特表 2023-553869 ディッシュでの器官形成を促進するオルガノイド培養のエンジニアリング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-26

(54)【発明の名称】ディッシュでの器官形成を促進するオルガノイド培養のエンジニアリング

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20231219BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20231219BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20231219BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 Z

C12N1/00 A

C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023533796

(86)(22)【出願日】2021-12-06

(85)【翻訳文提出日】2023-08-02

(86)【国際出願番号】 US2021072762

(87)【国際公開番号】W WO2022120391

(87)【国際公開日】2022-06-09

(31)【優先権主張番号】63/121,684

(32)【優先日】2020-12-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500429103

【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア

(74)【代理人】

【識別番号】100104411

【弁理士】

【氏名又は名称】矢口 太郎

(72)【発明者】

【氏名】ホ、ドンウン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ソンヒ エステル

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC02

4B029GA08

4B029GB10

4B065AA93X

4B065BC46

4B065CA46

(57)【要約】

開示された主題は、オルガノイドまたは細胞を培養するための技術を提供する。オルガノイドを培養するための装置は、溶液を受け取るように構成されたアクセスポートと、装填チャンバーであって、アクセスポートが前記装填チャンバー内に位置する、装填チャンバーと、複数の培養チャンバーとを含み得るものであり、前記培養チャンバーは、アクセスポートを通じて装填チャンバーに注入された溶液が複数の培養チャンバーに分配されるように装填チャンバーから放射状に配置され、複数の培養チャンバーは、外部環境に対して開放されており、および、複数の培養チャンバーの開口部に突出した縁部を含む。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オルガノイドを培養するための装置であって、前記装置は、
溶液を受け取るように構成されたアクセスポートと、
装填チャンバーであって、アクセスポートが前記装填チャンバー内に位置する、装填チャンバーと、
複数の培養チャンバーであって、前記培養チャンバーは、アクセスポートを通じて装填チャンバーに注入された溶液が複数の培養チャンバーに分配されるように装填チャンバーから放射状に配置されるものであり、前記複数の培養チャンバーは、外部環境に対して開放され、および、前記複数の培養チャンバーの開口部に突出した縁部を含む、複数の培養チャンバーと
を含む、装置。

【請求項2】

請求項１記載の装置であって、前記装置は、ポリ（ジメチルシロキサン）を含む、装置。

【請求項3】

請求項１記載の装置であって、前記装置は、光学的に透明である、装置。

【請求項4】

請求項１記載の装置において、前記アクセスポートは、前記装填チャンバーの中央に配置される、装置。

【請求項5】

請求項４記載の装置において、前記複数の培養チャンバーは、前記アクセスポートに関する回転に関して対称である、装置。

【請求項6】

請求項５記載の装置において、前記アクセスポートを介して前記装填チャンバーに注入された溶液は、前記複数の培養チャンバーに均一に分配される、装置。

【請求項7】

請求項１記載の装置であって、前記装置は、前記複数の培養チャンバーの前記開口部を介して前記外部環境から培地を接触させるように構成されている、装置。

【請求項8】

請求項１記載の装置において、前記溶液は、ヒドロゲル溶液である、装置。

【請求項9】

請求項１記載の装置において、前記ヒドロゲル溶液は、細胞またはオルガノイドを含む、装置。

【請求項10】

請求項１記載の装置において、前記オルガノイドはヒトオルガノイドである、装置。

【請求項11】

請求項１記載の装置において、前記培養チャンバーの各々が、約１００μｍ～約５ｃｍの範囲の幅または高さを有する、装置。

【請求項12】

請求項１１記載の装置において、前記培養チャンバーの各々は、約１ｃｍの幅及び高さを有する、装置。

【請求項13】

請求項１記載の装置において、前記培養チャンバー内の前記オルガノイドの少なくとも約８０％が、培養の２１日目に生存している、装置。

【請求項14】

請求項１記載の装置において、前記突出した縁部が、前記培養チャンバーの前記開口部において溶液のメニスカスを留めるように構成され、前記開口部を通して前記溶液を流出させることなく前記培養チャンバーの充填を可能にする、装置。

【請求項15】

請求項１記載の装置において、各培養チャンバーは、共培養のための異なる種類の細胞またはオルガノイドを含む、装置。

【請求項16】

請求項１記載の装置において、前記オルガノイドの成長は少なくとも約２１日間継続する、装置。

【請求項17】

請求項１記載の装置において、前記オルガノイドのサイズは、少なくとも約２１日間増加する、装置。

【請求項18】

請求項１７記載の装置であって、前記装置は、オルガノイドのサイズの変動を低減させる、装置。

【請求項19】

オルガノイドを培養する方法であって、前記方法は、
細胞またはオルガノイドを含む溶液をアクセスポートを通して装填チャンバーに注入する工程と、
細胞またはオルガノイドを含む溶液で複数の培養チャンバーを充填する工程であって、前記装填チャンバーに注入された溶液が前記複数の培養チャンバーの中に分配されるように、前記培養チャンバーが前記装填チャンバーから放射状に配置され、前記複数の培養チャンバーは、外部環境に対して開放されており、前記培養チャンバーの開口部に、前記開口部を通じた前記溶液の流出を防止するための突出した縁部を含む、充填する工程と；
前記複数の培養チャンバーの開口部を介して前記装置に培地を供給する工程と、
を含む方法。

【請求項20】

請求項１９記載の方法において、前記アクセスポートは、前記装填チャンバーの中央に配置される、方法。

【請求項21】

請求項２０記載の方法において、前記複数の培養チャンバーは、前記アクセスポートに関する回転に関して対称である、方法。

【請求項22】

請求項２１記載の方法において、前記アクセスポートを介して前記装填チャンバーに注入された溶液は、前記複数の培養チャンバーに均一に分配される、方法。

【請求項23】

請求項１９記載の方法において、前記溶液は、ヒドロゲル溶液である、方法。

【請求項24】

請求項１９記載の方法において、前記オルガノイドはヒトオルガノイドである、方法。

【請求項25】

請求項２３記載の方法において、前記ヒドロゲル溶液は、前記装填チャンバーに注入され、前記複数の培養チャンバーに分配された後、前記複数の培養チャンバー内で固化してヒドロゲルを形成するものである、方法。

【請求項26】

請求項１９記載の方法において、前記培養チャンバー内の前記オルガノイドの少なくとも約８０％が、培養の２１日目に生存している、方法。

【請求項27】

請求項１９記載の方法において、各培養チャンバーは、共培養のための異なる種類の細胞またはオルガノイドを含む、方法。

【請求項28】

請求項１９記載の方法において、前記オルガノイドの成長は少なくとも約２１日間継続する、方法。

【請求項29】

請求項１９記載の方法において、前記オルガノイドのサイズは、少なくとも約２１日間増加する、方法。

【請求項30】

請求項１７記載の方法において、前記装置は、オルガノイドのサイズの変動を低減させる、方法。

【請求項31】

請求項１９記載の方法において、前記培地は可溶性因子を含む、方法。

【請求項32】

請求項３１記載の方法において、前記可溶性因子は、成長因子、活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。

【請求項33】

請求項１９記載の方法であって、前記オルガノイドを成熟させる工程をさらに含む、方法。

【請求項34】

請求項１９記載の方法であって、前記複数の培養チャンバーにおける前記オルガノイドの生存率および成熟を評価する工程をさらに含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、２０２０年１２月４日に出願された米国特許出願第６３／１２１，６８４号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府主催の研究に関する声明
この発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から授与されたＨＬ１２７７２０およびアメリカ国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）から授与された１５４８５７１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、この発明について一定の権利を有している。

【背景技術】

【0003】

オルガノイドは、組織や臓器の複雑な発生過程をｉｎ ｖｉｔｒｏで再現するために使用することができる。３次元（３Ｄ）培養した幹細胞は、オルガノイドと呼ばれる自己組織化する多細胞構造体を生み出し、その由来となる臓器の解剖学的および機能的単位に類似させることができる。オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養の手軽さで、ｉｎ ｖｉｖｏの生理システムの複雑さを再現することができるため、生物医学や医薬品の応用として、様々な成人臓器の健康状態および／または疾患状態をモデル化するために使用することができる。

【0004】

オルガノイド培養のための３Ｄ環境を提供するために、ある種の技術では、可溶化した基底膜抽出物から調製した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲル（例えば、マトリゲル）の平面上液滴に幹細胞を埋め込むことが必要である。この３Ｄ環境は、適切な細胞増殖と臓器特異的な系統への分化を促す可溶性因子を含む培地を供給すると、分化細胞が異なるドメインに分離して運命決定が行われ、臓器様構造へと自発的に組織化させることができる。しかし、その有用性と汎用性にもかかわらず、オルガノイドの寿命が限られているため、これらの技術には限界がある。典型的なセットアップでは、ＥＣＭヒドロゲルに埋め込まれた発育中のオルガノイドは、栄養供給と老廃物除去のために受動的な拡散に依存している。この輸送様式は、発生の初期段階において、ヒドロゲルスキャフォールドを通してオルガノイドを効果的に支持する。しかし、オルガノイドが成長し、代謝要求が高くなるにつれて、３Ｄスキャフォールドの内部領域への栄養と酸素の拡散が制限され、オルガノイドの生存能力が徐々に大きく低下し、その結果、ネクロティックコアが形成される。この変性プロセスが起こる速度はオルガノイドの種類によって異なるが、ほとんどの場合、ＥＣＭヒドロゲルを用いた培養から１０日以内に、かなりの細胞死が明らかになる。ある種の培養技術では、オルガノイドを５～７日ごとに継代することで細胞死を回避することができる。しかし、各サイクルの期間が短いと、オルガノイドの持続的な発達と生体内類似組織構築物への成熟に必要な長期間の連続培養を中断することになる。

【0005】

この問題に対処するため、研究者はバイオリアクターを用いて、オルガノイドの３Ｄ培養における酸素と栄養素の拡散輸送を改善した。最近の大脳オルガノイドの研究で実証されたように、この方法は、オルガノイドの継続的な発達と成熟を促進するための長期培養の確立に役立つことが証明されている。しかし、この技術を日常的な実験で実施するためには、機械的に複雑で、操作およびメンテナンスに専門的な知識を必要とする設備が必要であるという欠点がある。もう一つの欠点は、オルガノイドはバイオリアクター内において懸濁状態で培養されるため、培養中の成長および発達をモニターすることが難しいことである。栄養供給を改善するための代替戦略として、オルガノイドの血管新生が提案されているが、制御された脈管灌流を伴うオルガノイドモデルの生成プロセスは法外に複雑で、しばしば高度なｉｎ ｖｉｔｒｏシステムと専門技術を必要とし、非エンジニアにとって容易にアクセスできない。

【0006】

そのため、オルガノイドの培養を長期間中断せず、継続的に行うことができる技術の改良が求められている。

【発明の概要】

【0007】

開示された主題は、オルガノイドおよび／または細胞を培養するための技術を提供する。オルガノイドを培養するための例示的な装置は、溶液を受け取るように構成されたアクセスポート、装填チャンバー、および複数の培養チャンバーを含み得る。非限定的な実施形態では、アクセスポートは、装填チャンバーの中央に位置することができる。いくつかの実施形態では、アクセスポートを通じて装填チャンバーに注入された溶液が培養チャンバーに均等に分配され得るように、培養チャンバーは装填チャンバーから放射状に配置されることができる。非限定的な実施形態では、培養チャンバーは、外部環境に対して開放され得、培養チャンバーの開口部に突出した縁部を含む。

【0008】

特定の実施形態では、装置は、ポリ（ジメチルシロキサン）を含むことができる。非限定的な実施形態では、装置は、光学的に透明であり得る。

【0009】

特定の実施形態では、溶液は、ヒドロゲル溶液であり得る。非限定的な実施形態では、ヒドロゲル溶液は、細胞および／またはオルガノイドを含むことができる。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、ヒトオルガノイドであり得る。非限定的な実施形態では、各培養チャンバーは、共培養のために異なるタイプの細胞またはオルガノイドを含むことができる。いくつかの実施形態では、培養チャンバー内のオルガノイドの少なくとも約８０％が、培養の２１日目に生存可能であり得る。非限定的な実施形態では、オルガノイドの増殖は、少なくとも２１日間継続することができる。いくつかの実施形態では、オルガノイドの大きさは、少なくとも２１日間増加し得る。特定の実施形態では、装置は、オルガノイドのサイズの変動を低減させることができる。

【0010】

特定の実施形態では、培養チャンバーの各々は、約１００μｍ～約５ｃｍの範囲の幅および高さを有することができる。非限定的な実施形態では、突出した縁部は、開口型頂部を通して溶液を流出させることなく培養チャンバー全体を充填するために、培養チャンバーの開口部で溶液のメニスカスを留めるように構成することができる。

【0011】

開示された主題はまた、オルガノイドを培養するための方法を提供する。例示的な方法は、アクセスポートを介してオルガノイドを含むヒドロゲル前駆体溶液を装填チャンバーに注入する工程と、オルガノイドを含むヒドロゲル前駆体溶液で複数の培養チャンバーを充填する工程と、ヒドロゲル前駆体溶液を固化して複数の培養チャンバー内でヒドロゲルを形成する工程と、開口型頂部を介してヒドロゲルに接触する培養培地を提供する工程とを含むことができる。非限定的な実施形態では、アクセスポートは、装填チャンバーの中央に位置し得る。いくつかの実施形態では、培養チャンバーは、装填チャンバーに注入されたヒドロゲル前駆体溶液が培養チャンバーに均一に分配され得るように、装填チャンバーから放射状に配置され得る。非限定的な実施形態では、培養チャンバーは外部環境に対して開放され得、開口型頂部を通してヒドロゲル前駆体溶液の流出を防止するために培養チャンバーの開口部に突出した縁部を含むことができる。

【0012】

特定の実施形態において、培地は、可溶性因子を含む。非限定的な実施形態において、可溶性因子は、成長因子、活性剤、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0013】

特定の実施形態において、本方法は、オルガノイドを成熟させる工程をさらに含むことができる。非限定的な実施形態では、本方法は、複数の培養チャンバーにおけるオルガノイドの生存率および成熟を評価する工程をさらに含むことができる。複数の培養チャンバーは、透明であり得る。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、ヒトオルガノイドであり得る。

【0014】

一実施形態によれば、本開示は、オルガノイドを培養するための装置であって、溶液を受け取るように構成されたアクセスポートと、装填チャンバーであって、アクセスポートが装填チャンバー内に位置する、装填チャンバーと、複数の培養チャンバーであって、培養チャンバーが、アクセスポートを通じて装填チャンバーに注入された溶液が複数の培養チャンバーに分配されるように装填チャンバーから放射状に配置される、複数の培養チャンバーの開口部に突出した縁部を具備する培養装置に関する。

【0015】

一実施形態において、装置は、ポリ（ジメチルシロキサン）を含む。一実施形態において、装置は光学的に透明である。一実施形態において、アクセスポートは、装填チャンバーの中央に位置する。一実施形態において、複数の培養チャンバーは、アクセスポートを中心とする回転に関して対称である。一実施形態において、アクセスポートを介して装填チャンバーに注入された溶液は、複数の培養チャンバーに均一に分配される。一実施形態において、装置は、複数の培養チャンバーの開口部を通じて外部環境から培地に接触するように構成される。一実施形態において、溶液は、ヒドロゲル溶液である。実施形態において、ヒドロゲル溶液は、細胞又はオルガノイドを含む。一実施形態において、オルガノイドは、ヒトオルガノイドである。一実施形態において、培養チャンバーの各々は、約１００μｍ～約５ｃｍの範囲の幅または高さを有する。一実施形態では、培養チャンバーの各々は、約１ｃｍの幅および高さを有する。一実施形態では、培養チャンバー内のオルガノイドの少なくとも約８０％が、培養の２１日目に生存している。一実施形態において、突出した縁部は、培養チャンバーの開口部で溶液のメニスカスを留めるように構成され、開口部から溶液をこぼすことなく培養チャンバーの充填を可能にする。一実施形態において、各培養チャンバーは、共培養のための異なるタイプの細胞又はオルガノイドを含んでいる。一実施形態において、オルガノイドの成長は、少なくとも約２１日間継続する。一実施形態において、オルガノイドの大きさは、少なくとも約２１日間増加する。一実施形態において、本装置は、オルガノイドの大きさの変動を低減させる。

【0016】

実施形態によれば、本開示は、オルガノイドを培養する方法であって、アクセスポートを介して細胞またはオルガノイドを含む溶液を装填チャンバーに注入する工程と、複数の培養チャンバーを細胞またはオルガノイドを含む溶液で充填する工程であって、前記装填チャンバーに注入された溶液が前記複数の培養チャンバーの中に分配されるように、前記培養チャンバーが前記装填チャンバーから放射状に配置され、前記複数の培養チャンバーは、外部環境に対して開放されており、前記培養チャンバーの開口部に、前記開口部を通じた前記溶液の流出を防止するための突出した縁部を含む、充填する工程と；前記複数の培養チャンバーの開口部を介して前記装置に培地を供給する工程と、を含む方法に関する。

【0017】

一実施形態において、培地は、可溶性因子を含む。一実施形態において、可溶性因子は、成長因子、活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態において、本方法は、オルガノイドを成熟させる工程をさらに含む。一実施形態において、本方法は、複数の培養チャンバーにおけるオルガノイドの生存率および成熟を評価する工程をさらに含む。

【0018】

以下、開示された主題をさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１Ａ～１Ｇは、開示された主題に従ったオルガノイドを培養するための例示的なシステムの写真と図を提供する。図１Ｂ～１Ｄの顕微鏡写真のスケールバーは５００μｍである。図１Ｆの上画像のスケールバーは５ｍｍであり、図１Ｆの下画像のスケールバーが３ｍｍである。

【図2】図２Ａ～２Ｓは、開示された主題に従って、開示されたシステムを用いた腸オルガノイドの長期培養を示すグラフおよび共焦点画像を提供する。図２Ａ～２Ｃ、２Ｆ、２Ｇ、および２Ｋのスケールバーは、１００μｍである。

【図3】図３Ａ～３Ｏは、開示された主題に従った腸オルガノイドの成熟を示すグラフおよび共焦点画像を提供する。図３Ｃ、３Ｄ、および３Ｊのスケールバーは、１００μｍである。図３Ｉ、３Ｌ、および３Ｍのスケールバーは、１０μｍである。

【図4】図４Ａ～４Ｋは、開示された主題に従った、開示されたシステムにおける腸オルガノイドの機能的特徴付けを示すグラフ及び画像を提供する。図４Ｅ～４Ｆのスケールバーは、１００μｍである。

【図5】図５Ａ～５Ｇは、開示された主題に従った、開示されたシステムにおける共培養を示すグラフ及び画像を提供する。図５Ａ及び図５Ｃ、並びに図５Ｄの左側のスケールバーは、５ｍｍである。

【図6】図６Ａ～６Ｒは、開示された主題に従った薬物検査のための腸線維症の例示的なモデルを示すグラフおよび画像を提供する。

【図7】図７は、開示された主題に従った、開示されたシステムの例示的な製造を示す図である。

【図8】図８は、ヒドロゲル培養システムと開示された主題に従ったシステムとの間の芽の長さの比較を示す図および共焦点画像とを提供する。

【図9】図９は、開示された主題に従った、開示されたシステムにおける腸オルガノイドの細胞組成を示すグラフを提供する。

【図10】図１０は、開示された主題に従った、開示されたシステムにおけるオルガノイドの連続的な成長を示す共焦点画像を提供する。図１０のスケールバーは、２００μｍである。

【図11】図１１Ａ～１１Ｃは、開示された主題に従った、開示されたシステムを用いたヒト腸オルガノイドの培養を示す図および画像を提供する。

【図12】図１２Ａ～１２Ｑは、開示された主題に従った、開示されたシステムを使用したヒト腸オルガノイドの長期培養を示す図及び画像を提供する。図１２Ａ－ＯＣＴＯＰＵＳおよびマトリゲルドロップで５日間培養したヒト成人腸幹細胞由来のヒトエンテロイド。スケールバー、１００μｍ。図１２Ｂおよび図１２Ｃ－１４日間培養すると、ＯＣＴＯＰＵＳのエンテロイドは大きくなり、陰窩／絨毛様構造（上）が形成され、マトリゲルドロップ培養では、成長が止まり、生存率が低下する（下）のと対照的である。スケールバー、１００μｍ。図１２Ｄおよび図１２Ｅ－オルガノイドの生存率（１２Ｄ）およびサイズ（１２Ｅ）の定量化。図１２Ｆおよび図１２Ｇ－７日目（１２Ｄ）および１４日目（１２Ｅ）のＯＣＴＯＰＵＳおよびマトリゲルドロップにおけるＨ&Ｅ染色エンテロイド切片の代表的な画像。スケールバー、２０μｍ。図１２Ｈおよび図１２Ｉ－芽の数（１２Ｈ）および長さ（１２Ｉ）の定量化。図１２Ｊ－ＯＣＴＯＰＵＳにおけるヒトエンテロイドの２１日間にわたる成長。スケールバー、５０μｍ。図１２Ｋおよび図１２Ｐ－７日目および14日目における、陰窩ドメインのＫｉ６７＋増殖細胞（１２Ｋ、１２Ｌ）およびＫＲＴ２０＋吸収性腸細胞（１２Ｍ、１２Ｎ）およびＭＵＣ２＋杯細胞（ｏ、ｐ）を含む絨毛表面の分化腸管上皮細胞の免疫蛍光およびｍＲＮＡ解析である。スケールバー、１０μｍ。データは平均値±ＳＥＭで表示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｎ≧３）。ｓｄ

