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特表2023-553798ヒト活性化プロテインＣを対象とするモノクローナル抗体とその製造及び応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-26
(54)【発明の名称】ヒト活性化プロテインＣを対象とするモノクローナル抗体とその製造及び応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231219BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231219BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20231219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231219BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231219BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20231219BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231219BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20231219BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231219BHJP
G01N 33/86 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C07K16/40
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P7/04
A61K39/395 N
A61K31/7088
A61K35/12
A61K48/00
G01N33/531 A
G01N33/53 D
G01N33/86
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023530723
(86)(22)【出願日】2021-07-28
(85)【翻訳文提出日】2023-05-19
(86)【国際出願番号】 CN2021108933
(87)【国際公開番号】W WO2023284012
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】202110791310.X
(32)【優先日】2021-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594003676
【氏名又は名称】オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＯＫＬＡＨＯＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】８２５ Ｎ．Ｅ． １３ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈｏｍａ ７３１０４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100112737
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 考晴
(74)【代理人】
【識別番号】100136168
【弁理士】
【氏名又は名称】川上 美紀
(74)【代理人】
【識別番号】100196117
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 利恵
(72)【発明者】
【氏名】徐俊
(72)【発明者】
【氏名】程露
(72)【発明者】
【氏名】易佳▲輝▼
(72)【発明者】
【氏名】夏之松
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼▲業▼恒
【テーマコード（参考）】
2G045
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA10
2G045DA36
2G045FB03
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA53
4C085AA14
4C085DD62
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA53
4C087AA01
4C087AA02
4C087CA12
4C087CA20
4C087NA14
4C087ZA53
4H045AA11
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、モノクローナル抗体の技術分野に属し、活性化プロテインＣ（ａＰＣ）を対象とするモノクローナル抗体に関する。前記モノクローナル抗体は、重鎖、軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５～２６で表され、ＣＤＲ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７～９２で表される。本発明は、更に、前記モノクローナル抗体に関連するバイオマテリアルを提供する。前記モノクローナル抗体は、ａＰＣには選択的に結合可能であるが、活性化していないプロテインＣには結合しない。本発明は、更に、血液凝固欠乏又は欠陥症を治療する薬物の製造における前記モノクローナル抗体及び関連のバイオマテリアルの応用、及び関連の治療方法を提供する。本発明は、広範な応用可能性を有している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖ＣＤＲ領域及び／又は軽鎖ＣＤＲ領域が、突然変異として、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表される軽鎖ＣＤＲ２と比較してＮ５７Ｒ及び／又はＮ５７Ｗの突然変異、
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表される軽鎖ＣＤＲ２と比較してＥ５９Ｇ及び／又はＥ５９Ｐの突然変異、
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で表される軽鎖ＣＤＲ３と比較してＱ９３Ｖの突然変異、
４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で表される重鎖ＣＤＲ１と比較してＮ３１Ｆの突然変異、
５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表される重鎖ＣＤＲ２と比較してＳ５５Ｋの突然変異、
６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表される重鎖ＣＤＲ３と比較してＹ１０４Ｔの突然変異、のうちの１又は複数を含むことを特徴とする抗ａＰＣモノクローナル抗体。
【請求項2】
前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の突然変異前の原配列は、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で表される重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表される重鎖ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖、及び、
ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表される軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表される軽鎖ＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖、を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体。
【請求項3】
前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表される軽鎖ＣＤＲ２と比較してＮ５７Ｒ及びＥ５９Ｇの突然変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体。
【請求項4】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８及び２９で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３４及び３５で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３７及び３８で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０及び４１で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３及び４４で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｈ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４９及び５０で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２及び５３で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｊ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、５５及び５６で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｋ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、５８及び５９で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｌ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｍ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、６４及び６５で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｎ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、６７及び６８で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｏ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、７０及び７１で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｐ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、７３及び７４で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｑ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｒ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、７９及び８０で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｓ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、８２及び８３で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｔ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８５及び８６で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、
（ｕ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、８８及び８９で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、９１及び９２で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、のいずれかから選択されることを特徴とする請求項１に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５のいずれかの配列で表される重鎖、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６のいずれかの配列で表される軽鎖、を含むことを特徴とする請求項４に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体。
【請求項6】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で表される軽鎖を含む抗体、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表される軽鎖を含む抗体、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表される重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で表される軽鎖を含む抗体、から選択されることを特徴とする請求項４に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体。
【請求項7】
前記抗ａＰＣモノクローナル抗体は、完全抗体又はその抗体断片であり、前記抗体断片は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、シングルドメイン抗体、Ｆｖ又はｓｃＦｖであることを特徴とする請求項１に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体に関連するバイオマテリアルであって、１）請求項１に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体をコードする核酸分子、
２）前記１）に記載の核酸分子を含む構造体、
３）前記１）に記載の核酸分子を含む発現システム、のいずれかであることを特徴とするバイオマテリアル。
【請求項9】
製剤製品であって、前記製剤製品は、薬物組成物又は検出用試薬キットであり、
前記製剤製品は、請求項１に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体、又は請求項８に記載のバイオマテリアルのうちのいずれか１つ又は複数を含み、
前記製剤製品が薬物組成物の場合には、更に、薬学的に許容可能なベクターを含むことを特徴とする製剤製品。
【請求項10】
血液凝固の治療に関連する方法であって、治療が必要な個体に対し、有効量の請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体、又は請求項８に記載のバイオマテリアルのうちのいずれか１つ又は複数を投与し、前記個体は血液凝固欠乏又は欠陥症に罹患しており、或いは、前記個体は血液凝固の治療を必要としており、或いは、前記個体は敗血症又は血友病に罹患しており、或いは、前記個体は止血調節を必要としていることを特徴とする方法。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ａＰＣモノクローナル抗体、又は請求項９に記載のバイオマテリアルの、ｉ）血液凝固欠乏又は欠陥症を予防及び／又は治療する薬物の製造における応用、
ｉｉ）ａＰＣによるヒストンＨ３及びＨ４の分解能力を強化する促進剤の製造における応用、
ｉｉｉ）個体内の活性化プロテインＣの抗凝固活性を阻害する薬物の製造における応用、
ｉｖ）血液凝固を必要とする個体を治療する薬物の製造における応用、
ｖｉ）個体の止血を調節する薬物の製造における応用、
ｖｉｉ）疾病、又は非疾病の診断や治療を目的とする免疫学的検査・分析、もしくはａＰＣの検出用試薬又は試薬キットの製造における応用、
ｖｉｉｉ）その他の試薬又は薬物と合わせて使用する際の応用、のうちのいずれか１つ又は複数の使用。
【請求項12】
前記血液凝固欠乏又は欠陥症には、血液凝固因子の欠乏に起因して血液凝固障害が生じ、出血が引き起こされる病気、及び、外傷や手術に起因する血液凝固の乱れが含まれることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項13】
前記血液凝固欠乏又は欠陥症には、血友病、敗血症、外傷性出血が含まれることを特徴とする請求項１２に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、モノクローナル抗体の技術分野に属し、ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）を対象とするモノクローナル抗体とその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
