特表 2023-553677 虚血再灌流障害の治療のためのＰＰＡＲβ／δアゴニストを用いたＭＳＣの前処理

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-25

(54)【発明の名称】虚血再灌流障害の治療のためのＰＰＡＲβ／δアゴニストを用いたＭＳＣの前処理

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20231218BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20231218BHJP

【ＦＩ】

A61K35/28

A61P9/00

C12N5/0775

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023536416

(86)(22)【出願日】2021-12-17

(85)【翻訳文提出日】2023-08-14

(86)【国際出願番号】 EP2021086394

(87)【国際公開番号】W WO2022129468

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】20306596.6

(32)【優先日】2020-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521240402

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ド モンペリエ

(71)【出願人】

【識別番号】594016872

【氏名又は名称】サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス）

(71)【出願人】

【識別番号】507002516

【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）

(71)【出願人】

【識別番号】513096967

【氏名又は名称】サントル・オスピタリエ・ユニヴェルシテール・ドゥ・モンペリエ

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ

(74)【代理人】

【識別番号】110003421

【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ファリダ、ジュアド、サムリ

(72)【発明者】

【氏名】ステファニー、バレール、ルメール

(72)【発明者】

【氏名】クリスチャン、ヨルゲンセン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065AC12

4B065AC20

4B065BB13

4B065BC12

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB44

4C087BB64

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA36

(57)【要約】

本発明は、虚血再灌流障害を治療することを目的とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物を調製するためのイン・ビトロ方法に関し、この方法は、ａ）ＭＳＣを提供する工程；ｂ）ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含む培地でＭＳＣを培養する工程；ｃ）培地を除去し、ＭＳＣを洗浄する工程；およびｄ）薬学上許容される担体中にＭＳＣを収集する工程、ここで、薬学上許容される担体はＰＰＡＲβ／δアゴニストを含有しない、を含む。本発明は、さらに、本発明の方法を使用して得られたＭＳＣ、ならびに、好ましくは虚血再灌流障害の治療または予防における、薬剤としてのそれらの使用に関し、治療または予防の方法は、対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない。
【選択図】図１０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

虚血再灌流障害、好ましくは、心筋または腎の虚血再灌流障害の治療方法において、それを必要とする対象に使用するための、ＰＰＡＲβ／δプライムド間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物であって、
ａ）ＭＳＣを提供する工程；
ｂ）ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含む培地でＭＳＣを培養する工程；
ｃ）培地を除去し、ＭＳＣを洗浄する工程；および
ｄ）薬学上許容される担体中にＭＳＣを収集する工程、ここで、前記薬学上許容される担体はＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まない、
を含むイン・ビトロ方法によって得られたものであり、
前記治療方法は前記対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない、組成物。

【請求項2】

静脈内投与または冠動脈内投与によって前記対象に投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記対象に投与されるＭＳＣの総量が、５×１０^６～５×１０^１０のＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

虚血再灌流障害の発症から７日以内にまたは虚血性臓器の再灌流中に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

虚血再灌流障害を治療することを目的とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物を調製するためのイン・ビトロ方法であって、
ａ）ＭＳＣを提供する工程；
ｂ）ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含む培地でＭＳＣを培養する工程；
ｃ）培地を除去し、ＭＳＣを洗浄する工程；および
ｄ）薬学上許容される担体中にＭＳＣを収集する工程、ここで、前記薬学上許容される担体はＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まない、
を含み、
工程ｂ）の継続時間が、１２時間～７２時間、好ましくは１８時間～４８時間、より好ましくは２０時間～３０時間、例えば、２４時間である、方法。

【請求項6】

工程ａ）において提供されるＭＳＣが、骨髄由来ＭＳＣまたは脂肪組織由来ＭＳＣである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

工程ａ）において提供されるＭＳＣが、同種異系であり、かつ、健康な対象から得られたものである、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

工程ｂ）の培地中のＰＰＡＲβ／δアゴニストの濃度が、０．０１μＭ～１０μＭ、好ましくは０．０５μＭ～５μＭ、より好ましくは０．１μＭ～１μＭである、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ＰＰＡＲβ／δアゴニストが、ＧＷ０７４２およびＧＷ５０１５１６から選択される、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

工程ｂ）の培地が、ＭＳＣに形質導入するためのウイルスベクターを含有しない、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

工程ｃ）における洗浄が、ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まない溶液を用いて実行される、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

工程ｄ）において、ＭＳＣが、薬学上許容される担体中に１０^２～１０^８ ＭＳＣ 細胞／ｍＬの濃度で、好ましくは１０^３～１０^７ ＭＳＣ 細胞／ｍＬの濃度で収集される、請求項５～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ＰＰＡＲβ／δプライムド間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載のイン・ビトロ方法によって得られた、組成物。

【請求項14】

治療方法において使用するための、請求項１３に記載の組成物であって、前記治療方法は、前記対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、間葉系幹細胞の使用に基づく虚血再灌流障害の治療を目的とした治療法の分野にある。本発明は、虚血再灌流障害を治療することを目的とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物を調製するためのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法に関し、この方法は、ａ）ＭＳＣを提供する工程；ｂ）ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含む培地でＭＳＣを培養する工程；ｃ）培地を除去し、ＭＳＣを洗浄する工程；およびｄ）薬学上許容される担体中にＭＳＣを収集する工程、ここで、薬学上許容される担体はＰＰＡＲβ／δアゴニストを含有しない、を含む。本発明は、さらに、本発明の方法を使用して得られたＭＳＣ、ならびに、好ましくは虚血再灌流障害の治療または予防における、薬剤としてのそれらの使用に関し、治療または予防の方法は、対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない。

【背景技術】

【0002】

責任動脈の血行再建による心筋再灌流は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）患者に対する唯一の治療である。しかしながら、主にアポトーシスに起因し、虚血組織での急激な酸素回復によって引き起こされる再灌流の副作用と考えられている、不可逆的な虚血再灌流（ＩＲ）障害を特異的に予防する治療はない。アポトーシスは、動物モデルおよび患者の両方の虚血性疾患において観察されるため、高度に調節されたエネルギー依存形式の細胞死であり、治療的介入にとって潜在的に興味深いものである(Roubille, F. et al. Delayed postconditioning in the mouse heart in vivo. Circulation 124, 1330-1336, doi:CIRCULATIONAHA.111.031864 [pii] 10.1161/CIRCULATIONAHA.111.031864 (2011); ); Saraste, A. et al. Apoptosis in human acute myocardial infarction. Circulation 95, 320-323, doi:10.1161/01.cir.95.2.320 (1997))。この調節された細胞死の機構は、再灌流段階に特有のものである。実際、アポトーシスはＡＴＰ産生に依存しているため、虚血中に予め作動させ、再灌流中に実行される(McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M. & Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 286, H1923-1935, doi:10.1152/ajpheart.00935.2003 (2004))。アポトーシスカスケードを特異的に標的とすることは、再灌流障害を予防し、梗塞サイズを制限するための主な戦略であると考えられる(Boisguerin, P. et al. A novel therapeutic peptide targeting myocardial reperfusion injury. Cardiovasc Res 116, 633-644, doi:10.1093/cvr/cvz145 (2020))。したがって、ＡＭＩ後のＩＲ誘導性アポトーシスを標的とする戦略を開発する必要がある。

【0003】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に基づく療法は、心筋梗塞（ＭＩ）後の心筋の機能回復を、内因性細胞の生存、増幅および血管新生の増加を含む無数の経路によって改善することが報告されている。加えて、ＭＳＣは、その可塑性と、生物活性分子を放出し、ミトコンドリアおよび細胞外小胞（ＥＶ）などの細胞小器官を移動させる能力によって炎症およびアポトーシスを強く抑制する(Karantalis, V. & Hare, J. M. Use of mesenchymal stem cells for therapy of cardiac disease. Circ Res 116, 1413-1430, doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.303614 (2015))。これらの特性に基づいて、ＭＳＣは、いくつかの前臨床研究で試験されており、有望な結果が得られている。実際、ＡＭＩの前臨床研究では、ＭＳＣ注射は、組織修復および心臓機能を改善し(Cashman, T. J., Gouon-Evans, V. & Costa, K. D. Mesenchymal stem cells for cardiac therapy: practical challenges and potential mechanisms. Stem Cell Rev Rep 9, 254-265, doi:10.1007/s12015-012-9375-6 (2013))、炎症反応を調節し、細胞アポトーシス(Tompkins, B. A. et al. Preclinical Studies of Stem Cell Therapy for Heart Disease. Circ Res 122, 1006-1020, doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.312486 (2018))および動物の死亡率を減少させる(Llano, R. et al. Intracoronary delivery of mesenchymal stem cells at high flow rates after myocardial infarction improves distal coronary blood flow and decreases mortality in pigs. Catheter Cardiovasc Interv 73, 251-257, doi:10.1002/ccd.21781 (2009))。臨床試験では、第Ｉ相および第ＩＩ相におけるＭＳＣの安全性および有効性が実証されているが、第ＩＩＩ相試験では矛盾が報告されている(Jeong, H. et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Ischemic Heart Disease: Systematic Review and Meta-analysis. International journal of stem cells, doi:10.15283/ijsc17061 (2018); Roncalli, J. et al. Intracoronary autologous mononucleated bone marrow cell infusion for acute myocardial infarction: results of the randomized multicenter BONAMI trial. European heart journal 32, 1748-1757, doi:10.1093/eurheartj/ehq455 (2011); Chen, Z., Chen, L., Zeng, C. & Wang, W. E. Functionally Improved Mesenchymal Stem Cells to Better Treat Myocardial Infarction. Stem Cells Int 2018, 7045245, doi:10.1155/2018/7045245 (2018))。これらの矛盾は、部分的には、ＭＳＣによって示されるイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）生存率の低さと生着に起因しただけでなく、使用されるＭＳＣの供給源とＭＳＣ機能のイン・ビトロ増幅プロセスの悪影響にも起因した(Chen, Z., Chen, L., Zeng, C. & Wang, W. E. Functionally Improved Mesenchymal Stem Cells to Better Treat Myocardial Infarction. Stem Cells Int 2018, 7045245, doi:10.1155/2018/7045245 (2018))。したがって、ＭＳＣの治療可能性を最適化し、それらを日常的な臨床現場に導入するためには、ＭＳＣの生存率および損傷組織への生着、ならびに心臓細胞に対する抗アポトーシス性を高めることによってＭＳＣを強化／増大する必要があると提案されている。

【0004】

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、３つの異なるアイソフォーム：ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δおよびＰＰＡＲγで存在する核内受容体である。それらはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成し、リガンド結合後、転写調節因子として作用する。組織リガンドおよび補因子に応じて、ＰＰＡＲアイソフォームは複数の機能を発揮する(Wagner, K. D. & Wagner, N. Peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta (PPARbeta/delta) acts as regulator of metabolism linked to multiple cellular functions. Pharmacology & therapeutics 125, 423-435, doi:10.1016/j.pharmthera.2009.12.001 (2010))。ＰＰＡＲαは主に褐色脂肪組織、腸、心臓、肝臓、腎臓で発現されるが、ＰＰＡＲγは免疫細胞、消化管、白色脂肪組織および褐色脂肪組織で発現され、ＰＰＡＲβ／δは遍在的に発現される。ＰＰＡＲファミリーの血管新生促進メンバーであるＰＰＡＲβ／δは、血管細胞で発現される(Bishop-Bailey, D. Peroxisome proliferator-activated receptors in the cardiovascular system. Br J Pharmacol 129, 823-834, doi:10.1038/sj.bjp.0703149 (2000))。細胞質プロスタサイクリン受容体が欠損したＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲβ／δの活性化は、アポトーシスを促進する(Hatae, T., Wada, M., Yokoyama, C., Shimonishi, M. & Tanabe, T. Prostacyclin-dependent apoptosis mediated by PPAR delta. The Journal of biological chemistry 276, 46260-46267, doi:10.1074/jbc.M107180200 (2001))。その後の研究では、内皮細胞におけるＰＰＡＲβ／δの抗アポトーシス性は内皮１４－３－３の活性化を介して媒介されることが報告されている(Liou, J. Y., Lee, S., Ghelani, D., Matijevic-Aleksic, N. & Wu, K. K. Protection of endothelial survival by peroxisome proliferator-activated receptor-delta mediated 14-3-3 upregulation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 26, 1481-1487, doi:10.1161/01.ATV.0000223875.14120.93 (2006); Brunelli, L., Cieslik, K. A., Alcorn, J. L., Vatta, M. & Baldini, A. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta upregulates 14-3-3 epsilon in human endothelial cells via CCAAT/enhancer binding protein-beta. Circ Res 100, e59-71, doi:10.1161/01.RES.0000260805.99076.22 (2007))。これらの研究と一致して、選択的ＰＰＡＲδアゴニスト、ＧＷ５０１５１６が、Ｈ_２Ｏ_２誘発細胞死から心筋芽細胞株Ｈ９ｃ２を保護することが示された(Pesant, M. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARdelta) activation protects H9c2 cardiomyoblasts from oxidative stress-induced apoptosis. Cardiovasc Res 69, 440-449, doi:10.1016/j.cardiores.2005.10.019 (2006))。

【0005】

ＰＰＡＲβ／δアゴニストはまた、様々な病状を治療するための幹細胞とＰＰＡＲβ／δアゴニストの同時投与を含む併用療法における幹細胞生着促進剤としての使用について、ＷＯ２０１５／１６４５０６において提案されている。具体的には、この出願において開示される主な使用は、血管関連疾患および／または筋疾患の治療のための、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）を過剰発現する幹細胞とＰＧＩ２の組合せの使用であるが、この出願の実施例６には、虚血後肢の状況におけるＭＳＣとＰＰＡＲβ／δアゴニストＧＷ５０１５１６の併用が開示されている。ＭＳＣは、イン・ビトロで４日間ＰＰＡＲβ／δアゴニストＧＷ５０１５１６で前処理され、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの虚血後肢の腓腹筋に直接注射され、マウスにはＰＰＡＲβ／δアゴニストＧＷ５０１５１６も毎日投与される。

【0006】

ＰＰＡＲβ／δアゴニストはまた、ＷＯ２０１４／０１５３１８において、様々な細胞集団（ＭＳＣを含むが、実験データは造血幹細胞－ＨＳＣに集中している）における遺伝子送達ベクター（特にレトロウイルスベクター）の細胞形質導入効率を高めるために提案されている。

【0007】

しかしながら、ＰＰＡＲβ／δアゴニストのイン・ビボ投与は、重大な悪影響をもたらす可能性がある。具体的には、ＰＰＡＲβ／δアゴニストＧＷ５０１５１６は、マウスおよびラットの両方において、３ｍｇ／ｋｇ／日の用量でいくつかの臓器で癌を急速に発生させることが判明した(Sahebkar A, Chew GT, Watts GF (2014). "New peroxisome proliferator-activated receptor agonists: potential treatments for atherogenic dyslipidemia and non-alcoholic fatty liver disease". Expert Opin Pharmacother. 15 (4): 493-503; Geiger LE, Dunsford WS, Lewis DJ, Brennan C, Liu KC, Newsholme SJ (2009). PS 895 - Rat carcinogenicity study with GW501516, a PPAR delta agonist. 48th Annual Meeting of the Society of Toxicology. Baltimore: Society of Toxicology. p. 105; Newsholme SJ, Dunsford WS, Brodie T, Brennan C, Brown M, Geiger LE (2009). PS 896 - Mouse carcinogenicity study with GW501516, a PPAR delta agonist. 48th Annual Meeting of the Society of Toxicology. Baltimore: Society of Toxicology. p. 105)。

【発明の概要】

【0008】

したがって、特に心筋梗塞の状況において、先行技術で開示されているＰＰＡＲβ／δアゴニストの同時投与の悪影響を及ぼすことなく、抗アポトーシス性を有するＭＳＣの効率的な生着を可能にする、細胞療法により虚血再灌流障害を治療するための改善された方法が必要とされている。

【0009】

ＰＰＡＲβ／δは、ＭＳＣによって高度に発現されるが(Luz -Crawford, P. et al. PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis. Annals of the rheumatic diseases, doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696 (2016))、ＭＳＣの抗アポトーシス性および心臓保護特性に対するその役割は調査されていない。

【0010】

本発明に関連して、本発明者らは、ＭＳＣによるＰＰＡＲβ／δの発現が心筋虚血再灌流障害の治療における治療効率に不可欠であることを見出した。実際、ＰＰＡＲβ／δのノックダウンにより抗炎症性は変わらなかったが、心臓保護作用が消失した（実施例１、特に図４Ｂ参照）。このことは、ＡＭＩにおける有益な効果を改善するためにＭＳＣの免疫調節性を強化することは、第ＩＩＩ相臨床試験の不一致を克服するための唯一のまたは主要なアプローチであるべきではなく、むしろ、患者に投与された後の生存を高めることと同時に考慮されるべきであることを示唆している。

【0011】

これらの最初の結果に基づいて、本発明者らはさらに、意外にも、心筋虚血再灌流障害の状況においてＭＳＣの生存、生着および抗アポトーシス性を大幅に改善するには、ＰＰＡＲβ／δアゴニストによるＭＳＣの短時間の前処理（わずか２４時間）で十分であり、前処理を受けていないＭＳＣを使用した場合の２分の１の用量で同様の治療効果が得られることを見出した。この方法では、天然（形質導入されていない）ＭＳＣをＰＰＡＲβ／δアゴニストで前処理し、その後洗い流し、前処理済みのＭＳＣを含むがＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まない組成物を、それを必要とする対象に投与し、その結果、ＰＰＡＲβ／δアゴニストのイン・ビボ投与に関連する悪影響が防止される。予想外なことに、このような短時間の前処理は、虚血再灌流障害の治療におけるＭＳＣの生着および抗アポトーシス性、ならびにそれらの治療効率を大幅に改善するのに十分である（実施例２参照）。

【0012】

したがって、第１の態様において、本発明は、虚血再灌流障害を治療することを目的とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物を調製するためのイン・ビトロ方法に関し、この方法は、ａ）ＭＳＣを提供する工程；ｂ）ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含む培地でＭＳＣを培養する工程；ｃ）培地を除去し、ＭＳＣを洗浄する工程；およびｄ）薬学上許容される担体中にＭＳＣを収集する工程、ここで、薬学上許容される担体は前記ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含有しない、を含む。

【0013】

本発明はまた、本発明によるイン・ビトロ方法によって得られた、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物に関する。

【0014】

本発明はまた、好ましくは、虚血再灌流障害の治療方法において、それを必要とする対象に薬剤として使用するための本発明による組成物に関し、前記治療方法は前記対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１：Ｃ５７Ｂｌ６マウス心臓をランゲンドルフシステムに取り付け、ＩＲ障害に供した。（Ａ）：エクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）プロトコールは、１５分間の安定化、それに続いて、大動脈を通る流れを止めることによって達成される３０分の全体虚血（無流）を含む。再灌流は、タイロード灌流を６０分間回復することによって達成した。ＳＨＡＭ条件では、虚血誘発を行わずに、プロトコール中ずっと心臓を灌流した。プロトコールの最後に、ＴＴＣ染色法を使用して梗塞サイズを測定した。冠動脈流出液は、エクス・ビボプロトコール中の２時点で収集した：サイトカイン放出の「基礎」レベルを評価するための安定化中と、ＩＲ障害後の「ＩＲ６０」サイトカイン産生を評価するための再灌流段階終了時。（Ｂ）：散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ心臓（ｎ＝１２）およびＳＨＡＭ心臓（ｎ＝３）における梗塞サイズ（ＬＶの％）を表したものである。ＴＴＣ染色したＬＶスライスの代表的な写真を各群について示した。（Ｃ）：バー（平均±ＳＤ）付きの散布図は、虚血前（基礎）と、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｖ－Ｐｌｅｘ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １（マウス）キットを使用したＩＲプロトコール後の６０分の再灌流後（ＩＲ_６０）に収集した冠動脈流出液内のサイトカインの定量について示すものである。統計分析は、マン・ホイットニー検定を使用して実行した。ＴＮＦα（ｐｇ／ｍｌ）では、ｐ^＊＊＝０．００２を^＊＊で記し、ＣＸＣＬ１（ｐｇ／ｍｌ）では、ｐ^＊＊＊＝０．０００７を^＊＊＊で記し、ＩＬ－６（ｐｇ／ｍｌ）では、ｐ^＊＊＊＊＜０．０００１を^＊＊で記した。

