特表 2023-553531 造血幹細胞を生成する方法及びその組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-21

(54)【発明の名称】造血幹細胞を生成する方法及びその組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0789 20100101AFI20231214BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231214BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20231214BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20231214BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20231214BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20231214BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231214BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231214BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20231214BHJP

   A61K 35/545 20150101ALN20231214BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0789

C12N5/10

C12N5/0786

A61K35/28

A61P35/02

A61P7/06

A61P7/00

A61P31/18

A61P37/06

A61P7/04

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

A61K35/545

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560237

(86)(22)【出願日】2021-12-10

(85)【翻訳文提出日】2023-07-12

(86)【国際出願番号】 US2021062884

(87)【国際公開番号】W WO2022125947

(87)【国際公開日】2022-06-16

(31)【優先権主張番号】63/123,778

(32)【優先日】2020-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523218371

【氏名又は名称】ガルーダ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シャー ドバニット

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065BA21

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA05

4C087ZA51

4C087ZA53

4C087ZA55

4C087ZB08

4C087ZB27

4C087ZB33

(57)【要約】

様々な態様及び実施形態において、本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を生成する方法、並びにそれを含む組成物、及び疾患を治療する方法を提供する。本開示は、Ｅ２６形質転換特異的変異体２（ＥＴＶ２）転写因子の発現（例えば過剰発現）により多能性幹細胞から内皮細胞を調製する方法を提供する。次いで、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝学的刺激を用いて内皮細胞からＨＳＣを生成する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

造血幹細胞（ＨＳＣ）を生成する方法であって、
Ｅ２６形質転換特異的変異体２（ＥＴＶ２）転写因子の発現により多能性幹細胞から内皮細胞を調製することと、
前記内皮細胞を造血性内皮細胞に転換させるとともに、該造血性内皮細胞を造血幹細胞に転換させることと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記多能性幹細胞が、体細胞のリプログラミングにより調製された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記体細胞が、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びＫｌｆ４の１つ以上から選択されるリプログラミング因子の発現によりリプログラミングされる、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｉＰＳＣが、レシピエントに対して自己由来又は同種異系である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ｉＰＳＣがＨＬＡ改変細胞又はＨＬＡ欠損細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ｉＰＳＣが遺伝子改変されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ｉＰＳＣが構成的又は誘導的な自殺遺伝子を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ｉＰＳＣがレポーター遺伝子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ＥＴＶ２が非統合エピソームから発現される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ＥＴＶ２発現が構成的又は誘導的である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

ＥＴＶ２が、前記ｉＰＳＣに導入されたｍＲＮＡから発現される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ＥＴＶ２ ｍＲＮＡを、前記ｉＰＳＣから調製された中胚葉前駆細胞（ＭＰＣ）に導入する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ｉＰＳＣを中胚葉前駆細胞（ＭＰＣ）に分化させ、該ＭＰＣを内皮細胞（ＥＣ）に分化させる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ＶＥＧＦ－Ａの添加によりＭＰＣをＥＣに分化させる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

Ｐｉｅｚｏ１アゴニストの添加によりＥＣを造血性内皮細胞（ＨＥＣ）に分化させる、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｐｉｅｚｏ１アゴニストがＹｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１及び／又はＪｅｄｉ２である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

サイクリックストレッチを適用することによりＥＣをＨＥＣに分化させる、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

ＣＤ３４^ｐｏｓであり、任意にＣＤ３１^ｐｏｓ、ＣＤ１４４^ｐｏｓ、ＫＤＲ^ｐｏｓ、ＣＤ２３５^ｎｅｇ及びＣＤ４３^ｎｅｇの１つ以上から選択される細胞表面表現型を有する細胞を選択又は富化することを更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

Ｐｉｅｚｏ１アゴニストの添加によりＨＥＣをＨＳＣに分化させる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記Ｐｉｅｚｏ１アゴニストがＹｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１及び／又はＪｅｄｉ２である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

サイクリックストレッチを適用することによりＨＥＣをＨＳＣに分化させる、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項22】

