(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-26
(54)【発明の名称】標的ＲＮＡ検出
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6888 20180101AFI20231219BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20231219BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20231219BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6888 Z
C12Q1/70 ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6844 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023533668
(86)(22)【出願日】2021-12-03
(85)【翻訳文提出日】2023-07-28
(86)【国際出願番号】 EP2021084172
(87)【国際公開番号】W WO2022117816
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】2019059.1
(32)【優先日】2020-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】305031567
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】タッカー， ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ダフォーン， ティモシー
(72)【発明者】
【氏名】カーター， ジェイク
(72)【発明者】
【氏名】デュプレイ， ジャン－ルイス ヘンリー アラン
(72)【発明者】
【氏名】イトゥルベ， ロレア オレタ
(72)【発明者】
【氏名】ヒックス， マシュー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR32
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
本開示は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成し、その生成物を増幅するプロセスに基づいて、サンプル中の標的ＲＮＡ配列を検出することにおける使用のための方法および生成物に関する。本開示は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成することができる酵素の同定および使用、ならびに増幅された生成物を生成するためのそのニック形成されたＤＮＡの使用に基づく。１つの教示において、その増幅された生成物は、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）を使用して生成され得る。本明細書中の教示に従って、本発明者らは、それらが、サンプル（例えば、ＣｏＶＩＤ－１９患者サンプル）から１０分未満で（例えば、５分以内に）ＲＮＡを正確に同定し得ることを示した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中の標的ＲＮＡ配列を検出する方法であって、前記方法は、ａ）前記サンプルと、第１の温度において、バインダーＤＮＡ分子および特異的認識配列においてＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のＤＮＡ鎖にニック形成することができる制限エンドヌクレアーゼとを、ニック形成されたＤＮＡ分子を生成するために接触させる工程であって、
ここで前記バインダーＤＮＡ分子は、前記第１の温度において前記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合し、それによってＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成することができ：前記バインダーＤＮＡ分子は、前記第１の温度において前記標的ＲＮＡ配列に結合せずかつテンプレートＤＮＡ分子に相補的な配列を含む配列の一部分；および前記第１の温度において前記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合することができかつ前記特異的認識配列を含む配列のさらなる一部分を含み、
ここで前記制限エンドヌクレアーゼは、前記認識配列において前記結合したバインダーＤＮＡ分子にニック形成し、その結果、前記ニック形成されたＤＮＡ分子を、前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から放出することができる工程；あるいは
ａ’）前記サンプルと、第１の温度において、バインダーＤＮＡ分子、逆転写酵素および特異的認識配列においてＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の前記ＤＮＡ鎖にニック形成することができる制限エンドヌクレアーゼとを、ニック形成されたＤＮＡ分子を生成するために接触させる工程であって、
ここで前記バインダーＤＮＡ分子は、前記第１の温度において前記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合し、それによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成し、ｄＮＴＰおよび前記逆転写酵素の存在下で鎖伸長および伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の生成を開始することができ、前記伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、前記特異的認識配列を含み、
ここで前記制限エンドヌクレアーゼは、前記認識配列において前記伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖にニック形成し、その結果、前記ニック形成されたＤＮＡ分子を、前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から放出することができる工程；ならびに
ｂ）第２の温度において、前記ニック形成されたＤＮＡ分子と前記テンプレートＤＮＡ分子とを接触させ、その結果、前記ニック形成されたＤＮＡ分子が前記テンプレートＤＮＡ分子を結合し、ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で鎖伸長および増幅された生成物の生成を開始する工程；および
前記増幅された生成物のうちのいずれかを検出する工程であって、ここで前記増幅された生成物の検出は、前記サンプルが検出されるべき前記標的ＲＮＡ配列を含むことを示す工程、
を包含する方法。
【請求項2】
工程ａ）／ａ’）および工程ｂ）は、単一の反応器、レセプタクルまたは容器中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のおよび第２の温度は同じである、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項4】
標的ＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡ；ｒＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ；ｈｎＲＮＡ；ｐｉＲＮＡ；ａＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；感染性因子に由来するＲＮＡ；または合成ＲＮＡ分子である、任意の前記の請求項に記載の方法。
【請求項5】
前記感染性因子は、細菌、真菌またはウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ウイルスは、１本鎖もしくは２本鎖のＲＮＡウイルス、または宿主細胞のゲノムに組み込まれかつｍＲＮＡを生成するために転写されるウイルスである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス、ウェストナイルウイルス、デングウイルス、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのようなプラスセンスＲＮＡウイルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスは、ＣｏＶＩＤ－１９である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
工程ａ）の前記バインダーＤＮＡ分子は、４５～７０℃の範囲にその標的ＲＮＡ分子に対する融解温度を有し、前記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度は３０～４５℃の範囲にある、任意の前記の請求項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｔＮＩ、ＡｖｒＩＩまたはＰｈｏＩである、任意の前記の請求項に記載の方法。
【請求項11】
前記増幅された生成物は、可変サーマルサイクリング（ＰＣＲのような）、もしくは等温増幅技術および／または線形増幅反応もしくは指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）によって生成される、任意の前記の請求項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＥＸＰＡＲは、鎖置換増幅（ＳＤＡ）またはニック形成酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記増幅された生成物は、発光、ＵＶまたは可視光の分光法もしくは分光測定法、蛍光分光法もしくは分光測定法、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、電気化学、電気泳動、酵素標識、蛍光標識、化学発光、生物発光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、発蛍光団改変プローブＤＮＡによって、裸眼によって視覚的に、適切な色素生成／色の変化もしくは生成によって（例えば、適切なタグもしくは色素改変プローブもしくは核酸を使用することによって）、またはこれらの任意の組み合わせによって検出される、任意の前記の請求項に記載の方法。
【請求項14】
前記増幅された生成物は、前記方法開始の１５分以内、１０分未満、９分未満、８分未満、７分未満、６分未満、またはさらには５分未満に検出される、任意の前記の請求項に記載の方法。
【請求項15】
任意の前記の請求項に記載の方法における使用のためのバインダーＤＮＡ分子であって、前記バインダーＤＮＡ分子は、ＲＮＡテンプレートを特異的に結合することができ、前記バインダーＤＮＡ分子は、標的ＲＮＡ分子に相補的であり、前記バインダーＤＮＡがＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の一部である場合に、制限エンドヌクレアーゼによってニック形成され得るＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む一部分；ならびに
標的ＲＮＡ分子に相補的である前記一部分が前記標的ＲＮＡ分子に結合される場合に、前記標的ＲＮＡ分子に相補的でもなく結合もしないさらなる一部分、
を含む、バインダーＤＮＡ分子。
【請求項16】
前記バインダーＤＮＡは、２０～５０ヌクレオチドの長さである、請求項１５に記載のバインダーＤＮＡ。
【請求項17】
前記標的ＲＮＡ配列に結合しない領域は、２～８ヌクレオチドの長さである、および／または前記バインダーＤＮＡの５’末端にある、請求項１５または１６のいずれかに記載のバインダーＤＮＡ。
【請求項18】
１またはこれより多くの化学的改変を含み、ここで必要に応じて前記１またはこれより多くの化学的改変は、前記バインダーＤＮＡの３’および／または５’末端にある、請求項１５～１７のいずれかに記載のバインダーＤＮＡ。
【請求項19】
前記バインダーＤＮＡ分子は、以下の配列：【化8】
【化9】
【請求項20】
前記バインダーＤＮＡは、以下の配列：【化10】
から本質的になるかまたはからなる、請求項１９に記載のバインダーＤＮＡ分子。
【請求項21】
請求項１～１４のいずれかに記載の方法における使用のためのキットであって、前記キットは、第１の温度において、前記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合することができ、それによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成するバインダーＤＮＡ分子であって：前記バインダーＤＮＡ分子は、前記第１の温度において前記標的ＲＮＡ配列に結合せず、テンプレートＤＮＡ分子に相補的な配列を含む配列の一部分；および前記第１の温度において前記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合することができ、かつ前記特異的認識配列を含む配列のさらなる一部分を含むバインダーＤＮＡ分子、あるいは
第１の温度において、前記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合することができ、それによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成し、ｄＮＴＰｓおよび逆転写酵素の存在下で鎖伸長および伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の生成を開始することができるバインダーＤＮＡ分子であって、前記伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、前記特異的認識配列を含むバインダーＤＮＡ分子、
から本質的になるかまたはからなり、前記キットは、必要に応じて、前記逆転写酵素；および
標的ＲＮＡ分子に結合した場合に、制限エンドヌクレアーゼの前記認識配列において前記バインダーＤＮＡ配列にニック形成することができる前記制限エンドヌクレアーゼ、
をさらに含むキット。
【請求項22】
前記バインダーＤＮＡ分子は、請求項１５～２０のいずれかに記載のバインダーＤＮＡ分子である、請求項２１に記載のキット。
【請求項23】
前記制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｔＮＩ、ＡｖｒＩＩまたはＰｈｏＩである、請求項２１または２２のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
本開示は、サンプル中の標的ＲＮＡ配列を検出することにおける使用のための方法および生成物に関する。
本開示は、サンプル中の標的ＲＮＡ配列を検出することにおける使用のための方法および生成物に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
ＣｏＶＩＤ－１９は、２０２０年３月１１日に全世界的なパンデミックを宣言され、１１８，０００を超える症例が、１１４の異なる国々において報告された。３ヶ月以内に、症例数は、１８８の国々においてほぼ６５０万症例へと上昇した。集団全体へのその拡がりを低減するために、正確かつ効率的なウイルス検査ストラテジーが、必須である。このストラテジーの重要な部分は、アッセイ時間を短縮し、サンプルスループットの増加を目的とした連続的なアッセイ開発である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の臨床症状が、風邪およびインフルエンザのものに似たものであり得ることを考慮すれば、ウイルス自体の明確な同定は、効果的な診断のために極めて重要である。上記疾患の早期ステージでは、これは、ウイルスＲＮＡを検出することによってのみ真に達成され得る。
