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特表2023-554181足場タンパク質としてのペルオキシレドキシンファミリーの多量体タンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-26
(54)【発明の名称】足場タンパク質としてのペルオキシレドキシンファミリーの多量体タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20231219BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231219BHJP
C12N 9/08 20060101ALI20231219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231219BHJP
C12N 15/30 20060101ALI20231219BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53
C07K19/00 ZNA
C12N9/08
C12N15/63 Z
C12N15/30
C12N15/62 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023559152
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-08-08
(86)【国際出願番号】 EP2021085149
(87)【国際公開番号】W WO2022122998
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】20306539.6
(32)【優先日】2020-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523222127
【氏名又は名称】キャットサライズ
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＴＳＡＬＹＺＥ
【住所又は居所原語表記】Ｌ’ａｔｅｌｉｅｒ ｄｅ ｌａ ｐｅｐ’ ２０ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ ｄｕ ２６ｅ Ｒｅｇｉｍｅｎｔ ｄ’Ｉｎｆａｎｔｅｒｉｅ ５４０００ ＮＡＮＣＹ （ＦＲ）
(74)【代理人】
【識別番号】100106297
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 克博
(72)【発明者】
【氏名】クインターネット、 マーク
(72)【発明者】
【氏名】クリズニク、 アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】シャゴット、 マリー‐イブ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA80Y
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA27
4B065CA28
4B065CA46
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA50
4H045EA60
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA26
4H045GA30
(57)【要約】
本願発明は、足場タンパク質としてのペルオキシレドキシンのファミリーの多量体タンパク質の使用であって、１つ以上の目的のタンパク質が、前記ペルオキシレドキシンの１つ以上の単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結されていて、前記ペルオキシレドキシンは酸化還元活性を有さないことを特徴とする使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペルオキシレドキシンのファミリーに由来する多量体タンパク質の足場タンパク質としての使用であって、１つ以上の目的のタンパク質が、前記ペルオキシレドキシンの１つ以上の単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結されていて、前記ペルオキシレドキシンは酸化還元活性を有さないことを特徴とする、使用。
【請求項2】
前記１つ以上の目的のタンパク質が酵素であり、前記足場タンパク質が前記酵素の触媒活性を増強するために使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記目的のタンパク質が同じ代謝経路のタンパク質であり、前記足場タンパク質が合成効率を増強するために使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記ペルオキシレドキシンが、配列番号１のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴＳＡ１、または配列番号１６のパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンであることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項5】
前記ペルオキシレドキシンＴＳＡ１が、配列番号１の配列の４８位および／または１７１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換され、好ましくは配列番号２９の配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンが、配列番号１６の配列の４６位および／または２１１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換され、好ましくは配列番号５２の配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項7】
前記目的のタンパク質が、連結配列を介して前記ペルオキシレドキシン単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に融合されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項8】
前記ペルオキシレドキシン単量体と目的のタンパク質がアダプター／ペプチドリガンド対を介して連結されていることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項9】
酸化還元活性を有さない１つ以上のペルオキシレドキシン単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結された少なくとも１つの目的のタンパク質を含む、ペルオキシレドキシンのファミリーに由来する多量体タンパク質であって、前記ペルオキシレドキシン単量体と前記目的のタンパク質がアダプター/ペプチドリガンド対を介して連結された多量体タンパク質。
【請求項10】
酸化還元活性を有さない１つ以上のペルオキシレドキシン単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結された少なくとも２つの異なる目的タンパク質を含む、ペルオキシレドキシンのファミリー由来の多量体タンパク質。
【請求項11】
前記ペルオキシレドキシンが、配列番号１のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴＳＡ１、または配列番号１６のパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンであることを特徴とする、請求項９または１０に記載の多量体タンパク質。
【請求項12】
前記ペルオキシレドキシンＴＳＡ１が、配列番号１の４８位および／または１７１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換されていることを特徴とする、請求項１１に記載の多量体タンパク質。
【請求項13】
前記パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンが、配列番号１６の４６位および／または２１１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換されていることを特徴とする、請求項１１に記載の多量体タンパク質。
【請求項14】
前記ペルオキシレドキシン単量体と目的のタンパク質がアダプター／ペプチドリガンド対を介して連結されていることを特徴とする、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項15】
請求項９～１４のいずれか一項に記載の多量体タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド構築物であって、好ましくは、４８位及び１７１位においてそれぞれセリン及びアラニンにより変異したペルオキシレドキシンＴＳＡ１をコードする配列番号５１の配列、又は、４６位および２１１位においてそれぞれセリン及びアラニンにより変異したパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンをコードする配列番号５３の配列を含む、ヌクレオチド構築物。
【請求項16】
請求項１５に記載のヌクレオチド構築物を含む発現ベクター。
【請求項17】
請求項９～１４のいずれか一項に記載の多量体タンパク質、請求項１５に記載の１つ以上のヌクレオチド構築物、または請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペルオキシレドキシン（Ｐｒｘｓ）のファミリーに由来する多量体タンパク質の足場タンパク質としての使用であって、１つ以上の目的のタンパク質が、前記ペルオキシレドキシンの１つ以上の単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結されていて、前記ペルオキシレドキシンは酸化還元活性を有さないことを特徴とする使用に関する。
【背景技術】
【0002】
酵素は、分子の合成、修飾、または分解を促進することができる生体触媒であり、生体に適合した条件下で最適に機能するという特定の特徴を有する。これらは、バイオプラスチック、バイオ燃料、治療用分子の合成などの多くの分野で使用されている。
【0003】
酵素の触媒力を改善するために多くの研究が行われてきた。その結果、遺伝子工学の急速な拡大により、特定の酵素に活性化変異を導入することが可能になった。タンパク質の立体構造解析とバイオインフォマティクスの進歩により、これらの変異を合理的な方法で誘導できるようになった(Goldenzweig et al., 2016, Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346)。
【0004】
別のアプローチは、反応物、中間体、及び酵素を同じ複合体に組み込んで局所的に濃縮し、生化学反応の効率を向上させることである。酵素の人工的な組み立てを可能にする様々な方法が開発されている。例えば、酵素同士の直接融合は、細胞内での生成物の生成を増強するように、レスベラトロールの生合成における２つの酵素の発現と局在を調整するために使用されている（Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 128:13030-13031 (2006))。それにもかかわらず、融合した２つの酵素の構造が悪影響を受け、酵素の不活性化をもたらす可能性がある。
【0005】
別のアプローチは、足場タンパク質と呼ばれるタンパク質性の支持体上に酵素を固定化することである。足場タンパク質は、1つ以上の酵素を目的の基質の近傍に局所的に集中させることができ、特に高分子基質の触媒反応に適している。また、足場タンパク質は、同じ代謝経路に属する酵素を空間的に近づけることができ、小分子の合成を加速させ簡略化する。
