特表 2023-553702 活動性強直性脊椎炎を処置するための抗ＴＮＦ抗体、組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-25

(54)【発明の名称】活動性強直性脊椎炎を処置するための抗ＴＮＦ抗体、組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20231218BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231218BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231218BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20231218BHJP

   A61K 31/635 20060101ALI20231218BHJP

   A61K 31/4706 20060101ALI20231218BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231218BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N

A61P19/02 ZNA

A61P43/00 121

A61K31/519

A61K31/635

A61K31/4706

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023536888

(86)(22)【出願日】2021-12-16

(85)【翻訳文提出日】2023-07-18

(86)【国際出願番号】 IB2021061863

(87)【国際公開番号】W WO2022130281

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】63/126,638

(32)【優先日】2020-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/140,307

(32)【優先日】2021-01-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(72)【発明者】

【氏名】ハリソン，ダイアン ディー．

(72)【発明者】

【氏名】シャ，エリザベス シー．

(72)【発明者】

【氏名】キム，リー－リアン

(72)【発明者】

【氏名】ロ，キム フン

【テーマコード（参考）】

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC28

4C086CB09

4C086DA20

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA16

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA23

4C086MA24

4C086MA35

4C086MA44

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA59

4C086MA63

4C086MA66

4C086MA67

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA96

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、活動性強直性脊椎炎（ＡＳ）の処置における抗ＴＮＦ抗体又はその抗原結合断片を利用する組成物及び方法、例えば、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を有する抗ＴＮＦ抗体を利用する処置に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、前記方法が、前記患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、前記患者が、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善、及び強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）からなる群から選択される転帰を達成し、前記転帰が、処置の５２週間まで維持又は改善される、方法。

【請求項2】

前記抗ＴＮＦ抗体が前記患者の体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるように、前記抗ＴＮＦ抗体が静脈内注入（ＩＶ）によって投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３８の可変重鎖アミノ酸配列及び配列番号３９の可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３６の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記抗ＴＮＦ抗体がゴリムマブ抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）及び／又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、前記抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、前記方法が、前記患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の前記改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり維持される又は継続して改善する、前記方法。

【請求項8】

前記抗ＴＮＦ抗体が前記患者の体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるように、前記抗ＴＮＦ抗体が静脈内注入（ＩＶ）によって投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３８の可変重鎖アミノ酸配列及び配列番号３９の可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３６の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記抗ＴＮＦ抗体がゴリムマブ抗体である、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）及び／又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、前記抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、前記方法が、前記患者に配列番号３８の可変重鎖アミノ酸配列及び配列番号３９の可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体の組成物を静脈内注入（ＩＶ）により投与し、こうして、前記抗ＴＮＦ抗体が、前記患者の体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるステップを含み、処置の１６週間後に、前記患者が、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善、及び強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）からなる群から選択される転帰を達成し、前記転帰が、処置の５２週間まで維持又は改善される、前記方法。

【請求項14】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３６の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記抗ＴＮＦ抗体がゴリムマブ抗体である、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）及び／又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、前記組成物を投与するステップを更に含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、前記抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、処置の１６週間後に、前記患者が、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善、及び強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）からなる群から選択される転帰を達成し、前記転帰が、処置の５２週間まで維持又は改善される、前記組成物。

【請求項18】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３８の可変重鎖アミノ酸配列及び配列番号３９の可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３６の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項20】

前記抗ＴＮＦ抗体がゴリムマブ抗体である、請求項１７に記載の組成物。

【請求項21】

前記組成物は、前記抗ＴＮＦ抗体が、前記患者の体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう、静脈内注入（ＩＶ）によって投与される、請求項１７に記載の組成物。

【請求項22】

メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）及び／又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）を更に含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項23】

＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、前記抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の前記改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり維持されるか又は継続して改善する、前記組成物。

【請求項24】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３８の可変重鎖アミノ酸配列及び配列番号３９の可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号３６の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項26】

前記抗ＴＮＦ抗体がゴリムマブ抗体である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項27】

前記組成物は、前記抗ＴＮＦ抗体が、前記患者の体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう、静脈内注入（ＩＶ）によって投与される、請求項２３に記載の組成物。

【請求項28】

メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）及び／又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）を更に含む、請求項２７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、２０２１年１２月３日付で作成された、「ＪＢＩ６４４５ＷＯＰＣＴ１Ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ」というファイル名のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、２５ＫＢのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、活動性強直性脊椎炎（ＡＳ）の処置における抗ＴＮＦ抗体又はその抗原結合断片を利用する組成物及び方法、例えば、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を有する抗ＴＮＦ抗体を利用する処置に関する。

【0003】

（発明の背景）
ＴＮＦαは、１７ｋＤのタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である。ＴＮＦの膜結合型の２６ｋＤの前駆体形態も存在する。

【0004】

単球又はマクロファージ以外の細胞もＴＮＦαを産生する。例えば、ヒト非単球腫瘍細胞株はＴＮＦα並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球を産生し、いくつかの培養されたＴ及びＢ細胞株もＴＮＦαを産生する。

【0005】

ＴＮＦαは、軟骨及び骨の分解、接着分子の誘導、血管内皮細胞で凝血促進活性を誘導する、好中球及びリンパ球の接着を増大させる、並びにマクロファージ、好中球及び血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激するなど、組織損傷をもたらす炎症誘発作用を引き起こす。

【0006】

ＴＮＦαは、感染、免疫障害、腫瘍性病態、自己免疫病態及び移植片対宿主病態に関連している。ＴＮＦαとがん及び感染性病態との関連は、宿主の異化状態に関連していることが多い。がん患者は、通常食欲不振に関連する体重減少に悩まされる。

【0007】

がん及びその他の疾患に関連する大幅な衰弱は、「悪液質」として知られる。悪液質は、悪性腫瘍の成長に応答する、進行性の体重減少、食欲不振、及び除脂肪体重の持続的衰えを含む。悪液質状態は、多くのがん罹患率及び死亡率の原因となる。ＴＮＦαが、がん、感染性病態及びその他の異化状態における悪液質に関与するという証拠がある。

【0008】

ＴＮＦαは、発熱、倦怠感、食欲不振、及び悪液質を含む、グラム陰性敗血症及び内毒素ショックにおいて中心的な役割を果たすと考えられている。内毒素は、単球／マクロファージ生成並びにＴＮＦα及びその他のサイトカインの分泌を強く活性化する。ＴＮＦα及びその他の単球由来サイトカインは、内毒素に対する代謝及び神経ホルモン応答を媒介する。ヒトボランティアへの内毒素投与は、発熱、頻脈、増加した代謝速度、及びストレスホルモン放出など、インフルエンザのような症状を伴う急性疾病をもたらす。ＴＮＦαの循環が、グラム陰性敗血症に罹患した患者において増加する。

【0009】

したがって、ＴＮＦαは、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、悪性腫瘍、並びに／又は神経変性疾患に関連付けられており、関節リウマチ及びクローン病などの疾患における特定の生物学的治療に有用な標的である。ＴＮＦαに対するキメラモノクローナル抗体（ｃＡ２）を用いた非盲検試験における有益な作用が、炎症の抑制、並びに関節リウマチ及びクローン病における再発後の良好な再処置と共に報告されている。ｃＡ２を用いた無作為の二重盲検プラセボ対照試験における有益な結果も、関節リウマチにおいて炎症の抑制と共に報告されている。

【0010】

他の研究者は、インビトロで中和活性を有した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡｂを説明した。これらのｍＡｂのうちのいくつかが、ヒトＴＮＦのエピトープをマッピングし、酵素イムノアッセイを開発するため、また組換えＴＮＦの精製を補助するために使用された。しかしながら、これらの試験は、免疫原性、低特異性及び／又は製薬学的不適性により、ヒトにおけるインビボ診断又は治療用途に使用することができるＴＮＦ中和抗体を生成するための基礎を提供するものではない。

【0011】

ＴＮＦに対する中和抗血清又はｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、実験的内毒素血症及び菌血症における致死的攻撃後の有害な生理学的変化を抑止し、死亡を阻止することが示されている。この作用は、例えば、げっ歯類致死率アッセイ及び霊長類病理モデル系において示されている。

【0012】

ｈＴＮＦの推定受容体結合座位が開示されており、ＴＮＦのアミノ酸１１～１３、３７～４２、４９～５７及び１５５～１５７からなるＴＮＦαの受容体結合座位が開示されている。

【0013】

非ヒト哺乳動物、キメラ、ポリクローナル（例えば、抗血清）、及び／又はモノクローナル抗体（Ｍａｂ）並びに断片（例えば、タンパク質分解消化又はその融合タンパク質生成物）は、ある特定の疾患を処置する試みのために一部の事例において調査されている有力な治療薬である。しかしながら、かかる抗体又は断片は、ヒトに投与された場合、免疫応答を誘発する場合がある。かかる免疫応答は、血液循環からの抗体又は断片の免疫複合媒介クリアランスをもたらし、反復投与を、治療に適さないものとし得、それにより、患者に対する治療的利益が低減し、抗体又は断片の再投与が制限される。例えば、非ヒト部分を含む抗体又は断片の反復投与は、血清病及び／又はアナフィラキシーをもたらし得る。これら及びその他の問題を回避するために、当該技術分野において周知のように、キメラ化及びヒト化を含む、かかる抗体及びその部分の免疫原性を低減するための多くのアプローチが取られてきた。しかしながら、これら及びその他のアプローチは尚も、多少の免疫原性、低親和性、低結合活性を有する、又は細胞培養、スケールアップ、生成及び／若しくは低収率における問題を伴う抗体又は断片をもたらし得る。したがって、かかる抗体又は断片は、治療用タンパク質としての製造又は使用に理想的にはあまり適していない可能性がある。

【0014】

したがって、これらの問題のうちのもう１つを克服する抗ＴＮＦ抗体又は断片、並びに既知の抗体又はその断片の改善を実現する必要性があった。この必要性から、完全ヒトモノクローナル抗ＴＮＦ抗体であるＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）が開発された。

【0015】

（発明の概要）
ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者（単数）（又は複数の患者）における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、患者が、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善、及び強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）からなる群から選択される転帰を達成し、転帰が、処置の５２週間まで維持又は改善される、方法を提供する。

【0016】

本方法又は使用の実施形態では、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加する。

【0017】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加し、当該抗ＴＮＦ抗体が、患者の体重１ｋｇ当たり２ｍｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるように、当該抗ＴＮＦ抗体が静脈内注入（ＩＶ）によって投与される、方法を提供する。

【0018】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加し、当該抗ＴＮＦ抗体が２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるように、当該抗ＴＮＦ抗体が静脈内注入（ＩＶ）によって投与され、当該方法が、メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、又はこれらを伴わないで、当該抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを更に含む、方法を提供する。

【0019】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰（oucome）の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり維持される又は継続して改善する、方法を提供する。

【0020】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善し、当該抗ＴＮＦ抗体が２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるように、当該抗ＴＮＦ抗体が静脈内注入（ＩＶ）によって投与される、方法を提供する。

【0021】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを含み、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善し、当該抗ＴＮＦ抗体が２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるように、当該抗ＴＮＦ抗体が静脈内注入（ＩＶ）によって投与され、当該方法が、メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）及び／又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、当該抗ＴＮＦ抗体を投与するステップを更に含む、方法を提供する。

【0022】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を含む組成物を投与するステップを含み、当該組成物が、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加する、方法を提供する。

【0023】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を含む組成物を投与するステップを含み、当該組成物が、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加し、当該組成物は、当該抗ＴＮＦ抗体が、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう投与される、方法を提供する。

【0024】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を含む組成物を投与するステップを含み、当該組成物が、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加し、当該組成物は、当該抗ＴＮＦ抗体が、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう投与され、当該方法が、メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、又はこれらを伴わないで、当該組成物を投与するステップを更に含む、方法を提供する。

【0025】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を含む組成物を投与するステップを含み、当該組成物が、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善する、方法を提供する。

【0026】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を含む組成物を投与するステップを含み、当該組成物が、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善し、当該組成物は、当該抗ＴＮＦ抗体が、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう投与される、方法を提供する。

【0027】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎を処置する方法であって、当該方法が、患者に重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含む抗ＴＮＦ抗体を含む組成物を投与するステップを含み、当該組成物が、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善し、当該組成物は、当該抗ＴＮＦ抗体が、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう投与され、当該方法が、メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、又はこれらを伴わないで、当該組成物を投与するステップを更に含む、方法を提供する。

【0028】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加する、組成物を提供する。

【0029】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、当該組成物は、当該抗ＴＮＦ抗体が、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加する、組成物を提供する。

【0030】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、当該組成物は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、又はこれらを伴わないで投与され、処置の１６週間後に、患者の≧７０％は、強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ２０）を達成し、患者の≧４５％は、強直性脊椎炎評価４０（ＡＳＡＳ４０）を達成し、患者の≧３５％は、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ５０）におけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成し、患者の≧２５％は、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患（＜１．３）を達成し、ＡＳＡＳ２０、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０及びＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を達成する患者の百分率は、処置の５２週間にわたり増加する、組成物を提供する。

【0031】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善する、組成物を提供する。

【0032】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、当該組成物は、当該抗ＴＮＦ抗体が、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、０週目及び４週目に、次にこれ以降８週ごと（ｑ８ｗ）に、３０±１０分間にわたり投与されるよう、静脈内注入（ＩＶ）により投与され、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善する、組成物を提供する。

【0033】

ある種の実施形態では、本発明は、＜２年の期間、初期疾患を有する患者における活動性強直性脊椎炎の処置に使用するための抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、抗ＴＮＦ抗体が、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の配列番号４０～４２及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号４３～４５を含み、当該組成物は、メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）又はヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）と共に、又はこれらを伴わないで投与され、処置の１６週間後に、強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）、夜の背部痛及び全背部痛に関して、患者報告転帰の改善があり、患者報告転帰の改善が、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛の５２週間の処置にわたり継続して改善する、組成物を提供する。

【0034】

上記のある種の実施形態では、抗ＴＮＦ抗体は、配列番号３８の可変重鎖アミノ酸配列及び配列番号３９の可変軽鎖アミノ酸配列を含み、抗ＴＮＦ抗体は、配列番号３６の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含み、又は抗ＴＮＦ抗体は、ゴリムマブ抗体である。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】ハイブリドーマ細胞上清中のＴＮＶ ｍＡｂが組換えＴＮＦ受容体へのＴＮＦα結合を阻害する能力のアッセイを示すグラフ表示を示す。既知量のＴＮＶ ｍＡｂを含有する様々な量のハイブリドーマ細胞上清を、固定濃度（５ｎｇ／ｍＬ）の^１２５Ｉ標識ＴＮＦαと共にプレインキュベートした。混合物を、組換えＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質ｐ５５－ｓｆ２で予めコーティングされた９６ウェルのＯｐｔｉｐｌａｔｅに移した。ｍＡｂの存在下でｐ５５受容体に結合したＴＮＦαの量は、未結合の材料を洗い流し、γ計数器を使用して計数した後に決定した。これらの実験において８つのＴＮＶ ｍＡｂ試料を試験したが、簡潔化のため、ＤＮＡ配列分析により、他のＴＮＶ ｍＡｂのうちの１つと同一であることを示したｍＡｂのうちの３つ（セクション５．２．２を参照のこと）は、ここに示されていない。各試料を二重に試験した。示される結果は、２つの独立した実験を代表する。

【図2A】ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ＤＰ－４６遺伝子である。「ＴＮＶｓ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６の配列であることを示す。ＴＮＶ配列の最初の３つのヌクレオチドは、翻訳開始Ｍｅｔコドンを定義する。ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１９のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂで始まるアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しない配列のためである。ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖は、Ｊ６結合領域を使用する。

【図2B】ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ＤＰ－４６遺伝子である。「ＴＮＶｓ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６の配列であることを示す。ＴＮＶ配列の最初の３つのヌクレオチドは、翻訳開始Ｍｅｔコドンを定義する。ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１９のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂで始まるアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しない配列のためである。ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖は、Ｊ６結合領域を使用する。

【図3】ＴＮＶ ｍＡｂ軽鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ヒトκ生殖系列可変領域遺伝子のＶｇ／３８Ｋファミリーの代表的なメンバーである。ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１６のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂのアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しない配列のためである。ＴＮＶ ｍＡｂ軽鎖は、Ｊ３結合領域を使用する。

【図4】ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列（一文字表記）は、非クローン化ＰＣＲ生成物及びクローン化ＰＣＲ生成物の両方から決定されたＤＮＡ配列から推定された。分泌シグナル配列（シグナル）、フレームワーク（ＦＷ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインに分割したアミノ配列が示される。ＤＰ－４６生殖系列遺伝子のアミノ酸配列は、各ドメインの上の行に示されている。点線は、ＴＮＶ ｍＡｂにおけるアミノ酸が生殖系列遺伝子と同一であることを示す。ＴＮＶ１４８（Ｂ）は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。「ＴＮＶ」は、異なる配列が示されない限り、示される配列が全てのＴＮＶ ｍＡｂに関することを示す。生殖系列配列（ＣＤＲ３）中の破線は、配列が知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しないことを示す。

【図5】ＴＮＶ ｍＡｂ軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列（一文字表記）は、非クローン化ＰＣＲ生成物及びクローン化ＰＣＲ生成物の両方から決定されたＤＮＡ配列から推定された。分泌シグナル配列（シグナル）、フレームワーク（ＦＷ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインに分割したアミノ配列が示される。Ｖｇ／３８Ｋ型軽鎖生殖系列遺伝子のアミノ酸配列は、各ドメインの上の行に示される。点線は、ＴＮＶ ｍＡｂにおけるアミノ酸が生殖系列遺伝子と同一であることを示す。ＴＮＶ１４８（Ｂ）は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。「Ａｌｌ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４８Ｂ、及びＴＮＶ１８６に関することを示す。

【図6】ｒＴＮＶ１４８Ｂ発現Ｃ４６６細胞を作製するために使用された重鎖及び軽鎖発現プラスミドの概略図を示す。ｐ１７８３は重鎖プラスミドであり、ｐ１７７６は軽鎖プラスミドである。ｒＴＮＶ１４８Ｂ可変及び定常領域コードドメインは、黒色のボックスで示される。Ｊ－Ｃイントロンの免疫グロブリンエンハンサは、灰色のボックスで示される。関連する制限部位が示される。Ａｂ遺伝子の転写が時計方向に進むように配向されたプラスミドが示される。プラスミドｐ１７８３の長さは１９．５３ｋｂであり、プラスミドｐ１７７６の長さは１５．０６ｋｂである。両プラスミドの完全なヌクレオチド配列は既知である。ｐ１７８３の可変領域コード配列は、ＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩ制限断片を置き換えることにより、別の重鎖可変領域配列に容易に置き換えることができる。ｐ１７７６の可変領域コード配列は、ＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ制限断片を置き換えることにより、別の可変領域配列に置き換えることができる。

【図7】５つのｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株の成長曲線分析のグラフ表示を示す。３０ｍＬの容量中に１．０×１０^５細胞／ｍＬの生存細胞密度を有するように、Ｔ７５フラスコ内のＩ５Ｑ＋ＭＨＸ培地に細胞を播種することにより、０日目に培養を開始した。これらの試験に使用された細胞培養物は、トランスフェクション及びサブクローニングが行われるため、連続培養であった。その後、Ｔフラスコ内の細胞を充分に再懸濁し、０．３ｍｌの培養物のアリコートを取り出した。成長曲線試験は、細胞計数が１．５×１０^５細胞／ｍＬ未満に低下したときに終了した。アリコート中の生細胞数をトリパン（ｔｙｐａｎ）ブルー排除により決定し、残りのアリコートは後のｍＡｂ濃度決定のために保管された。ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡが、同じ時に全ての試料アリコートに対して行われた。

【図8】様々なＭＨＸ選択物濃度の存在下での細胞成長速度の比較のグラフ表示を示す。細胞サブクローンＣ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂを、無ＭＨＸ培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）に解凍し、更に２日間培養した。次いで、両細胞培養物を、ＭＨＸ無し、０．２×ＭＨＸ又は１×ＭＨＸのいずれかを含有した３つの培養に分割した。１日後、新しいＴ７５フラスコに、１×１０^５細胞／ｍＬの開始密度で培養物を播種し、細胞を１週間、２４時間間隔で計数した。最初の５日間の倍加時間は、ＳＯＰ ＰＤ３２．０２５の式を使用して計算し、バーの上に示す。

【図9】２つのｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株からの経時的なｍＡｂ生成の安定性のグラフ表示を示す。トランスフェクション及びサブクローニングを行った後、連続培養にあった細胞のサブクローンを使用して、２４ウェル培養皿中での長期連続培養を開始した。ＭＨＸ選択物を伴う又は伴わないＩ５Ｑ培地中で細胞を培養した。細胞を、４～６日ごとに培養物を分けることにより連続して継代して、新たな生存培養物を維持し、同時に前の培養物を消耗させた。消耗した細胞上清のアリコートは、培養物が消耗した直後に回収し、ｍＡｂ濃度が決定されるまで保管した。ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡが、同じ時に全ての試料アリコートに対して行われた。

【図10】実施例４における対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの本発明の抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、又はＴＮＶ１９６）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、３～７週目で有意であった。１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、試験の７週目に有意な体重増加を達成した。

【図11A】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）にわたって継続して、Ｄ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。

【図11B】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）にわたって継続して、Ｄ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。

【図11C】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）にわたって継続して、Ｄ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。

【図12】実施例５における対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを体重に基づき８つの処置群のうちの１つに割り当て、対照品（Ｄ－ＰＢＳ）、又は３ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８）（０週目）の腹腔内ボーラス投与で処置した。注射は１、２、３、及び４週目に全ての動物において繰り返された。群１～６は、試験品の有効性に関して評価された。群７及び８の動物から得られた血清試料は、２、３及び４週目のＴＮＶ１４又はＴＮＶ１４８の免疫応答誘導及び薬物動態クリアランスに関して評価された。

【図13A】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。

【図13B】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。

【図13C】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。

【図14】実施例６における対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき６つの処置群のうちの１つに割り当て、３ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体（ｃＡ２又はＴＮＶ１４８）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。この試験は、Ｄ－ＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２対照群を利用した。

【図15】実施例６に示す関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。全ての処置群が初期の時点で多少の保護作用を示し、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１～３週目にＡＩにおいて有意な減少を示し、全ての処置群が２週目で有意な減少を示した。試験の後期に、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は多少の保護作用を示し、４、６及び７週目で有意に減少した。低用量（３ｍｇ／ｋｇ）のｃＡ２及びＴＮＶ１４８は両方とも、６週目で有意な減少を示し、全ての処置群が７週目で有意な減少を示した。試験の終わりで（８週目）有意な減少を維持することができた処置群はなかった。任意の時点で処置群のいずれかの間（食塩水対照群は除く）に有意差はなかった。

【図16】実施例７における対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。ＴＮＶ１４８（ハイブリドーマ細胞に由来する）及びｒＴＮＶ１４８Ｂ（トランスフェクトした細胞に由来する）の単回腹腔内投与の有効性を比較するために。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４８、ｒＴＮＶ１４８Ｂ）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。

【図17】実施例７に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、４週目から始まり、残りの試験（８週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。ＴＮＶ１４８で処置した群及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群は両方とも、４週目でＡＩにおける有意な減少を示した。以前の試験（Ｐ－０９９－０１７）は、ＴＮＶ１４８が単回の１ｍｇ／ｋｇの腹腔内ボーラス後の関節炎指数の減少にわずかにより効果的であることを示したが、この試験では、両バージョンのＴＮＶ抗体で処置した群からのＡＩがわずかに高いことを示した。１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群（６週目を除く）は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２群と比較したとき、有意に増加せず、ＴＮＶ１４８で処置した群は、７及び８週目で有意に高かったが、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８及び１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８Ｂの間には試験の任意の時点でＡＩにおいて有意差はなかった。

【図18】活動性強直性脊椎炎（ＡＳ）を有する対象における、静脈内投与されるＳｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）の試験に関する試験設計の図を示す。

【図19】初期疾患を有する強直性脊椎炎患者のサブセットに関する、処置の１６週目及び５２週目における患者報告転帰を示す（＜２年間の期間）。点線は、プラセボにより処置された患者が、１６週目にゴリムマブによる処置とクロスオーバーしたことを示している。プラセボにより処置された患者に関するデータ、及びプラセボにより処置し、次に１６週目にゴリムマブとクロスオーバーした患者に関するデータが、灰色の棒として示されている。ゴリムマブにより処置された患者のデータは、黒色の棒として示されている。ベースラインからの平均（ＳＤ）変化が報告され、低下は、患者報告転帰の改善を表す。ＡＳＱｏＬは、強直性脊椎炎の生活の質を指す。

【0036】

（発明の記述）
本発明は、配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／若しくは配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、単離された組換え及び／又は合成抗ＴＮＦヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化若しくはＣＤＲ移植抗体、並びにそれらに対するＴＮＦ抗イディオタイプ抗体、並びに少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体又は抗イディオタイプ抗体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物及びコード核酸分子を提供する。本発明は、診断用及び治療用組成物、方法、並びにデバイスを含む、かかる核酸及び抗体、並びに抗イディオタイプ抗体の作製及び使用方法を更に含むが、これらに限定されない。

【0037】

本明細書で使用するとき、「抗腫瘍壊死因子α抗体」、「抗ＴＮＦ抗体」、「抗ＴＮＦ抗体部分」若しくは「抗ＴＮＦ抗体断片」、及び／又は「抗ＴＮＦ抗体変異体」などは、本発明の抗体の中に組み込むことができる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はこれらの任意の部分、あるいはＴＮＦ受容体又は結合タンパク質の少なくとも一つの部分などであるがこれらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。かかる抗体は、任意選択的に、特定のリガンドに更に影響を及ぼし、これらに限定されないが、かかる抗体は、インビトロで、その場で、及び／又はインビボで、少なくとも１つのＴＮＦ活性若しくは結合、又はＴＮＦ受容体活性若しくは結合を調節、減少、増加、拮抗、作動、軽減、緩和、遮断、阻害、抑止、及び／又は干渉する。非限定的な例として、本発明の好適な抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又は変異体は、少なくとも１つのＴＮＦ又はその特定された部分、変異体若しくはドメインに結合することができる。好適な抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又は変異体はまた、任意選択的に、ＲＮＡ、ＤＮＡ、若しくはタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ生成、及び／又は合成などであるがこれらに限定されない、ＴＮＦ活性又は機能のうちの少なくとも１つに影響を及ぼすこともできる。「抗体」という用語は、更に、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を包含することを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、あるいは抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体及びその断片が挙げられる。機能断片としては、哺乳動物のＴＮＦに結合する抗原結合断片が挙げられる。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）及びＦ（ａｂ’）_２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）断片が挙げられるがこれらに限定されない、ＴＮＦ又はその部分に結合することができる抗体断片が、本発明に包含される（例えば、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと）。

【0038】

かかる断片は、当該技術分野において既知であるように、及び／又は本明細書に記載されるように、酵素切断、合成又は組換え技術により産生することができる。抗体は、天然の終止部位の上流に１つ又は２つ以上の終止コドンが導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断型でも産生され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２重鎖部分をコードする遺伝子の組み合わせは、重鎖のＣＨ_１ドメイン及び／又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むよう設計することができる。抗体の種々の部分を従来技術により化学的に結合することができ、又は遺伝子工学技術を使用して切れ目なく連続するタンパク質として調製することができる。

【0039】

本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、実質的にタンパク質の全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈドメイン（例えば、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３）、ヒンジ（Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ））が軽微な配列の変化又は変異を有するだけで実質的にヒトにおいて非免疫原性である抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスタなど）、及びその他の哺乳動物を指定された抗体は、かかる種、亜属、属、亜科、科に特異的な抗体を指す。更に、キメラ抗体は、上記の任意の組み合わせを含む。このような変化又は変異は、場合によりかつ好ましくは、修飾していない抗体に比べて、ヒト又はその他の種における免疫原性を保持するか、又は低減させる。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を発現することができる、ヒト以外の動物、又は原核若しくは真核細胞により産生され得ることが指摘される。更に、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、天然のヒト抗体では見られないリンカペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続する２～約８個のグリシン又はその他のアミノ酸残基などのリンカペプチドを含むことができる。このようなリンカペプチドは、ヒト由来のものと見なされる。

【0040】

また、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である、二重特異的、異種特異的、異種結合性、又は類似の抗体を使用してもよい。この場合では、結合特異性のうち一方は少なくとも１つのＴＮＦタンパク質に対するものであり、他方は任意のその他の抗原に対するものである。二重特異的抗体の製造方法は、技術分野において既知である。従来、二重特異的抗体の組換え体生成は、２種の免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づくが、ここで２本の重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、「Ｎａｔｕｒｅ」３０５：５３７頁（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為な組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の可能な混合物を産生し、これらのうち１種のみが正しい二重特異的構造を有する。正確な分子の精製（通常アフィニティクロマトグラフィ工程により行われる）はかなり面倒であり、生成物の収率は低い。類似する手順が、例えば、国際公開第９３／０８８２９号、米国特許第６，２１０，６６８号、同第６，１９３，９６７号、同第６，１３２，９９２号、同第６，１０６，８３３号、同第６，０６０，２８５号、同第６，０３７，４５３号、同第６，０１０，９０２号、同第５，９８９，５３０号、同第５，９５９，０８４号、同第５，９５９，０８３号、同第５，９３２，４４８号、同第５，８３３，９８５号、同第５，８２１，３３３号、同第５，８０７，７０６号、同第５，６４３，７５９号、同第５，６０１，８１９号、同第５，５８２，９９６号、同第５，４９６，５４９号、同第４，６７６，９８０号、国際公開第９１／００３６０号、同第９２／００３７３号、欧州特許第０３０８９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）に開示されており、これらの各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0041】

本発明の方法及び組成物において有用である抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＦ抗体とも称される）は、ＴＮＦへの高親和性結合、並びに任意選択的に及び好ましくは低毒性を有することを任意選択的に特徴とし得る。具体的には、可変領域、定常領域、及びフレームワークなどの個々の構成要素が、個々に及び／又は集合的に、任意選択的にかつ好ましくは、低い免疫原性を有する、本発明の抗体、その特定の断片、又は変異体が本発明において有用である。本発明で使用することができる抗体は、任意選択的に症状の測定可能な緩和並びに低い及び／又は許容できる毒性で、長期間患者を処置する能力を特徴とする。低い若しくは許容できる免疫原性、及び／又は高い親和性、並びに他の好適な特性が、得られる治療結果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、本明細書では、処置される患者の約７５％未満、若しくは好ましくは約５０％未満で有意にＨＡＨＡ、ＨＡＣＡ若しくはＨＡＭＡ応答が増加する、及び／又は、処置される患者において低い力価（二重抗原酵素免疫アッセイで測定したとき約３００未満、好ましくは約１００未満）が増加することとして定義される（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１２５－１１２７（１９９４）、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。

【0042】

有用性：本発明の単離核酸は、細胞、組織、器官又は動物（哺乳類及びヒトを含む）において測定し、又は作用して、免疫障害若しくは疾患、循環器障害若しくは疾患、感染性、悪性及び／若しくは神経性障害又は疾患のうちの少なくとも１つから選択されるがこれらに限定されない、少なくとも１つのＴＮＦ状態を診断、監視、調節、処置、緩和、発生を予防するのを助ける、又はその症状を低減するために使用され得る、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体又はその特定された変異体を生成するために使用され得る。

【0043】

かかる方法は、症状、作用、又は機序のかかる調節、処置、緩和、予防、若しくは低減を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含み得る。有効量は、本明細書に記載される、又は関連分野で知られている、既知の方法を使用して行い決定して、単回（例えば、ボーラス）、複数回、若しくは持続投与当たり約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇの量、又は単回、複数回、若しくは持続投与当たり０．０１～５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成する量、又はこの中の任意の有効範囲若しくは値を含み得る。引用文献。本明細書で引用する全ての刊行物又は特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本発明の時点での最高水準を示し、かつ／又は本発明の説明及び使用可能性を提供する。刊行物とは、電子形式若しくは印刷形式で記録されたものを全て含む任意のメディア形式で利用可能な、任意の科学刊行物若しくは特許公報又は任意の他の情報を指す。以下の文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７～２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４～２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７～２００１）。

【0044】

本発明の抗体：配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、本発明の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、任意選択的に、当該技術分野において周知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団により産生され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ、ＮＹ（１９８７～２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４～２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７～２００１）。

【0045】

ヒトＴＮＦタンパク質又はその断片に特異的なヒト抗体は、単離された及び／若しくはＴＮＦタンパク質、又はそれらの一部分（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適切な免疫原性抗原に対して生じ得る。その他の特異的な又は一般的な哺乳動物の抗体もまた、同様に生じることができる。免疫原性をもつ抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、任意の好適な技術を使用して行うことができる。

【0046】

１つのアプローチでは、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えば、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０－ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ－１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ－１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ－５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ－６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａなどであるがこれらに限定されない骨髄腫細胞株、又はヘテロミローマ（heteromylomas）、その融合産物、又はそれらに由来する任意の細胞若しくは融合細胞、又は当該技術分野において既知の任意の他の好適な細胞株を融合させることにより産生される。例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．などを参照のこと。単離若しくはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃、又はその他の免疫若しくはＢ細胞含有細胞などであるがこれらに限定されない抗体産生細胞、あるいは組換え若しくは内因性、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫類、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖、ハイブリダイズなど、又はそれらの組み合わせのような、内因性若しくは異種の核酸のいずれかとして、重鎖若しくは軽鎖定常若しくは可変若しくはフレームワーク若しくはＣＤＲ配列を発現する任意のその他の細胞を有する。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、及び上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第２章を参照されたい。なお両文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0047】

抗体産生細胞は、目的の抗原で免疫されたヒト又は他の好適な動物の末梢血、又は好ましくは脾臓若しくはリンパ節から得ることもできる。任意のその他の好適な宿主細胞を使用して、本発明の抗体、特定の断片又はその変異体をコードする異種核酸若しくは内在核酸を発現させることもできる。融合細胞（ハイブリドーマ）又は組換え細胞は、選択的培養条件又はその他の好適な周知の方法を使用して単離し、限界希釈若しくは細胞選別又はその他の周知の方法によってクローニングすることができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択することができる。

【0048】

ペプチド又はタンパク質ライブラリから組換え抗体を選択する方法が挙げられるがこれらに限定されない、必要とされる特異性を有する抗体を産生又は単離するのに好適なその他の方法を使用することができる（例えば、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのディスプレイライブラリであるがこれらに限定されるものではなく、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，ＤＥ、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ、Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．，Ｅｎｚｏｎ，Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ、Ｘｏｍａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ、Ｉｘｓｙｓ．から入手可能である）。例えば、欧州特許第３６８，６８４号、国際出願第ＧＢ９１／０１１３４号、国際出願第ＧＢ９２／０１７５５号、国際出願第ＧＢ９２／００２２４０号、国際出願第ＧＢ９２／００８８３号、国際出願第ＧＢ９３／００６０５号、米国特許出願第０８／３５０２６０号（５／１２／９４）、国際出願第ＧＢ９４／０１４２２号、国際出願第ＧＢ９４／０２６６２号、国際出願第ＧＢ９７／０１８３５号、（ＣＡＴ／ＭＲＣ）、同第９０／１４４４３号、同第９０／１４４２４号、同第９０／１４４３０号、国際出願第ＵＳ９４／１２３４号、国際公開第９２／１８６１９号、同第９６／０７７５４号（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、欧州特許第６１４ ９８９号（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）、同第９５／１６０２７号（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）、同第８８／０６６３０号、同第９０／３８０９号（Ｄｙａｘ）、米国特許第４，７０４，６９２号（Ｅｎｚｏｎ）、国際出願第ＵＳ９１／０２９８９号（Ａｆｆｙｍａｘ）、国際公開第８９／０６２８３号、欧州特許第３７１９９８号、欧州特許第５５０４００号、（Ｘｏｍａ）、欧州特許第２２９０４６号、国際出願第ＵＳ９１／０７１４９号（Ｉｘｓｙｓ）、又は確率論的に生成されるペプチド若しくはタンパク質－米国特許第５７２３３２３号、同第５７６３１９２号、同第５８１４４７６号、同第５８１７４８３号、同第５８２４５１４号、同第５９７６８６２号、国際公開第８６／０５８０３号、欧州特許第５９０６８９号（Ｉｘｓｙｓ、現在はＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＭＥ）、各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたく、又は当該技術分野において既知であり、かつ／又は本明細書に記載される、ヒト抗体のレパートリを生成することができるトランスジェニック動物の免疫に依存する（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎら、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１～９０７（１９９７）、Ｓａｎｄｈｕら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５～１１８（１９９６）、Ｅｒｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４～１６１（１９９８）、それぞれが参照によりその全体が組み込まれる）。このような技術には、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４９３７～４９４２（１９９７年５月）、Ｈａｎｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１３０～１４１３５（１９９８年１１月））、単一細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体方法（「selected lymphocyte antibody method、ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７～８９２（１９８７）、Ｂａｂｃｏｏｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３～７８４８（１９９６））、ゲルマイクロドロップレット及びフローサイトメトリ（Ｐｏｗｅｌｌら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３～３３７（１９９０））、Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、Ｇｒａｙら，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５～１６３（１９９５）、Ｋｅｎｎｙら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７～７９０（１９９５））、Ｂ細胞選択物（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１２５－１３４ （１９９４）、Ｊｏｎａｋら，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．５，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８８））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0049】

ヒト以外の抗体又はヒト抗体を操作又はヒト化する方法も同様に使用でき、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化又は操作された抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、又はその他の哺乳動物などであるがこれらに限定されない、非ヒトの供給源からの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変領域、定常領域又はその他のドメインから採取される。

【0050】

既知のヒトＩｇ配列は、数多くの刊行物及びウェブサイトに開示されており、例えば、
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；
ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；
ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；
ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／～ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；
ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ；
ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／～ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；
ｗｗｗ．ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．
ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；
ｗｗｗ．ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／～ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／～ｈｃｌ／；
ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；
ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／～ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；
ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／～ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｉｓａｃ－ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ－ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／～ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／～ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ－ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；
ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ－ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；
ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／～ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；
ｗｗｗ．ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／
ｗｗｗ．ａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／～ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／～ｕｂｃｇ０７ｓ／；
ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；
ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／～ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／～ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ－ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ；
ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．、Ｋａｂａｔら、
「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）があり、各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0051】

このようなインポートされた配列は、免疫原性を低減させるため、あるいは、当該技術分野において周知のように、結合、親和性、結合速度定数、解離速度定数、結合活性、特異性、半減期、又は任意のその他の好適な特性を低減、増強又は改変するために使用することができる。一般に、非ヒト若しくはヒトＣＤＲ配列の一部又は全ては、可変及び定常領域の非ヒト配列がヒト若しくは他のアミノ酸に置き換えられる間も維持される。抗体はまた、任意選択的に、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままで、ヒト化され得る。この目的を達成するために、任意選択的に、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製することが可能である。三次元の免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者に周知である。選択された免疫グロブリン配列候補について確率の高い三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、免疫グロブリン配列候補の機能において残基が示す可能性の高い働きの解析、すなわち免疫グロブリン候補の抗原結合能に影響する残基の解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、望ましい抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列及びインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に直接的にかつほとんど実質的に影響する。本発明の抗体のヒト化又は操作は、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５７２３３２３号、同第５９７６８６２号、同第５８２４５１４号、同第５８１７４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６８８６号、同第５７１４３５２号、同第６２０４０２３号、同第６１８０３７０号、同第５６９３７６２号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号、同第４８１６５６７号、国際出願第ＵＳ９８／１６２８０号、同第ＵＳ９６／１８９７８号、同第ＵＳ９１／０９６３０号、同第ＵＳ９１／０５９３９号、同第ＵＳ９４／０１２３４号、国際出願第ＧＢ８９／０１３３４号、同第ＧＢ９１／０１１３４号、同第ＧＢ９２／０１７５５号、国際公開第９０／１４４４３号、同第９０／１４４２４号、同第９０／１４４３０号、欧州特許第２２９２４６号（それぞれ、参照によりその全体が明細書に組み込まれ、その中に引用される文献を含む）に記載されるものなどであるがこれらに限定されない、任意の周知の方法を使用して行うことができる。

