特表 2023-554248 細胞をリプログラミングするための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-27

(54)【発明の名称】細胞をリプログラミングするための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20231220BHJP

   C12N 5/073 20100101ALI20231220BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20231220BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20231220BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20231220BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20231220BHJP

   A61P 27/12 20060101ALI20231220BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12N5/073

C12N5/0775

A61P27/02

A61P27/06

A61K35/30

A61P27/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023532738

(86)(22)【出願日】2020-12-30

(85)【翻訳文提出日】2023-07-26

(86)【国際出願番号】 CN2020141524

(87)【国際公開番号】W WO2022110494

(87)【国際公開日】2022-06-02

(31)【優先権主張番号】202011345680.2

(32)【優先日】2020-11-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523350981

【氏名又は名称】モウセリオン・セラーピューティクス・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000523

【氏名又は名称】アクシス国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】林偉鋒

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065BB04

4B065BB19

4B065BD25

4B065BD39

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087CA04

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA33

(57)【要約】

１種又は複数種のリプログラミング因子の存在下で細胞をリプログラミングするための方法、該方法を用いて得られたリプログラミング細胞及びその用途、並びにリプログラミング因子を含むキットを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子－β（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養することを含む、第１タイプの細胞を第２タイプの細胞にリプログラミングするための方法。

【請求項2】

前記第１組のリプログラミング因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＢＭＰ４又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１組のリプログラミング因子は、（ａ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤、（ｂ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤及びｂＦＧＦ、又は、（ｃ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって構成される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、Ｌｉ₂ＣＯ₃及びＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＴＤ１１４－２、ケンパウロン、ＴＷＳ１１９、ＣＢＭ１０７８、ＳＢ２１６７６３、３Ｆ８（ＴＯＣＲＩＳ）、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＦＲＡＴｉｄｅ、インジルビン－３’－オキシム及びＬ８０３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、Ｒｅｐｓｏｘ、６１６４５２、ＬＤＮ１９３１８９、Ａ８３０１、ＧＷ７８８３８８、ＳＤ２０８、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ＳＢ５０５１２４及びギニストからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記環状ＡＭＰ誘導剤は、フォルスコリン、ＩＢＭＸ、ロリプラム、８ＢｒｃＡＭＰ、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＮＫＨ４７７、ジブトイルモノシクロアデニル酸（ＤＢｃＡＭＰ）、Ｓｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰｓである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、５－アザ－ｄＣ、５－アザシチジン及びＲＧ１０８からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項8】

前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤はＥＰＺ００４７７７である、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット、デプシペプチド、Ｔｒａｐｏｘｉｎ、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ、ＦＲ９０１２２８及び酪酸塩からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項10】

前記第１タイプの細胞は体細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記体細胞は中胚葉、外胚葉又は内胚葉に由来する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記線維芽細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）、成人線維芽細胞（ＨＡＦ）、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記体細胞はヒト脱落腎臓上皮細胞である、請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

前記第１タイプの細胞は幹細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記幹細胞は、ヒト臍帯間葉系幹細胞、ヒト胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２タイプの細胞は幹細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記幹細胞は、神経堤細胞様細胞（ＮＣＣ様細胞）である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ＮＣＣ様細胞はＰ７５、Ｈｎｋ１、ＡＰ２α及びＳｏｘ１０陽性を呈する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記第１タイプの細胞は前記第１組のリプログラミング因子の存在下で（ａ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日間、又は、（ｂ）２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３又は１２日間未満培養する、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下で第２タイプの細胞を培養することを含む、第２タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法。

【請求項22】

前記第２組のリプログラミング因子は、ＢＭＰ４及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記カゼインキナーゼ１阻害剤はＣＫＩ－７である、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、５－アザ－ｄＣ、５－アザシチジン及びＲＧ１０８からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記第３タイプの細胞は体細胞である、請求項２１に記載の方法。

【請求項26】

前記体細胞は角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＣＥＣ様細胞はＺＯ－１及びＮａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素陽性を呈する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記第２タイプの細胞は前記第２組のリプログラミング因子の存在下で（ａ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日間、又は、（ｂ）２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３又は１２日間未満培養する、請求項２１に記載の方法。

【請求項29】

ステップ（ａ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養すること、及び、ステップ（ｂ）ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下でステップ（ａ）から得られた細胞を培養すること、を含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法。

【請求項30】

前記第１組のリプログラミング因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記方法は、ステップ（ｂ）を開始する前にステップ（ａ）から得られた細胞を洗浄することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間に洗浄ステップが存在しない、請求項２９に記載の方法。

【請求項33】

グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子及びＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養することを含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法。

【請求項34】

前記第１組のリプログラミング因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法に基づいて生成されたＮＣＣ様細胞集団。

【請求項36】

請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法に基づいて生成された角膜内皮細胞様細胞（ＣＥＣ様細胞）集団。

【請求項37】

請求項３５に記載のＮＣＣ様細胞又は請求項３６に記載のＣＥＣ様細胞を含む組成物。

【請求項38】

必要とする被験者に有効量の請求項３６に記載のＣＥＣ様細胞又は請求項３７に記載の組成物を投与することを含む、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状を治療する方法。

【請求項39】

前記被験者はヒトである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記疾患又は病状は、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性角膜変性症、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜色素変性症、緑内障、角膜ジストロフィー、コンタクトレンズの使用、白内障手術及び角膜移植における後期内皮不全からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子を含む、第１タイプの細胞を第２タイプの細胞にリプログラミングするためのキット。

【請求項42】

前記第１組のリプログラミング因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項４１に記載のキット。

【請求項43】

ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子を含む、第２タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするためのキット。

【請求項44】

グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子及びＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子を含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするためのキット。

【請求項45】

前記第１組のリプログラミング因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項４４に記載のキット。

【請求項46】

請求項３５に記載のＮＣＣ様細胞又は請求項３６に記載のＣＥＣ様細胞に薬物候補を投与し、前記細胞の前記薬物候補に対する反応を検出することにより薬物を識別することを含む、薬物を識別する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、概ね細胞をリプログラミングするための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

正常に作用する角膜内皮細胞（ＣＥＣ）は角膜の透明度及び適切な流体レベルを維持し、例えば流体が基質に「漏洩」することと基質から連続的に能動的にポンピングすることにより流体を眼の前房に移動させることとの間でバランスを保持する。

【0003】

角膜内皮細胞はイン・ビボ増殖能力がほとんどないか又はないため、それが損傷されるか又は他の方式で損失される時に自然に置き換えることができないことが報告された。人体内において、角膜内皮細胞層は生まれた時に最も密集に凝集し、その後に細胞密度が眼の成長に伴って急速に低下する（同じ数の細胞でより大きな面積が被覆される）。その後、角膜細胞密度は加齢に伴って徐々に低下し、置換されていない細胞の段階的な損失を顕著に反映する。細胞密度の低下に伴い、細胞層のバリア及びポンプ機能を維持するために各細胞は展開してより大きな面積を被覆するようになる。しかしながら、細胞密度が低すぎる（約５００～１０００個の細胞／平方ミリメートルより低い）と、その機能が損なわれ、角膜混濁、基質浮腫、視感度（ｖｉｓｕａｌ ａｃｕｉｔｙ）損失及び最終的な失明を引き起こす。

【0004】

異なる治療方法が開発されたが、新たな角膜内皮再構築技術が非常に必要とされる。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子－β（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養することを含む、第１タイプの細胞を第２タイプの細胞にリプログラミングするための方法を提供する。

【0006】

いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＢＭＰ４又はそれらの組み合わせをさらに含む。

【0007】

いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子は、（ａ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤、（ｂ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤及びｂＦＧＦ、又は、（ｃ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤）及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって構成される。

【0008】

いくつかの実施例において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、Ｌｉ₂ＣＯ₃及びＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン（Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ）－３’－オキシム）、ＴＤ１１４－２、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＴＷＳ１１９、ＣＢＭ１０７８、ＳＢ２１６７６３、３Ｆ８（ＴＯＣＲＩＳ）、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＦＲＡＴｉｄｅ、インジルビン－３’－オキシム及びＬ８０３からなる群から選択される。

【0009】

いくつかの実施例において、ＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、Ｒｅｐｓｏｘ、６１６４５２、ＬＤＮ１９３１８９、Ａ８３０１、ＧＷ７８８３８８、ＳＤ２０８、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ＳＢ５０５１２４及びギニスト（Ｔｒａｎｉｌａｓｔ）からなる群から選択される。

【0010】

いくつかの実施例において、環状ＡＭＰ誘導剤は、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、ＩＢＭＸ、ロリプラム（Ｒｏｌｉｐｒａｍ）、８ＢｒｃＡＭＰ、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＮＫＨ４７７、ジブトイルモノシクロアデニル酸（ＤＢｃＡＭＰ）、Ｓｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰｓである。

【0011】

いくつかの実施例において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、５－アザ－ｄＣ、５－アザシチジン（Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）及びＲＧ１０８からなる群から選択される。

【0012】

いくつかの実施例において、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤はＥＰＺ００４７７７である。

【0013】

いくつかの実施例において、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ（ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ；ＴＳＡ）、ボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、デプシペプチド（ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｔｒａｐｏｘｉｎ、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ、ＦＲ９０１２２８及び酪酸塩からなる群から選択される。

【0014】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は体細胞である。いくつかの実施例において、体細胞は中胚葉、外胚葉又は内胚葉に由来するものである。

【0015】

いくつかの実施例において、体細胞は線維芽細胞である。いくつかの実施例において、線維芽細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）、成人線維芽細胞（ＨＡＦ）、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）及びそれらの混合物からなる群から選択される。

【0016】

いくつかの実施例において、体細胞はヒト脱落腎臓上皮細胞である。

【0017】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は幹細胞である。いくつかの実施例において、幹細胞は、ヒト臍帯間葉系幹細胞、ヒト胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される。

【0018】

いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は幹細胞である。いくつかの実施例において、幹細胞は神経堤細胞様細胞（ＮＣＣ様細胞）である。いくつかの実施例において、ＮＣＣ様細胞はＰ７５、Ｈｎｋ１、ＡＰ２α及びＳｏｘ１０陽性を呈する。

【0019】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は第１組のリプログラミング因子の存在下で（ａ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日間、又は、（ｂ）２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３又は１２日間未満培養する。

【0020】

本開示は、ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下で第２タイプの細胞を培養することを含む、第２タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法を提供する。

【0021】

いくつかの実施例において、第２組のリプログラミング因子は、ＢＭＰ４及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施例において、カゼインキナーゼ１阻害剤はＣＫＩ－７である。いくつかの実施例において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、５－アザシチジン、５－アザ－ｄＣ及びＲＧ１０８からなる群から選択される。

【0022】

いくつかの実施例において、第３タイプの細胞は体細胞である。いくつかの実施例において、体細胞は角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞（ＣＥＣ様細胞）である。いくつかの実施例において、ＣＥＣ様細胞はＺＯ－１及びＮａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素陽性を呈する。

【0023】

いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は第２組のリプログラミング因子の存在下で（ａ）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日間、又は、（ｂ）２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３又は１２日間未満培養する。

【0024】

本開示は、ステップ（ａ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養すること、及び、ステップ（ｂ）ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下でステップ（ａ）から得られた細胞を培養すること、を含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法を提供する。

【0025】

いくつかの実施例において、方法は、ステップ（ｂ）を開始する前にステップ（ａ）から得られた細胞を洗浄することをさらに含む。いくつかの実施例において、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間に洗浄ステップが存在しない。

【0026】

本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子及びＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養することを含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法を提供する。

【0027】

本開示は、本明細書が提供する方法に基づいて生成されたＮＣＣ様細胞集団を提供する。

【0028】

本開示は、本明細書が提供する方法に基づいて生成された角膜内皮細胞様細胞（ＣＥＣ様細胞）集団を提供する。

【0029】

本開示は、本明細書が提供するＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞を含む組成物を提供する。

【0030】

本開示は、必要とする被験者に有効量の本明細書が提供するＣＥＣ様細胞又は本明細書が提供する組成物を投与することを含む、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施例において、被験者はヒトである。

【0031】

いくつかの実施例において、疾患又は病状は、フックスジストロフィー（Ｆｕｃｈ’ｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性角膜変性症、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜色素変性症、緑内障、角膜ジストロフィー、コンタクトレンズの使用、白内障手術及び角膜移植における後期内皮不全からなる群から選択される。

【0032】

本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子を含む、第１タイプの細胞を第２タイプの細胞にリプログラミングするためのキットを提供する。

【0033】

本開示は、ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子を含む、第２タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするためのキットを提供する。

【0034】

本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子及びＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子を含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするためのキットを提供する。

【0035】

本開示は、ＮＣＣ、ｃｉＮＣＣ又はｃｉＣＥＣに薬物候補を投与し、細胞の薬物候補に対する反応を検出することにより薬物を識別することを含む、ＮＣＣ、化学的に誘導されたＮＣＣ（ｃｉＮＣＣ）又は化学的に誘導されたＣＥＣ（ｃｉＣＥＣ）の効果に影響を与える薬物を識別する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】化学成分により決定された条件で線維芽細胞をｃｉＮＣＣに転換することを示す。Ａ）マウス線維芽細胞からの誘導方法を示す模式図である。Ｂ）神経堤細胞様細胞誘導期間の異なる時点での形態変化を示す。Ｃ）指定条件で生成されたｃｉＮＣＣコロニー数を示す。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝３の独立実験である。Ｄ）蛍光顕微鏡で原位置で撮影されたＳＯＸ１０⁺コロニーの画像を示す。Ｅ）指定条件で生成されたＳＯＸ１０⁺コロニー数を示す。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝３の独立実験である。Ｆ）１２日目のｃｉＮＣＣマーカーＰ７５、Ｈｎｋ１及びＡＰ２αの免疫染色を示す。

【0037】

【図2】線維芽細胞から転換されたｃｉＮＣＣの分化潜在能力を示す。Ａ）免疫細胞化学分析を示し、該分析は（例えばＴｕｊ１及びペリフェリン（ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ）の免疫細胞化学で示されるように）ｃｉＮＣＣが末梢ニューロンに分化することができ、（例えばＳ１００β及びＧＦＡＰの免疫細胞化学で示されるように）さらにシュワン細胞（ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ）に分化することができることを示す。右側の明視野画像は、ｃｉＮＣＣから分化したメラニン細胞を示す。Ｂ）（例えばそれぞれアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）染色、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色及びアリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ）染色で示されるように）ｃｉＮＣＣはさらに軟骨細胞、脂肪細胞及び骨細胞に分化することができることを示す。

【0038】

【図3】ｃｉＮＣＣがさらに角膜内皮細胞様細胞（又は化学的に誘導されたＣＥＣ、ｃｉＣＥＣ）に分化することができることを示す。図３Ａは角膜内皮マーカー（Ｎａ＋－Ｋ＋ＡＴＰ酵素、ＡＱＰ１、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）及びＡＱＰ１を含む）の免疫蛍光染色を示す。細胞核はＤＡＰＩで染色される。縮尺は５０μｍである。図３Ｂは透過型電子顕微鏡画像を示し、該画像は角膜内皮細胞の緊密な接続を示す。図３Ｃは線維芽細胞から角膜内皮細胞を機能的に生成するための２段階系譜リプログラミングストラテジーのスキームを示す。

【0039】

【図4】線維芽細胞の角膜内皮細胞様細胞（又はｃｉＣＥＣ）へのリプログラミングの系統追跡（Ｌｉｎｅａｇｅ ｔｒａｃｉｎｇ）を示す図である。Ａ）Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ：Ｒ２６Ｒ^tdTomatoＭＥＦからリプログラミングされた角膜内皮細胞様細胞の起源を追跡するための遺伝的運命マッピング（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆａｔｅ ｍａｐｐｉｎｇ）方法の模式図を示す。Ｂ）Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ：Ｒ２６Ｒ^tdTomatoＭＥＦからリプログラミングされた角膜内皮細胞様細胞の起源の系統追跡を示す。Ｃ）免疫細胞化学分析を示し、該分析はＦＳＰ１－ｃｉＮＣＣがＰ７５、Ｈｎｋ１、ＡＰ２α及びＳＯＸ１０陽性を呈することを示す。Ｄ）これらのＭＥＦから誘導されたＦｓｐ１－Ｃｒｅ：Ｒ２６Ｒ^tdTomatoＭＥＦ及びｃｉＣＥＣの代表的な形態変化を示す。

【0040】

【図5】小分子によって異なる人体細胞タイプから角膜内皮細胞様細胞が生成されることを示す。ヒト胚皮膚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）、成人線維芽細胞（ＨＡＦ）、ヒト臍帯間葉系基質細胞（ＭＳＣ）及び尿細胞（ＵＣ）である。

【0041】

【図6】ウサギにおけるｃｉＣＥＣグループと対照グループの異なる日数での臨床観察結果を示す。Ａ）第１０世代（Ｐ１０）におけるｃｉＣＥＣの明視野画像を示す。第１０世代のｃｉＣＥＣはＮａ＋－Ｋ＋ＡＴＰ酵素とＺＯ－１を発現する。Ｂ）スリットランプの写真を示し、該写真はｃｉＣＥＣ移植注射の７日目後に、ｃｉＣＥＣグループの角膜の透明度が顕著に改良され（第１図）、スリットランプの写真分析による未処理対照グループの角膜混濁及び基質浮腫が依然として深刻である（第３図）ことを示す。Ｃ）ｖｉｓａｎｔｅ ＯＣＴ分析によるＣＥＣ様細胞グループと対照グループにおける顕著な角膜厚さの差を示す。Ｄ）共焦点顕微鏡画像を示し、該画像はｃｉＣＥＣグループにおいてデスメ膜（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）上の多角形細胞の完全被覆が確認された。Ｅ）低用量（１×１０⁶個細胞／ミリリットルのｃｉＣＥＣ）、高用量（２×１０⁶個細胞／ミリリットルのｃｉＣＥＣ）及びＰＢＳで処理された対照グループにおける臨床観察期間の角膜厚さの変化を示す。Ｂ）～Ｄ）の左から右への画像は、第１の画像：ｃｉＣＥＣで処理されたグループ、第２の画像：無事な反対側の眼、第３の画像：ＰＢＳで処理された対照グループ、第４の画像：正常な眼のグループである。

【0042】

【図7】ウサギにおけるｃｉＣＥＣグループと対照グループの異なる日数の時のスリットランプの写真を示す。スリットランプ写真は注射後にｃｉＣＥＣグループの角膜の透明度が顕著に改良され、瞳孔及び虹彩テクスチャが見られることを示す（ｃｉＣＥＣグループ、上方の図）。約１４日後に、角膜が明らかに透明になり、対照グループにおいて角膜混濁及び基質浮腫が依然として深刻である（対照グループ、上方の図）。ｃｉＣＥＣグループ及び対照グループの両者の下方の図はスリットランプにより検出された角膜反射を示し、下方の図における各画像はその上方の図における画像に対応する。

【0043】

【図8】小分子誘導によりＭＥＦをｃｉＮＣＣに転換することを示す。Ａ）ＭＥＦからＮＣＣをリプログラミングする模式図である。Ｂ）各化学品のｃｉＮＣＣ生成に対する効果である。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝３の独立実験である。Ｃ）各化学品のｃｉＮＣＣ生成に対する促進効果である（データは平均値±ＳＤ、ｎ＝３の独立実験である）。Ｄ）ＭＥＦをｃｉＮＣＣに転換するストラテジーの模式図である。Ｅ）小分子混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を用いてＭＥＦからＷｎｔ１⁺ｃｉＮＣＣを生成することである。Ｆ）コンビナトリアルスクリーニングにおける候補混合物により誘導されたｃｉＮＣＣクラスタにおけるＷｎｔ１⁺細胞数の定量である（独立実験、ｎ＝３）。Ｇ）ｃｉＮＣＣ誘導処理期間の異なる日数での形態変化である（縮尺は５０μｍ）。Ｈ）異なる日数に候補混合物により誘導されたＷｎｔ１^-ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞の百分率である（独立実験、ｎ＝３）。

