(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-25
(54)【発明の名称】標的治療のための前駆体タンパク質及びキット
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20231218BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20231218BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20231218BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20231218BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20231218BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231218BHJP
C07K 14/52 20060101ALN20231218BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/00
A61K47/64
A61K38/43
A61K38/19
A61P35/00
C07K14/52
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536851
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-06-26
(86)【国際出願番号】 EP2021086151
(87)【国際公開番号】W WO2022129313
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】20215328.4
(32)【優先日】2020-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ブリンクマン ウルリッヒ
(72)【発明者】
【氏名】ブヨツェク アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ブルドゥン カン
(72)【発明者】
【氏名】ジョルジュ ガイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084DA01
4C084DC01
4C084NA13
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA01
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、不活性化された受容体リガンド又は酵素を含む前駆体タンパク質のセット、及び治療におけるそれらの使用方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットであって、各前駆体タンパク質が、二量体化ドメインを介して互いに会合した２つのポリペプチドを含み、
前記前駆体タンパク質の少なくとも１つが、受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、前記部分が、機能的に不活性であり、前記部分が前記二量体化ドメインに融合され、
前記第１の前駆体タンパク質と前記第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換時に、活性化タンパク質が形成され、
前記活性化タンパク質が、前記第１の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチド及び前記第２の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドを含み、両方のポリペプチドがそれらの二量体化ドメインを介して互いに会合しており、かつ、前記活性化タンパク質が前記部分を含み、
前記活性化タンパク質が前記部分を機能的に活性な形態で含むこと、を特徴とする、
前記第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項2】
前記第１の前駆体タンパク質又は前記第２の前駆体タンパク質のいずれかが、受容体リガンド及び酵素から選択される前記部分を含み、前記部分が不活性化部分に結合している、請求項１に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項3】
前記部分が、受容体リガンドであり、前記不活性化部分が、対応する受容体又はそのリガンド結合サブユニットである、請求項２に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項4】
前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が、受容体リガンド及び酵素から選択される前記部分の相補的サブユニットを含む、請求項１に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項5】
前記第１の前駆体タンパク質が、前記部分の第１の非改変サブユニット及び前記部分の第２のサブユニットを含み、前記第２のサブユニットが不活性化変異を含み；前記第２の前駆体タンパク質が、前記部分の第２の非改変サブユニットを含む、請求項４に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項6】
前記部分が受容体リガンドである、請求項５に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項7】
前記受容体リガンドがサイトカインであり、前記第１の前駆体タンパク質が、前記サイトカインの第１のサブユニット及び前記サイトカインの第２のサブユニットを含み、前記第２のサブユニットが不活性化変異を含み；前記第２の前駆体タンパク質が、前記サイトカインの第２の非改変サブユニットを含む、請求項６に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項8】
前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が、受容体リガンド及び酵素から選択される人工的に分割された部分の相補部分を含み、前記相補部分の１つが不活性化されている、請求項１に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項9】
前記部分が受容体リガンドである、請求項８に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項10】
前記受容体リガンドが、サイトカイン又は酵素である、請求項９に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項11】
前記二量体化ドメインがＣＨ３ドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項12】
前記第１の前駆体タンパク質と前記第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換を支持するために、前記ＣＨ３ドメインが、改変された界面を有する、請求項１１に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項13】
前記前駆体タンパク質が、細胞の表面に結合したときにポリペプチド鎖交換を受けることができる、前記請求項のいずれか一項に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【請求項14】
前記請求項のいずれか一項において定義される第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを含む、治療キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、不活性化された受容体リガンド又は酵素を含む前駆体タンパク質のセット、及び治療におけるそれらの使用方法に関する。
本発明は、不活性化された受容体リガンド又は酵素を含む前駆体タンパク質のセット、及び治療におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
抗原結合部位の標的化活性化のための方法及びポリペプチドは、以前に報告されている。国際公開第２０１９／０８６３６２号（特許文献１）及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３（特許文献２）は、ポリペプチド鎖交換による２つの前駆体タンパク質からの抗ＣＤ３抗体結合部位の形成を報告している。不安定化ＣＨ３界面及び所望の抗ＣＤ３抗体の可変ドメインの１つを含む２つの前駆体タンパク質は、ポリペプチド鎖交換を受け、それによって所望の抗ＣＤ３抗体を含むタンパク質へとアセンブリすると記載されている。
抗原結合部位の標的化活性化のための方法及びポリペプチドは、以前に報告されている。国際公開第２０１９／０８６３６２号（特許文献１）及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３（特許文献２）は、ポリペプチド鎖交換による２つの前駆体タンパク質からの抗ＣＤ３抗体結合部位の形成を報告している。不安定化ＣＨ３界面及び所望の抗ＣＤ３抗体の可変ドメインの１つを含む２つの前駆体タンパク質は、ポリペプチド鎖交換を受け、それによって所望の抗ＣＤ３抗体を含むタンパク質へとアセンブリすると記載されている。
【0003】
サイトカインは、白血球の生存、増殖、分化及びエフェクター機能を調節することによって免疫応答を調整するタンパク質である（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；３７（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３４－Ｓ４５（非特許文献１））。サイトカインは、構造的類似性に従ってファミリー及びサブファミリーに分類することができる。４αヘリックスバンドルファミリーには、とりわけ、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カーディオトロフィン－１（ＣＴ－１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が含まれる（Ｎｉｃｏｌａ ＮＡ ａｎｄ Ｈｉｌｔｏｎ ＤＪ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１９９８；５２：１－６５（非特許文献２））。ＩＬ－１２ファミリーは、ヘテロ二量体サイトカイン、例えばＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７及びＩＬ－３５を含み、そのうちのそれぞれのサイトカインのα鎖は４αヘリックスバンドルファミリーに属する（Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡＡ ａｎｄ Ｋｕｃｈｒｏｏ ＶＪ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ａｕｇ；１３（８）：７２２－７２８（非特許文献３））。ＩＬ－１７のホモログは、ＩＬ－１７ファミリーにおいて要約されている（ＭｃＧｅａｃｈｙ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１９；５０（４）：８９２－９０６（非特許文献４））。ＩＬ－１ファミリーは、ＩＬ－１及びＩＬ－１８からなる。システインノットファミリーは、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）サイトカインを含む（Ｓｕｎ ＰＤ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ ＤＲ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．１９９５；２４：２６９－２９１（非特許文献５））。
【0004】
今日まで、サイトカインは、自己免疫、ウイルス感染及び癌を含む様々な症状の処置に応用されている（Ｌｉｐｉａｉｎｅｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１５ Ｆｅｂ；１０４（２）：３０７－２６（非特許文献６））。インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びＩＦＮ－αなどのＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を含む広範囲のサイトカインが、癌の処置について評価されている（Ａｒｄｏｌｉｎｏ Ｍ，Ｈｓｕ Ｊ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５ ６：１９３４６－１９３４７（非特許文献７））。さらに、いくつかのサイトカイン産物が臨床使用のために承認されている（Ｌｉｐｉａｉｎｅｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１５ Ｆｅｂ；１０４（２）：３０７－２６（非特許文献６））。
【0005】
しかしながら、サイトカインを単独で治療薬として使用することは、しばしば重大な欠点を伴う。腫瘍組織において有効な濃度を達成するためには、大量のサイトカイン量を投与する必要があり、その結果、発熱、低血圧、疲労、悪心、食欲不振、又は好中球減少症を含む重篤な有害作用を引き起こす可能性がある。
【0006】
サイトカインは癌治療に使用されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ ＴＡ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｄｅｃ ３；１０（１２）（非特許文献８））。全身分布のこの問題は、サイトカインを腫瘍標的化抗体又は抗体様分子に融合し、腫瘍部位での治療薬の優先的な蓄積を可能にすることによって対処することができる。様々な抗体－サイトカイン融合物は、標的化癌免疫療法の有望な結果を示している（Ｋｉｅｆｅｒ ＪＤ，Ｎｅｒｉ Ｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１６；２７０（１）：１７８－１９２（非特許文献９））。サイトカインの抗原標的化送達は全身のサイトカイン負荷を減少させることができるが、抗原特異性は依然として課題である。多くの腫瘍抗原は単に過剰発現されるにすぎず、腫瘍細胞上に排他的に発現されるわけではない（Ｖｉｇｎｅｒｏｎ Ｎ，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１５；２０１５：９４８５０１（非特許文献１０））。オンターゲットオフ腫瘍標的化は、健康な組織の重度の損傷を引き起こす可能性がある。
【0007】
したがって、サイトカインベースの癌治療のための代替アプローチが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１９／０８６３６２号
【特許文献2】ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；３７（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３４－Ｓ４５
【非特許文献2】Ｎｉｃｏｌａ ＮＡ ａｎｄ Ｈｉｌｔｏｎ ＤＪ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１９９８；５２：１－６５
【非特許文献3】Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡＡ ａｎｄ Ｋｕｃｈｒｏｏ ＶＪ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ａｕｇ；１３（８）：７２２－７２８
【非特許文献4】ＭｃＧｅａｃｈｙ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１９；５０（４）：８９２－９０６
【非特許文献5】Ｓｕｎ ＰＤ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ ＤＲ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．１９９５；２４：２６９－２９１
【非特許文献6】Ｌｉｐｉａｉｎｅｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１５ Ｆｅｂ；１０４（２）：３０７－２６
【非特許文献7】Ａｒｄｏｌｉｎｏ Ｍ，Ｈｓｕ Ｊ，Ｒａｕｌｅｔ ＤＨ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５ ６：１９３４６－１９３４７
【非特許文献8】Ｗａｌｄｍａｎｎ ＴＡ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｄｅｃ ３；１０（１２）
【非特許文献9】Ｋｉｅｆｅｒ ＪＤ，Ｎｅｒｉ Ｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１６；２７０（１）：１７８－１９２
【非特許文献10】Ｖｉｇｎｅｒｏｎ Ｎ，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１５；２０１５：９４８５０１
【発明の概要】
【0010】
本発明は、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関するものであり、各前駆体タンパク質が二量体化ドメインを介して互いに会合した２つのポリペプチドを含み、前駆体タンパク質の少なくとも１つが受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、前記部分が機能的に不活性であり、前記部分が二量体化ドメインに融合し、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質と間のポリペプチド鎖交換時に、活性化タンパク質が形成され、活性化タンパク質が第１の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドと第２の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドとを含み、両方のポリペプチドがそれらの二量体化ドメインを介して互いに会合し、かつ、活性化タンパク質が前記部分を含み、活性化タンパク質が機能的に活性な形態で前記部分を含むこと、を特徴とする。
【0011】
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質又は第２の前駆体タンパク質のいずれかは、受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、該部分は不活性化部分に結合している。ポリペプチド鎖交換時に、不活性化部分が除去され、その部分は機能的に活性な形態になる。
【0012】
別の実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、受容体リガンド及び酵素から選択される部分の相補的サブユニットを含む。ポリペプチド鎖交換時に、得られた活性化タンパク質は、機能的に活性な形態の部分を含む、すなわち、両方の相補的サブユニットを含む。
【0013】
さらに別の実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、受容体リガンド及び酵素から選択される人工的に分割された部分の相補部分を含み、相補部分の１つは不活性化されている。ポリペプチド鎖交換時に、得られた活性化タンパク質は、人工的に分割された部分の両方の部分を含み、それらは不活性化されておらず、それにより、機能的に活性な形態の部分を含む。
【0014】
一実施形態では、二量体化ドメインはＣＨ３ドメインである。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換を支持するために、ＣＨ３ドメインは、改変された界面を有する。
【0015】
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞の抗原に特異的に結合する。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞の表面の抗原に特異的に結合する抗体断片を含む。
【0016】
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質はヒンジ領域を含む。一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない。
【0017】
一実施形態では、活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、ＶＨドメインは第１の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれ、ＶＬドメインは第２の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれるか；又は、活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、ＶＬドメインは第１の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれ、ＶＨドメインは第２の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれる。
【0018】
本発明の別の態様は、治療のための本発明のセットである。
【0019】
本発明の別の態様は、受容体リガンド及び酵素から選択される前記部分の活性化形態を生成するための本発明の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットの使用である。
【0020】
本発明の別の態様は、本発明の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを含む、治療キットである。
【0021】
本発明の別の態様は、本発明の治療キットを提供する方法であって、組換え発現された第１の前駆体タンパク質及び組換え発現された第２の前駆体タンパク質を提供する工程と、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを、任意に、薬学的に許容され得る担体と共に製剤化して、治療キットを提供する工程とを含む方法である。
【0022】
本発明の別の態様は、受容体リガンドから選択される部分の機能的に活性な形態と、本発明の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換によって産生される酵素とを含むタンパク質（活性化タンパク質）である。
【0023】
本発明の別の態様は、受容体リガンド及び酵素から選択される部分の機能的に活性な形態を含む活性化タンパク質を提供する方法であって、前駆体ポリペプチドがポリペプチド鎖交換を受けて活性化タンパク質を形成するように、本発明の第１の前駆体ポリペプチドと第２の前駆体ポリペプチドとを組み合わせる工程を含む方法である。
【0024】
本発明によれば、機能的に活性な受容体リガンド又は酵素は、ポリペプチド鎖交換によって２つの前駆体ポリペプチドから形成される。ポリペプチド鎖交換は、適切な条件下で２つの前駆体タンパク質を合わせた際に、例えば、標的細胞の表面に結合している場合のように両方の前駆体タンパク質が近接している場合に起こる。本発明は、目的の部位での治療的に所望の機能的部分の標的化された活性化を可能にし、それにより、治療、例えばオフターゲット毒性の低減に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】図１Ａ：実施例で例示的に使用される前駆体ポリペプチド（Ｒ１、Ｒ２）の抗体コアのドメイン配置。ポリペプチド鎖交換は、産物ポリペプチド（Ｐ１及びＰ２）の形成をもたらす。図１Ｂ：人工的に分割されたＩＬ－４を含む実施例１に記載の前駆体ポリペプチドのドメイン配置。前駆体タンパク質（Ｒ１、Ｒ２）間のポリペプチド鎖交換は、活性化産物タンパク質Ｐ１及び不活性産物タンパク質Ｐ２の形成をもたらす。
【図2】図２Ａ：インターロイキン－４（タンパク質データバンク２Ｂ８Ｕ）のスプリット設計。ＩＬ－４の３＋１スプリット。１つの部分はインターロイキン－４のＮ末端ヘリックスからなり（明るい灰色）、他の部分は残りのタンパク質からなる（暗い灰色）。図２Ｂ：インターロイキン－４（タンパク質データバンク２Ｂ８Ｕ）のスプリット設計。ＩＬ－４の２＋２スプリット。インターロイキン－４ ＤＡＢＣを生成する環状置換。１つの部分はインターロイキン－４ ＤＡＢＣの２つのＮ末端ヘリックスからなり（明るい灰色）、他の部分は残りのタンパク質からなる（暗い灰色）。
【図3】図３Ａ：実施例１による人工的に分割されたＩＬ－４及び活性産物（Ｐ１）タンパク質を含む精製前駆体タンパク質（Ｒ１、Ｒ２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。タンパク質調製を、細胞培養上清からのＫａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔ抽出、続いてイオン交換クロマトグラフィーによって行った。図３Ｂ：実施例１に記載の精製分子Ｒ２の例示的なＳＥＣプロファイル。プロファイルの主ピークは、目的のタンパク質を表す。
【図4】図４Ａ：ＴＦ－１細胞を用いたＩＬ－４活性測定。ＴＦ－１増殖アッセイによってＩＬ－４シグナル伝達機能性を検出する原理。ＩＬ－４は、ＴＦ－１細胞上のＩＬ－４受容体に結合し、増殖を誘導する。図４Ｂ：ＴＦ－１細胞上の抗原発現（Ｈｅｒ２、ＣＤ３８、ＬｅＹ、ＣＤ３３）のフローサイトメトリー分析。図４Ｃ：ＩＬ－４及びＩＬ－４のＤＡＢＣ活性を比較するために、構築物をＴＦ－１増殖アッセイで試験した。図４Ｄ：図４Ｂに示される分子を用いたＴＦ－１増殖アッセイ。ＩＬ－４ ＤＡＢＣはＩＬ－４と同様の活性を示す。
【図5】図５Ａ：Ｅ９Ｑ及びＲ８８Ｑ変異を有する３＋１スプリットＩＬ－４前駆体タンパク質を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。ＴＦ－１細胞上で発現されるＣＤ３８を標的とする分子。図５Ｂ：Ｅ９Ｑ及びＲ８８Ｑ変異を有する３＋１スプリットＩＬ－４前駆体タンパク質を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。ＴＦ－１細胞上に発現されないＨｅｒ２を標的とする分子。図５Ｃ：Ｅ９Ｑ及びＲ８８Ｑ変異を有する３＋１スプリットＩＬ－４前駆体タンパク質を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。標的化ポリペプチド鎖交換と非標的化ポリペプチド鎖交換の比較。
【図6】スプリットＩＬ－４前駆体タンパク質及びＣＤ３８を標的とする産物分子を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。
【図7】異なる変異を有する１００ｎＭの３＋１スプリットＩＬ－４反応物分子を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。
【図8】図８Ａ：Ｔ６Ｄ Ｅ９Ａ及びＲ８１Ｅ Ｒ８８Ｑ変異を有する２＋２スプリットＩＬ－４前駆体タンパク質を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。ＴＦ－１細胞上で発現されるＣＤ３８を標的とする分子。図８Ｂ：Ｔ６Ｄ Ｅ９Ａ及びＲ８１Ｅ Ｒ８８Ｑ変異を有する２＋２スプリットＩＬ－４前駆体タンパク質を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。ＴＦ－１細胞上に発現されないＨｅｒ２を標的とする分子。図８Ｃ：Ｔ６Ｄ Ｅ９Ａ及びＲ８１Ｅ Ｒ８８Ｑ変異を有する２＋２スプリットＩＬ－４前駆体タンパク質を用いたＴＦ－１細胞増殖アッセイ。標的化ポリペプチド鎖交換と非標的化ポリペプチド鎖交換の直接比較。
【図9】図９Ａ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。ＩＬ－４含有分子とＩＬ－４受容体アルファとの相互作用を研究するためのＳＰＲ設定。図９Ｂ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。ＳＰＲによって試験した分子の数値結果。図９Ｃ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。ＳＰＲによって試験した分子のグラフ結果。
【図10】図１０Ａ：インターロイキン－２を含む実施例２で使用される前駆体ポリペプチドの設計及びモジュール組成。図１０Ｂ：図１０Ａに示される方法における反応物質Ｒ１として適した３つの異なる前駆体タンパク質。ＩＬ－２ｖは、インターロイキン－２受容体アルファへの結合の減少のために設計されたＩＬ－２バリアントを指す。γｃは、共通のガンマ鎖の細胞外ドメインを指す。ＩＬ－２Ｒβは、インターロイキン－２受容体ベータの細胞外ドメインを指す。
【図11】精製された前駆体タンパク質Ｒ２、活性産物（Ｐ１）及び３つの異なる前駆体タンパク質Ｒ１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。タンパク質調製を、細胞培養上清からのＫａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔ抽出、続いてイオン交換クロマトグラフィーによって行った。
【図12】図１２Ａ：ＣＴＬＬ－２細胞を用いたＩＬ－２ｖ活性測定。ＣＴＬＬ－２増殖アッセイによってＩＬ－２ｖシグナル伝達機能性を検出する原理。ＩＬ－２ｖは、ＣＴＬＬ－２細胞上のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒβ及びγｃからなる）に結合し、増殖を誘導する。図１２Ｂ：ＣＴＬＬ－２細胞を用いたＩＬ－２ｖ活性測定。実施例２に記載のＣＴＬＬ－２増殖アッセイ。
