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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-26
(54)【発明の名称】遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231219BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231219BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231219BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20231219BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20231219BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20231219BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20231219BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231219BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20231219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231219BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20231219BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20231219BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20231219BHJP
A61K 39/00 20060101ALN20231219BHJP
A61K 39/385 20060101ALN20231219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P37/04
A61P35/00
A61P35/02
A61K9/10
A61K47/10
A61K47/24
A61K47/28
A61K48/00
A61K35/15
A61P43/00 121
A61K47/59
A61K31/713
A61K47/26
A61K39/00 H
A61K39/385
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537237
(86)(22)【出願日】2020-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-08-10
(86)【国際出願番号】 KR2020018484
(87)【国際公開番号】W WO2022131398
(87)【国際公開日】2022-06-23
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和２（２０２０）年８月１１日ウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０２０．０８．００９」（公開時のアドレス）における公開
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
(71)【出願人】
【識別番号】516172857
【氏名又は名称】インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション キョンサン ナショナル ユニバーシティ
(71)【出願人】
【識別番号】523223755
【氏名又は名称】イファ ユニヴァーシティー － インダストリー コラボレイション ファウンデイション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】リー ギュ リ
(72)【発明者】
【氏名】リー ヒョク ジン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA16
4C076AA95
4C076BB15
4C076CC06
4C076CC07
4C076CC27
4C076DD43Z
4C076DD63
4C076DD63F
4C076DD70
4C076DD70F
4C076EE23
4C076EE23F
4C076FF16
4C076FF61
4C084AA13
4C084MA21
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB021
4C084ZB091
4C084ZB261
4C084ZB271
4C084ZC751
4C085AA06
4C085BB01
4C085BB15
4C085CC31
4C085DD51
4C085DD81
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG03
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA04
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA21
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB02
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB44
4C087CA04
4C087MA02
4C087MA21
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZB02
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体に関する。本発明による遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体は、単一構造体内にｍＲＮＡとｓｉＲＮＡをすべて含むことによって同一の細胞にｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを同時に導入させ、これを通じて発現しようとするタンパク質を正常に発現させながらも、特定遺伝子の発現は特異的に抑制することができる。前記ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体は、抗原提示細胞にターゲットタンパク質を発現させて免疫体系を活性化させると同時に、免疫チェックポイントタンパク質の活性化を遮断して免疫回避妨害を克服することができ、免疫治療分野、特に抗がん免疫治療分野で非常に有用に使用され得るものと期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体であって、（ｉ）３’末端に５’方向から３’方向に順次に位置するポリ（Ａ）テール（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）；および第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列を含むｍＲＮＡ；および
（ｉｉ）前記第１のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合する混成化配列を含む核酸構造体。
【請求項2】
前記混成化配列は、第１のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合する第２のｓｉＲＮＡアンチセンスまたはセンス配列；或いは第１のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合するＤＮＡアンチセンスまたはセンス配列であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構造体。
【請求項3】
前記混成化配列は、３’末端に前記ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールと相補的に結合するポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸構造体。
【請求項4】
前記ポリ（Ｔ）テールは２ないし６ｎｔ長さであることを特徴とする、請求項３に記載の核酸構造体。
【請求項5】
前記核酸構造体は、前記ｍＲＮＡがコードするターゲットタンパク質の発現および標的遺伝子の発現抑制を同時に誘発することを特徴とする、請求項１に記載の核酸構造体。
【請求項6】
第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列の３’末端に追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列のための第１のリンカー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸構造体。
【請求項7】
前記第１のリンカー配列は、ポリ（Ｕ）テール（ｐｏｌｙ（Ｕ）ｔａｉｌ）であることを特徴とする、請求項６に記載の核酸構造体。
【請求項8】
前記第１のリンカー配列の３’末端に追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の核酸構造体。
【請求項9】
混成化配列；および第２のリンカー配列をさらに含むことを特徴とする核酸構造体であって、前記混成化配列は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合することを特徴とする、請求項８に記載の核酸構造体。
【請求項10】
前記混成化配列は、追加のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合する第２のｓｉＲＮＡアンチセンスまたはセンス配列；或いは追加のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合するＤＮＡアンチセンスまたはセンス配列であることを特徴とする、請求項９に記載の核酸構造体。
【請求項11】
前記第２のリンカー配列は、第１のリンカー配列と相補的に結合するポリ（Ａ）テール（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）であることを特徴とする、請求項９に記載の核酸構造体。
【請求項12】
前記核酸構造体は、第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列の３’末端に次の（ａ）および（ｂ）を含む繰り返し単位を複数個さらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸構造体：（ａ）追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列のための第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列；および
（ｂ）混成化配列；および第２のリンカー配列であって、前記混成化配列は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合することである。
【請求項13】
請求項１に記載の核酸構造体および核酸伝達体を含む組成物。
【請求項14】
前記核酸伝達体はナノ粒子であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１に記載の核酸構造体を含む免疫治療用薬学的組成物。
【請求項16】
前記免疫治療は、がん免疫治療であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項17】
前記がんは、脳腫瘍、陽性星状細胞腫、悪性星状細胞腫、脳下垂体腺腫、脳髄膜腫、脳リンパ腫、乏突起膠腫、頭蓋内咽腫、上衣細胞腫、脳幹腫瘍、頭頸部腫瘍、喉頭がん、中咽頭がん、鼻腔／副鼻腔がん、鼻咽頭がん、唾液腺がん、下咽頭がん、甲状腺がん、胸部腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺がん、縦隔洞腫瘍、食道がん、乳がん、男性乳がん、腹部腫瘍、胃がん、肝がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、小腸がん、大腸がん、肛門がん、膀胱がん、腎臓がん、男性生殖器腫瘍、陰茎がん、尿道がん、前立腺がん、女性生殖器腫瘍、子宮頸部がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮肉腫、腟がん、女性外部生殖器がん、女性尿道がん、皮膚がん、骨髄腫、白血病および悪性リンパ腫からなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項18】
請求項１に記載の核酸構造体を含むがんワクチン。
【請求項19】
前記がんワクチンは樹枝状細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載のがんワクチン。
【請求項20】
１）３’末端に５’方向から３’方向に順次に位置するポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）およびｓｉＲＮＡアンチセンスまたはセンス配列が導入されたＤＮＡ鋳型を製造するステップ；２）ＤＮＡ鋳型にＲＮＡ重合酵素を含む反応溶液を処理して３’末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡを得るステップ；および
３）３’末端にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）が連結されたｓｉＲＮＡを前記ｍＲＮＡ産物にアニーリングするステップ；を含むｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体の製造方法。
【請求項21】
免疫治療に使用するための請求項１の核酸構造体を含む薬学的組成物。
【請求項22】
免疫治療のための薬剤の製造における請求項１の核酸構造体の用途。
【請求項23】
請求項１に記載の核酸構造体を、これを必要とする個体に投与するステップを含む免疫治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体に関する。
【背景技術】
【0002】
がんは、人類の健康を脅かす最大の疾病のうち一つであって、細胞が一連の突然変異過程を経て無制限的且つ非調節的な方式で増殖および不死化されて発生する疾病である。がんと関連する多様な生化学的機序が究明され、それによる治療剤が開発されてきているが、未だ根本的な治療方法は提示されていない。このようながん治療の新たなパラダイムとして位置付けているのが、免疫抗がん療法（がん免疫治療、ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）である。
前記免疫抗がん療法は、受動免疫治療と能動免疫治療とに区分することができる。受動免疫治療には、免疫チェックポイント抑制剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、免疫細胞治療剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、治療用抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などが使用され、このうち免疫チェックポイント抑制剤は、Ｔ細胞抑制に関与する免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の活性化を遮断してＴ細胞を活性化させてがん細胞を攻撃する治療剤として、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１抑制剤などがある。
