特表2023-554350ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）を検出するためのリアルタイムＰＣＲ方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）を検出するためのリアルタイムＰＣＲ方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6888 20180101AFI20231220BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20231220BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20231220BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20231220BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6888 Z ZNA
C12N15/35
C12M1/00 A
C12M1/34 Z
C12Q1/6851 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536078
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-08-10
(86)【国際出願番号】 US2021063668
(87)【国際公開番号】W WO2022133005
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/126,939
(32)【優先日】2020-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/211,607
(32)【優先日】2021-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500049716
【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アミニ・バビル・オリャエ，サマド
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
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4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡをコードするＤＮＡを検出するためのプライマープローブの組み合わせを提供する。内在性陽性対照も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；
ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；
ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；
ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；
ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；
ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；並びに
ｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項2】
任意選択により、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第２の組成物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第１の組成物並びに配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第２の組成物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びに
ｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ
からなる群から選択される、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するための試薬。
【請求項6】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する、請求項５に記載の試薬。
【請求項7】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８の１つ以上は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ／又は３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）若しくはＺＥＮ－ＩＢのいずれか及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する、請求項５に記載の試薬。
【請求項8】
前記プライマープローブの組み合わせは、前記試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質及び／又は非構造（ＮＳ）タンパク質をコードするＤＮＡを検出する、請求項５に記載の試薬。
【請求項9】
内在性陽性対照プライマーの組み合わせとの組み合わせにおける、請求項５に記載の試薬。
【請求項10】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む、請求項５に記載の試薬。
【請求項11】
プライマープローブの組み合わせを含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するためのアッセイにおいて内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせとして使用するための試薬。
【請求項12】
前記プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する、請求項１１に記載の試薬。
【請求項13】
配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する、請求項１１に記載の試薬。
【請求項14】
配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、請求項１３に記載の試薬。
【請求項15】
ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するための内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを検出するためのプライマープローブの組み合わせ。
【請求項16】
ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びに
ｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ
からなる群から選択される、請求項１５に記載のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを検出するためのプライマープローブの組み合わせ。
【請求項17】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する、請求項１６に記載のプライマープローブの組み合わせ。
【請求項18】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８の１つ以上は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ／又は３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）若しくはＺＥＮ－ＩＢのいずれか及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する、請求項１６に記載のプライマープローブの組み合わせ。
【請求項19】
試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質及び／又は非構造（ＮＳ）タンパク質をコードするＤＮＡを検出する、請求項１５に記載のプライマープローブの組み合わせ。
【請求項20】
配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する、請求項１５に記載の試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するための内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせ。
【請求項21】
配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する、請求項２０に記載の内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせ。
【請求項22】
配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、請求項２０に記載のプライマープローブの組み合わせ。
【請求項23】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８を含む内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて検出するためのプライマープローブの組み合わせであって、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有し、及び配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、プライマープローブの組み合わせ。
【請求項24】
ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；
ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びに
ｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ
からなる群から選択される、ＢＰＶ－３をコードするＤＮＡを検出するプライマープローブの組み合わせと、
任意選択により、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと
を含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡ汚染を検出するためのキット。
【請求項25】
試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの存在又は非存在を決定するための方法であって、１）試験試料、陽性対照、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡ、核酸増幅試薬、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）、並びに
ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；並びに
ｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）
からなる群から選択される、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせを含む反応混合物；
２）前記反応混合物を定量的ＰＣＲ技術に供して、標的配列のコピーを得る工程；
３）蛍光シグナルの増加を測定する工程
を含み、蛍光シグナルの増加は、前記試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの存在を示す、方法。
【請求項26】
前記蛍光レポーター色素は、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、及び前記非蛍光クエンチャーは、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）又はＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
１つ以上の陰性抽出対照、テンプレートなし対照、陽性抽出対照、陽性対照及び／又は阻害対照をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
検出の感度又は分析限界は、１反応あたり２２ゲノムコピーである、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
試料の検出限界は、１反応あたり２５ゲノムコピーである、請求項２５に記載の方法。
【請求項30】
ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的な前記プライマープローブの組み合わせは、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）の非構造（ＮＳ）タンパク質及び／又は構造カプシド（ＶＰ）タンパク質をコードするＤＮＡを検出する、請求項２５に記載の方法。
【請求項31】
ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的な前記プライマープローブの組み合わせは、１４４ｂｐの断片を増幅する、請求項２５に記載の方法。
【請求項32】
ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的な前記プライマープローブの組み合わせは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の組み合わせを含み、配列番号９は、５’末端に６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項33】
内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項34】
前記プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
ＰＣＲ反応においてウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの１Ｅ３～１Ｅ８ゲノムコピーを定量化するための方法であって、１）試験試料の抽出ＤＮＡ、陽性対照、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡ、核酸増幅試薬、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）、並びに
ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；
ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；並びに
ｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）
からなる群から選択される、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせを含む反応混合物と；
２）前記反応混合物を定量的ＰＣＲ技術に供して、標的配列のコピーを得る工程と；
３）蛍光シグナルの増加を測定する工程と
を含む方法。
【請求項38】
前記方法の検出限界（ＬＯＤ９５％）は、１反応あたり２７ゲノムコピーのウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡであり、９５％信頼区間は、１反応あたり２２及び３４ゲノムコピーである、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記方法の直線性は、０．９８以上の相関係数（Ｒ２）及び９０～１１０％のＰＣＲ増幅効率を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
２５％以下の量のＣＶ％である併行精度値を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
３０％以下の量のＣＶ％である室内再現精度値を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項42】
アッセイのダイナミックレンジ全体にわたって許容基準値（ＳＴ）の±３０％以内の真度値を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項43】
併行精度で≦２５％、室内再現精度で≦３０％の量のＣＶ％である定量限界及び予想される標準基準値の±３０％以内の真度の許容基準を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項44】
併行精度で≦２５％、室内再現精度で≦３０％の量のＣＶパーセント及び最適化された条件の量の平均の±３０％の、試験された組み合わせマトリックス条件の量の平均の真度を有する頑健性を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項45】
テンプレートなし対照、陽性対照、陰性抽出対照、陽性抽出対照、阻害対照、内在性陽性対照及び標準の１つ以上を含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２０年１２月１７日に出願の米国仮特許出願第６３／１２６，９３９号明細書及び２０２１年６月１７日に出願の米国仮特許出願第６３／２１１，６０７号明細書の利益を主張するものであり、これらは、本明細書に完全に記載されているかのようにその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０２１年１２月９日に作成されたＡ－２７４１－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイル（サイズは、６ｋｂである）として提供される。本配列表の電子フォーマットにおける情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本発明は、バイオ医薬品製造の分野に関する。特に、本発明は、任意選択の内部対照を用いた試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡ汚染の定性的又は定量的検出のためのＰＣＲアッセイを提供する。
【背景技術】
【0004】
細胞培養プロセスを使用して治療用生物学的製剤を製造することは、ウイルス汚染物質を伝播するという固有のリスクを伴う。このような汚染物質は、材料及び装置、製造中の動物由来の試薬の使用並びにＧＭＰプロセスの失敗による製造システムの汚染を含む多くの原因から発生する可能性がある。ウシ血清（ＦＢＳ）などの動物由来の原料は、細胞培養に基づく製造プロセスの構成要素として使用されることがあり、バイオマニュファクチャリングプロセスにおけるウシ由来のウイルス汚染の主な汚染源の１つである。哺乳動物細胞に由来する生物学的治療薬中に外来性物質が存在しないことを保証する規制上の健康の要件を満たすために、バイオ製造業者は、ウイルス汚染を検出、除去及び／又は不活化するための措置を講じる必要がある。原材料は、使用前にウイルス汚染を試験し、是正措置を講じることができる。製造される生物学的分子に応じて、専用のウイルス不活化及び除去工程を下流の精製プロセスに加えて、生物学的治療薬のウイルス安全性を確保することができる。