【0006】
酵素が特定の部位に組み込まれたセルロソーム由来の人工多タンパク質複合体は、セルロースの分解を改善するために使用される(Fierobe et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:21257-21261及びFierobe et al. 2005, J Biol Chem. 280(16):16325-34)。また、メバロン酸塩やグルカル酸などの目的分子の生産効率を高めるために、タンパク質間相互作用ドメインを利用した足場タンパク質も開発されている (Dueber et al. 2009. Nat. Biotechnol. 27:753-759)。
【0007】
それにもかかわらず、多様な環境条件下で安定性を保ちながら、細胞内で強力に発現される新規の足場タンパク質を開発する必要性が依然として存在する。
【0008】
ペルオキシレドキシン（Ｐｒｘｓ）は、極限環境生物を含む生物界全体に見られるタンパク質である。ペルオキシレドキシンは、ｐＨ、温度、塩濃度の非常に多様な条件に対して耐性がある。これらは、細胞の存続に不可欠な酸化還元機能を確保するために、高い安定性を獲得している。これらの配列は、機能に重要なシステインの周辺に構成された共通のモチーフを含んでいる。このモチーフを囲む配列の多様性により、宿主生物に適切な物理化学的特性を付与している。このタンパク質ファミリーは、ほとんどの場合、多量体化して十量体または十二量体環を形成できる約２０ｋＤａの単量体に基づく共通の構造を共有している。この特定の三次元配置により、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のＴＳＡ１などのＰｒｘは、単量体のＮ末端位置およびＣ末端位置に位置する浮遊末端を示す。
【発明の概要】
【0009】
本発明者らは、多様な環境条件で使用できる足場タンパク質を開発するために、ペルオキシレドキシンファミリーの多量体タンパク質である、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＴＳＡ１タンパク質またはピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンの特性を利用した。Ｐｒｘの固有の酸化還元活性を抑制し、Ｐｒｘの支持機能のみを保持するために、活性システインに変異が加えられた。本発明者らは、Ｐｒｘｓ単量体のＮおよび／またはＣ末端位置に目的のタンパク質を連結しても、Ｐｒｘの十量体構造が保存されたままであることと、目的のタンパク質の機能が維持されること、ペルオキシレドキシンは特定の特性を有する足場タンパク質であることを示した。
【0010】
本発明は、ペルオキシレドキシンのファミリーに由来する多量体タンパク質の足場タンパク質としての使用であって、１つ以上の目的のタンパク質が、前記ペルオキシレドキシンの１つ以上の単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結されていて、前記ペルオキシレドキシンは酸化還元活性を有さないことを特徴とする使用に関する。１つの特定の実施形態において、前記1つ以上の目的のタンパク質は酵素であり、足場タンパク質は酵素の触媒活性を増強するために使用され、または、前記目的のタンパク質は同じシグナル伝達経路のタンパク質であり、足場タンパク質はシグナル伝達の効率を増強するために使用される。
【0011】
ペルオキシレドキシンは、好ましくは配列番号１のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴＳＡ１であり、より詳細には配列番号１の配列の４８位および／または１７１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換されている。
【0012】
別の好ましい実施形態では、ペルオキシレドキシンは、配列番号１６のパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンであり、より具体的には、配列番号１６の配列の４６位および／または２１１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換されている。
【0013】
特定の一実施形態では、目的のタンパク質は、連結配列を介して前記ペルオキシレドキシン単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に融合される。
【0014】
別の特定の実施形態では、前記ペルオキシレドキシン単量体および目的のタンパク質は、アダプター／ペプチドリガンド対を介して連結される。
【0015】
別の態様によれば、本発明は、酸化還元活性を有さない１つ以上のペルオキシレドキシン単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結された少なくとも１つの目的のタンパク質を含む、ペルオキシレドキシンのファミリーに由来する多量体タンパク質であって、前記ペルオキシレドキシン単量体と前記目的のタンパク質がアダプター／ペプチドリガンド対を介して連結していることを特徴とする多量体タンパク質に関する。本発明は、また、酸化還元活性を有さない１つ以上のペルオキシレドキシン単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結された少なくとも２つの異なる目的タンパク質を含むペルオキシレドキシンのファミリー由来の多量体タンパク質に関する。ペルオキシレドキシンは、好ましくは配列番号１のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴＳＡ１であり、より具体的には配列番号１の配列の４８位および／または１７１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換されている。
【0016】
別の好ましい実施形態では、ペルオキシレドキシンは、配列番号１６のパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンであり、より具体的には、配列番号１６の配列の４６位および／または２１１位に変異したシステインを含み、好ましくはそれぞれアラニンまたはセリンで置換されている。
【0017】
好ましい一実施形態では、前記ペルオキシレドキシン単量体と目的のタンパク質は、アダプター／ペプチドリガンド対を介して連結される。
【0018】
本発明はさらに、上記の多量体タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド構築物、および前記ヌクレオチド構築物を含む発現ベクターに関する。本発明はまた、すべて上述したような、多量体タンパク質、１つ以上のヌクレオチド構築物、または発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A】（Ａ）左から右へ、共有結合グラフトＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、およびＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）３－ＣＲＤＳＡＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。矢印で示された目的のタンパク質は、超音波処理上清（ＳＳｏ）、ラクトース－セファロース樹脂（Ｌａｃ－Ｓｅｐｈ）、および溶出画分（溶出１～３）中に見出された。
【図1BC】（Ｂ）（Ａ）に示した３つの構造で得られたサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。（Ｃ）（Ｂ）で得られたメインピーク（Ｐ１およびＰ２）に対応する画分がＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されている。
【図1D】（Ｄ）（Ｂ）で得られたピークＰ１とグラフトされていないタンパク質ＴＳＡ１の動的光散乱による分析。平均サイズがナノメートル単位で報告されている。
【図2】６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３とＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐとの複合体の再構成のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析。ＳＳｏおよびＴＡＬＯＮは、それぞれ、超音波処理上清およびアフィニティー樹脂を示す。
【図3】（Ａ）遊離Ｐｆｕ－ＰＲＸ、足場を備えたＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ３Ｃ、および（Ｃ）足場を備えたＰＥＴａｓｅのＤＬＳスペクトル（ＤＬＳ：動的光散乱）。主要な種のそれぞれのサイズが示されている。
【図4】２５℃での等温滴定マイクロカロリメトリーによって得られたＴｓａ１（灰色）およびＰｆｕ－Ｐｒｘ（黒色）について記録されたサーモグラム。
【図5】示差走査マイクロカロリメトリーによりＰｆｕ－Ｐｒｘについて得られた変性曲線。各ピークの頂上で測定された半変性温度を示す。
【図6】ＳＤＳ変性ゲルでの電気泳動による、Ｐｆｕ－Ｐｒｘを足場としたプロテアーゼ３Ｃによる６Ｈｉｓ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３の分解のモニタリング。「Ｐｆｕ－Ｐｒｘ：３Ｃ」と表示されたレーンは、足場を備えたプロテアーゼに対応する。「基質」と表示されたレーンは、プロテアーゼの非存在下、１０℃で６０分後の６Ｈｉｓ－ＳＰＡＧ１－Ｃｔｅｒに対応する。１から６０と表示されたレーンは、１、２、５、１０、１５、３０および６０分後に採取された反応液サンプルの堆積に対応する。「ＭＴ」と表示されたレーンは、ｋＤａで表されるサイズマーカー（ＭＴ）に対応する。
【図7】Ｐｆｕ－Ｐｒｘを足場としたＰＥＴａｓｅによるＰＥＴ分解中の反応液のｐＨのモニタリング。黒色の曲線は、酵素の存在下でのＰＥＴに対応する。灰色の曲線は、酵素を含まないコントロールに対応する。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明者らは、単量体の遊離ＮおよびＣ末端が目的のタンパク質に連結しているペルオキシレドキシンの多量体タンパク質が、その特定の三次元構造を十量体または十二量体として保持し、目的のタンパク質の機能を維持することを示した。したがって、ペルオキシレドキシンの多量体タンパク質は足場タンパク質として使用され得る。
【0021】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、この鎖を形成するアミノ酸の数に関係なく、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の鎖に対応する。
【0022】
足場タンパク質は、様々な目的タンパク質間の相互作用とそれらの機能を促進するため、あるいは目的のタンパク質を局所的に集合させるために、単一のタンパク質複合体において、複数の同一または異なる目的タンパク質を連結することを可能にするタンパク質である。
【0023】
足場タンパク質は、複数の目的タンパク質を連結することにより、例えば、不要な相互作用を制限し、目的タンパク質の近接性と濃度を増大することにより、酵素反応の効率を高めるために、同じ代謝経路の化合物を単一の複合体に集合させることを可能にする。足場タンパク質はまた、目的タンパク質の機能を向上させるために、目的タンパク質を細胞の特定の領域に局在させることもできる。
【0024】