前記免疫抗がん療法は、受動免疫治療と能動免疫治療とに区分することができる。受動免疫治療には、免疫チェックポイント抑制剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、免疫細胞治療剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、治療用抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などが使用され、このうち免疫チェックポイント抑制剤は、Ｔ細胞抑制に関与する免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の活性化を遮断してＴ細胞を活性化させてがん細胞を攻撃する治療剤として、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１抑制剤などがある。
【0003】
能動免疫治療には、がん治療ワクチン、免疫調節剤などが使用され、具体的に体内免疫細胞を収集して強化させるか、遺伝子工学的に変形させてさらに入れる細胞治療方式で腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）細胞治療剤などがあり、がん細胞が有している腫瘍特異的抗原（ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）をがん患者に投与して免疫体係を活性化させることで体内免疫機能を活発にしてがん細胞を攻撃するようにするがんワクチンなどがある。
その中でも樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）は、免疫係の最も核心的な抗原提示細胞であって、樹枝状細胞がんワクチンはがん抗原を提示して抗がん免疫反応活性化を通じて腫瘍を効果的に除去することができる理想的な治療剤とされている。しかし、腫瘍および腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＴＭＥ）は、直接的に樹枝状細胞の機能障害を誘導するか、腫瘍抗原を隠して免疫抑制サイトカインを多量分泌して抗がん免疫活性を抑制する。特に、がん細胞とこれを攻撃しようとする免疫細胞の力のバランスが崩れるようになると、がん細胞が本格的な増殖を開始して体内免疫システムを撹乱し、このとき、一部のがん細胞は免疫細胞の免疫チェックポイントを活用して免疫を回避することになる。
その中でも樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）は、免疫係の最も核心的な抗原提示細胞であって、樹枝状細胞がんワクチンはがん抗原を提示して抗がん免疫反応活性化を通じて腫瘍を効果的に除去することができる理想的な治療剤とされている。しかし、腫瘍および腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＴＭＥ）は、直接的に樹枝状細胞の機能障害を誘導するか、腫瘍抗原を隠して免疫抑制サイトカインを多量分泌して抗がん免疫活性を抑制する。特に、がん細胞とこれを攻撃しようとする免疫細胞の力のバランスが崩れるようになると、がん細胞が本格的な増殖を開始して体内免疫システムを撹乱し、このとき、一部のがん細胞は免疫細胞の免疫チェックポイントを活用して免疫を回避することになる。
【0004】
よって、免疫体係を活性化させて能動的にがん細胞に対する免疫反応を増加させながらも、受動的に免疫チェックポイントタンパク質の活性化を遮断して免疫回避妨害を受けないようにする新たな免疫抗がん剤に対する必要性が台頭する。
また、誘電体システムの複雑な環境、特に、がん環境で特定遺伝子の上向きまたは下向き調節が円滑に行われる必要があるが、一つの物質の処理でこのような遺伝子調節を成すことが非常に難しい。すなわち、単一の分子を利用して生体内で遺伝子の正確且つ速い調節を目的とする多くの研究があったが、十分な結果を確保していない実情である。
また、誘電体システムの複雑な環境、特に、がん環境で特定遺伝子の上向きまたは下向き調節が円滑に行われる必要があるが、一つの物質の処理でこのような遺伝子調節を成すことが非常に難しい。すなわち、単一の分子を利用して生体内で遺伝子の正確且つ速い調節を目的とする多くの研究があったが、十分な結果を確保していない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体を製造し、前記構造体が特定遺伝子をｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡそれぞれを通じて同時に発現または抑制することを確認した。特に、抗原ｍＲＮＡを発現させて免疫体係を活性化させると同時に、免疫チェックポイントタンパク質の活性化を抑制して免疫チェックポイントタンパク質による免疫回避機序を克服できることを確認し、本発明を完成することになった。
よって、本発明の目的は、遺伝子発現および抑制が同時に可能なｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体を提供することにある。
よって、本発明の目的は、遺伝子発現および抑制が同時に可能なｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前記目的を達成するために、本発明はｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体を提供する。
また、本発明は前記核酸構造体および核酸伝達体を含む組成物を提供する。
また、本発明は前記核酸構造体を含む免疫治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は前記核酸構造体を含むがんワクチンを提供する。
また、本発明は前記核酸構造体の製造方法を提供する。
また、本発明は前記核酸構造体および核酸伝達体を含む組成物を提供する。
また、本発明は前記核酸構造体を含む免疫治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は前記核酸構造体を含むがんワクチンを提供する。
また、本発明は前記核酸構造体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【0007】
本発明による遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体は、単一構造体内にｍＲＮＡとｓｉＲＮＡをすべて含むことによって同一の細胞にｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを同時に導入させ、これを通じて発現しようとするタンパク質を正常に発現させながらも、特定遺伝子の発現は特異的に抑制することができる。前記ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体は、抗原提示細胞にターゲットタンパク質を発現させて免疫体係を活性化させると同時に、免疫チェックポイントタンパク質の活性化を遮断して免疫回避妨害を克服することができ、免疫治療分野、特に抗がん免疫治療分野で非常に有用に使用され得るものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】核酸構造体の一模式図を示す。
【図2】本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体の製造方法を順に図式化したものである。
【図3】本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体の製造方法を順に図式化したものである。ＤＮＡ鋳型、前記鋳型ＤＮＡを使用して試験管内転写されたｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）」）および前記ｍＲＮＡにｓｉＲＮＡをアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させて製造されたｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体をｓｉＲＮＡのセンス（ＳＳ）またはアンチセンス配列（ＡＳ）表示とともに図式化した。
【図4】本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体が細胞内環境でＲＮａｓｅ ＨによってｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡに分離される過程を図式化したものである（ＡＡＡＡ、ＴＴＴＴ文字はＤＮＡ配列に該当）。
【図5】ｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス配列、長さを異にするＯｌｉｇｏ（ｄＴ）を多様な構成で組み合わせたｓｉＲＮＡ－Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をｍＲＮＡにアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させて製造したｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ実施例を図式化したものである（ＴＴ、ＴＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴ－ＡＳ、ＴＴＴＴ－ＳＳ文字はＤＮＡ配列に該当）。
【図6】ＤＮＡ鋳型（ａ）および試験管内転写産物（ｂ）に対して電気泳動した結果を示した図である。
【図7】ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡに対して電気泳動した結果を示した図である。
【図8】互いに異なるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ実施例のタンパク質（赤い蛍光タンパク質、ＧＦＰ）発現能力を評価した結果を示した図である。
【図9】形質注入２４時間後、互いに異なるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ実施例のタンパク質（青い蛍光タンパク質、ＢＦＰ）発現能力および遺伝子（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）発現抑制能力を評価した結果を示した図である。（ａ）ｍＢＦＰタンパク質発現効率、（ｂ）ＧＦＰタンパク質発現抑制効率。
【図10】形質注入４８時間後、互いに異なるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ実施例のタンパク質（青い蛍光タンパク質、ＢＦＰ）発現能力および遺伝子（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）発現抑制能力を評価した結果を示した図である。（ａ）ｍＢＦＰタンパク質発現効率、（ｂ）ＧＦＰタンパク質発現抑制効率。
【図11】本発明による核酸構造体にオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）を発現するｍＲＮＡおよびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを導入し、前記ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３のＳＴＡＴ３タンパク質発現抑制能力を評価した結果を示した図である。
【図12】本発明による核酸構造体にオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）を発現するｍＲＮＡおよびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを導入し、前記ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３のＳＴＡＴ３タンパク質発現抑制能力をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを通じて評価した結果を示した図である。
【図13】ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３の樹枝状細胞成熟促進効果をＣＤ４０、ＣＤ８０発現量を通じて確認した結果を示した図である。
【図14】ＯＶＡの発現がｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３構造体処理を通じて確認された結果を示す。
【図15】ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３を筋肉注射したマウスから採取した脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）のうち誘導されたＯＶＡ抗原特異細胞毒性Ｔ細胞集団が１３．８％と分析された結果を示す。
【図16】ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３を筋肉注射したマウスの脾臓細胞でｍＯＶＡとｓｉＳＴＡＴ３の単純ｍｉｘｔｕｒｅを筋肉注射したマウスに比べてさらに高いＯＶＡ特異細胞毒性Ｔ細胞集団が観察されることを見せる。
【図17】ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３を筋肉注射したマウスのＯＶＡ－特異的ＩｇＧ発現がｍＯＶＡとｓｉＳＴＡＴ３の単純ｍｉｘｔｕｒｅを筋肉注射したマウスに比べて向上したことを確認した結果を示す。
【図18】ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）は単純ｍｉｘｔｕｒｅと対比して顕著に優れた腫瘍抑制効果を示した結果を見せる。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明をより詳細に説明する。
他の式に正義されない限り、本明細書において使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常に理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書において使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常的に使用されるものである。
本発明において、用語「ベクター」は、適切な宿主細胞で目的とするタンパク質を発現することができるようにする作動可能に連結された必須的な調節要素を含む核酸製作物を意味する。
他の式に正義されない限り、本明細書において使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常に理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書において使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常的に使用されるものである。
本発明において、用語「ベクター」は、適切な宿主細胞で目的とするタンパク質を発現することができるようにする作動可能に連結された必須的な調節要素を含む核酸製作物を意味する。
【0010】
本発明において、前記ベクターは、本発明による核酸構造体を生産するのに適合したものであれば制限なく使用されることができ、プロモーターなどの転写のために必要な要素を含む。前記ベクターは、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターであってよく、好ましくはＤＮＡベクターであってよい。前記ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターのように通常の技術者にとって知られているベクターであれば制限なく使用されることができ、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターを使用することができる。また、前記ベクターは円形分子であることを特徴とすることができる。前記ベクター、好ましく円形ベクターは、例えば、制限酵素によって線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ）されることができる。
