▶ モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】新規の徐放性プロドラッグ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20231220BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231220BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20231220BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231220BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231220BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20231220BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231220BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231220BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231220BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18
C07K19/00
C07K14/47
A61K45/00
A61K39/395 N
A61K38/16
A61P43/00 105
A61P43/00 123
C12N15/13 ZNA
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536079
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-08-01
(86)【国際出願番号】 IB2021061888
(87)【国際公開番号】W WO2022130300
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/126,356
(32)【優先日】2020-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/182,394
(32)【優先日】2021-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515146556
【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ボスハート アンドレアス
(72)【発明者】
【氏名】アールスコーグ ユリア
(72)【発明者】
【氏名】シュレーレス ベルント
(72)【発明者】
【氏名】アムステュツ パトリック
(72)【発明者】
【氏名】フォンテーヌ シモン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA17
4C084BA02
4C084CA53
4C084NA12
4C084NA14
4C084NA15
4C084ZB21
4C085AA14
4C085DD62
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、結合部分及び薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が、当該薬物分子に可逆的に結合して、インビボでの投与時に薬物分子を徐放するプロドラッグ複合体を形成する、組成物に関する。本発明は更に、そのような組成物を形成する方法、及びそのような組成物を使用する治療方法に関する。結合部分、当該結合部分をコードする核酸、及び宿主細胞を使用してこれらを作製する方法についても記載されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）結合部分及び（ｉｉ）薬物分子を含む組成物であって、前記結合部分が、前記薬物分子に可逆的に結合し、前記結合部分が、結合した場合に、前記薬物分子の生物学的活性を阻害する、組成物。
【請求項2】
前記結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記薬物分子の前記生物学的活性が、前記薬物分子の生物学的標的への結合である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記薬物分子に対する前記結合部分の結合親和性が、哺乳動物への前記組成物の投与時の時間の関数としての前記薬物分子の放出を可能にする、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記結合部分が、１０ｎＭ未満の解離定数（ＫD）で前記薬物分子に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記結合部分が、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1の前記薬物分子からのオフレート（ｋoff）を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記結合部分が、前記薬物分子と複合体化された場合に遮断半減期（Ｔ1/2）を有し、前記遮断半減期が、以下の式：【数1】
【請求項8】
前記遮断半減期（Ｔ1/2）が、少なくとも約２時間である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記結合部分が、設計アンキリン反復ドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記設計アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記設計アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１～１０及び（２）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項12】
前記薬物分子が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記薬物分子が、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記結合部分の前記ＴＣＥ薬物分子への結合が、前記ＴＣＥ薬物分子のＴ細胞への結合及び／又はＴ細胞の活性化を阻害する、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項15】
療法に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／１２６，３５６号、２０２０年１２月２２日に出願された欧州特許第２０２１６７０５号、及び２０２１年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１８２，３９４号に対する優先権の利益を主張するものである。これら特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／１２６，３５６号、２０２０年１２月２２日に出願された欧州特許第２０２１６７０５号、及び２０２１年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１８２，３９４号に対する優先権の利益を主張するものである。これら特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１２月１６日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、１３０８１＿００２７－００３０４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、５４，３１０バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１２月１６日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、１３０８１＿００２７－００３０４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、５４，３１０バイトのサイズである。
【0003】
本発明は、結合部分及び薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が、当該薬物分子に可逆的に結合して、インビボでの投与時に薬物分子を徐放するプロドラッグ複合体を形成する、組成物に関する。本発明は更に、そのような組成物を形成する方法、及びそのような組成物を使用する治療方法に関する。結合部分、当該結合部分をコードする核酸、及び宿主細胞を使用してこれらを作製する方法についても記載されている。
【背景技術】
【0004】
実行可能な薬物候補が特定の有効性基準を満たす必要があることは明らかであるが、薬物候補が許容できる安全性プロファイルを有することも重要である。多くの薬物分子は、いくつかの有害なオフターゲット及び／又はオンターゲット副作用を有し、いくつかの薬物分子はまた、薬物分子の意図される標的における過剰な有害な薬理作用により、有害なオンターゲット作用を引き起こし得る。特定の薬物では、有害作用を回避することができないので、有害作用を軽減する必要がある。これにはいくつかの選択肢がある。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（nonsteroidal anti-inflammatory drugs）（ＮＳＡＩＤ）は、胃の内膜を損傷し得るため、胃を保護する薬剤、例えば、プロトンポンプ阻害剤オメプラゾールと共投与されることが多い。他の薬物分子については、薬物が複数回用量で、又はより長い期間にわたって連続的に患者に投与されるような特定の投与レジメンを使用して、有害作用又はそのリスクを軽減することができる。これの例は、薬物を１日に複数回服用すること、又は薬物の静脈内（ＩＶ）注入を含むことができる。
【0005】
分割投与及び静脈内薬物注入は、認識され受け入れられている投薬の方法であるが、欠点がないわけではない。患者にとって面倒な投与レジメン（例えば、比較的短い期間にわたって複数回の投薬を必要とする投与レジメン）は、患者の服薬遵守不良に結びつき、その結果としてより悪い治療結果となる。静脈内注入法は、患者の服薬遵守不良に悩まされる可能性が低いが、患者は医療を受ける必要がある。これは、患者にとって混乱を起こさせるものであり、医療制度に追加の負担をもたらす。結果として、有害な薬物作用を軽減する改善された方法が当該技術分野において必要とされている。
【0006】
様々な薬物の使用に関連する特に問題となる有害作用は、「サイトカインストーム」としても知られる、サイトカイン放出症候群（cytokine release syndrome）（ＣＲＳ）及び高サイトカイン血症である。例えば、ＣＲＳ又は高サイトカイン血症は、モノクローナル抗体及びＣＡＲ－Ｔ細胞などの特定の免疫療法による治療後に起こり得る。高サイトカイン血症は、典型的には、薬物の初回投与後に急速に起こり、体内でのサイトカインの制御されない過剰な放出を特徴とする。サイトカイン放出は正常な免疫機能の重要な部分であるが、血中へのあまりに多くのサイトカインのあまりに急速な放出は、高熱、炎症、重度の倦怠感、吐気などの症状、及び時には更に多臓器不全及び死を引き起こし得る。Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病及びリウマチ性関節炎の治療を目的としたＴｈｅｒａｌｉｚｕｍａｂ（セラリズマブ）薬物の臨床治験は、参加者が重度の高サイトカイン血症を発症した後に断念する必要があった。症状の発症は、投薬の１時間以内に生じ、治験の参加者全員が緊急の入院治療を必要とした。ＣＲＳはまた、免疫療法によって影響を受けた免疫細胞から血液へのサイトカインの大量かつ急速な放出によって引き起こされる。ＣＲＳの症状としては、発熱、悪心、頭痛、発疹、動悸、低血圧、及び呼吸困難が挙げられる。場合により、ＣＲＳは重篤であるか、又は生命を脅かすことがある。
【0007】
ＣＲＳと関連することが知られている薬物の１種は、Ｔ細胞エンゲージャー（T-cell engagers）（ＴＣＥ）である。ＴＣＥはまた、特に初回用量投与後に、全身性内皮活性化及び大量のリンパ球再分布、並びに神経毒性と関連する（Ｖｅｌａｓｑｕｅｚ，Ｂｌｏｏｄ，２０１８，１３１（１），３０－３８）。これらの毒性は、臨床治験設計及び用量漸増戦略に影響を与えることが多く、特に高い疾患負担を有する患者において、重症度により用量制限があることが証明されている。前投薬及び／又は積極的な治療介入も必要とされる場合があり、最終的に複雑な臨床治験設計につながる。
【0008】
Ｔ細胞エンゲージャーのような薬物の投与に関連するＣＲＳの臨床管理のために、いくつかの戦略が考案されている。これらには、段階的投薬（段階的用量漸増）、ステロイド（特にデキサメタゾン）による前治療、又はトシリズマブ（抗ＩＬ６レセプター抗体）による治療が含まれる（例えば、Ａｌｄｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９，２１：４を参照されたい）。ステロイドによる前治療は、治療の開始を遅らせ、これは侵攻的な疾患状態には推奨されず、ステロイドの使用は、高いボディマス指数（ＢＭＩ）及び／又は血圧を有する患者において禁忌であることがある。ＣＲＳを回避するためのトシリズマブによる治療は、２０１７年にＦＤＡによって承認された。しかしながら、この薬物の免疫抑制作用により、患者は他の感染性疾患に罹患しやすくなることがある。
【0009】
総合すると、癌を含む疾患の治療に使用される薬物分子の有害作用又はそのリスクを回避、低減又は軽減するための新規の又は改善されたアプローチが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0010】
本出願は、薬物分子の投与後の有害作用又はそのリスクを回避又は軽減するための新規アプローチを提供しようとするものである。本発明は、薬物製品の投与時に活性薬物分子を体内に徐放する方法を提供する。本方法は、活性薬物分子を長期間にわたって体内に放出し、それによって投与直後の体内の活性薬物分子濃度のピークを回避する、いわゆる「徐放性」組成物（本明細書ではプロドラッグ複合体とも呼ばれる）を使用する。この方法の有益な適用の例は、ＴＣＥを含む徐放性組成物を使用する、ＴＣＥの投与後のＣＲＳのリスクの低減である。
【0011】
プロドラッグ戦略は、特定の薬物が吸収され、分布され、代謝され、排出される方法に関連する問題を軽減するために採用されることが多い。一般に入手可能なプロドラッグの多くは、インビボで加水分解される小さな部分（エステル及びアミド基など）、又は投与後にリン酸化若しくは脱リン酸化される基を含有する。
【0012】
本出願において、本発明者らは、薬物分子に可逆的に結合し、結合した場合に、薬物分子の生物学的活性を阻害する結合部分を使用する新規プロドラッグアプローチを記載する。薬物分子のそのような生物学的活性は、例えば、生物学的標的への薬物分子の結合であってもよい。本発明のプロドラッグ複合体は、薬物分子に可逆的に結合したそのような結合部分を含む。薬物分子への結合部分の結合特性は、時間の関数として薬物分子の放出を可能にする。時間の関数としての薬物分子のそのような放出は、例えば、ヒトを含む対象への本発明のプロドラッグ複合体の投与時に起こり得る。本発明の結合部分は、薬物分子に対する高い親和性及び／又は薬物分子からの低いオフレートを有する。本発明の結合部分は、免疫グロブリン分子又は非免疫グロブリン分子などの異なる構造を有する分子を含む。結合部分は、抗体、操作された足場などの代替足場、及びポリペプチドを含む。そのような操作された足場の例は、設計アンキリン反復ドメインである。
【0013】
総合すると、本発明は、結合部分及び薬物分子を含む徐放性組成物、そのような組成物を作製する方法、並びにそのような組成物を使用する治療方法を提供する。本発明は、新規な結合部分、当該結合部分をコードする核酸、及び宿主細胞を用いてこれらを作製する方法を更に提供する。
【0014】
本明細書で提供される開示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。
１．第１の実施形態では、本発明は、（ｉ）結合部分及び（ｉｉ）薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が、当該薬物分子に可逆的に結合し、当該結合部分が、結合した場合に、当該薬物分子の生物学的活性を阻害する、組成物に関する。
２．第２の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、実施形態１に記載の組成物に関する。
３．第３の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、実施形態１又は２に記載の組成物に関する。
４．第４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、非免疫グロブリン分子を含む、実施形態１又は２に記載の組成物に関する。
５．第５の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６．第６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー（atrimer）、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれらに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ａ．実施形態６ａでは、本発明は、当該結合部分が、アドネクチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｂ．実施形態６ｂでは、本発明は、当該結合部分が、モノボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｃ．実施形態６ｃでは、本発明は、当該結合部分が、アフィボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｄ．実施形態６ｄでは、本発明は、当該結合部分が、アフィリンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｅ．実施形態６ｅでは、本発明は、当該結合部分が、アフィマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｆ．実施形態６ｆでは、本発明は、当該結合部分が、アプタマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｇ．実施形態６ｇでは、本発明は、当該結合部分が、アフィチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｈ．実施形態６ｈでは、本発明は、当該結合部分が、アルファボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｉ．実施形態６ｉでは、本発明は、当該結合部分が、反復タンパク質ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｊ．実施形態６ｊでは、本発明は、当該結合部分が、アルマジロ反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｋ．実施形態６ｋでは、本発明は、当該結合部分が、アトリマーに由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｌ．実施形態６ｌでは、本発明は、当該結合部分が、アビマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｍ．実施形態６ｍでは、本発明は、当該結合部分が、アンキリン反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｎ．実施形態６ｎでは、本発明は、当該結合部分が、フィノマーに由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｏ．実施形態６ｏでは、本発明は、当該結合部分が、ノッチンに由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｐ．実施形態６ｐでは、本発明は、当該結合部分が、クニッツドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｑ．実施形態６ｑでは、本発明は、当該結合部分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
７．第７の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、生物学的標的への当該薬物分子の結合である、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
８．第８の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、酵素活性である、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
９．第９の実施形態では、本発明は、当該薬物分子に対する当該結合部分の結合親和性が、哺乳動物への当該組成物の投与時の時間の関数としての薬物分子の放出を可能にする、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
１０．第１０の実施形態では、本発明は、当該哺乳動物が、ヒトである、実施形態９に記載の組成物に関する。
１１．第１１の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、１０ｎＭ未満、例えば、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、又は１ｐＭ未満の解離定数（ＫD）で当該薬物分子に結合する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
１２．第１２の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ－１、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1の当該薬物分子からのオフレート（ｋoff）を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
１３．第１３の実施形態では、本発明は、当該解離定数（ＫD）又はオフレート（ｋoff）が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定される、実施形態１１又は１２に記載の組成物に関する。
１４．第１４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、当該薬物分子と複合体化された場合に遮断半減期（Ｔ1/2）を有し、当該遮断半減期が、以下の式：
１．第１の実施形態では、本発明は、（ｉ）結合部分及び（ｉｉ）薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が、当該薬物分子に可逆的に結合し、当該結合部分が、結合した場合に、当該薬物分子の生物学的活性を阻害する、組成物に関する。
２．第２の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、実施形態１に記載の組成物に関する。
３．第３の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、実施形態１又は２に記載の組成物に関する。
４．第４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、非免疫グロブリン分子を含む、実施形態１又は２に記載の組成物に関する。
５．第５の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６．第６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー（atrimer）、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれらに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ａ．実施形態６ａでは、本発明は、当該結合部分が、アドネクチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｂ．実施形態６ｂでは、本発明は、当該結合部分が、モノボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｃ．実施形態６ｃでは、本発明は、当該結合部分が、アフィボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｄ．実施形態６ｄでは、本発明は、当該結合部分が、アフィリンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｅ．実施形態６ｅでは、本発明は、当該結合部分が、アフィマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｆ．実施形態６ｆでは、本発明は、当該結合部分が、アプタマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｇ．実施形態６ｇでは、本発明は、当該結合部分が、アフィチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｈ．実施形態６ｈでは、本発明は、当該結合部分が、アルファボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｉ．実施形態６ｉでは、本発明は、当該結合部分が、反復タンパク質ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｊ．実施形態６ｊでは、本発明は、当該結合部分が、アルマジロ反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｋ．実施形態６ｋでは、本発明は、当該結合部分が、アトリマーに由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｌ．実施形態６ｌでは、本発明は、当該結合部分が、アビマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｍ．実施形態６ｍでは、本発明は、当該結合部分が、アンキリン反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｎ．実施形態６ｎでは、本発明は、当該結合部分が、フィノマーに由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｏ．実施形態６ｏでは、本発明は、当該結合部分が、ノッチンに由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｐ．実施形態６ｐでは、本発明は、当該結合部分が、クニッツドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
６ｑ．実施形態６ｑでは、本発明は、当該結合部分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物に関する。
７．第７の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、生物学的標的への当該薬物分子の結合である、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
８．第８の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、酵素活性である、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
９．第９の実施形態では、本発明は、当該薬物分子に対する当該結合部分の結合親和性が、哺乳動物への当該組成物の投与時の時間の関数としての薬物分子の放出を可能にする、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
１０．第１０の実施形態では、本発明は、当該哺乳動物が、ヒトである、実施形態９に記載の組成物に関する。
１１．第１１の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、１０ｎＭ未満、例えば、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、又は１ｐＭ未満の解離定数（ＫD）で当該薬物分子に結合する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
１２．第１２の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ－１、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1の当該薬物分子からのオフレート（ｋoff）を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
１３．第１３の実施形態では、本発明は、当該解離定数（ＫD）又はオフレート（ｋoff）が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定される、実施形態１１又は１２に記載の組成物に関する。
１４．第１４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、当該薬物分子と複合体化された場合に遮断半減期（Ｔ1/2）を有し、当該遮断半減期が、以下の式：
【0015】
【数1】
１５．第１５の実施形態では、本発明は、当該遮断半減期（Ｔ1/2）が、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、例えば、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約５５時間又は少なくとも約６０時間である、実施形態１４に記載の組成物に関する。
１６．第１６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、設計アンキリン反復ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
１７．第１７の実施形態では、本発明は、当該設計アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、実施形態１６に記載の組成物に関する。
１８．第１８の実施形態では、本発明は、当該設計アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１～１０及び（２）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載の組成物に関する。
１９．第１９の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２０．第２０の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２１．第２１の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、非免疫グロブリン分子を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２２．第２２の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３．第２３の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー（atrimer）、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれらに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ａ．実施形態２３ａでは、本発明は、当該結合部分が、アドネクチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｂ．実施形態２３ｂでは、本発明は、当該結合部分が、モノボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｃ．実施形態２３ｃでは、本発明は、当該結合部分が、アフィボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｄ．実施形態２３ｄでは、本発明は、当該結合部分が、アフィリンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｅ．実施形態２３ｅでは、本発明は、当該結合部分が、アフィマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｆ．実施形態２３ｆでは、本発明は、当該結合部分が、アプタマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｇ．実施形態２３ｇでは、本発明は、当該結合部分が、アフィチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｈ．実施形態２３ｈでは、本発明は、当該結合部分が、アルファボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｉ．実施形態２３ｉでは、本発明は、当該結合部分が、反復タンパク質ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｊ．実施形態２３ｊでは、本発明は、当該結合部分が、アルマジロ反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｋ．実施形態２３ｋでは、本発明は、当該結合部分が、アトリマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｌ．実施形態２３ｌでは、本発明は、当該結合部分が、アビマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｍ．実施形態２３ｍでは、本発明は、当該結合部分が、アンキリン反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｎ．実施形態２３ｎでは、本発明は、当該結合部分が、フィノマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｏ．実施形態２３ｏでは、本発明は、当該結合部分が、ノッチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｐ．実施形態２３ｐでは、本発明は、当該結合部分が、クニッツドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２３ｑ．実施形態２３ｑでは、本発明は、当該結合部分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２４．第２４の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２５．第２５の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインを更に含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２５ａ．実施形態２５ａでは、本発明は、当該腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、ＣＤ３３である、実施形態２５に記載の組成物に関する。
２５ｂ．実施形態２５ｂでは、本発明は、当該腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、ＣＤ１２３である、実施形態２５に記載の組成物に関する。
２６．第２６の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２７．第２７の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、設計アンキリン反復ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
２８．第２８の実施形態では、本発明は、当該設計アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２７に記載の組成物に関する。