ＴＳＡ（チオール特異的抗酸化物質）とも呼ばれるペルオキシレドキシンタンパク質（ＰｒｘまたはＰＲＤＸ）（ＥＣ １．１１．１．２４）は、ペルオキシダーゼ性（Ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｃ）システイン（Ｃｐ）と呼ばれるシステイン残基によるペルオキシダーゼ活性を持つ高度に保存された酵素である。ペルオキシレドキシンは、その酸化部位を介して過酸化物を還元する。その後、Ｃｐシステインは「分解（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）」システイン（ＣＲ）と反応してジスルフィド架橋を形成し、これが電子供与体によって還元されて触媒サイクルを完了する(Revue Rhee SG, Mol Cells. 2016. 39(1):1-5)。
【0025】
ペルオキシレドキシンは、ＣＲシステインを有するか否かに応じて、２－Ｃｙｓ、非定型２－Ｃｙｓ、および１－Ｃｙｓペルオキシレドキシンのサブクラスに分類できる。Ｐｒｘの非定型２－Ｃｙｓサブクラスでは、ＣＲシステインは非定型の位置に位置する。
【0026】
最近では、ペルオキシレドキシンは、ＡｈｐＣ－Ｐｒｘ１、ＢＣＰ－ＰｒｘＱ、Ｐｒｘ５、Ｐｒｘ６、Ｔｐｘ、およびＡｈｐＥと呼ばれる６つのクラスにも分類される(Soito, Laura et al. 2011, Nucleic Acids Res. England. 39 (Database issue):D332-7.doi:10.1093/nar/gkq1060)。
【0027】
サブクラスＡｈｐＣ／Ｐｒｘ１およびＰｒｘ６のメンバーは、互いに結合して八量体、十量体、または十二量体を形成する(Hall et al. 2010, J Mol Biol. 402(1):194-209; Parsonage et al. 2005, Biochemistry, 2005;44(31):10583-92)。
【0028】
本特許出願のペルオキシレドキシンは、多量体化して、好ましくは十量体または十二量体を形成でき、より具体的にはＡｈｐＣ－Ｐｒｘ１またはＰｒｘ６のサブクラスのペルオキシレドキシン単量体である。Ｐｒｘ単量体は、好ましくは、ＡｈｐＣ－Ｐｒｘ１のサブクラスに由来する。
【0029】
サブクラスＡｈｐＣ－Ｐｒｘ１は、本質的に「典型的な２－Ｃｙｓ」Ｐｒｘで構成されている。このサブクラスのメンバーは、細菌のＡｈｐＣタンパク質、トリパレドキシンペルオキシダーゼ、シロイヌナズナ由来の２－Ｃｙｓ Ｐｘｒｓおよびオオムギ由来のＢａｓ１ Ｐｘｒｓを含む植物Ｐｒｘ、酵母タンパク質ＴＳＡ１およびＴＳＡ２、ならびにヒトＰｒｘＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含む。Ｐｒｘｓの共通の基本構造に加えて、このサブクラスのメンバーはＣＲを含むＣ末端伸長を持ち、これはＢ型インターフェースを介してそのパートナーのサブユニットのＣｐとジスルフィド結合を形成する(Hall et al 2010, J Mol Biol.402(1):194－209)。
【0030】
サブクラスＰｒｘ６は、細菌のＰｒｘ６タンパク質、シロイヌナズナおよびオオムギの１－Ｃｙｓ植物Ｐｒｘ、ミトコンドリア酵母タンパク質Ｐｒｘ１、およびヒトＰｒｘＶＩを含む。Ｐｒｘ６タンパク質は、ＡｈｐＣ／Ｐｒｘ１サブクラスに近い。Ｐｒｘ６タンパク質はＣ末端伸長を含み、Ｂ型二量体を形成し、場合によってはより高次のオリゴマー状態を形成する。しかし、ＡｈｐＣ－Ｐｒｘ１サブクラスとは対照的に、代表的な２－Ｃｙｓが存在するもののＰｒｘ６サブクラスのメンバーは主に１－Ｃｙｓである(Deponte and Becker 2005)。
【0031】
【表1A】
【0032】
【表1B】
【0033】
【表1C】
【0034】
【表1D】
【0035】
【表1E】
【0036】
好ましくは、ペルオキシレドキシンのファミリー由来の多量体タンパク質の単量体は、以下からなる群から選択される：サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴＳＡ１（配列番号１）、Aeropyrum pernix K1由来のペルオキシレドキシン（配列番号２）、Crithidia fasciculata由来のトリパレドキシンペルオキシダーゼ（配列番号３）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のペルオキシレドキシン（配列番号４）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のクロロプラスチック２－ＣｙｓペルオキシレドキシンＢＡＳ１（配列番号５）、リーシュマニア・インファンタム（Leishmania infantum）由来のミトコンドリアペルオキシレドキシン（配列番号６）、ラット（Rattus norvegicus）由来のペルオキシレドキシン－１（配列番号７）、Leishmania major由来のトリパレドキシンペルオキシダーゼ（配列番号８）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）由来のペルオキシレドキシン－４（アイソフォーム１）（配列番号９）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴＳＡ２（配列番号１０）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼＣ（配列番号１１）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）由来のペルオキシレドキシン－２（アイソフォーム１）（配列番号１２）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼＣ（配列番号１３）、吸虫（Schistosoma mansoni）（住血吸虫（Blood fluke））由来のチオレドキシンペルオキシダーゼ（配列番号１４）、Trypanosoma cruzi由来の推定トリパレドキシンペルオキシダーゼ（配列番号１５）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシン（配列番号１６）、Pyrococcus horikoshii由来のペルオキシレドキシン（配列番号１７）、Mus musculus由来のペルオキシレドキシン－４（配列番号１８）、Amphibacillus xylanus由来のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼＣ（配列番号１９）、Ancylostoma ceylanicum由来のペルオキシレドキシン－１（配列番号２０）、Enterococcus faecalis 由来のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼＣ（配列番号２１）、Larimichthys crocea由来のペルオキシレドキシン４（配列番号２２）、Sulfolobus islandicus由来のペルオキシレドキシン（配列番号２３）、Plasmodium vivax由来の推定２－Ｃｙｓペルオキシレドキシン（配列番号２４）、Leishmania braziliensis由来のペルオキシレドキシン（配列番号２５）、Akkermansia muciniphila由来のペルオキシレドキシン（配列番号２６）、大腸菌（Escherichia coli）由来のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼＣ（配列番号２７）およびMycobacterium tuberculosis H37Rv由来のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼＣ（配列番号２８）、またはその機能的変異体。
【0037】
「ペルオキシレドキシン単量体」または「ペルオキシレドキシン」とは、天然のペルオキシレドキシンの任意の単量体であるが、特に、多量体化して十量体または十二量体環を形成する能力を保持し、単量体のＮおよびＣ末端がこの環の外側に露出しているその機能的変異体も意味する。
【0038】
好ましくは、本明細書で使用される「変異体」または「機能的変異体」という用語は、上述のペルオキシレドキシン中のアミノ酸配列、より具体的には、配列番号１～２８からなる群から選択される配列のうちの１つと、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、多量体化して十量体または十二量体環を形成する能力を保持するポリペプチドを示し、単量体のＮおよびＣ末端がこの環の外側に露出している。
【0039】
本明細書において、「配列同一性」または「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列のアラインメントに由来する位置における一致（同一のアミノ酸残基）の数（％）を指す。配列の同一性は、配列間のギャップを最小限に抑えながら重複と同一性を最大化するように配列を並べたときに配列を比較することによって決定される。より具体的には、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、所定数のグローバルまたはローカル数学的アラインメントアルゴリズムを使用して決定され得る。類似した長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適に並べるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて並べ、一方、実質的に異なる長さを有する配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）またはＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Altschul et al, 1997; Altschul et al, 2005））を用いて並べる。アミノ酸配列の同一性パーセンテージを決定する目的のためのアラインメントは、例えばhttp:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/などのウェブサイトで公衆がアクセスできるデジタルソフトウェアを使用するなど、当業者の能力の範囲内であるさまざまな方法で実施することができる。この分野の専門家は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要なアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本文書の目的上、アミノ酸配列同一性のパーセント値は、EMBOSS Needleペアワイズ配列アラインメントプログラムを使用して生成された値を指す。このプログラムは、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作成するもので、すべての検索パラメータは、デフォルトの値、すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、オープンスペース＝１０、拡張スペース＝０．５、エンドスペースペナルティ＝ｆａｌｓｅ、エンドオープンスペース＝１０、およびエンド拡張スペース＝０．５に調節されている。
【0040】
「変異体」または「機能的変異体」という用語は、好ましくは、１つ以上の保存的置換において配列番号１～２８の配列の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。
【0041】
「置換された」または「修飾された」とは、本発明では、天然アミノ酸から変更または修飾されたアミノ酸を意味する。
【0042】
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、タンパク質の立体構造および全体的な機能に悪影響を与えることなく、あるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することを意味し、これには、あるアミノ酸を類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性度、塩基性酸性度、形状、疎水性、芳香族性など）を有する別のアミノ酸で置換することが挙げられるが、これに限定されない。