【0011】
本発明において、用語「プロモーター」は、転写調節因子が結合するＤＮＡ塩基配列部位を意味し、本発明の目的上、遺伝子発現率を高めるために強力且つ安定した遺伝子発現を誘導することができるプロモーターを使用することができる。本発明において、前記プロモーターは、好ましくはＲＮＡ重合酵素プロモーターであってよく、より好ましくはＴ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターであってよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、用語「ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ、非翻訳領域）」は、ｍＲＮＡの非翻訳領域を言う単語であって、一般的にコード領域の両末端を意味する。特に、５’末端部分を５’ＵＴＲと３’末端部分を３’ＵＴＲと指称する。
本発明において、用語「ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ、非翻訳領域）」は、ｍＲＮＡの非翻訳領域を言う単語であって、一般的にコード領域の両末端を意味する。特に、５’末端部分を５’ＵＴＲと３’末端部分を３’ＵＴＲと指称する。
【0012】
本発明において、用語「ポリ（Ａ）テール（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）」は、ポリアデニル酸またはポリアデニル酸切片とも呼ばれ、真核生物のｍＲＮＡ ３’末端に普遍的に存在するアデニル酸の連続した配列を意味する。その長さは１０ないし２００ヌクレオチド（ｎｔ）程度であり、発現ベクターバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の許容大きさによって多様に調節されることができる。ポリ（Ａ）は、ｍＲＮＡの安定化、翻訳、核から細胞質への輸送などに関与するものと知られている。
【0013】
本発明において、用語「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」は、二本鎖ＲＮＡがダイサー（Ｄｉｃｅｒ）酵素によって切断されて生成される１８～２３ヌクレオチド（ｎｔ）大きさの小さなＲＮＡ断片で、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合してターゲットタンパク質、ｍＲＮＡの発現を抑制するのに使用することができる。前記ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、このとき、センスＲＮＡがｍＲＮＡのうち一部の連続ヌクレオチドの標的配列と同一の核酸配列を含むｓｉＲＮＡ分子であることが好ましい。前記アンチセンス配列は、センス配列と相補的な配列を有することが最も好ましい。
【0014】
本発明において、用語「相補的な配列」は、互いに相補的結合を成す特徴を維持することができれば、１００％相補的配列の外に６０ないし１００％の相補的配列、好ましくは８０％ないし１００％相補的配列、さらに好ましくは９０ないし１００％相補的配列、より一層好ましくは９５％ないし１００％の相補的配列からなることを含んでよい。
本発明において、用語「標的遺伝子」とは、前記ｓｉＲＮＡによって発現が選択的に抑制されるか不活性化される遺伝子である。このような不活性化は、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子のｍＲＮＡを切断することによって達成される。
本発明において、用語「標的遺伝子」とは、前記ｓｉＲＮＡによって発現が選択的に抑制されるか不活性化される遺伝子である。このような不活性化は、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子のｍＲＮＡを切断することによって達成される。
【0015】
本発明において、用語「リボヌクレアーゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）」は、リボ核酸を分解してオリゴヌクレオチドあるいは単一核酸で作る反応を触媒する酵素であって、好ましくは、エンドリボ核酸分解酵素（ｅｎｄｏ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）であり、前記エンドリボ核酸分解酵素は、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ１およびＲＮａｓｅ Ｖを含む。
【0016】
本発明において、前記リボ核酸は、伝令リボ核酸（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）であってよく、前記リボヌクレアーゼとしては、好ましくはＲＮａｓｅ Ｈを使用することができる。本発明の一実施例においては、ＲＮａｓｅ Ｈを使用して本発明による核酸構造体であるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡのポリ（Ａ）－ポリ（Ｔ）混成化部分のリン酸ジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）を加水分解させてｍＲＮＡによる遺伝子発現およびｓｉＲＮＡによるタンパク質発現抑制を同時に達成することができることを確認している。
【0017】
本発明において、用語「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）」は、３’末端にｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス配列を含むｍＲＮＡを意味する。本発明の一実施例においては、ポリ（Ａ）配列および／またはｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列を含む逆方向プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＲＰ）を使用して３’ＵＴＲ真横３’にポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）およびｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）配列が導入されたＤＮＡ鋳型を製造し、製造したＤＮＡ鋳型を利用して試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）を通じて３’末端にｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列を含むｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）」）を製造した。
【0018】
本発明において、用語「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ」は、前記製造したｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）の３’末端に導入されたｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合することができる「混成化配列」をアニーリングした結果、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ ３’末端のポリ（Ａ）テールおよびｓｉＲＮＡ配列（センス／アンチセンス）がそれぞれこれと相補的な混成化配列（アンチセンス／センス）およびｏｌｉｇｏ（ｄＴ）と結合して二本鎖を形成する核酸構造体を意味する。
【0019】
本発明において、前記「混成化配列」は、ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、したがって「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ」は、本明細書内において、「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ」とも表記される。
本発明は、遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体を提供する。
より具体的に、本発明は、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体として、（ｉ）３’末端に５’方向から３’方向に順次に位置するポリ（Ａ）テール（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）；および第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列を含むｍＲＮＡ；および（ｉｉ）前記第１のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合する混成化配列を含む核酸構造体を提供する。
本発明は、遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体を提供する。
より具体的に、本発明は、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体として、（ｉ）３’末端に５’方向から３’方向に順次に位置するポリ（Ａ）テール（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）；および第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列を含むｍＲＮＡ；および（ｉｉ）前記第１のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合する混成化配列を含む核酸構造体を提供する。
【0020】
本発明において、前記混成化配列は、第１のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合する第２のｓｉＲＮＡアンチセンスまたはセンス配列；或いは第１のｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合するＤＮＡアンチセンスまたはセンス配列であることを特徴とする。
本発明において、前記混成化配列は、３’末端に前記ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールと相補的に結合するポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）をさらに含んでよい。前記ポリ（Ｔ）テールは２ないし６ｎｔ長さであってよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記核酸構造体は、第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列の３’末端に追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列のための第１のリンカー配列をさらに含んでよく、前記第１のリンカー配列は、リンカー配列の３’末端に追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列をさらに含んでよい。
また、本発明において、前記核酸構造体は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合する混成化配列；および第２のリンカー配列をさらに含んでよい。前記混成化配列は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合することを特徴とする。
本発明において、前記混成化配列は、３’末端に前記ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールと相補的に結合するポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）をさらに含んでよい。前記ポリ（Ｔ）テールは２ないし６ｎｔ長さであってよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記核酸構造体は、第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列の３’末端に追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列のための第１のリンカー配列をさらに含んでよく、前記第１のリンカー配列は、リンカー配列の３’末端に追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列をさらに含んでよい。
また、本発明において、前記核酸構造体は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合する混成化配列；および第２のリンカー配列をさらに含んでよい。前記混成化配列は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合することを特徴とする。
【0021】
本発明において、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）またはアダプター（ａｄａｐｔｏｒ）配列は、通常の方法による合成オリゴヌクレオチド配列を制限なく使用することができ、好ましくは、前記第１のリンカー配列は、ポリ（Ｕ）テールであってよく、前記第２のリンカー配列は、第１のリンカー配列と相補的に結合するポリ（Ａ）テールであってよいが、これに制限されるものではない。
前記リンカーまたはアダプター配列は、ＤＮＡと混成化されない部位を含んでよい。
前記リンカーまたはアダプター配列は、ＤＮＡと混成化されない部位を含んでよい。
【0022】
本発明において、前記核酸構造体は、下記図１で赤い点線で表示した繰り返し単位を複数個さらに含んでよく、好ましくは１個ないし５個さらに含んでよい。追加される繰り返し単位の個数は、当業者が目的によって適切に調節することができる。
具体的に、前記核酸構造体は、第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列の３’末端に（ａ）および（ｂ）を含む繰り返し単位を複数個さらに含んでよく、前記（ａ）および（ｂ）は、（ａ）追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列のための第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列；および（ｂ）混成化配列；および第２のリンカー配列であることを特徴とし、このとき前記混成化配列は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合することを特徴とする。
具体的に、前記核酸構造体は、第１のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列の３’末端に（ａ）および（ｂ）を含む繰り返し単位を複数個さらに含んでよく、前記（ａ）および（ｂ）は、（ａ）追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列のための第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列；および（ｂ）混成化配列；および第２のリンカー配列であることを特徴とし、このとき前記混成化配列は、前記第１のリンカー配列；および追加のｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス配列に相補的に結合することを特徴とする。
