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特表2023-554441細胞リプログラミングのための組成物、構築物及びベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】細胞リプログラミングのための組成物、構築物及びベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20231220BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20231220BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231220BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20231220BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20231220BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20231220BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20231220BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231220BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20231220BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20231220BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231220BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20231220BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20231220BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20231220BHJP
C12N 5/0787 20100101ALI20231220BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231220BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231220BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20231220BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231220BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/867 Z
C12N15/09 110
C12N5/0735
C12N5/0789
C12N5/071
C12N5/09
C12N5/10
C12N5/0783
C12N15/86 Z
C12N15/63 Z
C12N5/0775
C12N5/077
C12N5/0786
C12N5/0787
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/768
A61K35/17
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536992
(86)(22)【出願日】2021-12-17
(85)【翻訳文提出日】2023-07-05
(86)【国際出願番号】 EP2021086519
(87)【国際公開番号】W WO2022129542
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】20215068.6
(32)【優先日】2020-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522142442
【氏名又は名称】アスガード セラピューティクス エービー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】マリア ナシメント カイアド，イネス
(72)【発明者】
【氏名】クロチキン，イリア
(72)【発明者】
【氏名】テリアム ドゥシム，グラディス
(72)【発明者】
【氏名】シトゥニカ クイン，エワ
(72)【発明者】
【氏名】フィリペ リベイロ レモス ペレイラ，カルロス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD39
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、細胞をナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または前駆細胞にリプログラムするための組成物、ベクター、構築物、細胞及び方法に関する。特に、本開示は、細胞のリプログラミングのための転写因子の組み合わせに関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳからなる群から選択される少なくとも３つの異なる転写因子の組み合わせをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、４つの転写因子ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳの組み合わせである、請求項１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、配列番号１から配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、配列番号２２から配列番号２７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によって、または前記配列番号２２から配列番号２７のポリヌクレオチド配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記転写因子ＥＴＳ１は、前記配列番号１のアミノ酸配列、または前記配列番号１のアミノ酸配列の生物学的に活性なバリアントを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項6】
配列番号１をコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号２２、または前記配列番号２２の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である、請求項５に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記転写因子ＴＢＥＴは、前記配列番号２のアミノ酸配列、または前記配列番号２のアミノ酸配列の生物学的に活性なバリアントを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項8】
配列番号２をコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号２３、または前記配列番号２３の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である、請求項７に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記転写因子ＮＦＩＬ３は、配列番号３の前記アミノ酸配列、または配列番号３の前記アミノ酸配列の生物学的に活性なバリアントを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項10】
配列番号３をコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４、または前記配列番号２４の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である、請求項７に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記転写因子ＥＯＭＥＳは、配列番号４の前記アミノ酸配列、または配列番号４の前記アミノ酸配列の生物学的に活性なバリアントを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記生物学的に活性なバリアントが、配列番号５から配列番号６からなる群から選択される配列を含む、請求項１１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項13】
配列番号４から配列番号６をコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、または前記配列番号２５、前記配列番号２６及び前記配列番号２７の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項１１から１２に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳと、
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ及びＮＦＩＬ３と、
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳと、
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳと、
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳとからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項15】
前記組み合わせは、ＩＤ２、ＧＡＴＡ３、ＺＦＰ１０５、ＩＫＺＦ３、ＴＯＸ、ＲＵＮＸ３、ＫＬＦ１２、ＺＥＢ２、ＩＲＦ２、ＳＴＡＴ５、ＩＫＺＦ１、ＥＬＦ４、ＺＢＴＢ１６、ＧＡＴＡ２及びＥＬＦ１からなる群から選択される１つ以上の転写因子をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド。
【請求項16】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む構築物またはベクター。
【請求項17】
前記ベクターはウイルスベクターである、請求項１６に記載の構築物またはベクター。
【請求項18】
前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レオウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、カリシウイルスベクター、ヘパドナウイルスベクター、トガウイルスベクター、コロナウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター、ブニヤウイルスベクター及びフィロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１７に記載の構築物またはベクター。
【請求項19】
前記ウイルスベクターはレンチウイルスファミリーのメンバーである、請求項１７に記載の構築物またはベクター。
【請求項20】
前記ベクターは腫瘍溶解性ベクターである、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の構築物またはベクター。
【請求項21】
前記構築物またはベクターは、合成ｍＲＮＡ、裸のアルファウイルスＲＮＡレプリコン、または裸のフラビウイルスＲＮＡレプリコンである、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の構築物またはベクター。
【請求項22】
前記ベクターは翻訳後調節要素（ＰＲＥ）配列をさらに含む、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の構築物またはベクター。
【請求項23】
前記ＰＲＥ配列は、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）からなる群から選択される、請求項２２に記載の構築物またはベクター。
【請求項24】
前記ベクターは、請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの転写を制御するプロモーター配列をさらに含む、請求項１６から２３のいずれか１項に記載の構築物またはベクター。
【請求項25】
前記プロモーター配列は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ＭＮＤＵ３）を含む修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ユビキチンＣプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターからなる群から選択される、請求項２４に記載の構築物またはベクター。
【請求項26】
前記構築物または前記ベクターはプラスミドである、請求項１６に記載の構築物またはベクター。
【請求項27】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの前記少なくとも３つの転写因子が、以下の５’から３’への連続順序で、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳと、
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳと、
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳと、
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳと、
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳと、
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳと、
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１と、
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１と、
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１と、
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１と、
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１と、
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１と、
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴと、
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴと、
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴと、
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴと、
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴと、
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴと、
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３と、
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３と、
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３と、
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３と、
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３と、
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３と、
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３と、
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３と、
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴと、