造血分化を誘導することが、内皮細胞又はＨＥ細胞をインスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、アンジオテンシン２、ロサルタン、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ３リガンド、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ、ＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）、ＢＭＰ－４、アクチビンＡ、トランスフェリン、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ、ＩＬ－６、ＩＬ０１１、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＳＢ－４３１５４２、フィブロネクチン及びビトロネクチンの１つ以上とともに培養することを含むか、又は更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現又は活性を増加させることを含むプロセスにより前記ＥＣをＨＥＣ又はＨＳＣに転換させる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６遺伝子がエピソームから発現される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６が、前記ｉＰＳＣ、ＥＣ又はそれらの前駆体に導入されたｍＲＮＡから発現される、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記ＨＳＣを、任意にリノール酸、ＰＧＥ_２、ＰＧＥ_２誘導体及び／又はＰＧＥ_２前駆体（複数の場合もある）を用いて増殖させる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ＨＳＣ増殖が、引用することにより本明細書の一部をなす米国特許第１０，４５７，６８３号に記載される化合物を用いて前記細胞を培養することを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ＨＳＣ増殖が、ポリビニルアルコール、ＵＭ１７１、ニコチンアミド及びバルプロ酸の１つ以上を用いて前記細胞を培養することを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ＨＳＣが長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

ＣＤ３４^＋細胞を選択又は富化し、任意にＣＤ４５、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ及びＧＰＩ－８０の１つ以上の陽性発現又は陰性発現に基づいて細胞を選別又は富化することを更に含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

培養物中に浮遊している細胞を回収することを含む、請求項２８又は２９に記載の方法。

【請求項32】

前記ＨＳＣが少なくとも０．０００１％のＬＴ－ＨＳＣを含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法に従って作製されたＨＳＣ集団を含む組成物。

【請求項34】

レシピエントにおける疾患又は病態を治療する方法であって、請求項３３に記載の組成物を前記レシピエントに投与することを含む、方法。

【請求項35】

前記疾患又は病態が血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、免疫疾患又はミトコンドリア疾患である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記疾患又は病態が急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、赤芽球癆、発作性夜間血色素尿症、ファンコニ貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ウィスコット－アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン－ダイアモンド症候群、ダイアモンド－ブラックファン貧血及び白血球接着不全症から選択される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ＨＳＣが同種異系由来又はユニバーサル適合ドナー細胞、ＨＬＡ改変細胞又はＨＬＡ欠損細胞に由来し、任意に遺伝子改変されている、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ＨＳＣが前記レシピエントの細胞に由来する、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

免疫療法のための細胞集団を調製する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に従って産生されたＨＳＣを免疫細胞系統に分化させることを含む、方法。

【請求項40】

前記免疫細胞系統がＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記免疫細胞系統が制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞又はαβＴ細胞である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

異種ＴＣＲを発現させることを更に含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることを更に含む、請求項４０又は４１に記載の方法。

【請求項44】

異常ヘモグロビン症を治療するための細胞集団を調製する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に従って産生されたＨＳＣを赤血球に分化させることを含む、方法。

【請求項45】

移植免疫寛容、自己免疫障害又は線維症を治療するための細胞集団を調製する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に従って産生されたＨＳＣをマクロファージに分化させることを含む、方法。

【請求項46】

出血性障害を直接又は間接的に治療するための細胞集団を調製する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に従って産生されたＨＳＣを血小板に分化させることを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／１２３，７７８号の利益及び優先権を主張し、この内容全体を引用することによって本明細書の一部をなすものとする。

【背景技術】

【0002】

造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＨＳＣＴ）には、例えば血液癌の治療のように、骨髄又は免疫系に欠陥のある患者において造血機能を再確立するために、自己由来又は同種異系幹細胞を注入することが含まれる。ＨＳＣは、腫瘍関連抗原に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子の導入を含む癌免疫療法を生み出すのにも有用である。具体的には、被験体において生着して長期的に血球を産生する細胞は、寛解を持続させるための標的抗癌エフェクター細胞の長期的な供給源をもたらし得る（非特許文献１）。

【0003】

しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏでのＨＳＣ増殖は、特に患者への投与後に効果的に生着し得るＨＳＣ生成物を得ることにとって、依然として大きな障害である（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Gschweng et al., Hematopoietic stem cells for cancer immunotherapy, Immunol Rev. 2014 257(1):237-49

【非特許文献2】Tajer P, et al., Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells for Therapeutic Purposes: Lessons from Development and the Niche, Cells 2019 Feb; 8(2): 169

【発明の概要】

【0005】

様々な態様及び実施の形態において、本発明は、これらの目的を達成する。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が多能性に影響を及ぼさないことを示す図である。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現させるアデノウイルスベクターによるｉＰＳＣの形質導入効率の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。ＥＴＶ２過剰発現は、ＴＲＡ－１－６０幹細胞性マーカーの発現によって示されるように、ｉＰＳＣ幹細胞性に影響を及ぼさない。