【図13】図１３Ａ：インターロイキン－１２を含む実施例２で使用される前駆体ポリペプチドの設計及びモジュール組成。このアプローチは、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニット及びｐ４０サブユニットを利用する。Ｐ３５ｉ及びｐ４０ｉは、ｐ３５及びｐ４０の不活性化バージョンを指す。ここで、前駆体タンパク質Ｒ２は、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットのみを担持し、隣接するＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットを担持しない。図１３Ｂ：インターロイキン－１２を含む実施例２で使用される前駆体ポリペプチドの設計及びモジュール組成。ここで、前駆体タンパク質Ｒ２は、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット（ＩＬ－１２ ｐ４０）並びに不活性化ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット（ＩＬ－１２ ｐ３５ｉ）を担持する。
【図14】ＩＬ－１２のいくつかのサブユニットを含む精製産物Ｐ１及び反応物Ｒ１分子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。タンパク質調製を、細胞培養上清からのＫａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔ抽出、続いてイオン交換クロマトグラフィーによって行った。Ｐ１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥについて、全てのポリペプチド鎖が調製物中に存在することが示された。Ｒ１について、２つの重鎖は類似の分子量を有し、したがって２つのバンドは重なっていた。しかしながら、両方のタイプの重鎖の存在は、質量分析によって確認された。
【図16】ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）スプリットルシフェラーゼ酵素を含む実施例９で使用される前駆体ポリペプチドの設計及びモジュール組成。
【図17】ＣＤ３８を発現するＴＦ－１細胞の存在下又は非存在下における、ＣＤ３８を標的とする５０ｎＭでのスプリットルシフェラーゼ前駆体ポリペプチドＲ１及びＲ２並びにそれらの組み合わせの発光読み出し（実施例１０）。
【発明を実施するための形態】
【0026】
発明の詳細な説明
１．定義
本明細書で特に定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的な用語は、当技術分野の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法及び技術は、一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従って行われる。一般的に、本明細書中に記載されている生化学、酵素学、分子生物学、及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質及び核酸の化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法並びに技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。
１．定義
本明細書で特に定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的な用語は、当技術分野の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法及び技術は、一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従って行われる。一般的に、本明細書中に記載されている生化学、酵素学、分子生物学、及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質及び核酸の化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法並びに技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。
【0027】
用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、一般的には、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0028】
本明細書で特に定義されていない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語を含むものとする。
【0029】
「・・・又はのいずれか（ｅｉｔｈｅｒ … ｏｒ）」という用語を使用する２つの代替物の提供は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、相互に排他的な代替物を示す。
【0030】
本明細書で使用される「抗原結合領域」という用語は、標的抗原に特異的に結合する部分を指す。この用語は、抗体並びに、標的抗原に特異的に結合することができる他の天然分子（例えば、受容体、リガンド）又は合成分子（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ）を含む。
【0031】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【0032】
本明細書で使用される「結合部位」又は「抗原結合部位」という用語は、抗原が実際に結合する抗原結合領域の１つ以上の領域を表す。抗原結合領域が抗体である場合、抗原結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又はＶＨ／ＶＬの対を含む。標的抗原に特異的に結合する抗体由来の抗原結合部位は、ａ）抗原に特異的に結合する公知の抗体、又はｂ）とりわけ抗原タンパク質若しくは核酸若しくはその断片を使用するデノボ免疫化法か、又はファージディスプレイ法によって得られた新しい抗体若しくは抗体断片に由来するものであってよい。
【0033】
抗体に由来する場合、本発明による抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な程度で寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、アミノ酸配列のコンパイルされたデータベースと比較することによって決定され、それらの領域は、配列間の変動に従って定義される。より少ないＣＤＲ（すなわち、結合特異性が３つ、４つ又は５つのＣＤＲによって決定される）により構成される機能的抗原結合部位も本発明の範囲内に含まれる。例えば、６つのＣＤＲの完全なセット未満でも結合に十分であり得る。
【0034】
「価数」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体分子内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。天然抗体は、例えば、２つの結合部位を有し、二価である。したがって、「三価」という用語は、抗体分子中に３つの結合部位が存在することを示す。
【0035】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子である。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆ（ａｂ）２；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限られない。
【0036】
「特異性」は、抗原結合領域、例えば抗体による抗原の特定のエピトープの選択的認識を指す。例えば、天然抗体は単一特異性である。本明細書で使用される、「単一特異性抗体」という用語は、同一の抗原の同一のエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「多重特異性抗体」は、２つ以上の異なるエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の異なるエピトープ）に結合する。エピトープは、同一又は異なる抗原上にあり得る。多重特異性抗体の例は、２つの異なるエピトープに結合する「二重特異性抗体」である。抗体が２つ以上の特異性を有する場合、認識されたエピトープは、単一の抗原又は２つ以上の抗原に関連し得る。
【0037】
エピトープは、抗原結合領域、例えば抗体によって結合される抗原の領域である。「エピトープ」という用語は、抗体又は抗原結合領域に対して特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態において、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルを含み、特定の実施形態において、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の電荷特徴を有していてもよい。
【0038】
本明細書で使用される、「結合」及び「特異的結合」という用語は、インビトロアッセイ、好ましくは、精製された野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）における抗原のエピトープへの抗体又は抗原結合領域の結合を指す。特定の実施形態において、抗体又は抗原結合領域は、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【0039】
抗原に対する抗体の結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合の速度定数）、ｋｄ（解離定数）、及びＫＤ（ｋｄ／ｋａ）により定義される。一実施形態において、結合又は特異的に結合するとは、１０－８ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性（ＫＤ）を意味し、一実施形態においては、１０－８Ｍ～１０－１３ｍｏｌ／ｌである。したがって、抗原結合領域、特に抗体結合部位は、それが特異的である各抗原に、１０－８ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性（ＫＤ）、例えば、１０－８～１０－１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）、一実施形態においては、１０－９～１０－１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）で特異的に結合する。
【0040】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、類似の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照のこと。
【0041】
本出願内で使用される「定常ドメイン」又は「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの合計を示す。定常領域は、抗原の結合に直接的には関与していないが、種々のエフェクタ機能を示す。
【0042】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭといった「クラス」に分類され、これらのうちのいくつかは、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。５つの抗体クラス全てに見られる軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。
【0043】
ここで使用される「定常ドメイン」は、好ましくは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ領域もしくラムダ領域に由来するヒト起源に由来する。そのような一定のドメイン及び領域は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｋａｂａｔ等のＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって説明されている。
【0044】
野生型抗体において、「ヒンジ領域」は、ＩｇＧ及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスの重鎖の中央部分の柔軟なアミノ酸伸長であり、これは、ジスルフィド結合、すなわち２つの重鎖の間に形成される「鎖間ジスルフィド結合」によって２つの重鎖を連結する。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、一般的に、ヒトＩｇＧ１の約２１６位のＧｌｕ又は約２２６位Ｃｙｓから約２３０位のＰｒｏまでの伸長として定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５））。ヒンジ領域内のシステイン残基を欠失させること、又はヒンジ領域内のシステイン残基をセリン等の他のアミノ酸で置換することによって、ヒンジ領域内のジスルフィド結合形成が回避される。
【0045】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と称する２つの異なる型の１つに割り当てられ得る。野生型軽鎖は通常、２つの免疫グロブリンドメインを含み、通常、抗原への結合に重要な１つの可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）である。
【0046】
抗体のクラス又はアイソタイプを定義するいくつかの異なるタイプの「重鎖」が存在する。野生型重鎖には一連の免疫グロブリンドメインが含まれ、通常、抗原の結合に重要な１つの可変ドメイン（ＶＨ）といくつかの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３など）が含まれる。
【0047】
用語「Ｆｃ領域」とは、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。
【0048】
通常、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、およそ２３１位のアミノ酸残基からおよそ３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。多重特異性抗体はＣＨ２ドメインを欠いている。「ＣＨ２ドメインを欠く」とは、本発明による抗体がＣＨ２ドメインを含まないことを意味する。
【0049】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの一続きの残基（すなわち、ＩｇＧのおよそ３４１位のアミノ酸残基からおよそ４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書における「ＣＨ３ドメイン」は、バリアントＣＨ３ドメインであり、ここで、天然ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、多重特異性抗体内で互いに対向する２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進するために、少なくとも１つの異なるアミノ酸置換（すなわち、ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列の改変）に供された。
【0050】
典型的には、当技術分野で公知のヘテロ二量体化アプローチにおいて、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン及び他方の重鎖のＣＨ３ドメインは両方とも相補的に操作され、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖は、同じ構造の他の重鎖とは、もはやホモ二量体化することができないようになっている。それにより、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含む重鎖は、相補的な方法で操作されたＣＨ３ドメインを含む他方の重鎖とヘテロ二量体化することを余儀なくされる。
【0051】
当技術分野で公知のヘテロ二量体化アプローチの１つは、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」技術であり、これは、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１、及び国際公開第９８／０５０４３１号にいくつかの例を示して詳細に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。「ノブ・イントゥ・ホール」技術では、抗体の三次構造中の２つのＣＨ３ドメイン間に形成された界面内において、各ＣＨ３ドメイン上の特定のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインの一方に突起（「ノブ」）を、ＣＨ３ドメインの他方に空洞（「ホール」）をそれぞれ作製するように操作されている。多重特異性抗体の三次構造において、一方のＣＨ３ドメインの導入された突起は、他方のＣＨ３ドメインの導入された空洞内に配置可能である。
【0052】
ノブ・イントゥ・ホール技術による置換と組み合わせて、追加の鎖間ジスルフィド結合をＣＨ３ドメインに導入して、ヘテロ二量体化ポリペプチドをさらに安定化することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）。そのような鎖間ジスルフィド結合は、例えば、以下のアミノ酸置換をＣＨ３ドメインに導入することによって形成される、一方のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＫ３９２Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＥ３５６Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＥ３５７Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＬ３５１Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＴ３９４Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＶ３９７Ｃ。本明細書で使用される「システイン変異」は、システインによる第２のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の他の、一致するアミノ酸置換とともに有する鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、システインによるＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の１つのアミノ酸置換を指す。
【0053】
「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、組成物が投与される対象に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での調製物を指す。本発明の医薬組成物は、当該技術分野で公知の種々の方法によって投与し得る。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は態様は、所望な結果に依存して変わり得る。特定の投与経路によって本発明の抗体を投与するために、抗体をその不活性化を防止するための材料で被覆するか、又は抗体を材料と同時投与することが必要な場合がある。例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドは、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤中で対象に投与し得る。薬学的に許容され得る希釈剤としては、生理食塩水、及び緩衝液水溶液が挙げられる。
【0054】
医薬組成物は、有効量の本発明によって提供されるヘテロ二量体ポリペプチドを含む。薬剤、例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドの「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な薬用量及び所要期間で有効な量を指す。特に、「有効量」は、対象に投与された場合、（ｉ）特定の疾患、状態又は障害を処置又は予防する、（ｉｉ）特定の疾患、状態又は障害の１つ以上の症状を減弱、改善又は排除する、又は（ｉｉｉ）本明細書に記載する特定の疾患、状態又は障害の１つ以上の症状の発症を予防又は遅延する、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドの量を意味する。治療有効量は、使用されるヘテロ二量体ポリペプチド分子、処置される疾患状態、処置される疾患の重症度、対象の年齢及び相対的健康状態、投与経路及び投与形態、主治医又は獣医学専門家の判断、及び他の要因に応じて変化する。
【0055】
「薬学的に許容され得る担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容され得る担体としては、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。好ましい一実施形態では、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は点滴によって）に適している。
【0056】
本発明による医薬組成物はまた、アジュバント、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤も含有し得る。上記の滅菌化手順、及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含むことの両方によって、微生物の存在の予防が確保され得る。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射用医薬形態の長期吸収がもたらされ得る。
【0057】
本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されているＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされる。特に、可変ドメイン、並びにカッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬについては、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のナンバリングシステム（第 ６４７頁～第６６０頁参照）が使用され、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）については、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（第６６１頁～第７２３頁参照）が使用される。
【0058】
ポリペプチド鎖内のアミノ酸「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」又は「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」又は「変異」（全ての用語は本明細書では互換的に使用される）は、抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はヌクレオチド合成によって調製される。しかしながら、このような改変は、例えば、上記のように非常に限られた範囲でのみ実行できる。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプや抗原結合などの上記の抗体特性を変更しないが、組換え生成の収率、タンパク質の安定性をさらに改善するか、又は精製を容易にし得る。特定の実施形態では、１つ又は複数の保存アミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。本明細書で言及される「二重変異」は、示されたアミノ酸置換の両方がそれぞれのポリペプチド鎖に存在することを意味する。
【0059】
ここで使用される「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基のα位に位置するアミノ部分を有する有機分子を示す。アミノ酸の例としては、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが挙げられる。使用されるアミノ酸は、任意に、それぞれの場合に、Ｌ形態である。「正に帯電した」又は「負に帯電した」アミノ酸という用語は、ｐＨ７．４でのアミノ酸側鎖電荷を指す。アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性又は負に電荷した：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性又は正に電荷した：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性又は負に電荷した：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性又は正に電荷した：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。
【0060】
（表）特定の特性を有するアミノ酸
【0061】
２つのタンパク質間の「ポリペプチド鎖交換」は、第１の前駆体タンパク質由来の２つのポリペプチド鎖が解離し、第２の前駆体タンパク質由来の２つのポリペプチド鎖が解離し、第１の前駆体タンパク質由来のポリペプチド鎖が第２の前駆体タンパク質由来のポリペプチド鎖と対をなす場合に起こる。結果として、第１の前駆体ポリペプチド由来のポリペプチド鎖及び第２の前駆体ポリペプチド由来のポリペプチド鎖を含む「産物」タンパク質が形成される。両方のポリペプチド鎖は、産物タンパク質中のそれらの二量体化ドメインを介して会合する。
【0062】
本発明の前駆体タンパク質は、「受容体リガンド及び酵素から選択される部分」を含む。本明細書で使用される「部分」という用語は、受容体リガンド又は酵素から選択されるタンパク質；その断片；又は受容体リガンド、酵素若しくはその断片の置換バリアントを指す。例示的な受容体リガンドはサイトカインである。典型的には、受容体リガンド及び酵素は、１つよりも多くのサブユニットで構成されるタンパク質複合体である。したがって、本明細書で言及される「サブユニット」は、他のポリペプチド（「サブユニット」）とアセンブリしてタンパク質複合体を形成する単一のポリペプチド分子である。
【0063】
その結果、その部分は生物学的機能、すなわち受容体リガンド（すなわち、リガンドと受容体との間の複合体の形成）又は酵素（すなわち生体触媒活性）の生物学的機能を有する。本明細書で使用される「機能的に活性」という用語は、前記部分が生理学的条件下でその生物学的機能を示すことを意味する。本明細書で使用される「機能的に不活性」という用語は、前記部分の活性が、対応する機能的に活性な全長受容体リガンド又は酵素の活性の５％未満に低下していることを意味する。好ましくは、「機能的に不活性な」部分は生物学的活性を有さない。
【0064】
その部分は、好ましくはペプチドリンカーを介して、二量体化ドメインを有する前駆体タンパク質のポリペプチド鎖に含まれる。典型的には、ペプチドコネクタは、グリシン及びセリンなどの柔軟なアミノ酸残基から構成される。したがって、その部分をポリペプチドに融合するために使用される典型的なペプチドコネクタは、グリシン－セリンリンカー、すなわちグリシン及びセリン残基のパターンからなるペプチドコネクタである。部分の構造に応じて、前駆体タンパク質は、その部分が機能的に不活性であるように前記部分の１つ又は２つの断片を含むか、又は前駆体タンパク質は、前記部分と、その部分が機能的に不活性であるように前記部分に結合する不活性化部分とを含む。
【0065】
２．本発明の実施形態
第１の態様では、本発明は、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関するものであり、各前駆体タンパク質が二量体化ドメインを介して互いに会合した２つのポリペプチドを含み、前駆体タンパク質の少なくとも１つが受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、前記部分が機能的に不活性であり、前記部分が二量体化ドメインに融合し、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質と間のポリペプチド鎖交換時に、活性化タンパク質が形成され、活性化タンパク質が第１の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドと第２の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドとを含み、両方のポリペプチドがそれらの二量体化ドメインを介して互いに会合し、かつ、活性化タンパク質が前記部分を含み、活性化タンパク質が機能的に活性な形態で前記部分を含むこと、を特徴とする。
第１の態様では、本発明は、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関するものであり、各前駆体タンパク質が二量体化ドメインを介して互いに会合した２つのポリペプチドを含み、前駆体タンパク質の少なくとも１つが受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、前記部分が機能的に不活性であり、前記部分が二量体化ドメインに融合し、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質と間のポリペプチド鎖交換時に、活性化タンパク質が形成され、活性化タンパク質が第１の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドと第２の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドとを含み、両方のポリペプチドがそれらの二量体化ドメインを介して互いに会合し、かつ、活性化タンパク質が前記部分を含み、活性化タンパク質が機能的に活性な形態で前記部分を含むこと、を特徴とする。