【0043】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン）のグループに見られる。
【0044】
本特許出願におけるペルオキシレドキシンまたはペルオキシレドキシンの機能的変異体は、酸化還元活性を示さないペルオキシレドキシンである。より具体的には、ペルオキシレドキシンまたはペルオキシレドキシン変異体は、変異したペルオキシダーゼ性(peroxidatic)システインおよび／または「分解」残基を含む。ペルオキシレドキシンのペルオキシダーゼ性(peroxidatic)システインおよび「分解」システインは、多数のペルオキシレドキシンタンパク質について特徴づけられており、当業者にはよく知られている（Nelson et al. Proteins, 2012, 79(3):947-964; http://csb.wfu.edu/prex/search.php)。より具体的には、ＣＲはヒトＰｒｘＩＩのＣ１７２と同じ位置で保存されている。例として、多数のペルオキシレドキシンタンパク質のペルオキシダーゼ性(peroxidatic)システインと分解システインを表１に示す。
【0045】
上述のペルオキシレドキシン単量体は、他のアミノ酸、好ましくはアラニンまたはセリンによって変異したペルオキシダーゼ性(peroxidatic)および／または「分解」システインを有することが好ましい。
【0046】
本特許出願は、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のペルオキシレドキシン単量体ＴＳＡ１に関し、好ましくは配列番号１の配列の４８位および／または１７１位に任意の他のアミノ酸、好ましくはアラニンまたはセリンによって変異したシステインを有し、好ましくは、配列番号２９の配列を含む、またはそれからなる変異Ｐｒｘ単量体に関する。
【0047】
本発明者らは、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシンが特に安定であり、低濃度でもその十量体構造を保持しており、足場タンパク質として特に有利であることを実証した。したがって、別の好ましい実施形態においては、本特許出願は、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシン単量体に関し、好ましくは、配列番号１６の配列の４６位および／または２１１位において任意の他のアミノ酸、好ましくはアラニンまたはセリンにより変異したシステインを有し、好ましくは配列番号５２の配列を含む、またはそれからなる変異Ｐｒｘ単量体に関する。
【0048】
多量体化して十量体または十二量体環を形成できるペルオキシレドキシンは、各単量体のＮおよびＣ末端位置に浮遊末端をもつ。したがって、上述のように、１つ以上の目的のタンパク質は、ペルオキシレドキシンの１つ以上の単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結され得る。
【0049】
本発明によるペルオキシレドキシンのファミリー由来の多量体タンパク質は、好ましくは、酸化還元活性を有さない１つ以上のペルオキシレドキシン単量体の１つまたは２つのＮおよびＣ末端に連結する少なくとも２つの異なる目的のタンパク質を含む。
【0050】
目的のタンパク質は、タンパク質複合体に組み立てられたときに活性または機能が向上する任意のタンパク質を含む。目的のタンパク質は、好ましくは５０ｋＤａ未満、好ましくは４０、３０、２０または１０ｋＤａ未満、好ましくは２０ｋＤａ未満のサイズを有する。
【0051】
本発明による目的のタンパク質は、好ましくは代謝経路の酵素またはタンパク質である。
【0052】
特定の一実施形態では、目的のタンパク質は同じ代謝経路からのタンパク質であり、足場タンパク質は合成の効率を増強するために使用される。例えば、同じ代謝経路のタンパク質は、例えば、カテキン、Ｄ－グルカル酸、Ｈ２、ハイドロキノン、レスベラトロール、酪酸塩、γ－アミノ酪酸、およびメバロン酸塩、（２Ｓ，５Ｓ）－ヘキサンジオール、モノ（２－ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＭＨＥＴ）、テレフタル酸およびエチレングリコールなどの目的の分子の合成を可能にするタンパク質である。
【0053】
別の特定の実施形態では、目的のタンパク質は酵素であり、足場タンパク質は酵素の触媒活性を増強するために使用される。酵素は、好ましくはポリマー基質を有する酵素である。例えば、酵素は以下からなる群から選択され得る：ＰＥＴ加水分解酵素（ＰＥＴａｓｅ）、リゾチーム、ＭＨＥＴａｓｅ、アルコールデヒドロゲナーゼ、溶解性多糖モノオキシゲナーゼ（lytic polysaccharide monooxygenases）（ＬＰＭＯ）およびエンドペプチダーゼ。
【0054】
ある特定のケースでは、目的のタンパク質はレポータータンパク質ではない。
【0055】
「レポータータンパク質」という用語は、例えば生物発光（例えば蛍光）、酵素活性の検出、または抗体による認識によって、それを観察または定量化できる特徴を有するタンパク質を示す。したがって、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、着色された生成物または容易に特徴付け可能な表現型の出現を引き起こす作用を有する酵素、または他の定量化可能な活性を有する任意の他のタンパク質、またはタグと呼ばれるアミノ酸の短い配列から選択され得る。レポータータンパク質は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）またはヒドロラーゼ（β－グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびβ－ラクタマーゼ（ＴＥＭ－１）、タグＨＡ（ヒトインフルエンザヘマグルチニン）、ＦＬＡＧ、ｐｏｌｙＨｉｓ６および蛍光タンパク質から選択される。
【0056】
目的のタンパク質は、共有結合または非共有結合によって、ペルオキシレドキシン単量体のＮ末端またはＣ末端に連結させることができる。
【0057】
特定の一実施形態では、目的のタンパク質は、ペルオキシレドキシンの単量体のＮ末端またはＣ末端に共有結合で融合される。
【0058】
本特許出願において使用される「融合タンパク質」の用語は、同じタンパク質に由来しない少なくとも２つの異なるポリペプチドを含むタンパク質のことをいう。
【0059】
２つのタンパク質は、直接融合されてもよいし、リンカーと呼ばれるペプチド配列を介して融合されてもよく、このリンカーは、タンパク質がタンパク質の活性のためによりよい立体構造をとるように、様々なタンパク質またはタンパク質フラグメントを結合させることができる。より具体的には、ヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０アミノ酸のペプチド配列をコードする。１つの好ましい実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３０）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３１）からなるペプチド配列をコードする。
【0060】
別の特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ペルオキシレドキシンの単量体のＮ末端またはＣ末端に、好ましくはアダプター／ペプチドリガンド対を介して非共有結合的に連結される。アダプター／ペプチドリガンド対は、それぞれ連結している２つのタンパク質の効果的なカップリングを可能にする特定の配列モチーフを有するペプチドリガンドに対して高い親和性を有するタンパク質のアダプター領域からなる。
【0061】
アダプター／ペプチドリガンド対を使用すると、足場タンパク質のＰｒｘ単量体に連結する目的のタンパク質の数と種類を制御し、足場タンパク質上の目的のタンパク質の立体障害を防ぐことができる。
【0062】
本発明の文脈において使用することができるアダプター／ペプチドリガンド対は、当業者に周知であり、例えば、ドメインＳＨ３、ＳＨ２、ＰＤＺ、ＧＢＤ（ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン）が挙げられる（Horn A. H. C. et al. 2015, Front Bioeng Biotechnol. 3:191）。
【0063】
本発明者らはまた、Ｒｓａ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ０８９３２）、ＮＵＦＩＰ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９ＵＨＫ０），ＨＳＰ９０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０８２３８，Ｐ０７９００），ＨＳＰ７０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０ＤＭＶ８），ＲＰＡＰ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９Ｈ６Ｔ３），ＳＰＡＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ０７６１７）またはＴａｈ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２５６３８）のタンパク質の連結ドメインを含む新しいアダプター/ペプチドリガンド対の特徴づけも行った。
【0064】
１つの好ましい実施形態では、アダプター／ペプチドリガンド対は、以下の対から選択される（表２を参照）：
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３４のＳＰＡＧ１－６２２７４２；
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３５のＳＰＡＧ１－２０６３２７ｏｐｔ；
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３６のＲＰＡＰ３－２８１３９６；
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３７のＴａｈ１；
-配列番号３８のＨＳＰ７０Ｃおよび配列番号３４のＳＰＡＧ１－６２２７４２；
-配列番号３８のＨＳＰ７０Ｃおよび配列番号３５のＳＰＡＧ１－２０６３２７ｏｐｔ；
-配列番号３９のｙＳＮＵ１３および配列番号４０のＲｓａ１－２３８２５９；
-配列番号４１のｈＳＮＵ１３および配列番号４２のＮＵＦＩＰ１－２３３２５５；
-配列番号４３のＴａｈ１－９３１１１および配列番号４４のＰｉｈ１－２５８３４４；
-配列番号４５のＲＰＡＰ３－３９６４５５および配列番号４６のＰＩＨ１Ｄ１－１９９２９０；
-配列番号４７のＺＮＨＩＴ３－８５１５５および配列番号４８のＮＵＦＩＰ１－４６２４９５；
-配列番号４９のＨｉｔ１－７０１６４および配列番号５０のＲｓａ１－３１７３５２。
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３４のＳＰＡＧ１－６２２７４２；
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３５のＳＰＡＧ１－２０６３２７ｏｐｔ；
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３６のＲＰＡＰ３－２８１３９６；
-配列番号３２または３３のＨＳＰ９０Ｃおよび配列番号３７のＴａｈ１；
-配列番号３８のＨＳＰ７０Ｃおよび配列番号３４のＳＰＡＧ１－６２２７４２；
-配列番号３８のＨＳＰ７０Ｃおよび配列番号３５のＳＰＡＧ１－２０６３２７ｏｐｔ；
-配列番号３９のｙＳＮＵ１３および配列番号４０のＲｓａ１－２３８２５９；
-配列番号４１のｈＳＮＵ１３および配列番号４２のＮＵＦＩＰ１－２３３２５５；
-配列番号４３のＴａｈ１－９３１１１および配列番号４４のＰｉｈ１－２５８３４４；