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴと、
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１と、
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１と、
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳと、
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳと、
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴと、
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴと、
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１と、
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１と、
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳと、
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳと、
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３と、
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３と、
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１と、
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１と、
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳと、
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳと、
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３と、
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３と、
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴと、
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴとからなる群から選択される、請求項１９から２６のいずれか１項に記載の構築物またはベクター。
【請求項28】
前記構築物または前記ベクターはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ活性化システムである、請求項１６から２７のいずれか１項に記載の構築物またはベクター。
【請求項29】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び／または請求項１６から２８のいずれか１項に記載の構築物もしくはベクターを含む細胞。
【請求項30】
前記細胞は哺乳類細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項31】
前記細胞はヒト細胞である、請求項２９から３０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項32】
前記細胞は、幹細胞、分化細胞、がん細胞または腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項33】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞などの多能性幹細胞及び複能性幹細胞、ならびに造血幹細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の細胞。
【請求項34】
前記分化細胞は任意の体細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項35】
前記細胞は、線維芽細胞、または単球もしくはマスト細胞などの造血細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の細胞。
【請求項36】
前記細胞はＮＣＲ１陽性である、請求項２９から３５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項37】
前記細胞はＣＤ３４陽性である、請求項２９から３６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項38】
前記細胞はＣＤ５６陽性である、請求項２９から３７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項39】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項１６から２８のいずれか１項に記載の構築物もしくはベクター、及び／または請求項２９から３８のいずれか１項に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項40】
前記組成物が適切な担体をさらに含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項41】
細胞をナチュラルキラー細胞または前駆細胞にリプログラムまたは誘導するための方法であって、前記方法は、以下のステップ、ａ． 請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または請求項１６から２８のいずれか１項に記載の構築物もしくはベクター、または請求項３９から４０のいずれか１項に記載の細胞を使用して細胞を形質導入することと、
ｂ． 形質導入された細胞を細胞培地中で培養及び増殖させることと、
ｃ． リプログラムされた細胞を得ることとを含む、前記方法。
【請求項42】
前記方法は、１つ以上のサイトカインを含む培地中で前記形質導入された細胞を培養することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記１つ以上のサイトカインは、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－７及びＩＬ－１５からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記細胞は哺乳類細胞である、請求項４１から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記細胞はヒト細胞である、請求項４１から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記細胞は、幹細胞、分化細胞またはがん細胞からなる群から選択される、請求項４１から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項47】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、多能性幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記分化細胞は、線維芽細胞及び単球からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記形質導入細胞は、少なくとも２日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも８日間、例えば少なくとも１０日間、例えば少なくとも１２日間培養される、請求項４１から４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記リプログラムされた細胞はＮＣＲ１陽性である、請求項４１から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記リプログラムされた細胞はＣＤ３４陽性である、請求項４１から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記リプログラムされた細胞はＣＤ５６陽性である、請求項４１から５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
請求項４１から５２のいずれか１項に記載の方法により得られる、誘導ナチュラルキラー細胞。
【請求項54】
前記誘導細胞はＮＣＲ１陽性である、請求項５３に記載の誘導されたナチュラルキラー細胞。
【請求項55】
前記誘導細胞はＣＤ３４陽性である、請求項５３から５４のいずれか１項に記載の誘導ナチュラルキラー細胞。
【請求項56】
前記誘導細胞はＣＤ５６陽性である、請求項５３から５５のいずれか１項に記載の誘導ナチュラルキラー細胞。
【請求項57】
医療で使用するための、請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項１６から２８のいずれか１項に記載の構築物またはベクター、請求項２９から３８のいずれか１項に記載の細胞、請求項３９から４０のいずれか１項に記載の医薬組成物、及び／または請求項５３から５６のいずれか１項に記載の誘導ナチュラルキラー細胞。
【請求項58】
がん治療で使用するための、請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項１６から２８のいずれか１項に記載の構築物またはベクター、請求項２９から３８のいずれか１項に記載の細胞、請求項３９から４０のいずれか１項に記載の医薬組成物、及び／または請求項５３から５６のいずれか１項に記載の誘導ナチュラルキラー細胞。
【請求項59】
免疫療法で使用するための、請求項１から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項１６から２８のいずれか１項に記載の構築物またはベクター、請求項２９から３８のいずれか１項に記載の細胞、請求項３９から４０のいずれか１項に記載の医薬組成物、及び／または請求項５３から５６のいずれか１項に記載の誘導ナチュラルキラー細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、転写因子の組み合わせを使用する直接リプログラミングによる自己ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び前駆細胞の生成に関する。さらに、本開示は、単離／合成の転写因子を導入して発現させることによって、分化、多分化能または多能性の幹細胞から細胞傷害能力を有する自然リンパ球前駆細胞及び成熟細胞を作製するための方法の開発に関する。特に、本開示は、特定の転写因子の組み合わせを使用する直接細胞リプログラミングによって、自己自然リンパ球、特にＮＫ細胞を得るための方法を提供する。
【0002】
【背景技術】
【0003】
細胞リプログラミングは、ある細胞状態の転写ネットワーク及びエピジェネティックネットワークを別の細胞型のものに変化させるプロセスである。マウス及びヒトの体細胞は、定義された転写因子（ＴＦ）の発現によって誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にリプログラムされている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、２００６）。さらに、体細胞は、代替的な体細胞型になるように直接リプログラムすることができる。標的細胞の同一性を特定する能力を備えたＴＦを使用することにより、体細胞は、筋細胞、ニューロン及び肝細胞などの他の成熟細胞運命に直接変換されている（Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。造血システムでは、マウス及びヒトの線維芽細胞から造血前駆細胞（Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．、２０１３、Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．、２０１８）及び樹状細胞（Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．、２０１８）を生成するために直接リプログラミングが使用されている。直接リプログラミングは、細胞の同一性と拘束に関する研究を行うための強力なアプローチとして台頭してきている。固有の系統選択は確率論的であり、系統指定ＴＦの活性化に依存し、系統指定ＴＦは代替系統指定因子との交差拮抗的相互作用を通じて細胞の運命を固定する（Ｇｒａｆ ａｎｄ Ｅｎｖｅｒ、２００９）。リンパ球によるがん免疫療法が最近成功しているにもかかわらず、直接細胞リプログラミングによるリンパ球生成の事例は報告されていない。
【0004】
ＮＫ細胞は、ウイルス感染及びがんを制御する自然リンパ球（ＩＬＣ）の特定のグループを表す。いくらかのＮＫ細胞産生が胸腺で検出された場合でも、成人においては骨髄がＮＫ細胞前駆細胞及び成熟ＮＫ細胞が産生される主な部位である（Ｖｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。ＮＫ細胞は、胎児期の造血及びＮＫ細胞産生のための活性部位である肝臓だけでなく、末梢血、脾臓及びリンパ節などの様々な組織に存在する（Ｒｅｎｏｕｘ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。いくつかの転写因子は、ＮＫ細胞の生成及び機能にとって重要である。しかしながら、転写因子の多くは他の血液系統の制御にも関与している。ＥＴＳ１の発現はリンパ系前駆細胞で開始され、初期のリンパ系拘束とＮＫ最終分化との両方に関与している。ＥＴＳ１は、ＮＦＩＬ３とともに、ＮＫ細胞の転写ネットワークを調節し、ＩＤ２及びＥＯＭＥＳの発現を活性化する。ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳはどちらも、ＩＦＮ－ガンマ産生などのＮＫ細胞の機能特性に不可欠である。ＴＢＥＴは他のＩＬＣによって発現されるが、ＥＯＭＥＳはＮＫ細胞系統に限定されており、ＴＢＥＴ＋細胞におけるＥＯＭＥＳの異所性発現はＮＫ細胞様の特徴を誘導する。ＮＫ生物学におけるこれらの個々のＴＦの重要性にもかかわらず、他の細胞型においてＮＫの同一性を指示する主な組み合わせは不明である。計算による予測に基づいて、ＴＦであるＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２が、そのような役割を持つことが示唆されてきている（ＷＯ２０１９／１７７９３６）。全体的にみて、直接細胞リプログラミングによるＮＫ細胞の生成の成功は報告されていない。
【0005】