【0044】

【図9】Ｍ６により誘導されたｃｉＮＣＣに対する特徴付けを示す。Ａ）Ｍ６で誘導されたｃｉＮＣＣの形態である（縮尺は４００μｍ）。Ｂ）ＭＥＦ由来のｃｉＮＣＣがＰ７５、ＨＮＫ１、ＡＰ２ａ及びネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）を発現することを示す免疫染色である（縮尺は５０μｍ）。Ｃ）末梢ニューロンマーカーで染色された分化したｃｉＮＣＣの代表的な画像である（縮尺は５０μｍ）。Ｄ）ｃｉＮＣＣのシュワン細胞及びメラニン細胞への分化及びマーカー発現である（縮尺は５０μｍ）。Ｅ）ｃｉＮＣＣは間葉系系譜に分化してさらに脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞に分化する（縮尺は１００μｍ）。

【0045】

【図10】小分子誘導による線維芽細胞からのマウスｃｉＣＥＣの生成を示す。Ａ）ＭＥＦからｃｉＣＥＣを化学的にリプログラミングする模式図である。Ｂ）初期ＭＥＦ、リプログラミングされたｃｉＮＣＣコロニー及びｃｉＣＥＣの明視野画像である（縮尺は４００μｍ）。Ｃ）Ｗｎｔ１^-ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＮＣＣからｃｉＣＥＣを誘導加工する期間の異なる日数での形態変化である（縮尺は４００μｍ）。Ｄ）ｃｉＣＥＣの角膜内皮マーカーＮａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素、ＡＱＰ１、ビメンチン、Ｎ－カドヘリン、ラミニン及びＺＯ－１に対する免疫蛍光染色である（縮尺は５０μｍ）。Ｅ）ｃｉＣＥＣにおけるＬＤＬ取り込み機能である（縮尺は５０μｍ）。Ｆ）指定時点でのサンプル中の差次的発現遺伝子のヒートマップである。ヒートマップの下の番号は、独立したＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓを示す。赤色及び青色はそれぞれアップレギュレーション及びダウンレギュレーションされた遺伝子を示す。Ｇ）緊密に接続されたｃｉＣＥＣのＴＥＭを示す（縮尺は５μｍ）。

【0046】

【図11】ｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣの遺伝子発現プロファイリングを示す。Ａ）指定時点でのＮＣ遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。遺伝子発現（ｌｏｇ２）は、ＭＥＦにおける遺伝子発現に対して正規化されている。Ｂ）異なる継代数のＭＥＦ由来のｃｉＣＥＣ、ＭＥＦ及びｐＣＥＣにおける指定されたＮＣ細胞遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析である。Ｃ）指定時点でのサンプル中の差次的発現遺伝子のヒートマップである。ヒートマップの下の番号は独立したＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ（ｎ＝２－３）を示す。赤色及び青色はそれぞれアップレギュレーション及びダウンレギュレーションされた遺伝子を示す。Ｄ）リプログラミング、ｃｉＣＥＣ及び対照ｐＣＥＣの０日目（Ｄ０）、７日目（Ｄ７）及び１２日目（Ｄ１２）からのサンプルの主成分分析である。

【0047】

【図12】線維芽細胞からｃｉＣＥＣを誘導することを実証する系統追跡を示す。Ａ）遺伝系統追跡ストラテジーを示す模式図である。Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６^tdTomato背景のＥ１３．５マウス胚に由来するＭＥＦのＰ７５^-／ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞を分取することによりＭＥＦを得た。Ｂ）Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６^tdTomato遺伝的背景を有するＭＥＦ由来のＰ７５^-／ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞のＦＡＣＳ分取結果を示す。Ｃ）Ｐ７５^-／ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞におけるＳｏｘ１０、Ｐ７５、Ｏｌｉｇ２、Ｈｎｋ１、ＡＰ２、Ｓｏｘ２及びＰａｘ６の結果が陰性であることを示す免疫染色分析である（縮尺は１００μｍ）。Ｄ）Ｐ７５^-／ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞のｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣへの分化である（縮尺は４００μｍ）。ｅ）Ｆｓｐ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ－ＭＥＦ由来のｃｉＣＥＣにおけるＺＯ－１、ラミニン、Ｎａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素及びＡＱＰ１が陽性であることを示す免疫染色分析である（縮尺は５０μｍ）。

【0048】

【図13】小分子がｃｉＣＥＣの長期にわたる増幅を促進することを示す。Ａ）ｃｉＣＥＣが無血清対照培地で３日間増殖することである（縮尺は２００μｍ）。Ｂ）ＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７が添加された無血清培地におけるｃｉＣＥＣの連続増幅である（縮尺は２００μｍ）。Ｃ）ＳＢ４３１５４２及びＣＫ１－７を含むか又は含まない培地で培養されたｃｉＣＥＣの平均集団倍加時間である（平均値±ＳＤ、ｎ＝３；＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｄ）Ｐ５にあるｃｉＣＥＣの明視野画像であり、ｃｉＣＥＣはＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７が添加された培養条件で３日間増幅する（縮尺は５０μｍ）。Ｅ）Ｐ３０にあるこれらのｃｉＣＥＣが固定されＮａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素、ＡＱＰ１及びＺＯ－１に対して染色される（縮尺は５０μｍ）。

【0049】

【図14】ｃｉＣＥＣのイン・ビボ移植を示す。Ａ）ｃｉＣＥＣ及びＲＯＣＫ阻害剤をモデルウサギに移植することを描画する図である。Ｂ）移植後、移植された眼における角膜透明度が顕著に改良され、未処理対照における角膜混濁及び基質浮腫が依然として深刻である。Ｃ）移植後に、移植された角膜の透明度が顕著に改良され、未処理対照において角膜混濁及び基質浮腫が依然として存在することを示すスリットランプ顕微鏡画像である。Ｄ）生存ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＣＥＣがデスメ膜に接続されたことを示す免疫組織化学である（縮尺は１００μｍ）。Ｅ）移植された眼で改善された角膜浮腫（減少された角膜厚さ）を示すＶｉｓａｎｔｅ ＯＣＴである。Ｆ）移植後の角膜厚さの傾向である。未処理対照と移植対照との間に角膜厚さ上の顕著な差異が存在する。結果はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ（ｎ＝９）の平均値及びＳＥＭである。Ｇ）角膜内皮のリアルタイムな共焦点結像であり、それは移植された眼においてデスメ膜上の多角形細胞の完全被覆が確認された。

【0050】

【図15】Ｗｎｔ１^-ＭＥＦの特徴付けを示す。Ａ）遺伝系統追跡ストラテジーを示す模式図である。Ｗｎｔ１^-Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ背景のＥ１３．５マウス胚に由来するＭＥＦのｔｄＴｏｍａｔｏ^-細胞を分取することによりＷｎｔ１^-ＭＥＦを得た。Ｂ）ＭＥＦ由来のｔｄＴｏｍａｔｏ^-細胞のＦＡＣＳ分取結果を示す。Ｃ）Ｗｎｔ１^-ＭＥＦにおけるＰ７５、ＨＮＫ１、Ｓｏｘ１０及びＡｐ２の陰性結果を示す免疫染色分析である（縮尺は１００μｍ）。Ｄ）Ｗｎｔ１^-ＭＥＦ及び初代ＮＣＣにおいて指定された神経堤遺伝子発現を示すＲＴ－ＰＣＲ分析である。Ｇａｐｄｈは、対照とする。Ｅ）Ｗｎｔ１^-ＭＥＦ由来のｃｉＮＣＣコロニーの代表的な画像を示す（縮尺は４００μｍ）。

【0051】

【図16】Ｍ６がｔｄＭＥＦをｃｉＮＣＣに転換することを示す。Ａ）ｔｄＭＥＦ及びｔｄＭＥＦ由来のｃｉＮＣＣの形態である（縮尺は４００μｍ）。Ｂ）ｃｉＮＣＣがｃｉＣＥＣに分化する代表的な画像である（縮尺は４００μｍ）。Ｃ）ｔｄＭＥＦ由来のｃｉＮＣＣがＮＣ細胞マーカー（Ｐ７５、ＨＮＫ１、Ｓｏｘ１０及びＡＰ２α）を発現することを示す免疫染色分析である（縮尺は５０μｍ）。Ｄ）ＦＳＰ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＣＥＣの分化過程である。

【0052】

【図17】ｉＰＳＣ段階を経由せずに、小分子により線維芽細胞からｃｉＣＥＣを生成することを示す。Ａ）ＭＥＦからｃｉＣＥＣを誘導する期間の異なる時点での形態変化である（縮尺は４００μｍ）。Ｂ）ＭＥＦ由来のｃｉＮＣＣコロニーはＮＣマーカーＳｏｘ１０に対して行われた免疫蛍光染色である（縮尺は４００μｍ）。Ｃ）ＯＧ－ＭＥＦからｃｉＣＥＣを誘導する期間の異なる時点での形態変化である（縮尺は４００μｍ）。Ｄ）ＦＡＣＳ分析により、ｃｉＣＥＣ誘導に対して、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞が存在しないことが測定される。Ｅ）典型的なｃｉＣＥＣ核型（第１０世代）である。

【0053】

【図18】ｃｉＣＥＣの増殖潜在能力を示す。Ａ）Ｐ３にあるｃｉＣＥＣ及びＰ３にあるｐＣＥＣの代表的な画像である（縮尺は４００μｍ）。Ｂ）Ｐ３にあるｃｉＣＥＣ及びＰ３にあるｐＣＥＣにおけるＫｉ６７とＺＯ－１の発現の免疫蛍光画像である。Ｃ）フローサイトメトリーにより分析された異なる継代数のｃｉＣＥＣ及びｐＣＥＣのＥｄＵ取り込み実験である。Ｄ）細胞周期（Ｇ１、Ｓ及びＧ２期）におけるｃｉＣＥＣ及びｐＣＥＣの分布である（縮尺は４００μｍ）。Ｐ３にあるｃｉＣＥＣ及びＰ３にあるｐＣＥＣをスクラッチし、８時間及び２０時間後にマイグレーションが観察され、画像を撮影する。Ｅ）Ｐ３にあるｐＣＥＣ及びＰ３、Ｐ１５、Ｐ３０にあるｃｉＣＥＣのスクラッチアッセイ（ｓｃｒａｔｃｈ ｗｏｕｎｄ ａｓｓａｙ）である（縮尺は２００μｍ）。８時間及び２０時間後にマイグレーションが観察された。Ｆ）創傷閉鎖に対する定量を示す。

【0054】

【図19】ウサギモデルの移植眼を観察した結果を示す。Ａ）ベースライン（細胞注射前）及びＲＯＣＫ阻害剤が補充されたｃｉＣＥＣ注射後の異なる日数で得られた被験者＃１０における移植眼のスリットランプ顕微鏡（中央）及び共焦点顕微鏡画像（右側）である。Ｂ）異なる日数でｃｉＣＥＣ移植された眼中の角膜厚さを示すＶｉｓａｎｔｅ ＯＣＴである。Ｃ）デスメ膜に接続された生存ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＣＥＣを示す免疫染色分析である。Ｄ）異なる日数での角膜厚さの変化である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

以下の本開示の説明は、本開示の様々な実施例を説明するためのものに過ぎない。したがって、検討された具体的な修正は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者にとって明らかなように、本開示の範囲から逸脱することなく様々な等価物、変更及び修正を行うことができ、このような等価実施例が本明細書に含まれることが理解される。本明細書が引用する全ての参考文献は、出版物、特許及び特許出願を含み、いずれも全文引用の方式で本明細書に組み込まれる。

【0056】

Ａ．一般的な定義

【0057】

コンテキストが別途に明確に指示されない限り、単数の用語「一（ａ／ａｎ）」及び「前記」は複数の指示物を含む。例として、「一細胞」に言及することは一種又は複数種の細胞を指し、「前記方法」に言及することは本明細書に開示された及び／又は当業者に知られている等価ステップ及び方法に言及することを含み、以下同様とする。同様に、コンテキストが別途に明確に指示されない限り、単語「又は」は「及び」を含むことを意図する。本明細書に記載された方法及び材料と類似するか又は等価の方法及び材料は本開示を実践するか又は試験するために用いることができるが、以下に適切な方法及び材料を説明する。略語「例えば（ｅ．ｇ．）」はラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書において非限定的な例を示すために用いられる。したがって、略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。

【0058】

本明細書で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ／ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は組成物、方法及び前記方法又は組成物に対して不可欠なその対応する成分に言及する時に使用されるが、示されていない要素を含むことに対して、必要であるか否かに関わらず、依然として開放される。

【0059】

用語「～からなる」は本明細書に記載された組成物、方法及びその対応する成分を指し、それは前記実施例の説明に記載されていない任意の要素を排除する。

【0060】

用語「約」又は「略」は所定値又は範囲の２０％以内を意味し、好ましくは１０％以内であり、より好ましくは５％以内である。

【0061】

本明細書で使用される用語「細胞」は単一の細胞、細胞系又はそのような細胞に由来する培養物を指す。

【0062】

本明細書で使用されるように、用語「リプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍ／ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ／ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）」又はその等価物は、細胞がリプログラミングを行わない同じ条件で有する分化状態に比べて、培養物又はイン・ビボで細胞の分化状態を変更するか又は逆転する過程を指す。換言すれば、本開示の場合に、「リプログラミング」は分化、脱分化及び分化転換を含む。本明細書で使用されるように、用語「分化」は一種の細胞過程を指し、低特殊化の細胞は前記細胞過程により高特殊化の細胞タイプになることである。対照的に、用語「脱分化」は一種の細胞過程を指し、そのうちの一部又は最終分化細胞は早期発育段階、例えば多能性又は複能性を有する細胞に復帰することである。さらに対照的に、用語「分化転換」は一つの分化細胞タイプを別の分化細胞タイプに転換する細胞過程を指す。したがって、本明細書に使用されるように、用語「低い分化状態」又は「低い特殊化」又は「早期発育段階」は相対的な用語でありかつ完全脱分化状態（又は完全脱分化）及び部分的分化状態（又は部分的分化）を含む。上記細胞発育と区別するために、「未分化細胞」は多くの方向に分化することができる細胞であり、すなわちそれは二種又はそれ以上の特殊化細胞に分化することができる。未分化細胞の典型例は、幹細胞である。

【0063】

細胞タイプは分化期間において様々なレベルの潜在能力、例えば全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）及び複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を経由する。フレーズ「全能性幹細胞」は生体を構成する全ての細胞に分化することができる細胞を指し、例えば卵細胞と精細胞の融合により生成された細胞である。受精卵の前の数回の分裂により生成された細胞も全能性である可能性がある。これらの細胞は胚及び胚外細胞タイプに分化することができる。多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞は、任意の胚及び成体細胞タイプを生成することができる。しかしながら、それは胚又は成体動物を単独で育成することができず、それは胚外組織を発育する潜在能力が乏しいためである。胚外組織部分は胚外内胚葉に由来し、さらに遠位内胚葉（ｐａｒｉｅｔａｌ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ライヘルト膜（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ））及び近位内胚葉（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（卵黄嚢を形成する部分）に分類することができる。遠位内胚葉及び近位内胚葉の両方は胚の発育を支持するが、それ自体は胚構造を形成しない。さらに他の胚外組織が存在し、胚外中胚葉及び胚外外胚葉を含む。本明細書で使用されるように、「多能性幹細胞」又は「多能性」を有する細胞又は等価物は全ての三種類の胚葉（例えば、内胚葉、中胚葉及び外胚葉）に分化可能な細胞集団を指す。多能性細胞は様々な多能性細胞特異的マーカーを発現し、未分化細胞の細胞形態特徴（すなわち、緻密なコロニー、高核質比及び明らかな核小体）を有し、免疫低下動物、例えばＳＣＩＤマウスに導入する時に奇形腫を形成する。奇形腫は典型的には全ての三種類の胚葉の細胞又は組織特徴を含む。当業者であれば、当分野で一般的に用いられている技術を用いて、これらの特徴を評価することができる。例えばＴｈｏｍｓｏｎら、『サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）』２８２：１１４５－１１４７（１９９８）を参照する。多能性細胞は細胞培養において増殖して複能性特性を示す様々な系譜に向かって細胞集団の分化を制限することができる。複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）又は複能性又は等価性を有する細胞は多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に対して分化程度がより高いが、最終分化しない。これにより、多能性幹細胞は、複能性幹細胞よりも高い潜在能力を有する。

【0064】

Ｂ．リプログラミング細胞

【0065】

一態様において、本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子－β（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養することを含む、第１タイプの細胞を第２タイプの細胞にリプログラミングするための方法を提供する。

【0066】

いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はより多くの細胞を第２タイプの細胞に変化させる。

【0067】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は中胚葉、外胚葉又は内胚葉に由来する哺乳動物細胞であり、例えばヒト又はマウスである。

【0068】

外胚葉、中胚葉及び内胚葉は胚の発育中に形成された三つの胚葉であり、そのうち中胚葉を中間層とし、外胚葉を外層とし、内胚葉を内層とする。中胚葉は間葉系、中皮、非上皮血球及び体腔細胞を形成し、それは筋肉（平滑筋及び横紋筋）、骨、軟骨、結合組織、脂肪組織、循環系、リンパ系、真皮、泌尿生殖系、漿膜及び脊索を構成する。内胚葉は咽頭、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、膵臓、膀胱、気管及び気管支上皮部分、肺、甲状腺及び副甲状腺を形成する。外胚葉は表面外胚葉、神経堤及び神経管を形成し、そのうち表面外胚葉は表皮、毛髪、爪、眼の水晶体、皮質腺、角膜、エナメル質、口及び鼻の上皮に成長する。外胚葉の神経堤は末梢神経系、副腎髄質、メラニン細胞、顔面軟骨及び象牙質に成長する。また外胚葉の神経管は脳、脊髄、脳下垂体後葉、運動ニューロン及び網膜に成長する。

【0069】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は体細胞である。本明細書で使用されるように、用語「体細胞」は生殖系細胞（例えば、精子及び卵、及びそれを製造する細胞（生殖母細胞））及び未分化幹細胞以外の任意の細胞を指す。内臓、皮膚、骨、血液及び結合組織は、いずれも体細胞からなる。体細胞は、任意由来の任意タイプの体細胞であってもよい。例えば、体細胞は線維芽細胞、上皮細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、上皮顆粒層、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、肝細胞、毛嚢細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、単核細胞（ｍｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）、心筋細胞及び他の筋細胞を含むがそれらに限定されない。

【0070】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は中胚葉細胞である。中胚葉細胞のマーカーは本分野で知られており、例えばＣＤ５６及びＡＰＪである。いくつかの実施例において、中胚葉細胞は線維芽細胞、上皮細胞、白血球、脂肪細胞及びケラチノサイトを含む。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は線維芽細胞であり、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス新生児線維芽細胞（ＭＮＦ）、マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）、ヒト胚皮膚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）、成人線維芽細胞（ＨＡＦ）、ヒト胚肺線維芽細胞、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）及びそれらの混合物を含むがそれらに限定されない。

【0071】

線維芽細胞は任意の適切な供給源から取得することができ、例えば商業的供給源又は様々な器官組織又は皮膚組織から取得される。好ましい線維芽細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞及び成体真皮線維芽細胞である。いくつかの実施例において、線維芽細胞は患者から取得され、例えば皮膚生検（例えば、決定された因子で人体細胞を多能性になるまでリプログラミングする（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ）．Ｇｅｏｒｇｅ Ｑ．Ｄａｌｅｙら『ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）』２００８、ヒト皮膚の単一パンチ生検からケラチノサイト、内皮細胞及び線維芽細胞を分離して連続的に増殖するための方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｒｉａｌ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｕｎｃｈ ｂｉｏｐｓｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ）、Ｎｏｒｍａｎｄら『Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ａｎｉｍａｌ 』，１９９５）で取得される。

【0072】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は上皮細胞であり、例えばヒト脱落腎臓上皮細胞である。上皮細胞は、尿サンプルから得ることができる。

【0073】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）である。白血球は、血液サンプルから得ることができる。白血球は、一般的に、ＲＦ信号強度（高周波での電気インピーダンスの変化）、ＤＣ信号強度（懸濁粒子と粒子がその中に懸濁された液体媒体との間の電気伝導性差異による直流電流変化）、蛍光強度、散乱光強度、吸光度、散乱光脱分極等（ＵＳ５６１８７３３Ａを参照）の差異により、その亜集団（リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球）に分類することができる白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）である。

