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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】風味改変型タンパク質及びそれを含む食製品
(51)【国際特許分類】
C07K 14/415 20060101AFI20231220BHJP
A23L 27/30 20160101ALI20231220BHJP
A23L 27/00 20160101ALI20231220BHJP
A23C 9/13 20060101ALI20231220BHJP
A23L 27/60 20160101ALI20231220BHJP
A23G 4/06 20060101ALI20231220BHJP
A23F 5/24 20060101ALI20231220BHJP
A23F 3/16 20060101ALI20231220BHJP
A23L 2/60 20060101ALI20231220BHJP
A23L 2/64 20060101ALI20231220BHJP
A23L 19/00 20160101ALI20231220BHJP
A23L 25/10 20160101ALI20231220BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20231220BHJP
【ＦＩ】
C07K14/415 ZNA
A23L27/30 Z
A23L27/00 Z
A23L27/00 E
A23L27/00 D
A23L27/00 101A
A23L27/00 101
A23L27/30 A
A23L27/30 C
A23C9/13
A23L27/60 B
A23G4/06
A23F5/24
A23F3/16
A23L2/60
A23L2/64 101
A23L19/00 Z
A23L25/10
C12N15/29
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537469
(86)(22)【出願日】2021-12-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-15
(86)【国際出願番号】 IB2021062109
(87)【国際公開番号】W WO2022137121
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】63/128,207
(32)【優先日】2020-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/174,550
(32)【優先日】2021-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/223,608
(32)【優先日】2021-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523226538
【氏名又は名称】アマイ プロテインズ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＡＩ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】２Ａ Ｈａｉｍ Ｈｏｌｚｍａｎ Ｓｔ．， Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サミシュ イラン
(72)【発明者】
【氏名】カス イタマール
(72)【発明者】
【氏名】ヘクト ダリット
(72)【発明者】
【氏名】マルコ シュムエル
(72)【発明者】
【氏名】ズケール インバル
【テーマコード（参考）】
4B001
4B014
4B016
4B027
4B036
4B047
4B117
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B001AC02
4B001AC05
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4B001AC43
4B014GB13
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4B014GG08
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4H045AA10
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4H045GA23
4H045GA24
(57)【要約】
本発明は、参照ＭＮＥＩタンパク質からの２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせを有するアミノ酸配列を含む改変ＭＮＥＩタンパク質であって、改変ＭＮＥＩタンパク質が、参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する、改変ＭＮＥＩタンパク質、及び食品産業におけるその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質であって、参照ＭＮＥＩタンパク質からの２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、前記改変ＭＮＥＩタンパク質が、前記参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する、改変単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質。
【請求項2】
少なくとも２つ以上のアミノ酸の欠失、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせが、前記参照ＭＮＥＩタンパク質の表面上又は前記参照ＭＮＥＩタンパク質のコア内に位置する、請求項１に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項3】