プロテインＣ（ＰＣ）経路は、血液凝固及び炎症の調節において重要な役割を果たす。プロテインＣは、トロンビンと血管内皮細胞上のトロンボモジュリン（ＴＭ）が複合体を形成することで活性化される。活性化プロテインＣ（ａＰＣ）は、活性化したＶ因子及びＶＩＩＩ因子を分解することでトロンビンの形成をネガティブに下方調節するとともに、体内の血栓形成と止血とのバランスを維持する。また、ａＰＣは動物を保護し、エンドトキシン（ＬＰＳ）や大腸菌の侵入を減少させる。組換えヒトａＰＣ製品は、ＦＤＡにより、ヒト重症敗血症の第１の治療薬として認可されている。しかし、現在のところ、ａＰＣの抗炎症及び細胞保護の分子メカニズムは完全には把握されていない。突然変異研究より、ａＰＣの抗血液凝固活性は、ａＰＣによる内皮細胞の抗アポトーシス作用にとって決して必須ではないことが分かっている。血管内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）は、主に大血管内皮上で発現し、トロンビン－ＴＭ複合体によってプロテインＣの活性化を強化する。最近では、ＥＰＣＲに結合したａＰＣが、内皮細胞上でＰＡＲ－１を分解可能なことが証明されている。且つ、当該研究より、ａＰＣシグナルが伝達する全ての抗炎症及び抗アポトーシス作用は、いずれも内皮細胞中でＰＡＲ－１により媒介されることが明らかとなっている。しかし、致死投与量のＬＰＳによる攻撃下において、ＰＡＲ－１欠損型マウスの表現型は野生型対照マウスと類似していた。このことは、ＰＡＲ－１がａＰＣシグナルによる炎症及びアポトーシス調節に関与する唯一のものではないことを意味している。
【0003】
体内で病理・生理機能を調節する際のａＰＣの中心的作用に鑑みて、モノクローナル抗体ＨＡＰＣ１５７３が生産されている。当該抗体は、ヒト活性型プロテインＣ（ａＰＣ）を特異的に識別するが、プロテインＣは識別しない（Ｘｕ，特許文献１、特許文献２）。当該抗体は、ａＰＣによる発色ペプチド基質のアミド分解活性を変化させるとともに、血漿中のａＰＣ抗凝固活性をブロックする。より重要な点として、当該抗体は、ａＰＣによる細胞外ヒストンＨ３及びＨ４の分解には影響せず、内皮細胞のトロンビンが誘発する透過性に対するａＰＣの細胞保護活性にも影響しない。また、ＭＡＰＣ１５９１は、抗マウスａＰＣのモノクローナル抗体であり、ＨＡＰＣ１５７３と類似の機能を有する。ＭＡＰＣ１５９１は、マウスａＰＣの抗凝固活性をブロックしつつ、細胞保護活性は維持可能なことから、血友病Ａの場合でも外傷性出血の危険がない。このことは、抗ａＰＣ抗体を、血友病や外傷、敗血症等の臨床環境に適用可能なことを意味している。
【0004】
趙（Ｚｈａｏ）らは、抗凝固活性のみを対象とし、ａＰＣのその他の活性は対象としないＨＡＰＣ１５７３及びヒト化ＨＡＰＣ１５７３のＣＤＲ配列について報告している。彼らは、急性の後天性血友病Ａのサルモデルにおいて、出血に対する体内保護作用を示している（Ｚｈａｏ，特許文献３、特許文献４、非特許文献１）。これらの報告では、ａＰＣ－ヒト化ＨＡＰＣ１５７３ Ｆａｂ複合体のＸ線結晶構造より、ＨＡＰＣ１５７３はａＰＣの活性部位には結合せず、既知のａＰＣ－ＦＶａ結合点を含むａＰＣ自己消化ループ（ａｕｔｏｌｙｓｉｓ ｌｏｏｐ）に結合する可能性が示された。つまり、ヒト化ＨＡＰＣ１５７３は、ａＰＣとＦＶａの相互作用を妨害することでａＰＣの抗凝固機能を阻害する可能性があった。また、ヒト化ＨＡＰＣ１５７３の阻害作用はａＰＣの抗凝固活性にのみ限られ、細胞保護や抗炎症及び細胞シグナル伝達機能には影響しなかった。報告によると、ヒト血漿中のａＰＣ濃度は約４０ｐｍであり、表面プラズモン共鳴分析より、ａＰＣに対するヒト化ＨＡＰＣ１５７３の親和性は１０ｎＭであった。また、Ｐｒｏｔａｃに基づくＡＰＴＴ血液凝固分析の結果、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿及びヒトＦＩＸ欠乏血漿においてＡＰＴＴの延長を短縮させるＨＡＰＣ１５７３の濃度依存性効果が証明されている。しかし、ＨＡＰＣ１５７３は、濃度５０μｇ／ｍｌの場合でも、このインビトロ試験において、ａＰＣの抗凝固活性に対する最大の阻害作用を達成できていない。この観察の結果は、急性の後天性サル血友病モデルに使用したヒト化ＨＡＰＣ１５７３の体内観察結果と一致していた。動物研究では、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇという高投与量のＨＡＰＣ１５７３の場合にようやく大きな保護作用を付与可能なことが見出されている。しかし、このような高投与量は臨床での使用に適さないため、より親和性の高いヒト化ＨＡＰＣ１５７３とすることが、将来的な治療におけるａＰＣの潜在的応用の前提となり、且つそれを保証するものとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第８１５３７６６号明細書
【特許文献2】米国特許第９１２７０７２号明細書
【特許文献3】米国特許第９６５７１１１号明細書
【特許文献4】国際公開第２０１７／０８７３９１号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｚｈａｏ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０２０
【発明の概要】
【0007】
本発明は、一の態様において、抗ａＰＣモノクローナル抗体を提供する。前記抗ａＰＣモノクローナル抗体は、原抗体と、当該原抗体について、以下の６つの突然変異位置の１又は複数を突然変異させて得た突然変異抗体を含む。
【0008】
前記原抗体は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８及び２９の配列のうちのいずれか１つ又は複数で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２の配列のうちのいずれか１つ又は複数で表される軽鎖ＣＤＲ、を含む。
【0009】
前記６つの突然変異位置は、それぞれ、１）ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＮ５７Ｒ／Ｗ、２）ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＥ５９Ｇ／Ｐ、３）ＶＬ ＣＤＲ３に位置するＱ９３Ｖ、４）ＶＨ ＣＤＲ１に位置するＮ３１Ｆ、５）ＶＨ ＣＤＲ２に位置するＳ５５Ｋ、６）ＶＨ ＣＤＲ３に位置するＹ１０４Ｔ、である。
【0010】
本発明において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の配列のうちの１又は複数を含む。
【0011】
好ましくは、本発明において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の原抗体について行われる突然変異位置には、少なくとも、ＶＨ ＣＤＲ１に位置するＮ３１Ｆ、ＶＨ ＣＤＲ２に位置するＳ５５Ｋ、ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＮ５７Ｒ、及びＶＬ ＣＤＲ２に位置するＥ５９Ｇが含まれる。
【0012】
好ましくは、本発明において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の原抗体について行われる突然変異位置には、少なくとも、ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＮ５７Ｒ、ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＥ５９Ｇ、ＶＬ ＣＤＲ３に位置するＱ９３Ｖ、ＶＨ ＣＤＲ１に位置するＮ３１Ｆ、及びＶＨ ＣＤＲ２に位置するＳ５５Ｋが含まれる。
【0013】
本発明は、別の態様において、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体に関連するバイオマテリアルとして、以下の１）～１０）のうちのいずれか１つ又は複数を提供する。
【0014】
１） 上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体をコードする核酸分子。
【0015】
２） １）で述べた核酸分子を含む発現カセット。
【0016】
３） １）で述べた核酸分子を含む構造体。
【0017】
４） ２）で述べた発現カセットを含む構造体。
【0018】
５） １）で述べた核酸分子を含む発現システム。
【0019】
６） ２）で述べた発現カセットを含む発現システム。
【0020】
７） ３）で述べた構造体を含む発現システム。
【0021】
８） ４）で述べた組換えベクターを含む発現システム。
【0022】
９） 上記抗ａＰＣモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を増幅するプライマー対。
【0023】
１０） 上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体を含む融合抗体。
【0024】
本発明は、別の態様において、製剤製品を提供する。前記製剤製品は、薬物組成物又は検出用試薬キットである。前記製剤製品は、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアルのうちのいずれか１つ又は複数を含む。前記製剤製品が薬物組成物の場合には、更に、薬学的に許容可能なベクターを含む。
【0025】
本発明は、別の態様において、血液凝固の治療に関連する方法を提供する。当該方法は、治療が必要な個体に対し有効量の上記抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアルを投与することを含む。前記個体は血液凝固欠乏又は欠陥症に罹患している。或いは、前記個体は血液凝固の治療を必要としている。或いは、前記個体は敗血症又は血友病に罹患している。或いは、前記個体は止血調節を必要としている。
【0026】
本発明は、別の態様において、血液凝固欠乏又は欠陥症を予防及び／又は治療する薬物の製造における前記抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアルの応用を提供する。前記血液凝固欠乏又は欠陥症には、血液凝固因子の欠乏に起因して血液凝固障害が生じ、出血が引き起こされる病気、及び、外傷や手術に起因する血液凝固の乱れ等が含まれる。更に、前記血液凝固欠乏又は欠陥症には、血友病、敗血症、外傷性出血等が含まれる。
【0027】
本発明は、別の態様において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアルについて、ａＰＣによるヒストンＨ３及びＨ４の切断能力を強化する促進剤の製造における応用、或いは、個体内の活性化プロテインＣの抗凝固活性を阻害する薬物の製造における応用、或いは、血液凝固を必要とする個体について予防及び／又は治療を行う薬物の製造における応用、或いは、敗血症に罹患している個体について予防及び／又は治療を行う薬物の製造における応用、或いは、血友病に罹患している個体について予防及び／又は治療を行う薬物の製造における応用、或いは、個体の止血を調節する薬物の製造における応用、或いは、非疾病の診断や治療を目的とする免疫学的検査・分析、もしくはａＰＣの検出用試薬又は試薬キットの製造における応用、或いは、その他の試薬又は薬物と合わせて使用する際の応用、を提供する。
【0028】
本発明は、別の態様において、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体の製造方法を提供する。当該方法は、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の発現に適した条件で、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の発現システムを培養して、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体を発現させるステップを含む。
【発明の効果】
【0029】
本発明の有益な効果は以下の通りである。即ち、本発明で提供する抗ａＰＣモノクローナル抗体は、ヒト化抗体であって、ＨＡＰＣ１５７３をヒト化するか、単一位置と複合位置について同時に突然変異スクリーニングを行うことで取得する。当該抗ａＰＣモノクローナル抗体は、活性化プロテインＣと選択的に結合して活性化プロテインＣを阻害するが、活性化していないプロテインＣとは結合しないか、活性化していないプロテインＣを阻害しない。当該抗ａＰＣモノクローナル抗体は、ヒトの活性化プロテインＣとは選択的に結合するが、その他の種の活性化プロテインＣ又は活性化していないプロテインＣとは結合しない。前記抗体は親和性が顕著に向上しており、一部の抗体については、親和性がＨＡＰＣ１５７３と比べて１００倍向上している。Ｐｒｏｔａｃに基づくＡＰＴＴ血液凝固分析の結果、本発明では少量の抗体（例えば、１μｇ／ｍｌ）を使用するだけで、ａＰＣの抗凝固活性に対し最大の阻害作用を奏し得る。前記抗体は、潜在的にａＰＣの抗凝固活性をブロック可能なため、血液凝固欠乏又は欠陥症の治療において広範な応用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1A】ヒトａＰＣに対するヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１～Ｈｕｍａｂ００１－２８、又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ－２８）の結合力を示す図である。
【図1B】ヒトａＰＣに対するヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１～Ｈｕｍａｂ００１－２８、又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ－２８）の結合力を示す図である。
【図1C】ヒトａＰＣに対するヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１～Ｈｕｍａｂ００１－２８、又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ－２８）の結合力を示す図である。
【図1D】ヒトａＰＣに対するヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１～Ｈｕｍａｂ００１－２８、又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ－２８）の結合力を示す図である。
【図2A】ヒトＰＣに対するヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１～Ｈｕｍａｂ００１－２８、又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ－２８）の結合力を示す図である。
【図2B】ヒトＰＣに対するヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１～Ｈｕｍａｂ００１－２８、又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ－２８）の結合力を示す図である。
【図2C】ヒトＰＣに対するヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１～Ｈｕｍａｂ００１－２８、又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ－２８）の結合力を示す図である。
【図3A】ｈＡＰＣ／ｈＰＣに対するＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の結合力を示す図である。また、図３Ａの横座標は、それぞれ、１０－６ｎＭ、１０－４ｎＭ、１０－２ｎＭ、１００ｎＭ、１０２ｎＭ、１０４ｎＭである。
【図3B】ｈＡＰＣ／ｈＰＣに対するＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の結合力を示す図である。また、図３Ｂの横座標は、それぞれ、１０－６ｎＭ、１０－４ｎＭ、１０－２ｎＭ、１００ｎＭ、１０２ｎＭ、１０４ｎＭである。
【図3C】ｈＡＰＣ／ｈＰＣに対するＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の結合力を示す図である。また、図３Ｃの横座標は、それぞれ、１０－６ｎＭ、１０－４ｎＭ、１０－２ｎＭ、１００ｎＭ、１０２ｎＭ、１０４ｎＭである。
【図3D】ｈＡＰＣ／ｈＰＣに対するＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の結合力を示す図である。また、図３Ｄの横座標は、それぞれ、１０－６ｎＭ、１０－４ｎＭ、１０－２ｎＭ、１００ｎＭ、１０２ｎＭ、１０４ｎＭである。