２９．第２９の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、抗体を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
３０．第３０の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である抗体である、実施形態２９に記載の組成物に関する。
３１．第３１の実施形態では、本発明は、当該ＴＣＥが、ＣＤ３に結合する結合ドメインを含み、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する結合ドメインを更に含む、実施形態３０に記載の組成物に関する。
３１ａ．実施形態３１ａでは、本発明は、当該腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、ＣＤ３３である、実施形態３１に記載の組成物に関する。
３１ｂ．実施形態３１ｂでは、本発明は、当該腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、ＣＤ１２３である、実施形態３１に記載の組成物に関する。
３２．第３２の実施形態では、本発明は、当該結合部分の当該ＴＣＥ薬物分子への結合が、当該ＴＣＥ薬物分子のＴ細胞への結合及び／又はＴ細胞の活性化を阻害する、実施形態２４～３１ｂのいずれかに記載の組成物に関する。
３３．第３３の実施形態では、本発明は、当該ＴＣＥが、二重特異性抗体である、実施形態２４～２８及び３０～３２のいずれか１つに記載の組成物に関する。
３４．第３４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、当該薬物分子の抗イディオタイプ結合剤である、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
３５．第３５の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を追加的に含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
３６．第３６の実施形態では、本発明は、療法に使用するための、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
３７．第３７の実施形態では、本発明は、増殖性疾患の治療に使用するための、実施形態３６に記載の使用のための組成物であって、任意選択で、当該増殖性疾患が、癌である、組成物に関する。
３８．第３８の実施形態では、本発明は、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、治療方法に関する。
３９．第３９の実施形態では、本発明は、増殖性疾患を治療する方法であって、任意選択で、当該増殖性疾患が、癌である、実施形態３８に記載の方法に関する。
４０．第４０の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化の方法を必要とする対象における、Ｔ細胞活性化の方法であって、実施形態２４～２８及び３０～３２のいずれか１つに記載の組成物を、当該対象に投与するステップを含み、任意選択で、当該組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤を追加的に含む、方法に関する。
４１．第４１の実施形態では、本発明は、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、インビボで活性薬物分子の放出を制御する方法に関する。
４２．第４２の実施形態では、本発明は、当該対象が、ヒトである、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法に関する。
４３．第４３の実施形態では、本発明は、制御放出製剤を作製する方法であって、
（ｉ）実施形態１～６、９及び１１～１８のいずれか１つに定義される結合部分を提供するステップと、
（ｉｉ）実施形態１９～２３のいずれか１つに定義される薬物分子を提供するステップと、
（ｉｉｉ）当該薬物分子の実質的に全てが当該結合部分によって結合されるように、当該結合部分及び活性薬物分子を平衡に到達させるステップと、を含む、方法に関する。
４４．第４４の実施形態では、本発明は、薬物分子の生物学的活性を制御する方法であって、実施形態１～６、９及び１１～１８のいずれか１つに定義される結合部分を実施形態１９～２３のいずれか１つに定義される薬物分子と組み合わせて、組成物を形成することと、当該組成物を、それを必要とする患者に投与することと、を含む、方法に関する。
４５．第４５の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、生物学的標的への当該薬物分子の結合である、実施形態４４に記載の方法に関する。
４６．第４６の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、酵素活性である、実施形態４５に記載の方法に関する。
４７．第４７の実施形態では、本発明は、薬物分子に対して結合特異性を有する結合部分であって、当該結合部分が、当該薬物分子に結合した場合に、当該薬物分子の生物学的活性を阻害する、結合部分に関する。
４８．第４８の実施形態では、本発明は、当該結合部分の当該薬物分子への結合が、当該薬物分子の生物学的活性を可逆的に阻害する複合体を形成する、実施形態４７に記載の結合部分に関する。
４９．第４９の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、生物学的標的への当該薬物分子の結合である、実施形態４７又は４８に記載の結合部分に関する。
５０．第５０の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、酵素活性である、実施形態４７～４９のいずれかに記載の結合部分に関する。
５１．第５１の実施形態では、本発明は、１０ｎＭ未満、例えば、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満又は１ｐＭ未満の当該薬物分子に対する結合親和性（ＫD）を有する、実施形態４７～５０のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
５２．第５２の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ－１、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1の当該薬物分子からのオフレート（ｋoff）を有する、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
５３．第５３の実施形態では、本発明は、当該解離定数（ＫD）又はオフレート（ｋoff）が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定される、実施形態５１又は５２に記載の結合部分に関する。
５４．第５４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、当該薬物分子と複合体化された場合に遮断半減期（Ｔ1/2）を有し、当該遮断半減期が、以下の式：
【0016】
【数2】
５５．第５５の実施形態では、本発明は、当該遮断半減期（Ｔ1/2）が、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、例えば、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約５５時間又は少なくとも約６０時間である、実施形態５４に記載の結合部分に関する。
５６．第５６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、実施形態４７～５５のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
５７．第５７の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、実施形態４７～５６のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
５８．第５８の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、非免疫グロブリン分子を含む、実施形態４７～５６のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
５９．第５９の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５８のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
６０．第６０の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー（atrimer）、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれらに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
６０ａ．実施形態６０ａでは、本発明は、当該結合部分が、アドネクチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｂ．実施形態６０ｂでは、本発明は、当該結合部分が、モノボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｃ．実施形態６０ｃでは、本発明は、当該結合部分が、アフィボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｄ．実施形態６０ｄでは、本発明は、当該結合部分が、アフィリンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｅ．実施形態６０ｅでは、本発明は、当該結合部分が、アフィマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｆ．実施形態６０ｆでは、本発明は、当該結合部分が、アプタマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｇ．実施形態６０ｇでは、本発明は、当該結合部分が、アフィチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｈ．実施形態６０ｈでは、本発明は、当該結合部分が、アルファボディーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｉ．実施形態６０ｉでは、本発明は、当該結合部分が、反復タンパク質ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｊ．実施形態６０ｊでは、本発明は、当該結合部分が、アルマジロ反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｋ．実施形態６０ｋでは、本発明は、当該結合部分が、アトリマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｌ．実施形態６０ｌでは、本発明は、当該結合部分が、アビマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｍ．実施形態６０ｍでは、本発明は、当該結合部分が、アンキリン反復ドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｎ．実施形態６０ｎでは、本発明は、当該結合部分が、フィノマーに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｏ．実施形態６０ｏでは、本発明は、当該結合部分が、ノッチンに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｐ．実施形態６０ｐでは、本発明は、当該結合部分が、クニッツドメインに由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６０ｑ．実施形態６０ｑでは、本発明は、当該結合部分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか、又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態４７～５９のいずれかに記載の組成物に関する。
６１．第６１の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、設計アンキリン反復ドメインである、実施形態４７～６０のいずれか１つに記載の結合部分に関する。
６２．第６２の実施形態では、本発明は、当該設計アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、実施形態６１に記載の結合部分に関する。
６３．第６３の実施形態では、本発明は、当該設計アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１～１０及び（２）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６１又は６２に記載の結合部分に関する。
６４．第６４の実施形態では、本発明は、実施形態４７～６０のいずれかに記載の結合部分をコードする、核酸に関する。
６５．第６５の実施形態では、本発明は、実施形態６１～６３のいずれかに記載の設計アンキリン反復ドメインをコードする、核酸に関する。
６６．第６６の実施形態では、本発明は、実施形態６４又は６５に記載の核酸分子を含む、宿主細胞に関する。
６７．第６７の実施形態では、本発明は、実施形態４７～６３のいずれか１つに記載の結合部分を作製する方法であって、当該結合部分が発現される条件下で実施形態６６に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法に関する。
６８．第６８の実施形態では、本発明は、当該宿主細胞が、原核宿主細胞である、実施形態６７に記載の方法に関する。
６９．第６９の実施形態では、本発明は、当該宿主細胞が、真核宿主細胞である、実施形態６７に記載の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】患者への本発明のプロドラッグ複合体の単回用量投与後の、血漿中の総薬物分子（「総薬物」）、プロドラッグ複合体（「複合体化薬物」）、未結合薬物分子（「遊離薬物」）、及び未結合結合部分（「遊離結合剤」）の濃度のコンピュータシミュレーションである。図１は、投与時に実質的に完全に複合体化された薬物分子から開始した、経時的な（１０週間の期間）異なる分子及びプロドラッグ複合体の濃度の推移を図示する。未結合（活性）薬物の濃度は、約１０日後に複合体化（不活性）薬物よりも高い濃度に達し、５週間後に総薬物の大部分を占める。遊離結合剤は、系から迅速に除去され、従って、薬物分子から解離した後に薬物分子に再結合することができない。示されるように、遊離（活性）薬物の濃度は、投与時に総薬物の濃度に決して到達しない。従って、プロドラッグ複合体からの薬物分子の徐放により、本発明のプロドラッグ複合体の投与後に得られる遊離（活性）薬物の最大濃度（Ｃmax）は、複合体化されていない形態の同じ総量の薬物分子の投与後に得られるＣmaxと比較して有意に減少する。
【図2】未結合薬物分子（「結合剤を含まない遊離薬物」、点線）又は結合部分に結合した薬物分子を含むプロドラッグ複合体（「薬物＋結合剤」、実線）のいずれかの反復用量投与後の未結合（活性）薬物分子の濃度のコンピュータシミュレーションであり、そこでは、いずれの場合でも、同じ総量の薬物分子が患者に投与される。示されるように、薬物分子に対して異なる結合親和性を有する結合部分を用いて生成された３つの異なるプロドラッグ複合体が示される。図２は、本発明のプロドラッグ複合体を用いて、Ｃmaxの低下及び活性薬物分子の曝露の増加遅延を達成することができることを示す。更に、Ｃmax減少の程度及び曝露の増加遅延は、薬物分子に対する結合部分の結合親和性に依存する。結合親和性が高いほど、Ｃmaxの減少が強く、曝露の増加が遅延する。
【図3a】プロドラッグ複合体を患者に投与する前に、結合部分（「結合剤」）は薬物分子（「薬物」）に強固に結合し、それによってプロドラッグ複合体を形成する。プロドラッグ製剤において、結合部分及び薬物の両方の濃度が高いので、ｋonは結合平衡を支配し、実質的に全ての薬物分子が結合部分によって結合される。結合部分によって結合される場合、薬物分子の生物学的活性は阻害される。
【図3b】患者への投与後、溶液中の結合部分及び薬物の両方の濃度は大幅に低下し、平衡はプロドラッグ複合体の解離に有利になるようにシフトする（すなわち、ｋoffが結合平衡を支配する）。したがって、薬物分子は、経時的に結合部分から脱複合体化され、活性薬物分子を患者の体内に徐放する。
【図4】結合剤＃９の前駆体及び参照としての親結合剤と一緒に試験した異なる結合部分（結合剤＃１、＃４及び＃５）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データは、親結合剤が１～２時間の遮断Ｔ1/2を有することを示すのに対して、実施例２で試験した結合部分は、２時間の測定期間後にはるかに少ない解離を示す。この解離の大幅な低下は、親結合剤と比較してはるかに長い遮断Ｔ1/2をもたらす。
【図5a】ＴＣＥ＃１及び３つの異なる結合部分（結合剤＃４、＃５及び＃９）並びに中親和性親結合剤を用いた標準的な腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化アッセイである。試料を実施例３に記載のように調製した。腫瘍細胞死滅（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出、ＯＤ492－ＯＤ620によって決定される）を図５ａに示し、Ｔ細胞活性化（ＣＤ８＋細胞の％としてのＣＤ２５＋細胞）を図５ｂに示す。ＩＣ５０値（ｎＭ）は、示される通りである。
【図5b】ＴＣＥ＃１及び３つの異なる結合部分（結合剤＃４、＃５及び＃９）並びに中親和性親結合剤を用いた標準的な腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化アッセイである。試料を実施例３に記載のように調製した。腫瘍細胞死滅（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出、ＯＤ492－ＯＤ620によって決定される）を図５ａに示し、Ｔ細胞活性化（ＣＤ８＋細胞の％としてのＣＤ２５＋細胞）を図５ｂに示す。ＩＣ５０値（ｎＭ）は、示される通りである。
【図6a】連続希釈したＴＣＥ（ＴＣＥ＃１）の存在下でのＴＡＡ発現腫瘍細胞（ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（登録商標）で標識）のＴ細胞媒介増殖阻害（Ｔ細胞媒介死滅の代用として使用）をＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）によって決定した（実施例４を参照されたい）。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図6b】４．５日目の時点までのＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験からのＴＣＥ＃１の濃度に対するＡＵＣ（曲線下面積）データのプロットである。ＥＣ５０値をｐＭで示す（実施例４を参照されたい）。
【図7a】実施例４に記載されるように、ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害（Ｔ細胞媒介性死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、超高親和性結合部分及び中親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。以下の条件を試験した：ＴＣＥ又は結合部分の添加なし（バックグラウンド）、１０ｎＭ結合部分のみの添加（結合剤＃４、＃５及び＃９、図７ｅ）、ＴＣＥのみの添加（ＴＣＥ＃１）、結合部分：ＴＣＥの比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ＃１及び親結合剤の添加（ＴＣＥ＃１＋親結合剤）、結合部分：ＴＣＥ（の比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ及び超高親和性結合部分（結合剤＃５）の添加ＴＣＥ＃１＋結合剤＃５）。ＴＣＥ濃度は、先のＬＤＨ実験に基づくＴＣＥ＃１のＥＣ80にほぼ対応する１０ｐＭ最終濃度に設定した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図7b】実施例４に記載されるように、ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害（Ｔ細胞媒介性死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、超高親和性結合部分及び中親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。以下の条件を試験した：ＴＣＥ又は結合部分の添加なし（バックグラウンド）、１０ｎＭ結合部分のみの添加（結合剤＃４、＃５及び＃９、図７ｅ）、ＴＣＥのみの添加（ＴＣＥ＃１）、結合部分：ＴＣＥの比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ＃１及び親結合剤の添加（ＴＣＥ＃１＋親結合剤）、結合部分：ＴＣＥ（の比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ及び超高親和性結合部分（結合剤＃５）の添加ＴＣＥ＃１＋結合剤＃５）。ＴＣＥ濃度は、先のＬＤＨ実験に基づくＴＣＥ＃１のＥＣ80にほぼ対応する１０ｐＭ最終濃度に設定した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図7c】実施例４に記載されるように、ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害（Ｔ細胞媒介性死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、超高親和性結合部分及び中親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。以下の条件を試験した：ＴＣＥ又は結合部分の添加なし（バックグラウンド）、１０ｎＭ結合部分のみの添加（結合剤＃４、＃５及び＃９、図７ｅ）、ＴＣＥのみの添加（ＴＣＥ＃１）、結合部分：ＴＣＥの比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ＃１及び親結合剤の添加（ＴＣＥ＃１＋親結合剤）、結合部分：ＴＣＥ（の比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ及び超高親和性結合部分（結合剤＃５）の添加ＴＣＥ＃１＋結合剤＃５）。ＴＣＥ濃度は、先のＬＤＨ実験に基づくＴＣＥ＃１のＥＣ80にほぼ対応する１０ｐＭ最終濃度に設定した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図7d】実施例４に記載されるように、ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害（Ｔ細胞媒介性死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、超高親和性結合部分及び中親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。以下の条件を試験した：ＴＣＥ又は結合部分の添加なし（バックグラウンド）、１０ｎＭ結合部分のみの添加（結合剤＃４、＃５及び＃９、図７ｅ）、ＴＣＥのみの添加（ＴＣＥ＃１）、結合部分：ＴＣＥの比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ＃１及び親結合剤の添加（ＴＣＥ＃１＋親結合剤）、結合部分：ＴＣＥ（の比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ及び超高親和性結合部分（結合剤＃５）の添加ＴＣＥ＃１＋結合剤＃５）。ＴＣＥ濃度は、先のＬＤＨ実験に基づくＴＣＥ＃１のＥＣ80にほぼ対応する１０ｐＭ最終濃度に設定した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図7e】実施例４に記載されるように、ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害（Ｔ細胞媒介性死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、超高親和性結合部分及び中親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。以下の条件を試験した：ＴＣＥ又は結合部分の添加なし（バックグラウンド）、１０ｎＭ結合部分のみの添加（結合剤＃４、＃５及び＃９、図７ｅ）、ＴＣＥのみの添加（ＴＣＥ＃１）、結合部分：ＴＣＥの比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ＃１及び親結合剤の添加（ＴＣＥ＃１＋親結合剤）、結合部分：ＴＣＥ（の比率を減少させた、予め平衡化したＴＣＥ及び超高親和性結合部分（結合剤＃５）の添加ＴＣＥ＃１＋結合剤＃５）。ＴＣＥ濃度は、先のＬＤＨ実験に基づくＴＣＥ＃１のＥＣ80にほぼ対応する１０ｐＭ最終濃度に設定した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図8a】ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介増殖阻害（Ｔ細胞媒介死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、異なる超高親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。一定濃度のＴＣＥ（ＴＣＥ＃１、最終濃度１０ｐＭ）を、滴定した異なる結合部分（結合剤＃４、＃５及び＃９）と混合した。混合物を１００×濃度（結合部分によるＴＣＥの９９．９％超の結合を可能にするため）で少なくとも２４時間プレインキュベートし、次いでＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験を開始する直前に１００倍に希釈した。１０ｎＭ結合部分のみ（結合剤＃４、＃５及び＃９）についての陰性対照曲線を図８ｄに示す。バックグラウンド曲線は、ＴＣＥ又は結合部分を添加せずに作成した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した（実施例４を参照されたい）。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図8b】ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介増殖阻害（Ｔ細胞媒介死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、異なる超高親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。一定濃度のＴＣＥ（ＴＣＥ＃１、最終濃度１０ｐＭ）を、滴定した異なる結合部分（結合剤＃４、＃５及び＃９）と混合した。混合物を１００×濃度（結合部分によるＴＣＥの９９．９％超の結合を可能にするため）で少なくとも２４時間プレインキュベートし、次いでＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験を開始する直前に１００倍に希釈した。１０ｎＭ結合部分のみ（結合剤＃４、＃５及び＃９）についての陰性対照曲線を図８ｄに示す。バックグラウンド曲線は、ＴＣＥ又は結合部分を添加せずに作成した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した（実施例４を参照されたい）。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図8c】ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介増殖阻害（Ｔ細胞媒介死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、異なる超高親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。一定濃度のＴＣＥ（ＴＣＥ＃１、最終濃度１０ｐＭ）を、滴定した異なる結合部分（結合剤＃４、＃５及び＃９）と混合した。混合物を１００×濃度（結合部分によるＴＣＥの９９．９％超の結合を可能にするため）で少なくとも２４時間プレインキュベートし、次いでＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験を開始する直前に１００倍に希釈した。１０ｎＭ結合部分のみ（結合剤＃４、＃５及び＃９）についての陰性対照曲線を図８ｄに示す。バックグラウンド曲線は、ＴＣＥ又は結合部分を添加せずに作成した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した（実施例４を参照されたい）。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図8d】ＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介増殖阻害（Ｔ細胞媒介死滅の代用として使用）を経時的に遮断する能力について、異なる超高親和性結合部分を比較するための「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験である。一定濃度のＴＣＥ（ＴＣＥ＃１、最終濃度１０ｐＭ）を、滴定した異なる結合部分（結合剤＃４、＃５及び＃９）と混合した。混合物を１００×濃度（結合部分によるＴＣＥの９９．９％超の結合を可能にするため）で少なくとも２４時間プレインキュベートし、次いでＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験を開始する直前に１００倍に希釈した。１０ｎＭ結合部分のみ（結合剤＃４、＃５及び＃９）についての陰性対照曲線を図８ｄに示す。バックグラウンド曲線は、ＴＣＥ又は結合部分を添加せずに作成した。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した（実施例４を参照されたい）。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり４画像）。
【図9a】機能的シンク区画の非存在下又は存在下でのＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害（Ｔ細胞媒介性死滅の代用として使用）を経時的に遮断する超高親和性結合部分の能力を比較するための「複合体」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験（実施例６を参照されたい）である。実験は、コーティングされていないビーズを収容する注入口（すなわち、機能的シンク区画の非存在下）（図９ａ）又は解離した結合剤を捕捉することができるＣＤ３結合ドメインでコーティングされたビーズを収容する注入口（すなわち、機能的シンク区画の存在下）（図９ｂ）のいずれかを用いて行った。Ｔ細胞及び異なるモル比のＴＣＥ＃１対結合剤＃９で調製されたプロドラッグ複合体の存在下でのＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害曲線を、コーティングされていないビーズを用いた設定について図９ａに、コーティングされたビーズを用いた設定について図９ｂに示す。対照は、示されるように、未結合ＴＣＥ＃１（プロドラッグ複合体の代わりに）を用いて、及びＴＣＥ又はプロドラッグ複合体を全く用いずに（バックグラウンド）行った。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり３６画像）。
【図9b】機能的シンク区画の非存在下又は存在下でのＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害（Ｔ細胞媒介性死滅の代用として使用）を経時的に遮断する超高親和性結合部分の能力を比較するための「複合体」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験（実施例６を参照されたい）である。実験は、コーティングされていないビーズを収容する注入口（すなわち、機能的シンク区画の非存在下）（図９ａ）又は解離した結合剤を捕捉することができるＣＤ３結合ドメインでコーティングされたビーズを収容する注入口（すなわち、機能的シンク区画の存在下）（図９ｂ）のいずれかを用いて行った。Ｔ細胞及び異なるモル比のＴＣＥ＃１対結合剤＃９で調製されたプロドラッグ複合体の存在下でのＴＡＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性増殖阻害曲線を、コーティングされていないビーズを用いた設定について図９ａに、コーティングされたビーズを用いた設定について図９ｂに示す。対照は、示されるように、未結合ＴＣＥ＃１（プロドラッグ複合体の代わりに）を用いて、及びＴＣＥ又はプロドラッグ複合体を全く用いずに（バックグラウンド）行った。全赤色オブジェクト面積（腫瘍細胞に対応する）を規則的間隔で決定した。エラーバーは、画像当たりの標準誤差を示す（ウェル当たり３６画像）。
【図10a】サイトカイン放出は、エクスビボアッセイにおいて、対照又は薬物分子を、ＣＤ１２３＋及びＣＤ３３＋標的細胞を含有する新鮮なヒト全血に添加し、試料を、血液凝固を回避するための回転ホイール上でインキュベートことによって決定される。試験した対照及び薬物分子は、ビヒクル（星印）、１ｎＭのα－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３産業対照（黒塗りの三角形）、及び１ｎＭのＴＣＥ＃１（白塗りの四角形）、又はそれと比較して、１ｎＭのＴＣＥ＃１＋１．２ｎＭの結合剤＃５（白塗りのダイヤ）を含んだ。（Ａ）及び（Ｂ）は、未結合形態（Ａ）及び結合剤＃５との複合体化形態（Ｂ）のＴＣＥ薬物分子を示す。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術によって、０時間、２時間、４時間、８時間、２４時間で、ＴＮＦ－α（Ｃ）、ＩＦＮ－γ（Ｄ）、ＩＬ－２（Ｅ）及びＩＬ－６（Ｆ）のサイトカイン放出を測定した。データは、１人の健康なヒトドナーからの血を用いてＩｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで行われた単一の実験からのものである。
【図10b】サイトカイン放出は、エクスビボアッセイにおいて、対照又は薬物分子を、ＣＤ１２３＋及びＣＤ３３＋標的細胞を含有する新鮮なヒト全血に添加し、試料を、血液凝固を回避するための回転ホイール上でインキュベートことによって決定される。試験した対照及び薬物分子は、ビヒクル（星印）、１ｎＭのα－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３産業対照（黒塗りの三角形）、及び１ｎＭのＴＣＥ＃１（白塗りの四角形）、又はそれと比較して、１ｎＭのＴＣＥ＃１＋１．２ｎＭの結合剤＃５（白塗りのダイヤ）を含んだ。（Ａ）及び（Ｂ）は、未結合形態（Ａ）及び結合剤＃５との複合体化形態（Ｂ）のＴＣＥ薬物分子を示す。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術によって、０時間、２時間、４時間、８時間、２４時間で、ＴＮＦ－α（Ｃ）、ＩＦＮ－γ（Ｄ）、ＩＬ－２（Ｅ）及びＩＬ－６（Ｆ）のサイトカイン放出を測定した。データは、１人の健康なヒトドナーからの血を用いてＩｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで行われた単一の実験からのものである。
【図10c】サイトカイン放出は、エクスビボアッセイにおいて、対照又は薬物分子を、ＣＤ１２３＋及びＣＤ３３＋標的細胞を含有する新鮮なヒト全血に添加し、試料を、血液凝固を回避するための回転ホイール上でインキュベートことによって決定される。試験した対照及び薬物分子は、ビヒクル（星印）、１ｎＭのα－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３産業対照（黒塗りの三角形）、及び１ｎＭのＴＣＥ＃１（白塗りの四角形）、又はそれと比較して、１ｎＭのＴＣＥ＃１＋１．２ｎＭの結合剤＃５（白塗りのダイヤ）を含んだ。（Ａ）及び（Ｂ）は、未結合形態（Ａ）及び結合剤＃５との複合体化形態（Ｂ）のＴＣＥ薬物分子を示す。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術によって、０時間、２時間、４時間、８時間、２４時間で、ＴＮＦ－α（Ｃ）、ＩＦＮ－γ（Ｄ）、ＩＬ－２（Ｅ）及びＩＬ－６（Ｆ）のサイトカイン放出を測定した。データは、１人の健康なヒトドナーからの血を用いてＩｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで行われた単一の実験からのものである。