【0074】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は脂肪細胞又はケラチノサイトである。脂肪細胞及びケラチノサイトは皮膚生検又は採取された毛髪により容易に得ることができる（皮膚又は採取された毛髪からヒトケラチノサイトを分離して培養して人工多能性幹細胞を生成する（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ ｏｒ ｐｌｕｃｋｅｄ ｈａｉｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、Ｂｅｌｍｏｎｔｅら『ネイチャープロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）』２０１０）。

【0075】

他の実施例において、第１タイプの細胞は成体細胞である。本明細書で使用されるように、用語「成体細胞」は胚が発育した後に体全体に発見された細胞を指す。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は幹細胞、例えば胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び成形幹細胞であってもよく、造血幹細胞、血管内皮幹細胞、心臓幹細胞、筋由来幹細胞、間葉系幹細胞、表皮幹細胞、脂肪由来幹細胞、腸幹細胞、神経幹細胞、腎上皮幹細胞、尿道上皮幹細胞及び肝臓幹細胞を含むがそれらに限定されない。

【0076】

いくつかの実施例において、幹細胞は未分化細胞を指し、それは増殖してより多くの前駆細胞を生成することができ、前駆細胞は大量の母細胞を生成することができ、母細胞はさらに分化又は分化可能な子細胞を生成することができる。幹細胞は非対称分裂してもよく、そのうちの一つの子細胞は幹細胞状態を保持し他の子細胞はいくつかの独特な他の特定機能及び表現型を発現する。代わりに、集団中の幹細胞のうちのいくつかは二つの幹細胞に対称的に分裂することができ、したがって集団全体においていくつかの幹細胞を維持し、集団中の他の細胞は分化した子孫のみを生成する。子細胞自体は誘導されて増殖して子孫を生成することができ、子孫はその後に一種又は複数種の成熟細胞タイプに分化し、同時に親の発育潜在能力を有する一種又は複数種の細胞を保留する。他の実施例において、用語「幹細胞」は特定の環境でより特殊化又は分化表現型に分化する能力又は潜在能力を有する前駆細胞亜集団を指し、それはある状況で増殖してほぼ分化しない能力を保留する。一つの実施例において、用語幹細胞は一般的に天然に存在する母細胞を指し、その後代（子孫）は分化により（例えば完全な個体特徴を取得することにより）通常、異なる方向に特殊化し、例えば胚細胞及び組織の漸進的多様化において発生する。分化した細胞は複能性細胞に由来することができ、該複能性細胞自体は複能性細胞に由来するものであり、以下同様とする。これらの複能性細胞のそれぞれは幹細胞と見なすことができるが、それぞれの生成可能な細胞タイプの範囲は顕著に変更される。多くの生物の例において、幹細胞も「複能性」であり、それは一つ以上の独特な細胞タイプの子孫を生成することができるが、それは「幹細胞特性（ｓｔｅｍ－ｎｅｓｓ）」に必要なものではない。自己更新は、幹細胞定義の他の典型的な部分である。理論的には、自己更新は二つのメカニズムのうちのいずれか一つにより行うことができる。

【0077】

用語「胚性幹細胞」は胚の胚盤胞の内細胞塊の多能性幹細胞を指す（米国特許第５８４３７８０号、第６２００８０６号を参照、それは引用により本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞の区別的な特徴は胚性幹細胞の表現型を限定する。したがって、細胞が前記細胞を他の細胞と区別できる胚性幹細胞の独特な特徴のうちの一つ又は複数を有する場合、前記細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。例示的に胚性幹細胞の区別的な特徴は、遺伝子発現プロフィール、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する反応性等を含むがそれらに限定されない。

【0078】

用語「成体幹細胞」又は「ＡＳＣ」は、非胚性組織（胎児、幼体及び成体組織を含む）に由来する複能性幹細胞を意味する。成体幹細胞は広く様々な成体組織から分離され、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋及び心筋を含む。これらの幹細胞はいずれも培養物における遺伝子発現、因子反応性及び形態に基づいて特徴づけることができる。以上に示すように、幹細胞がほぼ各組織に存在することが発見された。したがって、本明細書に記載された技術から幹細胞集団がほとんど任意の動物組織から分離することができることを知ることができる。

【0079】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は間葉系幹細胞、間葉系基質細胞、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。

【0080】

本明細書で使用されるように、用語「ｉＰＳ細胞」、「ｉＰＳＣ」及び「人工多能性幹細胞」は互換的に使用することができ、かつ人工的に（例えば、完全又は部分的に逆転誘導により）作られた自己分化した体細胞（すなわち、非多能性細胞に由来する）多能性細胞を指す。多能性細胞は三種類の発育胚葉の全ての細胞に分化することができる。

【0081】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は間葉系基質細胞は、伝統的に骨髄から発見された成体幹細胞である。しかしながら、間葉系幹細胞は他の組織（臍帯血、末梢血、卵管及び胎児肝臓及び肺を含む）から分離することもできる。ＭＳＣは様々な細胞タイプに分類することができ、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ／ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌ）、筋細胞（筋肉細胞）及び脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）（骨髄脂肪組織を生成する脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ））を含む。

【0082】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は外胚葉細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は内胚葉細胞である。

【0083】

いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は第１タイプの細胞から分化転換する。例えば、中胚葉細胞を外胚葉細胞にリプログラミングする。いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は外胚葉細胞である。いくつかの実施例において、複能性幹細胞は神経堤細胞（ＮＣＣ）又は神経堤細胞様細胞である。いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は神経堤細胞（ＮＣＣ）又は神経堤細胞様細胞である。

【0084】

「神経堤細胞」又は「ＮＣＣ」とは、一般に、メラノソームマーカーとＨＭＢ４５とを共発現する色素細胞を生成する発育潜在能力を有する神経前駆細胞を意味する。神経堤細胞は本明細書で同定され当分野で知られているマーカーを発現することにより同定することができる。本明細書が提供する化学的に誘導されたＮＣＣ（ｃｉＮＣＣ）と初代ＮＣＣを区別するために、得られたｃｉＮＣＣも神経堤細胞様細胞（ＮＣＣ様細胞）と命名される。いくつかの実施例において、得られたＮＣＣのＮＣＣ様細胞は初代ＮＣＣ表現型と一致する一種又は複数種のバイオマーカーを示す。いくつかの実施例において、得られたＮＣＣ様細胞はＮＣＣ表現型と一致する一種又は複数種のバイオマーカーの発現を欠如するか又はその発現が低い（例えばＰＡＸ６の発現）。存在状況がＮＣＣ表現型と一致する例示的なＮＣバイオマーカーは、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ９、ＨＮＫ－１、Ｐ７５（ＮＧＦＲ）、ＡＰ２α、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＳＮＡＩ２、Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔｌ、Ｋｒｏｘ２０、ＣＤ２７１、ＦｏｘＤ３、ＡＮ２及びＫｉ６７、及び／又は少なくとも一種の多能性マーカーＮＡＮＯＧ、ＺＮＦ２０６又はＯＣＴ４を含むことができる。いくつかの実施例において、ＮＣバイオマーカーはＰ７５、Ｈｎｋ１、ＡＰ２α及び／又はＳＯＸ１０である。実施例において、ＮＣＣ様細胞を生成する第１タイプの細胞に対して、ＮＣバイオマーカーの発現の向上は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００倍を超え又はそれ以上である。

【0085】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は線維芽細胞でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞はマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞はマウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞はヒト胚皮膚線維芽細胞（ＨＥＦ）でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞はヒト胚肺線維芽細胞、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞はヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）又は成人線維芽細胞（ＨＡＦ）でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。

【0086】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は上皮細胞（例えばヒト脱落腎臓上皮細胞）でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は白血球（例えばリンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球）でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は脂肪細胞でありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞はケラチノサイトでありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞はＭＳＣ、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞又はｉＰＳＣでありかつ第２タイプの細胞はＮＣＣ様細胞である。

【0087】

いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は別のタイプの幹細胞（第１タイプの細胞）（例えば間葉系幹細胞、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））からリプログラミングされたいくつかのタイプの複能性幹細胞である。

【0088】

マーカーの発現は当分野で知られている任意の方法により検出することができ、ウエスタンブロッティング、ｍＲＮＡ増幅に基づく方法（例えば、ＰＣＲ、等温増幅等、それは逆転写を含み単一細胞又は複数の細胞からの発現を検出することに適用することができる）、ノーザンブロット、免疫染色等を含むがそれらに限定されない。また、前記マーカーの発現はレポーター構築物（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（例えば視覚的に検出可能な蛍光タンパク質の発現、抗生物質の存在下での細胞生存により検出可能な抗生物質耐性遺伝子の発現など）の発現により推定することができ、該レポーター構築物は細胞タイプに特異的発現を付与する遺伝子エレメント（例えば前述のマーカーのうちの一種又はその断片のプロモーター）の制御下にある。例示的なレポーター構築体はｐＯＣＴ４－ＧＦＰ及びｐＯＣＴ４－ＬＵＣ遺伝子であり、それらはそれぞれＧＦＰ及びルシフェラーゼのＥＳ細胞における発現を駆動し、ＧＦＰ及びルシフェラーゼのうちのいずれか一つの発現は従来の方法で容易に検出することができる。マーカー表現を検出する他の使用可能な方法は当分野で知られている。一般的にＡｕｓｕｂｅｌ、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌら、『Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；第５版，２００２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），第３版，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、『Ｔｈｅ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００６）を参照し、前記文献のそれぞれは全文引用の方式で本明細書に組み込まれる。

【0089】

当分野で知られている任意の細胞培養システムは本開示に用いることができる。いくつかの実施例において、接着培養システムは本開示の方法に用いられる。用語「接着培養」は一種の細胞培養システムを指し、細胞はこれにより固体表面で培養され、固体表面はさらに基質で塗布することができる。細胞は固体表面又は基質に密着していてもよく密着していなくてもよい。接着培養に用いられる基質は、さらに、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリオルニチン、ラミニン、ポリリジン、精製コラーゲン、ゼラチン、セルロース、細胞外マトリックス、フィブロネクチン、テネイシン（ｔｅｎａｃｉｎ）、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ポリ解糖系酸（ｐｏｌｙ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、マトリゲル、ヒドロキシアパタイト及び羊膜のうちのいずれか一種又は組み合わせを含むことができる。

【0090】

いくつかの実施例において、浮遊培養は本開示の方法に用いることができる。本明細書で使用される用語「浮遊培養」は細胞を固体担体又は培養容器に付着させない細胞培養方式を指す。細胞を浮遊培養物に転移するために、細胞を例えばセルスクレーパーにより培養容器から取り出して、培地を含有する無菌低接着性培養プレートに転移し、前記培養プレートは細胞を培養プレートの表面に接着することを許可しない。したがって、細胞はマトリックス又は培養皿の底部に付着せずに浮遊培養することができる。

【0091】

細胞の培養に適した培地は、培養皿に、ある細胞タイプを生育させるのに適した任意の培地である。該培地は例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＩＭＤＭ培地、培地１９９、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）、ａＭＥＭ培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びこれらの培地の混合物を含む。また、Ｈａｍら、『Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．』５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、『Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．』１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４７６７７０４号、第４６５７８６６号、第４９２７７６２号、第４５６０６５５号、又は第５１２２４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、又は米国特許再発行番号３０９８５に記載の培地のうちのいずれか一つを培地として用いることができる。これらの培地のいずれかは必要に応じて必要な塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム塩、マグネシウム塩及びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^TM薬物）、微量元素（通常、マイクロモル範囲内の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、グルコース又は等価エネルギー源、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、低分子量化合物、抗酸化剤、ピルビン酸、サイトカイン等を補充することができる。当業者に知られている適切な濃度の任意の他の必須補充剤をさらに含むことができる。培養条件（例えば温度、ｐＨ等）は従来の細胞培養に用いられる培養条件であり、一般的な当業者に明らかである。

【0092】

本明細書に記載の細胞リプログラミング方法において、細胞は一種又は複数種の本明細書に記載のリプログラミング因子が補充された基本培地で培養される。例えば、第１組のリプログラミング因子を添加する前に、基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ノックアウト血清代替（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を含むことができる。別の実施例において、第１組のリプログラミング因子を添加する前に、基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、０．０７５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を含むことができる。別の例について、第２組のリプログラミング因子を添加する前に、基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ノックアウト血清代替（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を含むことができる。いくつかの実施例において、第２組のリプログラミング因子に用いられる基本培地は血清を含まない。当業者に理解されるように、他の必要な補充剤（例えば上述した補充剤）を培地に添加することができる。

【0093】

培養温度について、３５．０℃又はそれ以上の温度で培養すると、細胞リプログラミングを促進することができることが実証された。培養温度は細胞を損傷しない温度であり、例えば好ましくは３５．０℃～４２．０℃であり、又はより好ましくは３６．０℃～４０．０℃であり、又はより好ましくは３７．０℃～３９．０℃である。

【0094】

リプログラミング因子は細胞と接触する時（例えば、細胞により発現されたり、細胞に形質転換されて発現したり、細胞に外因的に提供したりする等）に単独で又は他の分子と組み合わせてリプログラミングを引き起こすことができる分子である。リプログラミング因子は外因性の由来から提供することができ、例えば培地に添加することにより、かつ本分野で知られている方法、例えば細胞とのペプチドカップリング、タンパク質又は核酸トランスフェクション試薬、リポフェクション、エレクトロポレーション、バイオロジカルプロジェクタイルパーティクルデリバリーシステム（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）（遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ））、マイクロインジェクション等により細胞に導入することができる。いくつかの実施例において、リプログラミング因子は培地に添加されて任意の他の成分と結合しない。

【0095】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞を第２タイプの細胞にリプログラミングするための第１組のリプログラミング因子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子－β（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む。他の実施例において、第１組のリプログラミング因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＢＭＰ４又はそれらの組み合わせをさらに含む。

【0096】

いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子は、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤からなる。いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子はＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤及びｂＦＧＦからなる。いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子はＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びＢＭＰ４からなる。いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子はＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤）及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤からなる。

【0097】

いくつかの実施例において、リプログラミング因子は、その各自のファミリー内のパラログ（ｐａｒａｌｏｇ）により機能的に置換されることができる場合がある。

【0098】

本明細書で使用されるように、用語「阻害剤」は標的にされた発現産物（例えば標的をコードするｍＲＮＡ又は標的ポリペプチド）の発現及び／又は活性を例えば少なくとも１０％又はそれ以上（例えば１０％又はそれ以上、５０％又はそれ以上、７０％又はそれ以上、８０％又はそれ以上、９０％又はそれ以上、９５％又はそれ以上又は９８％又はそれ以上）低下させることができる試薬を指す。例えば発現産物のレベル及び／又は標的の活性を測定することにより阻害剤の効果（例えば標的レベル及び／又は活性を低下させる能力）を測定することができる。所定のｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドのレベルを測定するための方法は当業者に知られており、例えばＲＴ－ＰＣＲはＲＮＡレベルを測定するために用いることができ、抗体を利用するウエスタンブロッティングはポリペプチドのレベルを測定するために用いることができる。標的活性は当分野で知られかつ本明細書で説明された方法、例えば転写活性アッセイを使用することができる。いくつかの実施例において、阻害剤は阻害性核酸、アプタマー、抗体又はその結合断片、又は小分子であってもよい。

【0099】

ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）はセリン／スレオニンプロテインキナーゼであり、グリコーゲン生成、アポトーシス、幹細胞維持等に関連する多くのシグナル経路に関連する。ＧＳＫ３は、異なる遺伝子によりコードされ、アミノ酸レベルで高い相同性を有するアイソフォーム（ＧＳＫ３α及びＧＳＫ３β）を含む。ＧＳＫ３阻害剤の例としては、ＧＳＫ３α阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤を含む。ＧＳＫ３阻害剤の具体例としては、ＧＳＫ３をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、抗ＧＳＫ３抗体、ＣＨＩＲ９８０１４（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ）、ＡＲ－ＡＯ１４４－１８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＴＤＺＤ－８（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳ）、ＳＢ２１６７６３（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳ）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、ＴＷＳ－１１９（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳ）、ＳＢ４１５２８６（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳ）、Ｒｏ３３０３５４４（ＵＳ６４７９４９０）ＬｉＣｌ、Ｌｉ₂ＣＯ₃等を含む。これらの全ては市販されているか、又は当業者であれば既知の文献を参照して製造することができる。

【0100】

いくつかの実施例において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、Ｌｉ₂ＣＯ₃及びＢＩＯからなる群から選択される。いくつかの実施例において、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの実施例において、ＧＳＫ３阻害剤はＢＩＯである。培地中のＧＳＫ３阻害剤の濃度は、使用される阻害剤の種類に応じて適宜決定される。ＣＨＩＲ９９０２１又はＢＩＯの場合、濃度は一般的に０．１－１０μＭであり、好ましくは１－５μＭであり、より好ましくは約３μＭである。一種又は複数種のＧＳＫ３阻害剤を組み合わせて使用することができる。

【0101】

ＴＧＦβ（形質転換成長因子β）は、形質転換成長因子スーパーファミリーに属する多機能サイトカインである。ＴＧＦβは三種類の異なる哺乳動物のアイソフォーム（ＴＧＦβ１～３、ＨＧＮＣシンボルＴＧＦＢＥＴＡ１、ＴＧＦＢＥＴＡ２、ＴＧＦＢＥＴＡ３）を含む。ＴＧＦβはマクロファージを含む多くの細胞タイプから分泌することができ、潜伏形態を呈し、中でもＴＧＦβは他の二種類のポリペプチド（潜伏ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）及び潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ））と複合する。本発明において使用されるＴＧＦβ阻害剤の由来は特に限定されず、それがＴＧＦβ機能を効果的に阻害することができればよい。ＴＧＦβ阻害剤は市販されているか、又は当業者であれば既知の文献を参照して製造することができる。ＴＧＦβ阻害剤の具体例としては、ＧＳＫ３をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、抗ＴＧＦβ抗体及び化学アンタゴニストを含む。

【0102】

いくつかの実施例において、ＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、Ｒｅｐｓｏｘ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、ＬＤＮ１９３１８９（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）及びトラニラスト（（リザベン）Ｒｉｚａｂｅｎ）からなる群から選択される。いくつかの実施例において、ＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３１５４２である。培地中のＴＧＦβ阻害剤の濃度は、使用される阻害剤の種類に応じて適宜決定される。ＳＢ４３１５４２の場合、濃度は一般的に０．１－２０μＭであり、好ましくは１－１０μＭであり、より好ましくは約５μＭである。Ｒｅｐｓｏｘの場合、濃度は一般的に０．１－２０μＭであり、好ましくは１－１５μＭであり、より好ましくは約１０μＭである。

【0103】

本明細書で使用されるように、用語「環状ＡＭＰ誘導剤」は有効濃度で細胞におけるｃＡＭＰの細胞内濃度を少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、最も好ましくは少なくとも２０％向上させる任意の化合物を指す。細胞内のｃＡＭＰレベルを測定するための方法は当業者に知られている。好ましくは環状ＡＭＰ誘導剤はイソブチルメチルキサンチン及びフォルスコリンを含む。フォルスコリンの濃度は一般的に１－２０μＭであり、好ましくは５－１５μＭであり、より好ましくは約１０μＭである。

【0104】

ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）は体内に固有に存在する一種のタイプのタンパク質であり、かつそれが細胞成長及び分化を制御することができ、様々な組織及び器官において例えば血管生成、平滑筋細胞増殖、傷口治療、組織修復、造血、神経細胞分化などの機能を有することが知られている。本発明において使用されるｂＦＧＦの由来は特に限定されず、それがリプログラミングに有効であればよい。ｂＦＧＦは市販されているか、又は当業者であれば既知の文献を参照して製造することができる。例えば、それは既知の塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて合成することができ、例えばアミノ酸配列はＮＣＢＩ登録番号ＡＡＡ５２４４８．１（ヒト）及びＡＡＡ３７６２１．１（マウス）に基づいて取得することができる。培地中のｂＦＧＦの濃度は一般的に１－５０ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは約１－２０ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ又は約２０ｎｇ／ｍｌである。