-配列番号４５のＲＰＡＰ３－３９６４５５および配列番号４６のＰＩＨ１Ｄ１－１９９２９０；
-配列番号４７のＺＮＨＩＴ３－８５１５５および配列番号４８のＮＵＦＩＰ１－４６２４９５；
-配列番号４９のＨｉｔ１－７０１６４および配列番号５０のＲｓａ１－３１７３５２。
【0065】
【表2】
【0066】
より具体的には、上記のようなアダプタードメインおよび／またはペプチドリガンドは、ペルオキシレドキシンの単量体、好ましくは１つまたは２つのＮまたはＣ末端に融合され、対応するアダプタードメインおよび／またはペプチドリガンドは、ペルオキシレドキシンの単量体と目的のタンパク質とがアダプター／ペプチドリガンド対の連結を介して互いに連結されるように、目的のタンパク質に融合される。
【0067】
１つの好ましい実施形態では、タンパク質は、組換え技術を使用して合成される。この場合、上記のタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれからなる核酸構築物が使用され、宿主細胞内で発現される。本特許出願によるタンパク質を生産するために使用され得る核酸および発現ベクターを以下に記載する。
【0068】
核酸と発現ベクター
本特許出願はさらに、上述の多量体タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド構築物に関する。
本特許出願はさらに、上述の多量体タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド構築物に関する。
【0069】
「核酸」または「ヌクレオチド配列」という用語は、核酸から構成される、または核酸を含む任意の分子を指すために互換的に使用され得る。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ヌクレオチド配列は、化学的または人為的に改変されていてもよい。ヌクレオチド配列は、核酸、ペプチド、モルホリノ、ブロックされた核酸、さらにグリコール核酸およびトレオース核酸を含んでもよい。これらの配列はそれぞれ、天然のＤＮＡまたはＲＮＡとは骨格の性質が異なる。ホスホロチオエートヌクレオチドを使用してもよい。メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’－ホスホルアミデートおよびホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド、ならびに類似体２’－Ｏ－アリル－および２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネート等の、他の核酸類似体が本発明の文脈において使用され得る。
【0070】
特定の一実施形態において、本特許出願は、１つまたは２つのＮおよびＣ末端に、目的のタンパク質と、好ましくはリンカーを介して融合されたペルオキシレドキシン単量体をコードするヌクレオチド構築物に関する。
【0071】
上述のペルオキシレドキシン単量体をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、「リンカー」、好ましくは、タンパク質がタンパク質の活性のためにより良いコンフォメーションをとるように、種々のタンパク質またはタンパク質フラグメントを連結することを可能にするペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を介して、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合される。より具体的には、ヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０アミノ酸のペプチド配列をコードする。１つの好ましい実施形態において、リンカーは、ペプチド配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）またはＧＧＧＳをコードする。
【0072】
２つ以上のヌクレオチド配列の融合とは、異なるタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする２つ以上のヌクレオチド配列の組み合わせのことをいい、融合した２つの遺伝子の翻訳により単一の機能的ポリペプチドが得られる。本発明の文脈において、ペルオキシレドキシン単量体は、目的のタンパク質と融合し、目的のタンパク質または目的の複数のタンパク質が複合体化することを可能にする、多量体の「足場」タンパク質を形成する。
【0073】
別の特定の実施形態において、本特許出願は、１つまたは２つのＮおよびＣ末端で、上記で定義されたアダプタードメインの第１のペプチド配列と融合したペルオキシレドキシン単量体をコードするヌクレオチド構築物、ならびに、アダプター／ペプチドリガンド対の対応するペプチドリガンドに融合された目的のタンパク質をコードするヌクレオチド構築物に関する。ペルオキシレドキシン単量体は、アダプター／ペプチドリガンド対を介して、１つ以上の目的のタンパク質と非共有結合的に連結し、１つ以上の目的のタンパク質を複合化させる多量体の「足場」タンパク質を形成することができる。
【0074】
記載のヌクレオチド配列は、好ましくは、ペルオキシレドキシン単量体または目的のタンパク質をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡとも呼ぶ）のことをいう。本特許出願のヌクレオチド構築物は、好ましくは、上記のようなペルオキシレドキシン単量体をコードする配列を含み、好ましくは、４８位および１７１位が変異したＳ．セレヴィシエ（S. cerevisiae）由来のペルオキシレドキシン単量体ＴＳＡ１をコードする配列番号５１の配列を含む。
【0075】
別の好ましい実施形態において、本特許出願のヌクレオチド構築物は、４６位および２１１位が変異したパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のペルオキシレドキシン単量体をコードする配列番号５３の配列を含む。
【0076】
本特許出願はさらに、上記のヌクレオチド構築物を含むベクターに関する。
【0077】
ここで「ベクター」とは、一本鎖または二本鎖の形態を同様に有し得るＤＮＡ分子のことをいう。
【0078】
本発明による組換えベクターは、好ましくはプラスミドベクターまたは組み込みベクターである。本発明のある実施形態では、ベクターはプラスミドである。本明細書における「プラスミド」とは、細胞内で自律的に複製できるような複製起点と、細胞増殖の過程で生物によって失われないような選択遺伝子を持つ、２本鎖の環状ＤＮＡ分子のことをいう。それ自体、多数のベクターが知られている；適切なベクターの選択は、このベクターの使用目的（例えば、目的の配列の複製、この配列の発現、染色体外形態でのこの配列の維持、または宿主の染色体装置への組み込み）、および宿主細胞の性質による。
【0079】
前記ベクターは、好ましくは、上記で定義したような目的遺伝子の発現に必要な全ての要素を含む発現ベクターである。例えば、前記ベクターは、転写および場合によっては翻訳を調節する適切な配列（プロモーター、アクチベーター、イントロン、開始コドン（ＡＴＧ）、コドン停止、ポリアデニル化シグナル、スプライシング部位）の制御下にある、上記で定義した少なくとも１つの目的の遺伝子を含む発現カセットを含む。
【0080】
ベクターは好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。１つの特定の実施形態において、ベクターは、原核宿主細胞における使用に適合され、好ましくは以下から選択される：ＡＣＹＣ１８４、ｐＢｅｌｏＢａｃｌｌ、ｐＢＲ３３２、ｐＢＡＤ３３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳおよびその誘導体、ｐＳＣ１０１、ＳｕｐｅｒＣｏｓ（コスミド）、ｐＷＥ１５（コスミド）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢＡＤ２４、ＣｏｌＥ１複製起点を含むベクターおよびその誘導体、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＲＧＨＯ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭ、ｐｎＥＡ、ｐｎＹＫ、ｐｎＣＳおよびｐＴＺベクター。
【0081】
コード領域に加えて、目的の遺伝子は、活性化配列、応答エレメント、インスレーター、ポリアデニル化シグナルおよび／または任意の他の機能的エレメントのような、前記遺伝子の発現を促進または増強する1つ以上のエレメントを含むか、またはそれらと組み合わせられてもよい。
【0082】
ペルオキシレドキシン単量体および／または目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の発現を可能にするためのプロモーターの転写制御下で、発現ベクターに挿入され得る。
【0083】
「プロモーター」とは、操作的に連結されたヌクレオチド配列の細胞内での発現を正に制御することができるポリヌクレオチドのことをいう。プロモーターまたはプロモーター配列は、遺伝子の近くに位置し、ＤＮＡからＲＮＡへの転写に不可欠なＤＮＡ領域である。プロモーター配列は一般に転写開始部位の上流に位置する。プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡの合成を開始する前に最初に付着する領域に相当する。
【0084】
宿主細胞
本特許出願はさらに、すべて上記のような多量体タンパク質、ヌクレオチド構築物またはベクターを含む宿主細胞に関する。
宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。
本特許出願はさらに、すべて上記のような多量体タンパク質、ヌクレオチド構築物またはベクターを含む宿主細胞に関する。
宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。
【0085】
真核細胞には、特に動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞が含まれる。
真核宿主細胞は、好ましくは、以下からなる群から選択される：ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・コクラメ（Pichia koclamae）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・オプティアエ（Pichia opuntiae）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・ゲルカム（Pichia guercuum）、ピキア・ピジュペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スティプティス（Pichia stiptis）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア属種（Pichia sp.）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス属種（Saccharomyces sp.）、ハンセヌラ・ポリモルフ（Hansenula polymorphs）、クリベロマイセス属種（Kluyveromyces sp.）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム属種（Fusarium sp.）、フザリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、スポドプテラ・フルギペルダ Ｓｆ９（Spodoptera frugiperda Sf9）、スポドプテラ・フルギペルダ Ｓｆ２１（Spodoptera frugiperda Sf21）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）。