少なくとも２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせが、４６～５６残基にわたる前記改変ＭＮＥＩタンパク質のループ及びベータ鎖エッジ内に位置する、請求項１に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項4】
参照ＭＮＥＩタンパク質と４０％～９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＭＮＥＩタンパク質であって、前記改変ＭＮＥＩタンパク質が、前記参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する、改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項5】
ロゼッタエネルギー単位（ＲＥＵ）で表される－１８２未満のエネルギーを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項6】
前記少なくとも１つの食品関連特性が、甘味度、甘味動態、マスキング効果、味覚の増強、及び異味のうちの少なくとも１つである、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項7】
前記参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１．５倍増加した甘味度を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項8】
前記参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して、下記の少なくとも１つの特徴を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。（１）増加された熱安定性、（２）増加されたｐＨ安定性、（３）増加された溶解性、（４）疎水性領域への減少した結合、（５）高圧安定性、及び（６）増加された貯蔵寿命安定性。
【請求項9】
前記改変ＭＮＥＩタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項10】
前記参照ＭＮＥＩタンパク質が、配列番号４５に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質。
【請求項11】
経口送達用製品の調製に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の２つ以上の改変ＭＮＥＩタンパク質の任意の組み合わせ。
【請求項12】
前記製品が、食製品、栄養補助食製品、又は薬剤である、請求項１１に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質、又はＭＮＥＩタンパク質の組み合わせ。
【請求項13】
風味改変剤、風味増強剤、又は風味マスキング剤として使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の２つ以上の改変ＭＮＥＩタンパク質の任意の組み合わせ。
【請求項14】
甘味料として使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の２つ以上の改変ＭＮＥＩタンパク質の任意の組み合わせ。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の２つ以上の改変ＭＮＥＩタンパク質の任意の組み合わせを含む、食製品。
【請求項16】
少なくとも１つの食品成分を含む、請求項１５に記載の食製品。
【請求項17】
前記食品成分が、人工風味料、食品添加物、食用染料、防腐剤、又は甘味増強剤のうちの少なくとも１つである、請求項１６に記載の食製品。
【請求項18】
前記食品成分が、ステビア、スクロース、アガベネクター、玄米シロップ、ナツメヤシ糖、蜂蜜、メープルシロップ、糖蜜、ラカンカ、糖アルコール、希少砂糖、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウム、サッカリン、ネオテーム、アドバンテーム、及び食物繊維からなる群から選択される、請求項１７に記載の食製品。
【請求項19】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の２つ以上の改変ＭＮＥＩタンパク質の任意の組み合わせを含む、甘味組成物。
【請求項20】
請求項１９に記載の甘味組成物を含む、摂取可能な組成物。
【請求項21】
前記摂取可能な組成物が、低い血糖効果を有し、液体又は固体の食料品の形態にある、請求項２０に記載の摂取可能な組成物。
【請求項22】
１つ以上の改変単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質を含む食品又は飲料配合物であって、前記１つ以上の改変ＭＮＥＩタンパク質が、１００ｇｒ又は１００ｍｌ当たり約０．２ｍｇ～約３０ｍｇの範囲にある、食品又は飲料配合物。
【請求項23】
前記配合物が、約２～約８．５の範囲のｐＨを有する、請求項２２に記載の食品又は飲料配合物。
【請求項24】
前記改変ＭＮＥＩタンパク質が、配列番号４５に記載の前記配列を含む参照ＭＮＥＩタンパク質と４０％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の食品又は飲料配合物。
【請求項25】
前記改変ＭＮＥＩタンパク質が、配列番号１～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項２２に記載の食品又は飲料配合物。
【請求項26】
