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特表2023-553610重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスを標的とする干渉ＲＮＡＳ、及びＣＯＶＩＤ－１９を治療するためのそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-25
(54)【発明の名称】重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスを標的とする干渉ＲＮＡＳ、及びＣＯＶＩＤ－１９を治療するためのそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231218BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231218BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231218BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231218BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20231218BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231218BHJP
A61K 31/661 20060101ALI20231218BHJP
A61K 31/573 20060101ALI20231218BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231218BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20231218BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 100
A61P31/14 ZNA
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K31/713
A61K45/00
A61K31/661
A61K31/573
A61K39/395 S
A61K39/215
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023534695
(86)(22)【出願日】2021-12-03
(85)【翻訳文提出日】2023-07-31
(86)【国際出願番号】 CN2021135476
(87)【国際公開番号】W WO2022117085
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/133565
(32)【優先日】2020-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/121762
(32)【優先日】2021-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＱＲコード
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523209276
【氏名又は名称】マイクロバイオ （シャンハイ） カンパニー リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】512302005
【氏名又は名称】ワンネス・バイオテック・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＮＥＮＥＳＳ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】チャン，イー－チュン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，チー－ファン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，イー－フェン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，チャ－チュン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，ユエン－リン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA13
4C084MA16
4C084MA56
4C084MA59
4C084NA14
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC75
4C085AA03
4C085AA14
4C085BA71
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086DA10
4C086DA38
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA13
4C086MA16
4C086MA56
4C086MA59
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB21
4C086ZB33
4C086ZC75
(57)【要約】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、そのＰＯＬ、スパイク、ヘリカーゼ、又はエンベロープ遺伝子）を標的とする干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を阻害しかつ／又はその感染に関連する疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を治療するためのそれらの治療的使用が提供される。
【選択図】
【選択図】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）を阻害するための方法であって、有効量の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスに感染した細胞と接触させることを含み、
前記ｓｉＲＮＡが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのゲノム部位を標的とし、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスが、任意選択で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、方法。
【請求項2】
前記ゲノム部位が、ＰＯＬ遺伝子、スパイク遺伝子、ヘリカーゼ遺伝子、及びエンベロープ遺伝子からなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ遺伝子内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ゲノム部位が、（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＡ－３’（配列番号２）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡ－３’（配列番号４）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＵ－３’（配列番号６）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＡ－３’（配列番号８）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＵ－３’（配列番号１０）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵ－３’（配列番号１２）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＡ－３’（配列番号１４）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧ－３’（配列番号１６）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＡ－３’（配列番号１８）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＧ－３’（配列番号２０）、及び
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＡ－３’（配列番号２２）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ｓｉＲＮＡが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）遺伝子内の部位を標的とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記ｓｉＲＮＡが、ＲｄＲＰメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）内の部位を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ｓｉＲＮＡが、前記ｍＲＮＡ内の部位を標的とし、標的部位が、５’－ＵＵＧＣＵＵＵＵＣＡＡＡＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵＵＡＡＣＡＡＡＧＡ－３’（配列番号２３）のヌクレオチド配列内にある、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
標的部位が、５’－ＵＵＵＣＡＡＡＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵＵ－３’（配列番号２４）のヌクレオチド配列内にある、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖分子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ、以下のヌクレオチド配列、（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号２６）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号２８）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３０）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３２）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＮ１Ｎ２－３’（配列番号３４）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３６）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３８）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）及び
５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号４０）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）及び
５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４２）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）及び
５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４４）、又は
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４６）を含み、
（ｉ）～（ｘｉ）のそれぞれの前記センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおけるＸ１及びＸ２が、独立して、それぞれ、Ａ及びＵ若しくはその逆であるか、又はそれぞれ、Ｇ及びＣ若しくはその逆であり、
（ｉ）～（ｘｉ）のそれぞれの前記センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおけるＮ１及びＮ２のそれぞれが、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、又はＣであり、任意選択で、Ｎ２が、Ｕである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ、以下のヌクレオチド配列、（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＵＵ－３’（配列番号４７）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＵＵ－３’（配列番号４８）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＵＵ－３’（配列番号４９）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＵＵ－３’（配列番号５０）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＵＵ－３’（配列番号５１）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＵＵ－３’（配列番号５２）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＵＵ－３’（配列番号５３）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）及び
５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＵＵ－３’（配列番号５４）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）及び
５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＵＵ－３’（配列番号５５）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）及び
５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＵＵ－３’（配列番号５６）、又は
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＵＵ－３’（配列番号５７）を含み、
（ｉ）～（ｘｉ）のそれぞれの前記センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおけるＸ１及びＸ２が、独立して、それぞれ、Ａ及びＵ又はその逆である、請求項６に記載の方法。
【請求項11】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、又は（ｘｉ）に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ｓｉＲＮＡが、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、及びＣ１１からなる群から選択され、任意選択で、前記ｓｉＲＮＡが、Ｃ６である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ｓｉＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記１つ以上の修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ｓｉＲＮＡが、１つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ｓｉＲＮＡが、Ｃ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、又はＣ１０Ｇ３１Ａであり、任意選択で、前記ｓｉＲＮＡが、Ｃ６Ｇ２５Ｓである、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記接触させるステップが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスに感染した対象に、前記ｓｉＲＮＡを投与することによって実行される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ｓｉＲＮＡが、医薬組成物中で製剤化され、前記医薬組成物が、薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記対象が、ＣＯＶＩＤ－１９を有するヒト患者である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
前記対象に、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶによって引き起こされる感染の治療のための薬剤が更に投与され、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶが、任意選択で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、好ましくは、前記感染が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記薬剤が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、レムデシビル、ステロイド、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶワクチン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染のリスクがあるヒト患者である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項23】
前記ｓｉＲＮＡが、前記対象に、鼻腔内滴下、エアロゾル吸入、又はこれらの組み合わせによって投与される、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であって、前記ｓｉＲＮＡが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのゲノム部位に相補的な配列を含み、前記ｓｉＲＮＡが、請求項１～１６のいずれか一項に記載される、ｓｉＲＮＡ。
【請求項25】
請求項２２に記載の低分子干渉ＲＮＡと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３３５６５号、及び２０２１年９月２９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１２１７６２号の出願日の優先権を主張し、これらのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３３５６５号、及び２０２１年９月２９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１２１７６２号の出願日の優先権を主張し、これらのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス科及びコロナウイルス亜科のメンバーであるコロナウイルスは、２６～３２キロベースの範囲の長さを有する一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを含有するエンベロープウイルスである。コロナウイルスは、トリ、コウモリ、ブタ、げっ歯類、ラクダ、及びヒトを含むいくつかの脊椎動物宿主において同定されている。ヒトは、哺乳類の他の宿主からコロナウイルスに感染し得、これは、有害な上気道疾病を引き起こし得る。
コロナウイルス科のメンバーは、異なる系統発生起源を有し、かつ死亡率及び罹患率において異なる重症度を引き起こすウイルス株を含む。したがって、コロナウイルス感染のための治療は、感染を引き起こす特定の株、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（例えば、デルタ変異体）に依存して変動する。これまで、コロナウイルス感染のための承認された抗ウイルス薬物治療はない。したがって、コロナウイルス感染の治療、特に、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）によって引き起こされる感染の治療、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の治療を開発する必要性がある。
コロナウイルス科のメンバーは、異なる系統発生起源を有し、かつ死亡率及び罹患率において異なる重症度を引き起こすウイルス株を含む。したがって、コロナウイルス感染のための治療は、感染を引き起こす特定の株、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（例えば、デルタ変異体）に依存して変動する。これまで、コロナウイルス感染のための承認された抗ウイルス薬物治療はない。したがって、コロナウイルス感染の治療、特に、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）によって引き起こされる感染の治療、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の治療を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【0003】
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡ分子の開発に少なくとも部分的に基づく。本明細書に開示される干渉ＲＮＡ分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製及び産生の阻害において高い効率を示した。したがって、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを阻害するためのかつＣＯＶＩＤ－１９を治療するためのそれらの使用が、本明細書で提供される。
【0004】
いくつかの態様では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を阻害するための方法であって、有効量の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスに感染した細胞と接触させることを含み、ｓｉＲＮＡが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのゲノム部位を標的とする、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＰＯＬ遺伝子、スパイク遺伝子、ヘリカーゼ遺伝子、又はエンベロープ遺伝子を標的とし得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノム部位（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム部位）を標的とし得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノム部位は、以下のヌクレオチド配列、
（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＡ－３’（配列番号２）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡ－３’（配列番号４）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＵ－３’（配列番号６）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＡ－３’（配列番号８）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＵ－３’（配列番号１０）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵ－３’（配列番号１２）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＡ－３’（配列番号１４）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧ－３’（配列番号１６）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＡ－３’（配列番号１８）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＧ－３’（配列番号２０）、及び
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＡ－３’（配列番号２２）のうちの１つ（例えば、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、又は（ｘｉ））を含む。
（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＡ－３’（配列番号２）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡ－３’（配列番号４）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＵ－３’（配列番号６）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＡ－３’（配列番号８）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＵ－３’（配列番号１０）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵ－３’（配列番号１２）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＡ－３’（配列番号１４）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧ－３’（配列番号１６）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＡ－３’（配列番号１８）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＧ－３’（配列番号２０）、及び
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＡ－３’（配列番号２２）のうちの１つ（例えば、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、又は（ｘｉ））を含む。
【0005】
本明細書で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のゲノム部位を標的とするｓｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡが、ゲノム部位に（完全に又は部分的に）相補的である断片を含み、これにより、ｓｉＲＮＡが、ウイルスのゲノムＲＮＡ、又はゲノム部位によって転写された領域を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と相互作用して、ｓｉＲＮＡの阻害活性を発揮する、例えば、ウイルスゲノム複製及び／又はコードされたタンパク質産物の下方制御発現を阻害することができることを意味する。いくつかの事例では、ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスによって合成されたｍＲＮＡの部位を標的とする。
【0006】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）内の部位を標的とし得る（例えば、ＲｄＲＰメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を有する部位を標的とし得る）。このようなｓｉＲＮＡは、５’－ＵＵＧＣＵＵＵＵＣＡＡＡＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵＵＡＡＣＡＡＡＧＡ－３’（配列番号２３）のヌクレオチド配列内のＲｄＲＰ ｍＲＮＡ内の部位を標的とし得る。いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＵＵＵＣＡＡＡＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵＵ－３’（配列番号２４）のヌクレオチド配列内の部位を標的とし得る。
【0007】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖分子である。例示的な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）についての例示的なセンス鎖及びアンチセンス鎖が、以下で提供される。
（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号２６）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号２８）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３０）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３２）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＮ１Ｎ２－３’（配列番号３４）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３６）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３８）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）及び
５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号４０）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）及び
５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４２）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）及び
５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４４）、又は
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４６）。
（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号２６）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号２８）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３０）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３２）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＮ１Ｎ２－３’（配列番号３４）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３６）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３８）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）及び
５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号４０）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）及び
５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４２）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）及び
５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４４）、又は
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４６）。
【0008】
（ｉ）～（ｘｉ）のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおけるＸ１及びＸ２は、独立して、それぞれ、Ａ及びＵ又はその逆である。代替として、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ、Ｇ及びＣ又はその逆である。（ｉ）～（ｘｉ）のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおけるＮ１及びＮ２のそれぞれは、独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、又はＣである。いくつかの例では、Ｎ２は、Ｕであることができる。
【0009】
いくつかの例では、例示的な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）についてのセンス鎖及びアンチセンス鎖が、以下で提供される。
（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＵＵ－３’（配列番号４７）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＵＵ－３’（配列番号４８）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＵＵ－３’（配列番号４９）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＵＵ－３’（配列番号５０）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＵＵ－３’（配列番号５１）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＵＵ－３’（配列番号５２）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＵＵ－３’（配列番号５３）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）及び