【0052】

抗ＴＮＦ抗体は、任意選択的に、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知である、ヒト抗体のレパートリを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスタ、非ヒト霊長類など）の免疫により生成することもできる。ヒト抗ＴＮＦ抗体を産生する細胞をかかる動物から単離し、本明細書に記載される方法などの好適な方法を使用して不死化してもよい。

【0053】

ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリを産生することができるトランスジェニックマウスは、既知の方法（例えば、これらに限定されないが、Ｌｏｎｂｅｒｇらに発行された米国特許第５，７７０，４２８号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、及び同第５，７８９，６５０号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓらの国際公開第９８／５０４３３号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓらの国際公開第９８／２４８９３号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９８／２４８８４号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９７／１３８５２号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９４／２５５８５号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅらの国際公開第９６／３４０９６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅらの欧州特許第０４６３１５１（Ｂ１）号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅらの欧州特許０７１０７１９（Ａ１）号、Ｓｕｒａｎｉらの欧州特許第５，５４５，８０７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎらの国際公開第９０／０４０３６号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎらの欧州特許第０４３８４７４（Ｂ１）号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの欧州特許第０８１４２５９（Ａ２）号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの英国特許第２２７２４４０（Ａ）号、ＬｏｎｂｅｒｇらのＮａｔｕｒｅ３６８：８５６～８５９（１９９４）、ＴａｙｌｏｒらのＩｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）５７９～５９１（１９９４）、ＧｒｅｅｎらのＮａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４）、ＭｅｎｄｅｚらのＮａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６～１５６（１９９７）、ＴａｙｌｏｒらのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（２３）：６２８７～６２９５（１９９２）、ＴｕａｉｌｌｏｎらのＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（８）３７２０～３７２４（１９９３）、ＬｏｎｂｅｒｇらのＩｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（１）：６５～９３（１９９５）及びＦｉｓｈｗａｌｄらのＮａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４（７）：８４５～８５１（１９９６）であって、これらは、参照により各全体が本明細書に組み込まれる）によって生成することができる。一般に、これらのマウスは、機能的に再構成された、又は機能的な再構成を受けることができる少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座に由来するＤＮＡを含む、少なくとも１つの導入遺伝子を含む。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させて、マウスの、内因性遺伝子によりコードされている抗体の産生能を除去することができる。

【0054】

類似のタンパク質又は断片への特異的結合についての抗体のスクリーニングは、ペプチドディスプレイライブラリを使用して首尾よく達成することができる。この方法は、望ましい機能又は構造を持つ個々のメンバーについてペプチドの多数の試料採集をスクリーニングすることを伴う。ペプチドディスプレイライブラリの抗体スクリーニングは、当該技術分野において周知である。ディスプレイされたペプチド配列の長さは、３～５０００個又はそれ以上のアミノ酸であり、頻繁には５～１００個のアミノ酸長、多くは約８～２５個のアミノ酸長であることができる。ペプチドライブラリを作成する直接化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ方法も記述されている。１つのタイプは、バクテリオファージ又は細胞の表面上でのペプチド配列のディスプレイを含む。各バクテリオファージ又は細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。このような方法は、国際出願特許公報第９１／１７２７１号、同第９１／１８９８０号、同第９１／１９８１８号、及び同第９３／０８２７８号に記載されている。ペプチドライブラリを作成するためのその他のシステムは、インビトロでの化学合成法及び組換え法の両方の態様を有する。国際出願特許公報第９２／０５２５８号、同第９２／１４８４３号、及び同第９６／１９２５６号を参照されたい。米国特許第５，６５８，７５４号及び同第５，６４３，７６８号も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリ、ベクター、及びスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のような供給元から市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４７０４６９２号、同第４９３９６６６号、同第４９４６７７８号、同第５２６０２０３号、同第５４５５０３０号、同第５５１８８８９号、同第５５３４６２１号、同第５６５６７３０号、同第５７６３７３３号、同第５７６７２６０号、同第５８５６４５６号、Ｄｙａｘに譲渡された米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６９８号、同第５８３７５００号、Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された米国特許第５４２７９０８号、同第５５８０７１７号、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された米国特許第５８８５７９３号、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された米国特許第５７５０３７３号、Ｘｏｍａに譲渡された米国特許第５６１８９２０号、同第５５９５８９８号、同第５５７６１９５号、同第５６９８４３５号、同第５６９３４９３号、同第５６９８４１７号、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい、上記特許及び刊行物の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0055】

本発明の抗体は又、かかる抗体を乳中に産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのトランスジェニック動物又は哺乳動物を提供するために、核酸をコードする少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を使用して調製することもできる。このような動物は、周知の方法を使用して準備することができる。例えば、これらに限定されないが、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号；同第５，３０４，４８９号などを参照されたい（それらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0056】

本発明の抗体は、植物部分又はそれから培養された細胞において、かかる抗体、特定された部分又は変異体を産生するトランスジェニック植物及び培養された植物細胞（例えば、タバコ及びトウモロコシであるが、これらに限定されない）を提供するために、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体コード核酸を使用して更に調製することができる。非限定的な実施例として、例えば、誘導プロモータを用い、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉をうまく使用して、大量の組換えタンパク質が提供されてきた。例えば、Ｃｒａｍｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５～１１８（１９９９）及びその中で引用される文献を参照されたい。また、トランスジェニックトウモロコシは、その他の組換え系において生成されるタンパク質又は天然資源から精製されるタンパク質に等しい生物学的活性を有する哺乳動物タンパク質を、商業生成レベルで発現するために使用されてきた。例えば、Ｈｏｏｄら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．」第４６４：１２７～１４７（１９９９）及びその中で引用される文献を参照のこと。抗体は、タバコ種子及びポテト塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物種子からも大量に産生されてきた。例えば、Ｃｏｎｒａｄら、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」３８：１０１～１０９（１９９８）及びその中で引用される文献を参照のこと。したがって、本発明の抗体は、既知の方法により、トランスジェニック植物を使用して産生することもできる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９～１０８（１９９９年１０月）、Ｍａら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２～７（１９９５）、Ｍａら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１～６（１９９５）、Ｗｈｉｔｅｌａｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０～９４４（１９９４）、及びこれらの中で引用される文献も参照されたい。また、限定されないが、一般に抗体の植物発現についても参照のこと。上記文献の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0057】

本発明の抗体は、広範囲にわたる親和性（Ｋ_Ｄ）でヒトＴＮＦに結合することができる。好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのヒトｍＡｂは、任意選択的にヒトＴＮＦに高い親和性で結合することができる。例えば、ヒトｍＡｂは、ヒトＴＮＦを約１０^－７Ｍ以下、例えば０．１～９．９（又はその中の任意の範囲若しくは値）Ｘ１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３又はその中の任意の範囲若しくは値など（ただしこれらに限定されない）のＫ_Ｄで結合することができる。

【0058】

抗原に対する抗体の親和性又は結合活性は、任意の好適な方法を用いて実験により求めることができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書に記載される方法を参照されたい）。特定の抗体抗原相互作用について測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定された場合に異なることができる。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、Ｋ_Ｄ、Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝剤などの標準化緩衝剤を用いて行われる。

【0059】

核酸分子。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８のうちの少なくとも１つの隣接アミノ酸の少なくとも７０～１００％をコードするヌクレオチド配列、特定された断片、変異体若しくはそれらのコンセンサス配列、又はこれらの配列のうちの少なくとも１つを含む寄託ベクターなどの本明細書に提供される情報を使用して、配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体をコードする本発明の核酸分子は、本明細書に記載される又は当該技術分において既知の方法を使用して得ることができる。

【0060】

本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくは任意の他の形態のようなＲＮＡの形態、又はクローニングにより得られる若しくは合成的に産生されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡの形態、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡは、３本鎖、２本鎖若しくは１本鎖、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよいし、又はアンチセンス鎖と呼ばれる、非コード鎖であってもよい。

【0061】

本発明の単離された核酸分子は、任意選択的に１つ又は２つ以上のイントロンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、これらに限定されないが、少なくとも１つの重鎖（例えば、配列番号１～３）若しくは軽鎖（例えば、配列番号４～６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３のような、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定された部分を含む核酸分子、抗ＴＮＦ抗体若しくは可変領域のコード配列（例えば、配列番号７、８）を含む核酸分子、並びに上述の核酸分子とは実質的に異なるが、遺伝子コードの縮重により、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知である少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を尚もコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み得る。当然のことながら、遺伝子コードは、技術分野において周知である。したがって、当業者には、本発明の特定の抗ＴＮＦ抗体をコードする、かかる縮重核酸変異体を生成することは、日常的であろう。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。このような核酸変異体は、本発明に含まれる。本発明の単離核酸分子の非限定的な例としては、それぞれ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域をコードする核酸の非限定的な例に対応する、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５が挙げられる。

【0062】

本明細書に示されるように、抗ＴＮＦ抗体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子としてとしては、それ自体で抗体断片のアミノ酸配列をコードするもの、抗体の全長若しくは抗体の一部をコードする配列、抗体、断片若しくは部分のコード配列、並びに追加の配列、例えば、少なくとも１つのイントロンなど、前述の追加のコード配列を伴って、又は伴わずに、非コード５’及び３’配列、例えば、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性）を含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割を果たす転写された非翻訳配列を含むがこれに限定されない追加の非コード配列と共に、少なくとも１つのシグナルリーダ若しくは融合ペプチドのコード配列、追加のアミノ酸、例えば、追加の機能を提供するアミノ酸をコードする追加のコード配列を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、抗体をコードする配列はマーカ配列に融合させることができ、例えば、マーカ配列は、これを融合させた抗体断片又は部分を含む抗体の精製を促進するペプチドをコードする配列である。

【0063】

本明細書に記載されるポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド。本発明は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対して、選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離核酸を提供する。したがって、本実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリにおける部分長又は完全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、単離された、又はそうでなければヒト若しくは哺乳動物の核酸ライブラリのｃＤＮＡに相補的な、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列である。

【0064】

好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは、完全長配列の少なくとも８０％、好ましくは完全長配列の少なくとも８５％又は９０％、及びより好ましくは完全長配列の少なくとも９５％を含む。このｃＤＮＡライブラリは、稀な配列の発現量を増大させるよう正規化することができる。相補配列に対する配列同一性が低い配列を使用する、低又は中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が典型的なものであるが、これに限定されない。同一性がより高い配列には、任意選択的に、中及び高ストリンジェンシーの条件を使用することができる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性をもつ配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソロガス又はパラロガス配列を特定同定するために利用できる。

【0065】

任意選択的に、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコード化される抗体の少なくとも一部をコードすることになる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに対する選択的ハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を包含する。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、上記のＣｏｌｌｉｇａｎを参照されたい。各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0066】

核酸の構築。本発明の単離核酸は、当該技術分野にて周知のように、（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はこれらの組み合わせを使用して作製することができる。

【0067】

核酸には、本発明のポリヌクレオチドに加えて、都合よく配列を含ませることができる。例えば、１つ又は２つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニングサイトを核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカ配列は、本発明のタンパク質を精製するのに便利な手段を提供する。本発明の核酸（コード配列を除く）は、任意選択的に、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプタ又はリンカである。

【0068】

かかるクローニング配列及び／又は発現配列に追加の配列を付加して、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化すること、ポリヌクレオチドの単離に役立てること、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローン化ベクター、発現ベクター、アダプタ、及びリンカの使用は、技術分野において周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。

【0069】

核酸を構築するための組換え方法。ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせのような本発明の単離核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング手順を用いて生物源から得ることができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ内の望ましい配列の同定に使用される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリの構築は、当業者には周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。

【0070】

核酸のスクリーニング及び単離方法。本明細書で開示されているような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることができる。プローブを使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列にハイブリダイズさせて、同じ又は異なる生体の相同遺伝子を単離することができる。当業者であれば、アッセイに様々な度合のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーション又は洗浄媒質のいずれかをストリンジェントなものにできることを理解するであろう。ハイブリダイゼーション条件がストリンジェントになるほど、二重鎖の形成が生じる際のプローブと標的との間の相補性の度合が大きくなるはずである。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドのような部分的に変性する溶媒の存在、のうちの１つ又は２つ以上によって制御され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、０％～５０％の範囲内でのホルムアミド濃度の操作により反応溶液の極性を変えることにより首尾よく変更される。検出可能な結合に必要とされる相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーによって異なる。相補性の程度は、最適には１００％、又は７０～１００％、又はその中の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマ中の配列のわずかな違いは、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーを低減させることで埋め合わせることができることを理解すべきである。

【0071】

ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は技術分野において周知であり、本明細書で紹介する教示及び指針に基づいて、過度の実験なしに、本発明に従って使用可能である。

【0072】

ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、Ｔａｂｏｒらの米国特許第４，７９５，６９９号及び同第４，９２１，７９４号、Ｉｎｎｉｓの米国特許第５，１４２，０３３号、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，１２２，４６４号、Ｉｎｎｉｓの米国特許第５，０９１，３１０号、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらの米国特許第５，０６６，５８４号、Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第４，８８９，８１８号、Ｓｉｌｖｅｒらの米国特許第４，９９４，３７０号、Ｂｉｓｗａｓの米国特許第４，７６６，０６７号、Ｒｉｎｇｏｌｄの米国特許第４，６５６，１３４号を参照されたい）、及び二本鎖ＤＮＡ合成のためのテンプレートとして標的配列に対してアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介増幅（Ｍａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号、商標名ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない（これらの文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、又はＳａｍｂｒｏｏｋ（上記）を参照されたい。）

【0073】

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリから直接、本発明のポリヌクレオチド及び関連する遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングすること、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するため、核酸の配列決定のため、又は他の目的のためのプローブとして用いる核酸を作製することに関し有用であり得る。インビトロでの増幅方法によって当業者を導くのに充分な技術の例は、上記のＢｅｒｇｅｒ、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、及び上記のＡｕｓｕｂｅｌ、並びにＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）、及びＩｎｎｉｓら、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ編、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販キットは技術分野において既知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ－ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、長いＰＣＲ産物の収率を改善することができる。

【0074】

核酸を構築するための合成方法。本発明の単離核酸は、既知の方法による直接化学合成によっても調製可能である（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）。化学合成は、一般に、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、又は１本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、２本鎖ＤＮＡに変換可能な１本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成は約１００又はそれ以上の塩基の配列に限定され得るが、より長い配列は、より短い配列のライゲーションによって得ることができることを認識するであろう。

【0075】

組換え発現カセット。本発明は、本発明の核酸を含む組換え発現カセットを更に提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列を用いて、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入できる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に機能的に連結される、本発明のポリヌクレオチドを含む。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモータの両方を使用して、本発明の核酸の発現を導くことができる。

【0076】

いくつかの実施形態では、プロモータ、エンハンサ、又は他の要素として機能する単離核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方又は下方調節するために、本発明のポリヌクレオチドの非異種形の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入することができる。例えば、変異、欠失、及び／又は置換により、インビボ又はインビトロで内因性プロモータを変化させることができる。

【0077】

ベクター及び宿主細胞。本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び当該技術分野において周知である組換え技術による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の生成にも関する。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたく、それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0078】

ポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主の増殖についての選択マーカを含有するベクターに結合することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、又は荷電脂質との複合体内に導入される。ベクターがウイルスである場合は、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでこれをパッケージングし、その後、宿主細胞内に形質導入することができる。

【0079】

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモータに機能的に連結されるべきである。発現コンストラクトは、転写開始部位、転写終結部位、及び転写された領域内では翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含む。構築物により発現される成熟した転写産物のコード部分は、好ましくは、最初に翻訳開始部位を含み、翻訳されるｍＲＮＡの最後に終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）が適切に位置することになる。哺乳動物又は真核生物の細胞の発現ではＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。

【0080】

発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカを含むが、これは任意選択的である。かかるマーカには、例えば、真核細胞培養のためのメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸、又はグルタミンシンセターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）抵抗性遺伝子、並びにＥ．ｃｏｌｉ及び他の細菌又は原核生物における培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない（上記特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対して適切な培養培地及び条件は、技術分野において周知である。好適なベクターは、当業者にとって容易に明白となるであろう。宿主細胞へのベクターコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストランを介在させたトランスフェクション、カチオン性脂質を介在させたトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の周知の方法により達成することができる。このような方法については、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、第１～４章及び第１６～１８章、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１、９、１３、１５、１６章などの技術分野に記載されている。

【0081】

本発明の少なくとも１つの抗体は、融合タンパク質などの修飾された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域も含み得る。例えば、追加アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸を抗体のＮ末端に追加して、精製中又は後続の処理及び保存中に、宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本発明の抗体に追加して、精製を促進することもできる。抗体又は少なくとも１つのその断片の最終調製前に、このような領域を除去することができる。このような方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、第１７．２９～１７．４２章及び第１８．１～１８．７４章、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１６、１７及び１８章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。

【0082】

当業者であれば、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系について精通している。

【0083】

別の方法としては、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞内で、（操作により）オン切換えすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。このような方法は、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に記載されているように、当該技術分野において周知であり、上記特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0084】

抗体、その特定の部分又は変異体の産生に有用な細胞培養物の一例は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば細胞からなる単層形態を取るが、哺乳動物細胞の懸濁液又はバイオリアクタも使用可能である。無傷なグリコシル化タンパク質を発現可能な多くの好適な宿主細胞株が当該技術分野において開発されており、これにはＣＯＳ－１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１０）、及びＢＳＣ－１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられ、これらは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好適な宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ－１８５１）である。特に好ましい実施形態では、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。

【0085】

これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモータ（例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモータ、ｐｇｋ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモータ、ＥＦ－１αプロモータ（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモータ、エンハンサ、及び／又はリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ Ａｇポリ付加部位）、並びに転写終結配列などのプロセシング情報部位などであるがこれらに限定されるものではない、発現制御配列のうちの１つ又は２つ以上を含むことができる。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌら、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。本発明の核酸又はタンパク質の生成に有用な他の細胞は既知であり、並びに／あるいは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又は他の既知の若しくは商業的供給源から入手可能である。

【0086】

真核宿主細胞が利用される場合、典型的には、ベクター内にポリアデニル化又は転写終結配列が組み込まれる。終結配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列も、同様に含むことができる。スプライシング配列の一例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３～７８１（１９８３））。加えて、当該技術分野において周知であるように、宿主細胞内の複製を制御するための遺伝子配列をベクター内に組み込むことができる。

【0087】

抗体の精製。抗ＴＮＦ抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ及びレクチンクロマトグラフィが挙げられるがこれらに限定されない周知の方法により、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィ（「high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ」）を精製に利用することもできる。例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７～２００１）の、例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照されたく、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0088】

本発明の抗体には、天然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、並びに例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、真核宿主から組換え技法により産生された産物が含まれる。組換体産生手順に用いられる宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよいが、グリコシル化されるのが好ましい。このような方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、セクション１７．３７－１７．４２、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１０、１２、１３、１６、１８、及び２０章、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１２～１４章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0089】

抗ＴＮＦ抗体
配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む本発明の単離された抗体は、任意の好適なポリヌクレオチドによってコードされる本明細書で開示される抗体のアミノ酸配列、又は任意の単離又は調製された抗体を含む。好ましくは、ヒト抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦに結合し、それにより、タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を部分的又は実質的に中和する。少なくとも１つのＴＮＦタンパク質又は断片の少なくとも１つの生物学的活性を部分的に又は好ましくは実質的に中和する抗体又はその特定された部分若しくは変異体は、タンパク質又は断片に結合し、それによりＴＮＦのＴＮＦ受容体への結合を通して、又は他のＴＮＦ依存性若しくは介在性機序を通して介在される活性を阻害することができる。本明細書で使用するとき、「中和抗体」という用語は、アッセイに応じて約２０～１２０％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％又はそれ以上、ＴＮＦ依存性活性を阻害することができる抗体を指す。ＴＮＦ依存性活性を阻害する抗ＴＮＦ抗体の能力は、好ましくは、本明細書に記載され、かつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つの好適なＴＮＦタンパク質又は受容体アッセイによって評価される。本発明のヒト抗体は、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）又はアイソタイプのものであってもよく、κ又はλ軽鎖を含み得る。一実施形態において、ヒト抗体は、ＩｇＧ重鎖又は規定された断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの少なくとも１つのアイソタイプを含む。このタイプの抗体は、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つのヒト軽鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ）及びＩｇＭ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）導入遺伝子を含む、トランスジェニックマウス又は他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって調製することができる。別の実施形態において、抗ヒトＴＮＦヒト抗体は、ＩｇＧ１重鎖及びＩｇＧ１軽鎖を含む。

【0090】

本明細書で使用するとき、「抗体」又は「複数の抗体」という用語は、２００９年のバイオロジクス価格競争・イノベーション法（ＢＰＣＩ Ａｃｔ）並びに同様の世界的な法律及び規則で承認されたバイオシミラ抗体分子を含む。ＢＰＣＩ Ａｃｔの下で、抗体は、臨床的に不活性な構成成分のわずかな違いにも関わらず、基準品と「非常に類似」しており、安全性、純度、効力の点で基準品と同等の臨床結果が得られると「予想される」ことをデータが示す場合、バイオシミラであることが実証され得る（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：２０１８年２月、第２４巻第２号第１９５～２０４頁）。これらのバイオシミラ抗体分子は、短縮された承認経路を提供し、それにより、出願人は、法的な承認を確保するために、イノベータの基準品の臨床データに依存している。臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベータ基準抗体と比較して、バイオシミラ抗体分子は、本明細書では、「バイオ後続品」と呼ばれる。本明細書に提示されるように、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）は、臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベータ参照抗ＴＮＦ抗体である。ゴリムマブは、２００９年から米国で販売されている。

【0091】

例示的な配列
様々な実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、抗ＴＮＦ抗体ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）、又は以下に示す配列を含むその抗原結合断片を含む。抗ＴＮＦ抗体ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）及び他の抗ＴＮＦ抗体に関する更なる情報については、例えば、米国特許第７，２５０，１６５号；同第７，６９１，３７８号；同第７，５２１，２０６号；同第７，８１５，９０９号；同第７，８２０，１６９号；同第８，２４１，８９９号；同第８，６０３，７７８号；同第９，３２１，８３６号；及び同第９，８２８，４２４号を参照されたい。

【0092】

例示的な抗ＴＮＦ抗体の配列 例－ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）
重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔにより定義される。

【0093】

ＣＤＲに下線が付されたゴリムマブ重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列：（配列番号３６）

【0094】

【0095】

ＣＤＲに下線が付されたゴリムマブ軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列：（配列番号３７）

【0096】

【0097】

ＣＤＲに下線が付されたゴリムマブ可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列：（配列番号３８）

【0098】

【0099】

ＣＤＲに下線が付されたゴリムマブ可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列：（配列番号３９）

【0100】

【0101】

ゴリムマブ重鎖の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）のアミノ酸配列：（配列番号４０）
ＳＹＡＭＨ

【0102】

ゴリムマブ抗体重鎖の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）のアミノ酸配列：（配列番号４１）
ＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧ

【0103】

ゴリムマブ重鎖の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列：（配列番号４２）
ＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶ

【0104】

ゴリムマブ軽鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）のアミノ酸配列：（配列番号４３）
ＲＡＳＱＳＶＹＳＹＬＡ

【0105】

ゴリムマブ軽鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）のアミノ酸配列：（配列番号４４）
ＤＡＳＮＲＡＴ

【0106】

ゴリムマブ軽鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲＬ）のアミノ酸配列：（配列番号４５）
ＱＱＲＳＮＷＰＰＦＴ

【0107】

本発明の少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＴＮＦタンパク質、サブユニット、断片、部分、又はそれらの任意の組み合わせに特異的な少なくとも１つの特定のエピトープに結合する。この少なくとも１つのエピトープは、このタンパク質の少なくとも一部を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、このエピトープは、好ましくは、このタンパク質の少なくとも１つの細胞外部分、可溶性部分、親水性部分、外部部分、又は細胞質顆粒部分から構成されている。少なくとも１つの特定されたエピトープは、配列番号９の隣接アミノ酸の特定された部分全体に対する少なくとも１～３個のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸配列の任意の組み合わせを含むことができる。

【0108】

一般に、本発明のヒト抗体又は抗原結合断片は、少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの重鎖可変領域の変異体、及び少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの軽鎖可変領域の変異体を含む抗原結合領域を含む。非限定的な例として、抗体又は抗原結合部分若しくは変異体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３及び／又は配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、対応するＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２及び／又は３）を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部を含む抗原結合領域を有することができる。別の特定の実施形態において、抗体又は抗原結合部分若しくは変異体は、対応するＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列（例えば、配列番号４、５、及び／又は６）を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部を含む抗原結合領域を有することができる。好ましい実施形態において、抗体又は抗原結合断片の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書に記載される、ｍＡｂ ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１９６、ＴＮＶ１１８、ＴＮＶ３２、及びＴＮＶ８６のうちの少なくとも１つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列を有する。このような抗体は、組換えＤＮＡ技術に関する従来技術を使用して抗体をコードする（すなわち、１つ又は２つ以上の）核酸分子を調製して発現させることによって、又は任意のその他の好適な方法を使用することによって、従来技術を使用して抗体の種々の部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク）を一緒に化学的に結合させることにより調製できる。

【0109】

抗ＴＮＦ抗体は、規定されたアミノ酸配列を有する重鎖又は軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含むことができる。例えば、好ましい実施形態において、抗ＴＮＦ抗体は、任意選択的に配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は任意選択的に配列番号８のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含む。ヒトＴＮＦに結合し、規定された重鎖又は軽鎖可変領域を含む抗体は、好適な方法、例えば、当該技術分野において既知でありかつ／又は本明細書に記載される、ファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．ら、「Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ」１（５）：８６３－８６８（１９９８））又はトランスジェニック動物を採用する方法など、好適な方法を使用して調製することができる。例えば、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子と、機能的な再配列を受けることが可能なヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座からのＤＮＡを含む導入遺伝子と、を含むトランスジェニックマウスを、ヒトＴＮＦ又はその断片で免疫して抗体の生成を誘発することができる。所望する場合、抗体産生細胞を単離することができ、本明細書に記載されるように、かつ／又は技術分野において周知であるように、ハイブリドーマ又はその他の不死化させた抗体産生細胞を調製することができる。あるいは、抗体、特定の部分又は変異体は、好適な宿主細胞内で、コード核酸又はその一部分を使用して発現させることができる。

【0110】

本発明はまた、本明細書に記載されるアミノ酸配列と実質的に同じである配列中のアミノ酸を含む抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖及びＣＤＲに関する。好ましくは、かかる抗体又は抗原結合断片及びかかる鎖若しくはＣＤＲを含む抗体は、高い親和性（例えば、Ｋ_Ｄが約１０^－９Ｍ以下）で、ヒトＴＮＦに結合することができる。本明細書に記載されている配列と実質的に同じであるアミノ酸配列としては、保存的アミノ酸置換並びにアミノ酸欠失及び／又は挿入を含む配列が挙げられる。保存的アミノ酸置換は、第１のアミノ酸を、第１のアミノ酸のものに類似する化学的及び／又は物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸で置換することを指す。保存的置換は、１個のアミノ酸を、以下の群内の別のアミノ酸で置き換えることを含む：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸塩（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ、及びＹ；Ｃ、Ｓ、及びＴ。

【0111】

アミノ酸コード。本発明の抗ＴＮＦ抗体を構成するアミノ酸は、略されることが多い。アミノ酸表記は、その一文字コード、その三文字コード、名称、又は３つのヌクレオチドのコドンによりアミノ酸を表記することにより示すことができ、技術分野においてよく理解されている（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」第３版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい）。

【0112】

【表1】

【0113】

本発明の抗ＴＮＦ抗体は、本明細書で特定されるように、自然変異又はヒトによる操作のいずれかによる、１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含み得る。

【0114】

当然のことながら、当業者が行い得るアミノ酸置換の数は、上述のものを含む数多くの要因に依存する。概して、任意の所与の抗ＴＮＦ抗体、断片又は変異体についてのアミノ酸置換、挿入、又は欠失の数は、本明細書で特定されるように、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、例えば、１～３０、又はこの中の任意の範囲若しくは値を超えない。

【0115】

機能上不可欠である本発明の抗ＴＮＦ抗体内のアミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの、当該技術分野において既知の方法により特定することができる（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第８，１５章；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５（１９８９））。後者の手順では、分子内の残基ごとに単個のアラニンによる変異を導入する。次いで、結果として得られたミュータント分子は、例えば、少なくとも１つのＴＮＦ中和活性などがあるがこれに限定されない生物学的活性について試験される。抗体結合にとってきわめて重要である部位も、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識などの構造分析によって特定することができる（Ｓｍｉｔｈら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２２４：８９９～９０４（１９９２）及びｄｅ Ｖｏｓら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５５：３０６～３１２（１９９２））。

【0116】

本発明の抗ＴＮＦ抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６のうちの少なくとも１つの隣接アミノ酸のうちの１個～全てから選択された、少なくとも１つの部分、配列又は組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。

【0117】

抗ＴＮＦ抗体は更に、任意選択的に、配列番号７、８のうちの少なくとも１つの、隣接アミノ酸の７０～１００％の少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。

【0118】

一実施形態では、免疫グロブリン鎖又はその一部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号７、８のうちの少なくとも１つの対応する鎖のアミノ酸配列と、約７０～１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号８の配列と比較することができ、又は重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号７と比較することができる。好ましくは、７０～１００％のアミノ酸同一性（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）は、当該技術分野において周知であるように、好適なコンピュータアルゴリズムを使用して決定される。

【0119】

例示的な重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、配列番号７、８に示されている。本発明の抗体又はその特定された変異体は、本発明の抗体から任意の数の隣接アミノ酸残基を含み得、その数は、抗ＴＮＦ抗体における隣接残基数の１０～１００％からなる整数の群から選択される。任意選択的に、隣接アミノ酸のこの部分配列は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０又はそれ以上のアミノ酸長、又はその中の任意の範囲若しくは値である。更に、このような部分配列の数は、少なくとも２、３、４、又は５などの、１～２０からなる群から選択される任意の整数であることができる。

【0120】

当業者が認識しているように、本発明には、本発明の少なくとも１つの生物学的活性抗体が含まれている。生物学的活性抗体は、天然（非合成）、内因性又は関連する及び既知の抗体のものの、少なくとも２０％、３０％又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％～１０００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性のアッセイ及び定量測定の方法は、当業者にとって周知である。

【0121】

別の態様では、本発明は、有機部分の共有結合により修飾される、本明細書に記載されるヒト抗体及び抗原結合断片に関する。かかる修飾は、改善された薬物動態特性（例えば、増大したインビボでの血清半減期）を有する抗体又は抗原結合断片を産生することができる。有機部分は、直鎖又は分枝鎖親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であることができる。特定の実施形態では、親水性ポリマー基は、分子量が約８００～約１２０，０００ダルトンであって、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（polypropylene glycol、ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー又はポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基は、約８～約４０個の炭素原子を含むことができる。

【0122】

本発明の修飾された抗体及び抗原結合断片は、直接的又は間接的に抗体に共有結合される、１つ又は２つ以上の有機部分を含み得る。本発明の抗体又は抗原結合断片に結合される各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であることができる。本明細書で使用する場合、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。本明細書で使用する場合、「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンよりも水に対する溶解度が高い有機ポリマーを意味する。例えば、ポリリシンは、オクタンよりも水に対する溶解度が高い。よって、ポリリシンの共有結合により修飾された抗体は、本発明に包含される。本発明の抗体を修飾するのに好適な親水性ポリマーは、直線状又は分岐状であることができ、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ－ポリエチレングリコール（monomethoxy-polyethylene glycol、ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子体として、約８００～約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ_５０００及びＰＥＧ_{２０，０００}を使用することができ、下付き文字は、ポリマーの平均分子量（ダルトン）である。親水性ポリマー基は、１～約６個のアルキル基、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマー類は、好適な方法を利用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボン酸塩に連結させることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボン酸塩（例えば、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾールで活性化されている）をポリマー上のヒドロキシル基に連結させることができる。

【0123】

本発明の抗体を修飾するために好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和されてもよいし、又は１つ若しくは２つ以上の不飽和単位を含有していてもよい。本発明の抗体を修飾するのに好適な脂肪酸としては、例えば、ｎ－ドデカン酸塩（Ｃ_１２、ラウリン酸塩）、ｎ－テトラデカン酸塩（Ｃ_１４、ミリスチン酸塩）、ｎ－オクタデカン酸塩（Ｃ_１８、ステアリン酸塩）、ｎ－エイコサン酸塩（Ｃ_２０、アラキジン酸塩）、ｎ－ドコサン酸塩（Ｃ_２２、ベヘン酸）、ｎ－トリアコンタン酸塩（Ｃ_３０）、ｎ－テトラコンタン酸塩（Ｃ_４０）、シス－Δ９－オクタデカン酸塩（Ｃ_１８、オレイン酸塩）、全てのシス－Δ５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸塩（Ｃ_２０、アラキドン酸塩）、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルは、直鎖又は分枝鎖の低級アルキル基を含む、ジカルボン酸のモノエステルを含む。低級アルキル基は、１～約１２個、好ましくは１～約６個の炭素原子を含み得る。

【0124】

修飾ヒト抗体及び抗原結合断片は、１つ又は２つ以上の修飾剤と反応させることなどによって、好適な方法を使用して調製することができる。本明細書で使用されるとき、「修飾剤」という用語は、活性化基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」とは、適切な条件下で第２の化学基と反応し、これにより修飾剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することのできる、化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシル酸塩、メシル酸塩、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）などの求電子性基、Ｎ－ヒドロキシスクシニミジルエステル（ＮＨＳ）などを含む。チオール類と反応可能な活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ－チオール）などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子と連結することができ、アジド基は、三価リン基と反応してホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。分子中に活性化基を導入するための好適な方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接的に、又はリンカ部分、例えば、二価のＣ_１～Ｃ_１２基（ここで、１つ又は２つ以上の炭素原子は酸素、窒素、又は硫黄などのヘテロ原子で置換され得る）を介して、結合することができる。好適なリンカ部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、－（ＣＨ_２）_３－、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_６－ＮＨ－、－（ＣＨ_２）_２－ＮＨ－、及び－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－が挙げられる。リンカ部分を含む修飾剤は、例えば１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えば、モノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノへキサン）を脂肪酸と反応させることにより、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間のアミド結合を形成することによって産生可能である。Ｂｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理により生成物から除去して、記載されているように別のカルボン酸塩に連結し得る一級アミンを露出させることができ、あるいは、これを無水マレイン酸と反応させ、結果として得られた生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（例えば、参照により教示の全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらの国際公開第９２／１６２２１号を参照のこと。）

【0125】

本発明の修飾された抗体は、ヒト抗体又は抗原結合断片を修飾剤と反応させることによって生成することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性修飾剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを利用して、部位特異的なものではない方法で抗体に結合させることができる。抗体又は抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば、鎖内ジスルフィド結合）を還元することによって、修飾されたヒト抗体又は抗原結合断片を調製することもできる。このとき、還元された抗体又は抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、本発明の修飾された抗体を産生することが可能である。本発明の抗体の特定の部位に結合される有機部分を含む修飾されたヒト抗体及び抗原結合断片は、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：１４７－１５３（１９９２）、Ｗｅｒｌｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：４１１～４１７（１９９４）、Ｋｕｍａｒａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３～２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１号）：５９～６８（１９９６）、Ｃａｐｅｌｌａｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６～４６３（１９９７））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）に記載される方法などの好適な方法を使用して調製することができる。

【0126】

抗Ｔｎｆ抗体組成物に対する抗イディオタイプ抗体。モノクローナル又はキメラ抗ＴＮＦ抗体に加えて、本発明は、本発明のかかる抗体に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体にも関する。抗Ｉｄ抗体は、一般に別の抗体の抗原結合領域に関連する固有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、Ｉｄ抗体源と同じ種及び遺伝子型の動物（例えばマウス株）を、抗体又はそのＣＤＲ含有領域により免疫することによって調製することができる。免疫された動物は、免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識かつ応答し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体は、更に別の動物で免疫応答を誘導する「免疫原」としても使用され得、いわゆる抗－抗Ｉｄ抗体を生成する。

【0127】

抗Ｔｎｆ抗体組成物。本発明はまた、本明細書に記載され、かつ／又は当該技術分野において既知であるように、非自然発生組成物、混合物、又は形態で提供される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又はそれ以上のその抗ＴＮＦ抗体を含む、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物も提供する。かかる組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８の隣接アミノ酸の７０～１００％、又はその特定される断片、ドメイン若しくは変異体からなる群から選択される抗ＴＮＦ抗体のアミノ酸配列の少なくとも１つ又は２つの完全長、Ｃ及び／若しくはＮ末端欠失変異体、ドメイン、断片、又はその特定される変異体を含む非自然発生組成物を含む。好ましい抗ＴＮＦ抗体組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６の７０～１００％の抗ＴＮＦ抗体、又はその特定された断片、ドメイン若しくは変異体の、少なくとも１つのＣＤＲ又はＬＢＲ含有部分として少なくとも１つ又は２つの完全長、断片、ドメイン、又は変異体を含む。更に好ましい組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６の７０～１００％、又は特定された断片、ドメイン若しくはその変異体のうちの少なくとも１つを４０～９９％含む。このような組成物の百分率は、当該技術分野において既知であるように、又は本明細書に記載されるように、重量、体積、濃度、容量モル濃度、あるいは液体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、エマルジョン、又はコロイドとしての重量モル濃度によるものである。

【0128】

本発明の抗ＴＮＦ抗体組成物は更に、かかる調節、処置又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対する少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含み、任意選択的に、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、それらの融合タンパク質、又は小分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩剤、麻酔薬（narcotic）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔薬（anesthetic）、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋ブロッカ、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、駆虫薬、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌剤）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポイエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えばＧ－ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害薬、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似薬、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つを更に含む、任意の好適かつ有効量の組成物又は医薬組成物のうちの少なくとも１つを含み得る。このようなサイトカインの非限定的な例としては、ＩＬ－１～ＩＬ－２３のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。好適な投与量は、技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）；「ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００」特別版、Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0129】