【図4A】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4B】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4C】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4D】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4E】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4F】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4G】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4H】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4I】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4J】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図4K】ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０、又はＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）の親和性測定を示す図である。
【図5】ａＰＣによるヒストン切断能力に対するＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－６の影響を示す図である。
【図6A】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＡはＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿に対応している。
【図6B】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＢはＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿に対応している。
【図6C】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＣはＦＸＩ血液凝固因子欠乏血漿に対応している。
【図6D】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＤはＦＶＩＩ血液凝固因子欠乏血漿に対応している。
【図6E】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＥはＦＸＩＩ血液凝固因子欠乏血漿に対応している。
【図6F】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＦはＦＶ血液凝固因子欠乏血漿に対応している。
【図6G】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＧはＦＸ血液凝固因子欠乏血漿に対応している。
【図6H】体外薬効試験を示しており、血液凝固因子を欠乏した血漿中において、ＨＡＰＣ－１４の突然変異抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６がａＰＣの抗凝固活性を阻害する機能を示す図である。図中のＨはＶＷＦ欠乏血漿に対応している。
【図7A】体内薬効試験を示している図である。図中のＡは、ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏マウスにＦＶＩＩＩ血液凝固因子、ＨＡＰＣ１５７３、ＨＡＰＣ－１４－６を注射した場合の欠乏マウスにおける血液凝固機能に対する影響である。
【図7B】体内薬効試験を示している図である。図中のＢは、ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏マウスに異なる投与量のＨＡＰＣ－１４－６を注射した場合の欠乏マウスにおける血液凝固機能に対する影響である。
【図7C】体内薬効試験を示している図である。図中のＣは、ＦＩＸ血液凝固因子欠乏マウスにＨＡＰＣ１５７３及び異なる投与量のＨＡＰＣ－１４－６を注射した場合の欠乏マウスにおける血液凝固機能に対する影響である。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明では、ＨＡＰＣ１５７３をヒト化したあと親和性の最適化を行った。そして、Ｆａｂを利用する方式で、最適化突然変異位置のスクリーニングを行い、最終的に好ましい６つの位置を選別した。更に、突然変異を組み合わせたところ、得られた最適化突然変異体の親和性はＨＡＰＣ１５７３と比較して１００倍向上した。且つ、Ｐｒｏｔａｃに基づくＡＰＴＴ血液凝固分析の結果、１μｇ／ｍｌの突然変異抗体量で、ａＰＣの抗凝固活性に対する最大の阻害作用を達成可能であり、臨床への更なる応用の可能性を有していた。
【0032】
本発明は、抗ａＰＣ抗体、即ち、抗ａＰＣモノクローナル抗体１４（ＨＡＰＣ－１４）を提供する。前記抗体は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８及び２９のうちのいずれか１つ又は複数の配列で表される重鎖ＣＤＲを含む重鎖、及び／又は、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２のうちのいずれか１つ又は複数の配列で表される軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖、を含む。
【0033】
本発明で提供する抗ａＰＣモノクローナル抗体１４（ＨＡＰＣ－１４）は、重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で表され、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で表される。
【0034】
本発明は、更に、ヒト活性化プロテインＣ（ａＰＣ）を対象とするモノクローナル抗体（抗ａＰＣモノクローナル抗体１４）の突然変異抗体を提供する。前記突然変異抗体は、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体１４の配列をベースとして、設計、スクリーニング及び統計を行った結果、以下の６つの位置の突然変異のうちの１つ又は複数の突然変異を含む場合に、モノクローナル抗体のＦａｂ断片と捕捉抗体の結合能力に顕著に影響を及ぼすとともに、親和性が高く、機能活性に優れ、系統配列に由来する差が低いことが分かった。上記６つの位置は、それぞれ、ａ）ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＮ５７Ｒ／Ｗ（Ｎ５７ＲはＮ５７Ｗより優れる）、ｂ）ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＥ５９Ｇ／Ｐ（Ｅ５９ＧはＥ５９Ｐより優れる）、ｃ）ＶＬ ＣＤＲ３に位置するＱ９３Ｖ、ｄ）ＶＨ ＣＤＲ１に位置するＮ３１Ｆ、ｅ）ＶＨ ＣＤＲ２に位置するＳ５５Ｋ、ｆ）ＶＨ ＣＤＲ３に位置するＹ１０４Ｔ、である。
【0035】
これらのうち、最も重要な突然変異位置は軽鎖のＮ５７Ｒ及び重鎖のＮ３１Ｆである。いくつかの実施例において、ヒト化プロテインＣ（ｈａＰＣ）は、血友病マウスモデルにおいてａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害するとともに、血液凝固機能を正常に戻すために必要な抗ａＰＣモノクローナル抗体の濃度を１μｇ／ｍｌ未満まで低下させた。
【0036】
以下では、記載の便宜上、略称を用いて各突然変異の組み合わせついて説明する。つまり、Ｎ５７ＲはＶＬ ＣＤＲ２に位置するＮ５７Ｒ、Ｎ５７ＷはＶＬ ＣＤＲ２に位置するＮ５７Ｗ、Ｅ５９ＧはＶＬ ＣＤＲ２に位置するＥ５９Ｇ、Ｅ５９ＰはＶＬ ＣＤＲ２に位置するＥ５９Ｐ、Ｑ９３ＶはＶＬ ＣＤＲ３に位置するＱ９３Ｖ、Ｎ３１ＦはＶＨ ＣＤＲ１に位置するＮ３１Ｆ、Ｓ５５ＫはＶＨ ＣＤＲ２に位置するＳ５５Ｋ、Ｙ１０４ＴはＶＨ ＣＤＲ３に位置するＹ１０４Ｔである。
【0037】
本発明において、上記６つの位置の突然変異の組み合わせには、以下が含まれる（ただし、これらに限らない）。
【0038】
（１）Ｎ５７Ｒ、Ｎ５７Ｗ、Ｅ５９Ｇ、Ｅ５９Ｐ、Ｑ９３Ｖ、Ｎ３１Ｆ又はＳ５５Ｋのうちのいずれか１つの位置の突然変異のみを含む。或いは、（２）Ｎ５７Ｒ及びＮ５７Ｗ、Ｅ５９Ｇ及びＥ５９Ｐ、Ｑ９３Ｖ及びＮ３１Ｆ、Ｎ３１Ｆ及びＳ５５Ｋ、Ｎ５７Ｒ及びＥ５９Ｇ、Ｎ５７Ｒ及びＥ５９Ｐ、Ｎ５７Ｒ及びＱ９３Ｖ、Ｎ５７Ｒ及びＮ３１Ｆ、Ｎ５７Ｒ及びＳ５５Ｋ、Ｎ５７Ｗ及びＥ５９Ｐ、Ｎ５７Ｗ及びＱ９３Ｖ、Ｎ５７Ｗ及びＮ３１Ｆ、Ｎ５７Ｗ及びＳ５５Ｋ、Ｅ５９Ｇ及びＱ９３Ｖ、Ｅ５９Ｇ及びＮ３１Ｆ、Ｅ５９Ｇ及びＳ５５Ｋ、Ｅ５９Ｐ及びＮ３１Ｆ、Ｅ５９Ｐ及びＳ５５Ｋ、Ｑ９３Ｖ及びＳ５５Ｋ、という２つの位置の突然変異を同時に含む。或いは、（３）Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９Ｇ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９Ｐ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９Ｐ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＰとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＰとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＰとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９Ｐ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＰとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＰとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＰとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＷとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３Ｖ、Ｅ５９ＧとＥ５９ＰとＮ３１Ｆ、Ｅ５９ＧとＥ５９ＰとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＧとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｅ５９ＧとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＧとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｅ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＰとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｑ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、という３つの位置の突然変異を同時に含む。或いは、（４）Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９Ｐ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＰとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＰとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｅ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＧとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、という４つの位置の突然変異を同時に含む。或いは、（５）Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３Ｖ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＰとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｅ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、という５つの位置の突然変異を同時に含む。或いは、（６）Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１Ｆ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＲとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、Ｎ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋ、という６つの位置の突然変異を同時に含む。或いは、（７）Ｎ５７ＲとＮ５７ＷとＥ５９ＧとＥ５９ＰとＱ９３ＶとＮ３１ＦとＳ５５Ｋという７つの位置の突然変異を同時に含む。
【0039】
具体的実施形態において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７又は３３で表される重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８又は４０で表される重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又は７７で表される重鎖ＣＤＲ３のうちのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の１つ又は２つ又は３つ、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表される軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、３７、４３、４９、７３のいずれかの配列で表される軽鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又は４４で表される軽鎖ＣＤＲ３のうちのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の１つ又は２つ又は３つ、を含む抗ａＰＣモノクローナル抗体を提供する。
【0040】
具体的実施形態において、前記抗体は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８及び２９で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３４及び３５で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３７及び３８で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０及び４１で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３及び４４で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｈ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４９及び５０で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２及び５３で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｊ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、５５及び５６で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｋ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、５８及び５９で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｌ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｍ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、６４及び６５で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｎ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、６７及び６８で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｏ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、７０及び７１で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｐ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、７３及び７４で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｑ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｒ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、７９及び８０で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｓ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、８２及び８３で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｔ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８５及び８６で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体と、（ｕ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、８８及び８９で表される重鎖ＣＤＲ、及び／又は、（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、９１及び９２で表される軽鎖ＣＤＲを含む抗体、から選択される。