【0023】
繰り返し単位の一部として追加されるｓｉＲＮＡは、ターゲットにする遺伝子が互いに同一であるかまたは異なってよく、前記核酸構造体は、細胞内に注入されると、ＲＮａｓｅ ＨによってｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡの混成化部位が切断されて独立した二本鎖ｓｉＲＮＡに分離されて効果的に標的遺伝子の発現を抑制することができる。互いに異なる２種以上のｓｉＲＮＡを含む場合、２以上のターゲット遺伝子を同時に発現抑制することができる。
また、本発明は、本発明による核酸構造体および核酸伝達体を含む組成物を提供する。
また、本発明は、本発明による核酸構造体および核酸伝達体を含む組成物を提供する。
【0024】
本発明において、用語「核酸伝達体（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」は、本発明による核酸構造体の体内への伝達効率を高めるためのものであって、体内における安定性に優れるだけでなく、薬物としての製造工程が簡単であるという長所がある。
前記核酸伝達体は、これに制限されるものではないが、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、リポソーム、カチオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルションおよびナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を含んでよく、好ましくはナノ粒子であってよい。前記カチオン性高分子には、キトサン、アテロコラーゲン（ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）、カチオン性ポリペプチド（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）などのような天然高分子とｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎ）、線形または分枝型ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｎｅ）、シクロデキストリン系列多価カチオン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ－ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）などのような合成高分子を含む。
前記核酸伝達体は、これに制限されるものではないが、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、リポソーム、カチオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルションおよびナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を含んでよく、好ましくはナノ粒子であってよい。前記カチオン性高分子には、キトサン、アテロコラーゲン（ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）、カチオン性ポリペプチド（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）などのような天然高分子とｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎ）、線形または分枝型ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｎｅ）、シクロデキストリン系列多価カチオン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ－ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）などのような合成高分子を含む。
【0025】
本発明において、前記ナノ粒子は、これに制限されるものではないが、磁性粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）、金（Ａｕ）ナノ粒子、銀（Ａｇ）ナノ粒子、白金（Ｐｔ）ナノ粒子、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）、上方転換ナノ粒子（ｕｐｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＵＣＮＰ）、グラフェン（ｇｒａｐｈｅｎｅ）－ナノ粒子複合体、色染色ナノ粒子（ｃｏｌｏｒ ｄｙｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）およびラテックス（ｌａｔｅｘ）ナノ粒子、シリカナノ粒子（ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、炭素誘導体ナノ粒子（ｃａｒｂｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｌｃｅｓ；例えば、炭素ナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅ）および固形リピッドナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）からなる群より選択されるいずれか一つであってよい。
【0026】
本発明による核酸構造体は、前記のようなナノ粒子に導入される場合、前記核酸構造体のターゲット細胞への伝達が促進し、比較的低い濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達されて高いターゲットタンパク質発現誘導および標的遺伝子発現抑制機能を示すことができる。また、ターゲット以外の他臓器および細胞への非特異的なｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡの伝達を防止することができる。
また、本発明は、本発明による核酸構造体を含む免疫治療用薬学的組成物を提供する。本発明による薬学的組成物は、免疫反応を増加させるか、特定疾病、感染または疾患の治療または予防に好ましい免疫反応の一部を選択的に上昇させることができる。
本発明において、前記免疫治療は、好ましくはがん免疫治療であってよい。
また、本発明は、本発明による核酸構造体を含む免疫治療用薬学的組成物を提供する。本発明による薬学的組成物は、免疫反応を増加させるか、特定疾病、感染または疾患の治療または予防に好ましい免疫反応の一部を選択的に上昇させることができる。
本発明において、前記免疫治療は、好ましくはがん免疫治療であってよい。
【0027】
本発明において、前記がんは、脳腫瘍、陽性星状細胞腫、悪性星状細胞腫、脳下垂体腺腫、脳髄膜腫、脳リンパ腫、乏突起膠腫、頭蓋内咽腫、上衣細胞腫、脳幹腫瘍、頭頸部腫瘍、喉頭がん、中咽頭がん、鼻腔／副鼻腔がん、鼻咽頭がん、唾液腺がん、下咽頭がん、甲状腺がん、胸部腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺がん、縦隔洞腫瘍、食道がん、乳がん、男性乳がん、腹部腫瘍、胃がん、肝がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、小腸がん、大腸がん、肛門がん、膀胱がん、腎臓がん、男性生殖器腫瘍、陰茎がん、尿道がん、前立腺がん、女性生殖器腫瘍、子宮頸部がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮肉腫、腟がん、女性外部生殖器がん、女性尿道がん、皮膚がん、骨髄腫、白血病および悪性リンパ腫からなる群より選択されるいずれか一つであってよいが、これに制限されるものではない。
【0028】
本発明において、前記薬学的組成物は、本発明による核酸構造体を単独で含むか、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含んで提供されることができる。
前記「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常的に胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない組成物を意味し、前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができるが、これに制限されるものではない。
前記「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常的に胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない組成物を意味し、前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができるが、これに制限されるものではない。
【0029】
本発明による薬学的組成物は、前記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでよい。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記セフテゾールに少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また単なる賦形剤の以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、通常使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてよい。
【0030】
前記薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なり、当業者によって適切に選択されることができる。しかし、好ましい効果のために、１日０．０００１ないし１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．００１ないし１００ｍｇ／ｋｇで投与することが良い。投与は、一日に一回投与してよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
前記薬学的組成物は多様な経路で投与されることができ、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、腹腔、子宮内軽膜または脳血管内注射によって投与されることができる。
また、本発明は、本発明による核酸構造体を含むがんワクチンを提供する。本発明による核酸構造体は、抗原提示細胞に抗原を標識して免疫反応を誘導させることができ、同時に免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制することができる。前記核酸構造体は、ナノ粒子と結合した状態でがんワクチンに含まれてよい。
前記薬学的組成物は多様な経路で投与されることができ、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、腹腔、子宮内軽膜または脳血管内注射によって投与されることができる。
また、本発明は、本発明による核酸構造体を含むがんワクチンを提供する。本発明による核酸構造体は、抗原提示細胞に抗原を標識して免疫反応を誘導させることができ、同時に免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制することができる。前記核酸構造体は、ナノ粒子と結合した状態でがんワクチンに含まれてよい。
【0031】
本発明において、前記がんワクチンは、樹枝状細胞をさらに含むものであってよい。例えば、前記がんワクチンは、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で本発明による核酸構造体を樹枝状細胞に伝達した後、形質感染された樹枝状細胞を伝達する形態で提供されることができる。前記樹枝状細胞は、対象体の免疫原性を増加させることができ、対象体内腫瘍の増殖および／または転移を効果的に予防または抑制することができる。
本明細書において、用語「樹枝状細胞」は、抗原を細胞内部に吸収し、これを処理して抗原または抗原から由来したペプチドをＭＨＣクラスＩ複合体またはＭＨＣクラス複合体とともに提示する抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を意味する。樹枝状細胞は、成熟度によって未成熟樹枝状細胞と成熟樹枝状細胞とに分類する。
本明細書において、用語「樹枝状細胞」は、抗原を細胞内部に吸収し、これを処理して抗原または抗原から由来したペプチドをＭＨＣクラスＩ複合体またはＭＨＣクラス複合体とともに提示する抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を意味する。樹枝状細胞は、成熟度によって未成熟樹枝状細胞と成熟樹枝状細胞とに分類する。
【0032】
前記「未成熟樹枝状細胞」は、成熟初期ステップで発見されるものであって、成熟樹枝状細胞と同様にＣＤ１４のような細胞表面マーカーを発現せず、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ４０を低い水準で発現し、ＣＤ１ａおよびＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ１を通常の水準で発現する樹枝状細胞を言う。
前記「成熟樹枝状細胞」は、未成熟樹枝状細胞が成熟化して形成された細胞を意味し、Ｂ細胞およびＴ細胞活性に関与する細胞表面マーカー、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラス（ＨＬＡ－ＤＲ）、細胞接着因子（ＣＤ５４、ＣＤ１８、ＣＤ１１）、共同刺激因子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ４０）が未成熟樹枝状細胞に比べて高い水準または相対的に増加した水準で発現する細胞を意味する。
前記「成熟樹枝状細胞」は、未成熟樹枝状細胞が成熟化して形成された細胞を意味し、Ｂ細胞およびＴ細胞活性に関与する細胞表面マーカー、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラス（ＨＬＡ－ＤＲ）、細胞接着因子（ＣＤ５４、ＣＤ１８、ＣＤ１１）、共同刺激因子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ４０）が未成熟樹枝状細胞に比べて高い水準または相対的に増加した水準で発現する細胞を意味する。
【0033】
例えば、本発明の一実施例においては、本発明による核酸構造体にオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）を発現するｍＲＮＡおよびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを導入したｍＲＮＡ－ｓｉＳＴＡＴ３を形質注入した結果、ＣＤ４０およびＣＤ８０マーカーの発現量が顕著に増加して分離したｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを混合して投与することより樹枝状細胞成熟促進効果に遥かに優れることを確認した。
本発明はまた、免疫治療に使用するための本発明による核酸構造体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、免疫治療のための薬剤の製造における、本発明による核酸構造体の用途を提供する。
本発明はまた、免疫治療に使用するための本発明による核酸構造体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、免疫治療のための薬剤の製造における、本発明による核酸構造体の用途を提供する。
【0034】
本発明はまた、本発明による核酸構造体を、これを必要とする個体に投与するステップを含む免疫治療方法を提供する。
