特表 2023-554126 ＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体とその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-26

(54)【発明の名称】ＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体とその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20231219BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231219BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231219BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231219BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20231219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231219BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20231219BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231219BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231219BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231219BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231219BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231219BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231219BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231219BHJP

   A61K 47/68 20170101ALN20231219BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/86 Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N5/0783

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/76

A61K48/00

A61K35/17

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61P37/04

A61K39/395 U

A61K39/395 D

A61K47/68

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537626

(86)(22)【出願日】2021-10-29

(85)【翻訳文提出日】2023-08-09

(86)【国際出願番号】 CN2021127505

(87)【国際公開番号】W WO2022127401

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】202011498660.9

(32)【優先日】2020-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522322815

【氏名又は名称】イミュノファーム テクノロジー カンパニー リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】523228680

【氏名又は名称】山▲東▼金▲賽▼生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＪＩＮＳＡＩ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100115255

【弁理士】

【氏名又は名称】辻丸 光一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100201732

【弁理士】

【氏名又は名称】松縄 正登

(74)【代理人】

【識別番号】100154081

【弁理士】

【氏名又は名称】伊佐治 創

(74)【代理人】

【識別番号】100227019

【弁理士】

【氏名又は名称】安 修央

(72)【発明者】

【氏名】何 霆

(72)【発明者】

【氏名】▲齊▼ 菲菲

(72)【発明者】

【氏名】▲魯▼ ▲薪▼安

(72)【発明者】

【氏名】ディン ヤンピン

(72)【発明者】

【氏名】梁 梦梦

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC27

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB091

4C084ZB261

4C084ZB271

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB31

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA12

4C087CA16

4C087CA20

4C087CA47

4C087NA14

4C087ZB02

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本発明は、配列番号：５６、５７、５８、５９、６０及び６１から選択されたアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３と特異的に結合する一本鎖抗体ｓｃＦｖ、配列番号：６５、６６、６７、６８、６９及び７０から選択されたアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体、前記ｓｃＦｖ又はキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター及び細胞、及びＣＤ１２３を発現する腫瘍の治療薬の調剤における、前記抗体、キメラ抗原受容体、核酸分子、ベクター又は細胞の使用の提供を目的とする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変ドメインＶＨと軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、ＣＤ１２３と特異的に結合する抗体であって、
前記重鎖可変ドメインは、配列番号：１に示すアミノ酸配列ＶＨ－ＣＤＲ１（ＧＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４（Ｄ）ＹＸ_５Ｘ_６Ｘ_７）、配列番号：２に示すアミノ酸配列ＶＨ－ＣＤＲ２（Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０（Ｘ_１１）Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＮＸ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＫＸ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４）、配列番号：３に示すアミノ酸配列ＶＨ－ＣＤＲ３（ＡＸ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（ＹＤ）Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０）を含み、
Ｘ_１は、Ｓ及びＴから選択され、Ｘ_２は、Ｆ及びＩから選択され、Ｘ_３は、Ｔ、Ｓ及びＭから選択され、Ｘ_４は、Ｓ、Ｄ、Ｔ及びＧから選択され、Ｘ_５は、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ａ及びＮから選択され、Ｘ_６は、Ｍ、Ｖ、Ｉ及びＷから選択され、Ｘ_７は、Ｎ及びＨから選択され、Ｘ_８は、Ｙ及びＲから選択され、Ｘ_９は、Ｉ及びＣから選択され、Ｘ_１０は、Ｄ、Ｎ、Ｙ及びＳから選択され、Ｘ_１１は、Ｐ及びＣから選択され、Ｘ_１２は、Ｙ及びＧから選択され、Ｘ_１３は、Ｄ、Ｎ及びＳから選択され、Ｘ_１４は、Ｓ、Ｎ、Ｄ及びＧから選択され、Ｘ_１５は、Ｅ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_１６は、Ｔ、Ｉ及びＳから選択され、Ｘ_１７は、Ｈ、Ｓ及びＮから選択され、Ｘ_１８は、Ｙ及びＳから選択され、Ｘ_１９は、Ｑ、Ｅ及びＰから選択され、Ｘ_２０は、Ｋ、Ｎ及びＳから選択され、Ｘ_２１は、Ｆ及びＬから選択され、Ｘ_２２は、Ｄ、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_２３は、Ｋ及びＲから選択され、Ｘ_２４は、Ａ及びＩから選択され、Ｘ_２５は、Ｒ及びＧから選択され、Ｘ_２６は、Ｇ、Ｓ及びＥから選択され、Ｘ_２７は、Ｅ、Ｐ及びＲから選択され、Ｘ_２８は、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_２９は、Ｎ、Ｙ、Ｌ及びＷから選択され、Ｘ_３０は、Ｗ、Ｙ及びＬから選択され、Ｘ_３１は、Ｇ及びＤから選択され、Ｘ_３２は、Ｒ及びＥから選択され、Ｘ_３３は、Ｙ、Ｓ及びＴから選択され、Ｘ_３４は、Ｄ、Ｙ及びＧから選択され、Ｘ_３５は、Ｇ及びＹから選択され、Ｘ_３６は、Ｙ及びＬから選択され、Ｘ_３７は、Ａ、Ｇ及びＰから選択され、Ｘ_３８は、Ｍ及びＬから選択され、Ｘ_３９は、Ｄ及びＡから選択され、Ｘ_４０は、Ｙ及びＣから選択され、
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号：４に示すアミノ酸配列ＶＬ－ＣＤＲ１（Ｘ_４１ＳＸ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｘ_４８Ｘ_４９（ＱＫ）Ｘ_５０Ｘ_５１Ｘ_５２Ｘ_５３Ｗ）、配列番号：５に示すアミノ酸配列ＶＬ－ＣＤＲ２（Ｘ_５４ＳＸ_５５Ｘ_５６Ｘ_５７Ｘ_５８Ｘ_５９）、配列番号：６に示すアミノ酸配列ＶＬ－ＣＤＲ３（Ｘ_６０Ｘ_６１Ｘ_６２Ｘ_６３Ｘ_６４（Ｐ）Ｘ_６５ＴＦ）を含み、
Ｘ_４１は、Ａ及びＳから選択され、Ｘ_４２は、Ｑ、Ｋ及びＳから選択され、Ｘ_４３は、Ｓ及びＤから選択され、Ｘ_４４は、Ｉ、Ｖ及びＬから選択され、Ｘ_４５は、Ｓ、Ｎ、Ｄ及びＬから選択され、Ｘ_４６は、Ｋ、Ｙ、Ｓ、Ｄ及びＮから選択され、Ｘ_４７は、Ｄ及びＳから選択され、Ｘ_４８は、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_４９は、Ｄ及びＮから選択され、Ｘ_５０は、Ｓ及びＮから選択され、Ｘ_５１は、Ｄ及びＹから選択され、Ｘ_５２は、Ｌ、Ｉ及びＭから選択され、Ｘ_５３は、Ａ、Ｎ及びＨから選択され、Ｘ_５４は、Ｇ、Ｔ及びＡから選択され、Ｘ_５５は、Ｔ、Ｎ及びＱから選択され、Ｘ_５６は、Ｌ、Ｓ及びＲから選択され、Ｘ_５７は、Ｑ、Ｅ、Ａ、Ｉ及びＤから選択され、Ｘ_５８は、Ｓ及びＰから選択され、Ｘ_５９は、Ｇ及びＥから選択され、Ｘ_６０は、Ｑ及びＮから選択され、Ｘ_６１は、Ｈ、Ｙ、Ｓ、Ｆ及びＧから選択され、Ｘ_６２は、Ｎ、Ｄ、Ｈ及びＹから選択され、Ｘ_６３は、Ｋ、Ｌ、Ｅ、Ｒ及びＳから選択され、Ｘ_６４は、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｆ及びＴから選択され、Ｘ_６５は、Ｙ、Ｒ及びＷから選択され、
好ましくは、前記ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号：８、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号：１４、１５、１６、１７及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号：２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号：２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号：３２、３３、３４、３５及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号：３８、３９、４０、４１及び４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
さらに好ましくは、前記抗体は、
（１）配列番号：８に示すＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号：１４に示すＶＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号：２０に示すＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２６に示すＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号：３２に示すＶＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号：３８に示すＶＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は
（２）配列番号：９に示すＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号：１５に示すＶＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号：２１に示すＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２７に示すＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号：３３に示すＶＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号：３９に示すＶＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は
（３）配列番号：１０に示すＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号：１６に示すＶＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号：２２に示すＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２８に示すＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号：３４に示すＶＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号：４０に示すＶＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は
（４）配列番号：１１に示すＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号：１７に示すＶＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号：２３に示すＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２９に示すＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号：３５に示すＶＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号：４１に示すＶＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は
（５）配列番号：１２に示すＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号：１８に示すＶＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号：２４に示すＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号：３０に示すＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号：３６に示すＶＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号：４２に示すＶＬ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変ドメインを含む抗体。