【0041】
本発明において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の重鎖フレームワーク領域は、本発明における前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の機能を発揮するのに適した従来のいずれかのフレームワーク領域とすればよく、ヒト由来としてもよいし、マウス由来としてもよい。
【0042】
本発明において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の軽鎖フレームワーク領域は、本発明における前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の機能を発揮するのに適した従来のいずれかのフレームワーク領域とすればよく、ヒト由来としてもよいし、マウス由来としてもよい。
【0043】
具体的実施形態において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５のいずれかの配列で表される重鎖配列、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６のいずれかの配列で表される軽鎖配列、を含む。
【0044】
具体的実施形態において、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－４と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－５と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－６と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－７と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－８と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－９と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表される重鎖配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で表される軽鎖配列を含む抗体ＨａＰＣ１４－１０、から選択される。
【0045】
本発明において、一部の配列は、構成は同じだが番号が異なっている（具体的には、配列表の具体的なアミノ酸配列を参照すればよい）。
【0046】
例えば、抗体の重鎖ＣＤＲ１を表す配列では、配列２７、８７が同じであり、配列３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１が同じである。
【0047】
また、抗体の重鎖ＣＤＲ２を表す配列では、配列２８、３４、５２、７０が同じであり、配列４０、４６、５８、６４、７６、８２、８８が同じである。
【0048】
また、抗体の重鎖ＣＤＲ３を表す配列では、配列２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１が同じであり、配列７７、８３、８９が同じである。
【0049】
また、抗体の軽鎖ＣＤＲ１を表す配列では、配列３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０が同じである。
【0050】
また、抗体の軽鎖ＣＤＲ２を表す配列では、配列３７、６１が同じであり、配列４９、５５、６７、７９、８５、９１が同じである。
【0051】
また、抗体の軽鎖ＣＤＲ３を表す配列では、配列３２、３８、６８、７４、８６が同じであり、配列４４、５０、５６、６２、８０、９２が同じである。
【0052】
具体的実施形態において、本発明は、更に、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体に関連するバイオマテリアルとして、以下の１）～１０）のうちのいずれか１つ又は複数を提供する。
【0053】
１） 上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体をコードする核酸分子。
【0054】
２） １）で述べた核酸分子を含む発現カセット。
【0055】
３） １）で述べた核酸分子を含む構造体。
【0056】
４） ２）で述べた発現カセットを含む構造体。
【0057】
５） １）で述べた核酸分子を含む発現システム。
【0058】
６） ２）で述べた発現カセットを含む発現システム。
【0059】
７） ３）で述べた構造体を含む発現システム。
【0060】
８） ４）で述べた組換えベクターを含む発現システム。
【0061】
９） 上記抗ａＰＣモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を増幅するプライマー対。
【0062】
１０） 上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体を含む融合抗体。
【0063】
前記発現システムは、細胞としてもよいし、細胞株としてもよい。前記細胞又は細胞株は、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体をコードする。
【0064】
具体的実施形態において、本発明は製剤製品を提供する。前記製剤製品は、薬物組成物又は検出用試薬、又は検出用試薬キットである。
【0065】
具体的実施形態において、本発明で提供する薬物組成物は、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体又は上記のバイオマテリアルのうちのいずれか１つ又は複数と、薬学的に許容可能なベクターを含む。前記ベクターは、各種の賦形剤及び希釈剤を含み得るが、それ自体は必須の活性成分ではなく、且つ投与後に過剰な毒性を有さない。適切なベクターは、当業者が熟知するものとし、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．，１９９１）に薬学的に許容可能なベクターに関する内容が記載されている。
【0066】
具体的実施形態において、本発明で提供する検出用試薬又は検出用試薬キットは、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体又は上記のバイオマテリアルのうちのいずれか１つ又は複数を含む。また、前記抗体は標識されている。
【0067】
前記標識は、従来のいずれかの方式で実施可能であり、例えば、化学発光標識、蛍光色素分子、放射性標識又は発色団等を用いる。
【0068】
前記検出用試薬又は試薬キットは、更に、緩衝剤、希釈剤、取扱説明書等を含んでもよい。
【0069】
前記抗体は、その働きに適するか、活性を発揮し得るいかなる形式で存在してもよく、例えば、水性懸濁液の形式で存在する。
【0070】
いくつかの実施例において、本発明における前記抗ａＰＣモノクローナル抗体は、ａＰＣによるヒストンＨ３及びＨ４の分解能力を強化する。このことは、抗ａＰＣモノクローナル抗体が、ヒストンＨ３及びＨ４の細胞傷害性に対する細胞保護作用を提供し得ることを示唆している。
【0071】
具体的実施形態において、本発明は、血液凝固欠乏又は欠陥症を治療する方法を提供する。前記血液凝固欠乏又は欠陥症の定義は上述した通りである。具体的には、遺伝性及び後天性の血液凝固欠乏又は欠陥（例えば、血友病Ａや血友病Ｂ、又は敗血症）を治療する方法を提供する。また、必要な患者（例えば、外傷患者、又は血液凝固を必要とする患者）に抗ａＰＣモノクローナル抗体を投与することで出血時間を短縮する方法も提供する。更に、対象における活性化プロテインＣの抗凝固活性を阻害する方法を提供する。且つ、対象における血栓の形成を調節する方法を提供する。本発明の前記方法は、治療が必要な個体に対し、有効量の本発明における上記抗ａＰＣモノクローナル抗体を投与する。また、抗ヒトａＰＣモノクローナル抗体を生産する方法も提供する。
【0072】
具体的実施形態において、本発明は、治療が必要な個体に対し、有効量の上記抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアルを投与することを含む血液凝固欠乏又は欠陥症を治療する方法を提供する。
【0073】
具体的実施形態において、本発明は、血液凝固の治療に関連する方法を提供する。前記方法は、治療が必要な個体に対し、有効量の上記抗ａＰＣモノクローナル抗体、又は上記バイオマテリアルのうちのいずれか１つ又は複数を投与することを含む。前記個体は血液凝固欠乏又は欠陥症に罹患している。或いは、前記個体は血液凝固の治療を必要としている。或いは、前記個体は敗血症又は血友病に罹患している。或いは、前記個体は止血調節を必要としている。
【0074】
前記血液凝固欠乏又は欠陥症は、遺伝性であってもよいし、後天性であってもよく、血漿中のいずれか１つ又は複数の血液凝固因子の欠乏に起因して血液凝固障害が生じ、出血が引き起こされる病気を含む。具体的には、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩ血液凝固因子の欠乏に起因する血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃや、その他の血液凝固因子（即ち、Ｉ、ＩＩ、Ｖ、Ｖ＋ＶＩＩＩ、ＶＩＩ、Ｘ、又はＸＩＩＩ血液凝固因子）のうちの１つ又は複数の欠乏又は働きの異常に伴う出血性疾患等（例えば、外傷に伴う血液凝固の乱れ、敗血症の治療、移植、心臓手術、整形外科手術によって引き起こされる過度の出血等）の稀有な血液凝固因子欠乏症を含む。
【0075】
具体的実施形態において、本発明で提供するａＰＣによるヒストンＨ３及びＨ４の分解能力を強化する方法は、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアル又は薬物組成物を投与したあと、ａＰＣによるヒストンＨ３及びＨ４の分解能力を強化可能である。これにより、ヒストンＨ３及びＨ４の細胞傷害性に対する細胞保護作用を提供し得る。
【0076】
具体的実施形態において、本発明で提供する個体内の活性化プロテインＣの抗凝固活性を阻害する方法は、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアル又は薬物組成物を投与したあと、個体内の活性化プロテインＣの抗凝固活性を阻害することで、個体の血液凝固機能を調節可能である。
【0077】
具体的実施形態において、本発明は、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体又はその関連バイオマテリアルの、ｉ）血液凝固欠乏又は欠陥症を予防及び／又は治療する薬物の製造における応用、ｉｉ）ａＰＣによるヒストンＨ３及びＨ４の分解能力を強化する促進剤の製造における応用、ｉｉｉ）個体内の活性化プロテインＣの抗凝固活性を阻害する薬物の製造における応用、ｉｖ）血液凝固を必要とする個体を治療する薬物の製造における応用、ｖｉ）個体の止血を調節する薬物の製造における応用、ｖｉｉ）疾病、又は非疾病の診断や治療を目的とする免疫学的検査・分析、もしくはａＰＣの検出用試薬又は試薬キットの製造における応用、ｖｉｉｉ）その他の試薬又は薬物と合わせて使用する際の応用、を提供する。
【0078】
具体的実施形態において、本発明は、更に、上記の抗ａＰＣモノクローナル抗体の製造方法を提供する。当該方法は、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の発現に適した条件で、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の発現システムを培養して、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体を発現させるステップを含む。
【0079】
本発明では、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体のアミノ酸配列と一定の同一性を有するポリペプチドも本発明の保護の範囲内である。例えば、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を有し、且つ、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の機能を有する抗体又は抗体断片（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する）が挙げられる。具体的には、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体について、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸を置換、欠損又は添加することで得られるものや、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸を添加することで得られるものであり、且つ、前記抗ａＰＣモノクローナル抗体の機能を有するポリペプチド断片が挙げられる。
【0080】
「プロテインＣ」又は「ＰＣ」との用語は、酵素前駆体形式のプロテインＣのいずれかのバリアント、アイソタイプ及び／又は同族体を意味し、細胞により自然に発現して血漿中に存在するとともに、プロテインＣの活性化形式とは異なっている。
【0081】
「活性化プロテインＣ」或いは「ａＰＣ」との用語は、活性化形式のプロテインＣを意味する。
【0082】
「抗ａＰＣモノクローナル抗体」との用語は、ａＰＣのエピトープに特異的に結合する抗体を意味し、抗ヒトａＰＣモノクローナル抗体のことである。前記抗ａＰＣモノクローナル抗体は、完全抗体、抗体断片、ヒト抗体、ヒト化抗体及び遺伝子組換え抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体又は組換え抗体、及びこれら抗体の断片）を含む複数の抗体形式とすることができるが、これらに限らない。また、本発明に基づく性質を維持することが条件となる。
【0083】
前記抗体断片は、更に、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、シングルドメイン抗体、Ｆｖ又はｓｃＦｖ等と定義される。本文中で記載する抗ａＰＣモノクローナル抗体は、単一分子成分の抗体分子製剤を意味する。モノクローナル抗体成分は、特定のエピトープに対して単一的な結合特異性及び親和性を示し、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域、定常領域を有し得る。例えば、Ｆａｂ断片とは、ドメインＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１からなる一価断片を意味し、Ｆ（ａｂ’）２断片とは、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により接続された２つのＦａｂ断片を含む二価断片を意味する。また、Ｆｖ断片とは、抗体の片腕におけるドメインＶＬ及びＶＨからなるＦｖ断片を意味する。
【0084】
「同一性」との用語については、肉眼又はコンピュータソフトで評価可能である。コンピュータソフトを使用する場合には、２つ又は複数の配列間の同一性をパーセンテージ（％）で表すことが可能である。このパーセンテージは、関連配列間の同一性を評価するために使用可能である。
【0085】
「個体」との用語には、通常、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、哺乳動物、犬、猫、馬、羊、ブタ、牛等）が含まれる。「個体」は、上記の抗体、薬物、組成物、関連の製剤、試薬キット又は配合剤を用いて治療することで利益を獲得可能である。
【0086】
「治療有効量」との用語は、通常、適切な投与期間を経たあと、上記で列挙した疾病を治療する効果を達成可能な用量を意味する。
【0087】
「モノクローナル抗体」との用語は、単一のアミノ酸組成物による抗体分子製剤を意味する。「モノクローナル抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有し得る。一実施方案において、前記モノクローナル抗体はハイブリドーマから作製する。前記ハイブリドーマはＢ細胞を含む。当該Ｂ細胞は、不死化細胞と融合するヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子組換え非ヒト動物（例えば、遺伝子組換えマウス）から取得する。
【0088】