ＣｏＶＩＤ－１９は、２０２０年３月１１日に全世界的なパンデミックを宣言され、１１８，０００を超える症例が、１１４の異なる国々において報告された。３ヶ月以内に、症例数は、１８８の国々においてほぼ６５０万症例へと上昇した。集団全体へのその拡がりを低減するために、正確かつ効率的なウイルス検査ストラテジーが、必須である。このストラテジーの重要な部分は、アッセイ時間を短縮し、サンプルスループットの増加を目的とした連続的なアッセイ開発である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の臨床症状が、風邪およびインフルエンザのものに似たものであり得ることを考慮すれば、ウイルス自体の明確な同定は、効果的な診断のために極めて重要である。上記疾患の早期ステージでは、これは、ウイルスＲＮＡを検出することによってのみ真に達成され得る。
【0003】
診断産業は迅速に、一連の検出プラットフォームを、とりわけ、ＣＤＣ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、およびＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄとともに開発することに応じ、この前例のない危機を管理するために検査を発売した１。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出に使用される最も一般的なアッセイは、１サンプルあたり６０分超かかり、２工程プロセスを代表的には含むｑＰＣＲベースのものである。第１に、逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換するために使用される（最大３０分かかり得るプロセス）２。次いで、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、蛍光色素を使用して検出されるｃＤＮＡを増幅するために行われ得る（最大１時間かかるプロセス）３－５。アッセイ時間を短縮するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ検出へのたくさんの新たなアプローチが、過去数ヶ月間で文献中に出現してきている。ほぼまちがいなく、これらの中で最も成功裡のものは、ＤＮＡ増幅に等温的アプローチを適用し、増幅速度を大きく加速し、よって、アッセイ時間を短縮した６，７。最も一般的な等温増幅システムは、ループ媒介性等温増幅（Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）である。ＬＡＭＰ法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のために開発されたが、それらは、＜１０分で結果を与えることに悪戦苦闘している７。
【0004】
診断アッセイにおいてしばしば使用される別の技術は、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）である。ＥＸＰＡＲ反応は、ＤＮＡに制限される。なぜなら反応に必要とされるニックエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ二重鎖に対してのみ活性であるからである。このことは、ＥＸＰＡＲを使用してＲＮＡを検出するために、ＲＮＡ→ＤＮＡ工程が要求されることを意味する。これは、逆転写酵素（ＲＴ）反応によって概して提供される。ＲＴ工程をしばしば要求することはさておき、ＥＸＰＡＲは、他の類似の技術より迅速である。なぜならそれは、非常に短い１本鎖配列が増幅されることのみを要求するように最適化されているからである。ＥＸＰＡＲアッセイのためにかかる時間は一般に、得られる短いフラグメントがポリメラーゼをプライムするために必要とされる二重鎖を形成するために所望の温度での結合エネルギーを有しないであろうことから、さらに最適化され得ない。速度は、温度を上昇させることによって増加され得るが、これはまた、より長い配列が二重鎖を形成するために必要とされることを意味する。このことは、ＲＴ工程を使用するＥＸＰＡＲベースのようなＥＸＰＡＲｓ速度を増加させる方法が制限されることを意味する。さらに、アッセイを行うために必要な任意のさらなる反応は、合計のアッセイ時間をさらに増加させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
要旨
本開示は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成することができる酵素の同定および使用、ならびに増幅された生成物を生成するためのそのニック形成されたＤＮＡの使用に基づく。１つの教示において、その増幅された生成物は、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）を使用して生成され得る。本明細書中の教示に従って、本発明者らは、それらが、サンプル（例えば、ＣｏＶＩＤ－１９患者サンプル）から１０分未満で（例えば、５分以内に）ＲＮＡを正確に同定し得ることを示した。
本開示は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成することができる酵素の同定および使用、ならびに増幅された生成物を生成するためのそのニック形成されたＤＮＡの使用に基づく。１つの教示において、その増幅された生成物は、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）を使用して生成され得る。本明細書中の教示に従って、本発明者らは、それらが、サンプル（例えば、ＣｏＶＩＤ－１９患者サンプル）から１０分未満で（例えば、５分以内に）ＲＮＡを正確に同定し得ることを示した。
【0006】
第１の教示において、サンプル中の標的ＲＮＡ配列を検出する方法であって、上記方法は、
ａ）上記サンプルと、第１の温度において、バインダーＤＮＡ分子および特異的認識配列においてＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の上記ＤＮＡ鎖にニック形成することができる制限エンドヌクレアーゼとを、ニック形成されたＤＮＡ分子を生成するために接触させる工程であって、
ここで上記バインダーＤＮＡ分子は、上記第１の温度において上記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合し、それによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成することができ：上記バインダーＤＮＡ分子は、上記第１の温度において上記標的ＲＮＡ配列に結合せずかつテンプレートＤＮＡ分子に相補的な配列を含む配列の一部分；および上記第１の温度において上記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合することができかつ上記特異的認識配列を含む配列のさらなる一部分を含み、
ここで上記制限エンドヌクレアーゼは、上記認識配列において上記結合したバインダーＤＮＡ分子にニック形成し、その結果、上記ニック形成されたＤＮＡ分子を、上記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から放出することができる工程；あるいは
ａ’）上記サンプルと、第１の温度において、プライマー、逆転写酵素および特異的認識配列においてＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の上記ＤＮＡ鎖にニック形成することができる制限エンドヌクレアーゼとを、ニック形成されたＤＮＡ分子を生成するために接触させる工程であって、
ここで上記プライマーは、上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成し、ｄＮＴＰｓおよび上記逆転写酵素の存在下で鎖伸長および伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の生成を開始することができ、上記伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、上記特異的認識配列を含み、
ここで上記制限エンドヌクレアーゼは、上記認識配列において上記伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖にニック形成し、その結果、上記ニック形成されたＤＮＡ分子を、上記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から放出することができる工程；ならびに
ｂ）第２の温度において、上記ニック形成されたＤＮＡ分子と、上記テンプレートＤＮＡ分子とを接触させ、その結果、上記ニック形成されたＤＮＡ分子の少なくとも３’部分が、上記テンプレートＤＮＡ分子を結合し、ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で鎖伸長および増幅された生成物の生成を開始する工程；および
上記増幅された生成物のうちのいずれかを検出する工程であって、ここで上記増幅された生成物の検出は、上記サンプルが、検出されるべき上記標的ＲＮＡ配列を含むことを示す工程を包含する方法を提供する。
ａ）上記サンプルと、第１の温度において、バインダーＤＮＡ分子および特異的認識配列においてＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の上記ＤＮＡ鎖にニック形成することができる制限エンドヌクレアーゼとを、ニック形成されたＤＮＡ分子を生成するために接触させる工程であって、
ここで上記バインダーＤＮＡ分子は、上記第１の温度において上記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合し、それによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成することができ：上記バインダーＤＮＡ分子は、上記第１の温度において上記標的ＲＮＡ配列に結合せずかつテンプレートＤＮＡ分子に相補的な配列を含む配列の一部分；および上記第１の温度において上記標的ＲＮＡ配列に対して特異的に結合することができかつ上記特異的認識配列を含む配列のさらなる一部分を含み、
ここで上記制限エンドヌクレアーゼは、上記認識配列において上記結合したバインダーＤＮＡ分子にニック形成し、その結果、上記ニック形成されたＤＮＡ分子を、上記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から放出することができる工程；あるいは
ａ’）上記サンプルと、第１の温度において、プライマー、逆転写酵素および特異的認識配列においてＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の上記ＤＮＡ鎖にニック形成することができる制限エンドヌクレアーゼとを、ニック形成されたＤＮＡ分子を生成するために接触させる工程であって、
ここで上記プライマーは、上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡ配列に特異的に結合し、それによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成し、ｄＮＴＰｓおよび上記逆転写酵素の存在下で鎖伸長および伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の生成を開始することができ、上記伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、上記特異的認識配列を含み、
ここで上記制限エンドヌクレアーゼは、上記認識配列において上記伸長したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖にニック形成し、その結果、上記ニック形成されたＤＮＡ分子を、上記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から放出することができる工程；ならびに
ｂ）第２の温度において、上記ニック形成されたＤＮＡ分子と、上記テンプレートＤＮＡ分子とを接触させ、その結果、上記ニック形成されたＤＮＡ分子の少なくとも３’部分が、上記テンプレートＤＮＡ分子を結合し、ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で鎖伸長および増幅された生成物の生成を開始する工程；および
上記増幅された生成物のうちのいずれかを検出する工程であって、ここで上記増幅された生成物の検出は、上記サンプルが、検出されるべき上記標的ＲＮＡ配列を含むことを示す工程を包含する方法を提供する。
【0007】
本明細書中でより詳細に記載されるように、工程ａ）および工程ｂ）は、単一のレセプタクル／容器、または２個の別個のレセプタクル／容器の中で行われ得る。
【0008】
いくつかの教示において、上記第１のおよび第２の温度は、同じ温度である。
【0009】
上記標的ＲＮＡ配列は、任意の適切なＲＮＡ配列（ヒトＲＮＡ配列が挙げられる）であってもよく、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、感染性因子に由来するＲＮＡおよび合成ＲＮＡ分子などを含み得る。１つの教示において、上記標的ＲＮＡ配列は、感染性因子に由来し、本明細書で記載される方法は、上記サンプルが感染性因子、上記感染性因子に由来するＲＮＡを含むかどうかを確認するために使用され得る。従って、上記方法は、いくつかの教示において、例えば被験体が上記感染性因子に感染しているかどうか、または基材が上記感染性因子に汚染されているかどうかを検出するために使用され得る。
【0010】
さらに、いくつかの組み込まれるウイルス（宿主のゲノムへと組み込まれるウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））に関しては、上記ウイルスＤＮＡを検出するよりむしろ、転写されるｍＲＮＡを検出する方がよい場合がある。これは、ＨＰＶの場合には、高リスクＨＰＶのＥ６／Ｅ７発癌遺伝子の発現が、異形成表現型の発生および維持に必要であることが理由である。従って、Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出は、ＨＰＶ ＤＮＡを単に検出するよりも良好な予後評価を提供し得る。従って、細胞中で転写されるＨＰＶおよび他の組み込まれるウイルスのｍＲＮＡは、本開示に従って検出され得る。例としては、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）；肝炎（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））；アデノ随伴ウイルス－２（ＡＡＶ－２）；およびレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよび内在性レトロウイルス（ＥＲＶ１））が挙げられる。
【0011】
上記感染性因子は、例えば、細菌、真菌またはウイルスであり得る。ある特定の教示において、上記感染性因子は、１本鎖もしくは２本鎖のＲＮＡウイルス、またはゲノム組み込みウイルス（ここでそのうちの１もしくはこれより多くの遺伝子が、宿主細胞によって転写される）である。上記教示は、１本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、プラス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡウイルスが挙げられる）の検出に特に適している。
【0012】
プラス鎖ＲＮＡウイルスは、Ｋｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｃｏｔａ門、Ｌｅｎａｒｖｉｒｉｃｏｔａ門、およびＰｉｓｕｖｉｒｉｃｏｔａ門（特に、Ｐｉｓｏｎｉｖｉｒｉｃｅｔｅｓ綱およびＳｔｅｌｐａｖｉｒｉｃｔｅｓ綱）の間で分けられ、これらは全て、Ｏｒｔｈｏｒｎａｖｉｒａｅ界（kingdom）およびＲｉｂｏｖｉｒｉａ界（realm）の中にある。それらは、単系統であり、共通のＲＮＡウイルス祖先に由来している。