【請求項2】

前記重鎖可変ドメインが、配列番号：４４、４５、４６、４７及び４８からなる群から選択される、アミノ酸配列又は前記アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号：５０、５１、５２、５３及び５４からなる群から選択される、アミノ酸配列又は前記アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記抗体は、
（１）配列番号：４４に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５０に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（２）配列番号：４５に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５１に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（３）配列番号：４６に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５２に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（４）配列番号：４７に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５３に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（５）配列番号：４８に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５４に示す軽鎖可変ドメイン
を含み、より好ましくは、前記抗体が、配列番号：５６、５７、５８、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体が、一本鎖抗体ｓｃＦｖであり、より好ましくは、前記一本鎖抗体ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが、グリシンとセリンが豊富なリンカーペプチド鎖によって連結し、前記重鎖可変ドメインと前記軽鎖可変ドメインの順序を入れ替えることができる、請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

ＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体であって、 請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体と、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
好ましくは、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ－２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３から選択されるか、これらのいずれかの組み合わせであり、より好ましくは、前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢ及びＣＤ２８から選択され、前記４－１ＢＢは配列番号：６２に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：６３に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ヒンジ領域及び膜貫通ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１１受容体、ＰＤ－１又はＣＤ３４ヒンジ領域及び膜貫通ドメインから選択される、キメラ抗原受容体。

【請求項5】

配列番号：６５、６６、６７、６８、６９及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項４から５に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸分子を含み、好ましくはウイルスベクターであり、より好ましくはレンチウイルスベクターである、ベクター。

【請求項8】

請求項７に記載のベクターでトランスフェクションされ、請求項６に記載の核酸分子又は請求項７に記載のベクターを含み、好ましくはＴ細胞である、細胞。

【請求項9】

請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体と、請求項４から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体と、請求項６に記載の核酸分子と、請求項７に記載のベクター又は請求項８に記載の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。