「融合抗体」との用語は、遺伝子工学技術を利用して、抗体断片をその他の生物の活性化タンパク質と融合して得られる産生物を意味する。つまり、遺伝子レベルにおいて、目的遺伝子をＩｇの一部の断片遺伝子に連結し、真核又は原核細胞内で発現させた、上記２つの部分のドメインを有する組換えタンパク質を意味する。目的タンパク質がＩｇのどの断片に連結されるかによって、「融合抗体」は、Ｆａｂ（Ｆｖ）融合タンパク質とＦｃ融合タンパク質の２種類に大別可能である。また、２つの異なるタンパク質が連結されて１つの高分子となる。連結は、化学的手法で行ってもよいし、遺伝子融合で実現してもよい。融合抗体を作製する方法は、当該分野における公知の一般的なＤＮＡ組換え技術及び遺伝子導入技術に関連する。融合タンパク質の違いによって、このような抗体融合タンパク質は複数の生物学的機能を有する。且つ、発現される組換えタンパク質は、一本鎖抗体の抗原結合能力に影響することも、融合されるタンパク質の生物学的特性に影響することもない。
【0089】
「ヒト化抗体」との用語は、フレームワーク領域又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンと比較して異なる特異性を有する免疫グロブリンのＣＤＲを含むよう改良されたことを意味する。
【0090】
ａＰＣに対するａＰＣ基質の結合の阻害及び／又はブロックに言及する場合、阻害及びブロックとの用語には、抗ａＰＣ抗体との接触時に、生理学的基質に対するａＰＣの結合親和性が、抗ａＰＣ抗体にａＰＣが接触していないときと比べて測定可能に低下することも含まれる。例えば、ａＰＣとその基質（Ｖａ因子又はＶＩＩＩａ因子を含む）の相互作用を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％ブロックする。
【0091】
「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とは、抗体分子の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域内の３つの超可変領域のうちの１つを意味し、結合する抗原の３次元構造と相補的なＮ末端の抗原－結合面を形成する。重鎖又は軽鎖のＮ末端から、これらの相補性決定領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」と表される。ＣＤＲは、抗原－抗体結合に関連する。且つ、ＣＤＲ３は、抗原－抗体結合に対し特異性を有する固有の領域を含む。従って、抗原－結合部位は６つのＣＤＲを含み得る。これらは、重鎖及び軽鎖のＶ領域の各々からのＣＤＲ領域を含む。
【0092】
「エピトープ」との用語は、抗体が特異的に結合又は相互作用する抗原の範囲或いは領域を意味し、いくつかの実施形態では、抗原が物理的に抗体と接触する箇所を意味する。
【0093】
「保守的置換」との用語は、１又は複数のアミノ酸を、類似の生化学的特性を有するが、ポリペプチドの生物学的又は生化学的機能は喪失させないアミノ酸に置換するポリペプチド修飾を意味する。「保守的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。一般的な保守的置換には、例えば、芳香族アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間の相互置換、疎水性アミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間の相互置換、極性アミノ酸Ｇｌｎ、Ａｓｎ間の相互置換、アルカリ性アミノ酸Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間の相互置換、酸性アミノ酸Ａｓｐ、Ｇｌｕ間の相互置換、ヒドロキシ基のアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間の相互置換がある。
【0094】
「同一性」との用語は、２つの核酸又は２つのポリペプチドを比較したときにヌクレオチドが同じである割合（例えば、少なくとも約８０％（通常は少なくとも約８５％）のヌクレオチド又はアミノ酸）を表す。いくつかの実施形態では、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％、少なくとも１つの実施形態では、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％又は９９．５％のヌクレオチド又はアミノ酸が同じである。
【0095】
核酸は、細胞全体や細胞破砕物中に存在するか、或いは、一部が精製されるか実質的に精製された形式をなす。自然環境において核酸と通常結合しているその他の細胞成分から精製する場合、核酸は、「分離される」か、「実質的に精製される」。核酸は、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動等の当該分野で熟知されている技術で分離可能である。
【0096】
本発明で使用する関連の用語の説明は以下の通りである。
【0097】
【表1】
【0098】
以下に、実施例を組み合わせて、本発明につき更に詳述する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を制限するものではない。本発明を実施する過程、条件、実験方法等は、以下で特に言及する内容を除き、いずれも当該分野における普遍的知識及び公知の常識であるため、本発明ではその内容を特に制限しない。
【実施例1】
【0099】
マウス抗ａＰＣモノクローナル抗体のヒト化
マウスのハイブリドーマ抗体の可変領域配列についてヒト化設計を行った。まず、カバット（Ｋａｂａｔ）システムを用いて、ＶＨ／ＶＬアミノ酸配列をナンバリングした。次に、ペアリングされていないシステイン残基、Ｎ－グリコシル化部位及びＣＤＲ内部の脱アミノ部位を含むホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）部位がＶＨ／ＶＬ配列に存在するか否かを分析するとともに、ＣＤＲに近接するＮ－グリコシル化部位を高リスク部位とみなした。このような部位が識別された場合には、それらを除去する必要があった。また、ＶＨ／ＶＬ配列の比較に基づいて、最適なヒト遺伝子のフレーム配列を選択した。且つ、最適な相同性に基づき、Ｊ領域の配列を選択して連結した。続いて、マウス由来のＶＨ／ＶＬ配列につきホモロジーモデリングを行い、３Ｄ構造を形成した。そして、ＣＤＲと５Åの距離内にあるＦＲ残基、ＶＨ／ＶＬ結合面を変更したあと、抗原の結合に影響する残基等を潜在的に復帰突然変異が必要な部位とみなした。且つ、コンピュータ分析によって、復帰突然変異の重要性を決定し、１つ又は複数の復帰突然変異を含む異なる組み合わせを設計した。
マウスのハイブリドーマ抗体の可変領域配列についてヒト化設計を行った。まず、カバット（Ｋａｂａｔ）システムを用いて、ＶＨ／ＶＬアミノ酸配列をナンバリングした。次に、ペアリングされていないシステイン残基、Ｎ－グリコシル化部位及びＣＤＲ内部の脱アミノ部位を含むホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）部位がＶＨ／ＶＬ配列に存在するか否かを分析するとともに、ＣＤＲに近接するＮ－グリコシル化部位を高リスク部位とみなした。このような部位が識別された場合には、それらを除去する必要があった。また、ＶＨ／ＶＬ配列の比較に基づいて、最適なヒト遺伝子のフレーム配列を選択した。且つ、最適な相同性に基づき、Ｊ領域の配列を選択して連結した。続いて、マウス由来のＶＨ／ＶＬ配列につきホモロジーモデリングを行い、３Ｄ構造を形成した。そして、ＣＤＲと５Åの距離内にあるＦＲ残基、ＶＨ／ＶＬ結合面を変更したあと、抗原の結合に影響する残基等を潜在的に復帰突然変異が必要な部位とみなした。且つ、コンピュータ分析によって、復帰突然変異の重要性を決定し、１つ又は複数の復帰突然変異を含む異なる組み合わせを設計した。
【0100】
標的セグメントのＤＮＡをＰＣＲ増幅することで、ヒト化抗体配列をコードするプラスミドを構築した。続いて、一過性トランスフェクション及び発現を経て、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムにより抗体を精製した。そして、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ法でヒト化抗体を分析・鑑定し、２８個のヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体のクローンを取得した。
【0101】
１．１ ＥＬＩＳＡ法によるヒトａＰＣ（ｈａＰＣ）に対する抗ａＰＣモノクローナル抗体の親和性測定
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって、ｈａＰＣに対するキメラ抗体及び上記２８個のヒト化抗体の親和性を測定し、比較した。
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって、ｈａＰＣに対するキメラ抗体及び上記２８個のヒト化抗体の親和性を測定し、比較した。
【0102】
測定の結果、図１に示すように、１～２８番（Ｈｕｍａｂ００１－１～１－２８又はＨＡＰＣ－１～ＨＡＰＣ２８）のヒト化抗体、３６５７陽性対照抗体（３６５７ ＰＣ ｍＡｂ）、キメラ抗体（３０１２０－ｍＡｂ００１×ｈＩｇＧ）は、いずれもｈａＰＣに対し良好に結合した。また、１３～２０番の抗体はＥＣ５０値が低かった。このことは、これらの抗体のｈａＰＣに対する結合力がより強いことを意味していた。
【0103】
１．２ ＥＬＩＳＡ法によるヒトＰＣ（ｈＰＣ）に対する抗ａＰＣモノクローナル抗体の結合力測定
１３～２０番のヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１３～Ｈｕｍａｂ００１－２０、又はＨＡＰＣ－１３～ＨＡＰＣ－２０）を選択し、ｈＰＣに対する結合力を測定した。
１３～２０番のヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１３～Ｈｕｍａｂ００１－２０、又はＨＡＰＣ－１３～ＨＡＰＣ－２０）を選択し、ｈＰＣに対する結合力を測定した。
【0104】
結果は図２に示す通りであった。結果より、１３～２０番のヒト化抗ａＰＣモノクローナル抗体はｈＰＣに一切結合しないことが示された。
【0105】
１３番抗体（ＨＡＰＣ－１３）、１４番抗体（ＨＡＰＣ－１４）及び１６番抗体（ＨＡＰＣ－１６）は、親和性の最適化を試みる際に選択した３つの親抗体であった。これら３つの抗体は、重鎖のフレームワーク領域は同じであったが、軽鎖のフレームワーク領域は異なっていた。そのうち、ＨＡＰＣ－１３は原抗体であり、ＨＡＰＣ－１４は、ＨＡＰＣ－１３をベースに１つの復帰突然変異を有しており、ＨＡＰＣ－１６は、ＨＡＰＣ－１３をベースに５つの復帰突然変異を有していた。以下の実施例では、ＨＡＰＣ－１４の抗体を選択して後続の親和性の最適化を行った。
【実施例2】
【0106】
抗ａＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ－１４の親和性の最適化
上記の１４番抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１４又はＨＡＰＣ１４又はＨＡＰＣ－１４）をベースに、抗体の親和性最適化設計及び突然変異体の作製を行った。
上記の１４番抗体（Ｈｕｍａｂ００１－１４又はＨＡＰＣ１４又はＨＡＰＣ－１４）をベースに、抗体の親和性最適化設計及び突然変異体の作製を行った。
【0107】
【表2】
【0108】
２．１ 部位特異的変異導入
部位特異的変異導入手法を用いて、親ＨＡＰＣ－１４ Ｆａｂクローンの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）における各アミノ酸をそれぞれ別の１９個のアミノ酸に突然変異させた。突然変異を各標的ＣＤＲ位置に導入するために、２０個のアミノ酸をコードするＮＮＳコドンを含むＤＮＡプライマーを使用した。また、リン酸化した縮重プライマーを部位特異的変異導入反応に用いた。
部位特異的変異導入手法を用いて、親ＨＡＰＣ－１４ Ｆａｂクローンの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）における各アミノ酸をそれぞれ別の１９個のアミノ酸に突然変異させた。突然変異を各標的ＣＤＲ位置に導入するために、２０個のアミノ酸をコードするＮＮＳコドンを含むＤＮＡプライマーを使用した。また、リン酸化した縮重プライマーを部位特異的変異導入反応に用いた。
【0109】
２．２ ＰＣＲ反応
ＰＣＲ条件は、９４℃で２分（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で５分）、１６サイクル、７２℃で１０分とした。
ＰＣＲ条件は、９４℃で２分（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で５分）、１６サイクル、７２℃で１０分とした。
【0110】
ＰＣＲ産物の精製後、コロニーの形成及びＦａｂ断片の産生のために、大腸菌ＴＧ１内にエレクトロポレーションした。
【0111】
２．３ Ｆａｂ突然変異体ライブラリの一次スクリーニング
一次スクリーニングは単点（ｏｎｅ－ｐｏｉｎｔ）ＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）分析を含んでいた。また、当該分析は捕捉ＥＬＩＳＡにより行った。
一次スクリーニングは単点（ｏｎｅ－ｐｏｉｎｔ）ＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）分析を含んでいた。また、当該分析は捕捉ＥＬＩＳＡにより行った。
【0112】
即ち、４℃、ｐＨ７．４のコーティングバッファＰＢＳ中で、抗Ｆａｂ抗体を用いて９６ウェルマイクロプレートの各ウェルをコーティングした。２日目に、２５℃で、ｐＨ７．４のＰＢＳ中のカゼインを用いてプレートを１時間ブロッキングした。その後、Ｆａｂ ＰＥをプレートに添加し、２５℃で１時間培養した。そして、洗浄後に、ビオチン化した抗原をウェル内に加え、２５℃で１時間培養した。続いて、２５℃でＳＡ－ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体と１時間培養した。そして、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いてＨＲＰ活性を検出し、２Ｍ ＨＣｌでクエンチ反応させた。プレートは４５０ｎＭで読み取った。これにより、４５０ｎｍで親クローンよりも３倍大きい光学密度（ＯＤ）信号を示したクローンを選別し、シーケンシングを行った。このように、ｐＨ７．４の捕捉ＥＬＩＳＡによって、固有配列を有するＨＡＰＣ－１４の結合が改良された突然変異体について実証した。また、直接抗原コーティングＥＬＩＳＡによって、ＨＡＰＣ－１４の固有配列を有する結合が改良された突然変異体をソートした。結果を表３に示す。
【0113】
【表3】
【0114】
表３に示すように、ＨＡＰＣ－１４の一次スクリーニングで鑑定した９種類の個体（ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－１Ｈ１－Ｆ２、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－２Ｈ６－Ｃ２、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－３Ｈ４－Ｃ６、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－２Ｌ４－Ｂ２、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－２Ｌ４－Ｄ４、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－２Ｌ６－Ｇ１、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－２Ｌ６－Ｇ１１、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－３Ｌ１－Ｄ１１、ＨＡＰＣ－１４－Ｒ１－３Ｌ１－Ｇ８）における親和性が改良された突然変異は、更に、組み合わせ突然変異体ライブラリの設計及び構築に用いられた。
【0115】
２．４ 直接ＫＤソートＥＬＩＳＡによる主要Ｆａｂ突然変異体ライブラリの検証
直接抗原コーティングＥＬＩＳＡのＫＤ ＥＬＩＳＡによって、各突然変異体における結合が改良されたＦａｂのＫＤレベルを特定した。
直接抗原コーティングＥＬＩＳＡのＫＤ ＥＬＩＳＡによって、各突然変異体における結合が改良されたＦａｂのＫＤレベルを特定した。
【0116】
ｐＨ７．４の１ｘＰＢＳ緩衝液中で、ｈＰｒｏ１．ｂｉｏｔｉｎを用いて９６ウェルマイクロプレートの各ウェルをコーティングし、４℃で一晩培養した。２日目に、２５℃、ｐＨ７．４の１ｘＰＢＳ緩衝液中で、カゼインを用いてプレートを１時間ブロッキングした。そして、１つの濃度で希釈した各突然変異体のＦａｂ ＰＥをプレートに加えたあと、２５℃で１時間培養した。その後、２５℃で１時間カップリングしたヤギ抗ｃ－ｍｙｃ ＨＲＰと培養した。そして、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いてＨＲＰ活性を検出し、２Ｍ ＨＣｌでクエンチ反応させた。続いて、４５０ｎＭで各プレートのＯＤ値を読み取った。
【0117】
２．５ ＨＡＰＣ－１４ Ｆａｂライブラリの組み合わせスクリーニング