ヒト対象による消費のために配合された食品又は飲料組成物であって、前記組成物が、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の配合物を含む、食品又は飲料組成物。
【請求項27】
前記飲料が、炭酸清涼ドリンク、非炭酸清涼ドリンク、ファウンテン飲料、冷凍レディ・トゥ・ドリンク飲料、コーヒー飲料、茶飲料、乳飲料、果実飲料、風味付き水、増強水、スポーツドリンク、エネルギードリンク、アイソトニックドリンク、低カロリードリンク、及びアルコール飲料からなる群から選択される、請求項２６に記載の飲料組成物。
【請求項28】
前記食品が、ベーカリー製品、クッキー、ビスケット、ベーキングミックス、シリアル、菓子類、キャンディー、トフィー、チューインガム、風船ガム、乳製品、ヨーグルト、風味付きヨーグルト、ピーナッツバター、醤油及び他のダイズベースの製品、非乳製品、サラダドレッシング、ケチャップ、マヨネーズ、酢、冷凍デザート、肉製品、魚肉製品、瓶入り及び缶詰食品、卓上甘味料、チョコレート、果実、乾燥果実、並びに野菜からなる群から選択される、請求項２６に記載の食品組成物。
【請求項29】
前記組成物が、参照ＭＮＥＩタンパク質を有する食品又は飲料組成物と比較して、少なくとも１つの改善された食品又は飲料関連特性を有する、請求項２６に記載の食品又は飲料組成物。
【請求項30】
前記少なくとも１つの改善された食品又は飲料関連特性が、より良好な甘味プロファイル、短縮された甘い残味、より良好な甘味度、より良好な甘味動態、増加された熱安定性、高圧安定性、増加されたｐＨ安定性、疎水性領域への減少した結合、改善された凍結解凍安定性、乾燥後の改善された再構成性、増加された溶解性、砂糖のものにより近い感覚プロファイル、及び増加された貯蔵寿命安定性からなる群から選択される、請求項２９に記載の食品又は飲料組成物。
【請求項31】
少なくとも１つの追加の食品成分を含む、請求項２６に記載の食品又は飲料組成物。
【請求項32】
前記食品成分が、風味料、食品添加物、食用染料、防腐剤、及び甘味増強剤からなる群から選択される、請求項３１に記載の食品又は飲料組成物。
【請求項33】
前記食品成分が、ステビア、スクロース、アガベネクター、玄米シロップ、ナツメヤシ糖、蜂蜜、メープルシロップ、糖蜜、ステビオールグリコシド、ラカンカ、糖アルコール、希少砂糖、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウム、サッカリン、ネオテーム、アドバンテーム、及び食物繊維からなる群から選択される、請求項３１に記載の食品又は飲料組成物。
【請求項34】
前記食品又は飲料組成物が、低血糖効果を有する、請求項２６に記載の食品又は飲料組成物。
【請求項35】
前記炭酸清涼ドリンクが、コーラ、レモンライム風味のスパークライン飲料、オレンジ風味の発泡性飲料、グレープフルーツ風味の発泡性飲料、ブドウ風味の発泡性飲料、ラズベリー風味の発泡性飲料、イチゴ風味の発泡性飲料、パイナップル風味の発泡性飲料、ジンジャーエール、ルートビア、及び麦芽飲料からなる群から選択される、請求項２７に記載の飲料組成物。
【請求項36】
前記非炭酸清涼ドリンクが、果実ジュース、果実風味ジュース、ジュースドリンク、ネクター、野菜ジュース、野菜風味ジュース、スポーツドリンク、エネルギードリンク、タンパク質ドリンク、ビタミン入り増強水、ニアウォータードリンク、ココナッツウォーター、茶、コーヒー、カカオドリンク、ミルク構成成分含有飲料、穀類抽出物含有飲料、及びスムージーからなる群から選択される、請求項２７に記載の飲料組成物。
【請求項37】
請求項２２に記載の配合物を含む、添加糖が少ないか、又は無糖の清涼飲料製品。
【請求項38】
請求項２２に記載の配合物を含む、添加糖が少ないか、又は無糖の乳製品。
【請求項39】
請求項２２に記載の配合物を含む、添加糖が少ないか、又は無糖のソース製品。
【請求項40】
請求項２２に記載の配合物を含む、添加糖が少ないか、又は無糖の乾燥果実。
【請求項41】
請求項２２に記載の配合物を含む、添加糖が少ない又は無糖のガム製品。
【請求項42】
請求項２２に記載の配合物を含む、添加糖が少ない又は無糖のスプレッド製品。
【請求項43】
請求項２２に記載の配合物を含む、添加糖が少ない又は無糖のシロップ製品。
【請求項44】
前記アミノ酸の欠失、置換、置き換え、グラフト化、又はそれらの任意の組み合わせが、前記改変タンパク質のループ領域の安定化を、（ｉ）少なくとも１つの水素結合を添加すること、（ｉｉ）前記ループ領域を保持するベータ鎖を延長させること、（ｉｉｉ）前記ループ領域における相対的なデバイ－ウォーラー因子を減少させること、又は（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つによって達成することができる、請求項１に記載の改変単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質。
【請求項45】
前記安定化が、（ｉ）凝集の減少、（ｉｉ）溶融温度の上昇、（ｉｉｉ）貯蔵寿命安定性の増加、又は（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを行うことができる、請求項４４に記載の改変単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、風味改変型タンパク質、並びにそれを含む配合物及び食製品に関する。風味改変型タンパク質は、動物飼料及びヒト消費のための様々な配合物中に提供され得る。
【背景技術】
【0002】
砂糖の代替物は、代謝異常症候群の根底にある原因としての砂糖の過剰摂取の結果として、疾患認識の増加に起因してますます注目されている。代謝異常症候群の既知の症状発現は、糖尿病、肥満、虫歯、いくつかのタイプのがん、及び多くの追加の病気である。飲食業界は、消費者及び公的政策当局の要求を満たすために、より健康的で低減したカロリーの食品を生成することに挑戦している。この一部として、多数の国が、砂糖税及び警告ラベルを適用している。