【0005】
パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科には、まとめてパルボウイルスとして知られている、Ｔ＝１の二十面体対称性を有する小さい非エンベロープカプシドを有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスが含まれる。それらの直径は、１８～２６ｎｍの範囲である。ウイルスカプシドは、２つの主要なタンパク質、非構造（ＮＳ）タンパク質及び構造カプシド（ＶＰ）タンパク質をコードする約５ｋｂのゲノムを包含する。パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスは、広範囲の宿主に感染し、２つの亜科、パルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）及びデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）に分けられる。これらは、それぞれ脊椎動物及び節足動物の宿主に感染する。
【0006】
ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）は、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科、エリスロパルボウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属（有蹄類動物エリスロパルボウイルス１（Ｕｎｇｕｌａｔｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ １）の種）に属する。ＢＰＶ－３は、ウシに感染することが知られているが、その発症機序及び臨床症状は、依然として不明である。
【0007】
Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（９ ＣＦＲ１１３）における試験の要件に従い、生物製剤の製造に使用される動物由来の成分中の特定のウイルスの存在又は非存在は、動物由来の原材料を特定の指標細胞上でインキュベートすることによって評価する必要があり、その後、ウイルス誘導性細胞変性効果について観察され、血球吸着又は抗体蛍光によって試験される。ウシパルボウイルスの中で、ＢＰＶ－１は、選択された指標細胞株の少なくとも１つにおいて複製することができ、９ ＣＦＲ １１３試験によって検出することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、ＢＰＶ－３複製を支持する許容細胞株は、これまで特定されておらず、したがって日常的な９ ＣＦＲ１１３試験によって検出することができない。ＢＰＶ－３は、数年前に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって検出されたが、入手可能な情報が限られている新しく出現したウイルスのままである。従来の細胞培養に基づくウイルス試験は、ＢＰＶ－３の複製を支持することができず、したがって、分子生物学アッセイは、ＢＰＶ－３ゲノムＤＮＡを検出するための必須の代替方法である。細胞培養に基づく製造におけるＢＰＶ－３の影響は、依然として不明である。細胞培養に基づく製造からの、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び／又はＦＢＳを含有する未処理の非ＧＭＰバルク採取試料などの原材料中のＢＰＶ－３ゲノムＤＮＡの存在又は非存在を検出するための迅速且つ特異的な方法が必要とされている。本明細書に記載される本発明は、この必要性に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；並びにｅ）配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、任意選択により、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第２の組成物を含む。一実施形態において、組成物は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、組成物は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第１の組成物並びに配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第２の組成物を含む。
【0010】
本発明は、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｅ）配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせからなる群から選択される、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）をコードするＤＮＡを検出するための試薬を提供する。
【0011】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。関連する実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８の１つ以上は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ／又は３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）若しくはＺＥＮ－ＩＢのいずれか及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質及び／又は非構造（ＮＳ）タンパク質をコードするＤＮＡを検出する。一実施形態では、試薬は、内在性陽性対照プライマーの組み合わせとの組み合わせにおけるものである。一実施形態では、試薬は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む。
【0012】
本発明は、プライマープローブの組み合わせを含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するためのアッセイにおいて、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせとして使用するための試薬を提供する。関連する実施形態では、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する。一実施形態では、配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。関連する実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、試薬は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む。
【0013】
本発明は、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するための内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを検出するためのプライマープローブの組み合わせを提供する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２又は配列番号１５は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８の１つ以上は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ／又は３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）若しくはＺＥＮ－ＩＢのいずれか及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質及び／又は非構造（ＮＳ）タンパク質をコードするＤＮＡを検出する。一実施形態では、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせを、上記のように、試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するために使用されるプライマープローブの組み合わせと組み合わせて使用する。関連する実施形態では、配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。関連する実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。
【0014】
本発明は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡをコードするＤＮＡを、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８を含む内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて検出するためのプライマープローブの組み合わせであって、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有し、及び配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、プライマープローブの組み合わせを提供する。
【0015】
本発明は、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｅ）配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びに任意選択の配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせからなる群から選択される、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）をコードするＤＮＡを検出するプライマープローブの組み合わせを含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のＢＰＶ－３ゲノムＤＮＡ汚染を検出するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びに配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせからなる群から選択される、ＢＰＶ－３をコードするＤＮＡを検出するプライマープローブの組み合わせを含む。
【0016】
本発明は、験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの存在又は非存在を決定するための方法であって、１）試験試料の抽出ＤＮＡ、陽性対照、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡ、核酸増幅試薬、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）、並びにａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）からなる群から選択される、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせを含む反応混合物；２）反応混合物を定量的ＰＣＲ技術に供して、標的配列のコピーを得る工程；３）蛍光シグナルの増加を測定する工程を含み、蛍光シグナルの増加は、試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの存在を示す、方法を提供する。一実施形態では、蛍光レポーター色素は、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、及び非蛍光クエンチャーは、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）又はＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）である。一実施形態では、本発明は、１つ以上の陰性抽出対照、テンプレートなし対照、陽性抽出対照、陽性対照及び／又は阻害対照をさらに含む。一実施形態では、検出の感度又は分析限界は、１反応あたり２２ゲノムコピーである。一実施形態では、試料の検出限界は、１反応あたり２５ゲノムコピーである。一実施形態では、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせは、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）の非構造（ＮＳ）タンパク質及び／又は構造カプシド（ＶＰ）タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを検出する。一実施形態では、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせは、１４４ｂｐの断片を増幅する。一実施形態では、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の組み合わせを含み、配列番号９は、５’末端に６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、方法は、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせをさらに含む。関連する実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する。関連する実施形態では、配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。関連する実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。
【0017】
本発明は、ＰＣＲ反応においてウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの１Ｅ３～１Ｅ８ゲノムコピーを定量化するための方法であって、１）試験試料の抽出ＤＮＡ、陽性対照、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡ、核酸増幅試薬、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）、並びにａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）からなる群から選択される、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせを含む反応混合物と；２）反応混合物を定量的ＰＣＲ技術に供して、標的配列のコピーを得る工程と；３）蛍光シグナルの増加を測定する工程とを含む方法を提供する。一実施形態では、本方法の検出限界（ＬＯＤ９５％）は、１反応あたり２７ゲノムコピーのウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡであり、９５％信頼区間は、１反応あたり２２及び３４ゲノムコピーである。一実施形態では、本方法の直線性は、０．９８以上の相関係数（Ｒ２）及び９０～１１０％のＰＣＲ増幅効率を有する。一実施形態では、本方法は、２５％以下の量のＣＶ％である併行精度値を有する。一実施形態では、本方法は、３０％以下の量のＣＶ％である室内再現精度値を有する。一実施形態では、本方法は、アッセイのダイナミックレンジ全体にわたって許容基準値（ＳＴ）の±３０％以内の真度値を有する。一実施形態では、本方法は、併行精度で≦２５％、室内再現精度で≦３０％の量のＣＶ％である定量限界及び予想される標準基準値の±３０％以内の真度の許容基準を有する。別の実施形態では、本方法は、併行精度で≦２５％、室内再現精度で≦３０％の量のＣＶパーセント及び最適化された条件の量の平均の±３０％の、試験された組み合わせマトリックス条件の量の平均の真度を有する頑健性を有する。別の実施形態では、本方法は、テンプレートなし対照、陽性対照、陰性抽出対照、陽性抽出対照、阻害対照、内在性陽性対照及び標準の１つ以上を含む。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
本明細書に記載するように、定性的リアルタイムＰＲＣ法は、試験試料の抽出物中の潜在的なウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡ汚染を検出するために開発された。適格性パラメータ、例えば、特異性、検出限界（ＬＯＤ）、頑健性及び併行精度を用いて、アッセイの性能を試験し、確認した。
【0020】
このアッセイは、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するために最適化されたプライマープローブの組み合わせを利用する。ＢＰＶ－３ ＰＣＲプライマーは、ＢＰＶ－３ゲノム中のＢＰＶ－３非構造（ＮＳ）タンパク質及び／又は構造カプシド（ＶＰ）タンパク質をコードする遺伝子中の保存領域を増幅する。“Ｍｅｔｈｏｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＰＡ）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＲＥＶＩＳＩＯＮ：Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２１，２０１６を、アッセイの設計及び開発に参考にし、考慮した。
【0021】
本発明は、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノム（ＢＰＶ－３）をコードするＤＮＡを検出するための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）技術などの検出方法において使用することができるオリゴヌクレオチドプライマープローブの組み合わせ及び試験試料の抽出ＤＮＡ中のＢＰＶ－３の存在又は非存在を決定する方法において使用するためのオリゴヌクレオチドプライマープローブの組み合わせを提供する。
【0022】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、長さが２００ヌクレオチド未満、典型的には長さが１３～２５ヌクレオチドの範囲の短い一本鎖合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。オリゴヌクレオチドは、それらの相補オリゴヌクレオチドに結合して二重鎖を形成する。結果として、オリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在又は非存在の検出が望まれる様々な用途において一般に使用される。特に、オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するためのプライマーとして有用である。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で知られており、オリゴヌクレオチドを生成するための装置が市販されていて、要望に応じてカスタムオリゴヌクレオチドを作製するサービスプロバイダーも存在する。オリゴヌクレオチドは、より大きい核酸分子又はマイクロＲＮＡなどの天然に存在するオリゴヌクレオチドの分解からも得ることができる。
【0023】