【図13】図１３Ａ～１３Ｓは、開示された主題に従って、開示されたシステムを使用したヒトエンテロイドの単一細胞ＲＮＡ配列決定を示す図および画像を提供する。図１２Ａ－ＯＣＴＯＰＵＳでの７日間の培養によって生成されたヒトエンテロイドにおける異なる幹細胞および腸管上皮細胞集団を表す１２のクラスターのＵＭＡＰ投影である。図１２Ｂ～図１２Ｄ－吸収性腸細胞（図１２Ｂ）、杯細胞（図１２Ｃ）、および幹細胞（図１２Ｄ）に特有の代表的な標準遺伝子の発現を示すＵＭＡＰプロット。図１２Ｅ、図１２Ｆ－マトリゲルドロップでの７日間の培養（ｅ）およびＯＣＴＯＰＵＳでの１４日間の中断のない培養（図１２Ｆ）後のヒトエンテロイドにおける細胞クラスターのＵＭＡＰ投影。図１２Ｇ－ヒトエンテロイドにおける細胞組成の定量化。入手可能な場合、天然のヒト腸内で測定された各細胞タイプのパーセンテージを、破線で示す。図１２Ｆ－マトリゲルドロップ培養とＯＣＴＯＰＵＳとの間の選択された細胞型特異的成熟マーカーの発現を比較するバイオリンプロットである。図１２Ｉ－ＯＣＴＯＰＵＳで１４日間培養したヒトエンテロイドにおける分泌性及び吸収性細胞集団への腸幹細胞分化の擬似時間軌跡（上）及び分岐プロット（下）。図１２Ｊ－ＯＣＴＯＰＵＳとマトリゲルドロップ培養における分化した上皮細胞タイプの割合の比較。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図14】図１４Ａ～１４Ｘは、開示された主題に従って、開示されたシステムにおけるヒトＩＢＤのオルガノイドベースモデルを示す図及び画像を提供する。図１４Ａ－ＩＢＤ患者の腸から単離された成体幹細胞は、ＯＣＴＯＰＵＳにおいてエンテロイドを形成するために使用される。図１４Ｂ、図１４Ｃ－免疫蛍光（１４Ｂ）およびＨ&Ｅ染色（ｃ）によって可視化された、１４日間の培養後のＯＣＴＯＰＵＳにおけるＩＢＤ患者由来および正常エンテロイドの形態。スケールバー、１００μｍ（１４Ｂ）および５μｍ（１４Ｃ）。図１４Ｄ、図１４Ｅ－７日目および１４日目におけるエンテロイドサイズ（１４Ｄ）および芽の数（１４Ｅ）の定量化。図１４Ｆ、図１４Ｇ－ＩＢＤおよび正常エンテロイドにおける細胞増殖（Ｋｉ６７）およびアポトーシス（カスパーゼ３およびアネキシンＶ）の比較。スケールバー、１０μｍ。図１４Ｈ－エンテロイドの絨毛ドメイン上の分化した上皮細胞によるＺＯ－１発現の共焦点顕微鏡写真および定量化。スケールバー、１０μｍ。図１４Ｉ－ＩＢＤエンテロイドにおける上皮透過性を示すための、オルガノイド内腔（Ｌ）への４ｋＤａデキストラン－ＦＩＴＣ拡散の可視化。スケールバー、５０μｍ。図１４Ｊ、図１４Ｋ－ＯＣＴＯＰＵＳで１４日間培養した後のＩＢＤおよび正常エンテロイドにおける転写学的に異なる細胞集団のＵＭＡＰ投影（１４Ｊ）およびそれらの割合の定量化（１４Ｋ）。図１４Ｌ－ＩＢＤ関連遺伝子の比較。図１４Ｍ－正常エンテロイドにおける転写因子の発現と比較した、ＩＢＤエンテロイドにおける転写因子の平均発現を示すヒートマップ。図１４Ｎ－ＩＢＤ腸管におけるｌｎｃＲＮＡ遺伝子のアップレギュレーションは、ＵＭＡＰプロットにおいて破線で示したパネス細胞で主に起こる。図１４Ｏ－下層の間質によって支持された腸上皮は、ＯＣＴＯＰＵＳにおいて、同じヒドロゲルスキャフォールドにおけるヒトエンテロイドと初代ヒト腸線維芽細胞との混合共培養によってモデル化される。図１４Ｐ－１４日目における共培養構築物の共焦点顕微鏡写真。スケールバー、１００μｍ。図１４Ｑ－１４日目の培養後のエンテロイドを囲む局所領域の免疫蛍光顕微鏡写真。スケールバー、２５μｍ。図１４Ｒ－間質におけるＦＮ産生および線維芽細胞増殖の定量化。図１４Ｓ－１４日目のエンテロイドから放出されたサイトカインの定量化。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｎ≧３）。図１４Ｕ－マトリゲルドロップで培養した場合、ＩＢＤエンテロイドは、正常腸管の上皮に類似した適切に偏光した上皮細胞（右上）を示す。ＯＣＴＯＰＵＳにおけるＩＢＤエンテロイドと比較すると、ＺＯ－１の発現によって可視化されるように、上皮の構造的完全性も保持されている（右下）。スケールバー、５μｍ。

【図15】図１５Ａ～１５Ｏは、開示された主題に従って、開示されたシステムにおける脈管化ヒトエテロイドのマイクロエンジニアリングを示す図及び画像を提供する。図１５Ａ－標準的な１２ウェル細胞培養プレート内のＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯ装置の写真。図１５Ｂ－ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯの装置の構造。図１５Ｃ、図１５Ｄ－同じヒドロゲルスキャフォールド内で幹細胞のオルガノイドへの自己組織化をサポートしながら、自己組織化された灌流可能な血管を生成するために必要なマイクロ流体３Ｄ培養の連続ステップを示す。図１５Ｅ－１２日間の培養で、ヒトエンテロイドと微小血管が同時に発達していることを示す顕微鏡写真。スケールバー、２００μｍ。ｆ．１μｍの蛍光ビーズの流れによって可視化されたマイクロエンジニアリングされた血管網の灌流性。スケールバー、１００μｍ。図１５Ｇ－血管新生された構築物と血管新生されていない構築物との間のオルガノイドの大きさの比較。図１５Ｈ－ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯにおける血管新生された灌流可能なヒトＩＢＤエンテロイドの構築物。スケールバー、１００μｍ。ｉ．血管密度および血管直径の定量化。図１５Ｊ、図１５Ｋ－ＩＣＡＭ－１の内皮発現（１５Ｊ）および炎症性メディエーターの産生増加（１５Ｋ）により示される、脈管化ＩＢＤモデルの炎症性表現型の促進。スケールバー、５０μｍ。図１５Ｌ－末梢血単球で灌流したＩＢＤエンテロイドの顕微鏡写真。スケールバー、２００μｍ。図１５Ｍ、図１５Ｎ－ＩＢＤエンテロイドへの単球のリクルートメントの連続したステップの共焦点顕微鏡検査（１５Ｍ）および定量化（１５Ｎ）である。スケールバー、５０μｍ。データは平均±ＳＥＭで表示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｎ≧３）。

【0020】

前述の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方が例示的なものであり、開示された主題のさらなる説明を提供することを意図していることが理解されよう。

【発明を実施するための形態】

【0021】

開示された主題は、細胞および／またはオルガノイドを培養するための技術を提供する。開示された技術は、強化された器官形成および細胞またはオルガノイドの寿命の延長を提供し得る。開示された技術はまた、細胞およびオルガノイドの成熟を促進することができる。開示された技術は、細胞およびオルガノイドの大型化も可能にすることができる。また、開示された技術は、細胞やオルガノイドのばらつきを低減させることができる。

【0022】

特に定義がない限り、本書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。矛盾がある場合は、定義を含む本書が優先される。特定の方法および材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料は、現在開示されている主題の実施または試験において使用することができる。本明細書に記載されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に開示された材料、方法、および例は、例示的なものであり、限定することを意図するものではない。

【0023】

本明細書において、「オルガノイド」という用語は、一般に、対応するｉｎ ｖｉｖｏ臓器を模倣し、その臓器の特徴を研究するために使用することができる３Ｄ多細胞ｉｎ ｖｉｖｏ組織構築物を指す。本明細書で使用する場合、「オルガノイド」という用語は、自己組織化された３次元組織培養のあらゆる形状を記述するものである。特定の例では、「オルガノイド」という用語は、幹細胞および／または体細胞を含むものとしてさらに定義され得る。

【0024】

本明細書で使用する場合、用語「約」または「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味し、これは値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当業者の慣例により、３標準偏差以内または３標準偏差超を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、および最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、５倍以内、および２倍以内を意味することができる。

【0025】

本開示は、オルガノイドの長期的な発達と成熟を可能にする、簡便で拡張可能な工学的アプローチを導入する。本明細書に記載の方法は、従来のオルガノイド培養の３次元構成を再設計し、幹細胞懸濁液の単一注入を、長期間維持できるオルガノイドの放射状アレイに変換するプラットフォームを開発した。ヒトおよびマウスの幹細胞を用いて、腸オルガノイドの加速的な作製と、継代を必要としない４週間以上の持続的な発育が実証された。従来技術と比較して、開示された装置での長期培養は、陰窩－絨毛構造の形成を促進し、腸管上皮の機能的成熟度を著しく高める。さらに、血管新生された灌流可能なヒトエンテロイドをマイクロエンジニアリング装置で組み立て、ＩＢＤの疾患腸管上皮への自然免疫細胞の勧誘をモデル化するために使用することができる。開示されたシステム、方法、および装置は、ディッシュ内でより現実的な臓器様構造をエンジニアリングするための即時展開可能なプラットフォームを提供し得る。

【0026】

本開示は、従来のオルガノイドの３Ｄ培養の設計を再考することに基づく、簡単で直ちに展開可能な戦略について説明する。本明細書に記載の方法は、バルクヒドロゲルに固有の限定的かつ不均一な拡散の問題を解消するオルガノイドのオープンアレイを生成するために、３Ｄ培養スキャフォールドの幾何学的形状を再構成できる高度なプラットフォームを利用する。本明細書に記載のシステムは、確立されたプロトコルやワークフローを変更することなく、標準的な細胞培養プレートで使用できる、異なるサイズおよび形状の簡単ですぐに使用できる培養インサートとして製造することができる。

【0027】

本開示の概念実証は、マウス腸オルガノイドの長期間の連続培養による成長と発達によって証明された。得られた腸組織構築物は、従来の培養では達成できなかった構造的・機能的な成熟を示す。さらに、ヒト腸管オルガノイドの作製と長期間の維持、およびシングルセルＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を用いた成熟度の著しい向上に関する詳細な解析により、このアプローチの有用性を実証することができる。最後に、ｉ）患者由来のエンテロイドを用いたヒト炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のオルガノタイプモデル、および、ｉｉ）ＩＢＤにおける免疫－上皮相互作用のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングのための灌流可能な血管系と統合したマイクロエンジニアリングオルガノイド、の確立によって、この技術の先進性を実証することができる。

【0028】

背景として、従来のオルガノイドモデルにおける長期培養の課題の中心は、固着性ヒドロゲル液滴の内部領域における拡散制限に起因する細胞死の増加領域の形成であることが理解されよう。本質的に、本明細書に記載されたアプローチは、ｉ）オルガノイドが生存可能な外層を維持しながら、ヒドロゲルスキャフォールドからこのネクロティックコアを除去する工程と、および、ｉｉ）図１Ｇに示すように、この層を放射状にセグメント化し、オルガノイドの平面アレイを形成するためにそれを広げる工程として、概念づけることができる。このアレイは、培養スキャフォールドの厚みを大幅に減少させることで、栄養素、酸素、そのほかの可溶性因子の無制限の拡散と補給をできるように設計されており、長期培養に適した、より均一で持続可能な生化学的微小環境を形成することが可能になる。

【0029】

このアイデアを実用化するために、標準的な細胞培養プレートで放射状に配列したオルガノイドアレイを作製および維持できる円盤型の３Ｄ培養装置を作製した（図１Ａ）。簡単に紹介すると、ＯＣＴＯＰＵＳ（可溶性シグナルを無制限に供給できるオルガノイド培養ベースの３次元器官形成プラットフォームＯｒｇａｎｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｗｉｔｈ Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｓｕｐｐｌｙ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｓ）と名付けられたこの装置は、中央の装填チャンバーから放射状に広がる１つ以上のオルガノイド培養チャンバーからなる。一実施形態において、ＯＣＴＯＰＵＳは、放射状に広がる１つ以上のオルガノイド培養チャンバーの中心に、開放型アクセスポートを含むことができる。一実施形態において、各培養チャンバーは、１ｍｍ（高さ）×１ｍｍ（幅）の断面寸法を有し得る。重要なことは、培養チャンバーは外部環境に対して開放されており、開口部の縁から突出した微細な部分を含んでいることである（図１Ｂ）。このシステムでは、ＥＣＭヒドロゲル前駆体溶液に懸濁された幹細胞が、アクセスポートを介して中央のチャンバーに手動でピペットで注入される（図１Ｃ）。装置設計の幾何学的対称性により、注入された混合物は培養チャンバーに均等に分配される（図１Ｄ）。この過程で、表面張力が作用して、液体のメニスカスがチャンバー天井の突出した縁に固定され（図１Ｄ）、注入された溶液が前進し、開口型頂部からこぼれることなくチャンバー全体を充填することができる。ゲル化後、装置を含むウェルに培地を添加し、露出したヒドロゲル表面を通して埋め込まれた細胞に栄養を供給する（図１Ｅ）。ＯＣＴＯＰＵＳで３Ｄ培養を行うには、従来のオルガノイド培養に用いられていた標準的な手順を変更することなく、この２つの簡単なピペッティング手順を行うだけでよい。

【0030】

手技の簡便さに加えて、ＯＣＴＯＰＵＳは従来の技術よりも有利な新しい機能を備えている。ＯＣＴＯＰＵＳが取り外し可能な培養インサートとして設計されているため、このシステムは簡単に移動でき（図１Ｆ）、装置内で確立したオルガノイド培養モデルの取り扱い、操作、分析が容易になる。また、このアプローチは設計の柔軟性も備えている。ＯＣＴＯＰＵＳの構造を決める重要なパラメータは、装置製作中に培養チャンバーの数、サイズ、形状、および接続性を容易に調整できるため（図１Ｆ）、システム内で生成されるオルガノイドを含む３Ｄ組織構築物の体積と空間構成を制御する手段が提供される。同様に、ＯＣＴＯＰＵＳの全体的なサイズと形状は、異なるウェルサイズとフォーマットを持つ標準的な培養プレートと互換性のある装置を作成するために容易に変更することができる。この柔軟性は、スケーラビリティを可能にするため、特に重要である。図１Ｆに示すように、ＯＣＴＯＰＵＳは、自動液体処理システムと組み合わせた９６ウェル形式の培養プラットフォームとして展開することができ、実験スループットの大幅な向上を必要とする適用のためにオルガノイドモデルの生産をスケールアップすることができる。

【0031】

上記で簡単に紹介した、本開示のシステム、方法、および装置は、次に、図面を参照しながら、以下により詳細に説明される。

【0032】

特定の実施形態において、開示された主題は、細胞、オルガノイド、または組織外植片を培養するための装置を提供する。図１Ｂに示すように、例示的な装置は、アクセスポート１０１、装填チャンバー１０２、および少なくとも１つの培養チャンバー１０３（例えば、図１Ｂの８つの培養チャンバー１０３）を含むことができる。アクセスポート１０１は、装填チャンバー１０２の中央に位置することができ、少なくとも１つの培養チャンバー１０３は、装填チャンバー１０２から放射状に広がることができる。

【0033】

特定の実施形態では、装填チャンバー１０２は、アクセスポート１０１を通して溶液を受け取るように構成され得る。例えば、溶液は、アクセスポート１０１を通して装填チャンバー１０２にピペットで入れることができる。非限定的な実施形態では、アクセスポート１０１は、装填チャンバー１０２の中央に位置することができる。いくつかの実施形態では、装置は、異なるタイプの細胞およびオルガノイドを共培養するための複数の装填チャンバー１０２を含むことができる。特定の実施形態では、装填チャンバー１０２は、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）を含むことができる。特定の実施形態では、装填チャンバー１０２は、ポリスチレン、熱可塑性樹脂、ガラス、金属、紙、またはそれらの組み合わせを含むことができる。

【0034】

特定の実施形態では、装填チャンバー１０２は、約２ｍｍ～約１０ｍｍの範囲の直径を有することができる。非限定的な実施形態では、アクセスポート１０１は、約０．５ｍｍ～約３ｍｍの範囲の直径を有することができる。

【0035】

特定の実施形態では、アクセスポート１０１を介して装填チャンバー１０２に注入された溶液が少なくとも１つの培養チャンバー１０３に均一に分配され得るように、培養チャンバー１０３は装填チャンバー１０２から放射状に配置されることができる。非限定的な実施形態では、複数の培養チャンバー１０３は、装填チャンバー１０２から放射状に配置されることができる。いくつかの実施形態では、開示された装置は、複数の装填チャンバー１０２を含むことができ、各装填チャンバーは、共培養プラットフォーム用の１つまたは複数の培養チャンバーに接続することができる。各培養チャンバー１０３は、異なるタイプの細胞またはオルガノイドを含むことができ、一方、それらは同じ培地に曝露されることができる。各培養チャンバー１０３は、異なるタイプの細胞外マトリックスを含むことができる。特定の実施形態では、各培養チャンバー１０３は、独立してアクセス可能なフローチャネルを含むことができる。特定の実施形態では、培養チャンバー１０３は、ＰＤＭＳを含むことができる。特定の実施形態では、培養チャンバー１０３は、ポリスチレンを含むことができる。特定の実施形態では、培養チャンバー１０３は、熱可塑性プラスチックを含むことができる。特定の実施形態では、培養チャンバー１０３は、ガラスを含むことができる。特定の実施形態では、培養チャンバー１０３は、金属を含むことができる。特定の実施形態では、培養チャンバー１０３は、紙を含むことができる。

【0036】

いくつかの実施形態では、培養チャンバー１０３は、約１００μｍ～約５０ｍｍの範囲の幅を有することができる。非限定的な実施形態では、培養チャンバー１０３は、約１００μｍから約５ｃｍの範囲の高さを有することができる。いくつかの実施形態では、培養チャンバー１０３の形状およびサイズｅｒは、開示された装置の目的（例えば、共培養、標的細胞、および標的オルガノイド）に応じて変更することができる。いくつかの実施形態では、培養チャンバー１０３は、約１００μｍ～約５，０００，０００μｍの幅および／または高さを有することができる。いくつかの実施形態では、培養チャンバー１０３は、少なくとも約１００μｍの幅および／または高さを有することができる。いくつかの実施形態では、培養チャンバー１０３は、最大で約５，０００，０００μｍの幅および／または高さを有することができる。いくつかの実施形態では、培養チャンバー１０３は、約１００μｍ～約１，０００μｍ、約１００μｍ～約１０，０００μｍ、約１００μｍ～約５０，０００μｍ、約１００μｍ～約１００，０００μｍ、約１００μｍ～約５００，０００μｍ、約１００μｍ～約１，０００，０００μｍ、約１００μｍ～約５，０００，０００μｍ、約１，０００μｍ～約１０，０００μｍ、約１，０００μｍ～約５０，０００μｍ、約１，０００μｍ～約１００，０００μｍ、約１，０００μｍ～約５００，０００μｍ、約１，０００μｍ～約１，０００，０００μｍ、約１，０００μｍ～約５，０００，０００μｍ、約１０，０００μｍ～約５０，０００μｍ、約１０，０００μｍ～約１００，０００μｍ、約１０，０００μｍ～約５００，０００μｍ、約１０，０００μｍ～約１，０００，０００μｍ、約１０，０００μｍ～約５，０００，０００μｍ、約５０，０００μｍ～約１００，０００μｍ、約５０，０００μｍ～約５００，０００μｍ、約５０，０００μｍ～約１，０００，０００μｍ、約５０，０００μｍ～約５，０００，０００μｍ、約１００，０００μｍ～約５００，０００μｍ、約１００，０００μｍ～約１，０００，０００μｍ、約１００，０００μｍ～約５，０００，０００μｍ、約５００，０００μｍ～約１，０００，０００μｍ、約５００，０００μｍ～約５，０００，０００μｍ、又は約１，０００，０００μｍ～約５，０００，０００μｍの幅および／または高さを有することができる。いくつかの実施形態では、培養チャンバー１０３は、約１００μｍ、約１，０００μｍ、約１０，０００μｍ、約５０，０００μｍ、約１００，０００μｍ、約５００，０００μｍ、約１，０００，０００μｍ、または約５，０００，０００μｍの幅および／または高さを有することができる。

