特表2023-554465コラーゲンＸＩバイオマーカーを検出するためのアッセイ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】コラーゲンＸＩバイオマーカーを検出するためのアッセイ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20231220BHJP
G01N 33/577 20060101ALI20231220BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20231220BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231220BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
G01N33/577 B
G01N33/574 A
G01N33/53 D
G01N33/543 501A
G01N33/543 511A
G01N33/543 515A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537247
(86)(22)【出願日】2021-12-20
(85)【翻訳文提出日】2023-08-09
(86)【国際出願番号】 EP2021086770
(87)【国際公開番号】W WO2022136260
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】2020399.8
(32)【優先日】2020-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522403778
【氏名又は名称】ノルディック バイオサイエンス エー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ウィルムセン，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】ニッセン，ニール，インゲマン
(72)【発明者】
【氏名】カルスダル，モルテン，アッサー
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045FA72
(57)【要約】
本明細書に開示されているものは、Ａ’５１１↓でタイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドの開裂に対して形成されたＣ末端ネオエピトープを含むペプチドのＣ末端を特異的に認識してそれに結合するモノクローナル抗体、ならびに前記抗体を使用し、含む、イムノアッセイ法およびキットである。イムノアッセイ法は、癌などであるがこれに限定されない疾患の重症度もしくは予後を検出および／またはモニターおよび／または評価するために使用される可能性がある。
【選択図】図３Ｂ
【選択図】図３Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有するペプチドのＣ末端を特異的に認識してそれに結合する、モノクローナル抗体。
【請求項2】
Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡＱ（配列番号２）を有するペプチドに特異的に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳ（配列番号３）を有するペプチドに特異的に結合しない、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項4】
Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項5】
イムノアッセイの方法であって：ｉ）患者由来の試料を、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有するペプチドのＣ末端を特異的に認識してそれに結合するモノクローナル抗体と接触させるステップ；ならびに
ｉｉ）前記モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出し、決定するステップ
を含む、方法。
【請求項6】
患者の疾患を検出および／もしくはモニターする、ならびに／または患者の疾患の重症度もしくは予後を評価するためのイムノアッセイの方法であり、さらに：ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で決定されたような前記モノクローナル抗体の前記結合量を、健常人に関連する値、および／または既知の疾患重症度または予後に関連する値、および／または以前の時点で前記患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と関連付けるステップ
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記疾患が、膵癌または慢性膵炎である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記疾患が、メラノーマである、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記疾患が、間質および癌に関連する線維芽細胞が豊富な腫瘍微小環境を有する癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記疾患が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または胃癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項11】
前記疾患が、癌であり、前記方法が、１つまたは複数の化学療法剤および／または免疫チェックポイント阻害剤での処置での考えられる患者の生存期間または無増悪生存期間を評価するための方法である、請求項６に記載の方法。
【請求項12】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡＱ（配列番号２）を有するペプチドに特異的に結合しない、請求項５から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳ（配列番号３）を有するペプチドに特異的に結合しない、請求項５から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項５から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記試料が、血液、血清または血漿から選択される生物流体試料である、請求項５から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項５から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法である、請求項５から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有するペプチドのＣ末端を特異的に認識してそれに結合するモノクローナル抗体、ならびに；－ストレプトアビジンコートウェルプレート；
－ビオチン化ペプチドであるビオチン－Ｌ－ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号４）（ここで、Ｌは、任意選択のリンカーである）；
－サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するための二次抗体；
－前記配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を含むキャリブレータタンパク質；
－抗体ビオチン化キット；
－抗体ＨＲＰ標識キット；
－抗体放射標識キット；および
－アッセイ可視化キット
の少なくとも１つを含む、イムノアッセイキット。
【請求項19】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡＱ（配列番号２）を有するペプチドに特異的に結合しない、請求項１８に記載のイムノアッセイキット。
【請求項20】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳ（配列番号３）を有するペプチドに特異的に結合しない、請求項１８または１９に記載のイムノアッセイキット。
【請求項21】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のイムノアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドの開裂に対して形成されたネオエピトープを検出するため、および／または試料中の前記ネオエピトープの量を定量するためのイムノアッセイに関する。本発明はまた、前記ネオエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、および前記イムノアッセイを実行するための前記抗体を含むキットに関する。イムノアッセイ、抗体およびキットは、例えば患者の膵癌、慢性膵炎、メラノーマ、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、または胃癌などの疾患の重症度または予後を検出、モニターおよび／または評価するために使用される可能性がある。
【背景技術】
【0002】
膵癌（ＰＣ）は、わずかに１４番目に多い癌であるが、依然として世界中で癌死全体の４．５％を占めている（世界保健機関：Ｌａｔｅｓｔ ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄａｔａ，２０１８；Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。この主な理由は、ほとんどの患者が診断時に転移があり、患者の１０％のみが治癒的手術を受けることになる。他の標準ケア治療選択肢には、異なる化学療法レジメンが含まれるが、これらの薬物は、緩和的設定において主に使用される（ＭｃＧｕｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
【0003】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、結果として無血管および低酸素の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）となる重度の腫瘍線維症／線維形成症により特徴づけられる。ＰＣにおける線維化ＴＭＥは、多くの場合、周囲の間質からの持続的な傷害刺激のために活性化される線維芽細胞である、膨大な数の癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）により特徴づけられる（Ｈｏｓｅｉｎ，ＢｒｅｋｋｅｎおよびＭａｉｔｒａ，２０２０）。ＣＡＦは、腫瘍微小環境において最も多く存在する細胞型であり、腫瘍転帰を必要とすることが知られている（Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＣＡＦは、増殖因子、酵素ならびに腫瘍増殖、血管新生、腫瘍浸潤および転移を促進する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子を分泌し、そのため、腫瘍促進因子の豊富なリザーバとして考えられている（ＫａｌｌｕｒｉおよびＺｅｉｓｂｅｒｇ，２００６）。腫瘍の発生および進行におけるＣＡＦおよび線維形成性間質のこの重要な役割を認識すること、腫瘍の間質成分を同定し、標的化することは、癌の広範な研究の分野である。特に、ＰＣを有する患者の腫瘍において認められるような、間質およびＣＡＦが豊富なＴＭＥを有する患者における腫瘍生物学に、さらなる洞察を提供することができる新規非侵襲性バイオマーカーは、非常に有益であろう。
【0004】