【0003】
食品産業は、製品の成功に必要な味覚を提供しながら、消費者の動向に適合するより自然でより良好な食品及び飲料にするという課題に直面している。低カロリー甘味料成分は、食物中のカロリー及び砂糖レベルを低減しようとする消費者の選択肢を広げているが、これらの成分は、味覚、安定性、及び汎用性によって限定されている。
【0004】
世界市場での競争に成功するために、最適な感覚特性及び良好な安定性を有する食製品及び飲料製品のための健康的な甘味代替物に対する緊急の世界的ニーズが存在する。人工の高強度甘味料（high-intensity sweetener、ＨＩＳ）、例えば、サッカリン、アスパルテーム、シクラメート、並びにアセスルファムＫ、スクラロース、ネオテーム、及びアドバンテームは、糖尿病、高脂血症、代謝異常症候群などの砂糖関連疾患に罹患している患者のための低カロリー甘味料として世界中で使用されている。ＨＩＳは、様々な副作用を有し、例えば、これらのゼロカロリー甘味料は、砂糖よりも程度が低いとしても、ミクロビオームと相互作用し、肥満及び前糖尿病状態を引き起こすことが報告されている（Ｓｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ５１４，ｐａｇｅｓ １８１－１８６）。アメリカ心臓協会（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、「有害な健康への影響に関する証拠不足（”ａ ｄｅａｒｔｈ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｈｅａｌｔｈ ｅｆｆｅｃｔｓ”）」と主張する、ＨＩＳに対する助言を公開した（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１３８，Ｎｏ．９）。この助言では、天然（ステビオールグリコシド及びラカンカ）及び人工の全てのＨＩＳを同じ精査下に置いた。更に、低強度甘味料（low-intensity sweetener、ＬＩＳ）、すなわち希少糖及びポリオール（例えば、キシリトール、マンニトール、アルロースなど）は、高コストを伴い、人体によって完全に消化されず、膨満、下痢、及び他の有害な胃腸作用を回避するためにそれらの使用が限定される。したがって、現在、著しい（３０％超）砂糖の低減を可能にし、味覚、健康、コスト、及び製品適合性に完全に対処する良好な砂糖の代替物は存在しない。
【0005】
甘味タンパク質（sweet protein、ＳＰ）は、スクロースとは異なり、タンパク質がインスリン応答を誘導しないため、グリセミック指数を有しない天然の美味な低カロリー甘味料を提供することによってＨＩＳを置き換える可能性を有する（Ｗｅｉｈｒａｕｃｈ ２００１及びＣｏｈｅｎ ２００１）。ＳＰは、南国の果実に見られ、砂糖よりも７００～３，０００倍甘い。これらの健康甘味料は、砂糖と同様に甘味受容体に結合するが、タンパク質として消化される。それらは、グリセミック指数がゼロであり、約０カロリーを有し、健康又はミクロビオームに悪影響を及ぼさないと予想される。タウマチンは、現在、市場において世界的に承認されている唯一の甘味タンパク質である。価格の高さ、限定された供給、及び最適以下の感覚プロファイルに起因して、ＳＰは、一般に、著しい（３０％超）砂糖低減解決策として使用されない。タウマチン以外に、ＳＰは、費用、限定された供給、低い安定性、特に脂肪環境における短い貯蔵寿命、及び残味に起因して、大量食品市場に参入していない。したがって、前述の問題のうちの１つ以上を克服するための組成物及び配合物を開発する必要がある。
【0006】
英国特許第２１２３６７２号は、タウマチン及びモネリンなどの甘味タンパク質、並びに任意選択で食用酸又は増量剤とともに、様々な飲料、マウスウォッシュ中に、又は医薬ベースとして組み込まれる弱酸性多糖ガムを記載している。
【0007】
国際公開第８４０２４５０号は、タウマチン又はモネリンの、ガムベース、甘味料、及び風味料を含むチューインガム組成物の表面への適用を記載している。
【0008】
国際公開第２０１９／２１５７３０号は、改善された食品関連特性を有する改変タンパク質を開示している。
【発明の概要】
【0009】
いくつかの態様によれば、本開示は、単鎖モネリン（Monellin、ＭＮＥＩ）タンパク質の改変バージョンを提供し、これは、ＭＮＥＩ参照タンパク質からの２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【0010】
いくつかの他の態様によれば、本開示は、改変ＭＮＥＩタンパク質を含む食製品を提供し、これは、ＭＮＥＩ参照タンパク質からの２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。いくつかの実施形態によれば、改変タンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質からの少なくとも３つのアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0011】
いくつかの実施形態によれば、２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせは、参照ＭＮＥＩタンパク質の表面又は参照ＭＮＥＩタンパク質のコアに位置する。いくつかの実施形態によれば、２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせは、改変ＭＮＥＩループ（「リンカー領域」とも呼ばれる）及びベータ－鎖エッジ内に位置する。いくつかの実施形態によれば、２つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換え、又はそれらの任意の組み合わせは、４６～５６残基にわたる改変ＭＮＥＩループ及びベータ－鎖エッジ内に位置する。