【0066】
Ａ）第１の選択肢：不活性化部分に結合
第１の態様の第１の実施形態では、本発明は、第１の前駆体タンパク質又は第２の前駆体タンパク質のいずれかが受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、該部分が不活性化部分に結合している、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関する。一実施形態では、該部分は受容体リガンドであり、不活性化部分は対応する受容体、そのリガンド結合サブユニット又は部分を不活性化する別のタンパク質である。一実施形態では、受容体リガンドはサイトカインであり、不活性化部分は対応するサイトカイン受容体又はそのサイトカイン結合サブユニットである。一実施形態では、受容体リガンドはＩＬ－２ｖであり、不活性化部分はＩＬ－２Ｒのサブユニット、好ましくはＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ鎖、ＩＬ－２Ｒベータ＿ガンマ鎖から選択される。本明細書で言及される「対応する受容体」は、受容体リガンドの生物学的機能を示すために前駆体タンパク質に含まれる受容体リガンドによって結合される受容体である。例えば、受容体リガンドがサイトカイン、例えばＩＬ－２である場合、対応する受容体は、前記サイトカインのサイトカイン受容体、例えばＩＬ－２Ｒである。対応する受容体の「リガンド結合サブユニット」は、前記受容体リガンドの前記受容体への結合に関与する前記受容体のサブユニットを指す。例えば、受容体リガンドがＩＬ－２である場合、対応する受容体はＩＬ－２Ｒであり、リガンド結合サブユニットはＩＬ－２Ｒベータである。
第１の態様の第１の実施形態では、本発明は、第１の前駆体タンパク質又は第２の前駆体タンパク質のいずれかが受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、該部分が不活性化部分に結合している、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関する。一実施形態では、該部分は受容体リガンドであり、不活性化部分は対応する受容体、そのリガンド結合サブユニット又は部分を不活性化する別のタンパク質である。一実施形態では、受容体リガンドはサイトカインであり、不活性化部分は対応するサイトカイン受容体又はそのサイトカイン結合サブユニットである。一実施形態では、受容体リガンドはＩＬ－２ｖであり、不活性化部分はＩＬ－２Ｒのサブユニット、好ましくはＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ鎖、ＩＬ－２Ｒベータ＿ガンマ鎖から選択される。本明細書で言及される「対応する受容体」は、受容体リガンドの生物学的機能を示すために前駆体タンパク質に含まれる受容体リガンドによって結合される受容体である。例えば、受容体リガンドがサイトカイン、例えばＩＬ－２である場合、対応する受容体は、前記サイトカインのサイトカイン受容体、例えばＩＬ－２Ｒである。対応する受容体の「リガンド結合サブユニット」は、前記受容体リガンドの前記受容体への結合に関与する前記受容体のサブユニットを指す。例えば、受容体リガンドがＩＬ－２である場合、対応する受容体はＩＬ－２Ｒであり、リガンド結合サブユニットはＩＬ－２Ｒベータである。
【0067】
Ｂ）第２の選択肢：いくつかのサブユニット
第１の態様の第２の実施形態では、本発明は、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質のが受容体リガンド及び酵素から選択される部分の相補的サブユニットを含む、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関する。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質は、部分の第１の非改変サブユニット及び部分の第２のサブユニットを含み、第２のサブユニットは、不活性化変異を含み；第２の前駆体タンパク質は、部分の第２の非改変サブユニットを含む。「非改変サブユニット」という用語は、その生物学的機能を失わせる変異を含まない部分のタンパク質サブユニットを指す。一実施形態では、非改変サブユニットは、その部分の天然のそれぞれのサブユニットのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。「不活性化変異」という用語は、前記部分の天然サブユニットのアミノ酸配列におけるアミノ酸の付加、置換又は欠失を指す。不活性化変異を有するサブユニットを含む全長部分は、機能的に不活性である。
第１の態様の第２の実施形態では、本発明は、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質のが受容体リガンド及び酵素から選択される部分の相補的サブユニットを含む、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関する。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質は、部分の第１の非改変サブユニット及び部分の第２のサブユニットを含み、第２のサブユニットは、不活性化変異を含み；第２の前駆体タンパク質は、部分の第２の非改変サブユニットを含む。「非改変サブユニット」という用語は、その生物学的機能を失わせる変異を含まない部分のタンパク質サブユニットを指す。一実施形態では、非改変サブユニットは、その部分の天然のそれぞれのサブユニットのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。「不活性化変異」という用語は、前記部分の天然サブユニットのアミノ酸配列におけるアミノ酸の付加、置換又は欠失を指す。不活性化変異を有するサブユニットを含む全長部分は、機能的に不活性である。
【0068】
一実施形態では、部分は受容体リガンドである。一実施形態では、受容体リガンドはサイトカインであり、第１の前駆体タンパク質は、サイトカインの第１のサブユニット及びサイトカインの第２のサブユニットを含み、第２のサブユニットは不活性化変異を含み；第２の前駆体タンパク質は、サイトカインの第２の非改変サブユニットを含む。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質は、ＩＬ－１２ ｐ３５及び不活性化変異を含むＩＬ－１２ ｐ４０を含み；第２の前駆体タンパク質は、非改変ＩＬ－１２ ｐ４０を含む。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質は、ＩＬ－１２ ｐ３５及び不活性化変異を含むＩＬ－１２ ｐ４０を含み；第２の前駆体タンパク質は、非改変ＩＬ－１２ ｐ４０及び不活性化変異を含むＩＬ－１２ ｐ３５を含む。
【0069】
Ｃ）第３の選択肢：分割された受容体リガンド又は酵素
第１の態様の第３の実施形態では、本発明は、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質が、受容体リガンド又は酵素から選択される人工的に分割された部分の相補部分を含み、相補部分の１つが不活性化されている、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関する。「人工的に分割された部分」という用語は、本明細書では「スプリット断片」と呼ばれる２つ以上（好ましくは２つ）の断片に分割された機能的に活性なタンパク質部分を指す。各スプリット断片は、機能的に活性な部分の機能に関して不活性である。すべてのスプリット断片が会合すると、機能的に活性な部分の機能性が回復する。前駆体タンパク質は、人工的に分割された部分の１つの機能的（例えば変異していない）部分及び１つの不活性化（例えば変異した）部分を含むように配置される。他方の前駆体タンパク質は、２つの前駆体タンパク質間のポリペプチド鎖交換の際に、機能的に活性な部分の形成をもたらす人工的に分割された部分の２つの相補部分が活性化タンパク質に含まれるように配置される。
第１の態様の第３の実施形態では、本発明は、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質が、受容体リガンド又は酵素から選択される人工的に分割された部分の相補部分を含み、相補部分の１つが不活性化されている、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットに関する。「人工的に分割された部分」という用語は、本明細書では「スプリット断片」と呼ばれる２つ以上（好ましくは２つ）の断片に分割された機能的に活性なタンパク質部分を指す。各スプリット断片は、機能的に活性な部分の機能に関して不活性である。すべてのスプリット断片が会合すると、機能的に活性な部分の機能性が回復する。前駆体タンパク質は、人工的に分割された部分の１つの機能的（例えば変異していない）部分及び１つの不活性化（例えば変異した）部分を含むように配置される。他方の前駆体タンパク質は、２つの前駆体タンパク質間のポリペプチド鎖交換の際に、機能的に活性な部分の形成をもたらす人工的に分割された部分の２つの相補部分が活性化タンパク質に含まれるように配置される。
【0070】
一実施形態では、部分は受容体リガンドである。一実施形態では、受容体リガンドはサイトカインである。一実施形態では、人工的に分割された部分は、スプリットサイトカインである。「スプリットサイトカイン」は、当技術分野において、例えばＶｅｎｅｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ａｕｇ ２６；２９１（３５）：１８１３９－１８１４７に記載されている。
【0071】
一実施形態では、受容体リガンドは酵素である。一実施形態では、人工的に分割された部分は、スプリット酵素である。「スプリット酵素」は、当技術分野において、例えばＬｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ８，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１７１７９（２０１８）に記載さている。
【0072】
Ｄ）前駆体タンパク質
本発明のセットに含まれる前駆体タンパク質は、ポリペプチド鎖交換を受けることができる。そのような前駆体タンパク質対の一般的なドメイン配置は、例えば、ＷＯ２０１９／０７７０９２、ＷＯ２０１９０８６３６２、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、各前駆体タンパク質は、半抗体形状であり、すなわち、ヒンジ領域を介して１つの二量体化Ｆｃベース領域に配置された１つの抗原結合部位（好ましくはＦａｂ断片）を含む。そのような前駆体タンパク質は、例えばＷＯ２０１９／０７７０９２、ＷＯ２０１９０８６３６２、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に記載されている。前記二量体化Ｆｃベース領域は、ＣＨ３ドメインの対を含み、任意に、前記ＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されたＣＨ２ドメインの対をさらに含む（したがって、前駆体タンパク質の２つの二量体化ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＣＨ２－ＣＨ３のドメイン配列を含む）か、又は、前記ＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されたＶＨ及びＶＬドメインの対をさらに含む（したがって、前駆体タンパク質の一方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＬ－ＣＨ３のドメイン配列を含み、前駆体タンパク質の他方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ－ＣＨ３のドメイン配列を含む）。ＶＨ及びＶＬドメインの対はまた、ＣＨドメインのＮ末端に融合されたＣＨ２ドメインのＮ末端に配置され得る（したがって、前駆体タンパク質の一方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３のドメイン配列を含み、前駆体タンパク質の他方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３のドメイン配列を含む）。二量体化ドメインを含む２つのポリペプチドの二量体化を含み、さらに別の異なる前駆体タンパク質とのポリペプチド鎖交換を可能にする前駆体タンパク質のアセンブリを支持するために、前駆体タンパク質に含まれる二量体化ドメインが改変される。
本発明のセットに含まれる前駆体タンパク質は、ポリペプチド鎖交換を受けることができる。そのような前駆体タンパク質対の一般的なドメイン配置は、例えば、ＷＯ２０１９／０７７０９２、ＷＯ２０１９０８６３６２、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、各前駆体タンパク質は、半抗体形状であり、すなわち、ヒンジ領域を介して１つの二量体化Ｆｃベース領域に配置された１つの抗原結合部位（好ましくはＦａｂ断片）を含む。そのような前駆体タンパク質は、例えばＷＯ２０１９／０７７０９２、ＷＯ２０１９０８６３６２、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に記載されている。前記二量体化Ｆｃベース領域は、ＣＨ３ドメインの対を含み、任意に、前記ＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されたＣＨ２ドメインの対をさらに含む（したがって、前駆体タンパク質の２つの二量体化ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＣＨ２－ＣＨ３のドメイン配列を含む）か、又は、前記ＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されたＶＨ及びＶＬドメインの対をさらに含む（したがって、前駆体タンパク質の一方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＬ－ＣＨ３のドメイン配列を含み、前駆体タンパク質の他方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ－ＣＨ３のドメイン配列を含む）。ＶＨ及びＶＬドメインの対はまた、ＣＨドメインのＮ末端に融合されたＣＨ２ドメインのＮ末端に配置され得る（したがって、前駆体タンパク質の一方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３のドメイン配列を含み、前駆体タンパク質の他方のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３のドメイン配列を含む）。二量体化ドメインを含む２つのポリペプチドの二量体化を含み、さらに別の異なる前駆体タンパク質とのポリペプチド鎖交換を可能にする前駆体タンパク質のアセンブリを支持するために、前駆体タンパク質に含まれる二量体化ドメインが改変される。
【0073】
ａ．二量体化ドメイン
本発明の一実施形態では、二量体化ドメインはＣＨ３ドメインである。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの一続きの残基（すなわち、ＩｇＧのおよそ３４１位のアミノ酸残基からおよそ４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書における「ＣＨ３ドメイン」は、バリアントＣＨ３ドメインであり、ここで、天然ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、前駆体タンパク質内で互いに対向する２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進するために、少なくとも１つの異なるアミノ酸置換（すなわち、ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列の改変）に供された。
本発明の一実施形態では、二量体化ドメインはＣＨ３ドメインである。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの一続きの残基（すなわち、ＩｇＧのおよそ３４１位のアミノ酸残基からおよそ４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書における「ＣＨ３ドメイン」は、バリアントＣＨ３ドメインであり、ここで、天然ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、前駆体タンパク質内で互いに対向する２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進するために、少なくとも１つの異なるアミノ酸置換（すなわち、ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列の改変）に供された。
【0074】
一実施形態では、各前駆体タンパク質は、上で定義したようなノブ・イントゥ・ホール改変、システイン変異及び不安定化変異を有するＣＨ３ドメインを含む。
【0075】
ＣＨ３ドメインは任意のＩｇＧアイソタイプのものであり得るが、２つの前駆体タンパク質のＣＨ３ドメインは同じＩｇＧアイソタイプのものである。一実施形態では、ＣＨ３ドメインはＩｇＧ１アイソタイプのものである。一実施形態では、ＣＨ３ドメインはＩｇＧ３アイソタイプのものである。
【0076】
ノブ－イントゥ・ホール変異
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質はそれぞれ、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチドを含み、一方のＣＨ３ドメインはノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む。この実施形態によれば、前駆体タンパク質に含まれるＣＨ３ドメインは、ノブ・イントゥ・ホール改変を含む。「ノブ・イントゥ・ホール技術」は当技術分野で周知であり、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１、及び国際公開第９８／０５０４３１号にいくつかの例を示して詳細に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。「ノブ・イントゥ・ホール」技術では、抗体の三次構造中の２つのＣＨ３ドメイン間に形成された界面内において、各ＣＨ３ドメイン上の特定のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインの一方に突起（「ノブ」）を、ＣＨ３ドメインの他方に空洞（「ホール」）をそれぞれ作製するように操作されている。多重特異性抗体の三次構造において、一方のＣＨ３ドメインの導入された突起は、他方のＣＨ３ドメインの導入された空洞内に配置可能である。
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質はそれぞれ、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチドを含み、一方のＣＨ３ドメインはノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む。この実施形態によれば、前駆体タンパク質に含まれるＣＨ３ドメインは、ノブ・イントゥ・ホール改変を含む。「ノブ・イントゥ・ホール技術」は当技術分野で周知であり、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１、及び国際公開第９８／０５０４３１号にいくつかの例を示して詳細に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。「ノブ・イントゥ・ホール」技術では、抗体の三次構造中の２つのＣＨ３ドメイン間に形成された界面内において、各ＣＨ３ドメイン上の特定のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインの一方に突起（「ノブ」）を、ＣＨ３ドメインの他方に空洞（「ホール」）をそれぞれ作製するように操作されている。多重特異性抗体の三次構造において、一方のＣＨ３ドメインの導入された突起は、他方のＣＨ３ドメインの導入された空洞内に配置可能である。
【0077】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質に含まれるノブ変異は、第２の前駆体タンパク質に含まれるノブ変異と同一である。一実施形態において、ノブ変異は、Ｔ３６６Ｗである。一実施形態において、ホール変異はＴ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖである。
【0078】
ヘテロ二量体化を必然的に起こすためにＣＨ３ドメインを修飾するための、前述の「ノブ・イントゥー・ホール」技術以外のさらなる技術は、当技術分野において既知である。これらの技術、特に国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている技術は、本明細書において、本発明によって提供される前駆体タンパク質についての「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替として企図されている。これらの技術は全て、反対の電荷又は異なる側鎖体積のアミノ酸の導入により、相補的な様式でＣＨ３ドメインを操作し、それによってヘテロ二量体化を支持することを含む。
【0079】
システイン変異
ノブ・イントゥ・ホール技術による置換と組み合わせて、追加の鎖間ジスルフィド結合をＣＨ３ドメインに導入して、ヘテロ二量体化ポリペプチドをさらに安定化することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）。そのような鎖間ジスルフィド結合は、例えば、以下のアミノ酸置換をＣＨ３ドメインに導入することによって形成される、一方のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＫ３９２Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＥ３５６Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＥ３５７Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＬ３５１Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＴ３９４Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＶ３９７Ｃ。一実施形態において、ｉ）第１の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むかのいずれかである。本明細書で使用される「システイン変異」は、システインによる第２のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の他の、一致するアミノ酸置換とともに有する鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、システインによるＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の１つのアミノ酸置換を指す。
ノブ・イントゥ・ホール技術による置換と組み合わせて、追加の鎖間ジスルフィド結合をＣＨ３ドメインに導入して、ヘテロ二量体化ポリペプチドをさらに安定化することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）。そのような鎖間ジスルフィド結合は、例えば、以下のアミノ酸置換をＣＨ３ドメインに導入することによって形成される、一方のＣＨ３ドメイン中のＤ３９９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＫ３９２Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＥ３５６Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＥ３５７Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＬ３５１Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメイン中のＴ３９４Ｃ及び他方のＣＨ３ドメイン中のＶ３９７Ｃ。一実施形態において、ｉ）第１の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むかのいずれかである。本明細書で使用される「システイン変異」は、システインによる第２のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の他の、一致するアミノ酸置換とともに有する鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、システインによるＣＨ３ドメイン中のアミノ酸の１つのアミノ酸置換を指す。
【0080】
本発明の一実施形態において、前駆体タンパク質のＣＨ３ドメインは、相互作用する位置にシステイン置換を有する２つのＣＨ３ドメイン間の鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にするために、変異の第２のパターン、すなわちＣＨ３／ＣＨ３界面における異なるアミノ酸のシステインによる置換を含む。
【0081】
したがって、本発明の一実施形態において、ｉ）第１の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むかのいずれかである。言い換えれば、一実施形態において、ｉ）第１のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まず、第２のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まず、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まず、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まないかのいずれかである。
【0082】
一実施形態において、ｉ）第１の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインが第１のシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインが第２のシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインが第１のシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインが第２のシステイン変異を含むかのいずれかであり、第１及び第２のシステイン変異は、以下の対から選択される。
【0083】
一実施形態において、第１のシステイン変異は、Ｙ３４９Ｃであり、第２のシステイン変異は、Ｓ３５４Ｃである。
【0084】
本発明の一実施形態において、ｉ）第１の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含み、第２の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含むか、又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含み、第２の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含む。
【0085】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインは置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインは３４９位にＹを含み、第２の前駆体タンパク質内で、ホール変異を含むＣＨ３ドメインは置換Ｙ３４９Ｃを含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインは、３５４位にＳを含む。
【0086】
本発明の一実施形態において、ｉ）第１の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｗ Ｓ３５４Ｃを含み、第２の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ Ｙ３４９Ｃを含むか、又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ Ｙ３４９Ｃを含み、第２の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｗ Ｓ３５４Ｃを含む。
【0087】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインは置換Ｔ３６６Ｗ Ｓ３５４Ｃを含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインは３４９位のＹ、及び置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖを含み、第２の前駆体タンパク質内で、ホール変異を含むＣＨ３ドメインは置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ Ｙ３４９Ｃを含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインは、３５４位のＳ、及び置換Ｔ３６６Ｗを含む。
