特表2023-554402カチオン性乳清タンパク質の単離物を調製するための新しい方法およびこうして得られた製品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】カチオン性乳清タンパク質の単離物を調製するための新しい方法およびこうして得られた製品
(51)【国際特許分類】
A23J 1/20 20060101AFI20231220BHJP
A23C 1/00 20060101ALI20231220BHJP
A23C 9/146 20060101ALI20231220BHJP
A23C 9/148 20060101ALI20231220BHJP
A23C 9/00 20060101ALI20231220BHJP
A23C 21/00 20060101ALI20231220BHJP
A23L 33/19 20160101ALI20231220BHJP
A61K 31/714 20060101ALI20231220BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
A23J1/20
A23C1/00
A23C9/146
A23C9/148
A23C9/00
A23C21/00
A23L33/19
A61K31/714
A61P3/02 104
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536438
(86)(22)【出願日】2021-12-22
(85)【翻訳文提出日】2023-06-15
(86)【国際出願番号】 EP2021087268
(87)【国際公開番号】W WO2022136536
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】2013945
(32)【優先日】2020-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518422987
【氏名又は名称】サヴァンシア ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】御子神 隆
(72)【発明者】
【氏名】レシュヴァン、カリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ブルトゥロー、ミッシェル
【テーマコード（参考）】
4B001
4B018
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B001AC06
4B001AC15
4B001AC46
4B001AC99
4B001BC07
4B001BC08
4B001BC99
4B001EC05
4B018LB07
4B018LB10
4B018LE02
4B018LE03
4B018MD01
4B018MD18
4B018MD19
4B018MD20
4B018MD23
4B018MD27
4B018MD71
4B018ME14
4B018MF02
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4B018MF14
4C086AA01
4C086DA39
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA43
4C086NA11
4C086ZC24
(57)【要約】
本発明は、高純度ラクトフェリンのカチオン性乳清タンパク質の単離物を調製するための新しい方法に関するものである。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程ａ）～ｆ）を含む、カチオン性乳清タンパク質の単離物の調製方法：ａ）出発原料が哺乳類脱脂乳または哺乳類乳の乳清であり、出発原料が哺乳類脱脂乳で調製される場合、タンパク質材料ＰＭの濃度が４０～７２ｇ／Ｌであり、出発原料が乳清で調製される場合、タンパク質材料の濃度が２０～１００ｇ／Ｌであるように、膜技術によって予め濃縮されていること；
ｂ）以下の工程を含む、カチオン性タンパク質を選択的に抽出すること：
ｉ． 出発原料を、スルホプロピルＳＰタイプの強陽イオン交換樹脂を含む、好ましくは直径が１００μｍを超える、ラジアルフロークロマトグラフィーカラムに通すこと：
－ 未濃縮に相当する出発原料の容積は、樹脂ＢＶの容積の４０倍から５００倍である；
－ 出発原料通過の直線速度が１．０～４．０ｍ／ｈである；
ｉｉ． 脱塩水であるすぐこと：
－ 脱塩水の量は、２～６ＢＶ；
－ 脱塩水の通過速度が３．０～５．０ｍ／ｈである；
ｉｉｉ． 結合したカチオン性タンパク質を、電気伝導度が３０～５０ｍＳ／ｃｍの生理食塩水で溶出すること：
－ 生理食塩水の容積は、４～８ＢＶである；
－ 生理食塩水の通過速度が０．３～２．０ｍ／ｈである；
ｉｖ． 結合したカチオン性タンパク質を、電気伝導度８０～１４０ｍＳ／ｃｍの生理食塩水で溶出すること：
－ 生理食塩水の量は、３～６ＢＶ；
－ 生理食塩水の通過速度は、０．５～２．５ｍ／ｈである；
ｃ）生理食塩水から溶出した高純度ラクトフェリンを持つカチオン性タンパク質を、カットオフ閾値１０～２０ｋＤａの限外濾過膜を用いて濃縮すること；
ｄ）カットオフ閾値が１０～２０ｋＤａの限外濾過膜を用いた脱塩水による二重濾過により、高純度ラクトフェリンでカチオン性タンパク質を脱塩し、灰／タンパク質比を０．００１～０．０３とすること；
ｅ）特定のカチオン性タンパク質の濃縮溶液の０．２～１．４μｍのカットオフ閾値を持つ膜で精密濾過し、微生物負荷を軽減すること；
ｆ）場合により、あらかじめ精密濾過した特定のカチオン性タンパク質の濃縮溶液を噴霧乾燥または凍結乾燥し、粉末状のラクトフェリン単離物を得ることができる。
【請求項2】
乾燥物に対するタンパク質の割合が９０重量％以上であり、かつ全タンパク質に対するラクトフェリンの割合が９０重量％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法により得られるカチオン性乳清タンパク質の単離物。
【請求項3】
全タンパク質に対するラクトフェリンの割合が９５重量％以上であり、トランスコバラミンとの複合体形態のコバラミンをタンパク質に対して５μｇ／ｇ以下の濃度で含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法により得られた牛乳または山羊乳からのカチオン性乳清タンパク質の単離物。
【請求項4】
全タンパク質に対するラクトフェリンの割合が９０重量％以上であり、トランスコバラミンとの複合体形態のコバラミンをタンパク質に対して５μｇ／ｇ以上の濃度で含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法により得られる牛乳又は山羊乳からのカチオン性乳清タンパク質の単離物。
【請求項5】
胃切除術を受けた患者またはプロトンポンプ阻害剤ＰＰＩで慢性的に治療されている患者におけるビタミンＢ１２欠乏吸収の予防および／または治療におけるその使用のための、請求項４に記載のカチオン性乳清タンパク質の単離物。
【請求項6】
請求項２～４のいずれかに記載の単離物を含む、ヒトまたは動物が摂取するための食品。
【請求項7】
請求項２～４のいずれかに記載の単離物を含む、非食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高純度ラクトフェリンのカチオン性乳清タンパク質の単離物を調製するための新しい方法に関するものである。
【発明の概要】
【0002】
本出願人は、ラクトフェリンタンパク質の純度が９０％以上である乳清タンパク質の単離物を得る方法を開発した；この方法は、ラクトフェリン単離物中のビタミンＢ１２（コバラミン）含有量を制御することができる。
【0003】
この方法は、一方では、膜技術（逆浸透、ナノ濾過、限外濾過など）により以前に濃縮した乳原料（濃縮脱脂乳または濃縮乳清など）を使用し、他方では、放射状クロマトグラフィーカラムに充填したスルホプロピール（ＳＰ）タイプの強陽イオン交換樹脂を使用して選択的に抽出することを特徴としている。溶出したラクトフェリン純粋画分を限外濾過により濃縮・脱塩し、ラクトフェリン純度が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上のカチオン性乳清タンパク質の単離液を得る。得られたこの液体単離物は、精密濾過によって脱バクテリアまたは滅菌され、場合により噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥され、粉末単離物を取得する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