【図2】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が造血性内皮細胞の収率を増加させることを示す図である。造血性内皮細胞（ＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋と記載）の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥが造血性内皮細胞の形成を増進することが実証される。

【図3】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）がｉＰＳＣ分化時のＣＤ３４＋細胞形成を増進することを示す図である。ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増進することが実証される。

【発明を実施するための形態】

【0007】

様々な態様及び実施形態において、本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を生成する方法、並びにそれを含む組成物、及び疾患を治療する方法を提供する。本開示に従って産生されるＨＳＣは、様々な実施形態において、造血機能の確立及び／又は血球系統の長期産生のための生着、及び／又は免疫療法のための細胞のｅｘ ｖｉｖｏ産生に利点を有する。

【0008】

幾つかの実施形態において、本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を生成する方法を提供する。方法は、Ｅ２６形質転換特異的変異体２（ＥＴＶ２）転写因子の発現（例えば過剰発現）により多能性幹細胞から内皮細胞を調製することを含む。次いで、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝学的刺激を用いて内皮細胞からＨＳＣを生成する。ＥＴＶ２をコードするヌクレオチド配列は、Wang K, et al., Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of ETV2 with mRNA. Sci. Adv. Vol. 6 (2020)（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。

【0009】

本開示の実施形態によると、ｉＰＳＣにおけるＥＴＶ２過剰発現は、それらの多能性特性に影響を与えず、造血性内皮分化及び造血分化を受けるそれらの能力を促進する。

【0010】

幾つかの実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞のリプログラミングにより調製された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。例えば、体細胞は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びＫｌｆ４から選択される１つ又は組合せから選択されるリプログラミング因子の発現によりリプログラミングすることができる。幾つかの実施形態において、リプログラミング因子はＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びＫｌｆ４である。幾つかの実施形態において、リプログラミング因子はＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４である。ｉＰＳＣを調製する方法は、例えば米国特許第１０，６７６，１６５号、米国特許第９，５８０，６８９号及び米国特許第９，３７６，６６４号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。様々な実施形態において、リプログラミング因子は、レンチウイルス系又はセンダイウイルス系等の既知のウイルスベクター系を用いて発現される。代替的には、リプログラミング因子は、リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡ（複数の場合もある）を体細胞に導入することによって発現させてもよい。さらにまた、リプログラミング因子を発現する非統合エピソームプラスミド、すなわち導入遺伝子フリーかつウイルスフリーのｉＰＳＣを作製するための非統合エピソームプラスミドを導入することにより、ｉＰＳＣを作製してもよい。複製能力が限られ、したがって数細胞世代の間に失われる既知のエピソームプラスミドを用いることもできる。幾つかの実施形態において、線維芽細胞又はＰＢＭＣ等（これらに限定されない）の体細胞からｉＰＳＣを生成する。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、臍帯血（臍帯血に由来するＣＤ３＋細胞又はＣＤ８＋細胞を含む）、ＣＤ３４＋細胞若しくはＣＤ３４富化細胞、又は他のヒト一次組織に由来する。様々な実施形態において、ｉＰＳＣは、レシピエントに対して自己由来又は同種異系（例えばＨＬＡ適合）である。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ改変細胞又はＨＬＡ欠損（HLA-null）細胞である。これら又は他の実施形態において、ｉＰＳＣは遺伝子改変されており、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＣＣＲ５の発現のための遺伝子を含んでいてもよい。

【0011】

幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、１つ以上の構成的又は誘導的な自殺遺伝子を含む。これらの実施形態において、ＨＳＣでの処理後に、移植ＨＳＣを容易に枯渇させることができる。例示的な自殺遺伝子は、Liang Q, et al., Linking a cell-division gene and a suicide gene to define and improve cell therapy safety. Nature Vol. 563: 701-704 (2018)に記載されているようなＨＳＶ－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）である。ＨＳＶ－ＴＫは、ガンシクロビルを毒性生成物に変換するため、この活性剤を用いたＴＫ＋細胞の選択的な排除が可能である。代替的又は付加的な自殺遺伝子は、カスパーゼ－９である（Yagyu S. et al., An Inducible Caspase-9 Suicide Gene to Improve the Safety of Therapy Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Mol. Ther. 2015 23(9):1475-85）。Wiebking V., et al., Metabolic engineering generates a transgene-free safety switch for cell therapy. Nature Biotechnology Vol. 38: 1441-1450 (2020)も参照されたい。