本発明は、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【0024】
一実施形態では、組成物は、任意選択により、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第２の組成物を、上述のプライマープローブの組み合わせの１つ又は複数と組み合わせて含む。一実施形態では、組成物は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、組成物は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第１の組成物並びに配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む第２の組成物を含む。
【0025】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、５’末端に少なくとも１つの蛍光レポーター色素を含み得、且つ／又は３’末端に少なくとも１つの非蛍光クエンチャーを含み得る。一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、５’末端に少なくとも１つの蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に少なくとも１つの非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する。
【0026】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、５’末端に、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）又は２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）から選択される蛍光レポーター色素を有する。一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８は、５’末端に、蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に、蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を有する。
【0027】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、３’末端に非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、３’末端のクエンチャーは、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）並びにＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）から選択される。一実施形態では、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８の１つ又は複数は、３’末端に、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号３、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、３’末端に、ＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。
【0028】
一実施形態では、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号２２は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。
【0029】
本発明は、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡの検出に使用するための試薬を提供する。この試薬は、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの存在又は非存在を決定するために使用することができる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「試験試料」は、ＢＰＶ－３の存在又は非存在の決定が所望される抽出ＤＮＡの任意の試料を意味する。試験試料は、ＢＰＶ－３を含有することがわかっているか又は疑われるものであり得る。試験試料は、原材料、例えば生物学的治療薬の製造に使用される原材料からのものであり得る。原材料としては、動物起源のものであることがわかっているか若しくは疑われるもの、又は動物起源、特にウシ起源由来の成分を含むもの、又は動物起源、特にウシ起源を有する他の材料、例えばウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）及びウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）などの原材料と接触したことがわかっているか若しくは疑われるものが挙げられる。試験試料は、細胞培養培地、特にウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）又はウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を含有する細胞培養培地からのものでもあり得る。培地は、細胞培養前若しくは細胞培養中又は細胞培養操作から細胞培養培地を採取後に得ることができる。定期的な試料は細胞培養中に採取することができ、これは、１日に複数回、毎日、培養中の重要な時点で、特に培養の開始時及び採取時に行うことができる。試験試料は、ウシ起源の細胞及び細胞株を含む、生物学的治療薬の製造に使用される細胞株からのものでもあり得る。試験試料は、下流の処理中に採取された試料、例えば下流の精製工程の溶出液にも由来し得、試料は、原薬及び製剤から得ることができる。
【0031】
本発明は、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせからなる群から選択される試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するための試薬を提供する。一実施形態において、プライマープローブの組み合わせは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【0032】
一実施形態では、試薬は、任意選択により、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせを含む。一実施形態では、試薬は、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせをさらに含む。一実施形態では、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸を含む。一実施形態では、試薬は、配列番号７、配列番号８、配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ並びに配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせを含む。
【0033】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５又は配列番号１８の１つ又は複数は、５’末端に少なくとも１つの蛍光レポーター色素を含み得、且つ／又は３’末端に少なくとも１つの非蛍光クエンチャーを含み得る。関連する実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５又は配列番号１８の１つ又は複数は、５’末端に少なくとも１つの蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に少なくとも１つの非蛍光クエンチャーを有する。関連する実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８の１つ又は複数は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する。
【0034】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８の１つ又は複数は、５’末端に、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）又は２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）から選択される蛍光レポーター色素を有する。一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２及び配列番号１５は、５’末端に、蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に、蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を有する。
【0035】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５又は配列番号１８の１つ又は複数は、３’末端に、非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、３’末端のクエンチャーは、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）並びにＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）から選択される。一実施形態では、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８の１つ又は複数は、３’末端に、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号３は、３’末端に、ＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。
【0036】
一実施形態では、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。
【0037】
本発明は、ＢＰＶ－３の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質を標的とするプライマープローブの組み合わせを提供する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３５３５－３５５４を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３６６７－３６４３を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３５７１－３５８８を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号１の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２の核酸配列を有し、プローブは配列番号３の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１７３４－１７１６を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１６１８－１６４５を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１６６５－１６７８を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号１３の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号１４の核酸配列を有し、プローブは配列番号１５の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２８６２－２８７８を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２９６３－２９３８を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２９０２－２９３０を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号２０の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２１の核酸配列を有し、プローブは配列番号２２の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０５１－３０６８を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３１３４－３１１４を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０７９－３１０２を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号２３の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２４の核酸配列を有し、プローブは配列番号２５の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０６１－３０７９を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３１４０－３１２２を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０８１－３１０３を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号２６の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２７の核酸配列を有し、プローブは配列番号２８の核酸配列を有する。
【0038】
本発明は、ＢＰＶ－３の非構造（ＮＳ）タンパク質及び構造カプシド（ＶＰ）タンパク質を標的とするプライマープローブの組み合わせを提供する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２１９０－２２０９を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２２５６－２２３６を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２２１３－２２２６を標的とするプローブを含む。一実施形態では、フォワードプライマーは配列番号４の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号５の核酸配列を有し、プローブは配列番号６の核酸配列を有する。
【0039】
本発明は、ＢＰＶ－３の非構造（ＮＳ）タンパク質を標的とするプライマープローブの組み合わせを提供する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１３３１－１３５２を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１４７４－１４５３を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１３７７－１３９１を標的とするプローブを含む。一実施形態では、フォワードプライマーは配列番号７の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号８の核酸配列を有し、プローブは配列番号９の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１４５３－１４７４を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１５６２－１５３９を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１５０７－１５２２を標的とするプローブを含む。一実施形態では、フォワードプライマーは配列番号１０の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号１１の核酸配列を有し、プローブは配列番号１２の核酸配列を有する。
【0040】
一実施形態では、試料中のＢＰＶ－３ゲノムＤＮＡを検出するための試薬は、内在性陽性対照プライマーの組み合わせと組み合わせて使用される。本発明は、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８を含む内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡをコードするＤＮＡを検出するためのプライマープローブの組み合わせを提供する。本発明は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡをコードするＤＮＡを、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８を含む内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて検出するためのプライマープローブの組み合わせであって、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有し、及び配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、プライマープローブの組み合わせを提供する。一実施形態では、配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。
【0041】
本発明は、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを検出するための内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを検出するためのプライマープローブの組み合わせを提供する。一実施形態では、上記のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを検出するプライマープローブの組み合わせは、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ以上は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ／又は３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）若しくはＺＥＮ－ＩＢのいずれか及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質及び／又は非構造（ＮＳ）タンパク質をコードするＤＮＡを検出する。
【0042】
一実施形態では、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡを、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを検出するためのプライマープローブの組み合わせと組み合わせて検出するための内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する。一実施形態では、配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。