高純度ラクトフェリンのカチオン性乳清タンパク質の単離物の調製方法は、以下の工程ａ）～ｆ）を含む：
ａ）出発原料は、膜技術によって予め脱脂濃縮された哺乳類乳であることができ；また、膜技術によって予め脱脂濃縮された哺乳類乳と脱脂（未濃縮）乳との混合物であることができ；哺乳類乳は例えば牛乳または山羊乳；出発原料はまた哺乳類乳から予め濃縮されている乳清であることができる；
ｉ． 出発原料が牛乳やヤギ乳などの哺乳類の乳で調製される場合、それを脱脂し、場合により、例えば６０～７８℃の短時間の熱処理（同等レベルの最小熱処理７２℃、１５秒；脱脂は低温処理の前または後のいずれかで実行できる）により低温殺菌し、または０．８～１．４μｍの空隙率の多孔質膜を用いた精密濾過により脱菌し、逆浸透（ＲＯ）またはナノフィルトレーション（ＮＦ）または限外濾過（ＵＦ）により濃縮でき；本方法の実施には、脱脂乳（未濃縮）と上記の膜技術により以前に濃縮した脱脂乳の混合物を用いることも可能である；工程ｂ）で処理される製品は、好ましくは、４０～７２ｇ／Ｌ、好ましくは４３～５７ｇ／Ｌの間のタンパク質材料（ＰＭ）の濃度を有する；ＲＯ膜が使用される場合、低温殺菌脱脂乳の乾燥材料（ＤＭ）濃度は１１０～２００ｇ／Ｌ、好ましくは１２０～１６０ｇ／Ｌの間とする；
ｉｉ． 出発原料が乳清で調製される場合、それは、酸性化またはレンネット作用によるカゼインの分離後、精密濾過（その膜は約０．１μｍの空隙率を有する）により濃縮することができ；逆浸透（ＲＯ）またはナノ濾過（ＮＦ）または限外濾過（ＵＦ）により濃縮でき；本方法の実施のために、乳清（濃縮されていない）と上記のような膜技術により以前に濃縮した乳清との混合物を用いることもできる；工程ｂ）において処理すべき生成物は、好ましくは２０～１００ｇ／Ｌ、好ましくは３０～８０ｇ／Ｌ間のタンパク質濃度を有する；
ａ）出発原料は、膜技術によって予め脱脂濃縮された哺乳類乳であることができ；また、膜技術によって予め脱脂濃縮された哺乳類乳と脱脂（未濃縮）乳との混合物であることができ；哺乳類乳は例えば牛乳または山羊乳；出発原料はまた哺乳類乳から予め濃縮されている乳清であることができる；
ｉ． 出発原料が牛乳やヤギ乳などの哺乳類の乳で調製される場合、それを脱脂し、場合により、例えば６０～７８℃の短時間の熱処理（同等レベルの最小熱処理７２℃、１５秒；脱脂は低温処理の前または後のいずれかで実行できる）により低温殺菌し、または０．８～１．４μｍの空隙率の多孔質膜を用いた精密濾過により脱菌し、逆浸透（ＲＯ）またはナノフィルトレーション（ＮＦ）または限外濾過（ＵＦ）により濃縮でき；本方法の実施には、脱脂乳（未濃縮）と上記の膜技術により以前に濃縮した脱脂乳の混合物を用いることも可能である；工程ｂ）で処理される製品は、好ましくは、４０～７２ｇ／Ｌ、好ましくは４３～５７ｇ／Ｌの間のタンパク質材料（ＰＭ）の濃度を有する；ＲＯ膜が使用される場合、低温殺菌脱脂乳の乾燥材料（ＤＭ）濃度は１１０～２００ｇ／Ｌ、好ましくは１２０～１６０ｇ／Ｌの間とする；
ｉｉ． 出発原料が乳清で調製される場合、それは、酸性化またはレンネット作用によるカゼインの分離後、精密濾過（その膜は約０．１μｍの空隙率を有する）により濃縮することができ；逆浸透（ＲＯ）またはナノ濾過（ＮＦ）または限外濾過（ＵＦ）により濃縮でき；本方法の実施のために、乳清（濃縮されていない）と上記のような膜技術により以前に濃縮した乳清との混合物を用いることもできる；工程ｂ）において処理すべき生成物は、好ましくは２０～１００ｇ／Ｌ、好ましくは３０～８０ｇ／Ｌ間のタンパク質濃度を有する；
【0005】
低温殺菌処理と精密濾過処理は、本方法にとって必須ではないことに留意すべきである。
【0006】
ｂ）以下の工程を含むカチオン性タンパク質を選択的に抽出すること：
ｉ． 出発原料（例えば、予め濃縮された低温殺菌脱脂乳）を、好ましくは直径が１００μｍより大きいスルホプロピルＳＰタイプの強陽イオン交換樹脂（例えば、SP Sepharose Big Beads from Cytiva Sweden）を含む放射状流クロマトグラフィーカラムに通すこと：
－ 出発原料の体積（濃縮されていない原料の体積に相当する体積として表され、すなわち表示されている体積は濃縮される前の原料の体積である）は、樹脂の体積（ＢＶ、ベッドボリューム）の４０～５００倍、特に８０～５００倍、好ましくは８０～３００ＢＶの間；
－ 出発原料通過の線速度は、１．０～４．０ｍ／ｈ、好ましくは２．０～３．０ｍ／ｈの間である；
ｉｉ． 脱塩水、好ましくはＲＯ膜で処理された水（浸透水）でリンスすること：
－ 脱塩水の量は、２～６ＢＶ、好ましくは３～５ＢＶである；
－ 脱塩水の通過速度は、３．０～５．０ｍ／ｈ、好ましくは３．５～４．５ｍ／ｈの間である；
ｉｉｉ． 結合したカチオン性タンパク質を、電気伝導度が３０～５０ｍＳ／ｃｍの生理食塩水（脱塩水、好ましくは浸透水中のＮａＣｌ）で溶出すること：
－ 生理食塩水の容量は４～８ＢＶ、好ましくは５～７ＢＶである；
－ 生理食塩水の通過速度は、０．３～２．０ｍ／ｈ、好ましくは０．５～１．０ｍ／ｈである；
ｉｖ． 結合したカチオン性タンパク質を、８０～１４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは９０～１１０ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有する生理食塩水（脱塩水、好ましくは浸透水中のＮａＣｌ）で溶出すること：
－ 生理食塩水の量は、３～６ＢＶ、好ましくは４～５ＢＶである；
－ 生理食塩水の通過速度は、０．５～２．５ｍ／ｈ、好ましくは１．０～２．０ｍ／ｈである；
ｉ． 出発原料（例えば、予め濃縮された低温殺菌脱脂乳）を、好ましくは直径が１００μｍより大きいスルホプロピルＳＰタイプの強陽イオン交換樹脂（例えば、SP Sepharose Big Beads from Cytiva Sweden）を含む放射状流クロマトグラフィーカラムに通すこと：
－ 出発原料の体積（濃縮されていない原料の体積に相当する体積として表され、すなわち表示されている体積は濃縮される前の原料の体積である）は、樹脂の体積（ＢＶ、ベッドボリューム）の４０～５００倍、特に８０～５００倍、好ましくは８０～３００ＢＶの間；
－ 出発原料通過の線速度は、１．０～４．０ｍ／ｈ、好ましくは２．０～３．０ｍ／ｈの間である；
ｉｉ． 脱塩水、好ましくはＲＯ膜で処理された水（浸透水）でリンスすること：
－ 脱塩水の量は、２～６ＢＶ、好ましくは３～５ＢＶである；
－ 脱塩水の通過速度は、３．０～５．０ｍ／ｈ、好ましくは３．５～４．５ｍ／ｈの間である；
ｉｉｉ． 結合したカチオン性タンパク質を、電気伝導度が３０～５０ｍＳ／ｃｍの生理食塩水（脱塩水、好ましくは浸透水中のＮａＣｌ）で溶出すること：
－ 生理食塩水の容量は４～８ＢＶ、好ましくは５～７ＢＶである；
－ 生理食塩水の通過速度は、０．３～２．０ｍ／ｈ、好ましくは０．５～１．０ｍ／ｈである；
ｉｖ． 結合したカチオン性タンパク質を、８０～１４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは９０～１１０ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有する生理食塩水（脱塩水、好ましくは浸透水中のＮａＣｌ）で溶出すること：
－ 生理食塩水の量は、３～６ＢＶ、好ましくは４～５ＢＶである；
－ 生理食塩水の通過速度は、０．５～２．５ｍ／ｈ、好ましくは１．０～２．０ｍ／ｈである；
【0007】
陽イオン交換樹脂上の通過工程は、乳糖、ミネラル、カゼインなどの酸性タンパク質、β－ラクトグロブリン、α－ラクトグロブリン、血清アルブミンおよび大部分の免疫グロブリンなどの脱脂乳の主要成分の通過を可能にしながら、出発原料中に存在する陽イオン性タンパク質を結合する役割を果たす。第１溶出工程では、乳カチオン性タンパク質の主要タンパク質であるラクトフェリンの大部分を樹脂に結合させたまま、特定のカチオン性タンパク質を選択的に抽出する役割を果たす。そのため、純粋なウシ・ラクトフェリン画分は、第２溶出液で溶出される。
【0008】
ｃ）カットオフ閾値（ＭＷＣＯ）が１０～２０ｋＤａの限外濾過膜を用いて生理食塩水中に溶出した高純度ラクトフェリンを持つカチオン性タンパク質を濃縮すること；
ｄ）高純度ラクトフェリンを有するカチオン性タンパク質を、ＭＷＣＯが１０～２０ｋＤａの限外濾過膜を用いた脱塩水、好ましくは浸透水による二重濾過によって脱塩し、灰分／タンパク質比を０．００１～０．０３、好ましくは０．００３～０．０１とする；