５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＵＵ－３’（配列番号５４）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）及び
５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＵＵ－３’（配列番号５５）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）及び
５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＵＵ－３’（配列番号５６）、又は
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＵＵ－３’（配列番号５７）。
（ｉ）５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＵＵ－３’（配列番号４７）、
（ｉｉ）５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＵＵ－３’（配列番号４８）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＵＵ－３’（配列番号４９）、
（ｉｖ）５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＵＵ－３’（配列番号５０）、
（ｖ）５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）及び
５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＵＵ－３’（配列番号５１）、
（ｖｉ）５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）及び
５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＵＵ－３’（配列番号５２）、
（ｖｉｉ）５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＵＵ－３’（配列番号５３）、
（ｖｉｉｉ）５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）及び
５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＵＵ－３’（配列番号５４）、
（ｉｘ）５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）及び
５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＵＵ－３’（配列番号５５）、
（ｘ）５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）及び
５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＵＵ－３’（配列番号５６）、又は
（ｘｉ）５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）及び
５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＵＵ－３’（配列番号５７）。
【0010】
（ｉ）～（ｘｉ）のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおけるＸ１及びＸ２は、独立して、それぞれ、Ａ及びＵ又はその逆である。具体的な例が、以下の表１で提供される。
【0011】
いくつかの例では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、又は（ｘｉ）に記載のヌクレオチド配列を含み得る。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ６であることができる。他の例では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ７であることができる。他の例では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ８であることができる。他の例では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ１０であることができる。他の例では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ１１であることができる。本明細書で使用される場合、ｓｉＲＮＡ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１１などとは、これらのｓｉＲＮＡの修飾プロファイルにかかわらず、本明細書で提供されるそれぞれのｓｉＲＮＡに対応するアンチセンス及びセンス配列を含むｓｉＲＮＡを指す。例えば、ｓｉＲＮＡ Ｃ６とは、配列番号１２を含むセンス鎖、及び配列番号１１を含むアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡであって、センス鎖及びアンチセンス鎖のうちの１つ又は両方が、未修飾又は任意のパターン（例えば、本明細書に開示されるもの）での修飾のいずれかであることができる、ｓｉＲＮＡを指す。
【0012】
本明細書に開示される干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの例では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又はこれらの組み合わせを含む。代替として又は加えて、本明細書に開示される干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、修飾骨格、例えば、１つ以上のホスホロチオエート結合を含む修飾骨格を含み得る。例えば、修飾ｓｉＲＮＡは、Ｃ６Ｇ２５Ｓであり得る。他の例では、修飾ｓｉＲＮＡは、Ｃ８Ｇ２５Ｓであり得る。更に他の例では、修飾ｓｉＲＮＡは、Ｃ１０Ｇ３１Ａであり得る。
【0013】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、接触させるステップは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスに感染した対象に、ｓｉＲＮＡを投与することによって実行される。いくつかの例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染を有し得る。他の例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有し得る（例えば、ＣＯＶＩＤ１９を有し得る）。ｓｉＲＮＡは、医薬組成物中で製剤化され得、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。いくつかの事例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスに感染した、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したヒト患者であり得る。他の事例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を有すると疑われるヒト患者であり得る。更に他の事例では、対象は、このような感染のリスクがあるヒト患者であり得る。いくつかの事例では、対象に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶによって引き起こされる感染、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる感染の治療のための薬剤が更に投与され得る。例としては、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ抗体、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン）、レムデシビル、ステロイド、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0014】
いくつかの事例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ、又はこのようなｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、治療を必要としている対象に、鼻経路、例えば、鼻腔内滴下又はエアロゾル吸入を介して送達され得る。具体的な例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ、又はこのようなｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、対象に、鼻腔内滴下及びエアロゾル吸入の両方によって送達され得る。
【0015】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、対象に、本明細書に開示される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる感染の治療のための薬剤のうちのいずれかを投与することを更に含み得る。
【0016】
他の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを標的とする、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ、例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１のうちのいずれか、及びこのようなｓｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、本明細書に開示されるいずれかのパターンによって修飾されている。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、又はＣ１０Ｇ３１Ａの修飾ｓｉＲＮＡである。
【0017】
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染の阻害における使用のためのかつ／又はその感染によって引き起こされる疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を治療するための、ｓｉＲＮＡのうちのいずれか又はこのようなｓｉＲＮＡを含む医薬組成物、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染の阻害における使用のためのかつ／又はその感染によって引き起こされる疾患、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するための医薬品を製造するための、このようなｓｉＲＮＡ又は医薬組成物の使用が、本開示の範囲内である。
【0018】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの発明を実施するための形態から明らかであり、また、添付の特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0019】
以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、本開示のある態様を更に実証するために含まれ、本開示のある態様は、本明細書に提示される具体的な発明を実施するための形態と合わせて図面を参照することによって、より良好に理解され得る。
【0020】
【図1】ＲＴ－ｑＰＣＲによって判定された場合の、Ｖｅｒｏ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増殖に対する示される例示的なｓｉＲＮＡの阻害活性を示すグラフである。
【図2】示される例示的なｓｉＲＮＡの存在下でプラークアッセイによって定量化された場合の、ウイルス産生の低減を示すグラフである。
【図3A-E】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高度に強力なｓｉＲＮＡの同定を示す図を含む。図３Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする強力なｓｉＲＮＡを同定するために使用される選択戦略を示すフローチャート。それぞれの段階の終了に残っている選択基準及びヒットの数が示された。図３Ｂ：Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるウイルスＥ遺伝子発現を示すグラフ。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１０ｎＭのｓｉＲＮＡで事前にトランスフェクトされ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、２４時間後に、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で添加された。ウイルスＲＮＡコピーの数は、ＲＴ－ｑＰＣＲで定量化された。対照は、スクランブルｓｉＲＮＡであり、「Ｃｔｒｌ」と略される。Ｃ１～Ｃ１１は、選択後の最終候補配列である。図３Ｃ：Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるプラーク阻害を示すグラフ。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１０ｎＭのｓｉＲＮＡで事前にトランスフェクトされ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、２４時間後に、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で添加された。感染性ビリオンの数は、プラーク形成アッセイで定量化された。図３Ｄ：Ｃ６及び完全修飾Ｃ６Ｇ２５ＳのＩＣ５０を示すグラフ。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１０、２、０．４、０．０８、又は０．０１６ｎＭのＣ６又はＣ６Ｇ２５Ｓでトランスフェクトされ、ウイルスに、０．２のＭＯＩで曝露された。ウイルス遺伝子は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって、感染の２４時間後に定量化された。図３Ｅ：Ｃ６Ｇ２５ＳによるウイルスＲｄＲｐ阻害についてのＩＣ５０データを示すグラフを示す。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１０、２、０．４、０．０８、又は０．０１６ｎＭのＣ６Ｇ２５Ｓでトランスフェクトされ、ウイルスに、０．２のＭＯＩで曝露された。ウイルス遺伝子は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって、感染の２４時間後に定量化された。
【図4A-4B】Ｃ６Ｇ２５Ｓが様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を標的とし阻害したことを示す図を含む。図４Ａ：４つのＶＯＣ、４つのＶＯＩ、及び２つの他の変異体についてのゲノムマップ。ゲノムマップは、Ｃ６がウイルスＲｄＲｐ（受入番号：ＮＣ＿０４５５１２．２）の高度保存領域を標的とすることを示す。ゲノムの上の点は、それぞれの変異体についての典型的な変異の位置を示す。ウイルス感染性又は免疫系への耐性のいずれかに関連するスパイクタンパク質における重要な変異は、赤で標識され、変異アミノ酸は、示されるとおりである。他の変異は、黒色で標識される。ＲｄＲＰのＣ６Ｇ２５認識についての標的部位及び配列は、マップの下に示される。Ｃ６Ｇ２５のアンチセンスの配列は、配列番号５８に対応し、ウイルスゲノム領域は、配列番号５９に対応する標的部位配列を含む。図４Ｂ：異なる変異体に対するＣ６Ｇ２５ＳについてのＩＣ５０を示すグラフである。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１０、２、０．４、０．０８、又は０．０１６ｎＭのＣ６Ｇ２５Ｓでトランスフェクトされ、異なるウイルス株に曝露された。ウイルス遺伝子は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって、感染の２４時間後に定量化された。
【図5A-5F】Ｃ６Ｇ２５Ｓについての投与経路のインビボ研究を示す図を含む。図５Ａ：ＡＩを介する肺内のＣ６Ｇ２５Ｓの分布を示す写真。Ｃ６Ｇ２５Ｓで１．４８ｍｇ／ＬのＡＩによって３０分間処置されたＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス。図５Ｂ：ＩＮを介する肺内のＣ６Ｇ２５Ｓの分布を示す写真。５０ｕｇのＣ６Ｇ２５Ｓを含有する５０ｕｌのＰＢＳでＩＮによって処置されたＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス。図５Ｃ：陰性対照（１群当たりｎ＝５）として機能するＣ６Ｇ２５Ｓ未処置ＰＢＳで処置されたマウスの肺内の分布を示す写真。肺内のＣ６Ｇ２５Ｓ分布は、Ｃ６Ｇ２５Ｓ特異的プローブ（赤色）でのＩＳＨ染色によって可視化された。ボックスで記された気管支（ｉ）及び細気管支（ｉｉ）は、右側で拡大されている。図５Ｄ：Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺内のＣ６Ｇ２５Ｓ陽性細胞の定量化を示すグラフ（ＮＣ＝陰性対照、ＩＮ＝鼻腔内滴下、ＡＩ＝エアロゾル吸入）。図５Ｅ：ＡＩを介する送達後のＣ５７／Ｂ６マウスの肺及び鼻腔内に沈着したｓｉＲＮＡレベルを示すグラフ。図５Ｆ：ＩＮを介する送達後のＣ５７／Ｂ６マウスの肺及び鼻腔内に沈着したｓｉＲＮＡレベルを示すグラフ。（１群当たりｎ＝３）。定量化データは、平均±ＳＤを表す。
【図6A-6C】吸入エアロゾル、肺及び鼻腔内のＣ６Ｇ２５Ｓの定量化を示す図を含む。図６Ａ：Ｂｍａｘを示すグラフ。Ｂｍａｘは、最大Ｃ６Ｇ２５Ｓレベルを表す。エアロゾルが生成された後に、エアロゾル試料は、０．５ｍＬのシリンジを使用して、吸入チャンバから収集され、１００ｕＬのヌクレアーゼ不含水に通された。その後、ヌクレアーゼ不含水中のＣ６Ｇ２５Ｓレベルが、ＯＤ２６０によって判定された。図６Ｂ：エアロゾル吸入及び鼻腔内滴下の両方を介する送達の０．５、８、２４、及び４８時間後の肺内のＣ６Ｇ２５Ｓレベルの定量化を示すグラフ。図６Ｃ：エアロゾル吸入及び鼻腔内滴下の両方を介する送達の０．５、８、２４、及び４８時間後の鼻腔内のＣ６Ｇ２５Ｓレベルの定量化を示すグラフ。Ｃ５７／Ｂ６マウス（１群当たりｎ＝３）に、０．７４ｍｇ／ＬのＣ６Ｇ２５Ｓが、ＡＩを介して３０分間投与され、続いて、５０ｕｇのＣ６Ｇ２５Ｓが、ＩＮを介して投与された。定量化データは、平均±ＳＤを表す。
【図7A-7D】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びデルタ変異体のインビボ処置におけるＣ６Ｇ２５Ｓの予防的及び曝露後投与を示す図を含む。図７Ａ：ウイルスに感染していない対照及び処置マウスにおけるウイルスレベルを示す図。左パネルは、それぞれ、ＲＴ－ｑＰＣＲ及びプラーク形成アッセイで２ｄｐｉに定量化された、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺内のウイルスＲＮＡを示すグラフである。右パネルは、それぞれ、ＲＴ－ｑＰＣＲ及びプラーク形成アッセイで２ｄｐｉに定量化された、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺内の感染性バイロンを示すグラフである。スチューデントｔ検定によるＰ値。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（Ｗｉｎｋｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２７－１３３５）は、１０４プラーク形成単位（ＰＦＵ）の本来のウイルスに鼻腔内曝露される前に、１日１回３日間処置された。予防的処置は、３０分間のＡＩ（１．４８ｍｇ／ｌのＣ６Ｇ２５Ｓ）、続いて、５０ｕｇのＣ６Ｇ２５ＳのＩＮからなる。図７Ｂ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ変異体に感染した対照及び処置マウスにおけるウイルスレベルを示す図。左パネルは、曝露後のＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺内のウイルスＲＮＡの定量化を示すグラフである。右パネルは、曝露後のＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺内の感染性バイロンの定量化を示すグラフである。マウスは、１０４ＰＦＵのウイルスに鼻腔内曝露され、曝露後に、２．９６ｍｇ／ＬのＣ６Ｇ２５ＳでＡＩによって３０分間、０日目（感染直後）及び１日目に処置された。ウイルスＲＮＡ及び感染性ビリオンは、２ｄｐｉに定量化された。図７Ｃ：図７Ａと同じ実験設計に従って感染していない対照及び処置マウスにおけるウイルスレベルを示す図。肺内のウイルスＲＮＡ（左パネル）及び感染性ビリオン（右パネル）は、２ｄｐｉに定量化された。図７Ｄ：デルタウイルスに対するＣ６Ｇ２５Ｓの曝露後処置を示すグラフ。２回投与群は、０日目及び１日目に処置され、２日目ｄｐｉに分析された。３回投与群は、０日目、１日目、及び２日目に処置され、３日目ｄｐｉに分析された。ウイルスＲＮＡレベル（左パネル）及び感染性バイロン（右パネル）は、それぞれの時点の対照に対して評価された。処置群は、Ｔと標識され、緩衝液対照は、Ｃと標識される。
【図8A-8C】Ｃ６Ｇ２５ＳがＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘導性組織損傷を防止することを示す図を含む。図８Ａ：肺からのＩＳＨ画像の定量分析を示すグラフ。マウス１匹当たりの全肺切片、及び１群当たり５匹のマウスが測定された。データは、スチューデントｔ検定による平均±ＳＤ、Ｐ値を表す。図８Ｂ：肺の全切片内の肺浸潤免疫細胞の定量分析を示すグラフ。対照群（ｎ＝５）についての陽染性面積の百分率が、測定され、１００に正規化された。未処置対照についての陽染性面積の相対百分率は、赤で示され、Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置群は、青で示される（ｎ＝５）。データは、スチューデントｔ検定による平均±ＳＤ、Ｐ値を表す。図８Ｃ：肺傷害スコアを示すグラフ １群当たり５匹のマウスについて計算された。データは、スチューデントｔ検定による平均±ＳＤ、Ｐ値を表す。
【図9】Ｃ６Ｇ２５Ｓの臨床的有用性を示す図である。１０ｕＭの修飾Ｃ６（Ｃ６Ｇ２５Ｓ）及び修飾Ｃ８（Ｃ８Ｇ２５Ｓ）ｓｉＲＮＡと共培養された後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における炎症性サイトカインの刺激なし。共培養培地中のサイトカインＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－アルファ、及びＩＦＮ－ガンマは、フローサイトメトリー分析を介して、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｓｓａｙ（ＣＢＡ）Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出された。ＣｐＧ及びポリ（Ｉ：Ｃ）が、陽性対照として使用された。データは、３つの健常なドナーからのＰＢＭＣを使用する２つの独立した実験の平均±ＳＤとして提示される。Ｃｏｎｃ．＝濃度。
【図10】ＣＣＫ－８アッセイによって測定された、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞の細胞生存率へのＣ６Ｇ２５Ｓの効果を示すグラフである。未処置群と比較して、最大４０ｕＭまでのＣ６Ｇ２５Ｓにおいて有意な細胞毒性はなかった。
【図11A-11B】Ｃ６Ｇ２５Ｓの単回及び反復投与毒性学研究を示す図を含む。図１１Ａ：単回投与毒性学研究を示すグラフ。０日目に、単一用量のＣ６Ｇ２５Ｓ（０、２０、４０、及び７５ｍｇ／ｋｇ）が、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、鼻腔内投与された（１群当たりｎ＝３）。体重及び食物摂取量は、７日間毎日監視された。図１１Ｂ：反復投与毒性学研究を示すグラフである。ＩＣＲマウス（１群当たりｎ＝３）に、示される濃度のＣ６Ｇ２５Ｓが鼻腔内滴下によって毎日投与され、体重及び食物摂取量は、１４日間連続的に監視された。
【図12】Ｃ６Ｇ２５Ｓの潜在的な作用機序を示すフローチャートである。
【図13A-13B】結合部位のうちの１つを有するｍｉＲ２９１１が、Ｃ６の結合部位と重複する 本来のウイルスのウイルスＲＮＡを低減したが、アルファ変異体のウイルスＲＮＡを低減しなかったことを示す図を含む。図１３Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（受入番号：ＮＣ＿０４５５１２．２）内の、全ての１１個のｓｉＲＮＡ候補によって標的とされた位置を示す図。ＲｄＲｐ上のＣ６及びｍｉＲ２９１１の重複する標的部位は、赤及び青でそれぞれ概略されたＣ６アンチセンス及びｍｉＲ２９１１の配列で示される。配列は、上から下へ配列番号６０、６１、及び５８である。図１３Ｂ：ｍｉＲ２９１１によって引き起こされた、ウイルスＲＮＡの阻害を示すグラフ。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、１００ｎＭのｍｉＲ２９１１でトランスフェクトされ、次いで、本来のウイルス及びアルファ変異体に、それぞれ、０．１のＭＯＩで感染させた。ウイルスＲＮＡは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって検出された。
【発明を実施するための形態】
【0021】
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が宿主細胞内に導入されたときに、ｄｓＲＮＡが遺伝子発現を遮断する、プロセスである。（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６－８１１）。低分子ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において、遺伝子特異的転写後サイレンシングを指示し、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ分解を含み得る。
【0022】
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのＲＮＡゲノムを標的とする干渉ＲＮＡの開発に少なくとも部分的に基づく。いくつかの事例では、このような干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＲＮＡゲノムを標的とし得る。他の事例では、干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムを標的とし得る。ＲＮＡ干渉を介して、このような干渉ＲＮＡは、Ｖｅｒｏ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡゲノム複製及びウイルス産生の阻害において高い効率を示したが、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染の阻害における、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染によって引き起こされる疾患、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる感染の治療における、干渉ＲＮＡの治療可能性を示す。いくつかの例では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患であるＣＯＶＩＤ１９を治療するために使用され得る。
【0023】
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノム内の特定のゲノム部位を標的とする干渉ＲＮＡ、このような干渉ＲＮＡを含む医薬組成物、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染）を阻害するためのかつ／又はその感染によって引き起こされる疾患、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するためのそれらの治療的使用が、本明細書で提供される。
【0024】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、サイトゾルに侵入すると、いくつかのタンパク質と相互作用して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し、配列相補性に基づいて、標的遺伝子の発現をノックダウンする。ウイルスゲノム部位、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の高度保存領域（例えば、図４Ａに示されるＲｄＲｐ遺伝子内の領域）を標的とすることによって、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、広範囲のウイルス変異体を阻害することができ、したがって、急速に進化するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のための完結な療法であり得る。
【0025】
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのＳＡＲＳウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２の高度保存ＲｄＲｐ領域を標的とすることができる広範囲のｓｉＲＮＡ分子の開発に少なくとも部分的に基づく。このようなｓｉＲＮＡは、最も優性の変異体を含む広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して（ピコモルＩＣ５０値での）高い阻害活性を示す（以下の実施例２を参照されたい）。経鼻経路、例えば、鼻腔内滴下又はエアロゾル吸入を介する、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡの送達は、動物モデルにおいて観察されたように、有望な予防及び治療効力を示した。
【0026】
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする、修飾バージョンを含むｓｉＲＮＡ、並びに予防的治療及び実際の感染の治療の両方のためのそれらの治療的使用が、本明細書で提供される。
【0027】
Ｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする干渉ＲＮＡ
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知のプロセスを介して、ｍＲＮＡの配列特異的サイレンシングを指示する。ｄｓＲＮＡの２１～２３ｎｔの断片が、例えば、ＲＮＡ分解を引き起こすことによって、ＲＮＡサイレンシングの配列特異的メディエーターであることが実証されている。理論に拘束されることを望まないが、これは、これらの２１～２３ｎｔの断片内に存在する、単に特定の長さの断片であり得る分子シグナルが、ＲＮＡｉを媒介する細胞因子を動員することであり得る。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知のプロセスを介して、ｍＲＮＡの配列特異的サイレンシングを指示する。ｄｓＲＮＡの２１～２３ｎｔの断片が、例えば、ＲＮＡ分解を引き起こすことによって、ＲＮＡサイレンシングの配列特異的メディエーターであることが実証されている。理論に拘束されることを望まないが、これは、これらの２１～２３ｎｔの断片内に存在する、単に特定の長さの断片であり得る分子シグナルが、ＲＮＡｉを媒介する細胞因子を動員することであり得る。
【0028】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノムＲＮＡを標的とする干渉ＲＮＡ分子、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノムＲＮＡ内の特定のゲノム部位を標的とする干渉ＲＮＡ分子、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ複製／産生を阻害するためにかつ／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染に関連する疾患を治療するためにこのような干渉ＲＮＡ分子を使用する方法が、本明細書に記載される。いくつかの例では、干渉ＲＮＡ分子は、本明細書に開示する ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ゲノムＲＮＡを標的とし得、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ゲノムＲＮＡ内の特定のゲノム部位を標的とし得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１複製／産生を阻害するためにかつ／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染に関連する疾患を治療するために使用され得る。いくつかの例では、干渉ＲＮＡ分子は、本明細書に開示する ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡを標的とし得、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ内の特定のゲノム部位を標的とし得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製／産生を阻害するためにかつ／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連する疾患、例えば、ＣＯＶＩＤ１９を治療するために使用され得る。
【0029】
本明細書で使用される場合、「干渉ＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子の阻害において使用され得るいずれかのＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ干渉に直接関与する成熟ＲＮＡ分子（例えば、本明細書に開示される２１～２３ｎｔのｄｓＲＮＡ）又は成熟ＲＮＡ分子を産生する前駆体分子の両方を含む、ＲＮＡ分子を指す。
【0030】
干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）のゲノム部位に（完全に又は部分的に）相補的である断片を含む。断片は、標的部位に１００％相補的であり得る。代替として、断片は、部分的に相補的であり得、例えば、１つ以上のミスマッチを含むが、二本鎖を標的部位において形成してＲＮＡ干渉を媒介するのに十分に相補的であり得る。