Ｔ細胞とは異なり、ＮＫリンパ球は抗原の指定を必要とすることなしに、標的細胞を直接認識して排除できる。代わりに、ＮＫ細胞の死滅は、ＮＫ細胞表面の活性化受容体及び抑制性受容体からのシグナルのバランスに依存する（Ｎｏｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．、２０２０）。それらは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子によって阻害されるため、ＮＫリンパ球は健康な組織に反応することなくＭＨＣ－Ｉを表面でダウンレギュレーションする腫瘍細胞を除去するので、その臨床的有用性を裏付けている。前臨床データは、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を広範囲に実証しており、Ｔ細胞にターゲティングされないＭＨＣ－Ｉ陰性癌細胞を排除する能力、免疫細胞浸潤を増加させる能力（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１８、Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．、２０１８）、そして、重要な能力として、循環腫瘍細胞を排除することによって転移を防ぐ能力の証拠を提供している（Ｌｏｐｅｚ－Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、２０１７）。さらに、ＮＫ細胞のサイトカイン分泌プロファイルは、サイトカイン放出症候群の発症に関連する炎症誘発性サイトカインを産生するＴリンパ球とは異なる。したがって、ＮＫベースの免疫療法は、養子Ｔ細胞戦略よりも安全なプロファイルを有している（Ｌｏｐｅｚ－Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、２０１７）。末梢血から単離された、または臍帯造血前駆細胞から分化されたＮＫ細胞の養子移植は、臨床研究によって安全であることが示され、造血癌に対する有効性が実証されている（Ｂａｃｈａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．、２０１４、Ｐａｓｓｗｅｇ ｅｔ ａｌ．、２００４）。しかしながら、初代ＮＫ細胞を末梢血または臍帯血から大量に入手することは困難である。ＮＫ細胞株ＮＫ９２も臨床試験では最小限の副作用を示しているが、これらの細胞に放射線を照射する必要があるため、注射後のＮＫ９２細胞の持続性は制限される（Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．、２００３）。固形腫瘍では、免疫抑制微小環境がＮＫ細胞の浸潤及び活性化を阻害する。しかしながら、固形癌におけるＮＫ細胞の浸潤と抗腫瘍活性を最大化するためにＮＫ細胞を利用するためのいくつかの戦略が開発されている。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用したＮＫ細胞操作を開発されており、ＮＫリンパ球を特定の抗原を持つ腫瘍細胞に向けて導き、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を高めている。前臨床研究では、同種異系ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ ＮＫ細胞は、卵巣異種移植モデルにおいて腫瘍の進行を防止し、長期持続生存を促進する能力を実証した（Ｙｅ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、２０１８）。総合すると、これらの研究によって、初代ＮＫ細胞及びｉＰＳ細胞由来の同種異系ＮＫ細胞は安全であり、移植片対宿主病を引き起こす事例が最小限しかないことが実証されている。それにもかかわらず、ＮＫ細胞をｉＰＳＣから区別するためのプロトコールは複雑で時間がかかり、複数のサイトカインの組み合わせの添加及びフィーダー層との共培養が必要である。これらの制限によって、自己ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞の迅速な製造及び迅速な送達に課題が生じている。同種異系ＮＫ細胞は安全であることが証明されているものの、レシピエントの免疫系によって拒絶される場合があり、持続性が限られている（ＷＯ２０１９／１７７９３６）。代替アプローチとしてＭＨＣ－Ｉ遺伝子編集が提案されている。しかしながら、ＭＨＣ－Ｉ陰性細胞は宿主ＮＫ細胞によって拒絶される可能性があり、ＮＫ細胞はその機能を維持するために細胞内因性ＭＨＣ－Ｉを必要とする（Ｂｏｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。
【0006】
したがって、同時に遺伝子操作できるＮＫ細胞の直接的な生成を可能にする新しいアプローチが必要とされており、がん免疫療法において説得力のある価値を保持している。
【発明の概要】
【0007】
本発明の発明者らは、迅速かつ再現性のある、ＮＫ細胞を生成する新規の方法を開発した。特に、この方法には、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて持続性が高く、免疫療法での使用に適した自己ＮＫ細胞の生成が含まれる。本発明はまた、細胞をＮＫ細胞にリプログラムするために使用できる、ＮＫ細胞で豊富になることが示されている転写因子の組み合わせに関する。
【0008】
一態様では、本発明は、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＧＡＴＡ３、ＺＦＰ１０５、ＩＫＺＦ３、ＥＴＳ１、ＴＯＸ、ＲＵＮＸ３、ＫＬＦ１２、ＺＥＢ２、ＩＲＦ２、ＳＴＡＴ５、ＩＫＺＦ１、ＥＬＦ４、ＺＢＴＢ１６、ＧＡＴＡ２及びＥＬＦ１からなる群から選択される少なくとも３つの異なる転写因子の組み合わせをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供する。
【0009】
別の態様では、本発明は、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳからなる群から選択される少なくとも３つの異なる転写因子の組み合わせをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに関する。
【0010】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む構築物またはベクターに関する。
【0011】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び／または構築物もしくはベクターを含む細胞を提供する。
【0012】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、構築物もしくはベクター、及び／または細胞を含む医薬組成物に関する。
【0013】
一態様では、本発明は、任意の細胞をナチュラルキラー細胞または前駆細胞にリプログラムまたは誘導するための方法であって、この方法が、
ａ． 本明細書に記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチド、または構築物もしくはベクターを細胞に形質導入することと、
ｂ． 形質導入された細胞を細胞培地中で培養及び増殖させることと、
ｃ． リプログラムされた細胞を得ることとを含むステップを含む、方法を提供する。
ａ． 本明細書に記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチド、または構築物もしくはベクターを細胞に形質導入することと、
ｂ． 形質導入された細胞を細胞培地中で培養及び増殖させることと、
ｃ． リプログラムされた細胞を得ることとを含むステップを含む、方法を提供する。
【0014】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られる誘導ナチュラルキラー細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】直接リプログラムされたＮＫ細胞の応用形態の概略図である。患者から単離された線維芽細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、及び他の細胞種を含むヒト体細胞は、個別化免疫療法に適用できる自己ＮＫ細胞にリプログラムされる。この直接リプログラミングアプローチにより、ＮＫ細胞同一性のＴＦインストラクターによる形質導入と同時に遺伝子編集を行い、ＮＫ細胞の活性またはターゲティングを改善することが可能になる。誘導ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、がん及びウイルス感染に対する細胞傷害性免疫応答を開始することに使用し得る。
【図2】ＮＫ細胞をプログラムするための１９個の候補転写因子の同定を示す。ヒートマップは、複数のマウス組織及び細胞型にわたって選択された１９個のＴＦの遺伝子発現プロファイルを示す（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）。候補ＴＦは、７５個より多くの他の組織または細胞型と比較して、ＮＫ細胞で非常に豊富になる。
【図3A】１９個の転写因子の強制発現を組み合わせることにより、ＮＫ特異的レポーターが活性化されることを示す。ＮＫ誘導性ＴＦをスクリーニングするための実験戦略を示す。ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏダブルトランスジェニックマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦＳ）に、候補ＴＦ及びＭ２ｒｔＴＡをコードするレンチウイルス粒子を同時形質導入し、Ｄｏｘの存在下で１２日間培養した。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現は蛍光顕微鏡によってモニタリングされた。
【図3B】１９個の転写因子の強制発現を組み合わせることにより、ＮＫ特異的レポーターが活性化されることを示す。いくつかのマウス組織及び細胞にわたるＮＣＲ１の遺伝子発現プロファイル（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）を示す。
【図3C】１９個の転写因子の強制発現を組み合わせることにより、ＮＫ特異的レポーターが活性化されることを示す。Ｄｏｘ添加から６日後の、Ｍ２ｒｔＴＡのみを用いて形質導入されたＭＥＦＳ（左）、またはＭ２ｒｔＴＡ及び１９個の候補ＴＦすべてを用いて同時形質導入されたＭＥＦＳ（右）の蛍光顕微鏡写真である。６ウェルプレートのウェル全体を自動Ｚｅｉｓｓ ＣＤ７で取得した。すべてのＴＦの複合発現を用いて生成されたｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの６日目における状態を、高倍率で強調表示している。スケールバーは２００μｍである。
【図3D】１９個の転写因子の強制発現を組み合わせることにより、ＮＫ特異的レポーターが活性化されることを示す。３日目から１２日目までのコロニーあたりのｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の数を示す。１３個のコロニーの平均値＋ＳＥＭが示されている。
【図4A】制限されたプールの転写因子を用いた、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの増加数を示す。ＭＥＦを、コントロールＭ２ｒｔＴＡを用いて形質導入するか、またはＴＦのプール（ＴＦプールＡからＤ）を用いて同時形質導入した。ＭＥＦを、コントロールＭ２ｒｔＴＡを用いて形質導入するか、またはＴＦのプール（ＴＦプールＡからＤ）を用いて同時形質導入した。６日目（左）及び１２日目（右）におけるＴＦの組み合わせごとのｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの定量化。２つの独立した実験の平均値＋ＳＤが示されている。ｐ＜０．０５。
【図4B】制限されたプールの転写因子を用いた、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの増加数を示す。ＤＯＸ添加後６日目（上）及び１２日目（下）の、Ｍ２ｒｔＴＡを用いて形質導入されたＭＥＦ（左）、またはＭ２ｒｔＴＡとＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＩＤ２、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳとを用いて同時形質導入されたＭＥＦ（右）の蛍光顕微鏡写真である。
【図5A】ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーが培養中で拡大することを示す。ＤＯＸ添加後６日目（上）及び１２日目（下）の、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＩＤ２、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳを用いた形質導入後のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの蛍光顕微鏡写真。
【図5B】ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーが培養中で拡大することを示す。３日目から１２日目のコロニーあたりのｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の数。１０個のコロニーの平均値＋ＳＥＭが示されている。
【図5C】ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーが培養中で拡大することを示す。フローサイトメトリープロット。
【図5D】ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーが培養中で拡大することを示す。ＤＯＸ添加後１２日目のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の定量化。２つの独立した実験の平均値±標準偏差。
【図6】ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの組み合わせによって向上するリプログラミング効率を示す。ＭＥＦを、コントロールＭ２ｒｔＴＡを用いて形質導入するか、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＩＤ２、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳを用いて同時形質導入するか、またはこの５つのＴＦプールから１つの転写因子を個別に除去した追加の組み合わせを用いて同時形質導入した。（Ａ）免疫蛍光によって定量化されたｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの数及び（Ｂ）リプログラミング１２日目にフローサイトメトリーによって定量化されたｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージ（平均値±標準偏差、ｎ＝２）。
【図7】ＮＣＲ１レポーターを効率的に活性化するために、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳが必要かつ十分であることを示す。ＭＥＦを、対照Ｍ ２ ｒｔＴＡを用いて形質導入するか、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳを用いて同時形質導入するか、または４つのＴＦプールから１つの転写因子が個別に除去された追加の組み合わせを用いて形質導入した。免疫蛍光法で定量化したｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニー数及び（Ｂ）リプログラミング（平均値±標準偏差、ｎ＝２の場合）１２日目にフローサイトメトリーで定量化したｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージ。
【図8】ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現がＮＫ細胞で豊富になることを示す。９６個のマウス組織及び細胞型におけるＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの組み合わせの遺伝子発現濃縮スコア。遺伝子発現データ（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）をログ変換し、各遺伝子について０から１の範囲に正規化した後、ＥＴＳ１＋ＮＦＩＬ３＋ＴＢＥＴ＋ＥＯＭＥＳの最高平均発現を調べた。
【図9A】ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の組み合わせがＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを活性化しないことを示す。本発明の転写因子の組み合わせ（ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳ）を、Ｖｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１１に開示された組み合わせ（ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ及びＪＵＮ）と比較した。ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを活性化する組み合わせの能力を分析した。ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の組み合わせ、またはＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの組み合わせによる形質導入後の、リプログラミングの６日目（左）及び１２日目（右）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性コロニーの数。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入ＭＥＦがコントロールとして含められた。