【0012】

これら又は他の実施形態において、ｉＰＳＣは、患者への投与後を含む、本プロセスに従って調製されたＨＳＣの検出を可能にするレポーター遺伝子を含んでいてもよい。例示的なレポーター遺伝子としては、例えば治療用細胞の位置、全位置での量、経時的な生存及び増殖の全身モニタリングを可能にする陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングレポーター遺伝子が挙げられる。例示的なＰＥＴレポーター（reporting）遺伝子は、例えばYaghoubi S. et al., Positron Emission Tomography Reporter Genes and Reporter Probes: Gene and Cell Therapy Applications. Theranostics. 2012; 2(4): 374-391に記載されている。例示的なＰＥＴレポーター遺伝子はＰＭＫ２である。Haywood T., et al., Positron emission tomography reporter gene strategy for use in the central nervous system. PNAS 2019 116(23): 11402-11407を参照されたい。

【0013】

様々な実施形態において、ｉＰＳＣを中胚葉前駆細胞（ＭＰＣ）に分化させ、ＭＰＣを内皮細胞（ＥＣ）に分化させる。ＭＰＣへの分化は、一般にＷｎｔ及びＮｏｄａ１シグナル伝達経路の活性化による。Patsch C., et al., Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat. Cell. Biol. 17, 994-1003 (2015)を参照されたい。例えば、Ｗｎｔ及びＮｏｄａ１シグナル伝達経路は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を用いて活性化することができる。Wang K, et al., Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of ETV2 with mRNA. Sci. Adv. Vol. 6 (2020)を参照されたい。ＭＰＣ細胞におけるＥＴＶ２発現は、ＥＣへの分化に関与している。異種ＥＴＶ２は例えば、ＥＴＶ２の構成的又は誘導的発現及び導入遺伝子フリーのＥＣの産生のためのコード非統合エピソームプラスミドの導入によって発現させることができる。幾つかの実施形態において、ＥＴＶ２は、ＭＰＣに導入されたｍＲＮＡから発現される。ｍＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションを含む任意の利用可能な方法を用いて導入することができる。ＥＴＶ２を発現するＭＰＣの分化は、ＶＥＧＦ－Ａの添加を含み得る。Wang K, et al., Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of ETV2 with mRNA. Sci. Adv. Vol. 6 (2020)を参照されたい。幾つかの実施形態において、ＥＴＶ２の発現にウイルスベクターを用いることができる。

【0014】

幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣ（例えばＥＴＶ２を発現する）を用いて胚様体（ＥＢ）を生成し、これをＥＨＴの誘導に使用することができる。ＥＢの調製は、例えば米国特許出願公開第２０１９／０１７７６９５号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。幾つかの実施形態において、ヒトｉＰＳＣ集合体を、例えばAbecasis B. et al., Expansion of 3D human induced pluripotent stem cell aggregates in bioreactors: Bioprocess intensification and scaling-up approaches. J. of Biotechnol. 246 (2017) 81-93に記載されているようにバイオリアクター内で増殖させる。

【0015】

幾つかの実施形態において、分化（例えば内皮細胞への分化）を受けるように誘導されたヒト多能性幹細胞の集団を、例えば米国特許第９，８３４，７５４号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように富化する。例えば、このプロセスは、ヒト多能性幹細胞（又はそれに由来するＥＢ）の集団において分化を誘導することと、誘導された集団をＣＤ３４及び／又はＣＤ４３の発現に基づいて選別することとを含み得る。ＣＤ３４^＋及び／又はＣＤ４３^ｎｅｇの画分を選択する。

【0016】

このプロセスによって産生されたＥＣを、機械的、生化学的、遺伝学的及び／又は薬理学的刺激を用いて造血性内皮細胞（ＨＥＣ）又はＨＳＣに転換させることができる。幾つかの実施形態において、方法は、内皮細胞におけるＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３β（Ｄｎｍｔ３ｂ）及び／又はＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性又は発現を、ＨＳＣの形成を刺激するのに十分な条件下で（例えば機械的、薬理学的又は遺伝学的手段を用いて）増加させることを含む。国際公開第２０１９／２３６９４３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。幾つかの実施形態において、機械的、遺伝学的及び／又は薬理学的刺激を用いてＥＣを造血性内皮（ＨＥ）細胞に転換させ、これを続いて任意に機械的、遺伝学的及び／又は薬理学的刺激を用いてＨＳＣに転換させることができる。