【0043】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８を含む内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて検出するためのプライマープローブの組み合わせであって、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有し、及び配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する、プライマープローブの組み合わせも提供される。
【0044】
本発明は、試験試料の抽出されたＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの存在又は非存在を決定するための方法を提供する。本方法は、試験試料の抽出ＤＮＡ、核酸増幅試薬、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡに選択的なプライマープローブの組み合わせ及び任意選択により内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせを含む反応混合物；反応混合物をリアルタイムＰＣＲ技術（ｑＰＣＲ）に供して、標的配列のコピーを得る工程、蛍光シグナルの増加を測定する工程を含み、蛍光シグナルの増加は、試験試料中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの存在を示す。本明細書に記載される試薬は、試験試料中のＢＰＶ－３ゲノムコピー数の定量のために、例えば試験試料１ｍｌあたりのウイルスゲノム量に関して、陽性のレベル、ウイルス量を決定するためにも使用され得る。
【0045】
反応混合物は、定量的ＰＣＲ技術を実施するために必要な成分を含む。標準的なマスターミックス、成分ミックスなどは市販されており、２×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がある。成分は、典型的にはｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ）、マグネシウム、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー及びローディング色素（使用するＰＣＲサーマルサイクラーで必要な場合）を含む。他には、Ｑｕａｎｔａｂｉｏ、ＰｅｒｆｅＣＴａ ｑＰＣＲスーパーミックス、Ｌｏｗ ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）が含まれる。様々な市販のサーマルサイクラーもある。当業者であれば、どれがそのニーズを満たすかを判断することができるであろう。
【0046】
リアルタイムＰＣＲ又はｑＰＣＲは、定量化が可能で、反応の進行に伴いリアルタイムでＰＣＲの進行をモニタリングすることを容易にする、比較的少量のＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡを必要とする技術である。このＰＣＲ技術は、オリゴヌクレオチドプライマーと二重標識オリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせを利用する。プローブは、増幅された場合、ＰＣＲ反応の各サイクルで蓄積するレポーターとして作用する。
【0047】
増幅産物の特異的検出は、レポーター蛍光色素及びクエンチャー色素で標識された１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを用いて行うことができる。そのようなプローブは当業者に知られており、例えば分子指標、二重標識プローブ、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）プローブ及びＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブなど、市販もされている。オリゴヌクレオチドプローブは、レポーター蛍光色素及び１つ以上のクエンチャー色素で標識することができる。蛍光レポーター色素の例としては、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ又は６－ＦＡＭ）、２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシ－フルオレセイン（ＶＩＣ）、ＴＥＴ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＪＯＥ、Ｃｙ（登録商標）３、ＣＹ（登録商標）５、ＣＹ（登録商標）５．５、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ（商標）、ＬＣ Ｒｅｄ ６１０、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、ＬＣ６４０、ＳＵＮ（商標）、ＭＡＸ（商標）、ＡＴＴＯ（商標）５５０、ＡＴＴＯ６４７（商標）、Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０及びＯｒａｎｇｅ ５６０、ＴｘＲｄ（スルホローダミン１０１－Ｘ）、Ｑｕａｓａｒ ５７０及び６７０が挙げられる。蛍光クエンチャーの例としては、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）、ＺＥＮ－ＩＢ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ １、２及び３）、ＴＡＭＲＡ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ及びＲＱが挙げられる。
【0048】
例えば、二重標識プローブは、５’末端に相補的標的の存在下で蛍光を発する１つ又は複数の蛍光レポーター色素で、且つ３’末端に１つ又は複数の非蛍光クエンチャーで標識することができる。二重標識プローブは、２つのプライマー間のテンプレートにハイブリダイズするように設計され、固有の５’→３’エンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ酵素と組み合わせて使用される。プローブがインタクトであるとき、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素の近接によってクエンチされる。各ＰＣＲサイクルの伸長期の間、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エンドヌクレアーゼ活性はアニールされたプローブを切断し、プローブからレポーター色素を放出し、蛍光を増加させる。この蛍光の増加は、反応中に存在する増幅された標的ＤＮＡの量に正比例する。蛍光は、ＰＣＲ反応を通して連続的にモニターされる。ＰＣＲ反応の初期サイクルの間、蛍光の量は、装置の検出閾値を下回る。蛍光シグナルのモニタリングを継続し、蛍光が検出される最初のＰＣＲサイクルを記録する。反応の開始時に試料中に存在する標的ＤＮＡが多いほど、より早く蛍光が検出され、これは試料標的ＤＮＡ量と逆相関する。
【0049】
一実施形態では、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせは、１４４ｂｐの断片を増幅する。一実施形態では、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせは、１４４ｂｐの断片を増幅する。
【0050】
反応混合物は、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせも含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）からなる群から選択される。
【0051】
一実施形態では、反応混合物は、任意選択により、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせを含む。一実施形態では、反応混合物は、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせを含む。一実施形態では、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有し、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する。
【0052】
一実施形態では、本方法は、内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせをさらに含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する。一実施形態では、配列番号１８は、蛍光レポーター色素及び／又は非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。
【0053】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、５’末端に、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）又は２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）から選択される蛍光レポーター色素を有する。一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８は、５’末端に、蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に、蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を有する。
【0054】
一実施形態では、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、３’末端に、非蛍光クエンチャーを有する。一実施形態では、３’末端のクエンチャーは、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）並びにＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）から選択される。一実施形態では、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８の１つ又は複数は、３’末端に、副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号３、配列番号２２、配列番号２５及び配列番号２８の１つ又は複数は、３’末端に、ＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。
【0055】
一実施形態では、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号２２は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。一実施形態では、配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端にＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）を有する。
【0056】
一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＢＰＶ－３の非構造（ＮＳ）タンパク質を標的とする。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせはＢＰＶ－３の非構造（ＮＳ）タンパク質及び構造カプシド（ＶＰ）タンパク質を標的とする。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＢＰＶ－３の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質を標的とする。
【0057】
一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＢＰＶ－３の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質を標的とする。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３５３５－３５５４を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３６６７－３６４３を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３５７１－３５８８を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号１の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２の核酸配列を有し、プローブは配列番号３の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１７３４－１７１６を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１６１８－１６４５を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１６６５－１６７８を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号１３の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号１４の核酸配列を有し、プローブは配列番号１５の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２８６２－２８７８を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２９６３－２９３８を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２９０２－２９３０を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号２０の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２１の核酸配列を有し、プローブは配列番号２２の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０５１－３０６８を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３１３４－３１１４を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０７９－３１０２を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号２４の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２５の核酸配列を有し、プローブは配列番号２６の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０６１－３０７９を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３１４０－３１２２を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置３０８１－３１０３を標的とするプローブを含む。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせにおいて、フォワードプライマーは配列番号２６の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号２７の核酸配列を有し、プローブは配列番号２８の核酸配列を有する。
【0058】
一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＢＰＶ－３の構造カプシド（ＶＰ）タンパク質及び非構造（ＮＳ）タンパク質を標的とする。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２１９０－２２０９を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２２５６－２２３６を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置２２１３－２２２６を標的とするプローブを含む。一実施形態では、フォワードプライマーは配列番号４の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号５の核酸配列を有し、プローブは配列番号６の核酸配列を有する。
【0059】
一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＢＰＶ－３の非構造（ＮＳ）タンパク質を標的とする。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１３３１－１３５２を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１４７４－１４５３を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１３７７－１３９１を標的とするプローブを含む。一実施形態では、フォワードプライマーは配列番号７の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号８の核酸配列を有し、プローブは配列番号９の核酸配列を有する。一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１４５３－１４７４を標的とするフォワードプライマー、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１５６２－１５３９を標的とするリバースプライマー及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０６９６７を有するＢＰＶ－３分離株のオリゴ位置１５０７－１５２２を標的とするプローブを含む。一実施形態では、フォワードプライマーは、配列番号１０の核酸配列を有し、リバースプライマーは配列番号１１の核酸配列を有し、プローブは配列番号１２の核酸配列を有する。
【0060】
一実施形態では、プライマープローブの組み合わせは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８を含む内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせと組み合わせて含み、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有し、及び配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセインを、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する。
【0061】