【請求項10】

ＣＤ１２３を発現する腫瘍の治療薬の調剤における使用であって、好ましくは、前記ＣＤ１２３を発現する腫瘍が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、請求項４から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載のベクター、又は、請求項８に記載の細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、異なる抗原認識ドメインを有し、ＣＤ１２３を標的とするｓｃＦｖ配列、これらのｓｃＦｖ配列に基づき設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびに、ＣＤ１２３を発現する腫瘍、特に急性骨髄性白血病の治療における、これらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、発病率が増加している悪性腫瘍で、主に高齢者が発症し、年齢の中央値は６６歳である。米国国立がん研究所の推定によると、この疾患の２０１８年の新規患者数は１９,５２０人であり、内死亡者数は１０,６７０人に及ぶ（非特許文献１）。６５～７４歳の患者における１２か月生存率は、過去３０年間で２０％から３０％に増加したが、現在のＡＭＬの治療効果は依然として不十分であり、これらの患者の５年生存率は、５％未満である（非特許文献２）。若年のＡＭＬ患者に対する主な治療法は、集中化学治療法であり、再発リスクの高い患者（治癒率３５～４０％）に対しては、同種造血幹細胞移植（ＡＨＣＴ）が行われるが、高齢患者の予後は、改善されないままである（非特許文献２）。ＡＭＬが再発した患者が、再び回復する見込みは５０％未満であり、２回目の救済化学療法後に疾患の抑制が成功する患者は、わずか１６％である（非特許文献３）。１９７０年代にアントラサイクリンとシタラビンの併用化学療法が導入されて以来、それが主な治療法となっている（非特許文献４、５）。したがって、この疾患の治療には、新たな治療戦略が求められている。＼

【0003】

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、抗体特異性とＴ細胞の殺傷効果を組み合わせて養子免疫作用を形成するという構想であり、１９８０年代後半に初めて提唱された（非特許文献６、７）。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の分子構造は、主に、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体、細胞内シグナルドメイン、及びｓｃＦｖと細胞内シグナルドメインを結合するヒンジ領域と膜貫通領域を含む。近年、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２０のキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が、リンパ性腫瘍（Ｂ細胞急性リンパ性白血病及び非ホジキンリンパ腫）の治療に用いられ、成果を挙げている（非特許文献８）。現在、ＡＭＬ治療に対するＣＡＲ－Ｔの標的は、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＦＬＴ３等を含み、中でも、ＣＤ１２３を標的とするＣＡＲ－Ｔに関する研究が最も多い。

【0004】

ＣＤ１２３は、ＩＬ－３受容体のα鎖（ＩＬ－３Ｒα）である。ＣＤ１２３は、ＣＤ１３１と共に高親和性ＩＬ－３受容体を形成するが、このＩＬ－３受容体は、細胞の増殖と分化を促進し、ＩＬ－３と結合すると、造血細胞のアポトーシスを抑制する（非特許文献９、１０）。ＣＤ１２３の高発現は、シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）のシグナル伝達経路の活性化と関係する。ＳＴＡＴ５活性化経路は、様々な悪性血液疾患に関与している（非特許文献１１）。ＣＤ１２３は、主に造血系に発現し、正常なＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－細胞には、低発現するか発現しない（非特許文献１２）。また、正常な状態では、ＣＤ１２３は、骨髄系前駆細胞及びＢリンパ前駆細胞に高発現し、赤血球前駆細胞及び多方向分化能前駆細胞には、低発現するか発現しない（非特許文献１３、１４）。ＣＤ１２３は、６０～９０％を超えるＡＭＬ初代細胞に高発現する（非特許文献１５～１８）。Ｂｒａｓ ＡＥら（非特許文献１９）は、４５５人のＡＭＬ患者に検査を行い、そのうちのおよそ５５％の患者のＡＭＬ細胞にＣＤ１２３が発現しており、陽性率は８０％を超えていた。

【0005】

ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞治療において成果を挙げているが、ＣＡＲ－Ｔの有効性と安全性には、主にオフターゲット効果、サイトカインストーム、神経毒性等の大きな問題が残されている（非特許文献２０）。ＣＡＲ－Ｔ細胞における最適な有効性と安全性は、多くの要因に左右され、中でもＣＡＲ－Ｔ細胞の有効な活性化が重要な役割となる。ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化の度合いは、ＣＡＲ分子ｓｃＦｖの親和性、ヒンジ領域の長さ、共刺激シグナルドメイン、標的細胞の表面上の抗原密度等、多くの要因に影響を受ける。ＣＡＲ分子のｓｃＦｖは、標的細胞の表面上の抗原と直接結合する領域として用いられ、その親和性は、ＣＡＲ－Ｔ細胞全体の活性化において非常に重要である。ＣＡＲ分子ｓｃＦｖの親和性が低いと、ＣＡＲ－Ｔ細胞は十分な抗原認識を得られず、最適な活性化状態を得ることができない。ＣＡＲ分子ｓｃＦｖの親和性が高いと、ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍細胞を認識できる一方で、比較的抗原密度が低い正常細胞も認識するおそれがあり、深刻なオフターゲット効果を引き起こす可能性がある。

【0006】

したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性と安全性をさらに改善し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効な活性化を確保し、オフターゲット効果を避けるためには、標的に対して適度な親和性を有するｓｃＦｖをスクリーニングする必要がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Program. Research Data (1973-2015), National Cancer Institute, Dccps, Surveillance Research Program, Released April 2018, Based on the November 2017 Submission. 2019. (www.seer.cancer.gov).

【非特許文献2】Thein MS, Ershler WB, Jemal A, Yates JW, Baer MR. Outcome of older patients with acute myeloid leukemia: an analysis of SEER data over 3 decades. Cancer 2013;119(15):2720-7.

【非特許文献3】Kantarjian HM, DiNardo CD, Nogueras-Gonzalez GM, Kadia TM, Jabbour E, Bueso-Ramos CE, et al. Results of second salvage therapy in 673 adults with acute myelogenous leukemia treated at a single institution since 2000. Cancer 2018;124(12):2534-40.

【非特許文献4】Jang J, Lee J, Jang JH, Jung CW, Park S. Anti-leukemic effects of simvastatin on NRAS(G12D) mutant acute myeloid leukemia cells. Mol Biol Rep. 2019;46:5859-66.

【非特許文献5】Roboz GJ. Novel approaches to the treatment of acute myeloid leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011;2011:43-50.