ｅ）微生物の負荷を軽減するために、特定のカチオン性タンパク質の濃縮溶液を、０．２～１．４μｍ、好ましくは０．８～１．４μｍの二層でカットオフ閾値を有する膜で精密濾過すること；
ｆ）場合により、あらかじめ精密濾過した特定のカチオン性タンパク質の濃縮溶液を噴霧乾燥または凍結乾燥し、粉末状のラクトフェリン単離物を得ること。
ｄ）高純度ラクトフェリンを有するカチオン性タンパク質を、ＭＷＣＯが１０～２０ｋＤａの限外濾過膜を用いた脱塩水、好ましくは浸透水による二重濾過によって脱塩し、灰分／タンパク質比を０．００１～０．０３、好ましくは０．００３～０．０１とする；
ｅ）微生物の負荷を軽減するために、特定のカチオン性タンパク質の濃縮溶液を、０．２～１．４μｍ、好ましくは０．８～１．４μｍの二層でカットオフ閾値を有する膜で精密濾過すること；
ｆ）場合により、あらかじめ精密濾過した特定のカチオン性タンパク質の濃縮溶液を噴霧乾燥または凍結乾燥し、粉末状のラクトフェリン単離物を得ること。
【0009】
有利なことに、ＵＦ／ＮＦ／ＲＯ膜によって濃縮された哺乳類乳材料（例えば、低温殺菌脱脂牛の乳、低温殺菌ヤギの乳からのチーズ乳清）の使用は、抽出カラムを通過するために存在する等量のタンパク質に対する流路通過速度を低減することを可能にする。ＳＰタイプの強陽イオン交換樹脂との接触時間が長くなるため、カチオン性タンパク質の抽出効率が著しく向上する。
【0010】
さらに、ラジアルフローカラム（例えば、Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH）の使用は、その台形形状により、濃縮哺乳類ミルク材料が充填樹脂を通過することによって発生する圧力に持続的に耐えることが可能である。
【0011】
この濃縮乳原料とラジアルフローカラムの組み合わせは、安定した定期的な工業生産を実行するために不可欠である。
【0012】
本発明による方法の別の利点は、広い温度範囲で効果的に実施できることである。特に、樹脂メーカーは３０～５０℃の温度での実施を推奨しているが、本出願人は低温、すなわち１５℃未満、好ましくは１０℃未満の温度で効果を発揮する方法の開発に成功した。
【0013】
したがって、本発明は、乾燥材料上のタンパク質の割合が９０重量％以上であり、全タンパク質に対するラクトフェリンの割合が９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上であるような、ラクトフェリンに富むカチオン性乳清タンパク質の単離物または本発明に従う方法によって得られるものに関する。
【0014】
本発明はまた、本発明による方法によって得られる、または得られる牛乳または山羊乳の乳清からラクトフェリンを濃縮したカチオン性乳清タンパク質の単離物であって、乾燥材料上のタンパク質割合が９０重量％以上であるものに関するものであり、全タンパク質に対するラクトフェリンの割合が９５重量％以上（ｗ／ｗ）、好ましくは９８重量％以上であり、トランスコバラミンと複合体化したコバラミンをタンパク質に対して５μｇ／ｇ以下の濃度で含み、特にトランスコバラミンと複合体化したコバラミンの濃度はタンパク質に対して１～５μｇ／ｇの間である。
【0015】
本発明はまた、本発明による方法によって得られる、または得られる牛乳または山羊乳の乳清からラクトフェリンを濃縮したカチオン性乳清タンパク質の単離物であって、乾燥材料上のタンパク質割合が９０重量％以上であるものに関するものであり、全タンパク質中のラクトフェリンの割合が９０重量％以上（ｗ／ｗ）、好ましくは９５重量％以上であり、コバラミンがトランスコバラミンと複合体の形で、タンパク質に対して５μｇ／ｇ以上、好ましくは８μｇ／ｇ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｇ以上の濃度で含有されている。
【0016】
本発明による単離物は、液体形態（工程ｆは実施しない）または粉末形態（工程ｆは実施する）であることができる。液体形態である場合、乾燥材料に対する組成の点で粉末と同じ特性を有し、一般に、５～２５％、好ましくは１０～２０重量％の水を含んでなる。
【0017】
別の目的によれば、本発明は、本発明によるカチオン性タンパク質の単離物を含む、ヒトまたは動物の消費用の食品、ヒトまたは動物の医薬品、または食品サプリメントに関する。
【0018】
好ましくは、本発明による単離物は、好気性好中球叢のカウントが、本発明による単離物の粉末の１０００未満、好ましくは１００未満または１０未満、さらに好ましくは１ｃｆｕ／ｇ未満、または液体単離物の１００未満、好ましくは１０未満、さらに好ましくは１ｃｆｕ／ｍｌ未満というような微生物負荷がある。濃縮乳原料の使用とラジアルフローカラムの組み合わせにより、適切な条件下で陽イオン交換クロマトグラフィーにより２種類の高純度ラクトフェリンの単離物を安定かつ効率的に製造することができる：
－ ラクトフェリンタンパク純度が９５％以上または９８％以上であり、ビタミンＢ１２含有量が５μｇ／ｇタンパク以下または１～５μｇ／ｇタンパクの単離物；
－ ラクトフェリンタンパク純度が９５％以上または９８％以上であり、ビタミンＢ１２含有量が５μｇ／ｇタンパク以下または１～５μｇ／ｇタンパクの単離物；
【0019】
本発明によるこのような単離物は、牛またはヤギの乳をベースとする乳児用配合物（乳児用ミルクまたはフォローオンミルク）の調製に特に関心が持たれる。
及び、
－ ラクトフェリンタンパク純度が９０％以上または９５％以上であり、ビタミンＢ１２含有量が５μｇ／ｇタンパク質以上、好ましくは８μｇ／ｇタンパク質以上、より好ましくは１０μｇ／ｇタンパク質以上である単離物；
及び、
－ ラクトフェリンタンパク純度が９０％以上または９５％以上であり、ビタミンＢ１２含有量が５μｇ／ｇタンパク質以上、好ましくは８μｇ／ｇタンパク質以上、より好ましくは１０μｇ／ｇタンパク質以上である単離物；
【0020】
この単離物は、ベジタリアンのための食品サプリメント、または胃切除を受けた人やＰＰＩ（プロトンポンプ阻害剤）で慢性的に治療されている人など、ビタミンＢ１２の吸収が不足している人のための栄養製剤として、栄養上の利点を有する可能性がある。実際、この単離物は、ラクトフェリンの利点に加えて、胃から分泌される内因性因子がない場合でも、高い生物学的利用能を有するビタミンＢ１２の重要な供給源となり得る。
【0021】
したがって、本発明は、ビタミンＢ１２に富む本発明による単離物、すなわち、ラクトフェリンタンパク純度が９０％以上または９５％であり、ビタミンＢ１２含有量が５μｇ／ｇタンパク質以上、好ましくは８μｇ／ｇタンパク質以上、なおより好ましくは１０μｇ／ｇタンパク質以上の単離物を含む栄養補助食品に関するものでもある。
【0022】
食品サプリメント中の本発明による単離体の含有量は、補給すべき集団のプロファイル、したがって投与すべきビタミンＢ１２の用量、および単離体のビタミンＢ１２含有量に従って選択される。例えば、６μｇ／ｇのタンパク質でビタミンＢ１２を濃縮した本発明による単離物の１５０から１０００ｍｇのタンパク質の１日の投与量は、トランスコバラミンとの複合体の形で０．９から６．０μｇのビタミンＢ１２を提供できる。また、１０μｇ／ｇのタンパク質でビタミンＢ１２を濃縮した本発明による単離物の１００～６００ｍｇのタンパク質は、トランスコバラミンとの複合体の形で１．０～６．０μｇのビタミンＢ１２を提供できる。したがって、このような食品サプリメントは、ビタミンＢ１２の腸管吸収が妨げられたとしても、以下の表に示す各人口グループの必要量をカバーすることができる。
【0023】
【表0】
【0024】
本発明はさらに、ビタミンＢ１２欠乏吸収、例えば胃切除を受けた患者やＰＰＩ（プロトンポンプ阻害剤）で慢性的に治療されている患者の予防および／または治療のために、ラクトフェリンタンパク純度が９０％以上または９５％、ビタミンＢ１２含有量が５μｇ／ｇタンパク質以上、好ましくは８μｇ／ｇタンパク質以上、より好ましくは１０μｇ／ｇタンパク質以上の単離物に関するものである。
【0025】
コバラミン（ビタミンＢ１２）は、牛乳中では結合タンパク質と複合体の形で存在する。牛乳では、４３ｋＤａのカチオン性タンパク質であるトランスコバラミンと複合体の形で存在する(S.N. Fedosov, T.E. Petersen, E. Nexo, Transcobalamin from cow milk: isolation and physico-chemical properties, Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1292 (1996) 113-119)。このコバラミン－トランスコバラミン複合体の栄養学的興味は、ビタミンＢ１２のバイオアベイラビリティに関与すると考えられているため重要である(S.N. Fedosov, Ebba Nexo, Christian W. Heegaard, Vitamin B12 and its binding proteins in milk from cow and buffalo in relation to bioavailability of B12, Journal of Dairy Science. American Dairy Science Association. 102 (2019) 4891-4905)。