【0013】
プラス鎖ＲＮＡウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス、ウェストナイルウイルス、デングウイルス、ならびにＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのような多くの病原体、ならびにそれほど臨床上は重大ではない病原体（例えば、風邪を引き起こすライノウイルス）を含む大部分の公知のウイルスを占める。
【0014】
例示的なプラス鎖ＲＮＡウイルスとしては、以下が挙げられる：
１．ビモウイルス、コモウイルス、ネポウイルス、ノダウイルス、ピコルナウイルス、ポチウイルス、ソベモウイルス、および一部のルテオウイルス（テンサイ西部萎黄病ウイルスおよびジャガイモ葉巻ウイルス）－ピコルナ様グループ（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｔａ）。
２．カルモウイルス、ディアントウイルス（ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）、フラビウイルス、ペスチウイルス、スタトウイルス（ｓｔａｔｏｖｉｒｕｓｅｓ）、トンブスウイルス、１本鎖ＲＮＡバクテリオファージ、Ｃ型肝炎ウイルス、および一部のルテオウイルス（オオムギ黄萎ウイルス）－フラビ様グループ（Ｆｌａｖｉｖｉｒａｔａ）。
３．アルファウイルス、カルラウイルス（ｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ）、フロウイルス、ホルデイウイルス、ポテックスウイルス、ルビウイルス、トブラウイルス、トリコルナウイルス（ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、ティモウイルス、リンゴクロロティックリーフスポットウイルス（ａｐｐｌｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、テンサイ萎黄ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス－アルファ様グループ（Ｒｕｂｉｖｉｒａｔａ）。
１．ビモウイルス、コモウイルス、ネポウイルス、ノダウイルス、ピコルナウイルス、ポチウイルス、ソベモウイルス、および一部のルテオウイルス（テンサイ西部萎黄病ウイルスおよびジャガイモ葉巻ウイルス）－ピコルナ様グループ（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｔａ）。
２．カルモウイルス、ディアントウイルス（ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）、フラビウイルス、ペスチウイルス、スタトウイルス（ｓｔａｔｏｖｉｒｕｓｅｓ）、トンブスウイルス、１本鎖ＲＮＡバクテリオファージ、Ｃ型肝炎ウイルス、および一部のルテオウイルス（オオムギ黄萎ウイルス）－フラビ様グループ（Ｆｌａｖｉｖｉｒａｔａ）。
３．アルファウイルス、カルラウイルス（ｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ）、フロウイルス、ホルデイウイルス、ポテックスウイルス、ルビウイルス、トブラウイルス、トリコルナウイルス（ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、ティモウイルス、リンゴクロロティックリーフスポットウイルス（ａｐｐｌｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、テンサイ萎黄ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス－アルファ様グループ（Ｒｕｂｉｖｉｒａｔａ）。
【0015】
例示的なマイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、以下が挙げられる：Ｄ型肝炎ウイルスおよびネガルナウイルス門ウイルス（Ｎｅｇａｒｎａｖｉｒｉｃｏｒｔａ ｖｉｒｕｓｅｓ）（これは、ハプロウイルス亜門（Haploviricotina）およびポリプロウイルス亜門（Polyploviricotina）のウイルスを含む）。注目すべきハプロウイルス亜門ウイルスとしては、例えば、エボラ、マールブルグ、麻疹、ムンプス、ＲＳＶおよび狂犬病が挙げられる。注目すべきポリプロウイルス亜門ウイルスとしては、ラッサウイルスおよびインフルエンザウイルスが挙げられる。
【0016】
本発明は、コロナウイルスおよびＣｏＶＩＤ－１９を特に検出するという点において本明細書で例証され得るが、これは、限定として解釈されるべきではなく、当業者は、本教示を容易に認識し、他のＲＮＡ標的の検出に適応させ得る。
【0017】
標的ＲＮＡ配列を含み得るサンプルの任意のタイプが、本明細書で開示される方法においてまたはキットとともに使用され得る。よって、標的ＲＮＡ配列を含むかまたは含むと疑われるサンプルは、具体的に限定されず、例えば、生きている被験体に由来する生物学的サンプル（例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液）、組織（例えば、肺組織）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物または細菌培養物）；ＲＮＡを含むサンプル（例えば、ウイロイド、ウイルス、細菌、真菌、酵母、植物、および動物）；ウイルスまたは細菌のような微生物を含み得るかまたはこれらが感染し得るサンプル（例えば、食品および生物学的調製物）；ならびに生物学的物質を含み得るサンプル（例えば、土壌、産業プロセスおよび製造設備、ならびに廃水）；ならびに種々の水源に由来するサンプル（例えば、飲用水）が挙げられる。上記サンプルはまた、例えば、感染性因子を含むかまたは感染因子によって汚染されていると疑われる、例えば、固体表面のスワブであり得る。
【0018】
さらに、サンプルは、本明細書で開示される方法において使用されるＲＮＡ含有組成物を調製するために任意の公知の方法によって処理され得る。このような調製の例としては、細胞破砕（例えば、細胞溶解物および抽出物）およびサンプル分別が挙げられ得る。サンプルは、１個のサンプルであり得るか、または複数のサンプル（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個またはこれより多くのサンプル）であり得、これらは、一緒にプールされ得、単一の試験において試験される。
【0019】
本明細書でさらに記載されるように、本発明者らは、ある特定のＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼが、それらの通常の／従来の標的がＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖であったとしてもＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を認識することができ、上記ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成することができることを特定した。本発明のバインダーＤＮＡおよび／またはプライマー分子は、上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡ配列を特異的に結合することができ、上記制限エンドヌクレアーゼは、その認識配列において上記ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成することができなければならない。上記バインダーＤＮＡ／プライマー分子は、上記標的ＲＮＡ配列に相補的であり、その結果、上記バインダーＤＮＡ／プライマーが、上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡを結合し得る配列の一部分であるかまたはその一部分を含む。しかし、上記バインダーＤＮＡ／プライマーは、上記第１の温度において、テンプレートＤＮＡを結合することができないか、または少なくともテンプレートＤＮＡを結合して、そこから鎖伸長を開始することができない。
【0020】
さらなる局面において、ＲＮＡテンプレートを特異的に結合するためのバインダーＤＮＡ分子であって、上記バインダーＤＮＡ分子は、
標的ＲＮＡ分子に相補的であり、かつ上記バインダーＤＮＡがＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の一部である場合に、制限エンドヌクレアーゼによってニック形成され得るＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む一部分；ならびに標的ＲＮＡ分子に相補的である上記一部分が、第１の温度において上記標的ＲＮＡ分子に結合される場合に、上記標的ＲＮＡ分子に相補的でなく、結合しないさらなる一部分を含むバインダーＤＮＡ分子、
が提供される。
標的ＲＮＡ分子に相補的であり、かつ上記バインダーＤＮＡがＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の一部である場合に、制限エンドヌクレアーゼによってニック形成され得るＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む一部分；ならびに標的ＲＮＡ分子に相補的である上記一部分が、第１の温度において上記標的ＲＮＡ分子に結合される場合に、上記標的ＲＮＡ分子に相補的でなく、結合しないさらなる一部分を含むバインダーＤＮＡ分子、
が提供される。
【0021】
本明細書で言及されるように、１つの教示において、本開示は、ＣｏＶＩＤ－１９の検出に関し、この点において、本教示は、ＣｏＶＩＤ－１９を検出するために、本教示に従って使用するために具体的に設計されたバインダーＤＮＡ配列を提供する。
【0022】
従って、ＣｏＶＩＤ－１９の検出における使用のための１つの教示において、上記バインダーＤＮＡ分子は、以下の配列から本質的になり得るかまたはからなる：
。
【化1】
【0023】
１つの教示において、上記バインダーＤＮＡ分子は、以下の配列から本質的になるかまたはからなる：
。
【化2】
【0024】
この文脈において、から本質的になるは、特定されたヌクレオチド（例えば、３’ヌクレオチド）の１またはこれより多くのものが、化学的に改変されていてもよいが、ただしこれが、配列がその標的ＲＮＡ配列に結合する能力に実質的に影響を及ぼさないことを意味することが意図される。
【0025】
１つの教示において、上記バインダーＤＮＡ分子は、上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡ配列を結合し得る一部分、および上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡを結合しないさらなる一部分を含む。上記標的ＲＮＡ配列を結合する上記一部分はまた、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を認識し、その認識配列において上記ＤＮＡ鎖にニック形成することができる上記ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含む。上記第１の温度は、非標的ＲＮＡ配列への上記バインダーＤＮＡ／プライマー分子のいかなる非特異的結合をも制限または防止するように選択され、よって、上記バインダーＤＮＡ／プライマーがその特異的標的にのみ結合することを確実にする。この点において、上記標的ＲＮＡ配列を結合する上記一部分は、場合によっては、その標的ＲＮＡ配列への結合という点で完全に相補的であり得ることが認識され得る。しかし、場合によっては、上記標的ＲＮＡに結合する上記バインダーＤＮＡ／プライマーの上記一部分は、完全に相補的でなくてもよいし、いくつかのミスマッチが、許容されてもよい（例えば、上記バインダーＤＮＡ／プライマー配列の上記一部分の長さにわたって１個、２個、３個または４個のミスマッチがあり、これは、上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡを結合することができる）。このようなミスマッチは、上記ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含む一領域にあってもよいし、上記ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含まない一領域にあってもよいし、その両方の領域にあってもよい。１つの教示において、任意のミスマッチは、上記認識配列を含まない上記一領域にのみ見出され得る。
【0026】
上記バインダーＤＮＡ／プライマー分子は、代表的には、２０～５０ヌクレオチドの長さ（例えば、２５～４０ヌクレオチド）であり得る。存在する場合、上記標的ＲＮＡ配列を結合しない上記一領域は、例えば、２～８ヌクレオチド（例えば、３～６ヌクレオチドの長さ）であり得る。上記標的ＲＮＡ分子を結合しない上記一領域は、上記バインダーＤＮＡの５’末端に存在し得る。しかし、上記バインダーＤＮＡ分子の長さおよび上記標的ＲＮＡ結合およびその非結合領域はまた、機能的方法で決定され得る。この点において、上記バインダーＤＮＡは、上記第１の温度において、その標的ＲＮＡ配列に結合することができ、上記第１の温度において、それに由来するニック形成されたＤＮＡ分子が上記標的ＲＮＡ分子から放出されなければならない。従って、上記バインダーＤＮＡ／プライマー分子は、上記第１の温度において、上記標的ＲＮＡ分子に結合するのに対して、上記ＤＮＡニック形成された分子は結合しない。
【0027】
上記バインダーＤＮＡは、当該分野で概して公知であるような化学的改変を含み得る。いくつかの実施形態において、例えば、上記バインダーＤＮＡは、化学的に改変されたヌクレオチド（例えば、２’－０メチル誘導体、ホスホロチオエートなど）、３’末端改変、５’末端改変、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記バインダーＤＮＡの３’末端は、伸長反応が（例えば、上記標的ＲＮＡ配列、またはポリメラーゼ伸長のためのプライマーとして働き得る別の非標的配列に結合する際に）上記バインダーＤＮＡの３’末端から起こらないまたは起こり得ないように改変され得る。上記バインダーＤＮＡの３’末端から開始される任意の複製は、検出誤差（例えば、偽陽性）をもたらし得る。よって、いくつかの教示において、上記バインダーＤＮＡは、いかなる所望しない伸長反応（例えば、上で考察したもの）の発生をも低減または排除し得る３’末端改変を含む。３’末端改変の非限定的な例としては、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、およびＦＡＭの付加が挙げられる。改変の他の非限定的な例としては、例えば、ビオチン化、蛍光色素付加（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｏｎ）、リン酸化、チオール化、アミノ化、または改変／反転ヌクレオチドが挙げられ、これらは、ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＤＮＡ伸長反応下で上記バインダーＤＮＡ分子の３’末端へのさらなるヌクレオチドの付加を容易に許容しない。
【0028】
当該分野で公知の技術（例えば、参考文献８を参照のこと）を使用して、当業者は、相当する標的ＲＮＡ配列についての任意の特定のＤＮＡ配列の融解温度、およびニック形成されたＤＮＡ配列の融解温度を計算し得る。上記第１の温度は、第１の温度が、上記標的ＲＮＡに対して上記バインダーＤＮＡの融解温度を下回るが、制限エンドヌクレアーゼおよび適切な場合には逆転写酵素が機能し得る温度でもあることから、上記バインダーＤＮＡが結合すると予測される温度であるように選択される。温度が高すぎれば、制限エンドヌクレアーゼ／逆転写酵素は機能しないこともあり（例えば、上記酵素（複数可）は、変性状態になり得る）、温度が低すぎれば、ニック形成反応および／または鎖伸長反応が遅くなりすぎることもある。