【非特許文献6】Benmebarek, M.R.; Karches, C.H.; Cadilha, B.L.; Lesch, S.; Endres, S.; Kobold, S. Killing mechanisms of chimeric antigen receptor (CAR) T cells. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 1283.

【非特許文献7】Gross, G.; Waks, T.; Eshhar, Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 10024-10028.

【非特許文献8】Khalil DN, Smith EL, Brentjens RJ, Wolchok JD. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol 2016;13(6):394.

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【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第一の態様の抗体は、重鎖可変ドメインＶＨと軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、ＣＤ１２３と特異的に結合する抗体であり、前記重鎖可変ドメインは、配列番号：１に示すアミノ酸配列ＶＨ－ＣＤＲ１（ＧＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４（Ｄ）ＹＸ_５Ｘ_６Ｘ_７）と、配列番号：２に示すアミノ酸配列ＶＨ－ＣＤＲ２（Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０（Ｘ_１１）Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＮＸ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＫＸ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４）と、配列番号：３に示すアミノ酸配列ＶＨ－ＣＤＲ３（ＡＸ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（ＹＤ）Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０）とを含み、Ｘ_１は、Ｓ及びＴから選択され、Ｘ_２は、Ｆ及びＩから選択され、Ｘ_３は、Ｔ、Ｓ及びＭから選択され、Ｘ_４は、Ｓ、Ｄ、Ｔ及びＧから選択され、Ｘ_５は、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ａ、及びＮから選択され、Ｘ_６は、Ｍ、Ｖ、Ｉ及びＷから選択され、Ｘ_７は、Ｎ及びＨから選択され、Ｘ_８は、Ｙ及びＲから選択され、Ｘ_９は、Ｉ及びＣから選択され、Ｘ_１０は、Ｄ、Ｎ、Ｙ及びＳから選択され、Ｘ_１１は、Ｐ及びＣから選択され、Ｘ_１２は、Ｙ及びＧから選択され、Ｘ_１３は、Ｄ、Ｎ及びＳから選択され、Ｘ_１４は、Ｓ、Ｎ、Ｄ及びＧから選択され、Ｘ_１５は、Ｅ、Ａ、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_１６は、Ｔ、Ｉ及びＳから選択され、Ｘ_１７は、Ｈ、Ｓ及びＮから選択され、Ｘ_１８は、Ｙ及びＳから選択され、Ｘ_１９は、Ｑ、Ｅ及びＰから選択され、Ｘ_２０は、Ｋ、Ｎ及びＳから選択され、Ｘ_２１は、Ｆ及びＬから選択され、Ｘ_２２は、Ｄ、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_２３は、Ｋ及びＲから選択され、Ｘ_２４は、Ａ及びＩから選択され、Ｘ_２５は、Ｒ及びＧから選択され、Ｘ_２６は、Ｇ、Ｓ及びＥから選択され、Ｘ_２７は、Ｅ、Ｐ及びＲから選択され、Ｘ_２８は、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_２９は、Ｎ、Ｙ、Ｌ及びＷから選択され、Ｘ_３０は、Ｗ、Ｙ及びＬから選択され、Ｘ_３１は、Ｇ及びＤから選択され、Ｘ_３２は、Ｒ及びＥから選択され、Ｘ_３３は、Ｙ、Ｓ及びＴから選択され、Ｘ_３４は、Ｄ、Ｙ及びＧから選択され、Ｘ_３５は、Ｇ及びＹから選択され、Ｘ_３６は、Ｙ及びＬから選択され、Ｘ_３７は、Ａ、Ｇ及びＰから選択され、Ｘ_３８は、Ｍ及びＬから選択され、Ｘ_３９は、Ｄ及びＡから選択され、Ｘ_４０は、Ｙ及びＣから選択される。

【0009】

前記軽鎖可変ドメインは、配列番号：４に示すアミノ酸配列ＶＬ－ＣＤＲ１（Ｘ_４１ＳＸ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｘ_４８Ｘ_４９（ＱＫ）Ｘ_５０Ｘ_５１Ｘ_５２Ｘ_５３Ｗ）と、配列番号：５に示すアミノ酸配列ＶＬ－ＣＤＲ２（Ｘ_５４ＳＸ_５５Ｘ_５６Ｘ_５７Ｘ_５８Ｘ_５９）と、配列番号：６に示すアミノ酸配列ＶＬ－ＣＤＲ３（Ｘ_６０Ｘ_６１Ｘ_６２Ｘ_６３Ｘ_６４（Ｐ）Ｘ_６５ＴＦ）とを含み、Ｘ_４１は、Ａ及びＳから選択され、Ｘ_４２は、Ｑ、Ｋ及びＳから選択され、Ｘ_４３は、Ｓ及びＤから選択され、Ｘ_４４は、Ｉ、Ｖ及びＬから選択され、Ｘ_４５は、Ｓ、Ｎ、Ｄ及びＬから選択され、Ｘ_４６は、Ｋ、Ｙ、Ｓ、Ｄ及びＮから選択され、Ｘ_４７は、Ｄ及びＳから選択され、Ｘ_４８は、Ｇ及びＳから選択され、Ｘ_４９は、Ｄ及びＮから選択され、Ｘ_５０は、Ｓ及びＮから選択され、Ｘ_５１は、Ｄ及びＹから選択され、Ｘ_５２は、Ｌ、Ｉ及びＭから選択され、Ｘ_５３は、Ａ、Ｎ及びＨから選択され、Ｘ_５４は、Ｇ、Ｔ及びＡから選択され、Ｘ_５５は、Ｔ、Ｎ及びＱから選択され、Ｘ_５６は、Ｌ、Ｓ及びＲから選択され、Ｘ_５７は、Ｑ、Ｅ、Ａ、Ｉ及びＤから選択され、Ｘ_５８は、Ｓ及びＰから選択され、Ｘ_５９は、Ｇ及びＥから選択され、Ｘ_６０は、Ｑ及びＮから選択され、Ｘ_６１は、Ｈ、Ｙ、Ｓ、Ｆ及びＧから選択され、Ｘ_６２は、Ｎ、Ｄ、Ｈ及びＹから選択され、Ｘ_６３は、Ｋ、Ｌ、Ｅ、Ｒ及びＳから選択され、Ｘ_６４は、Ｙ、Ｌ、Ｄ、Ｓ、Ｆ及びＴから選択され、Ｘ_６５は、Ｙ、Ｒ及びＷから選択され、好ましくは、前記抗体は、ｓｃＦｖである。