本明細書に記載される方法において使用される反応混合物は、１つ以上の対照をさらに含み得る。これらの対照には、ＤＮＡテンプレートを除いて全てのＰＣＲ試薬を含有するテンプレートなし対照；核酸抽出中の交差汚染をモニターし、アッセイが非特異的バックグラウンドＤＮＡで偽陽性結果を生じないことを検証するための陰性抽出対照；試験試料調製中のＤＮＡ抽出性能を評価し、アッセイが偽陰性結果を生じないことを検証するための陽性抽出対照；ｑＰＣＲ成分が正確に作用し、標的配列に特異的なＰＣＲ増幅シグナルを与えることを検証するための陽性対照；試料干渉／阻害レベルを決定するための阻害対照、ＰＣＲ効率、直線範囲を決定し、試験試料／対照の抽出ＤＮ中の標的配列の絶対コピー数を定量するための標準並びに／又は試料調製及びアッセイ実行中に使用される試験試料中の陽性対照プラスミドの交差汚染をモニターするための内在性陽性対照の１つ以上が含まれる。
【0062】
アッセイの好適な精度、真度及び直線性のレベルは、本明細書に記載の分析アッセイ、特に定量アッセイのダイナミックレンジ内で優先的に示される。アッセイの精度は、併行精度（アッセイ内精度）及び室内再現精度（実験室内精度）に基づく。併行精度は、短時間の間に、同じ分析者により、同じ実験室で、同じ装置を用いて、同じ試料について、同じ方法で得られた結果の変動係数（ＣＶ）である。アッセイの併行精度を決定するために、量の平均及び標準偏差（ＳｔｄＤｅｖ）（１反応あたりの標的配列のゲノムコピー、ＧＣ／ｒｘｎ）並びに量のＣＶ％を、それぞれの濃度でのＰＣＲ反応の各セットから算出する。室内再現精度は、異なる分析者、異なる検出システム、異なる時間などの固有の変動性が考慮される。アッセイの室内再現精度を決定するために、量の平均及びＳｔｄＤｅｖ並びに量のＣＶ％を、一定期間にわたる独立した実験のそれぞれの全濃度のＰＣＲ反応の全セットから計算する。
【0063】
真度（Ａｃｃｕｒａｃｙ）（真度（ｔｒｕｅｎｅｓｓ）ともいう）は、一連の試料（例えば、所定の濃度の陽性対照プラスミド、）から得られた値を、標準（ＳＴ）と呼ばれる実際の値又は基準値と比較する。アッセイの真度を決定するために、量の平均（１反応あたりの標的配列のゲノムコピー、ＧＣ／ｒｘｎ）を、それぞれの濃度でのＰＣＲ反応の各セットから計算する。
【0064】
定量的ｑＰＣＲアッセイの定量限界（ＬＯＱ）は、適切な精度（併行精度及び室内再現精度）及び真度で定量的に決定することができる試料中の標的配列の最低量である。ＬＯＱを決定するために、最低、最高及び中間範囲のいくつかが試験される。最低濃度、中間濃度及び上限濃度の陽性対照プラスミドを調製して外因性抽出ＤＮＡにスパイクし、検量線の存在下、好ましくは異なる日に異なる分析者がアッセイを実施することにより、適切な数の反復を行って定量する。
【0065】
検出限界（ＬＯＤ）又はアッセイの感度は、アッセイによって検出することができるが、必ずしも正確な値として定量されるわけではない標的配列の最低量である。
【0066】
アッセイの頑健性は、Ｙｏｕｄｅｎ及びＳｔｅｉｎｅｒの方法（Ｙｏｕｄｅｎ、Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ ｅｄ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ １９７５，ｐｐｓ．３３－３６，７０－７１；８２０８３）によって決定することができる。例えば、特定の臨界試薬濃度に対する変化を評価することができる。特定の重要なＰＣＲ因子を選択し、わずかに変化させることができる。許容基準は、適用した微小変化に関して頑健性条件に対して得られた応答が確立されたアッセイの許容基準を満たすことを要求する。
【0067】
本発明は、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡを定量化するためのアッセイを提供する。一実施形態では、ＰＣＲ反応においてウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの１Ｅ３～１Ｅ８ゲノムコピーを定量化するためのアッセイが提供される。
【0068】
本発明は、１）試験試料の抽出ＤＮＡ、陽性対照、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡ、核酸増幅試薬、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）、並びにａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号３は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号６は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号９は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号１５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２２は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２５は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ（ここで、配列番号２８は、５’末端に蛍光レポーター色素を、且つ３’末端に非蛍光クエンチャーを有する）からなる群から選択される、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）のＤＮＡ配列に選択的なプライマープローブの組み合わせを含む反応混合物と；２）反応混合物を定量的ＰＣＲ技術に供して、標的配列のコピーを得る工程と；３）蛍光シグナルの増加を測定する工程とを含む、ＰＣＲ反応においてウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）ゲノムＤＮＡの１Ｅ３～１Ｅ８ゲノムコピーを定量化するための方法を提供する。
【0069】
一実施形態では、ダイナミックレンジは、１Ｅ３～１Ｅ８ＧＣ／ｒｘｎである。一実施形態では、定量下限は１Ｅ３ ＧＣ／ｒｘｎである。一実施形態では、定量上限は１Ｅ８ＧＣ／ｒｘｎである。一実施形態では、定量化アッセイの検出限界（ＬＯＤ９５％）は１反応あたり２７ゲノムコピーであり、９５％信頼区間は１反応あたり２２及び３４ゲノムコピーである。一実施形態では、アッセイは、相関係数（Ｒ２）≧０．９８及び９０～１１０％のＰＣＲ増幅効率を有する直線性を有する。一実施形態では、アッセイは、２５％以下の量のＣＶ％である併行精度値を有する。一実施形態では、アッセイは、３０％以下の量のＣＶ％である室内再現精度値を有する。一実施形態では、アッセイは、アッセイのダイナミックレンジ全体にわたって許容基準値（ＳＴ）の±３０％以内の真度値を有する。一実施形態では、アッセイは、併行精度で≦２５％、室内再現精度で≦３０％の量のＣＶ％及び予想される標準基準値の±３０％以内の真度の許容基準（最低、中間及び上限値）である定量限界を有する。一実施形態では、アッセイは、併行精度で≦２５％、室内再現精度で≦３０％の量のＣＶパーセント及び最適化された条件の量の平均の±３０％の、試験された組み合わせマトリックス条件の量の平均の真度を有する頑健性を有する。
【0070】
本発明は、ａ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｂ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｃ）配列番号７、配列番号８及び配列番号９の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｄ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｅ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｆ）配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；ｇ）配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びにｈ）配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８の核酸配列を有するプライマープローブの組み合わせ；並びに任意選択の配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の核酸配列を有する内在性陽性対照プライマープローブの組み合わせからなる群から選択される、ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）をコードするＤＮＡを検出するプライマープローブの組み合わせを含む、試験試料の抽出ＤＮＡ中のウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）ゲノムＤＮＡ汚染の検出に使用するためのキットを提供する。
【0071】
本願で使用する用語法は、当技術分野内で標準的であるが、特定の用語の定義は、特許請求の範囲の意味に対して明快さ及び明確さを保証するために本明細書において提供される。単位、接頭辞及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）許容形式で示すことができる。本明細書に記載の数値範囲は、範囲を定義する数を含み、定義された範囲内の各整数を含み、それを支持する。別段の記載がない限り、本明細書に記載の方法及び手法は、一般に、当技術分野においてよく知られる従来の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用され且つ論じられる様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。特許、特許出願、論文、書籍及び学術論文が挙げられるが、これらに限定されない、本願で引用される全ての文献又は文献の一部は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0072】
本発明は、本発明の個々の態様の単一の説明として意図されている本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等の方法及び構成要素は、本発明の範囲内である。実際、本明細書中に示され、記載されるものに加えて本発明の様々な変更形態は、上記及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本発明の一態様又は実施形態に記載されているものは、本発明の他の態様及び／又は実施形態と組み合わせることができる。
【0073】
以下の実施例は、実施された実験及び得られた結果を含むが、それらは、例示の目的のためにのみ提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0074】
実施例１ ＢＰＶ－３プライマー／プローブセットの開発
ＢＰＶ－３ゲノムの保存領域を特定するために、ＢＰＶ－３分離株の公開されている全ての完全長ゲノム配列をＧｅｎＢａｎｋから取得した（表１）。
ＢＰＶ－３ゲノムの保存領域を特定するために、ＢＰＶ－３分離株の公開されている全ての完全長ゲノム配列をＧｅｎＢａｎｋから取得した（表１）。
【0075】
【表1】
【0076】
複数のアラインメントを実施し、ＢＰＶ－３の非構造（ＮＳ）タンパク質及び構造カプシド（ＶＰ）タンパク質をコードする遺伝子中の異なる保存領域を選択し、８つの異なるプライマー／プローブセット（ＢＰＶ－３ｖ１．０－ＢＰＶ－３ｖ８．０）を設計するために使用した。プローブの５’末端を蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識し、３’末端を副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）又はＺＥＮ－ＩＢ及びＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ蛍光クエンチャー（ＩＢＦＱ）で標識した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）。表２に、プローブ及びプライマーセットのオリゴ位置及び配列を示す。プライマー／プローブセットを合成し、陽性対照プラスミドの５ｌｏｇ濃度範囲（１ｅ７～１ｅ３）を用いて６反復で試験した。
【0077】
【表2】
【0078】
【表3】
【0079】
【表4】
【0080】
ＬＯＤ、ダイナミックレンジ、ＰＣＲ効率及びＲ２値に基づいて、ＢＰＶ－３ ｖ３．０をアッセイの開発及び認定に使用するために選択した。プライマーはＢＰＶ ３の１４４ｂｐ断片を増幅した。プローブは、５’末端に蛍光レポーター色素の６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を、且つ３’末端に副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）を有する（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。設計されたＢＰＶ－３ ｖ３．０プライマー／プローブ配列は、インシリコ解析により、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科の５つの配列の全てと完全に一致した。他のパルボウイルスとの複数のアラインメントは、プライマープローブの組み合わせの配列がＢＰＶ－３に特異的であることを示す一致を生じなかった。
【0081】
内在性陽性対照プライマー／プローブセット及びＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡ
内在性陽性対照（ＩＰＣ）は、抽出効率と、スパイクした陽性対照プラスミドと試験試料の抽出ＤＮＡとの間の偶発的な交差汚染をモニターするように設計した。ＩＰＣプローブ（ＩＰＣ ｖ２．０）の５’末端を蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシ－フルオレセイン（ＶＩＣ）で標識し、３’末端を副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）で標識した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。ＩＰＣプライマー／プローブセットは、ＢＰＶ－３プライマー／プローブとの区別を容易にするために、６７ｂｐ断片を増幅した。表３は、プローブ及びプライマーのオリゴ機能及び配列を示す。このプローブ／プライマーセットをさらなるＢＰＶ－３アッセイの開発及び認定のために使用した。
内在性陽性対照（ＩＰＣ）は、抽出効率と、スパイクした陽性対照プラスミドと試験試料の抽出ＤＮＡとの間の偶発的な交差汚染をモニターするように設計した。ＩＰＣプローブ（ＩＰＣ ｖ２．０）の５’末端を蛍光レポーター色素の２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシ－フルオレセイン（ＶＩＣ）で標識し、３’末端を副溝バインダー非蛍光クエンチャー（ＭＧＢ－ＮＦＱ）で標識した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。ＩＰＣプライマー／プローブセットは、ＢＰＶ－３プライマー／プローブとの区別を容易にするために、６７ｂｐ断片を増幅した。表３は、プローブ及びプライマーのオリゴ機能及び配列を示す。このプローブ／プライマーセットをさらなるＢＰＶ－３アッセイの開発及び認定のために使用した。
【0082】
【表5】
【0083】
ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡを作製するために、ＢＰＶ－３及びＩＰＣの標的配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングした。陽性対照配列の５’末端は、ＢＰＶ－３標的ゲノムを有し、陽性対照配列の３’末端はＩＰＣ標的配列を有した。したがって、陽性対照プラスミドは、ＢＰＶ－３及びＩＰＣ配列の両方を有し、ＢＰＶ－３陽性対照並びに抽出効率及び偶発的な交差汚染をモニターする内在性陽性対照として機能する。陽性対照ＤＮＡの配列を表４に示す。
【0084】
【表6】
【0085】
実施例２ ＢＰＶ－３定性アッセイ
試料の調製
細胞を含有する試験試料では、試料を低速遠心分離（ＬＳＣ）（３２０×ｇ～１０００×ｇ、室温で１０分間）に供し、その後、ＤＮＡ抽出を行った。上清をＤＮＡ抽出のために回収した。無細胞試料は直接処理した。
試料の調製
細胞を含有する試験試料では、試料を低速遠心分離（ＬＳＣ）（３２０×ｇ～１０００×ｇ、室温で１０分間）に供し、その後、ＤＮＡ抽出を行った。上清をＤＮＡ抽出のために回収した。無細胞試料は直接処理した。
【0086】
２５０μＬの試験試料に、１０μＬのＲＮａｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（商標）酵素ミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の（９μＬ：１μＬ）混合物を添加した。ＡｕｔｏＭａｔｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）核酸抽出システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、試験試料からＤＮＡを抽出した。ＡｕｔｏＭａｔｅでは、ＤＮＡ抽出手順のために、以下のパラメータを有するＰｒｅｐＳＥＱ（ＰＳ）Ｅｘｐｒｅｓｓ １－２－３プロトコルを選択した：１時間プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化及び１００μＬ溶出。
【0087】
抽出されたＤＮＡを目視で検査し、溶出ＤＮＡ中に磁気ビーズが残存していた場合、ＤｙｎａＭａｇ（商標）－２マグネットベンチトップワークステーション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、溶出ＤＮＡ中に残存するビーズを除去した。ＤＮＡを直ちに使用するか又は－３０℃で保存した。
【0088】
試験試料からのＤＮＡの抽出と並行して、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ（ＰＥＣ）プラスミド対照及び陰性抽出対照（ＮＥＣ）も調製し、上記のように実行した。陽性抽出対照では、２５０μＬの滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、６２，０００ゲノムコピー（ＧＣ）のＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミドＤＮＡをスパイクした。陽性抽出対照を用いて、試料調製中のＤＮＡ抽出効率を評価した。ＤＮＡ抽出効率が１００％であると仮定すると、最終溶出ＤＮＡは５００ＧＣ／μＬを含むはずである。陰性抽出対照は、２５０μＬの滅菌１×ＰＢＳを含有した。陰性抽出対照を使用して、核酸抽出中に起こり得る偶発的な交差汚染をモニターした。
【0089】
追加のＢＰＶ－３検出アッセイ対照の調製
テンプレートなし対照（ＮＴＣ）：テンプレートなし対照は、ＤＮＡテンプレートを除く全てのＰＣＲ試薬を含有した。これを陰性対照として用いて、ｑＰＣＲ原材料にＤＮＡ汚染がないことを確認した。
テンプレートなし対照（ＮＴＣ）：テンプレートなし対照は、ＤＮＡテンプレートを除く全てのＰＣＲ試薬を含有した。これを陰性対照として用いて、ｑＰＣＲ原材料にＤＮＡ汚染がないことを確認した。
【0090】
陽性対照（ＰＣ）：陽性対照は、２０００ＧＣ／反応のＢＰＶ－３＿ＩＰＣ組換えプラスミドＤＮＡを含有した。陽性対照を用いて、アッセイの真度を確認した。