【0031】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）のリーダーセグメント内のゲノム部位を標的とし、例えば、５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＡ－３’（配列番号２）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とする。例としては、表１に列挙されるＣ１ ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【0032】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）のパパイン様プロテアーゼ（ＰＬＰ）遺伝子内のゲノム部位を標的とする。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡ－３’（配列番号４）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＵ－３’（配列番号６）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。例としては、表１に列挙されるＣ２及びＣ３ ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【0033】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）の３Ｃ様（３ＣＬ）プロテアーゼ遺伝子内のゲノム部位を標的とする。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＡ－３’（配列番号８）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＵ－３’（配列番号１０）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。例としては、表１に列挙されるＣ４及びＣ５ ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【0034】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡの（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしても既知である）ポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＰＯＬ遺伝子又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰＯＬ遺伝子）内のゲノム部位を標的とする。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＵＵＧＣＵＵＵＵＣＡＡＡＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵＵＡＡＣＡＡＡＧＡ－３’（配列番号２３）のヌクレオチド配列中のゲノム部位を標的とし得る。いくつかの事例では、干渉ＲＮＡは、５’－ＵＵＵＣＡＡＡＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵＵ－３’（配列番号２４）のヌクレオチド配列中の部位を標的とし得る。例えば、干渉ＲＮＡは、５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＵ－３’（配列番号１２）のヌクレオチド配列を有する部位を標的とし得る。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＡ－３’（配列番号１４）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。例としては、表１に列挙されるＣ６及びＣ７ ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【0035】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）のスパイク遺伝子内のゲノム部位を標的とする。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧ－３’（配列番号１６）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＡ－３’（配列番号１８）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＧ－３’（配列番号２０）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。例としては、表１に列挙されるＣ８、Ｃ９、及びＣ１０ ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【0036】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）のエンベロープ遺伝子内のゲノム部位を標的とする。いくつかの例では、このような干渉ＲＮＡは、５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＡ－３’（配列番号２２）のヌクレオチド配列を有するゲノム部位を標的とし得る。例としては、表１に列挙されるＣ１１ ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【0037】
修飾が具体的に記載されない、本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、任意の様式の非修飾配列及び修飾配列の両方を包含することが意図されている。
【0038】
いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡは、本明細書に開示する ｓｉＲＮＡ、すなわち、２つの別個の相補的ＲＮＡ鎖を含有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。このようなｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）の標的ゲノム部位に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖、及びセンス鎖（及び標的ゲノム部位）に相補的なアンチセンス鎖を含み得る。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖が、完全に同じである又は標的ゲノム部位に相補的である必要はないことが、当業者には既知である。ｓｉＲＮＡが、ゲノム部位を、塩基対形成を介して依然として標的として、ＲＮＡ干渉プロセスを媒介することができる限り、１つ以上のミスマッチが許容される。いくつかの事例では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖（全センス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖、又はセンス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の一部分）は、完全に同じである又は標的ゲノム部位に相補的である。他の例では、干渉ＲＮＡは、ここに開示する低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であることができ、ｓｈＲＮＡは、タイトヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの両方は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＮＡ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）内の標的ゲノム部位の配列に基づいて設計され得る。
【0039】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含有し得、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。いくつかの例では、センス鎖は、２１～２３個のヌクレオチド（例えば、１９ｎｔ）を有し得、アンチセンス鎖は、センス鎖に対して、２つのヌクレオチドオーバーハングをアンチセンス鎖の３’末端において有する（－Ｎ１Ｎ２－３’）２３～２５個のヌクレオチド（例えば、２３ｎｔ）を有し得る。オーバーハングヌクレオチドは、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵのうちのいずれかであり得る。いくつかの事例では、３’末端ヌクレオチド（Ｎ２）は、Ｕであり得る。代替として又は加えて、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的であり得る。いくつかの例では、センス鎖の３’末端ヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、塩基対、例えば、Ａ／Ｕ対又はＧ／Ｃ対を形成し得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子、例えば、以下の表１に列挙されるｓｉＲＮＡ分子であることができる。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１のうちの１つである。
【0041】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号２６）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＡＧＧＣＡＣＧＵＣＡＡＣＡＵＣＵＵＸ１－３’（配列番号２５）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＧＡＵＧＵＵＧＡＣＧＵＧＣＣＵＣＵＵ－３’（配列番号４７）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0042】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号２８）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＡＧＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＡＸ１－３’（配列番号２７）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＧＵＧＵＧＡＵＵＵＡＡＵＧＣＵＧＵＵ－３’（配列番号４８）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0043】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３０）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＧＧＵＧＵＵＵＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＸ１－３’（配列番号２９）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＣＡＣＧＧＵＵＵＡＡＡＣＡＣＣＧＵＵ－３’（配列番号４９）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0044】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３２）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＵＧＧＵＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＵＵＡＸ１－３’（配列番号３１）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＡＧＵＧＵＡＧＵＵＧＵＡＣＣＡＣＵＵ－３’（配列番号５０）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0045】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＮ１Ｎ２－３’（配列番号３４）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＵＧＧＣＵＵＧＡＵＧＡＣＧＵＡＧＵＵＸ１－３’（配列番号３３）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＣＵＡＣＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＡＵＵ－３’（配列番号５１）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてＸ１及びＸ２である。
【0046】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号３６）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＵＧＵＣＡＡＡＣＣＣＧＧＵＡＡＵＵＸ１－３’（配列番号３５）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＵＵＡＣＣＧＧＧＵＵＵＧＡＣＡＧＵＵ－３’（配列番号５２）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0047】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号３８）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＣＧＧＵＵＣＡＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号３７）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＡＣＡＵＡＵＡＧＵＧＡＡＣＣＧＣＵＵ－３’（配列番号５３）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0048】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＮ１Ｎ２－３’（配列番号４０）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＸ１－３’（配列番号３９）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＧＡＣＵＡＧＡＧＡＣＵＡＧＵＧＧＣＵＵ－３’（配列番号５４）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0049】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４２）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＵＣＣＵＡＣＵＵＧＧＣＧＵＧＵＵＵＸ１－３’（配列番号４１）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＵＡＧＧＡＧＵＵ－３’（配列番号６２）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0050】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４４）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。具体的な例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＧＣＡＣＡＵＵＧＣＵＡＡＣＵＡＡＧＸ１－３’（配列番号４３）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＣＵＵＡＧＵＵＡＧＣＡＡＵＧＵＧＣＧＵＵ－３’（配列番号５６）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0051】
いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＮ１Ｎ２－３’（配列番号４６）を含むアンチセンス鎖を含み得る。Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ又はＧ／Ｃ塩基対を形成する。Ｎ１及びＮ２のそれぞれは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）であることができる。いくつかの事例では、Ｘ１及びＸ２は、Ａ／Ｕ対を形成する。代替として又は加えて、Ｎ２は、Ｕであり、Ｎ１は、標的部位における対応するヌクレオチドに相補的である。いくつかの例では、ｓｉＲＮＡは、５’－ＣＡＧＧＵＡＣＧＵＵＡＡＵＡＧＵＵＡＸ１－３’（配列番号４５）を含むセンス鎖、及び５’－Ｘ２ＵＡＡＣＵＡＵＵＡＡＣＧＵＡＣＣＵＧＵＵ－３’（配列番号５７）を含むアンチセンス鎖を含み得、Ａ／Ｕ対についてのＸ１及びＸ２である。
【0052】
いくつかの事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１と同じセンス鎖及び／又は同じアンチセンス鎖を含み得る。他の事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ６のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるセンス鎖を含み得、かつ／又はＣ６のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるアンチセンス鎖を含み得る。他の事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ７のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるセンス鎖を含み得、かつ／又はＣ７のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるアンチセンス鎖を含み得る。他の事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ８のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるセンス鎖を含み得、かつ／又はＣ８のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるアンチセンス鎖を含み得る。他の事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ１０のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるセンス鎖を含み得、かつ／又はＣ１０のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるアンチセンス鎖を含み得る。他の事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ１１のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるセンス鎖を含み得、かつ／又はＣ１１のセンス鎖と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上）同一であるアンチセンス鎖を含み得る。
【0053】
２つの核酸の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３のように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して判定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長－１２で実行され得る。ギャップが２つの配列間に存在する場合、ギャップドＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているように使用され得る。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを使用するときに、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。
【0054】
他の実施形態では、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｓｉＲＮＡは、参照ｓｉＲＮＡ、例えば、表１に列挙されるもの、例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１のセンス鎖及びアンチセンス鎖と（合わせて又は別個に）比較して、最大６つ（例えば、最大６、５、４、３、又は２つ）までのヌクレオチド変異を含有し得る。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、非自然発生の核酸塩基、糖、又は共有結合性ヌクレオシド間結合（骨格）を含有し得る。このような修飾オリゴヌクレオチドは、所望の特性、例えば、増強された細胞取り込み、標的核酸への改善された親和性、増加したインビボ安定性を付与し、インビボ安定性（例えば、ヌクレアーゼ分解への耐性）を増強し、かつ／又は免疫原性を低減する。
【0056】
一例では、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）は、修飾骨格を有し、修飾骨格は、リン原子を保持するもの（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、及び同第５，６２５，０５０号を参照されたい）、及びリン原子を有さないもの（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、及び同第５，７９２，６０８号を参照されたい）を含む。リン含有修飾骨格の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル－ホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホトリエステル、セレノホスフェート、並びに３’－５’結合又は２’－５’結合を有するボラノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。このような骨格はまた、逆極性を有するもの、すなわち、３’から３’、５’から５’、又は２’から２’結合を有するものを含む。リン原子を含まない修飾骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されている。このような骨格は、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルホリノ結合を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成成分部分を有する他の骨格を含む。
【0057】
別の例では、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）は、１つ以上の置換糖部分を含む。このような置換糖部分は、以下の基のうちの１つを、置換糖部分の２’位において含むことができる。ＯＨ、Ｆ、Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル、Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル、Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル、及びＯ－アルキル－Ｏ－アルキル。これらの基において、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであることができる。置換糖部分はまた、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基を、置換糖部分の２’位において含み得る。好ましい置換糖部分は、２’－メトキシエトキシ、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシを有するものを含む。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４を参照されたい。
【0058】
代替として又は加えて、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）は、１つ以上の修飾天然核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）を含む。修飾核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に記載されているものを含む。これらの核酸塩基のうちのある核酸塩基は、干渉ＲＮＡ分子の標的部位への干渉ＲＮＡ分子の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、及びＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリン（例えば、２－アミノプロピル－アデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシン）を含む。Ｓａｎｇｈｖｉ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８を参照されたい）。
【0059】
代替として又は加えて、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。アクセス制限ＲＮＡとしばしば称されるＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、修飾ＲＮＡヌクレオチド内で、リボース部分が、２’酸素と４’炭素とを接続する余分なブリッジで修飾されている。このブリッジは、Ａ型二本鎖においてしばしば見出される３’－エンド（ノース）コンフォメーションのリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）のうちのいずれか内で使用され得る。いくつかの例では、干渉ＲＮＡ内のヌクレオチドの最大５０％（例えば、４０％、３０％、２０％、又は１０％）が、ＬＮＡである。
【0060】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、リガンドにコンジュゲートされてもよく、又は小胞中に封入されてもよく、これは、所望の細胞／組織へのｓｉＲＮＡの送達を容易にすることができ、かつ／又は細胞取り込みを容易にすることができる。好適なリガンドは、炭水化物、ペプチド、抗体、ポリマー、低分子、コレステロール、及びアプタマーを含むが、これらに限定されない。
【0061】
本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、従来の方法、例えば、化学合成又はインビトロ転写によって調製され得る。本明細書に記載される、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡの意図された生物活性は、例えば、以下の実施例に記載されるものによって検証され得る。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかを発現するためのベクターもまた、本開示の範囲内にある。
【0062】
具体的な例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療（予防的又は実際の治療）における使用のための、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ６Ｇ２５Ｓの修飾ｓｉＲＮＡである（以下の表４を参照されたい）。他の例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療（予防的又は実際の治療）における使用のための、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ８Ｇ２５Ｓの修飾ｓｉＲＮＡである（以下の表４を参照されたい）。更に他の例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療（予防的又は実際の治療）における使用のための、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、Ｃ１０Ｇ３１Ａの修飾ｓｉＲＮＡである（以下の表４を参照されたい）。
【0063】
ＩＩ．医薬組成物
干渉ＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されるＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、及びＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、好適な医薬組成物中に製剤化され得る。本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で更に含むことができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ。このような担体、賦形剤、又は安定剤は、本明細書に記載される組成物中の活性成分の１つ以上の特性、例えば、生物活性、安定性、生物学的利用能、並びに他の薬物動態及び／又は生物活性を増強し得る。
干渉ＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されるＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、及びＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、好適な医薬組成物中に製剤化され得る。本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で更に含むことができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ。このような担体、賦形剤、又は安定剤は、本明細書に記載される組成物中の活性成分の１つ以上の特性、例えば、生物活性、安定性、生物学的利用能、並びに他の薬物動態及び／又は生物活性を増強し得る。
【0064】
許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度で、レシピエントに無毒であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ベンゾエート、ソルベート、及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、アラニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）（ポリソルベート）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（非イオン性界面活性剤）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。
【0065】
いくつかの例では、本明細書に記載される医薬組成物は、肺適合性賦形剤を含む。好適なこのような賦形剤は、リクロロモノ－フルオロメタン、ジクロロ－ジフルオロメタン、ジクロロ－テトラフルオロエタン、クロロペンタ－フルオロエタン、モノクロロ－ジフルオロエタン、ジフルオロエタン、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロプロパン、オクタフルオロ－シクロブタン、精製水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、及びＰＥＧ１０００）、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、レシチン、オレイン酸、ポリソルベート８０、ステアリン酸マグネシウム及びラウリル硫酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、チモール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、水酸化ナトリウム、トロメタミン、アンモニア、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、クエン酸、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、サッカリン、メントール、アスコルビン酸、グリシン、リジン、ゼラチン、ポビドンＫ２５、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛、ラクトース、ラクトース一水和物、ラクトース無水物、マンニトール、並びにデキストロースを含むが、これらに限定されない。
【0066】
他の例では、本明細書に記載される医薬組成物は、持続的放出形式で製剤化され得る。持続的放出調製物の好適な例としては、成形品の形態である、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、例えば、フィルム又はマイクロカプセルが挙げられる。持続的放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸と７エチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成された注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、イソ酪酸酢酸スクロース、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【0067】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。治療組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ若しくはバイアル、又は手動でアクセスされる密封容器内に置かれる。
【0068】
本明細書に記載される医薬組成物は、吸入又は吹送による投与、髄腔内、肺内、又は脳内経路、経口、非経口、又は直腸投与のための単位剤形、例えば、固体、溶液若しくは懸濁液、又は坐剤であり得る。
【0069】
固体組成物を調製するために、主活性成分は、医薬担体、例えば、従来の錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、又はガム、及び他の医薬希釈剤、例えば、水と混合されて、本発明の化合物又は無毒の薬学的に許容されるその塩の均質の混合物を含有する固体予備製剤組成物を形成することができる。これらの予備製剤組成物を均質と言及するときに、これは、活性成分が、組成物全体にわたって均等に分散されており、このため、組成物が、等しく有効な単位剤形、例えば、粉末収集物、錠剤、丸剤、及びカプセル剤に容易に細分され得ることを意味する。次いで、この固体予備製剤組成物は、好適な量の活性成分を組成物中に含有する上記のタイプの単位剤形に細分される。