このような抗がん剤又は抗感染薬は、本発明の少なくとも１つの抗体と関連、結合、同時処方、又は併用される毒素分子も含み得る。毒素は、病態細胞又は組織を選択的に死滅させるように、任意選択的に作用させることができる。病態細胞は、がん細胞又は他の細胞であり得る。このような毒素は、これらに限定するものではないが、例えば、リシン、ジフテリア毒素、ヘビ毒素、又は細菌毒素の少なくとも１つから選択される、毒素の少なくとも１つの機能的細胞傷害性ドメインを含む、精製若しくは組換え毒素又は毒素断片であり得る。毒素という用語はまた、ヒト及び他の哺乳動物において、死に至り得る毒素性ショックを含む、任意の病態をもたらし得る任意の自然発生の、ミュータント、又は組換えの細菌又はウイルスによって産生される内毒素及び外毒素の両方を含む。かかる毒素としては、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）、赤痢菌細胞毒素、アエロモナス属エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素－１（ＴＳＳＴ－１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、又はＣ（ＳＥＣ）、連鎖球菌エンテロトキシンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。かかる細菌としては、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば血清型０１５７の株：Ｈ７）、ブドウ球菌（Staphylococcus）種（例えば、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス－ピオゲネス（Staphylococcus aureus））、赤痢菌（Shigella）種（例えば、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ボイド赤痢菌（Shigella boydii）及びソンネ赤痢菌（Shigella sonnei））、サルモネラ（Salmonella）種（例えば、腸チフス菌、サルモネラコレラ－スイス、サルモネラエンテリティディス）、クロストリジウム種（例えば、クロストリジウム－パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム－ディフィシル（Clostridium dificile）、クロストリジウム－ボツリヌス（Clostridium botulinum））、カンピロバクタ（Camphlobacter）種（例えば、カンピロバクタ－ジュジュニ（Camphlobacter jejuni）、カンピロバクタ－フィータス（Camphlobacter fetus））、ヘリコバクタ（Heliocbacter）種（例えば、ヘリコバクタ－ピロリ（Heliocbacter pylori））、アエロモナス（Aeromonas）種（例えば、アエロモナス－ソブリア（Aeromonas sobria）、アエロモナス－ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、アエロモナス－キャビエ（Aeromonas caviae））、プレシオモナス－シゲロイデス（Pleisomonas shigelloides）、腸炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）、ビブリオ（Vibrio）種（例えば、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ビブリオ－パラヘモリティカス（Vibrio parahemolyticus））、クレブシエラ（Klebsiella）種、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、及び連鎖球菌（Streptococci）の種の株が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｔｅｉｎ編、「ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ」第３版第１～１３頁、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９０）、Ｅｖａｎｓら編、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ」第２版第２３９～２５４頁、Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）、Ｍａｎｄｅｌｌら、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」第３版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）、Ｂｅｒｋｏｗら編、「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ」第１６版、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（１９９２）、Ｗｏｏｄら、「ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」７６：１２１～１３４（１９９１）、Ｍａｒｒａｃｋら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４：８７０５～７１１（１９９０）を参照のこと（これらの文献の内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。

【0130】

本発明の抗ＴＮＦ抗体化合物、組成物又は混合物は更に、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどであるがこれらに限定されない、任意の好適な助剤のうちの少なくとも１つを含み得る。薬学的に許容される助剤が好ましい。かかる滅菌溶液を調製する方法及びその非限定例は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）１９９０が挙げられるが、これに限定されない。当該技術分野において周知、又は本明細書に記載されるように、抗ＴＮＦ抗体、断片、又は変異体組成物の投与方法、溶解度、及び／又は安定性に好適な薬学的に許容できる担体を、日常的に選択することができる。

【0131】

本組成物において有用な製薬学的添加物及び添加剤は、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質及び炭水化物（例えば、単糖類、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖類、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖、並びに多糖類又は糖ポリマー）を含み、これらは、単独で又は組み合わせて存在してよく、単独で又は組み合わせて１～９９．９９重量％又は体積％含まれる。例示的なタンパク質添加物には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。好ましいアミノ酸の１つはグリシンである。

【0132】

本発明に使用するのに好適な炭水化物添加物としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン類などの多糖類、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのアルジトールが挙げられる。本発明で使用するのに好ましい炭水化物添加物は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。

【0133】

抗ＴＮＦ抗体組成物は、緩衝剤又はｐＨ調整剤も含み得、典型的には、緩衝剤は、有機酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩、トリス、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸緩衝剤が挙げられる。本組成物における使用に好ましい緩衝剤は、クエン酸塩などの有機酸塩である。

【0134】

加えて、本発明の抗ＴＮＦ抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ２０」及び「ＴＷＥＥＮ８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのポリマー添加物／添加剤を含み得る。

【0135】

本発明による抗ＴＮＦ抗体、部分又は変異体組成物における使用に適したこれら及び追加の既知の製薬学的添加物及び／又は添加剤は、当該技術分野において既知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、１９^ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、及び「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、５２^ｎｄ ｅｄ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）に列挙されており、これらの開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。好ましい担体又は添加物材料は、炭水化物（例えば、単糖類及びアルジトール）及び緩衝剤（例えば、クエン酸）又はポリマー剤である。

【0136】

製剤。上述したとおり、本発明は、好ましくは、生理食塩水又は選択された塩を含むリン酸緩衝剤である安定した製剤、並びに保存剤を含有する保存溶液及び製剤、並びに薬学的に許容できる製剤中に少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む薬剤学的又は獣医学的用途に好適な多用途保存製剤を提供する。保存製剤は、水性希釈剤中に、少なくとも１つのフェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物からなる群から任意選択的に選択される、少なくとも１つの既知の保存剤を含む。当該技術分野において既知であるように、０．００１～５％、又は０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４．、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又はその中の任意の範囲若しくは値などであるがこれらに限定されない、その中の任意の範囲若しくは値の、任意の好適な濃度又は混合物が使用され得る。非限定的な実施例としては、保存剤無添加、０．１～２％のｍ－クレゾール（例えば、０．２、０．３．０．４、０．５、０．９、１．０％）、約０．１～３％のベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１～０．５％のチメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、０．００１～２．０％のフェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５～１．０％のアルキルパラベン（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などが挙げられる。

【0137】

上述のとおり、本発明は、包装材と、任意選択的に水性希釈剤中に処方された緩衝剤及び／又は保存剤を伴う少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の溶液を含む少なくとも１つのバイアルと、を含む製品を提供し、この包装材は、かかる溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間以上にわたり保持することができることを記したラベルを含む。本発明は、包装材と、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む第１のバイアルと、処方された緩衝剤又は保存剤の水性希釈剤を含む第２のバイアルと、を含む製品を更に含み、この包装材は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を水性希釈剤で再構成して、２４時間以上にわたって保持することができる溶液を形成するように患者に指示するラベルを含む。

【0138】

本発明に従って使用される少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において既知の、哺乳類細胞又はトランスジェニック調製物から産生することを含む組換え手段により産生してもよいし、又は他の生物源から精製してもよい。

【0139】

本発明の製品中に含まれる、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の範囲は、湿式／乾式系の場合、再構成時に約１．０μｇ／ｍｌ～約１０００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度が得られる量で含まれるが、これより低い濃度及び高い濃度でも作業可能であり、これらの濃度は意図される送達ビヒクルによって決まり、例えば溶液製剤では、経皮パッチ、肺、経粘膜、又は浸透圧性若しくはマイクロポンプ方法とは異なる。

【0140】

好ましくは、水性希釈剤は任意選択的に、医薬的に許容される保存剤を更に含む。好ましい保存剤には、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物からなる群から選択されるものが挙げられる。製剤中で使用される保存剤の濃度は、抗菌効果を生み出すのに充分な濃度である。このような濃度は選択された保存剤によって異なり、当業者により容易に決定される。

【0141】

他の添加物、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤エンハンサは、任意選択的に及び好ましくは希釈剤に添加することができる。グリセリンなどの等張剤が、既知の濃度で一般に使用される。好ましくは、生理学的に耐性の緩衝剤を添加して、改善されたｐＨ制御を提供する。製剤は、約ｐＨ４～約ｐＨ１０、及び好ましくは約ｐＨ５～約ｐＨ９の範囲、及び最も好ましくは約６．０～約８．０の範囲などの、広範囲のｐＨ範囲を被検者とすることができる。好ましくは、本発明の製剤は、約６．８～約７．８のｐＨを有する。好適な緩衝剤には、リン酸塩緩衝剤を含み、最も好ましくは、リン酸ナトリウム、特にリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。

【0142】

他の添加剤、例えばＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの、薬学的に許容できる可溶化剤、又はポリソルベート２０若しくは８０又はポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールなどの非イオン性界面活性剤、その他のブロックコポリマー、並びにＥＤＴＡ及びＥＧＴＡなどのキレート剤を製剤又は組成物に任意選択的に添加することで、凝集を低減させることができる。これらの添加物は、製剤を投与するためにポンプ又はプラスチック容器が使用される場合に特に有用である。医薬的に許容される界面活性剤の存在により、タンパク質が凝集する傾向が軽減される。

【0143】

本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体と、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール又はこれらの混合物からなる群から選択される保存剤と、を水性希釈剤中で混合することを含むプロセスにより調製することができる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体と保存剤との水性希釈剤中での混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な製剤を調製するために、例えば、緩衝溶液中の一定量の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、所望の濃度のタンパク質及び保存剤を提供するのに充分な量の緩衝溶液中で所望の保存剤と組み合わせる。本プロセスの変化形態は、当業者によって認識されるであろう。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。

【0144】

特許請求される製剤は、透明な溶液として、又は水、保存剤及び／若しくは賦形剤、好ましくはリン酸塩緩衝剤及び／若しくは生理食塩水、並びに選択された塩を水性希釈剤中に含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアル（dual vial）として患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とするデュアルバイアルはいずれも複数回再利用することができ、単一又は複数の患者処置サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な処置レジメンを提供することができる。

【0145】

特許請求される本製品は、即時から２４時間以上の期間にわたる投与に有用である。したがって、本発明により特許請求される製品は、患者に大きな利益を提供する。本発明の製剤は、任意選択的に、約２～約４０℃の温度で安全に保存することができ、タンパク質の生物学的活性を長期間保持することができ、したがって、包装ラベルで、溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、又は９６時間以上保持及び／又は使用し得ることを示すことができる。保存されている希釈剤を使用する場合には、このようなラベルは、最高１～１２か月、半年、１年半、及び／又は２年までの使用を含むことができる。

【0146】

本発明の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の溶液は、少なくとも１つの抗体を水性希釈剤中で混合することを含むプロセスにより調製することができる。混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な希釈剤を調製するために、例えば、水又は緩衝剤中の一定量の少なくとも１つの抗体を、所望の濃度のタンパク質、及び任意選択的に保存剤又は緩衝剤を提供するのに充分な量で組み合わせる。本プロセスの変化形態は、当業者によって認識されるであろう。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。

【0147】

特許請求される製品は、透明な溶液として、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とするデュアルバイアルはいずれも複数回再利用することができ、単一又は複数の患者処置サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な処置レジメンを提供する。

【0148】

特許請求される製品は、透明な溶液、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアルを、薬局、診療所、又はその他のかかる機関及び施設に提供することによって、患者に対し間接的に提供することができる。この場合の透明溶液は最高１リットル又は更にはそれ以上の容量であってもよく、この大きな容器からより少量の少なくとも１つの抗体溶液を１回又は複数回取り出してより小さなバイアルに移し、かつ薬局又は診療所により顧客及び／又は患者に提供できる。

【0149】

これらの単一バイアルシステムを含む承認済みデバイスとしては、Ｂ－Ｄ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）、ＮＯｖｏＰｅｎ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）、ＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ Ｐｅｎ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥＮ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）、ＢＩｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）、Ｒｅｃｏ－Ｐｅｎ、Ｈｕｍａｊｅｃｔ、Ｊ－ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ－Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ、Ｍｅｄｉ－Ｊｅｃｔなどの溶液を送達するためのペン型インジェクタデバイスが挙げられ、例えば、Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ），Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ－ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ），Ｍｅｄｉ－Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）より製造又は開発されたものである。併用バイアル系を含む承認済みデバイスとしては、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥＮ（登録商標）（ペン型インジェクタデバイス）などの、再構成した溶液を送達するためのカートリッジ内で凍結乾燥された薬物を再構成するためのペン型インジェクタシステムが挙げられる。

【0150】

ここで特許請求される製品は、包装材を含む。包装材は、規制当局によって必要とされる情報に加えて、製品を使用することができる条件を提供する。本発明の包装材は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を水性希釈剤で再構成して溶液を形成し、２～２４時間以上の期間にわたって、この溶液を湿式／乾式の２つのバイアル製品に使用する、という指示を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品の場合、ラベルは、この溶液が２～２４時間以上にわたって使用できることを示す。ここで特許請求される製品は、ヒト用医薬製品用途に有用である。

【0151】

本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体及び選択された緩衝剤、好ましくは生理食塩水又は選択された塩を含有するリン酸塩緩衝剤を混合することを含むプロセスにより調製することができる。少なくとも１つの抗体と緩衝剤との水性希釈剤中での混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な製剤を調製するために、例えば、水又は緩衝剤中の一定量の少なくとも１つの抗体を、所望の濃度のタンパク質及び緩衝剤を提供するのに充分な量の水中で所望の緩衝剤と組み合わせる。本プロセスの変化形態は、当業者によって認識されるであろう。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。

【0152】

特許請求される安定又は保存製剤は、透明な溶液として、又は水性希釈剤中に保存剤若しくは緩衝剤及び添加物を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とするデュアルバイアルはいずれも複数回再利用することができ、単一又は複数の患者処置サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な処置レジメンを提供する。

【0153】

本明細書に記載される安定若しくは保存製剤又は溶液のいずれかの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、当該技術分野において周知のように、ＳＣ若しくはＩＭ注射、経皮、経肺、経粘膜、埋め込み、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当業者により理解されるその他の手段などの種々の送達方法を介して、本発明に従って被検者に投与することができる。

【0154】

療法適用。本発明は、当該技術分野において既知である、又は本明細書に記載されるように、本発明の少なくとも１つの二重インテグリン抗体を使用して、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つのＴＮＦ関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。

【0155】

本発明は、肥満、免疫関連疾患、循環器疾患、感染症、悪性疾患又は神経学的疾患のうち少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つのＴＮＦ関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。

【0156】

本発明はまた、関節リウマチ、若年性、全身性発症若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ヴェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除修復術、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少性発熱、尿性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、アルコール性肝炎、慢性炎症性病変、サルコイドーシス、クローン病変、鎌状赤血球貧血症、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏性反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、じん麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の器官又は組織の移植片拒絶反応、腎移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植片拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、任意の器官又は組織の異種移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、抗受容体過剰反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介性細胞障害、ＩＩＩ型過敏症反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、及び皮膚症状症候群）、多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、皮膚症状症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、血管炎、ＭＩ後心臓切開術症候群、ＩＶ型過敏症、接触性皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植拒絶反応、細胞内生物による肉芽腫、薬物過敏、代謝性／特発性ウィルソン病、ヘマクロマトーシス、α－１－アンチトリプシン欠乏症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血食組織のリンパ組織球増多症、皮膚科学的状態、乾癬症、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ｏｋｔ３療法、抗ｃｄ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、無力症、貧血、悪液質などが挙げられるがこれらに限定されない）、慢性サリチル酸塩中毒などの少なくとも１つが挙げられるがそれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの免疫関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。例えば、「Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ」第１２版～第１７版、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２、１９７７、１９８２、１９８７、１９９２、１９９９）、「Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｗｅｌｌｓら編、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８、２０００）を参照されたく、それぞれは参照することにより全体が組み込まれる。

【0157】

本発明は、心機能不全症候群（cardiac stun syndrome）、心筋梗塞、うっ血性心不全、卒中、虚血発作、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、還流後症候群、心肺バイパス炎症応答、無秩序型又は多源性心房頻脈、規則的狭ＱＲＳ頻脈（regular narrow QRS tachycardia）、固有不整脈（specific arrhythmias）、心室細動、ヒス束不整脈（His bundle arrhythmias）、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾病、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈瘤及び末梢動脈瘤、大動脈切開、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管障害、閉塞性動脈障害、末梢アテローム性動脈硬化症、閉塞性血栓性血管炎、機能性末梢動脈障害、レイノー現象及び疾患、先端チアノーゼ、紅痛症、静脈性疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再灌流傷害、ポンプ後症候群（post pump syndrome）、虚血再灌流傷害などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における循環器疾患を調節又は処置するための方法も提供する。かかる方法は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に投与することを、任意選択的に含み得る。

【0158】

本発明は、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス及び真菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：ｈ７、溶血性尿毒症性症候群／塞栓性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、結核菌、マイコバクテリウム－アビウム－イントラセルラーレ、ニューモシスティスカリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、ａ型インフルエンザ、エプスタイン－バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者において少なくとも１つの感染症を調節又は処置するための方法も提供する。

【0159】

本発明は、白血病、急性白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸がん、膵臓がん、鼻咽頭がん、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺がん、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、がん関連骨吸収、がん関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの悪性疾患を調節又は処置するための方法も提供する。

【0160】

本発明は、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、エイズ痴呆症候群、脱髄疾患、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎、錐体外路及び小脳障害、例えば、皮質脊髄系の病変、大脳基底核の障害若しくは小脳障害、多動性運動障害、例えば、ハンチントン舞踏病及び老年性舞踏病、薬剤誘発性運動障害、例えば、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発されるもの、運動低下性運動障害、例えば、パーキンソン病、進行性核上麻痺、小脳の構造病変、脊髄小脳変性症、例えば、脊髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性症、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ－Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｉ－Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性疾患（レフスム病、無βリポタンパク血症、運動失調症、毛細血管拡張症、及びミトコンドリア多系統障害）、脱髄性コア障害（demyelinating core disorder）、例えば、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎及び運動単位の障害、例えば、神経性筋萎縮症（前角細胞変性症、例えば、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症）、アルツハイマー病、中年層のダウン症候群、びまん性レヴィー小体病、レヴィー小体型の老人性痴呆症、ウェルニッケコルサコフ症候群、慢性アルコール中毒、クロイツフェルト－ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン－スパッツ病、並びにボクサー認知症などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの神経学的疾患を調節又は処置するための方法も提供する。かかる方法は、任意選択的に、少なくとも１つのＴＮＦ抗体又は特定された部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、このような調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対し投与する工程を含むことができる。例えば、「Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ」第１６版、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）を参照のこと。

【0161】

本発明のいずれの方法も、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含み得る。かかる方法は、任意選択的に、かかる免疫疾患の処置のための同時投与又は併用療法を更に含み得、この少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又はその変異体の投与は、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、その融合タンパク質、又は低分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペナム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ－ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋麻痺薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つを投与する前に、同時に、及び／又は後に投与することを更に含む。好適な投与量は、技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）、「ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００」特別版、Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0162】

本発明の組成物、併用療法、同時投与、デバイス及び／又は方法（本発明の少なくとも１つの抗体、その特定された部分及びその変異体を更に含む）に好適なＴＮＦ拮抗薬は、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、及びＴＮＦに特異的に結合する受容体分子、ＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出、若しくは標的細胞に対するその作用を阻止及び／又は阻害する化合物、例えば、サリドマイド、テニダプ、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ペントキシフィリン及びロリプラム）、Ａ２ｂアデノシン受容体作動薬及びＡ２ｂアデノシン受容体エンハンサ、ＴＮＦ受容体シグナル伝達を阻止及び／又は阻害する化合物、例えば、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤、膜ＴＮＦ切断を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ＴＮＦ活性を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル）、並びにＴＮＦ生成及び／又は合成を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない。

【0163】

本明細書で使用されるとき、「腫瘍壊死因子抗体」、「ＴＮＦ抗体」、「ＴＮＦα抗体」又は「断片」などは、インビトロ、その場で、及び／又は好ましくはインビボで、ＴＮＦα活性を減少、遮断、阻害、抑止又は干渉する。例えば、本発明の好適なＴＮＦヒト抗体は、ＴＮＦαに結合することができ、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、及びＴＮＦαに特異的に結合する特定されたミュータント又はそのドメインを含む。好適なＴＮＦ抗体又は断片は、ＴＮＦ ＲＮＡ、ＤＮＡ、若しくはタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ生成及び／又は合成を、減少、遮断、抑止、干渉、阻止及び／又は阻害することもできる。

【0164】

キメラ抗体ｃＡ２は、Ａ２と呼ばれる高親和性中和マウス抗ヒトＴＮＦαＩｇＧ１抗体の抗原結合可変領域及びヒトＩｇＧ１のκ免疫グロブリンの定常領域からなる。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、同種の抗体のエフェクタ機能を改善し、循環血清半減期を増加させ、抗体の免疫原性を減少させる。キメラ抗体ｃＡ２の結合活性及びエピトープの特異性は、マウス抗体Ａ２の可変領域に由来する。特定の実施形態において、マウス抗体Ａ２の可変領域をコードする核酸の好ましい供給源は、Ａ２ハイブリドーマ細胞株である。

【0165】

キメラＡ２（ｃＡ２）は、天然及び組換えの両方のヒトＴＮＦαの細胞傷害性作用を用量依存的に中和する。キメラ抗体ｃＡ２と組換えヒトＴＮＦαとの結合アッセイから、キメラ抗体ｃＡ２の親和性定数は、１．０４×ｌ０^１０Ｍ^－１であると計算された。競合阻害によるモノクローナル抗体の特異性及び親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、「ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２～２０００）、Ｋｏｚｂｏｒら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ」４：７２～７９（１９８３）、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７～２０００）、及びＭｕｌｌｅｒ、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．」９２：５８９～６０１（１９８３）に見ることができ、これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0166】

特定の実施形態において、マウスモノクローナル抗体Ａ２は、ｃ１３４Ａと呼ばれる細胞株によって産生される。キメラ抗体ｃＡ２は、ｃ１６８Ａと呼ばれる細胞株によって産生される。

【0167】

本発明において使用することができるモノクローナル抗ＴＮＦ抗体の更なる例は、当該技術分野において記載されている（例えば、米国特許第５，２３１，０２４号、Ｍｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ」２（３）：１６２～１６９（１９９０）；米国出願第０７／９４３，８５２号（１９９２年９月１１日出願）、Ｒａｔｈｊｅｎら、国際公開第９１／０２０７８号（１９９１年２月２１日公開）、Ｒｕｂｉｎら、ＥＰＯ特許公開第０ ２１８ ８６８号（１９８７年４月２２日公開）、Ｙｏｎｅら、ＥＰＯ特許公開第０ ２８８ ０８８号（１９８８年１０月２６日）、Ｌｉａｎｇら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７：８４７～８５４（１９８６）、Ｍｅａｇｅｒら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６：３０５～３１１（１９８７）、Ｆｅｎｄｌｙら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６：３５９～３６９（１９８７）、Ｂｒｉｎｇｍａｎら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６：４８９～５０７（１９８７）及びＨｉｒａｉら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７～６２（１９８７）を参照のこと。これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。

【0168】

ＴＮＦ受容体分子。本発明に有用な好ましいＴＮＦ受容体分子は、ＴＮＦαに高い親和性で結合し（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎら、国際公開第９２／０７０７６号（１９９２年４月３０日公開）、Ｓｃｈａｌｌら、「Ｃｅｌｌ」６１：３６１～３７０（１９９０）、及びＬｏｅｔｓｃｈｅｒら、「Ｃｅｌｌ」６１：３５１～３５９（１９９０）を参照のこと。これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、任意選択的に低い免疫原性を有するものである。特に、５５ｋＤａ（ｐ５５ ＴＮＦ－Ｒ）及び７５ｋＤａ（ｐ７５ ＴＮＦ－Ｒ）のＴＮＦ細胞表面受容体は、本発明において有用である。受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその機能的部分を含むこれらの受容体の切断型（例えば、Ｃｏｒｃｏｒａｎら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２２３：８３１～８４０（１９９４）を参照のこと）も本発明において有用である。ＥＣＤを含むＴＮＦ受容体の切断型は、尿及び血清中で、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのＴＮＦα阻害結合タンパク質として検出されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６５：１５３１～１５３６（１９９０））。ＴＮＦ受容体多量体分子及びＴＮＦ免疫受容体融合分子、並びにそれらの誘導体及び断片又は部分は、本発明の方法及び組成物において有用であるＴＮＦ受容体分子の更なる例である。本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子は、症状の良好乃至優れた緩和及び低毒性で患者を長期間処置する能力を特徴とする。低い免疫原性及び／又は高い親和性並びにその他の未定義の特性は、得られる治療結果に寄与し得る。

【0169】

本発明において有用なＴＮＦ受容体多量体分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、１つ又は２つ以上のポリペプチドリンカ又はその他の非ペプチドリンカを介して連結された２つ以上のＴＮＦ受容体のＥＣＤの全て又は機能的部分を含む。多量体分子は、多量体分子の発現をもたらすための分泌タンパク質のシグナルペプチドを更に含むことができる。これらの多量体分子及びそれらの生成方法は、米国出願第０８／４３７，５３３号（１９９５年５月９日出願）に記載されており、その内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0170】

本発明の方法及び組成物において有用なＴＮＦ免疫受容体融合分子は、１つ又は２つ以上の免疫グロブリン分子の少なくとも１つの部分及び１つ又は２つ以上のＴＮＦ受容体の全て又は機能的部分を含む。これらの免疫受容体融合分子は、単量体又はヘテロ若しくはホモ多量体として集合させることができる。免疫受容体融合分子は、一価であっても多価であってもよい。かかるＴＮＦ免疫受容体融合分子の例は、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質である。ＴＮＦ免疫受容体融合分子及びそれらの生成方法は、当該技術分野において記載されている（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」２１：２８８３～２８８６（１９９１）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８８：１０５３５～１０５３９（１９９１）、Ｐｅｐｐｅｌら、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３～１４８９（１９９１）、Ｋｏｌｌｓら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９１：２１５～２１９（１９９４）、Ｂｕｔｌｅｒら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ」６（６）：６１６～６２３（１９９４）；Ｂａｋｅｒら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」２４：２０４０～２０４８（１９９４）、Ｂｅｕｔｌｅｒら、米国特許第５，４４７，８５１号及び米国出願第０８／４４２，１３３号（１９９５年５月１６日出願）、これらの参照文献の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。免疫受容体融合分子の生成方法は、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，１１６，９６４号、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，２２５，５３８号及びＣａｐｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」３３７：５２５～５３１（１９８９）にも見ることができ、これらの参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0171】

ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物、誘導体、断片、又は領域は、本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似するのに十分な大きさ及び配列のものである（例えば、ＴＮＦαに高い親和性で結合し、低い免疫原性を有する）、ＴＮＦ受容体分子の部分、又はＴＮＦ受容体分子をコード化するＴＮＦ受容体分子配列の部分を指す。ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物は又、本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似する（例えば、ＴＮＦαに高い親和性で結合し、低い免疫原性を有する）修飾されたＴＮＦ受容体分子も含む。例えば、ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物は「ＳＩＬＥＮＴ」コドン、又は１つ又は２つ以上のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加（例えば、１個の酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸の代わりに用いるか、又は同じ若しくは異なる疎水性アミノ酸をコードする１つのコドンを、疎水性アミノ酸をコードする別のコドンの代わりに用いる）を含有し得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７～２０００）を参照のこと。

【0172】

サイトカインは、いかなる既知のサイトカインも包含する。例えば、ＣｏｐｅｗｉｔｈＣｙｔｏｋｉｎｅｓ．ｃｏｍを参照されたい。サイトカイン拮抗薬としては、任意の抗体、断片若しくは模倣薬、任意の可溶性受容体、断片若しくは模倣薬、任意の低分子拮抗薬、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0173】

療法による治療。本発明の任意の方法は、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む組成物又は医薬組成物を投与することを含む、ＴＮＦ媒介障害を処置するための方法を含み得る。かかる方法は、任意選択的に、かかる免疫疾患の処置のための同時投与又は併用療法を更に含み得、この少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又はその変異体の投与は、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、その融合タンパク質、又は低分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペナム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ－ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋麻痺薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つを投与する前に、同時に、及び／又は後に投与することを更に含む。

【0174】

本明細書で使用するとき、用語「安全」は、それが本発明の抗ＴＮＦ抗体（例えば、抗ＴＮＦ抗体ゴリムマブ）による組成物、用量、投与レジメン、処置又は方法に関する場合、標準的なケア又は他の抗ＴＮＦ剤などの別の比較薬と比較した有害事象（adverse events、ＡＥ）及び重篤な有害事象（serious adverse events、ＳＡＥ）の許容可能な頻度及び／又は許容可能な重症度による、良好なリスク対利益比を指す。有害事象とは、医薬品を投与された患者における好ましくない医療上の出来事である。具体的には、本発明の抗ＴＮＦ抗体による組成物、用量、投与レジメン、処置又は方法に関する場合の安全は、例えば、注入反応、肝胆検査値異常、ＴＢを含む感染、及び悪性腫瘍を含む有害事象の許容可能な頻度及び／又は許容可能な重症度を指す。

【0175】

組成物、用量、処置レジメン、治療又は方法の文脈において本明細書で使用される場合、「有効」及び「効果的な」という用語は、本発明の抗ＴＮＦ抗体（例えば、抗ＴＮＦ抗体ゴリムマブ）による特定の組成物、用量、投与量、処置又は方法の有効性を指す。本発明の薬剤に応答した疾患の経過中の変化に基づいて、有効性を測定することができる。例えば、本発明の抗ＴＮＦ抗体は、処置されている障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標の改善、好ましくは持続的な改善を引き起こすのに充分な量及び時間で、患者に投与される。その処置の量及び時間が充分であるかどうかを判定するために、対象の疾病、疾患又は状態の程度を反映する様々な指標が評価され得る。このような指標には、例えば、疾患重篤度、症状、又は問題となっている障害の発現についての、臨床的に認識されている指標が含まれる。改善の程度は、一般に、医師又は他の適切にトレーニングされた個人によって決定され、彼らは臨床症状の改善を示す徴候、症状、生検、若しくは他の試験結果、又は疾患活動性の任意の他の尺度に基づいて決定し得る。例えば、本発明の抗ＴＮＦ抗体は、強直性脊椎炎（ＡＳ）に関連する患者の状態の改善を達成するために投与され得る。ＡＳに関連する患者の状態の改善は、例えば、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score、ＡＳＤＡＳ）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能指標（ＢＡＳＦＩ）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測指標（ＢＡＳＭＩ）、３６項目略式健康調査身体的健康度（ＳＦ－３６ ＰＣＳ）、３６項目略式健康調査精神的健康度（ＳＦ－３６ ＭＣＳ）、及び／又は強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）アンケートの結果を含む１つ又は２つ以上の基準を使用して評価することができる。ＡＳＤＡＳは、国際強直性脊椎炎評価学会によって開発された、ＡＳにおいて使用するための疾患活動性スコア（disease activity score、ＤＡＳ）である。ＡＳＤＡＳは、例えば、全背部痛、朝のこわばりの持続時間、末梢疼痛／腫脹、及び患者の総合評価を含む評価を有する式を使用して計算される。ＢＡＳＦＩは、１０個の質問の平均として表される対象の自己評価であり、このうちの８個は対象の機能的な解剖学に関し、このうちの２個は日常生活に対処する対象の能力に関する。ＢＡＳＭＩは、外側腰椎屈曲、耳珠－壁間距離、腰椎屈曲、果間距離、及び頸椎回転角度を含む５つの評価のスコアに評価を変換することによって計算される集計スコアである。ＳＦ－３６は、スコア化された８つのマルチアイテムスケールからなるアンケートであり、ＳＦ－３６ ＰＳＡ及びＳＦ－３６ ＭＣＳは、異なる疾患の相対的な負担及び異なる処置の相対的な利益の比較を可能にする、ＳＦ－３６から得られるサマリスコアである。ＡＳＱｏＬは、睡眠、気分、動機、対処能力、日常生活の活動、自主性、人間関係、及び社会生活に対する痛みの影響に関連する質問への回答を要求する１８項目からなる、自己管理患者報告転帰手段である。

【0176】

本明細書で使用するとき、特に断りがない限り、「臨床的に証明された」という用語（独立して、又は「安全（性）」及び／又は「有効（性）」という用語を修飾するために使用される。例えば、臨床的に安全性が証明された、及び／又は臨床的に有効性が証明された）は、米国食品医薬品局、ＥＭＥＡ、又は対応する国家規制機関の承認基準を満たしている臨床試験によって証明されていることを意味するものとする。例えば、臨床試験は、薬剤の効果を臨床的に証明するために使用される、適切なサイズの無作為化二重盲検試験であってもよい。

【0177】

典型的には、病態の処置は、組成物中に含有される比活性に応じ、平均して、合計、１回の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約０．０１～５００ミリグラムの範囲の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、好ましくは、単回又は複数回投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約０．１～１００ミリグラムの範囲の抗体の、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物の安全かつ有効な量又は投与量を投与することにより達成される。あるいは、有効な血清濃度は、単回又は複数回投与当たり、０．１～５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を含み得る。好適な投与量は、医療実践者には既知であり、当然のことながら、具体的な疾患状態、投与される組成物の比活性、及び処置を受けている具体的な患者に依存する。いくつかの場合では、望ましい治療量を達成するために、反復投与、すなわち特定の監視された用量又は計量された用量の反復個別投与を提供することが必要となる場合があり、この場合、個別投与は、所望の１日の投与量又は効果が得られるまで繰り返される。

【0178】

好ましい用量は、任意選択的に、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び／若しくは１００～５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値若しくは分画を含むか、あるいは単回若しくは複数回投与当たり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００及び／若しくは５０００μｇ／ｍＬの血清濃度、又はその任意の範囲、値若しくは分画を得るように含み得る。

【0179】

あるいは、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特徴並びにその投与方法及び経路、受容者の年齢、健康状態及び体重、症状の性質及び程度、同時治療の種類、処置頻度、並びに所望の作用などの周知の因子に応じて異なり得る。活性成分の投与量は、通常、体重１キログラム当たり約０．１～１００ミリグラムであり得る。通常、投与当たり１キログラム当たり０．１～５０、好ましくは０．１～１０ミリグラム又は徐放性形態が、望ましい結果を得るために有効である。

【0180】

非限定的な例として、ヒト又は動物の処置は、単回、注入又は反復投与を使用して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは又は追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１若しくは５２週目のうちの少なくとも１週に、あるいは又は追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０年目のうちの少なくとも１年に、又はこれらの任意の組み合わせで、１日当たり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇの、本発明の少なくとも１つの抗体の１回又は周期的な投与量として提供され得る。

【0181】

体内投与に好適な剤形（組成物）は、一般に、１単位又は容器当たり約０．１ミリグラム～約５００ミリグラムの活性成分を含有する。これらの医薬組成物において、活性成分は、組成物の総重量に基づいて、通常、約０．５～９９．９９９重量％の量で存在する。

【0182】

非経口投与には、抗体は、薬学的に許容できる非経口ビヒクルと合わせて、又は別途供給される、溶液、懸濁液、エマルジョン若しくは凍結乾燥粉末として、処方することができる。このような溶剤の実施例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び１～１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルを使用することもできる。溶剤又は凍結乾燥粉末は、等張性及び化学安定性を維持する添加剤（例えば、等張性に関しては塩化ナトリウム、マンニトール、化学安定性に関しては緩衝剤及び保存剤）を含有することができる。製剤は、周知の又は好適な技術によって滅菌される。

【0183】

好適な薬学的担体は、本分野での標準的参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版の中で記載されている。

【0184】

代替的投与。製薬学的に有効な量の、本発明による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を投与するために、本発明により、多くの既知の及び開発された投与方法を使用することができる。以下の記述では経肺投与が使用されているが、本発明に従って他の投与方式を使用して、好適な結果を得てもよい。

【0185】

本発明のＴＮＦ抗体は、担体中で、溶液、エマルジョン、コロイド若しくは懸濁液として、又は乾燥粉末として、吸入によるか、又は本明細書に記載される若しくは当該技術分野において既知である他の方法による投与に適した様々なデバイス及び方法のいずれかを使用して、送達することができる。

【0186】

非経口製剤及び投与。非経口投与用製剤は、一般的な添加物として滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物に由来する油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。注射用の水性又は油性懸濁液は、周知の方法に従って、適切な乳化剤又は加湿剤及び懸濁剤を使用することによって調製可能である。注射剤は、例えば、水溶液、無菌注射液、又は溶媒中懸濁液などの非毒性の非経口投与可能な希釈剤であってよい。使用可能な溶剤又は溶媒としては、水、リンゲル液、等張生理食塩水などが許容され、通常の溶媒又は懸濁溶媒としては、無菌の不揮発性油を使用することができる。これらの目的では、天然又は合成若しくは半合成の、脂肪油又は脂肪酸、天然又は合成若しくは半合成の、モノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを含む、あらゆる種類の不揮発性油及び脂肪酸を使用することができる。非経口投与は技術分野において周知であり、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているようなガス加圧式無針注射デバイス、及び米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているようなレーザ穿孔機デバイスが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0187】

代替的送達。本発明は更に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物は、非経口（皮下、筋肉内又は静脈内）又は任意のその他の投与、特に、液体溶液若しくは懸濁液の形態で使用するために、特に、クリーム及び座薬などであるがこれらに限定されない半固体形態で、膣若しくは直腸の投与における使用のために、錠剤若しくはカプセルなどであるがこれらに限定されない形態で、口腔若しくは舌下投与用に、あるいは粉末、点鼻剤若しくはエアロゾル、又はある特定の薬剤などであるがこれらに限定されない形態で、鼻腔内に、あるいは皮膚構造を改変するか、又は経皮パッチ中の薬物濃度を増加させるかのいずれかのために、ジメチルスルホキシドなどの化学的促進剤を用いて（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒら、Ｉｎ「Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」；Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．（編）、５９～９０（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への適用を可能にする酸化剤を用いて（国際公開第９８／５３８４７号）、又はエレクトロポレーションなどの一過性の輸送経路を作り出すための、若しくはイオントフォレシスなどの皮膚を通して荷電薬物の移動度を増加させるための電界の適用、又は超音波導入などの超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）を用いて、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液若しくはパッチ送達系などであるが、これらに限定されずに、経皮的に、調製することができる（上記の刊行物及び特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。

【0188】

経肺／鼻腔内投与。経肺投与のためには、好ましくは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物は、肺の下気道又は洞に達するのに有効な粒径で送達される。本発明により、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、吸入により治療薬を投与するための、当該技術分野において既知の様々な吸入又は鼻腔内デバイスのいずれかにより送達することができる。患者の洞腔又は肺胞内にエアロゾル化した製剤を被着させることができるこれらのデバイスとしては、定量吸入器、ネブライザ、乾燥粉末発生器、噴霧器などが挙げられる。抗体の経肺又は鼻腔内投与を目的とするのに適したその他のデバイスも、当該技術分野において既知である。かかるデバイスは全てエアロゾル中の抗体を分配するための投与に適した製剤を使用することができる。このようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成され得る。ＶＥＮＴＯＬＩＮ（登録商標）（定量吸入器）のような定量吸入器は、典型的には噴射ガスを使用し、吸気時の作動を必要とする（例えば、国際公開第９４／１６９７０号、国際公開第９８／３５８８８号を参照のこと）。Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、ＤＩＳＫＵＳ（登録商標）（吸入器）（Ｇｌａｘｏ）、ＳＰＩＲＯＳ（登録商標）（吸入器）（Ｄｕｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市販されているデバイス、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）パウダ吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）などの乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼気作動を使用する（米国特許第４６６８２１８号（Ａｓｔｒａ）、欧州特許第２３７５０７号（Ａｓｔｒａ）、国際公開第９７／２５０８６号（Ｇｌａｘｏ）、国際公開第９４／０８５５２号（Ｄｕｒａ）、米国特許第５４５８１３５号（Ｉｎｈａｌｅ）、国際公開第９４／０６４９８号（Ｆｉｓｏｎｓ）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＥＲＸ（登録商標）（ネブライザ）（Ａｒａｄｉｇｍ）、ＵＬＴＲＡＶＥＮＴ（登録商標）（ネブライザ）（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、及びＡｃｏｒｎ ＩＩネブライザ（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第５４０４８７１号（Ａｒａｄｉｇｍ）、国際公開第９７／２２３７６号）（上記の参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）のようなネブライザは、溶液からエアロゾルを生じる一方、計量吸入器、乾燥粉末吸入器などは、小粒子エアロゾルを発生させる。市販の吸入デバイスのこれらの具体例は、本発明の実施に適した特定のデバイスを代表するものとして意図されており、本発明の範囲を制限するものとして意図されているものではない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む組成物は、乾燥粉末吸入器又は噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入デバイスには、複数の望ましい特徴が存在する。例えば、吸入デバイスによる送達は、有利に信頼性が高く、再現可能であり、かつ正確である。吸入デバイスは任意選択的に、うまく呼吸できるように、例えば、約１０μｍ未満、好ましくは約１～５μｍの小さな乾燥粒子を送達することができる。