免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の有効性を予測するため、そしてそれによって現在のＩＣＩレジメンおよび新規併用療法のための患者の選択を可能にするためのバイオマーカーは、同様に非常に有益であろう。Ｔ細胞排除腫瘍を有する患者は、ＩＣＩ治療に対して効果が乏しい。Ｔ細胞排除は、アップレギュレートされたＴＧＦ－β－シグナル伝達および活性化された線維芽細胞により行われ、線維性コラーゲンのレベルの増加を生じる（線維形成）。
【0005】
ＣＡＦにより分泌された主なＥＣＭタンパク質は、コラーゲンである。線維芽細胞由来コラーゲンには、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＩＶおよびＸＩが含まれる。これらのコラーゲンは、腫瘍間質コンパートメントの主な構成要素であり、間質マトリックス内に配置されている。基底膜コラーゲン、例えばコラーゲンＩＶ、および癌におけるそれらの役割が十分に説明されている一方で、線維芽細胞由来コラーゲンについては、あまり知られていない。しかし、証拠は、これらのコラーゲンが、腫瘍の開始および進行において主要な役割を果たす可能性があることを示している（Ｎｉｓｓｅｎ，ＫａｒｓｄａｌおよびＷｉｌｌｕｍｓｅｎ，２０１９）。特異的線維芽細胞由来コラーゲンフラグメントを定量するバイオマーカーは、種々の癌疾患における患者の転帰を予測することが示されている（Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，２０１４；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｂａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋｅｈｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。近年、コラーゲンＩＩＩのプロペプチドを標的化するバイオマーカーであるＰＲＯ－Ｃ３は、ＰＣにおける全生存期間（ＯＳ）についての予後徴候であったことが示されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。さらに、別の研究において、ＰＲＯ－Ｃ３が、新規抗線維化薬であるＰＥＧＰＨ２０に対して応答する患者を予測することができることが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
【0006】
いくつかの研究は、新規バイオマーカーとして機能することができるＣＡＦ特異的遺伝子／タンパク質を同定することに焦点を当てている。興味深いことに、これまでに同定されている最も特異的なＣＡＦ遺伝子の１つは、タイプＸＩコラーゲンのα１－鎖をコードするＣＯＬ１１Ａ１である（Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。タイプＸＩコラーゲンは、軟骨細胞、破骨細胞、ＣＡＦにより発現されるが、休止期の線維芽細胞には発現しないマイナーな線維性コラーゲンである（Ｇａｒｃｉａ－Ｐｒａｖｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；ＲａｇｌｏｗおよびＴｈｏｍａｓ，２０１５；Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。タイプＸＩコラーゲンの機能は、適切なフィブリル形成および直径の維持に関与することが示唆されている。成熟タイプＸＩコラーゲンは、プロコラーゲンとして合成されるα１－、α２－およびα３－鎖からなるヘテロ三量体であり、プロペプチドは、後でタンパク質分解的に開裂され、成熟タイプＸＩコラーゲンが得られる。タイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドは、Ａ’２５３↓でＢＭＰ－１開裂によりインビトロで部分的にのみ放出されることが示されている（Ｒｏｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。しかし、タイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドはまた、Ａ’５１１↓でのＮプロテイナーゼ開裂によるプロペプチドの最末端で開裂されることが示されている（ＹｏｓｈｉｏｋａおよびＲａｍｉｒｅｚ，１９９０）。
【0007】
米国特許第９，７０２，８７９号明細書（Ｓｅｒｒａ ｅｔ ａｌ）は、個体から採取された試料中のｐｒｏＣＯＬ１１Ａ１（タイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のプロコラーゲン）の量の検出に基づいて前記個体における浸潤癌の存在を検出するためのインビトロ法を説明している。その方法は、ｐｒＣＯＬ１１Ａ１のアミノ酸２６８から４００からなるｐｒｏＣＯＬ１１Ａ１のＮ末端領域に位置する親水性ドメインに存在する１つまたは複数のエピトープに結合するモノクローナル抗体を使用する。本文書の著者は、この領域が、その疎水性のため（領域が、タンパク質の本来の構造において露出されていることを示唆する）およびｐｒｏＣＯＬ１１Ａ１との類似性が最も高い他のコラーゲンアイソフォームとの相同性が最も低い配列を含むために、ｐｒｏＣＯＬ１１Ａ１に特異的なモノクローナル抗体を生成するための最も有望な領域であると結論づけた。
【0008】
国際公開第２０２０／０６５０７８号（Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ）は、Ａ’２５３↓でのタイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドの開裂に対して形成されたＣ末端ネオエピトープを標的化するモノクローナル抗体の生成、および患者の非小細胞肺癌を診断および／またはモニターするための競合ＥＣＬＩＡ（電気化学発光イムノアッセイ）における前記抗体の使用を説明している。
【0009】
それにも関わらず、間質およびＣＡＦが豊富なＴＭＥを有する癌（膵癌を有する患者の腫瘍で認められるものなど）およびＩＣＩ治療での処置の応答および生存転帰を予測する可能性があるＴ細胞排除腫瘍を有する癌、ならびに重度の線維症により特徴づけられるか、それを提示する他の疾患などであるがこれらに限定されない癌に罹患している患者を同定するために臨床的に使用される可能性がある新規の非侵襲性バイオマーカーの必要性が残っている。
【発明の概要】
【0010】
出願人は、現在、Ａ’５１１↓でのタイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドの酵素的開裂により生成されるＣ末端ネオエピトープを標的化する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を開発しており、ＰＣを有する患者、慢性膵炎（ＣＰ）を有する患者、および転移性メラノーマを有する患者および種々の他のタイプの癌を有する患者におけるこのバイオマーカーの予後値を示している。
【0011】
したがって、第１の態様において、出願人は、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有するペプチド（Ａ’５１１↓でのタイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドの開裂に対して形成されたＣ末端ネオエピトープを含む）のＣ末端を特異的に認識してそれに結合するモノクローナル抗体を提供する。アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）はまた、本明細書では「ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１標的配列」とも呼ばれ、前記配列からなるか、それらのＣ末端として前記配列を有するペプチドはまた、本明細書では「ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１標的ペプチド」とも呼ばれる。
【0012】
本明細書で使用されるように、用語「Ｃ末端」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＣ末端でのＣ末端ペプチド配列を指し、その一般的な方向の意味として解釈されるべきではない。
【0013】
本明細書で使用されるように、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、同義的に使用される。
【0014】
本明細書で使用されるように、用語「ネオエピトープ」は、ペプチドの開裂に対して形成されているが、（例えば、開裂部位での遊離－ＮＨ２または－ＣＯＯＨ基が、抗体により認識され、特異的に結合するエピトープの一部を形成するため）非開裂ペプチドでは存在しないか、抗体により認識可能ではないエピトープを指す。
【0015】
好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡＱ（配列番号２）（すなわちグルタミン残基の付加によりそのＣ末端で延びるＰＲＯ－Ｃ１１－５１１標的配列）を有するペプチドを特異的に認識しないか、それに結合しない。
【0016】
好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳ（配列番号３）（すなわち最後のアラニン残基の除去により不完全なＰＲＯ－Ｃ１１－５１１標的配列）を有するペプチドを特異的に認識しないか、それに結合しない。
【0017】
好ましくは、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体である。
【0018】
本明細書で使用されるように、用語「モノクローナル抗体」は、全抗体および例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、または当業者に既知の他のそのようなフラグメントなどの全抗体の結合特異性を保持しているそのフラグメントの両方を指す。周知のように、全抗体は、典型的に２つの同一なポリペプチド鎖対の「Ｙ字型」構造を有し、各対は、１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖で構成される。各軽鎖および重鎖のＮ末端領域は、可変領域を含む一方で、各重鎖および軽鎖のＣ末端部分は、定常領域を構成する。可変領域は、主に抗原認識の役割を担っている、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。定常領域は、抗体が免疫系の細胞および分子を補充することを可能にする。結合特異性を保持する抗体フラグメントは、少なくともＣＤＲおよび前記結合特異性を保持するのに十分な可変領域の残りの部分を含む。
【0019】
本発明の方法において、当技術分野において既知である任意の定常領域を含むモノクローナル抗体を使用することができる。ヒト定常軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。定常重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。モノクローナル抗体は、好ましくは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のいずれか１つを含む、ＩｇＧアイソタイプのものであり得る。
【0020】
抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌにより説明されたものなど、当技術分野において既知の方法を使用して決定することができる。抗体は、実施例に記載のＢ細胞クローンから生成することができる。抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧもしくはＩｇＡアイソタイプ、またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４サブクラスに特異的なＥＬＩＳＡにより決定することができる。生成された抗体のアミノ酸配列は、標準技術を使用して決定することができる。例えば、ＲＮＡは、細胞から単離することができ、逆転写によりｃＤＮＡを生成するために使用することができる。その後、ｃＤＮＡを、抗体の重鎖および軽鎖を増幅するプライマを使用するＰＣＲに供する。例えば、全ＶＨ（可変重鎖）配列のためのリーダー配列に特異的なプライマは、以前決定されているアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマと一緒に使用することができる。軽鎖は、カッパまたはラムダ鎖の３’末端に結合するプライマを、ＶカッパまたはＶラムダリーダー配列にアニールするプライマと一緒に使用して増幅することができる。完全長重鎖および軽鎖を生成し、配列決定することができる。
【0021】
第２の態様において、本出願は、イムノアッセイの方法を提供し、その方法は：
（ｉ）患者由来の生物流体試料を、第１の態様によるモノクローナル抗体と接触させるステップ；ならびに
（ｉｉ）前記モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出し、決定するステップ
を含む。
（ｉ）患者由来の生物流体試料を、第１の態様によるモノクローナル抗体と接触させるステップ；ならびに
（ｉｉ）前記モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出し、決定するステップ
を含む。
【0022】
好ましい実施形態において、方法は、患者の疾患を検出および／もしくはモニターする、ならびに／または患者の疾患の重症度もしくは予後を評価するためのイムノアッセイの方法であり、その方法はさらに：
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で決定されたような前記モノクローナル抗体の前記結合量を、健常人に関連する値、および／または既知の疾患重症度または予後に関連する値、および／または以前の時点で前記患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と関連付けるステップ
を含む。
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で決定されたような前記モノクローナル抗体の前記結合量を、健常人に関連する値、および／または既知の疾患重症度または予後に関連する値、および／または以前の時点で前記患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と関連付けるステップ
を含む。
【0023】
いくらかの実施形態において、疾患は、膵癌、メラノーマ、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、または胃癌などであるがこれらに限定されない癌である。癌は、間質および癌に関連する線維芽細胞が豊富な腫瘍微小環境を有する癌であり得る。癌は、特に膵管腺癌または転移性メラノーマであり得る。
【0024】
いくらかの実施形態において、疾患は、膵癌（特に膵管腺癌）または慢性膵炎などであるがこれらに限定されない膵疾患である。
【0025】
方法が、疾患の重症度または予後を評価するための方法である場合、方法は、例えば癌の病期を評価するため；または考えられる患者の生存期間または無増悪生存期間を評価するため；または１つもしくは複数の薬物（例えば１つまたは複数の化学療法剤（すなわち細胞毒性剤）および／または免疫チェックポイント阻害剤）での処置での考えられる患者の生存期間または無増悪生存期間などの医療介入に応答する可能性を評価するためのものであり得る。
【0026】
試料は、好ましくは生物流体である。生物流体は、血液、血清、血漿、尿または細胞もしくは組織培養物由来の上清であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、生物流体は、血液、血清または血漿である。
【0027】
イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであり得るが、これらに限定されない。イムノアッセイは、例えばラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であり得る。そのようなアッセイは、当業者に既知の技術である。
【0028】
本明細書で使用されるように、用語「結合量」は、モノクローナル抗体と患者の試料中のペプチドとの間の結合の定量化を指す。前記定量化は、患者の試料中で抗体が特異的に結合するペプチドの量をそれによって決定するために、例えば患者の試料中の結合の測定値を、抗体が特異的に結合するペプチドの既知の濃度を含む標準試料中の結合の測定値を使用して生成された検量線に対して比較することにより決定される可能性がある。以下に提示する実施例において、ＥＬＩＳＡ法が使用され、そこで分光光度分析が、患者の試料中、および検量線を生成する場合の両方で、結合量を測定するために使用される。しかし、任意の適切な分析法を使用することができる。
【0029】
本明細書で使用されるように、用語「所定のカットオフ値」は、患者の疾患の可能性が高いことまたは特定のその重症度（またはその予後）を示唆すると統計的に決定される結合量を意味し、統計的カットオフ値で、またはそれを超える患者の試料中での標的ペプチドの測定値は、前記疾患の存在またはその前記特定の重症度（またはその予後）の少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも７５％の確率、より好ましくは少なくとも８０％の確率、より好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、および最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応する。
【0030】
本明細書で使用されるように、用語「健常人に関連する値」は、健康であるとみなされる、すなわち疾患がない被験者由来の試料のために上述した方法により決定された標準化結合量を意味する；そして用語「既知の疾患重症度または予後に関連する値」は、既知の重症度または予後の疾患を有することが既知である患者由来の試料のために上述した方法により決定された標準化結合量を意味する。
【0031】
第３の態様において、本出願は、第１の態様によるモノクローナル抗体、ならびに；
－ストレプトアビジンコートウェルプレート；
－ビオチン化ペプチドであるビオチン－Ｌ－ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号４）（ここで、Ｌは、任意選択のリンカーである）；
－サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するための二次抗体；
－配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を含むキャリブレータタンパク質；
－抗体ビオチン化キット；
－抗体ＨＲＰ標識キット；
－抗体放射標識キット；および
－アッセイ可視化キット
の少なくとも１つを含むイムノアッセイキットに関する。
－ストレプトアビジンコートウェルプレート；
－ビオチン化ペプチドであるビオチン－Ｌ－ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号４）（ここで、Ｌは、任意選択のリンカーである）；
－サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するための二次抗体；
－配列ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号１）を含むキャリブレータタンパク質；
－抗体ビオチン化キット；
－抗体ＨＲＰ標識キット；
－抗体放射標識キット；および
－アッセイ可視化キット
の少なくとも１つを含むイムノアッセイキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３（Ａ）およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（Ｂ）バイオマーカーの標的の説明があるコラーゲンタイプＸＩの略図。
【図2】ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１アッセイの特異性テスト。Ａ）ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３抗体の反応性を、標準（ＳＴＤ）、伸長、不完全およびナンセンス（ナンセンスＳＴＤ）ペプチドおよびナンセンスコーターに対してテストした。３つの異なる除外ペプチドに対してもテストした。Ｂ）ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１抗体の反応性を、標準（ＳＴＤ）、伸長、不完全およびナンセンス（ナンセンスＳＴＤ）ペプチド、ナンセンスコーターおよび除外ペプチドに対してテストした。％Ｂ／Ｂ０：Ｂはｘｎｇ／ｍｌのペプチドでのＯＤと等しく、Ｂ０は、０ｎｇ／ｍｌのペプチドでのＯＤと等しい。
【図3】健康な対照（ｎ＝２０）、および慢性膵炎（ｎ＝１２）ならびに膵癌（ｎ＝３９）患者における個々のバイオマーカーの測定値。黒線は、中央値を示すものである。Ａ）ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３、Ｂ）ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１。Ｎｓ：有意差なし。＊はｐ＜０．０５である。＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。
【図4】ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１および全生存期間の高（＞７５％）および低（＜７５％）バイオマーカーレベル間の関連を示すカプラン・マイヤー生存プロット。Ａ）ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３、Ｂ）ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１
【図5】膵癌（ｎ＝６８６）における個々のＰＲＯ－Ｃ１１－２５３バイオマーカー測定値。黒線は、中央値を示すものである。＊はｐ＜０．０５である。＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図6】Ａ）膵癌（ｎ＝６８６）におけるＰＲＯ－Ｃ１１－５１１および全生存期間の高（＞７５％）および低（＞７５％）レベル間の関連を示すカプラン・マイヤープロット。Ｂ）高（＞７５％）および低（＞７５％）バイオマーカー測定値についてベースラインから２年後に生存している患者の割合を示すプロット。
【図7】ペンブロリズマブで処置された転移性メラノーマ患者において７５パーセンタイル（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３対Ｑ４）でグループ分けする（二分する）ことによる、ベースラインでのＰＲＯ－Ｃ１１－５１１に関連する無増悪生存期間および全生存期間を評価するためのカプラン・マイヤープロット。
【図8】多発性癌患者群および健康な対照の血清中でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を測定した。ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルを、データポイントジッタ付きのテューキースタイルの箱ひげ図として表す：水平の棒は、中央値を示す；箱の上部および下部ヒンジは、第１四分位数および第３四分位数（２５および７５パーセンタイル）を示す；ひげは、ヒンジから最大値または最小値まで延びるが、正負のいずれかの方向で、１．５×ＩＱＲ（こで、ＩＱＲは、第１四分位数と第３四分位数との間の四分位数範囲である）を超えない。測定範囲の下限（ＬＬＭＲ）未満で測定される試料には、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の検証で決定されたように、ＬＬＭＲの値を与えた。＊＊＊＊は、０．０００１未満のｐ値を示す。＊＊＊は、０．００１未満である。＊＊は、０．０１未満である。＊は０．０５未満である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