【0091】
阻害対照（ＩＨＮ）：阻害対照は、ＰＣＲ増幅及び試験試料マトリックスから課される干渉又は阻害のレベルをモニターするために使用される。試験試料からの最終抽出ＤＮＡを、陽性対照と同量のＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミド（２０００ＧＣ／反応）でスパイクした（＋Ｓ）。ＣＴ（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値を超える（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）ために必要なサイクル数である。阻害対照（＋Ｓ）の平均サイクル閾値（ＣＴ）値を、干渉又は阻害の尺度としての陽性対照の平均ＣＴ値と比較した。ΔＣＴは、３．３２ＣＴ（１ｌｏｇのＤＮＡ濃度に相当）未満とする。阻害又は干渉は、ΔＣＴ＝｜ＰＣ（平均ＣＴ）－ＩＨＮ（平均ＣＴ）｜として計算した。
【0092】
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ及びＩＰＣ ｑＰＣＲ検出アッセイのセットアップ
２つの異なるマスターミックス、ＢＰＶ＿３ ｐＰＣＲアッセイのためのＢＰＶ－３ ｑＰＣＲマスターミックス及びＩＰＣ ｑＰＣＲアッセイのためのＩＰＣ ｑＰＣＲマスターミックスを調製する。
２つの異なるマスターミックス、ＢＰＶ＿３ ｐＰＣＲアッセイのためのＢＰＶ－３ ｑＰＣＲマスターミックス及びＩＰＣ ｑＰＣＲアッセイのためのＩＰＣ ｑＰＣＲマスターミックスを調製する。
【0093】
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ検出アッセイのセットアップは、試験試料から抽出したＤＮＡ中のＢＰＶ－３ ＤＮＡを検出するＢＰＶ－３ ｖ３．０プライム／プローブセットを含んだ。ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲマスターミックスは、ＢＰＶ－３ ｖ３．０プライマー－プローブセット、水及び２×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。２×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスは、Ｇ／Ｃリッチ配列を増幅するための最適化された緩衝液、ｄＵＴＰを有するｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＯＸ色素（受動的内部参照として）及びＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）ＵＮＧ（ｄＵを含有するキャリーオーバー汚染ＰＣＲ産物を除去するためのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素）を含むｑＰＣＲ反応に必須の成分を含有した。
【0094】
表５に、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ反応において試験した各試料のための各反応成分の量を示す：被験試料から抽出したＤＮＡ並びに５つの対照：２つの異なる濃度（検出限界を超える（ＡＤＬ）量及び検出限界（ＤＬ）量）の陰性抽出対照（ＮＥＣ）、テンプレートなし対照（ＮＴＣ）、陽性抽出対照（ＰＥＣ）、阻害対照（ＩＨＮ）及び陽性対照（ＰＣ）。
【0095】
【表7】
【0096】
ＩＰＣ ｑＰＣＲ反応のために、ＩＰＣプライマー－プローブ、水及び２×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＩＰＣプライム／プローブマスターミックスを調製した。試験試料並びに４つの対照、すなわち２つの異なる濃度（検出限界を超える（ＡＤＬ）量及び検出限界（ＤＬ）量）の陰性抽出対照、テンプレートなし対照、陽性抽出対照及び陽性対照のための各反応成分の量を表６に示す。
【0097】
【表8】
【0098】
ＢＰＶ＿３ ｑＰＣＲ反応及びＩＰＣ ｑＰＣＲ反応はいずれも、９６ウェル反応プレートにおいて、各試料及び対照について少なくとも３連（３つのＰＣＲ反応ウェル）で実施した。反応成分は、手動で又はＱＩＡｇｉｌｉｔｙ ＨＥＰＡ／ＵＶリキッドハンドラー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）などのリキッドハンドラーロボットを使用してセットアップすることができる。ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にｑＰＣＲ反応混合物を収容し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でカバーした。各ＰＣＲ反応におけるＰＣＲ試薬成分、試料及び対照の量を表６及び７に示す。次いで、密封したプレートを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にロードした。
【0099】
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＰＣＲ反応を行った。熱サイクルプログラムは、以下の反応時間及び温度に設定した：５０℃２分、９５℃１０分及び９５℃１５秒の４０サイクル、６０℃１分（データ収集）。表７に、選択した実験プロパティを示す。
【0100】
【表9】
【0101】
試験試料を評価する前に、アッセイは、有効なアッセイとみなされるために、システム適合性及びアッセイ許容基準を満たしていなければならない。アッセイの許容基準を満たしていない場合、アッセイを繰り返さなければならない。試験試料が有効且つ陽性であった場合、アッセイを繰り返して、得られた陽性結果を確認しなければならない。ＢＰＶ－３定性アッセイの有効なアッセイ基準及び試験結果の評価を表８に概説する。試験試料が陽性の増幅シグナルを示す場合、ＩＨＮ及びΔＣＴ対照は無関係であり、システムの適合性及びアッセイの許容基準の一部とみなすべきではない。
【0102】
【表10】
【0103】
試験試料結果の許容基準
アッセイがシステム適合性及びアッセイ許容基準を満たしている場合、試験試料の許容基準を表９に示す。定性アッセイの結果は、「陽性」又は「陰性」として報告される。
アッセイがシステム適合性及びアッセイ許容基準を満たしている場合、試験試料の許容基準を表９に示す。定性アッセイの結果は、「陽性」又は「陰性」として報告される。
【0104】
【表11】
【0105】
反復試験戦略
ΔＣＴが純ＤＮＡ試料を用いた許容基準を満たさない場合、抽出ＤＮＡの１：２希釈液を用いてアッセイを繰り返し得る。希釈は、試料マトリックス干渉を低減する。この場合、アッセイを繰り返す前に、全ての試料及び対照ＤＮＡを分子生物学グレードの水で１：２に希釈しなければならない。
ΔＣＴが純ＤＮＡ試料を用いた許容基準を満たさない場合、抽出ＤＮＡの１：２希釈液を用いてアッセイを繰り返し得る。希釈は、試料マトリックス干渉を低減する。この場合、アッセイを繰り返す前に、全ての試料及び対照ＤＮＡを分子生物学グレードの水で１：２に希釈しなければならない。
【0106】
試験試料が標的ＩＰＣに対して陽性増幅シグナルを示す場合、これは、試験試料による陽性対照プラスミドＤＮＡの交差汚染を示す。この場合、アッセイは無効であり、現場に適用可能な手順による汚染除去を実施した後、アッセイを繰り返す必要がある。
【0107】
実施例３ ＢＰＶ３定性アッセイを試験する。
特異性：試料マトリックス効果（偽陽性がないことを試験するため）
培地成分とＢＰＶ－３ ｖ３．０及びＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブセットとの間に偽陽性結果がないことを実証するため、３つの試料マトリックス（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び２つのウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＳＡＦＣ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ及びＨｙｃｌｏｎｅ Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を試験した。アッセイ手順及びセットアップは、実施例２に記載した通りであった。
特異性：試料マトリックス効果（偽陽性がないことを試験するため）
培地成分とＢＰＶ－３ ｖ３．０及びＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブセットとの間に偽陽性結果がないことを実証するため、３つの試料マトリックス（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び２つのウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＳＡＦＣ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ及びＨｙｃｌｏｎｅ Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を試験した。アッセイ手順及びセットアップは、実施例２に記載した通りであった。
【0108】
表１０に、試験試料並びにＢＰＶ－３及びＩＰＣアッセイによるｑＰＣＲ試験の結果を示す。この手順の許容基準では、全ての試験試料が両プライマー／プローブセットで陰性結果を示すことが求められた。実施された全ての対照及びシステム適合性が許容基準を満たした場合の有効な実験の結果は、全ての試験試料が陰性であり、増幅シグナルを示さなかったことを明らかにした（ＣＴ＝４０．００）。
【0109】
【表12】
【0110】
ＢＰＶ－３検出（偽陰性がないことを試験するため）
ＢＰＶ－３ウイルスストックもＢＰＶ－３ゲノムＤＮＡも市販されていないため、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドを使用して、ＢＰＶ－３ ｖ３．０プライマー／プローブセットの特異性を試験した。ＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミドの配列を決定し、ＢＰＶ－３ ＮＳ遺伝子の真度をＢＬＡＳＴ分析により確認した。
ＢＰＶ－３ウイルスストックもＢＰＶ－３ゲノムＤＮＡも市販されていないため、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドを使用して、ＢＰＶ－３ ｖ３．０プライマー／プローブセットの特異性を試験した。ＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミドの配列を決定し、ＢＰＶ－３ ＮＳ遺伝子の真度をＢＬＡＳＴ分析により確認した。
【0111】
実施例２に記載のアッセイを使用した。特異性試験の一部として、ＢＰＶ－３ ＤＮＡについて陽性であることが確認された（Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ（ＢＲＥＬ）ｑＰＣＲ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖｏ Ｐａｎｅｌ、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤを使用）２つのウシ胎児血清試料とＦＢＳを含有する未処理の非ＧＭＰバルク採取試料を真陽性試料とした。シーケンシングにより陽性対照（ＰＣ）を確認した。
【0112】
この手順の許容基準では、全ての試験試料がＢＰＶ－３アッセイで陽性結果を示し、且つアッセイが以前に陽性が確認されたＢＰＶ－３試料で偽陰性結果を生じないことが求められた。
【0113】
表１１にＰＣにおけるＢＰＶ－３検出の結果を示し、これらは全て、許容基準を満たした。注目すべきことに、ＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブは陽性ＦＢＳ及び予想通りＦＢＳを含有する未処理の非ＧＭＰバルク採取試料において陰性であり、陽性対照プラスミド（ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ）を使用した場合にのみ陽性結果を生じた。ＩＰＣ ｑＰＣＲ反応の結果は予想通りであり、許容基準を満たした。
【0114】
【表13】
【0115】
交差反応性
ＢＰＶ－３ ｖ３．０及びＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブセットの交差反応性の効果を試験するために、種々のウイルス及び細胞株に由来する抽出核酸を、実施例２に記載のアッセイを用いて評価した。ＢＰＶ－３に最も近い市販のパルボウイルスは、ウシパルボウイルス１（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ １）（ＢＰＶ－１）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－７６７（商標））及びマウス微小ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＶ、げっ歯類パルボウイルス）であり、これらを、交差反応性を試験するために含めた。交差反応性を試験するために、以下のいくつかの他のＤＮＡウイルスを含めた：ブタサーコウイルス２（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ２）（ＰＣＶ ２）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １）（ＨＳＶ １）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）（Ｐｒｖ）。次の４つの細胞株由来のＤＮＡも試験した：アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＭＳＶ形質転換ネコ脳（ＰＧ ４）。実施例２に記載のようにＤＮＡを抽出した。
ＢＰＶ－３ ｖ３．０及びＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブセットの交差反応性の効果を試験するために、種々のウイルス及び細胞株に由来する抽出核酸を、実施例２に記載のアッセイを用いて評価した。ＢＰＶ－３に最も近い市販のパルボウイルスは、ウシパルボウイルス１（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ １）（ＢＰＶ－１）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－７６７（商標））及びマウス微小ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＶ、げっ歯類パルボウイルス）であり、これらを、交差反応性を試験するために含めた。交差反応性を試験するために、以下のいくつかの他のＤＮＡウイルスを含めた：ブタサーコウイルス２（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ２）（ＰＣＶ ２）、単純ヘルペスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １）（ＨＳＶ １）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）（Ｐｒｖ）。次の４つの細胞株由来のＤＮＡも試験した：アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＭＳＶ形質転換ネコ脳（ＰＧ ４）。実施例２に記載のようにＤＮＡを抽出した。
【0116】
全てのウイルスから抽出された核酸の真度を、社内の特異的ｑＰＣＲ又は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を用いて確認した。
【0117】
この手順の許容基準では、試験した全ての種がＢＰＶ－３ ｖ３．０及びＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブセットを用いて陰性結果（ＣＴ＝４０．００）を示すことが求められた。表１２は、交差反応性試験の結果、試験した全ての種がＢＰＶ－３について陰性であり、許容基準を満たしていることが明らかになったことを示している。
【0118】
【表14】
【0119】
検出限界（ＬＯＤ）
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ法は、定性的結果を得るためのものであり、直線性の証明は、求められない。実際には、ＬＯＤは、一連の試料の９５％で検出された陽性率により、増幅された標的配列の最小数の形式でのカットオフ点として決定される（ＬＯＤ９５％と呼ばれる）。
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ法は、定性的結果を得るためのものであり、直線性の証明は、求められない。実際には、ＬＯＤは、一連の試料の９５％で検出された陽性率により、増幅された標的配列の最小数の形式でのカットオフ点として決定される（ＬＯＤ９５％と呼ばれる）。
【0120】
本方法の検出感度又は分析限界（ＡＬＯＤ）を決定するために、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミドＤＮＡを異なる濃度に希釈した（１、５、１０、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００ＧＣ／ＰＣＲ反応）。ＡＬＯＤは、増幅産物が少なくとも０．９５（ＬＯＤ９５％）の確率で検出される標的ＤＮＡの濃度である。これを試験するために、各プラスミドＤＮＡ濃度からの１２のＰＣＲ反復測定を、実施例２に記載のアッセイを用いて、試料マトリックスの非存在下で評価した。１２全ての反復が陽性であったゲノムコピー数が最少の濃度レベルを、ＬＯＤ９５％の近似値とみなした。
【0121】
プロビット解析を９５％の関連確率で用いて、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイのＡＬＯＤを計算した。解析結果は、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイのＡＬＯＤが１反応あたり約２２ゲノムコピーであることを示した（図１）。
【0122】
試料検出限界（ＳＬＯＤ）は、試料マトリックスの存在下で所与のレベルの信頼度で検出することができる標的配列の最小量（ＬＯＤ９５％）である。ＳＬＯＤを決定するための実験は、ＡＬＯＤ実験と同じ方法で実施したが、但し、異なる濃度レベル（２５、５０、７５及び１００ＧＣ／反応）の陽性対照プラスミドＤＮＡを、分子生物学グレードの水（ＭＢＧＷ）ではなく、異なる試料マトリックスから抽出したＤＮＡにスパイクした。
【0123】
この試験では、異なる試料マトリックスを使用した（表１３を参照）。ＱＩＡｇｉｌｉｔｙリキッドハンドラー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）を用いて、各試料に反応ごとに２５、５０、７５及び１００ゲノムコピー（ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミド）をスパイクし、実施例２に記載のＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ検出アッセイを用いて試験した。全ての試料を１２反復で評価した。表１４及び１５に、ＳＬＯＤの結果を示す。結果から、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイのＳＬＯＤがＰＣＲの１反応あたり２５ゲノムコピーであることが明らかになった。同様の結果がＩＰＣ ｑＰＣＲアッセイについても得られた（表１６）。