【0029】
結合しているＤＮＡが標的ＲＮＡに結合する一部分および上記標的ＲＮＡを結合しない一部分を含む教示において、上記第１の温度は、上記標的ＲＮＡ配列に対して上記バインダーＤＮＡの融解温度を下回るが、ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度を上回るように選択され、その結果、ニック形成の際に、上記ニック形成されたＤＮＡ分子は、上記標的ＲＮＡ分子から放出される。当業者は、上記標的ＲＮＡ分子を結合しない上記バインダーＤＮＡならびに領域の長さにわたる任意のミスマッチの融解温度に対する効果を容易に考慮し、当業者の共通の一般的知識を使用して、相応に第１の温度を設定することが可能である。
【0030】
上記バインダーＤＮＡ分子の適切な設計を通じて、その長さ、ならびにミスマッチ、認識配列の位置および上記標的ＲＮＡ分子を結合しない領域の長さを考慮すれば、上記バインダーＤＮＡ分子は、その標的ＲＮＡ分子についてのその融解温度が４５～７０℃の範囲にある／その範囲にあり得る、および上記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度が３０～４５℃の範囲にある／その範囲にあり得るように、設計され得る。上記第１の温度は、上記バインダーＤＮＡ分子の融解温度を下回るが、上記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度を上回るように選択される。従って、例えば、相補的な核酸分子に対するバインダーＤＮＡ分子の融解温度が６０℃として計算され、上記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度が３５℃として計算される場合、上記第１の温度は、例えば、上記バインダーＤＮＡ分子が上記標的ＲＮＡ分子を結合し、上記ニック形成されたＤＮＡが結合せず、上記標的ＲＮＡ分子から放出されることを確実にするために、４５℃～５５℃の間であり得る。
【0031】
上記ニック形成されたＤＮＡ配列は、上記標的ＲＮＡ配列に結合しない（よって、非相補的である）配列の領域、ならびにＲＮＡ標的と相補的でありかつニック形成反応が起こる前にＲＮＡ標的に結合しない領域を含む。
【0032】
プライマーおよび逆転写酵素を利用する本明細書で記載される方法によれば、上記プライマーは、その標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく、従って、その標的ＲＮＡ配列を結合しないことが意図される一部分を含まない。しかし、標的ＲＮＡ結合および非結合領域を含み、逆転写酵素を利用しないバインダーＤＮＡの使用に関する教示とは異なり、上記ニック形成されたＤＮＡ配列は、単に、第１の温度がその標的ＲＮＡ配列に対して上記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度を上回ることによって、上記標的ＲＮＡ配列から放出されなくてもよい。このような状況では、上記逆転写酵素および／または他のプロセシング酵素は、上記標的ＲＮＡ配列から上記ニック形成されたＤＮＡ分子の放出を促進し得る。
【0033】
上記のように、上記ニック形成された１本鎖ＤＮＡ分子の長さは、上記バインダーＤＮＡ分子の設計に依存し得る。しかし、代表的には、上記ニック形成された１本鎖ＤＮＡ分子は、１０～３０ヌクレオチドの長さ（例えば、１２～２４ヌクレオチド、または１４～２０ヌクレオチドの長さ、または上限値と下限値との間の任意の整数もしくは範囲（例えば、１０～２０、もしくは１４～３０ヌクレオチドの長さ））であり得る。
【0034】
本開示に従うバインダーＤＮＡを設計する一般化された方法は、先ず、ＤＮＡ配列の中で、潜在的な標的ＲＮＡに相補的であるＢｓｔＮＩ、ＡｖｒＩＩまたはＰｈｏＩ制限部位全てを探すことを含み得る。このような制限部位を有するバインダーＤＮＡ分子が結合する適切な標的領域がいったん特定されると、以下の工程のうちの１またはこれより多くのもの（例えば、少なくとも２、３、または４つ）が行われる：
１）任意の潜在的バインダーＤＮＡ配列から、複数のＢｓｔＮＩ、ＡｖｒＩＩまたはＰｈｏＩ制限部位（例えば、２個、３個、４個またはこれより多くの制限部位）を有する配列およびポリＡを含む配列を排除する工程；
２）５’末端においてＡＧＧＧを有するバインダーＤＮＡ配列を設計する工程；
３）１より多くの潜在的バインダーＤＮＡ配列が特定された場合、その潜在的バインダーＤＮＡ配列のＴｍを決定し、最高のＴｍおよび最低のＴｍを有する配列を除去する工程、
４）上記バインダーＤＮＡ分子のニック形成後に生じるであろう上記ニック形成されたＤＮＡ／トリガー配列の３’末端を評価して、塩基ＣＣＡＣが存在するかどうかを調べる工程。最も多くのＣＣＡＣのマッチを有する配列は、工程３の後に最高のＴｍおよび最低のＴｍを有するバインダーＤＮＡ配列に加えて選択される。
１）任意の潜在的バインダーＤＮＡ配列から、複数のＢｓｔＮＩ、ＡｖｒＩＩまたはＰｈｏＩ制限部位（例えば、２個、３個、４個またはこれより多くの制限部位）を有する配列およびポリＡを含む配列を排除する工程；
２）５’末端においてＡＧＧＧを有するバインダーＤＮＡ配列を設計する工程；
３）１より多くの潜在的バインダーＤＮＡ配列が特定された場合、その潜在的バインダーＤＮＡ配列のＴｍを決定し、最高のＴｍおよび最低のＴｍを有する配列を除去する工程、
４）上記バインダーＤＮＡ分子のニック形成後に生じるであろう上記ニック形成されたＤＮＡ／トリガー配列の３’末端を評価して、塩基ＣＣＡＣが存在するかどうかを調べる工程。最も多くのＣＣＡＣのマッチを有する配列は、工程３の後に最高のＴｍおよび最低のＴｍを有するバインダーＤＮＡ配列に加えて選択される。
【0035】
上記ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは、任意の制限エンドヌクレアーゼであり得、これは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成するかまたは優先的にニック形成することができる。「優先的にニック形成する」によって、本発明者らは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖において、そのＤＮＡ鎖がそのＲＮＡ鎖より大きな程度までニック形成されることを意味する。より大きな程度によって、本発明者らは、上記ＲＮＡ鎖に関して、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または９５％超を意味する。１つのこのようなＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｔＮＩである。Ｍｕｒｒａｙら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１０， Ｖｏｌ． ３８， Ｎｏ． ２２ ８２５７－８２６８は、いくつかの制限エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖にニック形成し得ることを示した。例えば、ＢｓｔＮＩ（切断部位はＣＣ／ＷＧＧ（ここでＷ＝ＡまたはＴ））は、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖のＤＮＡ鎖のみを効率的に切断する。これは、ＢｓｔＮＩのような酵素が、本教示に従って、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を切断して、ニック形成されたＤＮＡ分子を生じるために使用され得ることを意味する。極めて重要なことには、制限エンドヌクレアーゼは、プロセッシブではないので、フラグメントを生じるために単一の反応のみを必要とする。例えば、逆転写酵素（ＲＴ）は、ＤＮＡフラグメントが増幅反応のために生成される前に、いくつかのホスホジエステル結合の形成を触媒するために必要とされるであろう。このことは、エンドヌクレアーゼ反応（例えば、ＢｓｔＮＩ反応）をＲＴ反応より本質的に速くする。ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖を切断することができる他の制限酵素としては、ＡｖｒＩＩ、ＮｄｅｌおよびＰｈｏＩが挙げられる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｙｂｒｉｄｌｉｓｔおよび参考文献１４を参照のこと。
【0036】
上記ニック形成されたＤＮＡ分子の、上記標的ＲＮＡ分子からの放出後に、上記ニック形成されたＤＮＡ分子は、より長いテンプレートＤＮＡ分子に／より長いテンプレートＤＮＡ分子と結合し、ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で鎖伸長および増幅された生成物の生成を開始し得る。上記テンプレート分子は、上記ニック形成されたＤＮＡ分子がそれに対して特異的に結合することができ、鎖伸長を開始するように設計される。１つの教示において、上記増幅された生成物は、当該分野で公知のＥＸＰＡＲ技術９－１１を通じて生成される。
【0037】
例示的な増幅反応は、テンプレートＤＮＡ分子内の配列によって特定される短いオリゴヌクレオチド（例えば、８～１６塩基）を迅速に合成し得る。当業者に公知の反応のバージョンは、線形増幅反応もしくは指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）のいずれかにおいて進み得る。別の例は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）である。これらの反応はともに、単純で安定な等温（すなわち、サーモサイクリングしない）条件を利用する。サーモサイクリング反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびそのバージョン）はまた、使用され得る。増幅の速度は、反応において分子の相互作用を左右する分子パラメーターに完全に依存する。上記方法の指数関数的バージョンは、各線形的反応のオリゴヌクレオチド生成物を使用して、増幅のその後のラウンドおよび増幅された生成物の生成において使用するためのいっそう多くの同じニック形成されたＤＮＡ分子を作り出し得る分子の連鎖反応である。
【0038】
上記ニック形成されたＤＮＡ分子は、上記テンプレートＤＮＡの３’末端または末端領域に結合し得、上記テンプレートＤＮＡ分子の５’末端または末端領域を増幅し得る。上記テンプレートＤＮＡ分子は、代表的には、１００ヌクレオチド未満（例えば、７０未満、６０未満または５０未満のヌクレオチドの長さ、およびその間の任意の整数）であり得る。上記テンプレートＤＮＡ分子は、上記ニック形成されたＤＮＡ分子より長く、場合によっては、本明細書中により詳細に記載されるように、ニック形成され、短くされた１本鎖ＤＮＡ分子の長さの少なくとも２倍であり得る。
【0039】
少なくとも、工程ａ）および工程ｂ）が単一のレセプタクル／容器（例えば、エッペンドルフチューブ、マルチウェルプレードのウェルなど）において行われる１個のレセプタクル／容器の実施形態において、上記テンプレートＤＮＡ分子を有する上記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度は、上記標的ＲＮＡ分子に関するものより高い。従って、上記第２の温度は、上記ニック形成されたＤＮＡ分子が、上記テンプレートＤＮＡ分子を結合することができかつ鎖伸長を開始することができるが、上記標的ＲＮＡ分子を結合することができないように選択され得る。１つの教示において、上記第１のおよび第２の温度は同じであるが、これは、常にそうである必要はない。例えば、上記第１の温度が５５℃であり、標的ＤＮＡ分子に対して上記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度が３０℃～４５℃の間であった場合、上記テンプレートＤＮＡ分子を有する上記ニック形成されたＤＮＡ分子の融解温度は、例えば、５５℃～６５℃の間であり得る。そうであれば、上記第２の温度は、例えば、上記テンプレートＤＮＡを有する上記ニック形成されたＤＮＡの計算された融解温度より低い温度であり得る（例えば、４０℃～５０℃）。
【0040】
１つの実施形態において、増幅された生成物の生成は、ＤＮＡを増幅するための等温反応（例えば、ＬＡＭＰまたはＥＸＰＡＲ）によって行われる。等温増幅方法は、最新の指数関数的方法で核酸標的配列の検出を提供し、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する場合のサーマルサイクリングの制約によって制限されない。多くの等温技術は、当業者に公知であるが、それらは全て、共通していくつかの特徴を共有する。例えば、ＤＮＡ鎖が熱変成されないことから、全ての等温方法は、プライマー結合および増幅反応の開始を可能にする代替のアプローチ：鎖置換活性を有するポリメラーゼに依拠する。反応がいったん開始されると、そのポリメラーゼはまた、目的の配列にまだアニールされている鎖を分離する必要がある。
【0041】
等温方法は、代表的には、二重鎖ＤＮＡを分離するために特有のＤＮＡポリメラーゼを使用する。この能力を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、中程度の温度の反応（２５～４０℃）に関してはＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ－、Ｂｓｕラージフラグメント、およびｐｈｉ２９、ならびに高温の反応（５０～６５℃、例えば、５０℃、５５℃、または６０℃）に関してはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントが挙げられる。本教示に従う方法は、等温または実質的に一定の温度条件下で行われ得る。実質的に一定の温度下で上記方法を行うことに関する実施形態において、温度におけるいくらかのゆらぎが許容される。例えば、いくつかの実施形態において、実質的に一定の温度は、所望のまたは特定された目標温度範囲（例えば、約±２℃または約±５℃）内でゆらぎ得る。実施形態において、実質的に一定の温度は、ＰＣＲを行う場合に使用されるようなサーマルサイクリングを含まない温度を含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２の温度は、上記テンプレートＤＮＡ分子の計算された／推定されたもしくは実験的に決定された最適なハイブリダイゼーションまたは融解温度について、例えば、５℃～１０℃であるかまたはそれより低い、あるいは上記テンプレートＤＮＡ分子の計算された／推定されたもしくは実験的に決定された最適なハイブリダイゼーションまたは融解温度について下回る。いくつかの実施形態において、便宜上、上記第１のおよび第２の温度は、同じまたは実質的に同じ（例えば、約±２℃または約±５℃）である。
【0042】
１つの実施形態において、本教示は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）またはニック形成酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）を利用する。両方の技術が、上記テンプレートＤＮＡ分子中に含まれる部位における鎖に制限される制限エンドヌクレアーゼまたはニック形成酵素によって作製されるニックにおいて開始するために、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、代表的には、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｕラージフラグメントまたはＥ．ｃｏｌｉに由来するＫｌｅｎｏｗフラグメントに依拠する。ニック形成部位は、各ポリメラーゼ置換工程で再生され、指数関数的増幅を生じる。ＮＥＡＲは、極めて迅速かつ高感度であり、数分で、小さな目標量の検出を可能にする。