【図10d】サイトカイン放出は、エクスビボアッセイにおいて、対照又は薬物分子を、ＣＤ１２３＋及びＣＤ３３＋標的細胞を含有する新鮮なヒト全血に添加し、試料を、血液凝固を回避するための回転ホイール上でインキュベートことによって決定される。試験した対照及び薬物分子は、ビヒクル（星印）、１ｎＭのα－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３産業対照（黒塗りの三角形）、及び１ｎＭのＴＣＥ＃１（白塗りの四角形）、又はそれと比較して、１ｎＭのＴＣＥ＃１＋１．２ｎＭの結合剤＃５（白塗りのダイヤ）を含んだ。（Ａ）及び（Ｂ）は、未結合形態（Ａ）及び結合剤＃５との複合体化形態（Ｂ）のＴＣＥ薬物分子を示す。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術によって、０時間、２時間、４時間、８時間、２４時間で、ＴＮＦ－α（Ｃ）、ＩＦＮ－γ（Ｄ）、ＩＬ－２（Ｅ）及びＩＬ－６（Ｆ）のサイトカイン放出を測定した。データは、１人の健康なヒトドナーからの血を用いてＩｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで行われた単一の実験からのものである。
【図10e】サイトカイン放出は、エクスビボアッセイにおいて、対照又は薬物分子を、ＣＤ１２３＋及びＣＤ３３＋標的細胞を含有する新鮮なヒト全血に添加し、試料を、血液凝固を回避するための回転ホイール上でインキュベートことによって決定される。試験した対照及び薬物分子は、ビヒクル（星印）、１ｎＭのα－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３産業対照（黒塗りの三角形）、及び１ｎＭのＴＣＥ＃１（白塗りの四角形）、又はそれと比較して、１ｎＭのＴＣＥ＃１＋１．２ｎＭの結合剤＃５（白塗りのダイヤ）を含んだ。（Ａ）及び（Ｂ）は、未結合形態（Ａ）及び結合剤＃５との複合体化形態（Ｂ）のＴＣＥ薬物分子を示す。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術によって、０時間、２時間、４時間、８時間、２４時間で、ＴＮＦ－α（Ｃ）、ＩＦＮ－γ（Ｄ）、ＩＬ－２（Ｅ）及びＩＬ－６（Ｆ）のサイトカイン放出を測定した。データは、１人の健康なヒトドナーからの血を用いてＩｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで行われた単一の実験からのものである。
【図10f】サイトカイン放出は、エクスビボアッセイにおいて、対照又は薬物分子を、ＣＤ１２３＋及びＣＤ３３＋標的細胞を含有する新鮮なヒト全血に添加し、試料を、血液凝固を回避するための回転ホイール上でインキュベートことによって決定される。試験した対照及び薬物分子は、ビヒクル（星印）、１ｎＭのα－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３産業対照（黒塗りの三角形）、及び１ｎＭのＴＣＥ＃１（白塗りの四角形）、又はそれと比較して、１ｎＭのＴＣＥ＃１＋１．２ｎＭの結合剤＃５（白塗りのダイヤ）を含んだ。（Ａ）及び（Ｂ）は、未結合形態（Ａ）及び結合剤＃５との複合体化形態（Ｂ）のＴＣＥ薬物分子を示す。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術によって、０時間、２時間、４時間、８時間、２４時間で、ＴＮＦ－α（Ｃ）、ＩＦＮ－γ（Ｄ）、ＩＬ－２（Ｅ）及びＩＬ－６（Ｆ）のサイトカイン放出を測定した。データは、１人の健康なヒトドナーからの血を用いてＩｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで行われた単一の実験からのものである。
【図11a】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥとＢ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥとの抗腫瘍活性を比較するインビボ有効性試験である。Ｃ）インビボでの有効性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を６日目に腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で開始した。２つの異なる用量２００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対して異なる親和性を有する２つの異なる結合剤と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った非半減期延長α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。Ｄ）ドナーＢについてのヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群（産業対照）を除いて、ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。６日目に開始し、１６日目に終了する治療期間が示されている。Ｅ）ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｆ）ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｇ）６つ全ての治療群の凡例である。
【図11b】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥとＢ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥとの抗腫瘍活性を比較するインビボ有効性試験である。Ｃ）インビボでの有効性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を６日目に腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で開始した。２つの異なる用量２００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対して異なる親和性を有する２つの異なる結合剤と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った非半減期延長α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。Ｄ）ドナーＢについてのヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群（産業対照）を除いて、ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。６日目に開始し、１６日目に終了する治療期間が示されている。Ｅ）ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｆ）ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｇ）６つ全ての治療群の凡例である。
【図11c】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥとＢ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥとの抗腫瘍活性を比較するインビボ有効性試験である。Ｃ）インビボでの有効性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を６日目に腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で開始した。２つの異なる用量２００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対して異なる親和性を有する２つの異なる結合剤と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った非半減期延長α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。Ｄ）ドナーＢについてのヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群（産業対照）を除いて、ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。６日目に開始し、１６日目に終了する治療期間が示されている。Ｅ）ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｆ）ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｇ）６つ全ての治療群の凡例である。
【図11d】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥとＢ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥとの抗腫瘍活性を比較するインビボ有効性試験である。Ｃ）インビボでの有効性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を６日目に腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で開始した。２つの異なる用量２００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対して異なる親和性を有する２つの異なる結合剤と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った非半減期延長α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。Ｄ）ドナーＢについてのヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群（産業対照）を除いて、ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。６日目に開始し、１６日目に終了する治療期間が示されている。Ｅ）ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｆ）ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｇ）６つ全ての治療群の凡例である。
【図11e】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥとＢ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥとの抗腫瘍活性を比較するインビボ有効性試験である。Ｃ）インビボでの有効性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を６日目に腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で開始した。２つの異なる用量２００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対して異なる親和性を有する２つの異なる結合剤と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った非半減期延長α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。Ｄ）ドナーＢについてのヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群（産業対照）を除いて、ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。６日目に開始し、１６日目に終了する治療期間が示されている。Ｅ）ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｆ）ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｇ）６つ全ての治療群の凡例である。
【図11f】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥとＢ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥとの抗腫瘍活性を比較するインビボ有効性試験である。Ｃ）インビボでの有効性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を６日目に腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で開始した。２つの異なる用量２００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対して異なる親和性を有する２つの異なる結合剤と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った非半減期延長α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。Ｄ）ドナーＢについてのヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群（産業対照）を除いて、ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。６日目に開始し、１６日目に終了する治療期間が示されている。Ｅ）ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｆ）ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｇ）６つ全ての治療群の凡例である。
【図11g】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥとＢ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥとの抗腫瘍活性を比較するインビボ有効性試験である。Ｃ）インビボでの有効性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を６日目に腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で開始した。２つの異なる用量２００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対して異なる親和性を有する２つの異なる結合剤と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った非半減期延長α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。Ｄ）ドナーＢについてのヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群（産業対照）を除いて、ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。６日目に開始し、１６日目に終了する治療期間が示されている。Ｅ）ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｆ）ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線である。Ｇ）６つ全ての治療群の凡例である。
【図12a】治療開始時に腫瘍が比較的小さい（約７０ｍｍ3）インビボ有効性試験中の初回投与前（ｐｒｅ）又は投与４時間後に採取された血液試料由来の血清において測定した、ヒトサイトカインレベルである。個々の動物のサイトカインレベルは、図１１に導入された６つの治療群について黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均はバー±ＳＤとして表示されている。図１１と同様に、ドナーＢについてヒト化が成功しなかったために、第２治療群の２匹のマウスを除外する必要があった。Ａ）ｐｇ／ｍｌ単位のＴＮＦ－αレベルである。Ｂ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＦＮ－γレベルである。Ｃ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－２レベル及びＤ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－６レベルである。
【図12b】治療開始時に腫瘍が比較的小さい（約７０ｍｍ3）インビボ有効性試験中の初回投与前（ｐｒｅ）又は投与４時間後に採取された血液試料由来の血清において測定した、ヒトサイトカインレベルである。個々の動物のサイトカインレベルは、図１１に導入された６つの治療群について黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均はバー±ＳＤとして表示されている。図１１と同様に、ドナーＢについてヒト化が成功しなかったために、第２治療群の２匹のマウスを除外する必要があった。Ａ）ｐｇ／ｍｌ単位のＴＮＦ－αレベルである。Ｂ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＦＮ－γレベルである。Ｃ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－２レベル及びＤ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－６レベルである。
【図12c】治療開始時に腫瘍が比較的小さい（約７０ｍｍ3）インビボ有効性試験中の初回投与前（ｐｒｅ）又は投与４時間後に採取された血液試料由来の血清において測定した、ヒトサイトカインレベルである。個々の動物のサイトカインレベルは、図１１に導入された６つの治療群について黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均はバー±ＳＤとして表示されている。図１１と同様に、ドナーＢについてヒト化が成功しなかったために、第２治療群の２匹のマウスを除外する必要があった。Ａ）ｐｇ／ｍｌ単位のＴＮＦ－αレベルである。Ｂ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＦＮ－γレベルである。Ｃ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－２レベル及びＤ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－６レベルである。
【図12d】治療開始時に腫瘍が比較的小さい（約７０ｍｍ3）インビボ有効性試験中の初回投与前（ｐｒｅ）又は投与４時間後に採取された血液試料由来の血清において測定した、ヒトサイトカインレベルである。個々の動物のサイトカインレベルは、図１１に導入された６つの治療群について黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均はバー±ＳＤとして表示されている。図１１と同様に、ドナーＢについてヒト化が成功しなかったために、第２治療群の２匹のマウスを除外する必要があった。Ａ）ｐｇ／ｍｌ単位のＴＮＦ－αレベルである。Ｂ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＦＮ－γレベルである。Ｃ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－２レベル及びＤ）ｐｇ／ｍｌ単位のＩＬ－６レベルである。
【図13a】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥのサイトカイン放出を、Ｂ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥと比較する独立したインビボ安全性試験である。Ｃ）インビボ安全性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を２日目に後側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、単回用量（感作誘発）を腫瘍サイズ約３００～８００ｍｍ3で１４日目に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対してＫD≦１ｐＭから二桁のｐＭまでの範囲の異なる親和性を有する３つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。投与前、初回治療投与の２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後に血液試料を採取して、中程度のサイズの腫瘍でのサイトカインレベルを決定した。Ｄ）確立した腫瘍（３００～８００ｍｍ3）を用いたインビボ安全性試験における単回投与治療前又は単回投与治療後に採取された血液試料由来の血清中のヒトサイトカインレベル（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６）である。サイトカインレベルは、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、無希釈血清試料で決定した。個々の動物のサイトカインレベルは、黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均値は、非遮断ＴＣＥ＃２対ＴＣＥ＃２＋結合剤治療群について、それぞれ黒実線及び灰色実線として示される。インビボ安全性試験１は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１又は結合剤＃４を使用して実施し、一方、別個であるが比較可能なインビボ安全性試験２は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１０に焦点を当てた。
【図13b】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥのサイトカイン放出を、Ｂ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥと比較する独立したインビボ安全性試験である。Ｃ）インビボ安全性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を２日目に後側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、単回用量（感作誘発）を腫瘍サイズ約３００～８００ｍｍ3で１４日目に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対してＫD≦１ｐＭから二桁のｐＭまでの範囲の異なる親和性を有する３つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。投与前、初回治療投与の２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後に血液試料を採取して、中程度のサイズの腫瘍でのサイトカインレベルを決定した。Ｄ）確立した腫瘍（３００～８００ｍｍ3）を用いたインビボ安全性試験における単回投与治療前又は単回投与治療後に採取された血液試料由来の血清中のヒトサイトカインレベル（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６）である。サイトカインレベルは、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、無希釈血清試料で決定した。個々の動物のサイトカインレベルは、黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均値は、非遮断ＴＣＥ＃２対ＴＣＥ＃２＋結合剤治療群について、それぞれ黒実線及び灰色実線として示される。インビボ安全性試験１は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１又は結合剤＃４を使用して実施し、一方、別個であるが比較可能なインビボ安全性試験２は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１０に焦点を当てた。
【図13c】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥのサイトカイン放出を、Ｂ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥと比較する独立したインビボ安全性試験である。Ｃ）インビボ安全性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を２日目に後側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、単回用量（感作誘発）を腫瘍サイズ約３００～８００ｍｍ3で１４日目に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対してＫD≦１ｐＭから二桁のｐＭまでの範囲の異なる親和性を有する３つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。投与前、初回治療投与の２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後に血液試料を採取して、中程度のサイズの腫瘍でのサイトカインレベルを決定した。Ｄ）確立した腫瘍（３００～８００ｍｍ3）を用いたインビボ安全性試験における単回投与治療前又は単回投与治療後に採取された血液試料由来の血清中のヒトサイトカインレベル（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６）である。サイトカインレベルは、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、無希釈血清試料で決定した。個々の動物のサイトカインレベルは、黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均値は、非遮断ＴＣＥ＃２対ＴＣＥ＃２＋結合剤治療群について、それぞれ黒実線及び灰色実線として示される。インビボ安全性試験１は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１又は結合剤＃４を使用して実施し、一方、別個であるが比較可能なインビボ安全性試験２は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１０に焦点を当てた。
【図13d】Ｍｏｌｍ－１３腫瘍担持ＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける、Ａ）未結合ＴＣＥのサイトカイン放出を、Ｂ）２つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥと比較する独立したインビボ安全性試験である。Ｃ）インビボ安全性試験の試験デザインである。２人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを０日目に移植し、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を２日目に後側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、単回用量（感作誘発）を腫瘍サイズ約３００～８００ｍｍ3で１４日目に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。１０００μｇ／ｋｇで投与された未結合ＴＣＥ＃２を、ＣＤ３結合ドメインに対してＫD≦１ｐＭから二桁のｐＭまでの範囲の異なる親和性を有する３つの異なる結合剤と複合体化したＴＣＥ＃２と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時にＴＣＥの１００％複合体化速度を保証した。投与前、初回治療投与の２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後に血液試料を採取して、中程度のサイズの腫瘍でのサイトカインレベルを決定した。Ｄ）確立した腫瘍（３００～８００ｍｍ3）を用いたインビボ安全性試験における単回投与治療前又は単回投与治療後に採取された血液試料由来の血清中のヒトサイトカインレベル（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６）である。サイトカインレベルは、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、無希釈血清試料で決定した。個々の動物のサイトカインレベルは、黒塗りの記号（ドナーＡ、ｎ＝５）又は白塗りの記号（ドナーＢ、ｎ＝５）としてプロットされ、平均値は、非遮断ＴＣＥ＃２対ＴＣＥ＃２＋結合剤治療群について、それぞれ黒実線及び灰色実線として示される。インビボ安全性試験１は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１又は結合剤＃４を使用して実施し、一方、別個であるが比較可能なインビボ安全性試験２は、ＴＣＥ＃２±結合剤＃１０に焦点を当てた。
【発明を実施するための形態】
【0018】
概要
本発明は、結合部分及び薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が薬物分子に可逆的に結合し、当該結合部分が、結合した場合に、薬物分子の生物学的活性を阻害する、組成物に関する。本発明のそのような組成物は、インビボでの投与時に薬物分子を徐放するプロドラッグ複合体である。投与時に活性薬物分子を徐放することによって、そうでなければ薬物分子に関連する有害作用又はそのリスクを最小限に抑えることができる。
本発明は、結合部分及び薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が薬物分子に可逆的に結合し、当該結合部分が、結合した場合に、薬物分子の生物学的活性を阻害する、組成物に関する。本発明のそのような組成物は、インビボでの投与時に薬物分子を徐放するプロドラッグ複合体である。投与時に活性薬物分子を徐放することによって、そうでなければ薬物分子に関連する有害作用又はそのリスクを最小限に抑えることができる。
【0019】
理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載の結合部分は、薬物分子に非共有結合様式で強固に結合することが理解される。結合は、薬物分子の活性部位で、又は薬物分子上の別の部位で生じ得る。結合は、抗イディオタイプであってもよい。結合位置に関係なく、結合部分が結合することによって、薬物分子の生物学的活性（すなわち、作用機序）を阻害する。薬物分子を過剰な結合部分と共に製剤化することで、薬物分子の完全な又はほぼ完全な複合体化及び阻害、並びに組成物（すなわち、プロドラッグ複合体）の形成をもたらす。患者への投与時、ｉ）体内の結合部分及び薬物の濃度が非常に低いこと、並びにｉｉ）結合部分が系から急速に排除されることにより、プロドラッグ複合体は強く希釈され、結合部分の再結合が無視できる程度になるため、活性薬物分子を、時間をかけて連続的に放出することになる。
【0020】
【0021】
本発明は更に、そのような組成物を形成する方法、そのような組成物を使用する治療方法、及び療法におけるそのような組成物の使用に関する。例えば、本発明は、癌などの増殖性疾患の治療における、そのような組成物の使用に関する。
【0022】
薬物分子に対して結合特異性を有する結合部分であって、当該結合部分の当該薬物分子への結合が、当該薬物分子の生物学的活性を可逆的に阻害する複合体を形成する、結合部分についても記載されている。例えば、当該薬物分子のそのような生物学的活性は、生物学的標的への当該薬物分子の結合である。
【0023】
本発明は更に、当該結合部分をコードする核酸、及び宿主細胞を用いてこれらを作製する方法に関する。
【0024】
定義
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質並びに核酸化学の技術に関連して使用される命名法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質並びに核酸化学の技術に関連して使用される命名法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
【0025】
用語「含む（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、及び「含有／収容する（containing）」は、特に明記しない限り、非限定的用語として解釈されるべきである。本発明の態様で、ある特徴について、「～を含む」と説明されている場合、実施形態では、その特徴について「～からなる」又は「～から本質的になる」も考えられる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示を意味する文言（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図するものであり、別段の請求がない限り、本開示の範囲に制限を課さない。本明細書におけるいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。実施されている例以外、又は別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語が当業者によって解釈されるように、その用語によって修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に明記しない限り、所与の数値の±１０％に相当する。
【0026】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各エンドポイントを個々に指す簡略法として役立つことを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【0027】
本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【0028】
用語「薬物分子」（用語「薬物」と本明細書で相互交換可能に使用される）は、ポリペプチド又はタンパク質を含む治療剤を指し、当該ポリペプチド又はタンパク質は、結合部分によって結合することができる部位を含有する。
【0029】
組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって生産される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを生産することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。
【0030】
本発明の文脈において、用語「結合部分」又は「結合剤」は、ポリペプチド又はタンパク質を含む結合剤を指し、当該ポリペプチド又はタンパク質は、薬物分子に非共有結合することができる。結合部分は、必ずしも薬物分子の活性部位に結合する必要はない。しかしながら、結合部分は、薬物の作用機序を阻害するような様式で結合する必要がある。これは、薬物の活性部位に結合することによるものであってもよいが、薬物分子上の別の部位に結合して、当該薬物の立体構造を変化させる（すなわち、アロステリック阻害）か、又は薬物分子の活性部位の立体障害になることによるものであってもよい。薬物分子の活性部位は、薬物分子の生物学的活性に関与する。生物学的活性は、酵素活性又は生物学的標的への結合であり得る。薬物分子への結合部分の結合は、薬物分子の生物学的活性を阻害する。例えば、薬物分子への結合部分の結合は、薬物分子の酵素活性を阻害するか、又は生物学的標的への薬物分子の結合を阻害する。薬物分子への結合部分の結合は、抗イディオタイプであってもよい。したがって、結合部分は、薬物分子の抗イディオタイプ結合剤であってもよい。
【0031】
本発明において使用される結合部分は、抗体、代替足場、及びポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫系が外来抗原を検出するときに典型的に生成されるものなどのインタクトな抗体分子だけでなく、抗原結合能力を保持する抗体分子の任意の断片、バリアント及び合成又は操作された類似体も指す。そのような断片及びバリアントもまた、当該技術分野で周知であり、インビトロ及びインビボの両方で正しく使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片、及び単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性又は多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合タンパク質、非従来型抗体、並びに免疫グロブリン分子由来の抗原結合ドメインを含むタンパク質を包含する。本明細書で使用される場合、用語「代替足場」は、タンパク質を含むか、又はタンパク質からなるが、抗体ではない任意の分子を指す。