【0124】
【表15】
【0125】
【表16】
【0126】
【表17】
【0127】
【表18】
【0128】
頑健性
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ検出アッセイの頑健性を評価するために、ＦＢＳを含有する未処理の非ＧＭＰバルク採取試料及びＦＢＳ試料を試験した（表１７）。許容基準は、実施例２に記載されているように、提案されたシステム適合性及びアッセイ許容基準並びに試料許容基準を満たすことである。試料は、ＮＧＳ、サンガーＤＮＡシーケンシング又はＢｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ（ＢＲＥＬ）Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖｏ Ｐａｎｅｌ ｑＰＣＲアッセイなどの代替法により、ＢＰＶ－３ ＤＮＡについて陰性又は陽性であることが以前に確認されていた。
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ検出アッセイの頑健性を評価するために、ＦＢＳを含有する未処理の非ＧＭＰバルク採取試料及びＦＢＳ試料を試験した（表１７）。許容基準は、実施例２に記載されているように、提案されたシステム適合性及びアッセイ許容基準並びに試料許容基準を満たすことである。試料は、ＮＧＳ、サンガーＤＮＡシーケンシング又はＢｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ（ＢＲＥＬ）Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖｏ Ｐａｎｅｌ ｑＰＣＲアッセイなどの代替法により、ＢＰＶ－３ ＤＮＡについて陰性又は陽性であることが以前に確認されていた。
【0129】
試料を、実施例２に記載されるように、ＤＮＡ抽出に供した。全ての対照を調製し、試験試料と並行してｑＰＣＲを実施し、次いで、実施例２に記載のようにＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ検出アッセイに供した。ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイの結果を、実施例２に記載されるように解釈し、「陽性」又は「陰性」として報告した。
【0130】
【表19】
【0131】
表１７の陰性試験試料の結果を表１８～２０に示す。このアッセイの信頼性は、ＰＣＲ反応３反復の３つのＢＰＶ－３及びＩＰＣアッセイでのＮＴＣ及びＮＥＣにおける陰性結果；ＰＣＲ反応３反復の３つのＢＰＶ－３及びＩＰＣアッセイでのＰＣにおける標的増幅シグナルの検出；正確な抽出回収を示すＰＣＲ反応３反復の３つでのＰＥＣに対するＢＰＶ－３及びＩＰＣアッセイによる増幅シグナルの検出；ＰＣＲ反応３反復の３つでのスパイクした試験試料（＋Ｓ）におけるＢＰＶ－３の検出；並びに試料マトリックス干渉を示さないΔＣＴ結果を含むアッセイ対照の結果で示された。試験試料は、ＰＣＲ反応３反復の３つのＩＰＣアッセイで陰性であり、陽性対照と試料との間に交差汚染が存在しないことを示し、また、試験試料は、ＰＣＲ反応３反復の３つのＢＰＶ－３アッセイで陰性であり、ＢＰＶ－３ ＤＮＡが存在しないことを示した。まとめると、ＢＰＶ－３アッセイの結果は、アッセイ及び試料の許容基準が満たされ、合格であり、試験試料は有効で、ＢＰＶ－３について「陰性」であったことを示している。
【0132】
【表20】
【0133】
【表21】
【0134】
【表22】
【0135】
陽性試験試料（ＦＢＳを含有する２つの未処理の非ＧＭＰバルク採取試料及び２つのＦＢＳ試料（ＦＢＳ＃２及びＦＢＳ＃３））についてのＢＰＶ－３アッセイの結果を表２１～２４に示す。アッセイの信頼性が示され、アッセイ対照の結果には、ＰＣＲ反応３反復の３つのＢＰＶ－３及びＩＰＣアッセイでのＮＴＣ及びＮＥＣの陰性の予想結果並びにＰＣＲ反応３反復の３つのＢＰＶ－３アッセイでのＰＣにおける標的増幅シグナルの検出が含まれた。
【0136】
試験試料がＢＰＶ－３の陽性増幅シグナル及び検出を示した場合、スパイクした試験試料（ＩＨＣ）及びΔＣＴの評価は無関係となり、アッセイの許容基準の一部として考慮する必要がなかった。ＰＣＲ反応の３反復の３つのＰＥＣについてのＢＰＶ－３アッセイ及びＩＰＣアッセイによる増幅シグナルの検出は、正確な抽出回収を示し、ＰＣＲ反応の３反復の３つのＩＰＣアッセイによる試験試料の陰性シグナルは、陽性対照と試料との間に交差汚染が存在しないことを示した。試験試料は、ＰＣＲ反応の３反復の３つのＢＰＶ－３アッセイで陽性増幅シグナルを示し、ＢＰＶ－３ ＤＮＡが存在することを示した。まとめると、結果は、アッセイ及び試料の許容基準が満たされ、合格であり、試験試料は有効で、ＢＰＶ－３について陽性であったことを示した。
【0137】
【表23】
【0138】
【表24】
【0139】
【表25】
【0140】
【表26】
【0141】
併行精度
併行精度を試験するために、ＢＨＫ及びＶｅｒｏ細胞から抽出されたＤＮＡ（３０ｎｇ／ＰＣＲ反応）を、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミド（ＳＬＯＤレベルでスパイクされた）の２５ゲノムコピーでスパイクされないか又はスパイクされた（ＳＬＯＤレベルでスパイクされた）ものとして調製した。（実施例２に記載されるような）ＢＰＶ－３検出アッセイを、異なる日に１２ＰＣＲ反応反復で行った。
併行精度を試験するために、ＢＨＫ及びＶｅｒｏ細胞から抽出されたＤＮＡ（３０ｎｇ／ＰＣＲ反応）を、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミド（ＳＬＯＤレベルでスパイクされた）の２５ゲノムコピーでスパイクされないか又はスパイクされた（ＳＬＯＤレベルでスパイクされた）ものとして調製した。（実施例２に記載されるような）ＢＰＶ－３検出アッセイを、異なる日に１２ＰＣＲ反応反復で行った。
【0142】
この手順の許容基準では、ＢＰＶ－３及びＩＰＣ ｑＰＣＲアッセイの１２反復の少なくとも１１でスパイクなしの試料は増幅シグナルを示さず、且つＢＰＶ－３及びＩＰＣ ｑＰＣＲアッセイの１２反復の少なくとも１１でスパイクありの試料は陽性の増幅シグナルを示すことが求められた。併行精度アッセイの結果は、１２のスパイクなし（表２５）及びスパイクあり（表２６）の１２が許容基準を満たしていることを示しており、ＢＰＶ－３検出アッセイの併行精度が実証された。
【0143】
【表27】
【0144】
【表28】
【0145】
要約すると、全ての試験試料は、特異性、検出限界、頑健性及び併行精度を含む、定性アッセイに要求される適格性仕様を満たしていた。適格なＢＰＶ－３検出アッセイにより、１ＰＣＲ反応あたり２５のＢＰＶ－３ゲノムコピーを確実に検出することができる。全ての試験試料は、提案されたシステム適合性及びアッセイの許容基準並びに試験試料の許容基準を満たしていた。したがって、適格なＢＰＶ－３リアルタイムＰＣＲアッセイにより、試験試料中のＢＰＶ－３ ＤＮＡの検出が可能になった。
【0146】
実施例４ ウシパルボウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ３）（ＢＰＶ－３）リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ
試料の調製
細胞を含有する試験試料では、試料を低速遠心分離（ＬＳＣ）（３２０×ｇ、室温で１０分間）に供し、その後、ＤＮＡ抽出を行った。上清をＤＮＡ抽出のために回収した。無細胞試料は直接処理した。
試料の調製
細胞を含有する試験試料では、試料を低速遠心分離（ＬＳＣ）（３２０×ｇ、室温で１０分間）に供し、その後、ＤＮＡ抽出を行った。上清をＤＮＡ抽出のために回収した。無細胞試料は直接処理した。
【0147】
２５０μＬの試験試料に、１０μＬのＲＮａｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（商標）酵素ミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の（９μＬ：１μＬ）混合物を添加した。ＡｕｔｏＭａｔｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）核酸抽出システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、２００μＬの試験試料を抽出した。ＡｕｔｏＭａｔｅでは、ＤＮＡ抽出手順のために、以下のパラメータを有するＰｒｅｐＳＥＱ（ＰＳ）Ｅｘｐｒｅｓｓ １－２－３プロトコルを選択した：１時間プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化及び１００μＬ溶出。抽出されたＤＮＡを目視で検査し、溶出ＤＮＡ中に磁気ビーズが残存していた場合、ＤｙｎａＭａｇ（商標）－２ マグネットベンチトップワークステーション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、溶出ＤＮＡ中に残存するビーズを除去した。ＤＮＡを直ちに使用するか又は－２０℃で保存した。
【0148】
試験試料と共に、ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ（ＰＥＣ）プラスミド対照及び陰性抽出対照（ＮＥＣ）も調製し、上記のように実行した。陽性抽出対照では、２５０μＬの滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、６２，０００ゲノムコピー（ＧＣ）のＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミドＤＮＡをスパイクした。これを用いて、試験試料調製中のＤＮＡ抽出性能を評価し、アッセイが偽陰性結果を生じないことを確認した。ＤＮＡ抽出効率が１００％であると仮定すると、最終溶出ＤＮＡは５００ＧＣ／μＬを含むはずである。陰性抽出対照には、１×ＰＢＳ中の約３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを用いた。このＮＥＣを使用して、核酸抽出中の交差汚染をモニターし、アッセイが非特異的バックグラウンドＤＮＡで偽陽性結果を生じなかったことを検証する。
【0149】
他のアッセイ対照の調製
テンプレートなし対照（ＮＴＣ）：ＤＮＡテンプレートを除く全てのＰＣＲ試薬を含有した。これを陰性対照として用いて、ｑＰＣＲ原材料にＤＮＡ汚染がないことを確認した。
テンプレートなし対照（ＮＴＣ）：ＤＮＡテンプレートを除く全てのＰＣＲ試薬を含有した。これを陰性対照として用いて、ｑＰＣＲ原材料にＤＮＡ汚染がないことを確認した。
【0150】
陽性対照（ＰＣ）：ＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡの２Ｅ４、２Ｅ５及び２Ｅ７ＧＣ／反応の３つのＰＣ濃度が含まれた。これを用いて、ｑＰＣＲ成分が正確に働き、標的配列に特異的なＰＣＲ増幅シグナルを有することを確認した。
【0151】
陽性抽出対照（ＰＥＣ）：約４００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（約３μＬ）を２５０μＬ（１×ＰＢＳの場合）に加え、また６２，５００コピーのＢＰＶ－３＿ＩＰＣ陽性対照プラスミドＤＮＡ（６．２５μＬ）をスパイクし、その後、抽出する。
【0152】
阻害対照（ＩＨＮ）：２Ｅ４ ＧＣ／反応でＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミドＤＮＡをスパイクした試験試料から抽出したＤＮＡを含有する。これを使用して、試料干渉／阻害レベルを決定する。
【0153】
標準（ＳＴ）：ＰＣＲ効率、線形範囲を決定し、試験試料／対照における標的配列の絶対コピー数を定量するために使用される、１０倍希釈のＢＰＶ－３＿ＩＰＣプラスミドＤＮＡ（１Ｅ８、１Ｅ７、１Ｅ６、１Ｅ５、１Ｅ４、１Ｅ３ＧＣ／反応）。
【0154】
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ及びＩＰＣ ｑＰＣＲ検出アッセイのセットアップ
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ検出アッセイセットアップは、試験試料中のＢＰＶ－３ＤＮＡを検出するためのＢＰＶ－３ｖ３．０プライム／プローブセット及び陽性試料と陰性試料との間の偶発的な交差汚染をモニターするためのＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブセットを含んだ。２つの異なるマスターミックス、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲマスターミックス及びＩＰＣ ｑＰＣＲマスターミックスを調製した。
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲ検出アッセイセットアップは、試験試料中のＢＰＶ－３ＤＮＡを検出するためのＢＰＶ－３ｖ３．０プライム／プローブセット及び陽性試料と陰性試料との間の偶発的な交差汚染をモニターするためのＩＰＣ ｖ２．０プライマー／プローブセットを含んだ。２つの異なるマスターミックス、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲマスターミックス及びＩＰＣ ｑＰＣＲマスターミックスを調製した。
【0155】
ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲマスターミックスは、ＢＰＶ－３ ｖ３．０プライマー－プローブ、水及び２×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）マスターミックスは、Ｇ／Ｃリッチ配列を増幅するための最適化された緩衝液、ｄＵＴＰを有するｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＯＸ色素（受動的内部参照として）及びＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）ＵＮＧ（ｄＵを含有するキャリーオーバー汚染ＰＣＲ産物を除去するためのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素）を含むｑＰＣＲ反応に必須の成分を含有した。表２７に、試験した各試料の試験試料及び５つの対照（陰性抽出対照（ＮＥＣ）、テンプレートなし対照（ＮＴＣ）、陽性抽出対照（ＰＥＣ）、阻害対照（ＩＨＮ）及び陽性対照（ＰＣ））のための各反応成分の量を示す。
【0156】
【表29】
【0157】
試料及び対照の各反応を、９６ウェル反応プレートにおいて３連（３ウェル）で行った。ｑＰＣＲ反応のセットアップは、手動で又はＱＩＡｇｉｌｉｔｙ ＨＥＰＡ／ＵＶリキッドハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）などのリキッドハンドラーロボットを使用して行うことができる。ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にｑＰＣＲ反応混合物を収容し、次いで、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でカバーした。各ＰＣＲ反応におけるＰＣＲ試薬成分、試料及び対照の量を表２７に示す。９６ウェルプレートの試料の配置は分析者ごとに設定することができ、密封したプレートを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にロードする。
【0158】
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてｑＰＣＲ反応を行った。熱サイクルプログラムは、以下の反応時間及び温度に設定した：５０℃２分（ＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）ＵＮＧ活性化）、９５℃１０分（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ活性化／変性）及び９５℃１５秒、６０℃１分を４０サイクル（アニーリング／伸長／データ収集）。表２８に、選択した実験プロパティを示す。
【0159】
【表30】
【0160】
アッセイは、ＱＳ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、本明細書に記載のＢＰＶ＿３及びＩＰＣプライマー及びプローブと組み合わせて用いる。
【0161】
アッセイは有効なアッセイとみなされるために、以下のアッセイ許容基準を満たさなければならない（表２９を参照）。アッセイの許容基準を満たさない場合、アッセイを繰り返さなければならない。
【0162】
【表31】
【0163】
データの統計分析は、Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）及び／又はＴＩＢＣＯ ＳＰＯＴＦＩＲＥ（登録商標）ソフトウェア（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて行った。「未確定」として報告されたＣＴ値は標的ＤＮＡが存在しないことを示し、さらなる統計分析のために４０．００に変換された。試料、標準及び対照は３反復で試験した。試料、対照又は標準からのＣＴ値に、グラブス検定又はディクソンのＱ検定に基づく外れ値ルールが適用され得る。外れ値分析試験は、結果の１つを外れ値として分析から省き得るかどうかを決定するために、３連のデータポイントに適用され得る。外れ値の除外が統計的に有意（有意水準：α＝０．０５）であり、許容される場合、有効な２連結果を用いてデータ解析を繰り返す。２連データポイントに基づく結果は、対照群及び標準が有効であるための全ての許容基準を満たさなければならない。外れ値の決定（有意水準アルファ０．０５の両側検定）は、当業者に知られたオンライン又はオフラインリソースを用いて試験することができる）。データの報告及び解釈の例を表３０に示す。
【0164】
【表32】
【0165】
実施例５ 定量アッセイの適格性
試験試料結果の許容基準
定量分析の適格性の確認を行った。以下のパラメータ：特異性、検出限界（ＬＯＤ）、直線性、ダイナミックレンジ、併行精度（アッセイ内特異性）及び室内再現精度（実験室内精度）を含む精度、真度、定量限界（ＬＯＱ）並びに頑健性が適格であり、アッセイ検証が決定された。
試験試料結果の許容基準
定量分析の適格性の確認を行った。以下のパラメータ：特異性、検出限界（ＬＯＤ）、直線性、ダイナミックレンジ、併行精度（アッセイ内特異性）及び室内再現精度（実験室内精度）を含む精度、真度、定量限界（ＬＯＱ）並びに頑健性が適格であり、アッセイ検証が決定された。
【0166】
特異性：試料マトリックス効果（偽陽性がないことを試験するため）
アッセイが偽陽性結果（ｑＰＣＲが標的配列の非存在下で誤って陽性をもたらすエラー）を生じないことを実証するために、以下の試料マトリックスを試験した。
アッセイが偽陽性結果（ｑＰＣＲが標的配列の非存在下で誤って陽性をもたらすエラー）を生じないことを実証するために、以下の試料マトリックスを試験した。
【0167】