【図2】図２．ランゲンドルフシステムにおいてエクス・ビボで灌流した摘出心臓は、図１Ａで記載したものと同様の灌流プロトコールに従った。（Ａ）ＭＳＣ群では、タイロードバッファーで調製した様々な濃度（２，５００；５，０００または２０，０００細胞／ｍＬ）のＭＳＣ細胞の溶液で再灌流を達成した。ＰｏｓｔＣ群については、１分の虚血－１分の再灌流を３サイクル含むポストコンディショニング刺激を再灌流の開始時に適用した。 対照条件（ＩＲ）では、心臓にタイロード液単独を再灌流した（対照条件）。プロトコールの最後に梗塞サイズ測定および免疫化学のために組織学的分析を実行した。（Ｂ）：散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１２）、ＭＳＣ ２５００細胞／ｍＬ（ｎ＝６）、ＭＳＣ ５，０００細胞／ｍＬ（ｎ＝６）およびＭＳＣ ２０，０００（ｎ＝６）における梗塞サイズ（ＬＶの％）を表したものである。統計分析は、クラスカル・ウォリス法を使用して実行し、多重比較のダンの事後検定を行った。ＩＲと比較した統計的有意性は、ｐ＝０．０００９を^＊＊＊と記し、ＩＲに対するｐ＝０．２２をｎｓと記し、ＭＳＣ ５，０００細胞／ｍＬに対するｐ＝０．８４を＃と記している。（Ｃ）：散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１２）、ＰｏｓｔＣ（ｎ＝６）およびＭＳＣ（５，０００細胞／ｍＬ、ｎ＝６）における梗塞サイズ（ＬＶの％）を表したものである。統計分析は、クラスカル・ウォリス法を使用して実行し、多重比較のダンの事後検定を行った。ＩＲと比較した統計的有意性は、ｐ＝０．０００２を^＊＊＊と記し、ｐ＝０．００６を^＊＊と記し、ＰｏｓｔＣに対するｐ＞０．９９を＃と記している。

【図3】図３．（Ａ）：ランゲンドルフシステムにおいてエクス・ビボで灌流した摘出心臓は、図１Ａで記載したものと同様の灌流プロトコールに従った。ＭＳＣ群では、５０００細胞／ｍＬの濃度に調製したＭＳＣタイロード液で再灌流を達成した。ＰｏｓｔＣ群については、１分の虚血－１分の再灌流を３サイクル含むポストコンディショニング刺激を再灌流の開始時に適用した。対照条件（ＩＲ）では、心臓にタイロード液単独を再灌流した（対照条件）。冠動脈流出液は、ＩＲ障害プロトコールおよびＰｏｓｔＣプロトコールの両方の後のサイトカイン産生を評価するための再灌流段階終了時に収集した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）：バー（平均±ＳＤ）付きの散布図は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｖ－Ｐｌｅｘ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １（マウス）キットを使用したＩＲまたはＰｏｓｔＣプロトコール（それぞれＩＲおよびＭＳＣ）後の６０分の再灌流後に収集した冠動脈流出液内のサイトカインの定量について示すものである。統計分析は、クラスカル・ウォリス検定を使用して実行した。（Ｂ）：ＴＮＦα（ｐｇ／ｍｌ）では、ｐ＝０．１０８をｎｓと記した。（Ｃ）：ＣＸＣＬ１（ｐｇ／ｍＬ）では、ｐ^＊＊＊＝０．０００６（対ＩＲ）を^＊＊＊と記し、ｐ^＊＝０．０１８（対ＩＲ）を^＊＊と記し、ｐ^＃＞０．９９９を^＃と記した。（Ｄ）：ＩＬ－６（ｐｇ／ｍＬ）では、ｐ^＊＊＝０．００２（対ＩＲ）を^＊＊と記し、ｐ^＊＝０．０２９（対ＩＲ）を^＊＊と記し、ｐ^＃＞０．９９９を^＃と記した。

【図4】図４．（Ａ）：ランゲンドルフシステムにおいてエクス・ビボで灌流した摘出心臓は、図１Ａで記載したものと同様の灌流プロトコールに従った。ＩＲ群ではタイロード液単独で、ＭＳＣに関して５０００細胞／ｍＬの濃度に調製したタイロード液で（ＭＳＣ群）、ＫＯ ＭＳＣで（ＫＯ ＭＳＣ群）再灌流を達成した。プロトコールの最後に、摘出心臓（Ｂ）で梗塞サイズ分析を実行し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｖ－Ｐｌｅｘ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １（マウス）キットを使用してサイトカイン産生を分析した（Ｃ、Ｄ、Ｅ）。統計分析は、クラスカル・ウォリス検定を使用して実行し、必要に応じてダンの事後検定を行った。（Ｂ）：散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１２）、ＭＳＣ（５，０００細胞／ｍＬ、ｎ＝９）およびＫＯ ＭＳＣ（５，０００細胞／ｍＬ、ｎ＝１３）における梗塞サイズ（ＬＶの％）を表したものである。ＩＲと比較した統計的有意性は、ｐ＝０．００１を^＊＊と記し、ｐ＝０．０２９を^＊と記し、ＭＳＣに対するｐ＝０７５を^＃と記している。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）：バー（平均±ＳＤ）付きの散布図は、再灌流の開始後６０分でＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙキットを使用して、未処置の心臓（ＩＲ）、野生型ＭＳＣ（ＭＳＣ）およびＰＰＡＲβ／δ欠損ＭＳＣ（ＫＯ ＭＳＣ）で処置した心臓から収集した冠動脈流出液内のＴＮＦα、ＣＸＣＬ１およびＩＬ－６の定量について示すものである。統計分析は、クラスカル・ウォリス検定を使用して実行した。（Ｃ）：ＴＮＦα（ｐｇ／ｍｌ）では、ｐ^ｎｓ＝０．６０をｎｓと記した。（Ｄ）：ＣＸＣＬ１（ｐｇ／ｍＬ）では、ｐ^＊＊＝０．００１７（ＭＳＣ 対ＩＲ）を^＊＊と記し、ｐ＝０．３４（ＫＯ ＭＳＣ 対ＩＲ）をｎｓと記し、ｐ^＃＝０．２８を^＃と記し（ＫＯ ＭＳＣ 対ＭＳＣ）；（Ｅ）：ＩＬ－６（ｐｇ／ｍＬ）では、ｐ^＊＊＝０．００４（ＭＳＣ 対ＩＲ）を^＊＊と記し、ｐ^＊＝０．０３（ＫＯ ＭＳＣ 対ＩＲ）を^＊と記し、ｐ^＃＞０．９９９（ＫＯ ＭＳＣ 対ＭＳＣ）を^＃と記した。

【図5】図５：ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣによって処置した心臓における心臓保護の増大。（Ａ）Ｃ５７Ｂｌ６マウス心臓をランゲンドルフシステムに取り付け、ＩＲ障害に供した。エクス・ビボプロトコールは、１５分間の安定化、それに続いて、大動脈を通る流れを止めることによって達成される３０分の全体虚血（無流）を含む。再灌流は、タイロード灌流を６０分間回復することによって達成した（ＩＲ群）。ＰｏｓｔＣ群については、１分の虚血－１分の再灌流を３サイクル含むポストコンディショニング刺激を再灌流の開始時に適用した。ＭＳＣ群では、タイロードバッファーで調製した様々な濃度（２，５００；５，０００または１０，０００細胞／ｍＬ）のＭＳＣ細胞の溶液で再灌流を達成した。プロトコールの最後に、心臓を梗塞サイズ（ＴＴＣ染色法；Ｂ～Ｅ）または免疫化学（Ｆ）の分析のみに使用した。（Ｂ）散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１１）、ＰｏｓｔＣ（ｎ＝７）、ＭＳＣ ２，５００細胞／ｍＬ（ｎ＝１１）、ＭＳＣ ５，０００細胞／ｍＬ（ｎ＝１０）、およびＭＳＣ １０，０００細胞／ｍＬ（ｎ＝１０）における梗塞サイズを表したものであり；統計分析は、クラスカル・ウォリス法を使用して実行し、多重比較のダンの事後検定を行った。ＩＲと比較した統計的有意性は、ｐ＝０．０００４（ＰｏｓｔＣ 対ＩＲ）にを^＊＊＊と記し、ｐ^ｎｓ＝０．８０（ＭＳＣ ２５００ 対ＩＲ）をｎｓと記し、ｐ^＊＊＊＝０．０００４（ＭＳＣ ５，０００ 対ＩＲ）を^＊＊＊と記し、ｐｎｓ＞０．９９（ＭＳＣ １０，０００ 対ＩＲ）をｎｓと記し、ＰｏｓｔＣとの比較では：ｐ＄＝０．０９７（ＭＳＣ ２，５００）を＄と記し、ｐ^＄＞０．９９（ＭＳＣ ５，０００）を^＄と記し、ｐ^＃＃＝０．００１（ＭＳＣ １０，０００）を＃＃と記している。（Ｃ）散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１１）、ＭＳＣ ５，０００細胞／ｍＬ（ｎ＝１２）、ＭＳＣ（５，０００細胞／ｍＬ）＋ＧＳＫ０６６０（ｎ＝９）における梗塞サイズを表したものである。統計分析は、ＡＮＯＶＡにより実行し（データが正規性検定に合格したため）、それに続いて、テューキーの多重比較検定を実行した。統計的有意性は、ＩＲに対するｐ^＊＊＊＊＜０．０００１を^＊＊＊＊と記し、ＩＲに対するｐ^＊＊＝０．００７を^＊＊と記し、ＭＳＣに対するｐ＃＝０．０１９を^＃と記した。（Ｄ）散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１１）、ＭＳＣ ２，５００細胞／ｍＬ（ｎ＝１２）、ＭＳＣ（２，５００細胞／ｍＬ）＋ＧＷ０７４２ ０．１μＭ（ｎ＝８）、ＭＳＣ（２，５００細胞／ｍＬ）＋ＧＷ０７４２ １μＭ（ｎ＝７）およびＭＳＣ（２，５００細胞／ｍＬ）＋ＧＷ０７４２ ５μＭ（ｎ＝５）における梗塞サイズを表したものである。統計分析は、クラスカル・ウォリス法によって実行し、それに続いて、ダンの事後検定を実行した。統計的有意性は、ｐ^＊＊＊＊＜０．０００１（ＭＳＣ＋ＧＷ０７４２ １μＭ 対ＩＲ）を^＊＊＊＊と記し、ｐ^ｎｓ＝０．１６（ＭＳＣ 対ＩＲ）をｎｓと記し、ｐ^ｎｓ＝０．０５６（ＭＳＣ＋ＧＷ０７４２ ０．１μＭ 対ＩＲ）をｎｓと記し、ｐ^ｎｓ＝０．０．０７（ＭＳＣ＋ＧＷ０７４２ ５μＭ 対ＩＲ）をｎｓと記した。（Ｅ）散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１１）、ＭＳＣ ５，０００細胞／ｍＬ（ｎ＝１２）およびＭＳＣ（２，５００細胞／ｍＬ）＋ＧＷ０７４２ １μＭ（ｎ＝７）における梗塞サイズを表したものである。統計分析は、クラスカル・ウォリス法によって実行し、それに続いて、ダンの事後検定を実行した。統計的有意性は、ｐ^＊＊＊＝０．００１（ＭＳＣ ５，０００ 対ＩＲ）を^＊＊＊と記し、ｐ^＊＊＊＝０．０００３（ＭＳＣ ２，５００＋ＧＷ０７４２ 対ＩＲ）を^＊＊＊と記し、ｐ^ｎｓ＞０．９９をｎｓと記した。（Ｆ）ＭＳＣ（ＤＩ－Ｉ標識ＭＳＣ）とＭＳＣ＋ＧＷ０７４２ １μＭ（各群ｎ＝３）を注射した心臓で測定された蛍光の％についての散布図およびバー（平均±ＳＤ）（比較）。各ドットは、各心臓のｎ＝１７～２６のスライスから得られた蛍光のパーセンテージの平均を表す。

【図6】図６：ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの酸化的ストレスに対する耐性および生存の増大。（Ａ）完全培地への播種工程から４８時間後、ＭＳＣを血清枯渇状態の最少培地中で４時間Ｈ_２Ｏ_２誘発酸化的ストレスに供した。ＰＰＡＲβ／δアゴニストまたはアンタゴニストを使用したＭＳＣの薬理学的プレコンディショニングは、酸化的ストレス曝露の２４時間前に実行した。プロトコールの最後に、ＥＬＩＳＡにより特異的なＤＮＡ断片化を測定し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより転写量を測定して、細胞死または相対的遺伝子発現を分析した。（Ｂ）：散布図およびバーは、最少培地中で様々な濃度（０、１００、１５０、２５０、５００および７５０μＭ）のＨ_２Ｏ_２で４時間処理したＭＳＣにおいて測定した特異的なＤＮＡ断片化の定量について示したものである。データ（未処理のＭＳＣで得られた対照値によって正規化したもの）を、各処理群の散布ドットブロットおよび平均±ＳＤとしてプロットし、クラスカル・ウォリス法（ダンの事後検定）を使用して比較し、ｐ＜０．０００１（２５０群、ｎ＝１１ 独立培養物 対０群、ｎ＝１３）を^＊＊＊＊と記し、ｐ＝０．００１３（１００群、ｎ＝１０ 対０群、ｎ＝１３）を^＊＊と記し、ｐ＝０．００１５（３５０群、ｎ＝９ 対０群、ｎ＝１３）を^＊＊と記し、ｐ＝０．００１５（５００群、ｎ＝９ 対０群、ｎ＝１３）を^＊＊と記し、ｐ＝０．０３３２（７５０群、ｎ＝３ 対０群、ｎ＝１３）を^＊と記した。（Ｃ）：散布図およびバーは、Ｈ_２Ｏ_２曝露の２４時間前に０．１および１μＭのＧＷ０７４２またはＧＳＫ０６６０で前処理し、２５０μＭのＨ_２Ｏ_２で処理したＭＳＣにおいて測定した特異的なＤＮＡ断片化の定量について示したものである。データ（Ｈ_２Ｏ_２誘発ナイーブＭＳＣで得られた値によって正規化したもの）を、各処理群の散布ドットブロットおよび平均±ＳＤとしてプロットし、クラスカル・ウォリス法（ダンの事後検定）を使用して比較した。Ｐ値は、ｐ＜０．０００１（ＭＳＣ／Ｈ_２０_２、ｎ＝１８に対するＭＳＣ、ｎ＝１６ 独立培養物）を^＊＊＊＊と記し、ｐ＝０．０４０２（ＭＳＣ／Ｈ_２Ｏ_２、ｎ＝１８に対するＭＳＣ＋１μＭ ＧＳＫ０６６０／Ｈ_２Ｏ_２、ｎ＝８）を^＊と記した、（Ｄ）Ｈ_２Ｏ_２曝露の２４時間前に０．１および１μＭでのＧＷ０７４２またはＧＳＫ０６６０で前処理し、Ｈ_２Ｏ_２で処理したＭＳＣにおけるＢｃｌ－２ 相対的発現。

【図7】図７：心筋細胞に対するＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの抗アポトーシス効果の増大。（Ａ）ＰＰＡＲβ／δアゴニストを使用した２４時間のＭＳＣの薬理学的プレコンディショニングの後、トランスウェル（上部チャンバー）とＨ９ｃ２（下部チャンバー）を使用して細胞を共培養した。両方の培養物を、最少培地（血清枯渇）中で３５０μＭのＨ_２Ｏ_２に４時間曝露した。プロトコールの最後に、Ｈ９ｃ２細胞において特異的なＤＮＡ断片化を定量し、値を、ナイーブＭＳＣまたはＰＰＡＲβ／δアンタゴニスト（ＧＳＫ０６６０またはＧＳＫ０３７８７）で前処理し、３５０ Ｈ_２Ｏ_２μＭに暴露したＭＳＣとの共培養物で得られた値と比較した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）散布ドットプロットおよびバーは、プロトコールの最後にＨ９ｃ２において定量した特異的なＤＮＡ断片化について示したものである。データ（各処理群の平均±ＳＤ）は、ナイーブＭＳＣ／Ｈ_２Ｏ_２で得られた値によって正規化し、クラスカル・ウォリス法（（ダンの事後検定）を使用して比較した。（Ｂ）：データは、条件１のプロトコールを使用して得た。（Ｃ）：条件２のプロトコールＰに従い、ｐ値は、ｐ＜０．０００１（ＭＳＣ／Ｈ_２０_２、ｎ＝１８に対するＭＳＣ、ｎ＝１６ 独立培養物）を^＊＊＊＊と記した。条件３のプロトコールで得られたデータ（Ｄ）については、ｐ値は、ｐ＝０．０４３６（ＭＳＣ／Ｈ_２Ｏ_２、ｎ＝１０に対するＭＳＣ＋１μＭ ＧＳＫ０６６０／Ｈ_２Ｏ_２、ｎ＝６）を^＊と記した。

【図8】図８：（Ａ）完全培地への播種工程から４８時間後、ＭＳＣを血清枯渇状態の最少培地中で４時間Ｈ_２Ｏ_２誘発酸化的ストレスに供した。ＰＰＡＲβ／δアゴニストまたはアンタゴニストを使用したＭＳＣの薬理学的プレコンディショニングは、酸化的ストレス曝露の２４時間前に実行した。プロトコールの最後に、ＲＴ－ｑＰＣＲにより転写量を測定して、相対的遺伝子発現を分析した。酸化的ストレスに暴露した未処理のＭＳＣまたはプレコンディショニング済みのＭＳＣにおけるｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。（Ｂ）ｖｅｇｆについては：データ（平均±ＳＥＭ）を、ＡＮＯＶＡおよび多重比較のテューキーの事後検定（正規性検定に合格）を使用して比較した。Ｐ値は、ｐ＝０．０３０１（Ｈ_２Ｏ_２、ｎ＝９に対する対照、ｎ＝９）を^＊と記し、ｐ＝０．０００９（ＧＳＫ０６６０ ０．１μＭ、ｎ＝９に対するＨ_２Ｏ_２、ｎ＝９）を^＊＊＊と記し、ｐ＝０．０１９１（ＧＳＫ０６６０ １μＭ、ｎ＝８に対するＨ_２Ｏ_２、ｎ＝９）を^＊と記した；（Ｃ）ｈｇｆについては：データ（平均±ＳＥＭ）を、クラスカル・ウォリス法、それに続いて、多重比較のダンの事後検定を使用して比較した。Ｐ値は、Ｈ_２Ｏ_２、ｎ＝７に対し、対照 ｎ＝８、ＧＷＯ７４２ ０．１μＭ ｎ＝７、ＧＷ０７４２ １μＭ ｎ＝９、ＧＳＫ０６６０ ０．１μＭ ｎ＝６およびＧＳＫ０６６０ １μＭ ｎ＝９についてｎｓであった；（Ｄ）ｐｄｇｆについては：データ（平均±ＳＥＭ）を、ＡＮＯＶＡおよび多重比較のテューキーの事後検定（正規性検定に合格）を使用して比較した。Ｐ値は、ｐ＝０．０１３２（Ｈ_２Ｏ_２、ｎ＝９に対する対照、ｎ＝９）を^＊と記し、ｐ＝０．０２７７（ＧＷ０７４２１ １μＭ、ｎ＝９に対するＨ_２Ｏ_２、ｎ＝９）てを^＊と記した。統計分析のため、未処理のＭＳＣ／Ｈ_２Ｏ_２群と比較した。