【0012】
いくつかの実施形態によれば、（ｉ）少なくとも１つの水素結合を添加すること、（ｉｉ）ループ領域を保持するベータ鎖を延長させること、（ｉｉｉ）ループ領域における相対的なデバイ－ウォーラー因子を減少させること、又は（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つによってループ領域を安定化させる、該アミノ酸の欠失、置換、置き換え、グラフト化、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態によれば、該安定化は、（ｉ）凝集の減少、（ｉｉ）溶融温度の増加、（ｉｉｉ）貯蔵寿命安定性の増加、又は（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つに関連する。
【0013】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質は、ロゼッタエネルギー単位（Rosetta Energy Unit、ＲＥＵ）で表される－１８２未満のエネルギーを有する。
【0014】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの食品関連特性は、甘味度、甘味動態、マスキング効果、味覚の増強、異味、又はそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１．５倍増加した甘味度を有する。
【0015】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して、（１）増加された熱安定性、（２）増加されたｐＨ安定性、（３）増加された溶解性、（４）疎水性領域への減少した結合、（５）高圧安定性、（６）増加された貯蔵寿命安定性、及びそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを特徴とする。
【0016】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0017】
いくつかの実施形態によれば、参照ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号４５に記載の配列を有する。
【0018】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質又はその任意の組み合わせは、経口送達用製品の調製において使用される。
【0019】
いくつかの実施形態によれば、製品は、食製品、栄養補助食製品、又は薬剤である。
【0020】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質又はその任意の組み合わせは、風味改変剤又は風味増強剤として使用される。
【0021】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質は、甘味料として使用される。
【0022】
いくつかの態様によれば、本開示は、本発明の改変タンパク質を含む食製品を提供する。
【0023】
いくつかの実施形態によれば、食製品は、少なくとも１つの食品成分を含む。いくつかの実施形態によれば、食品成分は、人工風味料、食品添加物、食用染料、防腐剤、又は砂糖添加物のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態によれば、食品成分は、ステビア、スクロース、アガベネクター、玄米シロップ、ナツメヤシ糖、蜂蜜、メープルシロップ、糖蜜、ラカンカ、糖アルコール、希少砂糖、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウム、サッカリン、ネオテーム、アドバンテーム、及び食物繊維からなる群から選択される。
【0024】
いくつかの実施形態によれば、該ステビアは、レバウジオシド又はステビオールグリコシドである。いくつかの実施形態によれば、該レバウジオシドは、ＲｅｂＭである。
【0025】
いくつかの実施形態によれば、ＲｅｂＭと本発明の改変ＭＮＥＩタンパク質との間に相乗作用が存在する。
【0026】
いくつかの態様によれば、本開示は、本発明の改変ＭＮＥＩタンパク質を含む甘味組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、該甘味組成物を含む摂取可能な組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、摂取可能な組成物は、低い血糖効果を有し、液体又は固体食料品の形態にある。
【0027】
本発明は、いくつかの態様によれば、改善された食品又は飲料関連特性を有する特定の食品及び飲料配合物を提供する。
【0028】
いくつかの態様によれば、本開示は、１００ｇｒ又は１００ｍｌ当たり約０．２ｍｇ～約３０ｍｇの範囲の１つ以上の改変単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質を含む食品又は飲料配合物を提供する。いくつかの実施形態によれば、範囲は、１００ｇｒ又は１００ｍｌ当たり約０．４ｍｇ～約１０ｍｇである。
【0029】
いくつかの実施形態によれば、該配合物は、約２～約８．５の範囲のｐＨを有する。
【0030】
いくつかの実施形態によれば、該改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含む参照ＭＮＥＩタンパク質と４０％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0031】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩは、配列番号１～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0032】