【0088】
本発明の一実施形態において、前駆体タンパク質のＣＨ３ドメインは、鎖間ジスルフィド結合を含まない。
【0089】
不安定化変異
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換を支持するために、ＣＨ３ドメインは、改変された界面を有する。本発明の前駆体タンパク質は、そのＣＨ３ドメインの１つのみに、本明細書において「不安定化変異」とも称する「ＣＨ３／ＣＨ３界面を不安定化する」アミノ酸置換を含む。これらの末端により、ヘテロ二量体前駆体タンパク質に会合しているＣＨ３ドメインの１つのみに配置されているアミノ酸置換が意味される。前記ＣＨ３ドメインにおいて、例えば上記のＣＨ３ヘテロ二量体化戦略に関連する先行技術に開示されているように、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で相互作用することが知られている１つ以上のアミノ酸位置が、他の部位鎖特性を有するアミノ酸によって置換される。典型的には会合したＣＨ３ドメイン中の相互作用するアミノ酸の対が置換されるヘテロ二量体化戦略（すなわち、ヘテロ二量体に関与する一方のＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基、及びヘテロ二量体に関与する他方のＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基）とは対照的に、不安定化変異は、本発明による前駆体タンパク質に関与するＣＨ３ドメインの１つのみに配置される。ＣＨ３／ＣＨ３接触面を不安定にする例示的アミノ酸置換は、以下に列挙される。本明細書に具体的に開示される全ての例示的なアミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が前記ＣＨ３ドメインの対内のＣＨ３／ＣＨ３界面で相互作用するように配置される。
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換を支持するために、ＣＨ３ドメインは、改変された界面を有する。本発明の前駆体タンパク質は、そのＣＨ３ドメインの１つのみに、本明細書において「不安定化変異」とも称する「ＣＨ３／ＣＨ３界面を不安定化する」アミノ酸置換を含む。これらの末端により、ヘテロ二量体前駆体タンパク質に会合しているＣＨ３ドメインの１つのみに配置されているアミノ酸置換が意味される。前記ＣＨ３ドメインにおいて、例えば上記のＣＨ３ヘテロ二量体化戦略に関連する先行技術に開示されているように、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で相互作用することが知られている１つ以上のアミノ酸位置が、他の部位鎖特性を有するアミノ酸によって置換される。典型的には会合したＣＨ３ドメイン中の相互作用するアミノ酸の対が置換されるヘテロ二量体化戦略（すなわち、ヘテロ二量体に関与する一方のＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基、及びヘテロ二量体に関与する他方のＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基）とは対照的に、不安定化変異は、本発明による前駆体タンパク質に関与するＣＨ３ドメインの１つのみに配置される。ＣＨ３／ＣＨ３接触面を不安定にする例示的アミノ酸置換は、以下に列挙される。本明細書に具体的に開示される全ての例示的なアミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が前記ＣＨ３ドメインの対内のＣＨ３／ＣＨ３界面で相互作用するように配置される。
【0090】
一実施形態では、ｉ）ノブ変異を含む第１の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン及びホール変異を含む第２の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン、又はｉｉ）ホール変異を含む第１の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン及びノブ変異を含む第２の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメインは、少なくとも１つの相補的不安定化変異を含むが、第１及び第２の前駆体ポリペプチドの他の２つのＣＨ３ドメインは不安定化変異を含まない。
【0091】
本発明によれば、ｉ）ノブ変異を含む第１の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン及びホール変異を含む第２の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン、又はｉｉ）ホール変異を含む第１の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン及びノブ変異を含む第２の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメインのいずれかは、１つ以上の不安定化変異を含む。第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質と内の１つ以上の不安定化変異は、それらが前駆体ポリペプチド間のポリペプチド鎖交換によって形成された産物ポリペプチドのＣＨ３／ＣＨ３界面で相互作用するように選択される。
【0092】
前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインが不安定化変異を含む場合、前記前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインは不安定化変異を含まない。ＣＨ３ドメインは、それが「不安定化変異を含まない」とき、同じクラスの野生型免疫グロブリンのＣＨ３ドメインにおいて、対応するＣＨ３ドメインに含まれる不安定化変異の位置にあるアミノ酸残基と相互作用する位置に、野生型アミノ酸残基を含む。
【0093】
変異の第１のセット（ＦＯＲＣＥ／ＰＡＣＥ １．０変異）
不安定化変異の第１のセットは、ＷＯ２０１９／０７７０９２、及びＷＯ２０１９０８６３６２に開示されている。
不安定化変異の第１のセットは、ＷＯ２０１９／０７７０９２、及びＷＯ２０１９０８６３６２に開示されている。
【0094】
本発明の一実施形態では、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｋ、Ｙ３４９Ｗ、Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｆ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｅ、Ｓ３５４Ｖ、Ｄ３５６Ｓ、Ｄ３５６Ａ、Ｄ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｓ、Ｅ３５７Ａ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｆ、Ｅ３５７Ｋ、Ｋ３６０Ｓ、Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｖ、Ｋ３７０Ｅ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ３９７Ｙ、Ｄ３９９Ａ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｋ、Ｄ４０１Ｒ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｗ、Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ｉ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｉ、Ｋ４３９Ｅ、Ｌ４４１Ｙ、Ｃ３４９Ｙ、Ｓ３６６Ｔ、Ａ３６８Ｌ、Ｖ４０７Ｙ、Ｃ３５４Ｓ、及びＷ３６６Ｔの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｋ、Ｙ３４９Ｗ、Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｆ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｅ、Ｓ３５４Ｖ、Ｄ３５６Ｓ、Ｄ３５６Ａ、Ｄ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｓ、Ｅ３５７Ａ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｆ、Ｅ３５７Ｋ、Ｋ３６０Ｓ、Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｖ、Ｋ３７０Ｅ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ３９７Ｙ、Ｄ３９９Ａ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｋ、Ｄ４０１Ｒ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｗ、Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ｉ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｉ、Ｋ４３９Ｅ、Ｌ４４１Ｙ、Ｃ３４９Ｙ、Ｓ３６６Ｔ、Ａ３６８Ｌ、Ｖ４０７Ｙ、Ｃ３５４Ｓ、及びＷ３６６Ｔ．の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含む。
【0095】
一実施形態では、ホール変異を持つＣＨ３ドメインは、３５７位又は３５６位に少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、３７０位又は４３９位に少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含む。一実施形態では、ホール変異を持つＣＨ３ドメインは、３５６位に少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、４３９位に少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含む。一実施形態では、ホール変異を持つＣＨ３ドメインは、３５７位に少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、３７０位に少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含む。
【0096】
一実施形態では、一方（例えば、第１）の前駆体タンパク質のホール変異を有するＣＨ３ドメインはＤ３５６Ｋ変異を含み、他方（例えば、第２）の前駆体タンパク質のノブ変異を有するＣＨ３ドメインはＫ４３９Ｅ変異を含む。一実施形態では、一方（例えば、第１）の前駆体タンパク質のホール変異を有するＣＨ３ドメインはＥ３５７Ｋ変異を含み、他方（例えば、第２）の前駆体タンパク質のノブ変異を有するＣＨ３ドメインはＫ３７０Ｅ変異を含む。
【0097】
変異の第２のセット（ＦＯＲＣＥ２．０変異）
不安定化変異の第２のセットは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２に開示されている。
不安定化変異の第２のセットは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２に開示されている。
【0098】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、疎水性アミノ酸でのＳ３５４の置き換え；正荷電アミノ酸でのＤ３５６の置き換え；正荷電アミノ酸又は疎水性アミノ酸でのＥ３５７の置き換え；正荷電アミノ酸でのＤ３５６の置き換えと、正荷電アミノ酸又は疎水性アミノ酸でのＥ３５７の置き換え；疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；負荷電アミノ酸でのＥ３９２の置き換え；疎水性アミノ酸でのＴ３９４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＤ３９９の置き換えと、正荷電アミノ酸でのＳ４００の置き換え；疎水性アミノ酸でのＤ３９９の置き換えと、正荷電アミノ酸でのＦ４０５の置き換え；疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え；及び負荷電アミノ酸でのＫ４０９の置き換え；及び負荷電アミノ酸でのＫ４３９の置き換えからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換，即ち不安定化変異を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、正荷電アミノ酸でのＱ３４７の置き換えと、負荷電アミノ酸でのＫ３６０の置き換え；負荷電アミノ酸でのＹ３４９の置き換え；疎水性アミノ酸のＬ３５１の置き換えと、疎水性アミノ酸でのＥ３５７の置き換え；疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＷ３６６の置き換えと、負荷電アミノ酸でのＫ４０９の置き換え；疎水性アミノ酸でのＬ３６８の置き換え；負荷電アミノ酸でのＫ３７０の置き換え；負荷電アミノ酸でのＫ３７０の置き換えと、負荷電アミノ酸でのＫ４３９の置き換え；負荷電アミノ酸でのＫ３９２の置き換え；疎水性アミノ酸でのＴ３９４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え；正荷電アミノ酸でのＤ３９９の置き換えと、負荷電アミノ酸でのＫ４０９の置き換え；正荷電アミノ酸でのＳ４００の置き換え；Ｆ４０５Ｗ；Ｙ４０７Ｗ；及び負荷電アミノ酸でのＫ４３９の置き換えの群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換，即ち不安定化変異を含む。
【0099】
一実施形態において、疎水性アミノ酸は、ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅから選択される。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｙｒから選択される。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｌｅｕ又はＩｌｅである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｌｅｕである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｔｙｒである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｐｈｅである。
【0100】
一実施形態において、正荷電アミノ酸は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。一実施形態において、正荷電アミノ酸は、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。一実施形態において、正荷電アミノ酸は、Ｌｙｓである。
【0101】
一実施形態において、負荷電アミノ酸は、Ａｓｐ又はＧｌｕである。一実施形態において、負荷電アミノ酸残基は、Ａｓｐである。一実施形態において、負荷電アミノ酸残基は、Ｇｌｕである。
【0102】
ＣＨ３ドメイン内に示されたアミノ酸位置にそれぞれの側鎖特性を有するアミノ酸でのアミノ酸置換は、２つの前駆体ポリペプチドからの産物ポリペプチド形成とポリペプチド鎖交換とをサポートすることが分かった。
【0103】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｖ、Ｓ３５４Ｉ、Ｓ３５４Ｌ、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｆ、Ｓ３６４Ｌ、Ｓ３６４Ｉ、Ａ３６８Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｌ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ４０７Ｙ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４３９Ｄ、Ｋ４３９Ｅ及び二重変異Ｄ３９９Ａ Ｓ４００Ｋ、Ｄ３９９Ａ Ｓ４００Ｒ、Ｄ３９９Ａ Ｆ４０５Ｗの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、Ｓ３６４Ｖ、Ｓ３６４Ｉ、Ｓ３６４Ｌ、Ｌ３６８Ｆ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｌ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ３９７Ｙ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｗ、Ｋ３４９Ｅ、Ｋ４３９Ｄ及び二重変異Ｑ３４７Ｋ Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３４７Ｒ Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３４７Ｋ Ｋ３６０Ｄ、Ｑ３４７Ｒ Ｋ３６０Ｄ、Ｌ３５１Ｆ Ｅ３５７Ｆ、Ｗ３６６Ｉ Ｋ４０９Ｅ、Ｗ３６６Ｌ Ｋ４０９Ｅ、Ｗ３６６Ｋ Ｋ４０９Ｄ、Ｗ３６６Ｌ Ｋ４０９Ｄ、Ｄ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｅ、Ｄ３９９Ｒ Ｋ４０９Ｅ、Ｄ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｄ、及びＤ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0104】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４Ｖ、Ｄ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｆ、Ｓ３６４Ｌ、Ａ３６８Ｆ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ４０７Ｙ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９Ｅ及び二重変異Ｄ３９９Ａ Ｓ４００Ｋの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｓ３６４Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ３９７Ｙ、Ｓ４００Ｋ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｗ、Ｋ３４９Ｅ、及び二重変異Ｑ３４７Ｋ Ｋ３６０Ｅ、Ｌ３５１Ｆ Ｅ３５７Ｆ、Ｗ３６６Ｉ Ｋ４０９Ｅ、及びＤ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0105】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｆ、Ｓ３６４Ｌ、Ｓ３６４Ｉ、Ｖ４０７Ｙ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ及び二重変異Ｄ３９９Ａ Ｓ４００Ｋ、Ｄ３９９Ａ Ｓ４００Ｒの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｌ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ３９７Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｗ、Ｋ３４９Ｅ、Ｋ４３９Ｄ及び二重変異Ｑ３４７Ｋ Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３４７Ｒ Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３４７Ｋ Ｋ３６０Ｄ、Ｑ３４７Ｒ Ｋ３６０Ｄ、Ｗ３６６Ｉ Ｋ４０９Ｅ、Ｗ３６６Ｌ Ｋ４０９Ｅ、Ｗ３６６Ｋ Ｋ４０９Ｄ、Ｗ３６６Ｌ Ｋ４０９Ｄ、Ｄ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｅ、Ｄ３９９Ｒ Ｋ４０９Ｅ、Ｄ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｄ及びＤ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0106】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｄ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｆ、Ｓ３６４Ｌ、Ｖ４０７Ｙ、Ｋ４０９Ｅ、及び二重変異Ｄ３９９Ａ Ｓ４００Ｋの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｉ、Ｖ３９７Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｗ、Ｋ３４９Ｅ、及び二重変異Ｑ３４７Ｋ Ｋ３６０Ｅ、Ｗ３６６Ｉ Ｋ４０９Ｅ、及びＤ３９９Ｋ Ｋ４０９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0107】
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示す群から選択されるアミノ酸置換の１つを含む。
【0108】
明確性のために、この表は、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが上記の表の第１列に示される不安定化変異を含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが、同じ行に示される上記の表の右列に列挙される不安定化変異を含むという点で理解されるべきである。
【0109】
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示す群から選択されるアミノ酸置換の１つを含む。
【0110】
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示す群から選択されるアミノ酸置換の１つを含む。
【0111】
変異の第３のセット（ＰＡＣＥ２．０変異）
不安定化変異の第３のセットは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に開示されている。
不安定化変異の第３のセットは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に開示されている。
【0112】
本発明の一実施形態では、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７の正荷電アミノ酸による置換、Ｓ３６４の疎水性アミノ酸による置換、Ａ３６８の疎水性アミノ酸による置換、及びＶ４０７の疎水性アミノ酸による置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、不安定化変異を含まないか、又はＫ３７０の負荷電アミノ酸による置換Ｋ３７０の負荷電アミノ酸による置換、及びＫ４３９の負荷電アミノ酸による置換、Ｋ３９２の負荷電アミノ酸による置換、及びＶ３９７の疎水性アミノ酸による置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、すなわち不安定化変異を含むかのいずれかである。
【0113】
一実施形態において、疎水性アミノ酸は、ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅから選択される。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｙｒから選択される。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｌｅｕ又はＩｌｅである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｌｅｕである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｔｙｒである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｐｈｅである。
【0114】
一実施形態において、正荷電アミノ酸は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。一実施形態において、正荷電アミノ酸は、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。一実施形態において、正荷電アミノ酸は、Ｌｙｓである。
【0115】
一実施形態において、負荷電アミノ酸は、Ａｓｐ又はＧｌｕである。一実施形態において、負荷電アミノ酸残基は、Ａｓｐである。一実施形態において、負荷電アミノ酸残基は、Ｇｌｕである。
【0116】
ＣＨ３ドメイン中の示されたアミノ酸位置にそれぞれの側鎖特性を有するアミノ酸によるアミノ酸置換は、ポリペプチド鎖交換及び２つの前駆体ポリペプチドからの産物ポリペプチド形成を支持することが見出された。
【0117】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｓ３６４Ｌ、Ｓ３６４Ｉ、Ｖ４０７Ｙ、Ｖ４０７Ｆ及びＡ３６８Ｆの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、不安定化変異を含まないか、又はＫ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、及び二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｄ、及びＫ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｄの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0118】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３６４Ｌ、Ｖ４０７Ｙ及びＡ３６８Ｆの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ及び二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0119】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｓ３６４Ｌ、Ｓ３６４Ｉ、Ｖ４０７Ｙ及びＶ４０７Ｆの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、及び二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｄ、及びＫ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｄの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0120】
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３６４Ｌ及びＶ４０７Ｙの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ及び二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0121】
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示す群から選択されるアミノ酸置換の１つを含む。
【0122】
明確性のために、この表は、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが上記の表の第１列に示される不安定化変異を含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが、同じ行に示される上記の表の右列に列挙される不安定化変異を含むという点で理解されるべきである。
【0123】
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示す群から選択されるアミノ酸置換の１つを含む。
【0124】
ｂ．抗原結合部位
上に概説したように、本発明の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とは、ポリペプチド鎖交換を受けることができる。特定の実施形態では、両方の前駆体タンパク質を溶液中に提供することによって、ポリペプチド鎖交換が自発的に起こる。特定の実施形態では、本発明の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのポリペプチド鎖交換は、両方の前駆体タンパク質が、例えば同じ細胞の表面に結合することによって近接するときに支持される。したがって、一実施形態では、前駆体タンパク質は、細胞の表面に結合したときにポリペプチド鎖交換を受けることができる。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞に特異的に結合する。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞の表面上の抗原に特異的に結合する。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞の表面上の異なる抗原に特異的に結合する。本明細書で使用される「標的細胞」は、本発明のタンパク質による治療を受けることが望ましい細胞である。一実施形態では、標的細胞は癌細胞である。