【0043】
１つのこのような適切なニック形成酵素は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩである。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩは、２本鎖ＤＮＡ基質におけるＤＮＡの１つの鎖のみを切断する部位特異的エンドヌクレアーゼである。ニック形成エンドヌクレアーゼは、認識配列の３’側を４塩基超えて１本鎖破壊を触媒する。適切なニック形成酵素の他の非限定的な例としては、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．Ｂｔｓｌ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、およびＮｔ．ＢｓｍＡＩが挙げられる。
【0044】
本明細書で記載される方法は、単一のレセプタクル（例えば、エッペンドルフチューブもしくは他のチューブ）を含む任意の適切なフォーマットにおいて、または例えば、マルチウェルプレートのような複数のフォーマットにおいて行われ得る。さらに、関連するリーダーありまたはなしで使用するためのカートリッジフォーマット（例えば、ラテラルフローまたは微小流体ベースのカートリッジ）が、想定され得る。
【0045】
上記増幅された生成物は、当該分野で公知の技術（例えば、発光、ＵＶまたは可視分光法もしくは分光測定法、蛍光分光法もしくは分光測定法、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、電気化学、電気泳動、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインもしくはローダミン）、化学発光、生物発光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、または発蛍光団改変プローブＤＮＡ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）によって、裸眼によって視覚的に、適切な色素生成／色の変化もしくは生成によって（例えば、適切なタグもしくは色素改変プローブもしくは核酸を使用することによって）、または上記技術の組み合わせ）によって検出され得る。
【0046】
代表的には、上記バインダーＤＮＡと上記標的ＲＮＡ配列とを接触させてから、十分な（例えば、ベースライン値（代表的には、任意のシグナル生成が起こる前に、アッセイの開始時に得られる）から５、６、７、８、９もしくは１０ 標準偏差より大きいかまたはこれらに等しい検出可能なシグナル）増幅された生成物を検出するまでの合計時間は、１５分未満、１０分未満、９分未満、８分未満、７分未満、６分未満、またはさらには５分未満であり得る。
【0047】
ＥＸＰＡＲの速度の鍵は、２要素ある； 第１に、増幅は、１つの温度において起こる、従って、長々とした加熱および冷却工程を回避する、第２に、その増幅された配列は、比較的小さい（代表的には１５～２０塩基の長さ）。これらの２つの要素は、ＥＸＰＡＲを生じ、いったん誘発されると、数分もすれば、ＤＮＡ生成物の約１０９の鎖を生じる９，１２。本教示によれば、ニック形成された１本鎖ＤＮＡ分子（トリガー）は、テンプレートＤＮＡ分子と相互作用することによってＥＸＰＡＲ反応を開始する。次いで、上記テンプレートをインタクトなままにしながら、上記配列を伸長することにＤＮＡポリメラーゼが、そしてそれを切断することにニック形成エンドヌクレアーゼが関わる等温サイクルにおいて大量の短い２本鎖ＤＮＡ配列が生成される（スキーム１ａを参照のこと）。ｑＰＣＲアッセイと同様に、二重鎖形成が分光学的に、例えば、蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ）の使用を通じてモニターされ得る１３。
【0048】
本明細書に記載されるとおりの上記バインダーＤＮＡおよびテンプレートＤＮＡ分子は、合成により作製され得、当該分野で公知のホスホルアミダイト法、ホスホトリエステル法、Ｈ－ホスホネート法、またはチオホスホネート法を使用して合成され得る。合成後に、上記バインダーＤＮＡおよびテンプレートＤＮＡ分子は、例えば、イオン交換ＨＰＬＣを使用して精製され得る。
【0049】
用語「３’」および「５’」とは、核酸の１本鎖内の特定の部位の位置を説明するために本明細書で使用される。核酸における位置が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「に対して３’」側または参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の「３’」側にある場合、このことは、その位置が、上記参照ヌクレオチドもしくは上記参照ヌクレオチド配列の３’末端と上記核酸のその鎖の３’ヒドロキシルとの間にあることを意味する。同様に、核酸における位置が、参照ヌクレオチドもしくは参照ヌクレオチド配列「に対して５’」側または参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の「５’」側にある場合、このことは、その位置が、上記参照ヌクレオチドもしくは上記参照ヌクレオチド配列の５’末端と上記核酸のその鎖の５’ホスフェートとの間にあることを意味する。
【0050】
本明細書で使用される場合、「ニック形成する（ｎｉｃｋｉｎｇ）」とは、完全に２本鎖の核酸分子、またはニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対して特定の位置において部分的に２本鎖の核酸分子の２本鎖の一部分の一方の鎖のみの切断をいう。上記核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位（ｎｉｃｋｉｎｇ ｓｉｔｅ）」（ＮＳ）といわれる。
【0051】
例えば、例示的な２本鎖ＤＮＡニック形成エンドヌクレアーゼであるＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列およびニック形成部位は、切断部位を示すために「▼」および任意のヌクレオチドを示すためにＮを用いて以下で示される：
【化3】
【0052】
上記Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列のセンス鎖の配列は、５’－ＧＡＧＴＣ－３’であるのに対して、アンチセンス鎖の配列は、５’－ＧＡＣＴＣ－３’である。
【0053】
「鎖伸長を開始する」とは、上記ニック形成されたＤＮＡ分子が、上記テンプレートＤＮＡに結合した場合にプライマーとして作用し、上記ニック形成されたＤＮＡ分子の３’末端へ、上記テンプレートＤＮＡに存在する次の塩基に相補的であるヌクレオチドを付加することによるプロセスをいう。このようにして、上記ニック形成されたＤＮＡの長さは、上記ニック形成されたＤＮＡ分子の伸長された３’末端にさらなるヌクレオチドが各々付加されて、成長または伸長する。これはまた、プライマーが標的ＲＮＡ配列に結合し、逆転写酵素が、標的ＲＮＡの逆相補ＤＮＡ配列を生成するために使用される教示にも当てはまる。
【0054】
用語「増幅された生成物の生成」とは、上記テンプレートＤＮＡの５’末端または領域に相補的な配列を含むプライマーとしてニック形成されたＤＮＡ分子を使用して、テンプレートＤＮＡ分子またはその一部分の１より多くのコピーを作製するプロセスに言及する。
【0055】
本明細書で使用される場合、語句「増幅された生成物」とは、特定の核酸分子の１またはこれより多くのコピーを含む生成物に言及する。代表的には、上記増幅された生成物は、上記核酸分子の少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、またはこれより多くのコピーを含む。
【0056】
さらなる局面において、以下を含むか、本質的になるか、またはからなるキットが提供される：
本明細書で定義されるとおりのバインダーＤＮＡ分子；および
制限エンドヌクレアーゼの認識配列において、標的ＲＮＡ分子に結合される場合に上記バインダーＤＮＡ配列にニック形成することができる上記制限エンドヌクレアーゼ。
本明細書で定義されるとおりのバインダーＤＮＡ分子；および
制限エンドヌクレアーゼの認識配列において、標的ＲＮＡ分子に結合される場合に上記バインダーＤＮＡ配列にニック形成することができる上記制限エンドヌクレアーゼ。
【0057】
ＣｏＶＩＤ－１９の検出における使用に関する１つの教示において、上記バインダーＤＮＡ分子は、以下の配列から本質的になるかまたはからなる：
。
【化4】
【0058】
１つの教示において、上記バインダーＤＮＡ分子は、以下の配列から本質的になるかまたはからなる：
。
【化5】
【0059】
この文脈において、から本質的になるは、特定されたヌクレオチド（例えば、３’ヌクレオチド）のうちの１またはこれより多くのものが、化学的に改変され得るが、ただしこれは、その標的ＲＮＡ配列に結合する配列の能力に実質的に影響を及ぼさないことを意味することが意図される。
【0060】
１つの教示において、上記制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｔＮＩである。
【0061】
上記キットは、必要に応じてさらに以下を含み得る：
上記ニック形成されたＤＮＡ分子が、（必要に応じてタグ化または色素標識された）ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、増幅された生成物を生成するために、結合し、鎖伸長を開始し得るテンプレートＤＮＡ分子。上記キットは、（必要に応じてタグ化または色素標識された）ｄＮＴＰｓおよび／またはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、ラージフラグメントまたはＫｌｅｎｏｗフラグメント（３’－５’ ｅｘｏ－）および必要に応じてＤＮＡニック形成酵素（例えば、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ）をさらに含み得る。
上記ニック形成されたＤＮＡ分子が、（必要に応じてタグ化または色素標識された）ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、増幅された生成物を生成するために、結合し、鎖伸長を開始し得るテンプレートＤＮＡ分子。上記キットは、（必要に応じてタグ化または色素標識された）ｄＮＴＰｓおよび／またはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、ラージフラグメントまたはＫｌｅｎｏｗフラグメント（３’－５’ ｅｘｏ－）および必要に応じてＤＮＡニック形成酵素（例えば、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ）をさらに含み得る。
【0062】
いくつかの実施形態において、上記方法および／またはキットは、さらなる試薬をさらに含み得る。本明細書中の教示に従って使用され得る他の試薬のいくつかの非限定的な例としては、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、および硫酸マグネシウム）；基質（例えば、ｄＮＴＰミックス）；および緩衝溶液（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、トリシン緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、およびリン酸カリウム緩衝液）が挙げられる。同様に、洗浄剤、酸化剤および還元剤がまた、本明細書で開示される方法の実施において使用され得る、および／あるいはＤＮＡインターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）、または任意の増幅された生成物に結合するように設計されたタグもしくは色素標識プローブが、さらに提供され得る。
【0063】
本開示の実施形態は、ここで例示によって、および添付の図面を参照しながら記載される。
【図面の簡単な説明】
【0064】
【図1-1】図１は、（ａ）指数関数的増幅反応を模式的に示す。トリガーＸは、テンプレートＸ’－Ｘ’にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ２．０ポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、ここで二重ＤＮＡの上の鎖は、ニック形成酵素（Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ）によって切断される。放出されたＤＮＡは、トリガーＸと同一であり、従って、別のテンプレートＸ’－Ｘ’をプライミングすることができる。（ｂ）逆転写酵素非含有ＥＸＰＡＲ。バインダーＤＮＡは、ウイルスＲＮＡにアニールする。ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖のうちのＤＮＡが、ＤＮＡのみを切断することによるニック形成酵素としての制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＮＩによってニック形成される。放出されたＤＮＡ鎖は、トリガーＸであり、ＥＸＰＡＲによって増幅される；（ｃ）逆転写酵素プライマーは、ウイルスＲＮＡにアニールし、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素）によってｃＤＮＡへと変換される。上記ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖形成は、制限エンドヌクレアーゼ（ＢｓｔＮＩ）のための認識部位を作り出して、上記ＤＮＡ鎖を切断する。その切断されたｃＤＮＡ鎖は、トリガーＸ配列を含み、これは、テンプレートＸ’－Ｘ’をプライミングし、全二重鎖を形成するために伸長される。次いで、ここで二重鎖ＤＮＡのうちの上の鎖は、ニック形成酵素（Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ）によって切断される。その放出されたＤＮＡは、トリガーＸであり、従って、別のテンプレートＸ’－Ｘ’をプライミングすることができる。
【図1-2】同上。
【図2】図２は、図１に対してより詳細に、ＣｏＶＩＤ－１９標的ＲＮＡ配列、上記標的ＲＮＡを結合し得るバインダーＤＮＡ配列、ニック形成されたＤＮＡ配列およびテンプレートＤＮＡ配列の特定の配列を有する例を示す。
【図18-1】図１８は、ＣＯＶＩＤ１９ Ｏｒｆ１ａｂ遺伝子を調べる患者サンプルからの結果を示す。ａ）シグナルを生成するためのＲＴＦ－ＥＸＰＡＲに関する時間を示す、患者検証サンプルに関するＲＴＦ－ＥＸＰＡＲアッセイデータ。赤色の棒は、陽性サンプルを表し、青色の棒は、陰性サンプルを表し、黄色の破線は、６分間のカットオフ時間を表す。各実行時間を、蛍光シグナルがベースラインシグナルから１０ 標準偏差より高かった点（１０－シグマ時間）であるように計算した；およびｂ）患者サンプル検証試験の結果を示す混同行列。
【図18-2】同上。
【図19-1】図１９は、ＣＯＶＩＤ１９ Ｎ遺伝子を調べる患者サンプルからの結果を示す。ａ）シグナルを生成するためのＲＴＦ－ＥＸＰＡＲに関する時間を示す、患者検証サンプルに関するＲＴＦ－ＥＸＰＡＲアッセイデータ。赤色の棒は、陽性サンプルを表し、青色の棒は、陰性サンプルを表し、黄色の破線は、６分間のカットオフ時間を表す。各実行時間を、蛍光シグナルがベースラインシグナルから１０ 標準偏差より高かった点（１０－シグマ時間）であるように計算した；およびｂ）患者サンプル検証試験の結果を示す混同行列。
【図19-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0065】
材料