【0105】

ヒストンのアセチル化は可逆的な修飾であり、脱アセチル化はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）と呼ばれる酵素ファミリーにより触媒される。ＨＤＡＣ阻害剤はバルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット（スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＳＡＨＡ、メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．））、デプシペプチド（ロミデプシン（Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）、ＦＫ－２２８、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、トラポキシン、デプデシン、ＦＲ９０１２２８（Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））及び酪酸塩を含む。いくつかの実施例において、ＨＤＡＣ阻害剤はＶＰＡである。培地中のＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、使用される阻害剤の種類に応じて適宜決定される。ＶＰＡの場合、濃度は一般的に１－２０００μＭであり、好ましくは１０－１０００μＭであり、より好ましくは約５００μＭである。

【0106】

第１組のリプログラミング因子が補充された基本培地を１、２又は３日ごとに一回更新する。

【0107】

いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は第１組のリプログラミング因子の存在下で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０日、１．５ヶ月又は２ヶ月培養する。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞は第１組のリプログラミング因子の存在下で２ヶ月、１．５ヶ月、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１日未満培養する。いくつかの実施例において、第１タイプの細胞を第１組のリプログラミング因子の存在下で１日～２ヶ月、１日～１ヶ月、１日～２５日、１日～２０日、１日～１９日、１日～１８日、１日～１７日、１日～１６日、５日～１６日、７日～１６日、８日～１６日、９日～１６日、１０日～１６日、１１日～１６日、１２日～１６日、１日～１５日、１日～１４日、１日～１３日、１日～１２日、２日～１２日、３日～１２日、４日～１２日、５日～１２日、６日～１２日、７日～１２日培養する。

【0108】

一態様において、本開示は、ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下で第２タイプの細胞を培養することを含む、第２タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするための方法を提供する。

【0109】

カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）は、大部分の真核細胞タイプにおいてシグナル伝達経路調節因子として作用するセリン／スレオニン選択性酵素である。ＣＫ１アイソフォームは、Ｗｎｔシグナル伝達、概日リズム、転写因子核－細胞質シャトリング、ＤＮＡ修復及びＤＮＡ転写に関与する。本発明において使用されるＣＫ１抑制剤の由来は特に限定されず、それがリプログラミングに有効であればよい。ＣＫ１抑制剤は市販されているか、又は当業者であれば既知の文献を参照して製造することができる。ＣＫ１阻害剤の具体例としては、ＣＫ１をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、抗ＣＫ１抗体及び化学アンタゴニストを含む。好ましくは、ＣＫ１抑制剤はＣＫＩ－７である。培地中のＣＫ１阻害剤の濃度は、使用される阻害剤の種類に応じて適宜決定される。ＣＫＩ－７の場合、濃度は一般的に０．１－２０μＭであり、好ましくは１－１０μＭであり、より好ましくは約５μＭである。カゼインキナーゼ１の他の阻害剤には、ＰＦ ６７０４６２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、Ｄ４４７６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、（Ｒ）－ＣＲ８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３二塩酸塩（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、ＴＡＫ ７１５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、ＰＦ ４８００５６７塩酸塩（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、ＬＨ ８４６、ＣＫＩ ７二塩酸塩（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、ＳＲ ３０２９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、エピブラスチンＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）、ＰＦ ５００６７３９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）を含む。

【0110】

いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は外胚葉細胞である。いくつかの実施例において、外胚葉細胞は神経堤細胞（ＮＣ）又はＮＣＣ様細胞である。いくつかの実施例において、第２タイプの細胞はＮＣ又はＮＣＣ様細胞である。ＮＣ又はＮＣＣ様細胞は、例えば、本明細書に記載されているような、又はＷＯ／２０１０／０９６４９６に記載されているような二重ＳＭＡＤ阻害剤を用いてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）から分化させることができる。ＮＣ又はＮＣＣ様細胞はＷｎｔアゴニスト（例えばＷｎｔ３ａ及び／又は（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ））とＳＭＡＤ阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２及び／又はノギン（Ｎｏｇｇｉｎ））との組み合わせを用いてｈＥＳ細胞から分化させることができる。Ｍｅｎｅｎｄｅｚら、『米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）』２０１１年１１月２９日、第１０８巻第４８期１９２４０－１９２４５を参照する。例えば、ｈＥＳ細胞をＳＢ４３１５４２及び（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）（ノギンが存在するか又は存在しない）又はＷｎｔ３ａ及びＳＢ４３１５４２と接触させた後にＮＣ又はＮＣＣ様細胞に対する効率的な誘導が報告された。ＮＣは神経ロゼット（ｒｏｓｅｔｔｅ）の培養によっても取得することができ、例えばＭＳ５基質の飼育細胞にｈＥＳ細胞を培養する（Ｌｅｅら、『Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ』２５（８），１９３１－１９３９（２００７）を参照し、それは全文引用の方式で本明細書に組み込まれる）。ＮＣは大量の組織からも取得することができ、発育胚において、神経管、坐骨神経、腸管及び背根神経節に含まれ、及び幼体及び成体において、背根神経節、骨髄、皮膚、心臓、角膜、歯及び頸動脈小体に含まれる。Ｎａｇｏｓｈｉら、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』１０７：１０４６－１０５２（２００９）；Ｃｒａｎｅ及びＴｒａｉｎｏｒ、『Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．』２００６．２２：２６７－８６；及びＢｌｕｍ、『Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ』８３（２０１０）１８９－１９３を参照し、前記文献のそれぞれは全文引用の方式で本明細書に組み込まれる。いくつかの実施例において、ＮＣＣ様細胞は本願に基づいて第１タイプの細胞をリプログラミングすることにより取得される。

【0111】

いくつかの実施例において、第２組のリプログラミング因子の存在下で第２タイプの細胞を培養し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の細胞が第３タイプの細胞になることを引き起こす。

【0112】

いくつかの実施例において、第３タイプの細胞は外胚葉細胞である。いくつかの実施例において、第３タイプの細胞は神経体細胞である。いくつかの実施例において、第３タイプの細胞は角膜内皮細胞様細胞（ＣＥＣ様細胞）である。

【0113】

「角膜内皮細胞」又は「ＣＥＣ」とは、一般的に、生体において角膜後面に配列し、眼の前房に面するミトコンドリアリッチ細胞を意味する。本明細書が提供する化学的に誘導されたＣＥＣ（ｃｉＣＥＣ）と初代ＣＥＣを区別するために、得られたＣＥＣも角膜内皮細胞様細胞（ＣＥＣ様細胞）と命名される。本明細書に開示されたリプログラミング方法により取得されたＣＥＣ様細胞は、ＣＥＣマーカーを表現し、主に六角形の均一な大きさの細胞単層を形成する能力、「リーキーポンプ（ｌｅａｋｙ ｐｕｍｐ）」（溶質及び栄養素が眼房水から角膜のより浅い層に漏れることを許可すると同時に逆方向でストロマから眼房水へ水を能動的にポンピングする）を形成する能力のような内因性ＣＥＣ属性のうちの一種又は複数種を示すことにより識別される。例示的なＣＥＣマーカーは、Ｎａ⁺／Ｋ⁺ＡＴＰ酵素、タイトジャンクションタンパク質１（ＴＪＰｌ／ＺＯ－１）、ＫＬＦ１３、ＡＱＰ１、コラーゲンＶＩＩＩ、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＦＴＲ、ＮＢＣ１、ＣＡ２、ＡＥ２／ＳＣＬ４Ａ２、ＳＣＬ１６Ａ１、ＣＡ１２、ＣＡ４、ＦｏｘＣｌを含むがそれらに限定されない。例えば、ＣＥＣは、通常、コラーゲンＶＩＩＩ、Ｎａ⁺Ｋ⁺ＡＴＰ酵素ポンプ及びＺＯ－１を発現し、かつｖＷＦ及びＣＤ３１を発現しない（後者は血管内皮細胞に存在する）。また、ＣＥＣは一種又は複数種の角膜内皮ポンプマーカー（それはＡＱＰ１、ＣＡ２、ＣＡ４、ＣＡ１２、ＳＣＬ１４Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ７、ＣＦＴＲ、ＮＨＥ１、ＡＤＣ Ｙ１０、電圧依存性陰イオンチャネルＶＤＡＣ２及びＶＤＡＣ３、塩素イオンチャネルタンパク質ＣＬＣＮ２及びＣＬＣを含む）、眼球周囲神経堤マーカー（それはＰＩＴＸ２及びＦＯＸＣｌを含む）及び／又は細胞接着及びマトリックスタンパク質（それはオクルディン（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ）、コネクシン（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ）４３、９．３Ｅ抗原、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、Ｎカドヘリン、ＶＥカドヘリン、Ｅカドヘリン、βカテニン、ラミニンα４、ネスチン（Ｎｉｄｏｇｅｎ）－２及びネトリン（Ｎｅｔｒｉｎ）４を含む）を発現することができる。例えば、ＣＥＣは少なくとも一種の角膜内皮ポンプマーカー、少なくとも一種の眼球周囲神経堤マーカー及び少なくとも一種の細胞接着及び基質タンパク質を発現することができる。

【0114】

いくつかの実施例において、得られたＣＥＣ様細胞は初代ＣＥＣ表現型と一致する一種又は複数種のバイオマーカーを示す。いくつかの実施例において、得られたＣＥＣ様細胞はタイトジャンクションタンパク質１（ＴＪＰｌ／ＺＯ－１）、Ｎ－カドヘリン及びＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰ酵素を発現する。いくつかの実施例において、ＣＥＣ様細胞を生成するＮＣＣ又はＮＣＣ様細胞に対して、ＣＥＣバイオマーカーの発現の向上は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００倍を超えて又はそれ以上である。

【0115】

マーカーは、当分野で公知の方法により検出又は測定することができる。例えば、Ｎ－カドヘリンによる接着接続はタンパク質レベル（例えば、抗原抗体反応を利用する方法）又は遺伝子レベル（例えば、ＲＴ－ＰＣＲを利用する方法）での発現を検査することにより確認することができる。細胞のＮａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素ポンピング機能は例えば『Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ』、２０１０第５１巻、第８期、３９３５－３９４２、及び『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ』、２００９第３４巻、３４７－３５４に記載の方法に基づき、ウッシングチャンバー（Ｕｓｓｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて測定することができる。

【0116】

いくつかの実施例において、第２組のリプログラミング因子は、ＢＭＰ４及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤をさらに含む。

【0117】

骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨及び軟骨の形成を促進する成長因子の群である。ＢＭＰは、骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）と呼ばれる細胞表面上の特異的受容体と相互作用する。ＢＭＰＲのシグナル伝達によりＳＭＡＤファミリータンパク質メンバーの動員を引き起こす。ＢＭＰ、ＢＭＰＲ及びＳｍａｄに関するシグナル伝達経路は心臓、中枢神経系及び軟骨発育及び生後骨発育において重要である。それは胚発育中に胚のパターニング及び早期骨格形成に重要な役割を有する。したがって、ＢＭＰシグナル伝達への干渉は発育胚のボディプラン（ｂｏｄｙ ｐｌａｎ）に影響を与える。ＢＭＰ阻害剤の例としては、ＤＭＨ２（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳ）、ドルソモルヒン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳ）、ＬＤＮ１９３１８９（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、ＤＭＨ－１（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、Ｋ ０２２８８（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）及びＭＬ ３４７（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）を含むがそれらに限定されない。培地中のＢＭＰ阻害剤の濃度は、使用される阻害剤の種類に応じて適切に決定され、例えば０．１ｎＭ－１０μＭ、０．１ｎＭ－５μＭ、０．１ｎＭ－２．５μＭ、０．１ｎＭ－２μＭ、０．５ｎＭ－２μＭ、１ｎＭ－２μＭ、１ｎＭ－１．５μＭ、１ｎＭ－１０００ｎＭ、５ｎＭ－１０００ｎＭ、１０ｎＭ－１０００ｎＭ、５０ｎＭ－１０００ｎＭ、５０ｎＭ－５００ｎＭ、５０ｎＭ－２００ｎＭ、１００ｎＭ－２００ｎＭ、１００ｎＭ－１５０ｎＭ又は１００ｎＭである。

【0118】

ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）は、形質転換成長因子－βスーパーファミリーの一部である骨形成タンパク質ファミリーのメンバーである。ＢＭＰ４は腹側辺縁帯及び眼、心血及び耳胞の早期胚発育に発見される。本発明において使用されるＢＭＰ４抑制剤の由来は特に限定されず、それがリプログラミングに有効であればよい。ＢＭＰ４阻害剤は市販されているか、又は当業者であれば既知の文献を参照して製造することができる。ＢＭＰ４阻害剤の具体例としては、ＢＭＰ４をコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、ノギン及び抗ＢＭＰ４抗体を含む。培地中のＢＭＰ４阻害剤の濃度は使用される阻害剤の種類に応じて適切に決定され、例えば０．０１－１００μｇ／ｍｌ、０．０１－５０μｇ／ｍｌ、０．０１－２５μｇ／ｍｌ、０．０１－１０μｇ／ｍｌ、０．０１－５μｇ／ｍｌ、０．０１－１μｇ／ｍｌ、０．０１－０．５μｇ／ｍｌ、０．０１－０．１μｇ／ｍｌ、０．０１－０．０５μｇ／ｍｌ、０．０５－１０μｇ／ｍｌ、０．１－１０μｇ／ｍｌ、０．１－５μｇ／ｍｌ、０．１－４μｇ／ｍｌ、０．１－３μｇ／ｍｌ又は０．１－２μｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌである。

【0119】

ＤＮＭＴ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）ファミリー酵素は、メチル基のＤＮＡへの移動を触媒することができる。ＤＮＡメチル化は広範な生物学的機能を提供する。本発明において使用されるＤＮＭＴ阻害剤の由来は特に限定されず、それがリプログラミングに有効であればよい。ＤＮＭＴ阻害剤は市販されているか、又は当業者であれば既知の文献を参照して製造することができる。ＤＮＭＴ阻害剤の具体例としては、ＤＮＭＴをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、抗ＤＮＭＴ抗体及び化学アンタゴニストを含む。

【0120】

いくつかの実施例において、ＤＮＭＴ阻害剤は、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、５－アザシチジン（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、５－アザ－ｄＣ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）及びＲＧ１０８（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）からなる群から選択される。培地中のＤＮＭＴ阻害剤の濃度は使用される阻害剤の種類に応じて適切に決定され、例えば０．１－１００μＭ、０．１－５０μＭ、０．１－２５μＭ、０．１－１０μＭ、０．５－１０μＭ、１－１０μＭ、５μＭである。

【0121】

ＤＯＴ１Ｌ（ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １－ｌｉｋｅ）は、一種類のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）であり、それはクロマチン構造（例えばテロメアのクロマチン）内のヒストン３の３７番目のリジン残基のメチル化を触媒する。本発明において使用されるＤＯＴ１Ｌ阻害剤は特に限定されず、それがリプログラミングに有効であればよい。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は市販されているか、又は当業者であれば既知の文献を参照して製造することができる。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の具体例としては、ＤＯＴ１Ｌをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、抗ＤＯＴ１Ｌ抗体及び化学アンタゴニストを含む。いくつかの実施例において、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は小分子ＤＯＴ１Ｌ阻害剤である。理論に拘束されることを望まない場合、ＤＯＴ１Ｌはアデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を補助因子としてＤＯＴ１Ｌ上のＡｄｏＭｅｔ結合部位によりＨ３Ｋ２７のメチル化を触媒することができることが知られている。したがって、ＡｄｏＭｅｔをそのＤＯＴ１Ｌでの結合部位から移動させたＡｄｏＭｅｔ分子構造をシミュレートする任意の化学品をＤＯＴ１Ｌ阻害剤とすることができることは本開示の想定内である。いくつかの実施例において、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＥＰＺ００４７７７、ＥＰＺ５６７６（ピノメトスタット（ｐｉｎｏｍｅｔｏｓｔａｔ）とも呼ばれる）、ＳＧＣ０９４６及びＳＹＣ－５２２からなる群から選択される。

【0122】

いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は第２組のリプログラミング因子の存在下で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０日、１．５ヶ月又は２ヶ月培養する。いくつかの実施例において、第２タイプの細胞は第２組のリプログラミング因子の存在下で２ヶ月、１．５ヶ月、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１日未満培養する。いくつかの実施例において、第２タイプの細胞を第２組のリプログラミング因子の存在下で１日～２ヶ月、１日～１ヶ月、１日～２５日、１日～２０日、１日～１９日、１日～１８日、１日～１７日、１日～１６日、５日～１６日、７日～１６日、８日～１６日、９日～１６日、１０日～１６日、１１日～１６日、１２日～１６日、１日～１５日、１日～１４日、１日～１３日、１日～１２日、２日～１２日、３日～１２日、４日～１２日、５日～１２日、６日～１２日、７日～１２日培養する。

【0123】

一態様において、本開示は、ステップ（ａ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養すること、及び、ステップ（ｂ）ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下でステップ（ａ）から得られた細胞を培養すること、を含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法を提供する。

【0124】

一態様において、本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子及びＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養することを含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングする方法を提供する。

【0125】

いくつかの実施例において、第１組のリプログラミング因子はｂＦＧＦをさらに含む。いくつかの実施例において、第２組のリプログラミング因子はＢＭＰ４及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤をさらに含む。

【0126】

いくつかの実施例において、第１組及び第２組のリプログラミング因子の存在下で第１タイプの細胞を培養して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の細胞を第３タイプの細胞に変更する。

【0127】

いくつかの実施例において、方法は、ステップ（ｂ）を開始する前にステップ（ａ）から得られた細胞を洗浄することをさらに含む。いくつかの実施例において、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間に洗浄ステップが存在しない。

【0128】

Ｃ．医薬組成物及び治療方法

【0129】

一態様において、本開示は、本明細書が提供する方法に基づいて生成されたＮＣＣ様細胞集団を提供する。いくつかの実施例において、群のうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％はＮＣＣ様細胞である。

【0130】

一態様において、本開示は、患者特異的神経堤細胞様細胞を生成するための方法を提供する。一つの実施例において、第１タイプの細胞は神経疾患に罹患している被験者から取得される。

【0131】

一態様において、本開示は本明細書が提供する方法に基づいて生成された角膜内皮細胞様細胞（ＣＥＣ様細胞）群を提供する。いくつかの実施例において、本開示の群のうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の細胞はＣＥＣ様細胞である。

【0132】

いくつかの実施例において、本明細書が提供する方法に基づいて生成されたＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞はエクスビボで精製される。いくつかの実施例において、リプログラミングのための方法では高純度のＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞が生成され、精製する必要がない。例えば、いくつかの実施例において、本明細書が提供するリプログラミング方法は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上のＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞を含む細胞組成物を得ることができる。いくつかの実施例において、本明細書が提供するリプログラミング方法は、低純度又は所望の純度より低いＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞が生成され、精製する必要がある。いくつかの実施例において、ＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞は、ＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞と組成物中の他の細胞を概ねに分離することにより精製される。ＣＥＣ様細胞を精製する場合、組成物中の他の細胞は未分化ＮＣＣ様細胞及び／又は所望しない細胞系譜又は表現型に分化したＮＣＣ様細胞を含むことができる。

【0133】

一態様において、本開示は、本明細書が提供する方法に基づいて生成されたＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞を含む組成物を提供する。組成物は一種又は複数種の薬学的に許容可能な担体及び希釈剤を含むことができる。

【0134】

用語「薬学的に許容可能」とは、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／又は塩が一般的に化学的及び／又は物理的に配合物を構成する他の成分と相溶し、かつその受容者と生理的に相溶することを示す。本明細書に開示された医薬組成物に用いられる薬学的に許容可能な担体は、例えば薬学的に許容可能な液体、ゲル又は固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、緩衝剤、酸化防止剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、キレート（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ／ｃｈｅｌａｔｉｎｇ）剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤又は非毒性補助物質、当分野で既知の他の成分又はその様々な組み合わせを含むことができる。

【0135】

本明細書に記載の組成物はさらに移植しやすい成分を含むことができる。本明細書に記載の組成物は、パイロジェンフリーであるか又は実質的にパイロジェンフリーでありかつ病原体フリーであってもよく、ここで病原体は細菌汚染物質、マイコプラズマ汚染物質及びウイルスを含む。