【0189】

スプレーでのＴＮＦ抗体組成物の投与。ＴＮＦ抗体組成物タンパク質を含むスプレーは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の懸濁液又は溶液に加圧下でノズルを通過させることにより生じさせることができる。ノズルの大きさ及び構成、適用される圧力並びに液体供給速度は、所望の出力及び粒径を達成するように選定することができる。例えば、キャピラリ又はノズルフィードと共に電界により電気スプレーを作製することができる。有利なことに、噴霧器により送達される少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍの範囲の粒径を有する。

【0190】

噴霧器で使用するのに適した少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の製剤は、典型的には、水溶液中に、例えば、０．１、０．２．、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｍＬ若しくは１００ｍｇ／ｇｍであるがこれらに限定されない、１ｍｌ若しくは１ｍｇ／ｇｍの溶液当たり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、又はその中の任意の範囲若しくは値の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の濃度で抗体組成物タンパク質を含む。この製剤は、添加物、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含み得る。この製剤は、添加物、還元剤、バルクタンパク質又は炭水化物などの抗体組成物タンパク質を安定化させるための賦形剤又は薬剤も含み得る。抗体組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質の処方において有用な典型的な炭水化物としては、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質製剤は、エアロゾル形成時の溶液の霧化により引き起こされる抗体組成物タンパク質の表面誘発性の凝集を低減又は阻止することができる界面活性剤も含み得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような様々な従来の界面活性剤を使用することができる。量は一般に、製剤の０．００１～１４重量％の範囲にわたる。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。ＴＮＦ抗体又は特定された部分若しくは変異体などのタンパク質の製剤には、当該技術分野において既知の更なる薬剤も又製剤中に含むことができる。

【0191】

ネブライザによるＴＮＦ抗体組成物の投与。抗体組成物タンパク質は、ジェットネブライザ又は超音波ネブライザなどのネブライザにより投与することができる。典型的には、ジェットネブライザでは、オリフィスを通して高速の空気ジェットを作り出すのに圧縮空気供給源を使用する。ガスがノズルを超えて膨脹する際に低圧領域が作り出され、それが液体リザーバに接続された毛細管を通して抗体組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体流は、それが管を出る際に不安定な糸状体及び液滴に剪断されてエアロゾルを作り出す。ある範囲の構成、流速及びバッフル型を、所定のジェットネブライザからの所望の性能の特徴を達成するのに使用することができる。超音波ネブライザにおいては、高周波電気エネルギーを使用して、典型的には圧電変換器を使用して、振動性の機械的エネルギーを作り出す。このエネルギーが、直接又はカップリング液を通じてのいずれかで抗体組成物タンパク質の製剤に伝播されて、抗体組成物タンパク質を含むエアロゾルを作り出す。有利なことに、ネブライザにより送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍの範囲の粒径を有する。

【0192】

ジェット又は超音波のいずれかのネブライザでの使用に適した少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の製剤は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体タンパク質の濃度を含む。この製剤は、添加物、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含み得る。この製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物などの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の安定化のための添加物又は薬剤も含み得る。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の処方において有用な典型的な炭水化物としては、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体製剤は、エアロゾル形成時に溶液の霧化により引き起こされる少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の表面誘発性の凝集を低減又は阻止し得る界面活性剤も含み得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビタル脂肪酸エステルのような様々な従来の界面活性剤を使用することができる。量は、一般に製剤の０．００１～４重量％の範囲である。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。抗体タンパク質などのタンパク質の製剤には、当該技術分野において既知の更なる薬剤も又製剤中に含むことができる。

【0193】

定量吸入器によるＴＮＦ抗体組成物の投与。定量吸入器（ＭＤＩ）では、噴射剤、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体及び任意の添加物又はその他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスタ内に収容される。絞り弁の作動により、好ましくは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～３μｍの範囲のサイズの粒子を含有するエアロゾルとしての混合物が放出される。ジェット粉砕、噴霧乾燥、臨界点凝結などを含む、当業者に既知の様々な方法により産生された抗体組成物タンパク質の製剤を用いることにより、所望のエアロゾル粒径を得ることができる。好ましい定量吸入器としては、３Ｍ又はＧｌａｘｏにより製造されかつヒドロフルオロカーボン噴射剤を使用するものが挙げられる。

【0194】

定量吸入器デバイスで使用するための少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の製剤は、一般に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、例えば、界面活性剤の助けを借りて噴射剤中に懸濁した非水性溶媒中の懸濁液として含有する微粉を含む。噴射剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２－テトラフルオロエタン、ＨＦＡ－１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン－１３４ａ）、ＨＦＡ－２２７（ヒドロフルオロアルカン－２２７）などが挙げられる、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又は炭化水素のような本目的上使用される任意の従来の物質であることができる。好ましくは、噴射剤はヒドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を噴射剤中の懸濁液として安定化させる、活性薬剤を化学的分解に対して保護するなどのために選択することができる。好適な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸などが挙げられる。場合によっては、エタノールなどの溶媒を使用する溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の製剤には、当該技術分野で既知の更なる薬剤を製剤中に含んでもよい。

【0195】

当業者は、本発明の方法が、本明細書に記載されないデバイスを介する少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物の経肺投与により達成され得ることを認識するであろう。

【0196】

経口製剤及び投与。経口のための製剤は、腸壁の浸透性を人工的に増加させるためのアジュバント（例えば、レゾルシノール、並びにポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤）の同時投与、並びに酵素的分解を阻害するための酵素阻害剤（例えば、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＦ）及びトラシロール）の同時投与による。経口投与のための固体型剤形の活性成分化合物は、ショ糖、乳糖、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドなどの、少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形はまた、他の種類の添加剤、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム）、パラベン、保存剤（ソルビン酸、アスコルビン酸、α－トコフェロールなど）、抗酸化剤（システインなど）、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、着香剤、香料などを含有し得る。

【0197】

錠剤及び丸剤は腸溶コーティング調製物に更に加工することができる。経口投与のための液体調製物には、医学的用途に許容できるエマルジョン、シロップ、エリキシル剤、懸濁剤及び溶液調製物が挙げられる。これらの調製物は、当該分野で通例に使用される不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。リポソームはインスリン及びヘパリンの薬物送達系としても記述されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。より最近では、混合アミノ酸の人工的ポリマーのミクロスフェア（プロテイノイド）が、医薬品を送達するために使用されている（米国特許第４，９２５，６７３号）。更に、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，５，８７１，７５３号に記載される担体化合物が、生物学的活性薬剤を経口で送達するのに使用されることは、当該技術分野において既知である。

【0198】

粘膜製剤及び投与。粘膜表面を通る吸収のため、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を投与するための組成物及び方法は、複数のサブミクロン粒子と、粘膜付着性巨大分子と、生物活性ペプチドと、エマルジョン粒子の粘膜付着を達成することにより粘膜表面を通る吸収を促進する水性連続相と、を含む、エマルジョンを含む（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明のエマルジョンの適用に適する粘膜表面には、角膜、結膜、口腔内、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、及び直腸投与経路を挙げることができる。膣又は直腸投与のための製剤、例えば座薬は、添加物として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオバターなどを含有し得る。鼻内投与のための処方は固体であってよく、添加物として、例えば乳糖を含有することができ、又は水性若しくは油性溶液の点鼻薬であることができる。口腔内投与のために、添加物として、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、αデンプン（pregelinatined starch）などが挙げられる（米国特許第５，８４９，６９５号）。

【0199】

経皮製剤及び投与。経皮投与のために、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、リポソーム若しくはポリマーナノ粒子、微小粒子、マイクロカプセル又はミクロスフェア（特に明示しない限り、集合的に微小粒子と称する）などの送達デバイス中にカプセル化する。ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマーなどのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物及びポリホスファゼンなどの合成ポリマー、並びにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン及びその他のタンパク質などの天然ポリマー、アルギン酸塩及びその他の多糖類並びにそれらの組み合わせから作製される微小粒子を含む多くの好適なデバイスが既知である（米国特許第５，８１４，５９９号）。

【0200】

長時間投与及び製剤。本発明の化合物を、単回投与により、長期間にわたり、例えば、１週～１年間、対象に送達することが時折望ましい場合がある。様々な徐放、デポー又は埋め込み剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液において溶解度が低い化合物の薬学的に許容できる非毒性塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ－又はジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの多塩基酸との酸付加塩、（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオン、又は例えば、Ｎ，Ｎ’－ジベンジル－エチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成された有機カチオンを有する塩、あるいは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含有し得る。加えて、本発明の化合物、又は好ましくは前述したものなどの比較的不溶性の塩を、注射に好適な、例えばゴマ油とともに、例えば、モノステアリン酸アルミニウムゲルなどのゲル中に処方することができる。とりわけ好ましい塩は、亜鉛塩、亜鉛タンニン酸塩、パモ酸塩などである。別の種類の注射用徐放デポー製剤は、例えば米国特許第３，７７３，９１９号に記載されるポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーなどのゆっくりと分解する非毒性の非抗原性ポリマー中にカプセル化されるために分散された化合物又は塩を含有する。化合物、又は好ましくは上述したものなどの比較的不溶性の塩は、特に動物での使用のために、コレステロールマトリックスのシラスティックペレット中に処方することもできる。更なる徐放デポー又は埋め込み製剤、例えば、ガス又は液体リポソームは、文献（米国特許第５，７７０，２２２号、及び「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）で既知である。

【0201】

本発明を全般的に記述したことから、同様物は、具体的説明として提供されるが制限することを意図していない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。

【0202】

実施例１：哺乳類細胞におけるＴＮＦ抗体のクローニング及び発現。
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１つのプロモータ要素、抗体コード配列、並びに転写の終結及び転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。付加的な要素には、エンハンサ、コザック配列並びにＲＮＡスプライシングのためのドナー及びアクセプタ部位に隣接している介在配列が含まれる。高効率の転写は、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモータ、レトロウイルス、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長末端反復（ＬＴＲＳ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモータで達成することができる。しかしながら、細胞要素を使用することもできる（例えば、ヒトアクチンプロモータ）。本発明の実施において使用するのに好適な発現ベクターとしては、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ若しくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／－）又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）並びにｐＢＣ１２ＭＩ （ＡＴＣＣ ６７１０９）などのベクターが挙げられる。使用することができる哺乳動物の宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１－３細胞、マウスＬ細胞及びチャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。

【0203】

あるいは、遺伝子を、染色体に組み込まれた遺伝子を含有する安定した細胞株において発現させることができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、又はハイグロマイシンなどの選択マーカとの共トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の特定及び単離を可能にする。

【0204】

トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコード化された抗体を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカは、目的の遺伝子の数百又は更には数千のコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」２２７：２７７～２７９（１９９１）、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１０：１６９～１７５（１９９２））。これらのマーカを使用して、哺乳動物細胞を選択的培地中で成長させ、最も高い耐性を有する細胞が選択される。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含有する。チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）及びＮＳＯ細胞が抗体の生成に使用されることが多い。

【0205】

発現ベクターｐＣ１及びｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強いプロモータ（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、「Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」５：４３８～４４７（１９８５））に加え、ＣＭＶエンハンサ（Ｂｏｓｈａｒｔら、「Ｃｅｌｌ」４１：５２１～５３０（１９８５））の断片を含有する。例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７ｌ８を伴う複数のクローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターは更に、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化及び終結シグナルを含有する。

【0206】

ＣＨＯ細胞におけるクローニング及び発現。ベクターｐＣ４は、ＴＮＦ抗体の発現に使用される。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２－ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモータの制御下でマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされる、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスタ卵巣細胞又はその他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択的培地（例えば、α－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で細胞を成長させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性の細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、充分に文書化されている（例えば、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５３：１３５７～１３７０（１９７８）、Ｊ．Ｌ．Ｈａｍｌｉｎ及びＣ．Ｍａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」１０９７：１０７～１４３（１９９０）、及びＭ．Ｊ．Ｐａｇｅ及びＭ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」９：６４～６８（１９９１）を参照のこと）。増大したＭＴＸ濃度において成長した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素であるＤＨＦＲの過剰生成により、薬物に対する耐性を発達させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合、通常、共増幅され、過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発することができることが、当該技術分野において知られている。続いて、メトトレキサートを回収する際、宿主細胞の１つ又は２つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞株が得られる。

【0207】

プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強いプロモータ（Ｃｕｌｌｅｎら、「Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」５：４３８～４４７（１９８５））に加え、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即初期遺伝子のエンハンサ（Ｂｏｓｈａｒｔら、「Ｃｅｌｌ」４１：５２１～５３０（１９８５））から単離された断片を含有する。プロモータの下流は、遺伝子の組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後に、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン及びポリアデニル化部位を含有する。他の高効率のプロモータ、例えば、ヒトβアクチンプロモータ、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモータ、又は他のレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩからの長末端反復も発現のために使用することができる。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ－Ｏｆｆ及びＴｅｔ－Ｏｎ遺伝子発現系、並びに類似の系を使用して、哺乳類細胞において調節された方法で、ＴＮＦを発現させることができる（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ及びＨ．Ｂｕｊａｒｄ、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８９：５５４７～５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン又はグロビン遺伝子からの他のシグナルも使用することができる。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定した細胞株は、ｇｐｔ、Ｇ４１８又はハイグロマイシンなどの選択マーカとの共トランスフェクションの際に選択することもできる。最初に１つを超える選択マーカ、例えばＧ４１８、に加えてメトトレキサートを使用するのが有利である。

【0208】

このプラスミドｐＣ４を制限酵素で消化した後に、当該技術分野において既知の手順により、子ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次に、ベクターは１％アガロースゲルから単離される。

【0209】

次に、単離された可変及び定常領域コードＤＮＡ及び脱リン酸化ベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次に、大腸菌ＨＢ１０１又はＸＬ－１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、例えば、制限酵素分析を使用して、プラスミドｐＣ４に挿入された断片を含有する細菌を特定する。

【0210】

トランスフェクションには、活性ＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているチャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞が使用される。５μｇの発現プラスミドｐＣ４は、リポフェクチンを使用して、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２－ｎｅｏで共トランスフェクトされる。プラスミドｐＳＶ２－ｎｅｏは、優性の選択マーカである、Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対して耐性を付与する酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。１μｇ／ｍＬのＧ４１８で補充したαマイナスＭＥＭに細胞を播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の、１０、２５、又は５０ｎｇ／ｍＬのメトトレキサート＋１μｇ／ｍＬのＧ４１８で補充したαマイナスＭＥＭに播種する。約１０～１４日後、単一クローンをトリプシン処理した後、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウェルペトリ皿又は１０ｍＬフラスコに播種する。次に、最高濃度のメトトレキサートで成長させているクローンを、更に高い濃度のメトトレキサート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新しい６ウェルプレートに移す。１００～２００ｍＭの濃度で成長するクローンが得られるまで同じ手順を繰り返す。所望の遺伝子生成物の発現は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、又は逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。

【0211】

実施例２：トランスジェニックマウスを使用する、ヒトＴＮＦと反応する高親和性ヒトＩｇＧモノクローナル抗体の生成。
概要。ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを使用して、１つ又は２つ以上のＴＮＦ媒介性疾患の処置のための、ＴＮＦ作用を阻害するために治療的に使用することができる高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体を生成する。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７／ＢＬ６／Ｊ）Ｆ_２ハイブリッドマウスをヒト組換えＴＮＦで免疫する（Ｔａｙｌｏｒら、「Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」６：５７９～５９１（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」３６８：８５６～８５９（１９９４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．」１４：８２６（１９９６）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：８４５～８５１（１９９６））。いくつかの融合物が完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体の１つ又は２つ以上のパネルを生み出した。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。全てはＩｇＧ１κである。かかる抗体は、およそ１×１０^９～９×１０^１２の親和性定数を有することが分かっている。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ関連疾患、病態、又は障害における治療用途のための好適な候補となる。

【0212】

略語。ＢＳＡ－ウシ血清アルブミン、ＣＯ_２－二酸化炭素、ＤＭＳＯ－ジメチルスルホキシド、ＥＩＡ－酵素イムノアッセイ、ＦＢＳ－ウシ胎児血清、Ｈ_２Ｏ_２－過酸化水素、ＨＲＰ－西洋わさびペルオキシダーゼ、ＩＤ－皮内、Ｉｇ－免疫グロブリン、ＴＮＦ－組織壊死因子α、ＩＰ－腹腔内、ＩＶ－静脈内、Ｍａｂ－モノクローナル抗体、ＯＤ－光学密度、ＯＰＤ －ｏフェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＥＧ－ポリエチレングリコール、ＰＳＡ－ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ＲＴ－室温、ＳＱ－皮下、ｖ／ｖ－単位容量当たりの容量、ｗ／ｖ－単位容量当たりの重量。

【0213】

材料及び方法
動物。ヒト抗体を発現し得るトランスジェニックマウスは、当該技術分野において既知であり、（例えば、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡなどから）市販されており、これはヒト免疫グロブリンを発現するが、マウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しない。例えば、かかるトランスジェニックマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞変異を受けてヒト配列免疫グロブリンのレパートリを生成する、ヒト配列導入遺伝子を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」３６８：８５６～８５９（１９９４））。軽鎖導入遺伝子は、例えば、部分的に、生殖系列ヒトＶκ領域のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来し得る。加えて、重鎖導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１の両方（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：８４５～８５１（１９９６））並びに／又はγ３定常領域をコードすることができる。適切なゲノトピック系統由来のマウスを免疫化及び融合プロセスにおいて使用して、ＴＮＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成することができる。

【0214】

免疫付与。１つ又は２つ以上の免疫付与スケジュールは、抗ＴＮＦヒトハイブリドーマを生成するために使用することができる。以下の例示的な免疫付与プロトコルに従って、最初のいくつかの融合を行うことができるが、他の類似の既知のプロトコルを使用することもできる。数匹の１４～２０週齢の雌及び／又は外科的に去勢した雄のトランスジェニックマウスに対して、最終容量１００～４００μＬ（例えば、２００）で等量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は完全フロイントアジュバントで乳化した１～１０００μｇの組換えヒトＴＮＦをＩＰ又はＩＤに接種する。各マウスは、任意選択的に、２ＳＱ部位の各々に１００μＬの生理学的生理食塩水中１～１０μｇを受けることもできる。その後、マウスは、１～７、５～１２、１０～１８、１７～２５及び／又は２１～３４日後にＩＰ（１～４００μｇ）及びＳＱ（１～４００μｇｘ２）により等量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は完全フロイントアジュバントで乳化したＴＮＦで、免疫化され得る。抗凝固薬無しで１２～２５及び２５～４０日後に眼窩後方穿刺によりマウスを出血させることができる。次に、血液を室温で１時間凝固させ、血清を回収し、既知の方法によりＴＮＦ ＥＩＡアッセイを使用して滴定する。反復注射が力価の増加を生じなければ、融合を行う。その際、マウスに、１００μＬの生理学的生理食塩水に希釈した１～４００μｇのＴＮＦの最終ＩＶブースタ注射を与えることができる。３日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に除去し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を含有する、１０ｍＬの冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬することができる。ＰＳＡ－ＰＢＳで脾臓を無菌灌流することにより、脾細胞を採取する。細胞を冷ＰＳＡ－ＰＢＳ中で１回洗浄し、トリパンブルー染料排除を使用して計数し、２５ｍＭヘペスを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁する。

【0215】

細胞融合。既知の、例えば、当該技術分野で従来の方法に従い、１：１～１：１０のマウス骨髄腫細胞対生脾臓細胞比率で融合を行うことができる。非限定的な例として、脾臓細胞及び骨髄腫細胞は一緒にペレット化することができる。次に、３０秒かけてペレットを３７℃でゆっくり１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量１，４５０、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁することができる。その後、１分かけて２５ｍＭヘペスを含有する１０．５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地（３７℃）をゆっくり添加することによって、融合を停止させることができる。融合細胞を５分間５００～１５００ｒｐｍで遠心分離する。その後、細胞をＨＡＴ培地（２５ｍＭヘペス、１０％胎児クローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２．５％Ｏｒｉｇｅｎ培養サプリメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、１０％６５３調整ＲＰＭＩ１６４０／ヘペス培地、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地）に再懸濁した後、１５の９６ウェル平底組織培養プレートに２００μＬ／ウェルで平板培養する。次に、７～１０日間、５％ＣＯ_２及び９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベータにプレートを配置する。

【0216】

マウス血清におけるヒトＩｇＧ抗ＴＮＦ抗体の検出。固相ＥＩＡを使用して、ヒトＴＮＦに特異的なヒトＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングすることができる。簡潔に、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのＴＮＦで一晩プレートをコーティングすることができる。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１５Ｍ生理食塩水で洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間遮断することができる。プレートは、直ちに使用するか、又は後に使用するために－２０℃で凍結する。マウス血清希釈物を、５０μＬ／ウェルでＴＮＦコーティングしたプレート上で、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：３０，０００で希釈したＦｃ特異的な５０μＬ／ウェルＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧにより、室温で１時間プローブする。プレートを再度洗浄することができ、１００μＬ／ウェルのクエン酸塩－リン酸塩基質溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％ Ｈ_２Ｏ_２及び１ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ）を１５分かけて室温で添加する。次に、２５μＬ／ウェルで反応停止溶液（４Ｎ硫酸）を添加し、自動プレート分光光度計により４９０ｎｍでＯＤを読み取る。

【0217】

ハイブリドーマ上清における完全ヒト免疫グロブリンの検出。好適なＥＩＡを使用して、完全ヒト免疫グロブリンを分泌する成長陽性ハイブリドーマを検出することができる。簡潔に、９６ウェルのポップアウトプレート（ＶＷＲ、６１０７４４）を、４℃で一晩、炭酸ナトリウム緩衝剤中１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃでコーティングすることができる。プレートを洗浄し、３７℃で１時間、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで遮断し、直ちに使用するか、又は－２０℃で凍結する。未希釈ハイブリドーマ上清を、プレート上で、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：１０，０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトκにより、３７℃で１時間プローブする。次に、上述のように、プレートを基質溶液と共にインキュベートする。

【0218】

完全ヒト抗ＴＮＦ反応性の決定。上記のハイブリドーマは、好適なＲＩＡ又は他のアッセイを使用してＴＮＦに対する反応性について同時にアッセイすることができる。例えば、上記のように、上清をヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃプレート上でインキュベートし、洗浄した後、室温で１時間、ウェル当たり適切な計数で、放射線標識されたＴＮＦでプローブする。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、好適な計数器を使用して、結合した放射線標識されたＴＮＦを定量化する。

【0219】

ヒトＩｇＧ１κ抗ＴＮＦ分泌ハイブリドーマを細胞培養において拡張し、限定希釈により系列的にサブクローニングすることができる。結果として得られたクローン集団を拡張し、凍結培地（９５％ＦＢＳ、５％ＤＭＳＯ）中で凍結保存し、液体窒素中で保管する。

【0220】

アイソタイプ。抗体のアイソタイプの決定は、特定の滴定に対するマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されたものと類似の形式のＥＩＡを使用して達成することができる。上述のように９６ウェルプレート上にＴＮＦをコーティングすることができ、２μｇ／ｍＬの精製された抗体を、室温で１時間、プレート上でインキュベートすることができる。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：４０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ_１又はＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ_３で、室温で１時間プローブする。プレートを再度洗浄し、上述のように基質溶液と共にインキュベートする。

【0221】

ヒトＴＮＦによるヒト抗ヒトＴＮＦ抗体の結合動力学。抗体の結合特徴は、例えば、ＴＮＦ捕捉ＥＩＡ及びＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用して好適に評価することができる。精製されたヒトＴＮＦ抗体の段階的濃度は、上述のように、アッセイにおいて、２μｇ／ｍＬのＴＮＦでコーティングされたＥＩＡプレートへの結合について評価することができる。その後、相対結合効率を示す片対数プロットとしてＯＤを表すことができる。

【0222】

定量的結合定数は、例えば、以下のように、又は任意のその他の既知の好適な方法によって得ることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ－５（カルボキシメチル）チップをＢＩＡｃｏｒｅ ２０００ユニットに配置する。ＨＢＳ緩衝剤（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ Ｐ２０界面活性剤、ｐＨ７．４）を、安定したベースラインが得られるまで、５μｌ／分でチップのフローセル上に流す。２００μＬの水中１５ｍｇのＥＤＣ（Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチル－アミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩）の溶液（１００μＬ）を、２００μＬの水中２．３ｍｇのＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド）の１００μＬの溶液に添加する。結果として得られた溶液の４０μＬをチップ上に注入する。６μＬのヒトＴＮＦの溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中１５μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．８）をチップ上に注入し、約５００ＲＵの増加をもたらす。緩衝剤をＴＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ／ＢＳＡ泳動緩衝剤（２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５％トリトンＸ－１００、２５μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に変更し、一晩チップ上に流してそれを平衡化し、全ての未反応のコハク酸エステルを加水分解又はキャップする。

【0223】

３３．３３、１６．６７、８．３３、及び４．１７ｎＭで泳動緩衝剤中に抗体を溶解する。流量を３０μＬ／分に調整し、器具の温度を２５℃に調整する。１つはＴＮＦが固定化され（試料）、２つ目は非誘導化フローセル（ブランク）である、２つのフローセルを動態実行に使用する。各抗体濃度を１２０μＬ、フローセル上に３０μＬ／分で注入し（会合相）、続いて３６０秒間連続して緩衝剤を流す（解離相）。各３０μＬの２Ｍチオシアン酸グアニジンを２回順次注入することにより、チップの表面を再生する（組織壊死因子α／抗体複合体の解離）。

【0224】

データの分析は、当該技術分野において既知であるＢＩＡ評価３．０又はＣＬＡＭＰ２．０を使用して行われる。各抗体濃度について、ブランクセンソグラムを試料センソグラムから減ずる。解離（ｋ_ｄ，ｓｅｃ^－１）及び会合（ｋ_ａ，ｍｏｌ^－１ ｓｅｃ^－１）の両方についてグローバルフィットを行い、解離定数（Ｋ_Ｄ，ｍｏｌ）を算出する（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）。抗体親和性が充分に高いため、捕捉された抗体のＲＵが＞１００である場合、抗体の追加希釈が実行される。

【0225】

結果と考察
抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体の生成。いくつかの融合を行い、ヒトＴＮＦに特異的な数十の抗体を生み出す各融合物を１５のプレート（１４４０ウェル／融合物）に播種する。これらのうち、いくつかは、ヒト及びマウスＩｇ鎖の組み合わせからなることが分かる。残りのハイブリドーマは、ヒト重鎖及び軽鎖のみからなる抗ＴＮＦ抗体を分泌（ｓｅｃｒｅｔ）する。ヒトハイブリドーマの全てがＩｇＧ１κであることが予想される。

【0226】

ヒト抗ヒトＴＮＦ抗体の結合動力学。ＥＬＩＳＡ分析は、これらのハイブリドーマのほとんど又は全てからの精製された抗体が、濃度依存的にＴＮＦに結合することを確認する。図１～図２は、これらの抗体の相対的結合効率の結果を示す。この場合、抗体のその同族抗原（エピトープ）に対する結合活性度を測定する。ＴＮＦを直接ＥＩＡプレートに結合すると、タンパク質の変性を引き起こし得、見かけ上の結合親和性は、未変性タンパク質への結合を反映することができないことに留意するべきである。５０パーセントの結合が広範な濃度にわたって見られる。

【0227】

定量的結合定数はヒト抗体のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して得られ、ヒトモノクローナル抗体のいくつかが１×１０^－９～７×１０^－１２の範囲のＫ_Ｄを有して非常に高い親和性であることを明らかにする。

【0228】

結論
いくつかの融合は、ヒトＴＮＦで免疫化されるヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われる。ＩｇＧ１κアイソタイプのいくつかの完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体のセットを生成する。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。生成された抗体のうちのいくつかは、１×１０^９～９×１０^１２の親和性定数を有する。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ依存疾患、病態又は関連状態における治療用途に好適なものとなる。

【0229】

実施例３：ヒトＴＮＦαに反応性のヒトＩｇＧモノクローナル抗体の生成。
概要。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｆ_２ハイブリッドマウス（１～４）を組換えヒトＴＮＦαで免疫化した。ＧｅｎＴＮＶと命名された１つの融合が、固定化された組換えヒトＴＮＦαに結合する完全ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体を８つ生み出した。特定直後、８つの細胞株は、更に特徴付けするためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに譲渡された。これらＭａｂは配列が完全にヒトであるため、それらはヒトにおけるｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）よりも免疫原性が低いと予想される。

【0230】

略語。ＢＳＡ－ウシ血清アルブミン、ＣＯ_２－二酸化炭素、ＤＭＳＯ－ジメチルスルホキシド、ＥＩＡ－酵素イムノアッセイ、ＦＢＳ－ウシ胎児血清、Ｈ_２Ｏ_２－過酸化水素、ＨＣ－重鎖、ＨＲＰ－西洋わさびペルオキシダーゼ、ＩＤ－皮内、Ｉｇ－免疫グロブリン、ＴＮＦ－組織壊死因子α、ＩＰ－腹腔内、ＩＶ－静脈内、Ｍａｂ－モノクローナル抗体、ＯＤ－光学密度、ＯＰＤ－ｏフェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＥＧ－ポリエチレングリコール、ＰＳＡ－ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ＲＴ－室温、ＳＱ－皮下、ＴＮＦα－腫瘍壊死因子α、ｖ／ｖ－単位容量当たりの容量、ｗ／ｖ－単位容量当たりの重量。

【0231】

序論。ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを利用して、組換えヒトＴＮＦαに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を生成した。ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）は、血清半減期が増加し、免疫原性に関する副作用が減少する利益を有して、ＴＮＦα媒介性疾患に関与する炎症性プロセスを治療的に阻害するために使用されるため、これらの固有の抗体を使用することができると期待される。

【0232】

材料及び方法
動物。ヒト免疫グロブリンを発現するが、マウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しないトランスジェニックマウスは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより開発されてきた。これらのマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞変異を受けて抗原特異的ヒト免疫グロブリン（１）のレパートリを生成する、機能性ヒト抗体導入遺伝子を含有する。軽鎖導入遺伝子は、部分的に、生殖系列ヒトＶ遺伝子座のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来する。いくつかのＶＨ遺伝子に加えて、重鎖（ＨＣ）導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１（２）、並びに／又はγ３定常領域の両方をコードする。本明細書に記載されるモノクローナル抗体を生成するための免疫付与及び融合プロセスにおいて、ＨＣｏ１２／ＫＣｏ５遺伝子型系統由来のマウスを使用した。

【0233】

ヒトＴＮＦαの精製。セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結されたＴＮＦα受容体－Ｆｃ融合タンパク質（ｐ５５－ｓｆ２）（５）を充填したカラムを使用して、アフィニティクロマトグラフィにより、ヒトＴＮＦαを、Ｃ２３７Ａ細胞からの組織培養上清から精製した。細胞上清を、その容量の９分の１の１０ｘＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）と混合し、４ｍＬ／分で、４℃でカラムを通過させた。次に、ＰＢＳでカラムを洗浄し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５でＴＮＦαを溶出し、２ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和した。精製されたＴＮＦαは、１０ｍＭトリス、０．１２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５に緩衝剤交換され、０．２ｕｍのシリンジフィルタを通して濾過された。

【0234】

免疫付与。およそ１６週齢の雌のＧｅｎＰｈａｒｍマウスを、０、１２及び２８日目に等量のＴｉｔｅｒｍａｘアジュバントで乳化した合計１００μｇのＴＮＦα（ロットＪＧ１０２２９８又はＪＧ１０２０９８）で、ＩＰ（２００μＬ）及びＩＤ（尾の付け根にて１００μＬ）により免疫化した。抗凝固薬無しで２１及び３５日目に眼窩後方穿刺によりマウスを出血させた。血液を室温で１時間凝固させ、血清を回収し、ＴＮＦα固相ＥＩＡアッセイを使用して滴定した。２８日目の注射後、マウスを７週間休ませた後に、ＧｅｎＴＮＶと命名された融合を行った。その後、ＴＮＦαに対して１：１６０の特定のヒトＩｇＧ力価を有するマウスに、１００μＬの生理学的生理食塩水で希釈した５０μｇのＴＮＦαの最終ＩＶブースタ注射を与えた。３日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に除去し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を含有する、１０ｍＬの冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬した。ＰＳＡ－ＰＢＳで脾臓を無菌灌流することにより、脾細胞を採取した。細胞を冷ＰＳＡ－ＰＢＳ中で１回洗浄し、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器を使用して計数し、２５ｍＭヘペスを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。

【0235】

細胞株。Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＢＳ）グループは、９７年５月１４日に、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ’ｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔグループから非分泌マウス骨髄腫融合パートナー６５３を受け取った。細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（全てＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で補充したＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で拡張し、９５％ＦＢＳ及び５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結保存した後、ＣＢＳの蒸気相液体窒素冷凍庫に保管した。細胞バンクは無菌であり（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ）、マイコプラズマ（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がなかった。細胞は融合まで対数増殖期培養物内で維持された。融合前に、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、トリパンブルー染料排除により生存率を決定した（＞９５％）。

【0236】

ヒトＴＮＦαは、組換え細胞株により産生され、Ｃ２３７Ａと命名され、ＣｅｎｔｏｃｏｒのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙで産生された。細胞株を、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｓ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（全てＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）及び０．５：ｇ／ｍＬのマイコフェノール酸で補充したＩＭＤＭ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で拡張し、９５％ＦＢＳ及び５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結保存した後、ＣＢＳ（１３）の蒸気相液体窒素冷凍庫に保管した。細胞バンクは無菌であり（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ）、マイコプラズマ（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がなかった。

【0237】

細胞融合。細胞融合は、１：１の比率の６５３マウス骨髄腫細胞及びマウス生脾臓細胞を使用して行った。簡潔に、脾臓細胞及び骨髄腫細胞を一緒にペレット化した。３０秒間かけてペレットを３７℃でゆっくり１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量１，４５０ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。１分かけて１０．５ｍＬのＲＰＭＩ培地（添加剤無し）（ＪＲＨ）（３７℃）をゆっくり添加することにより、融合を停止させた。融合細胞を５分間７５０ｒｐｍで遠心分離した。その後、細胞をＨＡＴ培地（１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２．５％Ｏｒｉｇｅｎ培養サプリメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１％ ６５３調整ＲＰＭＩ培地、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含有するＲＰＭＩ／ＨＥＰＥＳ培地）に再懸濁した後、５つの９６ウェル平底組織培養プレートを２００μＬ／ウェルで平板培養した。次に、７～１０日間、５％ＣＯ_２及び９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベータにプレートを配置した。

【0238】

マウス血清におけるヒトＩｇＧ抗ＴＮＦα抗体の検出。固相ＥＩＡを使用して、ヒトＴＮＦαに特異的なヒトＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングした。簡潔に、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＴＮＦαで一晩プレートをコーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１５Ｍ生理食塩水で洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間遮断した。プレートは、直ちに使用するか、又は後に使用するために－２０℃で凍結されるかのいずれかにした。マウス血清を、５０μＬ／ウェルで、室温で１時間、２倍階段希釈法で、ヒトＴＮＦαコーティングされたプレート上でインキュベートした。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：３０，０００で希釈したＦｃ特異的（Ａｃｃｕｒａｔｅ）な５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧにより、室温で１時間プローブする。プレートを再度洗浄し、１００μＬ／ウェルのクエン酸塩－リン酸塩基質溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％ Ｈ_２Ｏ_２及び１ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ）を１５分かけて室温で添加した。次いで、２５μＬ／ウェルで反応停止溶液（４Ｎ硫酸）を添加し、自動プレート分光光度計を使用して４９０ｎｍでＯＤを読み取った。

【0239】

ハイブリドーマ上清における完全ヒト免疫グロブリンの検出。ＧｅｎＰｈａｒｍマウスは、マウス及びヒト免疫グロブリン鎖の両方を生成することができるため、２つの別個のＥＩＡアッセイを使用して、ヒト軽鎖及びヒト重鎖の両方の存在について成長陽性ハイブリドーマクローンを試験した。プレートを上述のようにコーティングし、未希釈のハイブリドーマ上清を３７℃で１時間、プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、３７℃で１時間、１％ ＢＳＡ－ＨＢＳＳ中で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体、又は１％ ＢＳＡ－ＨＢＳＳ中で１：３０，０００に希釈したＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体のいずれかでプローブした。次に、上述のように、プレートを基質溶液と共にインキュベートした。抗ヒトκ及び抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＥＩＡ形式の両方で陽性シグナルをもたらさなかったハイブリドーマクローンは廃棄された。

【0240】

アイソタイプ。抗体のアイソタイプの決定は、特定の力価に対するマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されたものと類似の形式のＥＩＡを使用して達成した。４ＥＣで一晩、炭酸ナトリウム緩衝剤中１０：ｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）でＥＩＡプレートをコーティングし、上述のように遮断した。２４ウェル培養物からの希釈無しの上清を、室温で１時間、プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：４０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）で、室温で１時間プローブした。プレートを再度洗浄し、上述のように基質溶液と共にインキュベートした。

【0241】

結果及び考察。完全ヒト抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体の生成。組換えヒトＴＮＦαタンパク質で免疫化されたＧｅｎＰｈａｒｍマウスから、ＧｅｎＴＮＶと命名された融合を１回行った。この融合から、１９６の成長陽性ハイブリッドがスクリーニングされた。ヒトＴＮＦαと反応性の完全ヒトＩｇＧ抗体を分泌した８つのハイブリドーマ細胞株を特定した。これらの８つの細胞株はそれぞれ、ヒトＩｇＧ１κアイソタイプの免疫グロブリンを分泌し、限界希釈により全てを２回サブクローニングして、安定した細胞株を得た（＞９０％均質）。細胞株名及びそれぞれのＣコード表記を表１に列挙する。細胞株の各々は、液体窒素中に保管された１２－バイアル研究細胞バンクにおいて凍結された。

【0242】

８つの細胞株の各々の２４ウェル培養皿のウェルから回収した親細胞は、トランスフェクション及び更なる特徴付けのために、１９９９年２月１８日にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙグループに引き渡された。

【0243】

【表2】

【0244】

結論
ＧｅｎＴＮＶ融合は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒで調製された組換えヒトＴＮＦαで免疫化されたヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われた。ＩｇＧ１κアイソタイプの８つの完全ヒトＴＮＦα反応性ＩｇＧモノクローナル抗体を生成した。更なる特徴付け及び開発のために、親細胞株をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙグループに移した。これらの新しいヒト抗体のうちの１つは、Ｒｅｍｉｃａｄｅと比較して、免疫原性及びアレルギー型合併症が減少する利益の可能性を有して、抗炎症に有用であり得る。