いくつかの実施形態によれば、改変ＭＮＥＩタンパク質は、消化可能なタンパク質である。
【0033】
いくつかの態様によれば、本発明は、ヒト対象による消費のために配合された食品又は飲料組成物を提供し、本組成物は、該配合物を含む。
【0034】
いくつかの実施形態によれば、飲料組成物は、炭酸清涼ドリンク、非炭酸清涼ドリンク、ファウンテン飲料、冷凍レディ・トゥ・ドリンク飲料、コーヒー飲料、茶飲料、乳飲料、果実飲料、風味付き水、増強水、スポーツドリンク、エネルギードリンク、アイソトニックドリンク、低カロリードリンク、及びアルコール飲料からなる群から選択される。
【0035】
いくつかの実施形態によれば、食品組成物は、焼成品、クッキー、ビスケット、ベーキングミックス、シリアル、菓子類、キャンディー、トフィー、チューインガム、乳製品、ヨーグルト、風味付きヨーグルト、醤油及び他のダイズベースの製品、非乳製品、サラダドレッシング、ケチャップ、マヨネーズ、酢、冷凍デザート、肉製品、魚製品、瓶入り及び缶詰食品、卓上甘味料、チョコレート、果実、乾燥果実、並びに野菜からなる群から選択される。
【0036】
いくつかの実施形態によれば、該組成物は、参照ＭＮＥＩタンパク質を有する食品又は飲料組成物と比較して、少なくとも１つの改善された食品又は飲料関連特性を有する。
【0037】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの改善された食品又は飲料関連特性は、改善された甘味プロファイル、短縮された甘い残味、改善された甘味度、改善された甘味動態、増加された熱安定性、高圧安定性、増加されたｐＨ安定性、疎水性領域への減少した結合、改善された凍結解凍安定性、乾燥後の改善された再構成性、増加された溶解性、砂糖のものにより近い感覚プロファイル、及び増加された貯蔵寿命安定性からなる群から選択される。
【0038】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の食品成分を含む食品又は飲料組成物。
【0039】
いくつかの実施形態によれば、食品成分は、風味料、食品添加物、食用染料、防腐剤、又は甘味増強剤のうちの少なくとも１つである。
【0040】
いくつかの実施形態によれば、食品成分は、ステビア、スクロース、アガベネクター（agave nectar）、玄米シロップ、ナツメヤシ糖、蜂蜜、メープルシロップ、糖蜜、ステビオールグリコシド、ラカンカ、糖アルコール、希少砂糖、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウム、サッカリン、ネオテーム、アドバンテーム、及び食物繊維からなる群から選択される。
【0041】
いくつかの実施形態によれば、希少砂糖は、アルロース又はタガトースである。
【0042】
いくつかの実施形態によれば、食品又は飲料組成物は、低い血糖効果を有する。
【0043】
いくつかの実施形態によれば、炭酸清涼ドリンクは、コーラ、レモンライム風味の発泡性飲料、オレンジ風味の発泡性飲料、グレープフルーツ風味の発泡性飲料、ブドウ風味の発泡性飲料、ラズベリー風味の発泡性飲料、イチゴ風味の発泡性飲料、パイナップル風味の発泡性飲料、ジンジャーエール、ルートビア、及び麦芽飲料からなる群から選択される。
【0044】
いくつかの実施形態によれば、非炭酸清涼ドリンクは、果実ジュース、果実風味ジュース、ジュースドリンク、ネクター、野菜ジュース、野菜風味ジュース、スポーツドリンク、エネルギードリンク、タンパク質ドリンク、ビタミン入り増強水、ニアウォータードリンク、ココナッツウォーター、茶、コーヒー、カカオドリンク、ミルク構成成分含有飲料、穀類抽出物含有飲料、及びスムージーからなる群から選択される。
【0045】
いくつかの実施形態によれば、配合物は、経口送達用製品を調製するのに使用される。
【0046】
いくつかの実施形態によれば、製品は、食製品若しくは飲料製品、栄養補助食物製品、又は薬剤である。
【0047】
いくつかの態様によれば、本開示は、本発明の配合物を含む食製品又は飲料製品を提供する。
【0048】
いくつかの態様によれば、本開示は、該配合物を含む添加糖が少ないか、又は無糖の清涼飲料製品を提供する。
【0049】
いくつかの態様によれば、本開示は、該配合物を含む添加糖が少ないか、又は無糖の乳製品を提供する。いくつかの実施形態によれば、該乳製品は、ヨーグルト又はマラビ（malabi）である。
【0050】
いくつかの態様によれば、本開示は、該配合物を含む添加糖が少ないか、又は無糖のソース製品を提供する。いくつかの実施形態によれば、該ソースは、ケチャップである。
【0051】
いくつかの態様によれば、本開示は、該配合物を含む添加糖が少ないか、又は無糖の乾燥果実を提供する。いくつかの実施形態によれば、該乾燥果実は、クランベリー、レーズン、ブルーベリー、プルーン、サクランボ、リンゴ、パイナップル、スイカ、カンタロープ、イチジク、バナナ、ナツメヤシ、スグリ、及びアプリコットからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、該乾燥果実は、フルーツレザー（fruit leather）である。
【0052】
いくつかの態様によれば、本開示は、該配合物を含む添加糖が少ないか、又は無糖のガム製品を提供する。いくつかの実施形態によれば、該ガム製品は、チューインガム又は風船ガム製品である。
【0053】
いくつかの態様によれば、本開示は、該配合物を含む添加糖が少ないか、又は無糖のスプレッド製品を提供する。いくつかの実施形態によれば、該スプレッド製品は、ピーナッツバターである。
【0054】
いくつかの態様によれば、本開示は、該配合物を含む添加糖が少ないか、又は無糖のシロップ製品を提供する。
【0055】