【0017】

幾つかの実施形態において、薬理学的刺激は、内皮細胞とＤｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストとを接触させることを含む。幾つかの実施形態において、機械感受性受容体はＰｉｅｚｏ１である。例示的なＰｉｅｚｏ１アゴニストはＹｏｄａ１である。Ｙｏｄａ１（２－［５－［［（２，６－ジクロロフェニル）メチル］チオ］－１，３，４－チアジアゾール－２－イル］－ピラジン）は、機械感受性イオンチャネルＰｉｅｚｏ１に対して開発された小分子アゴニストである（Syeda R, Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1. eLife (2015)）。Ｙｏｄａ１は以下の構造を有する：

【化1】

【0018】

Ｙｏｄａ１の誘導体は、様々な実施形態に用いることができる。例えば、２，６－ジクロロフェニルコアを含む誘導体が幾つかの実施形態に用いられる。例示的なアゴニストは、Evans EL, et al., Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation, British J. of Pharmacology 175(1744-1759): 2018に開示されている。更に他のＰｉｅｚｏ１アゴニストとしては、Ｊｅｄｉ１及び／又はＪｅｄｉ２、又はそれらの誘導体が挙げられる。Wang Y., et al., A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive Piezo1 channel. Nature Communications (2018) 9:1300を参照されたい。Ｊｅｄｉ１及びＪｅｄｉ２は、３－カルボン酸メチルフラン構造モチーフを有する。このモチーフを共有する他のＰｉｅｚｏ１アゴニストが本発明の実施形態に従って用いられ得る。これらのＰｉｅｚｏ１アゴニストは市販されている。様々な実施形態において、Ｐｉｅｚｏ１アゴニスト又は誘導体の有効量は、約０．１μＭ～約５００μＭ、若しくは約０．１μＭ～約２００μＭ、若しくは約０．１μＭ～約１００μＭの範囲、又は幾つかの実施形態において、約１μＭ～約１５０μＭ、若しくは約５μＭ～約１００μＭ、若しくは約１０μＭ～約５０μＭ、若しくは約２０μＭ～約５０μＭの範囲である。

【0019】

代替的又は付加的に、ＨＥ細胞又はＨＳＣへの転換は、遺伝学的刺激による。例えば、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現は、Ｄｎｍｔ３ｂをコードする転写産物を細胞に送達するか、又はＤｎｍｔ３ｂをコードする導入遺伝子を導入するか、又は非統合エピソームを細胞に導入することに限定されない導入遺伝子フリーの方法によって増加させることができる。幾つかの実施形態において、遺伝子編集を用いて内皮細胞のＤｎｍｔ３ｂ発現エレメントに遺伝子改変を導入し、例えばプロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるか、又はＲＮＡスプライシングに影響を与える。

【0020】

幾つかの実施形態において、方法は、内皮細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性又は発現を、単独で又はＤｎｍｔ３ｂと組み合わせて増加させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させるために、Ｇｉｍａｐ６をコードするｍＲＮＡ転写産物を細胞に導入することができ、エピソーム又は代替的にはＧｉｍａｐ６をコードする導入遺伝子を細胞に導入することを含むが、これに限定されない、導入遺伝子フリーのアプローチを用いることもできる。幾つかの実施形態において、遺伝子編集を用いて内皮細胞のＧｉｍａｐ６発現エレメントに遺伝子改変（例えばプロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるか、又はＲＮＡスプライシングに影響を与えるための１つ以上の改変）を導入する。

【0021】

細胞へのｍＲＮＡ送達を用いる本開示の実施形態において、既知の化学修飾を用いて、細胞における先天性免疫応答を回避することができる。例えば、カノニカルヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、細胞において強力な免疫応答を誘発することができる。この応答は、翻訳ブロック、炎症性サイトカインの分泌、及び細胞死を引き起こし得る。或る特定の非カノニカルヌクレオチドを含むＲＮＡは、自然免疫系による検出を回避することができ、高効率でタンパク質に翻訳され得る。特に先天性免疫応答を回避するためのヌクレオチド修飾に関して、米国特許第９，１８１，３１９号（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。