【図9】図９：（Ａ）Ｃ５７Ｂｌ６マウス心臓をランゲンドルフシステムに取り付けた。エクス・ビボプロトコールは、１５分間の安定化、それに続いて、大動脈を通る流れを止めることによって達成される３０分の全体虚血（無流）を含む。再灌流は、タイロード灌流を６０分間回復することによって達成した（ＩＲ群）。ＭＳＣ群では、タイロードバッファーで調製した、１μＭのＧＷ０７４２により前処理したまたは前処理していないＭＳＣ細胞の溶液（２５００細胞／ｍＬ）で再灌流を達成した。プロトコールの最後に、心臓を採取し、さらなる分析のためにタンパク質を抽出した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ウエスタンブロット分析を、薬理学的前処理を行ってまたは行わずに、未処置ＩＲ心臓またはＭＳＣ処置マウスＩＲ心臓からのＬＶタンパク質抽出物から実行した（エクス・ビボ）。散布ドットブロットおよび平均±ＳＤは、開裂カスパーゼ３（ＩＲ、ｎ＝１０についてのＭＳＣ＋ＧＷ０７４２、ｎ＝１０に対するｐ^＊＝０．０３２２）およびｐＡＫＴ／ＡＫＴ（ＩＲ、ｎ＝８についてのＭＳＣ＋ＧＷ０７４２、ｎ＝８に対するｐ^＊＝０．０３８５）についてのプロットである。データは、ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定（ダンの事後検定）を使用して比較した。

【図10】図１０：（Ａ）ＭＳＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍｌヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が添加された最少必須培地（ＭＥＭ）－αを含有する完全培地中で培養した。エクス・ビボ実験の２４時間または９６時間前に、ＭＳＣを、培地で希釈したＰＰＡＲβ／δアゴニストを含有する処理溶液（ＧＷ０７４２、１μＭおよびＧＷ５０１５１６、０．１μＭ）とともにインキュベートした。処理は２４時間または９６時間続けた。細胞を洗浄し、トリプシン処理工程の後、２００ｇで３分間遠心分離した。ＭＳＣを、終濃度５０００細胞／ｍｌで、予熱したタイロード液に再懸濁した。（Ｂ）Ｃ５６Ｂｌ６マウス心臓に予熱したタイロード液を１５分間灌流した（安定化）。全体虚血は、灌流の流れを３０分間止めることによって得た（《無流》）。再灌流工程（６０分）は、ＭＳＣ溶液で流れを回復することによって達成し、これは、６０分の再灌流工程の間適用した。対照条件（ＩＲ）は、タイロード液単独を使用して得た。（Ｃ）散布図およびバー（平均±ＳＤ）は、ＩＲ（ｎ＝１；グラフでは未処理と記している）、ＭＳＣ（ｎ＝３）、ＭＳＣ＋ＧＷ５０１５１６ ０．１μＭ（９６時間のプレコンディショニング；ｎ＝８）、ＭＳＣ＋ＧＷ５０１５１６ ０．１μＭ（２４時間のプレコンディショニング；ｎ＝７） ＭＳＣ＋ＧＷ０７４２ １μＭ（２４時間のプレコンディショニング；ｎ＝２）における梗塞サイズを表したものである。ＭＳＣは、プレコンディショニング処理およびその継続時間に関係なく、同様の心臓保護作用を示す。

【発明の具体的説明】

【0016】

虚血再灌流障害を治療することを目的とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物を調製するためのイン・ビトロ方法
本発明は、第一に、虚血再灌流障害を治療することを目的とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物を調製するためのイン・ビトロ方法に関し、この方法は、
ａ）ＭＳＣを提供する工程；
ｂ）ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含む培地でＭＳＣを培養する工程；
ｃ）培地を除去し、ＭＳＣを洗浄する工程；および
ｄ）薬学上許容される担体中にＭＳＣを収集する工程、ここで、前記薬学上許容される担体はＰＰＡＲβ／δアゴニストを含有しない、を含む。

【0017】

工程ａ）
工程ａ）において、間葉系幹細胞が提供される。
ヒトＭＳＣを定義するための最小基準は、２００６年に国際細胞治療学会(the International Society for Cellular Therapy)の間葉系および組織幹細胞委員会(the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of)によって定義され、現在でも広く受け入れられている：
１．ＭＳＣは、標準的な培養条件で維持した場合、プラスチックに接着性を有する必要があり。
２．表現型：ＭＳＣは、以下である必要がある：
ａ．（細胞の少なくとも９５％が）ＣＤ１０５（エンドグリンとして知られ、もともとＭＡｂ ＳＨ２によって認識される）、ＣＤ７３（エクト５’ヌクレオチダーゼとして知られ、もともとＭＡｂ ＳＨ３およびＳＨ４によって認識される）およびＣＤ９０（Ｔｈｙ－１としても知られる）を発現すること、および
ｂ．（細胞の２％未満が）ＣＤ４５（汎白血球マーカー）、ＣＤ３４（未分化造血前駆細胞および内皮細胞のマーカー）、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ（ＭＳＣ培養物中で見つかる可能性が最も高い造血細胞である単球およびマクロファージで顕著に発現され、１つだけで検査する必要がある）、ＣＤ７９ａまたはＣＤ１９（Ｂ細胞のマーカー、１つだけで検査する必要がある）、およびＨＬＡ－ＤＲ（刺激を受けない限りＭＳＣでは発現されない）表面分子の発現を欠いていること。
３．イン・ビトロでの分化：ＭＳＣは、イン・ビトロで骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞への分化能を有する必要がある。

【0018】

ＭＳＣの起源の組織
ＭＳＣは、骨髄(BM, the initial source of MSCs, Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284:143-147)、脂肪組織(Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frankhauser M, Wirkner U, Krause U, Blake J, Schwager C, Eckstein V, Ansorge W. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol 2005;33:1402-1416; Zhang X, Yang M, Lin L, Chen P, Ma K, Zhou C, Ao Y. Runx2 overexpression enhances osteoblastic differentiation and mineralization in adipose-derived stem cells in vitro and in vivo. Calcif Tissue Int 2006;79:169-178)、歯の組織(Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: Their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res 2009;88:792-806)、唾液腺(Rotter N, Oder J, Schlenke P, Lindner U, Bohrnsen F, Kramer J, Rohwedel J, Huss R, Brandau S, Wollenberg B. Isolation and characterization of adult stem cells from human salivary glands. Stem Cells Dev 2008;17:509-518)、周産期組織、例えば、胎盤、臍帯組織（ホウォートンゼリー）または羊水(Raynaud C, Maleki M, Lis R, Ahmed B, Al-Azwani I, Malek J, Safadi F, Rafii A. Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation. Stem Cells Int 2012; 2012:658356; Wang HS, Hung SC, Peng ST, Huang CC, Wei HM, Guo YJ, Fu YS, Lai MC, Chen CC. Mesenchymal stem cells in the Wharton’s jelly of the human umbilical cord. Stem Cells 2004;22:1330-1337; Hou T, Xu J, Wu X, Xie Z, Luo F, Zhang Z, Zeng L. Umbilical cord Wharton’s Jelly: a new potential cell source of mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering. Tissue Eng Part A 2009;15:2325-2334; Kita K, Gauglitz GG, Phan TT, Herndon DN, Jeschke MG. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells Dev 2010;19:491-502)、月経血(Luz-Crawford, P. et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Interleukin 1 Receptor Antagonist Promotes Macrophage Polarization and Inhibits B Cell Differentiation. Stem cells 2016; 34, 483-492, doi:10.1002/stem.2254; Francisca Alcayaga-Miranda et al.,Characterization of menstrual stem cells: angiogenic effect, migration and hematopoietic stem cell support in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther 2015 Mar 17;6(1):32)、末梢血(Weiping Lin et al., Characterisation of multipotent stem cells from human peripheral blood using an improved protocol. J Orthop Translat 2019; 7;19:18-28)および滑膜組織(Djouad, F., Bony, C., Haupl, T. et al. Transcriptional profiles discriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stem cells. Arthritis Res Ther 7, R1304 (2005); De Bari C, Dell'Accio F, et al. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum. 2001 Aug;44(8):1928-42)を含む様々な組織から単離し得る。

【0019】

したがって、工程ａ）において提供されるＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、歯の組織、唾液腺由来、または周産期組織（胎盤、臍帯組織（ホウォートンゼリー）、羊水、月経血、末梢血または滑膜組織などに由来し得る。

【0020】

好ましい実施形態では、工程ａ）において提供されるＭＳＣは、骨髄由来または脂肪組織由来のＭＳＣ、特に骨髄由来のＭＳＣである。

【0021】

ＭＳＣの起源の対象
工程ａ）において提供されるＭＳＣは、虚血再灌流障害を治療するためのそれらの投与の前に前処理されることを意図している。したがって、それらは自己（すなわち、治療される対象の組織に由来する）または同種異系（すなわち、別の対象の組織に由来する）であり得る。

【0022】

本発明に関連して、工程ａ）において提供されるＭＳＣは同種異系であり、健康な対象から事前に採取されていることが好ましい。

【0023】

これにより、個人差を克服することができ、虚血再灌流障害に罹患している対象への投与の前のＭＳＣの調製が簡単かつはるかに迅速になる。

【0024】

工程ａ）において提供されるＭＳＣは、工程ａ）の直前に健康な対象から採取し得る。しかしながら、個人差を制限し、本発明の調製方法をできるだけ早く開始することを目標として、健康な対象に由来する、すでに単離されている同種異系ＭＳＣのバンクから選んだＭＳＣを使用することが好ましい。この実施形態では、健康な対象に由来する、単離された同種異系ＭＳＣの凍結サンプルのバンクが事前に作成され、工程ａ）においてＭＳＣの供給源として使用される。

【0025】

ＭＳＣの単離
上述の様々な組織からＭＳＣを単離するための方法は、当技術分野で知られている。それらの方法は、一般に、外科手術中にドナーから採取された骨髄および脂肪組織の新鮮なサンプルに依存する。

【0026】

骨髄（ＢＭ）から開始する場合、好適なプロトコールは次のとおりである(Djouad, F., Bony, C., Haupl, T. et al. Transcriptional profiles discriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stem cells. Arthritis Res Ther 7, R1304 (2005))：
ＢＭ穿刺液を培地に再懸濁し、周囲温度で１５０～３００×ｇ（好ましくは約２００×ｇ）で５～１５分間（好ましくは約１０分間）遠心分離する。次に、細胞を、５～１５％（好ましくは約１０％）ウシ胎仔血清、１～１０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１ｎｇ／ｍｌ）塩基性線維芽細胞増殖因子、抗生物質（通常ペニシリンおよびストレプトマイシン）を添加したα－ＭＥＭ中に、４×１０^４～６×１０^４細胞／ｃｍ^２（好ましくは約５×１０^４細胞ｓ／ｃｍ^２）の密度でプレーティングする。コンフルエンシーに達したら、細胞を剥がし、その後、５００～１，５００細胞／ｃｍ^２（好ましくは約１，０００細胞／ｃｍ^２）の密度で再びプレーティングする。第２継代～第７継代の間の接着細胞が、単離されたＢＭ由来ＭＳＣを構成する。

【0027】

ヒトＢＭからヒトＭＳＣを単離する場合、好ましいプロトコールは、Djouad, F., Bony, C., Haupl, T. et al. Transcriptional profiles discriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stem cells. Arthritis Res Ther 7, R1304 (2005)に開示されている。

【0028】

脂肪組織から開始する場合、好適なプロトコールは次のとおりである(Maumus M, Manferdini C, et al. Adipose mesenchymal stem cells protect chondrocytes from degeneration associated with osteoarthritis. Stem Cell Res. 2013 Sep;11(2):834-44.)：
脂肪組織を消化し、遠心分離する（１５０～３００×ｇ、好ましくは約３００×ｇで、５～１５分間、好ましくは約１０分間）。間質血管細胞群を収集し、３０００～６００細胞／ｃｍ^２（好ましくは約４０００細胞／ｃｍ^２）の初期密度で、抗生物質（通常ペニシリンおよびストレプトマイシン）、グルタミンおよび５～１５％（好ましくは約１０％）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したαＭＥＭに播種する。２４時間～４８時間（好ましくは約２４時間）後、培養物を生理食塩水（好ましくはＰＢＳ）で２回洗浄する、５～１０日（好ましくは約１週間）後、細胞を剥がし、サブコンフルエンシーに到達するまで１０００～３０００細胞／ｃｍ^２（好ましくは約２０００細胞／ｃｍ^２）で増殖させる。

【0029】

歯の組織(Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: Their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res 2009;88:792-806)、唾液腺(Rotter N, Oder J, Schlenke P, Lindner U, Bohrnsen F, Kramer J, Rohwedel J, Huss R, Brandau S, Wollenberg B. Isolation and characterization of adult stem cells from human salivary glands. Stem Cells Dev 2008;17:509-518)、および周産期組織、例えば、胎盤、臍帯組織（ホウォートンゼリー）または羊水(Raynaud C, Maleki M, Lis R, Ahmed B, Al-Azwani I, Malek J, Safadi F, Rafii A. Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation. Stem Cells Int 2012; 2012:658356; Wang HS, Hung SC, Peng ST, Huang CC, Wei HM, Guo YJ, Fu YS, Lai MC, Chen CC. Mesenchymal stem cells in the Wharton’s jelly of the human umbilical cord. Stem Cells 2004;22:1330-1337; Hou T, Xu J, Wu X, Xie Z, Luo F, Zhang Z, Zeng L. Umbilical cord Wharton’s Jelly: a new potential cell source of mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering. Tissue Eng Part A 2009;15:2325-2334; Kita K, Gauglitz GG, Phan TT, Herndon DN, Jeschke MG. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells Dev 2010;19:491-502)からＭＳＣを単離するための好適なプロトコールは、当技術分野で開示されている。

【0030】

工程ｂ）
工程ｂ）において、ＭＳＣは、ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含む培地で培養される。

【0031】

ＭＳＣの播種
工程ａ）において提供されるＭＳＣは、培地を含む培養容器に播種される。

【0032】

ＭＳＣは接着細胞であるため、接着細胞の培養に好適な培養容器、供給業者ＣｏｒｎｉｎｇまたはＦａｌｃｏｎによって提供される７５ｃｍ^２フラスコなどに播種することが好ましい。

【0033】

ＭＳＣに好適な播種密度は、６０～８０％のコンフルエンシー、すなわち、３０００～１００００細胞／ｃｍ^２、好ましくは３０００～７０００細胞／ｃｍ^２、４０００～６０００細胞／ｃｍ^２、より好ましくは約５，０００細胞／ｃｍ^２である(Bouffi C, Bony C, et al. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLoS One. 2010 Dec 7;5(12):e14247)。

【0034】

培地
工程ｂ）において使用される培地は、ＭＳＣの維持に好適な任意の培地であり得る。そのような培地には、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、グルタミン、抗生物質（通常ペニシリンおよびストレプトマイシン）、およびヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）－αが含まれる。

【0035】

一実施形態では、工程ｂ）の培地は、５～１５％（好ましくは１０％）ウシ胎仔血清、１～５ｍＭ（好ましくは２ｍＭ）グルタミン、５０～２００Ｕ／ｍＬ（好ましくは１００Ｕ／ｍＬ）ペニシリン、５０～２００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ）ストレプトマイシンおよび１～５ｎｇ／ｍＬ（好ましくは２ｎｇ／ｍＬ）ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）－αであり得る。

【0036】

ＰＰＡＲβ／δアゴニスト
実施例２および３に示すデータは、いくつかの異なるＰＰＡＲβ／δアゴニストは、前処理プロトコールで使用した場合に、ＭＳＣの心臓保護特性を大幅に改善する能力を有することを示している。加えて、本発明による調製方法は、工程ｃ）において、培地の除去とＰＰＡＲβ／δアゴニストで処理されたＭＳＣの洗浄によって、ＰＰＡＲβ／δアゴニストが除去されるため、ＰＰＡＲβ／δアゴニストが対象に投与されないことから、イン・ビボ投与により悪影響（ＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ５０１５１６の場合の癌など）のリスクが増加することが示されているＰＰＡＲβ／δアゴニストであっても使用し得る。

【0037】

したがって、いかなるＰＰＡＲβ／δアゴニストも本発明による調製方法に使用し得る。

【0038】

既知のＰＰＡＲβ／δアゴニストには、Takada I, Makishima M. Peroxisome proliferator-activated receptor agonists and antagonists: a patent review (2014-present). Expert Opin Ther Pat. 2020 Jan;30(1):1-13（特に、この論文の図１の化合物３～５、および図３の化合物１４～２０参照）に開示されているように、下記表１に示す化合物が含まれる：

【0039】

【表1】

【0040】

本発明に関連して使用し得るＰＰＡＲβ／δのアゴニストとして提案するさらなる化合物は、ＵＳ９４８７４９３Ｂ２、ＵＳ９６９５１３７Ｂ２、ＵＳ２０１７３０４２５５Ａ１、ＵＳ２０１８３０５４０３Ａ１およびＷＯ２０１７１８０８１８Ａ１において開示されており、これらの総ては、引用することにより本明細書の一部とされる。

【0041】

したがって、工程ｂ）において使用されるＰＰＡＲβ／δアゴニストは、いかなるＰＰＡＲβ／δアゴニストからも選択し得、特に上記表１に開示されているもの、好ましくは、ＧＷ０７４２、ＧＷ５０１５１６、Ｌ１６５０４１、ＭＢＸ－８０２５およびＫＤ－３０１０から選択し得る。特に好ましい実施形態では、工程ｂ）において使用されるＰＰＡＲβ／δアゴニストは、ＧＷ０７４２およびＧＷ５０１５１６から選択される。

【0042】

工程ｂ）において使用されるＰＰＡＲβ／δアゴニストの濃度は、選択された特定のＰＰＡＲβ／δアゴニストおよびＰＰＡＲβ／δに対する親和性に応じて調整される。しかしながら、実施例２および３で得られたデータに基づき、工程ｂ）の培地中のＰＰＡＲβ／δアゴニスト（特に化合物ＧＷ０７４２およびＧＷ５０１５１６）の濃度は、好ましくは、０．００１～１０μＭ、より好ましくは０．０１μＭ～１０μＭ、より好ましくは０．０５μＭ～５μＭ、最も好ましくは０．１μＭ～１μＭである。

【0043】

継続時間
実施例２および３に示すデータは、ＭＳＣの心臓保護特性を大幅に改善するには、ＰＰＡＲβ／δアゴニストによるＭＳＣの短時間（２４時間）の前処理で十分であることを示している。

【0044】

したがって、工程ｂ）の継続時間は、好ましくは、１２時間～７２時間、好ましくは１８時間～４８時間、より好ましくは２０時間～３０時間に含まれ、例えば、２４時間である。

【0045】

ＭＳＣに形質導入するためのウイルスベクターが存在しない
ＷＯ２０１４／０１５３１８に開示されているものとは対照的に、本発明による調製方法を使用して調製されるＭＳＣは、好ましくは、異種遺伝子を発現するベクター（特にウイルスベクター、とりわけレトロウイルスベクター）による形質導入を使用した遺伝子改変を受けない。

【0046】

したがって、工程ｂ）の培地は、好ましくは、ＭＳＣに形質導入するためのウイルスベクターを含有しない。

【0047】

工程ｃ）
工程ｃ）において、培地が除去され、ＭＳＣが洗浄される。

【0048】

この工程は、ＭＳＣの前処理に使用されたＰＰＡＲβ／δアゴニストを除去し得るため、非常に重要である。結果として、本発明による調製方法を使用して得られる前処理済ＭＳＣ組成物は、工程ｂ）において使用されたＰＰＡＲβ／δアゴニストを含有しないかまたは微量レベルしか含有しない。これにより、ＰＰＡＲβ／δアゴニストのイン・ビボ投与に関連している可能性のある悪影響が防止される。