上に概説したように、本発明の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とは、ポリペプチド鎖交換を受けることができる。特定の実施形態では、両方の前駆体タンパク質を溶液中に提供することによって、ポリペプチド鎖交換が自発的に起こる。特定の実施形態では、本発明の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのポリペプチド鎖交換は、両方の前駆体タンパク質が、例えば同じ細胞の表面に結合することによって近接するときに支持される。したがって、一実施形態では、前駆体タンパク質は、細胞の表面に結合したときにポリペプチド鎖交換を受けることができる。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞に特異的に結合する。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞の表面上の抗原に特異的に結合する。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、標的細胞の表面上の異なる抗原に特異的に結合する。本明細書で使用される「標的細胞」は、本発明のタンパク質による治療を受けることが望ましい細胞である。一実施形態では、標的細胞は癌細胞である。
【0125】
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は抗体結合領域を含む。抗体結合領域は、二量体化ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に配置され得る。
【0126】
本発明の一実施形態において、抗原結合領域は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの対を含み、これは標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する。
【0127】
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は抗体断片を含む。一実施形態では、各前駆体タンパク質は、一本鎖抗体断片又は２つのポリペプチドを含む抗体断片であり得る抗体フラグメントを含む。
【0128】
本発明の一実施形態において、本発明による（前駆体）ポリペプチドに含まれる抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ）２、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、及びｓｃＦａｂの群から選択される抗体断片である。一実施形態において、本発明による（前駆体）ポリペプチドに含まれる抗体断片はＦｖ又はＦａｂである。本発明の一実施形態において、標的抗原結合領域は、Ｆａｂ断片である。本発明の一実施形態において、第１の抗原結合領域は第１のＦａｂ断片であり、第２の抗原結合領域は第２のＦａｂ断片である。
【0129】
一実施形態では、抗体断片がＦａｂ断片である場合、前駆体タンパク質は、３つのポリペプチド：ＶＬ－ＣＬドメインを含む抗体軽鎖、機能性Ｆａｂ断片及びＣＨ３ドメインの形成を可能にする対応するＶＨ－ＣＨ１ドメインを含む抗体重鎖様ポリペプチド、対応するＣＨ３ドメインを含む別の抗体重鎖様ポリペプチドを含む。上記のように、ＣＨ２ドメイン又はＶＨ／ＶＬ対のようなさらなる抗体ドメインが存在してもよい。
【0130】
本発明の一実施形態において、第１のＦａｂ断片、第２のＦａｂ断片又はその両方、第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、ドメイン交差によって、
ａ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインのみが互いに置換されている、
ｂ）ＶＨドメインとＶＬドメインのみが互いに置換されている、又は
ｃ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインは互いに置換されており、ＶＨドメインとＶＬドメインは互いに置換されているように変更される。
ａ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインのみが互いに置換されている、
ｂ）ＶＨドメインとＶＬドメインのみが互いに置換されている、又は
ｃ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインは互いに置換されており、ＶＨドメインとＶＬドメインは互いに置換されているように変更される。
【0131】
本発明の一実施形態において、標的抗原結合領域は、Ｆｖ断片である。本発明の一実施形態において、第１の抗原結合領域は第１のＦｖ断片であり、第２の抗原結合領域は第２のＦｖ断片である。
【0132】
本発明の一実施形態では、第１の前駆体タンパク質の抗原結合領域及び第２の前駆体タンパク質の抗原結合領域は、同じ抗原に結合する。本発明の一実施形態では、第１の前駆体タンパク質の抗原結合領域及び第２の前駆体タンパク質の抗原結合領域は、同一の抗原結合部分である。
【0133】
本発明の一実施形態では、第１の前駆体タンパク質の抗原結合領域及び第２の前駆体タンパク質の抗原結合領域は、異なる抗原に結合する。この場合、２つの前駆体タンパク質間のポリペプチド鎖交換時に、第１の前駆体タンパク質に由来する抗原結合領域及び第２の前駆体タンパク質に由来する抗原結合領域を含む、多重特異性産物ポリペプチドが形成される。
【0134】
さらなる抗原結合部分は、前駆体タンパク質中に存在してよく、これは、より高い価数の産物ポリペプチドを提供するために、前駆体タンパク質に含まれるポリペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に融合され得る。
【0135】
そのようなさらなる抗原結合部分は、適切なペプチドコネクタを介してポリペプチド鎖に融合される。一実施形態において、ペプチドコネクタはグリシン－セリンリンカーである。
【0136】
本発明の一実施形態において、前駆体タンパク質において、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の１つのみが、抗原結合領域の少なくとも一部を含む。本発明の一実施形態において、前駆体タンパク質において、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位のＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の１つ。本発明の一実施形態において、前駆体タンパク質において、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の１つは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ヒンジ領域、抗体可変ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチド鎖は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位の一部ではない。本発明の一実施形態において、前駆体タンパク質において、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の１つは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ヒンジ領域、抗体可変ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチド鎖は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位の一部ではない。
【0137】
ｃ．前駆体タンパク質のドメイン配列
本発明による前駆体タンパク質は、種々の形式及び種々のドメイン配置の産物ポリペプチドの生成に適している。前駆体タンパク質に提供されるドメインの選択及び抗原結合領域の数に応じて、異なる抗原結合特性（例えば、特異性、結合価）及び異なるエフェクタ機能を有する産物ポリペプチドが生成され得る。
本発明による前駆体タンパク質は、種々の形式及び種々のドメイン配置の産物ポリペプチドの生成に適している。前駆体タンパク質に提供されるドメインの選択及び抗原結合領域の数に応じて、異なる抗原結合特性（例えば、特異性、結合価）及び異なるエフェクタ機能を有する産物ポリペプチドが生成され得る。
【0138】
一実施形態において、第１の前駆体ポリペプチド及び第２の前駆体タンパク質は、ＣＨ３ドメインを含む正確に２つのポリペプチド鎖を含む。したがって、ＣＨ３ドメインを欠くさらなるポリペプチド鎖が、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とに含まれ得る。
【0139】
抗体断片
本発明の一実施形態において、抗原結合領域は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、これは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、
ａ）第１の前駆体タンパク質は、
－ ＣＨ３ドメインと第１の抗体可変ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第２の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１及び第２の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２の前駆体タンパク質は、
－ ＣＨ３ドメインと第３の抗体可変ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第４の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第３及び第４の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含む。
本発明の一実施形態において、抗原結合領域は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、これは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、
ａ）第１の前駆体タンパク質は、
－ ＣＨ３ドメインと第１の抗体可変ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第２の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１及び第２の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２の前駆体タンパク質は、
－ ＣＨ３ドメインと第３の抗体可変ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第４の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第３及び第４の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含む。
【0140】
ＣＨ２ドメインを含む前駆体タンパク質
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む前駆体タンパク質は、Ｆｃ媒介エフェクター機能の媒介及び循環における長い半減期といった有利な特性を呈する。
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む前駆体タンパク質は、Ｆｃ媒介エフェクター機能の媒介及び循環における長い半減期といった有利な特性を呈する。
【0141】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
【0142】
本発明の一実施形態では、ｉ）第１の前駆体タンパク質が、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２の前駆体タンパク質が、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質が、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２の前駆体タンパク質が、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。
【0143】
本発明の一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質はＣＨ２ドメインを欠いている。ＣＨ２ドメインを欠く前駆体タンパク質は、循環からの迅速なクリアランスといった有利な特性を呈する。
【0144】
活性化可能な抗原結合部位
特定の実施形態では、各前駆体タンパク質は、抗原結合領域の一部を含み、前記抗原結合領域は、前駆体ポリペプチド内で非機能性であり、前駆体ポリペプチド間のポリペプチド鎖の交換により形成された産物ポリペプチド内で、抗原結合領域は機能性であり、標的抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、本発明の前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質間のポリペプチド鎖交換後、すなわち活性化タンパク質でのみ機能的に活性なＶＨ及びＶＬドメインの追加の対を含む。ポリペプチド鎖交換による抗原結合部位の活性化は、ＷＯ２０１９０８６３６２、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に以前に記載されている。簡単に記載すると、一方の前駆体タンパク質は、目的の抗体に由来するＶＨドメインを含み、これが、ＣＨ２ドメイン又は異なる抗体由来のＶＬドメインのいずれかと対になる。どちらの場合も、機能的結合部位は形成されない。さらに、他方の前駆体タンパク質は、目的の抗体に由来する対応するＶＬドメインを含み、これが、ＣＨ２ドメイン又は異なる抗体由来のＶＨドメインのいずれかと対になる。ポリペプチド鎖交換時に、目的の抗体の両方の可変ドメインＶＨ及びＶＬが活性化抗体内で組み合わされる。一実施形態では、目的の抗体は、Ｔ細胞抗原に、一実施形態ではＣＤ３に特異的に結合する。このためには、両方の可変ドメインがＣＨ３ドメインを有するポリペプチド上に配置されなければならず、ＶＨドメインはノブ変異を有するＣＨ３ドメイン上に配置され、ＶＬドメインはホール変異を有するＣＨ３ドメイン上に配置され、逆もまた同様である（すなわち、ＣＨ３－ホールポリペプチド上にＶＨドメイン及びＣＨ３－ノブポリペプチド上にＶＬ）。したがって、一実施形態では、ａ）活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、ＶＨドメインは第１の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれ、ＶＬドメインは第２の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれるか；又は、ｂ）活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、ＶＬドメインは第１の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれ、ＶＨドメインは第２の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれる。一実施形態では、抗原はＴ細胞抗原、好ましくはＣＤ３である。
特定の実施形態では、各前駆体タンパク質は、抗原結合領域の一部を含み、前記抗原結合領域は、前駆体ポリペプチド内で非機能性であり、前駆体ポリペプチド間のポリペプチド鎖の交換により形成された産物ポリペプチド内で、抗原結合領域は機能性であり、標的抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、本発明の前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質間のポリペプチド鎖交換後、すなわち活性化タンパク質でのみ機能的に活性なＶＨ及びＶＬドメインの追加の対を含む。ポリペプチド鎖交換による抗原結合部位の活性化は、ＷＯ２０１９０８６３６２、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１２及びＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６１４１３に以前に記載されている。簡単に記載すると、一方の前駆体タンパク質は、目的の抗体に由来するＶＨドメインを含み、これが、ＣＨ２ドメイン又は異なる抗体由来のＶＬドメインのいずれかと対になる。どちらの場合も、機能的結合部位は形成されない。さらに、他方の前駆体タンパク質は、目的の抗体に由来する対応するＶＬドメインを含み、これが、ＣＨ２ドメイン又は異なる抗体由来のＶＨドメインのいずれかと対になる。ポリペプチド鎖交換時に、目的の抗体の両方の可変ドメインＶＨ及びＶＬが活性化抗体内で組み合わされる。一実施形態では、目的の抗体は、Ｔ細胞抗原に、一実施形態ではＣＤ３に特異的に結合する。このためには、両方の可変ドメインがＣＨ３ドメインを有するポリペプチド上に配置されなければならず、ＶＨドメインはノブ変異を有するＣＨ３ドメイン上に配置され、ＶＬドメインはホール変異を有するＣＨ３ドメイン上に配置され、逆もまた同様である（すなわち、ＣＨ３－ホールポリペプチド上にＶＨドメイン及びＣＨ３－ノブポリペプチド上にＶＬ）。したがって、一実施形態では、ａ）活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、ＶＨドメインは第１の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれ、ＶＬドメインは第２の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれるか；又は、ｂ）活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、ＶＬドメインは第１の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれ、ＶＨドメインは第２の前駆体タンパク質由来のポリペプチドに含まれる。一実施形態では、抗原はＴ細胞抗原、好ましくはＣＤ３である。
【0145】
本発明の一実施形態において、前記抗原結合領域は、一対の抗体可変ドメインを含む抗原結合部位である。
【0146】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は、ＶＬドメイン及びＣＨ３ドメインを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２の前駆体タンパク質は、ＶＨドメイン及びＣＨ３ドメインを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの対に会合した場合に抗原に特異的に結合する。一実施形態において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの対によって特異的に結合される抗原はＣＤ３である。
【0147】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬドメイン及びＣＨ３ドメインを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨドメイン及びＣＨ３ドメインを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの対に会合した場合に抗原に特異的に結合する。
【0148】
本発明の一実施形態では、
ａ）第１の前駆体タンパク質は、
ａ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、及び
ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
ｃ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとが互いに結合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２の前駆体タンパク質は、
ｄ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、及び
ｅ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
ｆ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
ａ）第１の前駆体タンパク質は、
ａ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、及び
ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
ｃ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとが互いに結合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２の前駆体タンパク質は、
ｄ）Ｎ末端からＣ末端方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、及び
ｅ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
ｆ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
【0149】
一実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含み；第３の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第４の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドはＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む。一実施形態において、第１、第２、第３及び第４の重鎖ポリペプチドに含まれるペプチドコネクターは同一である。
【0150】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質では、第１の重鎖ポリペプチドに含まれる第２の抗体可変ドメインは、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体に由来しており、第２の重鎖ポリペプチドに含まれる抗体可変ドメインは、第２の標的抗原に特異的に結合する。両方の可変ドメインは、互いに会合することができる。したがって、重鎖ポリペプチドの一方はＶＨドメインを含み、他方の重鎖ポリペプチドはＶＬドメインを含む。ＶＨドメインとＶＬドメインは、互いに会合することができる。しかしながら、非機能性抗原結合部位が形成される。したがって、本発明の文脈で用語「互いに会合することのできる可変ドメイン」は、ＶＨドメインとＶＬドメインの対が提供されることを意味する。この実施形態では、第２の前駆体タンパク質内で、第３の重鎖ポリペプチドに含まれる第３の抗体可変ドメインは、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体に由来しており（即ち第１の前駆体タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドに含まれる第２の可変ドメインと機能性ＶＨ／ＶＬ対を形成することができる）、第４の重鎖ポリペプチドに含まれる抗体可変ドメインは、別の、例えば第２の、標的抗原に特異的に結合する。第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドに含まれる可変ドメインは、互いに会合することができ、即ち可変ドメインの一方がＶＨドメインであり、可変ドメインの他方がＶＬドメインであり；第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドに含まれる可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができ、即ち両方の可変ドメインが、標的抗原に特異的に結合する同じ抗体に由来している。
【0151】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、第１の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、ＶＬドメインとＶＨドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
【0152】
本発明の一実施形態では、
ａ）第１の前駆体タンパク質は、
ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
ｃ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとが互いに結合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２の前駆体タンパク質は、
ｄ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
ｅ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
ｆ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
ａ）第１の前駆体タンパク質は、
ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
ｃ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとが互いに結合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２の前駆体タンパク質は、
ｄ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
ｅ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
ｆ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドがホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドがノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
【0153】
一実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含み；第３の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第４の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドはＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む。一実施形態において、第１、第２、第３及び第４の重鎖ポリペプチドに含まれるペプチドコネクターは同一である。
【0154】
鎖間ジスルフィド結合
本発明の前駆体タンパク質は抗体ベースの構造を有するので、前駆体タンパク質の個々のポリペプチド間の鎖間ジスルフィドが存在し得る。しかしながら、鎖間ジスルフィドを介して連結されたポリペプチド間のポリペプチド鎖交換は、ジスルフィド結合の還元後にのみ起こり、これは治療的使用には望ましくない。したがって、治療のために、前駆体タンパク質は、二量体化ドメインを含むポリペプチド間の鎖間ジスルフィド結合を欠いている。これを実現するために、天然に存在するジスルフィド結合は、当技術分野で公知の適切なアミノ酸変異（付加、欠失、置換）によって除去される。
本発明の前駆体タンパク質は抗体ベースの構造を有するので、前駆体タンパク質の個々のポリペプチド間の鎖間ジスルフィドが存在し得る。しかしながら、鎖間ジスルフィドを介して連結されたポリペプチド間のポリペプチド鎖交換は、ジスルフィド結合の還元後にのみ起こり、これは治療的使用には望ましくない。したがって、治療のために、前駆体タンパク質は、二量体化ドメインを含むポリペプチド間の鎖間ジスルフィド結合を欠いている。これを実現するために、天然に存在するジスルフィド結合は、当技術分野で公知の適切なアミノ酸変異（付加、欠失、置換）によって除去される。
【0155】
ヒンジ領域
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質はヒンジ領域を含む。一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない。
一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質はヒンジ領域を含む。一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない。
【0156】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域とＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
【0157】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
【0158】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない。鎖間ジスルフィド結合のないヒンジ領域を有する前駆体タンパク質は、還元剤の非存在下でポリペプチド鎖交換を受けることができる。したがって、鎖間ジスルフィド結合のないヒンジ領域を有する前駆体タンパク質は、還元剤の存在が不可能であるか、又は望ましくない用途に特に適している。したがって、これらの前駆体タンパク質は、治療に有利に使用し得る。