【0136】

本明細書に記載のＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞を含む組成物はさらに免疫抑制剤又は免疫寛容剤を含むことができる。

【0137】

別の態様では、本開示は、本明細書が提供するＣＥＣ様細胞の治療用途に関する。例えば、本発明のＣＥＣ様細胞は細胞療法において角膜内皮を移植する必要がある疾患を治療するための移植物として使用することができ、前記疾患は例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑等である。

【0138】

一態様において、本開示は、必要とする被験者に有効量の本明細書が提供するＣＥＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞を含む組成物を投与することを含む、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状を治療する方法を提供する。

【0139】

いくつかの実施例において、角膜内皮細胞を投与して眼治癒過程を誘導する。いくつかの実施例において、角膜内皮細胞を投与して病変組織を補充する。いくつかの実施例において、角膜内皮細胞の投与は損傷又は病変眼組織に対して再生効果を有する。

【0140】

投与経路は任意の適切な手段を含むことができ、眼部位に局所的に投与すること、眼部位に注射すること、眼部位に移植すること等を含むがそれらに限定されない。いくつかの実施例において、選択された特定の投与モードは特定の治療、患者の疾患状態又は病状、被験者に投与された他の薬物又は治療剤の性質又は投与経路等に依存する。いくつかの実施例において、角膜内皮細胞は単回投与量又は選択された時間間隔内に複数回の投与量で被験者に投与することができ、例えば滴定投与量である。複数回の投与量で投与する場合、投与量は例えば一週間、一ヶ月、一年又は十年間隔とすることができる。細胞を投与する前、投与中又は投与後に、前記細胞がさらに特定の細胞タイプに偏るように一種又は複数種の成長因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカイン、小分子又は他の細胞を投与してもよい。

【0141】

本明細書で使用されるように、用語「有効量」は一般的に患者に投与して疾患を治療する時に疾患に対するこのような治療を実現するのに十分な化合物又は細胞の量を指す。有効量はプロフィラキシス（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための有効量及び／又はプリベンション（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）のための有効量であってもよい。有効量は、兆候・症状を効果的に減少させることができる量であってもよく、兆候・症状の発生を効果的に防止する、兆候・症状の発生の重症度を低下させる、兆候・症状の発生を解消する、兆候・症状の発生の進行を遅らせる、兆候・症状の発生の進行を防止する及び／又は兆候・症状の発生へのプロフィラキシスを実現することができる量であってもよい。「有効量」は、疾患やその重症度、治療対象の患者の年齢、体重、病歴、感受性、過去に存在していた病状によって異なりうる。本発明の目的のために、用語「有効量」は「治療有効量」と同義である。

【0142】

本明細書で使用されるように、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は被験者、例えばヒト、動物又は哺乳動物の本明細書に記載された疾患又は医学的病状に対する治療を含み、また、（ｉ）疾患又は病症を抑制し、すなわち、その発展を抑制すること、（ｉｉ）疾患又は病症を緩和し、すなわち、病症の消失を引き起こすこと、（ｉｉｉ）病症の進行を遅らせること、及び／又は（ｉｖ）疾患又は医学的病状の一種又は複数種の症状を抑制し、緩和するか又は疾患又は医学的病状の一種又は複数種の症状の進行を遅らせることを含む。

【0143】

本明細書で使用されるように、用語「被験者」は、特定種又はサンプルタイプに限定されない。例えば、用語「被験者」は患者を指すことができ、かつ常に患者を指す。しかしながら、この用語はヒトに限定されず、このため様々な哺乳動物種を含み、例えば非ヒト獣医学哺乳動物、例えば犬、猫、ウサギ、豚、げっ歯類動物、馬又はサルである。

【0144】

本明細書が提供するＣＥＣ様細胞は細胞塊であり、例えば濃縮及び濾過により取得された塊及びその類似体であり、かつその類似体は本発明の薬剤として用いられる。なお、薬剤に保護剤、例えばグリセリン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、プロピレングリコール、アセトアミド等を添加し、混合物を冷凍保存する可能性もある。薬剤をより安全に利用するために、薬剤は病原性タンパク質の変性を引き起こす条件下での処理、例えば熱処理、放射処理などを経ることができ、同時に角膜内皮細胞の機能を保持する。

【0145】

いくつかの実施例において、ＣＥＣ様細胞は手術と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施例において、手術はデスメ膜剥離角膜内皮移植（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ；ＤＳＥＫ）であってもよく、それはデスメ膜及び角膜内皮を除去し、後続のドナー組織を移植することを含む。代わりに、手術はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ（ＰＫＰ）であってもよく、ここで角膜全体が除去され置換される。その他の手術としては、ｌａｍｅｌｌａｒ ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ、デスメ膜角膜内皮移植（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ；ＤＭＥＫ）、ＤＳＡＥＫ、ＤＬＥＫを含む。

【0146】

「機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状」は、ＣＥＣ様細胞を投与することにより治療することに適する任意の疾患又は病状を含み、被験者のＣＥＣ数が減少するか又は死亡し、密度が低下するか又は他の方式で機能不全になる疾患を含む。角膜内皮に影響を与える原発性疾患は、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性角膜変性症、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィーを含む。効果的な治療には角膜内皮の置換を含みうる継発性疾患又は病状は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜色素変性症、緑内障、角膜ジストロフィー、コンタクトレンズの使用、白内障手術及び角膜移植における後期内皮不全を含む。角膜内皮細胞疾患は、また角膜への任意の損傷を含み、例えば化学刺激による損傷、コンタクトレンズの使用、（例えば、コンタクトレンズの洗浄保存液、化粧品、点眼液、薬剤、煙等に対する）反応又は敏感、引っ掻き、引っ掻き傷、擦り傷、座傷、眼中の異物（例えば、砂又は粉塵）又は紫外光に曝される（例えば日光、蛍光灯、雪反射、水反射又はアーク溶接又は他の暴露）に起因する損傷を含む。いくつかの実施例において、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状は、被験者の視力喪失を引き起こす。いくつかの実施例において、被験者の視力喪失は恒久的又は不可逆的である。

【0147】

いくつかの実施例において、角膜内皮細胞は、被験者と免疫学的に適合する（例えば同種他家由来又は自己由来である）。

【0148】

いくつかの実施例において、治療方法は、前記被験者に免疫抑制剤又は免疫寛容剤を投与することをさらに含むことができる。免疫抑制剤又は免疫寛容剤は、前記ＣＥＣ様細胞に対する拒絶反応のリスクを低減するのに十分な量で投与することができる。

【0149】

免疫抑制剤又は免疫寛容剤は、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、ＢＡＳＩＬＩＸＩＭＡＢ（登録商標）（抗ｌＬ－２Ｒａ受容体抗体）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）（シクロスポリンＡ）、ＤＡＣＬＩＺＵＭＡＢ（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒａ受容体抗体）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ミコフェノール酸エステル及びコルチコステロイドのうちの一種又は複数種を含むことができる。

【0150】

免疫抑制剤は少なくとも約１、２、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇ投与することができる。免疫抑制剤を使用する場合、それは全身又は局所的に投与することができ、かつそれはＣＥＣ様細胞を投与する前に投与したり、ＣＥＣ様細胞と一緒に投与したり、ＣＥＣ様細胞を投与した後に投与したりすることができる。免疫抑制療法は、細胞投与後、数週間、数ヶ月、数年又は無限期継続してもよい。例えば、患者はＣＥＣ様細胞を投与した後に５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンを６週間持続投与することができる。

【0151】

一態様において、本開示は、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状を治療するための薬剤を製造するために用いられる、本明細書が提供するＣＥＣ様細胞又は組成物の用途を提供する。

【0152】

一態様において、本開示は、必要とする被験者に有効量の本明細書が提供するＮＣＣ様細胞又はＮＣＣ様細胞を含む組成物を投与することを含む、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状を治療する方法を提供する。

【0153】

一態様において、本開示は、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状を治療するための薬剤を製造するために用いられる、本明細書が提供するＮＣＣ様細胞又は組成物の用途を提供する。

【0154】

本明細書が提供するＮＣＣ様細胞は、神経疾患の治療に用いることができる。

【0155】

本明細書で使用される「神経疾患」は神経系の病症として定義され、中枢神経系（脳、脳幹及び小脳）、末梢神経系（脳神経を含む）及び自律神経系（その一部が中枢及び末梢神経系に位置する）に関する病症を含む。特に、神経疾患は、神経堤細胞又はシュワン細胞の機能が損なわれ、変更され、又は破壊される任意の疾患を含む。シュワン細胞に関連する神経疾患の例は、脱髄疾患、多発性硬化、脊髄症、実験的アレルギー性脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＥＡＥ）、急性播種性脳脊髄炎（ａｃｕｔｅ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＡＤＥＭ）、感染後又は接種後の脳脊髄炎、末梢神経病変、シュワン細胞腫病（Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａｔｏｓｉｓ）、シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－ Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｒａｄｉｃｕｌｏｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ；ＣＩＤＰ）。である。

【0156】

本開示は、さらに薬物発見及び／又は薬物スクリーニングのための方法を提供する。さらに薬物発見及び／又は薬物スクリーニングのための分析を提供する。いくつかの実施例において、これらの方法はＮＣＣ様細胞又はＣＥＣ様細胞に薬物候補物を投与し、細胞の薬物候補物に対する反応を検出することを含む。検出反応は、薬物候補が適切な特性（例えば、毒性又は治療効果）を有するか否かを識別することができる。いくつかの実施例において、方法は、薬物候補物の存在下での細胞の健康さ及び活力を特定することに用いることができる。いくつかの実施例において、方法は、薬物候補物の毒性を試験するために用いることができる。いくつかの実施例において、方法は、薬物候補物の存在下での細胞集団表現型の変化を評価することに用いることができる。

【0157】

一態様において、本開示は、ＮＣＣ様細胞を使用して神経疾患又は薬剤（例えば糖尿病薬剤）の神経副作用を逆転、抑制又は予防する薬物をスクリーニングする方法を提供する。

【0158】

Ｄ．キット

【0159】

一態様において、本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子を含む、第１タイプの細胞を第２タイプの細胞にリプログラミングするためのキットを提供する

【0160】

一態様において、本開示は、ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子を含む、第２タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするためのキットを提供する。

【0161】

一態様において、本開示は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子及びＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子を含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするためのキットを提供する。

【0162】

キットは、取扱説明書、及びキット中の成分の各成分を分離する包装をさらに含むことができる。

【0163】

本明細書に引用された全ての出版物及び特許はいずれも全文引用の方式で本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例１：材料及び方法

【0164】

１．動物

【0165】

全ての動物実験はいずれも中国の温州の温州医科大学動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｎｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）により承認された。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ遺伝子組換えアレル担持マウス（ＣＢＡ／ＣａＪ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）はジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に由来する。Ｗｎｔ１－ｃｒｅ及びＦｓｐ１－Ｃｒｅマウスはジャクソン・ラボラトリーに由来する（ＢＡＬＢ／ｃ－Ｔｇ（Ｓ１００ａ４－ｃｒｅ）１Ｅｇｎ／ＹｕｎｋＪ）。ＲＯＳＡ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスはジャクソン・ラボラトリーに由来する（Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ）。１２９Ｓｖ／Ｊａｅ及びＣ５７ＢＬ／６マウスはＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに由来する。Ｗｎｔ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６^tdTomato及びＦｓｐ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６^tdTomatoマウスは、それぞれＷｎｔ１－Ｃｒｅ及びＦｓｐ１－ＣｒｅマウスとＲＯＳＡ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスとをハイブリダイズすることにより取得する（図４Ａ参照）。ニュージーランドの白ウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔ）は、ＪＯＩＮＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｚｈｏｕ）Ｉｎｃ．，Ｓｕｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａに由来する。全ての動物は、ＡＲＶＯ（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）及びＳｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより処理される。全ての動物は１２時間暗／光サイクルを有する安定条件（２１℃±２℃）で閉じ込め養殖される。

【0166】

２．細胞培養

【0167】

前述したように、初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、胚が１３．５日目（Ｅ１３．５）にあるマウス胚から分離される（Ｌｉｕ，Ｃ．，Ｈｕ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｌｕ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｃａｏ，Ｎ．，Ｚｈｕ，Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｄｉｎｇ，Ｓ．及びＺｈａｎｇ，Ｍ．（２０１９）．『Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ』。『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ』；Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｃａｏ，Ｎ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｃ．Ｉ．，Ｎｉｅ，Ｂ．，Ｍａ，Ｔ．，Ｘｕ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｄ．及びＤｉｎｇ，Ｓ．（２０１４）．『小分子使得能（▲ゴウ▼、句偏に多い）用単一因子Ｏｃｔ４進行小鼠成線維細胞的心臓重編程（Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ，Ｏｃｔ４） 』。『Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ』６，９５１－９６０）。簡単に言えば、胚の頭、尾、肢体及び内臓組織を注意深く取り出して捨てる。残りの組織を小片にスライスし、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）により、トリプシン化して１０－ｃｍの培養皿に接種する。線維芽細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍ ＭＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）、１００単位／ミリリットルのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する線維芽細胞培地で培養する。全ての線維芽細胞を二世代増幅させた後にさらなる実験に用いる。Ｗｎｔ１^-ＭＥＦを調製するために、Ｗｎｔ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６^tdTomatoマウス胚に由来する線維芽細胞をｔｄＴｏｍａｔｏ^-細胞に対してＦＡＣＳにより分取する。

【0168】

マウス初代角膜内皮細胞（ＣＥＣ）（ＣＰ－Ｍ１７９）及び培地（ＣＭ－Ｍ１７９）は、Ｐｒｏｃｅｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（中国武漢）から購入される。マウスの初代ＣＥＣを１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）、２ｍ ＭＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭで培養する。ｍＥＳＣをＥＳＣ培地に維持し、ＥＳＣ培地は１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ＬＩＦ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）、２ｍ ＭＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３ｍＭ）及びＰＤ０３２５９０１（１ｍＭ）を含有するＤＭＥＭで構成される。

【0169】

ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）及び成人線維芽細胞（ＨＡＦ）はＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入される。ヒト臍帯間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はＮｕｗａｃｅｌｌ Ｌｔｄ．（中国合肥）により友情によって提供される。前記細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）を補足したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する線維芽細胞培地に維持した。ヒト脱落腎臓上皮細胞（ＵＣ）は正常ヒトからの１００－３００ｍＬの尿サンプルに由来し、例えば、前述した報告Ｚｈｏｕ，Ｔ．ら（２０１２）、『Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ』、『Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ』７，２０８０－２０８９）を参照する。

【0170】

３．ｔｄＭＥＦを生成するためのＦＡＣＳ分取

【0171】

ｔｄＭＥＦを調製するために、前述したように、得られた線維芽細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺／Ｐ７５^-細胞に対してＦＡＣＳによって分取する。Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ２６^tdTomato（Ｆｓｐ１－Ｃｒｅマウス×Ｒｏｓａ２６^tdTomatoマウス）の遺伝的背景を有するＥ１３．５マウス胚から初代ＭＥＦを分離した。第２世代にあるＭＥＦを０．２５％のトリプシンで３７℃で５分間解離し、ＭＥＦ培地で中和する。それらのＭＥＦを、Ｐ７５に対する特異的抗体で染色し、ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺／Ｐ７５^-細胞に対するＦＡＣＳ分取を経由させる。ＦＡＣＳ分取期間において、マトリゲルで塗布された２４ウェル培養プレートを３７℃で少なくとも３０分間予熱し、その後にｔｄＭＥＦを接種する。ＦＡＣＳ分取後、直ちに３７℃で５％ＣＯ２及び２０％Ｏ２でｔｄＭＥＦを１５，０００個の細胞／ウェルで予熱されたマトリゲルで塗布された２４ウェル培養プレート中の１μＭのチアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）（Ｔｚｖ）が補充されたＭＥＦ培地に接種して５時間持続することにより、ＭＥＦをプレートに接続する。５時間後、培地をＴｚｖを含まないＭＥＦ培地に変更し、ｔｄＭＥＦｓを３７℃で５％ＣＯ₂で一晩培養する。

【0172】

４．小分子化合物及びライブラリー

【0173】

小分子はＳｉｇｍａから入手した、ＧＳＫ３ｂ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＳＭＬ１０４６）、ＴＧＦｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｓ４３１７）、ＤＮＡメチル化阻害剤５－アザ－ｄＣ（Ａ３６５６）、環状ＡＭＰ誘導剤フォルスコリン（Ｆ６８８６）及びＣＫＩ－７（Ｃ０７４２）を含む。ｂＦＧＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから入手した。ＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＥＰＺ００４７７７（Ｓ７３５３）及びＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（Ｓ１０４９）はＳｅｌｌｅｃｋから入手した。

【0174】

５．免疫細胞化学

【0175】

典型的な神経堤（ＮＣ）細胞マーカーの発現をさらに研究するために、リプログラミンされたグＭＥＦに対して固定、免疫染色及び分析を行う。簡単に言えば、細胞を１×ＰＢＳで一回洗浄して４％のパラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定し、次に０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の１×ＰＢＳ溶液で１０分間透過性化し、７．５％のＢＳＡで少なくとも１時間封止する。全ての一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を７．５％ＢＳＡに希釈し、４℃で一晩培養する。細胞を室温で１×ＰＢＳで１０分間洗浄し、五回持続する。二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）Ａｌｅｘａ－４８８、Ａｌｅｘａ－５５５及びＡｌｅｘａ－６４７はイン・ビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入され、それを７．５％ＢＳＡに希釈し、室温で１時間培養し続け、次に１×ＰＢＳで五回１０分間洗浄する。細胞核はＤＡＰＩで染色される。この研究に用いた抗体を表２に示す。

【0176】

【表1】

【0177】

６．統計分析

【0178】

全ての実験を独立して少なくとも三回行う。結果は平均値±ＳＤとして示した。データはｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔにより分析されて二つのグループを比較し、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔ又はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔにより分析されて複数のグループを比較する。全ての分析は、ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １９．０ソフトウェアを用いて行った。Ｐ値＜０．０５であれば顕著とみなす。

【0179】

７．細胞周期分析

【0180】

アクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）溶液を用いて細胞を単細胞懸濁液に注意深く解離し、ＰＢＳで二回洗浄し、その後に冷たい７０％のエタノールで一晩固定する。固定された細胞をＰＢＳで二回洗浄し、次に３７℃でリボヌクレアーゼ（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）処理され及びヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で３０分間染色する。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて約１×１０⁶個の細胞を分析し、細胞周期分布パターンを特定した。ＭｏｄＦｉｔ ４．１（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）を用いて細胞周期のＧ１、Ｓ及びＧ ２／Ｍ期にある細胞の百分率を分析する。

【0181】

８．移植

【0182】

ＤＳＥＫ
全ての重量が２．０－２．５ｋｇのウサギを塩酸ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｂａｙｅｒ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を筋肉内に麻酔する。ウサギを２つのグループ（各グループｎ＝１０）に分け、その右眼はこの実験に用いられる。操作部位に消毒及び無菌被覆を行った後、スリットナイフで１２時中央の６ ｍｍ角膜切断を行い、粘弾性剤（Ｈｅａｌｏｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）を前房に注入する。角膜表面をマーキングペン（（Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）Ｄｅｖｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）で画線した後、３０ゲージのニードル（Ｔｅｒｕｍｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて角膜中心にデスメ膜除去術（ｄｅｓｃｅｍｅｔｏｒｈｅｘｉｓ）のための直径６．０ｍｍの円形孔口を生成し、眼の前房からデスメ膜を除去する。前述したように、涙道洗浄器（Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｗｅｉｇａｏ）を用いてデスメ膜から角膜内皮を機械的に引っ掻く。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用してＦｓｐ－ｃｉＣＥＣを解離し、１×１０⁷個の細胞／ミリリットルの密度で基本培地に再懸濁し氷上で保持する。前房をＰＢＳで三回洗浄する。この手順の後に、２６ゲージのニードルを使用して１００μｌの１００μＭＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含有する基本ＤＭＥＭに懸濁した１×１０⁶個の培養されたｃｉＣＥＣを右眼の前房に注射する。その後、凍結（個別の凍結損傷）、ＣＥ眼の下向き（凍結損傷及びＣＥ注射）及び球体眼の下向き（凍結損傷及び球体注射）グループにおけるウサギは眼の下向き位置を２４時間保持することにより、細胞は重力により接続することができ、また球体眼の上向きグループにおけるウサギは深麻酔下で眼の上向き位置を２４時間保持する。各手術眼は外部検査により、一週間に二回又は三回検査し、かつ注射後の３、７、１４及び２８日目に写真を撮影する。手術後の０．５、１、３、７、１４、２１及び２８日目に、超音波角膜厚さ測定装置（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｐａｃｈｙｍｅｔｅｒ）で中央角膜厚さを測定し、気圧眼圧計（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ）で眼内圧を測定する。三回の読み取り値の平均値を取る。