【0049】

ＭＳＣは接着細胞であるため、培地は、廃棄または吸引することによって容易に除去し得る。

【0050】

次いで、ＭＳＣは、洗浄溶液を加え、工程ｂ）の培地の場合と同様の方法を使用してそれを除去することにより洗浄される。洗浄溶液は、ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まず、好ましくは、生理食塩水緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ＭＥＭ）から選択される。洗浄工程（すなわち、洗浄溶液の添加とその除去）は、場合により繰り返してよい（すなわち、２工程以上の洗浄、例えば、２または３工程の洗浄を含め得る）が、ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まないかまたは微量しか含まない組成物を得るためには、一般に、１工程の洗浄だけで十分であろう。

【0051】

工程ｄ）
工程ｄ）において、ＭＳＣは、ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まない、薬学上許容される担体中に収集される。

【0052】

前記薬学上許容される担体は、血液と等張の生理食塩水であり、とりわけ、塩化ナトリウムの等張水溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） １×および生理血清から選択され得る。以下の化合物を、血液と等張の生理食塩水にさらに添加し得る：
・ヘパリン（好ましくは１～１０Ｕ／ｍＬの濃度のもの、ヘパリンは、ウサギＩＲ障害のモデルにおいて、細胞療法の有効性を向上させることが記載されているため）(Ghadrdoost B, Khoshravesh R, et al. Heparin Enhances the Effects of Mesenchymal Stem Cell Transplantation in a Rabbit Model of Acute Myocardial Infarction. Niger J Physiol Sci. 2018 Jun 30;33(1):9-15)、および／または
・ヒト血清(Janssens S, Dubois C, et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 2006 Jan 14;367(9505):113-21)もしくはヒト血清アルブミン(Chullikana A, Majumdar AS, Gottipamula S, et al. Randomized, double-blind, phase I/II study of intravenous allogeneic mesenchymal stromal cells in acute myocardial infarction. Cytotherapy. 2015 Mar;17(3):250-261)（好ましくは１～１０％（ｖ／ｖ）の濃度のもの）。

【0053】

ＭＳＣは接着細胞であるため、収集するには培養容器から細胞を剥離する必要がある。これは、細胞をトリプシン、トリプシン－ＥＤＴＡ、またはＰＢＳ－ＥＤＴＡに暴露することにより行い得る。

【0054】

次に、ＭＳＣの収集に使用される薬学上許容される担体の量は、以下に応じて選択される：
・培養容器中に存在するＭＳＣの総数、および
・ＭＳＣの所望の終濃度、これ自体は、選択された投与経路に応じた投与に好適な液体の量に依存する。

【0055】

例えば、前処理したＭＳＣが静脈内投与を目的としたものである場合、最大１５０ｍＬ（特に３０～１５０ｍＬ）の量を投与し得、特に心筋虚血再灌流障害の治療では、１０^２～１０^８ＭＳＣ細胞／ｍＬ、好ましくは１０^３～１０^７ＭＳＣ細胞／ｍＬである薬学上許容される担体中のＭＳＣの濃度を使用し得る。

【0056】

前処理したＭＳＣが冠動脈内投与を目的としたものである場合、最大１０ｍＬ（特に２０～１０ｍＬ）の量を投与し得、特に心筋虚血再灌流障害の治療では、１０^６～１０^１０ＭＳＣ細胞／ｍＬである薬学上許容される担体中のＭＳＣの濃度を使用し得る。

【0057】

任意選択の凍結工程ｅ）
本発明による調製方法は、場合により、使用まで保存するためにＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣを凍結する工程ｅ）をさらに含んでもよい。

【0058】

この場合、ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物は、好ましくは、供給業者に応じた特定のＭＳＣ凍結溶液（とりわけ、様々な供給業者から入手可能な、プラズマライトＡなどの複数の電解質注入溶液、好ましくは、ヒト血清アルブミン（好ましくは３～７％）および／またはジメチルスルホキシド（好ましくは８～１２％）などの凍結保存剤を含有するもの）を使用して凍結され、液体窒素中で－１９６℃の温度で保存される。

【0059】

凍結したＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物は、凍結ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣサンプルのバンクを作成するために使用され得る。

【0060】

上記の本発明によるイン・ビトロ調製方法によって得られる、ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣを含む組成物
本発明はまた、本発明によるイン・ビトロ方法によって得られた、ＰＰＡＲβ／δプライムド間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物に関する。

【0061】

「ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ」は、本明細書では、本発明による方法を使用してＰＰＡＲβ／δによって処理されたＭＳＣを意味することを意図する。

【0062】

したがって、本発明によるＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物は、以下の特徴を有する：
・ＰＰＡＲβ／δアゴニストで短期間プライミングされ、心臓保護特性が向上したＭＳＣを含む
・ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まないかまたは微量しか含まない。

【0063】

ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣは、薬学上許容される担体中に存在し、この薬学上許容される担体は、ＰＰＡＲβ／δアゴニストを含まず、血液と等張の生理食塩水であり、とりわけ、塩化ナトリウムの等張水溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） １×および生理血清から選択され得る。以下の化合物が、薬学上許容される担体中にさらに存在し得る：
・ヘパリン（好ましくは１～１０Ｕ／ｍＬの濃度のもの、ヘパリンは、ウサギＩＲ障害のモデルにおいて、細胞療法の有効性を向上させることが記載されているため）(Ghadrdoost B, Khoshravesh R, et al. Heparin Enhances the Effects of Mesenchymal Stem Cell Transplantation in a Rabbit Model of Acute Myocardial Infarction. Niger J Physiol Sci. 2018 Jun 30;33(1):9-15)、および／または
・ヒト血清(Janssens S, Dubois C, et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 2006 Jan 14;367(9505):113-21)もしくはヒト血清アルブミン(Chullikana A, Majumdar AS, Gottipamula S, et al. Randomized, double-blind, phase I/II study of intravenous allogeneic mesenchymal stromal cells in acute myocardial infarction. Cytotherapy. 2015 Mar;17(3):250-261) （好ましくは１～１０％（ｖ／ｖ）の濃度のもの）。

【0064】

本発明による組成物は、好ましくは、前処理したＭＳＣを治療上有効な量で含有する。本発明者らは、マウスモデルにおいて、ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの総数３．１０^５細胞に相当する２．５×１０^３ＭＳＣ細胞／ｍＬの濃度で前処理したＭＳＣを含む８０～１５０ｍＬの量の組成物の再灌流が、ナイーブ（すなわち、非ＰＰＡＲβ／δプライムド）ＭＳＣの２倍と同じくらい有効であることを見出した。したがって、ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの治療上有効な量は、ナイーブＭＳＣの治療上有効な量の約半分であるはずである。

【0065】

ヒトでは、様々な状況（ＭＳＣ起源、投与経路…）で虚血再灌流障害の治療にある程度の有効性を示すことが判明したナイーブＭＳＣの数は、１０^７～１０^１１細胞である。ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣを使用する場合、治療上有効な量は少なくなるはずであり、とりわけ、５×１０^６～５×１０^１０細胞であり得る。

【0066】

本発明による方法の工程ｄ）において上に開示したように、選択された投与経路を使用する場合に投与され得る量に応じて、本発明によるＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物についてのＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの好適な量および濃度が選択される。

【0067】

本発明による調製方法の工程ａ）に関して上に説明したように、組成物のＭＳＣは自己または同種異系であり得るが、好ましくは同種異系であり、好ましくは健康な対象から得られたものである。

【0068】

本発明による組成物は、好ましくは医薬組成物である。

【0069】

本発明による組成物の治療的使用
本発明者らは、予想外なことに、本発明による組成物が、心筋虚血再灌流障害の場合に心臓保護作用の改善を示すＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣを含み、したがって、ＰＰＡＲβ／δアゴニストを併用せずに単独で投与した場合に心筋虚血再灌流障害の治療または予防に有効であることを示した。

【0070】

したがって、本発明はまた、治療または予防の方法における使用のための本発明による組成物にも関し、この治療または予防の方法は対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない。

【0071】

具体的には、本発明は、それを必要とする対象における虚血再灌流障害の治療または予防の方法における使用のための本発明による組成物に関し、この治療または予防の方法は対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない。

【0072】

本発明はまた、虚血再灌流障害の治療または予防を目的とした薬剤の製造のための本発明による組成物の使用にも関し、この治療または予防は対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない。

【0073】

本発明はまた、虚血再灌流障害の治療または予防のための本発明による組成物の使用にも関し、この治療または予防は対象にＰＰＡＲβ／δアゴニストを投与することを含まない。

【0074】

本発明はまた、虚血再灌流障害を、それを必要とする対象において治療または予防するための方法にも関し、この方法は、本発明による組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含む。

【0075】

「治療」または「治療すること」とは、虚血再灌流障害が生じた後に本発明による組成物を投与した場合の、対象における臨床的または生物学的基準の改善を意味する。例えば、「治療」または「治療すること」は、本発明による組成物の投与前と比較した、対象臓器におけるアポトーシスおよび／または炎症の減少に対応し得る。

【0076】

「予防」または「予防すること」とは、虚血が起こった後、対象臓器の再灌流の前またはその間に、すなわち、虚血再灌流障害が生じる前に本発明による組成物を投与した場合の、虚血再灌流障害に関連する臨床的または生物学的基準の発症を予防もしくは遅延するまたは強度を下げるという事実を意味する。例えば、「予防」または「予防すること」は、同様の再灌流の場合に一般的に観察されるものと比較して、臓器の再灌流後の対象臓器における炎症および／またはアポトーシスの不在または弱い発生に対応し得る。

【0077】

「治療上有効な量」とは、上で定義したように、対象に治療的または予防的利益を与えるのに必要な量に相当する。

【0078】

虚血再灌流障害
「虚血再灌流障害」または「ＩＲ障害」または「ＩＲＩ」は、すでに虚血状態にある組織への血流回復後の細胞の機能障害および死という逆説的な悪化として定義し得る。血流の再確立は虚血組織を回復させるために不可欠であるが、再灌流自体が逆説的にさらなる損傷を引き起こし、臓器の機能および生存能力を脅かす。ＩＲＩは、心臓、肺、腎臓、消化管、骨格筋および脳を含む広範囲の臓器で起こり、虚血臓器自体が関与するだけでなく、遠隔臓器に対する全身損傷を誘発する可能性があり、多系統臓器不全に至る可能性がある。

【0079】

したがって、本発明による組成物は、とりわけ、心臓、肺、腎臓、消化管、骨格筋または脳の虚血再灌流障害の治療において使用し得る。

【0080】

心筋虚血再灌流障害において本発明者らによって得られたデータに基づいて、本発明による組成物は、好ましくは、心臓（特に心筋）の虚血再灌流障害において使用される。

【0081】

虚血再灌流障害が重大な問題となる別のケースは、臓器移植（腎臓移植など）中にあり、したがって、本発明による組成物は、好ましくは、臓器移植後、特に腎臓移植後の虚血再灌流障害の治療においても使用され得る。

【0082】

投与スケジュール
任意の好適な投与スケジュールを使用し得る。

【0083】

投与経路
具体的には、治療する虚血再灌流障害のタイプに応じて、いくつかの投与経路を使用し得る。

【0084】

心臓（特に心筋）の虚血再灌流障害の場合、好適な投与経路には、冠動脈内（血管内手段による）、静脈内および心筋内（開心術手段による）または経心内膜（血管内手段による）が含まれる。

【0085】

血管内手段を使用した冠動脈内投与は、冠動脈造影法中、再灌流時またはその後に行い得るため、特に好ましい。冠動脈造影法は、心筋梗塞に罹患している患者において定期的に実行される比較的ソフトな介入である。

【0086】

全身投与は、投与されたＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣが様々な臓器で広まり、それらの多くが非標的臓器（肺など）に捕捉される可能性があることを意味するため、静脈内投与は、あまり好ましくない。しかしながら、静脈内投与は、ナイーブＭＳＣを使用するいくつかの臨床的プロトコールにおいて心筋梗塞後の患者に使用されており（Kobayashi K, Suzuki K. Mesenchymal Stem/Stromal Cell-Based Therapy for Heart Failure - What Is the Best Source? Circ J. 2018 Aug 24;82(9):2222-2232参照）、したがって、本発明に関連しても使用し得る。

【0087】

心筋内投与もナイーブＭＳＣを使用するいくつかの臨床的プロトコールにいて心筋梗塞後の患者に使用されており（Kobayashi K, Suzuki K. Mesenchymal Stem/Stromal Cell-Based Therapy for Heart Failure - What Is the Best Source? Circ J. 2018 Aug 24;82(9):2222-2232参照）、したがって、本発明に関連しても使用し得る。心筋内投与は、開心術の状況においてまたは血管内手段を使用して実行し得るが、血管内手段を使用する心筋内投与が好ましい。

【0088】

臓器（とりわけ腎臓）移植後の虚血再灌流障害の場合、好適な投与経路には、血管内手段による最も近い動脈（移植腎の場合、腎内動脈）への投与が含まれる。

【0089】

ＭＳＣ用量
治療上有効な用量の本発明によるＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物を使用する。

【0090】

本発明によるＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物に関するセクションで上に説明したように、治療上有効な用量の範囲は、投与経路を含む様々なパラメーターに依存する。しかしながら、特に冠動脈内投与により投与される場合、好適な用量範囲は５×１０^６～５×１０^１０ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣである。

【0091】

投与のタイミング
虚血再灌流障害の場合、迅速な治療的介入が重要である。具体的には、ＡＭＩ（急性心筋梗塞）患者では、ＭＳＣの投与が有効であるためには、ＡＭＩ後１週間以内に実行すべきである。

【0092】

したがって、好ましい実施形態では、本発明によるＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物は、虚血再灌流障害の発症から１週間以内、好ましくは、６日以内、５日以内、４日以内、より好ましくは、３日以内、２日以内、さらには、２４時間以内に投与される。

【0093】

別の好ましい実施形態では、本発明によるＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣ組成物は、虚血再灌流障害を予防するために、虚血性臓器の再灌流中に投与される。

【0094】

虚血または虚血再灌流障害に対するそのような迅速な応答は、本発明に関連して、ＭＳＣの短時間のＰＰＡＲβ／δプライミングによって可能になる。

【0095】

同種異系ＭＳＣを使用する場合、それは、事前に作成されたＭＳＣバンクのサンプルを使用することによってさらに可能になる。一実施形態では、ＭＳＣバンクは、本発明による迅速な調製方法を使用してすぐにＰＰＡＲβ／δプライミングができるナイーブＭＳＣのサンプルを含むため、対象を捉える捉えた時点から２日以内でのＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの投与を可能にする。別の実施形態では、ＭＳＣバンクは、すでにＰＰＡＲβ／δでのプライミングを受けたＭＳＣのサンプルを含み、対象を捉える捉えた時点から数時間以内（２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、さらには、６時間以内など）の投与を可能にする。

【0096】

以下の実施例は、単に本発明を説明するためのものである。

【実施例】

【0097】

実施例１：ＰＰＡＲβ／δは、心筋虚血再灌流障害における間葉系幹細胞の心臓保護作用に必要である
心筋梗塞は世界での死亡率第１位となっている。成人の心臓は再生できないため、梗塞後の収縮組織の損失を補うために線維化が拡大し、心臓リモデリングおよび心不全を引き起こす。成人の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の再生特性、ならびにそれらの安全性および有効性は、前臨床モデルで実証されている。しかしながら、臨床試験では、それらの有益な効果については議論の余地がある。関節炎の実験モデルにおいて、ＰＰＡＲβ／δノックアウト（ＫＯ ＭＳＣ）マウス由来のＭＳＣは、野生型マウス由来のＭＳＣよりも強い治療効果をもたらすことが示されている

【0098】

この研究の目的は、虚血再灌流障害に対するＫＯ ＭＳＣ細胞および野生型ＭＳＣと未処理の対照条件（ＩＲ）の治療効果を比較することであった。

【0099】

材料および方法
動物の飼育と世話
実験は、１９８６年１１月の欧州共同体理事会指令(the European Communities Council directive)に従って、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス(Charles River laboratory)において実施し、米国国立衛生研究所(the US National Institutes of Health)発行の「実験動物の管理と使用に関する指針(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」（ＮＩＨ刊行物 第８版、２０１１）に準拠した。総てのマウスを研究所の動物施設内で環境制御条件（２２±２℃、１２時間の明／１２時間の暗サイクル）下で維持した。総てのエクス・ビボプロトコールは、動物研究倫理委員会 (the Ethical Committee for Animal Research)（協定番号Ａ３４－１７２－４１）によって承認された。

【0100】

エクス・ビボ実験
雄マウスを、ケタミン（１４ｍｇ／ｋｇ、Ｉｍａｌｇeｎｅ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ）、キシラジン（１４ｍｇ／ｋｇ、Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ）の腹腔内注射（ＩＰ）、その後のペントバルビタール（ＩＰ；７６．６ｍｇ／ｋｇ；Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）の注射によって麻酔した。麻酔したマウスには、血栓形成を防ぐために、２５０Ｕのヘパリン（ＩＰ）を投与した。胸骨切開後、心臓を切除し、上行大動脈にカニューレを挿入し、迅速にランゲンドルフシステムに取り付けた。予熱したタイロード液（ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ５．４ｍＭ、ＭｇＣｌ １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ ５ｍＭ、グルコース ５．５ｍＭ、ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ、ｐＨ７．４）を一定の圧力および温度（３７℃）で灌流した。

【0101】

虚血・再灌流プロトコール（ＩＲ）
ランゲンドルフシステムで、心臓に予熱したタイロード液を１５分間灌流した（安定化）。全体虚血は、灌流の流れを３０分間止めることによって得た（《無流》）。再灌流工程（６０分）は、流れを回復することによって達成した。ＭＳＣによる処置は、再灌流の間適用した（タイロード液中のＭＳＣ）。対照条件（ＩＲ）は、タイロード液単独を使用して得た。再灌流プロトコール全体にわたって（再灌流後５、３０および６０分で）冠動脈流出液を収集し、今後の実験のために－８０℃で保存した。

【0102】

梗塞サイズの測定
ＩＲプロトコールの最後に、心臓を摘出した。左心室を寒天（４％）に入れ、ビブラトームで横方向にスライスした（１ｍｍ）。組織の生存能力を明らかにするために、スライスを２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液（ＴＴＣ色素）とともに３７℃で１５分間インキュベートした。固定工程（４％パラホルムアルデヒド、４８時間）後、各スライスの各面を撮影した。梗塞領域は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた面積測定によって定量した。

【0103】

ＭＳＣ培養物
マウスＭＳＣの単離、増幅および特性評価は、これまでに報告されているように実行した(Scholtysek, C. et al. PPARβ/δ governs Wnt signaling and bone turnover. Nat Med 19, 608-613, doi:10.1038/nm.3146 (2013))。簡潔には、Beatrice Desvergneによって提供された、ＰＰＡＲβ／δ^－／－ ＭＳＣと呼ばれるＰｐａｒｄ ｆｌ／ｆｌ ｓｏｘ２ｃｒｅｔｇ ＰＰＡＲβ／δ欠損マウスおよびＰＰＡＲβ／δ^＋／＋ ＭＳＣと呼ばれるそれらの野生型Ｐｐａｒｄ ｆｌ／＋同腹仔の長骨から骨髄（ＢＭ）を洗い流した(Scholtysek, C. et al. PPARβ/δ governs Wnt signaling and bone turnover. Nat Med 19, 608-613, doi:10.1038/nm.3146 (2013))。細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍｌ ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する最少必須培地（ＭＥＭ）－α中、０．５×１０^６細胞／ｃｍ^２の密度で培養した。ＭＳＣの表現型および機能の特性評価は、従前に実行された(Luz-Crawford, P. et al. PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis. Annals of the rheumatic diseases, doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696 (2016))。ＰＰＡＲβ／δ^＋／＋ ＭＳＣは、５μＭのＰＰＡＲβ／δアンタゴニストＧＳＫ０６６０とともに２４時間プレインキュベートした。