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｌｉｘ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ａ１０システム（抵抗率＞１８μΩ．ｃｍ、ＴＯＣ≦５ｐｐｂ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｆｒａｎｃｅ）で精製したＭｉｌｌｉ－Ｑ水を、全ての実験において使用した。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＢｓｔＮＩおよびＢｓｔ ２．０ポリメラーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｈｉｔｃｈｉｎ， ＵＫ）から得た。緩衝液も同様であり、１０×等温増幅緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０、ｐＨ ８．８）を、全ての実験において使用した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）から得、ＤＭＳＯ（≧９９％）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ， ＵＫ）から得、ｄｓＧｒｅｅｎ １００×（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのアナログ）を、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ， Ｄｅ）から得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ， 水で４ｍｇ／ｍＬへと希釈）および１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ、 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ グリセロール中、０．５ｍｇの溶液）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）から得た。全てのヌクレオチド三リン酸およびオリゴヌクレオチド配列（脱塩済み）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）から得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡおよびｃＤＮＡ患者サンプル（ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ溶離緩衝液中）を、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ（ＰＨＥ）から得、－８０℃において貯蔵した。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｌｉｘ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ａ１０システム（抵抗率＞１８μΩ．ｃｍ、ＴＯＣ≦５ｐｐｂ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｆｒａｎｃｅ）で精製したＭｉｌｌｉ－Ｑ水を、全ての実験において使用した。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＢｓｔＮＩおよびＢｓｔ ２．０ポリメラーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｈｉｔｃｈｉｎ， ＵＫ）から得た。緩衝液も同様であり、１０×等温増幅緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０、ｐＨ ８．８）を、全ての実験において使用した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）から得、ＤＭＳＯ（≧９９％）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ， ＵＫ）から得、ｄｓＧｒｅｅｎ １００×（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのアナログ）を、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ， Ｄｅ）から得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ， 水で４ｍｇ／ｍＬへと希釈）および１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ、 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ グリセロール中、０．５ｍｇの溶液）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）から得た。全てのヌクレオチド三リン酸およびオリゴヌクレオチド配列（脱塩済み）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）から得た。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡおよびｃＤＮＡ患者サンプル（ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ溶離緩衝液中）を、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ（ＰＨＥ）から得、－８０℃において貯蔵した。
【0066】
ＰＨＥサンプル：全ての臨床標本を、封じ込めレベル２実験室の中で扱った。各サンプルを調製するために、鼻および咽頭スワブからのＶｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｄｉｕｍ （ＶＴＭ， ３００μＬ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｗｉｒｅ ＶｉｒｏＣｕｌｔ）を、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ）に１：１比で添加し、較正したヒートブロックにおいて６０℃へと３０分間加熱した。次いで、サンプルを、ＭａｇＮＡＰｕｒｅ９６（Ｒｏｃｈｅ）自動化抽出システムで抽出し、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ検出に関してＡｂｂｏｔｔ Ｍ２０００ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｔｅｓｔで実行した。ＥＸＰＡＲアッセイ開発のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡアッセイからの陽性および陰性サンプルを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ溶離緩衝液中で別個に組み合わせた（組み合わせた陽性サンプルに関しては２９，０８０ ＲＮＡコピー／μＬを与える）。ＰＨＥから受領した際に、各サンプルを４００倍希釈し、５０μＬ バイアルへとアリコートに分け、－８０℃で貯蔵した。使用前に、各サンプルを氷中に沈め、ゆっくりと溶解させた；いったん溶解したら、上記サンプルを直ぐに使用し、その後－８０℃において再び貯蔵するために冷却した。
【表1-1】
【表1-2】
【0067】
データ分析および分類
ＥＸＰＡＲリアルタイム蛍光増幅曲線を分析するために、本発明者らは、蛍光データの分析を行うプログラムをＣ＃で開発した。そのプログラムは、最初の２０個のデータ点を分析し、ベースラインとして平均値および標準偏差を計算する。これらの２つの値の生成後に、各々のその後のデータ点を分析して、その値から平均値を引いたものが平均から１０ 標準偏差を超えて離れているかどうかを決定する。この基準を満たすサイクルを時間へと変換し、最小増幅時間として使用する。この時間が２０分未満である場合、その出力は真であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を示し、２０分以降の時間である場合は、偽の出力を生じ、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの非存在を示す。
ＥＸＰＡＲリアルタイム蛍光増幅曲線を分析するために、本発明者らは、蛍光データの分析を行うプログラムをＣ＃で開発した。そのプログラムは、最初の２０個のデータ点を分析し、ベースラインとして平均値および標準偏差を計算する。これらの２つの値の生成後に、各々のその後のデータ点を分析して、その値から平均値を引いたものが平均から１０ 標準偏差を超えて離れているかどうかを決定する。この基準を満たすサイクルを時間へと変換し、最小増幅時間として使用する。この時間が２０分未満である場合、その出力は真であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を示し、２０分以降の時間である場合は、偽の出力を生じ、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの非存在を示す。
【実施例】
【0068】
実施例
成功裡のＥＸＰＡＲアッセイの開発への重要な要素は、標的ゲノムにおける最適なヌクレオチド配列の特定である。
成功裡のＥＸＰＡＲアッセイの開発への重要な要素は、標的ゲノムにおける最適なヌクレオチド配列の特定である。
【0069】
Ｑｉａｎらは以前、ＥＸＰＡＲにおいて使用される特定のトリガー配列が、その成功を決定するにあたって極めて重要な役割を果たすことを見出した１２。それらのアプローチを適合させて、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにおけるＯｒｆ１ａｂ１４の配列に相補的である、ＥＸＰＡＲのための１７マーのＤＮＡトリガー（トリガーＸ、図１ａ）を設計した。
【0070】
上記バインダーＤＮＡ配列の設計は、この配列を以下ができるように設計しなければならなかった：
１）ＲＮＡ上の関連配列と安定な複合体を生じるために十分な塩基対形成相互作用を有する
２）関連酵素によって認識され得かつニック形成され得る配列を生成する
３）反応の次の段階のためのＤＮＡテンプレートＸ’－Ｘ’配列にアニールすることを可能にするであろう非相補的配列（例えば、５’末端において）を含む。
１）ＲＮＡ上の関連配列と安定な複合体を生じるために十分な塩基対形成相互作用を有する
２）関連酵素によって認識され得かつニック形成され得る配列を生成する
３）反応の次の段階のためのＤＮＡテンプレートＸ’－Ｘ’配列にアニールすることを可能にするであろう非相補的配列（例えば、５’末端において）を含む。
【0071】
これを達成するために、本発明者らは、ウイルスＲＮＡに対しては相補的でないが、上記テンプレートＸ’－Ｘ’配列に対してなお相補的である、５’末端において「テール」を含むようにバインダーＤＮＡ配列を設計した。その「テール」の長さおよび配列は、それが、ＲＮＡへの結合を阻害するかまたはＲＮＡの非存在下でＥＸＰＡＲ反応を誘発するいかなる二次構造をも形成しないように設計されなければならなかった。「テール」配列の配列はまた、上記テンプレートＸ’－Ｘ’に相補的な鎖のポリメラーゼ触媒性の伸長を可能にするために十分安定な二重鎖が形成されることを確実にするために、上記テンプレートＸ’－Ｘ’への結合に関して十分な結合エネルギーを提供しなければならなかった（図１ｂを参照のこと）。
【0072】
上記テールの配列はまた、それがＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖から放出されたらＥＸＰＡＲ反応が進み得るようにされる必要がある。例示的なテール配列は、Ｑｉａｎらの教示に従って開発した。しかし、簡潔には、上記プロセスは、以下の工程を含む：
１）目的の領域における全てのＢｓｔＮＩ制限部位は、５’末端および３’末端に１０塩基で存在することが見出された
２）これらから、複数の制限部位およびポリＡ（ploy A）を有する配列を排除した。
３）これらの残りの配列から、ＡＧＧＧを５’末端に付加した（これらの塩基はＥＸＰＡＲにとって重要であることが示されているので（Ｑｉａｎら））
４）これらのバインダー配列のＴｍを分析し、その最高および最低のＴｍを有する配列を除去した
５）本発明者らが選択した配列は、高Ｔｍおよび低Ｔｍを有した配列、ならびに３’末端において最も多くの塩基ＣＣＡＣを有する配列であった（Ｑｉａｎらの教示）。
１）目的の領域における全てのＢｓｔＮＩ制限部位は、５’末端および３’末端に１０塩基で存在することが見出された
２）これらから、複数の制限部位およびポリＡ（ploy A）を有する配列を排除した。
３）これらの残りの配列から、ＡＧＧＧを５’末端に付加した（これらの塩基はＥＸＰＡＲにとって重要であることが示されているので（Ｑｉａｎら））
４）これらのバインダー配列のＴｍを分析し、その最高および最低のＴｍを有する配列を除去した
５）本発明者らが選択した配列は、高Ｔｍおよび低Ｔｍを有した配列、ならびに３’末端において最も多くの塩基ＣＣＡＣを有する配列であった（Ｑｉａｎらの教示）。
【0073】
より詳細には、図２は、特定のＣｏＶＩＤ－１９ウイルス標的ＲＮＡ配列（ａ）およびこの標的ＲＮＡ配列を結合するように設計された上記バインダーＤＮＡ配列（ｂ）を特定する。示されるように、上記バインダーＤＮＡは、上記標的ＲＮＡ配列に相補的でありかつＢｓｔＮＩ認識配列（ＣＣＴＧＧ）を含む３’の一部分、ならびに非相補的５’末端を含む。ＢｓｔＮＩによる上記バインダーＤＮＡのニック形成の際に、上記ニック形成されたＤＮＡ（標識されたトリガーＸ）は、標的ＲＮＡ空放出される。上記ニック形成されたＤＮＡは、上記テンプレートＤＮＡ（標識されたテンプレートＸ’－Ｘ’）に結合し、鎖伸長および増幅されたＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖テンプレートＸ’－Ｘ’の生成を開始することができる。上記テンプレートＤＮＡの配列は、中央にあるスペーサーとともに、上記テンプレートのいずれかの末端において反復配列を有し、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩのための認識配列を有するように設計される。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの作用は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の上の鎖にニック形成し、ポリメラーゼ分子は、そのニック形成された部位から伸長させ続けることができ、テンプレートＸ’－Ｘ’分子を結合して別のラウンドの増幅を開始できるトリガーＸ分子のコピーを置き換える。このようにして、増幅されたＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖テンプレートＸ’－Ｘ’分子の指数関数的生成が起こり得、このようなＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖分子の生成数の増加は、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖分子を結合することができる色素の使用によって検出され得る。
【0074】
図１ｃにおいて、特定のＣｏＶＩＤ－１９ ＲＮＡ標的配列が特定され、プライマー配列がアニールし、逆転写酵素を使用して伸長される。ＢｓｔＮＩ認識配列（ＣＣＴＧＧ）にわたる伸長は、ＤＮＡ鎖が切断され、転写酵素の鎖置換活性によって置換されることを可能にする。その切断されたＤＮＡ鎖は、テンプレートＸ’－Ｘ’のＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成するためにＢｓｔポリメラーゼによって伸長されるテンプレートＸ’－Ｘ’に相補的である。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の上の鎖がニック形成されることを可能にし、テンプレートＸ’－Ｘ’分子を結合し得かつＥＸＰＡＲを開始し得るトリガーＸ分子のコピーを置換する。
【0075】