本発明において、前記免疫治療は、がん免疫治療であってよい。より具体的に、がん治療用途であってよい。
また、本発明は、
１）３’末端に５’方向から３’方向に順次に位置するポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）およびｓｉＲＮＡアンチセンスまたはセンス配列が導入されたＤＮＡ鋳型を製造するステップ；
２）ＤＮＡ鋳型にＲＮＡ重合酵素を含む反応溶液を処理して３’末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡを得るステップ；および
３）３’末端にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）が連結されたｓｉＲＮＡを前記ｍＲＮＡ産物にアニーリングするステップ；を含むｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体の製造方法を提供する。
本発明において、前記免疫治療は、がん免疫治療であってよい。より具体的に、がん治療用途であってよい。
また、本発明は、
１）３’末端に５’方向から３’方向に順次に位置するポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）およびｓｉＲＮＡアンチセンスまたはセンス配列が導入されたＤＮＡ鋳型を製造するステップ；
２）ＤＮＡ鋳型にＲＮＡ重合酵素を含む反応溶液を処理して３’末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡを得るステップ；および
３）３’末端にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）が連結されたｓｉＲＮＡを前記ｍＲＮＡ産物にアニーリングするステップ；を含むｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸構造体の製造方法を提供する。
【0035】
前記１）ステップにおいて、ＤＮＡ鋳型はｍＲＮＡ合成のための転写鋳型であって、Ｔ７プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）および３’ＵＴＲを含むＤＮＡベクター（ｐＵＣＩＤＴ－Ａｍｐ ｖｅｃｔｏｒ）を製造し、前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを遂行してベクターを線形化した後、増幅させたものであってよい。
【0036】
ＰＣＲは、ＤＮＡベクターを１次鋳型にしてＰＣＲ反応混合液、正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）として５’－ＴＴＧＧＡＣＣＣＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧ－３’（配列番号４）からなるオリゴヌクレオチド、逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）として「５’－ｓｉＲＮＡ配列－ポリ（Ａ）－ＤＮＡベクターと特異的に結合するプライマー配列－３’（逆方向プライマー）」構成に基盤したものを使用して遂行した。具体的に、前記逆方向プライマーは、ポリ（Ａ）配列および／またはｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列を含み、製造されたＤＮＡ鋳型の３’ＵＴＲ真横３’にポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）およびｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）配列を導入させた。本発明の一実施例において、前記ＰＣＲ反応混合液は、２Ｘ ＴＯＰｓｉｍｐｌｅTM ＤｒｙＭＩＸ－ＨＯＴ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）を使用したが、これに制限されるものではない。
【0037】
ＤＮＡ鋳型を製造するためのＰＣＲの条件は、ＰＣＲ遂行のための３ステップ、すなわち変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ、混成（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ、延長（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステップを遂行するための温度および時間をそれぞれ維持することができ、前記変性ステップを遂行するための条件は、８５℃ないし１０５℃ ５分ないし１５分、好ましくは９５℃ １０分、前記混成ステップを遂行するための条件は、４０℃ないし６５℃ ２０秒ないし４０秒、好ましくは５９℃ ３０秒、前記延長ステップを遂行するための条件は、５０℃ないし８０℃ ３０秒ないし２分、好ましくは７２℃ １分であってよい。前記ＰＣＲ遂行のための特定された温度および時間範囲は、ＰＣＲを遂行するにあたって実現可能な範囲内で調節可能である。
【0038】
本発明の一実施例において、前記ＤＮＡ鋳型を製造するためのＰＣＲの条件は、初期変性（Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）９５℃ １０分後、変性９５℃ ３秒、混成５９℃ ３０秒、延長７２℃ １分を１回転に計３０回転を進行し、追加延長（Ｆｉｎａｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）７２℃ ５分を進行した。また、増幅されたＰＣＲ反応産物は、ＡｃｃｕＰｒｅｐTMＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して精製した。
【0039】
前記２）ステップは、試験管内転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）ステップであって、１）ステップで製造したＤＮＡ鋳型にＲＮＡ重合酵素を含む反応溶液を処理して３’末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ」）を製造することを特徴とすることができる。本発明の一実施例において、前記試験管内転写は、製造したＤＮＡ鋳型に反応溶液を処理して３７℃で１６時間の間培養した後、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ Ｉを１μｌ追加して３７℃で１５分間反応させて遂行した。ただし、前記試験管内転写のための具体的な反応条件は、実現可能な範囲内で調節可能である。
【0040】
前記３）ステップにおいて、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）のための条件は、配列－依存的であり環境的変数によって多様であるが、４０ないし８０℃ ５分ないし１５分、好ましくは７５℃ １０分であってよい。本発明の一実施例において、前記アニーリングは、７５℃ １０分遂行後、４℃までファーストクーリング（急冷）して遂行した。
【0041】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものであるだけであって、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、これから多様な変形および均等な他の実施例が可能であるという点を理解するはずである。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付の特許請求の範囲の技術的思想によって決まらなければならないだろう。
【実施例】
【0042】
実施例．本発明による核酸構造体の製造
ＤＮＡ鋳型製造
遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体を製造するために、次のように実験を遂行した。先ず、ｍＲＮＡ合成のための転写鋳型として、Ｔ７プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）および３’ＵＴＲを含むＤＮＡベクター（ｐＵＣＩＤＴ－Ａｍｐ ｖｅｃｔｏｒ）を製造した。前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを遂行してベクターを線形化し、Ｔ７プロモーターから３’ＵＴＲまで増幅させた。ＰＣＲは、ＴＯＰｓｉｍｐｌｅTM ＤｒｙＭＩＸ－ＨＯＴ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）を使用して遂行し、具体的なＰＣＲ条件は、下記表１のとおりである。増幅されたＰＣＲ反応産物は、ＡｃｃｕＰｒｅｐTM ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して精製した。
ＤＮＡ鋳型製造
遺伝子発現および抑制が同時に可能な核酸構造体を製造するために、次のように実験を遂行した。先ず、ｍＲＮＡ合成のための転写鋳型として、Ｔ７プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）および３’ＵＴＲを含むＤＮＡベクター（ｐＵＣＩＤＴ－Ａｍｐ ｖｅｃｔｏｒ）を製造した。前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを遂行してベクターを線形化し、Ｔ７プロモーターから３’ＵＴＲまで増幅させた。ＰＣＲは、ＴＯＰｓｉｍｐｌｅTM ＤｒｙＭＩＸ－ＨＯＴ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）を使用して遂行し、具体的なＰＣＲ条件は、下記表１のとおりである。増幅されたＰＣＲ反応産物は、ＡｃｃｕＰｒｅｐTM ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用して精製した。
【0043】
【表1】
【0044】
このとき、ポリ（Ａ）配列および／またはｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列を含む逆方向プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＲＰ）を使用して３’ＵＴＲ真横３’にポリ（Ｔ）テール（ｐｏｌｙ（Ｔ）ｔａｉｌ）およびｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）配列が導入されたＤＮＡ鋳型を製造した（図２のａ）。すなわち、前記逆方向プライマーは、次の構成に基盤したものを使用した。
５’－ｓｉＲＮＡ配列－ポリ（Ａ）－ＤＮＡベクターと特異的に結合するプライマー配列－３’（逆方向プライマー）
５’－ｓｉＲＮＡ配列－ポリ（Ａ）－ＤＮＡベクターと特異的に結合するプライマー配列－３’（逆方向プライマー）
【0045】
本実施例において、本発明者らは、前記逆方向プライマーとして、１２０ｎｔポリ（Ａ）配列のみからなるプライマー、１２０ｎｔポリ（Ａ）配列とｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列とを含むプライマー、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）ｍＲＮＡを標的するｓｉＲＮＡ（以下、ｓｉＧＦＰ）、赤い蛍光タンパク質（Ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＦＰ）および青蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＦＰ）をコードするｍＲＮＡを使用した。
【0046】
ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ合成
前記実施例において製造したＤＮＡ鋳型を使用して、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）を遂行して末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ（以下、「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）」という）を合成した。Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰおよびキャップ類似体（ｃａｐ ａｎａｌｏｇｕｅ）を含む反応溶液（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔTMＴ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用して試験管内転写を遂行し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）処理で鋳型ＤＮＡを除去してｍＲＮＡのみを回収した。
具体的に、反応溶液をチューブに入れて３７℃で１６時間の間培養した後、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ Ｉを１μｌ追加して３７℃で１５分間反応させ、反応産物をＭＥＧＡｃｌｅａｒTM Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用して精製した。反応溶液を構成するすべての成分およびその用量、濃度は、下記表２のとおりである。これを通じて合成されたｍＲＮＡは、キャップ類似体を転写反応に添加することで生産された５’－キャップ（５’－ｃａｐ）を５’末端に含んだ（図２のｂ）。
前記実施例において製造したＤＮＡ鋳型を使用して、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）を遂行して末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ（以下、「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）」という）を合成した。Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰおよびキャップ類似体（ｃａｐ ａｎａｌｏｇｕｅ）を含む反応溶液（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔTMＴ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用して試験管内転写を遂行し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）処理で鋳型ＤＮＡを除去してｍＲＮＡのみを回収した。
具体的に、反応溶液をチューブに入れて３７℃で１６時間の間培養した後、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ Ｉを１μｌ追加して３７℃で１５分間反応させ、反応産物をＭＥＧＡｃｌｅａｒTM Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用して精製した。反応溶液を構成するすべての成分およびその用量、濃度は、下記表２のとおりである。これを通じて合成されたｍＲＮＡは、キャップ類似体を転写反応に添加することで生産された５’－キャップ（５’－ｃａｐ）を５’末端に含んだ（図２のｂ）。
【0047】
【表2】
【0048】
本発明による核酸構造体の製造
次に、ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴと連結させたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ－Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ））を含む逆方向プライマーを前記実施例において製造したｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）して、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）の一部が混成化配列と相補的に結合して二本鎖を形成する、本発明による核酸構造体（「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ」を製造した。このとき、前記混成化配列は、ポリ（Ｔ）を含むｓｉＲＮＡ配列またはポリ（Ｔ）を含むＤＮＡ配列に該当する。