【0104】

ＣＭ－ＤｉＩによるＭＳＣ標識
蛍光細胞トレーサーＣＭ－ＤｉＩ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ)のストック溶液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１μｇ／μＬの濃度に再構成した。ＭＳＣを収集し、５ｍＬ ＰＢＳに１０^７細胞／１０μｇ ＣＭ－ＤｉＩの濃度に懸濁した。細胞を暗所で、３７℃で５分間、続いて、４℃で１５分間インキュベートした。次に、取り込まれなかった蛍光色素を、３００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄することによって除去した。標識細胞をＰＢＳに再懸濁し、心筋に注射するまで４℃で維持した。

【0105】

サイトカインの定量
サイトカインの定量のために、灌流した心臓からの流出液の収集物を、基礎条件（ｔ０）、１０分間の安定化後、および６０分間の再灌流後のプロトコールの終了時（ＩＲ６０）に得た。異なる流出液は、「Ｐｌａｔｅｆｏｒｍｅ ｄｅ Ｐｒｏｔeｏｍｉｑｕｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｄｅ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ」において、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ） Ｖ－Ｐｌｅｘ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １（マウス）キットを使用して製造業者のプロトコールに従ってアッセイを実行するまで、－８０℃で保存した。このパネルには、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＫＣ／ＧＲＯ（ＣＸＣＬ１）、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０およびＴＮＦαが含まれた。特定のサイトカインについて、検出限界より低い、すなわち、バックグラウンドノイズと区別できないサイトカイン濃度を有するサンプルは、そのサイトカインについて陰性であるとみなした。

【0106】

免疫化学
エクス・ビボ実験の終了時に、左心室（ＬＶ）を４％－ＰＦＡで固定し、パラフィン包埋した。各左心室を心尖部から基部まで切断した（４μｍ切片、各１５０μｍ）。パラフィン包埋した切片を脱パラフィン処理し、その後、アルコール勾配によって再水和した。ＬＶ切片を一次抗体：抗Ｆ４／８０（１：１００；ラットモノクローナル；Ａｂｃａｍ）、抗ＣＤ６８モノクローナル抗体（ＦＡ－１１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＸ３ＣＲ１抗体（１Ｈ１４Ｌ７；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗α－アクチニン（１：１００、マウスモノクローナル；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベートした。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳＡＳ）で染色し、内皮細胞をイソレクチンＢ４（ＦＩＴＣコンジュゲート；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。一次抗体のインキュベーション後、切片をＰＢＳで洗浄し、二次抗体（１：２，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともにインキュベートした（３時間）。一次抗体および二次抗体は、３％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有するＰＢＳで希釈した。染色した切片をＭｏｗｉｏｌ（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）に取り付けた。画像はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｚ３蛍光顕微鏡で取得し、ＩｍａｇｅＪおよびＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して分析し、最終図面を作成した。

【0107】

統計分析
平均±ＳＤ値として表したデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用したノンパラメトリックなマン・ホイットニー法（２群）およびクラスカル・ウォリス法（多重比較）を使用して比較した。グラフは、平均±標準偏差（ＳＤ）を示している。Ｐ値＜０．０５（^＊）、Ｐ＜０．０１（^＊＊）、Ｐ＜０．００１（^＊＊＊）およびｐ＜０．０００１（^＊＊＊＊）は、統計的に有意であるとみなされた。分析およびグラフ表示は、Ｇｒａｐｈ－Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して実行した。

【0108】

結果
エクス・ビボで虚血再灌流障害に供した、灌流した摘出心臓における炎症促進反応の誘導
この研究では、ＭＳＣの治療効果を評価するために、全体虚血とそれに続く再灌流（ＩＲプロトコール）のエクス・ビボモデルを開発した。摘出心臓をランゲンドルフシステムに取り付け、灌流し、３０分の全体虚血（無流）、それに続いて、６０分の再灌流に供し、この段階で細胞を投与した（図１Ａのプロトコールを参照）。研究の最初の部分は、本発明者らのモデルの特性評価に専念した。心筋虚血再灌流障害後の心臓の特徴は、左心室のパーセンテージで表した梗塞サイズの平均値５６．４±１０．３であった（図１Ｂ）。免疫組織学により、心筋の厚さに位置する心筋内在住マクロファージを証明することができた（データは示していない）。

【0109】

したがって、ＩＲ障害の誘導および心筋内のマクロファージの存在が、安定化中に収集された基礎状態（基礎）と比較して、再灌流開始後６０分において収集された冠動脈流出液中の炎症促進性サイトカインの過剰な放出と関連しているのではないかと考えた。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＶＰｌｅｘ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙを使用して定量した１０種のサイトカインのうち、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０を含む７種は、検出できないレベルのサンプルが多すぎたため、統計分析に含めなかった。３種のサイトカイン、ＴＮＦα、ＫＣ／ＧＲＯ（ＣＸＣＬ１）およびＩＬ－６は、基礎状態（１０分の安定化で収集、基礎）と比較して、ＩＲ障害後（虚血および６０分の再灌流後）の心臓における冠動脈流出液の極めて大きな増加を示した（図１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、エクス・ビボで３０分の虚血とそれに続く１時間の再灌流に供したＣ５７Ｂｌ６マウスの心臓の心筋ＩＲ障害が、炎症を起こした心筋内に浸潤するマクロファージの存在と関連していることを明らかにしている。

【0110】

ＭＳＣは、エクス・ビボ全体虚血モデルの再灌流中に投与した場合に強力な心臓保護作用を発揮した。
ＩＲ心筋の炎症を軽減し、その結果として、梗塞サイズを縮小するために、本発明者らがエクス・ビボモデルで初めて比較した２つの広く認められている心臓保護戦略：虚血ＰｏｓｔＣおよびＭＳＣに基づく療法を利用した。その目的で、図２Ａに示すプロトコールに記載するように、３０分の全体虚血に供した摘出心臓の再灌流中にＭＳＣを投与した。灌流溶液中の様々な濃度のＭＳＣを試験した（図２Ｂ）。用量反応曲線は、様々な用量のＭＳＣを使用して確立し、有意な有益な効果が得られない２，５００細胞／ｍＬ（３．１０^５細胞／心臓）と比べて（ＩＲでの５６．３９±１０．３３、ｎ＝１２に対して、ＭＳＣ ２，５００での３４．１±１３．９３、ｎ＝６；ｐ＝０．２２３８）、５，０００細胞／ｍＬ（６．１０^５細胞／心臓）および２０，０００細胞／ｍＬ（２４．１０^５細胞／心臓）により心臓保護作用が誘発されることを示した（それぞれ、ＩＲでの５６．３９±１０．３３、ｎ＝１２に対して、ＭＳＣ ５，０００の１７．２９±６，８４、ｎ＝６；ｐ＝０．０００９および５６．３９±１０．３３、ｎ＝１２に対して、ＭＳＣ ２０，０００での１７．０４±４．０７；ｎ＝６；ｐ＝０．０００９）。５，０００細胞／ｍＬの濃度は、エクス・ビボマウスモデルにおいて最大の心臓保護をもたらす最小濃度であるため、本発明者らの研究の総ての実験に選択した。さらに、５，０００細胞／ｍＬ（６．１０^５細胞／心臓）のＭＳＣによる再灌流により、本発明者らの実験で陽性対照として用いた虚血ＰｏｓｔＣと同程度に梗塞サイズが縮小することを実証した（ＭＳＣでの１７．２９±６．８４、ｎ＝６に対して、ＰｏｓｔＣでの１４．０４±４．３２、ｎ＝８、ｐ＞０．９９；図２Ｃ）。免疫組織学的分析により、エクス・ビボで灌流したＭＳＣは、１時間の再灌流後に冠状微小血管内に位置することが明らかになった（データは示していない）。まとめると、これらの結果は、６．１０^５ＭＳＣ／心臓が、ＡＭＩ中の心臓保護におけるゴールドスタンダードな戦略である虚血ＰｏｓｔＣと同じくらい治療効果があることを実証している。

【0111】

虚血ＰｏｓｔＣとＭＳＣ投与の両方の強力な心臓保護作用は、損傷した心筋内の炎症促進性サイトカインの減少と関連している
ＩＲ障害に対する虚血ＰｏｓｔＣとＭＳＣの投与の有益な効果が、免疫応答の調節と関連しているかどうかを判断するために、再灌流開始後１５、３０および６０分において収集された冠動脈流出液内の炎症促進性サイトカインを定量した（図３Ａ）。ＭＳＤアプローチを使用して定量した１０種のサイトカインのうち、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０を含む７種は、サンプルにおいて検出されなかった。しかしながら、ＴＮＦα（図３Ｂ）、ＣＸＣＬ１（ＫＣ／ＧＲＯ）（図３Ｃ）およびＩＬ－６（図３Ｄ）は、虚血ＰｏｓｔＣまたはＭＳＣの投与を受けた心臓の冠動脈流出液中に有意に低いレベルで存在した。この結果は、冠動脈流出液中の炎症促進性サイトカインの定量によって評価されるように、ＰｏｓｔＣおよびＭＳＣの保護作用が強力な抗炎症作用と関連していることを示している。

【0112】

ＰＰＡＲ β／δは、ＩＲ障害に対するＭＳＣによって媒介される心臓保護作用に関与している。
最近、関節炎の実験において、ＰＰＡＲβ／δがＭＳＣの免疫調節機能および治療機能にとって極めて重要であることを示した(Luz-Crawford, P. et al. PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 2016;75:2166-2174)。しかしながら、ＭＳＣの心臓保護活性に対するＰＰＡＲβ／δの役割および炎症を起こした心筋におけるＭＳＣの免疫調節性に対するＰＰＡＲβ／δの関連性については、これまで取り上げられていない。ＰＰＡＲβ／δがＭＳＣの心臓保護特性に重要であるかどうかを判断するために、ＰＰＡＲβ／δ^－／－欠損マウスから単離されたＭＳＣ（ＫＯ ＭＳＣ）およびそれらのＰＰＡＲβ／δ^＋／＋対照同腹仔から得られたもの（ＭＳＣ）の効果を比較した。摘出心臓を再灌流中に、６．１０^５細胞／心臓の最適用量でＭＳＣを含有する溶液によって灌流した（プロトコール図４Ａ参照）。これらの条件において、虚血障害後に摘出心臓にＫＯ ＭＳＣを灌流すると、野生型ＭＳＣによって誘発される梗塞サイズの劇的な減少（ＩＲでの５６．４±１０．３、ｎ＝１２に対して、ＭＳＣでの２４．１±１１．８、ｎ＝９；ｐ^＊＊＝０．００１）は、消失した（ＩＲでの５６．４±１０．３、ｎ＝１２に対して、ＫＯ ＭＳＣでの４８．４±２５．４、ｎ＝１３；ｐ^ｎｓ＝０．７５およびＭＳＣでの２４．１±１１．８、ｎ＝９に対して、ＫＯ ＭＳＣでの４８．４±２５．４、ｎ＝１３；ｐ^＊＝０．０２９）（図４Ｂ）。ＰＰＡＲβ／δのノックダウンに応答したＭＳＣの治療効果の喪失が、梗塞した心筋における炎症を軽減する能力の喪失と関連しているかどうかを判断するために、再灌流開始後６０分において収集された冠動脈流出液内の炎症促進性サイトカインを定量した。サイトカインのＭＳＤ定量では、ＭＳＣ処置した心臓と未処置の心臓の冠動脈流出液中のＴＮＦα濃度に変化は見られなかった。しかしながら、本発明者らは、再灌流時に収集された冠動脈流出液中のＣＸＣＬ１およびＩＬ－６濃度の有意な減少によって明らかなように、虚血障害を起こしている心臓におけるＭＳＣの抗炎症作用を実証した（ＣＸＣＬ１については：ＭＳＣでの２．５６ｐｇ／ｍｌ±３．７９、ｎ＝１０に対して、ＩＲでの１６．６１ｐｇ／ｍｌ±１０．５３、ｎ＝１０、ｐ^＊＊＝０．００１７（図４Ｄ）およびＩＬ－６については：ＭＳＣでの５．４３ｐｇ／ｍｌ±３．０２、ｎ＝１０に対して、ＩＲでの２１．８３ｐｇ／ｍｌ±１１．０８、ｎ＝１０、ｐ^＊＊＝０．００４（図４Ｅ））。注目すべきことに、ＭＳＣにおけるＰＰＡＲβ／δのノックダウンは、再灌流時に収集され維持された冠動脈流出液中のＣＸＣＬ１（ＫＯ ＭＳＣでの３．７３ｐｇ／ｍｌ±１．６５、ｎ＝８に対して、ＭＳＣでの２．５６ｐｇ／ｍｌ±３．７９、ｎ＝１０、ｐ^ｎｓ＝０．２８；図４Ｄ）およびＩＬ－６（ＫＯ ＭＳＣでの７．６５ｐｇ／ｍｌ±５．０４、ｎ＝８に対して、ＭＳＣでの５．４３ｐｇ／ｍｌ±３．０２、ｎ＝１０、ｐ^ｎｓ＞０．９９；図４Ｅ）の濃度によって明らかなように、それらの抗炎症能を変更しなかった。

【0113】

考察および結論
前記研究で使用した全体虚血（３０分）とそれに続く６０分の再灌流のエクス・ビボプロトコールが、６０分の再灌流時に収集された冠動脈流出液中のＴＮＦα、ＩＬ－６およびＣＸＣＬ１のレベルの増加によって評価されるように、炎症促進反応を誘発したことを実証した後、ＭＳＣの免疫調節機能および治療機能に対するＰＰＡＲβ／δの役割を試験した。まず、本発明者らは、最小限の細胞濃度でエクス・ビボマウスモデルにおいて有意な心臓保護を提供可能な、ＭＳＣの最適用量、６． １０^５細胞／心臓を確認した。注目すべきことに、選択したＭＳＣのこの用量では、本発明者らの研究で陽性対照として用いた虚血ポストコンディショニング（ＰｏｓｔＣ）と同様の心臓保護が観察された。実際、両方の治療により、同じ有効性でＩＲ障害の炎症促進反応を軽減し、梗塞サイズを縮小することができた。さらに、この研究は、ＭＳＣの心臓保護特性が、冠動脈流出液中のＴＮＦα、ＣＸＣＬ１およびＩＬ－６の放出に対する抗炎症作用と比べて、ＰＰＡＲβ／δ依存性であることを明らかにしている。

【0114】

ＡＭＩ患者において有益な効果があるにもかかわらず、再灌流療法は、無菌性炎症と呼ばれる局所炎症と全身炎症の両方を誘発し、ＡＭＩ後の壊死細胞を除去し、梗塞した心筋を修復するために引き起こされる初期炎症反応を強化する。革新的な治療アプローチを開発および評価するために、すでにイン・ビボで報告されているように、５６％梗塞サイズ（左心室(left ventricel)のパーセンテージで表される）および冠動脈流出液中への炎症促進性サイトカインの有意なレベルでの放出によって評価される強力なＩＲ障害を提供するエクス・ビボモデルを設計した。

【0115】

この炎症反応は、梗塞サイズの決定とその後の左心室のリモデリングに重要な役割を果たすため、ＭＩ後の臨床状態を改善するための潜在的な治療標的である。心筋を保護するために、ＡＭＩ後の炎症促進反応を間接的または直接的に標的とする多数の治療戦略が試験されてきた。

【0116】

ＩＲ障害に対する心臓保護におけるゴールドスタンダードと考えられている虚血ポストコンディショニング（ＰｏｓｔＣ）は、無数の細胞内カスケードを活性化して、調節された細胞死を阻害し、１時間の再灌流時に強い心臓保護作用を誘発するために抗炎症反応も引き起こすことが報告されている(Roubille, F. et al. Delayed postconditioning in the mouse heart in vivo. Circulation 124, 1330-1336, doi:CIRCULATIONAHA.111.031864 [pii] 10.1161/CIRCULATIONAHA.111.031864 (2011))。本研究において使用したＩＲ障害のエクス・ビボモデルでは、ＰｏｓｔＣ心臓保護戦略により、ＩＲと比較して、梗塞サイズが７５．１％縮小し（ＩＲに対するＰｏｓｔＣ、ｐ^＊）、摘出心臓の冠動脈流出液中のＴＮＦα、ＩＬ－６およびＣＸＣＬ１レベルがそれぞれ、７１．７、７１．８および９１．４％減少した。まとめると、これらの結果は、炎症反応の調節が、虚血ＰｏｓｔＣによって媒介されるＩＲ障害に対する心臓保護と関連していることを示唆している。

【0117】

これに関連して、動物モデルにおいて炎症性サイトカインおよびケモカインを標的にすることを目的とした戦略が研究されており、炎症の制御に関して有望な結果が得られている(Ong, S. B. et al. Inflammation following acute myocardial infarction: Multiple players, dynamic roles, and novel therapeutic opportunities. Pharmacol Ther 186, 73-87, doi:10.1016/j.pharmthera.2018.01.001 (2018))。しかしながら、ＡＭＩ患者で評価した場合、ほとんどの治療試験では、梗塞サイズ縮小または臨床転帰に関して何の利益も示されていない（総説については、Ong, S. B. et al. Inflammation following acute myocardial infarction: Multiple players, dynamic roles, and novel therapeutic opportunities. Pharmacol Ther 186, 73-87, doi:10.1016/j.pharmthera.2018.01.001 (2018)参照）。再灌流の補助剤としてインターロイキン－１の特異的阻害剤を使用すると、ＮＳＴＥＭＩ患者において死亡が大幅に増加することが報告されている (Morton, A. C. et al. The effect of interleukin-1 receptor antagonist therapy on markers of inflammation in non-ST elevation acute coronary syndromes: the MRC-ILA Heart Study. Eur Heart J 36, 377-384, doi:10.1093/eurheartj/ehu272 (2015))。加えて、コルチコステロイドまたは免疫抑制剤も臨床試験において不本意な結果を示しており(Ong, S. B. et al. Inflammation following acute myocardial infarction: Multiple players, dynamic roles, and novel therapeutic opportunities. Pharmacol Ther 186, 73-87, doi:10.1016/j.pharmthera.2018.01.001 (2018))、急性ＭＩ後のこの治療アプローチは問題として取り上げられ、炎症は氷山の一角であることも示唆されている。