抗原との結合に有利なＶＨ及びＶＬ中の点突然変異を特定し、更に組み合わせることで、更なる結合相乗効果を取得した。簡単に述べると、各縮重プライマーを全てリン酸化したあと、ウラシル化したｓｓＤＮＡと１０：１の割合で使用した。次に、混合物を８５℃まで加熱して５分間経過したあと、５５℃まで冷却して１時間以上経過させた。その後、Ｔ４リガーゼ及びＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを加え、混合物を３７℃で１．５時間培養した。そして、１００ｎｇの組み合わせライブラリＤＮＡをＴＧ１にエレクトロポレーションすることで、コロニーの形成及びＦａｂ断片の産生を行った。
抗原との結合に有利なＶＨ及びＶＬ中の点突然変異を特定し、更に組み合わせることで、更なる結合相乗効果を取得した。簡単に述べると、各縮重プライマーを全てリン酸化したあと、ウラシル化したｓｓＤＮＡと１０：１の割合で使用した。次に、混合物を８５℃まで加熱して５分間経過したあと、５５℃まで冷却して１時間以上経過させた。その後、Ｔ４リガーゼ及びＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを加え、混合物を３７℃で１．５時間培養した。そして、１００ｎｇの組み合わせライブラリＤＮＡをＴＧ１にエレクトロポレーションすることで、コロニーの形成及びＦａｂ断片の産生を行った。
【0118】
組み合わせ突然変異体にＦａｂを発現させて、捕捉ＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行った。４５０ｎｍで、一次リードクローン（ｌｅａｄ ｃｌｏｎｅ）よりも３倍大きい光学密度（ＯＤ）信号を示したクローンにつきシーケンシングを行った。こうして、捕捉ＥＬＩＳＡにより、固有配列を有する結合が改良された突然変異体について実証するとともに、直接抗原コーティングＥＬＩＳＡによりソートを行った。
【0119】
ＨＡＰＣ－１４の複数の組み合わせ突然変異体を選別し、ＫＤ ＥＬＩＳＡによって、上位１６個の親和性が顕著に改善された組み合わせ突然変異体を確認した（表４のＮｏ．１～１６参照）。
【0120】
【表4】
【0121】
スクリーニング及び統計の結果、以下の６つの位置の突然変異がＦａｂ断片と捕捉抗体の結合能力に顕著に影響を及ぼすことが見出された。これら６つの位置は、それぞれ、ａ）ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＮ５７Ｒ／Ｗ（Ｎ５７ＲはＮ５７Ｗより優れる）、ｂ）ＶＬ ＣＤＲ２に位置するＥ５９Ｇ／Ｐ（Ｅ５９ＧはＥ５９Ｐより優れる）、ｃ）ＶＬ ＣＤＲ３に位置するＱ９３Ｖ、ｄ）ＶＨ ＣＤＲ１に位置するＮ３１Ｆ、ｅ）ＶＨ ＣＤＲ２に位置するＳ５５Ｋ、ｆ）ＶＨ ＣＤＲ３に位置するＹ１０４Ｔ、である。
【0122】
これらのうち、最も重要な突然変異位置は、軽鎖に位置するＮ５７Ｒ及び重鎖に位置するＮ３１Ｆである。
【実施例3】
【0123】
ＨＡＰＣ－１４の組み合わせ突然変異位置についての抗ａＰＣモノクローナル抗体（完全ＩｇＧ１の作製）
３．１ ＨＡＰＣ－１４の組み合わせ突然変異位置についての抗ａＰＣモノクローナル抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０）の作製
実施例２の６つの突然変異位置に基づいて、組み合わせ及び作製を行うことで、１０個の突然変異体を取得した（下表５の１４－１～１４－１０参照）（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０）。その後、配列を完全なＩｇＧ形式に構成して発現精製を行い、抗体の発現量、親和性及びその他の生物活性の状況について考察した。
３．１ ＨＡＰＣ－１４の組み合わせ突然変異位置についての抗ａＰＣモノクローナル抗体（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０）の作製
実施例２の６つの突然変異位置に基づいて、組み合わせ及び作製を行うことで、１０個の突然変異体を取得した（下表５の１４－１～１４－１０参照）（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０）。その後、配列を完全なＩｇＧ形式に構成して発現精製を行い、抗体の発現量、親和性及びその他の生物活性の状況について考察した。
【0124】
ＨＡＰＣ－１４及び１０個の突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５～２６に示す通りであった。
【0125】
ヒト化抗体１３（ＨＡＰＣ－１３）
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）
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【0126】
ヒト化抗体１６（ＨＡＰＣ－１６）
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
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【0127】
ヒト化抗体１４（ＨＡＰＣ－１４）
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
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【0128】
ＨＡＰＣ－１４－１
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
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【0129】
ＨＡＰＣ－１４－２
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
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【0130】
ＨＡＰＣ－１４－３
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
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【0131】
ＨＡＰＣ－１４－４
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）
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【0132】
ＨＡＰＣ－１４－５
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）
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【0133】
ＨＡＰＣ－１４－６
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）
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重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）
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【0134】
ＨＡＰＣ－１４－７
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９）
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軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【0135】
ＨＡＰＣ－１４－８
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＹＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＩＴＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＤＴＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＹＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＩＴＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＤＴＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【0136】
ＨＡＰＣ－１４－９
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＹＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＩＴＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＤＴＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＹＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＩＴＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＤＴＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【0137】
ＨＡＰＣ－１４－１０
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＩＴＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＤＴＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＩＴＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＤＴＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＲＬＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＮＮＥＤＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【0138】
ＨＡＰＣ－１４
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）
ＮＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）
ＮＹＹＬＮ
【0139】
ＨＡＰＣ－１４
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0140】
ＨＡＰＣ－１４
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0141】
ＨＡＰＣ－１４
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0142】
ＨＡＰＣ－１４
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１）
ＬＡＳＮＬＥＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１）
ＬＡＳＮＬＥＳ
【0143】
ＨＡＰＣ－１４
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0144】
ＨＡＰＣ－１４－１
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）
ＦＹＹＬＮ
【0145】
ＨＡＰＣ－１４－１
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0146】
ＨＡＰＣ－１４－１
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0147】
ＨＡＰＣ－１４－１
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0148】
ＨＡＰＣ－１４－１
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７）
ＬＡＳＷＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７）
ＬＡＳＷＬＧＳ
【0149】
ＨＡＰＣ－１４－１
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0150】
ＨＡＰＣ－１４－２
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９）
ＦＹＹＬＮ
【0151】
ＨＡＰＣ－１４－２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０）
重鎖ＣＤＲ２
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0152】
ＨＡＰＣ－１４－２
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0153】
ＨＡＰＣ－１４－２
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0154】
ＨＡＰＣ－１４－２
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３）
ＬＡＳＷＬＥＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３）
ＬＡＳＷＬＥＳ
【0155】
ＨＡＰＣ－１４－２
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0156】
ＨＡＰＣ－１４－３
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５）
ＦＹＹＬＮ
【0157】
ＨＡＰＣ－１４－３
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0158】
ＨＡＰＣ－１４－３
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0159】
ＨＡＰＣ－１４－３
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0160】
ＨＡＰＣ－１４－３
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９）
ＬＡＳＲＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９）
ＬＡＳＲＬＧＳ
【0161】
ＨＡＰＣ－１４－３
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0162】
ＨＡＰＣ－１４－４
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１）
ＦＹＹＬＮ
【0163】
ＨＡＰＣ－１４－４
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0164】
ＨＡＰＣ－１４－４
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0165】
ＨＡＰＣ－１４－４
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0166】
ＨＡＰＣ－１４－４
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５）
ＬＡＳＲＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５）
ＬＡＳＲＬＧＳ
【0167】
ＨＡＰＣ－１４－４
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0168】
ＨＡＰＣ－１４－５
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７）
ＦＹＹＬＮ
【0169】
ＨＡＰＣ－１４－５
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0170】
ＨＡＰＣ－１４－５
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0171】
ＨＡＰＣ－１４－５
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0172】
ＨＡＰＣ－１４－５
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１）
ＬＡＳＷＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１）
ＬＡＳＷＬＧＳ
【0173】
ＨＡＰＣ－１４－５
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0174】
ＨＡＰＣ－１４－６
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３）
ＦＹＹＬＮ
【0175】
ＨＡＰＣ－１４－６
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0176】