【0037】

特定の実施形態では、培養チャンバーは外部環境に対して開放され得る。図１Ｂ～図１Ｅに示すように、培養チャンバー内の細胞、オルガノイド、ヒドロゲル、またはそれらの組み合わせは、培養チャンバー１０３の開口部１０４を通して栄養素および／または培地で供給することができる。例えば、栄養分を含む培地１０５に装置を浸漬し、栄養分を培養チャンバー内のヒドロゲル全体に均一に拡散させることができる。例えば、可溶性シグナルを含む培地を供給すると、ヒドロゲルスキャフォールドは３Ｄ培養チャンバー全体に急速な培地拡散を可能にし、３０分以内に細胞および／またはオルガノイドに栄養供給を提供する。

【0038】

特定の実施形態では、培地は、栄養素、可溶性因子、成長因子、活性剤、またはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、適切な細胞成長および器官特異的な系統への指向性分化を可能にする可溶性／成長因子を含む培地を供給すると、３Ｄ培養チャンバー内の細胞および／またはオルガノイドを器官様構造へと分化させることができる。特定の実施形態では、培地は、Ｒ－スポンジンリガンド、ノギン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｂ－２７、Ｎ－２、ＢＳＡ、アスコルビン酸、ＭＴＧ、グルタマックス、ＣＨＩＲ９９０２１、ｒｈＫＧＦ、８ＢｒｃＡＭＰ、ＩＢＭＸ、ＤＭＨ－１、Ａ８３－０１、ヒドロコルチゾンおよびヘパリンなどの可溶性／成長因子を含み得る。非限定的な実施形態では、培地は、薬剤をスクリーニングするための標的活性剤を含み得る。例えば、腸幹細胞を培養チャンバー１０３に播種し、線維化表現型に対する薬剤の効果を試験するために、予め決められた濃度の抗線維化薬剤（例えば、ピルフェニドン及び／又はニンテダニブ）で処理することができる。非限定的な実施形態では、活性剤は、化学物質、毒素、ナノ材料、細菌、ウイルス、核酸、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0039】

非限定的な実施形態では、培養チャンバー１０３は、培養チャンバー１０３の開口部１０４に突出した縁部１０６、またはステップ１０６を含むことができる。突出した縁部１０６は、培養チャンバー１０３の開口上部で注入された溶液のメニスカスを固定し、開口上部から溶液がこぼれることなく培養チャンバー１０３全体を満たすように構成することができる。

【0040】

特定の実施形態では、培養チャンバー１０３は、培養チャンバー１０３の内表面へのゲルおよび／または細胞の接着を強化するためにコーティングされ得る。例えば、各培養チャンバー１０３は、ヒドロゲルの接着を強化するための表面コーティングを形成するために、室温（ＲＴ）で、ドーパミン塩酸塩溶液で満たされ得る。

【0041】

特定の実施形態において、開示された装置は、ＰＤＭＳを含むことができる。特定の実施形態では、装填チャンバーは、ポリスチレンを含むことができる。非限定的な実施形態では、装置は光学的に透明であり得る。例えば、開示された装置内に位置するヒドロゲルに埋め込まれた細胞またはオルガノイドは、開示された装置からヒドロゲルを取り除くことなく、顕微鏡技術（例えば、明視野、共焦点、蛍光、電子、原子力、およびレーザー走査顕微鏡）を通じて観察することができる。特定の実施形態において、装置は、約１ｍｍ～約５０ｃｍの範囲のサイズを有し得る。

【0042】

特定の実施形態では、装填チャンバーに注入される溶液は、ヒドロゲル溶液であり得る。例えば、ヒドロゲル溶液は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）前駆体溶液であり得、これは、培養チャンバー内の後に固化（すなわち、ゲル化）され得、３Ｄ培養環境を提供することができる。非限定的な実施形態では、溶液は、細胞、オルガノイド、または組織外植片を含むことができる。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる任意の細胞であり得る。例えば、限定するものではないが、細胞は、幹細胞、杯細胞、内皮細胞、上皮細胞、間葉細胞、神経細胞、筋肉細胞、前駆細胞、免疫細胞、内分泌細胞、またはそれらの組み合わせであり得る。オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる任意のオルガノイドであり得る。例えば、限定するものではないが、オルガノイドは、ヒトオルガノイド、マウスオルガノイド、腸オルガノイド、肝臓オルガノイド、肺オルガノイド、新生オルガノイド、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0043】

特定の実施形態において、開示された装置で培養されたオルガノイドは、延長された寿命を有することができる。例えば、開示された装置内で培養されたオルガノイドは、継代せずに約３週間まで生存することができる。非限定的な実施形態では、培養チャンバー内のオルガノイドの少なくとも約８０％が、培養の５日目、１０日目、１４日目、および２１日目に生存可能であり得る。

【0044】

特定の実施形態では、開示された装置は、オルガノイドの改善された形態的および機能的成熟を提供することができる。開示された装置の長期培養能力は、腸オルガノイドの成熟度を高めるために活用され得る。例えば、培養中（例えば、約７日間）、平坦な上皮は指状の突起（例えば、絨毛）に折り畳まれ、拡張した出芽を有することができ、これは開示された装置なしで培養した絨毛よりも長くなり得る。形態学的な発達に加えて、開示された装置は、オルガノイドの改善された機能的な成熟の改善を提供することができる。例えば、開示された装置で培養された絨毛は、開示された装置なしで培養された絨毛よりもより高機能なマーカー（例えば、ペプチドトランスポーター１、ナトリウム－グルコース連結トランスポーター１（ＳＧＬＴ１）、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２））を発現し得る。

【0045】

特定の実施形態において、開示された主題は、オルガノイドを培養するための方法を提供する。例示的な方法は、アクセスポートを通じてオルガノイドを含むヒドロゲル前駆体溶液を装填チャンバーに注入することと、オルガノイドを含むヒドロゲル前駆体溶液で複数の培養チャンバーを充填する工程と、ヒドロゲル前駆体溶液を固化して複数の培養チャンバー内でヒドロゲルを形成することと、開口型頂部を通じてヒドロゲルに接触する培養培地を提供することを含み得る。例えば、開示された装置でオルガノイドを形成するために、オルガノイド／ヒドロゲル混合物は、ヒドロゲル前駆体溶液を完全オルガノイド増殖培地中のオルガノイドのペレットと混合することによって生成することができる。予め濡らしたピペットチップを使用して、約１００μｌのオルガノイド／マトリゲル混合物を、アクセスポートを通して開示された装置に注入することができる。混合物は、混合物がこぼれることなく、培養チャンバーを通して均一に分配することができる。例えば、各培養チャンバーは、アクセスポートから注入された後、同じ体積の混合物を有することができる。開示された装置は、ヒドロゲル前駆体溶液のゲル化のためにインキュベートされ得る。長期培養のために、予め温めたオルガノイド増殖培地を各培養チャンバーに加えることができる。

【0046】

特定の実施形態において、本方法は、透明な装置を通して、複数の培養チャンバー内のオルガノイドの生存率および成熟を評価する工程をさらに含むことができる。例えば、オルガノイドの生存率および成熟は、顕微鏡技術（例えば、明視野、共焦点、蛍光、電子、原子力、およびレーザー走査顕微鏡）および生化学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡ）を通じて評価することができる。

【0047】

一実施形態によれば、上記による装置は、標準的なソフトリソグラフィ技術を使用して、マイクロパターン化された３次元プリント型に対してＰＤＭＳプレポリマーを鋳造することによって作製することができる。例えば、ＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）モノマーベースは、硬化剤（１０：１、ｗ／ｗ）と混合し、３Ｄプリント型（Ｐｒｏｔｏｌａｂｓ、米国）上に注ぐことができる。鋳造された鋳型は、乾燥室内で３０分間真空脱気することができ、その後、ＰＤＭＳを６５℃で一晩オーブン硬化させて、図１Ａ～図１Ｆに記載のように、オルガノイド培養チャンバーを含む装置を製造することができる。硬化したＰＤＭＳを金型から取り出し、未硬化ＰＤＭＳの薄い層に対してスタンピングし（１５００ｒｐｍで５分間、平坦なウェハ上にスピンコート）、次に装置の底部層を形成する硬化ＰＤＭＳの薄いスラブに対してシールすることができる。組み立てられたＯＣＴＯＰＵＳは、６５℃で焼成してスタンプされたＰＤＭＳ接着層を完全に硬化させ、使用するまで２４ウェルプレートに入れることができる。

【0048】

図７は、上述の装置作製方法のフロー図である。装置を作製するために、脱気したＰＤＭＳプレポリマーを、オルガノイド培養チャンバー、装填チャンバー、およびアクセスポートの突出した特徴を有するパターン化された３Ｄプリント型に分注することができる。次に、この型を、オルガノイド培養チャンバーとアクセスポートの開口部を形成するための、一致する凸レリーフパターンを含む別の３Ｄプリント型で覆うことができる。ＰＤＭＳを６５℃で２時間硬化させた後、ＰＤＭＳスラブを型から剥がすことができる。最後に、図１Ａに示すように、作製した装置を標準的なマルチウェルプレートに配置することができる。

【0049】

実施例
結果
開示された装置は、オルガノイドの寿命を延ばすことができる。標準的なオルガノイド培養の最も一般的な設定をシミュレートするために、市販のマウス成体幹細胞およびプロトコルから得られる小腸オルガノイドをモデル系として選択した。図２Ａは、ＯＣＴＯＰＵＳとドロップ培養の両方で、マトリゲル中のマウス腸成体幹細胞が腸オルガノイドに自己組織化する様子を示している。培養中、ＯＣＴＯＰＵＳのマトリゲルアレイに埋め込まれた細胞は、製造元のプロトコルや先行研究で説明されている方法で５日間にわたって自己組織化のプロセスを経て、陰窩－絨毛構造によって識別される腸オルガノイドを形成した（図２Ａの上段）。これらのオルガノイドは、同じプロトコルで一般的に使用されるサイズ（半径３ｍｍ程度）のマトリゲルの平面上液滴で形成したものと同様の生存率と形態的特徴を示した（図２Ａ下段；図２Ｄ）。しかし、継代前の連続培養の推奨最大期間である５～７日を超えて培養期間を延長すると、２つのグループ間でかなりの違いが見られた。ＯＣＴＯＰＵＳのオルガノイドは、図２Ｄで定量化したように、測定可能な生存率の低下なしに成長を続け、芽（図２Ｂおよび図２Ｃの上段）を形成し、その結果、図２Ｅに示すように、培養１４日後にそのサイズが３．２倍増加した。一方、マトリゲルドロップで維持したオルガノイドの大部分（～６５％）は、１０日目までに壊死を起こし（図２Ｂの下段；図２Ｄで定量化）、これは時間とともにさらに悪化して１４日間の培養終了時に生存率が８０％以上低下した（図２Ｃの下段；図２Ｄで定量化）。この著しい細胞死は、オルガノイドの形態（図２Ｃの下段）およびサイズの進行性減少（図２Ｅ）によって証明されるように、オルガノイドの崩壊および崩壊につながった。ＯＣＴＯＰＵＳにおけるより高い細胞生存率とオルガノイドの成長の増加は、図２Ｐに示すように、最初の細胞播種密度に関係なく観察された。また、ＯＣＴＯＰＵＳは、マトリゲルドロップ培養法から改変された他の従来技術、例えば、オルガノイド由来細胞の３Ｄ「上」培養や単層培養と比較して、オルガノイドの長期生存性と発達を支える優れた能力を示した（図２Ｑおよび図２Ｒ）。図２Ｆは、ＯＣＴＯＰＵＳにおいて、２１日間にわたり腸オルガノイドが連続的に肥大化していることを示す。図２Ｇは、変動係数が実質的に小さいことからわかるように、ＯＣＴＯＰＵＳがオルガノイドの大きさの変動を低減していることを示している。画像は、１４日目のオルガノイドを示す。図２Ｆに示すように、ＯＣＴＯＰＵＳでは、より支持的な環境により、継代することなく３週間以上にわたってオルガノイドの長期培養と連続成長が可能であり、マトリゲルドロップによる従来の腸オルガノイド培養の典型的期間（５～７日）と比較して、培養サイクルあたりの寿命が３倍以上延びることが示された。さらに、ＯＣＴＯＰＵＳでの培養寿命の向上は、発育中のオルガノイドのサイズの変動を著しく低減させることを伴っていた（図２Ｇ）。

【0050】

観察された差異についてさらなる洞察を提供する試みとして、開示された装置における可溶性因子の受動拡散をシミュレートするために、オルガノイドを含むマトリゲルスキャフォールドへの７０ｋＤａ ＦＩＴＣデキストラン透過の時間プロファイルを測定した。空間分析のために、これらの測定は、スキャフォールドの内側および外側領域を表す２つの位置で行われた。図２Ｈおよび図２Ｉは、マトリゲルドロップ（図２Ｈ）およびＯＣＴＯＰＵＳ（図２Ｉ）におけるヒドロゲルスキャフォールドの内側および外側領域への７０ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン拡散を示す。内側および外側領域のオルガノイドは、それぞれヒドロゲル表面から６００μｍ（ＯＣＴＯＰＵＳ）／２４００μｍ（マトリゲルドロップ）および４００μｍ（両グループ）の位置にあった。図２Ｊは、デキストラン拡散による平均蛍光強度（ＭＦＩ）の時間的プロフィールを示す。図２Ｋは、ＯＣＴＯＰＵＳおよび従来のドロップ培養におけるマウス肝オルガノイドの形成および拡張培養を示す図である。図２Ｌは、ＯＣＴＯＰＵＳ２０３およびドロップ２０４における肝臓オルガノイドのサイズおよび生存率の定量化を示す図である。

【0051】

これらの結果は、装置内の３Ｄ培養環境が、可溶性因子の無制限かつ空間的に均一な拡散性輸送を可能にすることを示唆している。マトリゲル平面上液滴では、外層へのデキストランの無制限な輸送は、３０分以内の蛍光強度の急激な増加から明らかであり、スキャフォールドのコアへの色素の浸透が限られているのとは対照的だった（図２Ｈ、図２Ｊ）。重要なことは、この有意な空間変動はＯＣＴＯＰＵＳでは観察されず、デキストラン拡散はヒドロゲル構築物全体にわたってほぼ同じ速度で起こり、３０分未満で飽和レベルに到達した（図２Ｉ、図２Ｊ）。この場合、スキャフォールドの内側および外側領域における蛍光強度の時間的プロファイルは、ヒドロゲル滴の表面層で測定したものと密接に一致した（図２Ｊ）。

【0052】

これらの知見と一致して、ＯＣＴＯＰＵＳにおけるマトリゲルスキャフォールドへの酸素の浸透は迅速かつ均一に起こり、３０分以内に構築物の全厚さを通じて酸素飽和状態になった（図２Ｎ、図２Ｏ）。この拡散パターンは、スキャフォールド全体に酸素勾配が生じ、培養期間中ずっと低酸素コアが存在することを明確に示したマトリゲルドロップでの拡散パターンとは異なっていた（図２Ｍ、図２Ｏ）。

【0053】

これらの結果は、ＯＣＴＯＰＵＳの設計原理を検証するものであり、開示されたシステムで示されたサイズの変動を抑えたオルガノイドの長期生存性と持続的な成長は、オルガノイドとマトリゲル表面の距離を短くすることで達成される、栄養素、成長因子、酸素の無制限かつ空間的に均一な拡散輸送に起因すると考えられる（図２Ｓ）ことを示唆している。この実証は腸オルガノイドの使用に基づくものであったが、この結果は、同じアプローチを他のタイプのオルガノイドに拡張することの実現可能性をも示している。例えば、肝臓オルガノイドの培養においても、ＯＣＴＯＰＵＳは同様の効果を発揮し、長期間にわたって生存率を低下させることなく成長を続けることが示された（図２Ｋ）。これらのデータを総合すると、ＯＣＴＯＰＵＳはオルガノイドの寿命を延ばすことで、従来の培養技術にない大きな付加価値を提供することがわかる。

【0054】

従来の培養では、オルガノイドの寿命が限られているため、発生の後期に到達し、より成熟した表現型を獲得する能力が妨げられている。ＯＣＴＯＰＵＳの長寿命化は、モデル系における腸オルガノイドの成熟度を高めるために活用できる。

【0055】

胚発生期において、発達中の腸管の平坦な上皮は、絨毛と呼ばれる指状の突起に折り畳まれ始め、陰窩と呼ばれる深い侵襲によって分離される（図３Ａ）。図３Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏでの腸管発達過程における絨毛－陰窩構造の形成を示している。発生が進むにつれ、絨毛の数が増えて陰窩絨毛構造がより顕著になり、栄養吸収に利用できる上皮の表面積が飛躍的に拡大する。この形態形成の重要なプロセスに着目し、オルガノイドの陰窩様ドメインに相当する芽の数と長さを測定することで、腸オルガノイドの形態を検討した（図３Ｂ）。図３Ｂは、３Ｄ培養における腸オルガノイドの形態発達を解析するための指標として用いた芽の形成を示す図である。７日間の培養中、発達中のオルガノイドにおける折り畳み構造の形成は、マトリゲルドロップとＯＣＴＯＰＵＳの両方ではっきりと確認できたが、出芽の程度はＯＣＴＯＰＵＳの方が大きいように見えた（図３Ｃから３Ｅ）。図３Ｃおよび図３Ｄは、マトリゲルドロップ（図３Ｃ）およびＯＣＴＯＰＵＳ（図３Ｄ）におけるオルガノイドの共焦点顕微鏡写真である。ＯＣＴＯＰＵＳでは、オルガノイドの出芽がより顕著に見られる。重要なことは、この装置により、これらのオルガノイドは７日目を超えて発達を続け、１４日目までにおよそ３倍の数の芽を形成することができたことである（図３Ｄ、図３Ｅ）。図３Ｅおよび図３Ｆは、ＯＣＴＯＰＵＳおよびドロップで培養した芽の数（図３Ｅ）および長さ（図３Ｆ）の定量化を示している。一方、ヒドロゲルドロップ中のオルガノイドは、培養７日後に芽が出なくなり、急速に生存率が低下した（データ示さず）。また、解析の結果、ＯＣＴＯＰＵＳで生成したオルガノイドでは、著しく伸長した芽が確認された（図３Ｆおよび図８）。注目すべきは、７日目および１４日目のＯＣＴＯＰＵＳからの芽の数が、それぞれＥ１５．５およびＥ１８．５のマウス胚で測定された数の良い近似値であったことである（図３Ｇ）。図３Ｇは、異なる発生段階における絨毛の数のｉｎ ｖｉｔｒｏ－ｉｎ ｖｉｖｏ比較を示す。同様に、これらのオルガノイドにおける芽の平均長さ（１６７．２５μｍ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの測定値（１３０．９５μｍ）と同等であった。

【0056】

また、装置内でオルガノイドを作製した場合、幹細胞マーカー（Ｌｇｒ５、Ｋｉ６７）の発現が高く（図３Ｈ）、ＥｄＵの免疫染色がより強固である（図３Ｉ）ことも結果として示された。図３Ｈおよび図３Ｉは、ＯＣＴＯＰＵＳ内のオルガノイドが、腸幹細胞マーカー（Ｋｉ６７およびＬｇｒ５）の発現が上昇し、ＥｄＵの免疫蛍光の増加によって示されるように、より活発な細胞増殖を示すことを示す。この発見は、オルガノイドの出芽の違い（図３Ｃ～図３Ｆ）を裏付けるものである。オルガノイドの発生過程で陰窩ビラス構造の形成と伸展には、幹／前駆細胞の拡大とその活発な増殖が必要だからである。興味深いことに、装置培養におけるＥｄＵ＋増殖性細胞は、７日目にオルガノイド構築物全体に分布した（図３Ｊ）。図３Ｊは、ＯＣＴＯＰＵＳで生成したオルガノイドにおけるＥｄＵ＋細胞（白色）の空間分布を示す共焦点顕微鏡写真である。クローズアップ画像の線は、オルガノイドの芽を概説している。しかし、培養が進むにつれて、これらの細胞は芽の先端に局在することが観察され（図３Ｊ）、ｉｎ ｖｉｖｏの腸の発達における絨毛形成後の細胞増殖の陰窩領域への制限というよく知られた事実を再現している。