次に、ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴと連結させたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ－Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ））を含む逆方向プライマーを前記実施例において製造したｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）して、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）の一部が混成化配列と相補的に結合して二本鎖を形成する、本発明による核酸構造体（「ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ」を製造した。このとき、前記混成化配列は、ポリ（Ｔ）を含むｓｉＲＮＡ配列またはポリ（Ｔ）を含むＤＮＡ配列に該当する。
【0049】
具体的に、アニーリングは、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）とｓｉＲＮＡ－Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を同じチューブに入れて混合し、７５℃で１０分間反応させた後、４℃までファーストクーリング（急冷）した。このとき、ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ部位は、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）のポリ（Ａ）テール（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）にアニーリングされ、ｓｉＲＮＡ配列（アンチセンス／センス）は、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）の３’末端に導入されたｓｉＲＮＡに相補的にアニーリングされ（図２のｃ）、その結果、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）３’末端のポリ（Ａ）テールおよびｓｉＲＮＡ配列（センス／アンチセンス）がそれぞれこれと相補的なｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）およびｏｌｉｇｏ（ｄＴ）と結合して二本鎖を形成する本発明による核酸構造体が形成された（以下、「（またはｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡあるいはｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ）」という）。前記ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡの製造過程を図式化して図３に示した。
本実施例および実験例において使用したＤＮＡベクター、すべてのプライマー配列、すべてのｓｉＲＮＡ配列を下記表３に示した。すべての配列は、ＩＤＴ（遺伝子合成サービス）から提供されて使用した。
本実施例および実験例において使用したＤＮＡベクター、すべてのプライマー配列、すべてのｓｉＲＮＡ配列を下記表３に示した。すべての配列は、ＩＤＴ（遺伝子合成サービス）から提供されて使用した。
【0050】
【表3】
【0051】
本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡは、細胞内環境でＲｎａｓｅ ＨによってｍＲＮＡのポリ（Ａ）とｓｉＲＮＡのポリ（Ｔ）との間に形成された二本鎖混成体が切断され、ターゲットタンパク質を発現させ得るｍＲＮＡと特定遺伝子の発現を抑制させることができるｓｉＲＮＡとに分離され、これを通じて対象体でタンパク質の発現と抑制を同時に可能にする（図４）。
一方、図４に示したように、本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’末端にｓｉＲＮＡが一つ以上連結され得ることを特徴とする。このとき、一番目のｓｉＲＮＡの導入以降、二番目のｓｉＲＮＡからは前記アニーリングと同一の条件で実験を遂行するが、逆方向プライマーにｓｉＲＮＡ配列を追加して進行する。追加されるｓｉＲＮＡの場合、逆方向プライマーに対して導入しようとする個数だけｓｉＲＮＡを導入して追加することができることを特徴とする。例えば、二番目のｓｉＲＮＡを導入するために使用したすべてのプライマーを下記表４に示した。
一方、図４に示したように、本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’末端にｓｉＲＮＡが一つ以上連結され得ることを特徴とする。このとき、一番目のｓｉＲＮＡの導入以降、二番目のｓｉＲＮＡからは前記アニーリングと同一の条件で実験を遂行するが、逆方向プライマーにｓｉＲＮＡ配列を追加して進行する。追加されるｓｉＲＮＡの場合、逆方向プライマーに対して導入しようとする個数だけｓｉＲＮＡを導入して追加することができることを特徴とする。例えば、二番目のｓｉＲＮＡを導入するために使用したすべてのプライマーを下記表４に示した。
【0052】
【表4】
【0053】
本実施例において、本発明者らは、下記のようにｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス配列、長さを異にするＯｌｉｇｏ（ｄＴ）を多様な構成で組み合わせたｓｉＲＮＡ－Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を使用してｍＲＮＡのタンパク質発現効率およびｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能を評価し、遺伝子発現および抑制効果に優れた核酸構造体の最適構造を導出しようとした（図５）。
【0054】
５’－ｓｉＧＦＰと相補的に結合するｓｉＲＮＡ配列（アンチセンス／センス）－ｄＴｄＴ－３’（Ｔ２）
５’－ｓｉＧＦＰと相補的に結合するｓｉＲＮＡ配列（アンチセンス／センス）－ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ－３’（Ｔ６）
５’－ｓｉＧＦＰと相補的に結合するＤＮＡ配列（アンチセンス／センス）－ｄＴｄＴｄＴｄＴ－３’（ＤＮＡ）
５’－ｓｉＧＦＰと相補的に結合するｓｉＲＮＡ配列（アンチセンス／センス）－ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ－３’（Ｔ６）
５’－ｓｉＧＦＰと相補的に結合するＤＮＡ配列（アンチセンス／センス）－ｄＴｄＴｄＴｄＴ－３’（ＤＮＡ）
【0055】
実験例１．各反応産物の確認
前記実施例の各反応が終わった後、反応産物を１％アガロースゲルに１００Ｖ電圧で３０分間電気泳動してＰＣＲ反応産物、試験管内転写産物を確認した結果を図６に示した。
図６のａに示したように、逆方向プライマーを使用して増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、それぞれ９７１ｂｐ（ｐｏｌｙ（Ａ）１２０、レーン４）および９９２ｂｐ（ｐｏｌｙ（Ａ）１２０－ＡＳ ｓｉＧＦＰ、レーン５）であることを確認した。前記結果を通じて、ＰＣＲを遂行することによって３’ＵＴＲ真横３’にポリ（Ｔ）ｔａｉｌおよびｓｉＲＮＡ配列が導入されるようにデザインされた逆方向プライマーを通じてＤＮＡ鋳型が効果的に増幅されたことを確認した。
前記実施例の各反応が終わった後、反応産物を１％アガロースゲルに１００Ｖ電圧で３０分間電気泳動してＰＣＲ反応産物、試験管内転写産物を確認した結果を図６に示した。
図６のａに示したように、逆方向プライマーを使用して増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、それぞれ９７１ｂｐ（ｐｏｌｙ（Ａ）１２０、レーン４）および９９２ｂｐ（ｐｏｌｙ（Ａ）１２０－ＡＳ ｓｉＧＦＰ、レーン５）であることを確認した。前記結果を通じて、ＰＣＲを遂行することによって３’ＵＴＲ真横３’にポリ（Ｔ）ｔａｉｌおよびｓｉＲＮＡ配列が導入されるようにデザインされた逆方向プライマーを通じてＤＮＡ鋳型が効果的に増幅されたことを確認した。
【0056】
また、図６のｂに示したように、前記ＤＮＡ鋳型を使用して試験管内転写を遂行した結果、それぞれ３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）１２０配列が導入されたｍＲＦＰ（レーン２）および３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）１２０－ＡＳ ｓｉＧＦＰ配列が導入されたｍＲＦＰ（レーン３）が合成されたことを確認した。
同様に、前記実施例に記載した方法で製造したｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体を確認した結果を図７に示した。
同様に、前記実施例に記載した方法で製造したｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体を確認した結果を図７に示した。
【0057】
図７のａに示したように、ｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）１２０配列のみ導入されたものとｐｏｌｙ（Ａ）１２０とアンチセンスｓｉＧＦＰ配列が共に導入された形態のｍＲＦＰをセンスｓｉＧＦＰ鎖とファーストクーリングをさせた結果、ｐｏｌｙ（Ａ）１２０とアンチセンスｓｉＧＦＰ配列が共に導入された形態のｍＲＦＰに注入したセンスｓｉＧＦＰのバンドが薄くなることを確認することで、センスｓｉＧＦＰが成功的にｐｏｌｙ（Ａ）１２０とアンチセンスｓｉＧＦＰ配列が導入されたｍＲＦＰにアニーリングされたことを確認した。
【0058】
また、図７のｂに示したように、ＦＩＴＣ標識されたセンスｓｉＧＦＰ（ＦＩＴＣ－ＳＳ ｓｉＧＦＰ、レーン１）より、３’末端にアンチセンスｓｉＧＦＰが導入されたｍＲＦＰ（ｍＲＦＰ－ＡＳ ｓｉＧＦＰ）に対してＦＩＴＣ標識されたセンスｓｉＧＦＰがアニーリングされた場合（ｍＲＦＰ－ＡＳ ｓｉＧＦＰ＋ＦＩＴＣ－ＳＳ ｓｉＧＦＰ、レーン２）、バンドがさらに上側で現れることを確認した。前記結果を通じて、３’末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡと前記ｓｉＲＮＡ配列に相補的に結合するｓｉＲＮＡをアニーリングさせると、相互間に部分的に混成化されたｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体が形成されることを確認した。
【0059】
実験例２．各構造体のタンパク質発現能力評価
前記実施例において製造した互いに異なるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体のタンパク質発現効果を確認した。具体的に、細胞を９６－ウェルプレートにウェル当たり１×１０4個でシーディングし、形質注入試薬を使用して細胞を１０ｐｇ ｍＲＮＡ／ｃｅｌｌの用量の各構造体で形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。形質注入２４時間後、フローサイトメーターＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を使用して各実施例で発現される赤い蛍光タンパク質の蛍光強度を測定して各構造体の翻訳効率（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を確認し、その結果を図８に示した。実験に使用したすべての実施例を下記表５に示した。下記表５において、ｍＲＮＡ－ＳＳ／ＳＳまたはｍＲＮＡ－ＳＳ／ＡＳは、ｓｉＧＦＰ－Ｔ２配列とアニーリングされたことを意味し、ｍＲＮＡ－ＡＳ／ＳＳ（ＤＮＡ）またはｍＲＮＡ－ＡＳ／ＡＳ（ＤＮＡ）は、ｓｉＧＦＰ配列を有しているＤＮＡに追加的にｄＴ配列が４個導入された配列とアニーリングされたことを意味する。
前記実施例において製造した互いに異なるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体のタンパク質発現効果を確認した。具体的に、細胞を９６－ウェルプレートにウェル当たり１×１０4個でシーディングし、形質注入試薬を使用して細胞を１０ｐｇ ｍＲＮＡ／ｃｅｌｌの用量の各構造体で形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。形質注入２４時間後、フローサイトメーターＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を使用して各実施例で発現される赤い蛍光タンパク質の蛍光強度を測定して各構造体の翻訳効率（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を確認し、その結果を図８に示した。実験に使用したすべての実施例を下記表５に示した。下記表５において、ｍＲＮＡ－ＳＳ／ＳＳまたはｍＲＮＡ－ＳＳ／ＡＳは、ｓｉＧＦＰ－Ｔ２配列とアニーリングされたことを意味し、ｍＲＮＡ－ＡＳ／ＳＳ（ＤＮＡ）またはｍＲＮＡ－ＡＳ／ＡＳ（ＤＮＡ）は、ｓｉＧＦＰ配列を有しているＤＮＡに追加的にｄＴ配列が４個導入された配列とアニーリングされたことを意味する。
【0060】
【表5】
【0061】
図８に示したように、３’末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡを形質注入した実施例において共通的に翻訳効率が低くなったことを確認した。これに対し、ｍＲＮＡ（ＳＳ）にｓｉＧＦＰ（ＡＳ）－ＴＴＴＴ（ＤＮＡ）をアニーリングさせた実施例とｍＲＮＡ（ＡＳ）にｓｉＧＦＰ（ＳＳ）－ＴＴＴＴ（ＤＮＡ）をアニーリングさせた実施例の場合、減少された翻訳効率が顕著に増加し、ｍＲＦＰを形質注入した場合よりも蛍光強度が強くてｍＲＮＡのタンパク質発現能力が完全に回復したことを確認した。
【0062】
前記結果を通じて、３’末端にｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列を含むｍＲＮＡと、前記ｓｉＲＮＡに相補的に結合するｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）配列およびｍＲＮＡに相補的に結合するＯｌｉｇｏ（ｄＴ）を含むｓｉＲＮＡを混成化させると、ｓｉＲＮＡ配列の結合によって阻害されたｍＲＮＡの翻訳効率が、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）のｓｉＲＮＡ配列にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）されたＤＮＡ配列によって回復できることを確認した。これは、本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド構造体が細胞内ＲＮａｓｅ Ｈによって切られる機序によるものと見られる。また、ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）にアニーリングさせたｓｉＲＮＡ－ｄＴｄＴ（Ｔ２）の場合、タンパク質翻訳効率が阻害されることを確認することでｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）とアニーリングされたＤＮＡのシーケンスの長さが少なくとも２個以上となってこそ細胞内ＲＮａｓｅ Ｈによって追加的に導入されたｓｉＲＮＡシーケンスが切られてｍＲＮＡタンパク翻訳効率が回復できることが分かった。よって、以後の実験ではｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ（ＳＳ ｏｒ ＡＳ）にｓｉＲＮＡ－ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ（Ｔ６）をアニーリングさせて細胞内導入時にＲＮａｓｅ ＨによってｍＲＮＡとｓｉＲＮＡとに分離してｍＲＮＡのタンパク質翻訳効率およびｓｉＲＮＡのタンパク質抑制効率が維持できるようにデザインした。