真核宿主細胞は、好ましくは、以下からなる群から選択される：ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・コクラメ（Pichia koclamae）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・オプティアエ（Pichia opuntiae）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・ゲルカム（Pichia guercuum）、ピキア・ピジュペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スティプティス（Pichia stiptis）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア属種（Pichia sp.）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス属種（Saccharomyces sp.）、ハンセヌラ・ポリモルフ（Hansenula polymorphs）、クリベロマイセス属種（Kluyveromyces sp.）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム属種（Fusarium sp.）、フザリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、スポドプテラ・フルギペルダ Ｓｆ９（Spodoptera frugiperda Sf9）、スポドプテラ・フルギペルダ Ｓｆ２１（Spodoptera frugiperda Sf21）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）。
【0086】
原核細胞は、好ましくは、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス属菌（Lactobacillus sp.）、サルモネラ属菌（Salmonella sp.）、赤痢菌属（Shigella sp.）、ロドコッカス属菌（Rhodococcus sp.）、バチルス属菌（Bacillus sp.）、およびシュードモナス属菌（Pseudomonas sp.）からなる群から選択される。
【0087】
多量体タンパク質の使用
上述のペルオキシレドキシンのファミリーに由来する多量体タンパク質は、足場タンパク質として使用される。足場タンパク質は、１つまたは複数の目的のタンパク質の機能を改善するために、１つまたは複数の目的のタンパク質を複合体化することを可能にする。
上述のペルオキシレドキシンのファミリーに由来する多量体タンパク質は、足場タンパク質として使用される。足場タンパク質は、１つまたは複数の目的のタンパク質の機能を改善するために、１つまたは複数の目的のタンパク質を複合体化することを可能にする。
【0088】
足場タンパク質は、好ましくは、１つ以上の代謝経路タンパク質を足場タンパク質に複合体化することによって、目的の分子の合成を増強することを可能にする。目的のタンパク質が代謝経路タンパク質である場合の機能改善とは、代謝経路の最終産物または中間産物に相当する目的の分子の合成を増強することをいう。より具体的には、本発明による足場タンパク質の使用は、遊離酵素の存在下での生産と比較して、目的の分子の代謝生産レベルを少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０倍に増強することを可能にする。
【0089】
目的の分子としては、限定されるものではないが、カテキン、Ｄ－グルカル酸、Ｈ２、ヒドロキノン、レスベラトロール、酪酸塩、γ－アミノ酪酸、メバロン酸塩、（２Ｓ，５Ｓ）ヘキサンジオール、モノ（２－ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＭＨＥＴ）、テレフタル酸、エチレングリコールなどが挙げられる。
【0090】
目的のタンパク質が酵素である場合、機能の向上とは酵素の触媒活性を増強することをいう。したがって、足場タンパク質は酵素の濃度と安定性を高め、よって、触媒活性を高めることができる。
【0091】
特定の一実施形態において、目的のタンパク質は加水分解酵素であり、好ましくは高分子基質を有する加水分解酵素である。加水分解酵素は、好ましくは以下から選択される酵素である：ＰＥＴヒドロラーゼ、ＭＨＥＴアーゼ、リゾチーム、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＬＰＭＯおよびエンドペプチダーゼ。
【0092】
以下の実施例を参照すると、本発明がよりよく理解されるであろうが、これらの実施例はいかなる制限も課すことを意図しておらず、単に本発明の特定の実施形態および特定の有利な特性を文書化するものである。
【実施例】
【0093】
１．共有結合グラフトの例
以下の例では、ヒトガレクチン－３のＣＲＤＳＡＴドメインをＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のＴＳＡ１タンパク質の変異体Ｃ１７１Ａに共有結合でグラフトさせた。このために、大腸菌によるタンパク質の過剰発現に適したプラスミドが合成された。ＣＲＤＳＡＴドメインのオリゴヌクレオチド配列（Kriznikら、2019、Biotechnol.J., doi:10.1002/biot.201800214）を、これらのプラスミド上で、ＴＳＡ１－Ｃ１７１Ａのオリゴヌクレオチド配列の上流（Ｎｔｅｒ位置）または下流（Ｃｔｅｒ位置）、あるいはその両側に配置した。Ｃｔｅｒ位置に配置されるとき、ＣＲＤＳＡＴの配列の前には、タンパク質配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＳ）３、配列番号３１）の非天然リンカー領域がある。
以下の例では、ヒトガレクチン－３のＣＲＤＳＡＴドメインをＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のＴＳＡ１タンパク質の変異体Ｃ１７１Ａに共有結合でグラフトさせた。このために、大腸菌によるタンパク質の過剰発現に適したプラスミドが合成された。ＣＲＤＳＡＴドメインのオリゴヌクレオチド配列（Kriznikら、2019、Biotechnol.J., doi:10.1002/biot.201800214）を、これらのプラスミド上で、ＴＳＡ１－Ｃ１７１Ａのオリゴヌクレオチド配列の上流（Ｎｔｅｒ位置）または下流（Ｃｔｅｒ位置）、あるいはその両側に配置した。Ｃｔｅｒ位置に配置されるとき、ＣＲＤＳＡＴの配列の前には、タンパク質配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＳ）３、配列番号３１）の非天然リンカー領域がある。
【0094】
ａ．プロトコル
各プラスミドは、コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ２ Ｃａ２＋株に４２℃で６０秒間のヒートショックにより導入した。形質転換クローンは、アンピシリン（Ａ）とクロラムフェニコール（Ｃ）を添加した固形ＬＢ－寒天培地上で選択した。３７℃で一晩おいた後、単離したコロニーを５０ｍＬのＬＢ－ＡＣ培地中で撹拌しながら３７℃で１６時間培養する。この培養液１０ｍＬを５００ｍＬのＬＢ－ＡＣ培地に導入し、３７℃で撹拌しながら、波長６００ｎｍで測定した溶液の吸光度が０．６になるまで培養する。プラスミドがコードする組換えタンパク質の過剰発現が、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、最終濃度０．２５ｍＭ）の添加によって誘導される。この培養液を２０℃で１６時間撹拌した後、４０００ｇで４５分間遠心分離する。菌体ペレットを２０ｍＬのバッファー１（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）に取り込み、超音波処理で溶解する。超音波処理物を４℃、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清をあらかじめバッファー１で平衡化した５０％ラクトース・セファロース樹脂１ｍＬとともに４℃で３０分間インキュベートする。樹脂をバッファー１で３回洗浄する。組換えタンパク質を、濃度２００ｍＭのＤ－ラクトースを含む１．５ｍＬのバッファー１を３回加えて溶出する。各精製ステップ（溶解、固定、溶出）でサンプルを採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析する。必要に応じて、目的のタンパク質を含む画分を集め、体積が０．２５ｍＬになるまで濃縮する。この溶液を、あらかじめバッファー２（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ分析カラム（Ｓ６Ｉ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入する。タンパク質は、そのサイズに応じてバッファー２で溶出される。溶出液は２８０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターされる。０．５ｍＬの画分をカラム出口で回収する。画分中の目的のタンパク質の存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニターする。
各プラスミドは、コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ２ Ｃａ２＋株に４２℃で６０秒間のヒートショックにより導入した。形質転換クローンは、アンピシリン（Ａ）とクロラムフェニコール（Ｃ）を添加した固形ＬＢ－寒天培地上で選択した。３７℃で一晩おいた後、単離したコロニーを５０ｍＬのＬＢ－ＡＣ培地中で撹拌しながら３７℃で１６時間培養する。この培養液１０ｍＬを５００ｍＬのＬＢ－ＡＣ培地に導入し、３７℃で撹拌しながら、波長６００ｎｍで測定した溶液の吸光度が０．６になるまで培養する。プラスミドがコードする組換えタンパク質の過剰発現が、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、最終濃度０．２５ｍＭ）の添加によって誘導される。この培養液を２０℃で１６時間撹拌した後、４０００ｇで４５分間遠心分離する。菌体ペレットを２０ｍＬのバッファー１（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）に取り込み、超音波処理で溶解する。超音波処理物を４℃、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清をあらかじめバッファー１で平衡化した５０％ラクトース・セファロース樹脂１ｍＬとともに４℃で３０分間インキュベートする。樹脂をバッファー１で３回洗浄する。組換えタンパク質を、濃度２００ｍＭのＤ－ラクトースを含む１．５ｍＬのバッファー１を３回加えて溶出する。各精製ステップ（溶解、固定、溶出）でサンプルを採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析する。必要に応じて、目的のタンパク質を含む画分を集め、体積が０．２５ｍＬになるまで濃縮する。この溶液を、あらかじめバッファー２（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ分析カラム（Ｓ６Ｉ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入する。タンパク質は、そのサイズに応じてバッファー２で溶出される。溶出液は２８０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターされる。０．５ｍＬの画分をカラム出口で回収する。画分中の目的のタンパク質の存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニターする。