【0026】
陽イオン交換クロマトグラフィーによる処理中のこの複合体の挙動はラクトフェリンのそれに近いが、本発明による方法によって得られる溶出液中のビタミンＢ１２含有量は、使用する条件によって変えることが可能である。
【0027】
さらに、その栄養学的興味にもかかわらず、特定の用途（例えば、乳児用配合物、すなわち乳児用配合物／ミルクおよび／または後続配合物／ミルク）の特定の場合（高組み込み量）には、純粋なラクトフェリン画分成分中のこのビタミンＢ１２含量を制限することに興味がある場合がある。この文脈において、最終的なビタミンＢ１２含有量を調整することを可能にする本発明による方法は、非常に興味深いものである。
【0028】
したがって、本発明は、本発明による単離物を含むヒトまたは動物消費用の食品に関する；乳児用配合物、すなわち乳児用配合物／ミルクおよび／またはフォローオン配合物／ミルクの文脈では、ラクトフェリンタンパク質の純度が９５％超で、ビタミンＢ１２含有量が５μｇ／ｇタンパク以下である単離物が好ましく使用される。本発明による単離物の組込み率は、すぐに食べられる粉ミルク１リットル中、５０～１０００ｍｇのタンパク質である。
【0029】
本発明はまた、本発明による単離物を含む衛生製品および化粧品のような非食品に関するものである。
【0030】
また、本発明には、本発明による単離物を含む、ジェル状またはペースト状の歯磨き粉、マウスウォッシュ、チューインガムなどの口腔衛生用製品も含まれる。本発明による単離物の組込み率は、製品１ｇ中に１～１００ｍｇのタンパク質が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
例１：低温殺菌脱脂乳を用いたベンチアッセイ（コントロール）
１） ＤＭが９２ｇ／Ｌである脱脂乳を７３℃で２０秒間低温殺菌した後、６℃に冷却した。この低温殺菌した脱脂乳中のウシラクトフェリンの濃度をＨＰＬＣ ＳＣＸ（High Performance Liquid Chromatography by strong cation exchange;カラム Ｐｒｏｐａｃ ＳＣＸ、ＮａＣｌグラジエントで２０ｍＭリン酸緩衝液、検出は２８０ｎｍ）により測定した；
２） SP Sepharose Big Beads ２０ｍＬ（ＢＶ）を含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、低温殺菌脱脂乳を４００ｃｍ／ｈｒの線速で可変通過させた；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液６ＢＶで結合タンパク質を溶出させる；
４） 各溶出液のウシラクトフェリン量は、ＲＰ ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー；Ｃ１８カラム３００Å、０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した。こうして、各溶出液中のウシ・ラクトフェリン量を求めた。
１） ＤＭが９２ｇ／Ｌである脱脂乳を７３℃で２０秒間低温殺菌した後、６℃に冷却した。この低温殺菌した脱脂乳中のウシラクトフェリンの濃度をＨＰＬＣ ＳＣＸ（High Performance Liquid Chromatography by strong cation exchange;カラム Ｐｒｏｐａｃ ＳＣＸ、ＮａＣｌグラジエントで２０ｍＭリン酸緩衝液、検出は２８０ｎｍ）により測定した；
２） SP Sepharose Big Beads ２０ｍＬ（ＢＶ）を含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、低温殺菌脱脂乳を４００ｃｍ／ｈｒの線速で可変通過させた；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液６ＢＶで結合タンパク質を溶出させる；
４） 各溶出液のウシラクトフェリン量は、ＲＰ ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー；Ｃ１８カラム３００Å、０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した。こうして、各溶出液中のウシ・ラクトフェリン量を求めた。
【0033】
アッセイの条件と結果を表１に示す：
【表1】
【0034】
例２：濃縮低温殺菌脱脂牛乳を用いたベンチアッセイ
１） この牛の乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却した。このＤＭが９２ｇ／Ｌの低温殺菌脱脂牛乳を、逆浸透膜により６℃で１３０ｇ／ＬのＤＭに濃縮した。この濃縮された低温殺菌脱脂乳中のウシラクトフェリン濃度をＨＰＬＣ ＳＣＸ（カラムＰｒｏｐａｃ ＳＣＸ、２０ｍＭリン酸緩衝液ｉｎ ＮａＣｌグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した；
２） 濃縮された低温殺菌脱脂乳（１３０ｇ／Ｌ ＤＭ）を、２０ｍＬ（ＢＶ）のSP Sepharose Big Beadsを含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、低温殺菌脱脂乳を可変の線速で通過させる；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液５ＢＶで溶出させる；
４） 各溶出液のウシラクトフェリン量は、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した。こうして、各溶出液中のウシラクトフェリン量を求めた。
１） この牛の乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却した。このＤＭが９２ｇ／Ｌの低温殺菌脱脂牛乳を、逆浸透膜により６℃で１３０ｇ／ＬのＤＭに濃縮した。この濃縮された低温殺菌脱脂乳中のウシラクトフェリン濃度をＨＰＬＣ ＳＣＸ（カラムＰｒｏｐａｃ ＳＣＸ、２０ｍＭリン酸緩衝液ｉｎ ＮａＣｌグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した；
２） 濃縮された低温殺菌脱脂乳（１３０ｇ／Ｌ ＤＭ）を、２０ｍＬ（ＢＶ）のSP Sepharose Big Beadsを含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、低温殺菌脱脂乳を可変の線速で通過させる；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液５ＢＶで溶出させる；
４） 各溶出液のウシラクトフェリン量は、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した。こうして、各溶出液中のウシラクトフェリン量を求めた。
【0035】
アッセイの条件と結果を表２に示す：
【表2】
【0036】
表１および表２の比較は、得られるウシラクトフェリンの収量が、同等の結合条件（例えば、ＤＭ流速３７～３９ｇ／ｃｍ２／ｈの低温殺菌脱脂乳の～３００ＢＶ相当の通過）を用いて以前に濃縮した低温殺菌脱脂乳ではるかに高い（＞２０％）ことを示した。
【0037】
例３：濃縮低温殺菌脱脂牛乳を用いたベンチアッセイ法
１） この牛の乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却した。このＤＭが９２ｇ／Ｌの低温殺菌脱脂牛乳を、逆浸透膜により６℃で１３０ｇ／ＬのＤＭに濃縮した。この濃縮された低温殺菌脱脂乳中のウシラクトフェリン濃度をＨＰＬＣ ＳＣＸ（カラムＰｒｏｐａｃ ＳＣＸ、２０ｍＭリン酸緩衝液ｉｎ ＮａＣｌグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した；