【0118】

したがって、ＭＳＣに基づく療法を含むより包括的な療法は、多面的な虚血性心臓疾患を治療し、心臓機能を回復するための有望なアプローチとして浮上している。実際、免疫調節能力、抗線維化能力および抗アポトーシス能力を含むＭＳＣの多面発現効果を考えると、ＭＳＣに基づく療法は、ＡＭＩの３つの主な病原軸を抑えることが可能であり、したがって、医療ニーズが満たされていないこの難治性障害の突破口と考えられている。安全性および有効性は、それぞれ、有害事象の評価と、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）および死亡率の改善によって評価した。得られた結果は重大な異質性を特徴としていたが、ＭＳＣ注射は急性有害事象とは関連しておらず、患者のＬＶＥＦの改善を誘導するようであった。死亡率に有意差は報告されなかった。他の興味深い結果はほとんど研究されておらず、結論は限定されていた。本発明者らの研究では、ＭＳＣは、ＰｏｓｔＣによってもたらされる心臓保護作用と同様の心臓保護作用を発揮し、ＰｏｓｔＣは、本発明者らの研究では陽性対照と見なされるものである。実際、ＭＳＣ細胞療法を使用すると、梗塞サイズは６９．３％縮小した（ＰｏｓｔＣ 対ＭＳＣ、ｐ＝ｎｓ）。加えて、ＴＮＦα、ＩＬ－６およびＣＸＣＬ１のＭＳＤ定量によって評価すると、ＭＳＣ（６．１０^５細胞／心臓）は強い抗炎症作用をもたらしており、それぞれ、３５、７５．１および８４．６％縮小していた。本発明者らの結果は、ＡＭＩのマウスモデルで報告されたデータと一致しており、ＭＳＣの注射により、ＭＩ誘導の２日後、循環心臓と梗塞心臓の両方において、炎症促進性マクロファージを含むマクロファージ／単球の頻度が減少し、抗炎症性マクロファージおよび修復性マクロファージ（Ｆ４／８０^＋ＣＤ２０６^＋）のパーセンテージが増加したことを示している(Ben-Mordechai, T. et al. Macrophage subpopulations are essential for infarct repair with and without stem cell therapy. J Am Coll Cardiol 62, 1890-1901, doi:10.1016/j.jacc.2013.07.057 (2013); Dayan, V. et al. Mesenchymal stromal cells mediate a switch to alternatively activated monocytes/macrophages after acute myocardial infarction. Basic Res Cardiol 106, 1299-1310, doi:10.1007/s00395-011-0221-9 (2011))。したがって、ＭＳＣに基づく療法は、ＡＭＩの３つの主な病原軸のうちの１つ、すなわち、炎症に対抗し、この免疫調節性の強化は、ＡＭＩにおけるＭＳＣの治療効果の向上につながる可能性がある。実際、ＭＩのラットモデルでは、ＭＳＣにおけるＩＬ－３３の過剰発現は、対照ＭＳＣと比較して、ＬＶＥＦを改善する。ＩＬ－３３を過剰発現するＭＳＣのこの有効性強化は、イン・ビトロで抗炎症性表現型へのマクロファージの分極を促進し、ビボでの心臓炎症を軽減する高い能力と関連していた (Chen, Y. et al. The enhanced effect and underlying mechanisms of mesenchymal stem cells with IL-33 overexpression on myocardial infarction. Stem Cell Res Ther 10, 295, doi:10.1186/s13287-019-1392-9 (2019))。これに関連して、本研究では、本発明者らの研究室がこれまでに報告している、ＰＰＡＲβ／δについてノックダウンされたＭＳＣの治療的役割を試験し、ナイーブＭＳＣと比較して、イン・ビトロでのＴリンパ球の増幅と、イン・ビボでの関節炎の発生およびＣＩＡの進行の両方を阻害する能力の増強を示した(Luz-Crawford, P. et al. PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis. Annals of the rheumatic diseases, doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696 (2016))。ＴＮＦαおよびＩＦＮγでプライミングすると、ＰＰＡＲβ／δを欠損しているＭＳＣは、それらの野生型対応ＭＳＣと比較して、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１および一酸化窒素（ＮＯ）を含むＭＳＣ免疫抑制メディエーターの発現レベルが増加した (Luz-Crawford, P. et al. PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis. Annals of the rheumatic diseases, doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696 (2016))。

【0119】

本研究では、梗塞した心筋に注射した場合、ＭＳＣのＰＰＡＲβ／δノックダウンにより抗炎症性は変わらないことが観察された。実際、野生型およびＰＰＡＲβ／δ ＫＯ ＭＳＣの両方は、ＩＲプロトコール後の６０分の再灌流後の冠動脈流出液内の炎症促進性サイトカインの濃度を有意に低下させた。したがって、ＰＰＡＲβ／δ ＫＯ ＭＳＣについて本明細書で報告した心筋虚血再灌流障害におけるＭＳＣの治療効果の喪失は、ＡＭＩにおける有益な効果に極めて重要なＭＳＣの他の機能の障害に起因する可能性があり、またはそれらのアポトーシスの促進によりイン・ビボでの生存率を低下させる可能性がある。ＰＰＡＲβ／δは、癌細胞および心筋細胞を含むいくつかの細胞型の生存を促進することが報告されているため、ＭＳＣにおけるＰＰＡＲβ／δの欠損は、それらの生存率に影響を及ぼし、イン・ビボで注射すると、それらの生着を低下させる可能性があると予測しようとしている(Palomer, X., Barroso, E., Zarei, M., Botteri, G. & Vazquez-Carrera, M. PPARbeta/delta and lipid metabolism in the heart. Biochim Biophys Acta 1861, 1569-1578, doi:10.1016/j.bbalip.2016.01.019 (2016); Li, Y. J. et al. PPAR-delta promotes survival of chronic lymphocytic leukemia cells in energetically unfavorable conditions. Leukemia 31, 1905-1914, doi:10.1038/leu.2016.395 (2017); Wang, X. et al. PPAR-delta promotes survival of breast cancer cells in harsh metabolic conditions. Oncogenesis 5, e232, doi:10.1038/oncsis.2016.41 (2016))。実際、血管細胞におけるＰＰＡＲβ／δの役割は、血管細胞をアポトーシスから保護する一方で、細胞が細胞質プロスタサイクリン受容体を欠損している場合には、ＰＰＡＲβ／δの活性化によりアポトーシスが促進される(Hatae, T., et al. (2001). "Prostacyclin-dependent apoptosis mediated by PPAR delta." J Biol Chem 276(49): 46260-46267)。内皮細胞では、ＰＰＡＲβ／δの抗アポトーシス性が報告されており、根底にある機構は内皮１４－３－３活性化に関連していた(Liou, J. Y., et al. (2006). "Protection of endothelial survival by peroxisome proliferator-activated receptor-delta mediated 14-3-3 upregulation." Arterioscler Thromb Vasc Biol 26(7): 1481-1487; Brunelli, L., et al. (2007). "Peroxisome proliferator-activated receptor-delta upregulates 14-3-3 epsilon in human endothelial cells via CCAAT/enhancer binding protein-beta." Circ Res 100(5): e59-71)。また、心筋芽細胞株Ｈ９ｃ２では、選択的アゴニスト、ＧＷ５０１５１６によるＰＰＡＲβ／δ受容体の活性化が、Ｈ_２Ｏ_２誘発細胞死から細胞を保護することが報告されている(Pesant, M., et al. (2006). "Peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARdelta) activation protects H9c2 cardiomyoblasts from oxidative stress-induced apoptosis." Cardiovasc Res 69(2): 440-449)。ＰＰＡＲβ／δは、ＭＳＣによって高度に発現される(Luz-Crawford, P., et al. (2016). "PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis." Ann Rheum Dis 75(12): 2166-2174)が、それらのＣ 抗アポトーシス性および心臓保護特性はこれまで研究されていなかった。

【0120】

結論として、本発明者らの研究は、抗炎症作用が持続しているにもかかわらず、ＰＰＡＲβ／δ受容体が欠如すると、ＭＳＣの心臓保護作用は失われることを示している。このことは、ＡＭＩにおける有益な効果を改善するためにＭＳＣの免疫調節性を強化することは、第ＩＩＩ相臨床試験の不一致を克服するための唯一のまたは主要なアプローチであるべきではなく(Jeong, H. et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Ischemic Heart Disease: Systematic Review and Meta-analysis. International journal of stem cells, doi:10.15283/ijsc17061 (2018); Roncalli, J. et al. Intracoronary autologous mononucleated bone marrow cell infusion for acute myocardial infarction: results of the randomized multicenter BONAMI trial. Eur Heart J 32, 1748-1757, doi:10.1093/eurheartj/ehq455 (2011))、むしろ、患者に投与された後の生存を高めることと同時に考慮されるべきであることを示唆している。

【0121】

実施例２：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体β／δアゴニストは心筋虚血再灌流障害における間葉系幹細胞の抗アポトーシス性および治療特性を強化する
ＫＯ ＭＳＣ細胞を使用して実施例１で得られた結果に従って、心筋の虚血再灌流障害におけるそれらの抗アポトーシス性および治療特性に対するＰＰＡＲβ／δアゴニストによるＭＳＣの前処理の効果を試験した。

【0122】

材料および方法
動物実験
総ての実験を、１９８６年１１月の欧州共同体理事会指令に従って、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス(Charles River laboratory)において実施し、米国国立衛生研究所発行の「実験動物の管理と使用に関する指針」（ＮＩＨ刊行物 第８版、２０１１）に準拠した。

【0123】

ランゲンドルフエクス・ビボ研究
Ｃ５７Ｂｌ６雄マウスを、ケタミン（１４ｍｇ／ｋｇ、Ｉｍａｌｇeｎｅ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ）およびキシラジン（１４ｍｇ／ｋｇ、Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ）を含む麻酔薬カクテルの最初の筋肉内注射と、ペントバルビタール（７６．６ｍｇ／ｋｇ；Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）の２回目の注射によって麻酔した。胸骨切開後、心臓を切除し、迅速に大動脈にカニューレを挿入し、自家製ランゲンドルフシステムに取り付けた。それを、圧力および温度が一定（３７℃）のタイロード液で逆行灌流した。

【0124】

虚血・再灌流プロトコール
ランゲンドルフシステムにおいて、心臓を、１５分のタイロード灌流安定化期間の後、全体虚血を誘発するための３０分の無流期間を含む虚血－再灌流（ＩＲ）プロトコールに供した。再灌流は、タイロード液単独（ＩＲ対照）または再灌流中に投与されるタイロード液（ＭＳＣ）中のＭＳＣ細胞を使用して６０分間灌流を回復することによって達成した。虚血ポストコンディショニングは、全体虚血の最後に、１分の再灌流／１分の虚血を３サイクルとそれに続く５４分の再灌流を含むコンディショニング刺激を適用することにより誘導した。ＭＳＣに基づく細胞療法のエクス・ビボ評価のために、タイロード液で調製した様々な濃度（２５００、５０００ ｅｔ ２００００細胞／ｍＬ）のＭＳＣ細胞 ８０～１５０ｍＬ（平均値１２０ｍＬ）を、６０分の再灌流段階中に、摘出心臓の大動脈および冠状血管を介して逆行灌流した。

【0125】

梗塞サイズの評価
ＬＶは、横方向に１ｍｍ厚にスライスし、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の１％溶液中、３７℃で１５分間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液での固定後、スライスの重さを量り、各面を撮影した（オリンパス社製カメラ）。梗塞領域は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を用いた面積測定法により測定し、左心室のパーセンテージとして表した。

【0126】

ＭＳＣ培養物
マウスＭＳＣのＭＳＣ単離および増幅は、これまでに記載されている条件で実施した(Bouffi, C., Bony, C., Courties, G., Jorgensen, C. & Noel, D. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLoS One 5, e14247 (2010))。次に、ＭＳＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍｌ ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）－αに０．５×１０^６細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。ＭＳＣの表現型および分化能については従前と同様に実行した(Bouffi, C., Bony, C., Courties, G., Jorgensen, C. & Noel, D. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLoS One 5, e14247 (2010))。簡潔には、表現型の特性評価では、ＭＳＣを、０．１％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳ中で、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、フランス）のコンジュゲートモノクローナル抗体とともに２０分間インキュベートした。ＭＳＣの脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨細胞への分化に関しては、すでに報告されている誘導条件を利用した(Bouffi, C., Bony, C., Courties, G., Jorgensen, C. & Noel, D. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLoS One 5, e14247 (2010))。ＭＳＣの脂質生成分化は、オイルレッドＯ染色後の液滴形成の分析およびＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。ＭＳＣの軟骨形成分化は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価し、骨形成分化は、ＲＴ－ｑＰＣＲおよび細胞外マトリックスの石灰化によって評価した。

【0127】

ＰＰＡＲβ／δアゴニストおよびアンタゴニストによるＭＳＣの前処理とＣＭ－ＤｉＩによる標識。
ＭＳＣを、ＰＰＡＲβ／δアンタゴニスト ＧＳＫ３７８７（０．１および１μＭ）、ＰＰＡＲβ／δ逆アゴニスト ＧＳＫ０６６０（０．１および１μＭ）またはＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ０７４２（０．１、１および５μＭ）のいずれかとともに２４時間プレインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、共培養実験に使用するかまたは心筋に注射した。必要であれば、ＭＳＣを蛍光細胞トレーサーＣＭ－ＤｉＩ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ)で標識した。ＭＳＣを収集し、ＣＭ－ＤｉＩを含有するＰＢＳ ５ｍＬに懸濁した（１０^７細胞／１０μｇ）後、暗所で、３７℃で５分間、続いて、４℃で１５分間インキュベートした。標識ＭＳＣをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、心筋に注射するまで４℃で維持した。

【0128】

心筋細胞とＭＳＣの共培養
Ｈ９ｃ２、ドブネズミの心筋細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬ ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。アポトーシスを誘導するために、Ｈ９ｃ２を、３５０μＭのＨ_２Ｏ_２を含有する最少培地（ＦＢＳ不含）中で４時間培養した。心筋細胞に対するＭＳＣの影響を評価するため、細胞間接触を避けるためにトランスウェルシステムを使用した共培養アッセイを設計した。３５０μＭのＨ_２Ｏ_２の存在下で、１２ウェルディッシュの各ウェル当たり１５，０００個の心筋細胞（下部）をプレーティングし、または１５，０００個のＭＳＣ（上部）をプレーティングした。２つの異なる共培養プロトコールを実行した。プロトコール１では、Ｈ９ｃ２および共培養したＭＳＣをＨ_２Ｏ_２に暴露した（血清枯渇状態）。プロトコール２では、Ｈ９ｃ２を最少培地中のＨ_２Ｏ_２に４時間暴露し、洗浄後、細胞を完全培地中でＭＳＣと共培養した。プロトコール３では、Ｈ９ｃ２を、Ｈ_２Ｏ_２の存在下、血清を含まない通常の培地で４時間培養し、さらに１時間培養を続けた。次いで、Ｈ９ｃ２とＭＳＣの共培養を完全培地中で１時間実行した。総てのプロトコールの終了時に、アポトーシスおよびＲＴ－ｑＰＣＲ分析のためにＨ９ｃ２を回収した。

【0129】

ＤＮＡ断片化アッセイ
ＤＮＡ断片化は、細胞溶解物において、アポトーシスの誘導後の細胞の細胞質外のヒストン複合体ＤＮＡ断片（モノおよびオリゴヌクレオソーム）を測定するように設計された酵素結合免疫吸着測定キット（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＥＬＩＳＡ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてイン・ビトロ定量した。

【0130】

ＲＴ－ｑＰＣＲ
各サンプルの全ＲＮＡの単離は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ）を使用して実行した。抽出されたＲＮＡの量と質は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することにより定義した。次に、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用し、５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写してｃＤＮＡを合成した。ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）ＳＹＢＲ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０定量的検出システムを製造業者の推奨に従って使用し、ＰＣＲを実行した。ａｎｇｐｌ４、ｐｄｋ４、ｂｃｌ２、ｈｇｆ、ｐｄｇｆ、ｎｒｆ２に特異的なプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを使用して設計した。データは、ハウスキーピング遺伝子リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）に対して正規化し、それらの値を２^－ΔＣｔ法を使用して算出された特定の遺伝子発現の相対的ｍＲＮＡレベルとして表した。

【0131】

免疫ブロット法
組織サンプル（左心室）は、エクス・ビボでのＩＲプロトコール終了後、液体窒素中で急速凍結した。サンプルは、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｕｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ－１００Ｘ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＲＩＰＡバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） ｐＨ８．０］中でグラインダーを用いてホモジナイズした。遠心分離後、タンパク質の精製のためにペレットをＲＩＰＡバッファーに再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。タンパク質のサンプル（２５μｇ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（４～２０％ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル；Ｂｉｏｒａｄ）によって分離し、ニトロセルロース（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）；Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。次の抗体および供給業者を使用した：１）ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：抗カスパーゼ３（Ｕｐｓｔａｔｅ ０６－７３５）、２）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：抗リン酸化ＥＲＫ１，２；抗ＥＲＫ１，２；抗リン酸化ＡＫＴ；抗ＡＫＴ；β－チューブリン；抗α－アクチニン；ビンキュリン（Ｅ１Ｅ９Ｖ）、ＧＡＰＤＨ、３）Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ：西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ。タンパク質バンドは、ＥＣＬキット（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を使用した強化化学発光法により視覚化した。濃度測定分析は、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）およびＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を使用して実行した。各タンパク質のバンドのシグナル強度は、ローディング対照（チューブリン、ビンキュリン、ＧＡＰＤＨまたはα－アクチニン）について得られた対応する値で補正した後、ＩＲ対照条件について得られた平均値で正規化した。

【0132】

免疫化学
エクス・ビボ実験の終了時に、左心室（ＬＶ）をホルモルで固定し、パラフィン包埋した。各左心室を心尖部から基部まで切断した（４μｍ切片、各１５０μｍ）。パラフィン包埋した切片を脱パラフィン処理し、その後、アルコール勾配によって再水和した。切片をＭｏｗｉｏｌ（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）に取り付けた。ＬＶ切片は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ Ｚ１スライドスキャナー（Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）でスキャンした。スキャンは２０倍対物レンズを使用して行った。画像はＩｍａｇｅＪを使用して分析した。

【0133】

統計分析
統計分析は、ｎ≧５の独立した実験に対してのみ実行した。データ（平均±ＳＤ）は、母集団の正規性を確認した後（正規分布については、アンダーソン・ダーリング検定）、ＡＮＯＶＡパラメトリック検定を用いて分析した。適合しない場合には、ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス法、それに続いて、多重比較のダンの事後検定または２群のマン・ホイットニー法を使用した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＭａｃＯｓ用バージョン８．３．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、米国カリフォルニア州、www.graphpad.com）を用いて分析した。統計的有意性は、ｐ＞０．０５をｎｓと記し、ｐ＜０．０５を^＊と記し、ｐ＜０．０１を^＊＊と記し、ｐ＜０．００１を^＊＊＊と記し、ｐ＜０．０００１を^＊＊＊＊と記した。

【0134】

結果
全体虚血のエクス・ビボモデルにおいて再灌流中に投与されたＭＳＣの心臓保護作用はＰＰＡＲβ／δに依存する
まず、これまでに記載されているように、研究に使用したＭＳＣの表現型および機能を特徴付けた(Bouffi, C., Bony, C., Courties, G., Jorgensen, C. & Noel, D. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLoS One 5, e14247 (2010))。本発明者らは、ＭＳＣは、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５について陰性であるが、ＭＳＣで発現されるＣＤ４４およびＳｃａ－１などのマーカーについて陽性であることを示した（データは示していない）。３つの特定の系統へのＭＳＣ分化の誘導後、ＭＳＣは以下を生じた：１）ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２）の発現によって示される軟骨細胞；２）ｐｐａｒγおよびｌｐｌの発現および脂肪液滴の形成を特徴とする脂肪細胞、ならびに３）オステオカルシンの発現およびアルカリホスファターゼおよびリザリンレッドＳ染色（データは示していない）を特徴とする骨芽細胞。本発明者らのＩＲ障害のエクス・ビボモデルにおいてＭＳＣの保護作用を評価するために、全体虚血に供した摘出心臓の再灌流段階中にＭＳＣを様々な濃度で（タイロード液中２５００、５０００ ｅｔ １００００細胞／ｍＬ）投与した（プロトコール、図５Ａ参照）。図５Ｂは、ＭＳＣの心臓保護作用の用量反応について得られたＵ字曲線を示す。５，０００細胞／ｍＬの濃度は、ＰｏｓｔＣ刺激によってもたらされる最適な有効性と同様の最適な有効性を提供する用量として特定され、これは、本発明者らの実験では陽性対照と見なされた（ＭＳＣ ５，０００；ｎ＝１２での３０．２７±５．８９に対して、ＰｏｓｔＣでの２８．１３±４．６９、ｎ＝７；ｐ ＄＞０．９９９）。加えて、２，５００細胞／ｍＬの用量（ＩＲでの４６．５１±６．２８、ｎ＝１１に対して３８．６４±５．３６、ｎ＝１１；ｐｎｓ＝０．８０）でも、試験した最大の１０，０００細胞／ｍＬ（ＩＲでの４６．５１±６．２８、ｎ＝１１に対してＭＳＣ １０，０００での５０．２８±１１．０９、ｎ＝６；ｐｎｓ＞０．９９９）でも、ＩＲと比較して、梗塞サイズの有意な縮小は生じなかった。