【0063】
実験例３．各構造体のタンパク質発現能力および遺伝子発現抑制能力評価
前記実施例において製造した互いに異なるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ構造体のタンパク質発現能力および遺伝子発現抑制効果を確認した。具体的に、細胞を９６－ウェルプレートにウェル当たり１×１０4個でシーディングし、形質注入試薬を使用して細胞を１０ｐｇ ｍＲＮＡ／ｃｅｌｌの用量の各構造体で形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。形質注入２４、４８時間後、フローサイトメーターＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を使用して各実施例で発現される青い蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質の蛍光強度を測定して各構造体のタンパク質発現効率を確認し、その結果を図９および図１０に示した。実験に使用したすべての実施例を下記表６に示した。
前記実施例において製造した互いに異なるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ構造体のタンパク質発現能力および遺伝子発現抑制効果を確認した。具体的に、細胞を９６－ウェルプレートにウェル当たり１×１０4個でシーディングし、形質注入試薬を使用して細胞を１０ｐｇ ｍＲＮＡ／ｃｅｌｌの用量の各構造体で形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。形質注入２４、４８時間後、フローサイトメーターＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を使用して各実施例で発現される青い蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質の蛍光強度を測定して各構造体のタンパク質発現効率を確認し、その結果を図９および図１０に示した。実験に使用したすべての実施例を下記表６に示した。
【0064】
【表6】
【0065】
図９のａに示したように、３’末端にｓｉＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡを形質注入した実施例において青い蛍光強度が減少し、これを通じてｓｉＲＮＡ配列を連結することによってタンパク質発現効率が低くなったことを確認した。これに対し、ｍＢＦＰ（ＳＳ）にｓｉＧＦＰ（ＡＳ）－ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）、ｓｉＧＦＰ（ＡＳ）－ＴＴＴＴ（ＤＮＡ）をアニーリングさせた実施例とｍＢＦＰ（ＡＳ）にｓｉＧＦＰ（ＳＳ）－ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）、ｓｉＧＦＰ（ＳＳ）－ＴＴＴＴ（ＤＮＡ）をアニーリングさせた実施例の場合、減少された翻訳効率が顕著に増加し、ｍＢＦＰを形質注入した場合よりも蛍光強度が強くてｍＲＮＡのタンパク質発現能力が完全に回復したことを確認した。
【0066】
前記結果を通じて、３’末端にｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列を含むｍＲＮＡと、前記ｓｉＲＮＡに相補的に結合するｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）配列を含むｓｉＲＮＡを混成化させる場合（ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡにｓｉＲＮＡ配列を連結させることによる翻訳効率の減少を克服できることを確認した。さらに、減少された翻訳効率は、アニーリングされるｓｉＲＮＡの３’末端に位置するＯｌｉｇｏ（ｄＴ）がＴ２である場合よりはＴ６が、Ｔ６である場合よりはＴ４であるとき顕著に増加することを確認した。
【0067】
一方、図９のｂに示したように、ｍＢＦＰ（ＳＳ）にｓｉＧＦＰ（ＡＳ）－ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）をアニーリングさせた実施例とｍＢＦＰ（ＡＳ）にｓｉＧＦＰ（ＳＳ）－ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）をアニーリングさせた実施例において緑色蛍光強度が減少し、特に測定された蛍光強度が正常ｓｉＲＮＡを形質注入した場合と類似することを確認した。
前記結果を通じて、ｍＲＮＡのタンパク質発現とは独立して、３’末端にｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列を含むｍＲＮＡと、前記ｓｉＲＮＡに相補的に結合するｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）配列を含むｓｉＲＮＡを混成化させる場合（ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ）、前記ｓｉＲＮＡが標的する遺伝子の発現が顕著に抑制されることを確認した。特に、タンパク質発現抑制効率は、アニーリングされるｓｉＲＮＡの３’末端に位置するＯｌｉｇｏ（ｄＴ）がＴ６である場合に最も高いことを確認した。
前記結果を通じて、ｍＲＮＡのタンパク質発現とは独立して、３’末端にｓｉＲＮＡ（センス／アンチセンス）配列を含むｍＲＮＡと、前記ｓｉＲＮＡに相補的に結合するｓｉＲＮＡ（アンチセンス／センス）配列を含むｓｉＲＮＡを混成化させる場合（ｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ）、前記ｓｉＲＮＡが標的する遺伝子の発現が顕著に抑制されることを確認した。特に、タンパク質発現抑制効率は、アニーリングされるｓｉＲＮＡの３’末端に位置するＯｌｉｇｏ（ｄＴ）がＴ６である場合に最も高いことを確認した。
【0068】
このような結果は、形質注入４８時間後にも類似して示されることを確認した。ただし、図１０のａに示したように、ｍＲＮＡにｓｉＲＮＡ配列を連結させることによる減少された翻訳効率は、アニーリングされるｓｉＲＮＡの３’末端に位置するＯｌｉｇｏ（ｄＴ）がＴ２またはＴ４であるとき最も大きく増加した。また、図１０のｂに示したように、遺伝子発現抑制効率は、ｍＢＦＰ（ＡＳ）にｓｉＧＦＰ（ＳＳ）－ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）をアニーリングさせた実施例において最も高かった。
【0069】
上述した分析結果、本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体は、高効率で細胞に同時に導入され、導入された後に細胞内ＲＮａｓｅによってｍＲＮＡとｓｉＲＮＡとの間に形成された二本鎖混成体が切断されてターゲットタンパク質を発現させることができるｍＲＮＡと特定遺伝子の発現を抑制させることができるｓｉＲＮＡとに分離されることを確認した。さらに、このような特異的構造を有することで、本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体は、一つの細胞でｍＲＮＡによるターゲットタンパク質の発現およびｓｉＲＮＡによる特定遺伝子の発現抑制を同時に成功的に達成することができることを確認した。
【0070】
実験例４．本発明による核酸構造体の免疫原性向上能力評価
ｍＲＮＡは、トール－類似受容体（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）を刺激して免疫反応を誘導する効果があると知られている。すなわち、ｍＲＮＡは、自体に免疫反応誘導効果があると同時に抗原（タンパク質）発現が可能であって別途のアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）なしにもワクチンとして活用可能である。一方、このようなｍＲＮＡ基盤ワクチンは樹枝状細胞やＴ細胞に特定抗原を発現させるが、このとき、ＳＴＡＴ３タンパク質は免疫反応活性化を抑制して樹枝状細胞の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を抑制する。
ｍＲＮＡは、トール－類似受容体（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）を刺激して免疫反応を誘導する効果があると知られている。すなわち、ｍＲＮＡは、自体に免疫反応誘導効果があると同時に抗原（タンパク質）発現が可能であって別途のアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）なしにもワクチンとして活用可能である。一方、このようなｍＲＮＡ基盤ワクチンは樹枝状細胞やＴ細胞に特定抗原を発現させるが、このとき、ＳＴＡＴ３タンパク質は免疫反応活性化を抑制して樹枝状細胞の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を抑制する。
【0071】
よって、本発明者らは、本発明による核酸構造体を活用して、抗原を発現するように設計されたｍＲＮＡ構造体にＳＴＡＴ３の発現を抑制するｓｉＲＮＡ配列を導入すると、免疫回避妨害を受けないと同時に樹枝状細胞の成熟を効果的に促進することができるものと判断して、次のように実験を遂行した。先ず、前記実施例に記載したことと同一の方法で、本発明による核酸構造体にオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）を発現するｍＲＮＡおよびＳＴＡＴ３遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを導入した。比較実験群としては、ＳＴＡＴ３を標的するｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＴＡＴ３）、オボアルブミンを発現するｍＲＮＡとｓｉＳＴＡＴ３の単純混合物（ｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３）を使用した。実験に使用したすべてのｍＲＮＡとｓｉＲＮＡ配列は、前記実施例内の表３に記載した。
【0072】
４－１．ＳＴＡＴ３タンパク質発現抑制効果
骨髄－由来樹枝状細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＢＭＤＣ）に前記製造したｓｉＳＴＡＴ３、ｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３の単純混合物（ｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３の単純混合物）およびｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３構造体をそれぞれ処理した。具体的に、ＢＭＤＣ（１×１０6ｃｅｌｌｓ／ウェル）を１０％ ＦＢＳと抗生剤（１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＸ－ｖｉｖｏ １５ ｍｅｄｉａで３７℃で２４時間の間２４－ウェルプレートで培養した。培養したＢＭＤＣを対象にｓｉＳＴＡＴ３、ｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３およびｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３をそれぞれ形質注入した。各ＢＭＤＣでＳＴＡＴ３遺伝子の発現程度をｑＲＴ－ＰＣＲ方法を使用して分析し、その結果を図１１に示した。
骨髄－由来樹枝状細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＢＭＤＣ）に前記製造したｓｉＳＴＡＴ３、ｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３の単純混合物（ｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３の単純混合物）およびｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３構造体をそれぞれ処理した。具体的に、ＢＭＤＣ（１×１０6ｃｅｌｌｓ／ウェル）を１０％ ＦＢＳと抗生剤（１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＸ－ｖｉｖｏ １５ ｍｅｄｉａで３７℃で２４時間の間２４－ウェルプレートで培養した。培養したＢＭＤＣを対象にｓｉＳＴＡＴ３、ｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３およびｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３をそれぞれ形質注入した。各ＢＭＤＣでＳＴＡＴ３遺伝子の発現程度をｑＲＴ－ＰＣＲ方法を使用して分析し、その結果を図１１に示した。
【0073】
図１１に示したように、本発明による核酸構造体にｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３を導入したｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）処理時、ｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３を単純混合したｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３に比べてＳＴＡＴ３発現が顕著に抑制されることを確認した。前記結果を通じて、分離されたｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを混合して投与することよりタンパク質発現を目的とするｍＲＮＡとｓｉＲＮＡが結合された形態のｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体を投与する場合に免疫原性向上効果に遥かに優れることを確認した。
また、前記発現変化の確認結果をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを通じて確認し、その結果を図１２に示した。
図１２において確認できるように、ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡが結合された形態のｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体を投与する場合に免疫原性向上効果に遥かに優れることを確認した。
また、前記発現変化の確認結果をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを通じて確認し、その結果を図１２に示した。
図１２において確認できるように、ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡが結合された形態のｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体を投与する場合に免疫原性向上効果に遥かに優れることを確認した。
【0074】
４－２．樹枝状細胞成熟促進効果