【図9B】ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の組み合わせがＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを活性化しないことを示す。本発明の転写因子の組み合わせ（ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳ）を、Ｖｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１１に開示された組み合わせ（ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ及びＪＵＮ）と比較した。ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを活性化する組み合わせの能力を分析した。９６個のマウス組織及び細胞型におけるＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、及びＮＦＡＴＣ２の組み合わせの遺伝子発現濃縮スコア。遺伝子発現データ（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）をログ変換し、各遺伝子について０から１の範囲に正規化した後、ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の最高平均発現を調べた。
【図10】ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現により、全体的な遺伝子発現の変化が誘導されることを示す。ＮＣＲ１－ｔｄＴ＋ＭＥＦＳを、リプログラミングの３日目、６日目及び１２日目にＦＡＣＳソートし、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓを用いてシングルセルＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）によってプロファイリングした。形質導入されていないＭＥＦがコントロールとして含められた。３日目、６日目及び１２日目のＭＥＦＳのｔ－ＳＮＥ視覚化、及びリプログラムされた細胞のｔ－ＳＮＥ視覚化（左）。マウスＮＫ特異的マーカーＩｔｇａ２の発現（右）。矢印はリプログラミングの軌跡を示す。
【図11】線維芽細胞関連遺伝子は、ＮＫリプログラミング中にダウンレギュレートされる。３日目、６日目及び１２日目のＭＥＦＳ及びリプログラムされた細胞における線維芽細胞関連遺伝子Ｃｏｌ１ａ２、Ｌｏｘ及びＦｂｎｌ２の遺伝子発現ヒートマップを示すｔ－ＳＮＥプロットを示す。
【図12】ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳ転写因子によって、ナチュラルキラー転写ネットワークが誘導されることを示す。ＭＥＦＳ及びリプログラミングプロセス中の、１９個の候補転写因子（ＴＦ）の内因性発現（左）と、Ｅｔｓ１、Ｎｆｉｌ３、Ｔｂｘ２１（Ｔｂｅｔをコードする）、及びＥＯＭＥＳ（右）の内因性発現とのバイオリンプロットでの定量化。
【図13A】未熟なＮＫ細胞プログラムは、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの強制発現によって指定されることを示す。４つの転写因子を用いた形質導入の３日、６日及び１２日後における、ＮＣＲ１－ｔｄＴ＋ＭＥＦ上の未成熟ＮＫ遺伝子シグネチャ（左）及び成熟ＮＫ遺伝子シグネチャ（右）（Ｂｅｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１２）を示す単細胞トランスクリプトームのｔ－ＳＮＥプロットを示す図である。
【図13B】未熟なＮＫ細胞プログラムは、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの強制発現によって指定されることを示す。ＮＫリプログラミング中の単細胞における未熟ＮＫ遺伝子シグネチャ及び成熟ＮＫ遺伝子シグネチャの発現分布を示す箱ひげ図。
【図13C】未熟なＮＫ細胞プログラムは、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの強制発現によって指定されることを示す。リプログラミング中のＮＫ前駆遺伝子Ｃｄ３８、Ｃｄ３４及びＭｍｅ（ＣＤ１０をコードする）のｔ－ＳＮＥ遺伝子発現ヒートマップ。
【図14】ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳによって、ＮＫケモカイン及びサイトカイン受容体の発現が誘導されることを示す。リプログラミングの３日目、６日目及び１２日目のＭＥＦＳにおける、ｃｃｌ５、Ｉｆｉｈ１及びＩｌ１５ｒａの箱ひげ図における定量化。
【図15】ヒト細胞からＮＫ様細胞を誘導するためのプロトコールの概略図である。ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）を、Ｍ２ｒｔＴＡ（ＵｂＣ－Ｍ２ｒｔＴＡ）及びＥｔｓ１（ｔｅｔＯ－Ｅｔｓ１）、Ｎｆｉｌ３（ｔｅｔＯ－Ｎｆｉｌ３）、ならびにＴｂｅｔ（ｔｅｔＯ－Ｔｂｅｔ）及びＥｏｍｅｓ（ｔｅｔＯ－Ｅｏｍｅｓ）をコードするレンチウイルス粒子を用いて同時形質導入している。あるいは、ＳＦＦＶプロモーター（ＳＦＦＶ－Ｅｔｓ１、ＳＦＦＶ－Ｎｆｉｌ３、ＳＦＦＶ－Ｔｂｅｔ及びＳＦＦＶ－Ｅｏｍｅｓ）を用いた構成的レンチウイルス駆動発現の試験を行った。レンチウイルス粒子と一晩インキュベートした後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。ＦＵＷ－ＴｅｔＯ形質導入細胞の場合、増殖培地にはドキシサイクリン（Ｄｏｘ）が補充された。幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むサイトカインカクテルを、図示するタイミングで培養物に添加した。形質導入の６日後及び１２日後に、ＮＫリプログラミングをフローサイトメトリーによって評価した。
【図16A】ヒト線維芽細胞におけるＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの強制発現により、ＣＤ３４陽性細胞が生成されることを示す。誘導性（ＦＵＷ－ＴｅｔＯ）または構成的（ＳＦＦＶ）レンチウイルスベクターに個別にクローン化された４つの転写因子による形質導入から６日及び１２日後のヒト胎児性線維芽細胞（ＨＥＦ）の代表的なフローサイトメトリープロット。ＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡ及び空ベクター（ＳＦＦＶ－ＭＣＳ）を対照として使用した。
【図16B】ヒト線維芽細胞におけるＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの強制発現により、ＣＤ３４陽性細胞が生成されることを示す。６日目及び１２日目における２つのレンチウイルス発現系で４つのＴＦを用いて誘導されたＣＤ３４＋細胞の定量化（平均値＋標準偏差、ｎ＝２）。
【図17A】サイトカインシグナル伝達、及び転写因子の強制発現により、リプログラミング効率が向上することを示す。サイトカインＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加の有無にかかわらず、４つのＴＦによる形質導入６日後及び１２日後のヒト胎児性線維芽細胞（ＨＥＦ）の代表的なフローサイトメトリープロット。ＳＦＦＶ－ＭＣＳを対照として使用した。
【図17B】サイトカインシグナル伝達、及び転写因子の強制発現により、リプログラミング効率が向上することを示す。サイトカインカクテルの存在下または非存在下で４つのＴＦを用いて誘導されたＣＤ３４＋細胞の定量化（平均値＋標準偏差、ｎ＝２）。
【図18A】ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現により、ヒトＣＤ５６陽性細胞が誘導されることを示す。４つのＴＦを用いた形質導入６日後のヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）の代表的なフローサイトメトリープロット。空のベクター（ＳＦＦＶ－ＭＣＳ）を対照として使用した。
【図18B】ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現により、ヒトＣＤ５６陽性細胞が誘導されることを示す。４つのＴＦを用いて誘導されたＣＤ５６＋細胞の定量化（平均値＋標準偏差、ｎ＝２）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本開示の発明者らは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞運命を誘導することができる多数の転写因子を同定した。発明者らはまた、少なくとも３つの転写因子を使用して細胞をＮＫ細胞にリプログラムする新しい方法を開発した。ＮＫ細胞は、ウイルス感染及びがんを制御する自然リンパ球（ＩＬＣ）の特定のグループを表す。
【0017】
一態様では、本発明は、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＧＡＴＡ３、ＺＦＰ１０５、ＩＫＺＦ３、ＥＴＳ１、ＴＯＸ、ＲＵＮＸ３、ＫＬＦ１２、ＺＥＢ２、ＩＲＦ２、ＳＴＡＴ５、ＩＫＺＦ１、ＥＬＦ４、ＺＢＴＢ１６、ＧＡＴＡ２及びＥＬＦ１からなる群から選択される少なくとも３つの異なる転写因子の組み合わせをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供する。
【0018】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は核酸分子を指し、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、混合ポリマー、組換え核酸、ならびにそれらの断片及びバリアントなどを含む。
【0019】
本明細書で使用する場合、「転写因子」という用語は、転写の活性化または抑制などによって、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は単独で転写の制御に影響を与えるが、他の転写因子は他のタンパク質と協調して作用する。いくつかの転写因子は、特定の条件下で転写を活性化することも抑制することもできる。概して、転写因子は、特定の標的配列を結合するか、または標的遺伝子の調節領域内の特定のコンセンサス配列に非常に類似した配列を結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で制御する場合も、他の分子との複合体で制御する場合もある。
【0020】
別の態様では、本発明は、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳからなる群から選択される少なくとも３つの異なる転写因子の組み合わせをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドに関する。
【0021】
本発明の一実施形態では、少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、４つの転写因子ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳの組み合わせである。
【0022】
本発明の一実施形態では、組み合わせは、ＩＤ２、ＧＡＴＡ３、ＺＦＰ１０５、ＩＫＺＦ３、ＴＯＸ、ＲＵＮＸ３、ＫＬＦ１２、ＺＥＢ２、ＩＲＦ２、ＳＴＡＴ５、ＩＫＺＦ１、ＥＬＦ４、ＺＢＴＢ１６、ＧＡＴＡ２及びＥＬＦ１からなる群から選択される１つ以上をさらに含む。
【0023】
一実施形態では、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、配列番号１から配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、先行請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、配列番号２２から配列番号２７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によって、または前記配列番号２２から配列番号２７のポリヌクレオチド配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0024】
一実施形態では、先行項目のいずれか１つに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの転写因子ＥＴＳ１は、配列番号１のアミノ酸配列、または前記配列番号１のアミノ酸配列の生物学的に活性なバリアントを含む。別の実施形態では、転写因子ＴＢＥＴは、配列番号２のアミノ酸配列、または前記配列番号２のアミノ酸配列の生物学的に活性なバ列番号３のアミノ酸配列の生物学的に活性なバリアントを含む。一実施形態では、転写因子ＥＯＭＥＳは、配列番号４のアミノ酸配列、または前記配列番号４のアミノ酸配列の生物学的に活性なバリアントを含む。一実施形態では、ＥＯＭＥＳの生物学的に活性なバリアントは、配列番号５から配列番号６からなる群から選択される配列を含む。
【0025】
本明細書で使用する場合、「生物学的に活性なバリアント」には、結合特性などの分子と実質的に同じ機能的及び／または生物学的特性、及び／またはペプチドバックボーンもしくは基本的なポリマー単位などの同じ構造基盤を有する当該分子の任意の誘導体またはバリアントが含まれる。それはまた、当業者によって実施される本発明で開示する試験などの試験において、本明細書で開示する転写因子としての機能的特徴を示す分子を指す。この試験により、ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを活性化できる転写因子が同定される場合がある。
【0026】
一実施形態では、配列番号１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２２、または配列番号２２の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である。
【0027】
一実施形態では、配列番号２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、または配列番号２３の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である。
【0028】
一実施形態では、配列番号３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４、または配列番号２４の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である。
【0029】
一実施形態では、配列番号４から配列番号６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、またはその配列番号の配列の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される。
【0030】
別の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳである。
【0031】
別の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ及びＮＦＩＬ３である。
【0032】
別の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳである。
【0033】
別の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳである。
【0034】
別の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子の組み合わせは、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３及びＥＯＭＥＳである。
【0035】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む構築物またはベクターに関する。
【0036】
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の態様が含まれる。したがって、次のものなどがその例である。「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」という表現には、単一のベクターだけでなく２つ以上のベクターも含まれる。「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及には、１つのポリヌクレオチドだけでなく２つ以上のポリヌクレオチドも含まれる。
【0037】
本明細書で使用する「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、細菌、人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、ＤＮＡプラスミドであり得る。
【0038】
一実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レオウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、カリシウイルスベクター、ヘパドナウイルスベクター、トガウイルスベクター、コロナウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター、ブニヤウイルスベクター及びフィロウイルスベクターからなる群から選択される。