【0070】
好適な表面活性剤は、特に、非イオン性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）、及び他のソルビタン（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）を含む。表面活性剤を有する組成物は、好都合には、０．０５～５％の表面活性剤、例えば、０．１～２．５％の表面活性剤を含む。他の成分、例えば、マンニトール又は他の薬学的に許容されるビヒクルが、必要に応じて添加されてもよいことが理解されよう。
【0071】
好適なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）、及びＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）を使用して調製され得る。活性成分は、予め混合されたエマルジョン組成物中に溶解させてもよく、又は代替として、活性成分は、油（例えば、ダイズ油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、又はアーモンド油）中に溶解させてもよく、リン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、又はダイズレシチン）及び水と混合されると形成されるエマルジョン中に溶解させてもよい。他の成分、例えば、グリセロール又はグルコースが、エマルジョンの浸透圧を調節するために添加されてもよいことが理解されよう。好適なエマルジョンは、典型的には、最大２０％の油、例えば、５～２０％の油を含有する。
【0072】
吸入又は吹送のための医薬組成物は、薬学的に許容される水性若しくは有機溶媒又はこれらの混合物中の溶液及び懸濁液、並びに粉末を含む。液体又は固体組成物は、上記の好適な薬学的に許容される賦形剤を含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、局所又は全身効果のための経口又は鼻呼吸器経路によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、１０ｎｍ～１００ｍｍのサイズの粒子から構成されている。
【0073】
好ましくは滅菌である薬学的に許容される溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接呼吸されてもよく、又は噴霧デバイスは、フェイスマスク、テント、気管内チューブ、及び／若しくは間欠的陽圧呼吸器（換気装置）に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液、又は粉末組成物は、製剤を適切な様式で送達するデバイスから、好ましくは、経口又は経鼻投与され得る。
【0074】
いくつかの事例では、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡのうちのいずれかを含む組成物は、鼻スプレー（例えば、エアロゾル吸入）のために又は鼻腔内送達のために製剤化され得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、リポソームに封入されてもよく又は付着させてもよく、これは、当該技術分野において既知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）、並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されている方法によって調製され得る。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、逆相蒸発法によって、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物で生成され得る。リポソームは、一定の孔径のフィルタを介して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【0076】
いくつかの実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかはまた、例えば、コアセルベーション技法によって若しくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入されてもよく、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に封入されてもよく、又はマクロエマルジョン中に封入されてもよい。このような技法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）を参照されたい。
【0077】
本明細書に開示される、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ干渉ＲＮＡ（例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１干渉ＲＮＡ又は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ）を含む医薬組成物のうちのいずれかは、エンドソーム及び／又はリソソームから細胞質への組成物の輸送を増強する構成成分を更に含み得る。例としては、ｐＨ感受性薬剤（例えば、ｐＨ感受性ペプチド）が挙げられる。
【0078】
いくつかの実施形態では、本明細書の医薬組成物のうちのいずれかは、組成物の意図された治療的使用に基づいて、第２の治療剤を更に含み得る。
【0079】
ＩＩＩ．治療用途
いくつかの態様では、本開示は、コロナウイルス感染を患っている、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を患っている患者において、ウイルス負荷を阻害する、治療する、低減するためのかつ／又は臨床転帰における罹患率若しくは死亡率を低減するための、本明細書に開示される干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれか、あるいはこのような干渉ＲＮＡを含む組成物のうちのいずれかの使用を提供する。更に別の態様では、本開示は、個体が、臨床的後遺症を有する病理学的コロナウイルス感染を発症するリスクを低減する方法を更に提供する。方法は、概して、治療有効量の治療有効量の本明細書の組成物を投与することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、コロナウイルス感染を患っている、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を患っている患者において、ウイルス負荷を阻害する、治療する、低減するためのかつ／又は臨床転帰における罹患率若しくは死亡率を低減するための、本明細書に開示される干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれか、あるいはこのような干渉ＲＮＡを含む組成物のうちのいずれかの使用を提供する。更に別の態様では、本開示は、個体が、臨床的後遺症を有する病理学的コロナウイルス感染を発症するリスクを低減する方法を更に提供する。方法は、概して、治療有効量の治療有効量の本明細書の組成物を投与することを含む。
【0080】
ＣＯＶＩＤ－１９は、２０１９新型コロナウイルスとして以前に既知の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる疾患である。他の事例では、患者は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１などの別のコロナウイルスによって引き起こされる感染を有し得る。
【0081】
本明細書に開示される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製及び産生を阻害するために使用され得、それによって、ウイルス感染の抑制、及びコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患又は障害、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の治療において有効である。
【0082】
本明細書に開示される方法を実施するために、少なくとも１つの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）を含有する、有効量の本明細書に記載される医薬組成物は、治療を必要としている対象（例えば、ヒト）に、好適な経路を介して、例えば、静脈内投与を介して、例えば、ボーラスとして、又は筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、気管内、経口、吸入、若しくは局所経路によるある期間にわたる連続注入によって投与され得る。ジェットネブライザ及び超音波ネブライザを含む、液体製剤のための市販のネブライザは、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧され得、凍結乾燥粉末は、再構成後に噴霧され得る。代替として、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ干渉ＲＮＡ含有組成物は、フルオロカーボン製剤及び定量噴霧式吸入器を使用してエアロゾル化されてもよく、又は凍結乾燥及び粉砕粉末として吸入されてもよい。
【0083】
本明細書で使用される場合、「有効量」とは、単独又は１つ以上の他の活性剤との組み合わせのいずれかで治療効果を対象に付与するために必要とされるそれぞれの活性剤の量を指す。いくつかの実施形態では、治療効果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）複製及び／又は産生の低減である。ある量の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡが治療効果を達成したかの判定は、当業者には明らかである。有効量は、当業者によって認識されるように、治療されている特定の状態、状態の重症度、年齢、健康状態、サイズ、性別、及び体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の持続期間、（存在する場合）同時療法の性質、特定の投与経路、並びに医療従事者の知識及び専門知識内の同様の因子に依存して変動する。これらの因子は、当業者に周知であり、通例の実験法のみで扱われ得る。概して、最大用量の個々の構成成分又はこれらの組み合わせ、すなわち、健全な医学的判断による最高安全用量が使用されることが好ましい。
【0084】
半減期などの経験的考慮事項は、概して、投与量の判定に寄与する。投与頻度は、療法の経過にわたって判定及び調節され得、概して、治療及び／又は抑制及び／又は寛解及び／又は標的疾患／障害の遅延に基づくが、必ずしもそうではない。代替として、干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）の持続的連続放出製剤が、適切であり得る。持続的放出を達成するための様々な製剤及びデバイスは、当該技術分野において既知である。
【0085】
一例では、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）についての投与量は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡの１つ以上の投与が与えられた個体において、経験的に判定され得る。個体に、漸増投与量の拮抗剤が与えられる。拮抗剤の効力を評価するために、疾患／障害の指標が追跡され得る。
【0086】
概して、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれかの投与について、初期候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであることができる。本開示の目的で、典型的な１日投与量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇ～３０μｇ／ｋｇ～３００μｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上のうちのいずれかの範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与について、状態に依存して、治療は、症状の所望の抑制が発生するまで、あるいは十分な治療レベルが達成されて標的疾患若しくは障害又はその症状を緩和するまで持続される。例示的な投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量、続いて、約１ｍｇ／ｋｇの週１回の維持用量の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）、又は続いて、隔週の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が、従事者が達成することを望む薬物動態学的減衰のパターンに依存して有用であり得る。例えば、週１～４回の投与が企図される。いくつかの実施形態では、約３μｇ／ｍｇ～約２ｍｇ／ｋｇ（例えば、約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、及び約２ｍｇ／ｋｇ）の範囲の投与が使用され得る。いくつかの実施形態では、投与頻度は、毎週１回、２週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、若しくは１０週間毎、又は毎月１回、２ヶ月毎、若しくは３ヶ月毎以上である。この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易に監視される。（使用される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）を含む）投与計画は、経時的に変動することができる。
【0087】
いくつかの実施形態では、標準体重の成人患者について、約０．３～５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が投与され得る。特定の投与計画、すなわち、用量、タイミング、及び反復は、特定の個体及びこの個体の病歴、並びに個々の薬剤の特性（例えば、薬剤の半減期、及び当該技術分野において周知の他の考慮事項）に依存する。
【0088】
本開示の目的で、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）の適切な投与量は、特定のｓｉＲＮＡ、疾患／障害のタイプ及び重症度、ｓｉＲＮＡが防止又は治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の臨床歴及び拮抗剤に対する患者の応答、並びに主治医の裁量に依存する。臨床医は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）を、所望の結果を達成する投与量が達せられるまで投与し得る。いくつかの実施形態では、所望の結果は、腫瘍負荷の減少、がん細胞の減少、又は免疫活性の増加である。投与量が所望の結果をもたらしたかを判定する方法は、当業者には明らかである。１つ以上の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療又は予防であるか、及び熟練した従事者に既知の他の因子に依存して、連続的又は間欠的であり得る。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）の投与は、事前選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、又は一連の間隔をおいた投与であってもよく、例えば、標的疾患又は障害の発症前、中、又は後のいずれかでの投与であってもよい。
【0089】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、標的疾患若しくは障害、疾患／障害の症状、又は疾患／障害の素因を有する対象に、障害、疾患の症状、又は疾患若しくは障害の素因を治癒させる、治す、緩和する、軽減する、変化させる、療治する、寛解させる、改善する、又はこれらに影響する目的で、１つ以上の活性剤を含む組成物を適用又は投与することを指す。
【0090】
標的疾患／障害を緩和することは、疾患の発症若しくは進行を遅延させること、又は疾患重症度を低減することを含む。疾患を緩和することは、必ずしも治癒結果を必要とするわけではない。本明細書で使用される場合、標的疾患又は障害の発症を「遅延させる」とは、疾患の進行を延期する、妨げる、遅くする、遅らせる、安定させる、かつ／又は延ばすことを意味する。この遅延は、疾患歴及び／又は治療されている個人に依存して、様々な時間長さの遅延であることができる。疾患の発症を「遅延させる」若しくは緩和する、又は疾患の発病を遅延させる方法は、方法を使用しない場合と比較されたときに、疾患の１つ以上の症状を発症する確率を所与の時間枠内で低減しかつ／又は症状の程度を所与の時間枠内で低減する方法である。このような比較は、典型的には、統計的に有意な結果を得るのに十分な数の対象を使用する臨床研究に基づく。
【0091】
疾患の「発症」又は「進行」とは、疾患の初期徴候及び／又はその後の進行を意味する。疾患の発症は、当技術分野において周知の標準的な臨床技法を使用して、検出可能であることができ、評価され得る。しかしながら、発症とは、検出不可能であり得る進行も指す。本開示の目的で、発症又は進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、及び発病を含む。本明細書で使用される場合、標的疾患又は障害の「発病」又は「発生」は、初期発病及び／又は再発を含む。
【0092】
本明細書に記載される意図された治療効果のうちのいずれかを達成するために、有効量の本明細書の組成物は、治療を必要としている対象に、好適な経路を介して投与され得る。
【0093】
本明細書で使用される場合、「有効量」とは、単独又は１つ以上の他の活性剤、例えば、本明細書に記載される第２の治療剤のうちの１つ以上との組み合わせのいずれかで治療効果を対象に付与するために必要とされるそれぞれの活性剤の量を指す。いくつかの実施形態では、治療効果は、ウイルス感染の基礎状態の改善である。いくつかの実施形態では、治療効果は、本明細書に記載されるウイルスによる感染のうちのいずれかに関連する１つ以上の症状を緩和することである。
【0094】
ある量の本明細書に記載される組成物が治療効果を達成したかの判定は、当業者には明らかである。有効量は、当業者によって認識されるように、治療されている特定の状態、状態の重症度、年齢、健康状態、サイズ、性別、及び体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の持続期間、（存在する場合）同時療法の性質、特定の投与経路、遺伝因子、並びに医療従事者の知識及び専門知識内の同様の因子に依存して変動する。これらの因子は、当業者に周知であり、通例の実験法のみで扱われ得る。概して、最大用量の個々の構成成分又はこれらの組み合わせ、すなわち、健全な医学的判断による最高安全用量が使用されることが好ましい。
【0095】
半減期などの経験的考慮事項は、概して、投与量の判定に寄与する。投与頻度及び／又は投与経路は、療法の経過にわたって判定及び調節され得、概して、治療及び／又は抑制及び／又は寛解及び／又は標的疾患／障害の遅延に基づくが、必ずしもそうではない。代替として、本明細書に記載される組成物の持続的連続放出製剤が、適切であり得る。持続的放出を達成するための様々な製剤及びデバイスは、当該技術分野において既知である。
【0096】
いくつかの実施形態では、有効量は、コロナウイルス感染を有するリスクを低減するための予防有効量（例えば、ウイルス感染を患っており、ウイルス負荷を阻害する、治療する、低減すること及び／又は罹患率若しくは死亡率を低減することを必要としている対象において、このような効果に有効な量）であり得る。
【0097】
医学分野の当業者に既知の従来の方法が、治療される疾患のタイプ又は疾患の部位に依存して、対象に、医薬組成物を投与するために使用され得る。この組成物はまた、他の従来の経路を介して投与され得、例えば、経口、非経口投与されてもよく、吸入スプレーによって投与されてもよく、局所、直腸、経鼻、頬側、膣内投与されてもよく、又は埋め込み型リザーバを介して投与されてもよい。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注入技法を含む。加えて、組成物は、対象に、注射可能デポ投与経路を介して、例えば、１、３、又は６ヶ月デポ注射可能又は生分解性材料及び方法を使用して投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、鼻経路を介して、例えば、鼻腔内スプレー、鼻スプレー、又は点鼻を介して投与され得る。具体的な例では、組成物は、（例えば、予防的又は実際の）治療を必要としている対象に、鼻腔内滴下及びエアロゾル吸入の両方を介して投与され得る。
【0098】
注射可能組成物は、様々な担体、例えば、植物油、ジメチルアクタミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、及びポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）を含有し得る。静脈内注射について、水溶性抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）は、点滴法によって投与され得、それによって、干渉ＲＮＡと、生理学的に許容される賦形剤と、を含有する医薬製剤が注入される。生理学的に許容される賦形剤は、例えば、５％のデキストロース、０．９％の生理食塩水、リンガー溶液、又は他の好適な賦形剤を含み得る。筋肉内調製物、例えば、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡの好適な可溶性塩形態の滅菌製剤は、医薬賦形剤、例えば、注射用水、０．９％の生理食塩水、又は５％のグルコース溶液中に溶解させて投与され得る。
【0099】
一実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、又はＣ１１などのｓｉＲＮＡ）は、部位特異的又は標的局所送達技法を介して投与される。部位特異的又は標的局所送達技法の例としては、ｓｉＲＮＡの様々な埋め込み型デポソース、又は局所送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、若しくは針カテーテル、合成グラフト、外膜ラップ、シャント及びステント、若しくは他の埋め込み型デバイス、部位特異的担体、直接注射、又は直接適用が挙げられる。例えば、国際公開第００／５３２１１号及び米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【0100】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、又はサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療組成物の標的送達もまた、使用され得る。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２、Ｃｈｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）（１９９４）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２、Ｚｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５５、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。
【0101】
いくつかの実施形態では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちのいずれか、又はこのような抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡを含む医薬組成物は、肺送達システムによって投与され得、すなわち、活性医薬成分は、肺内に投与される。肺送達システムは、吸入器システムであることができる。いくつかの実施形態では、吸入器システムは、加圧定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器、又はネブライザである。いくつかの実施形態では、吸入器システムは、スペーサー付きである。
【0102】
いくつかの実施形態では、加圧定量噴霧式吸入器は、噴射剤、共溶媒、及び／又は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、噴射剤は、フッ素化炭化水素、例えば、トリクロロモノ－フルオロメタン、ジクロロ－ジフルオロメタン、ジクロロ－テトラフルオロエタン、クロロペンタ－フルオロエタン、モノクロロ－ジフルオロエタン、ジフルオロエタン、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロプロパン、オクタフルオロ－シクロブタンを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、共溶媒は、精製水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、及びＰＥＧ１０００を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤又は潤滑剤は、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、レシチン、オレイン酸、ポリソルベート８０、ステアリン酸マグネシウム、及びラウリル硫酸ナトリウムを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、保存剤又は酸化防止剤は、メチルパラベン、プロピパラベン、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、チモール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ｐＨ調節又は浸透圧調節は、酸化ナトリウム、トロメタミン、アンモニア、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、クエン酸、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３を含む群から選択される。
【0103】
いくつかの実施形態では、乾燥粉末吸入器は、分散剤を含む。いくつかの実施形態では、分散剤又は担体粒子は、ラクトース、ラクトース一水和物、ラクトース無水物、マンニトール、デキストロースを含む群から選択され、これらの粒子サイズは、約１～１００μｍである。
【0104】
いくつかの実施形態では、ネブライザは、共溶媒、界面活性剤、潤滑剤、保存剤、及び／又は酸化防止剤を含み得る。いくつかの実施形態では、共溶媒は、精製水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、及び／又はＰＥＧ１０００）を含む群から選択される。いくつかの例では、界面活性剤又は潤滑剤は、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、レシチン、オレイン酸、ステアリン酸マグネシウム、及びラウリル硫酸ナトリウムを含む群から選択される。いくつかの例では、保存剤又は酸化防止剤は、メチルパラベン、プロピパラベン、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、チモール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡを含む群から選択される。いくつかの例では、ネブライザは、酸化ナトリウム、トロメタミン、アンモニア、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、クエン酸、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３を含む群から選択されるｐＨ調節又は浸透圧調節を更に含む。
【0105】
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｉＲＮＡ、又はこのような抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｉＲＮＡを産生するためのベクター）を含有する治療組成物は、遺伝子療法プロトコルにおける局所投与のために、約１００ｎｇ～約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。いくつかの実施形態では、約５００ｎｇ～約５０ｍｇ、約１μｇ～約２ｍｇ、約５μｇ～約５００μｇ、及び約２０μｇ～約１００μｇ以上のＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子療法プロトコル中に使用され得る。
【0106】
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって判定された場合の、特定の値についての許容誤差範囲内を意味し、これは、どのように値が測定又は判定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野における実施に従って、許容標準偏差以内を意味することができる。代替として、「約」とは、所与の値の最大±２０％、好ましくは、最大±１０％、より好ましくは、最大±５％、より好ましくは、更には、最大±１％までの範囲を意味することができる。代替として、特に、生物学的系又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは、２倍以内を意味することができる。特定の値が本明細書及び特許請求の範囲に記載される場合、別途記載されない限り、「約」の用語は、暗示的であり、この文脈において、特定の値についての許容誤差範囲内を意味する。
【0107】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、治療のために評価されているかつ／又は治療されている哺乳動物を指す。対象は、ヒトであり得るが、他の哺乳動物、特に、ヒト疾患についての実験モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌなども含む。治療を必要とするヒト対象は、ウイルス又はコロナウイルスによる感染などの標的疾患／障害を有する、これらのリスクがある、又はこれらを有すると疑われるヒト患者であり得る。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、コロナウイルスによる感染を有し得る又はこれを有すると疑われ得る。いくつかの例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による感染を有する又はこれを有すると疑われるヒト患者である。いくつかの例では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を有する又はこれを有すると疑われるヒト患者である。いくつかの例では、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する又はこれを有すると疑われるヒト患者である。
【0108】
標的疾患／障害のための治療効力は、当該技術分野において周知の方法によって評価され得る。
【0109】
ＩＶ．併用療法
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちの１つ以上を含む本明細書に記載される組成物のうちのいずれかと、本明細書に記載されるものなどの第２の治療剤と、を使用する併用療法もまた、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、これらの薬剤（例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ干渉ＲＮＡ及び抗ウイルス剤）が逐次的な様式で投与されること、すなわち、それぞれの治療剤が異なる時間に投与されること、及びこれらの治療剤、又は薬剤のうちの少なくとも２つが実質的に同時の様式で投与されることを包含する。それぞれの薬剤が逐次的に又は実質的に同時に投与されることは、任意の適切な経路によって影響され得、適切な経路は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、粘膜組織を介する直接吸収、及び肺送達経路を含むが、これらに限定されない。薬剤は、同じ経路によって又は異なる経路によって投与され得る。例えば、第１の薬剤（例えば、本明細書に記載される組成物）は、肺送達経路によって投与され得、第２の薬剤（例えば、抗ウイルス剤）は、静脈内投与され得る。
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）のうちの１つ以上を含む本明細書に記載される組成物のうちのいずれかと、本明細書に記載されるものなどの第２の治療剤と、を使用する併用療法もまた、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、これらの薬剤（例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ干渉ＲＮＡ及び抗ウイルス剤）が逐次的な様式で投与されること、すなわち、それぞれの治療剤が異なる時間に投与されること、及びこれらの治療剤、又は薬剤のうちの少なくとも２つが実質的に同時の様式で投与されることを包含する。それぞれの薬剤が逐次的に又は実質的に同時に投与されることは、任意の適切な経路によって影響され得、適切な経路は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、粘膜組織を介する直接吸収、及び肺送達経路を含むが、これらに限定されない。薬剤は、同じ経路によって又は異なる経路によって投与され得る。例えば、第１の薬剤（例えば、本明細書に記載される組成物）は、肺送達経路によって投与され得、第２の薬剤（例えば、抗ウイルス剤）は、静脈内投与され得る。
【0110】
