプライマーを示す。

【0124】

図１２は、クローニング戦略を示す。両端は、各遺伝子が完全になることを確実にするために、繰り返しＤＮＡの小さな領域を有する（５’余分なＨＢｘ ＤＮＡ；３’余分なコアＤＮＡ）。Ｎｈｅ１及びＳａｌ１を使用してｐＭＣ．ＥＦ１ａ．ＭＣＳ．ＳＶ４０Ｐｏｌｙにクローニングすることも、Ｎｈｅ１／Ｓｃａ１を使用してＬｏｘ－Ｓｔｏｐ－Ｌｏｘ－ＴＯＰＯにクローニングすることもできる。

【0125】

当業者であれば、通常範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A-D】

【配列表】

2023553422000001.app

【国際調査報告】