【0057】

形態的な発達に加え、ＯＣＴＯＰＵＳの３Ｄ培養環境が腸オルガノイドにおける器官特異的な組織の出現にどのような影響を与えるかを評価した。胚性腸の幹細胞や前駆細胞は、栄養吸収やその他の重要な腸の生理機能に重要な吸収細胞や分泌細胞を含む絨毛上の特殊な上皮を生じさせる。実際、この上皮の分化と成熟の過程は、従来のオルガノイドモデルとＯＣＴＯＰＵＳオルガノイドモデルの両方で起こり、胚形成期の腸の成熟に不可欠な役割を果たす転写因子である肝細胞核因子４α（Ｈｎｆ４α）の発現によって証明された。しかし、マトリゲルドロップ中のオルガノイドは、その成熟が最大となる時点（７日目）でも、かなり低い発現量で見られた（図３Ｋ、図３Ｌ）。図３Ｋは、ＯＣＴＯＰＵＳで発育したオルガノイドは、マトリゲルドロップの対照群と比較して、成熟した腸管上皮細胞のマーカーであるＨｎｆ４αの発現量が増加していることを示している。図３Ｌは、Ｈｎｆ４α＋細胞の割合とＨｎｆ４αの発現レベルの定量化を示す図である。Ｈｎｆ４αの免疫蛍光は、細胞数に関して正規化した。ＯＣＴＯＰＵＳでは、すでに高いＨｎｆ４αの発現が１４日間の培養の間にさらに増加し、Ｈｎｆ４α＋細胞の割合および細胞あたりの発現レベルがそれぞれ約１．５倍および１．４倍に増加した（図３Ｋ、図３Ｌ）。

【0058】

重要なことに、装置内でのオルガノイドの成熟が促進されたことは、細胞タイプに特化したマーカーの分析によってさらに裏付けられた。例えば７日目には、吸収性腸細胞の終末分化マーカーであるビリンの発現が、ヒドロゲルドロップと比較してＯＣＴＯＰＵＳでは著しく上昇し（図３Ｍ）、この表現型は長期の培養によってさらに促進された（図３Ｍ）。同様の傾向は、粘液産生杯細胞（ＭＵＣ２）（図３Ｎ）およびホルモン分泌を担う腸内分泌細胞（ソマトスタチン）に特異的なメーカーの誘導（図３Ｏ）にも観察された。図３Ｍ～３Ｏは、腸細胞（ビリン、図３Ｍ）、杯細胞（ＭＵＣ２、図３Ｎ）および腸内分泌細胞（ソマトスタチン、図３Ｏ）に特有の分化マーカーの可視化および定量化を示す。興味深いことに、発育中のオルガノイドで出現した絨毛上の腸細胞の数は、他の細胞タイプよりも有意に多く（図９）、これらの細胞が生体内の腸上皮で最も多く存在することを再現している。これらのことから、ＯＣＴＯＰＵＳを用いることで、従来の３Ｄ培養に比べて、より加速的かつ持続的にオルガノイドを発達させ、形態的および細胞的に高いレベルに到達させることができることが示唆された。

【0059】

次の段階では、本装置で示された形態形成と組織成熟の促進が、腸管オルガノイドの機能成熟に寄与するかどうかを評価した。腸の主要な機能は栄養吸収であることから、腸上皮の吸収機能を制御する主要な分子トランスポーターとして、ｉ）ペプチドの腸内取り込みを担うペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）、ｉｉ）単糖類の吸収を媒介するナトリウム－グルコース連結トランスポーター１（ＳＧＬＴ１）およびグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）を含む糖トランスポーターについて測定した。

【0060】

この解析では、最大培養期間（７日間）のヒドロゲルドロップ中のオルガノイドを、ＯＣＴＯＰＵＳで１４日間維持したものと比較し、延長培養による寄与を検討した。培養プラットフォームに関係なく、免疫染色では絨毛上にトランスポーターの存在が明確に示されたが、これらの機能マーカーの発現はＯＣＴＯＰＵＳで著しく上昇した（図４Ａ、図４Ｂ）。装置で生成したオルガノイドでは、ＰＥＰＴ１は基底部側で検出可能な蛍光を発することなく、絨毛の頂端面に局在しており（図４Ｃ）、これは本来の腸上皮の刷子縁膜上での極性発現を彷彿とさせる。糖トランスポーターは、頂端面と基底部面の両方で検出され（図４Ｄ）、ＳＧＬＴ１（頂端面）とＧＬＵＴ２（基底部と頂端面）の空間分布をとらえている。

【0061】

さらに機能的な特徴を明らかにするために、ライブセルイメージング技術を用い、モデルで検出された腸管栄養トランスポーターの活性を制御することが示されている、細胞内カルシウムシグナルを可視化した。細胞内カルシウムのレベルを評価するために、オルガノイドを蛍光カルシウム指示色素（Ｆｌｕｏ－４）で標識し、その蛍光をリアルタイムでモニターした。オルガノイドは多細胞で複雑なため、解析のために選んだ代表的なオルガノイドから平均蛍光強度を測定した。１００μＭのＡＴＰで処理すると、装置内のオルガノイドは６０秒以内に約１．６倍の蛍光を発し、その後ベースラインレベルまで徐々に減少した（図４Ｅ）。同じ刺激に対する従来型の反応は、顕著に遅く、発生する程度も小さかった（図４Ｆ）。同様に、５０ｍＭ Ｄ－グルコースをより生理的な刺激物質として使用した場合、ＯＣＴＯＰＵＳでのオルガノイド培養は、同じ処理条件でのヒドロゲルドロップで観察されたよりもはるかに迅速かつ実質的な方法でカルシウム応答を示した（図４Ｇ、図４Ｈ）。これら２つのグループ間の比較により、より多くのオルガノイドの割合が、ＯＣＴＯＰＵＳにおいてＡＴＰおよびグルコースに反応することも明らかになった（図４Ｉ）。グルコース処理中に装置内で測定された細胞内カルシウムの増加は、ＡＴＰ刺激によって誘導されたものよりも大きいことが注目された（図４Ｅ、図４Ｇ）。

【0062】

結果は、腸のもう一つの重要な生理機能である腸管内腔の栄養素の増加に応じた消化器系ホルモンの分泌にも、細胞内カルシウムシグナルが重要な役割を果たしていることを示した。この証拠に基づき、開示されたオルガノイドモデルにおけるホルモン分泌を、機能成熟の指標として評価した。腸上皮の腸内分泌Ｌ細胞から分泌され、膵臓β細胞からのグルコース刺激インスリン放出を増強するインクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）のグルコース誘導放出を測定するために、馴化培地の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）が行われた。ＥＬＩＳＡ法により、培養した腸オルガノイドは、培地に含まれるグルコースに反応して、生物学的に活性なＧＬＰ－１を放出することが確認された。特に、３つの分析時点（５日目、７日目、および１０日目）すべてにおいて、ＯＣＴＯＰＵＳでは、従来のモデルで測定されたよりも有意に多量のホルモンが分泌されていた（図４Ｊ）。この２群間の差は、装置内のオルガノイドが発達および成熟を続けるにつれて強調され、培養１０日後のＯＣＴＯＰＵＳでは７倍を超える高濃度のＧＬＰ－１が生じた（図４Ｊ）。ホルモン分泌とは関係ないが、ＥＬＩＳＡ分析では、杯細胞から分泌され、上皮表面に保護粘液層を形成する腸特異的な糖タンパク質であるＭＵＣ２も検出された。ＭＵＣ２の分泌はＧＬＰ－１の分泌と同様の傾向を示し（図４Ｋ）、ＯＣＴＯＰＵＳが腸のバリア機能に中心的な役割を果たすこの分泌表現型の誘導と成熟を促進する能力を実証している。

【0063】

オルガノイドは、生体内に存在する多細胞の複雑性を再現する能力を備えているが、従来のオルガノイド培養では、本来の臓器の高次構造および機能を統合的に再現することは、依然として大きな課題となっている。この課題を解決するために、現在のオルガノイドモデルの細胞異質性を高め、細胞レベルの組織を超えて生物学的クロストークを再現し、組織間および多臓器間の相互作用をモデル化する新しい方法の開発に取り組んでいる。このような新しい研究成果に触発され、ＯＣＴＯＰＵＳを使用して、オルガノイドとその関連組織を３Ｄ培養で組み合わせた共培養モデルを作成する可能性が評価された。

【0064】

まず、ＯＣＴＯＰＵＳのデザインは、個別にアクセス可能な注入ポートを備えた一対の開放らせん型培養チャンバーを組み込むように設計されている（図５Ａ）。この構成では、チャンバーを異なる種類の細胞で満たし、同じ可溶性環境に維持される２つの並置された組織構築物を生成することができる。このアプローチを実証するために、マトリゲルに埋め込まれた血管内皮細胞と小腸オルガノイドの共培養を確立した（図５Ｂ）。この組織対は、腸管上皮とその下の間質における微小血管系を近似させるために選択された。この共培養条件は、幹細胞の自己組織化を妨げず、典型的な陰窩－絨毛の微細構造を持つ腸オルガノイドに成長させることができた（図５Ｂ）。このプロセスと同時に、もう一方のチャンバーの内皮細胞は、培養５日以内に、相互に連結した内皮管の３Ｄネットワークに自己組織化し（図５Ｂ）、発生過程における新生血管形成のプロセスを模倣した。得られた血管網と腸オルガノイドは、長期間（＞１０日）にわたって安定に維持された。

【0065】

デュアルチャンバー設計は、装置製作中に容易に変更でき、より多くの組織タイプに対応することができる。これは、チャンバーの数を増やして、腸オルガノイドと、腸の線維芽細胞と血管を含む２つの隣接する３Ｄ構築物からなる３培養システムを作成することで実証された（図３Ｃ）。ＯＣＴＯＰＵＳはまた、小腸オルガノイドと肝臓オルガノイドの共培養に見られるように、複数の臓器を表現するために２つ以上の異なるタイプのオルガノイドを単一の装置に組み込むことを可能にした（図５Ｄ）。これらのオルガノイドの共培養に最適化された共通の可溶性環境において、２つの別々の区画に播種された幹細胞は、単一培養と同じ時間軸でそれぞれの臓器様構築物を形成した（図５Ｄ）。この装置は、生存率と構造的完全性を損なうことなく、このオルガノイドペアの２週間にわたる長期培養を、サポートした。

【0066】

重要なことは、共培養モデルを解析した結果、オルガノイドの発生に非実質組織が大きく影響することがわかったことである。例えば、小腸オルガノイドと初代腸線維芽細胞との共培養を確立した場合（図５Ｅ）、このシステムにおけるオルガノイドの平均サイズは、単一培養でのサイズよりも大きかった（図５Ｆ）。この共培養オルガノイドは、単一培養のものと比較して、Ｈｎｆ４αの発現量が有意に上昇（１．５倍）しており（図５Ｇ）、腸オルガノイドの成長と成熟に、上皮－間質相互作用を再現することの有益性を示している。

【0067】

複雑な疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングがオルガノイド研究の主要な焦点として浮上していることを認識し、この活発な研究分野へのＯＣＴＯＰＵＳの応用の可能性を評価した。開示されたシステムの長期培養能力を利用する目的で、寿命が限られているため従来のオルガノイドモデルでは容易に再現できない長期の疾患プロセスによって引き起こされる病態生理学的状態の代表例として、モデル腸線維症が確立された。線維症は、炎症性腸疾患や消化管がんなどの腸疾患の合併症としてよく知られている。腸が本来持っている、傷を修復し、恒常性を回復する能力は、慢性炎症などの持続的な障害による反復的な上皮傷害によって損なわれることがある。創傷治癒の調節不全は、線維芽細胞の活性化とＥＣＭの過剰な沈着を特徴とする上皮下組織の異常なリモデリングを引き起こす可能性がある。このような腸の線維化組織のリモデリングの顕著な特徴を再現できるオルガノイドベースの高度なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築することが目的の一つであった。

【0068】

この目的のために、ＯＣＴＯＰＵＳを用いて、腸オルガノイドと初代腸線維芽細胞を同じヒドロゲルスキャフォールドで共培養し、腸上皮とその下の間質を思わせる多細胞構造体をｉｎ ｖｉｖｏで作製した（図６Ａ）。この混合共培養では、マトリゲルに埋め込まれた腸管前駆細胞が５日ほどでオルガノイドに発達し、その間に線維芽細胞が初期オルガノイドの周囲に広がって増殖し始めた。線維芽細胞は活発に増殖しているが、オルガノイドの成長を妨げるようなことはなく、オルガノイドの形態的特徴に重大な変化をもたらすこともなかった（図６Ｂ）。この装置で長期間培養すると、拡大したオルガノイドと線維芽細胞が密集した微小組織が形成された（図６Ｃ）。

【0069】

このシステムを用いて、通常の実験室設定で腸線維症を評価するシナリオをシミュレートするために、線維化のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングに広く用いられている一般的な技術である、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－βで共培養構築物を処理する方法を用いた。ＴＧＦ－βは、線維化を促進する重要なエフェクター細胞である線維芽細胞の活性化と筋線維芽細胞への分化を誘導することにより、腸をはじめとする臓器の線維化の病態に中心的な役割を果たす。線維形成反応を誘発するために、モデルを５日目から１２日目まで１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βで処理した。この条件に腸の微小組織を曝露すると、α－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の強力な発現によって証明されるように、確かに線維芽細胞は筋線維芽細胞の収縮表現型を獲得した（図６Ｄ）。未処理の組織と比較して、発現レベルは、８日目および１２日目までにそれぞれ１．９倍および２．９倍を超えて増加した（図６Ｅ）。また、ＴＧＦ－β処理は線維芽細胞の増殖を促進し、未処理の対照群と比較して、１２日目までに約２倍の細胞を生成した（図６Ｆ）。注目すべきことに、繊維芽細胞におけるこれらのＴＧＦ－β誘発変化は、腸オルガノイドがモデルから除去されるとかなり減少し（図６Ｅ～図６Ｇ）、繊維形成反応に対する上皮の有意な寄与を示唆した。

【0070】

このモデルはまた、線維化組織のリモデリングに不可欠なＥＣＭ沈着の研究を可能にした。この解析では、代表的なＥＣＭタンパク質としてフィブロネクチン（ＦＮ）に注目した。

【0071】

同じ処理期間中（５日目～１２日目）、免疫染色は、ＴＧＦ－βによる刺激が、未処理の組織と比較して、線維芽細胞の細胞周囲領域におけるＦＮを大幅に増加させることを示した（図６Ｈ）。この２群間の差は、処置の３日以内に明らかになり、培養期間を通じて統計的に有意なままであった（図６Ｉ）。免疫蛍光法によって示されたＦＮのこの増加した沈着は、ＴＧＦ－βで処理した腸組織においてより高いレベルの放出ＦＮを明らかにした馴化培地のＥＬＩＳＡによって検証された（図６Ｊ）。線維芽細胞の活性化および増殖の分析（図６Ｅ、図６Ｆ）と一致して、共培養モデルと単一培養モデルの比較から、腸オルガノイドはＴＧＦ－βの線維化効果を増強し、線維芽細胞によるＦＮ生成を促進する（図６Ｉ、図６Ｊ）ことが確認された。

【0072】

モデルの線維化表現型をさらに検証するために、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて、ＴＧＦ－β処理した微小組織の剛性を測定した。この測定は、ＯＣＴＯＰＵＳの開口型頂部設計により、ＡＦＭプローブが培養チャンバー内の組織構築物に直接アクセスできるため、非常に容易となった（図６Ｋ）。ＯＣＴＯＰＵＳで形成したブランクのマトリゲルスキャフォールドを試験したところ、剛性は約４４０Ｐａであったが、同じタイプのマトリックスで腸オルガノイドと線維芽細胞を１４日間共培養すると、測定値が３．５ｋＰａに上昇し、これはｉｎ ｖｉｖｏでの健康な腸組織の剛性と同等だった（図６Ｋ）。予想通り、このモデルをＴＧＦ－β１で処理すると、組織の硬化の程度が著しく増加し、未処理の装置よりも２．９倍硬い共培養構築物が生成された（図６Ｋ）。興味深いことに、この場合の平均組織剛性（１０．１ｋＰａ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで測定された線維化腸組織の生理学的範囲内であった（図６Ｋ）。これらの結果を総合すると、ＯＣＴＯＰＵＳでオルガノイドの微小環境をエンジニアリングして、腸線維症発症中のマトリックスのリモデリングと硬化の進行過程を模倣することが可能であることが示された。

【0073】

腸線維症モデルの薬剤試験用途への有用性が検証された。現在、腸線維症に対する特異的な治療法はないことから、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療薬として承認されているピルフェニドンとニンテダニブという２つの抗線維化薬を使用した。これらの薬剤は肺の線維化を対象として開発されたが、心臓、腎臓、肝臓、皮膚など他の臓器の線維化経路の活性を変調させることができる。これらの知見から、この化合物が腸線維症に対しても同様の治療効果を示すかどうかが検討された。このモデルでは、線維芽細胞の活性化と過剰なＥＣＭの沈着という線維化表現型を逆転させる薬剤の可能性が評価された。

【0074】

まず、５日間かけて共培養オルガノイドを形成し、上記のようにさらに７日間ＴＧＦ－βに曝露することにより、ＯＣＴＯＰＵＳにおける線維化腸組織構築物を作製した（５日～１２日）。次に、これらの構築物を、生存率評価によって特定された治療ウィンドウ内で、臨床的に関連する濃度の薬剤で４８時間（１３日目～１４日目）処理した（データは示さず）。対照群では、線維化組織は４８時間の間、薬物処理を受けなかった。０．１ｍＭのピルフェニドンは、未処理の対照と比較してαＳＭＡの５０％減少によって示されるように、線維芽細胞の収縮表現型を変化させるのに有効であった（図６Ｌ～図６Ｏ）。αＳＭＡの発現は、用量が０．５ｍＭに増加したときにさらに減少した（図６Ｌ～図６Ｏ）。ＥＣＭリモデリングに対するピルフェニドンの効果は、薬物処理した線維化構築物におけるＦＮの免疫蛍光の有意な減少から明らかであった（図６Ｌ～６Ｐ）。この結果と一致して、ＥＬＩＳＡ分析は、ピルフェニドンがモデルから放出されたＦＮの量も減少させたことを示した（図６Ｑ）。重要なことは、高用量（０．５ｍＭ）処理後のαＳＭＡ発現およびＦＮ産生のレベルは、健康な腸組織を表す正常群での測定値と統計的に区別がつかなかったことであり（図６Ｏ～６Ｑ）、モデルにおけるＴＧＦ－β誘導線維化を逆転し正常表現型を救済するピルフェニドンの能力を実証した。

【0075】

ニンテダニブの場合、低用量（０．１ｐＭ）では線維化モデルに対して有意な効果を発揮しなかった（図６Ｍ～図６Ｑ）。しかし、薬物濃度を０．５ｐＭまで上げると、線維芽細胞の活性化およびＦＮの蓄積はともに大幅に減少し、ピルフェニドンを０．５ｍＭで投与した場合と同等のレベルになった（図６Ｌ～６Ｑ）。この場合、放出されたＦＮの濃度の同時減少（図６Ｑ）は観察されず、組織内のαＳＭＡおよびＦＮ沈着がニンテダニブの治療効果のより良い指標であることが示唆された。

【0076】

免疫蛍光分析の結果と一致して、ＡＦＭデータはピルフェニドンとニンテダニブの抗線維化効果を用量依存的に実証した（図６Ｒ）。両薬剤とも、高用量で投与した場合、ＴＧＦ－β処理した線維化組織の剛性を有意に減少させたが、組織の軟化の程度が大きいことからわかるように、ピルフェニドンはより顕著な効果を有するように見えた（図６Ｒ）。０．５ｍＭのピルフェニドンで処理した線維症モデルで測定した平均剛性（３．５ｋＰａ）は、正常組織構築物（３．３ｋＰａ）とほぼ一致し、モデル系における線維症腸管組織の機械特性を正常化するピルフェニドンの可能性を示している。