ウイルス侵入阻害剤、ウイルス非コーティング阻害剤、ウイルス逆転写酵素阻害剤、ウイルスタンパク質合成阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、ウイルスポリメラーゼ阻害剤、ウイルスインテグラーゼ阻害剤、インターフェロン、又はこれらの組み合わせから選択される追加の医薬剤の例。ウイルス侵入阻害剤の例としては、マラビロク、エンフビルチド、イバリズマブ、ホステムサビル、プレリキサフォル、没食子酸エピガロカテキン、ビクリビロク、アプラビロク、マラビロク、トロマンタジン、ニタゾキサニド、ウミフェノビル、及びポドフィロックスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス非コーティング阻害剤の例としては、アマンタジン、リマンタジン、及びプレコナリルが挙げられるが、これらに限定されない。逆転写酵素阻害剤の例としては、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、エンテカビル、トルバダ、ネビラピン、ラルテグラビル、及びテノホビルジソプロキシルが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスプロテアーゼ阻害剤の例としては、ホサンプレナビル、リトナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、インジナビル、サキナビル、サキナビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ロピナビル、リバビリン、ダルナビル、オセルタミビル、及びチプラナビルが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスポリメラーゼ阻害剤の例としては、アマトキシン、リファマイシン、シタラビン、フィダキソマイシン、タゲチトキシン、ホスカルネットナトリウム、イドクスウリジン、ペンシクロビル、ソホスブビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビダラビン、及びレムデシビルが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスインテグラーゼ阻害剤の例としては、ラルテガルビル、エルビテグラビル、ドルテグラビル、ビクテグラビル、及びカボテグラビルが挙げられるが、これらに限定されない。インターフェロンの例としては、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、及びペグインターフェロンアルファ－２ａが挙げられるが、これらに限定されない。
【0111】
いくつかの例では、追加の治療剤は、１つ以上の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、例えば、ＲＥＧＮ１０９３３及びＲＥＧＮ１０９８７を含み得る。他の例では、追加の治療剤は、レムデシビルなどの低分子抗ＳＡＲＳ剤であり得る。更に他の例では、追加の治療剤は、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、又はメチルプレドニゾロン）などのステロイド化合物を含み得る。
【0112】
本明細書で使用される場合、「逐次的な」という用語は、別途指定されない限り、規則的な順序又は順番によって特徴付けられ、例えば、投与計画が組成物及び抗ウイルス剤の投与を含む場合、逐次的な投与計画は、組成物を、抗ウイルス剤の投与前に、同時に、実質的に同時に、又は後に投与することを含み得るが、両方の薬剤は、規則的な順序又は順番で投与されることを意味する。「離す」という用語は、別途指定されない限り、互いに間隔を保つことを意味する。「同時に」という用語は、別途指定されない限り、同時に起こる又は行われること、すなわち、本発明の薬剤が、同時に投与されることを意味する。「実質的に同時に」という用語は、薬剤が、互いに数分以内に（例えば、互いに１０分以内に）投与され、共同投与及び継続的投与を包含することを意図するが、投与が継続的である場合、投与は、短期間（例えば、医療従事者が２つの化合物を別個に投与する時間）のみ時間的に離れていることを意味する。本明細書で使用される場合、同時投与及び実質的に同時投与は、互換的に使用される。逐次的な投与とは、本明細書に記載される薬剤の時間的に離れた投与を指す。
【0113】
併用療法はまた、本明細書に記載される薬剤（例えば、組成物及び抗ウイルス剤）を、他の生物学的活性成分（例えば、異なる抗ウイルス剤）及び非薬物療法と更に組み合わせて投与することを包含することができる。
【0114】
本明細書に記載される組成物と第２の治療剤（例えば、抗ウイルス剤）とのいずれかの組み合わせは、標的疾患を治療するためのいずれかの順序で使用され得ることを理解されたい。本明細書に記載される組み合わせは、いくつかの因子に基づいて選択され得、いくつかの因子は、ウイルス又はウイルス感染に関連する少なくとも１つの症状を阻害する有効性を含むが、これに限定されない。
【0115】
Ｖ．コロナウイルス感染を治療するためのキット
本開示はまた、コロナウイルス感染の治療における使用のためのキットを提供する。このようなキットは、１つ以上の容器を含むことができ、容器は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）又はこのような抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡを含む本明細書に記載される組成物と、任意選択で、本明細書にまた記載される第２の治療剤のうちの１つ以上と、を含む。
本開示はまた、コロナウイルス感染の治療における使用のためのキットを提供する。このようなキットは、１つ以上の容器を含むことができ、容器は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、若しくはＣ１１などの未修飾ｓｉＲＮＡ、又はＣ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、若しくはＣ１０Ｇ３１Ａなどの修飾ｓｉＲＮＡ）又はこのような抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉ＲＮＡを含む本明細書に記載される組成物と、任意選択で、本明細書にまた記載される第２の治療剤のうちの１つ以上と、を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによる使用のための説明書を含むことができる。含まれる説明書は、例えば、ウイルス感染の医学的状態又はウイルス感染の堆積における医学的状態を改善するための、ｓｉＲＮＡ化合物の投与の説明と、任意選択で、第２の治療剤の投与の説明と、を含むことができる。キットは、治療に好適な個体を、この個体が疾患を有する又は疾患のリスクがあるかを同定することに基づいて選択する説明を更に含み得る。尚も他の実施形態では、説明書は、ウイルス感染のリスクがある個体に、本開示の１つ以上の薬剤を投与することの説明を含む。
【0117】
意図された治療効果を達成するためのｓｉＲＮＡ化合物の使用に関する説明書は、概して、意図された治療のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）、又はサブ単位用量であり得る。本発明のキット内に供給される説明書は、典型的には、標識又は添付文書上の書面説明書（例えば、キット内に含まれる紙シート）であるが、機械可読説明書（例えば、磁気若しくは光学記憶ディスク又はＱＲコード上に保持された説明書）もまた、許容される。
【0118】
標識又は添付文書は、組成物が意図された治療的有用性のために使用されることを示し得る。本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実施するための説明書が提供され得る。
【0119】
本発明のキットは、好適な包装内にある。好適な包装は、チャンバ、バイアル、ボトル、ジャー、及び軟包装（例えば、密封Ｍｙｌａｒ又はプラスチックバッグ）などを含むが、これらに限定されない。また、特定のデバイス、例えば、吸入器、ネブライザ、換気装置、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザ）、又は注入デバイス、例えば、ミニポンプと組み合わせて使用するためのパッケージが企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。容器はまた、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。
【0120】
キットは、任意選択で、緩衝液及び解釈情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上若しくは容器に伴う標識又は添付文書と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【0121】
一般的な技法
本開示の実施は、別途示されない限り、（組換え技法を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法を使用し、これらは、当業者の技量の範囲内である。このような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５≫、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４≫、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６≫、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６≫、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献に完全に説明されている。
本開示の実施は、別途示されない限り、（組換え技法を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法を使用し、これらは、当業者の技量の範囲内である。このような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５≫、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４≫、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６≫、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６≫、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献に完全に説明されている。
【0122】
更なる詳細なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に使用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、本開示の残りの部分をなんら限定しない。本明細書に記載される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的で又は主題のために、参照により組み込まれる。
【0123】
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする例示的なｓｉＲＮＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の阻害。
コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の流行は、健康及び経済的負担を伴う世界的大流行に急速に発展している。ＣＯＶＩＤ－１９疾患は、コロナウイルス（ＣｏＶ）科に属する重症呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムは、３０ｋｂの平均サイズを有する非セグメント化ポジティブセンスＲＮＡである。ゲノムの５’末端におけるゲノムの３分の２は、２つのポリタンパク質をコードし、２つのポリタンパク質は、ウイルス複製に不可欠な１６個の非構造タンパク質を含有する。ゲノムの３’末端におけるゲノムの３分の１は、４つの構造タンパク質及びいくつかのアクセサリータンパク質をコードする。
コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の流行は、健康及び経済的負担を伴う世界的大流行に急速に発展している。ＣＯＶＩＤ－１９疾患は、コロナウイルス（ＣｏＶ）科に属する重症呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムは、３０ｋｂの平均サイズを有する非セグメント化ポジティブセンスＲＮＡである。ゲノムの５’末端におけるゲノムの３分の２は、２つのポリタンパク質をコードし、２つのポリタンパク質は、ウイルス複製に不可欠な１６個の非構造タンパク質を含有する。ゲノムの３’末端におけるゲノムの３分の１は、４つの構造タンパク質及びいくつかのアクセサリータンパク質をコードする。
【0124】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介され、ＲＩＳＣは、二本鎖ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を同定及び保持し、相補的ｍＲＮＡ標的を破壊する。したがって、ＲＮＡｉは、ウイルスＲＮＡゲノムを破壊しＲＮＡウイルス複製及びウイルスタンパク質の発現を阻害するのに好適な戦略である。
【0125】
２９７７１個の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列が、２０２０年６月現在、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにあり、これらを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の少なくとも９９％の同一性（高度保存）を示した１９ヌクレオチド伸長について分析した。ＲＮＡ標的アクセシビリティがｓｉＲＮＡ効力に影響するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのＲＮＡ二次構造を評価した。ｓｉＲＮＡ候補の設計及び選択を、以下の基準を考慮して実行した。（１）弱いＲＮＡ二次構造を有する又はＲＮＡ二次構造を有さないＲＮＡ領域を標的とすること、（２）低いオフターゲット可能性、すなわち、ヒトｍＲＮＡデータベースに対する低い交差反応性、及び（３）低い数の、ｓｉＲＮＡ候補によって標的とされると予測される必須遺伝子。ｓｉＲＮＡ候補を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにおける高いカバレッジ、低いオフターゲットレート、及びＲＮＡ二次構造への低い傾向を有する最上位配列から選択した。
【0126】
最上位１１個のｓｉＲＮＡ候補を、更なるインビトロスクリーニング実験のために選択した。これらのｓｉＲＮＡの配列を、以下に列挙する。
【表1】
【0127】
表１に列挙される１１個のｓｉＲＮＡ候補を、合成し、Ｖｅｒｏ細胞において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｓｉＲＮＡ候補の阻害活性についてスクリーニングした。簡潔には、Ｖｅｒｏ細胞を、ｓｉＲＮＡ候補で逆トランスフェクトし、次いで、２４ウェル培養プレート内に播種した。トランスフェクションの２４時間後に、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させた。２４時間の感染後に、全ＲＮＡを、ウイルス感染Ｖｅｒｏ細胞から単離した。ｓｉＲＮＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノムのノックダウンを、Ｅ（エンベロープ）遺伝子を標的とするＲＴ－ｑＰＣＲによって判定した。培養培地中のウイルス力価を、プラークアッセイによって定量化した。それぞれのアッセイの簡潔な説明を、以下で提供する。
【0128】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
全細胞ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ）で抽出した。ウイルスＲＮＡの量を、ウイルスＥ遺伝子の逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して判定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするプライマー及びプローブは、以下のとおりであった。
フォワードプライマー、５’－ＡＣＡＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴ－３’（配列番号６２）、
リバースプライマー、５’－ＡＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ－３’（配列番号６３）、及び
プローブ、５’－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－３’（配列番号６４）。
全細胞ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ）で抽出した。ウイルスＲＮＡの量を、ウイルスＥ遺伝子の逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して判定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするプライマー及びプローブは、以下のとおりであった。
フォワードプライマー、５’－ＡＣＡＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴ－３’（配列番号６２）、
リバースプライマー、５’－ＡＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ－３’（配列番号６３）、及び
プローブ、５’－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－３’（配列番号６４）。
【0129】
部分的なＥ断片を含有するプラスミドを、ウイルス負荷（コピー／μｌ）を計算するための標準として使用した。
【0130】
プラークアッセイ
Ｖｅｒｏ細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中の２４ウェル培養プレート内に播種し、コンフルエントな単層に２４時間成長させた。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、細胞は、段階１０倍希釈のウイルス含有培地を３回接種された。１時間の吸着後に、ウイルス上清を除去した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１％メチルセルロースを含有する培地でオーバーレイし、３～５日間インキュベートした。その後、プレートを、ＰＢＳ中の１０％ホルムアルデヒドで１時間固定し、洗浄してオーバーレイ培地を除去し、０．７％クリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数して、ＰＦＵ／ｍｌとして表されるウイルス力価を計算した。
Ｖｅｒｏ細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中の２４ウェル培養プレート内に播種し、コンフルエントな単層に２４時間成長させた。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、細胞は、段階１０倍希釈のウイルス含有培地を３回接種された。１時間の吸着後に、ウイルス上清を除去した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１％メチルセルロースを含有する培地でオーバーレイし、３～５日間インキュベートした。その後、プレートを、ＰＢＳ中の１０％ホルムアルデヒドで１時間固定し、洗浄してオーバーレイ培地を除去し、０．７％クリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数して、ＰＦＵ／ｍｌとして表されるウイルス力価を計算した。
【0131】
図１に示されるように、この研究において試験された抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｉＲＮＡの全ては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ複製に対するあるレベルの阻害活性を示した。試験されたｓｉＲＮＡのうち、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ１０は、９８％超の阻害活性を示した。図１。
【0132】
以下の表２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする全ての試験された例示的なｓｉＲＮＡの阻害活性を概略する。
【表2】
【0133】
培養培地中のウイルス力価を、上記のプラークアッセイを使用して判定した。図２に示されるように、試験されたｓｉＲＮＡのほとんどは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産生に対する阻害活性を示した。試験されたｓｉＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、及びＣ１１は、Ｖｅｒｏ細胞アッセイから受け取られたデータと一致して、９８％超の阻害活性を示した。
【0134】
要約すると、この研究から得られた結果は、ｓｉＲＮＡ－Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、及びＣ１１を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするｓｉＲＮＡによる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製及び産生の効率的な阻害を実証する。
【0135】
実施例２：広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を標的とする修飾ｓｉＲＮＡの開発及び特徴付け
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス変異体の出現は、ＣＯＶＩＤ－１９大流行の行方を変え、ワクチン戦略の長期的効率についてのある不確実性を生じさせた。広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する新しい治療薬の開発が、不可欠である。この研究は、アルファ、デルタ、ガンマ、及びイプシロンなどの現在優性の変異体株を含む広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体によって引き起こされる感染を阻害するのに有効である強力なｓｉＲＮＡの開発及び同定を目的とする。１つの修飾ｓｉＲＮＡであるＣ６Ｇ２５Ｓを、一例として同定した。Ｃ６Ｇ２５Ｓは、現在のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の９９．８％をカバーし、本明細書に記載される株を含む優性株を、ピコモル範囲のＩＣ５０でインビトロで阻害することが可能であることを、ここに報告する。また、Ｃ６Ｇ２５Ｓは、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおいて、ウイルス関連の広範な肺胞損傷、血管血栓、及び免疫細胞浸潤の有意な防止を伴って、肺内の感染性ビリオンの産生を予防的処置によって完全に阻害することができ、ビリオンの９６．２％を曝露後処置によって減少させることができた。データは、Ｃ６Ｇ２５Ｓを含む、本明細書に開示される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｓｉＲＮＡが、ＣＯＶＩＤ－１９大流行と戦うのに有効な治療剤であることを示唆する。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス変異体の出現は、ＣＯＶＩＤ－１９大流行の行方を変え、ワクチン戦略の長期的効率についてのある不確実性を生じさせた。広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する新しい治療薬の開発が、不可欠である。この研究は、アルファ、デルタ、ガンマ、及びイプシロンなどの現在優性の変異体株を含む広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体によって引き起こされる感染を阻害するのに有効である強力なｓｉＲＮＡの開発及び同定を目的とする。１つの修飾ｓｉＲＮＡであるＣ６Ｇ２５Ｓを、一例として同定した。Ｃ６Ｇ２５Ｓは、現在のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の９９．８％をカバーし、本明細書に記載される株を含む優性株を、ピコモル範囲のＩＣ５０でインビトロで阻害することが可能であることを、ここに報告する。また、Ｃ６Ｇ２５Ｓは、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおいて、ウイルス関連の広範な肺胞損傷、血管血栓、及び免疫細胞浸潤の有意な防止を伴って、肺内の感染性ビリオンの産生を予防的処置によって完全に阻害することができ、ビリオンの９６．２％を曝露後処置によって減少させることができた。データは、Ｃ６Ｇ２５Ｓを含む、本明細書に開示される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ｓｉＲＮＡが、ＣＯＶＩＤ－１９大流行と戦うのに有効な治療剤であることを示唆する。
【0136】
材料及び方法：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ｓｉＲＮＡ選択：
２０２０年６月現在、Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ（ＧＩＳＡＩＤ）のウェブサイトから入手可能な２９，８７１個の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列があった。これらの配列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の少なくとも９９％の同一性（高度保存）を示した１９ヌクレオチド伸長について分析した。ＲＮＡ標的アクセシビリティがｓｉＲＮＡ効力に影響するため、ゲノム全域の硫酸ジメチル配列決定変異プロファイリング（ＤＭＳ－ＭａＰｓｅｑ）（Ｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０，ｄｏｉ：２０２０．０６．２９．１７８３４３）及びＲＮＡｚ（ＲＮＡｚ Ｐ＜０．９）でのインシリコ予測（Ｒａｎｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＲＮＡ ２６：９３７－９５９）によってインビボで分析されたＲＮＡ構造に基づいて、ウイルスＲＮＡ二次構造を評価した。強い二次構造を有するウイルス領域を標的とする配列を除去した（ＲＮＡｚ Ｐ＞０．９）。合計６７４個のｓｉＲＮＡ候補は、９９％超のカバレッジを示し、標的領域は、ＲＮＡ二次構造への低い傾向を有した。本発明者らは、ウイルスリーダー、パパイン様プロテアーゼ、３Ｃ様プロテアーゼ、ＲｄＲＰ、ヘリカーゼ、スパイクタンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードする領域内に位置する候補を、更なるオフターゲット予測及び必須遺伝子標的化のために選択した。オフターゲット効果を、ｂｌａｓｔを介して、ＧＲＣｈ３８参照配列データベースで予測し、候補を、３６以下のオフターゲット遺伝子数で選別した。オフターゲット遺伝子を、細胞生存率へのオフターゲット遺伝子の必須寄与について更に評価した（Ｂｌｏｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０：１０９２－６、Ｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３：１５１５－２６、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０：１０９６－１０１）。候補を、低い数の、ｓｉＲＮＡ候補によって標的とされると予測される必須遺伝子（ｎ≦１）で選択した。最上位１１個のｓｉＲＮＡ候補を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるウイルスＲＮＡノックダウン及びプラーク低減アッセイによる後続のインビトロスクリーニングのために同定した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ｓｉＲＮＡ選択：
２０２０年６月現在、Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ（ＧＩＳＡＩＤ）のウェブサイトから入手可能な２９，８７１個の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列があった。これらの配列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の少なくとも９９％の同一性（高度保存）を示した１９ヌクレオチド伸長について分析した。ＲＮＡ標的アクセシビリティがｓｉＲＮＡ効力に影響するため、ゲノム全域の硫酸ジメチル配列決定変異プロファイリング（ＤＭＳ－ＭａＰｓｅｑ）（Ｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０，ｄｏｉ：２０２０．０６．２９．１７８３４３）及びＲＮＡｚ（ＲＮＡｚ Ｐ＜０．９）でのインシリコ予測（Ｒａｎｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＲＮＡ ２６：９３７－９５９）によってインビボで分析されたＲＮＡ構造に基づいて、ウイルスＲＮＡ二次構造を評価した。強い二次構造を有するウイルス領域を標的とする配列を除去した（ＲＮＡｚ Ｐ＞０．９）。合計６７４個のｓｉＲＮＡ候補は、９９％超のカバレッジを示し、標的領域は、ＲＮＡ二次構造への低い傾向を有した。本発明者らは、ウイルスリーダー、パパイン様プロテアーゼ、３Ｃ様プロテアーゼ、ＲｄＲＰ、ヘリカーゼ、スパイクタンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードする領域内に位置する候補を、更なるオフターゲット予測及び必須遺伝子標的化のために選択した。オフターゲット効果を、ｂｌａｓｔを介して、ＧＲＣｈ３８参照配列データベースで予測し、候補を、３６以下のオフターゲット遺伝子数で選別した。オフターゲット遺伝子を、細胞生存率へのオフターゲット遺伝子の必須寄与について更に評価した（Ｂｌｏｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０：１０９２－６、Ｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３：１５１５－２６、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０：１０９６－１０１）。候補を、低い数の、ｓｉＲＮＡ候補によって標的とされると予測される必須遺伝子（ｎ≦１）で選択した。最上位１１個のｓｉＲＮＡ候補を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるウイルスＲＮＡノックダウン及びプラーク低減アッセイによる後続のインビトロスクリーニングのために同定した。
【0137】
細胞及びウイルス：
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃で５％ＣＯ２で維持した。ヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ－２Ｂを、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者から得られた痰検体を、ウイルス輸送培地中で維持した。検体中のウイルスを、２ｕｇ／ｍＬのトシルスルホニルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）－トリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＤＭＥＭ中のＶｅｒｏ Ｅ６細胞において増殖させた。細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞の７０％超において観察されたときに、培養上清を採取し、ウイルス力価を、プラークアッセイによって判定した。インビトロｓｉＲＮＡスクリーニング及びＩＣ５０判定において使用されたウイルス単離物は、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ１３／２０２０（Ａ．３；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４２２４１５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ４９／２０２０（Ｂ．１．１．７；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０１０７１８）、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ５６／２０２１（Ｂ．１．４２９；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２０３１５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＣＧＭＨ－ＣＧＵ－５３／２０２１（Ｐ．１；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿２２４９４９９）、ｈＣｏＶ１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ９２／２０２１（Ｂ．１．６１７．２；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿３９７９３８７）であった。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの感染において使用されたウイルスは、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０（Ｂ；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９２７）及びｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／１１４４／２０２０（Ｂ．１．６１７．２；ＧＩＳＡＩＤデータベースにアップロードされていない）であった。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃で５％ＣＯ２で維持した。ヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ－２Ｂを、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者から得られた痰検体を、ウイルス輸送培地中で維持した。検体中のウイルスを、２ｕｇ／ｍＬのトシルスルホニルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）－トリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＤＭＥＭ中のＶｅｒｏ Ｅ６細胞において増殖させた。細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞の７０％超において観察されたときに、培養上清を採取し、ウイルス力価を、プラークアッセイによって判定した。インビトロｓｉＲＮＡスクリーニング及びＩＣ５０判定において使用されたウイルス単離物は、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ１３／２０２０（Ａ．３；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４２２４１５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ４９／２０２０（Ｂ．１．１．７；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０１０７１８）、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ５６／２０２１（Ｂ．１．４２９；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２０３１５）、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＣＧＭＨ－ＣＧＵ－５３／２０２１（Ｐ．１；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿２２４９４９９）、ｈＣｏＶ１９／Ｔａｉｗａｎ／ＮＴＵ９２／２０２１（Ｂ．１．６１７．２；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿３９７９３８７）であった。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの感染において使用されたウイルスは、ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０（Ｂ；ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９２７）及びｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／１１４４／２０２０（Ｂ．１．６１７．２；ＧＩＳＡＩＤデータベースにアップロードされていない）であった。