実施例
本開示の実施形態は、以下の実施例において説明され、本開示の理解を助けるために記載され、その後に続く特許請求の範囲で定義される本開示の範囲をいかなる方法でも制限するものと解釈されるべきではない。以下の実施例は、説明された実施形態を製造および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように述べられており、本開示の範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が、すべてまたは唯一の実行された実験であることを表すことを意図していない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を期するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は、説明されるべきである。別段の指示のない限り、部は重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
本開示の実施形態は、以下の実施例において説明され、本開示の理解を助けるために記載され、その後に続く特許請求の範囲で定義される本開示の範囲をいかなる方法でも制限するものと解釈されるべきではない。以下の実施例は、説明された実施形態を製造および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように述べられており、本開示の範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が、すべてまたは唯一の実行された実験であることを表すことを意図していない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を期するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は、説明されるべきである。別段の指示のない限り、部は重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【0034】
材料および方法
コラーゲンＸＩアッセイ開発－標的配列の同定およびモノクローナル抗体産生
タイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドは、アミノ酸Ａ’２５３↓またはアミノ酸（Ｒｏｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）Ａ’５１１↓（ＹｏｓｈｉｏｋａおよびＲａｍｉｒｅｚ，１９９０）のいずれかで開裂されることが示されている。標的化されるこれらの２つの部位の関連性を評価するため、モノクローナル抗体は、ペプチド２４４ＤＳＳＡＰＫＡＡＱＡ２５３（配列番号５）（その標的配列およびペプチドは、本明細書ではＰＲＯ－Ｃ１１－２５３と呼ばれる）または５０２ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ５１１（配列番号１）（その標的配列およびペプチドは、本明細書ではＰＲＯ－Ｃ１１－５１１と呼ばれる）のいずれかに対して上昇した（図１）。アミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔデータベースを用いるＮＰＳ＠：Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を使用して他のヒト分泌細胞外マトリックスタンパク質との相同性のためにＢＬＡＳＴ検索し、一意であることが分かった（Ｃｏｍｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
コラーゲンＸＩアッセイ開発－標的配列の同定およびモノクローナル抗体産生
タイプＸＩコラーゲンのα１－鎖のＮ末端プロペプチドは、アミノ酸Ａ’２５３↓またはアミノ酸（Ｒｏｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）Ａ’５１１↓（ＹｏｓｈｉｏｋａおよびＲａｍｉｒｅｚ，１９９０）のいずれかで開裂されることが示されている。標的化されるこれらの２つの部位の関連性を評価するため、モノクローナル抗体は、ペプチド２４４ＤＳＳＡＰＫＡＡＱＡ２５３（配列番号５）（その標的配列およびペプチドは、本明細書ではＰＲＯ－Ｃ１１－２５３と呼ばれる）または５０２ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ５１１（配列番号１）（その標的配列およびペプチドは、本明細書ではＰＲＯ－Ｃ１１－５１１と呼ばれる）のいずれかに対して上昇した（図１）。アミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔデータベースを用いるＮＰＳ＠：Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を使用して他のヒト分泌細胞外マトリックスタンパク質との相同性のためにＢＬＡＳＴ検索し、一意であることが分かった（Ｃｏｍｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【0035】
免疫原性ペプチド（ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３用：ＫＬＨ－ＣＧＧ－ＤＳＳＡＰＫＡＡＱＡ（配列番号６）およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１用：ＫＬＨ－ＣＧＧ－ＤＧＳＫＧＰＴＩＳＡ（配列番号７））を、スルホサクシニミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、ＳＭＣＣ（サーモサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ、カタログ番号２２３２２）を使用して標的ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）輸送タンパク質に共有的に架橋させることにより生成した。グリシンおよびシステイン残基をＮ末端で添加して、輸送タンパク質の正しい結合を確保した。モノクローナル抗体を、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３免疫原性ペプチド用にはＳｐｅｃｏｌ（インビトロジェンカタログ番号７９２５０００）と、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１免疫原性ペプチド用にはシグマアジュバントシステム（シグマカタログ番号Ｓ６３２２）と混合した免疫原性ペプチド１００μｇを含む乳化抗原２００μＬを用いる６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下免疫付与により生成した。安定した血清力価レベルに到達するまで、２週間間隔で連続免疫付与を実行した。最高力価を有するマウスを４週間休ませ、その後、０．９％ＮａＣｌ溶液１００μＬ中の免疫原性ペプチド１００μｇを用いて静脈内で追加免疫付与した。以前説明された（Ｇｅｆｔｅｒ，ＭａｒｇｕｌｉｅｓおよびＳｃｈａｒｆｆ，１９７７）ように脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合することによりによりハイブリドーマ細胞を生成した。その後、得られたハイブリドーマ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートで培養し、標準限界希釈を使用して単クローン性増殖を確保した。
【0036】
メーカーの指示書（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス、リトルチャルフォント、ＵＫ、ｃａｔ．＃１７－０４０４－０１）にしたがって、タンパク質－Ｇ－カラムを使用してモノクローナル抗体を精製した。各バイオマーカー用の最良の抗体クローンを、選択ペプチド（標的ペプチド、標準ペプチドとも呼ばれる）に対する反応性、および標的ペプチド配列のＣ末端に添加された追加のアミノ酸を有する伸長選択ペプチド、第１のＣ末端アミノ酸の除去を有する不完全選択ペプチド、ナンセンス選択ペプチドおよびナンセンスビオチン化コーティングペプチドに反応性がないことについて、予備競合ＥＬＩＳＡに基づいて選択した（表１を参照されたい）。ビオチン化選択ペプチドを、コーティングペプチドとして使用した（表１）。他のタンパク質に対する任意の潜在的な交差反応性についてスクリーニングし、抗体特異性をさらにテストするため、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３には、標的配列中の第１の６個のアミノ酸と比較して１つのアミノ酸ミスマッチを有する３個のペプチド（シスタチン－Ｍ、リジルオキシダーゼホモログ１およびケラチン様タンパク質ＫＲＴ２２２由来）が、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１には、１つのペプチド（ムチン４由来）が含まれていた（表１）。
【0037】
【表1】
【0038】
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－２５３ＥＬＩＳＡプロトコル
抗体／コーターペプチドの最適比、インキュベーション緩衝液、－時間および－温度、ならびに（ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３アッセイの感度を高めるため）西洋ワサビペルオキシダーゼのＰＲＯ－Ｃ１１－２５３抗体へのコンジュゲーションの決定後、競合ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－２５３ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように実行した：
抗体／コーターペプチドの最適比、インキュベーション緩衝液、－時間および－温度、ならびに（ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３アッセイの感度を高めるため）西洋ワサビペルオキシダーゼのＰＲＯ－Ｃ１１－２５３抗体へのコンジュゲーションの決定後、競合ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－２５３ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように実行した：
【0039】
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３ＥＬＩＳＡ