【0077】

オルガノイド研究のための新しい技術の必要性が高まる中、ここでは、従来のオルガノイド培養の３次元性を再構成するマイクロエンジニアリングのプラットフォームを確立した。本論文で紹介するＯＣＴＯＰＵＳは、３次元培養に特有の栄養供給の制限という問題に対処し、オルガノイドの長期培養に有益な、より均一で制限のない可溶性環境を設計する、シンプルかつ効果的な手段を提供する。モデル系で実証されたように、オルガノイドの寿命が延びたことで、従来の技術では達成できなかったサイズと成熟度が大幅に向上し、器官形成や疾患発症のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして、よりリアルな多細胞構築物の作製が可能となった。

【0078】

従来のヒドロゲルドロップスキャフォールド内のオルガノイドは、毎週、長期間にわたって継代培養することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの寿命を延ばすことができる。継代培養中に機械的に破壊されたオルガノイドは、それ自体を迅速に密閉し、元の構造および機能特性を回復する能力を持つ。腸オルガノイドの１年以上の長期培養で実証されたように、この方法はオルガノイドを拡大し、その分化した表現型を長期間維持するのに有効であることが証明されている。しかし、従来の培養プロトコルで必要とされる頻繁な継代（通常５～７日ごと）が、オルガノイドの持続的な発達と成熟のプロセスを阻害するため、この場合のオルガノイドの寿命の延長は、必ずしも組織の成熟度の向上につながるわけではない。ＯＣＴＯＰＵＳは、この問題を解決し、オルガノイドの連続培養を大幅に長期間（＞３倍）継続することを可能にした。

【0079】

長期間の連続培養に対応できることがＯＣＴＯＰＵＳの主な利点であるが、このデータから、このシステムにおけるオルガノイド開発の望ましい他の特徴も明らかになった。例えば、培養７日後、構造的および機能的成熟の測定されたほぼすべてのマーカーは、ＯＣＴＯＰＵＳで生成されたオルガノイドにおいて有意に高いレベルで発現していた（図３）。これらの結果は、ＯＣＴＯＰＵＳが、発生の初期段階におけるオルガノイドの成長と成熟を促進することも可能であることを示唆している。これは、可溶性シグナルが装置内でより迅速かつ均一に拡散することで、ＯＣＴＯＰＵＳが初期オルガノイドの急速に増加する代謝ニーズに、より効果的に対応できるようになったためと推測される。

【0080】

また、これらの機能を活用することで、ＯＣＴＯＰＵＳにおいて、腸線維症の発症に伴う線維形成異常の特徴をシミュレートできる特殊なオルガノイドモデルを開発することが可能であることも実証された。開示された課題は、共培養オルガノイド構築物を作成し、それらを線維化因子に曝露するという連続的なプロセスを必要とし、これは通常の培養におけるオルガノイドの典型的な寿命をはるかに超える期間（１２～１４日）にわたって行われたものである。実際、５日目以降にマトリゲルの滴下でオルガノイドの生存率が急速に低下したため、ＴＧＦ－βに対する線維化反応のモデル化は不可能ではないにしても困難であった（データ示さず）。この反応はＯＣＴＯＰＵＳでの連続培養８日後に初めて起こり始め、時間の経過とともにより顕著になっていった（図６Ｅ、図６Ｆ）。その単純さにもかかわらず、線維化モデルはｉｎ ｖｉｖｏで測定された組織硬化の程度に近似しており、線維化組織のリモデリングにおける腸管上皮の重要な役割を明らかにした。さらに、この疾患モデルを薬物試験プラットフォームとして利用するための原理原則が示された。使用されたピルフェニドンとニンテダニブの抗線維化作用は、他の臓器ですでに確立されているが、今回の結果は、腸線維症に使用を拡大する可能性を支持するｉｎ ｖｉｔｒｏの証拠を提供する。また、マイクロフルオロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＡＦＭなど、薬物反応をその場で測定するための様々な分析技術の使用によって示されるように、このモデルがハイコンテント薬物スクリーニングに応用できる可能性を強調することも重要である。繊維症の基礎となる病態生理学的プロセスは臓器全体で保存されていることを考慮すると、同じ装置とｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、他の臓器における線維性疾患とその薬理学的調節のモデリングに適用可能である。

【0081】

ＯＣＴＯＰＵＳは、従来のオルガノイドモデルの設計を大きく変えるものであるが、このシステムの導入には、既存の培養プロトコルやワークフローを変更する必要はなく、特殊な機器や人材に依存することもない。この利点に不可欠なのは、ＯＣＴＯＰＵＳが、標準的なウェルプレートや実験室のインフラと直接互換性があり、すぐに使えて簡単にアクセスできる培養インサートとしてデザインされていることである。腸のモデルに代表されるように、ＯＣＴＯＰＵＳで成熟したオルガノイドを作製することは、従来の技術で一般的に使用されている材料や実験手順に基づいて、従来の実験室環境で容易に達成することができる。これは、ＯＣＴＯＰＵＳを即座に展開でき、容易に利用できる培養プラットフォームとする本方法の重要な側面であり、本技術を広く普及させることに貢献することができる。

【0082】

以上の実証は、さらなる研究のための新たな道を開くいくつかの基本的な疑問を投げかけるものであった。その中でも、どのような設計パラメータがＯＣＴＯＰＵＳ内のオルガノイドの長期的な発達に重要な役割を果たすかということである。長期培養中、装置内の腸オルガノイドは図２Ｆに示すように成長を続け、最終的には培養チャンバーの表面に接触した（図１０）が、その後、横方向へのさらなる拡大は壁によって物理的に制限された。この観察から、ＯＣＴＯＰＵＳでオルガノイドを持続的に成長させるためには、培養チャンバーの大きさが重要であることが示唆される。チャンバーの形状は装置製作時に容易に調整可能であるため、拡大した培養アレイにおけるオルガノイドの発生パターンを評価し、チャンバーのサイズと形状を最適化することで、物理的にも生化学的にも制限のない３Ｄ培養環境を構築することを目指すことができる。

【0083】

おそらく、より重要な問題は、継代が必要になるまでに、このシステムがどの程度の期間、オルガノイドの継続的な増殖と成熟をサポートできるかということであろう。装置内の多くの腸オルガノイドは、４週間の培養後に成長を停止した（データは示さず）。この結果は、現在のＯＣＴＯＰＵＳの設計では、小腸オルガノイドの連続培養の最大期間として保守的に考えることができるものである。この結果は、オルガノイドの成長の停止は、上述の培養チャンバーの物理的制約によるものなのか、という疑問を抱かせる。別の説明は、上皮の代謝回転の自然な過程で上皮から剥がれ落ちた死細胞が、閉じた境界腔に蓄積することで、オルガノイドに有害な影響を及ぼす可能性があるというものであり、これは同じタイプのオルガノイドで以前に報告されている。オルガノイドがある限界を超えて成長すると、現在の構成のシステムが最大限の能力を発揮し、肥大化したオルガノイドの代謝要求に応えられなくなるということもあり得る。以上のように、サイズや形状の異なる培養チャンバーでのオルガノイドの発達を分析することで、このような疑問を解決することができる。ＯＣＴＯＰＵＳの外部環境は、オルガノイドの培養スキャフォールドでの拡散を促進するように改変することができる。例えば、拡散速度を高める簡単な戦略として、オービタルシェーカーを使用して培地を撹拌し、ＯＣＴＯＰＵＳを含む培養ウェルに対流を発生させることで、オルガノイドモデルの寿命をさらに向上させることに貢献することができる。

【0084】

最後に、オルガノイドモデルで天然の臓器の成熟度を再現するには、ここで実証された栄養供給および細胞生存率の向上だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏシステムの統合的な生物学的複雑性を考慮した高度なアプローチが必要である。この評価は、オルガノイドの寿命が短いことが、後期発生段階に到達して成熟した表現型を獲得する能力が限られている主な理由であるという根拠に基づいている。しかし、発生生物学の観点からは、従来のモデルにおけるオルガノイドの成熟度が限られているのは、臓器の発生と成熟のプロセスを導くための指導的な手がかりとなる、生体内の発生臓器の周辺胚組織が存在しないためであるという認識が広まりつつある。このような臓器形成の重要な側面をｉｎ ｖｉｖｏで再現することで、ＯＣＴＯＰＵＳが臓器の構造的および機能的成熟を促進する能力を大きく向上させることができる。共培養オルガノイドモデルからの結果（図５）は、このアプローチの実現可能性と潜在的な利点を実際に示している。関連する線維芽細胞とともに培養した腸オルガノイドは、単一培養対照と比較して、著しく成長および成熟が促進されている（図５Ｆ、図５Ｇ）。予備的ではあるが、これらの知見は、ＯＣＴＯＰＵＳでより成熟したリアルなオルガノイド構築物を開発するための補完的な戦略として、本来の臓器における特殊組織の収集とそれらの生物学的相互作用を模倣することが可能かどうかについて、さらなる検討を要する。

【0085】

オルガノイドの実験室での生産と維持のための新しいｉｎ ｖｉｔｒｏ技術の開発は、オルガノイド研究の主要な調査分野として浮上している。この新しい流れを代表するように、本研究は、従来のオルガノイド培養の合理的な設計工学が、オルガノイドがｉｎ ｖｉｖｏの対応物の構造や機能の複雑さを模倣する能力を向上させることを示す好例となる。従来のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術に工学的な新しさをシームレスに統合することで、この技術は、現在のオルガノイドモデルの能力を拡張するためにすぐに実行できる、シンプルで実用的な３Ｄ培養戦略を提供する。ＯＣＴＯＰＵＳは、オルガノイド技術に大きな影響を与える可能性があり、また、３Ｄ環境での細胞や組織の培養を伴う他の様々な適用に強力なプラットフォームを提供することができる。

【0086】

図１１Ａから図１１Ｃは、ヒトのオルガノイドをＯＣＴＯＰＵＳで長期間培養できることを示す。例えば、ヒト腸オルガノイドは、ＯＣＴＯＰＵＳ中で１４日を超えて培養することができ（図１１Ａ）、１日目のオルガノイド（図１１Ｂ）と比較して、より大きく、より分化した組織表現型が得られる。ヒトオルガノイドは、３Ｄ微小環境で内皮細胞と共培養することにより、血管新生され得る（図１１Ｃ）。

【0087】

ヒトのオルガノイドモデルについては、後ほど詳しく説明する。

【0088】

マウスオルガノイドを用いたＯＣＴＯＰＵＳの概念実証を行った後、本技術のヒト腸オルガノイドへの適用可能性を検討した。この目的のため、健康なドナーの小腸（回腸末端）から分離した単一細胞懸濁液を培養し、開示した装置とマトリゲルドロップにおいて、その自己組織化と上皮分化を検討した（図１２Ａ）。培養開始から最初の５日間は、いずれの方法でも細胞生存率の高い球状のオルガノイドの形成が認められたが（図１２Ａ、図１２Ｄ）、ＯＣＴＯＰＵＳの方が著しく大きいことがわかった（図１２Ａ、図１２Ｅ）。培養が進むにつれて、開示された装置の嚢胞性オルガノイドは、測定可能な細胞死を伴わずに成長を続け、周囲のマトリックスに上皮の襞を伸ばす出芽構造への形態的変化を遂げた（図１２Ｂ～図１２Ｄ）。この発生過程は、マトリゲルドロップでは観察されず、１４日間にわたる長期培養により、芽形成の証拠なしで成長が停止し、細胞生存率が５０％を超えて低下した（図１２Ｂ～図１２Ｅ）。これらの顕微鏡的所見は、７日目にＯＣＴＯＰＵＳエンテロイドに芽様構造の存在を示す組織学的分析によって裏付けられ（図１２Ｆ）、延長培養中に数と長さの両方で増加し続けた（図１２Ｇ～図１２Ｉ）。対照的に、マトリゲルドロップ中の腸オルガノイドは、かなり少ない、より小さな芽を発達させ（図１２Ｆ～図１２Ｉ）、培養期間中ほとんど球形のままであった。重要なことは、ＯＣＴＯＰＵＳで継代なしでの１ヶ月にわたる継続的で中断のない培養は、サイズ３２倍を超える増加をもたらし、直径２．６ｍｍもの大きさの広範な上皮の折り畳みを有するヒトエンテロイドが得られた（図１２Ｊ）。

【0089】

培養された構築物の詳細な検査により、発達中のオルガノイド内に、異なる細胞集団の存在とそれらの局所的な空間分布が確認された。例えば、陽性Ｋｉ６７免疫染色によって同定された増殖細胞は、主に陰窩領域に対応する芽の先端で見られた（図１２Ｋ）。この観察は細胞周期のＧ１／Ｓ転移を媒介するタンパク質である、Ｋｉ６７（図１２Ｉ）およびＣｙｃｌｉｎＤ１（図１２Ｑ）をコードする遺伝子のＲＴ－ＰＣＲ分析によって検証された。オルガノイドは、分化した吸収性腸細胞のマーカー（ＫＲＴ２０）を発現する細胞も含んでいた（図１２Ｍ）。注目すべき重要なことは、免疫蛍光とｍＲＮＡ発現の両方によって示されるように、ＯＣＴＯＰＵＳ培養におけるＫＲＴ２０発現は、マトリゲルドロップにおけるそれよりも有意に高かったことである（図１２Ｍ、図１２Ｎ）。開示された装置の分析により、長期の培養中に上皮の発達と成熟が持続することに起因する、７日目から１４日目にかけてＫＲＴ２０の誘導が増加することも明らかになった（図１２Ｍ、図１２Ｎ）。この増加は、同期間におけるＫｉ６７およびＣｙｃｌｉｎＤ１の発現の減少を伴っており（図１２Ｌ、図１２Ｑ）、腸上皮の分化が進んだことによる細胞増殖の減少が示唆された。 この逆関係は、マトリゲルドロップでは観察されず、この場合、細胞分化と増殖の両方が経時的に減少した（図１２Ｌ、図１２Ｎ、図１２Ｑ）。

【0090】

ＯＣＴＯＰＵＳにおけるエンテロイドの上皮成熟の促進は、杯細胞特異的マーカー（ＭＵＣ２）の誘導における同様の傾向によってさらに証明された（図１２Ｏ、図１２Ｐ）。これらの結果は、ＯＣＴＯＰＵＳを用いたヒト腸オルガノイドの作製が可能であることを示し、従来のマトリゲルドロップ培養では達成できなかったサイズと組織成熟を達成するために、その持続的な発達を支持するものである。

【0091】

ヒト腸幹細胞は、オルガノイドの発生過程で様々な細胞種を生み出す内在的な能力を持つことを認識し、ＯＣＴＯＰＵＳにおけるヒトエンテロイドの細胞異質性を調べるためにｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。この研究のために、７日目と１４日目に開示した装置からエンテロイドを採取し、その単一細胞の転写プロファイルを、マトリゲルドロップで７日間培養したものと比較して調べた。１４日間のマトリゲルドロップ培養からの配列データは、このグループで観察された著しい細胞死による交絡因子を避けるために解析から除外した（図１２Ｄ）。

【0092】

７日目のＯＣＴＯＰＵＳから得られた配列データを均一多様体近似投影（ＵＭＡＰ）クラスタリングしたところ、３つの広義の細胞群、すなわち、吸収細胞、分泌細胞および幹細胞が得られ、それぞれの細胞群には、ヒト小腸のこれまでのｉｎ ｖｉｖｏ研究で報告されている細胞型特異的遺伝子の発現によって明確に識別される複数のサブ集団が含まれていた（図１３Ａ）。具体的には、吸収性細胞群は、吸収性腸細胞、腸細胞前駆細胞、ベストロフィン－４（ＢＥＳＴ４）陽性腸細胞、吸収性通過増幅（ＴＡ）細胞、およびＭ細胞を含む５つの転写的に異なる細胞タイプで構成されていた（図１３Ａ）。この群の吸収性腸細胞クラスターは、例えば、ケラチン２０（ＫＲＴ２０）、脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）、がん胎児性抗原関連細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）など、腸上皮の吸収機能を制御することが知られている腸細胞特異的転写物の高発現によって定義された（図１３Ｂ、図１３Ｋ）。分泌細胞群は６つのクラスターを含み（図１３Ａ）、そのうちの１つは、シスタチンＣ（ＣＳＴ３）、トレフォイル因子３（ＴＦＦ３）、およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１４（Ｓ１００Ａ１４）の発現によって識別される杯細胞を表す（図１３Ｃ、図１３Ｌ）。幹細胞のクラスター化は、アキタテ－スキュー複合体ホモログ２（ＡＳＣＬ２）、エフリンタイプＢ受容体２（ＥＰＨＢ２）、およびＳＰＡＲＣ関連モジュラーカルシウム結合２（ＳＭＯＣ２）を含む腸幹細胞マーカーの発現に基づいた（図１３Ｄ、図１３Ｍ）。

【0093】

重要なことは、配列決定の結果、ＯＣＴＯＰＵＳに独自に存在する細胞集団が明らかになったことである。そのような細胞タイプの好例は、ＢＥＳＴ４を発現する吸収性細胞集団のサブセット（ＢＥＳＴ４＋腸細胞）（図１３Ａ）であり、宿主－マイクロバイオームの相互作用およびイオン輸送など腸の様々な恒常性維持機能において重要な役割を担っている。この特殊な細胞タイプは、マトリゲルドロップ培養によって生成されたヒトエンテロイドには見出されなかった（図１３Ｅ）。アポリポタンパク質（ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＡ１、ＡＬＰＩ、およびＡＰＯＢ）の発現によって識別される脂質吸収性腸細胞は、開示された装置培養によって生成される吸収性腸細胞の別の部分集団（図１３Ｎ）であり、マトリゲルドロップ（図１３Ｅ）には存在しない。これら２つのシステムにおける細胞クラスターの比較も、ＯＣＴＯＰＵＳにおける吸収性細胞系列の実質的に高い存在度を示した（図１３Ａ、図１３Ｅ）。ＯＣＴＯＰＵＳ群で培養期間を７日から１４日に延長しても、同定された細胞集団の空間分布はほとんど変化しなかった（図１３Ｆ）。しかし、多くのクラスターは、その密度が顕著に変化しており、長期間の培養中に細胞の存在量が変化したことが示された。

【0094】

これらの変化をさらに検討し、天然系との関連性を理解するために、ＯＣＴＯＰＵＳにおけるエンテロイドの細胞構成を、以前に発表されたｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト腸管上皮の単一細胞アトラスと比較して分析した。この解析の結果、本明細書でテストした培養条件の間で、上皮組成にいくつかの違いがあることを示した。第一に、ＯＣＴＯＰＵＳでの長期培養は、総集団における幹細胞の割合が７日目の７．４％から１４日目までに１２．３％に増加したことから明らかなように、マトリゲルドロップ培養で達成可能なものをはるかに超えた幹細胞の濃縮をもたらし、ｉｎ ｖｉｖｏの腸幹細胞の割合（１４％）に非常に近似した（図１３Ｇ）。第二に、ＯＣＴＯＰＵＳは、７日目から１４日目にかけて、吸収細胞集団における腸細胞系譜（吸収性腸細胞、ＢＥＳＴ４＋腸細胞、腸細胞前駆細胞）の拡大を認め（図１３Ｇ）、これはマトリゲルドロップにおけるこれらの細胞の割合が小さいか無視できるのと対照的である。その結果、腸球前駆細胞は、培養１４日後に生理学的レベルの存在量に到達し、それを超えた。しかし、拡大にもかかわらず、吸収性腸細胞およびＢＥＳＴ４＋腸細胞の割合は、ｉｎ ｖｉｖｏアトラスで報告された割合よりも依然として著しく低かった。第三に、分泌細胞群の部分集団は、７日目から１４日目にかけて、ＯＣＴＯＰＵＳで存在量が減少する一般的傾向を示した（図１３Ｇ）。このグループの大部分の細胞タイプについて、１４日目におけるそれらの割合は、マトリゲルドロップにおける割合よりもかなり小さいが、存在量が少ないため、ｉｎ ｖｉｖｏにおける分泌上皮の細胞組成をよりよく近似させることができた。例えば、１４日目のＯＣＴＯＰＵＳにおける杯細胞の割合（２．５６％）は、マトリゲルドロップで測定されたもの（１９．６３％）よりもはるかにｉｎ ｖｉｖｏのもの（５％）と同等であった。