【0159】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、鎖間ジスルフィドを形成しない天然ヒンジ領域を含む。一例は、ＩｇＧ４アイソタイプの抗体に由来するヒンジ領域ペプチドである。
【0160】
鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域の代わりに、前駆体タンパク質は、抗原結合領域（の一部）と定常抗体ドメイン（即ちＣＨ２又はＣＨ３）を接続するペプチドコネクターを含んでもよい。本発明の一実施形態において、第１及び第２のペプチドコネクタの間に鎖間ジスルフィド結合は形成されない。本発明の一実施形態において、第１及び第２のペプチドコネクタは互いに同一である。
【0161】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ペプチドコネクタとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
【0162】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ペプチドコネクタ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
【0163】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は、第１のペプチドコネクターと，抗体可変ドメインと，任意にＣＨ２ドメインと，ＣＨ３ドメインとを含む第１のポリペプチド鎖，及び第１のペプチドコネクターと，第１のポリペプチド鎖からの抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、任意にＣＨ２ドメインと，ＣＨ３ドメインとを含む第２のポリペプチド鎖を含み；第２の前駆体タンパク質は、第１のペプチドコネクターと，抗体可変ドメインと，任意選択的にＣＨ２ドメインと，ＣＨ３ドメインとを含む第１のポリペプチド鎖，及び第１のペプチドコネクターと，第１のポリペプチド鎖からの抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、任意にＣＨ２ドメインと，ＣＨ３ドメインとを含む第２のポリペプチド鎖を含む。
【0164】
本発明の一実施形態において、ペプチドコネクタは、少なくとも１５アミノ酸のペプチドである。本発明の他の実施形態において、ペプチドコネクタは、１５～７０アミノ酸のペプチドである。本発明の他の実施形態において、ペプチドコネクタは、２０～５０アミノ酸のペプチドである。本発明の他の実施形態において、ペプチドコネクタは、１０～５０アミノ酸のペプチドである。例えば、活性化可能な結合部位によって結合される抗原の種類に応じて、より短い（又はさらに長い）ペプチドコネクタも、本発明による前駆体タンパク質に適用可能であり得る。
【0165】
本発明のさらに他の実施形態において、第１及び第２のペプチドコネクタは、天然のヒンジ領域（ＩｇＧ１アイソタイプの天然抗体分子については約１５アミノ酸であり、ＩｇＧ３アイソタイプについては約６２アミノ酸である）とほぼ同じ長さである。したがって、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質がＩｇＧ１アイソタイプである一実施形態において、ペプチドコネクタは１０～２０アミノ酸、好ましい一実施形態においては１２～１７アミノ酸のペプチドである。第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質がＩｇＧ３アイソタイプである別の一実施形態において、ペプチドコネクタは５５～７０アミノ酸、好ましい一実施形態においては６０～６５アミノ酸のペプチドである。
【0166】
本発明の一実施形態において、ペプチドコネクタはグリシン－セリンリンカーである。本発明の一実施形態において、ペプチドコネクタは、グリシン残基及びセリン残基からなるペプチドである。本発明の一実施形態において、グリシン－セリンリンカーは、構造
（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ
（式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝３又は４、ｎ＝２、３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３である）
のものである。
（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ
（式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝３又は４、ｎ＝２、３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３である）
のものである。
【0167】
上記で定義されたグリシン－セリンリンカーの一実施形態において、ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３；又はｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、及びｍ＝０、１、２又は３である。１つの好ましい実施形態において、ｘ＝４、及びｎ＝２又は３、及び、ｍ＝０である。一のさらに他の好ましい実施形態において、ｘ＝４、及びｎ＝２である。一実施形態において、前記ペプチドコネクタは（Ｇ４Ｓ）４又は（Ｇ４Ｓ）６である。
【0168】
本発明の一実施形態では、ｉ）第１の前駆体タンパク質が、ＶＬドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２の前駆体タンパク質が、ＶＨドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質が、ＶＨドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２の前駆体タンパク質が、ＶＬドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。
【0169】
本発明の一実施形態では、ｉ）第１の前駆体タンパク質が、ＶＬドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２の前駆体タンパク質が、ＶＨドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質が、ＶＨドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２の前駆体タンパク質が、ＶＬドメインと、ペプチドコネクタと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。
【0170】
抗体アイソタイプ
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプが含まれ、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合はそれらのサブタイプが含まれる。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドはＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプが含まれ、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合はそれらのサブタイプが含まれる。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドはＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。
【0171】
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、哺乳動物ＩｇＧクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、哺乳動物ＩｇＧ１サブクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、哺乳動物ＩｇＧ４サブクラスのものである。
【0172】
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。
【0173】
一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、ヒトＩｇＧクラスのものである。一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。
【0174】
一実施形態において、前駆体ポリペプチドはＣＨ４ドメインを欠いている。
【0175】
本発明の一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、同じ免疫グロブリンサブクラスのものである。本発明の一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの可変ドメインと定常ドメインは、同じ免疫グロブリンサブクラスのものである。
【0176】
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは単離された前駆体ポリペプチドである。本発明の一実施形態において、産物ポリペプチドは単離された産物ポリペプチドである。
【0177】
一実施形態において、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む前駆体タンパク質又はヘテロ二量体産物ポリペプチドは、全長ＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメインを含み、１つ又は２つのＣ末端アミノ酸残基、すなわちＧ４４６及び／又はＫ４４７は存在しない。
【0178】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は単一特異性であり、第２の抗原結合部位の一部を含み、第２の前駆体タンパク質は単一特異性であり、第２の抗原結合部位の他の部分を含む。前記実施形態において、ヘテロ二量体産物ポリペプチドは二重特異性又は三重特異性である。
【0179】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は単一特異性であり、第２の抗原結合部位の一部を含み、第２の前駆体タンパク質は単一特異性であり、第２の抗原結合部位の他の部分を含む。前記実施形態において、ヘテロ二量体産物ポリペプチドは三重特異性である。
【0180】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は二重特異性である。一実施形態において、第２の前駆体タンパク質は単一特異性である。
【0181】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は二重特異性である。一実施形態において、第２の前駆体タンパク質は二重特異性である。
【0182】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は一価である。一実施形態において、第２の前駆体タンパク質は一価である。
【0183】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は二価である。一実施形態において、第２の前駆体タンパク質は二価である。
【0184】
一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は三価である。一実施形態において、第２の前駆体タンパク質は三価である。
【0185】
一実施形態において、ヘテロ二量体産物ポリペプチドは三価である。一実施形態において、ヘテロ二量体産物ポリペプチドは四価である。
【0186】
Ｅ）治療への応用
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様について上で定義した第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質を含む、治療キットに関する。一実施形態では、治療キットは、第１の前駆体タンパク質を含む第１の医薬組成物と、第２の前駆体タンパク質を含む第２の医薬組成物とを含む。一実施形態では、本発明の治療キットは医薬として使用するためのものである。一実施形態では、本発明の治療キットは、ＣＤ３に特異的に結合する活性化可能な抗原結合部位を有する第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質を含み、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、癌細胞上の抗原に特異的に結合する抗原結合領域を含み、癌の処置における医薬として使用するためのものである。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、癌細胞上の異なる抗原に結合する抗原結合領域を含む。
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様について上で定義した第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質を含む、治療キットに関する。一実施形態では、治療キットは、第１の前駆体タンパク質を含む第１の医薬組成物と、第２の前駆体タンパク質を含む第２の医薬組成物とを含む。一実施形態では、本発明の治療キットは医薬として使用するためのものである。一実施形態では、本発明の治療キットは、ＣＤ３に特異的に結合する活性化可能な抗原結合部位を有する第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質を含み、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、癌細胞上の抗原に特異的に結合する抗原結合領域を含み、癌の処置における医薬として使用するためのものである。一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、癌細胞上の異なる抗原に結合する抗原結合領域を含む。
【0187】
第３の態様では、本発明は、部分の活性化形態を生成するための、本発明の第１の態様について上で定義した第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質のセットの使用に関する。
【0188】
第４の態様では、本発明は、治療のための、本発明の第１の態様について上で定義した第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質のセットの使用に関する。一実施形態では、治療は癌の処置である。
【0189】
第５の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による治療キットを提供する方法であって、組換え発現された第１の前駆体タンパク質及び組換え発現された第２の前駆体タンパク質を提供する工程と、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを、任意に、薬学的に許容され得る担体と共に製剤化して、治療キットを提供する工程とを含む方法に関する。
【0190】
本発明によるタンパク質は、組換え手段によって産生される。タンパク質、例えば抗体の組換え生産のための方法は、当技術分野で広く知られており、原核生物及び真核生物宿主細胞におけるタンパク質発現と、それに続くポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容され得る純度への精製を含む。宿主細胞における前述のようなポリペプチドの発現のために、それぞれのポリペプチド鎖をコードする核酸が、標準的な方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等の適切な原核生物又は真核生物の宿主細胞で行われ、抗体は細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。ポリペプチド、例えば抗体の組換え生産のための一般的な方法は、最先端技術でよく知られており、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３－２０２；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．等のＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１－２８２；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１－１６１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０－８８０の総説に記載されている。
【0191】
Ｆ）活性化タンパク質を生成する方法
第６の態様では、本発明は、活性化タンパク質を生成する方法であって、ａ）組換え発現された第１の前駆体タンパク質及び組換え発現された第２の前駆体タンパク質を提供する工程と、ｂ）活性化タンパク質が形成されるように、前駆体タンパク質間のポリペプチド鎖交換を可能にする条件下で第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを組み合わせる工程とを含み、活性化タンパク質が、第１の前駆体タンパク質に由来するポリペプチド及び第２の前駆体タンパク質に由来するポリペプチドを含む、方法に関する。
第６の態様では、本発明は、活性化タンパク質を生成する方法であって、ａ）組換え発現された第１の前駆体タンパク質及び組換え発現された第２の前駆体タンパク質を提供する工程と、ｂ）活性化タンパク質が形成されるように、前駆体タンパク質間のポリペプチド鎖交換を可能にする条件下で第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを組み合わせる工程とを含み、活性化タンパク質が、第１の前駆体タンパク質に由来するポリペプチド及び第２の前駆体タンパク質に由来するポリペプチドを含む、方法に関する。
【0192】
第６の態様の一実施形態において、本発明は、産物タンパク質を生成する方法を提供し，この方法は、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質を接触させて、第１の前駆体タンパク質からのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチドを形成することを含む。本発明の一実施形態において、本方法は、第３のヘテロ二量体ポリペプチドを回収するステップを含む。
【0193】
一実施形態において、本発明による第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを接触させて、第１の前駆体タンパク質からのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチド、及び前駆体タンパク質からのＣＨ３ドメインを含む他のポリペプチドと、第２の前駆体タンパク質からのＣＨ３ドメインを含む他のポリペプチドとを含む第４のヘテロ二量体ポリペプチドを形成する。一実施形態において、方法は、第４のヘテロ二量体産物ポリペプチドを回収する工程を含む。
【0194】
本発明の一実施形態において、方法は、第３のヘテロ二量体産物ポリペプチド及び第４のヘテロ二量体産物ポリペプチドの形成を含み、産物ポリペプチドの一方（即ち第３のヘテロ二量体産物ポリペプチド、又は第４のヘテロ二量体産物ポリペプチド）は、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含まない。
【0195】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質は、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部位の一部を含み、第２の前駆体タンパク質は、第３の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部位の他の部分を含み、第３のヘテロ二量体ポリペプチドは、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部分、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分、及び第３の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含む。
【0196】
本発明の一実施形態において、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域を含む。この場合、ポリペプチド鎖交換は、還元剤の非存在下で起こり得る。したがって、一実施形態では、第１の前駆体タンパク質及び第２の前駆体タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域を含み、第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを、還元剤の非存在下で接触させる。
【0197】
本発明の一実施形態において、第１及び第２のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合は形成されず、接触は還元剤の非存在下で実施される。
【0198】
第７の態様では、本発明は、本発明の第６の態様による方法によって産生される活性化タンパク質に関する。
【0199】
本発明の一態様は、ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む活性化タンパク質、一実施形態ではヘテロ二量体活性化産物タンパク質であり、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖は不安定化変異を含まない。
【0200】
産物ポリペプチドを生成する方法の他の産物、したがって本発明の他の態様は、好ましくは本発明の方法によって得られる産物ポリペプチドであり、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含み、ＣＨ３ドメインの両方が不安定化変異を含まない。
【0201】
３．本発明の特定の実施形態
以下に、本発明の特定の実施形態を列挙する。
以下に、本発明の特定の実施形態を列挙する。
【0202】
１．第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットであって、
各前駆体タンパク質は、二量体化ドメインを介して互いに会合した２つのポリペプチドを含み、
前駆体タンパク質の少なくとも１つは、受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、前記部分は機能的に不活性であり、前記部分は二量体化ドメインに融合され、
第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換時に、活性化タンパク質が形成され、
活性化タンパク質が、第１の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチド及び第２の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドを含み、両方のポリペプチドがそれらの二量体化ドメインを介して互いに会合しており、かつ、活性化タンパク質が前記部分を含み、
活性化タンパク質が前記部分を機能的に活性な形態で含むこと、を特徴とする、
前記第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
各前駆体タンパク質は、二量体化ドメインを介して互いに会合した２つのポリペプチドを含み、
前駆体タンパク質の少なくとも１つは、受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、前記部分は機能的に不活性であり、前記部分は二量体化ドメインに融合され、
第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換時に、活性化タンパク質が形成され、
活性化タンパク質が、第１の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチド及び第２の前駆体タンパク質由来の１つのポリペプチドを含み、両方のポリペプチドがそれらの二量体化ドメインを介して互いに会合しており、かつ、活性化タンパク質が前記部分を含み、
活性化タンパク質が前記部分を機能的に活性な形態で含むこと、を特徴とする、
前記第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0203】
２．前記第１の前駆体タンパク質又は前記第２の前駆体タンパク質のいずれかが、受容体リガンド及び酵素から選択される部分を含み、前記部分が不活性化部分に結合している、実施形態１に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0204】
３．前記部分が、受容体リガンドであり、前記不活性化部分が、対応する受容体又はそのリガンド結合サブユニットである、実施形態２に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0205】
４．前記受容体リガンドがサイトカインであり、前記不活性化部分が、対応するサイトカイン受容体又はそのサイトカイン結合サブユニットである、実施形態３に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0206】
５．前記受容体リガンドがＩＬ－２ｖであり、前記不活性化部分がＩＬ－２Ｒのサブユニット、好ましくはＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ鎖、ＩＬ－２Ｒベータ＿ガンマ鎖から選択される、実施形態３に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0207】
６．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が、受容体リガンド及び酵素から選択される前記部分の相補的サブユニットを含む、実施形態１に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0208】
７．前記第１の前駆体タンパク質が、前記部分の第１の非改変サブユニット及び前記部分の第２のサブユニットを含み、前記第２のサブユニットが不活性化変異を含み；前記第２の前駆体タンパク質が、前記部分の第２の非改変サブユニットを含む、実施形態６に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0209】
８．前記部分が受容体リガンドである、実施形態７に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0210】
９．前記受容体リガンドがサイトカインであり、前記第１の前駆体タンパク質が、前記サイトカインの第１のサブユニット及び前記サイトカインの第２のサブユニットを含み、前記第２のサブユニットが不活性化変異を含み；前記第２の前駆体タンパク質が、前記サイトカインの第２の非改変サブユニットを含む、実施形態８に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0211】
１０．前記第１の前駆体タンパク質が、ＩＬ－１２ ｐ３５及び不活性化変異を含むＩＬ－１２ ｐ４０を含み；前記第２の前駆体タンパク質が、非改変ＩＬ－１２ ｐ４０を含む、実施形態９に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0212】
１１．前記第１の前駆体タンパク質が、ＩＬ－１２ ｐ３５及び不活性化変異を含むＩＬ－１２ ｐ４０を含み；前記第２の前駆体タンパク質が、非改変ＩＬ－１２ ｐ４０及び不活性化変異を含むＩＬ－１２ ｐ３５を含む、実施形態１０に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0213】
１２．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が、受容体リガンド及び酵素から選択される人工的に分割された部分の相補部分を含み、前記相補部分の１つが不活性化されている、実施形態１に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0214】
１３．前記部分が受容体リガンドである、実施形態１２に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0215】
１４．前記受容体リガンドがサイトカインである、実施形態１３に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0216】
１５．前記人工的に分割された部分がスプリットサイトカインである、実施形態１４に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0217】
１６．前記受容体リガンドが酵素である、実施形態１５に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0218】
１７．前記人工的に分割された部分がスプリット酵素である、実施形態１６に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0219】
１８．前記二量体化ドメインがＣＨ３ドメインである、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0220】
１９．前記第１の前駆体タンパク質と前記第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換を支持するために、前記ＣＨ３ドメインが、改変された界面を有する、実施形態１８に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0221】