【0183】

９．細胞増殖分析

【0184】

Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ^TMエチニルデオキシウリジン（ＥｄＵ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８イメージングキット（Ｑｉａｇｅｎ社）により、メーカーの説明書に基づいて、個別の分化培地又は個別のＭ５で培養されたｃｉＣＥＣの増殖速度を測定する。簡単に言えば、継代ＣＥＣを５×１０³個の細胞／平方センチメートルの低い密度でスライドガラスに接種し、２４時間培養する。

【0185】

１０．透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析

【0186】

ＴＥＭ分析について、細胞を２．５％ＥＭ級グルタルアルデヒド（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ）で４℃で２－４時間固定し、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、１％四酸化オスミウムで、４℃で２－４時間固定処理し、洗浄しその後にエタノールシリーズ（５０－１００％）で１００％アセトン最終洗浄まで脱水し、次に１：１アセトン／Ｐｏｎ ８１２（ＳＰＩ）で２時間培養し、１：２アセトン／Ｐｏｎ ８１２で一晩培養する。サンプルをＰｏｎ ８１２に包埋し、６０℃で４８時間重合し、その後にダイヤモンドナイフ（Ｄａｉｔｏｍｅ）でスライスする（６０－８０ｎｍ）。切片を２％の酢酸ウランで染色し、次にクエン酸鉛で染色し、ＨＴ７７００透過型電子顕微鏡（日立（ＨＩＴＡＣＨＩ））で可視化される。

【0187】

１１．核型分析

【0188】

０．１μｇ／ｍＬのコルセミド（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃で細胞を２時間処理し、トリプシン化し、さらに懸濁し０．０７５Ｍの塩化カリウムで３７℃で１５分間培養し、３：１のメタノール：酢酸で固定し、その後にスライドガラスに滴下して染色体を分散させる。染色体は、ギムザ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）染色により可視化される。

【0189】

１２．ＲＮＡシークエンシング及び分析

【0190】

メーカーの説明書に準拠して、ＴＲＩｚｏｌ試薬で各サンプルの全ＲＮＡを分離しＲＮｅａｓｙ ２３ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００、 Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏキットを用いてＲＮＡ質量及び数量を評価する。Ａｎｎｏｒｏａｄ Ｇｅｎｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによりＲＮＡライブラリー構築及びＲＮＡシークエンシングを行う。メーカーの提案に従いＩｌｌｕｍｉｎａ２４用のＮＥＢ Ｎｅｘｔ ＵｌｔｒａＲＮＡライブラリー調製キット（ＮＥＢ）を使用してシークエンシングライブラリーを生成し、ＨｉＳｅｑ ＰＥクラスタキットｖ４－ｃＢｏｔ－ＨＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用してライブラリークラスタリングを行う。クラスタを生成した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のプラットフォームでライブラリーをシークエンシングし１５０ｂｐのペアエンドリードを生成する。ＢＭＫＣｌｏｕｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｌｏｕｄ．ｎｅｔ／）で初期データ分析を行う。

【0191】

１３．ＦＡＣＳサイトメトリー

【0192】

ＭＥＦ調製について、所望の遺伝子型を有する線維芽細胞をＭＥＦ培地で培養し、それが８０％を超える融合度に達するまで停止する。細胞を１×ＰＢＳで二回洗浄し、０．２５％トリプシンで３７℃で５分間処理した。収穫した後、細胞を７０－μｍのフィルタに通過させ、予備冷却緩衝液（１×ＰＢＳ、１．５％ＦＢＳ、０．５％ＢＳＡ）で二回洗浄し、前記緩衝液に再懸濁させる。推奨濃度で、細胞とＦＩＴＣコンジュゲートＰ７５抗体（Ａｂｃａｍ）又はアイソタイプ・コントロール（ＢＤ）を氷上で共に３０分間培養し、又は室温で４５分間培養し、次にＦＡＣＳ緩衝液で六回洗浄する。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで分取した。
実施例２：線維芽細胞からｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣを生成する

【0193】

１．培地調製

【0194】

段階Ｉ培地調製

【0195】

ＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を含有する基礎培地であって、それに小分子Ｒｅｐｓｏｘ（１０μＭ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（１０μＭ）、フォルスコリン（１０μＭ）、及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）が補充されている。

【0196】

第１組のリプログラミング因子分子を添加する前に、基礎培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、０．０７５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）をさらに含有してもよく、細胞リプログラミングの面で同等又はより高い効果が得られる（データは未図示）。

【0197】

なお、小分子Ｒｅｐｓｏｘ（１０μＭ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（１０μＭ）及びフォルスコリン（１０μＭ）の組み合わせは、類似の誘導効果を達成することができる（データは未図示）。培地を３０分間振とうして完全に溶解させる。

【0198】

段階ＩＩ培地調製

【0199】

ＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）であって、５μＭ ＳＢ４３１５４２及び５μＭ ＣＫＩ－７が補充されている。

【0200】

２．線維芽細胞からｃｉＣＥＣを化学的に誘導する

【0201】

小分子が化学的に線維芽細胞を角膜内皮細胞にリプログラミングできるか否かを研究するために、本発明者らは２段階法を設計してマウス線維芽細胞を神経堤細胞に直接リプログラミングし、角膜内皮細胞に分化させる（図１Ａ）。Ｗｎｔ１－Ｃｒｅ－Ｒｏｓａ^Tomatoマウスにおいて、ｔｄＴｏｍａｔｏはＷｎｔ１遺伝子の制御下で神経堤（ＮＣ）において忠実に発現する。したがって、胚期Ｅ１３．５にあるＷｎｔ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６^tdTomatoマウスからＭＥＦを分離し、神経堤集団をｔｄＴｏｍａｔｏ発現でマーカーする。本発明者らは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を行ってｔｄＴｏｍａｔｏ^-集団を収集することにより、いかなる神経堤又は前駆細胞を排除する。これらのＭＥＦは典型的なＮＣマーカー（Ｓｏｘ１０、Ｐ７５、Ｈｎｋ１及びＡＰ２αを含む）に対して陰性を呈する（データは未図示）。また、これらのＭＥＦも典型的な神経幹細胞（ＮＳＣ）マーカー（Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６及びＯｌｉｇ２を含む）に対して陰性を呈する（データは未図示）。小分子によって線維芽細胞からｃｉＮＣＣを誘導するための方法は報告されていない。小分子が化学的に線維芽細胞をｃｉＮＣＣにリプログラミングすることができるか否かを研究するために、本発明者らは２０種を超える小分子を潜在的な候補分子として選択し、これらの候補分子は標的外観遺伝的修飾及び神経堤発育シグナル伝導調節に基づいて神経堤系譜のリプログラミングを行うために用いられる。候補小分子は三種類の小分子を含む三つの主なタイプのリプログラミング因子に着目する。（１）ＴＧＦ－βシグナル伝達抑制剤、例えばＲｅｐｓｏｘ（Ｒ）であり、それは中胚葉及び内胚葉の特殊化を抑制する。（２）ＧＳＫ３抑制剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）であり、それは神経発育を促進する。及び（３）環状ＡＭＰ誘導剤、例えばフォルスコリン（Ｆ）である。この三種類の化合物が塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と組み合わせて化学成分が決定された培地（以下ＲＣＦと呼ばれる）とすることにより、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をｃｉＮＣＣにリプログラミングする。

【0202】

簡単に言えば、ＭＥＦを５０，０００個の細胞／ウェルで６ウェル培養プレートに接種する。一晩培養した後、ＲＣＦ化学成分が決定されたリプログラミング培地でＭＥＦを処理する。ＲＣＦ培地において、多数の明瞭なエッジを有する小さい緻密な細胞クラスタは十二日間以内に迅速に出現する（図１Ｂ）。マウス線維芽細胞を化学的に誘導された神経堤細胞（ｃｉＮＣＣ）にリプログラミングするのに十分なＲＣＦの組み合わせを識別するために、Ｗｎｔ１^-ＭＥＦを用いてｔｄＴｏｍａｔｏ発現を観察する。結果は、ＲＣＦ化合物がＭＥＦをｔｄＴｏｍａｔｏ陽性神経堤細胞様細胞にリプログラミングすることができることを示す（図１Ｄ）。典型的なＮＣマーカーの発現をさらに研究するために、ＲＣＦ処理されたＭＥＦに固定、免疫染色及び分析を行う。これらの細胞は、ＨＮＫ１、Ｐ７５及びＡＰ２αを発現している（図１Ｆ）。これらの線維芽細胞由来の、増殖性が高く自己再生が可能なＳｏｘ１０陽性細胞は、以下、ｃｉＮＣＣと呼ばれる。

【0203】

リプログラミング過程において、多数の明瞭なエッジを有する小さい緻密な細胞クラスタは７日間以内に迅速に出現する（図１Ｂ及び図１Ｃ）。Ｒｅｐｓｏｘ、Ｃｈｉｒ９９０２１、フォルスコリン及びｂＦＧＦで処理された後、１０日間処理した後にｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞を観察した（図１Ｄ及び図１Ｅ）が観察された。１２日目に、神経堤細胞（ＮＣ）のマーカー（ＨＮＫ１、Ｐ７５及びＡＰ２α）が観察された（図１Ｆを参照）。しかしながら、ｂＦＧＦがない場合、小分子Ｒｅｐｓｏｘ（１０μＭ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（１０μＭ）及びフォルスコリン（１０μＭ）の組み合わせは類似の誘導効果を達成することができる（データは未図示）。

【0204】

ＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７分化培地でｃｉＮＣＣを１４日間誘導した後、ｃｉＮＣＣは角膜内皮細胞様細胞（ｃｉＣＥＣ）に分化する（図３Ｃを参照）。図３Ａは１４日目に免疫蛍光染色により検出された段階ＩＩで誘導されたｃｉＣＥＣのマーカー（Ｎａ⁺－Ｋ⁺ＡＴＰ酵素、ＡＱＰ１、ビメンチン、Ｎ－カドヘリン、ラミニン及びＡＱＰ１）を示す。また、透過型電子顕微鏡では、角膜内皮細胞の緊密な結合が観察された。

【0205】

あり得る出発ＭＥＦにおける神経堤細胞（ｃｉＮＣＣ）の汚染を回避するために、本発明者らは系統追跡実験を行ってｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣの由来を追跡する（図４Ｂ）。Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ－ＲｏｓａＴｏｍａｔｏマウスにおいて、ｔｄＴｏｍａｔｏはＦｓｐ１遺伝子の制御下でｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣにおいて忠実に発現する。Ｆｓｐ１－ｃｉＮＣＣにおいて免疫細胞化学によりｃｉＮＣＣマーカーＰ７５、Ｈｎｋ１、ＡＰ２α及びＳＯＸ１０の発現が観察された（図４Ｃを参照）。図４ＤはＦｓｐ１－Ｃｒｅ：Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦの代表的な形態変化及びこれらのＭＥＦから誘導されたｃｉＣＥＣを示す。

【0206】

以上に説明したような同じ手順を用いて、化学因子によりヒト細胞（ヒト胚皮膚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）、成人線維芽細胞（ＨＡＦ）、ヒト臍帯間葉系基質細胞（ＭＳＣ）及び尿細胞（ＵＣ））を誘導する。好ましくは、段階Ｉに添加された化学因子はＲｅｐｓｏｘ（１０μＭ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（１０μＭ）、フォルスコリン（１０μＭ）、５－アザシチジン（５μＭ）、ＶＰＡ（５００μＭ）及びＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）である。段階ＩＩに添加された化学因子は５μＭのＳＢ４３１５４２及び５μＭのＣＫＩ－７であり、これは上記と一致する。以上の細胞から誘導されたｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣを図５に示す。
実施例３：実施例２で得られたｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣに対する特徴付け

【0207】

１．１ ＲＮＡ調製及びＲＴ－ＰＣＲ

【0208】

ＮＣ遺伝子（Ｓｏｘ１０、Ｐ７５、Ｐａｘ３及びＭｓｘ１を含む）の発現を確認するためである。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出する。簡単に言えば、１μｇの全ＲＮＡはｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡシンセシスキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と逆転写反応を行うために用いられ、得られたｃＤＮＡをＨ₂Ｏで五回希釈してＰＣＲの使用に備える。半定量的ＰＣＲについて、１μｌの１／５希釈されたｃＤＮＡはＰＣＲプログラムのテンプレートとして用いられる。９５℃で５分間、及び３５個の９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒で循環し、次に７２℃で１０分間である。ＦＡＳＴ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（ＡＢＩ）のプロトコルに従って定量ＰＣＲを行う。全てのＰＣＲを三回繰り返し、個別の遺伝子の発現をＧａｐｄｈの発現に対して正規化する。プライマー配列を表２に示す。

【0209】

【表2】

【0210】

１．２ ＲＮＡシークエンシング及び解析パイプライン

【0211】

ｃｉＮＣＣのトランスクリプトーム解析を検証するために、ＲＮＡシークエンシングを行う。ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡシークエンシングシステムｖ２キット（ＮｕＧＥＮ）でＲＮＡシークエンシングライブラリーを製造する。全ＲＮＡ（５０ｎｇ）を逆転写してランダム六量体とポリＴキメラプライマーの組み合わせで第１鎖ｃＤＮＡを合成する。次にＲＮＡテンプレートを加熱により部分的に分解し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第二鎖ｃＤＮＡを合成する。次にシングルプライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）を使用して二本鎖ＤＮＡを増幅する。ＳＰＩＡは線形ｃＤＮＡ増幅プロセスであり、該プロセスにおいてリボヌクレアーゼＨは二本鎖ＤＮＡの５’端でＤＮＡ／ＲＮＡ異種二本鎖中のＲＮＡを分解し、その後にＳＰＩＡプライマーがｃＤＮＡに結合しポリメラーゼがプライマーの３’端で既存の順方向鎖を置換することにより複製を開始する。その後にランダム六量体を使用して第二鎖ｃＤＮＡを線形増幅する。最後に、Ｕｌｔｒａｌｏｗ Ｖ２ライブラリーキット（Ｎｕ ＧＥＮ）を使用してＳＰＩＡ増幅ｃＤＮＡからのライブラリーを作製する。ＲＮＡシークエンシングライブラリーをバイオアナライザにより分析してＱＰＣＲ（ＫＡＰＡ）により定量する。ＨｉＳｅｑ ２５００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で、三つのＲＮＡシークエンシングライブラリーをペアエンド１００ｂｐシークエンシングの各通路に集約する。Ｆａｓｔｑ－ｍｃｆを用いてリードの既知の継ぎ目及び低品質領域を調整する。サンプルＱＣは、ＦａｓｔＱＣｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を用いて評価した。Ｔｏｐｈａｔ ２．０．１３（Ｋｉｍ，Ｄ．ら、２０１１．『ＴｏｐＨａｔ ２：ａｃｃｕｒａｔｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ，ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ』、『Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ』１４．）を用いてリードをマウス参照アセンブリｍｍ９と比較する。Ｓｕｂｒｅａｄ ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（Ｌｉａｏら２０１４．『ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｌ－ｐｕｒｐｏｓｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ』、『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』３０，９２３－９３０．）により、ｍｍ９のＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子アノテーションを使用し、遺伝子レベルの発現を連携する。差次的発現を処理する前に、ＲＵＶＳｅｑを使用してバッチ効果を調節する（Ｄａｖｉｄ Ｒｉｓｓｏら、２０１４、『Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅｓ ｏｒ ｓａｍｐｌｅｓ』、『ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ』３２，８９６－９０２）。ＣＰＭ（百万当たり）値が．５～５０００にある少なくとも二つのサンプルを有しない遺伝子を除外する。差次的発現Ｐ値はｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．ら、２０１０．『ｅｄｇｅＲ：ａ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ』、『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』２６，１３９－１４０）を用いて計算される。内蔵Ｒ関数「ｐ．ａｄｊｕｓｔ」を使用してＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ｍｅｔｈｏｄ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ，（１９９５）．『Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ』、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ』５７，２８９－３００）でＦＤＲを計算する。ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ６．７又はＴｏｐｐＧｅｎｅにより遺伝子オントロジー解析を完了する。Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０によりヒートマップを生成し、Ｊａｖａ（登録商標） Ｔｒｅｅｖｉｅｗにより閲覧する。トランスクリプトーム解析は、これらの細胞がマウスＮＣと非常に類似するが、ＭＥＦと異なることを示す。

【0212】

１．３ ウエスタンブロッティング法

【0213】

ＮＣ特定マーカー及びＣＥＣ特定マーカーの発現を確認するためにウエスタンブロッティング法を行う。簡単に言えば、ホスファターゼ阻害剤（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下で細胞を収集し、それを同じ体積のＤＴＴを含有する２×ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合する。サンプルを煮沸し、遠心分離機で清澄した。電気泳動した後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移動する。膜をポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）染色剤中で短時間染色することにより移動の効率を求めた。膜を５％ＢＳＡで室温で少なくとも１時間封止し、５％ＢＳＡのＴＢＳＴ溶液に希釈された所望の抗体と共に４℃で一晩培養する。膜をＴＢＳＴで五回（毎回１０分間）洗浄し、次にＴＢＳＡで希釈されたＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共に室温で１時間培養する。ＴＢＳＴで五回洗浄した後、ＥＣＬにより検出キットを追加してブロットを発色させる。線維芽細胞をｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣにリプログラミングすることに対して、これらの結果は化学混合物がロバストで普遍的効果を有することを共に示す（データは未図示）。

【0214】

２．ｃｉＮＣＣの維持及び分化潜在能力

【0215】

ＦＡＣＳで分取し精製した後にｃｉＮＣＣを維持するには、細胞を神経堤培地のポリＤ－リジン／ラミニンで塗布された培養プレートで培養し、前記培地は１×Ｎ２、１×Ｂ２７、１０μｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１０μｇ／ｍｌ ＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４が補充された神経基礎培地（Ｇｉｂｃｏ）で構成される。

【0216】

増幅されたｃｉＮＣＣの分化潜在能力を特徴付けるために、まずそれを分化条件で培養する。ＦＧＦ２／ＥＧＦを引き下げＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ及びジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）に暴露することによりニューロンの分化を誘導し、末梢ニューロンを生成する。免疫染色により、ｃｉＮＣＣは第５世代の時にＴｕｊ１＋及びペリフェリン＋ニューロンを生成し、このような分化潜在能力は長期培養期間に良好に維持されている（図２Ａ）。例えばＳ１００ｂ及びＧＦＡＰ＋発現により評価されたシュワン細胞分化はＣＮＴＦ、ニューロリギン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）１ｂ及びｄｂｃＡＭＰの存在下で誘導される。

【0217】

メラニン細胞分化について、７日間の誘導処理の後、ｃｉＮＣＣをメラニン細胞分化培地（ＥＢＭ２基礎培地、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００ｎＭエンドセリン３（ＥＤＮ３、Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＷＮＴ１、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、５μｇ／ｍｌインスリン、１ｐＭコレラ毒素、１０ｎＭ １２－Ｏ－テトラ－デカノイルホルボール－１３－アセタート（ＴＰＡ、Ｓｉｇｍａ）及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ））に培養する。３－４週間処理した後、メラニン細胞が観察された（図２Ａ）。

【0218】

間葉系系譜への分化潜在能力を検査するために、本発明者らはＭＳＣ培養条件でｃｉＮＣＣを培養した。これらの条件下で、間葉系形態及びマーカー発現（ＣＤ１０５＋）を有する細胞が出現した（データは未図示）。さらに一ヶ月培養した後、大部分の細胞はＣＤ １０５及び一組の間葉系幹細胞に特有の表面マーカーを発現する。確立された間葉系幹細胞分化方案を使用し、ｃｉＮＣＣにより生成された間葉系前駆細胞が脂肪細胞、軟骨及び骨形成（図２Ｂ）へ分化できることを示す。