【0022】

幾つかの実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、所望のレベルの過剰発現を（様々なプロモーター強度又は発現制御エレメントの他の選択により）指向することができる導入遺伝子を細胞に導入することによって増加させる。導入遺伝子は、当該技術分野で既知の様々なウイルスベクター又はトランスフェクション試薬を用いて導入することができる。幾つかの実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、導入遺伝子フリーの方法（例えば、記載のようなエピソーム送達）によって増加させる。

【0023】

幾つかの実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６又は本明細書に開示される他の遺伝子の発現又は活性は例えば、プロモーター強度、リボソーム結合又はＲＮＡ安定性を増加させるための１つ以上の改変を導入する遺伝子編集技術を用いて増加させる。様々な編集技術が既知であり、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガー（ＺＦ）及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）が挙げられる。これらのＤＮＡ結合ドメイン１つ以上とＦｏｋ１エンドヌクレアーゼの切断ドメインとを含む融合タンパク質を用いて、細胞内のＤＮＡの所望の領域に二本鎖切断を生じさせることができる（例えば、米国特許出願公開第２０１２／００６４６２０号、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５号、米国特許第８，４７０，９７３号、米国特許出願公開第２０１３／０２１７１１９号、米国特許第８，４２０，７８２号、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号及び米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号（これら全ての内容が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。幾つかの実施形態において、遺伝子編集は、当該技術分野で既知のＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓシステムを用いて行われる。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号、米国特許第８，９０６，６１６号及び米国特許第８，９９９，６４１号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。

【0024】

幾つかの実施形態において、２Ｄ又は３Ｄ培養物における円周方向の伸展を含むプロセス等の機械的刺激を用いて、ＥＣ又はＨＥＣをＨＳＣに転換させる。例えば、発生的に塑性の内皮細胞又はＨＥ細胞を含む細胞集団をバイオリアクターに導入する。幾つかの実施形態において、バイオリアクターは、国際公開第２０１７／０９６２１５号に記載されるように繰り返し歪み生体力学的伸展をもたらす（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）。繰り返し歪み生体力学的伸展は、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させる。これらの実施形態において、機械的手段が細胞に伸展力を加える。例えば、フレキシブルボトム培養プレートのナイロン膜又は同様の生体適合膜又は生体模倣膜に取り付けたコンピュータ制御真空ポンプシステム（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標） Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｙｔｏｓｔｒｅｔｃｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ等）を用いて、規定の制御された繰り返し歪み条件下で細胞にｅｘ ｖｉｖｏで円周方向の伸展を加えることができる。

【0025】

幾つかの実施形態において、ＨＥ細胞の内皮細胞を、所望の細胞表面マーカー表現型を有する細胞について選別又は富化する。幾つかの実施形態において、内皮細胞又はＨＥ細胞をＣＤ３４＋細胞について選択又は富化する。任意に、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３１^ｐｏｓ、ＣＤ１４４^ｐｏｓ、ＫＤＲ^ｐｏｓ、ＣＤ４３^ｎｅｇ及びＣＤ２３５^ｎｅｇの１つ以上に基づいて細胞を選別又は富化する。

【0026】

幾つかの実施形態において、方法は、少なくとも部分的に、内皮細胞又はＨＥ細胞をインスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、アンジオテンシン２、ロサルタン、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ３リガンド、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ、ＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）、ＢＭＰ－４、アクチビンＡ、トランスフェリン、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ、ＩＬ－６、ＩＬ０１１、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＬ－３、ＳＢ－４３１５４２、フィブロネクチン及びビトロネクチンから選択される１つ以上の因子とともに培養することにより、造血分化を誘導することを含む。

【0027】

様々な実施形態において、生成したＨＳＣを増殖させる。例えば、米国特許第８，１６８，４２８号、米国特許第９，０２８，８１１号、米国特許第１０，２７２，１１０号及び米国特許第１０，２７８，９９０号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に開示される方法に従ってＨＳＣを増殖させることができる。例えば、幾つかの実施形態において、ＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ増殖に、培養物へのプロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）又はＰＧＥ_２誘導体若しくは前駆体の添加を用いる。これら又は他の実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖に培養物へのリノール酸の添加を用いる。これら又は他の実施形態において、ＨＳＣ増殖に培養物へのポリビニルアルコールの添加を用いる。幾つかの実施形態において、ＨＳＣ増殖は、少なくとも部分的に、米国特許第１０，４５７，６８３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているものを含む置換イミダゾピリジン及びイミダゾピラジン等のアリール炭化水素受容体アンタゴニストとともに細胞を培養することを含む。ＨＳＣを増殖させるのに有用な他の化合物及び試薬は、Papa L., et al., Distinct Mechanisms Underlying the Ex Vivo Expansion of Human Cord Blood Stem Cells with Different Strategies Currently Used for Allogeneic Transplantation, Blood (2019) 134 (Supplement 1): 4470に記載されている。かかる化合物及び試薬には、ニコチンアミド及びバルプロ酸が含まれ得る。