【0138】
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるｓｉＲＮＡスクリーニング：
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、培養培地中で、２×１０５細胞／ｍＬで再懸濁し、以下のとおり、ｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、別個に、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｇｉｂｃｏ）で希釈した。ｓｉＲＮＡ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ混合物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ混合物に添加した。ｓｉＲＮＡ－ＲＮＡｉＭＡＸ混合物（１００ｕＬ）を、室温で１０分間インキュベートした。次いで、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（５００ｕｌ、２×１０５細胞／ｍＬ）を、ｓｉＲＮＡ－ＲＮＡｉＭＡＸ混合物に添加し、２４ウェルプレート内に移した。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、培養培地中で、２×１０５細胞／ｍＬで再懸濁し、以下のとおり、ｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、別個に、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｇｉｂｃｏ）で希釈した。ｓｉＲＮＡ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ混合物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ混合物に添加した。ｓｉＲＮＡ－ＲＮＡｉＭＡＸ混合物（１００ｕＬ）を、室温で１０分間インキュベートした。次いで、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（５００ｕｌ、２×１０５細胞／ｍＬ）を、ｓｉＲＮＡ－ＲＮＡｉＭＡＸ混合物に添加し、２４ウェルプレート内に移した。
【0139】
２４時間のインキュベーション後に、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＶｅｒｏ Ｅ６細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。１時間のインキュベーション後に、接種物を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。新しい培地を、３７℃での２４時間のインキュベーションのために添加した。その後、培養上清を、プラークアッセイのために採取して（Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ３３：１０８２５４）、全細胞ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で抽出して、ウイルスＲＮＡの量を、ウイルスＥ遺伝子の逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して判定した（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするプライマー及びプローブは、以下のとおりであった。フォワードプライマー、５’－ＡＣＡ ＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴ－３’（配列番号６２）、
リバースプライマー、５’－ＡＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ－３’（配列番号６３）、及び
プローブ、５’－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－３’（配列番号６４）。
リバースプライマー、５’－ＡＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ－３’（配列番号６３）、及び
プローブ、５’－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－３’（配列番号６４）。
【0140】
部分的なＥ断片を含有するプラスミドを、ウイルス負荷（コピー／ｕＬ）を計算するための標準として使用した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを伴う全ての作業を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＦｉｒｓｔ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのバイオセイフティレベル－３研究室において実行した。
【0141】
吸入及び鼻腔内滴下を介するｓｉＲＮＡ送達：
ｓｉＲＮＡの吸入送達を、Ａｅｒｏｎｅｂ Ｌａｂ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ Ｕｎｉｔに接続されたポリカーボネートチャンバからなる標準デバイスを使用して、０．４ｍＬ／分で実行した。マウス（ｎ＝５／群）を、チャンバ内に置き、エアロゾルを、予防的処置のための６ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含有する又は曝露後処置のための１２ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含有する１０ｍＬの通常の生理食塩水から、２５分間生成した。マウスを、ｓｉＲＮＡエアロゾルに、チャンバ内で合計３０分間曝露した。鼻腔内投与のために、５０ｕＬのＤ５Ｗ中の５０ｕｇのｓｉＲＮＡを、両方の鼻孔内に滴下した（１鼻孔当たり２５ｕＬ）。吸入を介する肺及び鼻腔内のｓｉＲＮＡの分布及び濃度を分析するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、６ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含有する１０ｍＬの通常の生理食塩水から生成されたｓｉＲＮＡエアロゾルで処置した。チャンバ内のエアロゾルのｓｉＲＮＡ濃度を、以下のとおりに定量化した。エアロゾル試料を、チャンバから、０．５ｍＬの注射器を使用して、エアロゾル生成の１、２、５、１５、及び２５分後に収集し、次いで、１００ｕＬのヌクレアーゼ不含水中に通した。その後、ヌクレアーゼ不含水中のｓｉＲＮＡレベルを、ＯＤ２６０によって判定した。最大ｓｉＲＮＡレベルであるＢｍａｘを計算し、ｍｇ／Ｌ空気エアロゾルとして憤慨した。
ｓｉＲＮＡの吸入送達を、Ａｅｒｏｎｅｂ Ｌａｂ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ Ｕｎｉｔに接続されたポリカーボネートチャンバからなる標準デバイスを使用して、０．４ｍＬ／分で実行した。マウス（ｎ＝５／群）を、チャンバ内に置き、エアロゾルを、予防的処置のための６ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含有する又は曝露後処置のための１２ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含有する１０ｍＬの通常の生理食塩水から、２５分間生成した。マウスを、ｓｉＲＮＡエアロゾルに、チャンバ内で合計３０分間曝露した。鼻腔内投与のために、５０ｕＬのＤ５Ｗ中の５０ｕｇのｓｉＲＮＡを、両方の鼻孔内に滴下した（１鼻孔当たり２５ｕＬ）。吸入を介する肺及び鼻腔内のｓｉＲＮＡの分布及び濃度を分析するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、６ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含有する１０ｍＬの通常の生理食塩水から生成されたｓｉＲＮＡエアロゾルで処置した。チャンバ内のエアロゾルのｓｉＲＮＡ濃度を、以下のとおりに定量化した。エアロゾル試料を、チャンバから、０．５ｍＬの注射器を使用して、エアロゾル生成の１、２、５、１５、及び２５分後に収集し、次いで、１００ｕＬのヌクレアーゼ不含水中に通した。その後、ヌクレアーゼ不含水中のｓｉＲＮＡレベルを、ＯＤ２６０によって判定した。最大ｓｉＲＮＡレベルであるＢｍａｘを計算し、ｍｇ／Ｌ空気エアロゾルとして憤慨した。
【0142】
肺及び鼻粘膜内のｓｉＲＮＡレベルの定量化：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｓｉＲＮＡの肺送達又は鼻腔内滴下後に、異なる時点で屠殺した。肝臓及び鼻粘膜を、秤量し、ＰＢＳ中０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度に、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して４℃でホモジナイズした。ｓｉＲＮＡレベルを、ステムループＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４８：１１８２７－１１８４４）によって定量化した。簡潔には、ホモジナイズされた試料を、９５℃まで１０分間加熱し、短時間にボルテックスし、氷上で１０分間冷却した。得られた組織溶解物を、２０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した後に収集した。アンチセンス特異的ｃＤＮＡを、組織溶解物から、ステムループｃＤＮＡプライマーを使用して生成した：５’－ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＣＡ－３’（配列番号６５）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｓｉＲＮＡの肺送達又は鼻腔内滴下後に、異なる時点で屠殺した。肝臓及び鼻粘膜を、秤量し、ＰＢＳ中０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度に、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して４℃でホモジナイズした。ｓｉＲＮＡレベルを、ステムループＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４８：１１８２７－１１８４４）によって定量化した。簡潔には、ホモジナイズされた試料を、９５℃まで１０分間加熱し、短時間にボルテックスし、氷上で１０分間冷却した。得られた組織溶解物を、２０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した後に収集した。アンチセンス特異的ｃＤＮＡを、組織溶解物から、ステムループｃＤＮＡプライマーを使用して生成した：５’－ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＣＡ－３’（配列番号６５）。
【0143】
ｑＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。
【0144】
フォワードプライマー、５’－ＡＡＧＣＧＣＣＴＡＡＡＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴ－３’（配列番号６６）、
リバースプライマー、５’－ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ－３’（配列番号６７）。
アンチセンス鎖レベルを、合成ｓｉＲＮＡを同じ濃度の対応するナイーブ組織マトリックス中にスパイクすることによって生成された標準曲線を使用して定量化した。
リバースプライマー、５’－ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ－３’（配列番号６７）。
アンチセンス鎖レベルを、合成ｓｉＲＮＡを同じ濃度の対応するナイーブ組織マトリックス中にスパイクすることによって生成された標準曲線を使用して定量化した。
【0145】
Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスのｓｉＲＮＡ処置及びウイルス感染：
８～１６週齢の雄及び雌Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ＭｃＣｒａｙ，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：８１３－２１）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ，ＲＯＣ）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒにおいて同系交配させた。予防的処置のために、ウイルス感染の前に、マウスを、エアロゾル化ｓｉＲＮＡで処置し、その後、３日間毎日のｓｉＲＮＡの鼻腔内滴下で処置した（Ｄ－１～Ｄ－３）。最後のｓｉＲＮＡ処置（Ｄ０）の２４時間後に、マウスを、Ｚｏｌｅｔｉｌ／Ｄｅｘｄｏｍｉｔｏｒで麻酔し、２０ｕＬのＤＭＥＭ中の１０４プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔内感染させ、続いて、Ａｎｔｉｓｅｄａｎを投与した。曝露後処置のために、マウスを、エアロゾル化ｓｉＲＮＡで、Ｄ０及び感染の１日後に処置した。感染の２日後に、感染マウスを屠殺して、肺を収集した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を伴う全ての作業を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔａｉｗａｎ，ＲＯＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおけるバイオセイフティレベル（ＢＳＬ）－３及びＢＳＬ－４研究室において実施した。
８～１６週齢の雄及び雌Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ＭｃＣｒａｙ，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：８１３－２１）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ，ＲＯＣ）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒにおいて同系交配させた。予防的処置のために、ウイルス感染の前に、マウスを、エアロゾル化ｓｉＲＮＡで処置し、その後、３日間毎日のｓｉＲＮＡの鼻腔内滴下で処置した（Ｄ－１～Ｄ－３）。最後のｓｉＲＮＡ処置（Ｄ０）の２４時間後に、マウスを、Ｚｏｌｅｔｉｌ／Ｄｅｘｄｏｍｉｔｏｒで麻酔し、２０ｕＬのＤＭＥＭ中の１０４プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔内感染させ、続いて、Ａｎｔｉｓｅｄａｎを投与した。曝露後処置のために、マウスを、エアロゾル化ｓｉＲＮＡで、Ｄ０及び感染の１日後に処置した。感染の２日後に、感染マウスを屠殺して、肺を収集した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を伴う全ての作業を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔａｉｗａｎ，ＲＯＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおけるバイオセイフティレベル（ＢＳＬ）－３及びＢＳＬ－４研究室において実施した。
【0146】
肺内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ及び感染性ウイルスの定量化：
肺を、ビーズを使用してＰｒｅｃｅｌｌｙｓ組織ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において更にホモジナイズする前に、１×抗生物質－抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）が補充された１ｍＬのＤＭＥＭ中に懸濁した。組織ホモジネートを、１２，０００×ｇで５分間４℃で遠心分離することによって清澄化した。上清を、プラークアッセイによる感染性ウイルスの判定及びＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルスＲＮＡ力価の判定のために収集した。清澄化された肺ホモジネートを、５倍過剰のＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。ＲＮＡを、製造業者の説明書（ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ）に従って抽出した。抽出されたＲＮＡを、１００ｕＬのヌクレアーゼ不含水中に溶解した。ウイルスＲＮＡを、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ Ｐｒｏｂｅ Ｎｏ－ＲＯＸ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＩＯ－７６００５、Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において定量化した。ウイルスＥ遺伝子を標的とするプライマー及びプローブを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した（カタログ番号１０００６８８８、１０００６８９０、１０００６８９３）。ＲＴ－ｑＰＣＲを、２０ｕＬの全容積での、５００ｎｇの全ＲＮＡ、４００ｎＭのそれぞれのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに２００ｎＭのプローブで実行した。サイクリング条件は、以下のとおりであった。１０分間５５℃、３分間９４℃、並びに１５秒間９４℃及び３０秒間５８℃の４５サイクル。ウイルスＲＮＡの量を、ＲＮＡ標準から構築された標準曲線を使用して計算した。清澄化された肺ホモジネート中のウイルス力価を、プラークアッセイを使用して定量化した。簡潔には、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（１．５×１０５細胞／ウェル）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び抗生物質が補充されたＤＭＥＭ中の２４ウェル組織培養プレート内に播種した。１０倍段階希釈されたホモジネートが、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に、３７℃で１時間、時折振盪しながら接種された。上清を除去した後に、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、２％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中の１．５５％メチルセルロースでオーバーレイし、次いで、更に５日間インキュベートした。メチルセルロースオーバーレイを、５日間のインキュベーション後に除去した。細胞を、１０％ホルムアルデヒドで１時間固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数して、肺重量に従ってＰＦＵ／ｇを計算した。
肺を、ビーズを使用してＰｒｅｃｅｌｌｙｓ組織ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において更にホモジナイズする前に、１×抗生物質－抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）が補充された１ｍＬのＤＭＥＭ中に懸濁した。組織ホモジネートを、１２，０００×ｇで５分間４℃で遠心分離することによって清澄化した。上清を、プラークアッセイによる感染性ウイルスの判定及びＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルスＲＮＡ力価の判定のために収集した。清澄化された肺ホモジネートを、５倍過剰のＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。ＲＮＡを、製造業者の説明書（ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ）に従って抽出した。抽出されたＲＮＡを、１００ｕＬのヌクレアーゼ不含水中に溶解した。ウイルスＲＮＡを、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ Ｐｒｏｂｅ Ｎｏ－ＲＯＸ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＩＯ－７６００５、Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において定量化した。ウイルスＥ遺伝子を標的とするプライマー及びプローブを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した（カタログ番号１０００６８８８、１０００６８９０、１０００６８９３）。ＲＴ－ｑＰＣＲを、２０ｕＬの全容積での、５００ｎｇの全ＲＮＡ、４００ｎＭのそれぞれのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに２００ｎＭのプローブで実行した。サイクリング条件は、以下のとおりであった。１０分間５５℃、３分間９４℃、並びに１５秒間９４℃及び３０秒間５８℃の４５サイクル。ウイルスＲＮＡの量を、ＲＮＡ標準から構築された標準曲線を使用して計算した。清澄化された肺ホモジネート中のウイルス力価を、プラークアッセイを使用して定量化した。簡潔には、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（１．５×１０５細胞／ウェル）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び抗生物質が補充されたＤＭＥＭ中の２４ウェル組織培養プレート内に播種した。１０倍段階希釈されたホモジネートが、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に、３７℃で１時間、時折振盪しながら接種された。上清を除去した後に、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、２％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中の１．５５％メチルセルロースでオーバーレイし、次いで、更に５日間インキュベートした。メチルセルロースオーバーレイを、５日間のインキュベーション後に除去した。細胞を、１０％ホルムアルデヒドで１時間固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数して、肺重量に従ってＰＦＵ／ｇを計算した。
【0147】
インサイツハイブリダイゼーション：
肺及び鼻腔を、ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、４ｕｍの厚さで切断した。Ｃ６ ｓｉＲＮＡの局在化を、ｍｉＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｉｎｔｒｏ Ｐａｃｋ ＨＤ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ＲＥＤ－Ｍｍｕ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ［ＡＣＤ］）を使用して、ＡＣＤのホルマリン固定パラフィン包埋組織プロトコルに従って、組織切片中で調査した。Ｃ６ ｓｉＲＮＡの検出のためのプローブを、ＡＣＤによるカスタム合成した。Ｃ６ ｓｉＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルを、Ｆａｓｔ Ｒｅｄによって可視化し、続いて、ヘマトキシリンで対比染色した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＨＤ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ－Ｂｒｏｗｎ（ＡＣＤ）及びＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｖ－ｎＣｏＶ－２０１９－Ｓ（ＡＣＤ）を使用して検出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルを、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）試薬を使用して可視化した。組織切片中のＲＮＡの質を、Ｕ６ ｓｎＲＮＡを標的とするプローブを陽性対照として使用し、スクランブルされたプローブを陰性対照として使用して検証した。全スライド画像を、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＰ２００スライドスキャナ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して取得し、ＨＡＬＯソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して処理した。ＩＳＨシグナルの定量的比較を、ＨＡＬＯソフトウェアを使用して、ＲＮＡｓｃｏｐｅモジュールで分析した。
肺及び鼻腔を、ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、４ｕｍの厚さで切断した。Ｃ６ ｓｉＲＮＡの局在化を、ｍｉＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｉｎｔｒｏ Ｐａｃｋ ＨＤ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ＲＥＤ－Ｍｍｕ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ［ＡＣＤ］）を使用して、ＡＣＤのホルマリン固定パラフィン包埋組織プロトコルに従って、組織切片中で調査した。Ｃ６ ｓｉＲＮＡの検出のためのプローブを、ＡＣＤによるカスタム合成した。Ｃ６ ｓｉＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルを、Ｆａｓｔ Ｒｅｄによって可視化し、続いて、ヘマトキシリンで対比染色した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＨＤ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ－Ｂｒｏｗｎ（ＡＣＤ）及びＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｖ－ｎＣｏＶ－２０１９－Ｓ（ＡＣＤ）を使用して検出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルを、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）試薬を使用して可視化した。組織切片中のＲＮＡの質を、Ｕ６ ｓｎＲＮＡを標的とするプローブを陽性対照として使用し、スクランブルされたプローブを陰性対照として使用して検証した。全スライド画像を、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＰ２００スライドスキャナ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して取得し、ＨＡＬＯソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して処理した。ＩＳＨシグナルの定量的比較を、ＨＡＬＯソフトウェアを使用して、ＲＮＡｓｃｏｐｅモジュールで分析した。
【0148】
免疫組織化学分析：
ホルマリン固定パラフィン包埋された肺切片を、脱脂及び再水和し、抗原回収を、トリスＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９．０）で実行した。切片中の内在性ペルオキシダーゼを、３％過酸化水素でクエンチし、組織を、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｍｏｕｓｅｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って免疫染色した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、好中球、マクロファージ、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を、一次抗体希釈剤（ＳｃｙＴｅｋ）中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）ｓｐｉｋｅ抗体（クローン１Ａ９、Ｇｅｎｅｔｅｘ）、抗ＬＹ－６Ｇ（クローン１Ａ８、ＢＤ）、抗Ｆ４／８０（クローンＲｂ１６７Ｂ３、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び抗ＣＤ８（クローン、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、４℃で一晩インキュベートすることによって検出した。切片を、ＤＡＢ試薬を使用して染色し、ヘマトキシリンで対比染色し、次いで、脱水し、カバースリップの下に載せた。全スライドを、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＰ２００スライドスキャナ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）においてスキャンし、ＨＡＬＯソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して分析した。肺傷害の重症度を、肺胞腔内の好中球の存在、間質腔内の好中球、硝子膜、タンパク質性細片が気腔を満たしていること、及び肺胞中隔肥厚に基づいて、記載される方法（Ｍａｔｕｔｅ－Ｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４４：７２５－３８）に従って評価した。
ホルマリン固定パラフィン包埋された肺切片を、脱脂及び再水和し、抗原回収を、トリスＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９．０）で実行した。切片中の内在性ペルオキシダーゼを、３％過酸化水素でクエンチし、組織を、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｍｏｕｓｅｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って免疫染色した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、好中球、マクロファージ、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を、一次抗体希釈剤（ＳｃｙＴｅｋ）中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）ｓｐｉｋｅ抗体（クローン１Ａ９、Ｇｅｎｅｔｅｘ）、抗ＬＹ－６Ｇ（クローン１Ａ８、ＢＤ）、抗Ｆ４／８０（クローンＲｂ１６７Ｂ３、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び抗ＣＤ８（クローン、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、４℃で一晩インキュベートすることによって検出した。切片を、ＤＡＢ試薬を使用して染色し、ヘマトキシリンで対比染色し、次いで、脱水し、カバースリップの下に載せた。全スライドを、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＰ２００スライドスキャナ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）においてスキャンし、ＨＡＬＯソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して分析した。肺傷害の重症度を、肺胞腔内の好中球の存在、間質腔内の好中球、硝子膜、タンパク質性細片が気腔を満たしていること、及び肺胞中隔肥厚に基づいて、記載される方法（Ｍａｔｕｔｅ－Ｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４４：７２５－３８）に従って評価した。
【0149】
ヒトＰＢＭＣによるサイトカイン放出のインビトロ評価：