【0032】
これらの異なる構造型のいずれかの結合部分は、薬物分子に強固に結合し、薬物分子の作用機序を遮断し、プロドラッグ複合体を形成することができる。プロドラッグ複合体はゆっくりとインビボで脱複合体化し、薬物分子を体内に放出する。好ましい一実施形態では、結合部分は、薬物分子に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。別の好ましい実施形態では、結合部分は、薬物分子に対して結合特異性を有する抗体を含む。別の好ましい実施形態では、結合部分は、薬物分子に対して結合特異性を有する代替足場を含み、代替足場は、アンキリン反復ドメインを含まない。好ましい一実施形態では、薬物分子は、抗体を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該抗体に対して結合特異性を有する抗イディオタイプ抗体である。別の好ましい実施形態では、薬物分子は、抗体を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該抗体に対して結合特異性を有する、例えばアンキリン反復ドメインなどの抗イディオタイプ代替足場である。別の好ましい実施形態では、薬物分子は、例えばアンキリン反復ドメインなどの代替足場を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該代替足場に対して結合特異性を有する抗イディオタイプ抗体である。別の好ましい実施形態では、薬物分子は、例えばアンキリン反復ドメインなどの代替足場を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該代替足場に対して結合特異性を有する、例えばアンキリン反復ドメインなどの抗イディオタイプ代替足場である。
【0033】
用語「核酸」又は「核酸分子」は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子又は一本鎖若しくは二本鎖のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であることができるポリヌクレオチド分子を指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾形態及び人工形態を含む。核酸分子は、単離された形態で存在するか、又は組換え核酸分子若しくはベクターに含まれているかのいずれかであることができる。
【0034】
用語「生物学的標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。いくつかの実施形態では、生物学的標的は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又は別のタイプの免疫細胞などの免疫細胞である。いくつかの他の実施形態では、生物学的標的は、腫瘍細胞である。
【0035】
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。
【0036】
特許出願第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」第５３９巻第２～６頁）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。
用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインはまた、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールも含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３，２００３；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第２２巻（第５号）：５７５－５８２（２００４）、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１２／０６９６５５号）、高ロイシン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７－５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。
用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインはまた、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールも含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３，２００３；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第２２巻（第５号）：５７５－５８２（２００４）、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１２／０６９６５５号）、高ロイシン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７－５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。
【0037】
用語「アンキリン反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続するアンキリン反復モジュールを含む反復ドメインを指す。アンキリン反復ドメインは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインと共に、より大きなアンキリン反復タンパク質にモジュール式に組み立てられてもよい（例えば、Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６，２００３、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１６／１５６５９６号、国際公開第２０１８／０５４９７１号を参照されたい）。
【0038】
設計アンキリン反復タンパク質及び設計アンキリン反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計／設計された」は、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工のものであり、自然界では生じないという特性を指す。本明細書に記載の設計反復タンパク質は、少なくとも１つの設計反復ドメインを含む。好ましくは、設計反復ドメインは、設計アンキリン反復ドメインである。
【0039】
用語「標的相互作用残基」は、薬物分子との直接相互作用に寄与する結合部分のアミノ酸残基を指す。例えば、結合部分が設計アンキリン反復ドメインである場合、用語「標的相互作用残基」は、薬物分子との直接相互作用に寄与する設計アンキリン反復ドメインのアミノ酸残基を指す。
【0040】
用語「フレームワーク残基」又は「フレームワーク位置」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、当該反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくはβ－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。
【0041】
そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。
【0042】
用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じる反復タンパク質の反復単位に由来する、設計反復ドメインの反復アミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、好ましくは、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、標的上で選択された反復ドメインから得られた、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。
【0043】
したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。設計アンキリン反復タンパク質は、以前に記載されており、例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号、同第２０１０／０６０７４８号、同第２０１１／１３５０６７号、同第２０１２／０６９６５４号、同第２０１２／０６９６５５号、同第２０１４／００１４４２号、同第２０１４／１９１５７４号、同第２０１４／０８３２０８号、同第２０１６／１５６５９６号、及び同第２０１８／０５４９７１号を参照されたく、これらは全て、その全体が参照により組み込まれる。典型的には、アンキリン反復モジュールは、ループによって分離された２つのアルファヘリックスを形成する約３１～３３個のアミノ酸残基を含む。
【0044】
反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（本明細書で相互交換可能に使用される「非ランダム化された位置」又は「固定された位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化された位置」）を含み得る。非ランダム化された位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。
【0045】
用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。
【0046】
用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は、複数のコピーに見出され、タンパク質の折り畳みを決定する全ての当該モチーフに共通の定義された折り畳みトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富むバリアント反復単位が挙げられる。
【0047】
結合部分は、代替標的（例えば、細胞又は物質）の場合よりも、特定の薬物分子とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、より高い親和性及び／又はより高い親和力で反応又は会合する場合、薬物分子に「特異的に結合する」又は「優先的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）。結合部分は、所与のセットの条件下で、適切な薬物分子への結合を代替の薬物分子への結合と比較することによって、結合の特異性について試験され得る。いくつかの実施形態では、結合分子が、代替の薬物分子に対するよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍高い親和性で適切な薬物分子に結合する場合、それは特異的であるとみなされる。また、この定義を読むことにより、例えば、第１の薬物分子に特異的又は優先的に結合する結合部分が、第２の薬物分子に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（しかし、それを含むことができる）。概して、結合部分は、指定されたアッセイ条件下で特定の薬物分子に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない。
【0048】
任意の分子の別の分子への結合は、２つの力、すなわち、会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）によって支配されている。次いで、標的［Ｔ］に対する任意の結合剤［Ｂ］の親和性は、平衡解離定数ＫDによって表すことができ、これはｋoff／ｋonの商である。
【0049】
【数3】
【0050】
プロドラッグ複合体の半減期は、プロドラッグ複合体（又はその中の結合部分）が薬物の作用機序を「遮断」又は「阻害」するため、本明細書では「遮断半減期」又は「遮断Ｔ1/2」と呼ばれる。遮断Ｔ1/2は、以下の式：
【0051】
【数4】
式中、「ｌｎ（２）」は、数２の自然対数（logarsus naturalis）であり、約０．６９３である。同様に、結合部分は、本発明の組成物中で薬物分子と複合体化された場合に、遮断半減期（又は遮断Ｔ1/2）を有すると言うことができる。様々なアッセイ形式を使用して、目的の薬物分子に特異的に結合する結合部分を選択又は特徴付けることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）及びウエスタンブロット分析は、標的薬物分子に特異的に結合する結合部分を同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的又は選択的結合は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナル又はノイズ、より典型的には１０倍超のバックグラウンドシグナルである。より具体的には、結合部分は、平衡解離定数（ＫD）値が＜１μＭ、例えば、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜１００ｐＭ、＜１０ｐＭ、又は＜１ｐＭである場合、標的に「特異的に結合する」と言われる。
【0052】
結合親和性を測定する様々な方法は、技術分野で周知であり、それらのいずれも、本発明の目的のために使用することができる。例えば、本明細書に例示されるように、薬物分子標的に対する特定の結合部分の結合親和性は、ＫD値として表すことができ、これは、結合部分及び薬物分子標的の解離定数を指す。ＫDは、「オフレート（Ｋoff）」とも呼ばれる解離速度と、会合速度又は「オンレート（Ｋon）」との比率である。したがって、ＫDはＫoff／Ｋonに等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、ＫDが小さいほど、結合の親和性が強くなる。
【0053】
ＫD値は、任意の適切な方法を使用して決定することができる。ＫDを測定するための１つの例示的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１５ Ｍａｙ ５；１５（５）：１０４８１－５１０を参照されたい）。ＫD値は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用するＳＰＲによって測定されてもよい。ＢＩＡｃｏｒｅ動的分析は、例えば、それらの表面上の固定化分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）を有するチップからの抗原の結合及び解離を分析することを含む。タンパク質のＫDを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを使用することである（例えば、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４；（８４）：５１３８３を参照されたい）。ＫD値は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）テクノロジー（Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定することができる。代替的に又は追加的に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄ．）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動的排除アッセイ）アッセイを使用することもできる。２つの結合パートナー間の結合親和性を評価するのに好適な任意の方法が本明細書に包含される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が特に好ましい。最も好ましくは、ＫD値は、ＰＢＳ中及びＳＰＲによって決定される。
【0054】
用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。
【0055】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、少なくとも９５％を意味する。したがって、本明細書で使用される場合、句「実質的に全ての薬物分子が結合部分によって結合される」などは、全ての薬物分子の少なくとも９５％が結合部分によって結合されることを意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に」は、少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％を意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に」は、少なくとも９９．９％を意味する。
【0056】
「治療する」という用語、並びにそれに関連する単語は、必ずしも１００％又は完全な治癒を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識する治療の程度は様々である。この点で、本明細書に記載の治療方法及び医薬使用は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。更に、本開示の方法によって提供される治療は、１つ又は複数の病態又は症状の治療（すなわち、緩和する）を含むことができる。例示的な態様では、本発明は、患者へのプロドラッグ複合体の投与を含む、薬物分子による治療方法であって、患者が体験する有害作用又はそのリスクが、同量の薬物分子がプロドラッグ複合体中に（すなわち、本発明の結合部分との複合体中に）存在せずに投与された場合に患者が体験する有害作用又はそのリスクと比較して低減される、方法を提供する。したがって、プロドラッグ複合体を形成するための、本発明の結合部分の使用は、低減された有害作用若しくは低減されたそのリスクを伴う治療方法、及び／又はより高用量の薬物分子若しくは短期間にわたる薬物分子の投与を伴う、治療方法を可能にする。
【0057】
任意の所与の疾患又は状態における治療応答は、その疾患又は状態に特異的な標準化された応答基準によって決定することができる。療法を受けている対象は、治療剤の投与に関連する有害作用又はそのリスクの低減と共に、疾患に関連する症状の改善という有益な効果を体験し得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「増殖性疾患」は、細胞の過剰産生を特徴とする疾患を指す。増殖性疾患の例としては、癌、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、乾癬、特発性肺線維症、強皮症及び肝硬変が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、増殖性疾患は、癌である。
【0059】
結合部分
本明細書に記載の結合部分は、薬物分子に対して高い親和性で結合することができる、様々な異なる構造を有するポリペプチド又はタンパク質である。本発明で使用するための結合部分は、抗体、代替足場、及びポリペプチドを含む。
本明細書に記載の結合部分は、薬物分子に対して高い親和性で結合することができる、様々な異なる構造を有するポリペプチド又はタンパク質である。本発明で使用するための結合部分は、抗体、代替足場、及びポリペプチドを含む。
【0060】
抗体は、抗体又は免疫グロブリン分子に由来する抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を含む。抗原結合ドメインは、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び例えば、ヒト又はラクダ科動物起源の可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来し得る。いくつかの例では、抗原結合ドメインが、結合部分が最終的に使用されるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用のために、本明細書に記載の結合部分の抗原結合ドメインが、ヒト又はヒト化抗原結合ドメインを含むことは有益であり得る。抗体は、当該技術分野で周知の技術を用いて得ることができる。
【0061】
一実施形態では、結合部分は、ラクダ科ナノボディーである。ラクダ科ナノボディー（ラクダ科単一ドメイン抗体又はＶＨＨとしても知られる）は、ラマ、ラクダ、及びアルパカなどの哺乳動物のラクダ科に由来する。他の抗体とは異なり、ラクダ科抗体は軽鎖を欠き、２つの同一の重鎖から構成される。ラクダ科抗体は、典型的には、約１５ｋＤａの領域の比較的低い分子量を有する。
【0062】
一実施形態では、結合部分は、サメ抗体ドメインである。ラクダ科ナノボディーと同様に、サメ抗体ドメインも軽鎖を欠いている。
【0063】
抗原（薬物分子など）に結合することができ、抗体又は免疫グロブリン分子に由来しない結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を、代替足場は含む。代替足場の結合ドメインは、様々な異なるポリペプチド又はタンパク質構造を含んでもよく、又はそれに由来してもよい。代替足場としては、アドネクチン（モノボディー）、アフィボディー、アフィリン、アフィマー及びアプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アルマジロ反復タンパク質ベースの足場、アトリマー、アビマー、アンキリン反復タンパク質ベースの足場（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）、フィノマー、ノッチン、及びクニッツドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。代替足場は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ）．２０１７ Ｊｕｎｅ １２；１０（１）：２９３－３２０．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖａｎｃｈｅｍ－０６１５１６－０４５２０５に記載されている。
【0064】
アドネクチンは、元々はヒトフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質型タンパク質（１０Ｆｎ３）の１０番目の細胞外ドメインに由来する。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、７又は８個のβ鎖を有し、これらは２つのβシートの間に分布しており、βシート自体が互いにパッキングしてタンパク質のコアを形成し、更にループ（ＣＤＲに類似）を含み、ループはベータ鎖を互いに接続し、溶媒が露出している。βシートサンドイッチの各縁部には少なくとも３つのそのようなループが存在し、縁部は、β鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６８１８４１８号を参照されたい）。この構造のために、この非抗体足場は、抗体の抗原結合特性の性質及び親和性に類似した抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに類似するインビトロでのループ無作為化及びシャッフリング手法において使用することができる。
【0065】
アフィボディー親和性リガンドは、細菌黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の表面タンパク質であるプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルから構成される。この足場ドメインは５８個のアミノ酸からなり、そのうちの１３個を無作為化して、多数のリガンドバリアントを有するアフィボディーライブラリーを作製する（例えば、米国特許第５８３１０１２号を参照されたい）。アフィボディー分子は抗体を模倣しているが、抗体の場合の約１５０ｋＤａと比較して、約６ｋＤａの分子量を有し、かなり小さくなっている。サイズの違いにもかかわらず、アフィボディー分子の結合部位は抗体の結合部位と類似性を有する。
【0066】
アフィリンは、構造的にヒトユビキチンに由来する（歴史的にはγ－Ｂクリスタリンにも由来する）合成抗体模倣物である。アフィリンは、主にβシート構造及び約２０ｋＤａの総分子量を有する２つの同一のドメインからなる。アフィリンは、修飾に好適ないくつかの表面露出したアミノ酸を含有する。アフィリンは、抗原に対する親和性及び特異性において抗体に似ているが、構造においては似ていない。
【0067】
アフィマーは、ペプチドアプタマの一種であり、ＳＱＴ（Ｓｔｅｆｉｎ Ａ ｑｕａｄｒｕｐｌｅ ｍｕｔａｎｔ－Ｔｒａｃｙ）（ステフィンＡ四重変異体－トレイシー）として知られる構造を有する。アプタマー及びアフィマーは、結合ペプチドのＮ末端及びＣ末端両方が不活性な足場に埋め込まれた、構造上の制約のために不活性で剛性のあるタンパク質足場と親和的に結合する原因となる短いペプチドである。
【0068】
アフィチンは、特異的結合親和性を得るように操作されたＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄのバリアントである。Ｓａｃ７ｄは、元々は超好熱菌古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓに由来し、ＤＮＡと結合してそれの熱変性を防止する。アフィチンは、商業的にはＮａｎｏｆｉｔｉｎとして知られている。
【0069】
アルファボディーは、様々な抗原に結合するように操作された小さな（約１０ｋＤａ）タンパク質であり、したがって抗体模倣物である。アルファボディー足場は、コイルドコイル構造に基づいてコンピュータで設計される。標準的なアルファボディー足場は、高グリシン／セリンリンカーを介して連結された、各々４つのヘプタッド反復（７残基のストレッチ）から構成される３つのαヘリックスを含有する。標準的なヘプタッド配列は、「ＩＡＡＩＱＫＱ」である。細胞外及び細胞内タンパク質を標的とするアルファボディーの能力は、それらの高い結合親和性と組み合わせて、抗体では到達することができない標的にそれらが結合することを可能にし得る。
【0070】
アンチカリンは、リポカリンに見出される強固で保存的なβバレル構造を有する結合タンパク質の群である。リポカリンは、シグナル伝達分子などの様々な生物学的分子の認識、貯蔵、及び輸送を担う１つのペプチド鎖（１５０～１９０アミノ酸）を含む細胞外タンパク質の一種である。
【0071】
アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、真核生物において豊富であり、広範な生物学的プロセス、特に核輸送に関連するプロセスに関与する。アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、通常、３～５個の内部反復及び２個のキャッピングエレメントからなる。それらはまた、タンデム伸長スーパーヘリックス構造を有し、これは、伸長された立体構造で対応するペプチドリガンドと結合することが可能である。
【0072】
アトリマーは、テトラネクチンとして知られるトリマー血漿タンパク質に由来する足場であり、３つの同一の単位からなるＣ型レクチンのファミリーに属する。テトラネクチン内のＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）の構造は、標的化分子との相互作用を媒介する５つの柔軟なループを有する。
【0073】
アビマーは、ＨＥＲ３などの天然のＡドメイン含有タンパク質に由来し、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の異なる「Ａドメイン」モノマー（２～１０）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号、同第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００４８５１２号、及び同第２００６／０００８８４４号に記載される方法論を使用して、標的抗原に結合することができるアビマーを作製することができる。
【0074】
一実施形態では、結合部分は、アンキリン反復タンパク質である。設計又は操作されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質など）は、抗体模倣タンパク質のように機能することができ、典型的には、特異性の高いかつ高親和性の標的結合を示す。設計アンキリン反復タンパク質は、１つ以上の設計アンキリン反復ドメインを含む。設計アンキリン反復ドメインは、天然アンキリン反復タンパク質に由来し、各設計アンキリン反復ドメインは、典型的には、高い特異性及び高親和性で標的タンパク質に結合する。設計アンキリン反復タンパク質は、その高い特異性、安定性、効力及び親和性により、並びに単一特異性、二重特異性又は多重特異性タンパク質を生成するためのフォーマッティングにおけるその柔軟性により、高親和性結合部分としての使用に特に好適である。設計アンキリン反復タンパク質薬物候補はまた、迅速、低コスト及び高収率製造並びに４℃での数年までの貯蔵寿命を含む好ましい開発特性を示す。設計アンキリン反復タンパク質は、本発明の結合部分の好ましい実施形態である。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ．所有の登録商標である。
【0075】
フィノマーは、ヒトＦｙｎチロシンキナーゼのＳｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）のアミノ酸８３～１４５から進化した小さな球状タンパク質（約７ｋＤａ）である。フィノマーは、その高い熱安定性、システインを含まない足場、及びヒト起源により、潜在的な免疫原性を低減する、魅力的な結合分子である。
【0076】
システインノットミニタンパク質としても知られているノッチンは、典型的には、３つの逆平行βシートと、システインノットを作り出すジスルフィド結合によって縛られた拘束ループとを含む３０アミノ酸長のタンパク質である。このジスルフィド結合が高い熱安定性を与え、ノッチンを魅力的な抗体模倣物にしている。
【0077】
クニッツドメインペプチド又はクニッツドメイン阻害剤は、構造フレームワークを不安定化することなく変異され得る３つのジスルフィド結合及び３つのループを有する約６０個のアミノ酸を含む不規則な二次構造を有するプロテアーゼ阻害剤の一種である。
【0078】
一実施形態では、結合部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する抗原結合ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質である。
【0079】
結合部分の例
本発明で使用するためのアンキリン反復ドメインの例は、配列番号１～１０（実施例を参照されたい）によって提供される。
本発明で使用するためのアンキリン反復ドメインの例は、配列番号１～１０（実施例を参照されたい）によって提供される。
【0080】
配列番号１～１０のアンキリン反復ドメインは、配列番号１２～１５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に高い親和性で特異的に結合する。例えば、配列番号１～１０のアンキリン反復ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に高い親和性で特異的に結合する。一実施形態では、配列番号１～１０のアンキリン反復ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。別の実施形態では、配列番号１～１０のアンキリン反復ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。配列番号１２～１５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異性を有する別の結合分子に遺伝的に融合され、Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）薬物分子を形成することができる。そのようなＴ細胞エンゲージャー薬物分子への、配列番号１～１０のいずれかのアンキリン反復ドメインの結合は、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子のＣＤ３への結合を阻害し、ひいてはＴ細胞エンゲージャー薬物分子の生物学的活性を阻害する。
【0081】
したがって、一実施形態では、本発明の結合部分は、配列番号１～１０からなる群から選択されるアンキリン反復ドメインと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアンキリン反復ドメインである。
【0082】
一実施形態では、結合部分は、配列番号１～１０からなる群から選択されるアンキリン反復ドメインと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアンキリン反復ドメインである。
【0083】
一実施形態では、結合部分は、アンキリン反復ドメインであり、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１０からなる群から選択される。
【0084】
一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号１～１０及び（２）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む設計アンキリン反復ドメインである。
【0085】
一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大８個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大７個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大６個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大５個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大４個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号３０～５１及び（２）配列番号３０～５１のうちいずれかにおける最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む設計アンキリン反復タンパク質である。
【0086】
本明細書に記載の結合部分の全てにおいて、結合部分のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸によって置換され得る。いくつかの実施形態では、最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個の置換が、本明細書に記載の結合部分のいずれかにおいて行われる。
【0087】
いくつかの実施形態では、最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個の置換が、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、任意のアンキリン反復ドメインにおいて行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大１５個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大１４個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大１３個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大１２個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大１１個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大１０個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大９個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大８個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大７個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大６個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大５個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大４個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大３個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大２個の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０の配列のいずれかに対して、最大１個の置換が行われる。