【0245】

参考文献
Ｔａｙｌｏｒら、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 ６：５７９－５９１ （１９９３）。
Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」 ３６８：８５６－８５９ （１９９４）。
Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」 １４：８２６ （１９９６）。
Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」 １４：８４５－８５１ （１９９６）。
Ｓｃａｌｌｏｎら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ」 ７：７５９－７７０ （１９９５）。

【0246】

実施例４：ヒト抗ＴＮＦα抗体を発現する細胞株のクローニング及び調製。
概要。ＴＮＶ表記の８つのヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルは、明らかに高結合活性で固定化されたヒトＴＮＦαに結合することが認められた。８つのｍＡｂのうちの７つは、組換えＴＮＦ受容体へのヒトＴＮＦαの結合を効率的に遮断することを示した。７つのｍＡｂをコードするＤＮＡの配列分析は、全てのｍＡｂがヒトＶ領域を有していることを確認した。ＤＮＡ配列は、３対のｍＡｂが互いに同一であり、そのため８つのｍＡｂの元のパネルがＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６で表される４つの別個のｍＡｂのみを含有していることも明らかにした。ｍＡｂの推定アミノ酸配列の分析及びインビトロＴＮＦα中和データの結果に基づいて、ｍＡｂ ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４を更なる試験のために選択した。

【0247】

ＴＮＶ１４８重鎖の位置７５（フレームワーク３）のプロリン残基がデータベース検索中同じサブグループの他のヒト抗体のその位置に見られなかったため、それを既知の生殖系列フレームワークｅ配列と一致させるために、部位特異的ＤＮＡ変異誘発を行って、その位置にセリン残基をコード化した。セリン修飾ｍＡｂはＴＮＶ１４８Ｂと表記された。ＴＮＶ１４８Ｂ及びＴＮＶ１４の重鎖及び軽鎖可変領域をコード化するＰＣＲ増幅ＤＮＡを、別のヒトｍＡｂ（１２Ｂ７５）の最近クローニングされた重鎖及び軽鎖遺伝子に基づいた（国際公開第０２／１２５００号として公開された、「ＩＬ－１２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ」と題される、２０００年１０月７日出願の米国特許出願第６０／２３６，８２７号、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、新しく調製した発現ベクター内にクローニングした。

【0248】

Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）細胞又はＳｐ２／０－Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）マウス骨髄腫細胞を、それぞれの重鎖及び軽鎖発現プラスミドでトランスフェクトし、高レベルの組換えＴＮＶ１４８Ｂ及びＴＮＶ１４（ｒＴＮＶ１４８Ｂ及びｒＴＮＶ１４）ｍＡｂを生成する細胞株について２回のサブクローニングによりスクリーニングした。経時的なｍＡｂ産生の成長曲線及び安定性の評価は、６５３トランスフェクタントクローンＣ４６６Ｄ及びＣ４６６Ｃが使用済培養物において安定しておよそ１２５：ｇ／ｍＬのｒＴＮＶ１４８Ｂ ｍＡｂを産生し、一方Ｓｐ２／０トランスフェクタント１．７３－１２－１２２（Ｃ４６７Ａ）が使用済培養物において安定しておよそ２５：ｇ／ｍＬのｒＴＮＶ１４８Ｂ ｍＡｂを産生したことを示した。同様の分析が、Ｓｐ２／０トランスフェクタントクローンＣ４７６Ａが使用済培養物において１８：ｇ／ｍＬのｒＴＮＶ１４を産生したことを示した。

【0249】

序論。ヒトＴＮＦα免疫化ＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘマウス（ＨＣｏ１２／ＫＣｏ５遺伝子型）由来の８つのｍＡｂのパネルは、ヒトＴＮＦαに結合しかつ完全ヒトＩｇＧ１κアイソタイプを有することを前に示した。単純な結合アッセイを使用して、ＴＮＦαが組換えＴＮＦ受容体に結合するのを遮断する能力を評価することにより、本発明の例示的なｍＡｂがＴＮＦα中和活性を有する可能性があるかどうかを決定した。これらの結果、ＤＮＡ配列結果、及びｍＡｂのいくつかのインビトロ特徴付けに基づいて、更に特徴付けされるｍＡｂとしてＴＮＶ１４８が選択された。

【0250】

ＴＮＶ１４８ ｍＡｂをコードするＤＮＡ配列をクローニングし、好適な定常領域をコードする遺伝子発現ベクター内に合うように修飾し、充分に特徴付けされた６５３及びＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞内に導入し、結果として得られたトランスフェクトされた細胞株を、元のハイブリドーマ細胞株の４０倍のｍＡｂを産生するサブクローンが特定されるまでスクリーニングした。

【0251】

材料及び方法
試薬及び細胞。ＴＲＩＺＯＬ試薬はＧｉｂｃｏ ＢＲＬから購入した。プロテイナーゼＫはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから得た。逆転写酵素はＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬのいずれかから得た。制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔはＱｉａｇｅｎから得た。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＫｉｔはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｗｉｚａｒｄプラスミドミニプレップキット及びＲＮａｓｉｎはＰｒｏｍｅｇａからであった。ＯｐｔｉｐｌａｔｅｓはＰａｃｋａｒｄから得た。^１２５ＩｏｄｉｎｅはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。カスタムオリゴヌクレオチドはＫｅｙｓｔｏｎｅ／Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。この作業で使用したオリゴヌクレオチドの名称、識別番号、及び配列を表２に示す。

【0252】

表２．ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子をクローニング、操作又は配列決定するために使用されたオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ－Ｊ６によりコード化されるアミノ酸を配列の上に示す。「Ｍ」アミノ酸残基は翻訳開始コドンを表す。オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ－Ｊ６の下線付き配列は、それぞれ、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ制限部位を示す。ＨｕＨ－Ｊ６の斜線はエクソン／イントロン境界に対応する。配列がマイナス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは、３’－５’配向で書かれていることに留意する。

【0253】

【表3】

【0254】

６５３マウス骨髄腫細胞の凍結バイアルを１つ得た。バイアルをその日に解凍し、Ｔフラスコ中のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、及び２ｍＭグルタミン（培地）中で拡張させた。これらの細胞は、本明細書に記載される抗ＴＮＦ ＤＮＡで２～３週間後にトランスフェクトされるまで、連続培養において維持された。解凍した５日後に培養物のいくつかを採取し、遠心分離によりペレット化し、９５％ＦＢＳ、５％ＤＭＳＯに再懸濁し、３０のバイアルに等分し、凍結し、後に使用するために保管した。同様に、Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞の凍結バイアルを１つ得た。バイアルを解凍し、上述のように新しい凍結物（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｏｗｎ）を調製し、凍結バイアルをＣＢＣの冷凍庫ボックスＡＡ及びＡＢ内で保管した。これらの細胞を解凍し、本明細書に記載される全てのＳｐ２／０トランスフェクションに使用した。

【0255】

受容体へのＴＮＦの結合の阻害のためのアッセイ。ＴＮＶ ｍＡｂを含有するハイブリドーマ細胞上清を使用して、ｍＡｂが組換えＴＮＦ受容体融合タンパク質ｐ５５－ｓｆ２への^１２５Ｉ標識ＴＮＦαの結合を遮断する能力についてアッセイした（Ｓｃａｌｌｏｎら（１９９５）「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ」７：７５９～７７０）。３７℃で１時間インキュベートする際に、ＰＢＳ中０．５：ｇ／ｍＬで５０：Ｌのｐ５５－ｓｆ２をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓに添加してウェルをコーティングした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを希釈剤として使用して、８つのＴＮＶ細胞上清の系列希釈を、９６ウェル丸底プレートにおいて調製した。抗ＩＬ－１８ ｍＡｂを含有する細胞上清が陰性対照として含まれ、ｃＡ２（抗ＴＮＦキメラ抗体、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、米国特許第５，７７０，１９８号、参照により全体が本明細書に組み込まれる）でスパイクされた同じ抗ＩＬ－１８上清が陽性対照として含まれた。最終ＴＮＦα濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように、^１２５Ｉ標識ＴＮＦα（５８：Ｃｉ／：ｇ，Ｄ．Ｓｈｅａｌｙ）を１００：Ｌの細胞上清に添加した。混合物を室温で１時間プレインキュベートした。コーティングされたＯｐｔｉｐｌａｔｅｓを洗浄して未結合のｐ５５－ｓｆ２を除去し、５０：Ｌの^１２５Ｉ－ＴＮＦα／細胞上清混合物をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓに移した。室温で２時間後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回、Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓを洗浄した。１００：ＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ－２０を添加し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ γ計数器を使用して結合したｃｐｍを決定した。

【0256】

Ｖ遺伝子の増幅及びＤＮＡ配列分析。ＲＮＡの調製のために、ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで１回洗浄した後にＴＲＩＺＯＬ試薬を添加した。７×１０^６～１．７×１０^７の細胞を１ｍＬのＴＲＩＺＯＬに再懸濁した。２００μＬのクロロホルムの添加後に管を激しく振った。試料を４℃で１０分間遠心分離した。水相を新しいｍｉｃｒｏｆｕｇｅ管に移し、等量のイソプロパノールを添加した。管を激しく振り、室温で１０分間インキュベートした。次いで、試料を４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄し、真空乾燥機で短時間乾燥させた。ＲＮＡペレットを４０μＬのＤＥＰＣ処理水で再懸濁した。ＲＮＡ調製物の品質は、１％アガロースゲル中で０．５μＬを分画することによって決定された。ＲＮＡは使用するまで－８０℃の冷凍庫に保存した。

【0257】

重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡを調製するために、１１．５μＬの容量に３μＬのＲＮＡ及び１μｇのオリゴヌクレオチド１１９（重鎖）又はオリゴヌクレオチド１１７（軽鎖）のいずれか（表１を参照のこと）を含む混合物を調製した。混合物を水浴中、７０℃で１０分間インキュベートし、次に氷上で１０分間冷却した。２．５μＬの１０×逆転写酵素緩衝剤、１０μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬの逆転写酵素（２０単位）、及び０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）から構成される別個の混合物を調製した。１３．５μＬのこの混合物を、１１．５μＬの冷ＲＮＡ／オリゴヌクレオチド混合物に添加し、反応物を４２℃で４０分間インキュベートした。次に、ｃＤＮＡ合成反応物を、使用するまで－２０℃の冷凍庫に保存した。

【0258】

未精製の重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、可変領域コード配列をＰＣＲ増幅した。重鎖ＤＮＡの増幅をプライムする能力について、５つのオリゴヌクレオチド対（３６６／３５４、３６７／３５４、３６８／３５４、３６９／３５４、及び３７０／３５４、表１）を同時に試験した。軽鎖ＤＮＡの増幅をプライムする能力について、２つのオリゴヌクレオチド対（３６２／２０８及び３６３／２０８）を同時に試験した。総容量５０μＬにおいて２単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（商標）高忠実度（ＨＩＦＩ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ反応を行った。各反応物は、２μＬのｃＤＮＡ反応物、１０ピコモルの各オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、５μＬの１０×ＨＩＦＩ緩衝剤、及び２ｍＭの硫酸マグネシウムを含んでいた。サーマルサイクラプログラムは、９５℃で５分間、続いて３０サイクル（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、６８℃で１．５分間）であった。次に、６８℃で１０分間の最終インキュベーションを行った。

【0259】

直接ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ生成物を調製するために、製造業者のプロトコルに従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してそれらを精製した。５０μＬの減菌水を使用してスピンカラムからＤＮＡを溶出させた後、真空乾燥機を使用して１０μＬの容量まで乾燥させた。次に、総容量２０μＬの、１μＬの精製されたＰＣＲ生成物、１０μＭオリゴヌクレオチドプライマ、４μＬのＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ、及び１４μＬの減菌水でＤＮＡ配列決定反応物を設定した。オリゴヌクレオチド対３６７／３５４で作製された重鎖ＰＣＲ生成物は、オリゴヌクレオチドプライマ１５９及び３６０を用いて配列決定された。オリゴヌクレオチド対３６３／２０８で作製された軽鎖ＰＣＲ生成物は、オリゴヌクレオチド３４及び１６３を用いて配列決定された。配列決定用のサーマルサイクラプログラムは、２５サイクル（９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、６０℃で４分間）、続いて４℃で一晩であった。反応生成物は、ポリアクリルアミドゲルを介して分画され、ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシーケンサを使用して検出された。

【0260】

アミノ酸を変更するための部位特異的変異誘発。ＴＮＶ１４８ ｍＡｂにおいてＰｒｏ^７５をセリン残基に置き換えるために、ＴＮＶ１４８重鎖可変領域ＤＮＡ配列の単一ヌクレオチドを変更した。相補的オリゴヌクレオチド３９９及び４００（表１）を設計し、製造業者により説明されるように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発法を使用して、この変更を起こさせた。１５％ポリアクリルアミドゲルにより２つのオリゴヌクレオチドを最初に分画し、主要バンドを精製した。１０ｎｇ又は５０ｎｇのいずれかのＴＮＶ１４８重鎖プラスミドテンプレート（ｐ１７５３）、５μＬの１０×反応緩衝剤、１μＬのｄＮＴＰミックス、１２５ｎｇのプライマ３９９、１２５ｎｇのプライマ４００、及び１μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、変異誘発反応物を調製した。減菌水を添加して総容量を５０μＬにした。次に、反応混合物を、９５℃で３０秒間インキュベートするようにプログラムされたサーマルサイクラでインキュベートし、次に、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、６４℃で１分間、６８℃で７分間、続いて３０℃で２分間（１サイクル）の一連のインキュベーションで１４回サイクルした。これらの反応物は、変異原性オリゴヌクレオチドを、その他の点では同一の新しく合成されたプラスミドに組み込むように設計された。元のＴＮＶ１４８プラスミドを除去するために、元のメチル化プラスミドのみを切断する１μＬのＤｐｎＩエンドヌクレアーゼを添加した後、試料を３７℃で１時間インキュベートした。次に、１μＬの反応物を使用して、標準的な熱ショック方法によりＥｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅスーパーコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を形質転換し、ＬＢ－アンピシリン寒天プレート上で平板培養した後に形質転換された細菌を特定した。製造業者により説明されるＷｉｚａｒｄ（商標）キットを使用して、プラスミドミニプレップを調製した。Ｗｉｚａｒｄ（商標）カラムから試料を溶出した後、エタノールでプラスミドＤＮＡを沈殿させてプラスミドＤＮＡを更に精製し、その後２０μＬの減菌水に再懸濁した。次に、ＤＮＡ配列分析を行って、所望の塩基変更を有するプラスミドクローンを特定し、他の塩基変更が不注意にＴＮＶ１４８コード配列内に導入されなかったことを確認した。セクション４．３に記載される同じパラメータを使用して、１μＬのプラスミドを、３μＬのＢｉｇＤｙｅミックス、１μＬのｐＵＣ１９フォワードプライマ、及び１０μＬの減菌水で調製されたサイクル配列決定反応物に供した。

【0261】

１２Ｂ７５遺伝子からの発現ベクターの構築。いくつかの組換えＤＮＡ工程を行って、前にクローニングされた１２Ｂ７５コード重鎖及び軽鎖遺伝子のゲノムコピーから、それぞれ、新しいヒトＩｇＧ１発現ベクター及び新しいヒトκ発現ベクターを調製した（これは、国際公開第０２／１２５００号として公開された、ＩＬ－１２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓと題される、２０００年１０月７日出願の米国特許出願第６０／２３６，８２７号に開示されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。最終ベクターは、任意の適切に設計されたＰＣＲ増幅可変領域で、既存の可変領域配列の簡単な一工程置換を可能にするように設計された。

【0262】

プラスミドｐ１５６０の１２Ｂ７５重鎖遺伝子を修飾するために、プロモータ及び可変領域を含有する６．８５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐ１５６０からｐＵＣ１９に移してｐ１７４３を作製した。ｐ１５６０と比較してサイズがより小さいこのプラスミドは、製造業者のプロトコルに従い、翻訳開始部位のすぐ上流に固有のＢｓｉＷＩクローニング部位を導入するための、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発の使用（オリゴヌクレオチドＢｓｉＷＩ－１及びＢｓｉＷＩ－２を使用する）を可能にした。結果として得られたプラスミドはｐ１７４７と呼ばれた。ＢｓｔＢＩ部位を可変領域の３’端に導入するために、５’オリゴヌクレオチドプライマはＳａｌＩ及びＢｓｔＢＩ部位で設計された。このプライマをｐＵＣリバースプライマと共に使用してｐ１７４７から２．７５ｋｂの断片を増幅した。次に、この断片を１２Ｂ７５可変領域の自然に生じるＳａｌＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして戻し、それにより固有のＢｓｔＢ１部位を導入した。ｐ１７５０と表記される結果として得られた中間ベクターは、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ端を有する可変領域断片を受容することができた。定常領域も１２Ｂ７５遺伝子に由来する重鎖ベクターのバージョンを調製するために、ｐ１７５０のＢａｍＨＩ－ＨｉｎｄＩＩＩインサートは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流にＥｃｏＲＩ部位を有するためにｐＢＲ３２２に移された。次に、結果として得られたプラスミドｐ１７６８を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐ１５６０からｐＢＣに大きなＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ断片をクローニングすることによって得られたサブクローンであるｐ１７４４からの５．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＥｃｏＲＩ断片にライゲートした。次に、結果として得られたプラスミドｐ１７８４は、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ端を有するＴＮＶ Ａｂ ｃＤＮＡ断片のベクターとして使用された。追加の作業は、１２Ｂ７５遺伝子からのＩｇＧ１定常領域を含み、１２Ｂ７５重鎖Ｊ－Ｃイントロンをどの程度含有するかによって互いに異なる、発現ベクターｐ１７８８及びｐ１７９８を調製するために行われた。

【0263】

プラスミドｐ１５５８の１２Ｂ７５軽鎖遺伝子を修飾するために、１２Ｂ７５プロモータ及び可変領域を含有する５．７ｋｂのＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、ｐ１５５８からプラスミドＬ２８のＸｈｏＩ／ＡｆｌＩＩ部位に移した。この新しいプラスミドｐ１７４５は、変異誘発工程のためのより小さなテンプレートを提供した。オリゴヌクレオチド（Ｃ３４０ｓａｌＩ及びＣ３４０ｓａｌ２）を使用して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発により、可変領域の５’端に固有のＳａｌＩ制限部位を導入した。結果として得られた中間ベクターｐ１７４６は、可変領域断片がクローニングされ得る固有のＳａｌＩ及びＡｆｌＩＩ制限部位を有していた。ｐ１７４６にクローニングされた任意の可変領域断片は、軽鎖遺伝子の３’半分と結合されることが好ましいであろう。この目的のために使用され得る１２Ｂ７５軽鎖遺伝子の３’半分からの制限断片を調製するために、オリゴヌクレオチドＢＡＨＮ－１及びＢＡＨＮ－２を互いにアニールして、制限部位ＢｓｉＷ１、ＡｆｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、及びＮｏｔＩを含有し、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩ部位にライゲートされ得る端部を含有する二本鎖リンカを形成した。このリンカをｐＢＣのＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位との間にクローニングして、プラスミドｐ１７５７を得た。ｐ１５５８をＡｆｌＩＩで消化した後、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化することにより生成された、１２Ｂ７５軽鎖定常領域を含有する７．１ｋｂの断片を、ｐ１７５７のＡｆｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩ部位との間にクローニングしてｐ１７６２を得た。この新しいプラスミドは、プロモータ及び可変領域を含有するＢｓｉＷＩ／ＡｆｌＩＩ断片が遺伝子の２つの半分を結合して移入できるＢｓｉＷＩ及びＡｆｌＩＩの固有の部位を含有していた。

【0264】

発現プラスミドのｃＤＮＡクローニング及びアセンブリ。ＤＮＡ端部を更に埋めるために、全てのＲＴ－ＰＣＲ反応物（上記を参照のこと）をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した。重鎖ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩで消化した後、プラスミドＬ２８（１２Ｂ７５系中間ベクターｐ１７５０は未だ調製されていなかったため、Ｌ２８を使用した）のＢｓｉＷＩ部位とＢｓｔＢＩ部位との間にクローニングした。クローニングされたインサートのＤＮＡ配列分析は、結果として得られたコンストラクトが正しく、ＰＣＲ増幅中に誤差が導入されなかったことを示した。これらのＬ２８プラスミドコンストラクト（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４８Ｂ、及びＴＮＶ１９６）に割り当てられた識別番号を表３に示す。

【0265】

ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１４８Ｂ重鎖のＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩインサートは、Ｌ２８ベクターから新しく調製された中間ベクターｐ１７５０に移された。これらの中間プラスミドに割り当てられた識別番号を表２に示す。このクローニング工程及び後続の工程は、ＴＮＶ１５及びＴＮＶ１９６には行われなかった。次に、可変領域は、２つの異なるヒトＩｇＧ１発現ベクター内に移された。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して、可変領域を、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの以前使用されたＩｇＧ１ベクターｐ１０４内に移した。Ｇｍ（ｆ＋）アロタイプのＩｇＧ１をコードする、結果として得られた発現プラスミドは、ｐ１７８１（ＴＮＶ１４）、ｐ１７８２（ＴＮＶ１４８）、及びｐ１７８３（ＴＮＶ１４８Ｂ）と表記された（表２を参照のこと）。可変領域は、１２Ｂ７５（ＧｅｎＰｈａｒｍ）遺伝子に由来するＩｇＧ１定常領域の上流にもクローニングされた。Ｇ１ｍ（ｚ）アロタイプのＩｇＧ１をコードするこれらの発現プラスミドも表３に列記される。

【0266】

表３．様々な重鎖及び軽鎖プラスミドのプラスミド識別番号。
Ｌ２８ベクター又はｐＢＣベクターは、初期のＡｂ ｃＤＮＡクローンを表す。これらのプラスミドのインサートは、中間プラスミドを作製するために不完全な１２Ｂ７５系ベクターに移された。１つの追加の移動工程により、線形化された後に細胞に導入されたか、又は細胞のトランスフェクション前にｍＡｂ遺伝子インサートを精製するために使用されたかのいずれかであった最終発現プラスミドがもたらされた。ＮＤ＝実施せず。

【0267】

【表4】

【0268】

軽鎖ＰＣＲ生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｃＩＩで消化した後、プラスミドｐＢＣのＳａｌＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間にクローニングした。１つのアミノ酸で異なる２つの異なる軽鎖バージョンは、ｐ１７４８及びｐ１７４９と表記された（表２）。ＤＮＡ配列分析により、これらのコンストラクトが正しい配列を有することが確認された。次に、ｐ１７４８及びｐ１７４９のＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、中間ベクターｐ１７４６のＳａｌＩ部位とＡｆｌＩＩ部位との間にクローニングして、それぞれｐ１７５５及びｐ１７５６を作製した。次に、軽鎖遺伝子のこれらの５’等分を、ＢｓｉＷＩ／ＡｆｌＩＩ断片をｐ１７５５及びｐ１７５６から新しく調製されたコンストラクトｐ１７６２に移すことにより遺伝子の３’等分に結合し、それぞれ最終発現プラスミドｐ１７７５及びｐ１７７６を作製した（表２）。

【0269】

細胞のトランスフェクション、スクリーニング及びサブクローニング。合計１５のマウス骨髄腫細胞のトランスフェクションを様々なＴＮＶ発現プラスミドで行った（結果及び考察セクションの表３を参照のこと）。これらのトランスフェクションは、（１）宿主細胞がＳｐ２／０又は６５３であるか、（２）重鎖定常領域がＣｅｎｔｏｃｏｒの以前のＩｇＧ１ベクター又は１２Ｂ７５重鎖定常領域でコード化されたか、（３）ｍＡｂがＴＮＶ１４８Ｂ、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４、又は新しいＨＣ／ＬＣの組み合わせであったか、（４）ＤＮＡが、線形化プラスミド又は精製されたＡｂ遺伝子インサートであるかどうか、及び（５）重鎖遺伝子における完全なＪ－Ｃイントロン配列が存在又は不在であるかどうかにより区別された。加えて、トランスフェクションのいくつかは、多数のクローンをスクリーニングすることができる可能性を増大させるために繰り返された。

【0270】

Ｓｐ２／０細胞及び６５３細胞は各々、前に記載された標準条件下で（Ｋｎｉｇｈｔ ＤＭら（１９９３）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」３０：１４４３～１４５３）、エレクトロポレーションにより重鎖及び軽鎖ＤＮＡ（それぞれ８～１２：ｇ）の混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクション番号１、２、３、及び１６に関して、トランスフェクション前に制限酵素で消化することにより、適切な発現プラスミドが線形化された。例えば、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素は、それぞれＴＮＶ１４８Ｂ重鎖プラスミドｐ１７８３及び軽鎖プラスミドｐ１７７６を線形化するために使用された。残りのトランスフェクションに関して、ＢａｍＨＩで重鎖プラスミドを、そしてＢｓｉＷＩ及びＮｏｔＩで軽鎖プラスミドを消化することにより、ｍＡｂ遺伝子のみを含有するＤＮＡインサートをプラスミドベクターから分離した。次に、アガロースゲル電気泳動及びＱｉｅｘ精製樹脂により、ｍＡｂ遺伝子インサートを精製した。精製された遺伝子インサートでトランスフェクトされた細胞は、選択マーカ源として、３～５：ｇのＰｓｔＩ線形化ｐＳＶ２ｇｐｔプラスミド（ｐ１３）で同時にトランスフェクトされた。エレクトロポレーション後に、９６ウェル組織培養皿中のＩＭＤＭ、１５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン中に細胞を播種し、５％ＣＯ_２のインキュベータにおいて、３７℃でインキュベートした。２日後、等量のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、２×ＭＨＸ選択物（１×ＭＨＸ＝０．５：ｇ／ｍＬのマイコフェノール酸、２．５：ｇ／ｍＬのヒポキサンチン、５０：ｇ／ｍＬのキサンチン）を添加し、コロニが形成される間、更に２～３週間プレートをインキュベートした。

【0271】

コロニを有するウェルから回収された細胞上清を、記載されるようにＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧについてアッセイした。簡潔に言うと、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片でコーティングされた９６ウェルＥＩＡプレート内で、様々な希釈の細胞上清をインキュベートした後、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及び適切な色基質を使用して結合ヒトＩｇＧを検出した。細胞上清において測定された同じ精製されたｍＡｂを標準として使用した標準曲線は、上清中のヒトＩｇＧの定量化を可能にするために各ＥＩＡプレートに含まれた。最もヒトＩｇＧを生成しているように見えたそれらのコロニ中の細胞を、使用済培養物における更なる生成判断のために２４ウェルプレート内に継代し、生成が最も高い親クローンを特定した。

【0272】

生成が最も高い親クローンをサブクローニングして、生成がより高いサブクローンを特定し、より均質な細胞株を調製した。９６ウェル組織培養プレートに、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１×ＭＨＸの、ウェル当たり１つの細胞又はウェル当たり４つの細胞を播種し、コロニが現れるまで、１２～２０日間、５％ＣＯ_２インキュベータにおいて３７℃でインキュベートした。ウェル当たり１つのコロニを含有するウェルから細胞上清を回収し、上述のようにＥＬＩＳＡにより分析した。選択したコロニを２４ウェルプレートに継代し、培養物を消耗させた後、それらの上清におけるヒトＩｇＧレベルを定量化することにより、生成が最も高いサブクローンを特定した。このプロセスは、選択された初回のサブクローンを２回目のサブクローニングに供したときに繰り返された。２回目の最良のサブクローンを開発の細胞株として選択した。

【0273】

細胞サブクローンの特徴付け。２回目の最良のサブクローンを選択し、成長曲線を行って、ｍＡｂの生成レベル及び細胞成長特徴を評価した。Ｔ７５フラスコに、３０ｍＬのＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、及び１×ＭＨＸ（又は無血清培地）中１×１０^５細胞／ｍＬで播種した。３００μＬのアリコートを２４時間間隔で取り出し、生細胞密度を測定した。生細胞数が１×１０^５細胞／ｍＬ未満になるまで分析を継続した。回収された細胞上清のアリコートは、存在する抗体の濃度についてアッセイされた。標準としてｒＴＮＶ１４８Ｂ又はｒＴＮＶ１４ ＪＧ９２３９９を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦｃでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で試料を１時間インキュベートし、結合ｍＡｂを、１：１０００希釈のアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。

【0274】

様々な量のＭＨＸ選択物の存在下での成長速度を比較する目的のため、２つの細胞株について異なる成長曲線分析も行われた。細胞株Ｃ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂを、無ＭＨＸ培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）に解凍し、更に２日間培養した。その後、両細胞培養物を、ＭＨＸ無し、０．２×ＭＨＸ、又は１×ＭＨＸ（１×ＭＨＸ＝０．５：ｇ／ｍＬのマイコフェノール酸、２．５：ｇ／ｍＬのヒポキサンチン、５０：ｇ／ｍＬのキサンチン）のいずれかを含有する３つの培養物に分けた。１日後、新しいＴ７５フラスコに、１×１０^５細胞／ｍＬの開始密度で培養物を播種し、細胞を１週間、２４時間間隔で計数した。ｍＡｂ生成のためのアリコートは回収されなかった。ＳＯＰ ＰＤ３２．０２５に提供される式を使用して、これらの試料についての倍加時間を算出した。

【0275】

経時的なｍＡｂ生成の安定性を評価するために、追加の試験が行われた。ＭＨＸ選択物を有する、又は有しないのいずれかで、２４ウェルプレート中のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン中で培養物を成長させた。培養物がコンフルエントになったら、新しい培養物に分割し、その後、古い培養物は消耗させた。この時、上清のアリコートを取り、４℃で保存した。５５～７８日の期間にわたって、アリコートを取り出した。この期間の終了時に、上に概説するように、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＥＬＩＳＡにより、存在する抗体の量について上清を試験した。

【0276】

結果及び考察
組換え受容体へのＴＮＦ結合の阻害
ハイブリドーマ細胞上清に含有される８つのＴＮＶ ｍＡｂが、受容体へのＴＮＦα結合を阻害することができるかどうかを決定するために、簡単な結合アッセイが行われた。ヒトＩｇＧの標準ＥＬＩＳＡ分析により、それぞれの細胞上清におけるＴＮＶ ｍＡｂの濃度を最初に決定した。次に、組換えｐ５５ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質ｐ５５－ｓｆ２をＥＩＡプレート上にコーティングし、様々な量のＴＮＶ ｍＡｂの存在下で、^１２５Ｉ標識ＴＮＦαをｐ５５受容体に結合させた。図１に示すように、８つのＴＮＶ ｍＡｂのうちの１つ（ＴＮＶ１２２）を除く全てが、ｐ５５受容体へのＴＮＦαの結合を効率的に遮断した。実際、ＴＮＶ ｍＡｂは、陰性対照ハイブリドーマ上清にスパイクされたｃＡ２陽性対照ｍＡｂよりもＴＮＦα結合を阻害するのにより有効であるように見えた。これらの結果は、ＴＮＶ ｍＡｂが細胞系アッセイ及びインビボでＴＮＦαの生物活性を遮断する可能性が高く、したがって、追加の分析が必要であることを示すと解釈された。

【0277】

ＤＮＡ配列の分析
ＲＮＡがヒトｍＡｂをコードすることの確認
受容体結合アッセイにおいてＴＮＦα遮断活性を示した７つのＴＮＶ ｍＡｂ（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ３２、ＴＮＶ８６、ＴＮＶ１１８、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６）を特徴付ける際の最初の工程として、これらのｍＡｂを産生する７つのハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを単離した。次に、各ＲＮＡ試料を使用して、各ｍＡｂの完全なシグナル配列、完全な可変領域配列、及び定常領域配列の一部を含むヒト抗体重鎖又は軽鎖ｃＤＮＡを調製した。次に、これらのｃＤＮＡ生成物をＰＣＲ反応で増幅させ、最初に断片をクローニングすることなくＰＣＲ増幅ＤＮＡを直接配列決定した。配列決定した重鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在する５つのヒト生殖系列遺伝子のうちの１つであるＤＰ－４６と＞９０％同一であった（図２）。同様に、配列決定した軽鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在するヒト生殖系列遺伝子のうちの１つと１００％又は９８％のいずれかと同一であった（図３）。これらの配列結果は、ｃＤＮＡに転写され配列決定されたＲＮＡ分子がヒト抗体重鎖及びヒト抗体軽鎖をコード化したことを確認した。可変領域がシグナル配列コード配列の５’端にマッピングされるオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅されたため、シグナル配列の最初の数個のアミノ酸は元のＴＮＶ翻訳生成物の実際の配列ではない可能性があるが、組換えＴＮＶ ｍＡｂの実際の配列を表すことに留意するべきである。

【0278】

固有の中和ｍＡｂ
各ｍＡｂの重鎖及び軽鎖両方の可変領域全体のｃＤＮＡ配列の分析は、ＴＮＶ３２がＴＮＶ１５と同一であり、ＴＮＶ１１８がＴＮＶ１４と同一であり、ＴＮＶ８６がＴＮＶ１４８と同一であることを明らかにした。受容体結合アッセイの結果は、ＤＮＡ配列分析と一致していた、すなわち、ＴＮＶ８６及びＴＮＶ１４８の両方が、ＴＮＦ結合の遮断においてＴＮＶ１１８及びＴＮＶ１４の両方よりもおよそ４倍良好であった。したがって、後続の作業は、４つの固有のＴＮＶ ｍＡｂである、ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６にのみ焦点を当てた。

【0279】

４つのｍＡｂの関連性
ＤＮＡ配列結果は、４つのＴＮＶ ｍＡｂの重鎖をコードする遺伝子が全て互いに高度に相同であり、全てが同じ生殖系列遺伝子ＤＰ－４６に由来するように見えることを明らかにした（図２）。加えて、重鎖ＣＤＲ３配列の各々が非常に類似し、同じ長さのものであること、及びそれらが全てＪ６エクソンを使用することを理由に、それらは、単一のＶＤＪ遺伝子再配列事象、続く各ｍＡｂを固有のものにする体細胞変化から生じたと思われた。ＤＮＡ配列分析は、４つのｍＡｂにおいて２つの別個の軽鎖遺伝子のみが存在したことを明らかにした（図３）。ＴＮＶ１４及びＴＮＶ１５における軽鎖可変領域コード配列は、互いに同一であり、ヒトκ鎖のＶｇ／３８Ｋファミリーの代表的な生殖系列配列と同一である。ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６軽鎖コード配列は、互いに同一であるが、２つのヌクレオチド位置での生殖系列配列が異なる（図３）。

【0280】

４つのｍＡｂの推定アミノ酸配列は、実際のｍＡｂの関連性を明らかにした。４つのｍＡｂは、４つの別個の重鎖（図４）を含有するが、別個の軽鎖は２つのみである（図５）。ＴＮＶ ｍＡｂ配列と生殖系列配列との間の差異は、大半はＣＤＲドメインに限定されていたが、ｍＡｂ重鎖のうちの３つもフレームワーク領域において生殖系列配列とは異なっていた（図４）。ＤＰ－４６生殖系列コードＡｂフレームワーク領域と比較して、ＴＮＶ１４は同一であり、ＴＮＶ１５は１つのアミノ酸が異なり、ＴＮＶ１４８は２つのアミノ酸が異なり、ＴＮＶ１９６は３つのアミノ酸が異なっていた。

【0281】

ｃＤＮＡのクローニング、部位特異的変異誘発、及び最終発現プラスミドのアセンブリ。ｃＤＮＡのクローニング。ＰＣＲ増幅可変領域のＤＮＡ配列に基づいて、クローニングされるコード配列を発現ベクター内に適応させる目的のため、新しいオリゴヌクレオチドは別のＰＣＲ増幅を行うように命じられた。重鎖の場合、この２回目のＰＣＲの生成物は制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩで消化され、プラスミドベクターＬ２８（表２に示されるプラスミド識別番号）にクローニングされた。軽鎖の場合、２回目のＰＣＲ生成物はＳａｌＩ及びＡｆｌＩＩで消化され、プラスミドベクターｐＢＣにクローニングされた。次に、個々のクローンを配列決定して、それらの配列が、異種の可能性のある分子集団の各位置での最も豊富なヌクレオチドを明らかにするＰＣＲ生成物の直接配列決定から得られた前回の配列と同一であることを確認した。

【0282】

ＴＮＶ１４８を変化させる部位特異的変異誘発。ｍＡｂ ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６は、ＴＮＦα生理活性の中和において、次に最良のｍＡｂ（ＴＮＶ１４）よりも４倍強力であることが一貫して観察された。しかしながら、上述のように、ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６重鎖フレームワーク配列は、生殖系列フレームワーク配列とは異なる。ＴＮＶ１４８重鎖配列と他のヒト抗体との比較は、多くの他のヒトｍＡｂがフレームワーク１の位置２８でＩｌｅ残基を含有し（成熟配列のみ計数）、一方でフレームワーク３の位置７５でのＰｒｏ残基は、その位置では稀なアミノ酸であったことを示した。

【0283】

ＴＮＶ１９６重鎖の類似の比較は、フレームワーク３で生殖系列配列とは異なる３つのアミノ酸がヒトｍＡｂにおいて希であり得ることを示唆した。これらの差異は、ヒトに投与された場合、ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６を免疫原性にする可能性があった。ＴＮＶ１４８は、関心のアミノ酸残基を１個しか有しておらず、この残基はＴＮＦα結合に重要ではないと考えられているため、部位特異的変異誘発技術を使用して、生殖系列Ｓｅｒ残基が位置７５でＰｒｏ残基の代わりにコード化されるように、ＴＮＶ１４８重鎖コード配列（プラスミドｐ１７５３の）の単一のヌクレオチドを変更した。結果として得られたプラスミドはｐ１７６０と呼ばれた（表２を参照のこと）。結果として得られた遺伝子及びｍＡｂは、それを元のＴＮＶ１４８遺伝子及びｍＡｂと区別するためにＴＮＶ１４８Ｂと呼ばれた（図５を参照のこと）。

【0284】

最終発現プラスミドのアセンブリ。ゲノム断片として前にクローニングされた１２Ｂ７５重鎖及び軽鎖遺伝子に基づいた新しい抗体発現ベクターを調製した。異なるＴＮＶ発現プラスミドが調製されたが（表２を参照のこと）、それぞれの場合において、５’フランキング配列、プロモータ、及びイントロンエンハンサは、それぞれの１２Ｂ７５遺伝子に由来した。軽鎖発現プラスミドに関して、完全なＪ－Ｃイントロン、定常領域コード配列、及び３’フランキング配列も１２Ｂ７５の軽鎖遺伝子に由来した。最終生成細胞株（ｐ１７８１及びｐ１７８３、以下を参照のこと）をもたらした重鎖発現プラスミドに関して、ヒトＩｇＧ１定常領域コード配列は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの前に使用された発現ベクター（ｐ１０４）に由来した。重要なことには、ここで報告される最終生成細胞株は、元のハイブリドーマ由来ＴＮＶ ｍＡｂ（Ｇ１ｍ（ｚ））とは異なるアロタイプ（Ｇｍ（ｆ＋））のＴＮＶ ｍＡｂを発現する。これは、ＧｅｎＰｈａｒｍマウスに由来する１２Ｂ７５重鎖遺伝子はＣＨ１ドメインのＣ末端部でＡｒｇ残基をコードするが、ＣｅｎｔｏｃｏｒのＩｇＧ１発現ベクターｐ１０４はその位置でＬｙｓ残基をコードするためである。Ｊ－Ｃイントロン、完全定常領域コード配列、及び３’フラランキング配列が１２Ｂ７５重鎖遺伝子に由来する他の重鎖発現プラスミド（例えば、ｐ１７８６及びｐ１７８８）が調製されたが、これらの遺伝子でトランスフェクトされた細胞株は、生成細胞株として選択されなかった。ベクターは、最終発現プラスミドをもたらす後のＰＣＲ増幅Ｖ領域の一工程クローニングを可能にするように慎重に設計された。