【0219】

３．ｃｉＮＣＣ由来のニューロンの機能の特徴付け

【0220】

ｃｉＮＣＣ由来のニューロンの機能を特定するために、その電気生理学的特性を検査した。分化条件下で、ラット皮質ニューロンと１０－２０日間共培養した後、ｃｉＮＣＣ由来のニューロンから全細胞パッチクランプ記録（Ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）を取得する。培養されたニューロンをオリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＸ５１ＷＩ正立顕微鏡の灌流台に移し、以下の物質（ｍＭを単位とする）を含有する人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）で室温で２．５ミリリットル／分間で灌流する。ＮａＣｌ １１９、ＫＣｌ ２．５、ＮａＨ２ＰＯ４ １、ＮａＨＣＯ３ ２６．２及びグルコース１１、ＣａＣｌ２ ２．５及びＭｇＳＯ４ １．３を含有し、かつ浸透圧が３００ｏｓｍＬ－１に調整される。記録過程全体においてａＣＳＦを９５％Ｏ₂及び５％ＣＯ₂でバブリングする。データは、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で集め、２ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚでデジタル化した。オフライン分析はＩｇｏｒ Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）で行った。活動電位は電流クランプ全細胞配置で記録する。電流クランプ実験に用いられる電極液は以下の物質（ｍＭを単位とする）を含有する。グルコン酸カリウム１２３、ＫＣｌ １０、ＭｇＣｌ₂１、ＨＥＰＥＳ １０、ＥＧＴＡ１、ＣａＣｌ₂０．１、Ｋ₂ＡＴＰ １、Ｎａ₄ＧＴＰ ０．２及びグルコース４を含有し、ｐＨがＫＯＨで７．２に調整される。膜電位は約－７０ ｍＶに維持され、１０ｐＡ間隔で－２０～５０ｐＡのステップ電流が注入される。全細胞電流は－７０ｍＶの保持電位で記録され、－７０ｍＶ～＋３０ｍＶの範囲内の電圧ステップを２０－ｍＶ増分で送達する。自発的シナプス後電流は全細胞電圧クランプモードで記録される。シナプス電流記録用の全細胞電極液は以下の物質（ｍＭを単位とする）を含有する。ＣＳＣｌ １３５、ＨＥＰＥＳ １０、ＥＧＴＡ １、Ｍｇ－ＡＴＰ ４、Ｎａ₄ＧＴＰ ０．４及びＱＸ－３１４ １０を含有し、ｐＨ７．４である。興奮性及び阻害性電流をサンプリングするために、１ｍＭのグルタミン酸及び１００μＭのＧＡＢＡを１０ｐ．ｓ．ｉ．で１００ｍｓ吹きかけ、かつ保持電圧はそれぞれ－７０ｍＶ及び０ｍＶである。所望のように、それは電流クランプモードで膜に対して脱分極誘発を行う反復配列の動作電位を生成し、ｃｉＮＣＣ由来のニューロンが正常なニューロン活性を有することを示す（データは未図示）。

【0221】

４．細胞増殖分析

【0222】

ｃｉＣＥＣの増殖能力を測定するために、細胞増殖分析を行う。Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ^TMエチニルデオキシウリジン（ＥｄＵ）ＡｌｅｘＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８イメージングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、メーカーの説明書に従って段階ＩＩ培地で培養されたｃｉＣＥＣの増殖速度を測定する。簡単に言えば、継代ＣＥＣを５×１０³個の細胞／平方センチメートルの低い密度でＦＮＣコーティングされたスライドガラスに接種し、２４時間培養する。結果は、これらの細胞が高い増殖能力を有することを示す（データは未図示）。

【0223】

５．奇形腫形成試験により検証されたｃｉＣＥＣ安全性

【0224】

腫瘍発生の潜在的なリスクを評価するために、１×１０⁶個のｃｉＣＥＣをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに皮下注射し、奇形腫が４－８週間で形成される。キメラを生成するために、ｃｉＣＥＣをＩＣＲ胚盤胞に注射し偽妊娠ＩＣＲ雌に移植する。Ｆ２マウスとＩＣＲマウスとをハイブリダイズさせることにより、得られたキメラマウスの生殖系伝達を特定した。全ての動物実験は広州生物医薬と健康研究院動物保護及び使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ）により承認されかつその基準に基づいて行われる。ｃｉＣＥＣで移植した後の６ヶ月以内に腫瘍が形成されず、ｍＥＳＣで移植した受容者に４－８週間後に大きな奇形腫が出現する（データは未図示）。これはｃｉＣＥＣが極めて小さい（存在すれば）腫瘍誘発可能性を有することを示す。なお、イン・ビトロ３０回の連続継代期間でｃｉＣＥＣは正常な核型を維持する（データは未図示）。イン・ビボ分化をよりよく理解するために、ｃｉＣＥＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの眼に移植する。４－８週間後、ｃｉＣＥＣで移植した後、６ヶ月以内に移植されたｃｉＣＥＣは腫瘍を形成していない（データは未図示）。

【0225】

６．ｃｉＣＥＣのウサギ損傷眼への移植

【0226】

ｃｉＣＥＣがイン・ビボ移植及び増幅の能力を有するか否かを評価するために、本発明者らはそれをデスメ膜から機械的に引っ掻かれた角膜内皮により水疱性角膜症に誘導されたウサギモデルに移植する。ウサギを２つのグループ（各グループｎ＝１０）に分け、右目をこの実験に用いる。ｃｉＣＥＣを前房に注射する（図６Ｂ第１画像）。各受容者は、１×１０⁶個（低ドーズ量）のｃｉＣＥＣ又は２×１０⁶個（高ドーズ量）のｃｉＣＥＣを受ける。未処理の正常なウサギ（図６Ｂ第４画像）とＰＢＳのみを注射したウサギ（図６Ｂ第３画像）を対照として用いる。

【0227】

操作部位に消毒及び無菌被覆を行った後、スリットナイフ（中国上海Ａｌｃｏｎ Ｓｕｒｇｉｃａｌ）で１２時中央の６ｍｍ強膜角膜切断を行い、粘弾性剤（Ｈｅａｌｏｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）を前房に注入する。角膜表面をマーキングペン（（Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）Ｄｅｖｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）で画線した後、３０ゲージのニードル（Ｔｅｒｕｍｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて角膜中心にデスメ膜除去術（ｄｅｓｃｅｍｅｔｏｒｈｅｘｉｓ）のための直径６．０ｍｍの円形孔口を生成し、眼の前房からデスメ膜を除去する。涙道洗浄器（Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｗｅｉｇａｏ）を用いてデスメ膜から角膜内皮を機械的に引っ掻く。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用してＦｓｐ－ｃｉＣＥＣを解離し、１×１０⁷個の細胞／ミリリットルの密度でＰＢＳに再懸濁し氷上で保持する。前房をＰＢＳで三回洗浄する。

【0228】

この手順の後に、２６ゲージのニードルを使用して、１００μｌの、１００μＭＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（それは細胞のインプラント部位への付着を促進する）（ＲＯＣＫ阻害剤、Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含有する基礎ＤＭＥＭ中の１×１０⁶個のｃｉＣＥＣを右眼の前房に注射する（図６Ｂ、第１画像）。

【0229】

前記手順の後、ウサギを伏臥位置で２－３時間放置する。各手術眼は外部検査により一週間に二回又は三回検査し、かつ手術後に１、３、５、７、１４、２１、３５及び４２日目に写真を撮影する。スリットランプ写真は、注射後のＣＥＣ様細胞グループ（ｃｉＣＥＣグループ）角膜の透明度が顕著に改良され、かつ瞳孔及び虹彩テクスチャが見られることを示す。約７日後に、角膜が明らかに透明になり、対照グループにおいて角膜混濁及び基質浮腫が依然として深刻である（図６Ｂは左からそれぞれ第１画像及び第３画像である）。Ｖｉｓａｎｔｅ ＯＣＴもＣＥＣ様細胞を注射した後に角膜厚さが急速に減少することを示す（図６Ｃ、各画像はそれぞれ上方の図６Ｂの画像に対応する）。共焦点顕微鏡画像により、ｃｉＣＥＣグループ中のデスメ膜上の多角形細胞の完全被覆が確認された（図６Ｄ、第１の画像。図６Ｄの各画像はそれぞれ上方の図６Ｂ及び図６Ｃの画像に対応する）。ｃｉＣＥＣグループにおいて１、３、５、７、１４、２１、３５及び４２日目の平均角膜厚さは未処理対照グループの厚さよりも顕著に小さいことが分かる（図６Ｅ）。スリットランプ写真は１、３、７、１４、２１及び２８日目にｃｉＣＥＣグループの角膜の透明度が顕著に改良されたことを示す（図７）。
実施例４：別の実施例に基づいて線維芽細胞からｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣを生成する

【0230】

Ｍ６リプログラミング培地の調製

【0231】

基礎培地は、ノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を含み、かつ小分子Ｃｈｉｒ９９０２１（３μＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、フォルスコリン（１０μＭ）、ＶＰＡ（５００ｍＭ）、ＥＰＺ００４７７７（５μＭ）及び５－アザ－ｄＣ（０．５μＭ）が補充されている。培地を３０分間振とうして全ての成分を完全に溶解させる。

【0232】

分化培地の調製

【0233】

ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）にＳＢ４３１５４２（５μＭ）及びＣＫＩ－７（５μＭ）が補充されている。

【0234】

線維芽細胞からのＮＣＣの化成

【0235】

ＭＥＦを５×１０⁴個の細胞／ウェルで６ウェル組織培養プレート上の線維芽細胞培地に接種した。培養プレートをフィブロネクチン又はラミニンを２時間を超えてプレコーティングする。一晩培養した後、培地をＭ６化学培地で交換し、２日ごとに更新する。ＮＣＣ様細胞は３－５日目に出現し、かつ増加した。７－１０日間誘導した後、ＦＡＣＳ分取を行ってＷｎｔ１⁺細胞を収集する。

【0236】

マウスｃｉＮＣＣからＣＥＣ様細胞を化学的に誘導する

【0237】

１２－１６日目に、Ｍ６化学培地をＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７培地で置換し、２日ごとに更新する。内皮様細胞クラスタは８日目に出現しかつ増加し、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性クラスタは１２日目に出現する。ＣＥＣ様細胞は２０日目に早く出現する。３０日目から３５日目までの期間に、ＣＥＣ様細胞コロニーをカウントするか又はさらに検出する。

【0238】

ｃｉＮＣＣ分化

【0239】

約５×１０³個のｃｉＮＣＣをＮＣＳＣ培地を含有する２４ウェル培養プレート中のラミナインでコーティングされたカバーガラスに接種し、一番目の２４時間持続する。２４時間後、細胞に分化条件を経験させる。ニューロン分化について、培地をニューロン分化培地（ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含まないＮＣＣ培地であり、それに２００μＭのアスコルビン酸、２μＭのｄｂ－ｃＡＭＰ、２５ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＮＴ３及び５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦが添加されている）に切り替える。２－３日ごとに半分の培地を交換する。分化後１０日目～２０日目に特異的ニューロンマーカーを分析する。オリゴデンドロサイトに分化するために、５μＭのレチノイン酸及び２００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈの存在下で、細胞を１日間培養して２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び２００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨの存在下で３－５日間培養する。次に、それを４０ｎｇ／ｍｌのＴ３、２００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ、１ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、５ ｍＭのｄｂ－ｃＡＭＰ及び１０ｎｇ／ｍｌのＮＴ３を含有する分化培地で８－１２日間培養する。培地は一日ごとに更新する。アストロサイト分化について、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を分化培地に添加して８－１２日間持続し、培地を一日ごとに交換する。

【0240】

結果

【0241】

角膜内皮がＮＣＣに由来することに鑑み、本発明者らは小分子を用いてマウス線維芽細胞をＣＥＣ様細胞にリプログラミングする２段階法を設計した。第１段階はマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をガイドしてｃｉＮＣＣに化学的リプログラミングすることである。線維芽細胞をｃｉＮＣＣに転換する潜在能力を有する小分子をスクリーニングするために、本発明者らは系統追跡実験を行って転換過程を追跡し、出発ＭＥＦからいかなるＮＣＣ又は前駆細胞を排除する（図８Ａ、図１５Ａ）。Ｗｎｔ１－Ｃｒｅ遺伝子組換えマウスは、ＮＣ発育の系統追跡レポーターモデルであることが確認された。Ｗｎｔ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおいて、ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質はＮＣＣにおいて忠実に発現する。したがって、Ｅ１３．５にあるＷｎｔ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスからＭＥＦを分離する。ＮＣＣ集団はｔｄＴｏｍａｔｏがマーカーされているため、本発明者らは蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を行ってｔｄＴｏｍａｔｏ^-集団を収集していかなるＮＣＣ又は前駆細胞（精製細胞は以下にＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ^-ＭＥＦと呼ばれる、図１５Ｂ）を排除する。本発明者らはＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ^-ＭＥＦがさらに他のＮＣＣマーカー（Ｓｏｘ１０、Ｐ７５、Ｐａｘ３、Ｈｎｋ１及びＡＰ２αを含む）に対して陰性を呈することを確認した（図１５Ｃ、Ｄ）。また、これらのＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ^-ＭＥＦは典型的なＮＳＣマーカー（Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６及びネスチンを含む）に対して陰性を呈する（データは未図示）。

【0242】

報告によると、いくつかのリプログラミングを強化するための小分子は、系譜リプログラミングを促進することができる。ＭＥＦからｃｉＮＣＣを生成するために、（１）ＮＣＣ発育に対するエピジェネティクス制御及びシグナル伝達調節、及び（２）強化された神経系譜リプログラミングに基づいて、本発明者らは一組の１６種類の小分子を候補物として選択した。最初に、ＮＣ系譜リプログラミングに用いられる小分子候補は、Ｃｈｉｒ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－β阻害剤）及びフォルスコリン（ｃＡＭＰアゴニスト）を含む三つの種類のリプログラミング因子に絞ることに成功した（図８Ｂ）。後続のスクリーニング及び最適化について、本発明者らはＶＰＡ（ＨＤＡＣ阻害剤）、ＥＰＺ００４７７７（ＤＯＴ１Ｌ阻害剤）及び５－アザ－ｄＣ（ＤＮＡメチル化阻害剤）がＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞に対する誘導をさらに強化することを見出した（図８Ｃ）。この研究において、本発明者らは、化学成分が決定された培地と上記６種の小分子の混合物との組み合わせ（以下Ｍ６と呼ばれる）を使用してＭＥＦをｃｉＮＣＣにリプログラミングした（図８Ｄ）。Ｍ６培地で処理する場合、早く３日目に各細胞におけるＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏの発現が観察された（図８Ｅ）。Ｍ６リプログラミング培地は３．９７％でＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞を効果的に誘導した（図８Ｆ）。５－７日目に、Ｍ６リプログラミング培地で誘導されたＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺コロニーが観察された（図８Ｇ、図１５Ｅ）。これらのＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞及びコロニーは初代ＮＣＣ（ｐＮＣＣ）に類似する典型的な形態を有する。約１２日目に、小さなコロニーにおいてＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞数が顕著に増加した（図８Ｈ）。Ｗｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ＮＣＣの生成効率はＴＦｓ３１を用いてヒト線維芽細胞を転換する場合と同様であるが、この研究において２－５％の細胞のみがＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性を呈する。これらの結果は、異なるバッチのＭＥＦ（ｎ＝８）において再現することができ、異なる遺伝的背景（Ｃ５７ＢＬ／６、１２９×Ｃ５７ ＢＬ／６及び１２９）を有するＭＥＦもＭ６条件によりｃｉＮＣＣに転換することができる。総合すると、これらの結果は、Ｍ６がＭＥＦをｃｉＮＣＣにリプログラミングすることができることを示す。
実施例５：実施例４及び追加の研究で得られたｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣに対する特徴付け

【0243】

転換されたｃｉＮＣＣに対する特徴付け

【0244】

ｃｉＮＣＣのリプログラミング過程は、初期段階（０－７日目）及び増幅段階（７－１２日目）の２段階を有する。第１段階は、リプログラミング培地でＭＥＦを培養してエピジェネティクス活性化を開始することである。明らかなエッジを有する小さなＮＣＣ様クラスタが少数出現する。第２段階は、決定された小分子培地でエピジェネティクス活性化された細胞を培養することである。大部分のクラスタは第２段階で増幅し、徐々に成長する。

【0245】

ｃｉＮＣＣを取得するために、本発明者らはＦＡＣＳを行ってＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞を収集した。形成されたｃｉＮＣＣは、Ｎ２、Ｂ２７、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含む通常のＮＣＣ増幅培地で連続的に増殖した。形態上、Ｐ３にあるＭ６で誘導された細胞は単層培養において典型的なＮＣＣ特徴を維持した（図９Ａ）。継代した後、ｃｉＮＣＣは形態が均一になる。Ｍ６で誘導されたＷｎｔ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺細胞をさらに特徴付けるために、本発明者らはその遺伝子発現を検査しようとした。結果は、ｃｉＮＣＣが、Ｐ７５、ＨＮＫ１、ＡＰ２α及びネスチンを含む様々なＮＣＣマーカーを発現することを示した（図９Ｂ）。なお、本発明者らはｃｉＮＣＣが末梢ニューロン、シュワン細胞及びその他などに向かって分化する潜在能力を有するか否かを試験した。ｃｉＮＣＣの分化について、これらの細胞を異なる系譜分化培地で培養した。２－４週間培養した後、免疫染色によりマーカー発現を評価することにより、分化細胞を検査した。注意すべきことは、ｃｉＮＣＣはさらにニューロン（Ｔｕｊ１及びペリフェリンを含む）特異的マーカーを発現する細胞を生成することができる（図９Ｃ）。メラニン細胞分化について、２－３週間誘導した後にメラニン細胞が観察された（図９Ｃ）。免疫染色結果は、ｃｉＮＣＣがシュワン細胞に分化できることを示した。誘導されたシュワン細胞はＧＦＡＰ⁺及びＳ１００β⁺細胞である（図９Ｄ）。これらのｃｉＮＣＣのさらなるイン・ビトロ分化は、間葉系系譜を生成し、典型的な間葉系細胞形態が得られる。本発明者らの結果は、これらのｃｉＮＣＣ由来間葉系細胞が骨芽細胞、前脂肪細胞及び軟骨細胞を生成することができることを示した（図９Ｅ）。共通して、これらのデータは、本発明者らのｃｉＮＣＣが誘導されて末梢神経系系譜及び間葉系系譜に向けて分化することができることを示した。

【0246】

動物モデルに移植してｃｉＣＥＣ機能を示す

【0247】

ｃｉＣＥＣがイン・ビボで角膜内皮を再生する能力を有するか否かを評価するために、本発明者らはそれを良好に確立されたウサギモデルに移植し、該モデルはデスメ膜から角膜内皮を機械的に引っ掻くことにより水疱性角膜症を有する。以前の研究により、ＲＯＣＫ阻害剤を注射して補充したヒトｐＣＥＣは内皮機能が回復したことを見出した。この研究によれば、ｃｉＣＥＣとＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３６）を組み合わせて眼の前房に注射した（図１４Ａ）。受容者は、１×１０⁶個のｃｉＣＥＣを受けた。対側眼（正常）と未処理の眼（ＰＢＳ注射）を実験対照として用いた。未処理の眼に比べて、ｃｉＣＥＣ移植後、角膜浮腫の減少が非常に早い。本発明者らは、角膜の透明度が変化しないことを示す未処理の眼に比べて、移植された眼の角膜の透明度が移植後に徐々に向上することに気付いた（図１４Ｂ、図１９Ａ）。７日後、移植された眼の角膜は透明になり、未処理の眼の角膜混濁及び基質浮腫は依然として不良である。スリットランプの検査結果は、注射後に移植された眼の角膜の透明度も顕著に改良され、かつ瞳孔及び虹彩テクスチャを明らかに観察できることを示す（図１４Ｃ、図１９Ａ）。