【0088】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は全て、フレームワーク位置で行われる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は全て、非無作為化位置で行われる。設計アンキリン反復ドメインにおける無作為化位置の場所は、例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）に開示されている。
【0089】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、非置換結合部分のＫD値と比較して、ＫD値を約１０００倍超、約１００倍超、又は約１０倍超変化させない。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１～１０の配列のいずれかを含む結合部分を、配列番号１２～１５の配列のいずれかを含む薬物分子の結合のＫD値と比較して、ＫD値を約１０００倍超、約３００倍超、約１００倍超、約５０倍超、約２５倍超、約１０倍超、又は約５倍超変化させない。
【0090】
特定の実施形態では、結合部分におけるアミノ酸置換は、以下の表１による保存的置換である。
【0091】
【表1】
【0092】
結合部分が、アンキリン反復ドメインである場合、いくつかの実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われ得る。他の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われ得る。例えば、アンキリンドメインは、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘｌＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号５２）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を表し、又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡＡｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（配列番号５３）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を表し、「ｚ」は、アスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される。一実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基の外側で行われる。
【0093】
加えて、結合部分の任意のアンキリン反復ドメインの最後から２番目の位置は、「Ａ」若しくは「Ｌ」であり得、かつ／又は最後の位置は、「Ａ」若しくは「Ｎ」であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列１～１０のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。更に、結合部分の任意のアンキリン反復ドメインの配列は、任意選択で、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを含んでもよい（以下を参照されたい）。
【0094】
加えて、結合部分の各アンキリン反復ドメインは、任意選択で、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列１～１０のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、更に任意選択で、そのＮ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳを含む。例示的な実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列番号１～１０のいずれか１つと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、任意選択で、そのＮ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。更に、結合部分の任意のアンキリン反復ドメインの配列は、任意選択で、Ｌで置換された最後から２番目の位置のＡ、及び／又はＮで置換された最後の位置のＡを有していてもよい（上記を参照されたい）。
【0095】
Ｎ末端及びＣ末端キャッピング配列
本明細書に記載の結合部分がアンキリン反復ドメインを含む場合、アンキリン反復ドメインは、Ｎ末端又はＣ末端キャッピング配列を含み得る。キャッピング配列は、アンキリン反復配列モチーフ又はモジュールのＮ末端又はＣ末端に融合された追加のポリペプチド配列を指し、当該キャッピング配列は、隣接アンキリン反復配列モチーフ又はアンキリン反復ドメインのモジュールとの強固な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、側面のアンキリン反復ドメインの疎水性コアを、溶媒に曝露することから遮蔽するキャップを提供する。
本明細書に記載の結合部分がアンキリン反復ドメインを含む場合、アンキリン反復ドメインは、Ｎ末端又はＣ末端キャッピング配列を含み得る。キャッピング配列は、アンキリン反復配列モチーフ又はモジュールのＮ末端又はＣ末端に融合された追加のポリペプチド配列を指し、当該キャッピング配列は、隣接アンキリン反復配列モチーフ又はアンキリン反復ドメインのモジュールとの強固な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、側面のアンキリン反復ドメインの疎水性コアを、溶媒に曝露することから遮蔽するキャップを提供する。
【0096】
Ｎ末端及び／又はＣ末端のキャッピング配列は、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際公開第２００２／０２０５６５号及び同第２０１２／０６９６５５号、米国特許公開第２０１３０２９６２２１号、並びにＩｎｔｅｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４に記載されている。Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピング反復）の例は、配列番号２１から２３であり、Ｃ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピング反復）の例は、配列番号２８を含む。
【0097】
薬物分子
本発明の文脈内で、薬物分子は、ポリペプチド又はタンパク質を含む治療剤であり、当該ポリペプチド又はタンパク質は、結合部分によって結合することができる部位を含有する。本発明で使用するための薬物分子は、結合部分によって結合され得る限り、特に限定されない。これは、例えば、薬物分子が結合部分と同じ「クラス／種（class）」に属してもよく、結合部分と異なる「クラス／種」に属してもよいことを意味し、その結果、例えば、薬物分子及び結合部分の両方が抗体であり得るか、又は薬物分子及び結合部分の両方が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得るか、又は薬物分子が抗体であり得、結合部分が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得るか、又は薬物分子が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得、結合部分が抗体であり得る。これは更に、例えば、薬物分子自体が異なる構造部分、例えば、抗体部分と代替足場部分との組み合わせ、又は異なる代替足場構造の部分の組み合わせを含み得ることを意味する。薬物分子及び結合部分の両方が抗体である場合、抗体が、結合特異性に関するものを含めて、互いに異なることは当業者には明らかであろう。同様に、薬物分子及び結合部分の両方が代替足場である場合、代替足場が、結合特異性に関するものを含めて、互いに異なることは当業者には明らかであろう。
本発明の文脈内で、薬物分子は、ポリペプチド又はタンパク質を含む治療剤であり、当該ポリペプチド又はタンパク質は、結合部分によって結合することができる部位を含有する。本発明で使用するための薬物分子は、結合部分によって結合され得る限り、特に限定されない。これは、例えば、薬物分子が結合部分と同じ「クラス／種（class）」に属してもよく、結合部分と異なる「クラス／種」に属してもよいことを意味し、その結果、例えば、薬物分子及び結合部分の両方が抗体であり得るか、又は薬物分子及び結合部分の両方が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得るか、又は薬物分子が抗体であり得、結合部分が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得るか、又は薬物分子が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得、結合部分が抗体であり得る。これは更に、例えば、薬物分子自体が異なる構造部分、例えば、抗体部分と代替足場部分との組み合わせ、又は異なる代替足場構造の部分の組み合わせを含み得ることを意味する。薬物分子及び結合部分の両方が抗体である場合、抗体が、結合特異性に関するものを含めて、互いに異なることは当業者には明らかであろう。同様に、薬物分子及び結合部分の両方が代替足場である場合、代替足場が、結合特異性に関するものを含めて、互いに異なることは当業者には明らかであろう。
【0098】
更に、本発明で使用するための薬物分子は、半減期延長部分を含有し得る。半減期延長部分は、半減期延長部分を有していない同じタンパク質と比較して、薬物分子のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、半減期延長部分は、ＨＳＡに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み得る。他の例では、半減期延長部分は、免疫グロブリンドメイン、例えば、Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ1のＦｃドメイン、又はそのバリアント若しくは誘導体を含み得る。
【0099】
いくつかの実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、代替足場を含み、代替足場は、アドネクチン（モノボディー）、アフィボディー、アフィリン、アフィマー及びアプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アルマジロ反復タンパク質ベースの足場、アトリマー、アビマー、アンキリン反復タンパク質ベースの足場（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質など）、フィノマー、ノッチン、及びクニッツドメインペプチドから選択される。代替足場は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ）．２０１７ Ｊｕｎｅ １２；１０（１）：２９３－３２０．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖａｎｃｈｅｍ－０６１５１６－０４５２０５に記載されている。
【0100】
本発明で使用するための薬物分子としてはまた、以下のものなどの臨床使用のために現在承認されている異なるカテゴリーの薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
（１）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、
（２）二重特異性抗体、及び
（３）遺伝子改変された免疫細胞、例えばＴ細胞、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞。
（１）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、
（２）二重特異性抗体、及び
（３）遺伝子改変された免疫細胞、例えばＴ細胞、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞。
【0101】
本発明で使用するための薬物分子としてはまた、本明細書において「免疫チェックポイント調節因子」と呼ばれる、免疫チェックポイントの活性を上方制御又は下方制御する分子が挙げられるが、これらに限定されない。免疫チェックポイントは、免疫シグナルを増加させる（共刺激分子）又は減少させる（阻害分子）免疫系における分子である。癌患者において、腫瘍は、これらの免疫チェックポイントを使用して、特にＴ細胞による免疫系攻撃から自身を保護することがある。免疫チェックポイント療法において使用される薬物分子は、阻害性免疫チェックポイント分子を遮断するか、又は刺激性免疫チェックポイント分子を活性化し、それによって免疫系機能を回復させることができる。近年、免疫チェックポイント薬は、重要な新規の癌治療選択肢となっている。免疫チェックポイント分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ－１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭＩ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、Ｃ５ＡＲ１、ＣＣＲ８、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４７、ＣＤ９４、ＥＴＡＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＲＰα、ＴＬＲ８、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４及びＶＩＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、薬物分子は、免疫チェックポイント調節因子である。
【0102】
一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、抗体を含む。別の実施形態では、薬物分子は、二重特異性抗体を含む。別の実施形態では、薬物分子は、多重特異性抗体を含む。別の実施形態では、薬物分子は、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である抗体を含む。
【0103】
二重特異性抗体にはＴＣＥが含まれる。ＴＣＥである二重特異性抗体の例は、ＢｉＴＥ（商標）分子として知られる分子である。これらは、単一のペプチド鎖上の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる抗癌薬である。そのようなＴＣＥは、ｓｃＦｖのうちの１つを介してＴ細胞の表面上のＣＤ３（表面抗原分類３）分子に結合し、一方、他のｓｃＦｖは、腫瘍細胞の表面上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。ＣＤ３に結合し、Ｔ細胞を腫瘍細胞に連結することによって、Ｔ細胞は、「活性化」され、腫瘍細胞に対して細胞毒性活性を発揮することができる。ＴＣＥである二重特異性抗体の一例はブリナツモマブであり、これはＴ細胞の表面上のＣＤ３及びＢ細胞の表面上のＣＤ１９に結合する。ブリナツモマブは、急性リンパ芽球性白血病の治療での使用が承認されている。
【0104】
一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、二重特異性代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、多重特異性代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である代替足場分子を含む。好ましい実施形態では、当該代替足場は、アンキリン反復ドメインである。更に好ましい実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、代替足場を含み、当該代替足場は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１２～１５から選択されるアミノ酸配列を含む。更に好ましい実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１２～１５から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１３～１４から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１３を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１４を含む。
【0105】
二重特異性又は多重特異性代替足場分子にはＴＣＥが含まれる。一実施形態では、薬物分子は、二重特異性又は多重特異性代替足場分子であり、当該代替足場分子は、（ｉ）アンキリン反復ドメインであるＣＤ３特異的結合ドメイン、及び（ｉｉ）アンキリン反復ドメインであるＴＡＡ特異的結合ドメインを含むＴＣＥである。ＢｉＴＥ（商標）分子として知られるＴＣＥと同様に、代替足場を含むそのようなＴＣＥは、結合ドメインの１つを介してＴ細胞の表面上のＣＤ３分子に結合する一方で、他の結合ドメインが腫瘍細胞の表面上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗癌薬である。ＣＤ３に結合し、Ｔ細胞を腫瘍細胞に連結することによって、Ｔ細胞は、「活性化」され、腫瘍細胞に対して細胞毒性活性を発揮することができる。
【0106】
薬物分子がＴＣＥである場合、本発明の結合部分の好ましい結合部位は、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインである。ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに結合することによって、結合部分は、ＴＣＥがＴ細胞に結合するのを妨げることによって、ＴＣＥの作用機序を遮断する。一実施形態では、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインへの結合部分の結合は、抗イディオタイプである。
【0107】
以下に列挙されるものを含む、ＴＣＥである多数の二重特異性抗体が記載されており、それらのそれぞれの結合標的が括弧内に提供されている。例えば、上記のように、ブリナツモマブ（ＣＤ１９ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）は、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原、及びＢ細胞系統から生じた腫瘍細胞上のＣＤ１９抗原に結合する。ＴＣＥである他の二重特異性抗体としては、ＡＭＧ３３０（ＣＤ３３ｘＣＤ３）、フロテツズマブ（ＣＤ１２３ｘＣＤ３、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＣＬＡ１１７（Ｃｌｅｃ１２ＡＸＣＤ３、Ｍｅｒｕｓ）、ＡＭＧ１６０（ＨＬＥ ＰＳＭＡｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ４２７（ＨＬＥ ＦＬＴ３ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ５６２（ＨＬＥ ＣＤ１９ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ５９６（ＨＬＥ ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ６７３（ＨＬＥ ＣＤ３３ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ７０１（ＨＬＥ ＢＣＭＡｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ７５７（ＨＬＥ ＤＬＬ３ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ９１０（ＨＬＥ Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、オドロンエクスタマブ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、モスネツツズマブ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｒｏｃｈｅ）、ｇｌｏｆｉｔａｍａｂ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｒｏｃｈｅ）、及びエピコリタマブ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなＴＣＥのいずれも、本発明の組成物中の薬物分子として使用され得る。
【0108】
一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、抗体及び代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、２つの異なる代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来抗原認識ドメインを含む。
【0109】
一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、遺伝子改変された免疫細胞を含む。好ましい実施形態では、当該遺伝子改変された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。一実施形態では、当該遺伝子改変された免疫細胞は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）などの遺伝子改変されたＴ細胞である。別の実施形態では、当該遺伝子改変された免疫細胞は、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）などの遺伝子改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【0110】
結合親和性
本明細書に記載の結合部分及び薬物分子は、非共有結合様式で結合して、プロドラッグ複合体を形成する。任意の分子の別の分子への結合は、２つの力、すなわち、会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）によって支配されている。次いで、標的［Ｔ］に対する任意の結合剤［Ｂ］の親和性は、平衡解離定数ＫDによって表すことができ、これはｋoff／ｋonの商である。
本明細書に記載の結合部分及び薬物分子は、非共有結合様式で結合して、プロドラッグ複合体を形成する。任意の分子の別の分子への結合は、２つの力、すなわち、会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）によって支配されている。次いで、標的［Ｔ］に対する任意の結合剤［Ｂ］の親和性は、平衡解離定数ＫDによって表すことができ、これはｋoff／ｋonの商である。
【0111】
【数5】
【0112】
特定の実施形態では、薬物分子に対する結合部分の結合親和性は、ＫDに関して記載される。例示的な実施形態では、ＫDは、約１０-7Ｍ以下、約１０-8Ｍ以下、約１０-9Ｍ以下、約１０-10Ｍ以下、約１０-11Ｍ以下、約１０-12Ｍ以下、約１０-13Ｍ以下、約１０-14Ｍ以下、約１０-7Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-11Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-12Ｍ～約１０-15Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-11Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-12Ｍ～約１０-14Ｍ、約１０-7Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-8Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-9Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-10Ｍ～約１０-13Ｍ、約１０-11Ｍ～約１０-13Ｍ、又は約１０-12Ｍ～約１０-13Ｍである。
【0113】
例示的な実施形態では、結合部分は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ以下のＫD値で薬物分子に結合する。例示的な一実施形態では、結合部分は、約１ｎＭ以下のＫD値で薬物分子に結合する。別の例示的な実施形態では、結合部分は、約１００ｐＭ以下のＫD値で薬物分子に結合する。別の例示的な実施形態では、結合部分は、約１０ｐＭ以下のＫD値で薬物分子に結合する。更に別の例示的な実施形態では、結合部分は、約１ｐＭ以下のＫD値で薬物分子に結合する。
【0114】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0115】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号２と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号２と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0116】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号３と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号３と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0117】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0118】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号５と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号５と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0119】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号６と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号６と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0120】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号７と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号７と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0121】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号８と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号８と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0122】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号９と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号９と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0123】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１０と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１００ｎＭ未満、例えば、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約５００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、又は約１ｆＭ未満のＫD値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１０と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１～約１００ｐＭの範囲のＫD値で当該薬物分子に結合する。
【0124】
例示的な実施形態では、結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ－１、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で薬物分子に結合する。
【0125】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0126】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号２と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋｏｆｆ値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号２と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋｏｆｆ値で当該薬物分子に結合する。
【0127】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号３と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号３と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0128】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0129】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号５と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号５と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0130】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号６と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号６と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0131】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号７と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号７と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0132】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号８と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号８と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0133】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号９と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号９と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0134】
いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１０と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、例えば、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-7ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-8ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-6ｓ-1、約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1、又は約１×１０-6ｓ-1～約１×１０-5ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１０と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３又は１４と少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１×１０-7ｓ-1～約１×１０-4ｓ-1のｋoff値で当該薬物分子に結合する。
【0135】
結合部分及び薬物分子が一緒に結合される場合、薬物分子は、生物学的活性、例えば、生物学的標的分子への結合を発揮することができない。したがって、結合部分が薬物に結合している間、薬物の活性は「遮断」される。遮断半減期（以下、「遮断Ｔ1/2」と呼ばれる）は、プロドラッグ複合体の半分が解離するのにかかる時間である。したがって、Ｔ1/2は、プロドラッグ複合体の「半減期」である。遮断Ｔ1/2は、以下の式：
【0136】
【数6】
【0137】
対象への薬物の徐放を達成するために、遮断半減期は、少なくとも約２時間、少なくとも約５時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間であるべきである。遮断半減期は、上記の値のいずれの間にあってもよい。例えば、遮断半減期は、約１０～約２５０時間、約２０～約２５０時間、約４０～約２００時間、又は約５０～約１００時間の範囲内であってもよい。
【0138】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0139】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号２と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0140】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号３と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0141】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号４と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0142】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0143】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号６と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0144】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号７と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0145】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号８と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0146】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号９と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0147】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１０と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分、及び配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、当該プロドラッグ複合体は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約１００時間、少なくとも約１５０時間、又は少なくとも約２００時間の遮断半減期を示す。