【0285】

ＰＣＲ増幅可変領域ｃＤＮＡは、Ｌ２８又はｐＢＣベクターから、プロモータ領域及びＪ－Ｃイントロンの一部を提供する中間段階の１２Ｂ７５系ベクターに移された（プラスミド識別番号に関しては表２を参照のこと）。次に、抗体遺伝子の５’半分を含有する制限断片を、これらの中間段階のベクターから、それぞれの遺伝子の３’半分を提供する最終発現ベクターに移して、最終発現プラスミド（プラスミド識別番号に関しては表２を参照のこと）を形成した。

【0286】

細胞のトランスフェクション及びサブクローニング。発現プラスミドは、制限消化によって線形化されたか、又は各プラスミド中の抗体遺伝子インサートがプラスミド骨格鎖から精製されたかのいずれかであった。Ｓｐ２／０及び６５３マウス骨髄腫細胞は、エレクトロポレーションにより重鎖ＤＮＡ及び軽鎖ＤＮＡでトランスフェクトされた。１５の異なるトランスフェクションが行われ、そのほとんどはＡｂで規定されるように固有であり、遺伝子が線形化された全プラスミド又は精製された遺伝子インサート上にあるかどうかに関わらずＡｂ遺伝子の特定の特徴であり、宿主細胞株であった（表４に要約される）。マイコフェノール酸に耐性のクローンからの細胞上清を、ヒトＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡによりアッセイし、精製されたｒＴＮＶ１４８Ｂを参照標準曲線として使用して定量化した。

【0287】

産生が最も高いｒＴＮＶ１４８Ｂ細胞株
ｒＴＮＶ１４８Ｂトランスフェクション２からの、産生が最高の６５３親株のうちの１０（使用済２４ウェル培養物において５～１０：ｇ／ｍＬを産生）をサブクローニングして、産生がより高い細胞株についてスクリーニングし、より均質な細胞集団を調製した。親株２．３２０、２．３２０－１７、及び２．３２０－２０のサブクローンのうちの２つは、使用済２４ウェル培養物においておよそ５０：ｇ／ｍＬを産生し、これは、それらの親株に対して５倍の増加であった。サブクローニングした株２．３２０－１７及び２．３２０－２０の２回目のサブクローニングがもたらした。

【0288】

各ｍＡｂをコードする重鎖及び軽鎖プラスミドの識別番号を示す。精製されたｍＡｂ遺伝子インサートで行われたトランスフェクションの場合、ｇｐｔ選択マーカの供給源としてプラスミドｐ１３（ｐＳＶ２ｇｐｔ）が含まれた。重鎖定常領域は、Ｒｅｍｉｃａｄｅをコードするために使用された同じヒトＩｇＧ１発現ベクター（「旧」）又は１２Ｂ７５（ＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘ）重鎖遺伝子内に含有される定常領域（「新規」）のいずれかによりコード化された。Ｈ１／Ｌ２は、ＴＮＶ１４重鎖及びＴＮＶ１４８軽鎖で構成される「新規」ｍＡｂを指す。プラスミドｐ１７８３及びｐ１８０１は、それらの重鎖遺伝子がＪ－Ｃイントロンをどの程度含有するかによってのみ異なる。細胞クローンの遺伝子名の最初の数字を定義するトランスフェクション番号は右側に示される。本明細書に記載されるｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株Ｃ４６６（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）及びＣ４６７Ａは、それぞれトランスフェクション番号２及び１に由来した。ｒＴＮＶ１４生成細胞株Ｃ４７６Ａはトランスフェクション番号３に由来した。

【0289】

【表5】

【0290】

使用済の２４ウェル培養上清でのＥＬＩＳＡアッセイは、これらの２回目のサブクローンが全て９８～１２４：ｇ／ｍＬを産生したことを示し、これは初回のサブクローンに対して少なくとも２倍の増加であった。これらの６５３細胞株に、表５に示されるように、Ｃコード表記を割り当てた。

【0291】

ｒＴＮＶ１４８Ｂトランスフェクション１からの生成が最高のＳｐ２／０親株のうちの３つをサブクローニングした。親株１．７３の２回のサブクローニングは、使用済２４ウェル培養物において２５：ｇ／ｍＬを産生したクローンの特定につながった。このＳｐ２／０細胞株をＣ４６７Ａと表記した（表５）。

【0292】

産生が最も高いｒＴＮＶ１４細胞株
ｒＴＮＶ１４トランスフェクション３からの生成が最高のＳｐ２／０親株のうちの３つを１回サブクローニングした。サブクローン３．２７－１は、産生が１９：ｇ／ｍＬであり、使用済の２４ウェル培養物において最も高い生産体であることが分かった。この細胞株をＣ４７６Ａと表記した（表５）。

【0293】

表５．選択された生成細胞株及びそれらのＣコードの要約。
元のクローン名の最初の１桁は、細胞株がどのトランスフェクションに由来するかを示す。本明細書に報告されるＣコード細胞株の全てが制限酵素で線形化された重鎖及び軽鎖全プラスミドでのトランスフェクションに由来した。

【0294】

【表6】

【0295】

サブクローニングされた細胞株の特徴付け
細胞株の成長特徴をより慎重に特徴付けし、大規模でｍＡｂ生成レベルを決定するために、Ｔ７５培養物を使用して成長曲線分析を行った。結果は、細胞株の４つのＣ４６６シリーズの各々が１．０×１０^６～１．２５×１０^６細胞／ｍＬのピーク細胞密度及び１１０～１４０：ｇ／ｍＬの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達したことを示した（図７）。対照的に、生成が最高のＳｐ２／０サブクローンＣ４６７Ａは、２．０×１０^６細胞／ｍＬのピーク細胞密度及び２５：ｇ／ｍＬの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達した（図７）。成長曲線分析は、ｒＴＮＶ１４－生成細胞株Ｃ４７６Ａに対して行われなかった。

【0296】

更なる成長曲線分析を行って、異なる濃度のＭＨＸ選択物における成長速度を比較した。この比較は、ＭＨＸの不在下で培養されたＣ４６６細胞が、通常量のＭＨＸ（１×）で培養された同じ細胞よりも速く成長しているように思われる近年の観測によって促された。マイコフェノール酸などの化合物の細胞傷害性濃度は数桁の大きさ以上に測定される傾向にあるため、より低い濃度のＭＨＸを使用することにより、ｍＡｂ生成の安定性を犠牲にすることなく細胞の倍加時間を大幅に速くし得ることが可能であると考えられた。細胞株Ｃ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂは、ＭＨＸ無し、０．２×ＭＨＸ、又は１×ＭＨＸのいずれかで培養された。生細胞の計数は、７日間、２４時間間隔で行われた。結果により、ＭＨＸ濃度依存性細胞成長率が明らかになった（図８）。細胞株Ｃ４６６Ａは、１×ＭＨＸにおいて２５．０時間の倍加時間を示したが、ＭＨＸ無しではわずか２０．７時間の倍加時間を示した。同様に、細胞株Ｃ４６６Ｂは、１×ＭＨＸにおいて３２．４時間の倍加時間を示したが、ＭＨＸ無しではわずか２２．９時間の倍加時間を示した。重要なことには、０．２×ＭＨＸにおける両細胞株の倍加時間は、１×ＭＨＸよりもＭＨＸ無しで観察されたものとより類似していた（図８）。この観測は、倍加時間が重要なパラメータであるバイオリアクタにおいて、増強された細胞性能がより少ないＭＨＸを使用することにより実現され得る可能性を示す。しかしながら、安定性試験結果（以下を参照のこと）は、細胞株Ｃ４６６ＤがＭＨＸの不在下でも少なくとも６０日間、ｒＴＮＶ１４８Ｂを安定して生成することが可能であることを示唆するが、安定性試験はまた、ＭＨＸの不在と比較して、細胞がＭＨＸの存在下で培養されたとき、より高いｍＡｂ生成レベルも示した。

【0297】

およそ６０日の期間にわたって様々な細胞株からのｍＡｂの生成を評価するために、ＭＨＸ選択物を含有する又は含有しない、いずれかの培養物で安定性試験を行った。細胞株の全てが高ｍＡｂ生成を維持したわけではなかった。培養のちょうど２週間後、クローンＣ４６６Ａの生成は試験開始時よりもおよそ４５％少なかった。クローンＣ４６６Ｂからの生成も大幅に低下したように思われた。しかしながら、クローンＣ４６６Ｃ及びＣ４６６Ｄは、かなり安定した生成を維持し、Ｃ４６６Ｄは最も高い絶対生成レベルを示した（図９）。

【0298】

結論
ヒトＴＮＦαに対する８つのヒトｍＡｂの初期パネルから、タンパク質配列及びＴＮＦ中和効力を含むいくつかの基準に基づいて、ＴＮＶ１４８Ｂ並びにＴＮＶ１４が好ましいものとして選ばれた。１００：ｇ／ｍＬ超のｒＴＮＶ１４８Ｂ及び１９：ｇ／ｍＬ超のｒＴＮＶ１４を産生する細胞株を調製した。

【0299】

実施例５：単回ボーラス注射を使用した抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの本発明の抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、又はＴＮＶ１９６）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。

【0300】

結果：体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、３～７週目で有意であった。１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、試験の７週目に有意な体重増加を達成した。（図１０を参照されたい）。

【0301】

図１１Ａ～図１１Ｃは、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）を通して継続して、Ｄ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。

【0302】

実施例６：複数ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを体重に基づき８つの処置群のうちの１つに割り当て、対照品（Ｄ－ＰＢＳ）、又は３ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８）（０週目）の腹腔内ボーラス投与で処置した。注射は１、２、３、及び４週目に全ての動物において繰り返された。群１～６は、試験品の有効性に関して評価された。群７及び８の動物から得られた血清試料は、２、３及び４週目のＴＮＶ１４又はＴＮＶ１４８の免疫応答誘導及び薬物動態クリアランスに関して評価された。

【0303】

結果：体重を投与前からの変化として分析したとき、有意差は認められなかった。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。（図１２を参照されたい）。

【0304】

図１３Ａ～図１３Ｃは、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。

【0305】

実施例７：単回腹腔内ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき６つの処置群のうちの１つに割り当て、３ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体（ｃＡ２又はＴＮＶ１４８）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。この試験は、Ｄ－ＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２対照群を利用した。

【0306】

体重を投与前からの変化として分析したとき、全ての処置は似たような体重増加を達成した。３又は５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８又は５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２のいずれかで処置した動物は、試験の早期（２及び３週目）に体重量が有意に増加した。ＴＮＶ１４８で処置した動物のみが後の時点において有意な体重増加を維持した。３及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物はどちらも、７週目で有意を示し、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は注射の８週間後に尚も有意に上昇した。（図１４を参照されたい）。

【0307】

図１５は、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。全ての処置群が初期の時点で多少の保護作用を示し、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１～３週目にＡＩにおいて有意な減少を示し、全ての処置群が２週目で有意な減少を示した。試験の後期に、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は多少の保護作用を示し、４、６及び７週目で有意に減少した。低用量（３ｍｇ／ｋｇ）のｃＡ２及びＴＮＶ１４８は両方とも、６週目で有意な減少を示し、全ての処置群が７週目で有意な減少を示した。試験の終わりで（８週目）有意な減少を維持することができた処置群はなかった。任意の時点で処置群のいずれかの間（食塩水対照群は除く）に有意差はなかった。

【0308】

実施例８：抗ＴＮＦ抗体と修飾された抗ＴＮＦ抗体との間の単回腹腔内ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
ＴＮＶ１４８（ハイブリドーマ細胞に由来する）及びｒＴＮＶ１４８Ｂ（トランスフェクトした細胞に由来する）の単回腹腔内投与の有効性を比較するために。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ＝Ｓ ＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４８、ｒＴＮＶ１４８Ｂ）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。

【0309】

体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、１週目及び３～８週目で有意であった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、試験の５、６及び８週目に有意な体重増加を達成した。（図１６を参照されたい）。

【0310】

図１７は、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、４週目から始まり、残りの試験（８週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。ＴＮＶ１４８で処置した群及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群は両方とも、４週目でＡＩにおける有意な減少を示した。以前の試験（Ｐ－０９９－０１７）は、ＴＮＶ１４８が単回の１ｍｇ／ｋｇの腹腔内ボーラス後の関節炎指数の減少にわずかにより効果的であることを示したが、この試験では、両バージョンのＴＮＶ抗体で処置した群からのＡＩがわずかに高いことを示した。１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群（６週目を除く）は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２群と比較したとき、有意に増加せず、ＴＮＶ１４８で処置した群は、７及び８週目で有意に高かったが、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８及び１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８Ｂの間には試験の任意の時点でＡＩにおいて有意差はなかった。

【0311】

実施例９：強直性脊椎炎の治療又は予防のための抗ＴＮＦ抗体
概要
活動性強直性脊椎炎を有する対象において静脈内投与される抗ＴＮＦαモノクローナル抗体ゴリムマブの多施設無作為化二重盲検プラセボ対照試験。

【0312】

ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖アイソタイプ（Ｇ１ｍ［ｚ］アロタイプ）及びκ軽鎖アイソタイプを有する完全ヒトモノクローナル抗体である。ゴリムマブは、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。ゴリムマブの分子量は、１４９，８０２～１５１，０６４ダルトンの範囲である。ゴリムマブは、高い親和性及び特異性でヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合し、ＴＮＦα生物活性を中和する。

【0313】

目的及び仮説
主目的
この試験の主な目的は、ＡＳの徴候及び症状の低減を評価することによって、活動性強直性脊椎炎（ＡＳ）を有する対象におけるゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与の有効性を評価することである。

【0314】

二次目的
二次目的は、ゴリムマブについて以下を評価することである。
・身体機能、可動域、健康に関連する生活の質及び他の健康転帰の改善に関連する有効性
・安全性
・薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）及び免疫原性

【0315】

仮説
試験の主な目的に対処するために、統計的仮説（代替仮説）は、ＩＶゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇが、一次有効性エンドポイントに基づいて、活動性ＡＳを有する対象の徴候及び症状の低減において、プラセボより統計的に優れているというものである。

【0316】

この試験の一次エンドポイントは、１６週目に、強直性脊椎炎評価（ＡＳＡＳ）国際作業部会基準におけるベースラインからの２０％改善（ＡＳＡＳ２０と呼ばれる）を達成する対象の割合である。このエンドポイントは、規制当局及び臨床ＡＳコミュニティによって十分に受け入れられるので選択された。

【0317】

試験設計の概要
これは、ＮＳＡＩＤに対して応答が不十分であるか、又は不耐性である、活動性ＡＳを有する対象におけるＩＶゴリムマブの有効性及び安全性をプラセボと比較した第３相多施設無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。およそ２００人の対象は、およそ４０箇所の治験実施施設で無作為化される。全ての対象は、０週目、４週目、及びその後５２週まで８週ごと（ｑ８ｗ）に、ＩＶ注入でゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇ又はプラセボを受けるように無作為に割り当てられる。１６週目に、プラセボ注入を受けた全ての対象は、交差し、ゴリムマブＩＶ注入を受け始める。

【0318】

ゴリムマブＩＶ処置群における対象は、ゴリムマブＩＶ注入を受け続ける。データベースロックは、２８週及び６０週にスケジュールされる。最後の試験処置投与の少なくとも８週間後に、有害事象（ＡＥ）及び重篤な有害事象（ＳＡＥ）について対象を追跡する。試験の終了は、最後の対象が６０週の訪問を完了する時として定義される。

【0319】

対象集団
試験に適格な対象は、改訂ニューヨーク基準によって「明確」として定義される少なくとも３か月間のＡＳの診断、並びに０～１０ｃｍのスケールでそれぞれ、全背部痛に対する、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index、ＢＡＳＤＡＩ）≧４及びビジュアルアナログスケール（Visual Analogue Scale、ＶＡＳ）≧４によって証明されるとおり、活動性疾患の症状を有する１８歳以上の男性又は女性である。対象は、≧０．３ｍｇ／ｄＬのＣ反応性タンパク質（C-reactive protein、ＣＲＰ）レベルを有することが必要である。

【0320】

試験集団の他の主要な特徴は、以下のとおりである：
・メトトレキサート（ＭＴＸ）、スルファサラジン（ＳＳＺ）及びヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）及び低用量経口コルチコステロイドの現在の使用者は許容されており、これらの投薬の安定用量の服用状態で試験を開始するべきである。
・１つ以下の生物学的抗ＴＮＦα剤（ゴリムマブ以外）への曝露前の対象は、この試験への組み込みに許容されるが、試験集団の最大でも２０％に限定される。
・側面脊椎レントゲン写真上で視覚化された頸椎及び腰椎の全ての椎間レベルに存在して橋渡しする靱帯骨棘形成として定義される完全な脊椎強直症を有する対象は、この試験への組み込みに許容されるが、試験集団の最大でも１０％に限定される。

【0321】

適格な対象のためのスクリーニングは、試験薬の投与前６週間以内に実施される。

【0322】

対象はまた、包含及び除外基準を満たす必要がある。

【0323】

用量及び投与
初回スクリーニング訪問では、試験に適格である可能性があると考えられる全ての対象から、実験に登録するためのプロトコル指定の包含及び除外基準に従って、インフォームドコンセントが得られる。無作為化訪問では、対象は再評価され、全ての指定された包含及び除外基準が満たされる場合、対象は、ゴリムマブＩＶ注入又はプラセボＩＶ注入のいずれかを受けるように無作為化される。ランダム化は、地理的領域によって及び抗ＴＮＦα療法の使用前に階層化される。

【0324】

第１の試験注入の前に、対象は、以下の２つの処置群のうちの１つに１：１の比で無作為に割り当てられる：
群１（ｎ＝１００）：対象は、０週目、４週目及び１２週目にＩＶプラセボ注入を受ける。対象は、１６週目にＩＶゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇに交差し、１６週目、２０週目及びその後ｑ８ｗに投与を受ける。
群２（ｎ＝１００）：対象は、０週目、４週目及びその後ｑ８ｗに、２ｍｇ／ｋｇのＩＶゴリムマブを受ける。対象は、盲検を維持するために、１６週目にＩＶプラセボ注入を受ける。

【0325】

全ての注入は、３０±１０分にわたって完了される。

【0326】

有効性評価／エンドポイント
本試験のために選択された有効性評価は、ＡＳの処置のための治療用生物学的薬剤の以前の試験において確立された。本試験のために選択された患者報告転帰（patient reported outcome、ＰＲＯ）は、ＡＳ及び適用可能なＵＳ／ＥＵ規制指針文書における他の試験のために医学文献に受け入れられている臨床的に関連する測定値と一致する。

【0327】

強直性脊椎炎応答評価には、以下が含まれる。
・Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能指標（ＢＡＳＦＩ）
・患者の総合評価
・全背部痛
・Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ）
・３６項目略式健康調査（ＳＦ－３６）
・Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測指標（ＢＡＳＭＩ）
・強直性脊椎炎生活の質（ＡＳＱｏＬ）アンケート
・胸郭拡張
・夜の背部痛
・付着部炎指数
・医学的転帰試験睡眠スケール
・作業制限アンケート（ＷＬＱ）
・生産性ビジュアルアナログスケール
・ＥｕｒｏＱｏｌ－５Ｄ（ＥＱ－５Ｄ）アンケート

【0328】

一次エンドポイント
この試験の一次エンドポイントは、１６週目のＡＳＡＳ２０応答者の割合である。試験は、１６週目のＡＳＡＳ２０を有する対象の割合が、プラセボ群と比較してゴリムマブ群において統計的に有意に大きくなることが実証される場合、陽性であると考えられる。

【0329】

主要な二次エンドポイント
以下の主要な二次分析が実行される。エンドポイントは、以下に指定されるような重要性の順序で列挙される。
１． １６週目にＡＳＡＳ４０を達成した対象の割合。
２． １６週目に、ＢＡＳＤＡＩにおけるベースラインからの少なくとも５０％の改善を達成する対象の割合。
３． １６週目でのＢＡＳＦＩにおけるベースラインからの変化。

【0330】

薬物動態評価
血液試料を選択された訪問で収集して、ＡＳを有する成人対象におけるＩＶゴリムマブのＰＫを評価する。試験薬剤がその訪問で投与される場合、薬物動態試料は、ＩＶ注入ラインとは異なるアームから引き出されるべきである。具体的には、０、４、１２、２０、３６、及び５２週目の訪問において、血清ゴリムマブ濃度についての２試料が収集され、１つの試料が注入直前に収集され、もう一方が注入終了１時間後に収集される。残りの訪問のそれぞれについては、血清ゴリムマブ濃度についての１試料のみが収集される。この試料は、試験薬剤の注入がその訪問において投与される場合は、注入前に収集されるべきである。無作為なＰＫ試料はまた、１２週目、１６週目、又は２０週目の訪問時以外の１２～２０週目間の訪問の集団ＰＫ分析のために引き出される。この試料は、試験薬剤注入の少なくとも２４時間前又は後に、収集される必要がある。適用可能な時点で、ゴリムマブ濃度及びゴリムマブに対する抗体の両方の測定のための血清は、引き出された同じ血液に由来する。

【0331】

免疫原性評価
ＡＳを有する成人対象におけるゴリムマブの免疫原性を評価するために、ゴリムマブに対する抗体の検出のための血清試料を、時間及びイベントスケジュールに従って収集する。

【0332】

バイオマーカ評価
バイオマーカ試料は、臨床転帰における個体間変動の分子的理解を得るために収集され、これは、薬剤に異なる応答を示す集団サブグループを同定するのに役立ち得る。バイオマーカ試料は、新たな問題に対処するのに役立て、将来において安全で、より効果的で、最終的に個別化された療法の開発を可能にするために使用されてもよい。

【0333】

薬理遺伝学的（ＤＮＡ）評価
ゲノム検査が、疾患又は薬剤に対する応答と、特定の遺伝子とのリンクに関する研究のために行われる。ゴリムマブに関連するＤＮＡ研究のみ、又は、この薬物が開発された疾患に関連するＤＮＡ研究のみが行われる。ゲノムの幅広い薬理遺伝学的及び／又はエピジェネティクス試験は、同意を得た対象において本試験で行われる。試験のこの部分に参加する対象は、別個のインフォームドコンセント（同意書）に署名する必要がある。更に、対象は、試験の他の側面への参加や、試験への今後の参加に影響を与えること無しに、随時、そのような同意を撤回することができる。

【0334】

薬理遺伝学的血液試料は、必要に応じて薬理遺伝学的研究を可能にするために収集される（現地規制が許可される）。薬理遺伝学的研究への対象の参加は任意である。

【0335】

安全性の評価
他の抗ＴＮＦα剤の安全性プロファイル、並びにこれまでのゴリムマブ安全性データに基づいて、いくつかの関心のあるＡＥが特定され、この試験において監視及び評価される。これらには、輸注反応、肝胆検査値異常、ＴＢを含む感染、及び悪性腫瘍が挙げられる。

【0336】

統計的方法
連続変数のｎ、平均、ＳＤ、中央値、ＩＱ範囲、最小値、及び最大値、並びに離散変数の数及び百分率などの単純な記述要約統計を使用して、ほとんどのデータを要約する。

【0337】

抗ＴＮＦα療法の以前の使用によって階層化されたコクラン－マンテル－ヘンツェル（Cochran-Mantel-Haenszel、ＣＭＨ）検定を使用して、処置に応答する対象の割合などのカテゴリー変数を比較する。一般に、抗ＴＮＦα療法を因子として使用する前のＡＮＯＶＡは、特に明記しない限り、連続変数を分析するために使用される。全ての統計的試験は、α＝０．０５（両側検定）で行われる。統計分析に加えて、グラフデータ表示（卵、折れ線グラフ）及び対象リストもまた、データを要約／提示するために使用され得る。

【0338】

集団セット
集団セットは、意図的な処置集団（即ち、全ての無作為化された対象）である。有効性分析に含まれる対象は、割り当てられた治療を受けるか否かに関わらず、割り当てられた処置群に従って要約される。

【0339】

安全性及びＰＫ分析は、試験処置の少なくとも１回の投与を受けた全ての対象を含む。

【0340】

エンドポイント分析
一次評価項目分析
主目的に対処するために、１６週目にＡＳＡＳ２０応答を有する対象の割合（一次エンドポイント）が、０．０５の有意水準（両側検定）で抗ＴＮＦα療法の使用前に階層化されたＣＭＨ試験（Ｙｅｓ／Ｎｏ）を用いて、プラセボ群とゴリムマブ群との間で比較される。この主有効性分析では、全ての無作為化された対象からのデータは、それらの実際の治療を受けたかに関わらず、それらの割り当てられた処置群に従って分析される。対象が１６週目に少なくとも１つのＡＳＡＳ成分のデータを有する場合に、欠測ＡＳＡＳ成分を割り振るために、最後の観測値の繰り越し（ＬＯＣＦ）手順が使用される。対象が１６週目に全てのＡＳＡＳ成分のデータを有しない場合、対象は、非応答者と見なされる。

【0341】

主要二次エンドポイント分析
以下の主要な二次分析は、以下に指定されるような重要性の順序で行われる。
１． １６週目にＡＳＡＳ４０を達成した対象の割合を、処置群間で比較する。
２． １６週目にＢＡＳＤＡＩにおいてベースラインから少なくとも５０％の改善を達成した対象の割合を、処置群間で比較する。
３． １６週目でのＢＡＳＦＩにおけるベースラインからの変化を、処置群間で比較する。

【0342】

多重度についてのタイプＩ誤差率を制御するために、第１の主要な二次エンドポイントは、一次エンドポイントが０．０５の有意水準（両側検定）で統計的有意性を達成した場合にのみ試験される。続く主要な二次エンドポイントは、一次エンドポイント及び前述の主要な二次エンドポイントが、０．０５の有意水準（両側検定）で統計的に有意である場合にのみ試験される。

【0343】

安全性分析の概要
日常的な安全性評価が行われる。ＡＥ、ＳＡＥ、並びに注入反応及びＴＢを含む感染を含む合理的に関連するＡＥの発生及び種類は、処置群によって要約される。ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ毒性等級に基づく異常な実験室パラメータ（血液学及び化学）を有する対象の数が要約される。加えて、ＡＮＡ及び抗ｄｓＤＮＡ抗体を有する対象の数、並びにゴリムマブに対する抗体と注入反応との関係が要約される。

【0344】

全ての安全性分析は、試験薬剤の少なくとも１回の投与を受けた全ての対象の集団を使用して行われる。分析は、対象が実際に受けた処置を使用して行われる。

【0345】

加えて、グラフデータ表示（卵、折れ線グラフ）及び対象リストもまた、データを要約／提示するために使用され得る。

【0346】

略語：
ＡＥ 有害事象
ＡＳ 強直性脊椎炎
ＡＳＡＳ２０ 強直性脊椎炎評価２０
ＡＳＱｏＬ 強直性脊椎炎の生活の質
ＡＳＳＥＲＴ 組換えインフリキシマブ療法の評価のための強直性脊椎炎試験
ＢＡＳＤＡＩ Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指数
ＢＡＳＦＩ Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能指数
ＢＡＳＭＩ Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測指数
ＢＣＧ カルメット・ゲラン桿菌
ＣＨＦ うっ血性心不全
ＣＭＨ コクラン－マンテル－ヘンツェル
ＣＲＰ Ｃ反応性タンパク質
ＤＡＳ 疾患活動性スコア
ＤＢＬ データベースロック
ＤＭＡＲＤ 疾患変性抗リウマチ薬
ＤＭＣ データ監視委員会
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＣＧ 心電図
ｅＣＲＦ 電子ケースの報告形態
ｅＤＣ 電子データキャプチャ
ＥＱ－５Ｄ ＥｕｒｏＱｏｌ－５Ｄ
ＥＱ ＶＡＳ ＥＱビジュアルアナログスケール
ＥＵ 欧州連合
ＧＣＰ 良好な臨床実践
ＨＢＶ Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＣＱ ヒドロキシクロロキン
ＨＣＶ Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス
ＨＲＱＯＬ 健康関連の生活の質
ＩＢ 治験薬概要書
ＩＣＦ インフォームドコンセントフォーム
ＩＣＨ 医薬品規制調和国際会議
ＩＥＣ 独立倫理委員会
ＩｇＧ １ 免疫グロブリンＧ１
ＩＭＡ 独立筋骨格評価因子
ＩＲＢ 治験審査委員会
ＩＶ 静脈内
ＩＷＲＳ 相互作用ウェブ応答システム
ＭＣＳ 精神的健康度
ＭＯＳ－ＳＳ 医学的転帰試験睡眠スケール
ＭＭＰ－１ マトリックスメタロプロテイナーゼ－１
ＭＭＰ－３ マトリックスメタロプロテイナーゼ－３
ＭＴＸ メトトレキサート
ＮＳＡＩＤ 非ステロイド性抗炎症薬
ＰＣＳ 身体的健康度
ＰＤ 薬力学
ＰＫ 薬物動態
ＰＱＣ 製品品質の苦情
ＰＲＯ 患者報告転帰
ＰｓＡ 乾癬性関節炎
ｑ８ｗ ８週ごと
ＲＡ 関節リウマチ
ＲＢＣ 赤血球
ＳＡＥ 重篤な有害事象
ＳＡＰ 統計的分析計画
ＳＣ 皮下
ＳＦ－３６ ３６項目略式健康調査
ＳＳＺ スルファサラジン
ＴＢ 結核
ＴＮＦα 腫瘍壊死因子α
ＴＳＴ ツベルクリン皮膚反応
ＵＳ 米国
ＶＡＳ ビジュアルアナログスケール
ＷＢＣ 白血球
ＷＬＱ 作業制限アンケート

【0347】

導入
ゴリムマブは、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖アイソタイプ（Ｇ１ｍ［ｚ］アロタイプ）及びκ軽鎖アイソタイプを有する完全ヒトモノクローナル抗体である。ゴリムマブは、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。ゴリムマブの分子量は、１４９，８０２～１５１，０６４ダルトンの範囲である。ゴリムマブは、ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の可溶性形態及び膜貫通生物活性形態の両方を有する高親和性安定複合体を形成するヒトモノクローナル抗体であり、これは、ＴＮＦαのその受容体への結合を妨げる。他のＴＮＦαスーパーファミリーリガンドに対する結合は観察されなかった。具体的には、ゴリムマブは、ヒトリンパ球に結合しない、又は中和しない。腫瘍壊死因子αは、主に活性化単球、マクロファージ、及びＴ細胞によって、自己会合して生物活性ホモトリマーを形成する膜貫通タンパク質として合成され、タンパク質分解によって細胞表面から急速に放出される。ＴＮＦαのｐ５５又はｐ７５ ＴＮＦ受容体のいずれかへの結合は、受容体細胞質ドメインのクラスタ化をもたらし、シグナル伝達を開始させる。腫瘍壊死因子αは、さまざまな刺激に応答して産生され、続いて、カスパーゼ依存性アポトーシス経路並びに転写因子核内因子（ＮＦ）－κＢ及び活性化因子タンパク質－１（ＡＰ－１）の活性化による炎症応答を促進する、主要なセンチネルサイトカインとして特定された。κ腫瘍壊死因子αはまた、胚中心での免疫細胞の組織化における役割を介して免疫応答を調節する。ＴＮＦαの発現の上昇は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）などの慢性炎症性疾患、並びに乾癬性関節炎（ＰｓＡ）及び強直性脊椎炎（ＡＳ）などの脊椎関節症に関連しており、これらの疾患に特徴的な関節性炎症及び構造的損傷の重要なメディエーターである。

【0348】

強直性脊椎炎
強直性脊椎炎（ＡＳ）は、仙腸関節、多くの場合軸骨格、靭帯付着部、及び末梢関節を伴う未知の病因の慢性炎症性疾患である。ＡＳは、女性よりも男性に罹患することが多く、米国におけるその有病率は、人口の０．２～０．５％と推定される。靱帯付着部の慢性炎症は、主に軸骨格において、新骨形成、靭帯骨棘、及び関節の強直を引き起こす。この軸方向の強直性は、運動範囲の劇的な損失及び障害につながる場合がある。疾患はまた、ブドウ膜炎、心筋炎、肺線維症、腸炎症、及び心伝導異常を含む、骨格外症状も有し得る。脊椎関節炎のサブセットである強直性脊椎炎は、ヒト白血球抗原－Ｂ２７（ＨＬＡ－Ｂ２７）抗原の存在と強く関連していると考えられる。

【0349】

患者は、様々な筋骨格症状（付着部炎による近位関節痛、胸痛、及び末梢関節周囲の圧痛）を経験し得るが、最も一般的な提示症状は慢性的な腰痛症である。腰痛症は、通常、４０歳よりも前に始まり、発症が潜行性であり、朝のこわばりに関連付けられ、最終的には対称的である。これらの筋骨格症状は、倦怠感、発熱、及び体重減少などの構成的症状に関連し得る。ＴＮＦα阻害剤が承認されるまで、ＡＳの処置は有効性が限られており、末梢関節炎を有する患者のサブセットでは、運動、及び経口スルファサラジン（ＳＳＺ）の役割を有するＮＳＡＩＤから主になった。生物学的ＴＮＦα阻害剤は、ランダム化比較試験で、ＡＳ患者の徴候と症状、可動性と身体機能を大幅に改善することが示されている。

【0350】

強直性脊椎炎におけるＴＮＦαの役割
ＡＳなどの様々な適用症に対する抗ＴＮＦα療法の有効性及び安全性プロファイルは、十分に特徴付けられている。腫瘍壊死因子αは、多種多様な機能活性を示す主要な炎症性メディエーターと考えられる。異常に高レベルのＴＮＦαは、ＲＡ、ＰｓＡ、及びＡＳを含むいくつかの免疫介在性疾患の病態生理学に関与している。抗ＴＮＦα抗体によるＴＮＦαの結合は、標的が細胞表面ＴＮＦα受容体に結合することを防ぎ、その結果、下流シグナル伝達カスケード及び不適切な又は過剰なＴＮＦα発現の有害な影響を防止する。活動性ＡＳを有する患者に由来する末梢血及び滑膜組織の両方において、ＴＮＦαのレベルの上昇が観察された。ＴＮＦαはおそらく、ＲＡの滑膜炎にあるようなＡＳの仙腸関節炎において役割を果たすことが示唆されている。コンピュータ断層撮影を対象とする仙腸関節生検で評価された活動性ＡＳを有する５人の患者の試験では、免疫組織学的分析により、大部分がＴ細胞及びマクロファージからなる細胞浸潤が明らかになり、３人の対象の生検のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験により、豊富なＴＮＦαが明らかになった。

【0351】

多くの非盲検及び二重盲検プラセボ対照試験は、ＡＳの徴候及び症状を緩和する際に、インフリキシマブ、組換えＩｇＧ１－κヒトマウスキメラモノクローナル抗ＴＮＦα抗体の実質的な有効性を示している。インフリキシマブは、ＡＳに対する処置として試験された第１の抗ＴＮＦα剤であり、ＡＳを有する対象又はＡＳを含む脊椎関節症と診断された対象のいずれかにおける０、２、及び６週目での５ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ注入の誘導レジメンは、疾患活動性尺度の急速な改善をもたらした。

【0352】

ＡＳのみを有する患者、及びＡＳを含めた脊椎関節症を有する患者におけるインフリキシマブの２つの無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験により、インフリキシマブ療法が臨床転帰尺度の迅速で有意な改善をもたらしたことが示された。ＡＳＳＥＲＴ試験（ＡＳを有する２７９人の対象を含むインフリキシマブの大型、多施設、二重盲検、プラセボ対照試験）において、２４週目の強直性脊椎炎評価２０（ＡＳＡＳ ２０）応答率は、プラセボ処置群における１８％に対してインフリキシマブ処置対象において６０％であった。身体機能の測定値、可動域の生活の質、及びＭＲＩの疾患活動性スコアにも有意な改善が見られた。ＡＳ患者におけるインフリキシマブ療法は、一般に十分に忍容された。

【0353】

エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブなどの皮下（ＳＣ）薬を使用したＡＳにおける腫瘍壊死因子α阻害も、ランダム化プラセボ対照試験で有効であることが示されている。ＡＳの病態生理学におけるＴＮＦαの正確な役割は未だ不明確であるが、ＴＮＦα阻害がこの疾患において主要な治療効果を有するという大きく、かつ増加する一連の証拠が既に存在する。

【0354】

試験の全体的な理論的根拠
抗ＴＮＦα剤を用いた治療は、炎症性関節炎の処置に首尾よく使用されてきたが、抗ＴＮＦα剤は、安全性、投与レジメン、費用及び免疫原性に関して限界がある。これらの制限のいくつかに対処するために、ゴリムマブと呼ばれる完全ヒト抗ＴＮＦαｍＡｂ（ＣＮＴＯ １４８及びｒＴＮＶ １４８Ｂとしても知られる）。ゴリムマブ、完全ヒト抗ＴＮＦαｍＡｂは、ヒトＴＮＦαに高い親和性で結合し、ＴＮＦαの生物活性を阻害する。更に、ゴリムマブは、ＴＮＦα媒介細胞毒性及びＴＮＦα媒介内皮細胞活性化を阻害する。ゴリムマブはまた補体媒介細胞溶解の活性化を誘導し、ヒトＴＮＦαを過剰発現するマウスにおける関節炎の発症を減少させる。

【0355】

ＳＣゴリムマブを含む抗ＴＮＦα剤による治療は、ＡＳに罹患している対象において、徴候及び症状、身体機能、並びに健康関連生活の質（ＨＲＱＯＬ）を有意に改善することが実証されている。５年間の追跡調査を通して、ＳＣゴリムマブの長期的な安全性及び有効性を評価するために、ＡＳを有する対象におけるゴリムマブのＳＣ投与に関する全体的な無作為化二重盲検プラセボ対照第３相試験が完了した（試験Ｃ０５２４Ｔ０９）。ゴリムマブの皮下投与は、ＡＳの徴候及び症状を改善するのに有効であることが実証された。安全性分析は、ＳＣゴリムマブが一般的に耐容性が良好であることを示し、他の抗ＴＮＦα剤で観察されたものと同様の安全性プロファイルを示した。

【0356】

ＳＣゴリムマブの既知の安全性及び有効性を考慮すると、ＩＶゴリムマブは、ＲＡ、ＰｓＡ、及びＡＳなどのリウマチ性疾患における他の抗ＴＮＦα剤と一致する許容される安全性プロファイルで有効であることが証明されると予想された。ゴリムマブの静脈内投与は、ＲＡ処置の承認の基礎となった第３相試験（ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１）で確定的に試験された。ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１試験は、同時メトトレキサート（ＭＴＸ）療法にもかかわらず活動性ＲＡを有する対象における、０週目、４週目、及びその後８週ごと（ｑ８ｗ）に３０±１０分にわたって注入されるゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与の有効性及び安全性に関する、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、多施設２群試験であった。ＭＴＸにもかかわらず活動性ＲＡを有する対象は、０週目、４週目、及び８週ごとに２４週まで２ｍｇ／ｋｇでプラセボ注入又はゴリムマブのＩＶ投与のいずれかを受けるように無作為化された。２４週目に開始して、１００週まで、全ての対象をＩＶゴリムマブで処置した。ＩＶゴリムマブは、ＲＡの徴候及び症状、身体機能、並びに健康関連の生活の質の改善、並びに構造的損傷の進行の抑制において実質的な利益を提供することが実証された。