本明細書に開示されている主題をより良く理解し、実際にそれがどのように実行され得るかを例証するために、添付の図面を参照して、非限定的な例としてのみ、ここで実施形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1】ＭＮＥＩの相対甘味を示すヒストグラムであり、ＭＮＥＩ改変タンパク質の甘味を、ＤＭ０９に対して、水中で希釈した１：４０００の効力に基づいて６°Ｂｘで評価した。
【図3】９０℃に最大１０分加熱した後の、クエン酸緩衝液中のＤＭ１３の安定性を示すヒストグラムである。Ｙ軸は、甘味強度である。
【図4】９５℃に３０秒間加熱した後のクエン酸緩衝液中のＤＭ１３の安定性を示すヒストグラムである。Ｙ軸は、甘味強度である。
【図5A】２１℃及び３２℃で８週間保存した後のＤＭ１３の安定性を示すヒストグラムである。Ｙ軸は、甘味強度である。
【図5B】２１℃及び３２℃で８週間保存した後のＤＭ１３の安定性を示すヒストグラムである。Ｙ軸は、甘味強度である。
【図6】添加された砂糖が６９％低減した対照ケチャッププロトタイプ及びＤＭ０９を有する例示的なケチャップの特性を示すスパイダーグラフであり、結果は、対照ケチャップが、ＤＭ０９を有するケチャップと比較して、より甘くなく、より酸味があり、より塩味があり、かつ舌により強い刺痛をもたらすことを示す。
【図7】添加された砂糖が６９％低減したケチャッププロトタイプが、全糖ケチャップと比較して、より甘くなく、より酸味があり、かつより明るい色を有することを示すスパイダーグラフである。
【図8】ＤＭ０９を有するケチャッププロトタイプ（添加された砂糖が６９％低減されたもの）が、全糖ケチャップに非常に類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図9】ＤＭ２８を有するケチャップが、ＤＭ０９を有するケチャップと比較して類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図10】１ヶ月の貯蔵寿命後に、ＤＭ０９を有するケチャップが、その甘味を失わないことを示すスパイダーグラフである。製品に生じる変化は、１ヶ月の貯蔵寿命後のケチャップに典型的なものである（より暗い色、より調味された、より酸味のある、より濃厚な、より滑らかでない質感）。
【図11】添加された砂糖が３３％低減したプレーンヨーグルトが、ＤＭ０９を有し、かつ添加された砂糖が３３％低減したプレーンヨーグルトより甘くないことを示すスパイダーグラフである。
【図12】ＤＭ０９を有するプレーンヨーグルト（添加された砂糖が３３％低減した）が、全糖ヨーグルトに類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図13】ＤＭ２８を有するイチゴヨーグルトが、ＤＭ０９を有するイチゴヨーグルトに類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図14】２週間の貯蔵寿命後に、ＤＭ０９を有するプレーンヨーグルトが、ＤＭ０９を有する新鮮なプレーンヨーグルトに類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図15】ステビア及びＤＭ０９を有する水溶液が、同じ甘味レベル当量で、ステビアを単独で有する水溶液より甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図16】ラカンカ、ステビア、及びＤＭ０９の組み合わせを有する水溶液が、同じ甘味レベル当量で、ラカンカ及びステビアのみを有する水溶液と比較して、より甘く、より短い「遅発性」であることを示すスパイダーグラフである。
【図17】レモン風味ドリンク（ステビアを有する５０％の砂糖低減、５°Ｂｘ当量）が、ステビア及びＤＭ０９（各々２．５°Ｂｘ当量）に非常に類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図18】ＤＭ０３１を有するケチャップ（添加された砂糖が６９％低減した）が、ＤＭ０９を有するケチャップに非常に類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図19】ＤＭ３１を有するイチゴヨーグルトが、ＤＭ０９を有するイチゴヨーグルトに類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図20】ＤＭ０９を有するチューインガムが、３０秒間の咀嚼後にＤＭ０９を有しないチューインガムより甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図21】ＤＭ０９及び５０％の砂糖低減を有するピーナッツバターが、全糖ピーナッツバターに類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図22】ＤＭ０９（７０％の砂糖低減）を有するアイスコーヒーが、ＤＭ０９（７０％の砂糖低減）を有しないアイスコーヒーより甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図23】クランベリージュース（４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ０９）が、全糖クランベリージュースに類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである。
【図24】ＤＭ２８を有するクランベリージュースが、ＤＭ０９を有するクランベリージュースより甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図25】４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ３１を有するクランベリージュースが、４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ０９を有するクランベリージュースに類似した感覚プロファイルを有することを示すスパイダーグラフである）。