【0148】
遮断半減期に特定の上限はない。しかしながら、ある特定の疾患適応症及び関連する薬物分子について、当業者は、プロドラッグ複合体の遮断半減期が長すぎる場合、薬物が体内に放出されるのが遅すぎて所望の治療利益を得ることができない場合があることを理解するであろう。結果として、遮断半減期は、所与の薬物分子の所望の治療利益が依然として観察可能であるようなものであるべきである。
【0149】
組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書で定義される結合部分及び本明細書で定義される薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が、薬物分子に可逆的に結合し、当該結合部分が、結合した場合に、当該薬物分子の生物学的活性を阻害する、組成物に関する。一実施形態では、当該生物学的活性は、当該薬物分子の生物学的標的への結合である。一実施形態では、当該薬物分子に対する当該結合部分の結合親和性は、インビボ投与時の時間の関数としての薬物分子の放出を可能にする。本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、「プロドラッグ複合体」と互換的に使用される。
一実施形態では、本発明は、本明細書で定義される結合部分及び本明細書で定義される薬物分子を含む組成物であって、当該結合部分が、薬物分子に可逆的に結合し、当該結合部分が、結合した場合に、当該薬物分子の生物学的活性を阻害する、組成物に関する。一実施形態では、当該生物学的活性は、当該薬物分子の生物学的標的への結合である。一実施形態では、当該薬物分子に対する当該結合部分の結合親和性は、インビボ投与時の時間の関数としての薬物分子の放出を可能にする。本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、「プロドラッグ複合体」と互換的に使用される。
【0150】
上に列挙した任意のタンパク質結合部分は、結合部分が薬物分子に対する所望の結合親和性及び特異性を有する限り、上に列挙した任意の薬物分子と組み合わせて組成物（すなわち、プロドラッグ複合体）を形成することができる。
【0151】
組成物は、上記の結合部分及び薬物分子の組み合わせのいずれか、特に、明確に開示された結合係数（例えば、ＫD及びｋoff）又は遮断半減期を有する具体的に開示された組み合わせのいずれかを含み得る。
【0152】
上記のように、設計アンキリン反復ドメインは、本発明で使用するための好ましい結合部分である。したがって、一実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分を含む。別の実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、設計アンキリン反復ドメインを含む薬物分子とを含む。別の実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の設計アンキリン反復ドメインを含む薬物分子とを含む。別の実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、代替足場を含む薬物分子とを含む。別の実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、抗体を含む薬物分子とを含む。別の実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する抗原結合ドメインを含む薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子である薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、免疫チェックポイント調節因子薬物分子である薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復タンパク質を含む結合部分と、二重特異性抗体薬物分子である薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分と、ＣＡＲ発現免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞である薬物分子とを含む。
【0153】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号１、及び（２）配列番号１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0154】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号１と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0155】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号１と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0156】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0157】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0158】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0159】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号２、及び（２）配列番号２と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0160】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号２と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0161】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号２と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0162】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号２の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0163】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号２の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号２の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0164】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号２を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号２を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0165】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号３、及び（２）配列番号３と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0166】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号３と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0167】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号３と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号３と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0168】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号３の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0169】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号３の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号３の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0170】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号３を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号３を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0171】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号４、及び（２）配列番号４と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0172】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号４と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0173】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号４と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号４と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0174】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号４の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0175】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号４の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号４の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0176】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号４を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号４を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0177】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号５、及び（２）配列番号５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0178】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号５と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0179】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号５と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号５と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0180】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号５のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号５の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0181】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号５のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号５の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号５のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号５の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0182】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号５を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号５を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0183】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号６、及び（２）配列番号６と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0184】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号６と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0185】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号６と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号６と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0186】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号６の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0187】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号６の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号６の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0188】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号６を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号６を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0189】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号７、及び（２）配列番号７と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0190】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号７と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0191】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号７と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号７と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0192】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号７の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0193】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号７の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号７の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0194】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号７を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号７を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0195】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号８、及び（２）配列番号８と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0196】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号８と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0197】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号８と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号８と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0198】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号８のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号８の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0199】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号８のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号８の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号８のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号８の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0200】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号８を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号８を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0201】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号９、及び（２）配列番号９と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0202】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号９と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0203】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号９と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号９と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0204】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号９のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号９の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0205】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号９のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号９の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号９のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号９の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0206】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号９を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号９を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号１０、及び（２）配列番号１０と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）（１）配列番号１０、及び（２）配列番号１０と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0207】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３及び１４のいずれかと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0208】
一実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0209】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１０の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１２～１５及び（２）配列番号１２～１５と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0210】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１０の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１０の最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含む薬物分子と、を含む。
【0211】
別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１２～１５のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）配列番号１０を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１４のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。
【0212】
一実施形態では、上記の当該組成物のいずれかに含まれる当該薬物分子は、二重特異性又は多重特異性薬物分子である。別の実施形態では、上記の当該組成物のいずれかに含まれる当該薬物分子は、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子である。
【0213】
上記のように、抗体及び代替足場もまた、本発明で使用するための結合部分である。したがって、一実施形態では、組成物は、抗体又は代替足場を含む結合部分を含む。別の実施形態では、組成物は、（１）抗体又は代替足場を含む結合部分と、（２）設計アンキリン反復ドメインを含む薬物分子とを含む。別の実施形態では、組成物は、（１）抗体又は代替足場を含む結合部分と、（２）抗体を含む薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、（１）抗体又は代替足場を含む結合部分と、（２）Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子である薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、（１）抗体又は代替足場を含む結合部分と、（２）免疫チェックポイント阻害剤薬物分子である薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、（１）抗体又は代替足場を含む結合部分と、（２）二重特異性抗体薬物分子である薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、（１）抗体又は代替足場を含む結合部分と、（２）免疫細胞活性化薬物分子である薬物分子とを含む。一実施形態では、組成物は、（１）抗体又は代替足場を含む結合部分と、（２）遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞である薬物分子とを含む。
【0214】
本発明の組成物は、実質的に全ての薬物分子が結合部分に結合していることを必要とするため、医薬組成物は、そのような結合が起こり、平衡に達するのに十分な時間が与えられることが好ましい。平衡を形成するのに必要な時間は、結合定数（ｋon及びｋoff）に依存する。
【0215】
したがって、一実施形態では、本発明は、制御放出製剤を作製する方法であって、
（ｉ）本明細書で定義される結合部分を提供するステップと、
（ｉｉ）本明細書で定義される薬物分子を提供するステップと、
（ｉｉｉ）薬物分子の実質的に全てが結合部分によって結合されるように、当該結合部分及び活性薬物分子を平衡に到達させるステップと、を含む、方法に関する。
（ｉ）本明細書で定義される結合部分を提供するステップと、
（ｉｉ）本明細書で定義される薬物分子を提供するステップと、
（ｉｉｉ）薬物分子の実質的に全てが結合部分によって結合されるように、当該結合部分及び活性薬物分子を平衡に到達させるステップと、を含む、方法に関する。
【0216】
一実施形態では、薬物分子及び結合部分を、少なくとも約１時間、例えば少なくとも約２時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、又は少なくとも約７２時間平衡化させた。
【0217】
組成物中の結合部分の濃度は、ｋon平衡定数がｋoff平衡定数よりもかなり高いことを実現するために比較的高くあるべきであり、これは、実質的に全ての薬物分子が結合部分によって結合され、薬物分子の作用機序が実質的に阻害されることを意味する。一実施形態では、結合部分及び薬物分子は、１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、結合部分は、薬物分子の量と比較してモル過剰で存在すべきである。したがって、これらの実施形態では、結合部分は、少なくとも１．２：１、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも４００：１、又は少なくとも１０００：１の薬物分子に対するモル比で提供される。
【0218】
本発明は更に、本明細書に記載の組成物及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、医薬組成物に関する。当該医薬組成物の使用及びそれを用いる治療方法も本明細書に記載されている。本発明に包含される方法及び使用は、以下により詳細に記載されている。医薬組成物、方法及び使用により、医薬組成物を作製するために使用される薬物分子によって治療される疾患適応症を治療することに留意されたい。
【0219】
結合部分の主な機能は、薬物分子に結合して薬物分子の徐放をもたらすことである。したがって、いくつかの実施形態では、結合部分は、タンパク質結合部分との事前の複合体形成を伴わない直接投与よりも遅い速度で薬物分子を体内に放出すること以外に、インビボでの薬物分子の生物学的効果を実質的に変化させない。しかしながら、結合部分は、追加の機能的部分を含み得る。そのような追加の機能的部分は、生物学的活性などの特定の利点を提供し得るか、又は例えば検出目的のための結合部分のタグ化／標識において有用であり得る。
【0220】
本明細書に記載の医薬組成物は、当該技術分野で公知の方法を用いて調製することができる。
【0221】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含んでもよい。標準的な医薬担体としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水又は水／油エマルジョンなどのエマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤が挙げられる。
【0222】
医薬組成物は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル推進剤、空気置換剤、アルカリ化剤、抗硬化剤、抗凝固剤、抗菌防腐剤、抗酸化剤、消毒剤、基材、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、消毒薬、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、皮膚軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、フィルム形成剤、調味料、香味料、フローエンハンサー、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、パステル基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶剤、安定剤、坐剤基剤、界面活性剤、界面活性物質、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、張性剤、毒性剤、増粘剤、吸水性剤、水混和性共溶媒、軟水剤、又は湿潤剤を含む、任意の他の薬学的に許容される成分を含むことができる。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）を参照されたい。参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）。
【0223】
医薬組成物は、生理学的に適合性のあるｐＨを達成するように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、例えば、約４又は約５～約８．０、又は約４．５～約７．５、又は約５．０～約７．５であり得る。例示的な実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約５．５～約７．５である。
【0224】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化又はＮＫ細胞活性化などの免疫細胞活性化を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を、当該対象に投与するステップを含む、方法に関する。
【0225】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、インビボで活性薬物分子の放出を制御する方法に関する。
【0226】
別の実施形態では、本発明は、対象を治療する方法であって、有効量の本明細書で定義される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、増殖性疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態は、本方法は、癌を治療する方法である。
【0227】
別の実施形態では、本発明は、療法に使用するための、本明細書で定義される組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、療法に使用するための、本明細書で定義される医薬組成物に関する。好ましくは、本明細書で定義される医薬組成物は、増殖性疾患の治療で使用するために提供される。好ましい実施形態では、増殖性疾患は、癌である。
【0228】
本発明の医薬組成物は、典型的には、薬物分子に典型的に関連する特定の副作用について高いリスクを有するとして、及び／又は問題となる副作用の可能性が高まるような大量の薬物分子を必要とするとして特定された対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。好ましい実施態様では、対象は、ヒトである。
【0229】
いくつかの実施形態では、医薬組成物の単回投与が十分であり得る。他の実施形態では、反復投与が必要であり得る。対象の年齢及び全般的な健康状態、並びに薬物分子の性質及び典型的な投与レジメンなどの様々な因子が、投与の回数及び頻度に影響を及ぼす。
【0230】
本明細書に記載の医薬組成物は、非経口、経鼻、経口、肺、局所、膣内、又は直腸投与などの任意の好適な投与経路を介して対象に投与することができる。非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。詳細については、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６））を参照されたい。
【0231】
本明細書に記載の医薬組成物は、別の治療剤と組み合わせて使用され得る。各治療剤は、同時に（例えば、同じ薬剤で、又は同時に）、並行して（すなわち、任意の順序で一方が他方の直後に投与される別個の薬剤中で）、又は任意の順序で逐次的に投与されてもよい。逐次投与は、併用療法における治療剤が異なる剤形（例えば、１つの薬剤が錠剤又はカプセルであり、別の薬剤が滅菌液体である）である場合、及び／又は異なる投与スケジュールで投与される場合（例えば、少なくとも毎日投与される鎮痛剤、及び週に１回又は２週間に１回などのより少ない頻度で投与される生物療法剤の場合）に有用である。
【0232】
追加の治療剤としては、鎮痛剤、ステロイド、抗癌剤、抗生物質、ペニシリン、降圧薬、抗糖尿病薬、抗痙攣薬、制吐薬、抗うつ薬、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｉｍ－３、ＬＡＧ－３など）、免疫アゴニスト（例えば、４１－ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０など）、サイトカイン（ＩＬ－１５、ＩＬ－１２など、又は抗ＴＧＦｂ、抗ＩＬ－１０など）、免疫刺激剤、Ｔ細胞刺激剤、免疫腫瘍学モダリティー（例えば、ＣＡＲ－Ｔ及び細胞療法、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、腫瘍溶解性ウイルスなど）、化学療法、放射免疫コンジュゲートなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0233】
核酸及び方法
本発明は更に、本明細書に記載の結合部分をコードする、核酸に関する。一実施形態では、核酸は、本明細書で定義される設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分をコードする。そのような核酸の例は、配列番号１６～１９によって提供される。本発明は更に、当該核酸を含む、宿主細胞に関する。
本発明は更に、本明細書に記載の結合部分をコードする、核酸に関する。一実施形態では、核酸は、本明細書で定義される設計アンキリン反復ドメインを含む結合部分をコードする。そのような核酸の例は、配列番号１６～１９によって提供される。本発明は更に、当該核酸を含む、宿主細胞に関する。