試験した細胞株：ＰＧ４（形質転換されたネコ脳モロニー肉腫ウイルス）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）、３２４Ｋ（ＳＶ４０形質転換ヒト新生児腎臓）、Ｌ９２９（マウス線維芽細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）、ＭＤＢＫ（マディン－ダービーウシ腎臓）、ＮＲＫ（正常ラット腎臓）、ヒト白血球（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ）。試験した培地：ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ ９Ａ、ＨＡＭ Ｆ１２。試験した動物血清：ウシ胎児血清及びウマ血清。
【0168】
許容基準では、試験した全ての試料が６ＰＣＲ反復の少なくとも５反復で陰性の結果を示す必要があった。６反復のうち、６反復で偽陽性は検出されなかった。
【0169】
特異性：ＢＰＶ－３検出（偽陰性がないことを試験するため）
アッセイが偽陰性結果（標的配列の存在下でｑＰＣＲが誤って陰性を示すエラー）を生じないことを実証するために、上記の細胞株、培地及び動物血清に、ＢＰＶ－３陽性対照プラスミド（５０，０００ゲノムコピー／２００μＬの試料）をスパイクし、続いて、実施例４に記載のように、ＤＮＡを抽出し、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイを行った。許容基準では、６反復の少なくとも５反復で陽性の結果を示す必要があった。試験した試料の全てが、ＢＶＰ－３を検出する６反復のうち、６反復でＢＶＰ－３の検出を示した。偽陰性は検出されなかった。
アッセイが偽陰性結果（標的配列の存在下でｑＰＣＲが誤って陰性を示すエラー）を生じないことを実証するために、上記の細胞株、培地及び動物血清に、ＢＰＶ－３陽性対照プラスミド（５０，０００ゲノムコピー／２００μＬの試料）をスパイクし、続いて、実施例４に記載のように、ＤＮＡを抽出し、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイを行った。許容基準では、６反復の少なくとも５反復で陽性の結果を示す必要があった。試験した試料の全てが、ＢＶＰ－３を検出する６反復のうち、６反復でＢＶＰ－３の検出を示した。偽陰性は検出されなかった。
【0170】
特異性：交差反応性
アッセイの交差反応性を決定するために、密接に関連するウイルス種／分離株について、排他性及び包括性を評価した。
アッセイの交差反応性を決定するために、密接に関連するウイルス種／分離株について、排他性及び包括性を評価した。
【0171】
排他性は、アッセイが標的配列に密接に関連する非標的ウイルス種／分離株を検出しないことを実証した。ＢＰＶ－１（ウシパルボウイルス１（Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ １）、ＶＲ－７６７（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ＢＰＶ－２（ウシパルボウイルス２（Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ２））及びＭＭＶｐ（マウス微小ウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｉｎｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ）プロトタイプ）ウイルスを上記のように抽出した。ＢＰＶ－２は市販されていないため、ＢＰＶ－２の完全長非構造（ＮＳ）遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００６２５９）を合成し、プラスミドにクローニングし、シーケンシングにより確認した。プラスミドを、１ＰＣＲ反応あたり１Ｅ６ＧＣの濃度を有するＢＰＶ－２参照分離株として使用した。
【0172】
ウイルス種／分離株を、実施例４に記載されるように、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイにおいて使用した。許容基準では、試験した全ての試料が６反復の少なくとも５反復で陰性の結果を示す必要があった。ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲの結果は、これらの密接に関連する種との交差反応性を示さず、６反復のうち、６反復で非標的種／分離株を検出しないという許容基準を満たした。
【0173】
包括性は、アッセイがＢＰＶ－３標的配列種／分離株を特異的に検出することができることを実証する。以前に確認されたＢＰＶ－３陽性のウシ胎児血清試料（ＢＰＶ－３の完全長ゲノム配列決定によって確認した）を抽出し、続いてＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイを行った。この手順の許容基準では、試験した試料が６反復の少なくとも５反復で陽性結果を示す必要があった。ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイの結果は、ＢＰＶ－３ ＤＮＡを特異的に検出し、６反復のうち、６反復で標的分離株を検出するという許容基準を満たした。
【0174】
検出限界（ＬＯＤ）
検出限界（ＬＯＤ）は、検出可能な標的配列の最低量であるが、必ずしも正確な値として定量されるわけではない。ＬＯＤ９５％検出限界アプローチによるプロビット分析を、アッセイＬＯＤを決定するために使用した。ＬＯＤ９５％は、ｑＰＣＲアッセイにおいて９５％の検出確率（ＰＯＤ）を保証するために必要とされる標的ＤＮＡ配列のコピー数である。
検出限界（ＬＯＤ）は、検出可能な標的配列の最低量であるが、必ずしも正確な値として定量されるわけではない。ＬＯＤ９５％検出限界アプローチによるプロビット分析を、アッセイＬＯＤを決定するために使用した。ＬＯＤ９５％は、ｑＰＣＲアッセイにおいて９５％の検出確率（ＰＯＤ）を保証するために必要とされる標的ＤＮＡ配列のコピー数である。
【0175】
ＢＰＶ－３ 陽性対照ＤＮＡ（１０００、１００、５０、２５、２０、１０、５及び１ゲノムコピー／反応）を外因性抽出ＤＮＡ（約３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ）にスパイクし、実施例４に記載のようにＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイを用いて試験した。各濃度を１２ＰＣＲ反復で試験し、統計的に信頼できるＰＯＤ曲線を得て、そこから９５％信頼区間（ＣＩ）を有するＬＯＤ９５％を導出した。実験は３人の異なる分析者によって繰り返された。３９．９９以下のＣＴ値はいずれも陽性シグナルとみなし、未確定のＣＴ値（ＣＴ＝４０．００）はいずれも陰性シグナルとみなした。（全ての分析者から集めた）各濃度についての３６セットポイントを、プロビット分析のために得て、統計的に信頼できるＰＯＤ曲線を作成し、それから９５％信頼区間（ＣＩ）を有するＬＯＤ９５％を導出した（表３１及び図２を参照）。プロビット分析の結果、ＢＰＶ－３ ｑＰＣＲアッセイＬＯＤ９５％は２７ＧＣ／ｒｘｎであり、９５％信頼区間は２２及び３４ＧＣ／ｒｘｎであった。
【0176】
【表33】
【0177】
ダイナミックレンジ及び直線性
適切な精度、真度及び直線性は、分析手順のダイナミックレンジ内で示されなければならない。直線性（検量線の最小及び最大ダイナミック（操作）範囲）を評価するために、所定のコピー数の陽性対照プラスミドを含む８桁に及ぶ濃度で予備検量線を作製し評価した。ＢＶＰ－３アッセイにおいて、１Ｅ８、１Ｅ７、１Ｅ６、１Ｅ５、１Ｅ４、１Ｅ３、１Ｅ２及び１Ｅ１ゲノムコピー／反応のそれぞれで３反復を使用した。
適切な精度、真度及び直線性は、分析手順のダイナミックレンジ内で示されなければならない。直線性（検量線の最小及び最大ダイナミック（操作）範囲）を評価するために、所定のコピー数の陽性対照プラスミドを含む８桁に及ぶ濃度で予備検量線を作製し評価した。ＢＶＰ－３アッセイにおいて、１Ｅ８、１Ｅ７、１Ｅ６、１Ｅ５、１Ｅ４、１Ｅ３、１Ｅ２及び１Ｅ１ゲノムコピー／反応のそれぞれで３反復を使用した。
【0178】
アッセイ適用及び予想される用途についてだけでなく、予備試験結果から導出された許容可能な検量線性能パラメータについても、少なくとも６とおりの大きさを操作範囲に選択した。この手順では、選択した６とおりの選択された大きさ（最大及び最小の設定点を含む）内の検量線の直線性は、（ｉ）相関係数（Ｒ２）が≧０．９８及び（ｉｉ）ＰＣＲ増幅効率が９０～１１０％の許容基準を満たさなければならない。
【0179】
７つの設定点（１Ｅ２～１Ｅ８ゲノムコピー／反応）におけるダイナミックレンジはアッセイの許容基準を満たしたが、最小及び最大の標準範囲として１Ｅ２～１Ｅ８の７つの設定点の使用は頑健ではないと予想された。したがって、定量下限（ＬＯＱ）の上位の大きさ（１Ｅ３）を選択し、検量線の最小及び最大ダイナミックレンジを、１Ｅ３～１Ｅ８ゲノムコピー／反応間の６つのデータ設定点とした（表３２）。
【0180】
【表34】
【0181】
真度及び精度
アッセイの真度（ａｃｃｕｒａｃｙ）（真度（ｔｒｕｅｎｅｓｓ））及び精度（併行精度及び室内再現精度）を決定した。真度及び精度を決定するために、ＢＰＶ－３について定義された範囲及びゲノムコピー数（１Ｅ８、１Ｅ７、１Ｅ６、１Ｅ５、１Ｅ４及び１Ｅ３ゲノムコピー／反応）を有する陽性対照プラスミドの２つの別個のセットを調製し、ＢＶＰ－３アッセイを行う１つの９６ウェルＰＣＲ反応プレートにおいて並行して試験した。一方のセットを標準参照設定点として使用し、他方のセットをアッセイ評価に使用した。この手順は、異なる日に３人の異なる分析者によって試験された。
アッセイの真度（ａｃｃｕｒａｃｙ）（真度（ｔｒｕｅｎｅｓｓ））及び精度（併行精度及び室内再現精度）を決定した。真度及び精度を決定するために、ＢＰＶ－３について定義された範囲及びゲノムコピー数（１Ｅ８、１Ｅ７、１Ｅ６、１Ｅ５、１Ｅ４及び１Ｅ３ゲノムコピー／反応）を有する陽性対照プラスミドの２つの別個のセットを調製し、ＢＶＰ－３アッセイを行う１つの９６ウェルＰＣＲ反応プレートにおいて並行して試験した。一方のセットを標準参照設定点として使用し、他方のセットをアッセイ評価に使用した。この手順は、異なる日に３人の異なる分析者によって試験された。
【0182】
併行精度（アッセイ内精度）では、量（標的配列のゲノムコピー／反応）の平均及び標準偏差並びに量のＣＶ％（変動係数）を各濃度においてそれぞれ三連で計算した。量のＣＶ％が≦２５％であることがこの手順の許容基準であった。
【0183】
室内再現精度（実験室内精度）では、量の平均及び標準偏差並びにＣＶ％（変動係数）を、３つの独立した実験の全ての濃度で全て３連のＰＣＲ反応から計算した。許容基準は、量のＣＶ％が≦３０％であることであった。
【0184】
真度については、（アッセイを実施する異なる分析者における固有の変動性、異なる検出システム及びアッセイが異なる時間／時間で実施されることを考慮して）、平均量（標的配列のゲノムコピー／反応）を、各濃度（１Ｅ８、１Ｅ７、１Ｅ６、１Ｅ５、１Ｅ４及び１Ｅ３）での各３連のＰＣＲ反応から計算した。許容基準は、量のＣＶ％が上記の各試料濃度について計算されることであった。許容基準は、平均定量値がアッセイのダイナミックレンジ全体にわたって基準値の±３０％以内であることであった。この手順の許容基準では、各独立した実験の直線性が、相関係数（Ｒ２）が≧０．９８であり、且つＰＣＲ増幅効率が９０～１１０％であることを示さなければならないことも要求された。
【0185】
３つの独立した試験の結果は、アッセイが直線性について確立された許容基準を満たしていることを示した（表３３～３６を参照）。併行精度は≦２５％であり、室内再現精度は≦２５％であり、真度は±３０％以内であった。直線性も、相関係数（Ｒ２）が≧０．９８で、ＰＣＲ増幅効率が９０～１１０％と許容基準内であった。
【0186】
【表35】
【0187】
【表36】
【0188】
【表37】
【0189】
【表38】
【0190】
定量限界
定量的ｑＰＣＲアッセイの定量限界（ＬＯＱ）は、適切な精度及び真度で定量的に決定することができる試料中の標的配列の最低量である。ＬＯＱを決定するために、ダイナミックレンジの最低設定点（１Ｅ３ゲノムコピー／反応）、中間設定点（１Ｅ４及び１Ｅ６ゲノムコピー／反応）及び上限設定点（１Ｅ８ゲノムコピー／反応）を試験した。ダイナミックレンジの最低、中間及び上限の設定点の濃度を有する陽性対照試料を調製し、外因性抽出ＤＮＡ試料（バックグラウンド試料マトリックスＤＮＡとして機能する、１反応あたり約３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ）にスパイクし、検量線の存在下でＢＶＰ－３アッセイを１２連で行い評価した。アッセイは、異なる日に３人の分析者によって実施された。精度（併行精度及び室内再現精度）及び真度は、上記のように、上記の許容基準で決定した。
定量的ｑＰＣＲアッセイの定量限界（ＬＯＱ）は、適切な精度及び真度で定量的に決定することができる試料中の標的配列の最低量である。ＬＯＱを決定するために、ダイナミックレンジの最低設定点（１Ｅ３ゲノムコピー／反応）、中間設定点（１Ｅ４及び１Ｅ６ゲノムコピー／反応）及び上限設定点（１Ｅ８ゲノムコピー／反応）を試験した。ダイナミックレンジの最低、中間及び上限の設定点の濃度を有する陽性対照試料を調製し、外因性抽出ＤＮＡ試料（バックグラウンド試料マトリックスＤＮＡとして機能する、１反応あたり約３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ）にスパイクし、検量線の存在下でＢＶＰ－３アッセイを１２連で行い評価した。アッセイは、異なる日に３人の分析者によって実施された。精度（併行精度及び室内再現精度）及び真度は、上記のように、上記の許容基準で決定した。
【0191】
３つの独立したＬＯＱ実験の結果は、併行精度、室内再現精度及び真度（表３７～３９）並びに直線性（表４０）で、確立された許容基準内であった。
【0192】
【表39】
【0193】
【表40】
【0194】
【表41】
【0195】
【表42】
【0196】
【表43】
【0197】
【表44】
【0198】
【表45】
【0199】
頑健性
アッセイの頑健性を決定するために、Ｙｏｕｄｅｎ及びＳｔｅｉｎｅｒ（上記）の方法に従って、２０％までの重要な試薬の濃度の変化を評価した。いくつかの重要なｑＰＣＲ因子を選択し、わずかに変化させた（表４１）。ＢＰＶ－３陽性のウシ胎児血清試験試料を抽出し、検量線と並行してＢＰＶ－３アッセイの最適条件及び変化させた条件を用いて１２反復で試験した。
アッセイの頑健性を決定するために、Ｙｏｕｄｅｎ及びＳｔｅｉｎｅｒ（上記）の方法に従って、２０％までの重要な試薬の濃度の変化を評価した。いくつかの重要なｑＰＣＲ因子を選択し、わずかに変化させた（表４１）。ＢＰＶ－３陽性のウシ胎児血清試験試料を抽出し、検量線と並行してＢＰＶ－３アッセイの最適条件及び変化させた条件を用いて１２反復で試験した。
【0200】
【表46】
【0201】
この手順の許容基準では、適用した微小変化に関して頑健性条件から得られた応答が確立されたアッセイの許容基準を満たすことが要求された。この手順の許容基準には精度が含まれ、併行精度及び室内再現精度のＣＶ％は、上記のように≦２５％であった。真度については、組み合わせマトリックス条件（条件１～４）の量の平均が、最適条件の量の平均の±３０％であった。
【0202】
頑健性試験の結果は、最適条件と比較した場合、重要なｑＰＣＲ試薬のわずかな変化は許容可能であり、頑健性の結果は、精度及び真度（１１８，１００±３５，４３０）許容基準を満たしていることを示した（表４２）。
【0203】
【表47】
【0204】
【表48】
【0205】
検証
アッセイのシステム適合性及びアッセイの許容基準を、認定プロトコルに従ってアッセイ性能を検証するために定義した（表４４を参照）。アッセイが予想通りに実施されることを実証するために、標的配列を含有する試験試料（試料Ａ）及び標的配列を有さない試験試料（試料Ｂ）をＤＮＡ抽出に供し、続いてＢＰＶ－３ ｑＰＣＲに供した。検証試験は、異なる分析者によって異なる日に３回行われた。アッセイ対照、システム適合性及びアッセイ許容基準並びに試験結果の報告及び解釈を表４３～４４に示す。
アッセイのシステム適合性及びアッセイの許容基準を、認定プロトコルに従ってアッセイ性能を検証するために定義した（表４４を参照）。アッセイが予想通りに実施されることを実証するために、標的配列を含有する試験試料（試料Ａ）及び標的配列を有さない試験試料（試料Ｂ）をＤＮＡ抽出に供し、続いてＢＰＶ－３ ｑＰＣＲに供した。検証試験は、異なる分析者によって異なる日に３回行われた。アッセイ対照、システム適合性及びアッセイ許容基準並びに試験結果の報告及び解釈を表４３～４４に示す。
【0206】
【表49】
【0207】
【表50】
【0208】
検証試験の結果
表４５、４７及び４９は、３つの独立した実験のアッセイシステム適合性及びアッセイ対照の結果を示す。３つの独立した実験は全て、本明細書で定義される確立されたシステム適合性及びアッセイ対照の許容基準を満たした。表４５、４７及び４９に、試験試料の結果を示す（試料Ａ：以前に要請が確認された試料及びサンプルＢ：以前に陰性が確認された試料）。検証試験の結果は、３つの独立した実験の全てで、陰性試料（試料Ｂ）においてＢＰＶ－３は検出されず、３つの独立した実験の全てで、陽性試料（試料Ａ）においてＢＰＶ－３が検出され、定量され得ることを示した。
表４５、４７及び４９は、３つの独立した実験のアッセイシステム適合性及びアッセイ対照の結果を示す。３つの独立した実験は全て、本明細書で定義される確立されたシステム適合性及びアッセイ対照の許容基準を満たした。表４５、４７及び４９に、試験試料の結果を示す（試料Ａ：以前に要請が確認された試料及びサンプルＢ：以前に陰性が確認された試料）。検証試験の結果は、３つの独立した実験の全てで、陰性試料（試料Ｂ）においてＢＰＶ－３は検出されず、３つの独立した実験の全てで、陽性試料（試料Ａ）においてＢＰＶ－３が検出され、定量され得ることを示した。
【0209】
【表51】
【0210】
【表52】
【0211】
ＢＰＶ－３は、試料Ａにおいて、Ｌｏｇ１０７．０１±０．０１ゲノムコピー／ｍＬ（平均±ＳｔｄＤｅｖ）の濃度で検出された。サンプルＢでは、ＢＰＶ－３は検出されなかった。
【0212】
【表53】
【0213】
【表54】
【0214】
ＢＰＶ－３は、試料Ａにおいて、Ｌｏｇ１０７．０４±０．０１ゲノムコピー／ｍＬ（平均±ＳｔｄＤｅｖ）の濃度で検出された。サンプルＢでは、ＢＰＶ－３は検出されなかった。
【0215】
【表55】
【0216】
【表56】
【0217】
ＢＰＶ－３は、試料Ａにおいて、Ｌｏｇ１０７．０４±０．０１ゲノムコピー／ｍＬ（平均±ＳｔｄＤｅｖ）の濃度で検出される。サンプルＢでは、ＢＰＶ－３は検出されない。
【0218】
表５１は、確立されたＢＰＶ－３アッセイ適格基準を示す。適格な定量ＢＰＶ－３アッセイは、１ＰＣＲ反応あたり１Ｅ３～１Ｅ８のＢＰＶ－３ゲノムコピーの定量を可能にする。
【0219】
【表57】
【0220】
試験試料Ａ及びＢは、特異性、検出限界、定量限界、直線性、精度、真度及び頑健性を含む、定量アッセイに要求される適格性仕様を満たした。
【0221】
全ての試験試料（試料Ａ及びＢ）は、提案されたシステム適合性及びアッセイの許容基準を満たした。３つの独立した試験の定量レベルは、同様の結果を示し（表４５、４７及び４９）、適格なアッセイの正確で、高精度で、且つ頑健な性能を示した。定量ＢＰＶ－３アッセイ及び関連する適格性データは、ＢＰＶ－３定量リアルタイムＰＣＲアッセイが試験試料中のＢＰＶ－３ ＤＮＡの検出及び定量を可能にすることを実証した。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】