【0357】

ＲＡの処置において静脈内投与されたゴリムマブ（ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１）では、輸注反応の発生率は低く、ロバストな有効性及び許容される安全性プロファイルを示した。この提案された第３相試験は、活動性ＡＳを有する対象の処置における静脈内（ＩＶ）ゴリムマブの有効性及び安全性を評価するように設計されている。現在入手可能なＩＶ抗ＴＮＦα剤は免疫原性及び輸注反応に関して制限があり、ＩＶゴリムマブの提案された３０±１０分注入と比較してより長い注入時間（６０～１２０分）を有するので、ＡＳ患者におけるＩＶ投与経路が評価されている。

【0358】

患者はまた、ＳＣ剤と比較してより頻繁な投与よりもｑ８ｗ ＩＶゴリムマブの維持投与計画を好むことがある。したがって、ＩＶゴリムマブは現在利用可能な処置選択肢への重要な追加であり得る。

【0359】

この試験のための投与レジメンは、０週目及び４週目、その後８週ごとに３０分にわたってＩＶ注入により投与される２ｍｇ／ｋｇのゴリムマブである。

【0360】

試験設計及び理論的根拠
試験設計の概要
これは、ＮＳＡＩＤに対して応答が不十分であるか、又は不耐性である、活動性ＡＳを有する対象におけるＩＶゴリムマブの有効性及び安全性をプラセボと比較した第３相多施設無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。およそ２００人の対象は、およそ７０箇所の治験実施施設で無作為化される。対象は、０週目、４週目及び１２週目に、ＩＶ注入でゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇ又はプラセボを受けるように無作為に割り当てられる。１６週目に、プラセボ注入を受けた全ての対象は、交差し、１６週目、２０週目、及びその後ｑ８ｗに５２週までゴリムマブＩＶ注入を受け始める。ゴリムマブＩＶ処置群の対象は、１６週目にプラセボ注入を受け、盲検を維持し、２０週目及びその後ｑ８ｗに５２週までゴリムマブＩＶ注入を受容し続ける。データベースロック（ＤＢＬ）は、２８週目及び６０週目に予定されている。

【0361】

最後の試験処置投与の少なくとも８週間後に、有害事象（ＡＥ）及び重篤な有害事象（ＳＡＥ）について対象を追跡する。試験の終了は、最後の対象が６０週の訪問を完了する時として定義される。

【0362】

図１８に、試験設計の図を示す。

【0363】

試験設計の理論的根拠
試験母集団
標的試験集団は、改訂ニューヨーク基準によって定義されるように、試験薬剤の最初の投与の少なくとも３か月前に活性ＡＳを有する対象である。

【0364】

処置群、投与量、及び用量投与間隔
対象は、以下のように、０週～１週の２つの処置群で無作為化される。
・群１（ｎ＝１００）：ＩＶプラセボ注入
・群２（ｎ＝１００）：ＩＶゴリムマブを２ｍｇ／ｋｇ注入

【0365】

ゴリムマブに無作為に割り付けられた対象は、０週目、４週目、及びその後ｑ８ｗに５２週目まで、ゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入を受ける。ゴリムマブに無作為化された１６人の対象では、プラセボ注入を受けて盲検を維持する。０，４週目及び１２週目にプラセボＩＶ注入を受けるために無作為に割り当てられた全ての対象は、第１６週での積極的処置にクロスオーバーし、第１６，２０週及びその後５２週目までｑ８ｗで、ゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇ ＩＶ注入を受ける。ゴリムマブＩＶ処置群における対象は、ゴリムマブＩＶ注入を受け続ける。

【0366】

処置の試験相及び持続時間
この試験では、スクリーニング、二重盲検プラセボ制御、積極的処置、及び安全性追跡調査の４相がある。６週間までのスクリーニング段階は、スクリーニング試験評価を実施するのに充分な時間を可能にし、試験適格性を決定する。試験の第２相は、第０週から第１６．週までの二重盲検プラセボ制御期である。試験の第３相は、１６週目～５２週目までの積極的処置期である。試験の第４相は、安全性追跡調査相であり、試験薬剤の最後の投与から８週間である。安全性追跡調査は、ゴリムマブの半減期のおよそ５倍に相当する期間にわたって対象を監視することを可能にする。各対象の最初の処置割り当ては、試験の６０週間にわたって部位及び対象にまだ盲検化されている。この持続時間は、ＡＳに対する維持療法としてのＩＶゴリムマブの有効性及び安全性を実証するのに適切な時間を提供する。

【0367】

この試験は、最後の対象が最後の予定された訪問を完了すると終了する（６０週目の訪問）。

【0368】

試験管理、無作為化、及び盲検化
無作為化は、処置群に対する対象の評価における偏りを最小限に抑え、既知及び未知の対象属性（例えば、人口統計学的及びベースライン特性）が処置群全体に均等にバランスがとれるようにする可能性を高め、処置群にわたる統計的比較の妥当性を高めるために、使用される。加えて、ランダム化は、地理的領域及び抗ＴＮＦα療法の使用前に階層化される（はい又はいいえ）。

【0369】

個々の対象及び研究者は、試験の継続期間にわたって盲検化されたままである。盲検処置は、データ収集中及び臨床的エンドポイントの評価中の偏りの可能性を低減するために使用される。２つのＤＢＬは、２８週目及び第６０．週目の試験のために計画されている。第１のＤＢＬは、全ての対象が、第２８週目の訪問又は終了試験参加を完了した後に行われる。第２のＤＢＬは、全ての対象が、第６０週目の訪問又は終了試験参加を完了した後のいずれかで行われる。データベースは、第２８週にロックされ、サマリーレベルデータは、選択された個人のデータ分析及びデータレビューのために、対象レベルデータをＤＢＬで非盲検化する。全ての施設職員及び対象は、６０週目のＤＢＬが行われるまで、無盲検薬剤師を除いて、処置割り当てに対して盲検化されたままである。

【0370】

有効性評価
本試験のために選択された有効性評価は、ＡＳの処置のための治療用生物学的薬剤の以前の試験において確立された。本試験のために選択された患者報告転帰（ＰＲＯ）はまた、ＡＳの他の試験及び適用可能な米国／ＥＵ規制指針文書の医学文献に受け入れられている臨床的に関連する測定とも一致する。

【0371】

強直性脊椎炎応答評価には、以下が含まれる。
・Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能指標（ＢＡＳＦＩ）
・患者の総合評価
・全背部痛
・Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ）
・３６項目略式健康調査（ＳＦ－３６）
・Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測指標（ＢＡＳＭＩ）
・強直性脊椎炎生活の質（ＡＳＱｏＬ）アンケート
・胸郭拡張
・夜の背部痛
・付着部炎指数
・医学的転帰試験睡眠スケール
・作業制限アンケート（ＷＬＱ）
・生産性ビジュアルアナログスケール
・ＥｕｒｏＱｏｌ－５Ｄ（ＥＱ－５Ｄ）アンケート

【0372】

対象集団
試験に適格な対象は、改訂されニューヨーク基準によって「明確」として定義される少なくとも３か月のＡＳの診断、並びに０～１０ｃｍのスケールでそれぞれ、全背部痛に対する、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ）≧４及びビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）≧４によって証明されるように、活動性疾患の症状を有する１８歳以上の男性又は女性である。対象は、≧０．３ｍｇ／ｄＬのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルを有することが必要である。

【0373】

試験集団の他の主要な特徴は、以下のとおりである：
・ＭＴＸ、ＳＳＺ及びヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、並びに低用量経口コルチコステロイドの現在の使用者は許容されており、これらの投薬の安定用量服用の状態で試験を開始するべきである。
・１つ以下の生物学的抗ＴＮＦα剤（ゴリムマブ以外）への曝露前の対象は、この試験への組み込みに許容されるが、試験集団の最大でも２０％に限定される。
・側面脊椎レントゲン写真上で視覚化された頸椎及び腰椎の全ての椎間レベルに存在して橋渡しする靱帯骨棘形成として定義される完全な脊椎強直症を有する対象は、この試験への組み込みに許容されるが、試験集団の最大でも１０％に限定される。

【0374】

適格な対象のためのスクリーニングは、試験薬の投与前６週間以内に実施される。

【0375】

この試験に対象を登録するための組み入れ基準及び除外基準は、以下の２つのサブセクションに記述される。以下の組み入れ基準又は除外基準について疑問がある場合、治験責任医師は、試験に対象を包含する前に適切な治験依頼者担当者に相談すべきである。

【0376】

組み入れ基準
各可能性のある対象は、この試験に登録されるには下記の基準全てを満たす必要がある。
１． 対象は１８歳以上の男女である必要がある。
２． 対象は健康診断、病歴、バイタルサイン、スクリーニング時に行われた１２誘導心電図（ＥＣＧ）に基づいて医学的に安定している必要がある。この決定は、対象の情報源文書に記録され、治験責任医師によって頭文字で署名されている必要がある。
３． 対象は、スクリーニングで行われる臨床検査試験に基づいて医学的に安定である必要がある。肝臓酵素又は血液学を含む血清化学パネルの結果が正常な基準範囲外である場合、対象は、研究者が異常又は正常からの逸脱を臨床的に有意でないと、又は試験中の集団に適切かつ妥当であると、判断した場合にのみ対象が含まれてもよい。この決定は、対象の情報源文書に記録され、治験責任医師によって頭文字で署名されている必要がある。包含基準＃６及び＃１６に記載されている試験については、結果は、評価基準＃６及び＃１６で許容される適格範囲内である必要がある。
４． 改訂ニューヨーク基準によって定義されるように、試験薬剤の最初の投与の少なくとも３か月前に明確なＡＳ診断を受ける。
Ｘ線撮影基準と少なくとも１つの臨床基準との両方が満たされる必要がある。
ａ．Ｘ線撮影基準：両側仙腸関節炎等級≧２、又は片側仙腸関節炎等級３～４。
ｂ．臨床基準（少なくとも１つ）：
ｉ．運動により改善されるが安静により軽快しない、３か月を超える腰痛症及びこわばり。
ｉｉ．矢状面及び前頭面の両方における腰椎の運動の制限。
ｉｉｉ．年齢及び性別について補正された正常値に対する胸郭拡張の制限。
５． ０～１０ｃｍのスケールでそれぞれ、≧４の全背部痛に対する、≧４のＢＡＳＤＡＩスコア及びＶＡＳスコアの両方によって証明されるように、スクリーニング時及びベースライン時の活動性疾患の症状を有する。
６． スクリーニング時に≧０．３ｍｇ／ｄＬのＣＲＰレベルを有する。
７． ＮＳＡＩＤの最大推奨用量での合計４週間にわたる少なくとも２つのＮＳＡＩＤに対して不十分な応答を有するか、又はＮＳＩＤに対する不耐性、毒性、禁忌のために、４週間全部の最大ＮＳＡＩＤ治療を受けることができない。
８． ＡＳにＮＳＡＩＤ又は他の鎮痛剤を使用する場合、試験薬剤の最初の投与の少なくとも２週間前に、安定な用量である必要がある。現在ＡＳにＮＳＡＩＤ又は他の鎮痛剤を使用していない場合、試験薬剤の最初の投与の少なくとも２週間前にＡＳにＮＳＡＩＤ又は他の鎮痛剤を受けていない必要がある。
９． 経口コルチコステロイドを使用する場合、試験薬剤の最初の投与前の少なくとも２週間、≧１０ｍｇのプレドニゾン／日に相当する安定用量を服用する必要がある。現在コルチコステロイドを使用していない場合、試験薬剤の最初の投与前の少なくとも２週間にわたって、経口コルチコステロイドを受けていない必要がある。
１０． ＭＴＸ、ＳＳＺ、又はＨＣＱを使用する場合、試験薬剤の最初の投与の少なくとも３か月前に処置を開始する必要があり、疾患変性抗リウマチ薬（disease modifying antirheumatic drug、ＤＭＡＲＤ）に起因する重篤な毒性副作用を有していない必要がある。投与及び投与のメトトレキサート経路（２５ｍｇ／週を超えない）は、試験薬剤の最初の投与の少なくとも４週間前に安定であるべきである。ＳＳＺ又はＨＣＱを使用する場合、試験薬剤の最初の投与前の少なくとも４週間にわたって、同様に安定な用量である必要がある。ＭＴＸ、ＳＳＺ、又はＨＣＱを現在使用していない場合、試験薬剤の最初の投与の少なくとも４週間前にこれらのＤＭＡＲＤを受けていない必要がある。
１１． 無作為化の前に、女性は以下のいずれかである必要がある：
・妊娠する可能性がないこと：初経前、閉経後（少なくとも１２か月間無月経の＞４５歳）、永久不妊（卵子、卵管閉塞、子宮摘出術、両側卵管摘出術）、若しくはそれら以外で、妊娠できないこと、
・妊娠の可能性があり、臨床試験に参加している対象に対する避妊法の使用に関する現地の規制に一致する、非常に有効な避妊方法を実践している場合：卵子、確立された経口使用、注射又は埋め込みホルモン法による避妊；子宮内デバイス又は子宮内システムの配置、バリア方法：殺精子フォーム／ジェル／フィルム／クリーム／座薬を有するコンドーム又は殺精子フォーム／ジェル／フィルム／クリーム／座薬を有する閉塞キャップ（横隔膜又は頸部／ボールトキャップ）、男性パートナーの断種（精管切除したパートナーは、その対象の唯一のパートナーであるべきである）；真の禁欲（これが対象の好みの通常の生活様式と一致している場合）。
１２． 妊娠の可能性がある女性は、スクリーニング時に血清による妊娠検査が陰性（β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン［β－ＨＣＧ］）を有し、及び無作為化前の０週目に尿による妊娠検査が陰性を有する必要がある。
１３． 試験期間中及び試験薬の最後の投与を受けてから４か月間は、女性は妊娠しないこと、又は生殖補助医療の目的で卵子（卵子、卵母細胞）を提供しないことに同意する必要がある。
１４． 妊娠する可能性のある女性と性的に活動的であり、精管切除を受けていない男性は、試験中及び試験剤の最後の投薬後４か月間は、例えば、殺精子剤フォーム／ジェル／フィルム／クリーム／座薬付きのコンドーム又はパートナーによる殺精子剤フォーム／ジェル／フィルム／クリーム／座薬付きの閉塞キャップ（隔壁又は頚管／ボールトキャップ）の使用のいずれかの、受胎調節の障壁法を使用することに同意する必要がある。また、男性は全員、試験中及び試験薬剤の最後の投薬を受けてから４か月間は、精液を提供しない必要がある。
１５． 以下の結核（tuberculosis、ＴＢ）スクリーニング基準に従って資格を有すると考えられること：
ａ．スクリーニング前に、潜在性又は活動性ＴＢの病歴がないこと。潜在性ＴＢの病歴を有し、潜在性ＴＢの処置を現在受けている対象については、試験薬剤の最初の投与の前に潜在性ＴＢに対する処置を開始するか、又は試験薬剤の最初の投与前の５年以内に潜在性ＴＢに適切な処置を完了したことを文書にする。
ｂ．病歴及び／又は身体的検査の際に活動性ＴＢを示唆する徴候又は症状を有しないこと。
ｃ．活動性ＴＢを有する人と最近密接な接触がなかったこと、又はかかる接触があった場合は、ＴＢ専門医師に紹介して追加評価を受け、保証された場合は、試験薬剤の最初の投与前に、潜在性ＴＢのための適切な処置を受けること。
ｄ．試験薬剤の最初の投与前６週間以内に、陰性のＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ－ＴＢ Ｇｏｌｄ試験結果を有するか、又は活動性ＴＢが除外され、潜在性ＴＢのための適切な処置が試験薬剤の最初の投与前に開始されている、新たに同定された陽性のＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ－ＴＢ Ｇｏｌｄ試験結果を有すること。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ－ＴＢ Ｇｏｌｄ試験がその国で承認／登録されていないか、又はＴＳＴが現地の健康機関によって義務付けられている場合には、試験薬剤の最初の投与の６週間以内に、ツベルクリン皮膚反応（tuberculin skin test、ＴＳＴ）陰性、又は活動性ＴＢが除外され、潜在性ＴＢに対する適切な処置が試験薬剤の最初の投与の前に開始された、新たに同定されたＴＳＴ陽性が更に必要とされる。
ｉ．持続的に不確定なＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ－ＴＢ Ｇｏｌｄ試験結果を有する対象は、活動性ＴＢが除外され、彼らの胸部Ｘ線写真がＴＢ（活動性又は古い、非活動性ＴＢ）を示唆する異常を示さず、対象が治験責任医師によって判断されるようなＴＢの更なるリスク因子を有しない場合、潜在性ＴＢのための処置なしに登録され得る。
ｉｉ．ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ－ＴＢ Ｇｏｌｄ試験及びＴＳＴは、潜在性ＴＢの病歴及び潜在性ＴＢの進行中の処置を有する対象、又は上記のように十分な処置を完了したことを文書にした対象について、スクリーニングにおいて必須ではない。潜在性ＴＢのための更なる治療を開始するために、上記のように十分な処置を完了したことを文書にした対象は必須ではない。
ｅ．試験薬剤の最初の投与の前３か月以内に行った胸部Ｘ線写真（後－前像）があり、適格な放射線医の読み取りを受け、現在活動性のＴＢ又は古い非活動性ＴＢのエビデンスがないこと。
１６． 以下のパラメータ内のスクリーニング臨床試験結果を有すること：
ａ．ヘモグロビン≧８．５ｇ／ｄＬ
ｂ．白血球≧３．５ｘ１０３／μＬ
ｃ．好中球≧１．５ｘ１０３／μＬ
ｄ．血小板≧１００ｘ１０３／μＬ
ｅ．血清クレアチニン≧１．５ｍｇ／ｄＬ
ｆ．ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びアルカリホスファターゼのレベルは、試験を実施する実験室のＵＬＮ範囲の１．５倍以内である必要がある。
１７． 対象は、このプロトコルに指定された禁止事項及び制限事項を守る意思があり、それが可能である必要がある。
１８． 各対象は、各自が試験の目的とそれに必要な手順を理解し、試験に参加する意思があることを示す、インフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）に署名する必要がある。
１９． 研究のために任意選択のＤＮＡ試料を提供することに同意する場合は、各対象は別個のインフォームドコンセントフォームに署名する必要がある（現地の規制が許す場合）。任意選択のＤＮＡ研究試料に対して許諾を拒否しても、この試験への参加から対象を除外することはない。
２０． 試験薬剤の最初の投与前２週間以内、及び試験期間にわたって、アーユルヴェーダ医学、伝統的な漢方薬（複数可）、及び鍼療法を含む、補完療法の使用を控える意思がある。

【0377】

除外基準
以下の基準のうちのいずれかを満たす任意の可能性のある対象は、この試験の参加から除外される。
１． 限定するものではないが、ＲＡ、ＰｓＡ、全身性エリテマトーデス、又はライム病が挙げられるがこれらに限定されない、ゴリムマブ療法からの利益の評価を混乱させることができる他の炎症性疾患を有する。
２． 試験中に登録されている間、又は試験薬剤の最後の投与を受けた４か月以内に、妊娠している、授乳している、又は妊娠若しくは子をもうけることを計画している。
３． 試験薬剤の最初の投与前の４週間以内に、ＭＴＸ、ＳＳＺ、又はＨＣＱ以外の任意の全身性免疫抑制剤又はＤＭＡＲＤを受けた。これらのカテゴリーの薬剤としては、クロロキン、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、金、及びペニシリンが挙げられるが、これらに限定されない。コルチコステロイドはこの基準には含まれない。コルチコステロイドに関する他の適格性基準を参照されたい。
４． 試験薬剤の最初の投与前の４週間以内にレフルノミドを受けた（薬物排除措置を受けることに関係なく）か、又は試験薬剤の最初の投与前の３か月以内にレフルノミドを受け、薬物排除措置を受けていない。
５． 試験薬剤の最初の投与前の４週間前に副腎皮質刺激ホルモンを含む、硬膜外、関節内、ＩＭ、又はＩＶコルチコステロイドを受けた。
６． ゴリムマブを受けたことがある。
７． インフリキシマブ（バイオシミラの抗ＴＮＦα剤を含む）、アダリムマブ、又はセルトリズマブペゴオールを、試験薬剤の最初の投与前の３か月以内に受けていた。
８． 試験薬剤の最初の投与前の６週間以内にエタネルセプト又はイサイプを受けた。
９． ２つ以上の以前の抗ＴＮＦα剤を受けた。
１０． 以前の抗ＴＮＦα剤に対する主な失敗（治験責任医師によって評価された場合の応答の欠如、又は処置の最初の１６週間以内に有効性の欠如による中止と定義される）を経験したことがある。
１１． トシリズマブ、アレフェプトプト、エファリズマブ、ナタリズマブ、アバタセプト、アナキンラ、ウテキヌマブ、ブロダルマブ、セクキヌマブ、イキセキズマブ、及びＢ細胞枯渇療法を含むがこれらに限定されない抗ＴＮＦα薬以外の以前の生物学的療法を受けたことがある。
１２． トファシチニブ又は他のＪａｎｕｓキナーゼ阻害剤（ＪＡＫ）阻害剤を受けたことがある。
１３． ヒト免疫グロブリンタンパク質に対する過敏症が知られている。
１４． クロラムブシル、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、又は他のアルキル化剤を含む細胞毒性薬を使用していた。
１５． スクリーニングの前に、ヒストプラスマ症又はコクシジオイデス症を含む活発な肉芽腫性感染症の病歴がある。潜在的ＴＢの病歴の適格性に関する情報は、組み入れ基準を参照されたい。
１６． １２か月間のスクリーニングにおいて、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン接種をしていた。
１７． ＴＢを含む悪性疾患又は現在の活動性感染症の異常な示唆を示す、試験薬剤の最初の投与の３か月前の胸部Ｘ線写真を有する。
１８． スクリーニング前の６か月以内に非結核性のマイコバクテリア感染症又は日和見感染症（卵、サイトメガロウイルス、肺気胞症、アスペルギロシス症）を有していた。
１９． 試験薬剤の最初の投与前の２か月以内に帯状疱疹感染症を有していた。
２０． 試験薬剤の最初の投与前の３か月以内、試験中、又は試験薬剤の最後の投与後の３か月以内に、任意の生ウイルス又は細菌ワクチン接種を受けたか、又は受けることが見込まれていること。
２１． 感染した関節プロテーゼの病歴を有するか、又はそのプロテーゼが取り外されていない、若しくは交換されていない場合、関節プロテーゼの疑わしい感染のための抗生物質を受けている。
２２． 重篤な感染症を有していた（限定するものではないが、肝炎、肺炎、敗血症、若しくは腎盂腎炎を含むが、これらに限定されない）か、又は感染症のために入院したことがあるか、又は試験薬剤の最初の投与前の２か月以内に感染症のためのＩＶ抗生物質で処置していた。
２３． 慢性腎臓感染症、慢性胸部感染症（卵、気管支拡張症）、副鼻腔炎、再発性尿路感染症（卵、再発性腎盂腎炎）、開放性、排出性、又は感染性の皮膚創傷、又は潰瘍を含むがこれらに限定されない、慢性又は再発性の感染症の病歴がある、又は継続している。
２４． 対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体陽性であるか、スクリーニング時にＨＩＶ検査結果が陽性である。
２５． Ｂ型肝炎感染を有する。対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のスクリーニングを受ける必要がある。最低でも、これには、ＨＢｓＡｇ（ＨＢＶ表面抗原）、抗ＨＢｓ（ＨＢＶ表面抗体）、及び抗ＨＢｃ総（ＨＢＶコア抗体の合計）を試験することを含む。
２６． スクリーニング前に６か月離れて２つの陰性のＨＣＶ ＲＮＡ試験結果を有することがなく、スクリーニング時に第３の陰性のＨＣＶ ＲＮＡ試験結果を有する限り、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体に対して血清陽性である対象。
２７． 多発性硬化症又は視神経炎などの、既知の脱髄性疾患の病歴を有する。
２８． 重度、進行性、又は制御されていない腎、肝臓、血液学、胃腸、内分泌、肺、心臓、神経学、脳、又は精神疾患の現在の徴候又は症状を有する。
２９． 医学的に制御された無症候性ＣＨＦを含む、同時のうっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する。
３０． リンパ腫、又は異常な大きさ若しくは位置のリンパ性増殖性疾患、臨床的に有意な巨脾症、又は意義不明の単クローン性γグロブリン血症のようなリンパ増殖性疾患の可能性のあるリンパ腫、又は徴候と症状を含む、リンパ増殖性疾患の既知の病歴を有する。
３１． 対象が、スクリーニング前５年以内に悪性疾患の病歴を有する（例外は、外科的に治癒された子宮頸部のその場（in situ）で、試験薬剤の最初の投与及びがんの少なくとも３か月前の再発のエビデンス無しで処置された皮膚の扁平上皮がん及び基底細胞がんである）。
３２． 対象が、ゴリムマブ又はその賦形剤に対する既知のアレルギー、過敏症、又は不耐性を有する（ゴリムマブＩＢを参照）。
３３． 対象が、計画された第１の用量の試験薬剤の前に、任意の禁じられた治療を行った。
３４． 対象が、５半減期又は３か月以内のいずれか長い方に治験薬（治験ワクチンを含む）を受け、又は計画された第１の用量の試験薬剤の３か月以内に侵襲性治験医療装置を使用しているか、又は治験試験に現在登録されている。
３５． 対象が、治験責任医師の意見では参加が対象の最善の利益にならない（卵子、幸福を危うくする）か、又はプロトコルに規定された評価を妨げる、制限する、若しくは混乱させる可能性がある条件を有する。
３６． 対象が、スクリーニング前１か月以内に大手術（卵、全身麻酔が必要）を受けたか、又は手術から完全に回復しなかったか、又は対象が試験に参加すると予想される時期中若しくは試験薬剤の投与の最後の投与後１か月以内に手術を計画した。
３７． 移植器官を有すること（試験薬剤の最初の投与前＞３か月の角膜移植を除く）。
３８． 過去３年以内に薬物乱用（薬物又はアルコール）問題を抱えているか又は抱えていたこと。
３９． 不良な忍容性、又は静脈へのアクセスが困難であるために、複数の静脈穿刺を受ける意思がない、又は受けることができない。
４０． 対象が、治験責任者又は試験実施機関の被雇用者であり、その治験責任者又は試験実施機関の指示に基づいて提示試験又は他の試験に直接的に関与している者、並びにそのような被雇用者又は治験責任者の家族である。

【0378】

注記：治験責任者は、全ての試験登録基準がスクリーニング時に満たされ、再度無作為化の前に満たされていることを確認するべきである。スクリーニング後であるが、第１の用量の試験薬が投与される前に、対象の状態が変化（検査結果又は追加の医療記録の受領を含む）して、全ての適格性基準を満たすことができなくなった場合、対象は、試験への参加から除外されるべきである。

【0379】

禁止事項及び制限事項
可能性のある対象は、試験期間中に参加のために適格であるために、以下の禁止及び制限をいとわず順守することができる必要がある。
１． 妊娠が可能な異性愛の性的に活動的な女性、及び子供をもうけることができる男性はいずれも、非常に効果的な避妊方法を使用し、試験期間中にわたって、及び試験薬剤の最後の投与後４か月間にわたって避妊の使用を継続する必要がある。
２． 以下の薬物の使用は、ＩＶ試験薬剤投与と同時に許容されない。
・クロロキン、アザチオプリン、経口シクロスポリンＡ、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノマイド、経口又は非経口金を含む全身性免疫抑制剤又はＤＭＡＲＤ（ＭＴＸ、ＳＳＺ、及びＨＣＱ以外）。全身性免疫抑制剤は、コルチコステロイド類を指すものではない；コルチコステロイドの制限に関する他のものを参照されたい。
・ＴＮＦαの低減を標的とした生物剤（インフリキシマブ、ＳＣゴリムマブ、セルトリズマブペゴオール、エタネルセプト、ｙｉｓａｉｐｕ、ＣＴ－Ｐ１３［Ｒｅｍｓｉｍａ］及びアダリムマブが挙げられるが、これらに限定されない）α
・ＩＬ－１ｒａ（アナキンラ）
・トシリズマブ、又はＩＬ－６若しくはＩＬ－６受容体を標的とする任意の他の生物剤
・トファシチニブ又は任意の他のＪＡＫ阻害剤
・Ｂ－細胞枯渇剤（卵子、リツキシマブ）
・シクロホスファミド、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード又は他のアルキル化剤などの細胞毒性薬
・アバタセプト
・ウステキヌマブ
・抗ＩＬ－１７剤（卵子、ブロダルマブ、セクキヌマブ及びイキセキズマブ）
・治験薬
３． 試験中に生ウイルス又は生細菌ワクチン接種を受けないことに同意する必要がある。対象は、試験薬剤の最後の投与を受けた３か月後に生ワクチンを受けないことにも同意する必要がある。スクリーニングの１２か月以内にＢＣＧワクチン接種を受けていない必要がある。
４． 試験薬剤以外の治験医療デバイス又は治験薬を、試験期間にわたって受けないことに同意する必要がある。
５． アスピリン及び選択的ＣＯＸ－２阻害剤を含むＮＳＡＩＤ、並びに他の鎮痛剤で処置された対象は、試験が行われている国で承認された通常の市販用量を受けるべきである。ＮＳＡＩＤ及び他の鎮痛剤の処方は、試験薬の最初の投与前の少なくとも２週間調節されるべきではなく、１６週目まで、対象が容認できない副作用を生じた場合にのみ変更されてもよい。１６週目～６０週目の後、１回用量の減少が許容される。そうでなければ、ＮＳＡＩＤ及び他の鎮痛剤の処方は、対象が容認できない副作用を生じた場合にのみ変更されてもよい。
カプサイシン及びジクロフェナクを含む局所鎮痛剤の使用が許容される。
６． 経口コルチコステロイドで処置された対象は、試験薬剤の最初の投与前の少なくとも２週間にわたって、１日当たり≦１０ｍｇのプレドニゾンに相当する安定投与量を受け、この用量を１６週間にわたって投与し続ける必要がある。１６週目～６０週目に、経口コルチコステロイドの１回用量の減少が許容される。そうでなければ、経口コルチコステロイドの用量及び種類は、対象が容認できない副作用を生じた場合にのみ、研究者の裁量で変更されてもよい。
コルチコステロイドの硬膜外投与、ＩＭ又はＩＶ投与は、試験薬剤の最初の投与前の４週間以内には許容されず、試験全体を通して処置は許容されない。全ての試みは、ＡＳ以外の適用症のための試験中に、硬膜外、ＩＭ、及びＩＶコルチコステロイドの使用を避けるために行われるべきである。ＡＳ以外の適用症に対する長期（＞２週間）の経口又はＩＶコルチコステロイドの使用は、６０週目まで許容されない。ＡＳ以外の適用症に使用される短期（≦２週間）の経口、ＩＶ、ＩＭ、又は硬膜外コルチコステロイドは、治療医師の意見において、適切な代替物がない状況に限定されるべきである。
関節内ステロイドは、試験薬剤の最初の投与の４週間前に投与されるべきではない。特に試験の最初の１６週間、関節内コルチコステロイド注射を避ける試みが行われる必要がある。しかしながら、必要であれば、対象は、試験の６０週間の間、２つ以下の影響を受けた部位で、２つ以下の関節内、腱鞘、又は滑液嚢コルチコステロイド注射を受けてもよい。
７． 伝統的医学（卵、漢方薬、鍼療法、アーユルヴェーダ医学）を含むがこれらに限定されない、ＡＳ疾患活動性又は評価に影響を及ぼし得る補完療法の使用は、６０週目まで禁じられている。

【0380】

試験前治療及び併用治療
全ての努力は、第１６週を通して安定した、又はＡＳの治療のために指定された、対象の併用薬を維持するために、全ての努力を行うべきである。併用薬投与量は低減されてもよく、又は異常な検査室値、副作用、併発疾病、又は手術治療の実施のために一時的に中断されてもよいが、変化及び変化の理由は、対象の医療記録において明確に文書化されるべきである。

【0381】

対象は、６０週の試験期間中に、ＡＳの新たな処置を開始するべきではない。

【0382】

併用薬レビューは、時間及びイベントスケジュールにおいて特定された試験訪問において行われる。

【0383】

メトトレキサート、スルファサラジン、又はヒドロキシクロロキン
対象は、安定した用量のＭＴＸ、ＳＳＺ、又はＨＣＱに試験を入れることが可能である。

【0384】

対象がＭＴＸ、ＳＳＺ、又はＨＣＱを使用している場合、処置は、試験薬剤の最初の投与の少なくとも３か月前に開始されるべきである。投与のＭＴＸ経路及び投与量≦２５ｍｇ／週は、試験薬剤の最初の投与前の少なくとも４週間にわたって安定であるべきである。この試験でＭＴＸを摂取した全ての対象は、少なくとも５ｍｇの経口葉酸又は５ｍｇの葉酸を毎週受容することが推奨される。ＳＳＺ又はＨＣＱを使用する場合、対象はまた、試験薬剤の最初の投与前の少なくとも４週間にわたって安定用量を受ける必要がある。

【0385】

ＭＴＸ、ＳＳＺ、又はＨＣＱで処置しない対象は、試験薬剤の最初の投与の少なくとも４週間前に処置を中止する必要があり、６０週目までＭＴＸ、ＳＳＺ、又はＨＣＱを受けない必要がある。

【0386】

全ての努力は、この薬剤を受けている対象における試験の６０週目に、ＭＴＸ、ＳＳＺ、及びＨＣＱの投与の安定投与及び投与経路を維持するために行われるべきである。ＭＴＸ毒性の場合の用量調整に関するガイドラインは、Ｔｒｉａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｉｌｅに含まれる。

【0387】

コルチコステロイド療法
ＡＳのために経口コルチコステロイドで処置された対象は、試験薬剤の最初の投与前の少なくとも２週間、１日当たり≦１０ｍｇのプレドニゾンに相当する安定用量を服用し、この用量を１６週目まで服用し続けるべきである。１６週目～６０週目に、経口コルチコステロイドの１回用量の減少が許容される。そうでなければ、経口コルチコステロイドの用量及び種類は、対象が容認できない副作用を生じた場合にのみ、研究者の裁量で変更されてもよい。ベースラインにおいて経口コルチコステロイドで処置されていない対象は、試験薬剤の最初の投与の少なくとも２週間前に経口コルチコステロイドを中止する必要があり、６０週目までＡＳのための経口コルチコステロイドを受けない必要がある。

【0388】

ＡＳの処置のためのコルチコステロイドの静脈内、筋肉内、又は硬膜外投与は６０週まで許可されない。

【0389】

ＡＳ以外の適用症のための長期（＞２週間）の経口又はＩＶコルチコステロイドの使用は、６０週目まで許容されない。ＡＳ以外の適用症に使用される短期（２週間以内）の経口、ＩＶ、ＩＭ、又は硬膜外コルチコステロイドは、治療医師の意見において、適切な代替物がない状況に限定されるべきである。コルチコステロイドの吸入、耳、眼、鼻腔内、及び粘膜送達の他の経路は、試験の過程を通して許容される。

【0390】

特に試験の最初の１６週間、関節内コルチコステロイド注射を避ける試みが行われる必要がある。しかしながら、必要であれば、対象は、試験の６０週間の間、２つ以下の影響を受けた部位で、２つ以下の関節内、腱鞘、又は滑液嚢コルチコステロイド注射を受けてもよい。単一の関節において重度の圧痛又は腫れがある場合、対象は、関節内コルチコステロイド注射を受ける前に感染について評価されることが勧められる。

【0391】

非ステロイド性抗炎症性薬物及び他の鎮痛薬
安定した用量のＮＳＡＩＤ及び他の鎮痛剤の使用が許容される。

【0392】

アスピリン及び選択的シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤を含むＮＳＡＩＤ、並びに他の鎮痛剤で処置された対象は、試験が行われている国で認可されている通常の市販用量を受けるべきであり、試験薬剤の最初の投与の少なくとも２週間前に安定投与量を服用しているべきである。１６週目に、ＮＳＡＩＤ及び他の鎮痛剤の用量及び種類は、対象が容認できない副作用を生じた場合にのみ変更されてもよい。１６週目～６０週目に、１回用量の減少が許容される。そうでなければ、ＮＳＡＩＤ及び他の鎮痛剤の処方は、対象が容認できない副作用を生じた場合にのみ変更されてもよい。

【0393】

カプサイシン及びジクロフェナクを含む局所鎮痛剤の使用が許容される。

【0394】

この試験では、アスピリンは、心臓血管又は脳血管疾患のために処方された低用量アスピリンを除いて、ＮＳＡＩＤと見なされる。

【0395】

疾患変性抗リウマチ薬／全身性免疫抑制薬
ＭＴＸ、ＳＳＺ、及びＨＣＱを除く疾患変性抗リウマチ薬／全身性免疫抑制薬は、試験薬剤の最初の投与の少なくとも４週間前に中止する必要があり、６０週目までは禁止される。これらのＤＭＡＲＤとしては、クロロキン、金製剤、ペニシラミン、及びレフルノミドが挙げられるが、これらに限定されない。対象が試験薬の最初の投与前３か月以内にレフルノミドを投与された場合、対象は薬物排除措置を受ける必要がある。６０週までの禁忌の全身性免疫抑制薬には、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、及びアザチオプリンが含まれるが、これらに限定されない。全身性免疫抑制剤は、コルチコステロイドを指すものではない。

【0396】

生物学的薬剤、細胞毒性剤又は治験薬
生物学的薬剤（卵、ＳＣゴリムマブ、アナキンラ、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、アレファセプト、エファリズマブ、リツキシマブ、ナタリズマブ）、細胞毒性剤（卵、クロラムブシル、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスター、他のアルキル化剤）、又は治験薬は試験の６０週の際に許容されない。これらの薬物のいずれかが使用されている場合、対象は更なる試験薬の注入を中止されるであろう。

【0397】

補完療法
６０週間の試験期間中は、アーユルヴェーダ医学、漢方薬、又は鍼などの非薬物療法を含む補完療法の使用は許容されない。

【0398】

試験評価
有効性
評価
Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標
ＢＡＳＤＡＩは、以下に定義される。
以下の基準でＶＡＳ（０～１０ｃｍ）を使用した対象の自己評価：
Ａ．倦怠感
Ｂ．脊髄痛
Ｃ．関節痛
Ｄ．付着部炎
Ｅ．定性的な朝のこわばり
Ｆ．定量的な朝のこわばり
ＢＡＳＤＡＩ＝０．２（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋０．５［Ｅ＋Ｆ］）。

【0399】

Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能的指標
ＢＡＳＦＩは、１０個の質問の平均（ＶＡＳ；０～１０ｃｍ）として表される対象の自己評価であり、１０個の質問のうちの８個は対象の機能的な解剖学に関するものであり、１０個の質問のうちの２個は日常生活に対処する対象の能力に関するものである。スケールに沿った増加は、状態が悪化していることを示す。