２） 濃縮された低温殺菌脱脂乳（１３０ｇ／Ｌ ＤＭ）を、２０ｍＬ（ＢＶ）のSP Sepharose Big Beadsを含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、低温殺菌脱脂乳を可変の線速で通過させる；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を３８ｍＳ／ｃｍ、２０℃の２．６％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液６ＢＶで部分溶出させる。この溶出液からラクトパーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、その他の塩基性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液５ＢＶで溶出する。この溶出液からウシラクトフェリンを回収した；
５） この２ｎｄ溶出液中の全タンパク質中のラクトフェリンの割合は、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ｎｍで検出）により、ウシラクトフェリンのピークの相対面積として測定された。
１） この牛の乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却した。このＤＭが９２ｇ／Ｌの低温殺菌脱脂牛乳を、逆浸透膜により６℃で１３０ｇ／ＬのＤＭに濃縮した。この濃縮された低温殺菌脱脂乳中のウシラクトフェリン濃度をＨＰＬＣ ＳＣＸ（カラムＰｒｏｐａｃ ＳＣＸ、２０ｍＭリン酸緩衝液ｉｎ ＮａＣｌグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した；
２） 濃縮された低温殺菌脱脂乳（１３０ｇ／Ｌ ＤＭ）を、２０ｍＬ（ＢＶ）のSP Sepharose Big Beadsを含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、低温殺菌脱脂乳を可変の線速で通過させる；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を３８ｍＳ／ｃｍ、２０℃の２．６％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液６ＢＶで部分溶出させる。この溶出液からラクトパーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、その他の塩基性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液５ＢＶで溶出する。この溶出液からウシラクトフェリンを回収した；
５） この２ｎｄ溶出液中の全タンパク質中のラクトフェリンの割合は、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ｎｍで検出）により、ウシラクトフェリンのピークの相対面積として測定された。
【0038】
この２ｎｄ溶出液中のコバラミン（ビタミンＢ１２）含有量も、ＡＯＡＣ法により測定した。こうして、その総タンパク質含量が得られた。
【0039】
２系列のアッセイの条件と結果を表３に示す：
【表3】
【0040】
これらの結果から、適切な条件を用いれば、濃縮低温殺菌脱脂乳を通した陽イオン交換クロマトグラフィーによって、ラクトフェリン純度の高い（例えば、総タンパク質に対して９５％以上）２種類の画分を得ることができることがわかった：
－ ラクトフェリンタンパク質の純度が９５％以上で、ビタミンＢ１２の含有量が５μｇ／ｇタンパク質以下の画分；
－ ラクトフェリンタンパク質の純度が９０％以上で、ビタミンＢ１２の含有量が１０μｇ／ｇタンパク質以上である画分。
－ ラクトフェリンタンパク質の純度が９５％以上で、ビタミンＢ１２の含有量が５μｇ／ｇタンパク質以下の画分；
－ ラクトフェリンタンパク質の純度が９０％以上で、ビタミンＢ１２の含有量が１０μｇ／ｇタンパク質以上である画分。
【0041】
例４：低温殺菌脱脂乳（コントロール）を用いた工業的規模のアッセイ法
ベンチスケールでは１３０ｇ／Ｌまで濃縮された脱脂乳を軸流カラムに通すことができるが、産業スケールで乳原料のような複雑なマトリックス、特に濃縮乳を通すと、高い圧力損失とフィルター表面の目詰まりにより、長期にわたって安定した生産を想定することは困難である。
ベンチスケールでは１３０ｇ／Ｌまで濃縮された脱脂乳を軸流カラムに通すことができるが、産業スケールで乳原料のような複雑なマトリックス、特に濃縮乳を通すと、高い圧力損失とフィルター表面の目詰まりにより、長期にわたって安定した生産を想定することは困難である。
【0042】
工業用ラジアルフローカラムに、異なるＤＭの脱脂乳を異なる流量で通過させ、圧力損失挙動を確認した。
１） ２６０Ｌの工業用ラジアルフローカラム(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)に、２８０ＬのSP Sepharose Big Beads Food Grade樹脂を準備した。１０％ＮａＣｌで再生し、１Ｎ ＮａＯＨで飽和させ、最後に浸透水でリンスした；
２） 牛の乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃に冷却した。低温殺菌した脱脂牛乳の一部を６℃の逆浸透膜で濃縮した。これらの未濃縮脱脂乳及び濃縮低温殺菌脱脂乳の組成は、以下の通りである：
３） 低温殺菌脱脂乳をインラインミキシングで濃度レベルを調製した後、温度１０℃であらかじめ用意したラジアルフローカラムに異なる流量で通過させる。
１） ２６０Ｌの工業用ラジアルフローカラム(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)に、２８０ＬのSP Sepharose Big Beads Food Grade樹脂を準備した。１０％ＮａＣｌで再生し、１Ｎ ＮａＯＨで飽和させ、最後に浸透水でリンスした；
２） 牛の乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃に冷却した。低温殺菌した脱脂牛乳の一部を６℃の逆浸透膜で濃縮した。これらの未濃縮脱脂乳及び濃縮低温殺菌脱脂乳の組成は、以下の通りである：
【表4】
３） 低温殺菌脱脂乳をインラインミキシングで濃度レベルを調製した後、温度１０℃であらかじめ用意したラジアルフローカラムに異なる流量で通過させる。
【0043】
観察された脱脂乳組成、流量および圧力を表５に示す。ラジアルフローカラムによって発生する圧力損失（すなわち圧力）は、流量および移動相材料濃度の関数として増加し（図２）、ＤＭまたはＰＭの流量とよく相関した（図３）。これらの結果から、この工業規模のラジアルフローカラムは、日常的な工業生産条件下で、適切な通過流量を用いて、許容できる圧力損失で、２００ｇ／ＬＤＭまたは７２ｇＰＭ（またはＴＡＭ中で７５ｇ／Ｌ）までの濃縮低温殺菌脱脂乳（逆浸透法）の通過ができることが示された。
【表5】
【0044】
例５：濃縮低温殺菌脱脂乳を用いたウシラクトフェリンに純化した乳清の単離物の製造のための工業的アッセイ法
１） 牛乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却し、逆浸透膜で６℃で１２８ｇ／Ｌ ＤＭまで濃縮した；
２） この濃縮低温殺菌脱脂乳８０ｍ３を、SP Sepharose Big Beads Food Grade樹脂２８０Ｌを充填した２６０Ｌ(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)の工業用ラジアルフローカラムに、流速２．６ｍ／ｈで通した；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、２０℃の３８ｍＳ／ｃｍ ＮａＣｌ溶液６ＢＶで結合タンパク質を部分的に溶出させる。この溶出液からラクトパーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、その他の塩基性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃で１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液の４ＢＶで溶出される。ウシラクトフェリンを含むこの溶出液を冷却し、６℃で保存した；
５） 工程２～４を１０回繰り返した；
６） １１．２ｍ３の第２プール溶出液を限外濾過（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａの有機スパイラル膜）で濃縮し、１ｍＳ／ｃｍまで浸透させた浸透水をＵＦ（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）で二重濾過し、最後に１．４μｍのセラミック膜で二重に精密濾過した（Membrarox（登録商標）、Pall Corporation）；