【0039】
本明細書に記載される「レンチウイルスベクター」または「レンチウイルスファミリーのメンバー」は、レンチウイルス由来のウイルスゲノムを含み、自己更新能力を欠き、核酸分子を宿主に導入する能力を有するウイルス粒子である。具体的には、これらのベクターはレンチウイルスバックボーンを有する。「レンチウイルスバックボーンを有する」というフレーズは、ベクターを構成するウイルス粒子に含まれる核酸分子がレンチウイルスゲノムに基づくことを意味する。
【0040】
一実施形態では、ベクターは腫瘍溶解性ベクターである。腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書においては、概して、正常細胞を殺すよりも腫瘍細胞またはがん細胞を殺す頻度が高いウイルスを指すと定義される。
【0041】
一実施形態では、構築物またはベクターは、合成ｍＲＮＡ、裸のアルファウイルスＲＮＡレプリコン、または裸のフラビウイルスＲＮＡレプリコンである。
【0042】
一実施形態では、構築物またはベクターはプラスミドである。「プラスミド」という用語は、本明細書では「プラスミドＤＮＡ」という用語と同義で使用され、様々なプラスミド形態、すなわち、ニック付きプラスミドＤＮＡ及びスーパーコイル（ｃｃｃ）プラスミドＤＮＡとしても知られる開環状（ｏｃ）プラスミドＤＮＡを包含する。
【0043】
一実施形態では、ベクターは、翻訳後調節要素（ＰＲＥ）配列をさらに含む。一実施形態では、ＰＲＥ配列は、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）からなる群から選択される。
【0044】
一実施形態では、ベクターは、構築物または他のベクター遺伝要素の調節、発現、安定化のための他の核酸要素、例えば、当業者に既知の、プロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、リボソーム結合部位、ＩＲＥＳをさらに含み得る。
【0045】
一実施形態では、ベクターは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み得る。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能することも、ｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして機能することもあり得る。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含むｍＲＮＡは、リボソーム（「マルチシストロン性ｍＲＮＡ」）によって独立して翻訳される、本明細書に記載のＮＫ誘導因子などのいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。核酸にＩＲＥＳが提供される場合、さらに任意で第２の翻訳可能領域が提供される。本開示に従って使用し得るＩＲＥＳ配列の例としては、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、害虫ウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する配列、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＷ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0046】
一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドの転写を制御するプロモーター配列をさらに含む。一実施形態では、プロモーター配列は、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ＭＮＤＵ３）を含む修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ユビキチンＣプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターからなる群から選択される。
【0047】
一実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＦコード領域（ｐＦＵＷーＴｅｔＯ）の発現を制御する、テトラサイクリン応答要素（ＴＲＥ）及び最小ＣＭＶプロモーターを含む。このベクターは、構成的に活性なヒトユビキチンＣプロモーター（ＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡ）の制御下にある逆テトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）を含むベクターと組み合わせて使用してもよい。
【0048】
一実施形態では、ベクターは、構成的に活性なＰＧＫプロモーターの制御下でｒｔＴＡトランスアクチベーターと同じ構築物中のＴＦコード領域の発現を制御するテトラサイクリン応答要素（ＴＲＥ）を含む。
【0049】
一実施形態では、構築物またはベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ活性化システムである。当業者であれば、このシステムが内因性転写因子を活性化することができ、転写因子を含まないプラスミドの使用を可能にすることを理解するであろう。
【0050】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
【0051】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
【0052】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
【0053】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
【0054】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
【0055】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
【0056】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
【0057】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
【0058】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
【0059】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
【0060】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
【0061】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
【0062】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
【0063】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
【0064】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
【0065】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
【0066】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
【0067】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
【0068】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
【0069】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
【0070】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
【0071】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
【0072】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
【0073】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
【0074】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
【0075】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
【0076】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
【0077】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
【0078】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
【0079】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
【0080】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
【0081】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
【0082】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＢＥＴ。
【0083】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
【0084】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
【0085】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＥＴＳ１。
【0086】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
【0087】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ。
【0088】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３。
【0089】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
ＥＴＳ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
【0090】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＥＴＳ１。
【0091】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＥＴＳ１。
【0092】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ。
【0093】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ。
【0094】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ、ＮＦＩＬ３。
【0095】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
ＴＢＥＴ、ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３。
【0096】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ、ＴＢＥＴ。
【0097】
一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドの少なくとも３つの転写因子は、５’から３’への次の順序である：
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
ＥＯＭＥＳ、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ。
【0098】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び／また構築物もしくはベクターを含む細胞を提供する。
【0099】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、構築物もしくはベクター、及び／または細胞を含む医薬組成物に関する。一実施形態では、医薬組成物は、適切な担体をさらに含む。これらの組成物は、安全かつ効果的であると考えられる材料から構成される薬学的に許容される担体を使用して調製してもよく、望ましくない生物学的副作用または望ましくない相互作用を引き起こすことなく個体に投与することができる。担体は、活性成分（複数可）以外の医薬製剤中に存在するすべての成分である。本明細書で概して使用する「担体」には、可塑剤、結晶化阻害剤、湿潤剤、バルク充填剤、可溶化剤、バイオアベイラビリティー増強剤、溶媒、ｐＨ調整剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0100】
一態様では、本発明は、任意の細胞をナチュラルキラー細胞または前駆細胞にリプログラムまたは誘導するための方法を提供し、この方法は、
ａ．本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または構築物もしくはベクターを細胞に形質導入することと、
ｂ．形質導入された細胞を細胞培地中で培養及び増殖させることと、
ｃ．リプログラムされた細胞を得ることとのステップを含む。
ａ．本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または構築物もしくはベクターを細胞に形質導入することと、
ｂ．形質導入された細胞を細胞培地中で培養及び増殖させることと、
ｃ．リプログラムされた細胞を得ることとのステップを含む。
【0101】
一実施形態では、誘導前駆細胞またはリプログラムされた前駆細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ３８陽性、及び／またはＣＤ１０陽性である。当業者であれば、これらが未熟細胞マーカーであることを理解するであろう。本発明のリプログラムされた細胞は、培養中で前駆細胞から成熟細胞に移行してもよい。当業者であれば、これにより培養中での拡大が容易になることが理解されるであろう。成熟細胞状態は、ＣＤ３４及びＣＤ１０の発現の欠如、ならびにＣＤ８、ＣＤ３８及びＤＸ５（ＩＴＧＡ２遺伝子によってコードされる）の発現によって特徴付けられてもよい。
【0102】
本明細書で使用する場合、「＋」、「＋」及び「陽性」は同義で使用する。
【0103】
一実施形態では、この方法は、１つ以上のサイトカインを含む培地中で形質導入された細胞を培養することをさらに含む。別の実施形態では、１つ以上のサイトカインは、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－７及びＩＬ－１５からなる群から選択される。
【0104】
本発明の一実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、幹細胞、分化細胞、がん細胞または腫瘍細胞からなる群から選択される。
【0105】
一実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞、多能性幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択される。
【0106】
本発明のいくつかの実施形態では、体細胞は線維芽細胞である。
【0107】
本質的に任意の初代体細胞型は、本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、細胞及び方法に従って、誘導ＮＫ細胞を産生するか、または体細胞を誘導ＮＫ細胞にリプログラムするために使用し得る。本明細書に記載される方法の様々な態様及び実施形態において有用な初代体細胞のいくつかの非限定的な例には、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、心細胞、骨格筋細胞、造血細胞または免疫細胞、肝細胞、脾臓細胞、肺細胞、循環血球、胃腸細胞、腎細胞、骨髄細胞、膵臓細胞、ならびにそれらの細胞が由来する幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、脾臓、骨髄、血液、脳、肝臓、肺、腸、胃、小腸、脂肪、筋肉、子宮、皮膚、脾臓、内分泌器官及び骨を含むがこれらに限定されない任意の体細胞組織から単離された初代細胞であり得る。「体細胞」という用語は、いくつかの実施形態では、体細胞が不死化されていないという条件で、培養中で増殖した初代細胞をさらに包含する。細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で維持される場合、従来の組織培養条件及び方法を使用することができ、これらの条件及び方法は当業者に知られている。様々な初代体細胞の単離方法及び培養方法は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【0108】