実施例１：どのトリガー配列が最も適切であるかの決定
この実験は、特異的増幅と非特異的増幅との間の最大の分離を提供する配列を決定するために、それらそれぞれのテンプレート配列に対するこのプロセスのために設計された３個のトリガーを試験する。
この実験は、特異的増幅と非特異的増幅との間の最大の分離を提供する配列を決定するために、それらそれぞれのテンプレート配列に対するこのプロセスのために設計された３個のトリガーを試験する。
【0076】
方法
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
５．５５μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、１．５０μＬのテンプレート（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１００ｎＭにおいて３μＬの１個のトリガー（トリガーＸまたはトリガーＡまたはトリガーＢ）
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
５．５５μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、１．５０μＬのテンプレート（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１００ｎＭにおいて３μＬの１個のトリガー（トリガーＸまたはトリガーＡまたはトリガーＢ）
【0077】
添加工程：パートＢ（１７μＬ）を４℃に冷却したＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣを添加し、４℃において５分間維持し、その後、パートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0078】
増幅工程：等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、５５℃の一定温度に設定したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｄｉｄｃｏｔ， ＵＫ）を使用して行う。蛍光を、少なくとも２０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0079】
結果
実験の結果を、図３～５に示す。プロットのｘ軸は、時間を示す。全ての試験は、２分以内にトリガーを含むサンプルの増幅を示す。非特異的増幅までの時間は、トリガーによって異なり、トリガーＸは、シグナルが増加するのに９分超かかる。非特異的サンプルの蛍光増幅に基づいて、最も成功裡のトリガーとしてトリガーＸを選択し、前に進めた。
実験の結果を、図３～５に示す。プロットのｘ軸は、時間を示す。全ての試験は、２分以内にトリガーを含むサンプルの増幅を示す。非特異的増幅までの時間は、トリガーによって異なり、トリガーＸは、シグナルが増加するのに９分超かかる。非特異的サンプルの蛍光増幅に基づいて、最も成功裡のトリガーとしてトリガーＸを選択し、前に進めた。
【0080】
実施例２：ＥＸＰＡＲ配列の感度の決定
最適化工程を、陽性増幅と陰性増幅との間のより大きな分離を生じたトリガーＸおよびテンプレートＸ’－Ｘ’を使用して行った。上記テンプレート濃度を、５０ｎＭから２５ｎＭへと減少させ、反応温度を５５℃から５０℃へと下げた。この改変された手順を使用して、ＥＸＰＡＲ反応の感度を、ある濃度範囲（１０ｎＭ～１００ｆＭ）にわたるトリガーＸを使用して観察した。
最適化工程を、陽性増幅と陰性増幅との間のより大きな分離を生じたトリガーＸおよびテンプレートＸ’－Ｘ’を使用して行った。上記テンプレート濃度を、５０ｎＭから２５ｎＭへと減少させ、反応温度を５５℃から５０℃へと下げた。この改変された手順を使用して、ＥＸＰＡＲ反応の感度を、ある濃度範囲（１０ｎＭ～１００ｆＭ）にわたるトリガーＸを使用して観察した。
【0081】
方法
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
３μＬのトリガーＸ（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、ブランク）。
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
３μＬのトリガーＸ（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、ブランク）。
【0082】
添加工程：パートＢ（１７μＬ）を４℃に冷却したＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣを添加し、４℃において５分間維持し、その後、パートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0083】
増幅工程：等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、５０℃の一定温度に設定したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｄｉｄｃｏｔ， ＵＫ）を使用して行う。蛍光を、少なくとも２０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0084】
結果
結果を、図６～７に示す。トリガーＸの濃度を減少させるにつれて、増幅が起こる時間は増加する。これらの結果は、トリガーＸの濃度が高いほど、増幅がより迅速に生じることを示す。従って、バインダーＤＮＡの濃度が高いほど、より好ましい。
結果を、図６～７に示す。トリガーＸの濃度を減少させるにつれて、増幅が起こる時間は増加する。これらの結果は、トリガーＸの濃度が高いほど、増幅がより迅速に生じることを示す。従って、バインダーＤＮＡの濃度が高いほど、より好ましい。
【0085】
実施例３：ＥＸＰＡＲ手順の特異度の決定
この実験は、任意の配列が増幅を生じ得るかどうかを決定するために、テンプレートＸ’－Ｘ’配列に対して複数の非特異的トリガー配列を試験する。
この実験は、任意の配列が増幅を生じ得るかどうかを決定するために、テンプレートＸ’－Ｘ’配列に対して複数の非特異的トリガー配列を試験する。
【0086】
方法
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
３μＬの１個のトリガー配列（トリガーＸ、トリガーＡ、トリガーＢおよびトリガーＣ）
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
３μＬの１個のトリガー配列（トリガーＸ、トリガーＡ、トリガーＢおよびトリガーＣ）
【0087】
添加工程：パートＢ（１７μＬ）を４℃に冷却したＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣを添加し、４℃において５分間維持し、その後、パートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0088】
増幅工程：等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、５０℃の一定温度に設定したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｄｉｄｃｏｔ， ＵＫ）を使用して行う。蛍光を、少なくとも２０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0089】
結果
結果を、図８～９に示す。これらのデータセットは、完全に相補的なトリガーＸが、８分後に増幅を生じ得ることを示す。対照的に、非特異的トリガーは、２０分後にまで増幅を生じ得ない。これは、反応が非常に配列特異的であることを示す。
結果を、図８～９に示す。これらのデータセットは、完全に相補的なトリガーＸが、８分後に増幅を生じ得ることを示す。対照的に、非特異的トリガーは、２０分後にまで増幅を生じ得ない。これは、反応が非常に配列特異的であることを示す。
【0090】
実施例４：２ポット逆転写ＥＸＰＡＲ．
この実験は、２ポットｒｔ－ＥＸＰＡＲ手順が、ウイルスＲＮＡからの生成後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
この実験は、２ポットｒｔ－ＥＸＰＡＲ手順が、ウイルスＲＮＡからの生成後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
【0091】
方法：
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（ＤＭＳＯ中で１／５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
２μＬ ＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）および３μＬのウイルスｃＤＮＡ。
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（ＤＭＳＯ中で１／５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
２μＬ ＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）および３μＬのウイルスｃＤＮＡ。
【0092】
添加工程：パートＢ（１７μＬ）を４℃に冷却したＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣを添加し、４℃において５分間維持し、その後、パートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0093】
増幅工程：等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、５０℃の一定温度に設定したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｄｉｄｃｏｔ， ＵＫ）を使用して行う。蛍光を、少なくとも２０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0094】
結果：
結果を、図１０～１１に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが８．３３分後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２２．３３分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、ｃＤＮＡの検出が可能であることを示す。
結果を、図１０～１１に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが８．３３分後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２２．３３分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、ｃＤＮＡの検出が可能であることを示す。
【0095】
実施例５：１ポット逆転写ＥＸＰＡＲ．
この実験は、１ポットｒｔ－ＥＸＰＡＲ手順が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
この実験は、１ポットｒｔ－ＥＸＰＡＲ手順が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
【0096】
方法：
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（ＤＭＳＯ中で１／５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１μＬのｒｔ－プライマー（１００ｎＭ）、１μＬのＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）、３μＬのウイルスＲＮＡ（７２．７コピー／μＬ）および０．１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ Ｕ／μＬ）。
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（ＤＭＳＯ中で１／５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１μＬのｒｔ－プライマー（１００ｎＭ）、１μＬのＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）、３μＬのウイルスＲＮＡ（７２．７コピー／μＬ）および０．１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ Ｕ／μＬ）。
【0097】
添加工程：パートＢ（１７μＬ）を４℃に冷却したＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣを添加し、４℃において５分間維持し、その後、パートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0098】
増幅工程：等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、５０℃の一定温度に設定したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｄｉｄｃｏｔ， ＵＫ）を使用して行う。蛍光を、少なくとも２０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0099】
結果：
結果を、図１２～１３に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが７．５０分後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２３．０４分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、ＲＮＡの検出が可能であることを示す。
結果を、図１２～１３に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが７．５０分後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２３．０４分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、ＲＮＡの検出が可能であることを示す。
【0100】
実施例６：２ポット逆転写フリーＥＸＰＡＲ．
この実験は、２ポットｒｔｆ－ＥＸＰＡＲ手順が上記バインダーＤＮＡ配列および酵素ＢｓｔＮＩを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
この実験は、２ポットｒｔｆ－ＥＸＰＡＲ手順が上記バインダーＤＮＡ配列および酵素ＢｓｔＮＩを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
【0101】
方法：
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１０μＬのＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖消化混合物（以下のように調製）：２５μＬの水、５μＬの１０×等温増幅緩衝液、５μＬ ＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）、１０μＬのバインダーＤＮＡ（１μＭ）および５μＬのウイルスＲＮＡ（７２．７コピー／μＬ）。次いで、その混合物を、５０℃において５分間インキュベートする。