７） 精密濾液の形で得られたウシラクトフェリンで濃縮された乳清タンパク質の単離物は、噴霧乾燥を経て、４０ｋｇの粉末を得た（成分１）；
８） 成分１を分析した。特に、全タンパク質中のラクトフェリンの割合は、RP HPLC(C18 column 300 Å, 0.1% TFA in H2O/CH3CN gradient, detection at 280 nm)により、ウシのラクトフェリンの相対ピーク面積として求めた（図５）。また、この第２溶出液中のコバラミン（ビタミンＢ１２）含有量をＡＯＡＣ法により測定した。その分析結果を表６に示す。
１） 牛乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却し、逆浸透膜で６℃で１２８ｇ／Ｌ ＤＭまで濃縮した；
２） この濃縮低温殺菌脱脂乳８０ｍ３を、SP Sepharose Big Beads Food Grade樹脂２８０Ｌを充填した２６０Ｌ(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)の工業用ラジアルフローカラムに、流速２．６ｍ／ｈで通した；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、２０℃の３８ｍＳ／ｃｍ ＮａＣｌ溶液６ＢＶで結合タンパク質を部分的に溶出させる。この溶出液からラクトパーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、その他の塩基性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃で１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液の４ＢＶで溶出される。ウシラクトフェリンを含むこの溶出液を冷却し、６℃で保存した；
５） 工程２～４を１０回繰り返した；
６） １１．２ｍ３の第２プール溶出液を限外濾過（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａの有機スパイラル膜）で濃縮し、１ｍＳ／ｃｍまで浸透させた浸透水をＵＦ（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）で二重濾過し、最後に１．４μｍのセラミック膜で二重に精密濾過した（Membrarox（登録商標）、Pall Corporation）；
７） 精密濾液の形で得られたウシラクトフェリンで濃縮された乳清タンパク質の単離物は、噴霧乾燥を経て、４０ｋｇの粉末を得た（成分１）；
８） 成分１を分析した。特に、全タンパク質中のラクトフェリンの割合は、RP HPLC(C18 column 300 Å, 0.1% TFA in H2O/CH3CN gradient, detection at 280 nm)により、ウシのラクトフェリンの相対ピーク面積として求めた（図５）。また、この第２溶出液中のコバラミン（ビタミンＢ１２）含有量をＡＯＡＣ法により測定した。その分析結果を表６に示す。
【0045】
例６：濃縮低温殺菌脱脂乳を用いたウシラクトフェリンに純粋な乳清の単離物の製造のための工業的アッセイ法
１） 牛乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却し、逆浸透膜で６℃で１２０ｇ／Ｌ ＤＭまで濃縮した；
２） この濃縮低温殺菌脱脂乳６０ｍ３を、SP Sepharose Big Beads Food Grade樹脂２８０Ｌを充填した２６０Ｌラジアルフロー工業カラム(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)に流速２．６ｍ／ｈで通した；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、２０℃の３６ｍＳ／ｃｍ ＮａＣｌ溶液６ＢＶで結合タンパク質を部分的に溶出させる。この溶出液からラクトパーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、その他の塩基性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃で１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液の４ＢＶで溶出される。ウシラクトフェリンを含むこの溶出液を冷却し、６℃で保存した；
５） 工程２～４を１５回繰り返した；
６） １１６．８ｍ３の、第２プール溶出液を限外濾過（カットオフ閾値（ＭＷＣＯ）２０ｋＤａの有機スパイラル膜）で濃縮し、１ｍＳ／ｃｍまでの浸透水でＵＦ（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）で二重濾過し、最後に０．８μｍのセラミック膜で二重にマイクロ濾過した(Membrarox（登録商標）、Pall Corporation)；
７） 精密濾過物の形態で得られたウシラクトフェリンを濃縮した乳清タンパク質の単離物は、この以下のタンパク質画分の安定性を確保するために、以下の追加処理を受けた：
ｉ． 精密濾過液の一部を０．２μｍのＰＥＳ膜(Supor（登録商標） Pall)で精密濾過し、滅菌した１Ｌボトルに投入した（成分３）
ｉｉ． 残った精密濾過物は噴霧乾燥を行い、６０ｋｇの粉末を得た（成分２）。
８）成分２および３を分析し、特にこの第２溶出液中の全タンパク質中のラクトフェリンの割合を、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエントに０．１％ＴＦＡ、２８０ｎｍで検出）により、ウシラクトフェリンの相対ピーク面積として決定した（図６および図７）。また、この第２溶出液中のコバラミン（ビタミンＢ１２）含有量をＡＯＡＣ法により測定した。分析結果を表６に示す。
１） 牛乳を脱脂した後、７３℃で２０秒間低温殺菌し、その後６℃まで冷却し、逆浸透膜で６℃で１２０ｇ／Ｌ ＤＭまで濃縮した；
２） この濃縮低温殺菌脱脂乳６０ｍ３を、SP Sepharose Big Beads Food Grade樹脂２８０Ｌを充填した２６０Ｌラジアルフロー工業カラム(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)に流速２．６ｍ／ｈで通した；
３） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、２０℃の３６ｍＳ／ｃｍ ＮａＣｌ溶液６ＢＶで結合タンパク質を部分的に溶出させる。この溶出液からラクトパーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、その他の塩基性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃で１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液の４ＢＶで溶出される。ウシラクトフェリンを含むこの溶出液を冷却し、６℃で保存した；
５） 工程２～４を１５回繰り返した；
６） １１６．８ｍ３の、第２プール溶出液を限外濾過（カットオフ閾値（ＭＷＣＯ）２０ｋＤａの有機スパイラル膜）で濃縮し、１ｍＳ／ｃｍまでの浸透水でＵＦ（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）で二重濾過し、最後に０．８μｍのセラミック膜で二重にマイクロ濾過した(Membrarox（登録商標）、Pall Corporation)；
７） 精密濾過物の形態で得られたウシラクトフェリンを濃縮した乳清タンパク質の単離物は、この以下のタンパク質画分の安定性を確保するために、以下の追加処理を受けた：
ｉ． 精密濾過液の一部を０．２μｍのＰＥＳ膜(Supor（登録商標） Pall)で精密濾過し、滅菌した１Ｌボトルに投入した（成分３）
ｉｉ． 残った精密濾過物は噴霧乾燥を行い、６０ｋｇの粉末を得た（成分２）。
８）成分２および３を分析し、特にこの第２溶出液中の全タンパク質中のラクトフェリンの割合を、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエントに０．１％ＴＦＡ、２８０ｎｍで検出）により、ウシラクトフェリンの相対ピーク面積として決定した（図６および図７）。また、この第２溶出液中のコバラミン（ビタミンＢ１２）含有量をＡＯＡＣ法により測定した。分析結果を表６に示す。