【0135】

以前の研究で、分化能および免疫調節性を含むＭＳＣ機能におけるＰＰＡＲβ／δ発現の極めて重要な役割を実証したため、本明細書ではＭＳＣの心臓保護作用における役割に焦点を当てた(Scholtysek, C. et al. PPARβ/δ governs Wnt signaling and bone turnover. Nat Med 19, 608-613, doi:10.1038/nm.3146 (2013; Luz-Crawford, P. et al. PPARbeta/delta directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis. Ann Rheum Dis 75, 2166-2174, doi:10.1136/annrheumdis-2015-208696 (2016);Contreras-Lopez, R. A. et al. PPARβ/δ-dependent MSC metabolism determines their immunoregulatory properties. Sci Rep 10, 11423, doi:10.1038/s41598-020-68347-x (2020))。その目的で、ＭＳＣを、ＩＲ障害のエクス・ビボモデルに投与する（５，０００細胞／ｍＬ）前に、ＰＰＡＲβ／δアンタゴニストまたはアゴニスト薬剤で前処理した。図５Ｃは、ＭＳＣ（５，０００細胞／ｍＬ）を、再灌流段階中のエクス・ビボ虚血心臓に投与する前に、ＧＳＫ０６６０（１μＭ）で２４時間前処理すると心臓保護が低下したことを示している（ＭＳＣでの３０．２７±５．８９、ｎ＝１２に対して、ＭＳＣ＋ＧＳＫ０６６０での３７．７８±５．３１、ｎ＝９；ｐ＃＝０．０１９）。この結果に従って、様々な用量（０．１、１および５μＭ）でのＧＷ０７４２ ＰＰＡＲβ／δアゴニストの使用が、それ自体では保護できないより低い用量（２，５００細胞／ｍｌ）で投与されたＭＳＣによってもたらされる心臓保護の改善と関連しているかどうかを調査した。まず、ＭＳＣ培養物に対するＧＷ０７４２ ＰＰＡＲβ／δアゴニスト前処理の効果を検証し、ＧＷ０７４２のアゴニスト効果がａｎｇｐｌ４およびｐｄｋ４標的遺伝子の発現レベルの増加と関連しており、アゴニストの機能性の実証が可能であることを見出した（データは示していない）。次に、様々な濃度のＰＰＡＲβ／δアゴニストでのＭＳＣの前処理は１μＭの濃度で心臓保護作用を誘導した（ＩＲでの４６．５１±６．２８、ｎ＝１１に対して、ＭＳＣ＋ＧＷ０７４２ １μＭでの２５．７７±４．６８、ｎ＝７；ｐ^＊＊＊＊＜０．０００１）ことを示したが、０．１および５μＭでは有益な効果は観察されなかった。２５００ｃ／ｍＬでの投与前にＧＷ０４７２（１μＭ）で細胞を前処理することにより、５０００ｃ／ｍＬのナイーブＭＳＣを使用して観察された心臓保護作用と同じ心臓保護作用を誘導することができた（図５Ｅ）。ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの治療効果のこの改善は、ＤｉＩ標識ＭＳＣを使用した免疫組織学実験によって評価されたように、梗塞した心筋組織に移植されたＭＳＣの数の増加と関連しており、ＧＷ０４７２での前処理によって蛍光のパーセンテージが３．５倍増加したことが示された（図５Ｆ）。

【0136】

ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの模擬ＩＲに対する耐性の増加
組織学的実験により、ＭＳＣをＰＰＡＲβ／δアゴニストでプライミングすると、心筋の梗塞領域におけるＭＳＣ数の増加が明らかになったため、まず、プライムドＭＳＣのＩＲストレスに対する耐性を調べた。これを行うために、ＭＳＣを、様々な濃度のＨ_２Ｏ_２（１００、２５０、３５０、５００および７５０μＭ；図６Ａのプロトコール参照）を使用してイン・ビトロで４時間、ＩＲ模擬ストレスに供した。アポトーシスの定量は、異なる処理群の特異的なＤＮＡ断片化の測定によって評価した。本発明者らは、１００μＭのＨ_２Ｏ_２に暴露したＭＳＣにおいてＨ_２Ｏ_２により特異的なＤＮＡ断片化が誘導され、そのスコアは１００μＭから７５０μＭまで横ばい状態であることを見出した（図６Ｂ）。２５０μＭの濃度のＨ_２Ｏ_２を選択したのは、その濃度が、未処理のＭＳＣと比較して、最大の効果を提供する最低用量であるためであった（ｐ^＊＊＊＊）。Ｈ_２Ｏ_２に対するＭＳＣの耐性におけるＰＰＡＲβ／δの役割を決定するために、Ｈ_２Ｏ_２ストレス誘導（２５０μＭで４時間）の前に、異なる濃度（０．１および１μＭ）のＰＰＡＲβ／δアンタゴニストおよびアゴニストで２４時間、ＭＳＣを前処理した。０．１μＭのＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ０７４２でのＭＳＣの前処理により、酸化的ストレスに対するＭＳＣの抵抗能力は変わらなかった（図６Ｃ）。しかしながら、１μＭのＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ０７４２での前処理により、Ｈ_２Ｏ_２に暴露したナイーブＭＳＣと比較して、ＭＳＣの耐性は有意に増強された（ｐ^＊）。１μＭのＰＰＡＲβ／δアンタゴニスト ＧＳＫ０６６０での前処理により、Ｈ_２Ｏ_２誘発酸化に対するＭＳＣの耐性は有意に達することなく低下した（図６Ｃ）。ＰＰＡＲβ／δアゴニストでの前処理によって誘導されるＭＳＣのアポトーシスに対する耐性のこの増強は、特に、０．１μＭのＧＷ０７４２での前処理後の、ｂｃｌ２遺伝子発現レベルの有意な増加によって確認された（ｐ^＊＊）。逆に、１μＭのＧＳＫ０６６０でのＭＳＣの前処理により、ｂｃｌ２遺伝子発現レベルは、対照のＨ_２Ｏ_２処理したＭＳＣと比較して、有意に低下した（ｐ^＊；図６Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＰＰＡＲβ／δの活性化により、Ｈ_２Ｏ_２誘発模擬ＩＲストレスによってもたらされるアポトーシスからＭＳＣが保護されることを明らかにした。

【0137】

ＰＰＡＲβ／δプライミングは、ＩＲ様酸化的ストレスに暴露した心筋細胞に対するＭＳＣの保護作用を高める
心筋細胞に対するＭＳＣ誘導の保護作用におけるＰＰＡＲβ／δの役割を決定するために、梗塞組織に移植されたときにＭＳＣが受けるストレスを模倣するための３つのプロトコールを設計および開発した。第１のプロトコールは、トランスウェルを使用して、ナイーブなＭＳＣまたはプライムドＭＳＣを、３５０μＭのＨ_２Ｏ_２に４時間暴露したＨ９ｃ２とともに共培養することにあった。第２のプロトコールは、完全培地でそれらとナイーブなＭＳＣまたはプライムドＭＳＣを共培養する前に、Ｈ９ｃ２を３５０μＭのＨ_２Ｏ_２に４時間曝露することにあった。第３のプロトコールは、完全培地でそれらとナイーブなＭＳＣまたはプライムドＭＳＣを共培養する前に、Ｈ９ｃ２を３５０μＭのＨ_２Ｏ_２に４時間曝露し、それに続いて、血清枯渇を１時間行うことにあった。（図７Ａ）。第１のプロトコールでは、１μＭのＧＳＫ０６６０またはＧＳＫ３７８７で前処理したＭＳＣは、ナイーブＭＳＣと比較して、心筋細胞をアポトーシスから保護する能力を失うことが見出された。これに対して、０．１および１μＭのＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ０７４２で前処理したＭＳＣは、ナイーブＭＳＣと比較して、Ｈ_２Ｏ_２誘発酸化的ストレスに暴露した心筋細胞に対してより高い抗アポトーシス効果を示した（図７Ｂ）。第２のプロトコールでは、１μＭのＧＳＫ０６６０またはＧＳＫ３７８７でのＭＳＣの前処理により、Ｈ_２Ｏ_２ストレスを受けた心筋細胞に対するＭＳＣ保護特性は変わらないことが示された。しかしながら、１μＭのＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ０７４２でのＭＳＣの前処理により、ナイーブＭＳＣと比較して、ＩＲ様酸化的ストレスに暴露した心筋細胞に対する有意な保護作用がもたらされた（ＭＳＣ、ｎ＝１８ 対ＭＳＣ／１μＭ ＧＳＫ０７３４２、ｎ＝１０；ｐ^＊＊＊＝０．０００８）（図７Ｃ）。第３のプロトコールについては、１μＭのＧＳＫ０６６０またはＧＳＫ３７８７で前処理したＭＳＣは、ナイーブＭＳＣと比較して、心筋細胞をアポトーシスから保護する能力を失う。ＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ０７４２での前処理（１μＭ）により、ナイーブＭＳＣと比較して、ＩＲ様酸化的ストレスに暴露した心筋細胞に対する有意な保護作用がもたらされた（ＭＳＣ、ｎ＝１１ 対ＭＳＣ／１μＭ ＧＳＫ０７３４２、ｎ＝６；ｐ^＊＝０．００４３２６）（図７Ｄ）。まとめると、これらの結果は、損傷した心筋細胞との共培養に先立ち、ＰＰＡＲβ／δアゴニストでＭＳＣを前処理することにより、イン・ビトロでの心筋細胞に対する抗アポトーシス性が強化されることを明らかにした。

【0138】

ＰＰＡＲβ／δプライミングは、ＭＳＣパラクリン機能に対するＩＲ様酸化的ストレスの抑制効果を逆転させる
ＭＳＣ移植は、ＡＭＩモデルに適用した場合の心臓再生能力についても記載されているＶＥＧＦ(Scott, R. C. et al. Targeting VEGF-encapsulated immunoliposomes to MI heart improves vascularity and cardiac function. Faseb j 23, 3361-3367, doi:10.1096/fj.08-127373 (2009); Ruvinov, E., Leor, J. & Cohen, S. The promotion of myocardial repair by the sequential delivery of IGF-1 and HGF from an injectable alginate biomaterial in a model of acute myocardial infarction. Biomaterials 32, 565-578, doi:10.1016/j.biomaterials.2010.08.097 (2011))およびＰＤＧＦ(Xu, B., Luo, Y., Liu, Y., Li, B. Y. & Wang, Y. Platelet-derived growth factor-BB enhances MSC-mediated cardioprotection via suppression of miR-320 expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol 308, H980-989, doi:10.1152/ajpheart.00737.2014 (2015))を含む抗アポトーシス因子を放出する能力により、ＩＲ誘導性アポトーシスを抑制する。したがって、これらの因子の転写物レベルを調節するＭＳＣの能力に対するＨ_２Ｏ_２誘発酸化的ストレスの効果を試験し（図８Ａ）、Ｈ_２Ｏ_２ストレスを受けたＭＳＣが、ｖｅｇｆ－ａ転写物を上方調節し、ｈｇｆおよびｐｄｇｆの転写物を下方調節する能力の増強を示すことを見出した（図８Ｂ～Ｄ）。０．１または１μＭのＧＳＫ０６６０で前処理したＭＳＣでは、ｖｅｇｆ－ａ転写物の量が有意に減少することを証明した（それぞれ、ｐ^＊＊＊およびｐ^＊；図８Ｂ）。同様の傾向がｈｇｆおよびｐｄｇｆについても観察された（図８Ｃ、Ｄ）。これに対して、０．１および１μＭのＰＰＡＲβ／δアゴニスト ＧＷ０７４２でのＭＳＣの前処理により、ＭＳＣのｖｅｇｆ－ａおよびｈｇｆ転写レベルは変わらなかった（図８Ｂ、Ｃ）が、１μＭの濃度で適用した場合、ｐｄｇｆの発現は有意に増加した（ｐ^＊；図８Ｄ）。

【0139】

ＰＰＡＲβ／δ－プライミングは、エクス・ビボでのＭＳＣの心臓保護作用を高める
心筋細胞に対するＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの強力な抗アポトーシス効果を心臓全体においてさらに確認した。エクス・ビボでＩＲ障害に供した心臓におけるウエスタンブロット分析により、ＭＳＣ処理が、未処理のＩＲ条件と比較して、カスパーゼ３の活性化の減少をもたらしたことを示すことができた（図９Ａ）。ＭＳＣをＧＷ０７４２ ＰＰＡＲβ／δアゴニスト（１μＭ）で２４時間前処理すると、カスパーゼ３開裂のこの阻害はさらに増加した（図９Ｂ）。これに対して、再灌流時のエクス・ビボ ＩＲ心臓への注射に先立ち、ＧＳＫ０６６０ ＰＰＡＲβ／δアンタゴニストでＭＳＣを前処理することにより、ＩＲ対照条件と同じレベルでカスパーゼ３の完全活性化が回復した。

【0140】

加えて、ＥＲＫ１／２（図９Ｃ）およびＡＫＴ（図９Ｄ）生存促進キナーゼのリン酸化パターンの評価では、ＭＳＣを再灌流中の投与前にＧＷ０７４２ ＰＰＡＲβ／δアゴニスト（１μＭ）で前処理した場合、ＭＳＣ処置したＩＲ心臓と未処置のＩＲ心臓のリン酸化比ｐＡｋｔ／Ａｋｔの有意な増加を示した。これに対して、ナイーブＭＳＣをＩＲプロトコールの虚血後の段階で投与した場合には、ｐＥＲＫ１／２／ＥＲＫ１／２比に変化はなかった。

【0141】

考察および結論
本発明者らの研究は、ＰＰＡＲβ／δの活性化が、ＭＳＣをアポトーシスから保護し、抗アポトーシス性および心筋虚血再灌流障害に対する治療特性を強化することを初めて実証した。この研究のために、ナイーブなＭＳＣとＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの治療効果を評価および比較するために、全体虚血とそれに続く再灌流からなるエクス・ビボモデル（ＩＲプロトコール）を開発した。ＩＲプロトコールに供した心臓の再灌流段階中にＭＳＣを投与したことによって、梗塞サイズを縮小させることができた。ＭＳＣを投与前に２４時間、ＰＰＡＲβ／δアンタゴニストで前処理した場合、それらの心臓保護作用は有意に減少した。ＰＰＡＲβ／δアゴニストでの前処理により、ＭＳＣによって誘発される心臓保護が有意に増強され、これは心室壁で検出された細胞数の有意な増加と関連していた。本発明者らは、ＰＰＡＲβ／δの予備活性化によりＭＳＣの生存と酸化的ストレスに対する耐性が増加され得ることをイン・ビトロで証明した。Ｈ_２Ｏ_２誘発ストレスに対するＭＳＣの耐性のこの増加は、ＭＳＣをＰＰＡＲβ／δアゴニストを用いて、また、ｂｃｌ２転写物の量の増加によってプライミングされた場合のアポトーシス率の低下と関連していた。加えて、ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣは、Ｈ_２Ｏ_２ストレスを受けた心筋細胞培養物に対してナイーブＭＳＣよりも強力な抗アポトーシス治療効果を有していた。心臓全体では、本発明者らの結果は、カスパーゼ３活性化のウエスタンブロット分析によって評価したように、ＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣの抗アポトーシス効果は、ナイーブＭＳＣによってもたらされる効果よりも有効であることも明らかにした。したがって、ＡＫＴ生存促進キナーゼのリン酸化比もナイーブＭＳＣで処置したＩＲ心臓に対してＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣで処置したＩＲ心臓で増加した。

【0142】

再灌流は、両刃の剣と考えられたとしても、急性心筋梗塞患者に推奨される唯一の治療である(Braunwald, E. & Kloner, R. A. Myocardial reperfusion: a double-edged sword? J Clin Invest 76, 1713-1719, doi:10.1172/JCI112160 (1985))。虚血障害の解決における明らかな有益な効果であるにもかかわらず、責任動脈の血行再建は脅かされている心筋組織において酸素の突然の復帰をもたらす。致死的再灌流障害は、再灌流の開始時に起こる、アポトーシス死に至る、虚血期間の終了時に生存能力のある心臓細胞の死に相当する(Piper, H. M. & Garcia-Dorado, D. Prime causes of rapid cardiomyocyte death during reperfusion. Ann Thorac Surg 68, 1913-1919, doi:10.1016/s0003-4975(99)01025-5 (1999); Zhao, Z. Q. et al. Progressively developed myocardial apoptotic cell death during late phase of reperfusion. Apoptosis 6, 279-290 (2001))。細胞死、アポトーシス、壊死、ネクロトーシスおよびオートファジーの多くの調節された形態は、虚血再灌流障害中に心臓細胞で活性化され得る。アポトーシスおよび壊死は、主に重度の損傷の場合に誘発され、オートファジーは、障害がより中程度の場合に細胞生存を確保するのに寄与する(Galluzzi, L. et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell death and differentiation 25, 486-541, doi:10.1038/s41418-017-0012-4 (2018))。虚血イベント後の調節された細胞死経路を標的にすることは、再灌流障害を防止し、梗塞サイズを制限するための主な戦略として考えられる(Boisguerin, P. et al. A novel therapeutic peptide targeting myocardial reperfusion injury. Cardiovasc Res 116, 633-644, doi:10.1093/cvr/cvz145 (2020))。抗アポトーシス戦略によって、再灌流により誘発されるアポトーシス細胞死を特異的に阻害することが可能となり、マウス心臓で本発明者らのグループが最近証明したように、長期の心臓保護作用がもたらされる(Covinhes, A. et al. Anti-apoptotic peptide for long term cardioprotection in a mouse model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Sci Rep 10, 18116, doi:10.1038/s41598-020-75154-x (2020))。本発明者らの研究で使用したエクス・ビボモデルは、開裂カスパーゼ３発現のウエスタンブロット分析によって証明されたように、強いアポトーシス促進ストレスを誘発する４６．５％梗塞サイズ（ＬＶの％として表される）を生成するように設計したものである（ＳＨＡＭ、ｎ＝６ 対ＩＲ、ｎ＝１０；ｐ^＊＊＝０．００４７；データは示していない）。灌流した摘出心臓のこのエクス・ビボモデルにおいて再灌流時に投与されたＭＳＣは、梗塞サイズの３５％縮小をもたらした。イン・ビボデータで既に証明されている心臓保護のＵ字型曲線が観察され、臨床試験で報告されているように、ＭＳＣによって誘発される心臓保護が用量依存的であることが明確に示されている。実際、ＡＭＩ患者では、最近の研究により、１週間以内に１０^７個未満のＭＳＣ用量で投与した場合のみ左心室の収縮機能が向上したが、１週間後に１０^７個を超える細胞を投与すると逆の効果があったことが示されている(Wang, Z. et al. Rational transplant timing and dose of mesenchymal stromal cells in patients with acute myocardial infarction: a meta-analysis of randomized controlled trials. Stem Cell Res Ther 8, 21, doi:10.1186/s13287-016-0450-9 (2017))。この研究と一致して、慢性進行性虚血性心不全の治療におけるＭＳＣの心臓保護作用についてのＵ字型曲線が報告されており、最高用量の細胞では結果が劣ることを示している(Bartunek, J. et al. Congestive Heart Failure Cardiopoietic Regenerative Therapy (CHART-1) trial design. Eur J Heart Fail 18, 160-168, doi:10.1002/ejhf.434 (2016))。Ｕ字型曲線により、最大の心臓保護作用を提供する最適用量を特定することができた（６０分間、５０００ｃ／ｍＬで再灌流）。心臓あたりに投与された細胞の対応量は約７．５．１０^５細胞であり、これは比較的低用量に相当する。より高用量のＭＳＣを使用すると、心臓保護機能の喪失が生じた。これら結果は、ヒトではより高用量（１０^７個を超える細胞）の投与後に悪影響が現れたという観察と一致している(Wang, Z. et al. Rational transplant timing and dose of mesenchymal stromal cells in patients with acute myocardial infarction: a meta-analysis of randomized controlled trials. Stem Cell Res Ther 8, 21, doi:10.1186/s13287-016-0450-9 (2017))。興味深いことに、ＰＰＡＲβ／δアゴニストでプライミングしたＭＳＣによって、心臓へのＭＳＣの注射用量を二分の一に減らすことができることも観察された。実際、本発明者らの研究では、３．１０^５個のＭＳＣの用量で注射したＰＰＡＲβ／δプライムドＭＳＣを使用してエクス・ビボで観察された心臓保護作用は、最適用量（６．１０^５個のＭＳＣ）で投与したナイーブＭＳＣで得られたものと同様であった。損傷した心筋に注射されたＭＳＣについて既に報告されているように、エクス・ビボで証明されたＭＳＣによって誘発される心臓保護は、左心室で測定された開裂カスパーゼ３の量の減少と関連していた(Ward, M. R., Abadeh, A. & Connelly, K. A. Concise Review: Rational Use of Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Ischemic Heart Disease. Stem Cells Transl Med 7, 543-550, doi:10.1002/sctm.17-0210 (2018))。ＰＰＡＲβ／δアゴニストでのＭＳＣプライミングにより、ナイーブＭＳＣを使用してエクス・ビボで心臓において証明された抗アポトーシス性が悪化した。この結果は、心筋細胞共培養物におけるＨ_２Ｏ_２誘導性アポトーシスを阻害するプライムドＭＳＣの有効性の増加を示すイン・ビトロ実験によってさらに確認された。移植時点においてＭＳＣに及ぼす環境の影響を模倣した様々なプロトコールを使用して、ＰＰＡＲβ／δアゴニストによるプライミングによってＭＳＣの治療特性が増加し得ることを証明した。プロトコール２および３では、プロトコール１と比べて、ＭＳＣとＨ９ｃ２との共培養は、イン・ビボでは、ＭＳＣが、梗塞領域の部位での酸素を含む血液の存在下での再灌流期間中に送達されると仮定して、完全培地の存在下で実現された。しかしながら、２つのプロトコールでは、ＭＳＣはＨ_２Ｏ_２の暴露を受けておらず、これは臨床的状況を表していない。したがって、補足プロトコールでプライムドＭＳＣの心臓保護作用を調査することは興味深いことである。このプロトコールでは、Ｈ９ｃ２は、ストレスを受けた心筋細胞とプライムドＭＳＣの両方が存在する虚血心臓への酸素を含む血液の再流入を模倣するために完全培地に切り替えられる前の４時間、Ｈ_２Ｏ_２誘発ストレスにまだ直面しているＭＳＣと共培養される前に酸化的ストレスに暴露される。