【0010】

本発明の第二の態様のＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体は、第一の態様の抗体と、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。

【0011】

本発明の第三の態様の核酸分子は、第一の態様の抗体又は第二の態様のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0012】

本発明の第四の態様のベクターは、第三の態様の核酸分子を含む。

【0013】

本発明の第五の態様の細胞は、第四の態様のベクターでトランスフェクションされることにより、第三の態様の核酸分子又は第四の態様のベクターを含む。

【0014】

本発明の第六の態様の医薬組成物は、第一の態様の抗体と、第二の態様のキメラ抗原受容体と、第三の態様の核酸分子と、第四の態様のベクター又は第五の態様の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む。

【0015】

本発明の第七の態様は、ＣＤ１２３を発現する腫瘍の治療薬の調剤における、第一の態様の抗体、第二の態様のキメラ抗原受容体、第三の態様の核酸分子、第四の態様のベクター、又は第五の態様の細胞の使用である。

【発明の効果】

【0016】

本発明は、標的ＣＤ１２３のＣＡＲ分子のｓｃＦｖにおける親和性のスクリーニング、及びＣＡＲ-Ｔ細胞の殺傷効果の比較を行うことで、最良の標的ＣＤ１２３のｓｃＦｖ配列を得られ、ＣＡＲ-Ｔ細胞は、より高い安全性と有効性を有する。本発明によれば、先行技術と比較し、ＣＤ１２３を標的とするＣＡＲ-Ｔ細胞が持つ腫瘍細胞株及び初代腫瘍細胞に対する殺傷効率を、効果的に高め、また、細胞増殖能を高めることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、Ｔ細胞内における異なるｓｃＦｖのＣＤ１２３ ＣＡＲ分子の伝達効率を示す。

【図2】図２は、培養中におけるＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔの細胞増殖の総量を示す。

【図3】図３は、標的細胞であるＡＭＬ初代細胞とＴＨＰ－１細胞が、それぞれ刺激下におけるＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の分化に及ぼす影響を示す。

【図4】図４は、ＣＤ１２３陽性細胞株（ＴＨＰ－１）及びＣＤ１２３陰性細胞株（Ｋ５６２）に対するＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔの殺傷効率を示す。

【図5】図５は、ＡＭＬ初代細胞に対するＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔの殺傷効率を示す。

【図6】図６は、ＡＭＬ細胞を５時間刺激した後のＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン発現を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明の抗体は、ＣＤ１２３と特異的に結合し、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖可変ドメインＶＬを含み、前記重鎖可変ドメインは、ＶＨ－ＣＤＲ１と、ＶＨ－ＣＤＲ２と、ＶＨ－ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖可変ドメインは、ＶＬ－ＣＤＲ１と、ＶＬ－ＣＤＲ２と、ＶＬ－ＣＤＲ３とを含む。

【0019】

特定の一実施形態において、前記ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号：８、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号：１４、１５、１６、１７及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号：２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号：２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号：３２、３３、３４、３５及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号：３８、３９、４０、４１及び４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0020】

特に、本発明のＣＤ１２３と特異的に結合する抗体は、以下を含む。
（１）配列番号：８に示すＶＨ－ＣＤＲ１と、配列番号：１４に示すＶＨ－ＣＤＲ２と、配列番号：２０に示すＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２６に示すＶＬ－ＣＤＲ１と、配列番号：３２に示すＶＬ－ＣＤＲ２と、配列番号：３８に示すＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（２）配列番号：９に示すＶＨ－ＣＤＲ１と、配列番号：１５に示すＶＨ－ＣＤＲ２と、配列番号：２１に示すＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２７に示すＶＬ－ＣＤＲ１と、配列番号：３３に示すＶＬ－ＣＤＲ２と、配列番号：３９に示すＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（３）配列番号：１０に示すＶＨ－ＣＤＲ１と、配列番号：１６に示すＶＨ－ＣＤＲ２と、配列番号：２２に示すＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２８に示すＶＬ－ＣＤＲ１と、配列番号：３４に示すＶＬ－ＣＤＲ２と、配列番号：４０に示すＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（４）配列番号：１１に示すＶＨ－ＣＤＲ１と、配列番号：１７に示すＶＨ－ＣＤＲ２と、配列番号：２３に示すＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２９に示すＶＬ－ＣＤＲ１と、配列番号：３５に示すＶＬ－ＣＤＲ２と、配列番号：４１に示すＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（５）配列番号：１２に示すＶＨ－ＣＤＲ１と、配列番号：１８に示すＶＨ－ＣＤＲ２と、配列番号：２４に示すＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変ドメインと、配列番号：３０に示すＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号：３６に示すＶＬ－ＣＤＲ２、配列番号：４２に示すＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変ドメイン

【0021】

別の特定の実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号：４４、４５、４６、４７及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、前記アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号：５０、５１、５２、５３及び５４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0022】

特に、本発明のＣＤ１２３と特異的に結合する抗体は、以下を含む。
（１）配列番号：４４に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５０に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（２）配列番号：４５に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５１に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（３）配列番号：４６に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５２に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（４）配列番号：４７に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５３に示す軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（５）配列番号：４８に示す重鎖可変ドメイン及び配列番号：５４に示す軽鎖可変ドメイン