【0046】
【表6】
【0047】
例７：低温殺菌脱脂ヤギ乳からの濃縮乳清を用いたベンチアッセイ
１） ヤギの乳を脱脂し、７４℃で３０秒間低温殺菌した後、６℃まで冷却した；
２） ５０℃で３０分間保持した後の低温殺菌脱脂ヤギ乳３０００Ｌを、０．１μｍのセラミック精密濾過(Membrarox（登録商標）、Pall Corporation)に通し、脂肪とカゼインミセルを含まないヤギ乳の精密濾過物としてのホエイを得た；
３） ヤギ乳由来の乳清２０００Ｌを限外濾過（カットオフ閾値（ＭＷＣＯ）１０ｋＤａの有機スパイラル膜）上で濃縮した。得られた留出液（４５０Ｌ）の組成は、下記表７であった：
１） ヤギの乳を脱脂し、７４℃で３０秒間低温殺菌した後、６℃まで冷却した；
２） ５０℃で３０分間保持した後の低温殺菌脱脂ヤギ乳３０００Ｌを、０．１μｍのセラミック精密濾過(Membrarox（登録商標）、Pall Corporation)に通し、脂肪とカゼインミセルを含まないヤギ乳の精密濾過物としてのホエイを得た；
３） ヤギ乳由来の乳清２０００Ｌを限外濾過（カットオフ閾値（ＭＷＣＯ）１０ｋＤａの有機スパイラル膜）上で濃縮した。得られた留出液（４５０Ｌ）の組成は、下記表７であった：
【表7】
【0048】
この濃縮乳清中のヤギβ－ラクトグロブリンおよびヤギα－ラクトアルブミンの濃度は、SEC HPLC (TSK G3000PWxl column, CH3CN/H20/TFA, detection at 210 nm) により測定した。この濃縮乳清中のヤギラクトフェリン濃度は、ＨＰＬＣ ＳＣＸ（Ｐｒｏｐａｃ ＳＣＸカラム、２０ｍＭリン酸緩衝液ｉｎ ＮａＣｌグラジエント、検出波長２８０ｎｍ）で測定した。
４） 濃縮ヤギ乳清３Ｌを、SP Sepharose Big Beads ２０ｍＬ（ＢＶ）を含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、線速２００および３００ｃｍ／ｈで通過させる；
５） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を２０℃の２．２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液６ＢＶで部分的に溶出させる。この溶出液からラクトフェリン以外のラクトパーオキシダーゼなどのカチオン性タンパク質が回収された；
６） まだ結合しているタンパク質は、２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液５ＢＶで溶出される。この溶出液からヤギラクトフェリンを回収した。溶出液中のヤギラクトフェリン含量をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント中０．１％ＴＦＡ、２８０ｎｍで検出）により測定した。
４） 濃縮ヤギ乳清３Ｌを、SP Sepharose Big Beads ２０ｍＬ（ＢＶ）を含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、線速２００および３００ｃｍ／ｈで通過させる；
５） ５ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を２０℃の２．２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液６ＢＶで部分的に溶出させる。この溶出液からラクトフェリン以外のラクトパーオキシダーゼなどのカチオン性タンパク質が回収された；
６） まだ結合しているタンパク質は、２０℃の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液５ＢＶで溶出される。この溶出液からヤギラクトフェリンを回収した。溶出液中のヤギラクトフェリン含量をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント中０．１％ＴＦＡ、２８０ｎｍで検出）により測定した。
【0049】
表８に示すように、ヤギ乳の濃縮乳清から、非常に高いタンパク質純度を有するヤギラクトフェリン画分を非常に効率的に抽出することができた。
【表8】
【0050】
例８：低温殺菌脱脂ヤギ乳からの濃縮チーズ乳清を用いたベンチアッセイ
１） 低温殺菌したヤギ乳のチーズ乳清（７４℃、３０秒）２４０Ｌを限外濾過（ＭＷＣＯ１０ｋＤａの有機スパイラル膜）上で濃縮した。得られた留出液（６０Ｌ）の組成は、下表の通りであった：
この濃縮乳清中のヤギβ－ラクトグロブリンおよびヤギα－ラクトアルブミンの濃度は、ＳＥＣ ＨＰＬＣ（ＴＳＫ Ｇ３０００ＰＷｘｌカラム、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０／ＴＦＡ、２１０ｎｍで検出）により測定した。この濃縮乳清中のヤギラクトフェリン濃度は、ＨＰＬＣ ＳＣＸ（Ｐｒｏｐａｃ ＳＣＸカラム、２０ｍＭ ＮａＰＢ／ＮａＣｌグラジエント、検出波長２８０ｎｍ）で測定した。
２） 濃縮ヤギ乳清３Ｌを、SP Sepharose Big Beads ２０ｍＬ（ＢＶ）を含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、線速２００および３００ｃｍ／ｈで通過させる；
３） ６ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を６ＢＶの２．２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液で２０℃にて部分溶出させる。この溶出液からラクトフェリン以外のラクトパーオキシダーゼなどのカチオン性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃で１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液の５ＢＶで溶出される。この溶出液からヤギのラクトフェリンを回収した。溶出液中のヤギラクトフェリン含量をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント中０．１％ＴＦＡ、２８０ｎｍで検出）により測定した。
１） 低温殺菌したヤギ乳のチーズ乳清（７４℃、３０秒）２４０Ｌを限外濾過（ＭＷＣＯ１０ｋＤａの有機スパイラル膜）上で濃縮した。得られた留出液（６０Ｌ）の組成は、下表の通りであった：
【表9】
この濃縮乳清中のヤギβ－ラクトグロブリンおよびヤギα－ラクトアルブミンの濃度は、ＳＥＣ ＨＰＬＣ（ＴＳＫ Ｇ３０００ＰＷｘｌカラム、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０／ＴＦＡ、２１０ｎｍで検出）により測定した。この濃縮乳清中のヤギラクトフェリン濃度は、ＨＰＬＣ ＳＣＸ（Ｐｒｏｐａｃ ＳＣＸカラム、２０ｍＭ ＮａＰＢ／ＮａＣｌグラジエント、検出波長２８０ｎｍ）で測定した。
２） 濃縮ヤギ乳清３Ｌを、SP Sepharose Big Beads ２０ｍＬ（ＢＶ）を含む軸流カラム（直径１．６ｃｍ）に、線速２００および３００ｃｍ／ｈで通過させる；
３） ６ＢＶの浸透水でリンスした後、結合したタンパク質を６ＢＶの２．２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液で２０℃にて部分溶出させる。この溶出液からラクトフェリン以外のラクトパーオキシダーゼなどのカチオン性タンパク質が回収された；
４） まだ結合しているタンパク質は、２０℃で１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液の５ＢＶで溶出される。この溶出液からヤギのラクトフェリンを回収した。溶出液中のヤギラクトフェリン含量をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム３００Å、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント中０．１％ＴＦＡ、２８０ｎｍで検出）により測定した。
【0051】
表１０に示すように、ヤギ乳の濃縮チーズ乳清から、タンパク質純度の高いヤギラクトフェリン画分を非常に効率よく抽出することができた。
【表10】
【0052】
例９：ウシラクトフェリン添加粉乳（ビタミンＢ１２低含有）の調製アッセイ例