【0095】

また、配列データから、上皮成熟の転写制御における時間やプラットフォームに依存した重要な差異が明らかになった。中でも、ＯＣＴＯＰＵＳでの長期培養の結果、成熟腸細胞に特異的な遺伝子の発現が有意に増加することが明らかになった。これらの遺伝子には、ｉ） 吸収性腸細胞のＦＡＢＰ１、ＰＨＧＲ１、ＰＲＡＰ１、およびＳＬＣ６Ａ８（図１３Ｈ、図１３Ｏ）、およびｉｉ）ＢＥＳＴ４＋腸細胞で発現するＬＧＡＬＳ３およびＭＴ１Ｘ（図１３Ｈ、図１３Ｐ）があった。長期培養の同様の促進効果は、杯細胞特異的遺伝子（ＴＦＦ３、ＣＡ９、およびＳ１００Ａ１４）（図１３Ｈ、図１３Ｑ）および腸内分泌細胞転写物（ＲＥＧ４、ＳＥＺ６Ｌ２）（図１３Ｒ）の発現によって示されるように、１４日目のＯＣＴＯＰＵＳにおける分泌細胞集団の成熟において観察された。

【0096】

興味深いことに、マトリゲルドロップ培養と比較して、ＯＣＴＯＰＵＳエンテロイドは、ＴＯＰ２Ａ、ＰＣＮＡ、ＭＴ１Ｅ、ＦＡＢＰ５といったＴＡ細胞の増殖能に関連する遺伝子の著しいダウンレギュレーションを示した（図１３Ｈ、図１３Ｓ）。この結果は、小腸のＴＡゾーンにおける細胞増殖が、腸の発達における組織の成熟度の上昇に伴って抑制されるというこれまでのｉｎ ｖｉｖｏの報告と一致し、ＯＣＴＯＰＵＳのオルガノイド成熟促進能をさらに裏付けるものであった。

【0097】

最後に、ＯＣＴＯＰＵＳにおけるヒトエンテロイドの発生過程における幹細胞分化の動的なプロセスをさらに特徴付けるために、Ｍｏｎｏｃｌｅを用いて単一細胞の軌跡解析を実施した。ＵＭＡＰプロット上に擬似時間で再構成すると、発生軌跡は、培養開始直後に吸収性細胞系と分泌性細胞系を表す二つの異なるドメインへの分岐を示した（図１３Ｉ）。この最初の系統決定の後、分泌細胞ドメインの幹細胞は分泌ＴＡ細胞へと進み、その後、分化軌道は周期的ＴＡと腸内分泌細胞ドメインへと分岐した（図１３Ｉの矢印Ｓ１）。同じ期間の擬似時間中に、ＵＭＡＰプロット上の別々のクラスターも、分泌性ＴＡ細胞から未成熟杯細胞、そして杯細胞への移行を示した（図１３Ｉの矢印Ｓ２）。吸収細胞ドメインにおける分化の軌跡を追跡すると、幹細胞から吸収性ＴＡ細胞、腸細胞前駆体へと発達が進み、その後、吸収性腸細胞およびＢＥＳＴ４＋腸細胞を生じた（図１３Ｉの矢印Ａ）。

【0098】

各細胞タイプの割合と組み合わせることで、発生軌跡は、ＯＣＴＯＰＵＳとマトリゲルドロップにおける幹細胞の分化をより定量的に特徴づけ、直接比較することができた（図１３Ｉ、図１３Ｊ）。従来のドロップ培養では、幹細胞の発生は分泌細胞系に大きく偏っており、分化した細胞の５４．７９％以上を占めていることがデータから示された（図１３Ｊ）。対照的に、ＯＣＴＯＰＵＳにおける幹細胞の分化は、より成熟した腸細胞に向けられ、エンテロイド内の腸細胞前駆細胞、吸収性腸細胞、およびＢＥＳＴ４＋腸細胞が著しく多く生成され、これらは合わせて上皮集団の３１．９４％以上を構成した（図１３Ｊ）。小腸の臓器別機能を担う最も多くの細胞タイプとしての腸細胞の役割を考えると、この比較は、より生理的な細胞組成と強化された機能能力を持つヒトエンテロイドをエンジニアリングするためのＯＣＴＯＰＵＳの利点を裏付ける証拠となる。

【0099】

オルガノイド研究において、複雑な疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングが活発な研究分野として浮上していることを認識し、ＯＣＴＯＰＵＳを使用して、より忠実で生理的関連性の高いオルガノイドベースの疾患モデルを構築する原理を実証することに取り組んだ。ヒトエンテロイドの研究をベースに、消化管の慢性炎症を特徴とする疾患群であるヒト炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のモデル化に焦点を当てた。

【0100】

ＩＢＤの一般的な理解は進んでいるものの、この複雑な疾患をモデル化することは依然として大きな課題である。ＩＢＤの研究は、ヒトのＩＢＤの表現型に近づけるために、遺伝的または外来的な操作を必要とする化学マウスやコンジェニックマウスモデルを用いることが多いようである。一方、ヒトの腸管組織を再現するために、初代細胞や形質転換細胞（例えばＣａｃｏ－２）の２Ｄおよび３Ｄ培養を行い、外部から炎症シグナルを与えることができる。このような簡便なシステムの限界を克服するために、腸オルガノイドを使用して、ＩＢＤの病態生理学的な複雑さをより忠実にモデル化する新しい取り組みが行われている。このような新しい研究成果に触発され、患者由来の腸オルガノイドをＯＣＴＯＰＵＳで長期培養し、ＩＢＤの機能不全腸上皮を彷彿とさせるヒト腸管を作製することの実現可能性を探った（図１４Ａ）。

【0101】

ＩＢＤ患者の小腸から分離した細胞懸濁液を開示した装置に播種したところ、７日間かけて自己組織化を行い、健康なドナー由来の正常なエンテロイドで観察されるものと同様の出芽構造を含むオルガノイドになった（図１４Ｂ）。しかし、組織学的な解析では、両群の間に大きな相違点があることが明らかになった。正常エンテロイドは、核が小さく基底部に位置し、先端ブラシ境界が顕著な、適切に偏光した上皮細胞を含んでいたが、ＩＢＤオルガノイドの一部の領域は、核が大きく中央に位置し、核／細胞質比が高い腸細胞を含んでおり（図１４Ｃ）、ＩＢＤ患者の腸管上皮の組織学的所見と一致していた。また、ＩＢＤ腸上皮は、成長が遅く（図１４Ｄ）、芽の形成が著しく少なく（図１４Ｅ）、ＩＢＤ腸上皮の絨毛形成能に欠陥があるというこれまでの報告と一致している。これらの形態的な違いに加えて、患者由来の腸管は、正常対照と比較して、増殖能の低下と細胞アポトーシスの増加（図１４Ｆ、図１４Ｇ）を示していた。また、これらのオルガノイドの絨毛ドメインは、タイトジャンクションの発現が低下または消失した細胞の大きなパッチを含んでいた（図１４Ｈ）。上皮の構造的完全性が損なわれているため、ＩＢＤ腸管は、４－ｋＤａフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－デキストランを用いた透過性アッセイによって測定したところ、バリア機能の低下を示した（図１４Ｉ、図１４Ｔ）。これらの結果は、開示されたモデルが、ＩＢＤにおける欠陥のある腸上皮の主要な特徴のいくつかを再現する能力を実証するものである。注目すべきは、ＩＢＤオルガノイドを生成し、従来のマトリゲルドロップで維持した場合、ＯＣＴＯＰＵＳで示される程度までこれらの疾患表現型を再現することができなかった（図１４Ｕ）。

【0102】

ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いたさらなる解析により、ＩＢＤエンテロイドの病態生理的状態を反映した有意な変化が示された。最も顕著な変化の一つは、正常なエンテロイドと比較して、成熟した腸細胞の割合がほぼ５０％減少したことである（図１４Ｊ、図１４Ｋ）。この所見は、炎症を起こした腸上皮における腸細胞集団の減少というｉｎ ｖｉｖｏでの報告とほぼ同じであり、ＩＢＤ患者で報告されている、幹細胞の腸細胞分化の調節不全および／または腸細胞のアポトーシスの増加を示すものであった。同様の変化は、ＴＡ細胞やＢＥＳＴ４＋腸細胞といった吸収性腸上皮細胞の他の主要なサブタイプでも認められた（図１４Ｊ、図１４Ｋ）。これらの結果は、分泌細胞集団の一部の拡大とは対照的であった。特に、パネート細胞の割合は、正常エンテロイドの０．３７％からＩＢＤモデルの７．２％に増加し（図１４Ｊ、図１４Ｋ）、これは、炎症および上皮損傷の結果として小腸の陰窩領域で生じるパネート細胞の拡大および再増殖と一致する。トランスクリプトームレベルでは、配列決定データにより、患者由来のエンテロイドにおいて、ＡＮＫＲＤ１、ＭＵＣ５Ｂ、ＢＳＴ２などのＩＢＤ関連遺伝子の発現が大幅に増加していることが明らかになった（図１４Ｌ、図１４Ｖ）。このモデルでは、上方制御された遺伝子には、転写因子ＳＯＸ１４および長鎖非コードＲＮＡ ＭＡＰ３Ｋ２０－ＡＳ１などのＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の主要な調節因子も含まれ（図１４Ｌ、図１４Ｖ）、これは炎症性疾患としてのＩＢＤの性質を模倣するオルガノイドの能力を反映している。重要なことは、これらの既知のＩＢＤ関連遺伝子に加えて、ＬＩＮＣ０２２５３、ＬＩＮＣ０１２１０、ＬＩＮＣ０２３０３、ＬＩＮＣ０２５７７およびＬＩＮＣ０２１５９など、ＩＢＤに関してこれまで報告されていない、いくつかの長い遺伝子間非タンパク質コード（ＬＩＮＣ）ＲＮＡ遺伝子も患者由来エンテロイドで発現が上昇することが判明した（図１４）。これらのマーカーの多くは、ＩＢＤオルガノイドに拡大するパネート細胞および他の分泌細胞タイプによって優位に発現された（図１４Ｎ）。興味深いことに、ＬＩＮＣ遺伝子の差次的な制御は、マトリゲルドロップ培養では見られなかった（図１４Ｗ）。また、ＩＢＤ関連遺伝子の上方制御は、マトリゲルドロップで培養した患者由来のエンテロイドで有意に少ない程度で起こった（図１４Ｘ）。

【0103】

ＯＣＴＯＰＵＳで作製したＩＢＤエンテロイドの病態生理的特徴を分子および細胞レベルで明らかにした上で、ＩＢＤの進行に伴って組織スケールで発症する腸の異常を再現する能力を検討した。本研究では、ＩＢＤの代表的な合併症である腸線維症に着目した。腸が本来持っている傷の修復や恒常性の回復能力は、ＩＢＤの慢性炎症による反復的な上皮傷害によって損なわれることがある。持続的な傷害は、腸管上皮とその下の間質との間の組織間相互作用を調節し、線維芽細胞の過剰増殖とＥＣＭの過剰沈着を特徴とする上皮下区画の異常リモデリングをもたらすことが研究で示されている。本研究の目的は、この病態生理学的な線維化過程の顕著な特徴を、開示されたＩＢＤオルガノイドモデルで再現できるかどうかを調べることであった。

【0104】

そこで、患者由来のＩＢＤエンテロイドを、同じヒドロゲルスキャフォールド内で初代ヒト腸線維芽細胞と共培養し、生体内の腸管上皮とその下の間質組織を思わせる多細胞構造体を作製した（図１４Ｏ）。この混合共培養構成で１４日間中断せずに培養すると、線維芽細胞が新生オルガノイドの周囲に広がって増殖し、最終的には線維芽細胞に囲まれた拡大オルガノイドが密集した微小組織を形成した（図１４Ｐ）。培養１４日後のＩＢＤ構築物の免疫染色では、線維芽細胞の細胞周囲に過剰なフィブロネクチン（ＦＮ）の沈着が認められた（図１４Ｑ）。細胞外ＦＮは正常エンテロイドの培養物にも存在したが、そのレベルは著しく低かった（図１４Ｑ、図１４Ｒ）。この違いは、ＩＢＤモデルにおいてより高濃度の放出ＦＮを示した馴化培地のＥＬＩＳＡ分析によってさらに裏付けられた（図１４Ｒ）。患者由来のエンテロイドはまた、１４日間の培養後、ＩＢＤモデルにおいてほぼ２倍の線維芽細胞によって証明されるように、線維芽細胞の増殖を促進した（図１４Ｒ）。

【0105】

これらの知見は、ＩＢＤ患者の小腸に関するこれまでのｉｎ ｖｉｖｏ研究で報告された線維化組織のリモデリングの一般的なパターンと一致する。また、我々のデータは、開示されたモデルにおける自然発生的な線維化は、ＩＢＤエンテロイドの病的な上皮によって引き起こされることを示唆している。これらの上皮細胞が作り出す可溶性の線維化促進微小環境を特徴づけるために、ＩＢＤの腸上皮が過剰発現するＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーで、間葉系細胞によるＥＣＭ合成を選択的に活性化するトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－β１の産出を測定した。予想通り、ＩＢＤモデルでは正常エンテロイドと比較してＴＧＦ－β１産生が有意に上昇した（図１４Ｓ）。また、ＩＢＤに伴う線維化において腸線維芽細胞を活性化することが示されているインターロイキン（ＩＬ）－６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αの分泌量にも同様の違いが認められた（図１４Ｓ）。これらの結果から、ＯＣＴＰＵＳで作製した患者由来の腸オルガノイドを、より忠実で生理的なＩＢＤのモデルを作製するための基礎として使用することが可能であることが示された。

【0106】

オルガノイド技術の急速な進歩に伴い、より複雑な臓器の構造や生理機能を再現できる高度なオルガノイドモデルへの要求が高まっている。その代表的な例として、オルガノイド培養に血管系を組み込むことが、オルガノイド技術の能力と可能性を高めるための継続的な研究努力の中で、ますます関心を集めている分野として浮上している。オルガノイドの血管新生は、生体の血管や実質的な機能への血管の寄与を模倣するために必要であるが、オルガノイドの成長と成熟を促進するために３Ｄ培養における栄養と酸素の供給を改善する有望な戦略であることも示唆されている。しかし、血管のあるオルガノイドを作製し、制御された方法で灌流するプロセスは非常に複雑で、しばしば専門的な技術や培養システムを必要とし、非エンジニアが容易にアクセスできるものではない。

【0107】

このような問題意識から、ＯＣＴＯＰＵＳのプロトタイプが開発され、血管のある灌流可能なヒトのオルガノイドを作製するための新しい機能を提供しながらも、元のプラットフォームの簡便性を維持することができた（図１５）。ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯ（血管新生オルガノイドのエンジニアリングのためのＯＣＴＯＰＵＳ）（ＯＣＴＯＰＵＳ ｆｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ）と名付けられたこのシステムは、従来のピペットを使って簡単にアクセスできる微細加工チャンバーのネットワークをＯＣＴＯＰＵＳ挿入部に組み込むことによって構築された（図１５Ａ、図１５Ｂ）。一実施形態では、装置は、チャンバーの両側にある２つのフロースルー・マイクロチャネルによって挟まれた開放型細胞培養チャンバーから構成されている。一例では、装置は、３ｍｍ（幅）Ｘ１ｍｍ（厚さ）の断面寸法を有する開放型細胞培養チャンバーが、チャンバーの両側に２つのフロースルー・マイクロチャネル（１ｍｍＸ１ｍｍ）によって挟まれて構成されている（図１５Ｂ）。サイドチャネルは、独立したアクセスポートを用いて個別にアドレス指定が可能であり、一対の微細加工されたステップによって細胞培養チャンバーから分離されている（図１５Ｂ）。脈管オルガノイドを生成するために、ＥＣＭヒドロゲル前駆体溶液に懸濁させた幹細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞の混合物を培養チャンバーに注入する（図１５Ｃ）。この過程で、注入された溶液を分割ステップでキャピラリーピニングすることにより、混合物を中央のレーンに物理的に閉じ込めることが可能になる（図１５Ｃ、ステップ１）。ゲル化して細胞を含むＥＣＭヒドロゲルスキャフォールドを形成した後、サイドチャネルに内皮細胞を播種して、チャネル表面に連続した内皮内層を形成する（図１５Ｃ、ステップ２）。培養中、ヒドロゲルスキャフォールド内の幹細胞はオルガノイドに成長し、同じゲル内に埋め込まれた内皮細胞は、血管新生の発生過程を思わせる自己組織化を行い、成長中のオルガノイドを囲む相互接続した血管の３Ｄネットワークを形成する（図１５Ｃ、ステップ３）。これらの血管は側溝の内皮と吻合し、血管が発達したオルガノイド構築物は側溝から直接アクセスでき、灌流可能な状態になる（図１５Ｄ）。

【0108】

概念実証のために、ヒト腸管細胞、内皮細胞、線維芽細胞を含むフィブリンとマトリゲル前駆体の混合物を ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯに播種した。この共培養システムでは、培養開始から２～３日で幹細胞の腸管への急速な自己組織化をサポートした（図１５Ｅ）。血管の形成はより長い期間にわたって起こり、５～６日後に顕著になった（図１５Ｅ）。腸オルガノイドは、１２日間の培養の過程で、脈管化ヒドロゲル中で成長し続け、その間、自己組織化された微小血管系は、構造的完全性の測定可能な損失なしに安定で、発達中の腸オルガノイドと密接に関連したままであった（図１５Ｅ）。重要なことは、血管新生されたオルガノイド構築物全体が灌流可能であったことで、１μｍの蛍光マイクロビーズが脈管ネットワークを通ってスキャフォールド全体にかかる圧力勾配の方向に流れることが示された（図１５Ｆ）。もう一つの発見は、ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯの脈管で灌流された腸管が、同じ培養期間中にＯＣＴＯＰＵＳの脈管でない腸管よりも２倍以上大きく成長し（図１５Ｇ）、オルガノイド成長に対する灌流性脈管の有益な効果を示している。

【0109】

ＩＢＤエンテロイドの実証（図１４）に基づき、ＥＶＯプラットフォームを活用して患者由来オルガノイドを血管化し、血管異常や血管系が介在するＩＢＤの他の疾患プロセスの研究に使用できる、より高度な疾患モデルを開発できるかどうかを検討した。患者由来の腸幹細胞と内皮細胞および線維芽細胞をＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯのフィブリン／マトリゲルスキャフォールドで１２日間培養すると、周囲の微小血管系に完全に包まれたＩＢＤエンテロイドが形成された（図１５Ｈ）。興味深いことに、このモデルの血管は、正常な腸管の周囲に形成されたものと比較して、著しく減少した密度と直径を示し（図１５Ｅ、図１５Ｉ）、ＩＢＤの慢性的に炎症を起こした腸の血管の特徴と一致していた。さらに、血管の大部分における内皮細胞は、正常群では観察されなかった細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１の強固な免疫染色で見られた（図１５Ｊ、図１５Ｏ）。この所見と一致して、ＩＢＤモデルから採取した血管灌流液のＥＬＩＳＡは、内皮活性化を誘発することが知られている主要な炎症性メディエーターのかなり増加した産生を明らかに示した（図１５Ｋ）。重要なことに、血管を拡張したＩＢＤエンテロイドにおけるこれらのサイトカインのほとんどのレベルは、非血管拡張ＩＢＤモデルにおけるレベルよりも有意に高いことが判明した（図１５Ｋ）。これは、オルガノイド構築物からの放出サイトカインの輸送の改善および／またはＩＢＤエンテロイドの炎症性環境に対する血管内皮細胞の寄与の可能性を示唆している。

【0110】

最後に、血管新生型ＩＢＤエンテロイドで内皮の活性化が観察されたことから、開示されたモデルの血管灌流性を利用して、ＩＢＤにおける血中免疫細胞の動員をシミュレートできるかどうかの研究が行われた。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＩＢＤ発症時の重要な免疫学的事象の一つとして、循環血中単球の腸管粘膜への動員数の著しい増加が立証されている。実際、ヒト末梢血単球を灌流した開示されたＩＢＤモデルは、エンテロイド関連血管、およびエンテロイド内腔に多数の細胞を示した（図１５Ｌ）。血管内の単球は、管腔内流れの存在下でも内皮内層にしっかりと付着したままであった（左パネル、図１５Ｍ）。このモデルを詳しく観察すると、これらの付着単球の一部が内皮を越えて血管周囲に移動していることがわかった（中央パネル、図１５Ｍ）。また、このモデルでは、単球が腸管上皮を通過してエンテロイドの内腔に移動する様子も捉えられている（右パネル、図１５Ｍ）。ｉｎ ｖｉｖｏでの単球の動員を連続的に再現するこのような複雑な現象は、健康なドナーに由来する血管新生エンテロイドに単球を注入した場合、はるかに少ない細胞で観察された（図１５Ａ）。

【0111】

このデータは、ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯの概念実証を提供し、従来のオルガノイド培養の機能を拡張できる、血管新生があり灌流可能なオルガノイドを作製するための利用しやすいｉｎ ｖｉｔｒｏプラットフォームとしての可能性を示している。