【0400】

患者の総合評価
患者の疾患活動性の総合評価は、ＶＡＳに記録される（０～１０ｃｍ；０＝非常に良好、１０＝非常に悪い）。

【0401】

全背部痛
対象は、ＶＡＳ（０～１０ｃｍ；０＝痛みなし、１０＝最も重度の痛み）で、過去１週間にわたるその平均全背部痛を評価するように依頼される。

【0402】

夜の背部痛
対象は、ＶＡＳ（０～１０ｃｍ；０＝痛みなし、１０＝最も重度の痛み）で、過去１週間のその夜間の背部痛を評価するよう依頼される。

【0403】

筋骨格の評価
筋骨格系の評価には、ＢＡＳＭＩの各構成要素、付着部炎指数、及び胸郭拡張が含まれる。

【0404】

筋骨格評価を実施する際に適切なトレーニング及び経験を有する独立した筋骨格評価因子（independent musculoskeletal assessor、ＩＭＡ）は、全ての筋骨格評価を行うために各試験実施機関で指定される。対象についてのベースライン筋骨格評価を行う同じＩＭＡはまた、５２週目までの全ての後続の訪問において、その対象について筋骨格評価を実施すべきであることが強く推奨される。

【0405】

治験依頼者は、各部位における最初の対象のスクリーニング前に、各部位の指定されたＩＭＡについてトレーニングを提供する。バックアップＩＭＡは、対象の試験訪問のための筋骨格評価を行う前にトレーニングを完了する必要がある。各ＩＭＡのトレーニング文書は、試験部位で維持されるべきである。可能な場合、試験実施機関における独立した評価者は、試験中に変更されるべきではない。

【0406】

ＩＭＡが過去３年以内の以前の臨床試験において、治験依頼者によってトレーニングされ、このトレーニングの適切な文書（証明書）が存在する場合、そのトレーニングは、この試験に充分であると見なされる。ただし、試験開始前にトレーニングを繰り返すことを勧める。

【0407】

ある機関で筋骨格評価を行っている全てのＩＭＡは、試験実施機関の委任ログに記載されている必要があり、訪問ごとにソースドキュメントに文書化されている必要がある。

【0408】

２８週以降、筋骨格系の評価者はもはや独立している必要はない。しかしながら、筋骨格系の評価者を試験中に変更しないことが推奨される。

【0409】

Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測（Metrology）指標
ＢＡＳＭＩは、５つの要素（０から１０の範囲）の総合スコアとして表され、表６に示すようにファンデルハイデ計算を使用して計算される。

【0410】

【表7】

^＊外側腰椎屈曲、耳珠から壁までの距離、及び頸椎回転については、左右の平均をとる必要がある。スコアが０～１０の範囲外にある場合、０又は１０の値をそれぞれ使用する必要がある。

【0411】

ＢＡＳＭＩ_ｌｉｎは、５つのＳスコアの平均である。

【0412】

５つの成分の評価（Ａ）は部位で収集され、スコア（Ｓ）は、分析が行われたときの評価に基づいてプログラム的に計算される。

【0413】

強直性脊椎炎応答基準における評価
ＡＳＡＳ国際作業部会（ＡＳＡＳ２０）の基準による応答の２０％改善は、次のように定義される：
１． 以下の４つのドメインのうち少なくとも３つにおいて、０～１０ｃｍスケールでベースラインから≧２０％の改善、及び少なくとも１つのベースラインからの絶対的な改善：
ｉ．患者のグローバル
ｉｉ．全背部痛
ｉｉｉ．機能（ＢＡＳＦＩ）
ｉｖ．炎症（朝のこわばりに関するＢＡＳＤＡＩの最後の２つの質問の平均）
２． 潜在的な残りのドメインにおけるベースラインからの劣化（≧２０％、及び０～１０ｃｍスケールで少なくとも１の悪化）。

【0414】

ＡＳＡＳ４０は、４つのドメインの３つにおける≧４０％の改善として定義され、０～１０ｃｍのスケールで少なくとも２の絶対的な改善、及び残りのドメインにおける劣化はない。

【0415】

ＡＳＡＳ ５／６は、疼痛（ＶＡＳ ０～１０ｃｍ）、患者全体（ＶＡＳ ０～１０ｃｍ）、機能（ＢＡＳＦＩスコア）、朝のこわばり（ＢＡＳＤＡＩ）、ＣＲＰ、及び脊椎の可動性（腰椎側屈）の６つのドメインのいずれか５つにおける≧２０％の改善として定義される。

【0416】

低い疾患活動性
低レベルの疾患活動性は、上述の４つのＡＳＡＳドメインのそれぞれにおいて０～１０ｃｍのスケールで２未満の値として定義される「ＡＳＡＳ部分寛解」の基準によって測定される。

【0417】

強直性脊椎炎の疾患活動性スコア
脊椎関節炎国際学会（ＡＳＡＳ）の評価は、ＡＳ、ＡＳＤＡＳで使用するための疾患活動性スコア（ＤＡＳ）を発展させてきた。この試験では、次の式を使用してＡＳＤＡＳスコアを計算する。
ＡＳＤＡＳ＝０．１２１×全背部痛＋０．０５８×朝のこわばりの持続時間＋０．１１０×患者の総合評価＋０．０７３×末梢疼痛／腫脹＋０．５７９×Ｌｎ（ＣＲＰ（ｍｇ／Ｌ）＋１）。

【0418】

ＡＳＤＡＳの主な改善は、減少≧２．０．として定義される。非活動性疾患は、ＡＳＤＡＳスコア＜１．３として定義される。

【0419】

ＡＳＤＡＳにおける臨床的に重要な改善は、減少≧１．１として定義される。

【0420】

付着部炎指数
付着部炎は、ＡＳ及び他の脊椎関節症の重要な特徴である。この試験では、臨床研究で使用されている現在のカリフォルニア大学サンフランシスコ校（University of California San Francisco、ＵＣＳＦ）の付着部炎指数が設定される。ＩＭＡによるリストされた靱帯付着部の評価によって、総付着部炎スコアを決定することができる（表７）。

【0421】

【表8】

【0422】

靭帯付着部は、０（圧痛なし）又は１（圧痛あり）のいずれかとしてスコア化される。

【0423】

胸郭の拡張
胸郭の拡張は、ｃｍで表される、最大吸息及び最大呼気における胸郭の円周間の差である。男性の第４肋間腔のレベル、及び女性の乳房の真下のレベルで測定される。

【0424】

３６項目略式健康調査
医学的転帰試験の健康指標ＳＦ－３６アンケートは、ランド医療保険検査の一部として開発されたものであり、以下の８つのマルチアイテムスケールからなる。
・健康問題による身体機能の制限；
・身体健康問題による、通常の役割活動の制限；
・身体疼痛：
・全般的な精神的健康（心理的苦痛及び幸福）；
・個人的又は感情的な問題による通常の役割活動における制限；
・身体的又は精神的な健康問題による社会的機能の制限；
・活力（元気及び倦怠感）；
・一全般的健康知覚。

【0425】

これらのスケールは、０～１００でスコア化され、より高いスコアはより良好な健康を示す。別のアルゴリズムでは、２つの集計スコア、身体的健康度（ＰＣＳ）及び精神的健康度（、ＭＣＳ）が得られる。これらのサマリスコアはまた、健康状態が良好であることを示すより高いスコアで尺度化されるが、ノルムベースシステムを用いて尺度化され、このとき、一般の米国母集団の基準に基づいて、線形変換を実施してスコアを平均５０及び標準偏差１０に変換する。ＳＦ－３６によって測定される概念は、年齢、疾患又は処置群に対して特異的ではなく、様々な疾患の相対的な負荷、及び様々な治療の相対的な利益を比較することが可能になる。

【0426】

医学的転帰試験睡眠スケール
睡眠障害の程度は、ＭＯＳ－ＳＳを使用して評価される。ＭＯＳ－ＳＳは、開始、維持（ｅｇｇ，眠り）、量、妥当性、眠り（ｅｇｇ，眠気）、及び呼吸障害（ｅｇｇ，息切れ、いびき）を含む、６次元の睡眠を測定する。ＭＯＳ睡眠スケールは、全般的な健康指標であり、健康関連の生活の質（health-related quality of life、ＨＲＱＯＬ）概念－睡眠を評価することであり、これは、皆の健康状態及び福利に関連し、また疾患及び処置によって直接影響を受けることが知られている。したがって、ＭＯＳ－ＳＳは、任意の年齢、疾患、又は処置群に特有ではない。ＭＯＳ－ＳＳの信頼性及び妥当性は、神経障害性疼痛及びＲＡを含む多数の疾患領域において評価されている。

【0427】

強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）アンケート
強直性脊椎炎の生活の質は、自己記入式の患者報告転帰手段である。それは、睡眠、気分、動機、対処能力、日常生活活動、自立、人間関係、社会生活に対する痛みの影響に関する質問に対して「はい」又は「いいえ」の回答を求める１８項目で構成されている。１のスコアは、各アイテム上の「はい」の応答に与えられ、全ての項目スコアは、０～１８の範囲の合計スコアに合計される。より高いスコアは、健康に関係する生活の質を悪化させることを示す。対象は、この手段を４分未満で完了させることができる。

【0428】

ＥＱ－５Ｄアンケート
ＥｕｒｏＱｏｌ－５Ｄ（ＥＱ－５Ｄ）は、ＥｕｒｏＱｏＬ群によって開発された健康状態の標準化された尺度であり、臨床的及び経済的な評価（ＥｕｒｏＱｏＬ Ｇｒｏｕｐ、１９９０）の健康の単純な一般的尺度を提供する。ＥＱ－５Ｄは、幅広い健康状態及び処置に適用できる。ＥＱ－５Ｄは、本質的に、２つの要素：ＥＱ－５Ｄ記述系及びＥＱビジュアル類似体スケール（ＥＱ ＶＡＳ）から本質的になる。ＥＱ－５Ｄ記述系は、以下の５次元：移動性、自己ケア、通常の活動、疼痛／不快感、及び不安／うつ病を含む。各次元は、問題なし、わずかな問題、中程度の問題、深刻な問題、及び極端な問題の５レベルである。レスポンデントは、５つの次元のそれぞれにおいて最も適切な陳述に対して、ボックス内の身長を目印する（又は十字を配置する）ことによって、自分の健康状態を示すように依頼される。この決定は、その次元に対して選択されたレベルを表す１桁の数をもたらす。５次元の桁は、応答者の健康状態を記述する５桁の数字で組み合わせることができ、これは、それぞれの次元のレベルのそれぞれに値（重みとも呼ばれる）を取り付ける式を適用することにより、１つの要約指標（ＥＱ－５Ｄ指標）に変換され得る。ＥＱ ＶＡＳは、回答者の自己評価による健康状態を縦線で記録する。ＶＡＳでは、エンドポイントに「最良の健康状態」及び「最悪の健康状態」と表示される。ＥＱ ＶＡＳは、個々の応答者によって判定される健康転帰の定量的尺度として使用することができる。

【0429】

エンドポイント
一次エンドポイント
この試験の一次エンドポイントは、１６週目にＡＳＡＳ２０応答を達成する対象の割合である。

【0430】

試験は、１６週目のＡＳＡＳ２０を有する対象の割合が、プラセボ群と比較してゴリムマブ群において統計的に有意に大きくなることが実証される場合、陽性であると考えられる。

【0431】

主要な二次エンドポイント
以下の主要な二次エンドポイントは、以下に指定されるような重要性の順序で列挙される。
１． １６週目にＡＳＡＳ４０応答を達成した対象の割合。
２． １６週目にＢＡＳＤＡＩにおけるベースラインから少なくとも５０％の改善を達成する対象の割合。
３． １６週目にＢＡＳＦＩにおけるベースラインからの変化。

【0432】

他の二次エンドポイント
制御された二次エンドポイント（多重度についてのタイプＩ誤差率の制御を伴う）。
以下の制御された二次エンドポイントは、一次及び主要な二次エンドポイントに加えて分析され、以下に指定されるような重要性の順序で列挙される。
１． １６週目のＳＦ－３６ ＰＣＳにおけるベースラインからの変化。
２． １６週目のＳＦ－３６ ＭＣＳにおけるベースラインからの変化。
３． １６週目に低レベルの疾患活動性（ＡＳＡＳ部分寛解）を達成する対象の割合。
４． １６週目のＡＳＱｏＬにおけるベースラインからの変化。
５． １６週目にＢＡＳＭＩにおけるベースラインからの変化。

【0433】

多重度を制御するために、一次及び全ての主要な二次エンドポイントが統計的有意性を達成するときにのみ、上記の順序に従って順次試験される。

【0434】

他の二次エンドポイントとして挙げられるもの
一次、主要二次、及び制御された二次エンドポイントに加えて、以下のエンドポイントが評価される。
１． ２週目にＡＳＡＳ２０応答を達成する対象の割合。
２． ＡＳＡＳ２０応答及びＡＳＡＳ４０応答を経時的に達成する対象の割合。
３． 低疾患活性を達成する対象の割合（ＡＳＡＳ部分寛解）。
４． ＢＡＳＦＩにおけるベースラインの経時的な変化。
５． ＢＡＳＭＩにおけるベースラインからの経時変化。
６． ＳＦ－３６のＰＣＳ及びＭＣＳスコアにおけるベースラインからの経時的な変化。
７． 経時的に＜３のＢＡＳＤＡＩスコアを達成する対象の割合。
８． ＡＳＤＡＳにおけるベースラインからの経時変化。
９． 経時的にＡＳＤＡＳ主改善（減少≧２．０）を達成する対象の割合。
１０． ＡＳＤＡＳ非活動性疾患（＜１．３）を経時的に達成する対象の割合。
１１． ベースラインで付着部炎を有する対象における付着部炎スコアにおけるベースラインからの経時的な変化。
１２． ＡＳＱｏＬスコアにおけるベースラインからの経時的な変化。

【0435】

対象の完了／離脱
完了
対象は、試験の６０週目で評価を完了した場合、試験を完了したと考えられる。いずれの理由についても、試験処置を時期尚早に中止する対象は、試験を完了しているとは見なされない。

【0436】

試験からの離脱
以下の理由のいずれかの場合、対象は試験から離脱させられる。
・追跡調査不能
・同意の撤回
・死亡

【0437】

対象が追跡調査不能の場合、対象に接触し、中止／離脱の理由を判定するために、試験実施機関の職員によってあらゆる妥当な努力を行う必要がある。追跡調査するためにとられた測定値は文書化される必要がある。

【0438】

対象が試験を完了する前に中止する場合、中止の理由は、ｅＣＲＦ及び原資料に文書化する必要がある。中止した対象に割り当てられた試験薬は、別の対象に割り当てられなくてもよい。離脱する対象は交代されない。処置終了前に対象が試験薬剤投与を中止した場合、処置後評価を得る必要がある。

【0439】

主試験に残ったままでの任意選択の研究試料の収集への参加の撤回
対象は、試験に残ったまま、任意選択の研究試料についての同意を撤回することができる。かかる場合、任意選択の研究試料が破棄される。試料破壊プロセスは、上記のように進む。

【0440】

将来の研究における試料の使用の撤回
対象は、研究のために試料を使用するために同意を撤回することができる。かかる場合、試料は、臨床試験に必要とされなくなった後に破棄される。研究のための試料保持の詳細は、任意の研究試料について、主ＩＣＦ及び別個のＩＣＦに提示される。

【0441】

統計的方法
連続変数のｎ、平均、ＳＤ、中央値、ＩＱ範囲、最小値、及び最大値、並びに離散変数の数及び百分率などの単純な記述要約統計を使用して、ほとんどのデータを要約する。

【0442】

特に明記しない限り、抗ＴＮＦα療法の以前の使用によって階層化されたコクラン－マンテル－ヘンツェル（ＣＭＨ）検定を使用して、処置に応答する対象の割合などのカテゴリー変数を比較する。一般に、抗ＴＮＦα療法を因子として使用する前のＡＮＯＶＡは、特に明記しない限り、連続変数を分析するために使用される。全ての統計的試験は、α＝０．０５（両側検定）で行われる。統計分析に加えて、グラフデータ表示（卵、折れ線グラフ）及び対象リストもまた、データを要約／提示するために使用され得る。

【0443】

対象情報の有効性分析及び概要は、処置意図集団（即ち、全ての無作為化対象）に基づく。有効性分析に含まれる対象は、割り当てられた治療を受けるか否かに関わらず、割り当てられた処置群に従って要約される。

【0444】

安全性及びＰＫ分析は、試験処置の少なくとも１回の投与を受けた全ての対象を含む。

【0445】

有効性解析
一次評価項目分析
この試験の一次エンドポイントは、１６週目にＡＳＡＳ２０応答を達成する対象の割合である。

【0446】

主要な目的に対処するために、１６週目にＡＳＡＳ２０応答を達成する対象の割合は、０．０５（２面）の有意水準で抗ＴＮＦα療法（はい又はいいえ）を使用して階層化されたＣＭＨ試験を用いて、プラセボ群とゴリムマブ群との間で比較される。

【0447】

この主有効性分析では、全ての無作為化された対象からのデータは、それらの実際の治療を受けたかに関わらず、それらの割り当てられた処置群に従って分析される。対象が１６週目に少なくとも１つのＡＳＡＳ成分のデータを有する場合に、欠測ＡＳＡＳ成分を割り振るために、最後の観測値の繰り越し（ＬＯＣＦ）手順が使用される。対象が１６週目に全てのＡＳＡＳ成分のデータを有しない場合、対象は、非応答者と見なされる。更に、処置失敗規則が適用される。

【0448】

加えて、サブグループ分析は、人口統計的特性、ベースライン疾患特性、及びベースライン薬剤による一次有効性エンドポイントにおける一貫性を評価するために行われる。サブグループと処置群との間の相互作用検定も、必要に応じて提供される。

【0449】

主要な二次分析
以下の主要な二次分析は、以下に指定されるような重要性の順序で行われる。
１． １６週目にＡＳＡＳ４０を達成する対象の割合をまとめて、処置群間で比較する。
２． １６週目にＢＡＳＤＡＩのベースラインから少なくとも５０％の改善を達成する対象の割合をまとめて、処置群間で比較する。
３． １６週目におけるＢＡＳＦＩにおけるベースラインからの変化をまとめて、処置群間で比較する。

【0450】

２つの処置群（１つの統計的比較）のみが存在するため、各有効性エンドポイント内で多重度を調節する必要はない。

【0451】

多重度についてのタイプＩ誤差率を制御するために、第１の主要な二次エンドポイントは、一次エンドポイントが０．０５の有意水準（両側検定）で統計的有意性を達成した場合にのみ試験される。続く主要な二次エンドポイントは、一次エンドポイント及び前述の主要なセ二次エンドポイントが、０．０５の有意水準（両側検定）で統計的に有意である場合にのみ試験される。

【0452】

他の計画された有効性分析
制御された二次エンドポイント（多重度についてのタイプＩ誤差率の制御を伴う）。
以下の有効性分析は、一次及び主要な二次分析に加えて行われる。
１． １６週目におけるＳＦ－３６ ＰＣＳのベースラインからの変化をまとめて、処置群間で比較する。
２． １６週目におけるＳＦ－３６ ＭＣＳのベースラインからの変化をまとめて、処置群間で比較する。
３． １６週目に低レベルの疾患活性（ＡＳＡＳ部分寛解）を達成する対象の割合をまとめて、処置群間で比較する。
４． １６週目でＡＳＱｏＬのベースラインからの変化をまとめて、処置群間で比較する。
５． １６週目でＢＡＳＭＩのベースラインからの変化をまとめて、処置群間で比較する。

【0453】

多重度について制御するために、上記の分析は、全ての一次及び主要な二次エンドポイントが統計的有意性を達成したときにのみ、上記の順序に従って順次実施される。そうでなければ、公称Ｐ値が提供される。

【0454】

他の二次エンドポイントとして挙げられるもの
以下のエンドポイントは、処置群によって要約される。エンドポイントの訪問が指定されていない場合、要約は５２週まで経時的である。処置群間の比較は、１６週目の前の訪問時及び１６週目に行われる。
１． ２週目にＡＳＡＳ２０応答を達成する対象の割合は、処置群によって要約され、群間で比較される。
２． ＡＳＡＳ２０応答及びＡＳＡＳ４０応答を達成する対象の割合。
３． 低疾患活性を達成する対象の割合（ＡＳＡＳ部分寛解）。
４． ＢＡＳＦＩにおけるベースラインの変化。
５． ＢＡＳＭＩにおけるベースラインからの変化。
６． ＳＦ－３６のＰＣＳ及びＭＣＳスコアにおけるベースラインからの変化。
７． ＜３のＢＡＳＤＡＩスコアを達成する対象の割合。
８． ＡＳＤＡＳにおけるベースラインからの変化。
９． ＡＳＤＡＳ主要改善を達成する対象の割合（減少≧２．０）。
１０． ＡＳＤＡＳ非活動性疾患を達成する対象の割合（＜１．３）。
１１． ベースラインにおいて付着部炎を有する対象における付着部炎スコアにおけるベースラインからの変化。
１２． ＡＳＱｏＬスコアにおけるベースラインからの変化。

【0455】

エンドポイントの基準
試験は、１６週目のＡＳＡＳ２０を有する対象の割合が、プラセボ群と比較してゴリムマブ群において統計的に有意に大きくなることが実証される場合、陽性であると考えられる。

【0456】

試験薬情報
試験薬の物理的記述
ゴリムマブ
ＩＶ投与用の５０ｍｇゴリムマブ最終バイアル製品（ＦＶＰ）は、４ｍＬのＩ型ガラスバイアル中にＣＮＴＯ １４８ ＩｇＧを含有する使い捨て滅菌溶液として供給される。各バイアルは、ｐＨ５．５のヒスチジン、ソルビトール、及びポリソルベート８０の水性媒体中の１２．５ｍｇ／ｍＬゴリムマブの４ｍＬ溶液を含む。防腐剤は存在しない。

【0457】

プラセボ
通常の生理食塩水が、単回使用注入バッグ内でＩＶ注入用の滅菌液体として供給される。防腐剤は存在しない。

【0458】

調製、取り扱い、及び保管
試験施設では、ゴリムマブ溶液のバイアルを２℃～８℃（３５．６°Ｆ～４６．４°Ｆ）の安全な冷蔵庫に保管し、凍結せず、遮光する。製品の激しい振盪を避けるべきである。投与前に、製品は、粒子状物質及び変色に関して視覚的に検査されるべきである。変色、可視粒子、又は他の異物が溶液中に観察される場合、製品は使用されるべきではない。

【0459】

ガラスバイアル瓶中の試験薬剤は、使用の準備が整う。試験薬剤のＩＶ注入は、盲検薬剤師又は他の適切に許諾された及び許可された人員によって、対象の体重に従って調製される。薬剤師又は他の適切に許諾され、認可された職員は、適切な数のバイアルを使用して必要な量の試験薬剤を調製する。

【0460】

無菌手順は、試験材料の調製及び投与中に使用される必要がある。日光への曝露は、調製及び投与中に回避されるべきである。

【0461】

結果及び結論
活動性強直性脊椎炎を有する成人患者における静脈内ゴリムマブの安全性及び有効性のための２８週までの結果：
導入：
ＧＯ－ＡＬＩＶＥは、活動性ＡＳを有する成人患者におけるＩＶゴリムマブの安全性及び有効性を評価するために設計された第３相多施設共同無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。患者（年齢≧１８歳）は、明確なＡＳ（改訂ニューヨーク基準に準拠）及びＢＡＳＤＡＩ≧４、全背部痛ビジュアルアナログスケール≧４、及びＣＲＰ≧０．３ｍｇ／ｄＬの診断を受けた。患者は、０週目、４週目及び８週ごとのＩＶゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇ、又は１６週目にゴリムマブにクロスオーバーする０週目、４週目、及び１２週目のプラセボに無作為化された（１：１）。最大２０％の患者は、以前の抗ＴＮＦ薬（ゴリムマブ以外）を有し得、患者の最大１０％は、脊椎の完全な強直性を有し得る。一次エンドポイントは、１６週目におけるＡＳＡＳ２０であった。主要な二次エンドポイントは、１６週目におけるＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０、及びＢＡＳＦＩスコアの変化であった。他の統計的に制御された評価はＢＡＳＭＩ、ＡＳＡＳ部分寛解、ＳＦ－３６ ＰＣＳ／ＭＣＳ、及びＡＳＱｏＬであった。患者は、有害について監視され、２８週目までのデータをここに報告する。全ての研究者及び何人かの治験依頼者の職員は、試験の終了（６０週目）まで処置群について盲検化されたままである。したがって、個々の患者に対する処置群の割り当ては、ここでは報告されていない。

【0462】

結果：
２０８人の患者を無作為化し、試験薬剤を投与した（プラセボ：１０３人；ゴリムマブ：１０５人）。ベースラインの人口統計学的及び疾患の特徴は処置群間で類似していた。患者の７８％は男性であり、平均年齢は３９歳であり、平均疾患持続期間は５．５年であり、８９．９％はＨＬＡ－Ｂ２７陽性であり、５．８％は完全な脊椎強直症を有し、１４．４％は過去に抗ＴＮＦを使用した。１６週目には、プラセボよりもゴリムマブ患者の方が、ＡＳＡＳ２０（７３．３％対２６．２％）、ＡＳＡＳ４０（４７．６％対８．７％）及びＢＡＳＤＡＩ５０（４１．０％対１４．６％）の応答を有意に大きな割合で有した（全て、ｐ＜０．００１；表）。ＢＡＳＦＩの減少もゴリムマブで有意に大きかった。１６週目では、ＳＦ－３６ ＰＣＳ／ＭＣＳ及びＡＳＱｏＬの改善は、プラセボ群よりもゴリムマブ群の方が有意に大きかった。ＡＳＡＳ２０は、早くも２週間で、プラセボよりもゴリムマブの方が有意に高かった（３７．１％対１９．４％；ｐ＝０．００５）。ゴリムマブ群における応答は、２８週目まで維持された。１６週目でゴリムマブに交差したプラセボ患者は、２０週目における臨床応答の改善を有し、これは２８週目まで維持された。１６週目までに、プラセボ患者の２３．３％、及びゴリムマブ患者の３２．４％が、≧１のＡＥを有していた。感染症が、最も一般的なＡＥであった（プラセボ、７．８％；ゴリムマブ、１１．４％）。２８週目までに、全てのゴリムマブ処置患者の３４．８％が≧１ＡＥを示した。鼻咽頭炎（５．４％）は最も一般的であった。２人の患者（１．０％）が、ＳＡＥを有した（膵炎、ｎ＝１；肺炎、ｎ＝１）。２８週目まで、日和見感染症、悪性腫瘍、又は死亡はなく、輸注反応率は低かった（１．４％）。３名の患者に４つの反応が有したが、重篤又は重度なものはなかった。

【0463】

結論：
ＩＶゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇは、プラセボと比較して、ＡＳの徴候及び症状の低減に有効であった。ゴリムマブは、２８週目まで十分に忍容され、安全性プロファイルは、ＳＣゴリムマブを含む他の抗ＴＮＦと一致した。

【0464】

【表9】

【0465】

【表10】

【0466】

強直性脊椎炎患者の健康関連の生活の質に対する抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である静脈内ゴリムマブの効果：第ＩＩＩ相ＧＯ－ＡＬＩＶＥ試験の１年間の結果
背景／目的：
強直性脊椎炎（ＡＳ）を有する患者では、抗ＴＮＦα抗体ゴリムマブ（ＧＬＭ－ＩＶ）のＩＶ投与により、ＧＯ－ＡＬＩＶＥ試験において、１６週目又はそれより早くにプラセボ（ＰＢＯ）よりも大きい、疾患のさまざまな状況の複合尺度（例えば、ＡＳＡＳ応答百分率、ＢＡＳＤＡＩ及びＢＡＳＦＩ）の改善がもたらされた（Ｄｅｏｄｈａｒら Ｊ Ｒｈｅｕｍ．２０１８；４５：３４１）。α改善は、最大で１年間の処置の間、維持された（Ｒｅｖｅｉｌｌｅら Ｊ Ｒｈｅｕｍ．２０１９年．ＤＯＩ：１０．３８９９／ｊｒｈｅｕｍ．１８０７１８）。ここでは、健康関連の生活の質（ＨＲＱｏＬ）に関する処置効果を調べる。

【0467】

方法：
明確なＡＳ（改訂ＮＹ基準に準拠）、４以上のＢＡＳＤＡＩ、４以上の全背部痛ＶＡＳ、０．３ｍｇ／ｄＬ以上のＣＲＰ及びＮＳＡＩＤに対する不十分な応答を示す成人患者を、０週目及び４週目、次に８週間ごとに、ＧＬＭ－ＩＶ ２ｍｇ／ｋｇ、又は０週目及び４週目にＰＢＯ、並びに、１６週目及び２０週目、次に８週間ごとにＧＬＭ－ＩＶ、に無作為化した。ベースラインでこれらの薬剤を投与されていた患者には、安定した用量のメトトレキサート（≦２５ｍｇ／週）、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ＮＳＡＩＤ、その他の鎮痛薬、及び低用量の経口コルチコステロイドを許可した。ＨＲＱｏＬの指標には、強直性脊椎炎の生活の質に関するアンケート（ＡＳＱｏＬ）、項目略式身体的及び精神的コンポーネントサマリースコア（ＳＦ－３６ ＰＣＳ／ＭＣＳ）、医学的転帰試験睡眠スケール（ＭＯＳ－ＳＳ）、及びＥｕｒｏＱｏＬビジュアルアナログスケール（ＥＱ ＶＡＳ）が含まれ、各々１６、２８、及び５２週目に測定された。提示するＰ値は名目値であり、多重度の調整はしていない。

【0468】

結果：
最初の評価（８週目）において、ＧＬＭ ＩＶの投与を受けたＡＳを有する患者は、ＨＲＱｏＬ尺度であるＡＳＱｏＬ；ＳＦ－３６ ＰＣＳ；ＳＦ－３６ ＭＣＳ；ＭＯＳ－ＳＳ；及びＥＱ ＶＡＳにおいて、ＰＢＯを服用している患者よりも有意に高いベースラインからの改善を有した（表１０）。１６週目に、ＧＬＭ－ＩＶの投与を受けたＡＳ患者はまた、各尺度において、それぞれＰＢＯの投与を受けた患者よりもより大きなＨＲＱｏＬのベースラインからの改善を有した（ＡＳＱｏＬ、－５．４対－１．８ ＳＦ－３６ ＰＣＳ、８．５対２．９；ＳＦ－３６ ＭＣＳ、６．５対０．７８；ＭＯＳ－ＳＳ、６．６対２．５；及びＥＱ ＶＡＳ、２０．３対４．８；全てｐ＜０．００１）；表１０を参照されたい。ベースラインからの変化は、ＧＬＭ－ＩＶに無作為化した患者において５２週目まで維持された。１６週目にＰＢＯからＧＬＭＩＶに切り替えた患者は、２８週目までにベースラインからの改善を示し、これは５２週目まで維持され、ベースラインでＧＬＭ ＩＶを投与された患者と同様であった（表）。

【0469】

結論：
ＧＬＭ－ＩＶで処置された活動性ＡＳ患者の中でのＨＲＱｏＬの改善は、８週目でＰＢＯよりも有意に大きく、５２週目まで維持された。１６週目にＰＢＯからＧＬＭ－ＩＶに切り替えた患者は、２８週目までにＨＲＱｏＬの改善を経験し、５２週目まで、最初にＧＬＭ－ＩＶに無作為化された患者と同様のレベルで改善を維持した。

【0470】

【表11】

【0471】

初期疾患を有する強直性脊椎炎患者における静脈内ゴリムマブの有効性及び安全性：ＧＯ－ＡＬＩＶＥ試験の５２週目までの結果
背景：
ＧＯ－ＡＬＩＶＥ試験では、強直性脊椎炎を有する患者における静脈内（ＩＶ）ゴリムマブの有効性及び安全性を評価した。

【0472】

目標：
この事後分析において、有効性転帰及び強直性脊椎炎の生活の質（ＡＳＱｏＬ）を、初期疾患（＜２年の持続期間）を有する強直性脊椎炎患者のサブセットにおいて評価した。

【0473】

方法：
ＧＯ－ＡＬＩＶＥは、第３相無作為化二重盲検プラセボ対照試験とした。患者は、明確な強直性脊椎炎（改訂ニューヨーク基準に準拠）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ）≧４、全背部痛ビジュアルアナログスケールスコア≧４及びＣ反応性タンパク質≧０．３ｍｇ／ｄＬを有した。患者は、０週目、４週目、次いで８週間ごと（ｑ８ｗ）にＩＶゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇに、又は１６～５２週目にＩＶゴリムマブとのクロスオーバーを伴う、０週目、４週目及び１２週目のプラセボに無作為化した（１：１）。一次エンドポイントは、１６週目における脊椎関節炎国際協会（ＡＳＡＳ）２０の評価とした。他の転帰には、ＡＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能指標（ＢＡＳＦＩ）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測指標（ＢＡＳＭＩ）、強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）応答（非活動性疾患、主要かつ臨床的に重要な改善）、ＡＳＱｏＬ、夜の背部痛及び全背部痛、並びに付着部炎（ＵＣＳＦ指数［０～１７］）が含まれた。重篤な事象を含めた、処置により出現した有害事象を評価した。

【0474】

結果：
初期疾患を有する８４人の患者（３８人のプラセボ、４６人のＩＶゴリムマブ）（平均年齢３６．７歳、７３．８％が男性、７９．８％がＨＬＡＢ ２７に陽性）は、プラセボの場合０．８年、及びＩＶゴリムマブの場合０．９年の、疾患の平均持続期間を有した。１６週目に、数字上、より大きな割合のＩＶゴリムマブ患者が、ＡＳＡＳ２０を達成し（ＩＶゴリムマブ７２％対プラセボ２６％）、ＳＡＳ４０、ＢＡＳＤＡＩ５０、ＢＡＳＦＩ及びＢＡＳＭＩについて、一貫した応答パターンが見られた（表１１）。同様に、１６週目において、数字上、より大きな割合のＩＶゴリムマブ患者が、プラセボ（ＡＳＤＡＳの大きな改善及び臨床的に重要な改善それぞれ５％及び１６％）に対して、ＡＳＤＡＳの大きな改善（５９％）及び臨床的に重要な改善（７８％）を達成した；全ての有効性転帰についての応答率は、ＩＶゴリムマブを継続した患者では、５２週目まで維持され、Ｗ１６でＩＶゴリムマブにクロスオーバーした患者は、５２週目に同様の応答を示した。ＩＶゴリムマブの投与を受けた患者はまた、プラセボと比較して、１６週目及び５２週目に、数字上、ＡＳＱｏＬ及び夜の背部痛／全背部痛のより大きな改善を有した（図１９）。１６週目におけるＩＶゴリムマブによる付着部炎の改善（平均変化：プラセボの場合の－０．９に対して－２．３）は、５２週目まで維持され（－２．１）、プラセボからＩＶゴリムマブにクロスオーバーした患者でも同様であった（－２．８）。初期疾患を有する患者のこの部分集団からの、重篤な有害事象を含む安全性データは、試験集団全体に類似していた。

【0475】

【表12】

【0476】

結論：
この事後分析により、初期疾患を有する強直性脊椎炎患者のサブセットにおいて、ＩＶゴリムマブが徴候及び症状及びＡＳＱｏＬの臨床的に意味のある改善を実現することが示唆される。

【0477】

ＧＯ－ＡＬＩＶＥ試験の５２週目までの初期疾患強直性脊椎炎患者における、後期疾患を有する患者と比較した静脈内ゴリムマブの有効性及び安全性
目標：
この事後分析では、初期疾患（ＥＤ）を有する強直性脊椎炎（ＡＳ）患者において、ＧＯ－ＡＬＩＶＥ試験における、対後期疾患（ＬＤ）を有する患者と比較したＩＶ ＧＬＭの有効性及び安全性を、炎症性背部痛（ＩＢＰ）の患者報告持続期間に基づいて評価した。

【0478】

方法：
この第３相の二重盲検プラセボ（ＰＢＯ）対照試験では、活動性ＡＳを有する患者を無作為化（１：１）し、０週（Ｗ）目、Ｗ４に、次いでＱ８Ｗで２ｍｇ／ｋｇのＩＶ ＧＬＭを投与したか、又はＷ０、Ｗ４及びＷ１２にＰＢＯを投与し、Ｗ１６、Ｗ２０、次いで５２週目までＱ８ＷでＩＶ ＧＬＭにクロスオーバーした。一次エンドポイントは、Ｗ１６における脊椎関節炎国際協会（ＡＳＡＳ）２０の達成とした。この分析では、２０８人の患者を、ＩＢＰ症状の持続期間に基づいて四分位数に群分けした。ＥＤを有する６０人の患者（第１の四分位数）における有効性及び安全性を、ＬＤを有する５２人の患者（第４の四分位数）と比較した。

【0479】

結果：
試験集団全体について、ＩＢＰ症状の平均持続期間は１０．９年であり、診断からの平均期間は５．５年であった。ＥＤ患者の場合、ＩＢＰ症状の平均持続期間は２．３年（ＩＶ ＧＬＭ）；２．６年（ＰＢ）であり、ＬＤ患者の場合、２３．５年（ＩＶ ＧＬＭ）、２４．４年（ＰＢＯ）であった。Ｗ１６において、ＡＳＡＳ２０は、ＥＤを有するＰＢＯ患者３２％に対してＩＶ ＧＬＭ７２％で、及びＬＤを有するＰＢＯ患者２１％に対してＩＶ ＧＬＭ６７％で達成された。ＥＤを有する患者は、ＡＳＡＳ４０、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（ＢＡＳＤＡＩ）５０、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能指標（ＢＡＳＦＩ）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測指標（ＢＡＳＭＩ）及び強直性脊椎炎疾患活動性スコア（ＡＳＤＡＳ）非活動性疾患を含む、より厳密なエンドポイントにわたって、ＬＤを有する患者よりも数字上、良好な応答及び大きな改善を有した（表１２）。ＩＶ ＧＬＭで処置された患者の中での応答率は、ＥＤ及びＬＤサブグループの両方において１年を通して概ね一貫していた。同様に、ＥＤ及びＬＤサブグループでは、Ｗ１６においてＩＶ ＧＬＭにクロスオーバーした患者は、Ｗ０において、ＩＶ ＧＬＭを開始した患者と一致する応答をＷ５２に示した。Ｗ１６では、付着部炎の改善は、ＥＤ（平均変化は、ＩＶ ＧＬＭの場合の－２．９対ＰＢＯの場合の０．１）及びＬＤ（平均変化は、ＩＶ ＧＬＭの場合の－２．５対ＰＢＯの場合の０．６）を有する患者の場合、同様であった。応答は、ＥＤ及びＬＤ患者の場合、Ｗ５２で維持された。１年までの処置により出現した有害事象及び重症な有害事象は、それぞれ、ＬＤ患者の場合、６１％及び２％であるのに比較して、ＥＤ患者の場合、４６％及び３％であった。

【0480】

【表13】

【0481】

結論：
ＩＶ ＧＬＭは、ＥＤ及びＬＤを有する患者におけるＡＳの徴候及び症状において臨床的に意味のある改善を実現したが、ＥＤを有する患者における有効性が、数字上、優れていた。これは、迅速な診断及び早期処置の原則を支持するものである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2023553702000001.app

【国際調査報告】