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１０μＬのＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖消化混合物（以下のように調製）：２５μＬの水、５μＬの１０×等温増幅緩衝液、５μＬ ＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）、１０μＬのバインダーＤＮＡ（１μＭ）および５μＬのウイルスＲＮＡ（７２．７コピー／μＬ）。次いで、その混合物を、５０℃において５分間インキュベートする。
【0102】
添加工程：パートＢ（１７μＬ）を４℃に冷却したＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣを添加し、４℃において５分間維持し、その後、パートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0103】
増幅工程：等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、５０℃の一定温度に設定したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｄｉｄｃｏｔ， ＵＫ）を使用して行う。蛍光を、少なくとも２０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0104】
結果：
結果を、図１４～１５に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが９．１２分後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２７．２９分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、バインダーＤＮＡの使用を通じてＲＮＡの検出が可能であることを示す。
結果を、図１４～１５に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが９．１２分後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２７．２９分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、バインダーＤＮＡの使用を通じてＲＮＡの検出が可能であることを示す。
【0105】
実施例７：１ポット逆転写フリーＥＸＰＡＲ．
この実験は、１ポットｒｔｆ－ＥＸＰＡＲ手順が、単一のポットにおいて上記バインダーＤＮＡ配列および酵素ＢｓｔＮＩを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
この実験は、１ポットｒｔｆ－ＥＸＰＡＲ手順が、単一のポットにおいて上記バインダーＤＮＡ配列および酵素ＢｓｔＮＩを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を検出することができるかどうかを試験する。患者の陽性および陰性サンプルを使用することによって、増幅時間に区別があるかどうかを評価した。
【0106】
方法：
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１μＬ ＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）、２μＬのバインダーＤＮＡ（１μＭ）および３μＬのウイルスＲＮＡ（７２．７コピー／μＬ）。
パートＡ：
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ：
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×～２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ：
１μＬ ＢｓｔＮＩ（１０ Ｕ／μＬ）、２μＬのバインダーＤＮＡ（１μＭ）および３μＬのウイルスＲＮＡ（７２．７コピー／μＬ）。
【0107】
添加工程：パートＢ（１７μＬ）を４℃に冷却したＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣを添加し、４℃において５分間維持し、その後、パートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0108】
増幅工程：等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、５０℃の一定温度に設定したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｄｉｄｃｏｔ， ＵＫ）を使用して行う。少なくとも２０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0109】
結果：
結果を、図１６～１７に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが４．６９後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２４．９０後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、バインダーＤＮＡの使用を通じてＲＮＡの検出が可能であることを示す。
結果を、図１６～１７に示す。これらのデータセットは、患者の陽性サンプルが４．６９後に増幅を生じたのに対して、患者の陰性サンプルが２４．９０後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、バインダーＤＮＡの使用を通じてＲＮＡの検出が可能であることを示す。
【0110】
結論として、ＤＮＡ選択的制限エンドヌクレアーゼを含む新たな逆転写酵素フリーＥＸＰＡＲ方法の使用を通じて、本発明者らは、５分未満の増幅時間を伴う、１０分未満でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの成功裡の検出を明らかに示した。これらの速度は、ｑＰＣＲ（少なくとも６０分のアッセイ時間）より遙かに迅速であるのみならず、現在のところ、ＬＡＭＰおよび３０分のラテラルフロー試験より性能も優れている。このｒｔｆ－ＥＸＰＡＲ方法は、ｑＰＣＲベースのＣｏＶＩＤ－１９アッセイのために現在使用されている装置での使用に関して完全に適合している（導入の準備ができている）。上記アッセイの単純さおよび速度は、この方法が、本明細書上記で記載されるとおりの一連の感染性疾患（例えば、少し例を挙げれば、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスおよびエボラ）を検出するために改変されることを可能にする。
【0111】
本明細書で言及される全ての参考文献は、それらの全体が本明細書に援用される。
【0112】
実施例８：Ｏｒｆ１ａｂおよびＮ遺伝子に基づいてＣＯＶＩ１９を検出することに関する患者検証試験
指数関数的増幅反応
そのプロトコールは、先ず、３種の溶液、パートＡ、パートＢおよびパートＣの調製、続いて、添加工程、次いで最後に増幅工程を含む。
パートＡ
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）および次いで０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×から２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）および次いで０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ
ＲＴＦ ＥＸＰＡＲアッセイ（１ポットＲＴＦ－ＥＸＰＡＲ）：試薬を、以下のように一緒に混合する：１μＬ ＢｓｔＮＩ（２ Ｕ／μＬ）、２μＬのバインダーＤＮＡ Ｘ（１００ｎＭ）、および次いで３μＬの陽性または陰性サンプル。
指数関数的増幅反応
そのプロトコールは、先ず、３種の溶液、パートＡ、パートＢおよびパートＣの調製、続いて、添加工程、次いで最後に増幅工程を含む。
パートＡ
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）および次いで０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＸ’－Ｘ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×から２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）および次いで０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ
ＲＴＦ ＥＸＰＡＲアッセイ（１ポットＲＴＦ－ＥＸＰＡＲ）：試薬を、以下のように一緒に混合する：１μＬ ＢｓｔＮＩ（２ Ｕ／μＬ）、２μＬのバインダーＤＮＡ Ｘ（１００ｎＭ）、および次いで３μＬの陽性または陰性サンプル。
【0113】
添加工程
パートＢ（１７μＬ）をＰＣＲチューブに添加し、これに、パートＣ（６μＬ）、続いてパートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
パートＢ（１７μＬ）をＰＣＲチューブに添加し、これに、パートＣ（６μＬ）、続いてパートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0114】
ＥＸＰＡＲ増幅
等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム、９６ウェル、０．２ｍＬを使用して行う。温度を２５℃、１５秒間に設定し、その後、アッセイの継続時間にわたって５０℃へと上昇させる。蛍光読み取りは、３０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム、９６ウェル、０．２ｍＬを使用して行う。温度を２５℃、１５秒間に設定し、その後、アッセイの継続時間にわたって５０℃へと上昇させる。蛍光読み取りは、３０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0115】
結果
結果を、図１８～１９に示す。これらのデータセットは、６分間のカットオフ時間を示す。６分間未満の増幅時間を有する全てのサンプルを陽性として記録したのに対して、６分間を超える任意の時間を陰性として記録した。図１８ａおよびｂは、感度８２％および陰性度（ｎｅｇａｔｉｖｉｔｙ）９６％を示すＯｒｆ１ａｂ遺伝子標的の結果を示す。図１９ａおよびｂは、感度９６％および陰性度９６％を示すＮ遺伝子標的の結果を示す。これは、ＲＮＡありおよびなしで、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在することを示す。
結果を、図１８～１９に示す。これらのデータセットは、６分間のカットオフ時間を示す。６分間未満の増幅時間を有する全てのサンプルを陽性として記録したのに対して、６分間を超える任意の時間を陰性として記録した。図１８ａおよびｂは、感度８２％および陰性度（ｎｅｇａｔｉｖｉｔｙ）９６％を示すＯｒｆ１ａｂ遺伝子標的の結果を示す。図１９ａおよびｂは、感度９６％および陰性度９６％を示すＮ遺伝子標的の結果を示す。これは、ＲＮＡありおよびなしで、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在することを示す。
【0116】
実施例９；：ＨＰＶ例
【表2-1】
【表2-2】
【0117】
指数関数的増幅反応
そのプロトコールは先ず、３種の溶液、パートＡ、パートＢおよびパートＣの調製、続いて添加工程、および次いで最後に増幅工程を含む。
パートＡ
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）および次いで、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＨＰＶ’－ＨＰＶ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×から２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）および次いで、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ
ＲＴＦ ＥＸＰＡＲアッセイ（１ポットＲＴＦ－ＥＸＰＡＲ）：試薬を、以下のように一緒に混合する：１μＬ ＢｓｔＮＩ（２ Ｕ／μＬ）、２μＬのバインダーＤＮＡ ＨＰＶ（１００ｎＭ）、および次いで、３μＬの陽性または陰性サンプル。
そのプロトコールは先ず、３種の溶液、パートＡ、パートＢおよびパートＣの調製、続いて添加工程、および次いで最後に増幅工程を含む。
パートＡ
１．５０μＬの水、２．５０μＬの１０×等温増幅緩衝液、３．７５μＬのＢＳＡ溶液、１．５０μＬのＢｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．６ Ｕ／μＬ）および次いで、０．７５μＬのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（１０ Ｕ／μＬ）。
パートＢ
６．３０μＬの水、５．００μＬの１０×等温増幅緩衝液、０．７５μＬのテンプレートＨＰＶ’－ＨＰＶ’（１μＭ）、２．４０μＬのＭｇＳＯ４（１００ｍＭ）、１．５０μＬ ｄＮＴＰ（１０ｎＭ）、０．７５μＬのｄｓＧｒｅｅｎ（１００×から２０×までＤＭＳＯ中で１：５希釈）および次いで、０．３０μＬのＳＳＢ溶液。
パートＣ
ＲＴＦ ＥＸＰＡＲアッセイ（１ポットＲＴＦ－ＥＸＰＡＲ）：試薬を、以下のように一緒に混合する：１μＬ ＢｓｔＮＩ（２ Ｕ／μＬ）、２μＬのバインダーＤＮＡ ＨＰＶ（１００ｎＭ）、および次いで、３μＬの陽性または陰性サンプル。
【0118】
添加工程
パートＢ（１７μＬ）をＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣ（６μＬ）を添加し、続いてパートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
パートＢ（１７μＬ）をＰＣＲチューブに添加する。これに、パートＣ（６μＬ）を添加し、続いてパートＡ（１０μＬ）を添加する。次いで、チューブをシールし、その内容物を増幅に供する。
【0119】
ＥＸＰＡＲ増幅
等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム、９６ウェル、０．２ｍＬを使用して行う。温度を２５℃、１５分間に設定し、その後、アッセイの継続時間にわたって５０℃へと上昇させる。蛍光読み取りは、３０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
等温インキュベーションおよび蛍光シグナル測定を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム、９６ウェル、０．２ｍＬを使用して行う。温度を２５℃、１５分間に設定し、その後、アッセイの継続時間にわたって５０℃へと上昇させる。蛍光読み取りは、３０分のインキュベーション時間にわたって１０秒ごとに測定する。
【0120】
結果
結果を図２０に示す。これらのデータセットは、ｍＲＮＡ陽性サンプルが４．５分後に増幅を生じたのに対して、陰性サンプルは６分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、バインダーＤＮＡおよび本明細書で記載される方法の使用を通じて、ｍＲＮＡの検出が可能であることを示す。
結果を図２０に示す。これらのデータセットは、ｍＲＮＡ陽性サンプルが４．５分後に増幅を生じたのに対して、陰性サンプルは６分後に増幅を生じることを示す。これは、サンプルの増幅時間の間に有意差が存在し、バインダーＤＮＡおよび本明細書で記載される方法の使用を通じて、ｍＲＮＡの検出が可能であることを示す。
【0121】
参考文献
【化6】
【化7】
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【図】
【配列表】
【国際調査報告】