【0112】

オルガノイド研究のための新しい技術に対するニーズの高まりを受けて、本開示は、従来のオルガノイド培養の３次元性を再構成するマイクロエンジニアリング・プラットフォームについて説明するものである。ＯＣＴＯＰＵＳは、３Ｄ培養に特有の栄養供給量の制限という問題に対処するための、シンプルかつ効果的な手段を提供する。このシステムは、厚みを大幅に減らした開放型の３Ｄ培養スキャフォールドを制御して製造することで、成長するオルガノイドへの栄養と酸素の拡散の距離と空間的なばらつきを減らすことができる。従来のマトリゲルドロップ培養と比較して、オルガノイドの長期培養に有効な、より均一で制限のない可溶性微小環境を構築することが可能である。また、拡散の制限を大幅に減らすことで物質輸送特性が改善され、開示されたシステムの有効培養容積が減少する。これは、培養中に細胞がその環境を処理し制御する能力の逆数値である。その結果、ＯＣＴＯＰＵＳ内の幹細胞やオルガノイドは、発生中の局所的な微小環境に対してより良い制御を行うことができる。本明細書に記載されたデータは、ＯＣＴＯＰＵＳのこれらの望ましい特徴が、従来の技術で達成可能な以上にオルガノイドのサイズと成熟度を高め、器官形成と疾患発症のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル化に向けてよりリアルな多細胞構築物を製造できる可能性があることを示している。

【0113】

ＯＣＴＯＰＵＳは、オルガノイドの長時間無停止連続培養を可能にする。ヒトエンテロイドモデルのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑで示されるように、ＯＣＴＯＰＵＳを用いた中断のない培養期間を２倍にすることで、オルガノイドの腸管細胞の分化が大幅に促進され、マトリゲルドロップと比較して、機能的に成熟した腸細胞を大幅に含むより生理的な腸管上皮を生成することができた。

【0114】

長期間の連続培養に対応できることは、ＯＣＴＯＰＵＳの重要な利点であるが、本データは、開示したシステムにおけるオルガノイドの発達のさらに望ましい特徴を明らかにするものである。例えば、培養７日後、腸オルガノイドのサイズと上皮成熟のほぼすべてのマーカーの発現は、ＯＣＴＯＰＵＳで有意に大きくなった。ＳｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析により、従来のマトリゲルドロップで同じ時間培養したものと比較して、ＯＣＴＯＰＵＳ中のヒトエンテロイドは、本来の腸管上皮の細胞不均一性、ならびに分化した細胞タイプの相対量およびその生理的遺伝子発現プロファイルをより忠実に再現していることがさらに証明された。これらの結果は、ＯＣＴＯＰＵＳがオルガノイドの初期段階での成長と成熟を促進することができることを示唆している。

【0115】

これらの機能を活用することで、ＩＢＤの病的なヒト腸上皮の形態的、機能的、転写的特徴を再現できる特殊なオルガノイドモデルの開発が可能であることが示された。興味深いことに、このモデルで観察された病態生理学的変化の多くは、患者由来のオルガノイドのマトリゲルドロップ培養では起こらなかった。また、ＯＣＴＯＰＵＳ ＩＢＤモデルでは、いくつかの長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の発現が増加することが確認された。この発見は、ＩＢＤにおけるｌｎｃＲＮＡの生物学の新たな研究にとって重要な意味を持つかもしれない。上皮透過性、アポトーシス、炎症に関連するＩＢＤの主要な疾患プロセスを媒介するｌｎｃＲＮＡの積極的な関与を示唆する最近の証拠がある。このため、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＩＢＤに関与していないｌｎｃＲＮＡのセットを明らかにしている。ＬＩＮＣ０２１５９とＬＩＮＣ０２５７７は、これらの遺伝子の中で、大腸がん細胞の増殖を促進することにより腫瘍形成に関与することが示されている。ＬＩＮＣ０１２１０は、大腸がんや卵巣がんの細胞増殖や浸潤の制御因子として以前に報告された別のｌｎｃＲＮＡである。

【0116】

このモデルに腸線維芽細胞を含めることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腸線維症を再現することができる。外来性の線維化因子（ＴＧＦ－βなど）で処理することで生じるオルガノイドベースの線維症モデルのこれまでの実証とは異なり、開示された共培養システムは、ＩＢＤ患者の小腸に見られる異常マトリックスリモデリングの主要な特徴を再現するため、外部入力なしに自発的に線維症を生じさせた。この発見は、罹患または持続的に損傷した上皮が、上皮下コンパートメントのエフェクター細胞を活性化することができる病態生理学的臓器線維化のドライバーであるという一般的概念を支持するものである。このように、開示されたシステムは、腸における調節された線維形成異常のオルガノイドベースのメカニズム研究のためのシンプルかつ有効なプラットフォームを提供することができる。線維症の発症の基礎となる病態生理学的プロセスは臓器全体で保存されていることを考慮すると、同じ装置とオルガノイド培養技術は、他の臓器の線維性疾患の研究にも適用できる可能性がある。

【0117】

オルガノイドの血管新生の実証は、ＯＣＴＯＰＵＳの高度な能力と可能性を浮き彫りにしている。ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯは、同じ培養スキャフォールド内で器官形成と血管形成の同時かつ自然なプロセスを可能にし、血管－実質界面や生来の臓器のより複雑な生理反応を再現できる、血管があり灌流のできるヒト腸管を作り出すことができた。近年、脳、腎臓、肺、膵臓などの血管が豊富な臓器にオルガノイドをｉｎ ｖｉｖｏで移植するなどのオルガノイド血管形成技術が導入されているが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血管灌流を制御した構築物を生成することは大きな課題となっている。ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯは、この課題に取り組み、特殊なエンジニアリングシステムを必要とせず、従来の３Ｄ培養の利便性と簡便性でオルガノイドモデルの複雑性を向上させるアクセス可能な手段を提供する。このことは、オルガノイドの血管新生が、オルガノイドの成長を促進する有望な戦略であることを裏付けている。おそらく、培養スキャフォールドの血管新生は、栄養と酸素の供給を増加させ、より効率的で迅速なオルガノイドの発達を可能にすると思われる。内皮と実質組織との相互作用を示す多くの証拠に基づき、血管系とオルガノイドの間の生物学的クロストークがオルガノイドの成長を促進する原因である可能性もある。

【0118】

ＯＣＴＯＰＵＳは、従来のオルガノイドモデルの設計を大きく変えるものであるが、このシステムの導入には、既存の培養プロトコルやワークフローを変更する必要はなく、特殊な機器や人材に依存することもない。この利点に不可欠なのは、ＯＣＴＯＰＵＳが、標準的なウェルプレートや実験室のインフラと直接互換性があり、すぐに使えて簡単にアクセスできる培養インサートとして設計されていることである。開示された腸モデルに例示されるように、ＯＣＴＯＰＵＳで成熟したオルガノイドを生成することは、従来の技術で一般的に使用されている材料や実験手順に基づいて、従来の実験室設定で容易に達成することができる。これは、ＯＣＴＯＰＵＳを即座に展開可能で容易にアクセスできる培養プラットフォームとする開示された方法の重要な側面であり、本技術を広く使用するために迅速に普及させることに貢献すると考えられる。

【0119】

方法
上述の各実施例について、以下に記載する方法を適宜適用した。

【0120】

オルガノイド培養には、凍結保存したマウス腸オルガノイド（７０９３１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ）および凍結保存したマウス肝前駆オルガノイド（７０９３２、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ）を使用した。腸および肝臓オルガノイドは、それぞれＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）オルガノイド増殖培地（０６００５，ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ）およびＨｅｐａｔｉｃｕｌｔ（商標）オルガノイド増殖培地（０６０３０，ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ）を用いて製造者のプロトコルに従って２４ウェルのプレートで培養された。簡単に説明すると、あらかじめ存在するマトリゲルドロップをディスパーゼでインキュベートすることで溶解させた。３０分間インキュベートした後、オルガノイドを物理的に解離して単一細胞懸濁液とし、１５ｍｌのファルコンチューブに移し、２９０×ｇで遠心分離して幹細胞ペレットを得ることができた。次に、１００μｌの完全なオルガノイド増殖培地をペレットに添加した。１００μｌの冷たいマトリゲルを加えた後、懸濁液をピペッティングで１０回静かに上下させて完全に混合した。あらかじめ湿らせた２００μｌのチップを用い、オルガノイドとマトリゲルの混合物５０μｌを２４ウェルプレートに注入し、マトリゲルドロップを形成した。その後、ドロップを含むウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１０分間インキュベートし、マトリゲルをゲル化させた。このステップの完了後、７５０μｌの予め温めたオルガノイド増殖培地を各ウェルに添加した。オルガノイドは、メーカーの推奨に従って使用まで、新鮮なマトリゲル中で５～７日ごとに継代した。

【0121】

ヒトエンテロイド株について、回腸末端から生成されたエンテロイド株は、治験審査委員会承認のプロトコル（１３０４２）に基づき、フィラデルフィア小児病院消化管上皮モデル化プログラムより提供された。患者のすべての親は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。エンテロイド株が作成された。簡単に説明すると、２つの生検組織片を１ｍｌの冷たい滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、冷たいキレート緩衝液中で３０分間、冷蔵室のターンテーブル上でインキュベートし、その後、上皮層を機械的に解離（掻き取り）させた。この断片を１００μｍのストレーナーで漉して絨毛を除去し、８０％マトリゲルに再懸濁し、３０μＬの液滴あたり５０～２００個の陰窩の密度で播種した。液滴を３７℃で３０分間固化し、１ウェルあたり５００μｌのヒトＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で補充すると完全）を添加した。Ｙ－２７６３２（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ；最終濃度１０μＭ）を播種時のみ培地に添加した。

【0122】

ヒトエンテロイドの維持と継代に関しては、エンテロイド培地を週に３回交換した。１４日目に、培養物を継代および／またはＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ－１０ （ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で凍結保存した。継代は、マトリゲルドロップをＰ１０００チップで上下にピペッティングすることではずし、１．５ｍｌマイクロチューブに移し、遠心分離後、氷冷ＨＢＳＳで洗浄した。Ｐ１０００チップの上に置いたＰ２００チップで１０回ピペッティングし、遠心分離することにより、エンテロイドを機械的に解離させ、断片化した。ペレットを８０％マトリゲル中で再構成し、１：４の分割比で３０μｌドロップとして播種した。その後の培養は、７日目に継代および／または凍結保存の準備が整う。

【0123】

ＯＣＴＯＰＵＳにおける３Ｄオルガノイド構築物の形成について、まずＯＣＴＯＰＵＳインサートを含む標準２４ウェルプレートを紫外線（ＵＶ）光（Ｅｌｅｃｔｒｏ－ｌｉｔｅ ＥＬＣ－５００）に３０分間曝露して滅菌した。その後、ＯＣＴＯＰＵＳの培養チャンバーに、２ｍｇ／ｍｌ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．５中のｗ／ｖ）のドーパミン塩酸塩溶液を室温（ＲＴ）で２時間充填し、ＰＤＭＳへのマトリゲルの接着を強化する表面コーティングを形成させた。ポリ（ドーパミン）（ＰＤＡ）処理された装置は、使用するまで無菌状態に保たれた。開示された装置でオルガノイドを形成するために、まずペレットを作製した。この目的のために、マトリゲルドロップをディスパーゼ中でインキュベートすることにより、既存のマトリゲルを溶解させた。次に、細胞を１５ｍＬのファルコンチューブに移し、２９０×ｇで遠心分離して幹細胞ペレットを得た。次に、１００μｌの完全なＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）オルガノイド増殖培地をペレットに添加した。１００μｌの冷たいマトリゲルを加えた後、懸濁液を静かに１０回上下にピペッティングし、十分に混合した。ヒト腸内細菌の場合、細胞ペレットを８０％マトリゲルに再懸濁することができる。あらかじめ濡らした２００μｌのチップを用い、オルガノイドとマトリゲルの混合物１００μｌを注入ポートからＯＣＴＯＰＵＳに注入した。その後、ＯＣＴＯＰＵＳを含むウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートし、マトリゲルをゲル化させた。完了後、７５０μｌのあらかじめ温めたＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）オルガノイド増殖培地を各ウェルに添加した。ＯＣＴＯＰＵＳプレートは、３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養インキュベーターで維持した。長期培養中、培地交換は１日おきに行った。

【0124】

ヒトエンテロイドにおけるカスパーゼ－３、アネキシンＶ、ＴＮＦａ、ＴＧＦβ１、ＩＬ－６およびＩＬ－８の測定と定量化のために、培養１４日目に馴化培地を採取し、切断カスパーゼ－３（Ａｓｐ１７５）ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２２０６５５、ａｂｃａｍ）、ヒトアネキシンＶ ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２２３８６３、ａｂｃａｍ）、ヒトＴＮＦアルファＥＬＩＳＡキット（ａｂ１８１４２１、ａｂｃａｍ）、ヒトＴＧＦベータ１ ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１００６４７、ａｂｃａｍ）、ヒトＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１７８０１３、ａｂｃａｍ）、およびヒトＩＬ－８ ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２１４０３０、ａｂｃａｍ）を使用して分析を行った。各アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施した。簡単に言うと、１００μｌの標準溶液またはサンプル培地を各ウェルに添加した。２時間インキュベートした後、ウェルを３００μｌのメーカー提供の洗浄バッファーで５回洗浄し、２次抗体と１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、暗所で２０分間インキュベートした。最後に、１００μｌの停止液を各ウェルに加え、プレートリーダー（Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、スイス）で測定した。すべてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、マルチモードプレートリーダー（Ｍ２００，Ｔｅｃａｎ，スイス）を用いてサンプルの光学密度を測定した。標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィッティング法を用いて、各標準物質の平均光学濃度と濃度をプロットすることで作成した。サンプルの測定値は、標準曲線を用いて目標濃度に変換された。

【0125】

ＩＢＤの合併症としての腸線維症をモデル化するために、ヒト腸幹細胞をマトリゲル（３５６２５５、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）中で１Ｘ１０^６細胞／ｍｌの初代ヒト腸線維芽細胞と共培養した。この細胞含有ヒドロゲル溶液を装置内に注入し、オルガノイド培養チャンバー内に微小組織構築物を形成した。通常の細胞培養インキュベーターで１５分間ゲル化させた後、７５０μｌのＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）オルガノイド増殖培地（０６０１０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ）を各ウェルに加え、１４日間維持して、腸オルガノイドの発生と線維芽細胞の増殖を誘導した。この間、培地は１日おきに補充した。

【0126】

ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯにおけるヒトエンテロイドの血管形成については、細胞培養の前に、完全に組み立てられた装置を紫外線（ＵＶ）（Ｅｌｅｃｔｒｏ－ｌｉｔｅ ＥＬＣ－５００）に３０分以上照射することで滅菌した。ＯＣＴＯＰＵＳ－ＥＶＯで血管新生オルガノイドをエンジニアするために、フィブリノゲン（５ｍｇ／ｍｌ；Ｆ８６３０、Ｓｉｇｍａ）、トロンビン（１Ｕ／ｍｌ；Ｔ７５１３、Ｓｉｇｍａ）、アプロチニンを含む細胞懸濁液２０μｌを（０．１５Ｕ／ｍｌ；Ａ１１５３，Ｓｉｇｍａ）、ヒト腸幹細胞、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（５ｘ１０^６細胞／ｍｌ）、初代ヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）（１ｘ１０^６細胞／ｍｌ）を準備し、その入口アクセスポートから開放型細胞培養チャンバーに注入した。その後、３７℃、５％ＣＯ^２で、細胞培養インキュベーター内に３０分間放置した。ゲル化後、ＥＧＭ－２内皮培地と混合したＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ培地を培地リザーバーとサイドマイクロチャネルに添加した。細胞入りヒドロゲルの形成後、サイドマイクロチャネルをフィブロネクチン溶液（ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ；３５６００８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）と３７℃で２時間インキュベートし、チャネル表面にＥＣＭコーティングを形成した。その後、チャネルをＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ／ＥＧＭ－２で１回洗浄し、１０μｌのＨＵＶＥＣ懸濁液（１ｘ１０７細胞／ｍｌ）を両方のチャネルに導入した。播種した細胞は、１時間かけてチャネル表面に付着させた。１時間のインキュベート後、予め温めた培地を各培地リザーバーに添加した。この培養条件により、内皮細胞はサイドチャネルの表面に融合性である単層を形成し、ヒドロゲルスキャフォールドは内皮内層とヒドロゲル内の自己組織化血管の間の吻合を誘導することができた。

【0127】

オルガノイドの生存率を調べるために、哺乳類細胞用のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（商標）生存率／細胞毒性キット（Ｌ３２２４，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）を使用した。このアッセイでは、ライブセルイメージング溶液中のカルセインＡＭ（２μＭ）とエチジウムホモダイマー－１（４μＭ）の混合物をＯＣＴＯＰＵＳ含有ウェルに導入し、ＲＴで３０分間インキュベートした。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ８００，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）を用いて標識した細胞を観察した。定量分析のために、カルセインＡＭとエチジウムホモダイマー－１によってそれぞれ発生した蛍光から、健全なオルガノイドと壊死したオルガノイドの割合を算出した。各装置において、３０のオルガノイドを分析に使用した。

【0128】

ＯＣＴＯＰＵＳおよびヒドロゲルドロップにおける拡散の時空間パターンを調べるために、可視化のための蛍光トレーサーとして、４ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストランまたは７０ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ７０Ｓ－１００ＭＧ，Ｓｉｇｍａ，米国）が使用された。このアッセイでは、オルガノイドの培地をＦＩＴＣ－デキストラン溶液（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ）に置き換えた。デキストランの拡散は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ８００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いてモニターおよび可視化した。タイムラプス画像を１２０分間取得し、ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いて処理し、ヒドロゲルスキャフォールド内の定義された位置における蛍光強度の時間変化を測定した。

【0129】

腸オルガノイド内の増殖細胞を検出するために、ＥｄＵアッセイ／ＥｄＵ染色増殖キット－ｉＦｌｕｏｒ６４７（ａｂ２２２４２１，ａｂｃａｍ，米国）を使用した。簡単に説明すると、オルガノイドをＥｄＵ溶液（培地中２０μＭ）と共に通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ_２）で３時間インキュベートした。その後、オルガノイドをＰＢＳで２回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、製造元のプロトコルに従って、透過バッファーで透過処理した。ｉＦｌｕｏｒ６４７アジド色素で染色し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ８００，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）を用いて可視化した。

【0130】

カルシウムイメージングのために、オルガノイドの培地を培養ウェルから除去し、オルガノイド構築物をライブセルイメージング溶液（ＬＣＩＳ）で１回洗浄した。その後、オルガノイドに、製造元のプロトコルに従って調製したＦｌｕｏ－４カルシウムイメージング溶液（Ｆ１０４８９，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）を充填した。３７℃で３０分間インキュベートし、その後、室温でさらに３０分間インキュベートした。その後、Ｆｌｕｏ－４溶液を除去し、オルガノイドをＬＣＩＳで１回洗浄した。すべてのサンプルは、使用するまで新鮮なＬＣＩＳで保存した。倒立型落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１，Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）を用いて、１００μＭのＡＴＰ（Ａ１８５２，Ｓｉｇｍａ，米国）および５０ｍＭのグルコース（Ｇ７０２１，Ｓｉｇｍａ，米国）で刺激した際のオルガノイドのカルシウム染色を可視化した。

【0131】

Ｃａ^２＋レベルの変化をレシオメトリックに解析するために、各オルガノイドの蛍光強度を実験中に測定し、以下の式を使用して値をそれらの静止強度によって正規化した。
ΔＣａ^２＋＝（Ｆ－Ｆ_ｒｅｓｔ）／Ｆ_ｒｅｓｔ （１）

【0132】

腸オルガノイドからのＧＬＰ－１およびムチン２の分泌を解析するため、培養５日目、７日目、１０日目にウェル内の培地を回収した。多種総ＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡキット（ＥＺＧＬＰ１Ｔ－３６Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，米国）、グルカゴン様ペプチド－１（活性型）ＥＬＩＳＡキット（ＥＧＬＰ－３５Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，米国）、ＭＵＣ２ ＥＬＩＳＡキット（ＡＢＩＮ６７３０９７６，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ Ｉｎｃ，米国）を用いてそれぞれ総ＧＬＰ－１、活性型ＧＬＰ－１およびムチン２の濃度を計測した。各アッセイは、製造者のプロトコルに従って実施した。簡単に言うと、１００μｌの標準溶液またはサンプル培地を各ウェルに添加した。２時間インキュベートした後、ウェルを３００μｌのメーカー提供の洗浄バッファーで５回洗浄し、２次抗体と１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、暗所で２０分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌの停止液を加え、プレートリーダー（Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、スイス）で測定した。