いくつかの実施形態では、体細胞は造血系統細胞であり得る。
【0109】
本発明のいくつかの実施形態では、リプログラムされるか、または誘導ＮＫ細胞にされる体細胞は、造血起源の細胞である。本明細書で使用する場合、「造血由来細胞」、「造血由来分化細胞」、「造血系統細胞」及び「造血起源の細胞」という用語は、多分化能性造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する細胞、または多分化能性造血幹細胞（ＨＳＣ）から分化した細胞を指す。したがって、本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、細胞及び方法とともに使用するための造血系統細胞は、多能性造血前駆細胞、少能性造血前駆細胞、系統制限された造血前駆細胞、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞及びリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を運ぶＴリンパ球、免疫グロブリンを発現して抗体、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞を産生するＢリンパ球またはＢ細胞、及び自然リンパ球）を含む。本明細書で使用する場合、「造血前駆細胞」という用語は、顆粒球、単球、赤血球、巨核球、リンパ球Ｂ細胞及びＴ細胞を含むがこれらに限定されない、造血システムの２つ以上の細胞型に分化可能な多能性造血細胞、少能性造血細胞、及び系統制限された造血細胞を指す。造血前駆細胞は、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、骨髄性共通前駆細胞（ＣＭＰ）、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）、顆粒球－単球前駆細胞（ＧＭＰ）、及び前巨核球－赤血球前駆細胞を包含する。系統限定造血前駆細胞は、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、ＰｒｏＢ細胞、ＰｒｅＢ細胞、ＰｒｅＰｒｏＢ細胞、ＰｒｏＴ細胞、ダブルネガティブＴ細胞、プロＮＫ細胞、前顆粒球／マクロファージ細胞、顆粒球／マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞、及びプロマスト細胞（ＰｒｏＭＣ）を含む。
【0110】
本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、細胞及び方法で使用するための造血起源の細胞は、胎児組織、臍帯血、骨髄、末梢血、動員末梢血、脾臓、肝臓、胸腺、リンパなど、これらの細胞を含むことが知られている任意の供給源から得てもよい。これらの供給源から得られた細胞は、組成物、構築物、ベクター、細胞及び誘導ＮＫを作製するための方法とともに使用する前に、当業者に許容される任意の方法を使用してｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ得る。例えば、細胞は、当業者に許容される任意の手順を使用して、選別、分画、特定の細胞型を除去する処理、またはその他の方法で操作して、本明細書に記載の方法で使用するための細胞の集団を得ることができる。
【0111】
本発明の一実施形態では、形質導入細胞は、少なくとも２日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも８日間、例えば少なくとも１０日間、例えば少なくとも１２日間培養される。
【0112】
本発明の一実施形態では、リプログラムされた細胞はＮＣＲ１陽性である。
【0113】
本発明の一実施形態では、リプログラムされた細胞はＣＤ３４陽性である。
【0114】
本発明の一実施形態では、リプログラムされた細胞はＣＤ５６陽性である。
【0115】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られる誘導ナチュラルキラー細胞または前駆細胞を提供する。
【0116】
本発明の一実施形態では、細胞、リプログラムされた細胞及び／または誘導細胞は、ＮＣＲ１陽性である。本発明の別の実施形態では、細胞、リプログラムされた細胞及び／または誘導細胞は、ＣＤ３４陽性である。本発明の別の実施形態では、細胞、リプログラムされた細胞及び／または誘導細胞は、ＣＤ５６陽性である。
【0117】
一実施形態では、本発明は、医療で使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、構築物もしくはベクター、細胞、及び／または誘導ナチュラルキラー細胞に関する。
【0118】
一実施形態では、本発明は、がん治療で使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、構築物もしくはベクター、細胞、及び／または誘導ナチュラルキラー細胞に関する。
【0119】
一実施形態では、本発明は、免疫療法で使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、構築物もしくはベクター、細胞、及び／または誘導ナチュラルキラー細胞に関する。
【0120】
【実施例】
【0121】
例１．ＮＫ細胞リプログラミングのための候補転写因子の同定
方法
ＮＫ細胞の同一性を同定、及び細胞傷害性自然リンパ球としての機能を誘導する候補転写因子（ＴＦ）を同定するために、我々は次の３つの相補的なアプローチを使用した：（ｉ）開発された予測計算ツールＧＰＳＭａｔｃｈ、（ｉｉ）文献マイニング、（ｉｉｉ）利用可能な遺伝子発現データセットの分析（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）。
方法
ＮＫ細胞の同一性を同定、及び細胞傷害性自然リンパ球としての機能を誘導する候補転写因子（ＴＦ）を同定するために、我々は次の３つの相補的なアプローチを使用した：（ｉ）開発された予測計算ツールＧＰＳＭａｔｃｈ、（ｉｉ）文献マイニング、（ｉｉｉ）利用可能な遺伝子発現データセットの分析（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）。
【0122】
結果
我々は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球などの他の組織や細胞型と比較して、ＮＫ細胞で豊富になる１９個のＮＫ誘導候補ＴＦを同定した（図２）。
我々は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球などの他の組織や細胞型と比較して、ＮＫ細胞で豊富になる１９個のＮＫ誘導候補ＴＦを同定した（図２）。
【0123】
結論
他の細胞型におけるＮＫ細胞の同一性を指示する１９個の候補ＴＦが同定された。
他の細胞型におけるＮＫ細胞の同一性を指示する１９個の候補ＴＦが同定された。
【0124】
例２．ＮＫ誘導転写因子のスクリーニング
方法
ＮＫ誘導因子をスクリーニングするために、ＮＫ特異的レポーターシステム（Ｎｃｒ１－ＣｒｅＸ Ｒ２６－ｓｔｏｐ－ｔｄＴマウス、以下ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏと呼ぶ）を保有するマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の初代培養で１９個の候補ＴＦを発現させた（図３Ａ）。ＮＣＲ１は、ＮＫ細胞系統で特異的に発現する（図３Ｂ）。
方法
ＮＫ誘導因子をスクリーニングするために、ＮＫ特異的レポーターシステム（Ｎｃｒ１－ＣｒｅＸ Ｒ２６－ｓｔｏｐ－ｔｄＴマウス、以下ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏと呼ぶ）を保有するマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の初代培養で１９個の候補ＴＦを発現させた（図３Ａ）。ＮＣＲ１は、ＮＫ細胞系統で特異的に発現する（図３Ｂ）。
【0125】
ＭＥＦの単離
Ｎｃｒ１Ｃｒｅ／Ｃｒｅ（Ｅｃｋｅｌｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、２０１１）動物をＲｏｓａ２６－ｓｔｏｐｆｌｏｘ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスと交配して、二重ホモ接合性Ｎｃｒ１Ｃｒｅ／ＣｒｅＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ）マウスを生成した。すべての動物は、制御された温度（２３±２°Ｃ）下で飼育され、１２時間の明暗サイクルが固定され、餌と水は自由に摂取できるようにされた。
Ｎｃｒ１Ｃｒｅ／Ｃｒｅ（Ｅｃｋｅｌｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、２０１１）動物をＲｏｓａ２６－ｓｔｏｐｆｌｏｘ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスと交配して、二重ホモ接合性Ｎｃｒ１Ｃｒｅ／ＣｒｅＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ）マウスを生成した。すべての動物は、制御された温度（２３±２°Ｃ）下で飼育され、１２時間の明暗サイクルが固定され、餌と水は自由に摂取できるようにされた。
【0126】
ＭＥＦの初代培養は、Ｎｃｒ１－ｃｒｅマウスのＥ１３．５胚から単離された。頭部、胎児肝臓、及びすべての内臓が除去され、残りの組織が機械的に解離された。解剖した組織を、０．１２％トリプシン／０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の溶液（胚あたり３ｍＬ）を使用して酵素消化し、３７℃で１５分間インキュベートした。同じ溶液を胚あたり３ｍＬさらに添加し、その後さらに１５分間インキュベートした。シングルセル懸濁液を得て、増殖培地中の０．１％ゼラチンでコーティングされた１０ｃｍ組織培養皿に播種した。細胞をコンフルエントになるまで２日から３日間増殖させ、Ｔｒｙｐｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離させ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で凍結させた。レンチウイルス形質導入のためにプレーティングする前に、ＭＥＦを選別して、造血能を有する細胞を表す可能性のある残留ＣＤ４５＋及びｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を除去した。スクリーニング及び次の実験に使用したＭＥＦは、純度が９９％より高いｔｄＴｏｍａｔｏ－ ＣＤ４５－で、最大４継代まで増殖させた。
【0127】
形質導入
レンチウイルス形質導入のためにプレーティングする前に、ＭＥＦを選別して、造血能を有する細胞を表す可能性のある残留ＣＤ４５＋及びｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を除去した。ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを増殖培地［１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭＬ－グルタミン及び抗生物質（１０μｇ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）］で維持した。すべての細胞を３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で維持した。ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを、０．１％ゼラチンでコーティングした６ウェルプレートに、ウェルあたり４０，０００個の細胞の密度で播種した。細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレンを補充した増殖培地中で、１：１の比率のＦＵＷ－ＴｅｔＯ－ＴＦ及びＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルス粒子を一晩インキュベートした。細胞を連続した日において２回形質導入し、一晩インキュベートした後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。２回目の形質導入後、増殖培地にドキシサイクリン（１μｇ／ｍＬ）を補充し、これを０日目とした。培養期間中、培地は２日から３日ごとに交換した。出現したｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、形質導入後の３日目から１２日目の間、顕微鏡で分析した。６ウェルプレートのウェル全体を自動Ｚｅｉｓｓ ＣＤ７で取得した。フローサイトメトリー分析では、形質導入されたＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離し、ＰＢＳ５％のＦＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析前に４℃に維持した。
レンチウイルス形質導入のためにプレーティングする前に、ＭＥＦを選別して、造血能を有する細胞を表す可能性のある残留ＣＤ４５＋及びｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を除去した。ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを増殖培地［１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭＬ－グルタミン及び抗生物質（１０μｇ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）］で維持した。すべての細胞を３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で維持した。ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを、０．１％ゼラチンでコーティングした６ウェルプレートに、ウェルあたり４０，０００個の細胞の密度で播種した。細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレンを補充した増殖培地中で、１：１の比率のＦＵＷ－ＴｅｔＯ－ＴＦ及びＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルス粒子を一晩インキュベートした。細胞を連続した日において２回形質導入し、一晩インキュベートした後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。２回目の形質導入後、増殖培地にドキシサイクリン（１μｇ／ｍＬ）を補充し、これを０日目とした。培養期間中、培地は２日から３日ごとに交換した。出現したｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を、形質導入後の３日目から１２日目の間、顕微鏡で分析した。６ウェルプレートのウェル全体を自動Ｚｅｉｓｓ ＣＤ７で取得した。フローサイトメトリー分析では、形質導入されたＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離し、ＰＢＳ５％のＦＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析前に４℃に維持した。
【0128】
結果
１９個の候補ＴＦがすべて発現すると、３日目から６日目の間に非同期的に出現し、培養中で増殖するｔｄＴｏｍａｔｏ陽性（ｔｄＴ＋）コロニーが誘導される（図３Ｃ及び図３Ｄ）。ｔｄＴ＋コロニーの数は、特にＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＩＤ２、ＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴで構成される５つの候補ＴＦの組み合わせで、より小さい転写因子プールの過剰発現後に増加した（図４）。この５つのＴＦのプールによって誘導されたｔｄＴ＋コロニーは、リプログラミングの３日目から１２日目の間培養中で増殖を続ける（図５）。さらに、このＴＦプールは６％のｔｄＴ＋細胞を誘導し、ＮＣＲ１－ｔｄＴ活性化を誘導するために必要な最小限の組み合わせがこのプール内に含まれていることを示唆している（図５Ｃ及び図５Ｄ）。最小の組み合わせを定義するために、我々は、この５つのＴＦのプールから１つのＴＦを個別に除去し、ＩＤ２がリプログラミングプロセスに不要であることを示した。発見された４つのＴＦの組み合わせは、ｔｄＴ＋コロニーの数を増加させ（図６Ａ）、リプログラミングの１２日目に約２０％のｔｄＴ＋細胞を誘導する（図６Ｂ）。別のラウンドのＴＦ排除を実施したところ、３つのＴＦの組み合わせが、対照と比較してｔｄＴ＋コロニーの数及びｔｄＴ＋細胞の割合を増加させるのに十分であることが示された。