９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロプレートプレートを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＰＢＳ－ＢＴＢ、ＮａＣｌ／Ｌ８ｇ、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン化コーティングペプチド（０．５ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを用いて、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で３０分間コートした。５回の洗浄（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）後、標準ペプチドまたは血清試料（１：２に事前希釈した）２０μＬを、適切なウェルに添加し、続いて、アッセイ緩衝液に溶解したＰＲＯ－Ｃ１１－２５３用の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－コンジュゲート抗体（２５ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら４℃暗所で２０時間インキュベートした。５回の洗浄後、テトラメチルベジジン（Tetramethylbezidine）（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、トストルプ、デンマーク）１００ｕＬをプレートに添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で１５分間インキュベートした。１％硫酸１００μＬを添加することにより反応を停止した。プレートを、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー中、６５０ｎｍを基準として４５０ｎＭで分析した。４－パラメトリック数学的フィットモデルを使用して標準曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して、データを分析した。
９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロプレートプレートを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＰＢＳ－ＢＴＢ、ＮａＣｌ／Ｌ８ｇ、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン化コーティングペプチド（０．５ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを用いて、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で３０分間コートした。５回の洗浄（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）後、標準ペプチドまたは血清試料（１：２に事前希釈した）２０μＬを、適切なウェルに添加し、続いて、アッセイ緩衝液に溶解したＰＲＯ－Ｃ１１－２５３用の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－コンジュゲート抗体（２５ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら４℃暗所で２０時間インキュベートした。５回の洗浄後、テトラメチルベジジン（Tetramethylbezidine）（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、トストルプ、デンマーク）１００ｕＬをプレートに添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で１５分間インキュベートした。１％硫酸１００μＬを添加することにより反応を停止した。プレートを、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー中、６５０ｎｍを基準として４５０ｎＭで分析した。４－パラメトリック数学的フィットモデルを使用して標準曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して、データを分析した。
【0040】
ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１ＥＬＩＳＡ
９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロプレートプレートを、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＰＢＳ－ＢＴＢ、２ＮａＣｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン化ペプチド（１．９ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを用いて、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で３０分間コートした。５回の洗浄（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）後、標準ペプチドまたは血清試料（１：２に事前希釈した）２０μＬを、適切なウェルに添加し、続いて、アッセイ緩衝液に溶解したＰＲＯ－Ｃ１１－５１１用の抗体（１８．８ｎｇ／ｍＬ）を添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら４℃暗所で２０時間インキュベートした。５回の洗浄後、アッセイ緩衝液で希釈した１３０ｎｇ／ｍＬ二次ヤギ抗マウスＨＲＰ－コンジュゲートＩｇＧ抗体（サーモサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、２０℃で１時間振盪（３００ｒｐｍ）しながら暗所でインキュベートした。５回の洗浄後、テトラメチルベジジン（Tetramethylbezidine）（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、トストルプ、デンマーク）１００ｕＬをプレートに添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で１５分間インキュベートした。１％硫酸１００μＬを添加することにより反応を停止した。プレートを、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー中、６５０ｎｍを基準として４５０ｎＭで分析した。４－パラメトリック数学的フィットモデルを使用して標準曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して、データを分析した。
９６ウェルストレプトアビジンコートマイクロプレートプレートを、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＰＢＳ－ＢＴＢ、２ＮａＣｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン化ペプチド（１．９ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを用いて、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で３０分間コートした。５回の洗浄（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）後、標準ペプチドまたは血清試料（１：２に事前希釈した）２０μＬを、適切なウェルに添加し、続いて、アッセイ緩衝液に溶解したＰＲＯ－Ｃ１１－５１１用の抗体（１８．８ｎｇ／ｍＬ）を添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら４℃暗所で２０時間インキュベートした。５回の洗浄後、アッセイ緩衝液で希釈した１３０ｎｇ／ｍＬ二次ヤギ抗マウスＨＲＰ－コンジュゲートＩｇＧ抗体（サーモサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、２０℃で１時間振盪（３００ｒｐｍ）しながら暗所でインキュベートした。５回の洗浄後、テトラメチルベジジン（Tetramethylbezidine）（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、トストルプ、デンマーク）１００ｕＬをプレートに添加し、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２０℃暗所で１５分間インキュベートした。１％硫酸１００μＬを添加することにより反応を停止した。プレートを、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー中、６５０ｎｍを基準として４５０ｎＭで分析した。４－パラメトリック数学的フィットモデルを使用して標準曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して、データを分析した。
【0041】
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１ＥＬＩＳＡの技術的評価
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１ＥＬＩＳＡアッセイの技術的性能を、以下の検証テスト：測定範囲の下限（ＬＬＭＲ）、測定範囲の上限（ＵＬＭＲ）、アッセイ間およびアッセイ内変動、直線性、精度（添加）、検体安定性（凍結／解凍および貯蔵）ならびに干渉で評価した。
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１ＥＬＩＳＡアッセイの技術的性能を、以下の検証テスト：測定範囲の下限（ＬＬＭＲ）、測定範囲の上限（ＵＬＭＲ）、アッセイ間およびアッセイ内変動、直線性、精度（添加）、検体安定性（凍結／解凍および貯蔵）ならびに干渉で評価した。
【0042】
分析測定範囲を、１０個の独立した実験から推定されたＬＬＭＲからＵＬＭＲまでの濃度（標準曲線の線形部分）として定義した。アッセイ間およびアッセイ内変動を、検出範囲をカバーする５個の品質管理試料を使用する異なる日での１０個の独立した実験により決定し、各実験は、試料の二重判定からなっていた。５個の管理試料には、３個のヒト血清試料および緩衝液中の標準ペプチドを有する２個の試料が含まれていた。アッセイ内変動を、プレート内の平均変動係数（ＣＶ％）として算出し、アッセイ間変動を、異なる日に分析された１０個の個々の実験間の平均ＣＶ％として算出した。直線性（希釈回収率）を、３個のヒト血清試料の２倍希釈物を用いて決定し、未希釈試料の回収率として算出した。既知の濃度の８個のヒト血清試料を組み合わせることにより、精度（添加回収率）を評価し、添加回収率を、理論量の測定されたＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の量の回収率として算出した。繰り返し凍結／解凍の影響により、また温度貯蔵に関して検体安定性を決定した。３個の血清試料を４回解凍、凍結し、続いて、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を測定した。第１のサイクルを基準として用いて凍結／解凍回収率を算出した。４８時間の研究を実行し、３個のヒト血清試料を使用して４℃および２０℃での検体安定性を決定した。ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１のレベルを、貯蔵の４時間後、２４時間後および４８時間後に測定し、回収率を、－２０℃で貯蔵したノンストレスの試料を基準として用いて算出した。高／低含有量のヘモグロビン（２．５／５ｍｇ／ｍＬ）、血中脂肪／脂質（１．５／５ｍｇ／ｍＬ）およびビオチン（３０／９０ｎｇ／ｍＬ）を既知の濃度の血清試料に添加することにより、干渉を決定した。血清試料を基準として用いて回収率を算出した。
【0043】
慢性膵炎および膵癌を有する患者