前記実験例４－１に記載したことと同一の方法で骨髄－由来樹枝状細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＢＭＤＣ）に前記製造したｓｉＳＴＡＴ３、ｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３およびｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３構造体をそれぞれ処理して１２時間ないし４８時間の間培養した。一部細胞を取って細胞表面で発現するＣＤ４０およびＣＤ８０マーカーの発現量をフローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）を通じて分析した。その結果を図１３に示した。
前記実験例４－１に記載したことと同一の方法で骨髄－由来樹枝状細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＢＭＤＣ）に前記製造したｓｉＳＴＡＴ３、ｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３およびｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３構造体をそれぞれ処理して１２時間ないし４８時間の間培養した。一部細胞を取って細胞表面で発現するＣＤ４０およびＣＤ８０マーカーの発現量をフローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）を通じて分析した。その結果を図１３に示した。
【0075】
図１３に示したように、本発明による核酸構造体にｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３を導入したｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３処理時、ｍＯＶＡおよびｓｉＳＴＡＴ３を単純混合したｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３に比べて成熟した樹枝状細胞の表現型であるＣＤ４０およびＣＤ８０の発現がいずれも顕著に増加することを確認した。前記結果を通じて、分離されたｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを混合して投与することよりタンパク質発現を目的とするｍＲＮＡとｓｉＲＮＡが結合された形態のｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体を投与する場合に樹枝状細胞成熟促進効果に遥かに優れることを確認した。
【0076】
４－３．オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）発現確認
ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）構造体を樹枝状細胞に処理した後、ＯＶＡの発現量をＥＬＩＳＡを通じて測定して、その結果を図１４に示した。
図１４において確認できるように、相当量のＯＶＡの発現がｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３構造体処理を通じて確認された。
ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）構造体を樹枝状細胞に処理した後、ＯＶＡの発現量をＥＬＩＳＡを通じて測定して、その結果を図１４に示した。
図１４において確認できるように、相当量のＯＶＡの発現がｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３構造体処理を通じて確認された。
【0077】
実験例５．Ｔｅｔｒａｍｅｒ ａｓｓａｙ
Ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために、ｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３混合物またはｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）は微細流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｎａｄａ）を使用して次の組成の速い混合により脂質ナノ粒子で製剤化された：脂質混合物を含むエタノール相（Ｃ12-200：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）：コレステロール：Ｃ14－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００＝３５：１６：４６．５：２．５、モル比）および水性相（１０ｍＭクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３）。
Ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために、ｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３混合物またはｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）は微細流体装置（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｎａｄａ）を使用して次の組成の速い混合により脂質ナノ粒子で製剤化された：脂質混合物を含むエタノール相（Ｃ12-200：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）：コレステロール：Ｃ14－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００＝３５：１６：４６．５：２．５、モル比）および水性相（１０ｍＭクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３）。
【0078】
細胞毒性Ｔ細胞免疫誘導を確認するために、脂質で剤形化されたｍＯＶＡ＋ｓｉＳＴＡＴ３混合物またはｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３ナノ粒子を６週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２０ｐｍｏｌｅ ｍＯＶＡ＋２０ｐｍｏｌｅ ｓｉＳＴＡＴ３混合物または２０ｐｍｏｌｅ ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３）に筋肉内注射した。注射１週間後、脾臓細胞を分離して抗体混合物（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ、ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４４およびＡＰＣａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ））と組み合わせられたＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡのＭＨＣＩペプチドエピトープ）四量体で染色した。
【0079】
染色された細胞は、ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＡＣＥＡ）を使用して検証され、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアはデータ分析に使用された。
前記結果を図１５および図１６に示した。
脾臓細胞のうちＣＤ４５、ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＣＤ８ａの三重陽性細胞集団は、ＯＶＡ－特異的細胞毒性Ｔ細胞を示した。図１５に示したように、ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３処理された樹枝状細胞から収獲された脾臓細胞の１３．９％が三重陽性細胞集団で分析された。
また、図１６は、ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３を処理したマウスの脾臓細胞でさらに高いＯＶＡ特異細胞毒性Ｔ細胞集団が観察されたことを見せる。向上した樹枝状細胞成熟は、向上した細胞毒性Ｔ細胞免疫を有したｍＲＮＡで達成できることと確認された。
このような結果は、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞誘導効果で本発明による核酸構造体の優れた効果を示す。
前記結果を図１５および図１６に示した。
脾臓細胞のうちＣＤ４５、ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＣＤ８ａの三重陽性細胞集団は、ＯＶＡ－特異的細胞毒性Ｔ細胞を示した。図１５に示したように、ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３処理された樹枝状細胞から収獲された脾臓細胞の１３．９％が三重陽性細胞集団で分析された。
また、図１６は、ｍＯＶＡ－ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３を処理したマウスの脾臓細胞でさらに高いＯＶＡ特異細胞毒性Ｔ細胞集団が観察されたことを見せる。向上した樹枝状細胞成熟は、向上した細胞毒性Ｔ細胞免疫を有したｍＲＮＡで達成できることと確認された。
このような結果は、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞誘導効果で本発明による核酸構造体の優れた効果を示す。
【0080】
実験例６．総ＩｇＧ分析
前記実験例５のマウスセットを利用して総ＩｇＧ含量の分析を遂行した。血清サンプルは、注入後１週間に収集された。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートを一晩中培養して１０ｕｇ／ｍｌのｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でコーティングした。ｏｖａｌｂｕｍｉｎコーティングされたプレートを希釈された血清（１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で１：２００）とともに３７℃で２時間の間培養した後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０が含まれたＰＢＳ）で洗浄した。洗浄されたプレートを２次抗体（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ重鎖および軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ））とともに１時間の間培養した後、洗浄バッファーで洗浄した後、最後にプレートをＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理して停止溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して反応を停止した後、４５０ｎｍにおける吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｍｕｌｔｉ－ｒｅａｄｅｒで測定した。
その結果を図１７に示した。
図１７で確認できるように、ＯＶＡ－特異的ＩｇＧ発現向上が誘導されたことを確認した。
前記実験例５のマウスセットを利用して総ＩｇＧ含量の分析を遂行した。血清サンプルは、注入後１週間に収集された。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートを一晩中培養して１０ｕｇ／ｍｌのｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でコーティングした。ｏｖａｌｂｕｍｉｎコーティングされたプレートを希釈された血清（１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で１：２００）とともに３７℃で２時間の間培養した後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０が含まれたＰＢＳ）で洗浄した。洗浄されたプレートを２次抗体（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ重鎖および軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ））とともに１時間の間培養した後、洗浄バッファーで洗浄した後、最後にプレートをＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理して停止溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して反応を停止した後、４５０ｎｍにおける吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｍｕｌｔｉ－ｒｅａｄｅｒで測定した。
その結果を図１７に示した。
図１７で確認できるように、ＯＶＡ－特異的ＩｇＧ発現向上が誘導されたことを確認した。
【0081】
実験例７．腫瘍サイズ減少確認
前記実験例５のマウスセットを利用して腫瘍抑制効果を確認した。薬物注入１週間後、オボアルブミン（３１０７Ｅ．Ｇ．７－ＯＶＡ細胞）を発現する腫瘍細胞にチャレンジした。腫瘍チャレンジ後、デジタルキャリパーを使用して腫瘍サイズを測定して腫瘍の体積をｅｑ．Ｖ＝０．５Ｗ2Ｌ（Ｖ；腫瘍体積、Ｗ；腫瘍幅、Ｌ；腫瘍長さ）で計算した。
前記結果を図１８に示した。
図１８で確認できるように、ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）は、単純ｍｉｘｔｕｒｅと対比して顕著に優れる腫瘍抑制効果を示した。
前記のような実験を通じて、本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体はｍＲＮＡとｓｉＲＮＡが同時に細胞に導入されて、ｍＲＮＡは発現しようとするタンパク質を正常に発現し、ｓｉＲＮＡは特定遺伝子の発現を特異的に抑制することができることを確認した。前記結果を通じて、本発明による核酸構造体は、抗原提示細胞にターゲットタンパク質を発現させて免疫体係を活性化させると同時に、免疫チェックポイントタンパク質の活性化を遮断して免疫回避妨害を克服することができ、免疫治療分野、特に、抗がん免疫治療分野で非常に有用に使用することができることを確認した。
前記実験例５のマウスセットを利用して腫瘍抑制効果を確認した。薬物注入１週間後、オボアルブミン（３１０７Ｅ．Ｇ．７－ＯＶＡ細胞）を発現する腫瘍細胞にチャレンジした。腫瘍チャレンジ後、デジタルキャリパーを使用して腫瘍サイズを測定して腫瘍の体積をｅｑ．Ｖ＝０．５Ｗ2Ｌ（Ｖ；腫瘍体積、Ｗ；腫瘍幅、Ｌ；腫瘍長さ）で計算した。
前記結果を図１８に示した。
図１８で確認できるように、ｓｉＳＴＡＴ３／ｓｉＳＴＡＴ３（ｍＯＶＡ－Ｔ６－ＳＴＡＴ３ｉ）は、単純ｍｉｘｔｕｒｅと対比して顕著に優れる腫瘍抑制効果を示した。
前記のような実験を通じて、本発明によるｍＲＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸構造体はｍＲＮＡとｓｉＲＮＡが同時に細胞に導入されて、ｍＲＮＡは発現しようとするタンパク質を正常に発現し、ｓｉＲＮＡは特定遺伝子の発現を特異的に抑制することができることを確認した。前記結果を通じて、本発明による核酸構造体は、抗原提示細胞にターゲットタンパク質を発現させて免疫体係を活性化させると同時に、免疫チェックポイントタンパク質の活性化を遮断して免疫回避妨害を克服することができ、免疫治療分野、特に、抗がん免疫治療分野で非常に有用に使用することができることを確認した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】