【0023】

別の特定の実施形態において、本発明のＣＤ１２３と特異的に結合する抗体は、配列番号：５６、５７、５８、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、前記アミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は、少なくとも９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。

【0024】

好ましくは、本発明の抗体は一本鎖抗体ｓｃＦｖであり、より好ましくは、前記一本鎖抗体ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインは、グリシンとセリンが豊富なリンカーペプチド鎖によって連結し、前記重鎖可変ドメインと前記軽鎖可変ドメインの順序を入れ替えることができる。

【0025】

本発明のＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体は、本発明の抗体と、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。

【0026】

特定の実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ－２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３から選択されるか、またはこれらのいずれかの組み合わせであり、好ましくは、前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢ及びＣＤ２８から選択され、前記４－１ＢＢは、配列番号：６２に示すアミノ酸配列を含む。

【0027】

特定の一実施形態において、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：６３に示すアミノ酸配列を含む。

【0028】

特定の一実施形態において、前記ヒンジ領域及び前記膜貫通ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１１受容体、ＰＤ－１又はＣＤ３４ヒンジ領域及び膜貫通ドメインから選択される。

【0029】

好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、配列番号：６５、６６、６７、６８、６９及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0030】

本発明の核酸分子は、本発明の抗体又は本発明のキメラ抗原受容体をコードする、ヌクレオチド配列を含む。

【0031】

本発明のベクターは本発明の核酸分子を含み、好ましくは、前記ベクターはウイルスベクターであり、より好ましくは、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。

【0032】

本発明の細胞は、本発明のベクターでトランスフェクションされることにより、前記核酸分子又は前記ベクターを含み、好ましくは、前記細胞がＴ細胞である。

【0033】

本発明は、ＣＤ１２３を発現する腫瘍の治療薬の調剤における、前記抗体、前記キメラ抗原受容体、前記核酸分子、前記ベクター又は前記細胞の使用であり、好ましくは、前記ＣＤ１２３を発現する腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

【0034】

特に明示されない限り、ここに記載される技術的解決は、いかなる組み合わせであってもよい。

【0035】

本発明について、例を挙げて、さらに具体的に説明する。

【実施例】

【0036】

［実施例１］
（ＣＤ１２３ ＣＡＲ分子の設計とＣＡＲ－Ｔの作製）
本実施例では、異なる抗原認識ドメインを有するＣＤ１２３ ＣＡＲ分子の設計と、ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を行った。

【0037】

前記抗原認識ドメインを設計した原理は、以下の通りである。 ＣＡＲ－Ｔ－１を対照群とし、ＣＤ１２３のｓｃＦｖ配列は、ペンシルバニア大学より報告されたものであり（非特許文献２１）、ｓｃＦｖ配列を、本開示ではｓｃＦｖ－０１と呼ぶ。マウス免疫のＣＤ１２３細胞外融合タンパク質から得られたモノクローナル抗体配列由来のｓｃＦｖ配列を有するＣＡＲ－Ｔ－２～ＣＡＲ－Ｔ－７を、修飾群とし、これらのｓｃＦｖ配列を、本明細書ではｓｃＦｖ－０２－０７と呼ぶ。

【0038】

異なる抗原認識ドメインのＣＤ１２３ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を、遺伝子合成方法により合成し、次いで、前記ＣＤ１２３ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を相同組換え法によりＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通領域、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内領域の配列と連結し、完全なＣＡＲ分子、すなわち、ＣＡＲ１―７を形成した。このＣＡＲ核酸フラグメントを、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び、リガーゼによるライゲーションによって、レンチウイルストランスファープラスミドｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５（アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）内に組み込んだ。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用し、レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＬＰ／ＶＳＶＧ、ｐＬＰ１／ＭＤＫ、ｐＬＰ２／ＲＳＫ（アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）、及び、得られた前記トランスファープラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、４８時間後に培養基を収集し、３００ｇで遠心分離して細胞片を取り除き、遠心分離は、超遠心機を用いて、２５,０００ｒｐｍで３時間行った。そして、沈殿物を生理食塩水１ｍＬで溶解し、目的のレンチウイルスベクターを得た。

【0039】

Ｔ細胞は、ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、カタログ番号：４０２０３Ｄ）を使用し、健康なボランティアの末梢血単核球から単離した。単離し、精製した前記Ｔを細胞１．０×１０^６個／ｍＬとし、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（中国、Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｊｉｎｔａｉ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社）を含む培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５（スイス、Ｌｏｎｚａ社）に播種し、培養した。４８時間の培養後、Ｔ細胞を、ＣＤ１２３ ＣＡＲ分子を有するレンチウイルスベクターに、ＭＯＩ＝０．５の比率で感染させ、ＣＡＲ－Ｔ－１－７を得た。２４時間のレンチウイルス感染後、細胞液交換を行い、Ｘ－ＶＩＶＯ １５と、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２とを合わせた新たな培養系に前記レンチウイルスを播種し、培養を継続した。５日間のレンチウイルス感染後、ピペットを用いて、前記培養系中の細胞を繰り返し吹きつけ、遠心チューブ内に回集し、ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズを、磁気スタンド上で除去した。Ｔ細胞を、遠心分離してカウントし、また、一部の細胞を取り出し、フローサイトメトリー（アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、商品名：ＮｏｖｏＣｙｔｅ ２０６０Ｒ）を用いて、各細胞群のＣＡＲ分子伝達効率を検出した。