【0028】

様々な実施形態において、本開示に従って産生される造血幹細胞は、優れた生着を示し、レシピエントにおいて機能的な多系統の成体血液に再構成される長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む。幾つかの実施形態において、ＨＳＣは、Ｌｉｎ－／Ｓｃａｌ＋／ｃ－ｋｉｔ＋細胞を含む。ＬＴ－ＨＳＣは、自己複製して幹細胞プールを維持するか、又は短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）若しくは系統限定前駆細胞に分化し、広範な増殖及び分化を経て、最終分化した機能的な造血細胞を産生する。ＳＴ－ＨＳＣ又は多能性前駆細胞（ＭＰＰ）は、造血を短期的にしか維持することができないが、ＬＴ－ＨＳＣは、生物の生涯にわたって存続し、絶えず造血系を補充することができる。本開示の幾つかの実施形態において、ＨＳＣは、少なくとも約０．０００１％のＨＳＣ、又は少なくとも約０．００１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．０１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約１％のＬＴ－ＨＳＣを含む。幾つかの実施形態において、細胞の亜集団（例えばＬＴ－ＨＳＣ）は、例えば細胞選別アプローチを用いて単離又は富化することができる。例えば、幾つかの実施形態において、細胞をＣＤ３４＋細胞について選択又は富化する。幾つかの実施形態において、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ及びＧＰＩ－８０の１つ以上の発現に基づいて細胞を富化又は選別する。幾つかの実施形態において、以下の表現型マーカー：ＣＤ１１０＋、ＣＤ１３５＋及びＡＰＬＮＲ＋の１つ以上を有する細胞について細胞を富化又は選別する。

【0029】

様々な実施形態において、ＨＳＣへの転換時に、培養物中に浮遊している（例えば非接着）細胞を回収する。

【0030】

幾つかの態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って作製されたＨＳＣ集団を含む組成物を提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載の方法によって調製されたＨＳＣの集団と、薬学的に許容可能なビヒクルとを含む細胞療法用の組成物を調製する。医薬組成物は、少なくとも約１０^２個のＨＳＣ、又は少なくとも約１０^３個のＨＳＣ、又は少なくとも約１０^４個のＨＳＣ、又は少なくとも約１０^５個のＨＳＣ、又は少なくとも約１０^６個のＨＳＣ、又は少なくとも約１０^７個のＨＳＣ、又は少なくとも１０^８個のＨＳＣを含み得る。例えば、幾つかの実施形態において、レシピエントの体重１ｋｇ当たり約１０００００個～約４０００００個の（ＣＤ３４＋）ＨＳＣ（例えば１ｋｇ当たり約２０００００個の細胞）を含む医薬組成物を投与する。

【0031】

療法又は移植用のＨＳＣは、幾つかの実施形態において、比較的短時間、例えば２ヶ月未満、又は１ヶ月未満、又は約２週間未満で生成することができる。

【0032】

細胞組成物は、静脈内注入又は他の投与経路に適した薬学的に許容可能な担体又はビヒクルを更に含んでいてもよく、好適な抗凍結剤を含んでいてもよい。例示的な担体は、ＤＭＳＯ（例えば約１０％のＤＭＳＯ）である。細胞組成物は、ユニットバイアル又はバッグで提供し、使用まで凍結して保管することができる。或る特定の実施形態において、組成物の容量は、約１液量オンス～１パイントである。

【0033】

本明細書に記載の方法を用いて生成したＨＳＣは、例えば静脈内注入又は骨髄内移植によって被験体（レシピエント）に投与する。方法は骨髄破壊的、骨髄非破壊的又は免疫毒素ベース（例えば抗ｃ－ｋｉｔ、抗ＣＤ４５等）の移植前処置（conditioning regimes）に続いて行うことができる。