ＨＡＰＣ－１４－６
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0177】
ＨＡＰＣ－１４－６
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0178】
ＨＡＰＣ－１４－６
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７）
ＬＡＳＲＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７）
ＬＡＳＲＬＧＳ
【0179】
ＨＡＰＣ－１４－６
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0180】
ＨＡＰＣ－１４－７
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９）
ＦＹＹＬＮ
【0181】
ＨＡＰＣ－１４－７
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０）
ＤＩＲＬＫＳＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0182】
ＨＡＰＣ－１４－７
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１）
ＥＧＤＹＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１）
ＥＧＤＹＦＤＹ
【0183】
ＨＡＰＣ－１４－７
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７２）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７２）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0184】
ＨＡＰＣ－１４－７
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７３）
ＬＡＳＲＬＥＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７３）
ＬＡＳＲＬＥＳ
【0185】
ＨＡＰＣ－１４－７
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７４）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７４）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0186】
ＨＡＰＣ－１４－８
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５）
ＦＹＹＬＮ
【0187】
ＨＡＰＣ－１４－８
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７６）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７６）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0188】
ＨＡＰＣ－１４－８
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７７）
ＥＧＤＴＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７７）
ＥＧＤＴＦＤＹ
【0189】
ＨＡＰＣ－１４－８
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７８）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７８）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0190】
ＨＡＰＣ－１４－８
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７９）
ＬＡＳＲＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７９）
ＬＡＳＲＬＧＳ
【0191】
ＨＡＰＣ－１４－８
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８０）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８０）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0192】
ＨＡＰＣ－１４－９
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１）
ＦＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１）
ＦＹＹＬＮ
【0193】
ＨＡＰＣ－１４－９
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８２）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８２）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0194】
ＨＡＰＣ－１４－９
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８３）
ＥＧＤＴＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８３）
ＥＧＤＴＦＤＹ
【0195】
ＨＡＰＣ－１４－９
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８４）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８４）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0196】
ＨＡＰＣ－１４－９
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８５）
ＬＡＳＲＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８５）
ＬＡＳＲＬＧＳ
【0197】
ＨＡＰＣ－１４－９
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８６）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８６）
ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0198】
ＨＡＰＣ－１４－１０
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７）
ＮＹＹＬＮ
重鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７）
ＮＹＹＬＮ
【0199】
ＨＡＰＣ－１４－１０
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８８）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
重鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８８）
ＤＩＲＬＫＫＮＮＹＥＫＨＹＡＥＳＶＫＧ
【0200】
ＨＡＰＣ－１４－１０
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８９）
ＥＧＤＴＦＤＹ
重鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８９）
ＥＧＤＴＦＤＹ
【0201】
ＨＡＰＣ－１４－１０
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９０）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
軽鎖ＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９０）
ＲＡＳＥＳＶＤＳＦＧＡＴＦＭＨ
【0202】
ＨＡＰＣ－１４－１０
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１）
ＬＡＳＲＬＧＳ
軽鎖ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１）
ＬＡＳＲＬＧＳ
【0203】
ＨＡＰＣ－１４－１０
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９２）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
軽鎖ＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９２）
ＶＱＮＮＥＤＰＹＴ
【0204】
詳細な情報を表５に示す。
【0205】
【表5】
【0206】
【表6】
【0207】
下線はＣＤＲｓ領域であり、その他はフレームワーク領域である。また、白字はヒト化位置を示す。
【0208】
【表7】
【0209】
３．２ ＨＡＰＣ１４の組み合わせ突然変異位置について作製した抗ａＰＣモノクローナル抗体のｈａＰＣ／ｈＰＣに対する結合力測定（ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０）
測定方法：
Ｅｌｉｓａ法で、ｈａＰＣ／ｈＰＣに対する抗ａＰＣモノクローナル抗体の結合力を測定した。
測定方法：
Ｅｌｉｓａ法で、ｈａＰＣ／ｈＰＣに対する抗ａＰＣモノクローナル抗体の結合力を測定した。
【0210】
１．ｈａＰＣ／ｈＰＣ（ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌ）を用い、１００μＬ／ウェル、４℃で、ＥＬＩＳＡプレートを一晩コーティングした。
【0211】
２．ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、２００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄した。
【0212】
３．２００μＬ／ウェル、室温で、２％ＢＳＡ（ＰＢＳ溶液）を用いてプレートを１時間ブロッキングした。
【0213】
４．ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、２００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄した。
【0214】
５．抗ａＰＣモノクローナル抗体を一次抗体として用い（２％ＢＳＡ中で１０μｇ／ｍｌから希釈）、１００μＬ／ウェルでプレートを室温で１時間培養した。
【0215】
６．ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、２００μＬ／ウェルでパレットを３回洗浄した。
【0216】
７．プレートと抗ｈＩｇＧ－Ｆｃ抗体－ＨＲＰ（２％ＢＳＡ緩衝液中で５０００倍に希釈）を室温で１時間培養した。
【0217】
８．ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、２００μＬ／ウェルでパレットを６回洗浄した。
【0218】
９．１００μＬ／ウェルで、ＴＭＢ基質を用いてプレートを培養し（Ａ溶液とＢ溶液を１：１（ｖ／ｖ）で用いて調製）、１０分間遮光した。
【0219】
１０．１００μＬ／ウェルで、ＨＣｌ（１Ｍ）を用いてクエンチ反応させ、ＯＤ４５０を読み取った。
【0220】
測定結果は、図３、表８及び表９に示す通りとなった。これより、抗ａＰＣモノクローナル抗体はｈＡＰＣと結合するが、ｈＰＣとは結合しないことが分かった。
【0221】
【表8】
【0222】
【表9】
【0223】
３．３ Ｏｃｔｅｔ生体分子相互作用システムによるＨＡＰＣ－１４の組み合わせ突然変異位置について作製した抗ａＰＣモノクローナル抗体の親和性測定（ＨＡＰＣ－１４－１～ＨＡＰＣ－１４－１０）
測定方法：Ｏｃｔｅｔ解析は、２５℃でＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｏｃｔｅｔバイオセンサを用い、１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で行った。動力学的測定時には、第１のベースラインステップを１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で１２０秒実行したあと、バイオセンサに抗体を付加して２４０秒実行した。続いて、第２のベースラインステップを１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で１２０秒実行した。その後、５つの希釈濃度（３．１３ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ及び５０ｎＭ）の抗原（ｈｕＡＰＣ）を含むウェルに捕捉抗体のバイオセンサを１８０秒浸漬してから、１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で４００秒解離させた。また、１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液をブランク対照とし、緩衝液中における抗体の自然な解離を示した。そして、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンを再生ステップに用いた。且つ、Ｏｃｔｅｔデータ解析ソフトを用いて結合キネティクスを演算するとともに、１：１結合モデルを用いてカーブフィッティングを行った。
測定方法：Ｏｃｔｅｔ解析は、２５℃でＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｏｃｔｅｔバイオセンサを用い、１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で行った。動力学的測定時には、第１のベースラインステップを１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で１２０秒実行したあと、バイオセンサに抗体を付加して２４０秒実行した。続いて、第２のベースラインステップを１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で１２０秒実行した。その後、５つの希釈濃度（３．１３ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ及び５０ｎＭ）の抗原（ｈｕＡＰＣ）を含むウェルに捕捉抗体のバイオセンサを１８０秒浸漬してから、１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液中で４００秒解離させた。また、１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液をブランク対照とし、緩衝液中における抗体の自然な解離を示した。そして、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンを再生ステップに用いた。且つ、Ｏｃｔｅｔデータ解析ソフトを用いて結合キネティクスを演算するとともに、１：１結合モデルを用いてカーブフィッティングを行った。
【0224】
突然変異抗体の親和性はｐＨ７．４で測定した。結果は、図４及び表１０に示す通りであった。
【0225】
【表10】
【0226】
図４及び表１０の結果から明らかなように、突然変異後の抗体は依然としてｈａＰＣと結合可能であるが、ｈＰＣとの結合は不可能であった。且つ、親和性は、突然変異していない１４番の抗体ＨＡＰＣ－１４よりも向上していた。特に、６番（ＨＡＰＣ１４－６）及び３番（ＨＡＰＣ１４－３）は１００倍近く向上していた。
【実施例4】
【0227】
抗ａＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ１４－６及びａＰＣによるヒストン分解作用
測定方法：
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動後にクマシーブリリアントブルーで染色し、ＨＡＰＣモノクローナル抗体がａＰＣによるヒストン分解を促進したか阻害したかを観察した。
測定方法：
【表11】
【0228】
測定結果は図５に示す通りであった（図５は、左から右に向かって順に、ヒストンのみを含んでいた場合、ヒストン及びＡＰＣを含んでいた場合、ヒストン、ＡＰＣ及びＨＡＰＣ１５７３を含んでいた場合、ヒストン、ＡＰＣ及びＨＡＰＣ１４－６を含んでいた場合を示す）。図面から明らかなように、ＨＡＰＣ１５７３及びＨＡＰＣ１４－６は、ａＰＣによるヒストン分解能力を強化した。このことは、本発明のＨＡＰＣ１４－６モノクローナル抗体が、ヒストンＨ３及びＨ４の細胞傷害性に対する細胞保護作用を提供し得ることを示唆している。
【0229】
ＨＡＰＣ１５７３と同様に、ＨＡＰＣ－１４－６は、ａＰＣによるヒストンＨ３及びＨ４の分解を阻害することなく、実質的に強化した。ただし、ＨＡＰＣ１５７３との違いとして、ＨＡＰＣ－１４－６はａＰＣによるヒストンＨ１の分解を軽微に阻害した。このことは、ＨＡＰＣ－１４－６が、ヒストンＨ３及びＨ４の細胞傷害性に対する細胞保護作用を提供し得ることを示唆している。