１９個の候補ＴＦがすべて発現すると、３日目から６日目の間に非同期的に出現し、培養中で増殖するｔｄＴｏｍａｔｏ陽性（ｔｄＴ＋）コロニーが誘導される（図３Ｃ及び図３Ｄ）。ｔｄＴ＋コロニーの数は、特にＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＩＤ２、ＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴで構成される５つの候補ＴＦの組み合わせで、より小さい転写因子プールの過剰発現後に増加した（図４）。この５つのＴＦのプールによって誘導されたｔｄＴ＋コロニーは、リプログラミングの３日目から１２日目の間培養中で増殖を続ける（図５）。さらに、このＴＦプールは６％のｔｄＴ＋細胞を誘導し、ＮＣＲ１－ｔｄＴ活性化を誘導するために必要な最小限の組み合わせがこのプール内に含まれていることを示唆している（図５Ｃ及び図５Ｄ）。最小の組み合わせを定義するために、我々は、この５つのＴＦのプールから１つのＴＦを個別に除去し、ＩＤ２がリプログラミングプロセスに不要であることを示した。発見された４つのＴＦの組み合わせは、ｔｄＴ＋コロニーの数を増加させ（図６Ａ）、リプログラミングの１２日目に約２０％のｔｄＴ＋細胞を誘導する（図６Ｂ）。別のラウンドのＴＦ排除を実施したところ、３つのＴＦの組み合わせが、対照と比較してｔｄＴ＋コロニーの数及びｔｄＴ＋細胞の割合を増加させるのに十分であることが示された。
【0129】
結論
ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを使用したスクリーニングにより、ＮＫ－ＴＦインストラクターの同定が可能になる。これらの結果は、ＮＣＲ１レポーターを活性化し、増殖可能なＮＣＲ１陽性コロニーを誘導するには、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴから選択される３つのＴＦの組み合わせが必要かつ十分であることを示した。４つのＴＦ（ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳ）の組み合わせにより、ＮＣＲ１レポーターの最大の増加が得られた。ＮＫリプログラミングは速く（３日目から始まり）、効率的である（１２日目までに約２０％）。
ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを使用したスクリーニングにより、ＮＫ－ＴＦインストラクターの同定が可能になる。これらの結果は、ＮＣＲ１レポーターを活性化し、増殖可能なＮＣＲ１陽性コロニーを誘導するには、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＥＯＭＥＳ及びＴＢＥＴから選択される３つのＴＦの組み合わせが必要かつ十分であることを示した。４つのＴＦ（ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳ）の組み合わせにより、ＮＣＲ１レポーターの最大の増加が得られた。ＮＫリプログラミングは速く（３日目から始まり）、効率的である（１２日目までに約２０％）。
【0130】
例３．ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳはＮＫ細胞で豊富になる
方法
遺伝子発現データ（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）をログ変換し、各遺伝子について０から１の範囲に正規化した後、ＥＴＳ１＋ＮＦＩＬ３＋ＴＢＥＴ＋ＥＯＭＥＳの最高平均発現を調べた。
方法
遺伝子発現データ（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）をログ変換し、各遺伝子について０から１の範囲に正規化した後、ＥＴＳ１＋ＮＦＩＬ３＋ＴＢＥＴ＋ＥＯＭＥＳの最高平均発現を調べた。
【0131】
結果
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現は、ＮＫ細胞と関連性が非常に高かった（図８）。
ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現は、ＮＫ細胞と関連性が非常に高かった（図８）。
【0132】
結論
これらの結果によって、ＮＫ細胞の同一性を誘導する組み合わせとしてＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳが同定されたことが検証された。
これらの結果によって、ＮＫ細胞の同一性を誘導する組み合わせとしてＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳが同定されたことが検証された。
【0133】
例４．ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の組み合わせは、ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを活性化しない。
方法
ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを用いたスクリーニングは例２で説明したように実施し、遺伝子発現データは例３で説明したように分析した。
方法
ＮＣＲ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを用いたスクリーニングは例２で説明したように実施し、遺伝子発現データは例３で説明したように分析した。
【0134】
結果
ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の発現は、リプログラミングの６日目または１２日目ではＮＣＲ１レポーターを活性化しない（図９Ａ）。さらに、遺伝子発現分析によって、ＲＯＲα＋ＳＭＡＤ７＋ＦＯＳ＋ＪＵＮ＋ＮＦＡＴＣ２の複合発現が、他の組織及び細胞型の中でもＮＫ細胞で豊富にならないことが示された（図９Ｂ）。
ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の発現は、リプログラミングの６日目または１２日目ではＮＣＲ１レポーターを活性化しない（図９Ａ）。さらに、遺伝子発現分析によって、ＲＯＲα＋ＳＭＡＤ７＋ＦＯＳ＋ＪＵＮ＋ＮＦＡＴＣ２の複合発現が、他の組織及び細胞型の中でもＮＫ細胞で豊富にならないことが示された（図９Ｂ）。
【0135】
結論
これらの結果は、ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２がＮＫ細胞で豊富にはならず、ＮＣＲ１レポーターを活性化しないことを示している。
これらの結果は、ＲＯＲα、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２がＮＫ細胞で豊富にはならず、ＮＣＲ１レポーターを活性化しないことを示している。
【0136】
例５．ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳはＮＫ細胞系統に対する全体的な転写変化を誘導する
方法
未形質導入のＭＥＦ、ならびにＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳを用いて形質導入されたＭＥＦをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して解離し、５％ＰＢＳに再懸濁し、３日目（ｔｄＴ＋）、６日目（ｔｄＴ＋）、及び１２日目（ｔｄＴ＋）にＦＡＣＳでソートした。精製ＭＥＦ（細胞５０００個）、ｔｄＴ＋ｄ３（細胞５０００個）、ｔｄＴ＋ｄ６（細胞５０００個）、ｔｄＴ＋ｄ１２（細胞５０００個）を、製造業者のプロトコールに従って１０×Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）にロードした。シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーは、製造業者のプロトコールに従ってＣｈｒｏｍｉｕｍシングルセル３′ｖ３．１試薬キット（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して調製した。単細胞を、１０倍の固有の分子識別子（ＵＭＩ）及びポリ（ｄＴ）配列を有する固有のプライマーでコーティングされたゲルビーズとともに液滴に単離した。逆転写反応を実行して、バーコード化された完全長ｃＤＮＡを生成した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍシングルセル３′ｖ３．１試薬キット（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）の試薬を使用して、インデックス付きシーケンシングライブラリーを構築した。ライブラリーの定量化及び品質評価は、Ｑｕｂｉｔ及びＡｇｉｌａｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用して決定された。インデックス付きライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００ Ｓ２ １００ ＦｌｏｗＣｅｌｌ ｖ１で配列決定された。ｔｄＴ＋の３日目、６日目及び１２日目のサンプルでは１単細胞あたり約１００，０００リードのカバレッジが得られ、ＭＥＦＳサンプルでは１単細胞あたり２５，０００リードのカバレッジが得られた。
方法
未形質導入のＭＥＦ、ならびにＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳを用いて形質導入されたＭＥＦをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して解離し、５％ＰＢＳに再懸濁し、３日目（ｔｄＴ＋）、６日目（ｔｄＴ＋）、及び１２日目（ｔｄＴ＋）にＦＡＣＳでソートした。精製ＭＥＦ（細胞５０００個）、ｔｄＴ＋ｄ３（細胞５０００個）、ｔｄＴ＋ｄ６（細胞５０００個）、ｔｄＴ＋ｄ１２（細胞５０００個）を、製造業者のプロトコールに従って１０×Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）にロードした。シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーは、製造業者のプロトコールに従ってＣｈｒｏｍｉｕｍシングルセル３′ｖ３．１試薬キット（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して調製した。単細胞を、１０倍の固有の分子識別子（ＵＭＩ）及びポリ（ｄＴ）配列を有する固有のプライマーでコーティングされたゲルビーズとともに液滴に単離した。逆転写反応を実行して、バーコード化された完全長ｃＤＮＡを生成した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍシングルセル３′ｖ３．１試薬キット（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）の試薬を使用して、インデックス付きシーケンシングライブラリーを構築した。ライブラリーの定量化及び品質評価は、Ｑｕｂｉｔ及びＡｇｉｌａｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用して決定された。インデックス付きライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００ Ｓ２ １００ ＦｌｏｗＣｅｌｌ ｖ１で配列決定された。ｔｄＴ＋の３日目、６日目及び１２日目のサンプルでは１単細胞あたり約１００，０００リードのカバレッジが得られ、ＭＥＦＳサンプルでは１単細胞あたり２５，０００リードのカバレッジが得られた。
【0137】
結果
４つのＴＦがＭＥＦＳでＮＫ細胞の同一性を誘導しているかどうかを判断するために、リプログラミングの３日目、６日目及び１２日目のｔｄＴ＋細胞を１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを使用したシングルセルＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）によってプロファイリングした。ＴｄＴ＋細胞は、全体的な転写変化を示すことが、早ければ３日目に始まり、線維芽細胞特異的遺伝子がサイレンシングされる６日目及び１２日目に徐々に増加した（図１０Ａ及び図１１）。１２日目には、Ｉｔｇａ２などの成熟ＮＫ遺伝子も検出された（図１０Ｂ）。４つのＴＦの複合発現は、ＮＫ様転写ネットワークを課し、３日目にＮＫに特異的な１９個の候補ＴＦの発現を誘導し、リプログラミングの１２日目まで徐々に増加した（図１２）。Ｅｔｓ１、Ｎｆｉｌ３、Ｔｂｘ２１（Ｔｂｅｔをコードする）及びＥＯＭＥＳの内因性発現もリプログラミング中に活性化された。さらに、ｓｃＲＮＡーｓｅｑ分析により、４つのＴＦがＮＫ細胞前駆細胞の同一性に向けた全体的なトランスクリプトームリプログラミングを誘発し、ＣＤ３８、ＣＤ３４及びＭＭＥ（ＣＤ１０をコードする）などのＮＫ前駆細胞遺伝子のアップレギュレーションを誘導することが明らかになった（図１３Ｃ）。４つのＴＦで生成された誘導ＮＫ細胞は、リプログラミングの初期段階から未熟なＮＫ細胞の特徴で非常に豊富になった（Ｂｅｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。したがって、成熟ＮＫ遺伝子発現サインは、後のリプログラミング段階で徐々に増加する（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。重要なこととしては、我々は、ｃｃｌ５、Ｉｆｉｈ１及びＩｌ１５ｒａなどのＮＫ機能に関連する遺伝子の発現増加を検出した（図１４）。
４つのＴＦがＭＥＦＳでＮＫ細胞の同一性を誘導しているかどうかを判断するために、リプログラミングの３日目、６日目及び１２日目のｔｄＴ＋細胞を１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを使用したシングルセルＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）によってプロファイリングした。ＴｄＴ＋細胞は、全体的な転写変化を示すことが、早ければ３日目に始まり、線維芽細胞特異的遺伝子がサイレンシングされる６日目及び１２日目に徐々に増加した（図１０Ａ及び図１１）。１２日目には、Ｉｔｇａ２などの成熟ＮＫ遺伝子も検出された（図１０Ｂ）。４つのＴＦの複合発現は、ＮＫ様転写ネットワークを課し、３日目にＮＫに特異的な１９個の候補ＴＦの発現を誘導し、リプログラミングの１２日目まで徐々に増加した（図１２）。Ｅｔｓ１、Ｎｆｉｌ３、Ｔｂｘ２１（Ｔｂｅｔをコードする）及びＥＯＭＥＳの内因性発現もリプログラミング中に活性化された。さらに、ｓｃＲＮＡーｓｅｑ分析により、４つのＴＦがＮＫ細胞前駆細胞の同一性に向けた全体的なトランスクリプトームリプログラミングを誘発し、ＣＤ３８、ＣＤ３４及びＭＭＥ（ＣＤ１０をコードする）などのＮＫ前駆細胞遺伝子のアップレギュレーションを誘導することが明らかになった（図１３Ｃ）。４つのＴＦで生成された誘導ＮＫ細胞は、リプログラミングの初期段階から未熟なＮＫ細胞の特徴で非常に豊富になった（Ｂｅｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。したがって、成熟ＮＫ遺伝子発現サインは、後のリプログラミング段階で徐々に増加する（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。重要なこととしては、我々は、ｃｃｌ５、Ｉｆｉｈ１及びＩｌ１５ｒａなどのＮＫ機能に関連する遺伝子の発現増加を検出した（図１４）。
【0138】
結論
これらのデータは、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳがＮＫ細胞系統への線維芽細胞のリプログラミングを指示し、前駆細胞ＮＫの同一性を課すことを実証した。
これらのデータは、ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳがＮＫ細胞系統への線維芽細胞のリプログラミングを指示し、前駆細胞ＮＫの同一性を課すことを実証した。
【0139】
例６．ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの強制発現により、ヒトＣＤ３４及びＣＤ５６陽性細胞が生成される
方法
ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）を、０．１％ゼラチンでコーティングした６ウェルプレートに１ウェルあたり３０，０００細胞の密度で播種した。細胞を、１：１の比率のＦＵＷ－ＴｅｔＯ－ＴＦ及びＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルス粒子で一晩インキュベートした。あるいは、細胞を、同じ感染多重度（ＭＯＩ）でＳＦＦＶ－ＭＣＳまたはＳＦＦＶ－ＴＦのレンチウイルス粒子とともにインキュベートした。レンチウイルス粒子を、８μｇ／ｍＬのポリブレンを補充した増殖培地に添加した。一晩インキュベートした後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。ＦＵＷ－ＴｅｔＯ形質導入細胞には、増殖培地にドキシサイクリン （１μｇ／ｍＬ） を添加した。培養期間中、培地を２日から３日ごとに交換した。幹細胞因子（ＳＣＦ）（１０μｇ／ｍＬ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）（１０μｇ／ｍＬ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）（５μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５μｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１５－（１０μｇ／ｍＬ）を含むサイトカインカクテルを、指示に応じて培養に添加した。ＮＫリプログラミングを、形質導入の６日後及び１２日後にフローサイトメトリーによって評価した （図１５） 。フローサイトメトリーでは、形質導入されたＨＥＦをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離し、ＰＢＳ５％のＦＢＳに再懸濁し、マウス抗ヒトＣＤ３４抗体または抗ヒトＣＤ５６で染色した。非特異的な抗体結合を防ぐために、１％のマウス血清を使用した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析前に４℃に保たれた。
方法
ヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）を、０．１％ゼラチンでコーティングした６ウェルプレートに１ウェルあたり３０，０００細胞の密度で播種した。細胞を、１：１の比率のＦＵＷ－ＴｅｔＯ－ＴＦ及びＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルス粒子で一晩インキュベートした。あるいは、細胞を、同じ感染多重度（ＭＯＩ）でＳＦＦＶ－ＭＣＳまたはＳＦＦＶ－ＴＦのレンチウイルス粒子とともにインキュベートした。レンチウイルス粒子を、８μｇ／ｍＬのポリブレンを補充した増殖培地に添加した。一晩インキュベートした後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。ＦＵＷ－ＴｅｔＯ形質導入細胞には、増殖培地にドキシサイクリン （１μｇ／ｍＬ） を添加した。培養期間中、培地を２日から３日ごとに交換した。幹細胞因子（ＳＣＦ）（１０μｇ／ｍＬ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）（１０μｇ／ｍＬ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）（５μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５μｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１５－（１０μｇ／ｍＬ）を含むサイトカインカクテルを、指示に応じて培養に添加した。ＮＫリプログラミングを、形質導入の６日後及び１２日後にフローサイトメトリーによって評価した （図１５） 。フローサイトメトリーでは、形質導入されたＨＥＦをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離し、ＰＢＳ５％のＦＢＳに再懸濁し、マウス抗ヒトＣＤ３４抗体または抗ヒトＣＤ５６で染色した。非特異的な抗体結合を防ぐために、１％のマウス血清を使用した。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析前に４℃に保たれた。
【0140】
結果
ｐＳＦＦＶに個別にクローニングされたＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現は、リプログラミングの６日目及び１２日目にヒトＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）細胞の稀な集団を誘導した（図１６）。ＣＤ３４＋細胞は、空ベクター（ＭＣＳ）コントロールでは観察されなかった。ＮＫ分化及び活性化サイトカインカクテルの存在下での培養は、リプログラミング効率を６日目で１．５倍、１２日目で約２倍増加させた（図１７）。さらに、４つのＴＦの複合発現は、形質導入の６日後にヒトＣＤ５６陽性（ＣＤ５６＋）細胞を誘導した（図１８）。
ｐＳＦＦＶに個別にクローニングされたＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳの複合発現は、リプログラミングの６日目及び１２日目にヒトＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）細胞の稀な集団を誘導した（図１６）。ＣＤ３４＋細胞は、空ベクター（ＭＣＳ）コントロールでは観察されなかった。ＮＫ分化及び活性化サイトカインカクテルの存在下での培養は、リプログラミング効率を６日目で１．５倍、１２日目で約２倍増加させた（図１７）。さらに、４つのＴＦの複合発現は、形質導入の６日後にヒトＣＤ５６陽性（ＣＤ５６＋）細胞を誘導した（図１８）。
【0141】
結論
これらの結果は、４つのＴＦ（ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳ）が、ヒトＣＤ３４＋ＮＫ前駆細胞の同一性及びＣＤ５６＋成熟ＮＫ細胞の組み合わせを誘導するのに十分であることを示唆している。さらに、これらのデータは、構成的レンチウイルスベクターＳＦＦＶが、誘導性ＦＵＷ－ＴｅｔＯシステムよりも高い効率でヒト細胞からのリプログラミングを可能にすることを示している。ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の追加により、ＮＫリプログラミングプロセスが改善される。
これらの結果は、４つのＴＦ（ＥＴＳ１、ＮＦＩＬ３、ＴＢＥＴ及びＥＯＭＥＳ）が、ヒトＣＤ３４＋ＮＫ前駆細胞の同一性及びＣＤ５６＋成熟ＮＫ細胞の組み合わせを誘導するのに十分であることを示唆している。さらに、これらのデータは、構成的レンチウイルスベクターＳＦＦＶが、誘導性ＦＵＷ－ＴｅｔＯシステムよりも高い効率でヒト細胞からのリプログラミングを可能にすることを示している。ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の追加により、ＮＫリプログラミングプロセスが改善される。
【0142】
例７．ＮＫベースの免疫療法は、液体癌及び固形癌をターゲティングすることができる
本明細書に記載の方法によって産生される細胞は、白血病、ＮＣＴ０１８０７６１１のようなリンパ腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫（ＮＣＴ００７２０７８５、ＮＣＴ０２９５５５５０）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂリンパ性悪性腫瘍、急性リンパ性白血病（ＮＣＴ０３０１９６４０、ＮＣＴ０３５７９９２７、ＮＣＴ０３０５６３３９）、急性骨髄性白血病（ＮＣＴ０２７８２５４６、ＮＣＴ０３０８１７８０、ＮＣＴ０１７８７４７４）、小児急性骨髄性白血病（ＮＣＴ０３０６８８１９）、形質細胞白血病（ＮＣＴ０１７２９０９１）、急性赤血球性白血病、急性巨核芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄異形成症候群（ＮＣＴ０１８２３１９８）などの血液癌を含むいくつかのがん及び腫瘍を治療または緩和するために使用することができる。本明細書に記載の方法によって産生される細胞は、神経芽腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫（ＮＣＴ０１８５７９３４、ＮＣＴ０２１００８９１）、膵臓癌、結腸／直腸癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、乳癌、肝細胞癌、腎細胞癌、黒色腫、尿路上皮癌、子宮頸癌、メルケル細胞癌（ＮＣＴ００７２０７８５、ＮＣＴ０３３１９４５９、ＮＣＴ０３８４１１１０）、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌（ＮＣＴ０３５３９４０６）、髄芽腫、上衣腫（ＮＣＴ０２２７１７１１）、悪性骨新生物、口唇癌及び口腔癌、内分泌腫瘍、男性生殖器腫瘍、中皮腫、口腔腫瘍、咽頭腫瘍、骨腫瘍、甲状腺腫瘍（ＮＣＴ０３４２０９６３）などの固形癌を治療または緩和するために使用することができる。
本明細書に記載の方法によって産生される細胞は、白血病、ＮＣＴ０１８０７６１１のようなリンパ腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫（ＮＣＴ００７２０７８５、ＮＣＴ０２９５５５５０）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂリンパ性悪性腫瘍、急性リンパ性白血病（ＮＣＴ０３０１９６４０、ＮＣＴ０３５７９９２７、ＮＣＴ０３０５６３３９）、急性骨髄性白血病（ＮＣＴ０２７８２５４６、ＮＣＴ０３０８１７８０、ＮＣＴ０１７８７４７４）、小児急性骨髄性白血病（ＮＣＴ０３０６８８１９）、形質細胞白血病（ＮＣＴ０１７２９０９１）、急性赤血球性白血病、急性巨核芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄異形成症候群（ＮＣＴ０１８２３１９８）などの血液癌を含むいくつかのがん及び腫瘍を治療または緩和するために使用することができる。本明細書に記載の方法によって産生される細胞は、神経芽腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫（ＮＣＴ０１８５７９３４、ＮＣＴ０２１００８９１）、膵臓癌、結腸／直腸癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、乳癌、肝細胞癌、腎細胞癌、黒色腫、尿路上皮癌、子宮頸癌、メルケル細胞癌（ＮＣＴ００７２０７８５、ＮＣＴ０３３１９４５９、ＮＣＴ０３８４１１１０）、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌（ＮＣＴ０３５３９４０６）、髄芽腫、上衣腫（ＮＣＴ０２２７１７１１）、悪性骨新生物、口唇癌及び口腔癌、内分泌腫瘍、男性生殖器腫瘍、中皮腫、口腔腫瘍、咽頭腫瘍、骨腫瘍、甲状腺腫瘍（ＮＣＴ０３４２０９６３）などの固形癌を治療または緩和するために使用することができる。
【0143】
シーケンスの概要
参照文献
Ｂａｃｈａｎｏｖａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｙ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ＩＬ－２ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｂｌｏｏｄ １２３， ３８５５－３８６３ （２０１４）．
Ｂａｒｒｙ， Ｋ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｘｉｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２４， １１７８－１１９１ （２０１８）．
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Ｆｉｒａｓ， Ｊ．， Ｐｏｌｏ， Ｊ．， Ｇｏｕｇｈ， Ｊ．， Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ， Ｙ．， Ｒａｃｋｈａｍ， Ｏ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ， Ｐａｔｅｎｔ ＷＯ２０１９１７７９３６Ａ１， ２０１７
Ｇｏｍｅｓ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｈｅｍｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２５， ２８２１－ ２８３５．ｅ７ （２０１８）
Ｇｒａｆ Ｔ．， Ｅｎｖｅｒ Ｔ．， Ｆｏｒｃｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｃｈａｎｇｅ Ｌｉｎｅａｇｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ ４６２， ５８７－９４ （２００９）
Ｌｏｐｅｚ－Ｓｏｔｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ＮＫ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３２， １３５－１５４ （２０１７）．
Ｎｏｒｉｋｏ Ｓｈｉｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ． ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １９， ２００－２１８ （２０２０）．
Ｐａｓｓｗｅｇ， Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｄｏｎｏｒ ＮＫ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８， １８３５－１８３８ （２００４）．
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Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ Ａｄｕｌｔ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １２６（４）：６６３－７６ （２００６）．
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【表1】
Ｂａｃｈａｎｏｖａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｙ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ＩＬ－２ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｂｌｏｏｄ １２３， ３８５５－３８６３ （２０１４）．
Ｂａｒｒｙ， Ｋ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｘｉｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２４， １１７８－１１９１ （２０１８）．
Ｂｏｔｔｃｈｅｒ， Ｊ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃＤＣ１ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｃｅｌｌ １７２， １０２２－１０３７ （２０１８）．
Ｂｏｕｄｒｅａｕ ＪＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ－ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４５， ２８０－２９１ （２０１６）．
Ｂｅｚｍａｎ ＮＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３，１０００－１００９ （２０１２）．
Ｅ． Ｖｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｎａｔｅ ｏｒ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ？ Ｔｈｅ Ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３１， ４４－４９ （２０１１）．
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【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】