健常なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓから、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）の承認（ＩＲＢ Ｎｏ．２０１５２８６９）で得た。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ １６４０培地中で再懸濁した。合計１×１０５個の生存ＰＢＭＣを、９６ウェル培養プレートのそれぞれのウェルに添加した。４時間後に、細胞を、異なる濃度（４０、２０、１０、及び５ｕＭ）のｓｉＲＮＡ、８００ｕｇ／ｍＬのＣｐＧ、及び１００ｕｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で、４０時間処置した。上清中のサイトカインＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－アルファ、及びＩＦＮ－ガンマの濃度を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｓｓａｙ（ＣＢＡ）Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者の説明書に従って定量化した。データを、ＦＡＣＳ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において収集し、ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
健常なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓから、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）の承認（ＩＲＢ Ｎｏ．２０１５２８６９）で得た。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ １６４０培地中で再懸濁した。合計１×１０５個の生存ＰＢＭＣを、９６ウェル培養プレートのそれぞれのウェルに添加した。４時間後に、細胞を、異なる濃度（４０、２０、１０、及び５ｕＭ）のｓｉＲＮＡ、８００ｕｇ／ｍＬのＣｐＧ、及び１００ｕｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で、４０時間処置した。上清中のサイトカインＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－アルファ、及びＩＦＮ－ガンマの濃度を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｓｓａｙ（ＣＢＡ）Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者の説明書に従って定量化した。データを、ＦＡＣＳ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において収集し、ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【0150】
ＲＮＡ－ｓｅｑを使用するゲノムワイドオフターゲット分析：
Ｂｅａｓ－２Ｂ細胞を、５×１０５細胞／ウェルで、６ウェル培養プレート内に播種し、１８時間インキュベートした。次いで、ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（９ｕｌ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、Ｂｅａｓ－２Ｂ細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後に、細胞を、１×ダルベッコＰＢＳで２回洗浄し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で可溶化した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って抽出し、ゲノムＤＮＡ混入を回避するためにデオキシリボヌクレアーゼで処理した。抽出されたＲＮＡの純度（Ａ２６０／Ａ２８０とＡ２６０／Ａ２３０との比）及び質（ＲＩＮ≧８．０）を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して判定した。全ての抽出されたＲＮＡ試料の質は、Ａ２６０／Ａ２８０≧１．９、Ａ２６０／Ａ２３０≧２、及びＲＩＮ＝１０．０であった。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｇｏｌｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において、製造業者の説明書に従って配列決定した。１試料当たり平均８６７０万リードを、２×１５０ｂｐのペアエンド配列決定から得た。生ＲＮＡリードを、ＳｅｑＰｒｅｐ及びＳｉｃｋｌｅを使用して、２０の最小平均質スコアで選別した。選別されたリードを、ＨＩＳＡＴ２を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ．３８．ｐ１３）にアライメントし、次いで、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅを使用してアセンブルした。遺伝子発現レベルを、ＲＳＥＭによって認定し、ＴＰＭ（１００万当たりの転写物）によって正規化した。差次的に発現された遺伝子を、Ｐ≦０．００１について調節されたベンジャミニ－ホッホベルグ偽発見率で、ｓｉＲＮＡ処置群とｓｉＲＮＡ未処置群との間の差異が少なくとも３倍である遺伝子として同定した。オフターゲット遺伝子プロファイルを、下方制御された遺伝子の数及び細胞影響の可能性から評価した。下方制御された遺伝子の発現レベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲによって更に確認した。第一鎖ｃＤＮＡを、Ｍａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び２ｕｇの全細胞ＲＮＡで合成した。ｑＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して実施した。それぞれの試料を、３回アッセイして、平均閾値サイクル（Ｃｔ）値を判定した。遺伝子発現倍率変化を、ΔΔＣｔ法を使用して計算した。それぞれの遺伝子のｍＲＮＡレベルを、恒常的に発現されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した。
Ｂｅａｓ－２Ｂ細胞を、５×１０５細胞／ウェルで、６ウェル培養プレート内に播種し、１８時間インキュベートした。次いで、ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（９ｕｌ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、Ｂｅａｓ－２Ｂ細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後に、細胞を、１×ダルベッコＰＢＳで２回洗浄し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で可溶化した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って抽出し、ゲノムＤＮＡ混入を回避するためにデオキシリボヌクレアーゼで処理した。抽出されたＲＮＡの純度（Ａ２６０／Ａ２８０とＡ２６０／Ａ２３０との比）及び質（ＲＩＮ≧８．０）を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して判定した。全ての抽出されたＲＮＡ試料の質は、Ａ２６０／Ａ２８０≧１．９、Ａ２６０／Ａ２３０≧２、及びＲＩＮ＝１０．０であった。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｇｏｌｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して調製し、ＮｏｖａＳｅｑ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において、製造業者の説明書に従って配列決定した。１試料当たり平均８６７０万リードを、２×１５０ｂｐのペアエンド配列決定から得た。生ＲＮＡリードを、ＳｅｑＰｒｅｐ及びＳｉｃｋｌｅを使用して、２０の最小平均質スコアで選別した。選別されたリードを、ＨＩＳＡＴ２を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ．３８．ｐ１３）にアライメントし、次いで、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅを使用してアセンブルした。遺伝子発現レベルを、ＲＳＥＭによって認定し、ＴＰＭ（１００万当たりの転写物）によって正規化した。差次的に発現された遺伝子を、Ｐ≦０．００１について調節されたベンジャミニ－ホッホベルグ偽発見率で、ｓｉＲＮＡ処置群とｓｉＲＮＡ未処置群との間の差異が少なくとも３倍である遺伝子として同定した。オフターゲット遺伝子プロファイルを、下方制御された遺伝子の数及び細胞影響の可能性から評価した。下方制御された遺伝子の発現レベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲによって更に確認した。第一鎖ｃＤＮＡを、Ｍａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び２ｕｇの全細胞ＲＮＡで合成した。ｑＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して実施した。それぞれの試料を、３回アッセイして、平均閾値サイクル（Ｃｔ）値を判定した。遺伝子発現倍率変化を、ΔΔＣｔ法を使用して計算した。それぞれの遺伝子のｍＲＮＡレベルを、恒常的に発現されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに正規化した。
【0151】
急性及び反復投与毒性研究：
Ｃ６Ｇ２５Ｓの急性毒性を評価するために、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを、ＢｉｏＬＡＳＣＯ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ，ＲＯＣ）から得た。Ｄ５Ｗ中のＣ６Ｇ２５Ｓを、７週齢のラット（１群当たり３匹）に、鼻腔内滴下を介して、２０、４０、又は７５ｍｇ／ｋｇで０．４２ｍｌ／ｋｇの投与量で投与した。次いで、ラットを、７日間観察した。反復投与毒性を、ＢｉｏＬＡＳＣＯから得られた雄Ｂｌｔｗ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスにおいて実施した。Ｃ６Ｇ２５Ｓ（２、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇ）を、８週齢のマウス（１群当たり３匹）に、１４日間毎日鼻腔内滴下した（１．６７ｍＬ／ｋｇ）。研究中に、動物の体重、摂食量、及び全身状態を監視した。それぞれの研究の終了に、臓器及び末梢血を収集した。ラットにおける急性毒性を、臨床徴候、体重及び摂食量、血液学、血液生化学、並びに鼻腔及び肺の顕微鏡的病理学に基づいて評価した。反復投与毒性の評価はまた、心臓、肝臓、脾臓、及び腎臓の顕微鏡的病理学を含んだ。
Ｃ６Ｇ２５Ｓの急性毒性を評価するために、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを、ＢｉｏＬＡＳＣＯ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ，ＲＯＣ）から得た。Ｄ５Ｗ中のＣ６Ｇ２５Ｓを、７週齢のラット（１群当たり３匹）に、鼻腔内滴下を介して、２０、４０、又は７５ｍｇ／ｋｇで０．４２ｍｌ／ｋｇの投与量で投与した。次いで、ラットを、７日間観察した。反復投与毒性を、ＢｉｏＬＡＳＣＯから得られた雄Ｂｌｔｗ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスにおいて実施した。Ｃ６Ｇ２５Ｓ（２、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇ）を、８週齢のマウス（１群当たり３匹）に、１４日間毎日鼻腔内滴下した（１．６７ｍＬ／ｋｇ）。研究中に、動物の体重、摂食量、及び全身状態を監視した。それぞれの研究の終了に、臓器及び末梢血を収集した。ラットにおける急性毒性を、臨床徴候、体重及び摂食量、血液学、血液生化学、並びに鼻腔及び肺の顕微鏡的病理学に基づいて評価した。反復投与毒性の評価はまた、心臓、肝臓、脾臓、及び腎臓の顕微鏡的病理学を含んだ。
【0152】
ＣＣＫ－８細胞毒性アッセイ：
Ｂｅａｓ－２Ｂ細胞を、１．７７×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル培養プレート内に播種し、１８時間インキュベートした。次いで、細胞を、様々な濃度のＣ６Ｇ２５Ｓ（４０、２０、１０、５、及び０ｕＭ）で、３回２４時間処置した。ＣＣＫ－８溶液（１０ｕＬ）を、それぞれのウェルに添加し、細胞を、更に３時間インキュベートした。ＣＣＫ－８溶液のみを有する培地及びＣ６Ｇ２５Ｓを有さない培地は、それぞれ、ブランク及び正常対照として機能した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。相対細胞生存率／細胞毒性を、製造業者の説明書に従って計算した。
Ｂｅａｓ－２Ｂ細胞を、１．７７×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル培養プレート内に播種し、１８時間インキュベートした。次いで、細胞を、様々な濃度のＣ６Ｇ２５Ｓ（４０、２０、１０、５、及び０ｕＭ）で、３回２４時間処置した。ＣＣＫ－８溶液（１０ｕＬ）を、それぞれのウェルに添加し、細胞を、更に３時間インキュベートした。ＣＣＫ－８溶液のみを有する培地及びＣ６Ｇ２５Ｓを有さない培地は、それぞれ、ブランク及び正常対照として機能した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。相対細胞生存率／細胞毒性を、製造業者の説明書に従って計算した。
【0153】
結果
Ｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高度に特異的かつ強力なｓｉＲＮＡの選択及びスクリーニング
コロナウイルスは、全ての既知のＲＮＡウイルスのうちで最も大きいゲノムを有し、２６～３２ｋｂの範囲のゲノムを有する（Ｗｏｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２：１８０４－２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対して高度に強力かつ特異的なｓｉＲＮＡ配列を同定するために、系統的及び包括的選択戦略を適用した。図３Ａに示されるように、選別プロセスは、１９ヌクレオチド伸長の２９，７７１個のヒット配列へのウイルスゲノムのセグメント化から始まった。次に、２９，８７１個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのうち９９．８％超のカバレッジレートを有し、これらの対応する標的領域が二次構造への低い傾向を有する、６７４個のｓｉＲＮＡ候補を選択した（Ｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０，ｄｏｉ：２０２０．０６．２９．１７８３４３、Ｒａｎｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＲＮＡ ２６：９３７－９５９）。ウイルス複製及び感染に関与する重要な遺伝子上のｓｉＲＮＡ結合部位の位置を更に評価して、ウイルスリーダー、パパイン様プロテアーゼ、３Ｃ様プロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ヘリカーゼ、スパイクタンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードする領域内に位置する３７４個を単離した。ヒトトトランスクリプトームへのオフターゲット効果の高い可能性を有するものを除去し、細胞生存率に必須な遺伝子を標的とした後に、最も低い予測されるオフターゲット効果及び高い予測される効力を有する最上位１１個のｓｉＲＮＡを選択し、重要な比較情報を有する詳細配列を、以下の表３に示した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から保護するための選択されたｓｉＲＮＡの有効性を検証した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるインビトロスクリーニングは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ１０が、１０ｎＭの濃度で、ウイルスエンベロープ遺伝子発現及びプラーク形成ビリオン産生の両方の最大９９．９％まで阻害することが可能であることを示した（図３Ｂ～３Ｃ及び表３）。
Ｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高度に特異的かつ強力なｓｉＲＮＡの選択及びスクリーニング
コロナウイルスは、全ての既知のＲＮＡウイルスのうちで最も大きいゲノムを有し、２６～３２ｋｂの範囲のゲノムを有する（Ｗｏｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２：１８０４－２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対して高度に強力かつ特異的なｓｉＲＮＡ配列を同定するために、系統的及び包括的選択戦略を適用した。図３Ａに示されるように、選別プロセスは、１９ヌクレオチド伸長の２９，７７１個のヒット配列へのウイルスゲノムのセグメント化から始まった。次に、２９，８７１個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのうち９９．８％超のカバレッジレートを有し、これらの対応する標的領域が二次構造への低い傾向を有する、６７４個のｓｉＲＮＡ候補を選択した（Ｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０，ｄｏｉ：２０２０．０６．２９．１７８３４３、Ｒａｎｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＲＮＡ ２６：９３７－９５９）。ウイルス複製及び感染に関与する重要な遺伝子上のｓｉＲＮＡ結合部位の位置を更に評価して、ウイルスリーダー、パパイン様プロテアーゼ、３Ｃ様プロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ヘリカーゼ、スパイクタンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードする領域内に位置する３７４個を単離した。ヒトトトランスクリプトームへのオフターゲット効果の高い可能性を有するものを除去し、細胞生存率に必須な遺伝子を標的とした後に、最も低い予測されるオフターゲット効果及び高い予測される効力を有する最上位１１個のｓｉＲＮＡを選択し、重要な比較情報を有する詳細配列を、以下の表３に示した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から保護するための選択されたｓｉＲＮＡの有効性を検証した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるインビトロスクリーニングは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ１０が、１０ｎＭの濃度で、ウイルスエンベロープ遺伝子発現及びプラーク形成ビリオン産生の両方の最大９９．９％まで阻害することが可能であることを示した（図３Ｂ～３Ｃ及び表３）。
【表3】
【0154】
表３に列挙される１１個のｓｉＲＮＡ候補の開始部位及び末端部位、並びにｓｉＲＮＡ候補によって直接標的とされる位置する遺伝子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の参照ゲノムＮＣ＿０４５５１２．２に基づく。カバレッジレートを、Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ（ＧＩＳＡＩＤ）ウェブサイトからの２９，８７１個の全ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を使用することによって計算した。二次構造予測のために、非構造化領域として確認された標的部位を、なしと標識した（Ｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０，ｄｏｉ：２０２０．０６．２９．１７８３４３、Ｒａｎｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＲＮＡ ２６：９３７－９５９）。ＲＮＡｚ Ｐ＜０．９を有する部位を、二次構造を形成する傾向を有すると予測し、弱いと標識した。高い抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２効力について選択された候補を、太字で標識した。
【0155】
ウイルスゲノム上のＣ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ１０の標的部位を、上記の表３に列挙した。次いで、Ｃ６、Ｃ８、及びＣ１０を、以下の表４に示されるように、ヌクレアーゼ保護のための２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、及びホスホロチオエート（ＰＳ）置換によって、Ｃ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、及びＣ１０Ｇ３１Ａに完全に修飾した（Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒ ５：１０１）。
【表4】
【0156】
Ｃ６Ｇ２５Ｓ、Ｃ８Ｇ２５Ｓ、及びＣ１０Ｇ３１についての最大半減阻害濃度（ＩＣ５０）を、それぞれ、０．１７、１．２５、及び０．９４ｎＭとして判定した。Ｃ６Ｇ２５Ｓを、後続のインビトロ及びインビボ実験のために、Ｃ６Ｇ２５Ｓの最も低いＩＣ５０値及びインシリコで予測されるオフターゲット遺伝子の数について選択した。
【0157】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用する全トランスクリプトーム分析は、Ｃ６の修飾が、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞におけるオフターゲット遺伝子の合計数を２１から１５に低減したことを示した。１５個のオフターゲット遺伝子を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって更に検証し、ＣＸＣＬ５、ＲＥＥＰ３、ＳＧＰＰ１、及びＡＲＴＮを含む４つの遺伝子のみが、真のオフターゲット遺伝子であることを確認した（表４）。いずれも、細胞の生存に必須であると既知ではなく、これは、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、安全かつ高度に特異的なｓｉＲＮＡ候補であることを実証する。更に、Ｃ６Ｇ２５Ｓの主要なオフターゲット遺伝子であるＣＸＣＬ５は、肺上皮細胞によって分泌される走化性因子であり、好中球浸潤及び急性肺傷害の誘導によるＣＯＶＩＤ－１９関連病因において参加的役割を有し（Ｎｏｕａｉｌｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２４：１２６８－８２）、ＣＯＶＩＤ－１９関連病因において参加的役割を有する（Ｔｏｍａｒ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｃｅｌｌｓ ９）。このデータは、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、同時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害することができかつ重症疾病のリスクを低減することができる固有の二重効果を有し得ることを示唆する。
【0158】
また、Ｃ６Ｇ２５Ｓ及び非修飾Ｃ６は、ウイルスエンベロープ遺伝子の阻害について同様のＩＣ５０（それぞれ、０．１７及び０．１８ｎＭ）を有することが見出された（図３Ｄ）。また、Ｃ６Ｇ２５Ｓについての直接標的であるＲｄＲｐの発現を分析し、０．１３ｎＭのＩＣ５０と判明した（図３Ｅ）。これらのデータは、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の阻害においてピコモル範囲のＩＣ５０を有する高度に強力なｓｉＲＮＡであったことを示唆し、低いオフターゲット特性は、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、治療的使用に有益であるより良好な安全性プロファイルを有し得ることを意味する。
【表5】
【0159】
表５は、Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置Ｂｅａｓ－２Ｂ細胞（１０ｎＭのＣ６Ｇ２５Ｓ）において、下方制御された遺伝子が、ｓｉＲＮＡを有さない対照と比較して、ＲＮＡ－ｓｅｑの発現レベルである１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）に基づく阻害％で提示して、３以上の倍率変化を有することを示す。ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲによって確認し、ＧＡＰＤＨ参照遺伝子に正規化した。
【0160】
ＩＩ．Ｃ６Ｇ２５ＳによるインビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数の株の阻害
Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎのウェブサイトによれば、２０２１年８月１７日現在、アルファ（Ｂ．１．１．７）、ベータ（Ｂ．１．３５１）、ガンマ（Ｐ．１）、及びデルタ（Ｂ．１．６１７．２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の懸念される変異体（ＶＯＣ）として認識されており、エータ（Ｂ．１．５２５）、イオタ（Ｂ．１．５２６）、カッパ（Ｂ．１．６１７．１）、及びラムダ（Ｃ．３７）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の注目すべき変異体（ＶＯＩ）として認識されている。
Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎのウェブサイトによれば、２０２１年８月１７日現在、アルファ（Ｂ．１．１．７）、ベータ（Ｂ．１．３５１）、ガンマ（Ｐ．１）、及びデルタ（Ｂ．１．６１７．２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の懸念される変異体（ＶＯＣ）として認識されており、エータ（Ｂ．１．５２５）、イオタ（Ｂ．１．５２６）、カッパ（Ｂ．１．６１７．１）、及びラムダ（Ｃ．３７）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の注目すべき変異体（ＶＯＩ）として認識されている。
【0161】
図４Ａ～４Ｂに提示されるデータは、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、アルファ、ガンマ、デルタ、及びイプシロンを含む複数の変異体に、ピコモル範囲のＩＣ５０で取り組むことができることを示す。また、Ｃ６Ｇ２５Ｓ標的部位における９番目のヌクレオチドに位置するいくつかのアルファ変異体のＣからＵへのトランスバージョンは、ｓｉＲＮＡ認識によって許容され（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７：７５６０－９）、依然として、Ｃ６Ｇ２５Ｓによって、０．４６ｎＭのＩＣ５０で阻害され得る（図４Ｂ、左上）。
【0162】
Ｃ６候補を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への変異を有さない高度保存領域を標的とするように設計した。図５Ａの上部は、Ｃ６の位置、並びにＶＯＣ、ＶＯＩ、及び上記で列挙される他の株の遺伝子マップを提示する。図４Ａの下部は、ＯＲＦ１ｂの前セクションに位置する、Ｃ６とＲｄＲｐとの配列アライメントを示す。図４Ｂで観察されるように、Ｃ６Ｇ２５Ｓは、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体を有意に阻害することが可能であり、アルファ変異体について０．４６ｎＭのＩＣ５０、ガンマについて０．５ｎＭのＩＣ５０、デルタについて０．０９ｎＭのＩＣ５０、及びイプシロン変異体について０．７３ｎＭのＩＣ５０で阻害することが可能である。これらのデータは、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、ウイルスＲｄＲｐ遺伝子の高度保存領域を標的とすることができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数の株を抑制するのに高度に有効な治療剤であることを実証する。
【0163】
ＩＩＩ．Ｃ６Ｇ２５Ｓの肺投与経路のインビボ評価。
次に、ｓｉＲＮＡ担体、例えば、ウイルス様粒子、脂質ナノ粒子、及び細胞透過性ペプチドが有害な免疫刺激又は細胞毒性を引き起こし得る（Ｆａｒｋｈａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０：８７－９５、Ｓｌｕｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １５４：１２３－３０、Ｖａｎｇａｓｓｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ ２３：３８５－９５、Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ９６：１５１－７）ことを考慮して、鼻腔内滴下（ＩＮ）又はエアロゾル吸入（ＡＩ）を介するＣ６Ｇ２５Ｓの直接送達を実施した。更に、ＩＮ又はＡＩを介するネイキッドｓｉＲＮＡ送達は、非ヒト霊長類（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：９４４－５１）及びヒト（ＤｅＶｉｎｃｅｎｚｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：８８００－５、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３５：２１３－２１）を含む異なる動物種（Ｂｉｔｚｏ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：５０－５、Ｋａｎｄｉｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ １０：２０３－２０６、Ｚａｆｒａ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９１９９６）の肺において特異的遺伝子をノックダウンする又はウイルス感染を阻害するために広く適用されている。
次に、ｓｉＲＮＡ担体、例えば、ウイルス様粒子、脂質ナノ粒子、及び細胞透過性ペプチドが有害な免疫刺激又は細胞毒性を引き起こし得る（Ｆａｒｋｈａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０：８７－９５、Ｓｌｕｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １５４：１２３－３０、Ｖａｎｇａｓｓｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ ２３：３８５－９５、Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ９６：１５１－７）ことを考慮して、鼻腔内滴下（ＩＮ）又はエアロゾル吸入（ＡＩ）を介するＣ６Ｇ２５Ｓの直接送達を実施した。更に、ＩＮ又はＡＩを介するネイキッドｓｉＲＮＡ送達は、非ヒト霊長類（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：９４４－５１）及びヒト（ＤｅＶｉｎｃｅｎｚｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：８８００－５、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３５：２１３－２１）を含む異なる動物種（Ｂｉｔｚｏ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：５０－５、Ｋａｎｄｉｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ １０：２０３－２０６、Ｚａｆｒａ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９１９９６）の肺において特異的遺伝子をノックダウンする又はウイルス感染を阻害するために広く適用されている。
【0164】
ＩＮ又はＡＩが肺へのＣ６Ｇ２５Ｓの均等な分布を提供することができるかを評価するために、ＩＮ又はＡＩのいずれかによってＣ６Ｇ２５Ｓに曝露されたマウスを、人道的に屠殺し、マウスの肺を、Ｃ６Ｇ２５Ｓ特異的プローブでのインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）のために収集した。ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、ＡＩ群のマウスの気管支、細気管支、及び肺胞全体にわたって均等に分布している（図５Ａ）ことを示したが、不均等な分布が、ＩＮ群のマウスの肺内で観察された（図５Ｂ）。Ｃ６Ｇ２５Ｓ未処置マウスからの肺は、陰性対照として機能した（図５Ｃ）。また、ＡＩ群のＣ６Ｇ２５Ｓプローブ染色陽性細胞は、ＩＮ群のＣ６Ｇ２５Ｓプローブ染色陽性細胞と比較して、２倍多かった（図５Ｄ）。これらのデータは、エアロゾル吸入によって、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、鼻腔内滴下よりも、全肺全体にわたって均等にかつ効率的に分布することができることを示した。
【0165】