【0234】
本発明は更に、本明細書で定義される結合部分を作製する方法であって、当該組換え結合タンパク質が発現される条件下で本明細書で定義される宿主細胞を培養することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、当該宿主細胞は、真核宿主細胞である。他の実施形態では、当該宿主細胞は、原核宿主細胞である。一実施形態では、結合部分を作製する方法は、当該組換え結合タンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養することを含み、当該結合部分は、設計アンキリン反復ドメインを含み、当該宿主細胞は、例えば大腸菌などの原核宿主細胞である。別の実施形態では、結合部分を作製する方法は、当該組換え結合タンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養することを含み、当該結合部分は、抗体を含み、当該宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞などの真核宿主細胞である。
【実施例】
【0235】
以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を用いて調製することができる。
【0236】
材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質産生に使用した。ＳＰＲ測定のためのＮＬＣチップは、ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）製であった。ＨＴＲＦ試薬は、Ｃｉｓｂｉｏ（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）製であった。Ｐａｎ－Ｔ細胞単離キットは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。２４ウェル形式の「複合」Ｉｎｃｕｃｙｔｅのためのポリエステル注入口は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＵＳＡ）製であり、ニュートラアビジンビーズは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＵＳＡ）製であった。Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（ドイツ）製であった。細胞毒性検出（ＬＤＨ放出による）キットは、Ｒｏｃｈｅ製であった。
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質産生に使用した。ＳＰＲ測定のためのＮＬＣチップは、ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）製であった。ＨＴＲＦ試薬は、Ｃｉｓｂｉｏ（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）製であった。Ｐａｎ－Ｔ細胞単離キットは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。２４ウェル形式の「複合」Ｉｎｃｕｃｙｔｅのためのポリエステル注入口は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＵＳＡ）製であり、ニュートラアビジンビーズは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＵＳＡ）製であった。Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（ドイツ）製であった。細胞毒性検出（ＬＤＨ放出による）キットは、Ｒｏｃｈｅ製であった。
【0237】
分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
【0238】
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、（２００４年）、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号２１、２２、若しくは２３のＮ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号２４によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、配列番号２５、２６、若しくは２７の配列モチーフによる１個以上のランダム化反復モジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号２８のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号２９によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができた。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有することがないように組み立てられる。
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、（２００４年）、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号２１、２２、若しくは２３のＮ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号２４によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、配列番号２５、２６、若しくは２７の配列モチーフによる１個以上のランダム化反復モジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号２８のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号２９によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができた。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有することがないように組み立てられる。
【0239】
更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリーの補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ、Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ、Ｇｏｔｏ，Ｙ．、Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．、「ＥＭＢＯ Ｊ．」第２３巻第３０号第３９２９～３９３８頁（２００４年））。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入されている、このアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの、１つ以上のβターンに挿入された可変長（例えば、１～２０個のアミノ酸）のランダム化ループ（固定化及びランダム化位置を有する）を含有してもよい。
【0240】
アンキリン反復タンパク質ライブラリーのＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ又はＲＥＬＬＫＡモチーフを有し、アンキリン反復タンパク質ライブラリーの任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＫＬＮ、ＫＬＡ又はＫＡＡモチーフを有する。
【0241】
そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。蛋白質構造データバンク（Protein Data Bank：ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。
【0242】
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃで設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例が説明されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚら、２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。
【0243】
反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、１アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。
【0244】
実施例１：ＣＤ３特異的結合ドメインに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインの選択
概要
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を用いて、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子（ＴＣＥ）のＣＤ３特異的結合ドメインに対して結合特異性を有する複数のアンキリン反復ドメインを、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって説明されているものと同様の方法で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択し、具体的な条件及び追加の選択解除ステップは以下であった。ＣＤ３特異的結合ドメインに対する選択されたクローンの結合及び特異性を、大腸菌粗抽出物ホモジニアス時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence、ＨＴＲＦ）によって評価したところ、ＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する複数の結合タンパク質が首尾よく選択されたことが示された。これらの最初に同定された結合タンパク質を更に開発して、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに対して更に高い親和性及び／又はそれからの更に低いオフレートを有する結合タンパク質を得た。例えば、配列番号１～１０のアンキリン反復ドメインは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子のＣＤ３特異的結合ドメインに対する結合特異性並びに高い結合親和性及び／又はそれからの低いオフレートを有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
概要
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を用いて、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子（ＴＣＥ）のＣＤ３特異的結合ドメインに対して結合特異性を有する複数のアンキリン反復ドメインを、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって説明されているものと同様の方法で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択し、具体的な条件及び追加の選択解除ステップは以下であった。ＣＤ３特異的結合ドメインに対する選択されたクローンの結合及び特異性を、大腸菌粗抽出物ホモジニアス時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence、ＨＴＲＦ）によって評価したところ、ＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する複数の結合タンパク質が首尾よく選択されたことが示された。これらの最初に同定された結合タンパク質を更に開発して、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに対して更に高い親和性及び／又はそれからの更に低いオフレートを有する結合タンパク質を得た。例えば、配列番号１～１０のアンキリン反復ドメインは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子のＣＤ３特異的結合ドメインに対する結合特異性並びに高い結合親和性及び／又はそれからの低いオフレートを有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
【0245】
標的及び選択材料としてのＣＤ３特異的結合ドメイン
二重特異的ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインを標的及び選択材料として使用した。そのような標的ドメインは、配列番号１１～１５のポリペプチドから選択された。標的タンパク質を、標準的な方法を用いてビオチン化した。
二重特異的ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインを標的及び選択材料として使用した。そのような標的ドメインは、配列番号１１～１５のポリペプチドから選択された。標的タンパク質を、標準的な方法を用いてビオチン化した。
【0246】
リボソームディスプレイによる標的特異的アンキリン反復タンパク質の選択
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ）を、標的として使用されるＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号１１）に対するリボソームディスプレイ選択において使用した（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２，５７５－５８２（２００４）、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２６９－２７９（２００７）、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，１４１３０－１４１３５（１９９８）を参照されたい）。
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ）を、標的として使用されるＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号１１）に対するリボソームディスプレイ選択において使用した（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２，５７５－５８２（２００４）、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２６９－２７９（２００７）、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，１４１３０－１４１３５（１９９８）を参照されたい）。
【0247】
標的及びライブラリーごとに４回の選択ラウンドを行った。４ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させる（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４年、上記引用）。各選択ラウンドの後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数を、結合剤の濃縮により、収率に合わせて調整して、連続的に減少させた。次いで、得られた３つのプールを、結合剤スクリーニングに供した。
【0248】
選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるように、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する。
溶液中でＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する個々に選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、クローンがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメイン（配列番号１１）に共有結合したフォーマットでｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にクローニングし、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６５μＬの成長培地（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃で、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＬＢ培地に、新しい９６ディープウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、６時間続けた。プレートの遠心分離によって細胞を収集し、上清を廃棄し、ペレットを－２０℃で一晩凍結させた後、１０μＬμＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１０分間）。
溶液中でＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する個々に選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、クローンがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメイン（配列番号１１）に共有結合したフォーマットでｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にクローニングし、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６５μＬの成長培地（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃で、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＬＢ培地に、新しい９６ディープウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、６時間続けた。プレートの遠心分離によって細胞を収集し、上清を廃棄し、ペレットを－２０℃で一晩凍結させた後、１０μＬμＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１０分間）。
【0249】
溶解した各クローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の１：８００希釈物（最終濃度）として、１２．５ｎＭ（最終濃度）のビオチン化ＣＤ３結合ドメイン、１：３００（終濃度）の抗ＦＬＡＧ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴアクセプターコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：３００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）と共に、３８４ウェルプレートのウェルに適用し、４℃で１２０分間インキュベートした。ＨＴＲＦを、３４０ｎｍ励起波長並びにバックグラウンド蛍光検出用の６２０±１０ｎｍ発光フィルタ及び特異的結合についての蛍光シグナルを検出するための６６５±１０ｎｍ発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００において読み出した。
【0250】
同じ溶解物を、１２．５ｎＭ（最終濃度）のビオチン化ＨＳＡ、１：３００（最終濃度）の抗ＦＬＡＧＤ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴアクセプターコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：３００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）と、３８４ウェルプレートのウェルに混合し、４℃で１２０分間インキュベートした。ＨＴＲＦを、３４０ｎｍ励起波長並びにバックグラウンド蛍光検出用の６２０±１０ｎｍ発光フィルタ及び特異的結合についての蛍光シグナルを検出するための６６５±１０ｎｍ発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００において読み出した。
【0251】
各溶解クローンの抽出物を、ビオチン化ＣＤ３結合標的ドメインへの結合の阻害及びビオチン化ＨＳＡへの妨害されない結合について試験して、ＣＤ３結合ドメインへの特異的結合を評価した。
【0252】
標的タンパク質に対して非常に高い親和性を有する結合タンパク質の更なる分析及び選択
合計７４４個の結合タンパク質が最初に同定された。結合プロファイルに基づいて、１７２個の候補を選択して９６ウェルフォーマットで発現させ、ＤＮＡ配列決定と並行して均質になるまで精製した。候補を、サイズ排除クロマトグラフィ、Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ熱安定性評価（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，２２１２－２２２１，（２００７）を参照）、ＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）標的親和性評価、ＥＬＩＳＡ、標的タンパク質競合ＨＴＲＦ実験、及び／又はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって生物物理学的に特徴付けた。
合計７４４個の結合タンパク質が最初に同定された。結合プロファイルに基づいて、１７２個の候補を選択して９６ウェルフォーマットで発現させ、ＤＮＡ配列決定と並行して均質になるまで精製した。候補を、サイズ排除クロマトグラフィ、Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ熱安定性評価（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，２２１２－２２２１，（２００７）を参照）、ＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）標的親和性評価、ＥＬＩＳＡ、標的タンパク質競合ＨＴＲＦ実験、及び／又はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって生物物理学的に特徴付けた。
【0253】
最初に同定された結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対する非常に高い親和性及び／又はそれからの非常に低いオフレートを有する結合剤が、２つの異なるアプローチを用いて生成された。第１のアプローチにおいて、１つの最初に同定された結合タンパク質（「親」結合タンパク質）を、親和性成熟のための好適な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合ＨＴＲＦによってより低いオフレートについてスクリーニングした。それによって同定された有益な変異を、タンパク質操作によって結合タンパク質に組み合わせた。親和性成熟及び操作された結合タンパク質の結合特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検証した。結合剤＃１～＃４（配列番号１～４）は、この方法によって生成され、親結合剤に由来した。
【0254】
第２のアプローチにおいて、標的タンパク質（配列番号１１）に対する４ラウンドのリボソームディスプレイ選択後に得られた選択プールを、追加のオフレート選択のための出発点として使用した。プールからのオフレート選択は、２つの更なるビオチン化標的タンパク質（配列番号１３及び配列番号１４）に対して連続的に行われ、各回とも過剰の非ビオチン化標的タンパク質の存在下で行われた。いくつかの例では、オフレート選択プロセスをエラープローンＰＣＲと組み合わせた。次いで、この手順によって生成された数百の結合タンパク質を、ＳＰＲによってそれらの結合特性について評価した。
【0255】
これらの第２のアプローチに基づいて、ＣＤ３特異的結合標的ドメインに対して高い親和性及び／又は低いオフレートで結合する、結合剤＃５～＃１０（配列番号５～１０）を、更なる分析のために選択した。
総合すると、これら２つの異なるアプローチによって誘導された１０個の結合タンパク質（配列番号１～１０）は、本発明の結合部位を構成する。
総合すると、これら２つの異なるアプローチによって誘導された１０個の結合タンパク質（配列番号１～１０）は、本発明の結合部位を構成する。
【0256】
ＴＣＥ ＣＤ３結合ドメインに対して結合特異性を有するこれらの選択された結合タンパク質を、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号２０）を提供するｐＱＥ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ベースの発現ベクターにクローニングして、以下に説明されるような単純なタンパク質精製を容易にした。以下の結合剤をコードする発現ベクターを構築した：
結合剤＃１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号１）、
結合剤＃２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号２）、
結合剤＃３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号３）、
結合剤＃４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号４）、
結合剤＃５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号５）、
結合剤＃６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号６）、
結合剤＃７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号７）、
結合剤＃８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号８）、
結合剤＃９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号９）、及び
結合剤＃１０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号１０）。
結合剤＃１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号１）、
結合剤＃２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号２）、
結合剤＃３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号３）、
結合剤＃４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号４）、
結合剤＃５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号５）、
結合剤＃６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号６）、
結合剤＃７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号７）、
結合剤＃８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号８）、
結合剤＃９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号９）、及び
結合剤＃１０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号２０）を有する配列番号１０）。
【0257】
分析のために選択された結合タンパク質の高レベル及び可溶性発現。
更なる分析のために、結合剤を大腸菌細胞において発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを使用して精製した。５０ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、１０００ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ500（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理又はフレンチプレス）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理ステップの前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。ＴＣＥ ＣＤ３結合ドメインに対して結合特異性を有する高可溶性アンキリン反復タンパク質は、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥから推定される９５％超の純度で、大腸菌培養物から精製した（培養物１リットル当たり最大２００ｍｇのアンキリン反復タンパク質）。
更なる分析のために、結合剤を大腸菌細胞において発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを使用して精製した。５０ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、１０００ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ500（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理又はフレンチプレス）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理ステップの前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。ＴＣＥ ＣＤ３結合ドメインに対して結合特異性を有する高可溶性アンキリン反復タンパク質は、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥから推定される９５％超の純度で、大腸菌培養物から精製した（培養物１リットル当たり最大２００ｍｇのアンキリン反復タンパク質）。
【0258】
実施例２：ＳＰＲ結合アッセイ
本発明の結合部分の重要な特徴は、薬物分子に対するその親和性である。関連する態様には、薬物分子からの結合部分のオフレート及び得られる遮断半減期が含まれる。薬物分子が結合部分によって可逆的に結合されている複合体からの薬物分子の徐放を達成するためには、高親和性、低オフレート及び大きな遮断半減期が必要である。本発明のプロドラッグ複合体の機能及び特性の更なる例示及び説明については、図１～図３を参照されたい。
本発明の結合部分の重要な特徴は、薬物分子に対するその親和性である。関連する態様には、薬物分子からの結合部分のオフレート及び得られる遮断半減期が含まれる。薬物分子が結合部分によって可逆的に結合されている複合体からの薬物分子の徐放を達成するためには、高親和性、低オフレート及び大きな遮断半減期が必要である。本発明のプロドラッグ複合体の機能及び特性の更なる例示及び説明については、図１～図３を参照されたい。
【0259】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して、ＴＣＥ薬物分子のＣＤ３結合ドメインに対するアンキリン反復結合ドメインの結合親和性及びオフレートを決定した。
【0260】
全てのＳＰＲデータを、ランニングバッファーとしてＰＢＳ－Ｔ（０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置を使用して生成した。新しいニュートラアビジンセンサーチップ（ＮＬＣ）を空気で初期化し、Ｂｉｏ－Ｒａｄマニュアルに従って調整した。
【0261】
結合剤＃１、＃４、＃５、及び結合剤＃９の前駆体（上記の実施例１に列挙されるような）、並びに親和性成熟アプローチ（実施例１を参照されたい）に使用される親結合剤について、チップ上に配列番号１３及び１４をそれぞれ有するビオチン化ＣＤ３特異的結合ドメインに結合して、ＳＰＲデータを生成した。データは、２５℃で、１００ｎＭ（すなわち、シングルトレース）の１つの結合剤濃度を用いて、２時間、オフレートを測定して生成した。標的タンパク質として配列番号１３で得られたＳＰＲトレースを図４に示す。結合剤＃１、＃４、＃５、及び結合剤＃９の前駆体は全て、親結合剤と比較して著しく減少したオフレートを示した。同様の結果が標的タンパク質として配列番号１で得られた。
【0262】
チップ上に配列番号１３及び１４をそれぞれ有するビオチン化ＣＤ３特異的結合ドメインに結合する結合剤＃１～＃９（上記の実施例１に列挙される）について、更なるＳＰＲデータを生成した。３３℃で、いくつかの結合剤濃度（２６．７ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ）（すなわち、マルチトレース）でデータを生成し、２時間、オンレート（ｋon）、オフレート（ｋoff）を測定して平衡解離定数（ＫD）を導出した。次いで、遮断半減期（Ｔ1/2）を計算した。結果を以下の表２に示す。
【0263】
【表2】
【0264】
表２は、２つの異なるＣＤ３結合タンパク質（配列番号１３及び配列番号１４）に対するいくつかの超高親和性結合（分析物）のｋon、ｋoff及びＫD値を提供し、遮断Ｔ1/2は、オフレート（ｋoff）から式Ｔ1/2＝ｌｎ２／ｋoff＝０．６９３／ｋoffを用いて計算している。結合剤のオフレートは全て１×１０-4ｓ-1未満であった。ＫD値は全て１×１０-10Ｍ未満であった。結合剤＃５～＃９（配列番号５～９）についてのＳＰＲ測定は、少なくとも１０％の解離期（ｋoff計算の基礎となる）のシグナル低下の欠如のために、表２に示される値よりも正確な値をもたらさなかった。
【0265】
全ての結合剤は、少なくとも３時間の遮断半減期（Ｔ1/2）を示し、それらのうちのいくつかは、少なくとも１０時間の遮断半減期を示した。したがって、これらの実験は、結合剤＃１～＃９が、ＴＣＥ薬物分子において使用されるＣＤ３特異的結合ドメインに対して非常に高い結合親和性を有することを示した。更に、結合剤＃１～＃９は、これらの標的タンパク質からの非常に低いオフレートを有し、それゆえ非常に大きな遮断半減期を有する。結合剤＃１０は、同等のＳＰＲアッセイで試験した場合、結合剤＃９と同様の特性を示す。
【0266】
実施例３：Ｔ細胞活性化／死滅アッセイ
本実施例では、本発明の３つの結合部分及び親結合剤を、Ｔ細胞エンゲージャー（本明細書ではＴＣＥ＃１と呼ぶ）によるＴ細胞活性化及び活性化Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅を阻害するそれらの能力について試験した。ＴＣＥ＃１は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的結合ドメイン（ＴＡＡ結合ドメイン）に共有結合したＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号１３）を含む。ＴＡＡは、アッセイに使用される腫瘍細胞上で発現される。
本実施例では、本発明の３つの結合部分及び親結合剤を、Ｔ細胞エンゲージャー（本明細書ではＴＣＥ＃１と呼ぶ）によるＴ細胞活性化及び活性化Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅を阻害するそれらの能力について試験した。ＴＣＥ＃１は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的結合ドメイン（ＴＡＡ結合ドメイン）に共有結合したＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号１３）を含む。ＴＡＡは、アッセイに使用される腫瘍細胞上で発現される。
【0267】
実質的に全てのＴＣＥが結合部分によって結合されることを実現するために、最終アッセイ濃度と比較して１００倍高い濃度で、プロドラッグ複合体試料を以下に示すように調製した。
【0268】
プロドラッグ複合体試料の調製及びＴ細胞活性化／死滅アッセイへの添加
１．最終１０ｐＭ ２００×濃縮（２ｎＭ）でＴＣＥ定数を調製する