【0133】

腸線維症モデルにおけるフィブロネクチン産生の解析には、マウスフィブロネクチンＥＬＩＳＡキット（ａｂ１０８８４９，ａｂｃａｍ，米国）を使用した。ウェル内の培地を指定された時点で回収し、メーカー提供のプロトコルを用いてアッセイした。まず、５０μｌの標準試料または装置で採取した試料を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、ウェルを３００μｌの洗浄用緩衝液で５回洗浄し、フィブロネクチン抗体と１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートを各ウェルに加え、３０分間インキュベートした後、再度洗浄した。５０μｌの発色基質と１０分間インキュベートした後、５０μｌの停止液を導入した。

【0134】

すべてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、マルチモードプレートリーダー（Ｍ２００，Ｔｅｃａｎ，スイス）を用いてサンプルの光学濃度を測定した。標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィッティング法を用いて、各標準物質の平均光学濃度と濃度をプロットすることで作成した。サンプルの測定値は、標準曲線を用いて目標濃度に変換された。

【0135】

特定の共培養実証のために、初代マウス腸線維芽細胞（ｍＩＦｓ）と初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を使用した。冷凍保存からの初期増殖のために、ｍＩＦとＨＵＶＥＣは、それぞれ成長因子を補充した完全線維芽細胞培地（Ｍ２２６７、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、米国）と内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ）－２（ＣＣ－３１６２、Ｌｏｎｚａ、スイス）を用いて、メーカーのプロトコルに従って７５ｃｍ^２フラスコで培養された。腸線維症のモデル化には、初代ｍＩＦと初代ヒト腸線維芽細胞を使用した。すべての細胞は、継代３から６までの間にあった。

【0136】

ＯＣＴＯＰＵＳで、例えば薬剤試験に適した腸線維症モデルを形成するために、マウス腸幹細胞を１×１０^６細胞／ｍｌのマウス腸線維芽細胞とマトリゲル（３５６２５５，Ｃｏｒｎｉｎｇ，米国）中で混合した。この細胞含有ヒドロゲル溶液を装置内に注入し、オルガノイド培養チャンバー内に微小組織構築物を形成させた。通常の細胞培養インキュベーターで１５分間ゲル化した後、７５０μｌのＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（商標）オルガノイド増殖培地（０６００５， ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ）を各ウェルに加え、５日間維持して腸内器官の発達と線維芽細胞の増殖を誘導した。この間、培地は１日おきに補充した。繊維症を誘導するために、５日目に１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β（Ｔ５０５０、Ｓｉｇｍａ、米国）を培養ウェルに添加し、さらに７日間維持した。薬物投与は、市販のピルフェニドン（Ｐ１８７１、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ、米国）およびニンテダニブ（Ｓ１０１０、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、米国）を指定濃度で使用して１２日目に行った。線維症モデルを４８時間薬剤で処理し、その後、その線維症表現型の変化を、本明細書に記載の方法で分析した。

【0137】

ＯＣＴＯＰＵＳおよびマトリゲルドロップにおける酸素拡散を調べるために、ジクロリチス（１，１０－フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．＃３４３７１４）を酸素指示薬として使用した－溶存酸素分子はこの蛍光色素を消光するようになる。簡単に説明すると、１５μｌのＲｕ（ｐｈｅｎ）３（２ｍＭ）と２７０μｌのマトリゲルを、１５μｌの亜硫酸ナトリウム（２００ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．＃Ｓ０５０５）と混合し、マトリゲル中に残った水性酸素を除去するために使用された。その後、この混合物を用いて、ＯＣＴＯＰＵＳとマトリゲルの滴下で３Ｄ組織構築物を生成した。酸素の拡散は共焦点顕微鏡でモニターし、その間、構築物内の決められた時間間隔と位置で画像を取得した。撮影した画像はＩｍａｇｅＪで解析し、蛍光強度の時空間的変化を測定した。

【0138】

マイクロエンジニアリングされた血管網の灌流性を調べるために、蛍光標識した１μｍのマイクロビーズ（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ；Ｆ－８８１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をフロー・トレーサーとして使用した。血管構造を通る流れを生じさせるために、リザーバー内の培地を吸引し、ビーズ溶液を側面のマイクロチャネルの１つに挿入した。この構成により、ヒドロゲルスキャフォールド全体に静水圧の勾配が生じ、マイクロビーズが血管を流れるための駆動力となった。血管灌流は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ８００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いてモニターおよび可視化した。

【0139】

単球浸潤アッセイを行うために、ヒト末梢血単球をペンシルバニア大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅから入手した。開示したシステムで単球の内皮接着を試験するために、細胞を蛍光色素（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、最終濃度３×１０^６細胞／ｍｌでＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ／ＥＧＭ－２培地に懸濁した。その後、サイドマイクロチャネルの１つから血管内に注入し、細胞培養インキュベーター内で２４時間、血管内を灌流させた。灌流終了後、装置をＤＰＢＳで３回洗浄し、付着、移行、浸潤した単球の数を解析するために検査した。

【0140】

原子間力顕微鏡（ＡＦＭ，ＭＦＰ－３Ｄ－ＢＩＯ，Ａｓｙｌｕｍ）を用いて、腸線維症モデルの水和微小組織の剛性を測定した。バネ定数１４．５８ｐＮ／ｎｍの金コーティングされたカンチレバー（ＳＣＯＮＴ ｔｉｐ，ＮＡＮＯＳＥＮＳＯＲＳ）とピラミッド型圧子を用いて、力－圧痕曲線を得た。開放型のチャンバー内の組織サンプルは、何も手を加えずにそのまま使用した。ＡＦＭ測定では、微小組織を含むＯＣＴＯＰＵＳインサートをプレートから取り外し、装置に取り付けた。ＰＢＳを１滴垂らして微小組織を濡らした後、走査型プローブを用いて機械的特性を測定した。ヤング率は、Ａｔｏｍｉｃ Ｊソフトウェアを用いて、力による圧痕データから算出した。

【0141】

免疫蛍光染色のために、ＯＣＴＯＰＵＳの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，米国）で室温で１５分間固定し、ＰＢＳで再度２回洗浄した。その後、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）で３分間透過処理し、ＰＢＳと３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）からなるブロッキングバッファーに４℃で一晩曝された。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をアクチンフィラメント（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ ４８８試薬，ａｂ１７６７５３，１：１０００，ａｂｃａｍ，米国；Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ ５９４試薬，ａｂ１７６７５７，１：１０００，ａｂｃａｍ，米国）、成熟上皮細胞（抗ＥＰＣＡＭ抗体，ａｂ７１９１６，１：２５０，ａｂｃａｍ，米国；抗ＨＮＦ－４－アルファ抗体［Ｋ９２１８］－ＣｈＩＰ Ｇｒａｄｅ，ａｂ４１８９８，１：５００，ａｂｃａｍ，米国）、幹細胞（抗Ｋｉ６７抗体、ａｂ１５５８０，１：１０００，ａｂｃａｍ，米国；Ｌｇｒ５モノクローナル抗体，ＭＡ５－２５６４４，１：１０００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）、腸細胞（抗ビリン抗体［３Ｅ５Ｇ１１］－Ｎ－末端，ａｂ２０１９８９，１：５００，ａｂｃａｍ，米国）、杯細胞（抗ＭＵＣ２抗体、ａｂ９０００７，１：２００，ａｂｃａｍ，米国）、腸内分泌細胞（抗ソマトスタチン抗体［Ｍ０９２０４］，ａｂ３０７８８，１：１００，ａｂｃａｍ，米国）、ペプチドトランスポーター１（抗ＳＬＣ１５Ａ１／ＰＥＰＴ１抗体、ａｂ２０３０４３，１：１００，ａｂｃａｍ，米国）、グルコーストランスポーター１（抗グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１抗体［ＳＰＭ４９８］，ａｂ４００８４，１：２５０，ａｂｃａｍ，米国）、内皮細胞（抗ＣＤ３１抗体［ＪＣ／７０Ａ］（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８），ａｂ２１５９１１，１：１００，ａｂｃａｍ，米国）、アルファ平滑筋アクチン（組換え抗アルファ平滑筋アクチン抗体［Ｅ１８４］，ａｂ３２５７５，１：５００，ａｂｃａｍ，米国）、フィブロネクチン（抗フィブロネクチン抗体［ＩＳＴ－９］，ａｂ６３２８，１：２００，ａｂｃａｍ，米国）、アルファ平滑筋アクチン（組換え抗アルファ平滑筋アクチン抗体［Ｅ１８４］，ａｂ３２５７５，１：５００，ａｂｃａｍ，米国）、フィブロネクチン（抗フィブロネクチン抗体［ＩＳＴ－９］，ａｂ６３２８，１：２００，ａｂｃａｍ，米国）、切断カスパーゼ３（抗切断カスパーゼ３抗体［Ｅ８３－７７］，ａｂ３２０４２，１：２００，ａｂｃａｍ，米国）、アネキシンＶ（抗アネキシンＶ／ＡＮＸＡ５抗体［ＥＰＲ３９８０］，ａｂ１０８１９４，１：５００，ａｂｃａｍ，米国）またはＩＣＡＭ１（抗ＩＣＡＭ１抗体［ＥＰＲ２４６３９－３］，ａｂ２８２５７５，１：５００，ａｂｃａｍ，米国）について免疫染色した。一次抗体と４℃で一晩インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ&Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８），ａｂ１５００７７，１：１０００，ａｂｃａｍ，米国；ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ&Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８），ａｂ１５０１１３，１：１０００，ａｂｃａｍ，米国；ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ&Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４），ａｂ１５０１１６，１：１０００，ａｂｃａｍ，米国；ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ&Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４），ａｂ１５００８０，１：１０００，ａｂｃａｍ，米国）と４℃で一晩インキュベートした。核染色には、１：１０００で希釈したＤＡＰＩ（Ｄ１３０６，Ｔｈｅｒ－ｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）を使用した。染色した細胞の蛍光画像をレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ８００，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）を用いて取得し、ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）およびＩｍａｇｅＪソフトウェアで処理した。

【0142】

ヒトエンテロイドのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ&Ｅ）染色は、オルガノイドを冷ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，米国）で固定した。その後、オルガノイドを２％バクト－アガーと２．５％ゼラチンからなる包埋ゲルに再懸濁し、液滴として包埋ラックに移した。３０分間ゲルを固化させた後、オルガノイドを埋め込んだゲルをあらかじめ標識した組織カセットに入れ、７０％エタノールに浸した。パラフィン切片の入ったスライドを３Ｘキシレン、２Ｘ１００％エタノール、９５－９５－８０－７０％エタノール、蒸留水に順次浸し、脱パラフィンおよび再水和を行った。その後、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）に浸し、電子レンジで１５分間インキュベートした。スライドを軽くすすいだ後、組織切片をタンパク質ブロッキング剤でブロックした。Ｈ&Ｅ染色を行うために、スライドをヘマトキシリンに浸し、脱イオン水ですすいだ。さらにスライドをエオシンに３０秒間浸し、９５％エタノール－１００％エタノール－キシレン溶液で脱水した。組織切片は、Ｐｅｒｍｏｕｎｔを使用してカバースリップスライドで覆い、分析まで保存した。

【0143】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析は、以下のように実施した。ＲＮＡの単離は、オルガノイドを含むマトリゲルを冷ＰＢＳで溶解することによりオルガノイドを採取した。３００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離後、上清を除去し、ペレット化したオルガノイドを３５０μＬのＲＬＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）に再懸濁した。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造者の指示に従って単離した。ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、製造者の指示に従って合成した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを使用して実施した。

【0144】

シングルセルシーケンス解析のため、回収したオルガノイドをトリプシン中で３７℃、１０分間インキュベートし、２０μｍのセルストレーナーを通した。単離した単細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭに７００ライブセル／μｌの密度で再懸濁させた。その後、トリパンブルーで染色して生存率を確認し、顕微鏡で２回数えて平均細胞濃度を決定した。

【0145】

各オルガノイドサンプルの単細胞懸濁液を、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ １０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓシングルセル３’試薬キットｖ２ ライブラリーチップ （１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）の別チャネルに、製造元のプロトコルにしたがって装填した。単一細胞からのＲＮＡ転写物は一意にバーコード化され、逆転写された。ｃＤＮＡシーケンスライブラリーは、メーカーのプロトコル（ライブラリー準備用１０Ｘユーザーガイド）に従って調製し、Ｓ１ １００サイクルフローセルｖ１．５を使用してイルミナＮｏｖａＳｅｑ ６０００でシーケンスされた。ライブラリーの品質管理は、サイジング（ｂｐ）にはＡｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを、濃度（ｎＭ）にはＫＡＰＡ ｑＰＣＲを使用した。配列読み取りの生データは、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒパイプライン（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖ．５．０．０）を用いて逆多重化を行い、ヒトゲノムＧＲＣｈ３８トランスクリプトームにアライメントした。サンプルデータはＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ ａｇｇｒパイプラインを使用して集約され、ライブラリーはサンプルセット全体のシーケンス深度について正規化された。細胞タイプの識別と直接比較のために、合計５つのオルガノイドサンプル数マトリックスを一緒にマージした。

【0146】

統計分析に関しては、各実験のサンプルサイズは、各実験グループに対して最低ｎ＝３の独立した装置に基づいて決定された。データは、ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）を用いてスチューデントのｔ検定で分析し、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍで示した。得られたデータの統計的有意性は、一元配置分散分析で決定した＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１の値によるものであった。

【0147】

実施形態
以下の実施形態は例示であり、本開示または添付の請求項の範囲を限定するものではない。

【0148】

実施形態１．オルガノイドを培養するための装置であって、前記装置は、溶液を受け取るように構成されたアクセスポートと、装填チャンバーであって、アクセスポートが前記装填チャンバー内に位置する、装填チャンバーと、複数の培養チャンバーであって、前記培養チャンバーは、アクセスポートを通じて装填チャンバーに注入された溶液が複数の培養チャンバーに分配されるように装填チャンバーから放射状に配置されるものであり、前記複数の培養チャンバーは、外部環境に対して開放され、および、前記複数の培養チャンバーの開口部に突出した縁部を含む、複数の培養チャンバーとを含む、装置。

【0149】

実施形態２．実施形態１記載の装置であって、前記装置は、ポリ（ジメチルシロキサン）を含む、装置。

【0150】

実施形態３．実施形態１または２記載の装置であって、前記装置は、光学的に透明である、装置。

【0151】

実施形態４．実施形態１～３のいずれか１つに記載の装置において、前記アクセスポートは、前記装填チャンバーの中央に配置される、装置。

【0152】

実施形態５．実施形態４記載の装置において、前記複数の培養チャンバーは、前記アクセスポートに関する回転に関して対称である、装置。

【0153】

実施形態６．実施形態５記載の装置において、前記アクセスポートを介して前記装填チャンバーに注入された溶液は、前記複数の培養チャンバーに均一に分配される、装置。

【0154】

実施形態７．実施形態１～６のいずれか１つに記載の装置であって、前記装置は、前記複数の培養チャンバーの前記開口部を介して前記外部環境から培地を接触させるように構成されている、装置。

【0155】

実施形態８．実施形態１記載の装置において、前記溶液は、ヒドロゲル溶液である、装置。

【0156】

実施形態９．実施形態１記載の装置において、前記ヒドロゲル溶液は、細胞またはオルガノイドを含む、装置。

【0157】

実施形態１０．実施形態１記載の装置において、前記オルガノイドはヒトオルガノイドである、装置。

【0158】

実施形態１１．実施形態１～１０のいずれか１つに記載の装置において、前記培養チャンバーの各々が、約１００μｍ～約５ｃｍの範囲の幅または高さを有する、装置。

【0159】

実施形態１２．実施形態１１記載の装置において、前記培養チャンバーの各々は、約１ｃｍの幅及び高さを有する、装置。

【0160】

実施形態１３．実施形態１～１２のいずれか１つに記載の装置において、前記培養チャンバー内の前記オルガノイドの少なくとも約８０％が、培養の２１日目に生存している、装置。

【0161】

実施形態１４．実施形態１～１３のいずれか１つに記載の装置において、前記突出した縁部が、前記培養チャンバーの前記開口部において溶液のメニスカスを留めるように構成され、前記開口部を通して前記溶液を流出させることなく前記培養チャンバーの充填を可能にする、装置。

【0162】

実施形態１５．実施形態１～１４のいずれか１つに記載の装置において、各培養チャンバーは、共培養のための異なる種類の細胞またはオルガノイドを含む、装置。

【0163】

実施形態１６．実施形態１～１５のいずれか１つに記載の装置において、前記オルガノイドの成長は少なくとも約２１日間継続する、装置。

【0164】

実施形態１７．実施形態１～１６のいずれか１つに記載の装置において、前記オルガノイドのサイズは、少なくとも約２１日間増加する、装置。

【0165】

実施形態１８．実施形態１７記載の装置であって、前記装置は、オルガノイドのサイズの変動を低減させる、装置。

【0166】

実施形態１９．オルガノイドを培養する方法であって、前記方法は、細胞またはオルガノイドを含む溶液をアクセスポートを通して装填チャンバーに注入する工程と、細胞またはオルガノイドを含む溶液で複数の培養チャンバーを充填する工程であって、前記装填チャンバーに注入された溶液が前記複数の培養チャンバーの中に分配されるように、前記培養チャンバーが前記装填チャンバーから放射状に配置され、前記複数の培養チャンバーは、外部環境に対して開放されており、前記培養チャンバーの開口部に、前記開口部を通じた前記溶液の流出を防止するための突出した縁部を含む、充填する工程と；前記複数の培養チャンバーの開口部を介して前記装置に培地を供給する工程と、を含む方法。

【0167】

実施形態２０．実施形態１９記載の方法において、前記アクセスポートは、前記装填チャンバーの中央に配置される、方法。

【0168】

実施形態２１．実施形態２０記載の方法において、前記複数の培養チャンバーは、前記アクセスポートに関する回転に関して対称である、方法。

【0169】

実施形態２２．実施形態２１記載の方法において、前記アクセスポートを介して前記装填チャンバーに注入された溶液は、前記複数の培養チャンバーに均一に分配される、方法。

【0170】

実施形態２３．実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の方法において、前記溶液は、ヒドロゲル溶液である、方法。

【0171】

実施形態２４．実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の方法において、前記オルガノイドはヒトオルガノイドである、方法。

【0172】

実施形態２５．実施形態２３または２４記載の方法において、前記ヒドロゲル溶液は、前記装填チャンバーに注入され、前記複数の培養チャンバーに分配された後、前記複数の培養チャンバー内で固化してヒドロゲルを形成するものである、方法。

【0173】

実施形態２６．実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の方法において、前記培養チャンバー内の前記オルガノイドの少なくとも約８０％が、培養の２１日目に生存している、方法。

【0174】

実施形態２７．実施形態１９～２６のいずれか１つに記載の方法において、各培養チャンバーは、共培養のための異なる種類の細胞またはオルガノイドを含む、方法。

【0175】

実施形態２８．実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の方法において、前記オルガノイドの成長は少なくとも約２１日間継続する、方法。

【0176】

実施形態２９．実施形態１９～２８のいずれか１つに記載の方法において、前記オルガノイドのサイズは、少なくとも約２１日間増加する、方法。

【0177】

実施形態３０．実施形態１７記載の方法において、前記装置は、オルガノイドのサイズの変動を低減させる、方法。

【0178】

実施形態３１．実施形態１９～３０のいずれか１つに記載の方法において、前記培地は可溶性因子を含む、方法。

【0179】

実施形態３２．実施形態３１記載の方法において、前記可溶性因子は、成長因子、活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。

【0180】

実施形態３３．実施形態１９～３２のいずれか１つに記載の方法であって、前記オルガノイドを成熟させる工程をさらに含む、方法。

【0181】

実施形態３４．実施形態１９～３３のいずれか１つに記載の方法であって、前記複数の培養チャンバーにおける前記オルガノイドの生存率および成熟を評価する工程をさらに含む、方法。

【0182】

本明細書で引用するすべての特許、特許出願、刊行物、製品説明、およびプロトコルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。用語に矛盾がある場合、本開示が支配する。

【0183】

本明細書に記載された主題は、上記の利益および利点を達成するために十分に計算されていることが明らかになるが、現在開示されている主題は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。開示された主題は、その精神から逸脱することなく、修正、変形、および変更が可能であることが理解されよう。当業者は、本明細書に記載された特定の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験以上のことを用いずに認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の請求項によって包含されることが意図される。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図2-7】

【図2-8】

【図2-9】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図12-6】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図13-5】

【図13-6】

【図13-7】

【図13-8】

【図13-9】

【図13-10】

【図13-11】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図14-5】

【図14-6】

【図14-7】

【図14-8】

【図14-9】

【図14-10】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【図15-5】

【国際調査報告】