【0095】
ｂ．結果
超音波処理上清中、ラクトース－セファロース樹脂上、およびラクトース－セファロース樹脂からの溶出画分中に、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴの存在が検出された（図１Ａ）。各溶出液の大部分のピークのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、これらのピークの画分には、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、またはＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴタンパク質が高純度で含まれていることが示された。Ｓ６Ｉカラムでの保持量とＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でのタンパク質の移動プロファイルは、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、またはＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴの分子量と一致している（図１Ｂおよび１Ｃ）。目的のタンパク質を含むＳ６Ｉ画分の動的光散乱（ＤＬＳ）分析は、ＮａｎｏＳｉｚｅｒ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて２０℃で行った。この分析は、目的の各タンパク質について、溶液中の大部分の種を非常によく特徴づける単分散ピークを示す。十量体野生型タンパク質ＴＳＡ１で行った測定で示されるように、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴのサイズは、Ｎｔｅｒ、Ｃｔｅｒ、またはＮｔｅｒ／ＣｔｅｒがＣＲＤＳＡＴドメインによって装飾されたＴＳＡ１十量体に適合する（図１Ｄ）。
超音波処理上清中、ラクトース－セファロース樹脂上、およびラクトース－セファロース樹脂からの溶出画分中に、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴの存在が検出された（図１Ａ）。各溶出液の大部分のピークのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、これらのピークの画分には、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、またはＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴタンパク質が高純度で含まれていることが示された。Ｓ６Ｉカラムでの保持量とＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でのタンパク質の移動プロファイルは、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、またはＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴの分子量と一致している（図１Ｂおよび１Ｃ）。目的のタンパク質を含むＳ６Ｉ画分の動的光散乱（ＤＬＳ）分析は、ＮａｎｏＳｉｚｅｒ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて２０℃で行った。この分析は、目的の各タンパク質について、溶液中の大部分の種を非常によく特徴づける単分散ピークを示す。十量体野生型タンパク質ＴＳＡ１で行った測定で示されるように、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１、ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴ、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－ＣＲＤＳＡＴのサイズは、Ｎｔｅｒ、Ｃｔｅｒ、またはＮｔｅｒ／ＣｔｅｒがＣＲＤＳＡＴドメインによって装飾されたＴＳＡ１十量体に適合する（図１Ｄ）。
【0096】
２．非共有結合グラフトの例
ａ．プロトコル
組換えタンパク質の生産のために、タンパク質ＴＳＡ１－Ｃ１７１Ａのオリゴヌクレオチド配列、その後ろにＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（配列番号３０）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（配列番号３１）、その後続けてヒトタンパク質ＨＳＰ９０（ＨＳＰ９０ｐｅｐ）から得られたペプチド配列ＤＡＳＲＭＥＥＶＤ（配列番号３２）をコードするｐＣＡＲＧＨＯ２型プラスミドを設計した。ｐｎＥＡベクターは、ヒトタンパク質ＳＰＡＧ１のＴＰＲ３ドメイン（タンパク質の６２２－７４２領域に対応、配列番号３４）をコードすることができ、Ｎ末端位置に６－ヒスチジン（６ｘＨＩＳ）標識が融合されている。上記で詳述したように、ＬＢ培地中で組換えタンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐおよび６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３を過剰発現させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ２株の３０ｍＬ培養物を生産する。
ａ．プロトコル
組換えタンパク質の生産のために、タンパク質ＴＳＡ１－Ｃ１７１Ａのオリゴヌクレオチド配列、その後ろにＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（配列番号３０）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（配列番号３１）、その後続けてヒトタンパク質ＨＳＰ９０（ＨＳＰ９０ｐｅｐ）から得られたペプチド配列ＤＡＳＲＭＥＥＶＤ（配列番号３２）をコードするｐＣＡＲＧＨＯ２型プラスミドを設計した。ｐｎＥＡベクターは、ヒトタンパク質ＳＰＡＧ１のＴＰＲ３ドメイン（タンパク質の６２２－７４２領域に対応、配列番号３４）をコードすることができ、Ｎ末端位置に６－ヒスチジン（６ｘＨＩＳ）標識が融合されている。上記で詳述したように、ＬＢ培地中で組換えタンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐおよび６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３を過剰発現させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ２株の３０ｍＬ培養物を生産する。
【0097】
発現した６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３を含む３０ｍＬの細菌培養液をペレット化し、１．５ｍＬのバッファー３（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）に取り込み、１６，０００ｇで２０分間遠心分離する。５００μＬの上清を１５０μＬのＴＡＬＯＮ樹脂懸濁液と４℃で２０分間接触させる。樹脂を５００μＬのバッファー１で３回洗浄する。ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐを含む細菌培養物３０ｍＬを１．５ｍＬのバッファー１に取り込み、１６，０００ｇで２０分間遠心分離する。５００μＬの上清を、６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３を固定したＴＡＬＯＮビーズと４℃で３０分間接触させる。樹脂を５００μＬのバッファー３で３回洗浄する。ビーズに固定されたタンパク質を、３００ｍＭのイミダゾールを混合した１５０μＬのバッファー３で溶出する。１５０μＬのＴＡＬＯＮビーズとＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐを含む５００μＬの上清を直接接触させる対照（上記で使用した条件と厳密に同一の条件で処理）により、６ｘＨＩＳ標識のないタンパク質の樹脂に対する非特異的な固定の程度を評価することができる。
【0098】
ｂ．結果
ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐと６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３の複合体の再構成をＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニターした（図２）。本発明者らは、目的のタンパク質が超音波処理上清中に存在し、６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３のＴＡＬＯＮビーズへの固定が特異的であることを観察した。対照実験との比較により、本発明者らは、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐが、むき出しのＴＡＬＯＮビーズ上よりも、６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３を固定したＴＡＬＯＮビーズ上に保持されやすいことを示した。タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐと６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３は、高濃度のイミダゾールの添加により化学量論的に共溶出される。対照実験で溶出したタンパク質が少量であることは、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐと６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３の特異的複合体が溶液中で形成されることを示唆する。
ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐと６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３の複合体の再構成をＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニターした（図２）。本発明者らは、目的のタンパク質が超音波処理上清中に存在し、６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３のＴＡＬＯＮビーズへの固定が特異的であることを観察した。対照実験との比較により、本発明者らは、タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐが、むき出しのＴＡＬＯＮビーズ上よりも、６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３を固定したＴＡＬＯＮビーズ上に保持されやすいことを示した。タンパク質ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐと６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３は、高濃度のイミダゾールの添加により化学量論的に共溶出される。対照実験で溶出したタンパク質が少量であることは、ＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐと６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３の特異的複合体が溶液中で形成されることを示唆する。