【実施例5】
【0230】
抗ａＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ－１４－３、ＨＡＰＣ－１４－６の体外薬効研究
本実施例では、血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度の影響を測定した。
本実施例では、血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度の影響を測定した。
【0231】
ｐｒｏｔａｃ誘導によるＡＰＴＴ試験を用い、複数の血液凝固因子を欠乏したヒト血漿中でモノクローナル抗体がａＰＣの抗凝固活性を阻害する最小投与量を測定した。その結果、ＨＡＰＣ１５７３の場合には１００μｇ／ｍｌ以上の濃度が必要なのに対し、本実施例では、最大でもわずか１μｇ／ｍｌの濃度でａＰＣの抗凝固活性を９５％以上阻害可能であった。
【0232】
５．１ 実験方法と原理
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定原理：３７℃条件において、カオリンでＸＩＩ及びＸＩ因子を活性化するとともに、セファリン（部分トロンボプラスチン）を血小板第３因子の代わりとした。そして、Ｃａ２＋を関与させて、血漿の凝固に要する時間（即ち、活性化部分トロンボプラスチン時間）を観察した。これは、内因凝固系における感度が高く、最も一般的に用いられるスクリーニング試験である。
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定原理：３７℃条件において、カオリンでＸＩＩ及びＸＩ因子を活性化するとともに、セファリン（部分トロンボプラスチン）を血小板第３因子の代わりとした。そして、Ｃａ２＋を関与させて、血漿の凝固に要する時間（即ち、活性化部分トロンボプラスチン時間）を観察した。これは、内因凝固系における感度が高く、最も一般的に用いられるスクリーニング試験である。
【0233】
新たに開発した抗ａＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ－１４－６は、複数の血液凝固因子を欠乏したヒト血漿中において、最大でも１μｇ／ｍｌの濃度でａＰＣの抗凝固活性を阻害可能であった。なお、複数の血液凝固因子の欠乏には、Ｖ血液凝固因子の欠乏、ＶＩＩ血液凝固因子の欠乏、ＶＩＩＩ血液凝固因子の欠乏、ＩＸ血液凝固因子の欠乏、Ｘ血液凝固因子の欠乏、ＸＩ血液凝固因子の欠乏、ＸＩＩ血液凝固因子の欠乏、ＶＷＦの欠乏等が含まれていた。
【0234】
５．２ 血液凝固因子欠乏血漿に対する抗体の影響測定
（１）ＶＩＩＩ及びＶＩＸ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
（１）ＶＩＩＩ及びＶＩＸ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0235】
ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿＋表１２の各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０５Ｕ／ｍｌ
Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿＋表１２の各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０１Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿＋表１２の各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０１Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
【0236】
測定結果：表１２に示すように、ＶＩＩＩ及びＶＩＸ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０は、いずれも異なる度合でａＰＣの抗凝固活性を阻害可能であった。且つ、同じ抗体濃度において、抗ａＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ１４－１～ＨＡＰＣ１４－１０によるａＰＣの抗凝固活性阻害効果は、いずれもラット抗体１５７３、ＨＡＰＣ１３及びＨＡＰＣ１４よりも優れていた。
【0237】
【表12】
【0238】
（２）ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0239】
ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿＋図６Ａの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０５Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
実験結果：図６Ａに示すように、ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
実験結果：図６Ａに示すように、ＦＶＩＩＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【0240】
（３）ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0241】
ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿＋図６Ｂの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０１Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｂに示すように、ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｂに示すように、ＦＩＸ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【0242】
（４）ＦＸＩ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0243】
ＦＸＩ血液凝固因子欠乏血漿＋図６Ｃの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０６Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＸＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｃに示すように、ＦＸＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＸＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｃに示すように、ＦＸＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【0244】
（５）ＦＶＩＩ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0245】
ＦＶＩＩ血液凝固因子欠乏血漿＋図６Ｄの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．１Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｄに示すように、ＦＶＩＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｄに示すように、ＦＶＩＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【0246】
（６）ＦＸＩＩ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0247】
ＦＸＩＩ血液凝固因子欠乏血漿＋図６Ｅの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０２５Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＸＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｅに示すように、ＦＸＩＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＸＩＩ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｅに示すように、ＦＸＩＩ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【0248】
（７）ＦＶ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0249】
ＦＶ血液凝固因子欠乏血漿（５％の標準血漿を含む）＋図６Ｆの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０５Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶ血液凝固因子欠乏血漿（５％の標準血漿を含む）１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｆに示すように、ＦＶ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＶ血液凝固因子欠乏血漿（５％の標準血漿を含む）１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｆに示すように、ＦＶ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【0250】
（８）ＦＸ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0251】
ＦＸ血液凝固因子欠乏血漿（１％の標準血漿を含む）＋図６Ｇの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０５Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＸ血液凝固因子欠乏血漿（１％の標準血漿を含む）１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｇに示すように、ＦＸ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＦＸ血液凝固因子欠乏血漿（１％の標準血漿を含む）１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｇに示すように、ＦＸ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【0252】
（９）ＶＷＦ血液凝固因子欠乏血漿に対する異なる抗体及び異なる濃度についての実験結果
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
実験方法：ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液を用い、抗体を対応濃度まで希釈した。
【0253】
ＶＷＦ血液凝固因子欠乏血漿＋図６Ｈの各希釈度の抗体（終濃度）＋０．０１Ｕ／ｍｌ Ｐｒｏｔａｃ（終濃度）＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液、室温１５ｍｉｎ
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＶＷＦ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｈに示すように、ＶＷＦ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
１５０μｌ 合計１５０μｌ
対照：ＶＷＦ血液凝固因子欠乏血漿１５０μｌ＋ＯＷＲＥＮ－ＫＯＬＬＥＲ緩衝液１５０μｌ
測定方法：ＳＴＡＧＯ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ ＡＰＴＴ－プログラム
測定結果：図６Ｈに示すように、ＶＷＦ血液凝固因子欠乏血漿中で、抗ａＰＣモノクローナル抗体はａＰＣの抗凝固活性を完全に阻害した。
【実施例6】
【0254】
体内薬効試験
ヒト化プロテインＣ血友病マウスモデルにおいて（中国特許出願第２０１９１１０２７０６１．６号の段落［０２３０］～［０２３８］参照）、一定投与量の抗ａＰＣモノクローナル抗体を注射したあと、マウスの断尾後の出血量状況を観察することで、抗ａＰＣモノクローナル抗体がａＰＣの抗凝固機能を阻害した結果達成される血液凝固効果を検査した。
ヒト化プロテインＣ血友病マウスモデルにおいて（中国特許出願第２０１９１１０２７０６１．６号の段落［０２３０］～［０２３８］参照）、一定投与量の抗ａＰＣモノクローナル抗体を注射したあと、マウスの断尾後の出血量状況を観察することで、抗ａＰＣモノクローナル抗体がａＰＣの抗凝固機能を阻害した結果達成される血液凝固効果を検査した。
【0255】
６．１ 実験方法
マウスの眼角静脈に注射して投薬した。そして、投薬から１時間後に、ペントバルビタールを腹腔注射してマウスを麻酔した。麻酔後に、マウスの尾の末端から２ｍｍの箇所で断尾し、傷口を１５ｍｌ、３７℃の生理食塩水中に配置してマウスから流れ出す血液を収集した。収集は２０分後に停止した。収集した液体は、赤血球を破砕したあと遠心分離にかけて上清を収集した。次に、ＵＶ分光光度計を使用し、波長６００ｎｍで上清液を測定して、測定したＯＤ値によりマウスの出血量を表した。マウスの出血量は、マウスの血液凝固機能を評価するために用いた。ＷＴは正常マウスであり、ｕｎｔｒｅａｔｅｄは未投薬のヒト化プロテインＣ血友病Ａマウスか、未投薬のヒト化プロテインＣ血友病Ｂマウスである。
マウスの眼角静脈に注射して投薬した。そして、投薬から１時間後に、ペントバルビタールを腹腔注射してマウスを麻酔した。麻酔後に、マウスの尾の末端から２ｍｍの箇所で断尾し、傷口を１５ｍｌ、３７℃の生理食塩水中に配置してマウスから流れ出す血液を収集した。収集は２０分後に停止した。収集した液体は、赤血球を破砕したあと遠心分離にかけて上清を収集した。次に、ＵＶ分光光度計を使用し、波長６００ｎｍで上清液を測定して、測定したＯＤ値によりマウスの出血量を表した。マウスの出血量は、マウスの血液凝固機能を評価するために用いた。ＷＴは正常マウスであり、ｕｎｔｒｅａｔｅｄは未投薬のヒト化プロテインＣ血友病Ａマウスか、未投薬のヒト化プロテインＣ血友病Ｂマウスである。
【0256】
６．２ 実験結果
図７Ａに示すように、ヒト化プロテインＣ血友病Ａマウスに対し、１Ｕ／匹のＦＶＩＩＩ血液凝固因子、２０μｇ／匹のマウス抗体１５７３、１μｇ／匹のＨＡＰＣ－１４－６をそれぞれ注射した。新たな抗ＡＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ－１４－６を注射したマウスの血液凝固機能は正常マウスのレベルまで回復し、且つ、ＦＶＩＩＩ血液凝固因子を用いてマウスを治療した際の効果と一致していた。
図７Ａに示すように、ヒト化プロテインＣ血友病Ａマウスに対し、１Ｕ／匹のＦＶＩＩＩ血液凝固因子、２０μｇ／匹のマウス抗体１５７３、１μｇ／匹のＨＡＰＣ－１４－６をそれぞれ注射した。新たな抗ＡＰＣモノクローナル抗体ＨＡＰＣ－１４－６を注射したマウスの血液凝固機能は正常マウスのレベルまで回復し、且つ、ＦＶＩＩＩ血液凝固因子を用いてマウスを治療した際の効果と一致していた。
【0257】
図７Ｂに示すように、ヒト化プロテインＣ血友病Ａマウスに対し、異なる投与量のＨＡＰＣ－１４－６をそれぞれ注射したところ、最大で１μｇのＨＡＰＣ－１４－６だけで欠乏マウスの血液凝固機能を正常レベルまで回復させることができた。
【0258】
図７Ｃに示すように、ヒト化プロテインＣ血友病Ｂマウスに対し、異なる投与量のＨＡＰＣ－１４－６をそれぞれ注射したところ、最大で１μｇのＨＡＰＣ－１４－６だけで欠乏マウスの血液凝固機能を正常レベルまで回復させることができた。
【0259】
結果として、本発明では、プロテインＣキナーゼ（ｐｒｏｔａｃ）誘導によるＡＰＴＴ試験を用い、複数の血液凝固因子を欠乏したヒト血漿中で抗ａＰＣモノクローナル抗体がａＰＣの抗凝固活性を阻害する最小投与量を測定した。その結果、マウス抗体ＨＡＰＣ１５７３の場合には１００μｇ／ｍｌ以上の濃度が必要なのに対し、本発明では、最大でもわずか１μｇ／ｍｌの濃度で完全に阻害可能であった。
【0260】
以上の実施例は本発明の技術方案を制限するものではなく、説明するためのものにすぎない。好ましい実施例を参照して本発明につき詳細に説明したが、当業者は以下の点を理解すべきである。即ち、依然として、本発明の具体的実施形態の修正や、一部の技術的特徴についての同等の置換が可能である。また、発明思想の精神及び範囲を逸脱することなく、当業者が想到可能な変形及び利点は、いずれも本発明が保護を請求する技術方案の範囲に含まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図4K】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【配列表】
【国際調査報告】