【0143】

最近、マウス関節炎に焦点を当てたイン・ビボ概念実証研究において、本発明者らのグループは、ＰＰＡＲβ／δの発現レベルによりＭＳＣの免疫調節能が予測され、その下方調節により治療上の抗炎症作用が高まることを実証した(Luz-Crawford P, Ipseiz N, Espinosa-Carrasco G, et al. PPARβ/δ directs the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in arthritis Annals of the Rheumatic Diseases 2016;75:2166-2174)。本研究では、エクス・ビボ投与前のＰＰＡＲβ／δ活性の下方調節により、ＩＲ損傷心臓におけるＭＳＣの心臓保護作用が低下した。同様に、ＰＰＡＲβ／δアゴニスト（ＧＷ０７４２、１μＭ）でのＭＳＣの前処理により、この心臓保護作用は増強された。実際、梗塞した心臓の再灌流中に２５００細胞／ｍＬ（弱く有意でない有益な効果をもたらす）で投与されたＭＳＣにおけるＰＰＡＲβ／δ受容体を刺激することにより心臓保護特性が現れることを実証した。イン・ビトロでは、本明細書において、ＭＳＣにおいて、ＰＰＡＲβ／δでのプレコンディショニングがＨ_２Ｏ_２ストレスに供した場合にアポトーシスから保護する能力の増強と関連していることを初めて実証した。Ｈ９ｃ２心筋芽細胞、内皮細胞、ニューロンまたはケラチノサイトを含むいくつかの分化した細胞型では、イン・ビトロ実験でＰＰＡＲβ／δ刺激により抗アポトーシス効果がもたらされることが報告されているｓ(Liou, J. Y., et al. Protection of endothelial survival by peroxisome proliferator-activated receptor-delta mediated 14-3-3 upregulation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 26, 1481-1487, doi:10.1161/01.ATV.0000223875.14120.93 (2006); Pesant, M. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARdelta) activation protects H9c2 cardiomyoblasts from oxidative stress-induced apoptosis. Cardiovasc Res 69, 440-449, doi:10.1016/j.cardiores.2005.10.019 (2006); Brunelli, L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta upregulates 14-3-3 epsilon in human endothelial cells via CCAAT/enhancer binding protein-beta. Circ Res 100, e59-71, doi:10.1161/01.RES.0000260805.99076.22 (2007))。

【0144】

内皮細胞では、ＰＰＡＲβ／δの抗アポトーシス性は、アポトーシス促進因子Ｂａｄに結合する内皮１４－３－３の発現増加によって媒介され、その後、酸化的ストレスに対する保護の増大につながることが示されている(Liou, J. Y., et al. Protection of endothelial survival by peroxisome proliferator-activated receptor-delta mediated 14-3-3 upregulation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 26, 1481-1487, doi:10.1161/01.ATV.0000223875.14120.93 (2006); Brunelli, L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta upregulates 14-3-3 epsilon in human endothelial cells via CCAAT/enhancer binding protein-beta. Circ Res 100, e59-71, doi:10.1161/01.RES.0000260805.99076.22 (2007))。

【0145】

ＡＫＴ１経路などのＰＰＡＲβ／δ受容体の活性化に続く他の抗アポトーシス機構も強調されている。実際、Ｄｉ－Ｐｏiと共同研究者らは、ケラチノサイトでのＰＰＡＲβ／δの活性化は、ｉｌｋ（インテグリン結合キナーゼ）およびｐｄｋ１（３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ－１）の転写を増加させることによってアポトーシスを防止することを示した(Di-Poi, N., et al. Antiapoptotic role of PPARbeta in keratinocytes via transcriptional control of the Akt1 signaling pathway. Mol Cell 10, 721-733, doi:10.1016/s1097-2765(02)00646-9 (2002))。Ｇａｍｄｚｙｋのチームは、ニューロンのストレスの状況において、アゴニストＧＷ０７４２によるＰＰＡＲβ／δの活性化は、アポトーシス促進経路ＡＳＫ１／ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化に関与するＴＸＮＩＰ（チオレドキシン相互作用タンパク質）を阻害することを示した(Gamdzyk, M. et al. Role of PPAR-β/δ/miR-17/TXNIP pathway in neuronal apoptosis after neonatal hypoxic-ischemic injury in rats. Neuropharmacology 140, 150-161, doi:10.1016/j.neuropharm.2018.08.003 (2018))。ＭＳＣに関しては、Ｈ_２Ｏ_２誘発ストレスの存在下で観察されたアポトーシス率の低下は、ＭＳＣの治療特性の増強を説明するために主として重要である可能性がある。アポトーシスは、特に、ＩＲ障害後に損傷を受けた心臓などの損傷組織にＭＳＣを移植する場合に、ＭＳＣの生存能力に影響を及ぼす細胞死のよく知られた機構である(Zhu, W et al. Hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells. Stem cells 24, 416-425, doi:10.1634/stemcells.2005-0121 (2006))。移植後にＭＳＣのアポトーシスを阻害し、ＭＳＣのヒートショック治療 (Gao, F. et al. Heat shock protein 90 protects rat mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis via the PI3K/Akt and ERK1/2 pathways. J Zhejiang Univ Sci B 11, 608-617, doi:10.1631/jzus.B1001007 (2010))または低酸素調節性ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）ベクター修飾 (Tang, Y. L. et al. Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated heme oxygenase-1 vector. Journal of the American College of Cardiology 46, 1339-1350, doi:10.1016/j.jacc.2005.05.079 (2005))などの低酸素・再酸素化障害をＭＳＣが生き残るよう助けるためのいくつかの戦略が開発された。ＭＳＣの治療効果に悪影響を及ぼす要因の中で、細胞移植後の生存率の低下は非常に重要である。したがって、ＩＲ障害に対するＭＳＣの治療効果を向上させることを目的として、酸化的ストレスに対するＭＳＣの耐性を高める必要がある(Li, L., Chen, X., Wang, W. E. & Zeng, C. How to Improve the Survival of Transplanted Mesenchymal Stem Cell in Ischemic Heart? Stem Cells Int 2016, 9682757, doi:10.1155/2016/9682757 (2016))。本発明者らの研究は、ＰＰＡＲβ／δアゴニストによるプライミングにより、イン・ビトロでＨ_２Ｏ_２誘発酸化的ストレスに対するＭＳＣの耐性を増加させることができることを証明した。さらに、ＲＴ－ｑＰＣＲ実験では、ＰＰＡＲβ／δによるプライミングでのＨ_２Ｏ_２誘発ストレスに対するＭＳＣの耐性の増加は、抗アポトーシスｂｃｌ２遺伝子転写物の量の増加と関連し、アポトーシス率の低下を裏付けていることを示した。

【0146】

さらに、ｖｅｇｆ（血管内皮増殖因子）遺伝子の上方調節が観察された。ＶＥＧＦは、Ｎｒｆ２活性化の下流の血管新生促進プログラムを活性化し、抗アポトーシス効果を提供することが報告されている。さらに、ＭＳＣによって分泌されるＶＥＧＦは、同じくＭＳＣによって放出されるＨＧＦと相乗作用して、内皮バリア機能を保護し得る(Yang, Y. et al. Synergism of MSC-secreted HGF and VEGF in stabilising endothelial barrier function upon lipopolysaccharide stimulation via the Rac1 pathway. Stem Cell Res Ther 6, 250, doi:10.1186/s13287-015-0257-0 (2015))。

【0147】

本発明者らの研究では、ｖｅｇｆは、ＰＰＡＲβ／δアゴニストプライムドＭＳＣにおけるＭＳＣのＨ_２Ｏ_２曝露で増加し、ｖｅｇｆがＰＰＡＲβ／δの抗アポトーシス効果と関与していることが示唆され、同じ発現プロファイルがＨＧＦでも観察された。ＨＧＦおよびＶＥＧＦパラクリン因子は両方とも抗アポトーシス性を示す(Kinnaird, T. et al. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms. Circ Res 94, 678-685, doi:10.1161/01.RES.0000118601.37875.AC (2004); Xu M, Uemura R, Dai Y, Wang Y, Pasha Z and Ashraf M. In vitro and in vivo effects of bone marrow stem cells on cardiac structure and function. J Mol Cell Cardiol. 2007;42:441-8)。実際、ＶＥＧＦは、骨髄由来のＭＳＣによって分泌され、損傷した心筋細胞において、ｍｉＲＮＡ－２３ａおよびｍｉＲＮＡ－９２の下方調節を介して抗アポトーシス効果をもたらすことが報告されている (Song, Y. S. et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived vascular endothelial growth factor attenuates cardiac apoptosis via regulation of cardiac miRNA-23a and miRNA-92a in a rat model of myocardial infarction. PLoS One 12, e0179972, doi:10.1371/journal.pone.0179972 (2017)。

【0148】

ＨＧＦは、特に、Ａｋｔのような生存経路の活性化によって、酸化的ストレス誘導性アポトーシスから心臓細胞を保護すると報告されている(Wang, Y., Ahmad, N., Wani, M. A. & Ashraf, M. Hepatocyte growth factor prevents ventricular remodeling and dysfunction in mice via Akt pathway and angiogenesis. J Mol Cell Cardiol 37, 1041-1052, doi:10.1016/j.yjmcc.2004.09.004 (2004))。低酸素プレコンディショニングでは、低酸素・再酸素化ストレスに対するＭＳＣの耐性は増大し、ｂｃｌ－２およびｖｅｇｆ発現の上方調節と関連し、ＥＲＫおよびＡｋｔを促進した(Wang, J. A. et al. Hypoxic preconditioning attenuates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells. Acta Pharmacol Sin 29, 74-82, doi:10.1111/j.1745-7254.2008.00716.x (2008))。

【0149】

最後に、Ｈ_２Ｏ_２誘発ストレスに暴露されたＭＳＣで観察されたｐｄｇｆの発現レベルの有意な低下は、ＭＳＣをＰＰＡＲβ／δで前処理することにより大幅に抑制されるが、ＰＰＡＲβ／δアンタゴニストでの前処理後に上昇する傾向があることを観察した。これは、いくつかの細胞型をアポトーシスから保護し、肥大成長を誘導すると報告されている、十分に裏付けされたＰＤＧＦの役割と一致している(Vantler, M. et al. PDGF-BB protects cardiomyocytes from apoptosis and improves contractile function of engineered heart tissue. J Mol Cell Cardiol 48, 1316-1323, doi:10.1016/j.yjmcc.2010.03.008 (2010))。心筋細胞の生存と機能に関しては、ＰＤＧＦが、心筋細胞の生存、α－サルコメアのアクチニン含量および収縮性能を改善することが示された(Vantler, M. et al. PDGF-BB protects cardiomyocytes from apoptosis and improves contractile function of engineered heart tissue. J Mol Cell Cardiol 48, 1316-1323, doi:10.1016/j.yjmcc.2010.03.008 (2010))。したがって、ＰＰＡＲβ／δアゴニストでプライミングしたＭＳＣの抗アポトーシス効果の増強は、部分的には、ｖｅｇｆ、ｈｇｆおよびｐｄｇｆの発現レベルの増加の組合せによって媒介される可能性がある。この仮説は機能の損益実験で調査する必要がある。

【0150】

結論として、本発明者らの研究は、増強されたＭＳＣに基づく細胞産物が、強力な抗アポトーシス効果と、再灌流開始から１時間後に損傷した心筋で生存するＭＳＣ数の増加により、ＩＲ障害からの心臓保護を誘導するという証拠を提供する。

【0151】

これらの結果は、ＡＭＩ患者における損傷した心筋の心臓保護のためにＭＳＣの有効性を改善する臨床状況で非常に興味深いものになる可能性がある。

【0152】

実施例３：ＰＰＡＲβ／δアゴニストでのＭＳＣの前処理の継続時間の効果
材料および方法
イン・ビトロ：
間葉系幹細胞の培養
Ｃ５７ＢＬ／６からの骨髄由来のＭＳＣを、これまでに記載されているように単離した(Bouffi C, Bony C, Courties G, Jorgensen C, Noel D. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLoS One. 2010 Dec 7;5(12):e14247)。簡潔には、長骨から骨髄を洗い流し、細胞懸濁液（０．５×１０^６細胞／ｃｍ^２）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍｌ ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）－αにプレーティングした。サブコンフルエンス状態で、細胞を収集し、５，０００細胞／ｃｍ^２の密度に増殖させ、第７代継代から使用した。

【0153】

薬理学的プレコンディショニング：
エクス・ビボ実験の２４時間または９６時間前に、培地で希釈したＰＰＡＲβ／δアゴニストを含有する処理溶液（ＧＷ０７４２、１μＭおよびＧ５０１５１６、０．１μＭ）とともにＭＳＣをインキュベートした。処理は２４時間または９６時間続いた。このプレコンディショニング段階の後、細胞をＰＢＳで２回すすぎ洗いし、トリプシンＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃で１分間トリプシン処理した（５％ＣＯ_２。細胞を２００ｇで３分遠心分離した後、予熱したタイロード液に終濃度５０００細胞／ｍｌで再懸濁した。

【0154】

エクス・ビボ評価：
プレコンディショニング済みのＭＳＣの心臓保護作用を、心筋虚血・再灌流のエクス・ビボモデルにおいて評価した。急性心筋虚血・再灌流は、３０分の虚血（無流）、それに続いて、再灌流に供したＣ５７Ｂｌ６マウスから摘出した灌流心臓で実行した。雄マウスを、ケタミン（１４ｍｇ／ｋｇ、Ｉｍａｌｇeｎｅ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ）、キシラジン（１４ｍｇ／ｋｇ、Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ）の腹腔内注射（ＩＰ）、その後のペントバルビタール（ＩＰ；７６．６ｍｇ／ｋｇ；Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）の注射によって麻酔した。麻酔したマウスには、血栓形成を防ぐために、２５０Ｕ ヘパリン（ＩＰ）を投与した。胸骨切開後、心臓を切除し、上行大動脈にカニューレを挿入し、迅速にランゲンドルフシステムに取り付けた。予熱したタイロード液（ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ５．４ｍＭ、ＭｇＣｌ １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ ５ｍＭ、グルコース ５．５ｍＭ、ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ、ｐＨ７．４）を一定の圧力および温度（３７℃）で灌流した。

【0155】

虚血・再灌流プロトコール（ＩＲ）
ランゲンドルフシステムで、心臓に予熱したタイロード液を１５分間灌流した（安定化）。全体虚血は、灌流の流れを３０分間止めることによって得た（《無流》）。再灌流工程（６０分）は、流れを回復することによって達成した。ＭＳＣによる処置は、再灌流の間適用した（タイロード液中のＭＳＣ；５，０００細胞／ｍｌ）。対照条件（ＩＲ）は、タイロード液単独を使用して得た。

【0156】

梗塞サイズの測定：
ＩＲプロトコールの最後に、心臓をランゲンドルフから外し、摘出した。左心室を寒天（４％）に入れ、ビブラトームで横方向にスライスした（１ｍｍ）。組織の生存能力を明らかにするために、スライスを２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液（ＴＴＣ色素）とともに３７℃で１５分間インキュベートした。固定工程（４％パラホルムアルデヒド、４８時間）後、各スライスの各面を撮影した。梗塞領域は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた面積測定により定量し、左心室質量のパーセンテージとして表した。

【0157】

結果：
図１０は、５，０００細胞／ｍｌ（^（合計４．１０^５細胞／心臓）を含有するタイロード液による再灌流により、対照条件（タイロード液による灌流、ＩＲ）と比較して梗塞サイズを３９，８％縮小させることができたことを示している。

【0158】

ランゲンドルフシステムにおいて４．１０^５細胞／心臓の量で灌流した場合、４日のＧＷ５０１５１６（０．１μＭ）によるＭＳＣのプレコンディショニングにより、対照条件（タイロード液単独による再灌流、ＩＲ）と比較して梗塞サイズを５４．５％縮小させることができた。

【0159】

ＧＷ５０１５１６での前処理を２４時間だけ適用した場合、ＭＳＣ（４．１０^５細胞／心臓）により、梗塞サイズを同程度に縮小させることができ、ＧＷ５０１５１６で１日間（ｎ＝７）での平均値は３７．４（ＬＶ質量の％）であったのに対し、ＧＷ５０１５１６で４日間（ｎ＝８）での平均値は３６．０５％となり、それぞれ、梗塞サイズは５２．８％および５４．５％縮小した。

【0160】

別のＰＰＡＲ β／δアゴニストであるＧＷＯ７４２を使用しても同様の結果が得られた。実際、ＭＳＣをＧＷＯ７４２（１μＭ）で２４時間プレコンディショニングした場合、梗塞サイズは未処理の条件（ＩＲ）と比較して５４．６％縮小した。

【0161】

結論：
上記のデータは、ＭＳＣをＧＷ５０１５１６で２４時間前処理することにより、９６時間の前処理で得られるものと同じ心臓保護をもたらす薬理学的刺激が提供されることを示している。

【0162】

したがって、心筋虚血再灌流障害後のＭＳＣの心臓保護作用を有意に改善するには、ＰＰＡＲβ／δアゴニストによるＭＳＣの短時間の前処理で十分である。

【0163】

それにもかかわらず、本発明者らの２４時間のプロトコールは、ＷＯ２０１５１６４５０６（実施例６）の９６時間のプロトコールよりも優れており、２つの主な利点を有する：－前処理の継続時間は４分の１に短縮される（４日に対して１日）、
－細胞用量は１０００～１００ ０００分の１である（ＷＯ２０１５１６４５０６の実施例６に記載されているように、５～６００×１０^６細胞／ｍｌに対して５，０００細胞／ｍｌ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】