【0040】

図１に、Ｔ細胞を、レンチウイルスに５日間、７日間、９日間、１２日間感染させた後の各細胞群のＣＡＲ分子伝達効率を示す。ＣＡＲ－Ｔ－２群、ＣＡＲ－Ｔ－３群、及び、ＣＡＲ－Ｔ－７群のＣＡＲ分子伝達効率は、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１のＣＡＲ分子伝達効率に近く、ＣＡＲ－Ｔ－４群、ＣＡＲ－Ｔ－５群、及びＣＡＲ－Ｔ－６群のＣＡＲ分子伝達効率は、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１のＣＡＴ分子伝達効率より、著しく高かった。よって、全ての各ＣＡＲ－Ｔ細胞群において、良好なＣＡＲタンパク質発現が示された。

【0041】

［実施例２］
（改変されたＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖能）
本実施例では、異なる抗原認識ドメインを有するＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔの増殖能を検出した。

【0042】

ＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞の培養過程において、レンチウイルスをＴ細胞に感染させた日を培養２日目とし、その後２～３日毎にＣＡＲ－Ｔ細胞を収集して遠心分離し、１～２ｍｌの培養系を加えて再懸濁し、細胞１０μｌを取り出して一定の倍率に希釈し、トリパンブルー（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、カタログ番号：Ｃ００４０）で着色し、倒立顕微鏡（日本、株式会社ニコン、商品名：Ｔｓ２－ＦＬ）を用いて、生細胞の総数と死細胞の総数をカウントし、各群における細胞増殖を算出した。

【0043】

図２によると、異なる抗原認識ドメインを有するＣＡＲ－Ｔ－２およびＣＡＲ－Ｔ－７の細胞増殖総量は、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１と比較して著しく増進していた。この結果は、ＣＡＲ－Ｔ－２およびＣＡＲ－Ｔ－７のｓｃＦｖ設計により、ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を増進できることを示している。

【0044】

［実施例３］
（標的細胞の刺激下における、改変されたＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞分化）
本実施例では、２つの標的細胞ＡＭＬ初代細胞又はＴＴＰ－１細胞（どちらもＣＤ１２３を発現）をそれぞれ刺激し、異なる抗原認識ドメインを有するＣＤ１２３ＣＡＲ－ＴのＴ細胞分化を検出した。

【0045】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を５日目まで培養したとき、各群から５×１０^５の細胞２個を取り出し１２ウェルプレートに加え、さらに、標的細胞であるＡＭＬ初代細胞又はＴＨＰ－１細胞を、それぞれエフェクター／標的の比率（Ｅ：Ｔ）＝５：１の比率となるよう前記１２ウェルプレートに加えた。６日間の標的細胞の刺激後、つまりＣＡＲ－Ｔ細胞を１１日目まで培養したとき、各群から１×１０^６の細胞を取り出し、遠心分離し、１００μｌのＤＰＢＳ（ブランド名：ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３００２８．０２）で再懸濁し、各ＣＡＲ－Ｔ細胞群をＴ細胞分化関連蛍光抗体で標識し、フルスペクトラムフローサイトメーター（フリーモント、Ｃｙｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、商品名：Ｎ７－００００８－０Ａ）を用いて検出した。

【0046】

図３はその結果を示し、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋細胞集団は、初期のＴ細胞集団と乾燥したメモリーＴ細胞集団の組み合わせを表し、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^－は、エフェクターＴ細胞集団を表した。異なる抗原認識ドメインを有するＣＡＲ－Ｔ－２及びＣＡＲ－Ｔ－７におけるＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋細胞集団の割合は、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１における割合と比べて高く、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^－細胞集団の割合においては、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１における割合と比べて低かった。この結果により、改変されたＣＤ１２３抗原認識ドメインは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性に優れていることが示された。

【0047】

［実施例４］
（改変されたＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞株に対する殺傷効率）
本実施例では、ＣＤ１２３を発現している細胞株と、ＣＤ１２３を発現していない細胞株に対する、異なる抗原認識ドメインを有するＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効率を検出した。

【0048】

ＣＤ１２３を発現している細胞株ＴＨＰ－１と、ＣＤ１２３を発現していない細胞株Ｋ５６２を、それぞれ収集し、遠心分離した後、通常の生理食塩水（中国、Ｈｅｂｅｉ Ｔｉａｎｃｈｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）１ｍｌで再懸濁し、５μｌの生細胞染色用色素Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（濃度１μｇ／μＬ、アメリカ合衆国、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、カタログ番号：Ｃ３１００ＭＰ）を加え、緩やかに混合し、３７℃のインキュベーターで３０分間インキュベートして、標的細胞を標識した。インキュベーション終了後、通常の生理食塩水で２回洗浄し、Ｘ－ＶＩＶＯ １５を加えて再懸濁し、カウントした。１ウェル当たり１×１０^５個の前記標識された標的細胞を、４８ウェル細胞培養用プレート（アメリカ合衆国ニューヨーク州コーニング、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に加え、各ＣＡＲ－Ｔ細胞群を前記４８ウェル細胞培養用プレートに、Ｅ：Ｔ＝１０：１の比率となるよう加え、この４８ウェル細胞培養用プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに配置し、５時間インキュベートした。インキュベーション終了後、濃度２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００（ドイツ、Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｔ８７８７－１００ＭＬ）を加え、陽性対照群、すなわち、前記標識した標的細胞１×１０^５を溶解した。各ウェルから殺傷系上清１００μｌを取り出してマイクロプレートに配置し、多機能マイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、商品名：Ｖａｒｉｏｓｃａｎ Ｌｕｘ）を用いて、蛍光値（励起波長：４９６ｎｍ、発光波長：５１５ｎｍ）を検出した。

【0049】

図４に示すように、ＣＤ１２３陽性の細胞株ＴＨＰ－１に対して、異なる抗原認識ドメインを有するＣＤ１２３ ＣＡＲ－ＴのＣＡＲ－Ｔ－３及びＣＡＲ－Ｔ－５の殺傷効率は、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１の殺傷効率よりも、著しく高かった。一方で、ＣＤ１２３を発現していない細胞株Ｋ５６２に対する、改変されたＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ及び対照群ＣＡＲ－Ｔ－１の各群の殺傷効率は、Ｔ細胞群の殺傷効率と一致していた。この結果により、各ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞群は、標的細胞に対する一定の殺傷効率と優れた特異性を備え、ＣＡＲ－Ｔ－３及びＣＡＲ－Ｔ－５のｓｃＦｖ設計は、ＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞の殺傷を、促進したことが示された。