２０．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質はそれぞれ、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチドを含み、一方のＣＨ３ドメインはノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む、実施形態１８又は１９に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0222】
２１．ｉ）第１の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１の前駆体タンパク質のホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、第２の前駆体タンパク質のノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むかのいずれかである、実施形態２０に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0223】
２２．ｉ）ノブ変異を含む第１の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン及びホール変異を含む第２の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン、又はｉｉ）ホール変異を含む第１の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメイン及びノブ変異を含む第２の前駆体タンパク質のＣＨ３ドメインは、少なくとも１つの相補的不安定化変異を含むが、第１及び第２の前駆体ポリペプチドの他の２つのＣＨ３ドメインは不安定化変異を含まない、実施形態２０又は２２に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0224】
２３．前記前駆体タンパク質が、細胞の表面に結合したときにポリペプチド鎖交換を受けることができる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0225】
２４．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が、標的細胞の表面上の抗原に特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0226】
２５．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が抗体結合領域を含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0227】
２６．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が抗体断片を含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0228】
２７．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質がヒンジ領域を含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0229】
２８．前記第１の前駆体タンパク質及び前記第２の前駆体タンパク質が、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない、実施形態２７に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0230】
２９．ａ）前記活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、前記ＶＨドメインは前記第１の前駆体タンパク質由来の前記ポリペプチドに含まれ、前記ＶＬドメインは前記第２の前駆体タンパク質由来の前記ポリペプチドに含まれるか；又は
Ｂ）前記活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、前記ＶＬドメインは前記第１の前駆体タンパク質由来の前記ポリペプチドに含まれ、前記ＶＨドメインは前記第２の前駆体タンパク質由来の前記ポリペプチドに含まれる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
Ｂ）前記活性化タンパク質は、抗原に特異的に結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み、前記ＶＬドメインは前記第１の前駆体タンパク質由来の前記ポリペプチドに含まれ、前記ＶＨドメインは前記第２の前駆体タンパク質由来の前記ポリペプチドに含まれる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0231】
３０．前記抗原がＴ細胞抗原、好ましくはＣＤ３である、実施形態２９に記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセット。
【0232】
３１．先行する実施形態のいずれか一つにおいて定義される第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを含む、治療キット。
【0233】
３２．前記部分の活性化形態を生成するための、実施形態１～３０のいずれか一つで定義される第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットの使用。
【0234】
３３．治療のための、実施形態１～３０のいずれか一つで定義される第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットの使用。
【0235】
３４．組換え発現された第１の前駆体タンパク質及び組換え発現された第２の前駆体タンパク質を提供する工程と、前記第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを、任意に、薬学的に許容され得る担体と共に製剤化して、治療キットを提供する工程とを含む、実施形態３１に記載の治療キットを提供する方法。
【0236】
３５．実施形態１～３０のいずれか一つで定義される第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換によって産生される活性化タンパク質。
【0237】
３６．第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との間のポリペプチド鎖交換を可能にする条件下で、実施形態１から３０のいずれか一つで定義される第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とを組み合わせる工程を含む、実施形態３５に記載の活性化タンパク質を生成する方法。
【0238】
３７．実施形態１～３０のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質とのセットと、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【0239】
３８．疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の実施形態１～３０のいずれか一つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質と又は実施形態３７に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、方法。
【0240】
３９．第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、癌の処置における使用のための、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、実施形態１～３０のいずれか一つに記載の前駆体タンパク質のセット。
【0241】
４０．癌を有する個体を処置する方法であって、個体に対し、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の第１の前駆体タンパク質と第２の前駆体タンパク質との有効量を投与することを含み、第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、方法。
【0242】
アミノ酸配列の説明
【実施例】
【0243】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、特許請求の範囲に明記されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
【0244】
実施例で使用した分子の配置を以下の表に示す：
【0245】
示された図には、以下の組換えタンパク質が示されている（以下の表１、２及び３によるタンパク質名）：
【0246】
実施例１：
人工的に分割されたＩＬ－４を含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
図１に示される一般的なドメイン配列の前駆体タンパク質を調製した。２つの前駆体タンパク質（Ｒ１及びＲ２）は、ノブ及びホール変異並びにさらなる不安定化変異を有するＣＨ３ドメインを含む。前駆体タンパク質は半ＩｇＧ様形状を有し、ＶＨ／ＶＬドアミンの非機能性対がＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されている。前駆体タンパク質は、ＣＤ３８又はＨｅｒ２に特異的に結合するＦａｂ断片をさらに含む。
人工的に分割されたＩＬ－４を含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
図１に示される一般的なドメイン配列の前駆体タンパク質を調製した。２つの前駆体タンパク質（Ｒ１及びＲ２）は、ノブ及びホール変異並びにさらなる不安定化変異を有するＣＨ３ドメインを含む。前駆体タンパク質は半ＩｇＧ様形状を有し、ＶＨ／ＶＬドアミンの非機能性対がＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されている。前駆体タンパク質は、ＣＤ３８又はＨｅｒ２に特異的に結合するＦａｂ断片をさらに含む。
【0247】
図１ｂに示すように、スプリットＩＬ－４の一部を各ポリペプチドのＣ末端に融合した。２つの前駆体タンパク質は、機能的に不活性であるが、ポリペプチド鎖交換時、産物タンパク質の１つ、すなわち活性化タンパク質における活性化ＩＬ－４分子と組み合わされるサイトカイン部分を含む（図１ｂ）。これは、活性化されたＩＬ－４部分をＲ１のＣＨ３（ノブ）ポリペプチドに融合し、対応する活性化されたＩＬ－４部分をＲ２のＣＨ３（ホール）ポリペプチドに融合することによって実現された。
【0248】
スプリットＩＬ－４分子の設計を以下のように行った：ヒトインターロイキン－４は、本明細書においてＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと称される４つのαヘリックスドメインを有する単一のポリペプチド鎖からなる。ＩＬ－４の２つの異なるスプリット設計を行った。
【0249】
－ 「３＋１」スプリット設計では、１つのジスルフィド架橋をＣ３Ｓ及びＣ１２８Ｓ変異によって除去した。第１のヘリックス（残基１～２１）は、３＋１スプリットＩＬ－４の一部（「Ａ」）を構成し、残りの構造（残基２２～１３０）は、３＋１スプリットＩＬ－４の他の部分（「ＢＣＤ」）を構成する（図２ａ）。スプリットＩＬ－４ ＰＡＣＥアプローチのために、２つのスプリットＩＬ－４単位を、前駆体タンパク質のＣＨ３ドメインのＣ末端にフレキシブルリンカーで融合した。各分子（Ｒ１、Ｒ２、Ｐ１、Ｐ２）は、１つの「ＢＣＤ」単位及び１つの「Ａ」単位を担持していた。
－ 「２＋２」スプリット設計では、ＩＬ－４のＣ末端及びＮ末端を７残基のフレキシブルリンカーと接続し、新しいＣ末端及びＮ末端をそれぞれＰ１００及びＶ１０１に設定することによって、ＩＬ－４を環状に置換した。最初の２つのヘリックスは、２＋２スプリットＩＬ－４の一部（「ＤＡ」）を構成し、残りの構造は、２＋２スプリットＩＬ－４の他の部分（「ＢＣ」）を構成する（図２ｂ）。スプリットＩＬ－４ ＰＡＣＥアプローチのために、２つのスプリットＩＬ－４単位を、従来のＰＡＣＥ分子のＣ末端にフレキシブルリンカーで融合した。各分子（Ｒ１、Ｒ２、Ｐ１、Ｐ２）は、１つの「ＢＣ」単位及び１つの「ＤＡ」単位を担持していた。
－ 「２＋２」スプリット設計では、ＩＬ－４のＣ末端及びＮ末端を７残基のフレキシブルリンカーと接続し、新しいＣ末端及びＮ末端をそれぞれＰ１００及びＶ１０１に設定することによって、ＩＬ－４を環状に置換した。最初の２つのヘリックスは、２＋２スプリットＩＬ－４の一部（「ＤＡ」）を構成し、残りの構造は、２＋２スプリットＩＬ－４の他の部分（「ＢＣ」）を構成する（図２ｂ）。スプリットＩＬ－４ ＰＡＣＥアプローチのために、２つのスプリットＩＬ－４単位を、従来のＰＡＣＥ分子のＣ末端にフレキシブルリンカーで融合した。各分子（Ｒ１、Ｒ２、Ｐ１、Ｐ２）は、１つの「ＢＣ」単位及び１つの「ＤＡ」単位を担持していた。
【0250】
条件付きサイトカイン活性は、前駆体タンパク質Ｒ１及びＲ２中に存在するＩＬ－４の「３＋１」及び「２＋２」バージョンの不活性化を必要とした。変異Ｅ９Ｑ及びＲ８８ＱはＩＬ－４活性を低下させることが以前に記載されている（Ｗａｎｇ Ｙ，Ｓｈｅｎ ＢＪ，Ｓｅｂａｌｄ Ｗ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９７；９４（５）：１６５７－１６６２）。したがって、Ｆａｂ断片を欠くポリペプチド鎖（「ダミー鎖」）に融合したスプリットＩＬ－４単位は、Ｅ９Ｑ変異（前駆体タンパク質Ｒ１）又はＲ８８Ｑ変異（前駆体タンパク質Ｒ２）のいずれかを保有していた。Ｒ１とＲ２との間のポリペプチド鎖交換時に、不活性産物タンパク質Ｐ２は両方の不活性化単位を担持し、活性化産物タンパク質Ｐ１は両方の野生型単位のＩＬ－４を担持し、機能的に活性なＩＬ－４分子を形成する（図１ｂ）。
【0251】
【表1】
【0252】
実施例２：
不活性化部分に結合したＩＬ－２ｖを含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
図１に示される一般的な抗体ドメイン配列の前駆体タンパク質を調製した。２つの前駆体タンパク質（Ｒ１及びＲ２）は、ノブ及びホール変異並びにさらなる不安定化変異を有するＣＨ３ドメインを含む。前駆体タンパク質は半ＩｇＧ様形状を有し、ＶＨ／ＶＬドアミンの非機能性対がＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されている。前駆体タンパク質は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片をさらに含む。
不活性化部分に結合したＩＬ－２ｖを含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
図１に示される一般的な抗体ドメイン配列の前駆体タンパク質を調製した。２つの前駆体タンパク質（Ｒ１及びＲ２）は、ノブ及びホール変異並びにさらなる不安定化変異を有するＣＨ３ドメインを含む。前駆体タンパク質は半ＩｇＧ様形状を有し、ＶＨ／ＶＬドアミンの非機能性対がＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されている。前駆体タンパク質は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片をさらに含む。
【0253】
この実験のために、ＩＬ－２受容体アルファ結合（ＩＬ－２ｖ）を減少させるように操作されたヒトインターロイキン－２を使用した（Ｋｌｅｉｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：３）。前駆体タンパク質の１つのポリペプチド鎖のＣ末端にフレキシブルリンカーを用いてＩＬ－２ｖを融合した。
【0254】
前駆体タンパク質Ｒ１において、機能的に活性なＩＬ－２ｖを、図１０ａに示されるように、一方のＣＨ３（ノブ）ポリペプチドのＣ末端に融合した。ＣＨ３（ホール）ポリペプチドのＣ末端とＩＬ－２受容体サブユニットとを融合させ、それによってＩＬ－２ｖ分子の活性を不活性化した。ＩＬ－２ｖは、２つのサブユニットＩＬ－２Ｒβ及び共通ガンマ鎖（γｃ）からなる細胞表面ＩＬ－２受容体に結合することによってその活性を発揮する。したがって、ＩＬ－２Ｒβの細胞外ドメイン若しくはγｃの細胞外ドメイン又はＩＬ－２Ｒβとγｃとの融合物をＣＨ３（ホール）鎖にすることによって、ＩＬ－２ｖの不活性化を試みた（図１０ｂ）。他の前駆体タンパク質Ｒ２は、サイトカインドメインを全く有していなかった。結果として、ポリペプチド鎖交換時、産物タンパク質のうちの１つ、すなわち活性化タンパク質（図１０ａ）には、機能的に活性なＩＬ－２ｖのみが含まれる。他の不活性な産物ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体サブユニットのみを含む。
【0255】
【表2】
【0256】
実施例３：
ＩＬ－１２の異なるサブユニットを含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
図１に示される一般的な抗体ドメイン配列の前駆体タンパク質を調製した。２つの前駆体タンパク質（Ｒ１及びＲ２）は、ノブ及びホール変異並びにさらなる不安定化変異を有するＣＨ３ドメインを含む。前駆体タンパク質は半ＩｇＧ様形状を有し、ＶＨ／ＶＬドアミンの非機能性対がＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されている。前駆体タンパク質は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片をさらに含む。
ＩＬ－１２の異なるサブユニットを含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
図１に示される一般的な抗体ドメイン配列の前駆体タンパク質を調製した。２つの前駆体タンパク質（Ｒ１及びＲ２）は、ノブ及びホール変異並びにさらなる不安定化変異を有するＣＨ３ドメインを含む。前駆体タンパク質は半ＩｇＧ様形状を有し、ＶＨ／ＶＬドアミンの非機能性対がＣＨ３ドメインのＮ末端に配置されている。前駆体タンパク質は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片をさらに含む。
【0257】
インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、２つのジスルフィド結合サブユニットｐ３５及びｐ４０のヘテロ二量体として最も高いシグナル伝達活性を示す（Ｓｉｅｂｕｒｔｈ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２ Ｓｅｐ；１４（１）：５９－６２）。ＩＬ－１２の標的化された活性化のための前駆体タンパク質を提供するために、２つのサブユニット間の分子間ジスルフィド結合を、ｐ３５におけるＣ７３Ｓ変異及びｐ４０におけるＣ１７７Ｓ変異によって除去した。
【0258】
前駆体タンパク質Ｒ１において、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５を、図１３ａに示されるように、フレキシブルリンカーを介して一方のＣＨ３（ノブ）ポリペプチドのＣ末端に融合した。ＩＬ－１２サブユニットｐ４０の不活性化バリアントであるＣＨ３（ホール）ポリペプチドのＣ末端を柔軟なリンカーを介して融合させ、その結果、ＩＬ－１２ヘテロ二量体全体が機能的に不活性であった。前駆体タンパク質Ｒ２において、機能的に活性なＩＬ－１２サブユニットｐ４０を、図１３ａに示されるように、フレキシブルリンカーを介してＣＨ３（ホール）ポリペプチドのＣ末端に融合した。
【0259】
Ｒ１とＲ２との間のポリペプチド鎖交換時に、活性化産物タンパク質Ｐ１は、不活性化単位なしで活性ＩＬ－１２を担持する（図１３ａ）。他方の不活性な産物ポリペプチドは、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０の不活性化バリアントのみを含む。
【0260】
【表3】
【0261】
実施例４：
前駆体タンパク質の発現及び精製
実施例１～３に記載される前駆体タンパク質の発現は、最先端技術を介して、軽鎖、重鎖（ノブ又はホール変異を有する）及び一致する「ダミー」重鎖（すなわち、抗原結合断片を欠く前駆体タンパク質の重鎖様ポリペプチド；ホール又はノブ）をコードするプラスミドの哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）への同時トランスフェクションによって行った。
前駆体タンパク質の発現及び精製
実施例１～３に記載される前駆体タンパク質の発現は、最先端技術を介して、軽鎖、重鎖（ノブ又はホール変異を有する）及び一致する「ダミー」重鎖（すなわち、抗原結合断片を欠く前駆体タンパク質の重鎖様ポリペプチド；ホール又はノブ）をコードするプラスミドの哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）への同時トランスフェクションによって行った。
【0262】
より詳細には、例えば、一過性トランスフェクション（例えばＨＥＫ２９３細胞において）による前駆体タンパク質の産生のために、ＣＭＶ－イントロンＡプロモーターを含む若しくは含まないｃＤＮＡ構成又はＣＭＶプロモーターを含むゲノム構成のいずれかに基づく発現プラスミドを適用した。
【0263】
抗体発現カセット以外に、プラスミドは、以下のものを含んでいた：
－ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこのプラスミドの複製を可能にする複製開始点、及び
－ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子。
－ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこのプラスミドの複製を可能にする複製開始点、及び
－ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子。
【0264】
各抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成されていた。
－ ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期遺伝子及びプロモーター、
－ 次に、ｃＤＮＡ組織化の場合には、イントロンＡ配列、
－ ヒト抗体遺伝子の５非翻訳領域、
－ 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ リンカー及びサイトカイン又はスプリットサイトカイン配列をｃＤＮＡ又はゲノム構成のいずれかで有する抗体鎖（免疫グロブリンエクソン－イントロン構成が維持される）、及び
－ ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、
重鎖及び軽鎖を含む融合遺伝子は、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって作成され、例えば、それぞれのプラスミド中の固有の制限部位を用いて、核酸セグメントに従って接続することによって、既知の組換え方法及び技術によってアセンブリされた。サブクローン化された核酸配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物からのプラスミド調製によって、より大量のプラスミドを調製した（ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。
－ ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期遺伝子及びプロモーター、
－ 次に、ｃＤＮＡ組織化の場合には、イントロンＡ配列、
－ ヒト抗体遺伝子の５非翻訳領域、
－ 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ リンカー及びサイトカイン又はスプリットサイトカイン配列をｃＤＮＡ又はゲノム構成のいずれかで有する抗体鎖（免疫グロブリンエクソン－イントロン構成が維持される）、及び
－ ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、
重鎖及び軽鎖を含む融合遺伝子は、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって作成され、例えば、それぞれのプラスミド中の固有の制限部位を用いて、核酸セグメントに従って接続することによって、既知の組換え方法及び技術によってアセンブリされた。サブクローン化された核酸配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物からのプラスミド調製によって、より大量のプラスミドを調製した（ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。
【0265】
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。
【0266】
前駆体タンパク質を、ＨＥＫ２９３－Ｆシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、それぞれのプラスミドでの一過性トランスフェクションによって生成した。簡潔に述べれば、シェークフラスコ又は撹拌発酵槽のいずれかにおいて無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で懸濁状態で生育させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に各々の発現プラスミド及び２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）、ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）をトランスフェクトした。２Ｌシェークフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を６００ｍＬ中１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、１２０ｒｐｍ、８％のＣＯ２でインキュベートした。翌日、細胞を約１．５＊１０６細胞／ｍＬの細胞密度で、Ａ）２０ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３００μｇの全プラスミドＤＮＡ（０．５μｇ／ｍＬ）及びＢ）２０ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋１．２ｍＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ又はｆｅｃｔｉｎ（２μＬ／ｍＬ）又は７５０μＬのＰＥＩｐｒｏ（１．２５μＬ／ｍＬ）の４２ｍＬの混合物によりトランスフェクションした。グルコース消費に従って発酵の経過の間にグルコース溶液を加えた。正確にアセンブリされた前駆体タンパク質が、標準的なＩｇＧのような培養上清に分泌された。前駆体タンパク質を含有する上清を５～１０日後に回収し、前駆体タンパク質を上清から直接的に精製したか、又は上清を－２０℃で凍結し、貯蔵した。
【0267】
使用した前駆体タンパク質はカッパ軽鎖を含むので、標準的なカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーを適用することによって精製した。前駆体タンパク質を、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィを使用する親和性クロマトグラフィによって細胞培養上清から精製した。
【0268】
簡潔に述べれば、無菌でフィルタにかけられた細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化されたＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂に捕捉させ、平衡化緩衝液を用いて洗浄し、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いてｐＨ３．０で溶出させた。溶出した前駆体タンパク質画分をプールし、２ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０を用いて中和した。前駆体タンパク質プールをサイズ排除クロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィによってさらに精製した。サイズ排除クロマトグラフィのために、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ｐｇ ＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６００（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）カラム。イオン交換クロマトグラフィのために、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ精製から得られたタンパク質試料を２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０で１：１０に希釈し、緩衝液Ａ（２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ ６．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＨＰイオン交換（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）カラムにロードした。０～１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭヒスチジン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の勾配を適用して、異なるタンパク質種を溶出した。前駆体タンパク質を含有する画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ限外濾過デバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して要求される濃度まで濃縮し、－８０℃で貯蔵した。