【0248】

次に、本発明者らは移植された眼におけるｃｉＣＥＣの生存を研究した。手術後２８日目に眼球をくり抜いて移植したｃｉＣＥＣ細胞を評価する。蛍光顕微鏡法でｔｄＴｏｍａｔｏ－標識された移植細胞の存在を確認した。免疫組織化学はＺＯ－１発現を示し、移植されたｃｉＣＥＣ細胞のポンプ機能を示した（図１４Ｄ、図１９Ｃ）。前眼部のＶｉｓａｎｔｅ光干渉断層撮影（ＯＣＴ）においても、ｃｉＣＥＣ注射後に角膜厚さが減少したことが示されている（図１４Ｅ）。共焦点顕微鏡は、ｃｉＣＥＣ移植疾患モデルにおいてデスメ膜上の多角形内皮細胞の完全被覆が確認され、それは未処理のモデルにおいてその深刻な角膜混濁のため検出できなかった（図１４Ｇ）。拡大下で、２８日目に、移植されたｃｉＣＥＣは単層で角膜の後表面に緊密に接着され、未処理のモデルにおいてデスメ膜が露出しかつ検出可能なＣＥＣを有しない。

【0249】

ｃｉＣＥＣ注射後の４週間内に角膜厚さが急速に減少し、次に、次の２週間内により漸進的に減少する（図１４Ｆ、図１９Ｄ）。未処理のグループにおいて、４２日の観察過程全体において平均角膜厚さは約１２００μｍである。対照的に、移植グループにおいて迅速に減少し、未処理グループにおける平均角膜厚さよりも顕著に小さい。手術後の１４日目（Ｐ＜０．０１）、２１、２８、３５及び４２日目（Ｐ＜０．００１）に、ｃｉＣＥＣ移植グループにおける平均角膜厚さが対照グループにおける平均角膜厚さより顕著に小さいことが観察され、角膜浮腫が明らかに逆転したことを示した。これらの結果は、ｃｉＣＥＣ移植が角膜後表面に再充填されかつ自己組織化し、かつ角膜内皮を再生する能力を有することを強力に示した。

【0250】

小分子はｃｉＮＣＣのｃｉＣＥＣへの誘導を促進する

【0251】

ｃｉＮＣＣからマウスＣＥＣ様細胞を生成するために、本発明者らはさらに小分子のイン・ビトロＣＥＣ器官での発生及び維持における重要性に基づいて一組の小分子を候補物として求めた。初期スクリーニングにおいて、本発明者らはＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７がｃｉＮＣＣからＣＥＣ様細胞を誘導することができることを見出した。この２つの化合物はその後分化条件に含まれる（図１０Ａ）。ｃｉＮＣＣが成熟ＣＥＣにさらに分化できるか否かを確認するために、本発明者らはこの２種類の小分子を含有する分化培地でｃｉＮＣＣを処理した。この分化培地で７－１５日間培養した後、クラスタ外又はクラスタ内の小集団は均一で多角形形態を有する典型的な緊密な集合体を示した（図１０Ｂ）。本発明者らは、さらに、これらのコロニーが迅速に増幅し、１２－１５日目になる時、小さいクラスタが大きいクラスタに合併することを観察した（図１０Ｂ）。これらのＣＥＣ様細胞は急速に成長しかつ強い増殖能力を有する。ｃｉＮＣＣにより誘導されたＣＥＣ様細胞は六角形及び五角形細胞の単層を形成する。ＣＥＣ様細胞がｃｉＮＣＣに由来することを証明するために、本発明者らは５μＭのＳＢ４３１５４２及び５μＭのＣＫＩ－７を含有するＣＥＣ分化培地でｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＮＣＣを分化する。これらのｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＮＣＣはその後に誘導されてＣＥＣ様細胞に向けて分化することができる（図１０Ｃ）。Ｎａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素、ＡＱＰ１、ビメンチン、ＺＯ－１及びＮ－カドヘリンの発現はさらに免疫蛍光染色により検証される（図１０Ｄ）。この研究において、本発明者らはＤｉｌで標識されたアセチル化低密度リポプロテイン（Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ）の摂取によりＣＥＣ様細胞の機能を識別する（図１０Ｅ）。ＲＮＡシークエンシングにより行われたグローバル遺伝子発現解析により、ＣＥＣ様細胞と初代ＣＥＣ（ｐＣＥＣ）が類似する遺伝子発現プロフィールを共有することが示されているが、このプロフィールは初期ＭＥＦのプロフィールと異なる（図１０Ｆ）。ＴＥＭによりＣＥＣ様細胞に緊密な接続が存在することを観察した（図１０Ｇ）。リプログラミング過程をさらに監視するために、本発明者らはｑＲＴ－ＰＣＲを使用することにより一組のＮＣＣ及びＣＥＣマーカーの異なる時間での発現をさらに確認した。１２日目になると、細胞においてＮＣＣ遺伝子のロバスト発現が検出され、Ｈｎｋ１、Ｐ７５、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ９、Ｐａｘ３及びＡＰ２（図１１Ａ）を含む。また、さらにｑＲＴ－ＰＣＲによりＣＥＣ遺伝子（例えばＳｌｃ４ａ１ｃ、Ｃｏｌ８ａ１、Ｎａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素、Ａｑｐ１及びＮ－カドヘリン）の遺伝子活性化の類似運動力学を検出する（図１１Ｂ）。ｐＣＥＣでリッチな遺伝子はｃｉＣＥＣにおいて大幅にアップレギュレートされたことが知られている。線維芽細胞からＣＥＣへの転換過程を検証するために、本発明者らはＲＮＡシークエンシングを用いてトランスクリプトームを分析した（図１１Ｃ）。ｃｉＣＥＣにおいて１６種類のＣＥＣ特徴遺伝子の発現は顕著にアップレギュレートされ、ｐＣＥＣと一致する。しかし線維芽細胞特徴遺伝子は明らかにダウンレギュレートされた。注意すべきことは、誘導過程において、一組のＮＣＣマーカー遺伝子は最初にアップレギュレートされ、その後にダウンレギュレートされた。主成分分析はＭ６で処理された細胞が初期ＭＥＦと異なることを示し、これは化学的リプログラミングが顕著な転写変化を引き起こすことを示す（図１１Ｄ）。これらの結果はＣＥＣ様細胞がＣＥＣ属性が得られたことを示す。共通して、これらのデータはＳＢ４３１５４２とＣＫＩ－７の組み合わせがｃｉＮＣＣ培養において１０－１５日間内のＣＥＣの生成を効果的に促進することを示す。それらの線維芽細胞由来のＣＥＣ様細胞は、その後に化学的に誘導されたＣＥＣ様細胞（ｃｉＣＥＣ）と呼ばれる。

【0252】

線維芽細胞からｃｉＣＥＣを誘導することを実証するための系統追跡

【0253】

小分子に基づくリプログラミングの初期線維芽細胞の起源を実証するために、本発明者らは線維芽細胞特異的タンパク質１（Ｆｓｐ１）－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性線維芽細胞を精製する遺伝系統追跡ストラテジーを求めた（図１２Ａ）。Ｆｓｐ１－Ｃｒｅは系統追跡のための特異的線維芽細胞マーカーとして既に実証されている。したがって、Ｆｓｐ１－ＣｒｅマウスをＲＯＳＡ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスとハイブリダイズさせる。ＭＥＦはＥ１３．５にある遺伝子組換えマウス（Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ）から分離され、線維芽細胞はｔｄＴｏｍａｔｏを特異的に発現する。これらの細胞は以下ｔｄＭＥＦと命名される（図１６Ａ）。あり得るＮＣＣ前駆細胞のＭＥＦに対する汚染を回避するために、ＦＡＣＳを行ってｔｄＴｏｍａｔｏ⁺／Ｐ７５^-集団を収集する（図１２Ｂ）。これらのｔｄＭＥＦは、全てのＮＣＣマーカー（Ｐ７５、ＨＮＫ１、Ｓｏｘ１０及びＡＰ２αを含む）に対して陰性を呈する（図１２Ｃ）。

【0254】

その後、これらのｔｄＭＥＦを上記Ｍ６培地で誘導する。ｃｉＮＣＣ誘導期間にｔｄＴｏｍａｔｏを発現する上皮クラスタが観察された（図１２Ｄ、図１６Ｂ）。Ｆｓｐ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＮＣＣを継代させ、ＮＣＣ増殖培地で培養してさらなる実験に供した（２週間誘導後）。免疫蛍光分析により、これらのＦｓｐ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＮＣＣがＮＣマーカーＰ７５、ＨＮＫ１、ＳＯＸ１０及びＡＰ２αに対して陽性を呈することが実証され、それはＦｓｐ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＮＣＣのコロニーがＣＥＣ様細胞に向かって分化したことを示す（図１６Ｃ）。なお、Ｆｓｐ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＮＣＣはｔｄＴｏｍａｔｏ⁺ｃｉＣＥＣに分化することができる（図１６Ｄ）。免疫染色により、本発明者らは分化したＣＥＣ様細胞がＮａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素、ＡＱＰ１、ラミニン、ＺＯ－１、Ｎａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素及びｔｄＴｏｍａｔｏを共発現することを見出した（図１２Ｅ）。注意すべきことは、これらの全てのｃｉＣＥＣはさらにｔｄＴｏｍａｔｏを発現し、それは線維芽細胞からの転換を示す。それらの結果により、ｃｉＮＣＣ及びｃｉＣＥＣが２段階系譜リプログラミングにより線維芽細胞から転換することが明らかに実証された。

【0255】

化学品により生成されたｃｉＣＥＣが人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）段階を避ける

【0256】

本発明者らの系譜リプログラミングのメカニズムは、化学的方式でリプログラミングされたｉＰＳＣに類似する可能性があるため、ｃｉＣＥＣがｉＰＳＣ段階を経験するか否かを評価しようとした。本発明者らは、ＭＥＦからのｉＰＳＣ化学的リプログラミングとｃｉＣＥＣ誘導との比較を行い、該ＭＥＦはＯｃｔ４プロモーターにより駆動されるＧＦＰ（ＯＧ２）レポーターを携帯するマウスに由来する。本発明者らは、Ｍ６で処理されたこれらのＭＥＦ形態に特徴的な間葉系から上皮への転換（ＭＥＴ）を経て、６日目に近い時に小さい細胞コロニーが徐々に出現することを観察した（図１７Ａ）。これらの細胞コロニーはＮＣＣマーカーＳｏｘ１０を発現する（図１７Ｂ）。対照的に、本発明者らの方法に基づいてＭＥＦからｃｉＣＥＣへの過程全体において任意のＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞が観察されていない（図１７Ｃ、３Ｄ）。なお、イン・ビトロでの十回の連続継代期間に、ｃｉＣＥＣは正常な核型を維持する（図１７Ｅ）。腫瘍発生の潜在的なリスクを評価するために、合計５×１０⁶個のｃｉＣＥＣと２×１０⁶個のマウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植する。注意すべきことは、ｃｉＣＥＣで移植した後、６ヶ月以内に腫瘍が形成されず、ＥＳＣで移植したマウスにおいて４－８週間後に大きな奇形腫が出現することである（データは未図示）。この結果は、ｃｉＣＥＣが造腫瘍性を有しないことを示す。そのイン・ビボでの分化をよりよく理解するために、ｃｉＣＥＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの眼の前房に移植した。４－８週間後、移植後の６ヶ月以内に、移植されたｃｉＣＥＣは腫瘍を形成しない。これらの結果は、本発明者らの方法がＭＥＦをｃｉＮＣＣに直接リプログラミングし最終的にｃｉＣＥＣにリプログラミングすることができ、同時にｉＰＳＣ段階を避けることを示す。

【0257】

ｃｉＣＥＣイン・ビトロ長期増幅能力

【0258】

イン・ビトロで維持培養されたＣＥＣの形態及び正常な生理機能が挑戦的なことであることが証明された。ｃｉＣＥＣを大規模に適用できることを目的として、本発明者らは線維芽細胞から大量の機能的ｃｉＣＥＣを生成できるか否かを試験した。本発明者らの観察結果に基づいて、即ちＳＢ４３１５４２（５μＭ）及びＣＫＩ－７（５μＭ）を含む培地で培養されたｃｉＣＥＣは小さい六角形細胞（上皮間葉転換様細胞がない）（図１８Ａ）であり、本発明者らはＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７がイン・ビトロでのｃｉＣＥＣの成長を促進すると仮定した。１：６の比率でｃｉＣＥＣを連続的に継代することによりｃｉＣＥＣのイン・ビトロ長期増幅能力を評価し、表現型がＰ３とＰ３０との間では類似することを見出した（図１３Ａ、Ｂ）。この結果は、ＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７がｃｉＣＥＣ増幅を強力に促進することを示した。小分子に基づく培地において、これらのｃｉＣＥＣは自体が六角形形態を有する同質細胞集団であることを少なくとも３０世代（Ｐ３０）保持する。また、これらのｃｉＣＥＣを１０世代にクローン的に培養してかつ一致する形態を示すことに成功した。免疫染色結果は、Ｐ３にあるｃｉＣＥＣにおけるＫｉ ６７陽性細胞比率がＰ３にあるｐＣＥＣより高いことを示す（図１８Ｂ）。ｃｉＣＥＣは高度な増殖性を有し、Ｐ１、Ｐ３及びＰ６にあるこれらの細胞の２４．６％、３７．８％、４８．１％はＥｄＵ組み込みを示す（図１８Ｃ）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色されたＦＡＣＳ分析の結果は、細胞周期分布（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期）がＰ３にあるｃｉＣＥＣに対して４６．３０％、４５．１１％及び８．５９％となり、Ｐ３にあるｐＣＥＣに対して６７．３０％、２１．５０％及び１１．２０％となることを示す（図１８Ｄ）。それは大きな同質コロニーに迅速に増幅し、集団増倍時間は２２．３±３．７時間である（図１３Ｃ）。注目すべきことは、Ｐ２～Ｐ１０にあるｃｉＣＥＣの表面に大きな「液泡様」構造を発見したことである（図１３Ｄ）。細胞が連続的に増殖する場合、Ｐ ２０でこれらの液泡様構造が消える。注意すべきことは、Ｐ３０にあるｃｉＣＥＣは典型的なＣＥＣマーカーも表現し、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰ酵素、ＡＱＰ１及びＺＯ－１を含む（図１３Ｅ）。イメージングによりスクラッチにより生成された隙間に移動する能力を分析する場合、ｐＣＥＣに比べて、ＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７を含む培地で培養された異なる継代数にあるｃｉＣＥＣはより強い増殖及び移動能力を示す（図１８Ｅ、Ｆ）。共通して、これらの結果はＳＢ４３１５４２及びＣＫＩ－７がｃｉＣＥＣイン・ビトロ長期増幅についてロバストでかつ普遍的効果を有することを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-26

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするための方法であって、以下のステップを含む方法：
ステップ（ａ）として、第１組のリプログラミング因子の存在下で前記第１タイプの細胞を培養して、第２タイプの細胞を提供すること、ここで、前記第１組のリプログラミング因子は以下を含む：
（１）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤、又は、
（２）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、形質転換成長因子（ＴＧＦβ）阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤、及び、以下から選択される更なるリプログラミング因子：塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＢＭＰ４若しくはそれらの組み合わせ、
並びに、
ステップ（ｂ）として、第２組のリプログラミング因子の存在下で、前記ステップ（ａ）で得られた前記第２タイプの細胞を培養して、第３タイプの細胞を提供すること、ここで、前記第２組のリプログラミング因子は以下を含む：
（１）ＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤、又は、
（２）ＴＧＦβ阻害剤、カゼインキナーゼ１阻害剤、及び、以下から選択される更なるリプログラミング因子：ＢＭＰ４、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、若しくはそれらの組み合わせ。

【請求項2】

前記第１組のリプログラミング因子は、（ａ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤、（ｂ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤及びｂＦＧＦ、又は、（ｃ）ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、環状ＡＭＰ誘導剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって構成される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、Ｌｉ₂ＣＯ₃及びＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＴＤ１１４－２、ケンパウロン、ＴＷＳ１１９、ＣＢＭ１０７８、ＳＢ２１６７６３、３Ｆ８（ＴＯＣＲＩＳ）、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＦＲＡＴｉｄｅ、インジルビン－３’－オキシム及びＬ８０３からなる群から選択される、並びに／又は、
前記ＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、Ｒｅｐｓｏｘ、６１６４５２、ＬＤＮ１９３１８９、Ａ８３０１、ＧＷ７８８３８８、ＳＤ２０８、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ＳＢ５０５１２４及びギニストからなる群から選択される、並びに／又は、
前記環状ＡＭＰ誘導剤は、フォルスコリン、ＩＢＭＸ、ロリプラム、８ＢｒｃＡＭＰ、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＮＫＨ４７７、ジブトイルモノシクロアデニル酸（ＤＢｃＡＭＰ）、Ｓｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰｓである、並びに／又は、
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、５－アザ－ｄＣ、５－アザシチジン及びＲＧ１０８からなる群から選択される、並びに／又は、
前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤はＥＰＺ００４７７７である、並びに／又は、
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット、デプシペプチド、Ｔｒａｐｏｘｉｎ、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ、ＦＲ９０１２２８及び酪酸塩からなる群から選択される、並びに／又は、
前記カゼインキナーゼ１阻害剤はＣＫＩ－７である、
請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第１タイプの細胞は体細胞若しくは幹細胞である、及び／又は、前記第２タイプの細胞は幹細胞である、及び／又は、前記第３タイプの細胞は体細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

請求項１に記載の方法であって、ここで、
前記第１タイプの細胞は、
線維芽細胞及びヒト脱落腎臓上皮細胞から成る群から選択される体細胞である、若しくは、
ヒト臍帯間葉系幹細胞、ヒト胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から成る群から選択される幹細胞である、
及び／又は、
前記第２タイプの細胞は、神経堤細胞様細胞（ＮＣＣ様細胞）である、
及び／又は、
前記第３タイプの細胞は、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞である、
方法。

【請求項6】

前記線維芽細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）、成人線維芽細胞（ＨＡＦ）、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ＮＣＣ様細胞はＰ７５、Ｈｎｋ１、ＡＰ２α及び／又はＳｏｘ１０陽性を呈する、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記第１タイプの細胞は前記第１組のリプログラミング因子の存在下で（ａ）少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日間、若しくは、（ｂ）２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３若しくは１２日間未満培養する、及び／又は、
前記第２タイプの細胞は前記第２組のリプログラミング因子の存在下で（ａ）少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日間、若しくは、（ｂ）２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３若しくは１２日間未満培養する、
請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記ＣＥＣ様細胞はＺＯ－１及びＮａ⁺／Ｋ⁺－ＡＴＰ酵素陽性を呈する、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

前記方法は、ステップ（ｂ）を開始する前にステップ（ａ）から得られた細胞を洗浄することをさらに含む、又は、
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間に洗浄ステップが存在しない、
請求項１に記載の方法。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法のステップ（ａ）に基づいて生成された化学誘導ＮＣＣ様細胞集団。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法に基づいて生成された化学誘導角膜内皮細胞様細胞（ＣＥＣ様細胞）集団。

【請求項13】

請求項１１に記載のＮＣＣ様細胞又は請求項１２に記載のＣＥＣ様細胞を含む組成物。

【請求項14】

必要とする被験者において、機能不全又は損傷した角膜内皮細胞に関連する疾患又は病状の治療に使用するための有効量の請求項１２に記載のＣＥＣ様細胞又は請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記被験者はヒトである、請求項１４に記載の使用のための有効量のＣＥＣ様細胞又は組成物。

【請求項16】

前記疾患又は病状は、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、後部多形性角膜変性症、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜色素変性症、緑内障、角膜ジストロフィー、コンタクトレンズの使用、白内障手術及び角膜移植における後期内皮不全からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための有効量のＣＥＣ様細胞又は組成物。

【請求項17】

グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤及び環状ＡＭＰ誘導剤を含む第１組のリプログラミング因子及びＴＧＦβ阻害剤及びカゼインキナーゼ１阻害剤を含む第２組のリプログラミング因子を含む、第１タイプの細胞を第３タイプの細胞にリプログラミングするためのキット。

【請求項18】

前記第１組のリプログラミング因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＢＭＰ４又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１７に記載のキット。

【国際調査報告】