ＰＣ（ステージＩ～ＩＶ）（ｎ＝３９）、慢性膵炎（ＣＰ）（ｎ＝１２）を有する患者ならびに年齢および性別が釣り合う健康な対照（ｎ＝２０）を含む発見コホート由来の前処理した血清試料中で、２個のバイオマーカーＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を分析した。さらに、ＰＣ（ステージＩ～ＩＶ）を有する６８６人の患者を含む検証コホート由来の前処理した血清試料中でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を分析した。健康な対照は、商業ベンダーであるＶａｌｌｅｙ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ（ＶＡ、ＵＳＡ）から取得した（患者の人口構成については表２を参照されたい）。Ｖａｌｌｅｙ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌは、専有の治験審査委員会／独立倫理委員会が承認した試料コレクションを有しており、すべての被験者は、インフォームドコンセントに記入した。ＰＣおよびＣＰ患者はすべて、デンマークＢＩＯＰＡＣ研究「ＢＩＯｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ」（ＮＣＴ０３３１１７７６）からであった。２００８年１２月から２０１７年９月まで、デンマークの６つの病院から患者を募集した。ＰＣ患者は、組織学的に腫瘍が確認された。ＰＣ患者は、国家ガイドライン（ｗｗｗ．ｇｉｃａｎｃｅｒ．ｄｋ）にしたがって種々のタイプの化学療法で処置された。健康研究倫理に関するデンマーク地域委員会の推奨事項にしたがって研究を実行した。ＢＩＯＰＡＣプロトコルは、健康研究倫理に関するデンマーク地域委員会（ＶＥＫ ｒｅｆ．ＫＡ－２００６０１１３）およびデータ保護機関（ｊ．ｎｒ．２００６－４１－６８４８）により承認された。被験者はすべて、ヘルシンキ宣言、バージョン８にしたがって書面によるインフォームドコンセントを提出した。診断時または手術前に血液試料を取得した。血液用の国内承認された標準の手術手順（ｗｗｗ．ｈｅｒｌｅｖｈｏｓｐｉｔａｌ．ｄｋ／ｂｉｏｐａｃ．ｄｋ）にしたがって試料を処理した。患者由来の血清試料および臨床データを、前向き研究的に回収した。血清試料を盲検的に測定した。臨床データには：年齢、性別、転移部位の数、肝転移、ＢＭＩ、病期、糖尿病、喫煙、飲酒、ＣＡ１９－９（中央値）、全身状態（ＰＳ）、チャールソン年齢併存疾患指数（ＣＡＣＩ）、全生存期間（ＯＳ）が含まれていた。
ＰＣ（ステージＩ～ＩＶ）（ｎ＝３９）、慢性膵炎（ＣＰ）（ｎ＝１２）を有する患者ならびに年齢および性別が釣り合う健康な対照（ｎ＝２０）を含む発見コホート由来の前処理した血清試料中で、２個のバイオマーカーＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を分析した。さらに、ＰＣ（ステージＩ～ＩＶ）を有する６８６人の患者を含む検証コホート由来の前処理した血清試料中でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を分析した。健康な対照は、商業ベンダーであるＶａｌｌｅｙ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ（ＶＡ、ＵＳＡ）から取得した（患者の人口構成については表２を参照されたい）。Ｖａｌｌｅｙ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌは、専有の治験審査委員会／独立倫理委員会が承認した試料コレクションを有しており、すべての被験者は、インフォームドコンセントに記入した。ＰＣおよびＣＰ患者はすべて、デンマークＢＩＯＰＡＣ研究「ＢＩＯｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ」（ＮＣＴ０３３１１７７６）からであった。２００８年１２月から２０１７年９月まで、デンマークの６つの病院から患者を募集した。ＰＣ患者は、組織学的に腫瘍が確認された。ＰＣ患者は、国家ガイドライン（ｗｗｗ．ｇｉｃａｎｃｅｒ．ｄｋ）にしたがって種々のタイプの化学療法で処置された。健康研究倫理に関するデンマーク地域委員会の推奨事項にしたがって研究を実行した。ＢＩＯＰＡＣプロトコルは、健康研究倫理に関するデンマーク地域委員会（ＶＥＫ ｒｅｆ．ＫＡ－２００６０１１３）およびデータ保護機関（ｊ．ｎｒ．２００６－４１－６８４８）により承認された。被験者はすべて、ヘルシンキ宣言、バージョン８にしたがって書面によるインフォームドコンセントを提出した。診断時または手術前に血液試料を取得した。血液用の国内承認された標準の手術手順（ｗｗｗ．ｈｅｒｌｅｖｈｏｓｐｉｔａｌ．ｄｋ／ｂｉｏｐａｃ．ｄｋ）にしたがって試料を処理した。患者由来の血清試料および臨床データを、前向き研究的に回収した。血清試料を盲検的に測定した。臨床データには：年齢、性別、転移部位の数、肝転移、ＢＭＩ、病期、糖尿病、喫煙、飲酒、ＣＡ１９－９（中央値）、全身状態（ＰＳ）、チャールソン年齢併存疾患指数（ＣＡＣＩ）、全生存期間（ＯＳ）が含まれていた。
【0044】
【表2】
【0045】
【表3】
【0046】
転移性メラノーマを有する患者
抗ＰＤ－１治療（ペンブロリズマブ）で処置された転移性メラノーマを有する３５人の患者由来の前処理した血清試料でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルを測定した。ヘアレウのコペンハーゲン大学病院で、インフォームドコンセントの後、１９７５年のヘルシンキ宣言に準拠し、デンマーク首都圏倫理委員会により承認された標準治療として、患者をペムブロリズマブで処置した。血清試料を盲検的に測定した。
抗ＰＤ－１治療（ペンブロリズマブ）で処置された転移性メラノーマを有する３５人の患者由来の前処理した血清試料でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルを測定した。ヘアレウのコペンハーゲン大学病院で、インフォームドコンセントの後、１９７５年のヘルシンキ宣言に準拠し、デンマーク首都圏倫理委員会により承認された標準治療として、患者をペムブロリズマブで処置した。血清試料を盲検的に測定した。
【0047】
種々の癌型を有する患者
２２２個の癌試料および３３個の健康な試料からなるさらなる患者コホート由来の試料で、Ｐｒｏ－Ｃ１１－５１１レベルを測定した。それには、それぞれ膵癌、結腸直腸癌、腎癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、メラノーマ、頭頸部癌および前立腺癌の２０人の患者、１９人の卵巣癌患者、３人の肝癌患者ならびに３３人の年齢が釣り合った健康な対照が含まれていた。すべての癌試料は、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（ロスアンゼルス、ＣＡ、ＵＳＡ）から取得され、健康な対照は、ＢｉｏＩＶＴ（ウェストバリー、ＮＹ、ＵＳＡ）から取得された。コホートの特徴の要約は、表３に認めることができる。
２２２個の癌試料および３３個の健康な試料からなるさらなる患者コホート由来の試料で、Ｐｒｏ－Ｃ１１－５１１レベルを測定した。それには、それぞれ膵癌、結腸直腸癌、腎癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、メラノーマ、頭頸部癌および前立腺癌の２０人の患者、１９人の卵巣癌患者、３人の肝癌患者ならびに３３人の年齢が釣り合った健康な対照が含まれていた。すべての癌試料は、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（ロスアンゼルス、ＣＡ、ＵＳＡ）から取得され、健康な対照は、ＢｉｏＩＶＴ（ウェストバリー、ＮＹ、ＵＳＡ）から取得された。コホートの特徴の要約は、表３に認めることができる。
【0048】
【表4】
【0049】
統計解析
ＲＥＭＡＲＫ（腫瘍マーカー予後研究のための推奨事項の報告）ガイドラインにしたがってバイオマーカーの結果を報告する。
ＲＥＭＡＲＫ（腫瘍マーカー予後研究のための推奨事項の報告）ガイドラインにしたがってバイオマーカーの結果を報告する。
【0050】
クラスカル－ウォリス検定を使用して、ＰＣ、ＣＰおよび健康な対照のＰＲＯ－Ｃ１１－２５３とＰＲＯ－Ｃ１１－５１１バイオマーカーレベル間の差異をテストした。カプラン－マイヤー曲線を使用して、高（＞７５％四分位数）および低（＜７５％四分位数）ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ５１１バイオマーカーレベルならびに全生存期間（ＯＳ）の間の差異を評価した。ＢＩＯＰＡＣ研究に組み入れられた日からフォローアップ終了まで、または何らかの原因で死亡するまでのいずれか早い時期まで患者を追跡した。単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルは、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１バイオマーカーレベルおよび臨床的共変量：年齢（連続）、性別（女性対男性）、転移部位の数（＜１対≦１）、肝転移（あり対なし／他）、ＢＭＩ（連続）、病期（連続およびＩＩＩ＋ＩＶ対Ｉ＋ＩＩ）、糖尿病（あり対なし）、喫煙（喫煙歴あり対喫煙歴なし）、飲酒（デンマーク保健局推奨事項未満対乱用）、ＣＡ１９－９（＞中央値）、全身状態（ＰＳ）（２対≦１、２対０、２＋３対０＋１）およびチャールソン年齢併存疾患指数（ＣＡＣＩ）（≧４対＜４）ごとのＯＳについて９５％信頼区間（Ｃｌ）でのハザード比（ＨＲ）を算出することであった（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１、年齢、転移部位（＜１対≦１）、肝転移（あり対なし／他）、病期（ＩＩＩ＋ＩＶ対Ｉ＋ＩＩ）、ＣＡ１９－９（＞中央値）およびＰＳ（２＋３対０＋１）を含む多変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを使用して、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１バイオマーカーの潜在的に独立した予後値を評価した。ｐ＜０．０５のｐ値は、統計的に有意であるとみなされた。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）およびＭｅｄＣａｌｃバージョン１９．３（Ｍｅｄｃａｌｃソフトウエア）を使用して、グラフデザインおよび統計解析を実行した。
【0051】
転移性メラノーマを有する患者のＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルと無増悪生存期間（ＰＦＳ）と全生存期間（ＯＳ）との間の関連を、カプラン・マイヤー分析およびＣｏｘ回帰分析により、単独ならびに腫瘍ＰＤＬ１発現およびＢＲＡＦ突然変異状態について調節した後、評価した。
【0052】
種々の癌型を有する患者から獲得した試料の分析は、ダネット検定を使用する対照群に対する通常の一元配置分散分析およびその後の一対比較を使用して群全体でのＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルの比較を含んでいた。０．０５未満のｐ値は、有意であるとみなされた。統計解析およびグラフ化を、Ｒバージョン４．０．４（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０２１）、Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、ウィーン、オーストリア、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）で行った。
【0053】
結果
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１抗体の特異性