【0050】

［実施例５］
（改変されたＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＭＬ初代細胞に対する殺傷効率）
本実施例では、異なる抗原認識ドメインを有するＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔの、ＡＭＬ初代細胞に対する殺傷効率を検出した。

【0051】

ＣＤ１２３陽性のＡＭＬ患者らから、高抗原密度（すなわち、ＡＭＬ１＃、ＣＤ１２３発現率９９．８７％、ＭＦＩ値１３２９８）、中抗原密度（すなわち、ＡＭＬ２＃、ＣＤ１２３発現率７５．４％、ＭＦＩ値７５１８）、低抗原密度（すなわち、ＡＭＬ３＃、ＣＤ１２３発現率９４．５８％、ＭＦＩ値５２５２）の３つの骨髄血サンプルを得た（抗原密度レベルは、以下に沿って定義した：高抗原密度：蛍光強度中央値（ＭＦＩ）が１０,０００より大きい；中抗原密度：ＭＦＩ値が６,０００より大きく、１０，０００より小さい；低抗原密度：ＭＦＩ値が６，０００より小さい）。ＣＤ１２３陽性のＡＭＬ患者から得た骨髄血サンプルから、単核細胞を単離させ、ＣＤ３４マイクロビーズ（ドイツ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、カタログ番号：１３０－１００－４５３）を用いて、ＣＤ３４陽性ＡＭＬ初代細胞を選別し、通常の生理食塩水１ｍｌで再懸濁し、１０μｌのＣａｌｌｅｉｎ－ＡＭ（濃度１μｇ／μＬ、アメリカ合衆国、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を加え、緩やかに混合し、３７℃のインキュベーターに配置して３０分間インキュベートし、ＡＭＬ初代細胞を標識した。インキュベーション終了後、通常の生理食塩水で２回洗浄し、Ｘ－ＶＩＶＯ １５を加えて再懸濁し、カウントした。４８ウェル細胞培養用プレート（アメリカ合衆国ニューヨーク州コーニング、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、１ウェルあたり１×１０^５個の前記標識したＡＭＬ初代細胞を加え、ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＥ：Ｔ＝１０：１の比率で４８ウェル細胞培養用プレートに加え、この４８ウェル細胞培養用プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに配置し、５時間インキュベートした。インキュベーション終了後、濃度２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００に、陽性対照群、すなわち前記標識したＡＭＬ初代細胞１×１０^５を溶解したものを加えた。１ウェルあたり１００μｌの殺傷系上清を取り出して、マイクロプレートに配置し、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、商品名：Ｖａｒｉｏｓｃａｎ Ｌｕｘ）を用いて、蛍光値（励起波長：４９６ｎｍ、発光波長：５１５ｎｍ）を検出した。

【0052】

図５に示すように、異なる抗原認識ドメインを有するＣＡＲ－Ｔ－３は、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１と比較し、ＣＤ１２３陽性ＡＭＬ患者の高抗原密度（すなわち、ＡＭＬ１＃）、中抗原密度（すなわち、ＡＭＬ２＃）、低抗原密度（すなわち、ＡＭＬ３＃）の３つの初代細胞に対して、著しく高い殺傷効率を有することがわかった。この結果により、ＣＡＲ－Ｔ－３ ｓｃＦｖを有するＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、初代細胞に対する殺傷効率を、効果的に改善できることが示唆された。

【0053】

［実施例６］
（標的細胞の刺激下における、改変されたＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン発現）
本実施例では、異なる抗原認識ドメインを有するＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔの、ＡＭＬ初代細胞に対するサイトカイン発現レベルを検出した。

【0054】

標的細胞であるＡＭＬ初代細胞を、１ウェルあたり１×１０^５個、４８ウェル細胞培養用プレート（アメリカ合衆国ニューヨーク州コーニング、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に加えた。前記ＡＭＬ初代細胞のＣＤ１２３発現率は、９９．８７％であり、ＭＦＩ値は、１３２９８であった。各ＣＡＲ－Ｔ細胞群を、４８ウェル細胞培養用プレートに、Ｅ：Ｔ＝１０：１の比率で加え、この４８ウェル細胞培養用プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに配置し、５時間インキュベートした。細胞上清を取り出し、ＣＢＡキット（アメリカ合衆国カリフォルニア州サンノゼ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、及び、フローサイトメトリー（アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、商品名：ＮｏｖｏＣｙｔｅ ２０６０Ｒ）を用いて、各種サイトカインの発現レベルを検出した。

【0055】

図６に示すように、異なる抗原認識ドメインを有するＣＡＲ－Ｔ－６における標的細胞の刺激下では、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１と比較すると、ＩＬ－２、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γの発現レベルが、著しく高かった。また、残りのＣＡＲ－Ｔ細胞群におけるサイトカイン発現レベルは、対照群ＣＡＲ－Ｔ－１のサイトカイン発現レベルと同程度だった。この結果により、ＣＡＲ－Ｔ－６のｓｃＦｖ設計は、ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔサイトカインの発現を促進することが示された。

【0056】

本発明に関するアミノ酸配列の詳細を、以下の表１及び表２に記載する。

【0057】

【表1-1】

【0058】

【表1-2】

【0059】

【表1-3】

【0060】

【表1-4】

【0061】

【表1-5】

【0062】

【表2-1】

【0063】

【表2-2】

【0064】

【表2-3】

【0065】

【表2-4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】