【0099】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株でＣＲＤＳＡＴ－ＴＳＡ１－（ＧＧＧＳ）２または３－ＨＳＰ９０ｐｅｐと６ｘＨＩＳ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３を共発現させることにより、非共有結合複合体が再構成される。このため、タンパク質をコードするプラスミドが互換性のある複製起点を持つ必要がある。各プラスミドは、２つのプラスミドによって共形質転換された細菌を選択するように、抗生物質に対する単独の耐性を与える。非共有結合性複合体は、１つまたは他の標識によって、好ましくは上記の場合には６ｘＨＩＳ標識によって精製される。
【0100】
３．目的の酵素のグラフトの例
ａ．装置
組換えタンパク質の生産と精製
ペルオキシレドキシンタイプの足場およびグラフト化の目的の酵素は、誘導性発現プラスミドによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ２で異種的に生産される。タンパク質は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で、細胞抽出物の可溶性画分から出発して、２つの連続したクロマトグラフィーを用いて精製される。最初の金属アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ Ｔａｌｏｎ Ｃｒｕｄｅ ５ｍＬ）に続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ）を行う。
ａ．装置
組換えタンパク質の生産と精製
ペルオキシレドキシンタイプの足場およびグラフト化の目的の酵素は、誘導性発現プラスミドによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ２で異種的に生産される。タンパク質は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で、細胞抽出物の可溶性画分から出発して、２つの連続したクロマトグラフィーを用いて精製される。最初の金属アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ Ｔａｌｏｎ Ｃｒｕｄｅ ５ｍＬ）に続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ）を行う。
【0101】
酵素の足場の組み立て
選択された足場は、システイン残基がセリン残基に変異したパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＰｒｘ１（Ｐｆｕ－Ｐｒｘ）に相当する（配列番号５２）。選択された目的の酵素は、プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ３Ｃおよび堆肥から得られたＰＥＴヒドロラーゼ（またはＰＥＴａｓｅ）である（配列番号５４および５５）。足場上の酵素の組み立ては、遺伝子融合によって、または上記のタンパク質／アダプターペプチド対を用いることによって生産される。ポリグリシンタイプのリンカーが目的の酵素から足場を離している。
選択された足場は、システイン残基がセリン残基に変異したパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＰｒｘ１（Ｐｆｕ－Ｐｒｘ）に相当する（配列番号５２）。選択された目的の酵素は、プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ３Ｃおよび堆肥から得られたＰＥＴヒドロラーゼ（またはＰＥＴａｓｅ）である（配列番号５４および５５）。足場上の酵素の組み立ては、遺伝子融合によって、または上記のタンパク質／アダプターペプチド対を用いることによって生産される。ポリグリシンタイプのリンカーが目的の酵素から足場を離している。
【0102】
ｂ．結果
動的光散乱（ＤＬＳ）によるタンパク質粒子径の分析
ＤＬＳ実験は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）と小容量の石英セルを用いて、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中、２０℃で行った。結果を図３に示す。
動的光散乱（ＤＬＳ）によるタンパク質粒子径の分析
ＤＬＳ実験は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）と小容量の石英セルを用いて、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中、２０℃で行った。結果を図３に示す。
【0103】
Ｐｆｕ－Ｐｒｘで１４．２ｎｍと測定された粒子の大きさは、このタンパク質が十量体環状構造であることを示している。それにより、３ＣプロテアーゼとＰＥＴアーゼをＰｆｕ－Ｐｒｘにグラフトさせると、それぞれ２７．８および２０．３ｎｍという、より大きなサイズの粒子が形成される。この分析は、十量体のＰｆｕ－Ｐｒｘ環上での目的の酵素の足場作りが正しく行われたことを示す。
【0104】
等温滴定マイクロカロリメトリー（isothermal titration microcalorimetry）（ＩＴＣ）による解離のモニタリング
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴｓａ１とＰｆｕ－Ｐｒｘを、１００μＭのＶＰ－ＩＴＣストック溶液（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて、マイクロカロリメーターのセルに注入した。実験は２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中、２５℃で行われた。結果を図４に示す。
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のペルオキシレドキシンＴｓａ１とＰｆｕ－Ｐｒｘを、１００μＭのＶＰ－ＩＴＣストック溶液（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて、マイクロカロリメーターのセルに注入した。実験は２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中、２５℃で行われた。結果を図４に示す。
【0105】
熱放出の測定により、臨界転移濃度（またはＣＴＣ）を決定することができる。この濃度は溶液中の十量体の５０％が解離する濃度に相当する。Ｔｓａ１（灰色）では２．８μＭの値が決定された。対照的に、Ｐｆｕ－Ｐｒｘ（黒）では値を決定できなかった。
【0106】
この結果から、Ｐｆｕ－Ｐｒｘは非常に低濃度（μモル閾値未満）でも、その十量体環状構造を保っていることが確認された。このパラメータは足場機能にとって有利である。したがって、Ｐｆｕ－Ｐｒｘは本発明に非常に適したツールである。
【0107】
示差走査マイクロカロリメトリー（differential scanning microcalorimetry）（ＤＳＣ）による熱変性のモニタリング
Ｐｆｕ－Ｐｒｘを、濃度０．５ｍｇ／ｍｌの原液を用い、圧力２ａｔｍで示差走査型マイクロカロリメーター（ＤＳＣ）のセルに注入した。実験は２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で行った。結果を図５に示す。
Ｐｆｕ－Ｐｒｘを、濃度０．５ｍｇ／ｍｌの原液を用い、圧力２ａｔｍで示差走査型マイクロカロリメーター（ＤＳＣ）のセルに注入した。実験は２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で行った。結果を図５に示す。
【0108】
記録されたサーモグラムは、２つの特異的な半変性温度（またはＴｍ）を示し、これはｉ）十量体が二量体への解離を起こす温度（９３．４℃）、および、ｉｉ）単量体が変性する温度（１０７．８℃）と解釈できる。これらの非常に高い温度は、Ｐｆｕ－Ｐｒｘの十量体構造の非常に高い安定性を示している。
【0109】
高温での安定性は工業的応用に有利である。さらに、この構造的安定性は、足場の長期的な完全性を示唆している。
【0110】
足場を備えた（ｓｃａｆｆｏｌｄｅｄ）ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ３Ｃプロテアーゼのタンパク質分解活性
Ｐｆｕ－Ｐｒｘを足場としたＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ３Ｃのタンパク質分解活性を、６Ｈｉｓ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３基質を用いて評価した。後者は前記プロテアーゼの特異的切断部位を有する。濃度１ｍｇ／ｍＬの基質と濃度２μＭの足場プロテアーゼを、１ｍＬの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で、１０℃で６０分間接触させる。分析は、変性ゲルでの電気泳動とクマシーブルーによる染色によって行われる。結果を図６に示す。
Ｐｆｕ－Ｐｒｘを足場としたＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ３Ｃのタンパク質分解活性を、６Ｈｉｓ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３基質を用いて評価した。後者は前記プロテアーゼの特異的切断部位を有する。濃度１ｍｇ／ｍＬの基質と濃度２μＭの足場プロテアーゼを、１ｍＬの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で、１０℃で６０分間接触させる。分析は、変性ゲルでの電気泳動とクマシーブルーによる染色によって行われる。結果を図６に示す。
【0111】
特異的な切断産物の時間経過に伴う出現の増加は、Ｐｆｕ－Ｐｒｘ上を足場としたプロテアーゼがタンパク質分解活性を有することを示している。プロテアーゼ非存在下での６Ｈｉｓ－ＳＰＡＧ１－ＴＰＲ３基質の自発的分解がないことを、１０℃で６０分後に確認する。
【0112】
足場を備えた（ｓｃａｆｆｏｌｄｅｄ）ＰＥＴアーゼによるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の分解試験
約０．５ｃｍ２のＰＥＴフィルムクーポン（ＧｏｏｄＦｅｌｌｏｗ社製、厚さ０．２５ｍｍ、透明、非晶質）を、３０％エタノールで１時間、周囲温度で処理した後、外気中で乾燥させる。１００ｍｇのクーポンを、５０℃で撹拌しながら、５ｍＬの１００ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ８．００）バッファーとＰｆｕ－Ｐｒｘを足場とした１μＭのＰＥＴアーゼを含む２５ｍＬ三角フラスコに入れる。反応は８日間、反応媒体のｐＨを測定することでモニターされる。酵素を含まない対照実験を同じ条件下で行う。結果を図７に示す。
約０．５ｃｍ２のＰＥＴフィルムクーポン（ＧｏｏｄＦｅｌｌｏｗ社製、厚さ０．２５ｍｍ、透明、非晶質）を、３０％エタノールで１時間、周囲温度で処理した後、外気中で乾燥させる。１００ｍｇのクーポンを、５０℃で撹拌しながら、５ｍＬの１００ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ８．００）バッファーとＰｆｕ－Ｐｒｘを足場とした１μＭのＰＥＴアーゼを含む２５ｍＬ三角フラスコに入れる。反応は８日間、反応媒体のｐＨを測定することでモニターされる。酵素を含まない対照実験を同じ条件下で行う。結果を図７に示す。
【0113】
Ｐｆｕ－Ｐｒｘを足場とするＰＥＴアーゼを含む反応媒体内で観察されるｐＨの低下は、ＰＥＴの分解から得られるテレフタル酸の放出によるものである。酵素がなければ、ｐＨは安定したままである。これらの結果は、足場を備えた酵素がＰＥＴに対して加水分解活性を有することを示す。
【図1A】
【図1BC】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】