各結合部位に対してＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１抗体の抗体特異性を確保するため、それらの反応性を、標準、伸長、不完全、およびナンセンス標準ペプチドに対して、上で議論したように、予備競合ＥＬＩＳＡでテストした。ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１抗体用に選択されたナンセンスペプチドは、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３標準ペプチドであった（上記表１を参照されたい）。さらに、それらの反応性を、ミスマッチアミノ酸配列を有する除外ペプチドに対してテストした。両方の選択ペプチドは、それらの各抗体と用量依存的にシグナルを阻害した。伸長、不完全ペプチドおよびナンセンスペプチドに対する反応性はなく、除外ペプチドに対する最小限の反応性があった。さらに、ナンセンスビオチン化コーティングペプチドを使用する場合、観察された検出可能なシグナルはなかった（図２）。
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１抗体の特異性
各結合部位に対してＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１抗体の抗体特異性を確保するため、それらの反応性を、標準、伸長、不完全、およびナンセンス標準ペプチドに対して、上で議論したように、予備競合ＥＬＩＳＡでテストした。ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１抗体用に選択されたナンセンスペプチドは、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３標準ペプチドであった（上記表１を参照されたい）。さらに、それらの反応性を、ミスマッチアミノ酸配列を有する除外ペプチドに対してテストした。両方の選択ペプチドは、それらの各抗体と用量依存的にシグナルを阻害した。伸長、不完全ペプチドおよびナンセンスペプチドに対する反応性はなく、除外ペプチドに対する最小限の反応性があった。さらに、ナンセンスビオチン化コーティングペプチドを使用する場合、観察された検出可能なシグナルはなかった（図２）。
【0054】
同時に、これらのデータから、モノクローナル抗体が、それらの各標的部位に対して高いネオペプチド特異性を示すことが示唆される。
【0055】
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１ＥＬＩＳＡの技術的評価
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１ＥＬＩＳＡアッセイの技術的性能を、表４に要約する。アッセイの測定範囲（ＬＬＭＲからＵＬＭＲ）は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については３．１～１０３．０ｎｇ／ｍＬ、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については１．６～１１７．５ｎｇ／ｍＬと決定された。ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３についてのアッセイ内およびアッセイ間変動は、それぞれ５％および９％であり、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については％および５％であった。未希釈から１：２希釈までに観察されたヒト血清についての平均希釈回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については１１２％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については８５．５％であった。平均添加回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については１０２．７％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９２．５％と決定された。検体安定性は、凍結／解凍サイクルならびに４℃および２０℃での試料安定性にしたがって分析された。４回の凍結／解凍サイクル後の血清における検体回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については９９．９％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９３．０％であった。検体は、４℃で２時間から４８時間のヒト血清の長期貯蔵後に回収され、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については１０５．２～９２．２％およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９１．５～９０％の範囲の回収となった。２０℃で２時間から４８時間では、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３についての回収率範囲は、１０４．７～８０．１％であり、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９１．２～１１９．１％であった。これらのデータから、血清検体ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１が結合し、４８時間まで４℃および２０℃で安定であることが示唆される。脂質またはヘモグロビンが低含有量または高含有量のいずれであっても干渉は検出されず、回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については８３．５～１２７．７％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９５．６～１０７．９％の範囲であった。
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１ＥＬＩＳＡアッセイの技術的性能を、表４に要約する。アッセイの測定範囲（ＬＬＭＲからＵＬＭＲ）は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については３．１～１０３．０ｎｇ／ｍＬ、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については１．６～１１７．５ｎｇ／ｍＬと決定された。ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３についてのアッセイ内およびアッセイ間変動は、それぞれ５％および９％であり、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については％および５％であった。未希釈から１：２希釈までに観察されたヒト血清についての平均希釈回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については１１２％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については８５．５％であった。平均添加回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については１０２．７％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９２．５％と決定された。検体安定性は、凍結／解凍サイクルならびに４℃および２０℃での試料安定性にしたがって分析された。４回の凍結／解凍サイクル後の血清における検体回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については９９．９％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９３．０％であった。検体は、４℃で２時間から４８時間のヒト血清の長期貯蔵後に回収され、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については１０５．２～９２．２％およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９１．５～９０％の範囲の回収となった。２０℃で２時間から４８時間では、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３についての回収率範囲は、１０４．７～８０．１％であり、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９１．２～１１９．１％であった。これらのデータから、血清検体ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１が結合し、４８時間まで４℃および２０℃で安定であることが示唆される。脂質またはヘモグロビンが低含有量または高含有量のいずれであっても干渉は検出されず、回収率は、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３については８３．５～１２７．７％、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１については９５．６～１０７．９％の範囲であった。
【0056】
【表5】
【0057】
健康なドナー、ＣＰを有する患者およびＰＣを有する患者由来の血清中のＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の臨床評価
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の臨床的関連性を評価するため、健康な対照（ｎ＝２０）、ＣＰを有する患者（ｎ＝１２）およびＰＣを有する患者（ｎ＝３９）のコホート由来の血清中でバイオマーカーを測定した。健康な対照、ＣＰおよびＰＣ患者の間でＰＲＯ－Ｃ１１－２５３では有意差がなかったが、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１は、健康な対照と比較してＣＰ（ｐ＝０．０１１６）およびＰＣ（ｐ＜０．０００１）を有する患者で有意に増加した（図３Ａおよび３Ｂ）。バイオマーカーレベルとＰＣの病期との間に差異はなかっった（データを示さず）。さらに、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３とＰＲＯ－Ｃ１１－５１１バイオマーカー測定値との間に相関はなかった（ｒ、０．１４、ｐ＝０．３８２７）。
ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の臨床的関連性を評価するため、健康な対照（ｎ＝２０）、ＣＰを有する患者（ｎ＝１２）およびＰＣを有する患者（ｎ＝３９）のコホート由来の血清中でバイオマーカーを測定した。健康な対照、ＣＰおよびＰＣ患者の間でＰＲＯ－Ｃ１１－２５３では有意差がなかったが、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１は、健康な対照と比較してＣＰ（ｐ＝０．０１１６）およびＰＣ（ｐ＜０．０００１）を有する患者で有意に増加した（図３Ａおよび３Ｂ）。バイオマーカーレベルとＰＣの病期との間に差異はなかっった（データを示さず）。さらに、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３とＰＲＯ－Ｃ１１－５１１バイオマーカー測定値との間に相関はなかった（ｒ、０．１４、ｐ＝０．３８２７）。
【0058】