【0034】

本明細書に記載の方法を用いて、例えば血液疾患（悪性及び非悪性）、骨髄疾患、代謝性疾患及び免疫疾患を治療するための移植プロトコルに用いられるＨＳＣの集団を生成することができる。幾つかの実施形態において、ＨＳＣ集団は、自己由来細胞、又はユニバーサル適合（universally-compatible）ドナー細胞、又はＨＬＡ改変細胞若しくはＨＬＡ欠損細胞に由来する。幾つかの実施形態において、ＨＳＣ集団は、１つ以上の導入遺伝子（例えばＣＣＲ５、ＴＣＲ又はＣＡＲ）を含む遺伝子編集細胞に由来する。すなわち、ＨＳＣ集団は、レシピエント被験体の細胞から調製されるか、又はドナー細胞（例えばユニバーサルドナー細胞、ＨＬＡ適合細胞、ＨＬＡ改変細胞又はＨＬＡ欠損細胞）から調製され、任意に遺伝子編集されるｉＰＳＣから生成する。

【0035】

幾つかの実施形態において、レシピエント被験体は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、赤芽球癆、発作性夜間血色素尿症、ファンコニ貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ウィスコット－アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン－ダイアモンド症候群、ダイアモンド－ブラックファン貧血及び白血球接着不全症から選択される病態を患っている。

【0036】

更に他の実施形態において、本開示に従って産生されたＨＳＣを用いて、Ｔ細胞（例えば異種ＴＣＲ発現Ｔ細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞、αβＴ細胞等）、ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む）又はＢ細胞（ＣＡＲ－Ｂ細胞を含む）等の免疫療法用の免疫細胞を産生する。

【0037】

他の実施形態において、本開示に従って産生されたＨＳＣを用いて、例えば移植免疫寛容、自己免疫障害又は線維症を治療するためのマクロファージを産生する。

【0038】

幾つかの実施形態において、本開示に従って産生されたＨＳＣを用いて、例えば異常ヘモグロビン症の治療に使用することができる赤血球を産生する。更に他の実施形態において、本開示に従って産生されたＨＳＣを用いて、直接又は間接的な出血性障害の治療のための血小板を産生する。幾つかの実施形態において、ＨＳＣを用いて、血液疾患、骨髄疾患、免疫疾患、代謝性疾患又はミトコンドリア障害と関連する併存疾患の治療のための血液製剤を調製する。

【0039】

所望の細胞系統に分化させる方法は、当該技術分野で既知である。

【0040】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、関連の数値の±１０％を意味する。

【実施例】

【0041】

実施例１－ＥＴＶ２過剰発現は、造血性内皮細胞の収率を増加させ、ｉＰＳＣ分化時のＣＤ３４＋細胞形成を増進するが、多能性には影響しない
ＥＦ１Ａプロモーターの制御下のＥＴＶ２及びＧＦＰ配列の両方を含むアデノウイルスベクターを用いて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を形質導入した。形質導入後に、ｉＰＳＣ培養物の約４５％がＧＦＰ陽性であることが観察され、ＥＴＶ２過剰発現（ＥＴＶ２－ＯＥ）が確認された。幹細胞性マーカー発現ＴＲＡ－１－６０によって示されるように、ｉＰＳＣにおけるＥＴＶ２－ＯＥがｉＰＳＣの多能性特性を保持することが更に観察された（図１）。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現させるアデノウイルスベクターによるｉＰＳＣの形質導入効率の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。

【0042】

次に、ＥＴＶ２－ＯＥ－ｉＰＳＣを（ＥＴＶ２を含まないＧＦＰ配列を有するベクターで形質導入した対照ｉＰＳＣとともに）胚様体に分化させ、続いて造血性内皮細胞に分化させた（Strugeon et al., 2014）。結果から、ＣＤ２３５ａ^－集団におけるＣＤ３４^＋及びＣＤ３１^＋マーカーの発現によって実証されるように、ＥＴＶ２の過剰発現が造血性内皮細胞の形成を増進させることが示唆される（図２）。具体的には、図２は、造血性内皮細胞（ここではＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋と定義される）の代表的なフローサイトメトリー分析を示し、相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥが造血性内皮細胞の形成を増進することが実証される。

【0043】

さらに、結果から、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４^＋細胞の形成を増進することが示唆される（図３）。図３は、ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示し、相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増進することが実証される。

【0044】

総合すると、これらのデータから、ｉＰＳＣにおけるＥＴＶ２過剰発現が、それらの多能性特性に影響を与えず、造血性内皮分化及び造血分化を受けるそれらの能力を促進することが示される。

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】