２．最終開始１０ｎＭ、２００×濃縮（開始２０００ｎＭ、１：３連続希釈：２０００ｎＭ、６６６ｎＭ、２２２ｎＭ、７４ｎＭ、２５ｎＭ、８．２ｎＭ、２．７ｎＭ、０．９１ｎＭ、０．３０ｎＭ）で結合部分滴定を準備する
３．ＴＣＥを結合部分滴定と１：１で混合する（又はＴＣＥのみ若しくは結合部分のみとアッセイ培地を混合）→１００ｘ
４．ｐＨ制御インキュベーター内で、３７℃で少なくとも２４時間平衡化する
５．アッセイ開始直前にＴ細胞活性化／死滅実験に１：１００（２００μｌ容量中２μｌ）に希釈する→１ｘ
６．４８時間インキュベートする
１．最終１０ｐＭ ２００×濃縮（２ｎＭ）でＴＣＥ定数を調製する
２．最終開始１０ｎＭ、２００×濃縮（開始２０００ｎＭ、１：３連続希釈：２０００ｎＭ、６６６ｎＭ、２２２ｎＭ、７４ｎＭ、２５ｎＭ、８．２ｎＭ、２．７ｎＭ、０．９１ｎＭ、０．３０ｎＭ）で結合部分滴定を準備する
３．ＴＣＥを結合部分滴定と１：１で混合する（又はＴＣＥのみ若しくは結合部分のみとアッセイ培地を混合）→１００ｘ
４．ｐＨ制御インキュベーター内で、３７℃で少なくとも２４時間平衡化する
５．アッセイ開始直前にＴ細胞活性化／死滅実験に１：１００（２００μｌ容量中２μｌ）に希釈する→１ｘ
６．４８時間インキュベートする
【0269】
Ｔ細胞活性化アッセイのために、標的腫瘍細胞及びエフェクターＴ細胞（健康な血液ドナーからのＰａｎ－Ｔ細胞）を、５：１のエフェクター対標的細胞比で組み合わせ、プロドラッグ複合体試料を添加し、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。死滅した腫瘍細胞のＬＤＨ放出について上清を分析し、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカー（ＣＤ２５）のレベルをＦＡＣＳ（ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＢＣ９６）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）を使用）によって決定した。図５ａ及び５ｂに示すように、様々な対照を含めた（すなわち、Ｔ細胞のみ、腫瘍細胞のみ、Ｔｒｉｔｏｎ対照、結合部分のみ）。
【0270】
結果を図５ａ及び５ｂに示す。本発明の３つの結合部分（結合剤＃４（配列番号４）、結合剤＃５（配列番号５）、結合剤＃９（配列番号９）は、本発明の結合部分のはるかに高い結合親和性と一致して、親結合剤よりもはるかに低い濃度でＴ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を阻害した。ＩＣ５０値（ｎＭ単位）を図５ａ及び５ｂに示す。
【0271】
実施例４：「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイ
上記の実施例３のものなどの標準的なＴ細胞活性化アッセイは、定義された時点の後に単一の読み出しを提供する。本発明の目的のために、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅の代用物として使用される、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞増殖阻害に関する時間分解図を得るためには、異なる時点での複数の読み出しが望まれる。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｃｕｃｙｔｅ／を参照されたい）は、そのような情報を提供することができる。Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイ原理は、Ｔ細胞（ｈＰＢＭＣのいずれかのＰａｎ－Ｔ細胞）を、細胞を赤色にするＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓで形質導入された腫瘍細胞と共インキュベートしてＩｎｃｕｃｙｔｅカメラで検出できるようにし、赤色物体（すなわち、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｎｕｌｉｇｈｔ（登録商標）、核限定ｍＫａｔｅ２タンパク質（赤色蛍光タンパク質）によって標識される腫瘍細胞）の面積を決定することによって、Ｔ細胞が存在する場合の腫瘍細胞増殖を、時間分解方式でＩｎｃｕｃｙｔｅカメラによってモニターすることができるというものである。
上記の実施例３のものなどの標準的なＴ細胞活性化アッセイは、定義された時点の後に単一の読み出しを提供する。本発明の目的のために、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅の代用物として使用される、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞増殖阻害に関する時間分解図を得るためには、異なる時点での複数の読み出しが望まれる。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｃｕｃｙｔｅ／を参照されたい）は、そのような情報を提供することができる。Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイ原理は、Ｔ細胞（ｈＰＢＭＣのいずれかのＰａｎ－Ｔ細胞）を、細胞を赤色にするＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓで形質導入された腫瘍細胞と共インキュベートしてＩｎｃｕｃｙｔｅカメラで検出できるようにし、赤色物体（すなわち、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｎｕｌｉｇｈｔ（登録商標）、核限定ｍＫａｔｅ２タンパク質（赤色蛍光タンパク質）によって標識される腫瘍細胞）の面積を決定することによって、Ｔ細胞が存在する場合の腫瘍細胞増殖を、時間分解方式でＩｎｃｕｃｙｔｅカメラによってモニターすることができるというものである。
【0272】
最初の実験において、Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ＃１）を、２ｎＭの濃度（アッセイにおいて２０ｐＭの最終濃度）から出発して、２倍連続希釈で１００倍濃縮して調製した。ＴＣＥ＃１を、ＴＡＡを発現するｐａｎ Ｔ細胞及び腫瘍細胞に添加し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）によって検出するためにＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄで標識した。赤色標識腫瘍細胞の増殖が、４．５日間にわたってＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）デバイスにおいて観察された。図６ａは、より高濃度のＴＣＥ＃１において（２０ｐＭから開始）、ＴＣＥ＃１が腫瘍細胞増殖を効率的に阻害したこと、及び濃度を減少させると（２倍ステップで）、腫瘍細胞増殖の阻害が徐々に減少し、０．１６～０．６４ｐＭで推移したことを示す（約０．２７ｐＭのＥＣ50）。したがって、０．１ｐＭ未満では、ＴＣＥは腫瘍細胞増殖に有意な影響を及ぼさなかったが、０．１～１ｐＭでは、ＴＣＥはＴ細胞媒介性腫瘍細胞増殖阻害のダイナミックレンジ内にあり、１ｐＭ超では、ＴＣＥは完全なＴ細胞媒介性腫瘍細胞増殖阻害（Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅の代用として使用）をもたらした。図６ｂは、これらの知見を示し、ＴＣＥ活性のＥＣ５０が約０．２７ｐＭであったことを示す。
【0273】
プロドラッグ複合体の滴定による「単純な」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイ設定
ＴＡＡ発現腫瘍細胞増殖のＴＣＥ媒介性阻害に対する本発明の結合部分の効果を調査するために、更なるＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイを、様々な薬物複合体試料を用いて行った。一定濃度のＴＣＥ（ＴＣＥ＃１）に対する結合部分の滴定を用いて、薬物複合体試料を調製した。実質的に全ての薬物分子が実験（すなわち、Ｔ細胞及び腫瘍細胞へのプロドラッグ複合体の添加）の開始時に結合部分によって複合体化されることを実現するために、混合物を１００×濃縮ストックとして調製した。平衡化された１００×濃縮ストックを細胞に添加することによって１００倍に希釈し、赤色標識腫瘍細胞の増殖の変化を、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅の代わりとして４．５日間にわたって追跡した（図７及び図８を参照されたい）。
ＴＡＡ発現腫瘍細胞増殖のＴＣＥ媒介性阻害に対する本発明の結合部分の効果を調査するために、更なるＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイを、様々な薬物複合体試料を用いて行った。一定濃度のＴＣＥ（ＴＣＥ＃１）に対する結合部分の滴定を用いて、薬物複合体試料を調製した。実質的に全ての薬物分子が実験（すなわち、Ｔ細胞及び腫瘍細胞へのプロドラッグ複合体の添加）の開始時に結合部分によって複合体化されることを実現するために、混合物を１００×濃縮ストックとして調製した。平衡化された１００×濃縮ストックを細胞に添加することによって１００倍に希釈し、赤色標識腫瘍細胞の増殖の変化を、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅の代わりとして４．５日間にわたって追跡した（図７及び図８を参照されたい）。
【0274】
プロドラッグ複合体試料の調製及びＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）実験への添加：
１．最終１０ｐＭ ２００×濃縮（２ｎＭ）で一定したＴＣＥを調製する
２．１０ｎＭ、２００×濃縮（開始２μＭ）の最終開始濃度で結合部分滴定を準備する
３．ＴＣＥを結合部分滴定と１：１で混合する（又はＴＣＥのみ若しくは結合部分のみとアッセイ培地を混合）→１００×濃縮ストック試料
４．ｐＨ制御インキュベーター内で、３７℃で少なくとも２４時間平衡化する
５．アッセイ開始直前に実験（ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄで標識されたＴ細胞＋腫瘍細胞）に１：１００で希釈する（２００μｌ容量中２μｌ）
６．Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）中で最大５日間、腫瘍細胞増殖を決定する
１．最終１０ｐＭ ２００×濃縮（２ｎＭ）で一定したＴＣＥを調製する
２．１０ｎＭ、２００×濃縮（開始２μＭ）の最終開始濃度で結合部分滴定を準備する
３．ＴＣＥを結合部分滴定と１：１で混合する（又はＴＣＥのみ若しくは結合部分のみとアッセイ培地を混合）→１００×濃縮ストック試料
４．ｐＨ制御インキュベーター内で、３７℃で少なくとも２４時間平衡化する
５．アッセイ開始直前に実験（ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄで標識されたＴ細胞＋腫瘍細胞）に１：１００で希釈する（２００μｌ容量中２μｌ）
６．Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）中で最大５日間、腫瘍細胞増殖を決定する
【0275】
第１の実験では、親結合剤（ＫＤ約２００ｐＭ）と配列番号５（ＫD約６ｐＭ以下）（結合剤＃５）を有する超高親和性結合部分とを区別する単純なＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイの能力を調査した。図７ａ～７ｄは、親結合剤が、試料中の薬物分子に対して３３０～１１０倍モル過剰の親結合剤の遮断の喪失を示したのに対して、超高親和性結合部分（結合剤＃５）は、プロドラッグ複合体試料中の薬物分子に対してはるかに低い４倍モル過剰の結合部分であっても、薬物分子の活性を完全に遮断したことを明確に示す。
【0276】
第２の実験では、異なる超高親和性結合部分を類似の設定で調査した（図８ａ～８ｃ）。薬物複合体試料中の薬物分子（ＴＣＥ＃１）に対する結合部分のモル過剰を減少させると、薬物分子の抗腫瘍活性の阻害の喪失が観察された。この阻害の喪失は、薬物分子に対する結合部分の結合親和性との相関性を示した。結合剤＃４は、４倍モル過剰で既にＴＣＥ活性の阻害の喪失を示し、腫瘍細胞増殖の阻害の増加につながったが、他の２つの結合部分、結合剤＃５及び結合剤＃９は、４倍モル過剰でＴＣＥ活性を依然として効果的に阻害し、Ｔ細胞媒介性阻害の全くない正常な増殖曲線をもたらした。モル比が１：１に減少した場合にのみ、結合剤＃５及び結合剤＃９は、ＴＣＥ活性の阻害の喪失を示し、腫瘍細胞増殖のＴ細胞媒介性阻害の増加につながった。１：１のモル比であっても、結合剤＃９は、ＴＣＥ活性をある程度まで阻害することができ、腫瘍細胞増殖の弱い阻害をもたらした。
【0277】
これらのデータにより、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイが、超高親和性結合部分によるＴＣＥ遮断を調査するための高感度の方法であること、及び結合部分が、実施例２においてＳＰＲによって示される超高親和性から予想されるような遮断活性を示すことが確認されている。
全体として、これらの実験により、本発明の結合部分が、薬物分子としてＴＣＥ＃１及び結合部分として実施例１に記載される結合剤を用いて例示的な様式で本明細書において実証されるように、薬物分子に対する結合部分の結合親和性に応じて、薬物分子の生物学的活性を効果的に阻害し得ることが示された。
全体として、これらの実験により、本発明の結合部分が、薬物分子としてＴＣＥ＃１及び結合部分として実施例１に記載される結合剤を用いて例示的な様式で本明細書において実証されるように、薬物分子に対する結合部分の結合親和性に応じて、薬物分子の生物学的活性を効果的に阻害し得ることが示された。
【0278】
実施例５：「複合」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）アッセイ
インビボ状況において、結合部分は、その短い半減期のために薬物分子から解離するとすぐに迅速に排除される。対照的に、薬物分子は、それが長い半減期を有するように設計されている場合、複合体化されているかどうかは無関係に、はるかに長い時間体内を循環することができる。長い半減期を有する薬物分子を生成するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、半減期延長部分への融合を伴う。結合剤の迅速な腎排出を模倣するために、「複合」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）設定は、追加のいわゆる「シンク」チャンバを備える。このシンクチャンバにおいて、試験された結合部分の大過剰のビーズ固定化標的タンパク質を添加する（主チャンバに添加したプロドラッグ複合体に含まれる結合部分の量に対して１０，０００倍超モル過剰）。この固定化標的タンパク質は、遊離結合部分がプロドラッグ複合体から解離し、シンクチャンバ内に拡散するとすぐに遊離結合部分を捕捉する。
インビボ状況において、結合部分は、その短い半減期のために薬物分子から解離するとすぐに迅速に排除される。対照的に、薬物分子は、それが長い半減期を有するように設計されている場合、複合体化されているかどうかは無関係に、はるかに長い時間体内を循環することができる。長い半減期を有する薬物分子を生成するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、半減期延長部分への融合を伴う。結合剤の迅速な腎排出を模倣するために、「複合」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）設定は、追加のいわゆる「シンク」チャンバを備える。このシンクチャンバにおいて、試験された結合部分の大過剰のビーズ固定化標的タンパク質を添加する（主チャンバに添加したプロドラッグ複合体に含まれる結合部分の量に対して１０，０００倍超モル過剰）。この固定化標的タンパク質は、遊離結合部分がプロドラッグ複合体から解離し、シンクチャンバ内に拡散するとすぐに遊離結合部分を捕捉する。
【0279】
本明細書に記載の実験では、ＴＣＥ（ＴＣＥ＃１）を薬物分子として使用した。したがって、シンクチャンバ内に添加した固定化スカベンジャータンパク質は、試験された結合部分によって高い親和性で結合しているＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号１１）であった。
【0280】
実験設定
実施例４と同様に、ＴＡＡを発現する腫瘍細胞株を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）カメラによる検出のためにＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓで形質導入された標的細胞株として使用した。Ｐａｎ Ｔ細胞を、異なるプロドラッグ複合体と共に添加した。プロドラッグ複合体を、１０ｐＭのＴＣＥ＃１（最終濃度）を、１２３ｐＭ（１２．３倍モル過剰）、４１ｐＭ（４．１倍モル過剰）及び１３．７ｐＭ（１．３７倍モル過剰）の異なる量の結合剤＃９と予め平衡化することによって生成した。次いで、これらのプロドラッグ複合体の各々を、陰性対照として遊離結合部分を隔離しないコーティングされていないビーズ（図９ａ）、又はＣＤ３特異的結合ドメインコーティングされたビーズ（したがって、機能的シンクを有する（図９ｂ））のいずれかと共に、「複合」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）設定で使用した。追加的に、未結合ＴＣＥ＃１（１０ｐＭ）並びにバックグラウンド（すなわち、プロドラッグ複合体もＴＣＥもないが、ビーズを含む）を対照とした。腫瘍細胞増殖を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）カメラによって検出された赤色物体の面積を決定することによって、５日間測定した。
実施例４と同様に、ＴＡＡを発現する腫瘍細胞株を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）カメラによる検出のためにＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓで形質導入された標的細胞株として使用した。Ｐａｎ Ｔ細胞を、異なるプロドラッグ複合体と共に添加した。プロドラッグ複合体を、１０ｐＭのＴＣＥ＃１（最終濃度）を、１２３ｐＭ（１２．３倍モル過剰）、４１ｐＭ（４．１倍モル過剰）及び１３．７ｐＭ（１．３７倍モル過剰）の異なる量の結合剤＃９と予め平衡化することによって生成した。次いで、これらのプロドラッグ複合体の各々を、陰性対照として遊離結合部分を隔離しないコーティングされていないビーズ（図９ａ）、又はＣＤ３特異的結合ドメインコーティングされたビーズ（したがって、機能的シンクを有する（図９ｂ））のいずれかと共に、「複合」Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）設定で使用した。追加的に、未結合ＴＣＥ＃１（１０ｐＭ）並びにバックグラウンド（すなわち、プロドラッグ複合体もＴＣＥもないが、ビーズを含む）を対照とした。腫瘍細胞増殖を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）カメラによって検出された赤色物体の面積を決定することによって、５日間測定した。
【0281】
図９ａは、コーティングされていないビーズを収容するシンクチャンバを有するウェルにおいて、試験された結合部分がＴＣＥ活性を完全に阻害し、それにより、最も低い結合剤：ＴＣＥ比（１．３７：１）で生成されたプロドラッグ複合体を除いて、腫瘍細胞増殖のＴ細胞媒介性阻害が観察されなかったことを示す。これは、実施例４に示した結果と一致する。対照的に、ＣＤ３特異的結合ドメインでコーティングされたビーズを収容する機能的シンクチャンバを有するウェル（図９ｂ）において、試験された結合部分はＴＣＥ活性を部分的にしか阻害せず、それにより、最も高い結合剤：ＴＣＥ比（１２．３：１）であっても、腫瘍細胞増殖のＴ細胞媒介性阻害が観察された。未結合ＴＣＥを用いた対照とは対照的に、プロドラッグ複合体を有するウェルにおける腫瘍細胞増殖のＴ細胞媒介性阻害（Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅の代わりとして）は、実験開始後わずか約１．５～２日で、大幅な遅延を伴って開始した。未結合ＴＣＥを有するウェルにおける腫瘍細胞増殖の阻害は、実験開始後約１日で既に開始していた。腫瘍細胞増殖の遅延阻害に反映されるＴＣＥ薬物分子の遅延活性により、結合部分が、薬物分子と複合体化してプロドラッグ複合体を形成する場合、薬物分子の生物学的活性を遅延させ得ることが実証された。これらのデータから、本発明の結合部分が薬物分子とプロドラッグ複合体を形成することができ、未結合薬物分子の投与と比較して、患者へのプロドラッグ複合体の投与時、薬物分子の放出が遅くなり、それにより薬物分子の活性が下方調節されるという考えが裏付けられる。
【0282】
実施例６：結合剤との複合体化によるＴＣＥ薬物分子のＣＤ３エフェクター部分の一過性遮断は、エクスビボでのヒト全血アッセイにおけるサイトカイン放出を減少させる。
ＴＣＥ薬物分子（本実施例では、ＴＣＥ＃１（配列番号５４）、α－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャー）のサイトカイン放出プロファイルに対する結合剤の効果を調査するために、エクスビボでのヒト全血アッセイを、Ｉｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで実施した。
ＴＣＥ薬物分子（本実施例では、ＴＣＥ＃１（配列番号５４）、α－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャー）のサイトカイン放出プロファイルに対する結合剤の効果を調査するために、エクスビボでのヒト全血アッセイを、Ｉｍｍｕｎｅｅｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎで実施した。
【0283】
適用された全血ループシステムは、血液と薬物試料との間の相互作用（サイトカイン放出に対する効果を含む）を試験するために使用され得る。血流ループシステムは、血中の免疫細胞、免疫グロブリン、並びにインタクトな補体及び凝固カスケード系の両方を独自に含む（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１８．５４：ｐ．１－１１．）。サイトカイン放出は、ＣＤ１２３＋及びＣＤ３３＋標的細胞を含有する１人の健康なヒトドナーからの新鮮なヒト全血に試験物質を添加し、その後、試料を回転ホイール上でインキュベートして血液凝固を回避し、血液循環を模倣することによって決定した。
【0284】
対照として、ビヒクル又は１ｎＭの抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３産業対照試験物質をヒト全血に添加した。ＴＣＥ＃１分子を１ｎＭの濃度で添加し、１ｎＭのＴＣＥ＃１＋１．２ｎＭの結合剤＃５と比較した。複合体化ＴＣＥを１．２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、実験開始時にＴＣＥの１００％複合体化率を保証した。試験物質を図１０Ａ及び１０Ｂに示す。
【0285】
ヒトＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６についてのサイトカイン放出を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術によって、０時間、２時間、４時間、８時間、２４時間の時点で決定した。
【0286】
図１０ Ｃ～Ｆに示すように、測定した２４時間中、α－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３産業対照に応答して、かつより少ない程度で未結合ＴＣＥ＃１に応答して、ビヒクルを超える全てのサイトカインのレベルの増加が観察された。しかしながら、結合剤＃５と複合体化したＴＣＥ＃１からなる複合体化ＴＣＥは、全ての時点で、未結合ＴＣＥ＃１と比較して、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６についてのサイトカイン放出を大きく減少させた。
【0287】
結論として、結合剤（結合剤＃５など）と複合体化したＴＣＥ（ＴＣＥ＃１など）を含むＴＣＥプロドラッグ複合体は、エクスビボでのヒト全血アッセイにおいてサイトカイン放出を効果的に抑制することが示された。
【0288】
実施例７：ＴＣＥプロドラッグ複合体は、インビボ有効性試験において最適な抗腫瘍活性を維持する。
インビボ有効性試験の目的は、未結合ＴＣＥ薬物分子の抗腫瘍活性（本実施例では、ＴＣＥ＃２（配列番号５５）、半減期延長部分（α－ＨＳＡ）を含むα－ＨＳＡ×α－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャー）及び複合体化ＴＣＥ薬物分子（ＴＣＥプロドラッグ複合体）（本実施例では、２桁のｐＭ（結合剤＃４）又は更に１ｐＭ以下の範囲（結合剤＃１０）のいずれかの親和性を有する２つの異なる結合剤のうちの１つと複合体化したＴＣＥ＃２）を比較することであった。ＮＯＧマウスを、２人のヒトドナー（ｎ＝５ドナーＡ及びｎ＝５ドナーＢ）由来のＰＢＭＣを用いて０日目にヒト化した。１×１０6Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で無作為化後６日目に開始した。品質管理には、単離１日後のＰＢＭＣ亜集団及びＦＣによる生存率の分析、並びに１９日目のＦＣによるマウス血液のヒト化の成功が含まれた。注射の１日前に、Ｍｏｌｍ－１３細胞を生存率及びＣＤ３３陽性について試験した。
インビボ有効性試験の目的は、未結合ＴＣＥ薬物分子の抗腫瘍活性（本実施例では、ＴＣＥ＃２（配列番号５５）、半減期延長部分（α－ＨＳＡ）を含むα－ＨＳＡ×α－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャー）及び複合体化ＴＣＥ薬物分子（ＴＣＥプロドラッグ複合体）（本実施例では、２桁のｐＭ（結合剤＃４）又は更に１ｐＭ以下の範囲（結合剤＃１０）のいずれかの親和性を有する２つの異なる結合剤のうちの１つと複合体化したＴＣＥ＃２）を比較することであった。ＮＯＧマウスを、２人のヒトドナー（ｎ＝５ドナーＡ及びｎ＝５ドナーＢ）由来のＰＢＭＣを用いて０日目にヒト化した。１×１０6Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、治療を腫瘍サイズ約７０ｍｍ3で無作為化後６日目に開始した。品質管理には、単離１日後のＰＢＭＣ亜集団及びＦＣによる生存率の分析、並びに１９日目のＦＣによるマウス血液のヒト化の成功が含まれた。注射の１日前に、Ｍｏｌｍ－１３細胞を生存率及びＣＤ３３陽性について試験した。
【0289】
インビボ有効性試験のための試験物質を図１１Ａ及び１１Ｂに示す。試験デザイン及び治療群を図１１Ｃに概説する。ＴＣＥ＃２は２００μｇ／ｋｇ又は１０００μｇ／ｋｇのいずれかの用量で投与され、結合剤＃４（ＫD約２０ｐＭ）又は結合剤＃１０（ＫD≦１ｐＭ）と複合体化した１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２と比較した。複合体を、２倍モル過剰の結合剤を使用して予め平衡化して、治療開始時に１００％の複合体化率を保証した。治療は、ビヒクルを含む全ての治療群について、２００μｇ／ｋｇで毎日治療を行った抗ＣＤ３３×抗ＣＤ３産業対照（第２群）を除いて、６日目から１６日目まで週３回静脈内投与した。これらの比較的小さな腫瘍での治療開始時のサイトカインレベルを決定するために、初回治療投与の前及び初回治療投与４時間後に血液試料を採取した。腫瘍増殖をモニターし、キャリパーを用いて週に３回、幅及び長さを測定し、その腫瘍体積を、長さ×幅×高さ×π／６の式を用いて計算した。
【0290】
ドナーＡ又はＢのいずれかのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝１０マウスについて平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線を図１１Ｄに示す。第２群（α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照）については、ドナーＢからのＰＢＭＣでヒト化された２匹の動物を、ヒト化が成功しなかったために分析から除外した。
【0291】
ドナーＡ及びＢの組み合わせでは、２００μｇ／ｋｇで毎日投与された非半減期延長抗ＣＤ３３×抗ＣＤ３産業対照群で強い腫瘍増殖阻害が観察され、１０００μｇ／ｋｇで週３回投与された半減期延長ＴＣＥ＃２で腫瘍消失が観察された。２００μｇ／ｋｇでＴＣＥ＃２を週３回投与された場合、並びに１０００μｇ／ｋｇでＴＣＥ＃２＋２倍モル過剰の結合剤＃４を含むＴＣＥプロドラッグ複合体を週３回投与された場合、あまり顕著でない腫瘍増殖阻害が観察された。同様の腫瘍増殖阻害は、１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ＃２＋２倍モル過剰の結合剤＃１０を含むＴＣＥプロドラッグ複合体について、これらの実験条件下で観察されなかった。
【0292】
インシリコモデリングでは、２００μｇ／ｋｇの遊離ＴＣＥと、結合剤＃４で一過的に遮断されたＴＣＥ＃２からなる１０００μｇ／ｋｇのＴＣＥ－結合剤複合体との間で同様のＡＵＣが予測される（ＫD約２０ｐＭ）。対照的に、ＴＣＥ＃２のＰＫと結合剤＃１０の非常に高い親和性（ＫD≦１ｐＭ）との組み合わせは、結合剤が活性ＴＣＥ＃２を放出することができる前に、より大きな割合のＴＣＥ＃２＋結合剤＃１０複合体が循環から排除され得るので、活性ＴＣＥのより低い曝露をもたらすことが予想される。したがって、完全な抗腫瘍効果を維持しながらサイトカイン放出を最適に減少させるという点での「スイートスポット」は、結合剤親和性とＴＣＥの血清半減期との相互作用である。提示された徐放性ＴＣＥプロドラッグツールボックスは、適切な結合剤をＴＣＥに適合させることを可能にする。
【0293】
図１１Ｅは、ドナーＡのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線を示し、図１１Ｆは、ヒト化が成功しなかったために２匹の動物が除外された第２群を除いて、ドナーＢのＰＢＭＣでヒト化されたｎ＝５マウスについての平均±ＳＥＭとしてプロットされた６つ全ての治療群についての腫瘍増殖曲線を示す。顕著なドナー間変動がこの実験で観察され、ドナーＡ由来のＰＢＭＣは、ドナーＢ由来のＰＢＭＣよりもＭｏｌｍ－１３細胞の増殖に対してより強い阻害作用を示した。図１１Ｇは、図１１Ｄ～図１１Ｆの凡例を示す。
【0294】
図１２は、腫瘍がまだ比較的小さい場合に、インビボ有効性試験の初回治療投与の前及び４時間後に採取された血液試料の血清中で決定されたサイトカインレベルを示す。ヒトサイトカインレベルは、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、無希釈血清試料で決定した。
【0295】
０時間から４時間までのサイトカインの顕著な増加は、α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３産業対照について測定された全てのサイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６）について観察することができ、投与された両方の用量でＴＣＥ＃２についてより少ない程度で観察することができる。しかしながら、サイトカインのこの増加は、ＴＣＥ＃２＋結合剤＃４又は結合剤＃１０を含むＴＣＥプロドラッグ複合体で防止され、ＴＣＥ薬物分子と高親和性結合剤との複合体化が活性ＴＣＥの徐放をもたらし、ひいては曝露プロファイルの変化をもたらすという知見を裏付けている。
【0296】
要約すると、徐放性ＴＣＥプロドラッグ複合体（結合剤＃４と複合体化したＴＣＥ＃２を含む（ＣＤ３エフェクター部分に対するＫD約２０ｐＭ））は、低用量で未結合ＴＣＥと同等の抗腫瘍効力を示し、初回治療投与の４時間後にＴＣＥ＃２の軽度サイトカインレベルを減少させた。
【0297】
実施例８：徐放性ＴＣＥプロドラッグ複合体は、インビボ安全性試験においてサイトカイン放出を減少させる。
２つの独立したインビボ安全性試験の目的は、未結合のＴＣＥ薬物分子（本実施例では、ＴＣＥ＃２、α－ＨＳＡ×α－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャー）及び徐放性ＴＣＥプロドラッグ複合体（本実施例では、２桁のｐＭ（結合剤＃１及び結合剤＃４、試験１）又は更に≦１ｐＭの範囲（結合剤＃１０、試験２）の親和性を有する３つの異なる結合剤のうちの１つと複合体化したＴＣＥ＃２）によって引き起こされるサイトカイン放出の程度を比較することであった。
２つの独立したインビボ安全性試験の目的は、未結合のＴＣＥ薬物分子（本実施例では、ＴＣＥ＃２、α－ＨＳＡ×α－ＣＤ１２３×α－ＣＤ３３×α－ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャー）及び徐放性ＴＣＥプロドラッグ複合体（本実施例では、２桁のｐＭ（結合剤＃１及び結合剤＃４、試験１）又は更に≦１ｐＭの範囲（結合剤＃１０、試験２）の親和性を有する３つの異なる結合剤のうちの１つと複合体化したＴＣＥ＃２）によって引き起こされるサイトカイン放出の程度を比較することであった。
【0298】
インビボ安全性試験のための試験物質を図１３Ａ及び１３Ｂに示す。試験デザイン及び治療群を図１３Ｃに概説する。インビボ安全性試験をインビボ有効性試験から切り離した理由は、ＴＣＥの初回投与時に十分な量の標的細胞を有し、それにより測定可能なサイトカイン応答が誘発されるためには、中程度のサイズの腫瘍が必要であるからである。
【0299】
ＮＯＧマウスを、２人のヒトドナー（ｎ＝５ドナーＡ及びｎ＝５ドナーＢ）由来のＰＢＭＣを用いて０日目にヒト化した。１×１０6Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞を２日目に皮下注射し、単回用量（感作誘発）を腫瘍サイズ約３００～８００ｍｍ3で１４日目に静脈内投与した。品質管理には、単離１日後のＰＢＭＣ亜集団及びＦＣによる生存率の分析、並びに１５日目（試験１）又は１９日目（試験２）のＦＣによるマウス血液のヒト化の成功が含まれた。１０００μｇ／ｋｇで投与された半減期延長未結合ＴＣＥ＃２を、ＴＣＥプロドラッグ複合体（結合剤＃１、結合剤＃４又は結合剤＃１０と複合体化したＴＣＥ＃２）と比較した。複合体を２倍モル過剰の結合剤で予め平衡化して、治療開始時に１００％の複合体化率を保証した。投与前、初回治療投与の２時間後、４時間後、８時間後及び２４時間後に血液試料を採取して、中程度のサイズの腫瘍でのサイトカインレベルを決定した。図１３Ｄは、単回用量治療の前又は後の指示された時点で採取された血液試料からの血清中のヒトサイトカインレベル（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－６）を示す。サイトカインレベルは、ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、無希釈血清試料で決定した。
【0300】
全てのサイトカインは、未結合ＴＣＥ＃２の単回投与後に上昇するが、試験した３つの異なるＴＣＥプロドラッグ複合体について、サイトカイン放出の減少を観察することができる。サイトカイン放出の減少は、実際に結合剤親和性と相関し、結合剤親和性が上段（ＫD約４０ｐＭを有する結合剤＃１）から中段（ＫD約２０ｐＭを有する結合剤＃４）、下段（ＫD≦１ｐＭを有する結合剤＃１０）まで増加するにつれてより顕著になる。結合剤＃１０はサイトカイン放出をほぼ完全に阻害した。
【0301】
結論として、徐放性ＴＣＥプロドラッグ複合体は、未結合ＴＣＥと比較して、インビボでのサイトカイン放出を減少させることができた。更に、ＴＣＥ中のＣＤ３エフェクター部分に対する結合剤親和性は、サイトカイン放出の減少と相関していた。
【0302】
本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【0303】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【0304】
【表3-1】
【0305】
【表3-2】
【0306】
【表3-3】
【0307】
【表3-4】
【0308】
【表3-5】
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
【図10f】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図11f】
【図11g】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図12d】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図13d】
【配列表】
【国際調査報告】