次に、上述したような３９人のＰＣ患者の同じ検証コホートにおいてカプラン－マイヤー曲線およびＣｏｘ比例ハザードモデルを使用してＰＲＯ－Ｃ１１－２５３およびＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の予後値を調べた。カプラン－マイヤー曲線およびＣｏｘ比例ハザードモデルにより、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３の高（＞７５％）および低（＜７５％）バイオマーカーレベルがＯＳと関連していなかったことが示された（ｐ＝０．９９５８、ＨＲ１．００、９５％Ｃｌ ０．４２～２．３５）。高（＞７５％）および低（＜７５％）ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３を有する患者についてのＯＳ中央値は、それぞれ１．２年および１．３年であった（図４Ａ）。興味深いことに、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１バイオマーカーレベルと生存率との間の関連を評価する場合、高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＞７５％）は、低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＜７５％）と比較してより短いＯＳと有意に関連していた（ｐ＝０．００４５、ＨＲ３．３３、９５％Ｃｌ １．４４～７．６９）。さらに、高（＞７％：０．３年）および低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＜７５％：２．２年）を有する患者についてのＯＳ中央値間には７倍の差異があった（図４Ｂ）。これらのデータから、ＰＲＯ－Ｃ１１－２５３ではなくＰＲＯ－Ｃ１１－５１１が、ＰＣを有する患者の予後の可能性を有することができ、同じタンパク質での特異的エピトープの測定が、異なる値を与える可能性があることを示唆する。
【0059】
検証コホートにおける予後バイオマーカーとしてのＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の確認
上述したＰＣ発見コホートで認められたＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の予後バイオマーカーの可能性を検証するため、ＰＣを有する患者のより大きいコホート（ｎ＝６８６）でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルを測定した。興味深いことに、各疾患の病期（ステージＩ～ＩＶ）に患者を分ける場合、ステージＩＩ～ＩＶおよびステージＩＩＩ～ＩＶ由来のＰＲＯ－Ｃ１１－５１１で有意な増加があった（図５）。次に、高（＞７５％）および低（＜７５％）ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１とＯＳとの間の関連を観察した。発見コホートと同様に、高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＞７５％）は、低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＜７％）と比較してより大きい研究個体群でより短いＯＳと有意に関連していた（ｐ＜０．０００１、ＨＲ１．６８、９５％Ｃｌ １．４０～２．０２）。高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＞７５％）を有する患者についてのＯＳ中央値は、０．４８年であり、低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＜７５％）を有する患者については０．８２年であった（図６Ａ）。興味深いことに、ベースラインから２年後、低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１患者群の２１％と比較して高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１患者群では７．０％のみ生存した（図６Ｂ）。これらのデータにより、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１がＰＣを有する患者の予後の可能性を有することが確認される。
上述したＰＣ発見コホートで認められたＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の予後バイオマーカーの可能性を検証するため、ＰＣを有する患者のより大きいコホート（ｎ＝６８６）でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルを測定した。興味深いことに、各疾患の病期（ステージＩ～ＩＶ）に患者を分ける場合、ステージＩＩ～ＩＶおよびステージＩＩＩ～ＩＶ由来のＰＲＯ－Ｃ１１－５１１で有意な増加があった（図５）。次に、高（＞７５％）および低（＜７５％）ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１とＯＳとの間の関連を観察した。発見コホートと同様に、高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＞７５％）は、低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＜７％）と比較してより大きい研究個体群でより短いＯＳと有意に関連していた（ｐ＜０．０００１、ＨＲ１．６８、９５％Ｃｌ １．４０～２．０２）。高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＞７５％）を有する患者についてのＯＳ中央値は、０．４８年であり、低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＜７５％）を有する患者については０．８２年であった（図６Ａ）。興味深いことに、ベースラインから２年後、低ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１患者群の２１％と比較して高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１患者群では７．０％のみ生存した（図６Ｂ）。これらのデータにより、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１がＰＣを有する患者の予後の可能性を有することが確認される。
【0060】
ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１およびＯＳの関連が、臨床的共変量とは無関係であるかどうかを評価するため、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を年齢、転移部位（＜１対≦１）、肝転移（あり対なし／他）、病期（ＩＩＩ＋ＩＶ対Ｉ＋ＩＩ）、ＣＡ１９－９（＞中央値）およびＰＳ（２＋３対０＋１）について調節して多変量Ｃｏｘ分析を実行した。分析により、高レベルのＰＲＯ－Ｃ１１－５１１（＞７５％）が、臨床的共変量に依存せず、そのため、依然として調節後もＰＣ患者のＯＳの予測因子であった（ｐ＜０．００２１、ＨＲ１．４１、９５％Ｃｌ １．１３～１．７４（表５Ａおよび５Ｂ）。
【0061】
【表6】
【0062】
【表7】
【0063】
転移性メラノーマ患者のＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の臨床評価
カプラン－マイヤー分析により転移性メラノーマ患者のＰＲＯ－Ｃ１１－５１１と生存転帰との間の関連を評価した。７５パーセンタイルカットポイントを使用して、高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベル（＞７５パーセンタイル）を有する患者が有意に悪化したＰＦＳ（ｐ＝０．０３２）およびＯＳ（ｐ＝０．０２０）を有していることが分かった（図７）。支持として、単変量Ｃｏｘ回帰は、不十分なＰＦＳ（ＨＲ＝２．８７、９５％ＣＩ＝１．０５～７．８７、ｐ＝０．０４０）およびＯＳ（ＨＲ＝４．５８、９５％ＣＩ＝１．１３～１８．６５、ｐ＝０．０３４）の予測因子として高（＞７５パーセンタイル）ベースラインＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を同定した。さらに、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１がＰＤＬ１発現（≧１％）およびＢＲＡＦ突然変異について調節された場合、バイオマーカーは、不十分なＰＦＳ（ＨＲ＝３．６６、９５％ＣＩ＝１．２２～１０．９８、ｐ＝０．０２１）およびＯＳ（ＨＲ＝７．８５、９５％ＣＩ＝１．３２～４６．７８、ｐ＝０．０２４）の独立した予測因子のままであった（表６）。
カプラン－マイヤー分析により転移性メラノーマ患者のＰＲＯ－Ｃ１１－５１１と生存転帰との間の関連を評価した。７５パーセンタイルカットポイントを使用して、高ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベル（＞７５パーセンタイル）を有する患者が有意に悪化したＰＦＳ（ｐ＝０．０３２）およびＯＳ（ｐ＝０．０２０）を有していることが分かった（図７）。支持として、単変量Ｃｏｘ回帰は、不十分なＰＦＳ（ＨＲ＝２．８７、９５％ＣＩ＝１．０５～７．８７、ｐ＝０．０４０）およびＯＳ（ＨＲ＝４．５８、９５％ＣＩ＝１．１３～１８．６５、ｐ＝０．０３４）の予測因子として高（＞７５パーセンタイル）ベースラインＰＲＯ－Ｃ１１－５１１を同定した。さらに、ＰＲＯ－Ｃ１１－５１１がＰＤＬ１発現（≧１％）およびＢＲＡＦ突然変異について調節された場合、バイオマーカーは、不十分なＰＦＳ（ＨＲ＝３．６６、９５％ＣＩ＝１．２２～１０．９８、ｐ＝０．０２１）およびＯＳ（ＨＲ＝７．８５、９５％ＣＩ＝１．３２～４６．７８、ｐ＝０．０２４）の独立した予測因子のままであった（表６）。
【0064】
【表8】
【0065】
種々の癌型を有する患者のＰｒｏ－Ｃ１１－５１１の臨床評価
他のタイプの癌でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の臨床的関連性を確認するため、２２２個の癌試料（それぞれ膵癌、結腸直腸癌、腎癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、メラノーマ、頭頸部癌および前立腺癌の２０人の患者、１９人の卵巣癌患者、３人の肝癌患者）ならびに３３人の年齢が釣り合った健康な対照からなる、さらなる患者コホート由来の血清試料中でＰｒｏ－Ｃ１１－５１１のレベルを測定した。すべての癌型でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルを評価し、健康な対照と比較して、肝癌を除くすべての癌型で有意に上昇した（図８）。
他のタイプの癌でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１の臨床的関連性を確認するため、２２２個の癌試料（それぞれ膵癌、結腸直腸癌、腎癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、メラノーマ、頭頸部癌および前立腺癌の２０人の患者、１９人の卵巣癌患者、３人の肝癌患者）ならびに３３人の年齢が釣り合った健康な対照からなる、さらなる患者コホート由来の血清試料中でＰｒｏ－Ｃ１１－５１１のレベルを測定した。すべての癌型でＰＲＯ－Ｃ１１－５１１レベルを評価し、健康な対照と比較して、肝癌を除くすべての癌型で有意に上昇した（図８）。
【0066】
本明細書において、明示的に別段の指示がない限り、単語「または」は、記載された条件のいずれかまたは両方が満たされた場合、真の値を返す演算子の意味で使用され、条件のうち１つのみが満たされることを必要とする演算子「排他的論理和」とは対照的である。単語「含む」は、「含むまたはからなる」を意味するために使用される。上記で認められたすべての先行教示は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において、いかなる先行公開文書の認識も、その教示が本明細書の日付の時点で、オーストラリアまたはその他の地域で共通の一般的な知識であったことを認めたり表明したりするものと解釈されるべきではない。
【0067】
参考文献
【表9】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】