空気試料を、吸入チェンバから、エアロゾル生成中に様々な時点で収集して、ＡＩによって沈着したＣ６Ｇ２５Ｓの用量、及びＣ６Ｇ２５Ｓ濃度を計算した。チェンバ内のＣ６Ｇ２５Ｓ濃度は、２分以内に最大に達し、１．４８ｍｇ／Ｌに維持された（図６Ａ）。ＩＮ及びＡＩによって送達されたＣ６Ｇ２５Ｓの沈着を判定するために、Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置マウスからの鼻腔及び全肺を収集して、Ｃ６Ｇ２５Ｓの分布を、ステムループ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって定量化した。Ｃ６Ｇ２５ＳがＡＩによって送達されたときに、肺内のＣ６Ｇ２５Ｓ濃度は、鼻腔内のＣ６Ｇ２５Ｓ濃度よりも５．８倍高かった（図５Ｅ）。対照的に、Ｃ６Ｇ２５ＳがＩＮによって送達されたときに、同様の濃度が、鼻腔及び肺内で検出されたが、肺内のｓｉＲＮＡレベルの有意な変動が観察された（図５Ｆ）。肺及び鼻腔内のＣ６Ｇ２５Ｓの排出速度を、ＡＩ及びＩＮ処置後のマウスについて、異なる時点で定量化し、鼻腔及び肺組織の両方内のＣ６Ｇ２５Ｓの急速な減少が、２４時間以内に観察された（図６Ｂ及び図６Ｃ）。これらの知見は、ＩＮとＡＩとの組み合わせが、完全なかつ安定した予防的保護を達成する利点を有し得ることを示唆する。
【0166】
ＩＶ．Ｃ６Ｇ２５Ｓの予防的及び曝露後処置。
Ｃ６Ｇ２５Ｓがインビボで保護的であるかを判定するために、Ｃ６Ｇ２５Ｓの予防的又は曝露後投与を受け取ったＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを、動物モデルとして使用した。以前の研究（Ｗｉｎｋｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２７－１３３５）基づく感染後２日目（ｄｐｉ）のウイルス定量化を、最初に評価した。ウイルスＲＮＡコピーは、予防群において９９．９５％低減され（図７Ａ、左パネル）、曝露後群において９６．２％低減された（図７Ｂ、左パネル）。プラーク形成ビリオンは、予防群において検出されず（図７Ａ、右パネル）、感染性ビリオンの有意な９６％減少が、曝露後群において観察された（図７Ｂ、右パネル）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ変異体が、世界的に普及しており、ワクチンブレイクスルー症例の原因となっていることを考慮して、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおけるこの特定の変異体へのＣ６Ｇ２５Ｓの治療効果を、この実施例で探求した。Ｃ６Ｇ２５Ｓでの感染マウスの予防的処置は、対照群のものと比較して、肺内で、ウイルスＲＮＡの９８．３％低減をもたらし（図７Ｃ、左パネル）、検出可能な感染性ビリオンはなかった（図７Ｃ、右パネル）。デルタ変異体感染後の２回投与及び３回投与のＣ６Ｇ２５Ｓ処置を含む２つの曝露後群を試験した。ウイルスＲＮＡの有意な７２％及び８８％阻害が、それぞれ、２回投与群及び３回投与群について観察された（図７Ｄ、左パネル）。また、感染性ビリオンの同様の低減が示され、２回投与について９０．５％低減、３回投与群について９２．７％低減が示された（図７Ｄ、右パネル）。このデータは、Ｃ６Ｇ２５Ｓの肺送達が、予防的及び曝露後処置の両方において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ変異体に対して強い抗ウイルス活性をインビボで有することを実証する。
Ｃ６Ｇ２５Ｓがインビボで保護的であるかを判定するために、Ｃ６Ｇ２５Ｓの予防的又は曝露後投与を受け取ったＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを、動物モデルとして使用した。以前の研究（Ｗｉｎｋｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２７－１３３５）基づく感染後２日目（ｄｐｉ）のウイルス定量化を、最初に評価した。ウイルスＲＮＡコピーは、予防群において９９．９５％低減され（図７Ａ、左パネル）、曝露後群において９６．２％低減された（図７Ｂ、左パネル）。プラーク形成ビリオンは、予防群において検出されず（図７Ａ、右パネル）、感染性ビリオンの有意な９６％減少が、曝露後群において観察された（図７Ｂ、右パネル）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ変異体が、世界的に普及しており、ワクチンブレイクスルー症例の原因となっていることを考慮して、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおけるこの特定の変異体へのＣ６Ｇ２５Ｓの治療効果を、この実施例で探求した。Ｃ６Ｇ２５Ｓでの感染マウスの予防的処置は、対照群のものと比較して、肺内で、ウイルスＲＮＡの９８．３％低減をもたらし（図７Ｃ、左パネル）、検出可能な感染性ビリオンはなかった（図７Ｃ、右パネル）。デルタ変異体感染後の２回投与及び３回投与のＣ６Ｇ２５Ｓ処置を含む２つの曝露後群を試験した。ウイルスＲＮＡの有意な７２％及び８８％阻害が、それぞれ、２回投与群及び３回投与群について観察された（図７Ｄ、左パネル）。また、感染性ビリオンの同様の低減が示され、２回投与について９０．５％低減、３回投与群について９２．７％低減が示された（図７Ｄ、右パネル）。このデータは、Ｃ６Ｇ２５Ｓの肺送達が、予防的及び曝露後処置の両方において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ変異体に対して強い抗ウイルス活性をインビボで有することを実証する。
【0167】
Ｖ．Ｃ６Ｇ２５Ｓによるスパイクタンパク質発現の阻害。
Ｃ６Ｇ２５Ｓ未処置の感染したＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスからの肺を、収集し、ミクロトーム上で切片化した。免疫組織化学は、気管支、細気管支、及び肺胞全体にわたるスパイクタンパク質の過剰発現を実証した。また、肺細胞増殖、肺胞内の空腔の喪失（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０２０ａ，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ５７：１０２８３３）、合胞体多核細胞の形成（Ｂｕｓｓａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ６１：１０３１０４）、及び血栓症（Ｂｕｓｓａｎｉ，ｅｔａｌ．，２０２０，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ６１：１０３１０４）を含む、ＣＯＶＩＤ－１９の病理学的特徴が観察された。対照的に、予防的Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置マウスからの肺組織は、スパイクタンパク質発現及びＣＯＶＩＤ－１９関連病理学的特徴の有意な低減を示した。
Ｃ６Ｇ２５Ｓ未処置の感染したＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスからの肺を、収集し、ミクロトーム上で切片化した。免疫組織化学は、気管支、細気管支、及び肺胞全体にわたるスパイクタンパク質の過剰発現を実証した。また、肺細胞増殖、肺胞内の空腔の喪失（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０２０ａ，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ５７：１０２８３３）、合胞体多核細胞の形成（Ｂｕｓｓａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ６１：１０３１０４）、及び血栓症（Ｂｕｓｓａｎｉ，ｅｔａｌ．，２０２０，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ６１：１０３１０４）を含む、ＣＯＶＩＤ－１９の病理学的特徴が観察された。対照的に、予防的Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置マウスからの肺組織は、スパイクタンパク質発現及びＣＯＶＩＤ－１９関連病理学的特徴の有意な低減を示した。
【0168】
更に、ＩＳＨによるウイルスＲＮＡの有意な減少もまた、Ｃ６Ｇ２５Ｓ予防的処置後に観察され、それぞれのウイルスＲＮＡシグナルを、定量化し、図８Ａに示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、好中球（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０２０ｂ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：２０６３）、リンパ球（Ｐｕｚｙｒｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｐａｔｈｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ ２２０：１５３３８０）、及びマクロファージ（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０２０ａ，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ５７：１０２８３３）の浸潤を誘導し、急性肺炎症が、Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置によって緩和され得るかを判定するために、未処置及び処置マウスからの肺組織を、抗Ｌｙ６Ｇ（好中球）、抗Ｆ４／８０（マクロファージ）、及び抗ＣＤ３（リンパ球）を使用して更に染色した。好中球、マクロファージ、及びリンパ球の浸潤が、感染マウスの肺内で観察されたが、Ｃ６Ｇ２５Ｓで処置すると、免疫細胞浸潤の有意な減少が観察された。浸潤した免疫細胞面積対全切片面積の比を、判定し、対照群に正規化した。好中球、マクロファージ、及びＣＤ３＋リンパ球面積の陽染性面積は、それぞれ、Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置によって、７８．２％、４６．９％、及び６２．４％低減した（図８Ｂ）。肺傷害を、２０１１年にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙによって発表されたスコアリングシステム（
Ｍａｔｕｔｅ－Ｂｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４４：７２５－３８）を使用して評価した。Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置は、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連肺傷害を有意に低減した（図８Ｃ）。
Ｍａｔｕｔｅ－Ｂｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４４：７２５－３８）を使用して評価した。Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置は、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連肺傷害を有意に低減した（図８Ｃ）。
【0169】
ＶＩ．Ｃ６Ｇ２５Ｓの非免疫原性。
Ｃ６Ｇ２５Ｓの臨床的有用性を判定するために、ヒト末梢血単核細胞を、１０ｕＭのＣ６Ｇ２５Ｓと共培養し、インターロイキン（ＩＬ）－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、腫瘍壊死因子－アルファ、及びインターフェロン－ガンマなどのサイトカインは、有意に誘導されなかった（図９）。加えて、正常な気管支上皮からのヒト細胞株であるＢＥＡＳ－２Ｂを、細胞毒性アッセイにおいて、より高い濃度のＣ６Ｇ２５Ｓに曝露し、サイトカイン誘導は観察されなかった（図１０）。結果は、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、ヒト免疫細胞に対して免疫原性でないことを示す。
Ｃ６Ｇ２５Ｓの臨床的有用性を判定するために、ヒト末梢血単核細胞を、１０ｕＭのＣ６Ｇ２５Ｓと共培養し、インターロイキン（ＩＬ）－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、腫瘍壊死因子－アルファ、及びインターフェロン－ガンマなどのサイトカインは、有意に誘導されなかった（図９）。加えて、正常な気管支上皮からのヒト細胞株であるＢＥＡＳ－２Ｂを、細胞毒性アッセイにおいて、より高い濃度のＣ６Ｇ２５Ｓに曝露し、サイトカイン誘導は観察されなかった（図１０）。結果は、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、ヒト免疫細胞に対して免疫原性でないことを示す。
【0170】
ＶＩＩ．単回投与及び複数回投与毒性研究
インビボでのＣ６Ｇ２５Ｓの有害作用の可能性を判定するために、単回投与毒性研究を、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、最大７５ｍｇ／ｋｇまでの単一用量で実施し、１４日間の反復投与研究を、マウスにおいて、最大５０ｍｇ／ｋｇまでの１日用量で実施した。
インビボでのＣ６Ｇ２５Ｓの有害作用の可能性を判定するために、単回投与毒性研究を、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、最大７５ｍｇ／ｋｇまでの単一用量で実施し、１４日間の反復投与研究を、マウスにおいて、最大５０ｍｇ／ｋｇまでの１日用量で実施した。
【0171】
【0172】
【0173】
表６は、単一用量のＣ６Ｇ２５Ｓで鼻腔内滴下によって処置され、血液細胞が処置後７日目に収集されたラット（ｎ＝３）における組織病理学研究を示す。鼻及び肺内の病理学的変化を評価した。重症度類別スキーム：１＝最小（＜１０％）２＝軽度（１０～３９％）３＝中等度（４０～７９％）４＝著明（８０～１００％）。異常が見出されない場合を、「－」と標識する。
【0174】
表７は、単一用量のＣ６Ｇ２５Ｓで鼻腔内滴下によって処置され、血液細胞が処置後７日目に収集されたラット（ｎ＝３）における血液学研究を示す。対照群（緩衝液単独）を１～３と標識し、２０ｍｇ／ｋｇ処置群を４～６と標識し、４０ｍｇ／ｋｇ処置群を７～９と標識し、７５ｍｇ／ｋｇ処置群を１０～１２と標識した。ＲＢＣ、１マイクロリットル当たり１００万個でのＲＢＣ数；ＨＧＢ、ヘモグロビン；ＨＣＴ、ヘマトクリット；ＭＣＶ、平均赤血球容積；ＭＣＨＣ、平均赤血球ヘモグロビン濃度；ＲＤＷ－ＳＤ、ＲＢＣ分布幅標準偏差；ＲＤＷ－ＣＶ、変動係数でのＲＢＣ分布幅；ＲＥＴ、網赤血球当量；ＰＬＴ、血小板数；ＰＤＷ、血小板分布幅；ＷＢＣ、白血球；ＮＥＵＴ、好中球；ＬＹＭＰＨ、リンパ球；ＭＯＮＯ、単球；ＥＯ、好酸球；ＢＡＳＯ、好塩基球。
【0175】
表８は、単一用量のＣ６Ｇ２５Ｓで鼻腔内滴下によって処置され、血清が処置後７日目に収集されたラット（ｎ＝３）における血清の分析を示す。対照群（緩衝液単独）を１～３と標識し、２０ｍｇ／ｋｇ処置群を４～６と標識し、４０ｍｇ／ｋｇ処置群を７～９と標識し、７５ｍｇ／ｋｇ処置群を１０～１２と標識した。ＡＳＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＢＵＮ、血中尿素窒素；ＣＲＥＡ、クレアチニン。
【0176】
組織病理学、血液学、及び血液生化学的分析により、１４日間の反復投与毒性研究において異常がないことが判明された。結果を、以下の表９～１１で提供する。また、図１１Ｂを参照されたい。
【表9】
【表10】
【表11】
【0177】
表９は、２、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇのＣ６Ｇ２５Ｓが１日１回１４日間鼻腔内投与され、組織病理学研究のために乱切されたマウス（ｎ＝３）における組織病理学研究を示す。対照群をＡ２、Ａ３、Ａ１１と標識し、２ｍｇ／ｋｇ処置群をＢ１、Ｂ９、Ｂ１２と標識し、１０ｍｇ／ｋｇ処置群をＣ４、Ｃ８、Ｃ１４と標識し、５０ｍｇ／ｋｇ処置群をＤ１６、Ｄ２１、Ｄ２５と標識した。重症度類別スキーム：１＝最小（＜１０％）、２＝軽度（１０～３９％）、３＝中等度（４０～７９％）、４＝著明（８０～１００％）。異常が見出されない場合を、「－」と標識する。
【0178】
表１０は、２、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇのＣ６Ｇ２５Ｓが１日１回１４日間鼻腔内投与され、血液が血液細胞分析のために収集されたマウス（ｎ＝３）における血液細胞分析研究を示す。対照群をＡ２、Ａ３、Ａ１１と標識し、２ｍｇ／ｋｇ処置群をＢ１、Ｂ９、Ｂ１２と標識し、１０ｍｇ／ｋｇ処置群をＣ４、Ｃ８、Ｃ１４と標識し、５０ｍｇ／ｋｇ処置群をＤ１６、Ｄ２１、Ｄ２５と標識した。ＲＢＣ、１マイクロリットル当たり１００万個でのＲＢＣ数；ＨＧＢ、ヘモグロビン；ＨＣＴ、ヘマトクリット；ＭＣＶ、平均赤血球容積；ＭＣＨＣ、平均赤血球ヘモグロビン濃度；ＲＤＷ－ＳＤ、ＲＢＣ分布幅標準偏差；ＲＤＷ－ＣＶ、変動係数でのＲＢＣ分布幅；ＲＥＴ、網赤血球当量；ＰＬＴ、血小板数；ＰＤＷ、血小板分布幅；ＷＢＣ、白血球；ＮＥＵＴ、好中球；ＬＹＭＰＨ、リンパ球；ＭＯＮＯ、単球；ＥＯ、好酸球；ＢＡＳＯ、好塩基球。
【0179】
表１１は、２、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇのＣ６Ｇ２５Ｓが１日１回１４日間鼻腔内投与され、血清が分析のために収集されたマウス（ｎ＝３）の血清分析を示す。対照群をＡ２、Ａ３、Ａ１１と標識し、２ｍｇ／ｋｇ処置群をＢ１、Ｂ９、Ｂ１２と標識し、１０ｍｇ／ｋｇ処置群をＣ４、Ｃ８、Ｃ１４と標識し、５０ｍｇ／ｋｇ処置群をＤ１６、Ｄ２１、Ｄ２５と標識した。ＡＳＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＢＵＮ、血中尿素窒素；ＣＲＥＡ、クレアチニン。インデックス：Ｈ＝溶血、Ｌ＝脂肪血症、Ｆ＝フィブリン、Ｎ／Ａ＝異常は観察されない。ＣＲＥＡ：線形範囲は、０．２～２５ｍｇ／ｄＬであり、線形範囲未満を、＜０．２０ｍｇ／ｄＬとして提示する。
【0180】
ＶＩＩＩ．Ｃ６Ｇ２５Ｓの治療効果。
図４Ａに示されるように、Ｃ６Ｇ２５Ｓは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２の高度保存ＲｄＲｐ領域を標的とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２感染の阻害におけるＣ６Ｇ２５Ｓの潜在的な作用機序を、図１２に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、宿主細胞上のＡＣＥ２受容体に結合し、エンドサイトーシスを誘導する。ＴＭＰＲＳＳ２によるウイルススパイクタンパク質の切断は、膜融合を誘発し、ウイルスセンス（＋）ＲＮＡゲノムが放出されて、宿主のリボソームをハイジャックして、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを産生し複製する。一方、サブゲノム転写及び翻訳は、大量のウイルス構造タンパク質、例えば、ヌクレオカプシド、スパイク、膜、及びエンベロープを産生する。子孫ウイルスが集合し、成熟ビリオンが、エキソサイトーシスによって放出される。Ｃ６Ｇ２５Ｓは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体と相互作用して、ウイルスゲノムのＲＮＡ及びポリメラーゼｍＲＮＡを、ＲＮＡｉ効果を介して消化することができる。ウイルスゲノム及びポリメラーゼｍＲＮＡのコピー数を低減することによって、ウイルスの複製サイクルに関与する後続のステップが、間接的に阻害され、それによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を停止する。
図４Ａに示されるように、Ｃ６Ｇ２５Ｓは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２の高度保存ＲｄＲｐ領域を標的とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１／２感染の阻害におけるＣ６Ｇ２５Ｓの潜在的な作用機序を、図１２に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、宿主細胞上のＡＣＥ２受容体に結合し、エンドサイトーシスを誘導する。ＴＭＰＲＳＳ２によるウイルススパイクタンパク質の切断は、膜融合を誘発し、ウイルスセンス（＋）ＲＮＡゲノムが放出されて、宿主のリボソームをハイジャックして、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを産生し複製する。一方、サブゲノム転写及び翻訳は、大量のウイルス構造タンパク質、例えば、ヌクレオカプシド、スパイク、膜、及びエンベロープを産生する。子孫ウイルスが集合し、成熟ビリオンが、エキソサイトーシスによって放出される。Ｃ６Ｇ２５Ｓは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体と相互作用して、ウイルスゲノムのＲＮＡ及びポリメラーゼｍＲＮＡを、ＲＮＡｉ効果を介して消化することができる。ウイルスゲノム及びポリメラーゼｍＲＮＡのコピー数を低減することによって、ウイルスの複製サイクルに関与する後続のステップが、間接的に阻害され、それによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を停止する。
【0181】
興味深いことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害することが報告されている（Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ ６：５４）天然マイクロＲＮＡであるｍｉＲ－２９１１は、Ｃ６と重複する予測される標的部位を有する（図１３Ａ）が、ｍｉＲ－２９１１は、本来のウイルスの７２％のみを低減することが示され、インビトロアッセイにおいて、アルファ変異体を阻害することができない（図１３Ｂ）ことも見出された。この知見は、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、ｍｉＲ－２９１１と比較して、はるかに有望な治療薬であることを示唆する。
【0182】
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから２０２１年８月２２日にダウンロードされた２００，０００個超のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列を使用したときに、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２変異体に対するＣ６Ｇ２５Ｓのカバレッジレートは、９９．８％であることが見出された。２００，０００個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノム配列を、ＮＣＢＩ ｖｉｒｕｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄａｔａ Ｈｕｂから２０２１年８月２２日にダウンロードした。結果を、以下の表１２で提供する。
【表12】
【0183】
要約すると、この実施例において提供される結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする（例えば、ウイルスの高度保存ＲｄＲｐ領域を標的とする）例示的なｓｉＲＮＡとしてのＣ６Ｇ２５Ｓが、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の感染を、ＲＮＡ干渉を介して有効に阻害して、認識部位における相補的ウイルスＲＮＡを切断することができたことを実証する。結果は、Ｃ６Ｇ２５Ｓが、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（上記の表１２を参照されたい）に、ピコモル範囲のＩＣ５０で取り組むことができることを示す。Ｃ６Ｇ２５Ｓの阻害活性は、Ｃ６Ｇ２５Ｓの標的部位と重複する予測される標的部位を有する、自然発生のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２９１１よりも強力である。
【0184】
例えば、エアロゾル吸入（ＡＩ）を介するｓｉＲＮＡの送達は、肺全体にわたるｓｉＲＮＡの均一な分布を示し、鼻腔内滴下（ＩＮ）は、鼻腔内の高い投与効率を示したが、これは、組み合わされた送達経路が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防的及び／又は実際の治療についてより有効であることが期待されることを示唆する。予防的処置後に、ウイルスＲＮＡの平均９９．９％低減が検出され、測定可能なプラーク形成ビリオンは検出されなかった。曝露後処置において、吸入を介して、ウイルスＲＮＡは、９６．２％低減され、感染性ビリオンは、９６．１％低減された。また、Ｃ６Ｇ２５Ｓ処置を受け取った感染マウスの肺内のスパイクタンパク質発現及び免疫細胞浸潤は両方、疾患関連病理学的特徴の低減とともに有意に減少した。これらの結果は全て、Ｃ６Ｇ２５Ｓを例として含む、本明細書に開示される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｉＲＮＡが、予防的治療及びウイルスに感染した患者の治療の両方において有効であることを示唆する。
【0185】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ、均等な、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別途明白に記載されない限り、開示されるそれぞれの特徴は、全般的な一連の均等な又は同様の機能の例のみである。
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ、均等な、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別途明白に記載されない限り、開示されるそれぞれの特徴は、全般的な一連の均等な又は同様の機能の例のみである。
【0186】
上記の説明から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正をなして、本発明を様々な使用及び条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内である。
【0187】
均等物
いくつかの発明実施形態が、本明細書に記載及び例示されているが、本明細書に記載される機能を実行しかつ／又は本明細書に記載される結果及び／若しくは利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造が、当業者には容易に想到され、このような変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書に記載される発明実施形態の範囲内であることが意図されている。概して、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示的であることが意図されていること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、発明教示が使用される具体的な用途又は複数の用途に依存することが、当業者には容易に理解されよう。当業者は、通例の実験法のみを使用して、本明細書に記載される具体的な発明実施形態の多くの均等物を認識するか又は確認することができる。したがって、上記の実施形態は、例としてのみ提示されること、並びに添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、発明実施形態は、具体的に記載及び特許請求されるものとは別法で実施されてもよいことが、理解される。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載されるそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法のいずれの組み合わせも、このような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明範囲内に含まれる。
いくつかの発明実施形態が、本明細書に記載及び例示されているが、本明細書に記載される機能を実行しかつ／又は本明細書に記載される結果及び／若しくは利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造が、当業者には容易に想到され、このような変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書に記載される発明実施形態の範囲内であることが意図されている。概して、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示的であることが意図されていること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、発明教示が使用される具体的な用途又は複数の用途に依存することが、当業者には容易に理解されよう。当業者は、通例の実験法のみを使用して、本明細書に記載される具体的な発明実施形態の多くの均等物を認識するか又は確認することができる。したがって、上記の実施形態は、例としてのみ提示されること、並びに添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、発明実施形態は、具体的に記載及び特許請求されるものとは別法で実施されてもよいことが、理解される。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載されるそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法のいずれの組み合わせも、このような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明範囲内に含まれる。
【0188】
本明細書で定義及び使用される場合、全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、及び／又は定義される用語の通常の意味よりも優先されると理解されるべきである。
【0189】
本明細書に開示される全ての参照文献、特許、及び特許出願は、これらのそれぞれが引用される主題、いくつかの場合では、これらの文書全体を包含し得る主題に関して、参照により組み込まれる。
【0190】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明白に反して示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0191】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「及び／又は」という語句は、このように等位接続された要素の「いずれか又は両方」、すなわち、要素は、いくつかの場合では、接続的に存在し、他の場合には、非接続的に存在することを意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じ様式で、すなわち、要素のうちの「１つ以上」が、このように等位接続されていると解釈されるべきである。「及び／又は」という句によって具体的に同定される要素以外の他の要素が、具体的に同定されるこれらの要素に関連するか又は関連しないかにかかわらず、任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などの非限定的な言語と合わせて使用されたときに、一実施形態では、（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）Ａのみ、別の実施形態では、（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）Ｂのみ、更に別の実施形態では、（任意選択で、他の要素を含む）Ａ及びＢの両方、などを指すことができる。
【0192】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するときに、「又は」又は「及び／又は」は、包括的である、すなわち、いくつかの要素又は要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、これらのうちの２つ以上も含み、任意選択で、列挙されない追加の項目を含むとして解釈される。明白に反して示される用語のみ、例えば、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」、又は特許請求の範囲で使用されたときに、「からなる」とは、いくつかの要素又は要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。概して、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」が前にあるときに、排他的な選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが、両方ではない」）を示すとしてのみ解釈される。特許請求の範囲内で使用されたときに、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される場合のこの通常の意味を有する。
【0193】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに言及して、「少なくとも１つの」という語句は、要素のリスト内の要素のうちのいずれかの１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも、要素のリスト内に具体的に列挙されるそれぞれ全ての要素のうちの少なくとも１つを含むとは限られず、要素のリスト内の要素のいずれの組み合わせも除外しないと理解されるべきである。この定義はまた、要素のリスト内で具体的に同定され「少なくとも１つ」という語句が指す要素以外の要素が、具体的に同定される要素に関連するか又は関連しないかにかかわらず、任意選択で存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は均等に、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は均等に、「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）こと、別の実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）こと、更に別の実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＡを含み、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＢを含む（任意選択で、他の要素を含む）ことなどを指すことができる。
【0194】
また、明白に反して示されない限り、２つ以上のステップ又は行為を含む、本明細書で特許請求されるいずれの方法においても、方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも、方法のステップ又は行為が列挙される順序に限定されるとは限らないことが理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】