【0269】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる精製後に純度及び完全性を分析した。タンパク質溶液（１３μｌ）を５μｌの４×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２μｌの１０×ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９５℃に５分間加熱した。試料をＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、Ｎｏｖｅｘ Ｍｉｎｉ－Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造業者の指示に従って泳動した。ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）クマシータンパク質染色を使用して染色した。さらに、タンパク質の完全性及び均一性を、分析的サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。
【0270】
実施例１に記載されるような前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質（Ｒ１、Ｒ２）及びＣＤ３８に特異的に結合するＦａｂ断片を含む活性化産物タンパク質（Ｐ１）については、図３ａ及び図３ｂに示されるように、高純度で生産可能であった。同様に、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含むタンパク質Ｒ１、Ｒ２及びＰ１、並びにＨｅｒ２に特異的に結合するＦａｂ断片を含むタンパク質Ｒ１、Ｒ２及びＰ１も高純度で生成可能であった（データは示さず）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び分析サイズ排除クロマトグラフィーによって分析したところ、タンパク質が首尾よく産生された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、予想される全てのポリペプチド鎖が調製物中に存在することが明らかになった（図３ａ）。分析的サイズ排除により、調製物の純度９０％超が確認された。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。調製物の収量は、Ｒ１分子については約０．２ｍｇ／Ｌの培養物、Ｒ２分子については０．５ｍｇ／Ｌの培養物、及びＰ１分子については２ｍｇ／Ｌの培養物であった。
【0271】
実施例２に記載されるような前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質（Ｒ１、Ｒ２）及びＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含む活性化産物タンパク質（Ｐ１）については、図１１に示されるように、高純度で生産可能であった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析したところ、タンパク質が首尾よく産生され、予想されるすべてのポリペプチド鎖が調製物中に存在したことが明らかになった（図１１）。タンパク質調製物の収量は、Ｒ１分子については約１０ｍｇ／Ｌの培養物、Ｒ２分子については６ｍｇ／Ｌの培養物、及びＰ１分子については２ｍｇ／Ｌの培養物であった。
【0272】
実施例３に記載されるような前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質（Ｒ１）及びＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含む活性化産物タンパク質（Ｐ１）については、図１４に示されるように、高純度で生産可能であった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析したところ、分子が首尾よく産生され、予想されるすべてのポリペプチド鎖がＰ１調製物中に存在したことが明らかになった（図１４）。Ｒ１については、２つの異なる重鎖は非常に類似した分子量を有し、したがってＳＤＳ－ＰＡＧＥによる満足のいく識別を可能にしなかった。代わりに、質量分析により、両方の重鎖がＲ１調製物中に存在することが明らかになった。調製物の収量は約５ｍｇ／Ｌ培養物であった。
【0273】
実施例５：
活性化可能なスプリットＩＬ－４を含む前駆体タンパク質の細胞表面標的化は、活性化ＩＬ－４を生成する
実施例１の前駆体タンパク質のインターロイキン－４活性を、ＴＦ－１細胞増殖アッセイを使用して評価した。
活性化可能なスプリットＩＬ－４を含む前駆体タンパク質の細胞表面標的化は、活性化ＩＬ－４を生成する
実施例１の前駆体タンパク質のインターロイキン－４活性を、ＴＦ－１細胞増殖アッセイを使用して評価した。
【0274】
ＴＦ－１細胞（最初はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨから得られ、その後Ｒｏｃｈｅ培養条件に適合させた）は、増殖の増加を伴ってインターロイキン－４に応答する赤芽球細胞である（図４ａ）。細胞をＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１０４９１－０１）、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ａｂｃａｍ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清中、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。アッセイのために、ＴＦ－１細胞を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを含まない培地で３回洗浄した。組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを含まない培地中の２０ ０００個のＴＦ－１細胞を９６ウェルプレートのウェルに添加した。前駆体タンパク質を、典型的には１μＭ～１０ｆＭの範囲の示された濃度で添加した。３７℃、５％ ＣＯ２で７２～９６時間インキュベートした後、製造業者のプロトコルに従ってレサズリン細胞生存度アッセイ（Ａｂｃａｍ）を使用して細胞増殖を評価した。簡潔には、予熱したＰＢＳ中の２×レサズリン試薬を９６ウェルプレート中の細胞に１：１の体積比で添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で最大４時間インキュベートした。ウェルの上清１００μｌをＣｏｒｎｉｎｇ（商標）９６ウェル透明底白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、５５０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光で蛍光を測定した。高い蛍光値は高い増殖に対応する。分析のために、対照試料（タンパク質を添加していないＴＦ－１細胞）の蛍光値を０に設定し、それに応じて残りの試料を調整した。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータを分析した。
【0275】
ＩＬ－４及び環状に置換したＩＬ－４ ＤＡＢＣの活性を比較するために、全長ＩＬ－４又は全長ＩＬ－４ ＤＡＢＣのいずれかに融合した抗体を用いてＴＦ－１増殖アッセイを行った（図４ｃ）。
【0276】
両方の構築物の活性は類似しており、ＩＬ－４の環状置換がシグナル伝達活性を損なわないことを示した（図４ｄ）。
【0277】
前駆体プロエイン間のポリペプチド鎖交換が細胞表面標的化によって増強されることを実証するために、個々の前駆体タンパク質、前駆体タンパク質の組み合わせ及び活性化産物タンパク質のＩＬ４活性を、ＴＦ－１活性アッセイを使用して評価した。
【0278】
このアッセイでは、活性化がシスで起こり、すなわち、ポリペプチド鎖交換及びＩＬ－４受容体活性化がＴＦ－１細胞表面で起こる。ポリペプチド鎖交換を評価するための実験は、それぞれがＴＦ－１細胞上で発現されるＣＤ３８に特異的に結合するＦａｂ断片を含む前駆体ポリペプチドを使用して「標的化設定」で行ない、比較として、それぞれがＴＦ－１細胞上に発現されないＨｅｒ２に特異的に結合するＦａｂ断片を含む前駆体ポリペプチドを使用して「非標的化設定」で行なった（図４ｂ）。Ｒ１又はＲ２単独のいずれかとは対照的に両方のスプリット前駆体ポリペプチド「Ｒ１＋Ｒ２」が存在する場合のＴＦ－１増殖の増加によって示されるように、両方の設定でポリペプチド鎖交換が起こった（図５ａ、図５ｂ）。これはまた、Ｅ９Ｑ（Ｒ１）及びＲ８８Ｑ（Ｒ２）によるスプリットＩＬ－４の片側不活性化が成功したことを示す。
【0279】
直接比較すると、標的化設定におけるポリペプチド鎖交換が非標的化設定よりも効率的であったことは明らかである（図５ｃ）。標的化ポリペプチド鎖交換は既に約０．１ｎＭで起こったが（図５ａ）、非標的化ポリペプチド鎖交換は約１０ｎＭでのみ起こった（図５ｂ）。非標的化活性と標的化活性との間のこの１００倍の差は、スプリットＩＬ－４からの機能的ＩＬ４の効果的な生成が、効果的な細胞表面標的化に依存することを示している。生産的ポリペプチド鎖交換に対する標的化の観察された効果は、効果的なポリペプチド鎖交換を可能にする細胞上濃度に達する前駆体ポリペプチドの標的化誘導蓄積を反映する。ポリペプチド鎖交換は濃度及び鎖の接近性に依存する様式で起こるので、細胞表面上の標的抗原の組成、配置及び密度は、ポリペプチド鎖交換の有効性に影響を及ぼす因子と見なされる必要がある。
【0280】
前駆体ポリペプチドを含むスプリットＩＬ－４ ３＋１及び２＋２：
全長ＩＬ－４及び３＋１スプリットＩＬ－４活性化産物タンパク質Ｐ１を担持する比較タンパク質は同様の活性を示し、再構成された３＋１スプリットＩＬ－４が全長サイトカインと同様のエフェクター効力を有することが示された（図６ａ）。Ｒ１及びＲ２のＣＤ３８標的化ポリペプチド鎖交換は、Ｐ１又は全長ＩＬ－４を含む比較タンパク質と同様の最大活性に達し、３＋１スプリットＩＬ－４がポリペプチド鎖交換時に完全なサイトカイン活性を再構成できることを示した（図６ａ）。
全長ＩＬ－４及び３＋１スプリットＩＬ－４活性化産物タンパク質Ｐ１を担持する比較タンパク質は同様の活性を示し、再構成された３＋１スプリットＩＬ－４が全長サイトカインと同様のエフェクター効力を有することが示された（図６ａ）。Ｒ１及びＲ２のＣＤ３８標的化ポリペプチド鎖交換は、Ｐ１又は全長ＩＬ－４を含む比較タンパク質と同様の最大活性に達し、３＋１スプリットＩＬ－４がポリペプチド鎖交換時に完全なサイトカイン活性を再構成できることを示した（図６ａ）。
【0281】
全長ＩＬ－４ ＤＡＢＣ又は２＋２スプリットＩＬ－４活性化産物タンパク質Ｐ１を担持する比較タンパク質は同様の活性を示し、再構成された２＋２スプリットＩＬ－４が全長環状置換サイトカインと同様のエフェクター効力を有することが示された（図６ｂ）。Ｒ１及びＲ２のＣＤ３８標的化ポリペプチド鎖交換は、Ｐ１又は全長ＩＬ－４と同様の最大活性に達し、２＋２スプリットＩＬ－４がポリペプチド鎖交換時に完全なサイトカイン活性を再構成できることを示した（図６ｂ）。
【0282】
スプリットＩＬ－４の代替バージョン：
反応物活性をさらに低下させるために、変異Ｅ９Ａ、Ｉ５Ａ Ｅ９Ｑ、Ｔ６Ｄ Ｅ９Ｑ及びＴ６Ｄ Ｅ９ＡをＲ１の不活性化ＩＬ－４部分に導入し、変異Ｒ８８Ａ、Ｒ８１Ｅ Ｒ８８Ｑ、Ｋ８４Ｅ Ｒ８８Ｑ、Ｒ８８Ｑ Ｎ８９Ａ及びＲ８８Ｑ Ｗ９１ＡをＲ２の不活性化ＩＬ－４部分に導入した。
反応物活性をさらに低下させるために、変異Ｅ９Ａ、Ｉ５Ａ Ｅ９Ｑ、Ｔ６Ｄ Ｅ９Ｑ及びＴ６Ｄ Ｅ９ＡをＲ１の不活性化ＩＬ－４部分に導入し、変異Ｒ８８Ａ、Ｒ８１Ｅ Ｒ８８Ｑ、Ｋ８４Ｅ Ｒ８８Ｑ、Ｒ８８Ｑ Ｎ８９Ａ及びＲ８８Ｑ Ｗ９１ＡをＲ２の不活性化ＩＬ－４部分に導入した。
【0283】
Ｒ１の不活性化ＩＬ－４部分に導入された変異Ｅ９Ａ、Ｉ５Ａ Ｅ９Ｑ及びＴ６Ｄ Ｅ９Ｑは、残留活性の低下を示したが、変異Ｔ６Ｄ Ｅ９Ａは、Ｒ１の不活性化ＩＬ－４部分に導入された場合、検出可能な活性を示さなかった（図７）。Ｒ２に存在する不活性化ＩＬ－４部分では、Ｒ８８Ａ及びＲ８８Ｑ Ｎ８９Ａ置換を含む変異バリアントは、残留活性の低下を示したが、変異Ｒ８１Ｅ Ｒ８８Ｑ及びＫ８４Ｅ Ｒ８８Ｑは、検出可能な活性を示さなかった（図７）。
【0284】
実施例６：
活性化可能なスプリットＩＬ－４を含む前駆体タンパク質の表面プラズモン共鳴は、活性化ＩＬ－４を生成する
インターロイキン－４のシグナル伝達活性には、インターロイキン－４受容体への結合が必要である。インターロイキン－４受容体アルファとタンパク質Ｒ１、Ｒ２、Ｐ１、並びに全長ＩＬ－４を含有するＲ１及びＲ２の組み合わせ（Ｐ１）又はインターロイキン－４のスプリット部分との間の相互作用の速度論的特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。
活性化可能なスプリットＩＬ－４を含む前駆体タンパク質の表面プラズモン共鳴は、活性化ＩＬ－４を生成する
インターロイキン－４のシグナル伝達活性には、インターロイキン－４受容体への結合が必要である。インターロイキン－４受容体アルファとタンパク質Ｒ１、Ｒ２、Ｐ１、並びに全長ＩＬ－４を含有するＲ１及びＲ２の組み合わせ（Ｐ１）又はインターロイキン－４のスプリット部分との間の相互作用の速度論的特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。
【0285】
抗ヒスチジン抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８－９９８０－５６）をＣＭ５センサー上に高密度（＞１０．０００ ＲＵ）で固定化した。組換えヒトＩＬ－４Ｒ Ｈｉｓタグタンパク質（Ａｂｃａｍ，ａｂ１６７７２６）の５ｎＭ溶液をＣＭ５センサーチップ上に４５秒間捕捉した（捕捉レベル約５５ＲＵ）。試験したタンパク質との相互作用を、５０μｌ／分の流速で１２０秒の会合時間及び９００秒の解離時間を使用して、７．４ｎＭ～６００ｎＭでの単一サイクル速度論によって分析した。全てのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００実験は、２５℃のＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥヘルスケア、Ｂｒ－１００８－２７）ｐＨ７．４ランニングバッファー中で行った。Ｔ２００評価ソフトウェア及び１：１ラングミュア結合モデルを使用して、速度論的特性を決定した。
【0286】
３＋１及び２＋２活性化産物タンパク質は、ＩＬ－４Ｒαに対する結合能を保持したが、全長ＩＬ－４対照分子と比較して親和性は低かった。Ｅ９Ｑ又はＲ８８Ｑを有する３＋１スプリットＩＬ－４ ＰＡＣＥ反応物分子は、ＩＬ－４Ｒαに対する残留結合を示したが、Ｔ６Ｄ Ｅ９Ａ及びＲ８１Ｅ Ｒ８８Ｑバリアントについては結合が検出できなかった（図９ｂ、ｃ）。これらの結果は、ＴＦ－１増殖アッセイと一致している（図７）。
【0287】
実施例７：
不活性化部分に結合したＩＬ－２ｖを含む活性化可能な前駆体タンパク質の細胞表面標的化
実施例２の前駆体タンパク質のインターロイキン－２ｖ活性を、ＣＴＬＬ－２細胞増殖アッセイを使用して評価した。
不活性化部分に結合したＩＬ－２ｖを含む活性化可能な前駆体タンパク質の細胞表面標的化
実施例２の前駆体タンパク質のインターロイキン－２ｖ活性を、ＣＴＬＬ－２細胞増殖アッセイを使用して評価した。
【0288】
ＣＴＬＬ－２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから最初に入手し、続いてＲｏｃｈｅ培養条件に適合させた）は、増殖の増加を伴ってインターロイキン－２ｖに応答するマウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞である（図１２ａ）。細胞をＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１０４９１－０１）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、Ｃｏｎ Ａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含む１０％（ｖ／ｖ）Ｔ細胞培養サプリメント中、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。アッセイのために、ＣＴＬＬ－２細胞をＴ細胞培養サプリメントを含まない培地で３回洗浄した。Ｔ細胞培養サプリメントを含まない培地中の３０ ０００個のＣＴＬＬ－２細胞をＵ底９６ウェルプレートのウェルに添加した。目的のタンパク質を、典型的には１μＭ～１０ｆＭの範囲の所望の濃度で添加した。３７℃、５％ ＣＯ２で４８～７２時間インキュベートした後、製造業者のプロトコルに従ってレサズリン細胞生存度アッセイ（Ａｂｃａｍ）を使用して細胞増殖を評価した。簡潔には、予熱したＰＢＳ中の２×レサズリン試薬を９６ウェルプレート中の細胞に１：１の体積比で添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で最大４時間インキュベートした。ウェルの上清１００μｌをＣｏｒｎｉｎｇ（商標）９６ウェル透明底白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、５５０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光で蛍光を測定した。高い蛍光値は高い増殖に対応する。分析のために、対照試料（タンパク質を添加していないＣＴＬＬ－２細胞）の蛍光値を０に設定し、それに応じて残りの試料を調整した。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータを分析した。
【0289】
ＩＬ－２ｖを３つの異なる不活性化ドメインと組み合わせて含む３つの異なる前駆体タンパク質Ｒ１はすべて、活性化産物タンパク質Ｐ１と比較してＩＬ－２ｖ活性が低下していた（図１２ｂ）。
【0290】
実施例８：
ＩＬ－１２の異なるサブユニットを含む活性化可能な前駆体タンパク質の細胞表面標的化
実施例３の前駆体タンパク質のインターロイキン－１２活性を、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞アッセイを製造者の説明書（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に従って使用して評価した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１０４９１－０１）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３０μｇ／ｍｌブラストサイジン、１００μｇ／ｍｌゼオシン中３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。アッセイのために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞を培地で３回洗浄した。培地中の５０ ０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞を９６ウェルプレートのウェルに加えた。目的のタンパク質を、典型的には１μＭ～１０ｆＭの範囲の所望の濃度で添加した。３７℃、５％ ＣＯ２で２０～２４時間インキュベートした後、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用してＩＬ－１２シグナル伝達活性を評価した。簡単に説明すると、検出試薬を予熱したエンドトキシンを含まない指示された水に溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）９６ウェル透明底白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに検出溶液２００μｌを添加し、細胞上清２０μｌを添加した。３７℃で１～５時間インキュベートした後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して６４０ｎｍで吸光度を測定した。高い吸光度値は、高いＩＬ－１２シグナル伝達活性に対応する。分析のために、対照試料（タンパク質を添加していないＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞）の蛍光値を０に設定し、それに応じて残りの試料を調整した。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータを分析した。
ＩＬ－１２の異なるサブユニットを含む活性化可能な前駆体タンパク質の細胞表面標的化
実施例３の前駆体タンパク質のインターロイキン－１２活性を、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞アッセイを製造者の説明書（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に従って使用して評価した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１０４９１－０１）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３０μｇ／ｍｌブラストサイジン、１００μｇ／ｍｌゼオシン中３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。アッセイのために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞を培地で３回洗浄した。培地中の５０ ０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞を９６ウェルプレートのウェルに加えた。目的のタンパク質を、典型的には１μＭ～１０ｆＭの範囲の所望の濃度で添加した。３７℃、５％ ＣＯ２で２０～２４時間インキュベートした後、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用してＩＬ－１２シグナル伝達活性を評価した。簡単に説明すると、検出試薬を予熱したエンドトキシンを含まない指示された水に溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）９６ウェル透明底白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに検出溶液２００μｌを添加し、細胞上清２０μｌを添加した。３７℃で１～５時間インキュベートした後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して６４０ｎｍで吸光度を測定した。高い吸光度値は、高いＩＬ－１２シグナル伝達活性に対応する。分析のために、対照試料（タンパク質を添加していないＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞）の蛍光値を０に設定し、それに応じて残りの試料を調整した。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータを分析した。
【0291】
前駆体タンパク質Ｒ１は、対応する活性化産物タンパク質Ｐ１と比較して、ＩＬ－１２活性が約１０００倍低下していた（図１５）。
【0292】
実施例９：
人工的に分割されたルシフェラーゼを含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）は、２つのサブユニット、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴからなるスプリットルシフェラーゼ酵素である（Ｄｉｘｏｎ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１６；１１（２）：４００－４０８）。２つのサブユニットが近接すると、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを変換して発光シグナルを生成することができる機能性酵素を形成する。前駆体ポリペプチドを生成するために、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴを、実施例１に示される前駆体タンパク質について示されるような一般構造に従って、前駆体タンパク質Ｒ１のＣＨ３（ノブ）ポリペプチド及び前駆体タンパク質Ｒ２のＣＨ３（ホール）ポリペプチドのＣ末端にそれぞれフレキシブルリンカーで融合した（図１６）。Ｒ１及びＲ２が組換えられると、産物分子Ｐ１はＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴの両方を保有し、ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）ルシフェラーゼ活性を再構成する（図１６）。
人工的に分割されたルシフェラーゼを含む活性化可能な前駆体タンパク質の設計
ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）は、２つのサブユニット、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴからなるスプリットルシフェラーゼ酵素である（Ｄｉｘｏｎ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１６；１１（２）：４００－４０８）。２つのサブユニットが近接すると、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを変換して発光シグナルを生成することができる機能性酵素を形成する。前駆体ポリペプチドを生成するために、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴを、実施例１に示される前駆体タンパク質について示されるような一般構造に従って、前駆体タンパク質Ｒ１のＣＨ３（ノブ）ポリペプチド及び前駆体タンパク質Ｒ２のＣＨ３（ホール）ポリペプチドのＣ末端にそれぞれフレキシブルリンカーで融合した（図１６）。Ｒ１及びＲ２が組換えられると、産物分子Ｐ１はＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴの両方を保有し、ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）ルシフェラーゼ活性を再構成する（図１６）。
【0293】
実施例１０：
スプリットルシフェラーゼＰＡＣＥ前駆体の細胞表面標的化
実施例９に記載されるようなＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ルシフェラーゼの一部を含有するタンパク質の活性を、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。
スプリットルシフェラーゼＰＡＣＥ前駆体の細胞表面標的化
実施例９に記載されるようなＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ルシフェラーゼの一部を含有するタンパク質の活性を、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。
【0294】
【表4】
【0295】
ＴＦ－１細胞をＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１０４９１－０１）、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ａｂｃａｍ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清中、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。アッセイのために、ＴＦ－１細胞をＰＢＳで２回洗浄した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の１００ ０００個のＴＦ－１細胞をＣｏｒｎｉｎｇ（商標）９６ウェル透明底白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍのみを含む無細胞プレートを調製して、細胞上ＰＡＣＥと溶液中ＰＡＣＥを比較した。目的のタンパク質を５０ｎＭで添加した。ルシフェラーゼ活性を、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコルに従って使用して評価した。簡潔には、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔを１：５の体積比で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して測定した。高い発光値は、高い基質変換に対応する。
【0296】
前駆体タンパク質は低い発光を示したが、前駆体タンパク質の組み合わせは高い発光を示し、産物分子Ｐ１の形成の成功を示した（図１７）。ＴＦ－１細胞上での標的化ポリペプチド鎖交換は、非標的化ポリペプチド鎖交換（ＴＦ－１細胞なし）よりも高い発光を示した（図１７）。非標的化活性と標的化活性との間のこの差は、スプリットルシフェラーゼＰＡＣＥ分子からの機能的ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）ルシフェラーゼの効果的な生成が、効果的な細胞表面標的化に依存することを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】