１） 牛乳をベースにした粉ミルクは、下記のものを配合し、標準的な製造方法により、調製した：脱脂乳、乳糖、マルトデキストリン、オレイン酸ヒマワリ油、無水乳脂肪、脱塩乳清、可溶性タンパク質をガラクトオリゴ糖、ヒマワリ油、菜種油、大豆レシチン、ヒマワリレシチン、リン酸カルシウム、魚油、リン酸カリウム、Mortierella alpina油、コリンビタレート、塩化カルシウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、フラクトオリゴ糖、ビタミンＣ、ピロリン酸第二鉄、炭酸カルシウム、タウリン、水酸化カリウム、塩化カリウム、イノシトール、ヌクレオチド、Ｌ－フェニルアラニン、トコフェロール富化エキス、パルミチン酸Ｌ－アスコルビル、硫酸亜鉛、Ｌ－トリプトファン、ビタミンＥ、ヨウ化カリウム、Ｌ－カルニチン、ニコチンアミド、亜セレン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン、ビタミンＡ、ビタミンＢ６、硫酸マンガン、葉酸、ビタミンＫ、ビオチン、ビタミンＤ、リボフラビン、ビタミンＢ１２。
２） 乳児用粉ミルクは、成分１と８２ｍｇ／１００ｇの配合率で混合されている。
１） 牛乳をベースにした粉ミルクは、下記のものを配合し、標準的な製造方法により、調製した：脱脂乳、乳糖、マルトデキストリン、オレイン酸ヒマワリ油、無水乳脂肪、脱塩乳清、可溶性タンパク質をガラクトオリゴ糖、ヒマワリ油、菜種油、大豆レシチン、ヒマワリレシチン、リン酸カルシウム、魚油、リン酸カリウム、Mortierella alpina油、コリンビタレート、塩化カルシウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、フラクトオリゴ糖、ビタミンＣ、ピロリン酸第二鉄、炭酸カルシウム、タウリン、水酸化カリウム、塩化カリウム、イノシトール、ヌクレオチド、Ｌ－フェニルアラニン、トコフェロール富化エキス、パルミチン酸Ｌ－アスコルビル、硫酸亜鉛、Ｌ－トリプトファン、ビタミンＥ、ヨウ化カリウム、Ｌ－カルニチン、ニコチンアミド、亜セレン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン、ビタミンＡ、ビタミンＢ６、硫酸マンガン、葉酸、ビタミンＫ、ビオチン、ビタミンＤ、リボフラビン、ビタミンＢ１２。
２） 乳児用粉ミルクは、成分１と８２ｍｇ／１００ｇの配合率で混合されている。
【表11】
【0053】
例１０：ウシラクトフェリンを添加した粉末栄養剤（高ビタミンＢ１２含有）の測定値
１） 牛乳をベースとした粉ミルク（特別医療用食品：ＦＳＭＰ）は、下記のものを配合し、標準的な製造方法で調製された：脱脂乳、植物油（パーム、菜種、コプラ、ヒマワリ）、脱塩可溶性タンパク質、乳糖、デンプン、ローカストビーン粉、レシチン、クエン酸カルシウム、魚油、Mortierella alpina油、炭酸カルシウム、ビタミンＣ、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化カルシウム、塩化コリン、タウリン、ビタミンＥ、イノシトール、硫酸第一鉄、Ｌ－トリプトファン、塩化カリウム、塩化カルシウム、トコフェロールリッチエキス、パルミチン酸Ｌ－アスコルビル、Ｌ－カルニチン、硫酸マグネシウム、ヌクレオチド、硫酸亜鉛ビタミンＡ、ニコチン酸アミド、ビタミンＫ、ビタミンＤ、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン、ビタミンＢ６、リボフラビン、硫酸マンガン、葉酸、ヨウ素酸カリウム、亜セレン酸ナトリウム、ビオチン。
２） ＦＳＭＰ粉乳に成分２を４００ｍｇ／１００ｇの割合で配合し、成分２を配合することにより、粉体１００ｇあたりトランスコバラミンとの複合型ビタミンＢ１２を３．１μｇ摂取することができた。
１） 牛乳をベースとした粉ミルク（特別医療用食品：ＦＳＭＰ）は、下記のものを配合し、標準的な製造方法で調製された：脱脂乳、植物油（パーム、菜種、コプラ、ヒマワリ）、脱塩可溶性タンパク質、乳糖、デンプン、ローカストビーン粉、レシチン、クエン酸カルシウム、魚油、Mortierella alpina油、炭酸カルシウム、ビタミンＣ、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化カルシウム、塩化コリン、タウリン、ビタミンＥ、イノシトール、硫酸第一鉄、Ｌ－トリプトファン、塩化カリウム、塩化カルシウム、トコフェロールリッチエキス、パルミチン酸Ｌ－アスコルビル、Ｌ－カルニチン、硫酸マグネシウム、ヌクレオチド、硫酸亜鉛ビタミンＡ、ニコチン酸アミド、ビタミンＫ、ビタミンＤ、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン、ビタミンＢ６、リボフラビン、硫酸マンガン、葉酸、ヨウ素酸カリウム、亜セレン酸ナトリウム、ビオチン。
２） ＦＳＭＰ粉乳に成分２を４００ｍｇ／１００ｇの割合で配合し、成分２を配合することにより、粉体１００ｇあたりトランスコバラミンとの複合型ビタミンＢ１２を３．１μｇ摂取することができた。
【表12】
【0054】
例１１：ウシラクトフェリンを添加した粉末栄養剤（高ビタミンＢ１２含有）の測定結果
１） 牛乳をベースとした液体ミルク（特別医療目的食品、ＦＳＭＰ）は、下記のものを配合し、標準製法により調製された：脱脂乳、脱塩可溶性タンパク質、植物油（パーム、パーム核、菜種、ひまわり）、乳糖、大豆レシチン、ひまわりレシチン、クエン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、ビタミンＣ、Mortierella alpina油、魚油、水酸化カルシウム、塩化カリウム、ビタミンＥ、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、トコフェロールリッチエキス、パルミチン酸Ｌ－アスコルビル、イノシトール、硫酸亜鉛、ヌクレオチド、Ｌ－カルニチンニコチン酸アミド、ビタミンＡ、硫酸マグネシウム、ビタミンＫ、ビタミンＤ、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン、ビタミンＢ６、リボフラビン、硫酸マンガン、葉酸、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、ビオチン。
２） 液状のＦＳＭＰ乳児用ミルクを超高温（ＵＨＴ）熱処理により殺菌し、成分３を４１０ｍｇ／１００ｇ（乾燥物換算）の配合率で混合した。この成分３の配合により、液状製剤１００ｍＬあたりトランスコバラミンとの複合型ビタミンＢ１２が０．４３μｇの摂取が達成された。
１） 牛乳をベースとした液体ミルク（特別医療目的食品、ＦＳＭＰ）は、下記のものを配合し、標準製法により調製された：脱脂乳、脱塩可溶性タンパク質、植物油（パーム、パーム核、菜種、ひまわり）、乳糖、大豆レシチン、ひまわりレシチン、クエン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、ビタミンＣ、Mortierella alpina油、魚油、水酸化カルシウム、塩化カリウム、ビタミンＥ、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、トコフェロールリッチエキス、パルミチン酸Ｌ－アスコルビル、イノシトール、硫酸亜鉛、ヌクレオチド、Ｌ－カルニチンニコチン酸アミド、ビタミンＡ、硫酸マグネシウム、ビタミンＫ、ビタミンＤ、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン、ビタミンＢ６、リボフラビン、硫酸マンガン、葉酸、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、ビオチン。
２） 液状のＦＳＭＰ乳児用ミルクを超高温（ＵＨＴ）熱処理により殺菌し、成分３を４１０ｍｇ／１００ｇ（乾燥物換算）の配合率で混合した。この成分３の配合により、液状製剤１００ｍＬあたりトランスコバラミンとの複合型ビタミンＢ１２が０．４３μｇの摂取が達成された。
【表13】
【0055】
例１２：本ウシラクトフェリン（ビタミンＢ１２高含有）を用いたカプセル食品サプリメントの調製
例５の成分２（混合物の９９．５％）とコロイダルシリカ（混合物の０．５％）の混合物からカプセル食品サプリメントを調製した。各カプセルは、２００ｍｇのタンパク質を含む。
例５の成分２（混合物の９９．５％）とコロイダルシリカ（混合物の０．５％）の混合物からカプセル食品サプリメントを調製した。各カプセルは、２００ｍｇのタンパク質を含む。
【0056】
トランスコバラミンとの複合体型のビタミンＢ１２の含有量は、１．６μｇ／カプセルである。各人口グループに対する１日の推奨量は以下の通りである：
【表14】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】