【図26】乾燥クランベリー（５０％の砂糖低減及びＤＭ０９）が、ＤＭ０９を有しない乾燥クランベリー（５０％の砂糖低減）より甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図27】ＤＭ０９を有するモモレザーが、ＤＭ０９を有しないモモレザーより甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図28】４０％の添加砂糖低減＋ＤＭ０９及びステビアを有するアイス緑茶が、ＤＭ０９及びステビアを有しない４０％の添加砂糖低減を有するアイス緑茶と比較してより甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図29】５０％の添加砂糖低減＋ＤＭ３１を有するマラビが、ＤＭ３１を有しない５０％の添加砂糖低減を有するマラビと比較してより甘いことを示すスパイダーグラフである。
【図30A】ＤＭ３１においてなされた変化を強調する結晶構造画像である。図３０Ａは、ＤＭ３１の結晶構造（黒色）とＭＮＥＩ（ＰＤＢ ＩＤ：２ｏ９ｕ）の結晶構造（白色）との整列を示す。図３０Ａのより小さいパネルは、ＤＭ３１における選択されたアミノ酸変化、並びに再設計されたループを拡大したものである。再設計されたループは、増加された安定性、並びに新しい水素結合及び近くの２つの伸長されたベータ－鎖をもたらした（図３０Ａ、右下パネル）。図３０Ｂは、ＤＭ３１の同じループ領域と公開データベースで利用可能な追加のＭＮＥＩ構造との重ね合わせを示す。ＤＭ３１は、黒色でマークされている。
【図30B】ＤＭ３１においてなされた変化を強調する結晶構造画像である。図３０Ａは、ＤＭ３１の結晶構造（黒色）とＭＮＥＩ（ＰＤＢ ＩＤ：２ｏ９ｕ）の結晶構造（白色）との整列を示す。図３０Ａのより小さいパネルは、ＤＭ３１における選択されたアミノ酸変化、並びに再設計されたループを拡大したものである。再設計されたループは、増加された安定性、並びに新しい水素結合及び近くの２つの伸長されたベータ－鎖をもたらした（図３０Ａ、右下パネル）。図３０Ｂは、ＤＭ３１の同じループ領域と公開データベースで利用可能な追加のＭＮＥＩ構造との重ね合わせを示す。ＤＭ３１は、黒色でマークされている。
【図31A】いくつかのＭＮＥＩ構造（２ｏ９ｕ、ｌｉｖ７、５ｚｌｐ）、ＤＭ０９、及びＤＭ３１についての正規化されたＢ因子を示すヒストグラムである。最初に、骨格Ｂ因子を、Ｚ－スコア正規化を使用して各構造について別々に正規化した。Ｂ因子は、異なる二次構造エレメント（図３１Ａ）、並びに再設計されたループ領域の一部である特定の残基（ＭＮＥＩの配列に従って番号付けされたＥ４８～Ｅ５４）（図３１Ｂ）についての平均として示される。
【図31B】いくつかのＭＮＥＩ構造（２ｏ９ｕ、ｌｉｖ７、５ｚｌｐ）、ＤＭ０９、及びＤＭ３１についての正規化されたＢ因子を示すヒストグラムである。最初に、骨格Ｂ因子を、Ｚ－スコア正規化を使用して各構造について別々に正規化した。Ｂ因子は、異なる二次構造エレメント（図３１Ａ）、並びに再設計されたループ領域の一部である特定の残基（ＭＮＥＩの配列に従って番号付けされたＥ４８～Ｅ５４）（図３１Ｂ）についての平均として示される。
【図32】ＭＮＥＩ（Ａ）、ＤＭ０９（Ｂ）、及びＤＭ３１（Ｃ）の結晶構造における安定化水素結合を示す。再設計されたループ領域は、黒枠で強調されている。
【発明を実施するための形態】
【0057】
人工低カロリー甘味料は、市場で容易に利用可能であるが、多くは、重大な副作用を有する。例えば、カロリー又は炭水化物を添加せずに食品及び飲料を甘くするために広く使用されているサッカリンは、膀胱がんなどのがんに関連付けられている。したがって、最適な感覚プロファイルを提供し、かつ食製品及び飲料における使用に好適である、現在利用可能な人工低カロリー甘味料の置き換え品に対して著しいニーズが存在する。
【0058】
本開示は、ＭＮＥＩベースの甘味タンパク質及びＭＮＥＩ味覚改変型タンパク質に関し、既知の甘味料に対して改善された特性を示すタンパク質の特定に基づく。そのようなタンパク質は、最適化方法、例えば、様々なコンピューター方法によって特定された。
【0059】
驚くべきことに、本発明者らは、ＭＮＥＩ（本明細書では「参照タンパク質」と示される）のアミノ酸配列に様々な特定の欠失又は置換を導入することによって、参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された特性を有するタンパク質がもたらされることを見出した。タンパク質の少なくとも１つの改善された特性は、食品及び飲料用途における改変ＭＮＥＩタンパク質の適合性及び使用において重要であり得ることが示唆された。
【0060】
具体的には、以下の実施例に示されるように、タンパク質（本明細書では「改変タンパク質」又は「デザイナータンパク質」と示される）は、それらの参照タンパク質と比較して改善された感覚プロファイル及び／又は安定性を示した。感覚プロファイルは、本明細書に記載されるように、味覚プロファイル（例えば、甘味度、後味、及び残味）に関する。
【0061】
したがって、本開示は、その最も広い態様において、参照ＭＮＥＩタンパク質の配列と比較して少なくとも２つのアミノ酸の欠失、置き換え（置換）、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む改変ＭＮＥＩタンパク質に関し、改変タンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された食品関連特性を有する。
【0062】
少なくとも１つの改善された食品関連特性は、食品及び飲料用途における改変タンパク質の適合性を増加させる特性、例えば、風味、質感、味覚、甘味閾値、甘味レベル、甘味プロファイル、感覚プロファイル、甘味動態、安定性（構造的及び機能的）、耐熱性、食品マトリックスへの適合性、貯蔵寿命、他の風味のマスキング及び／若しくは増強、異味、味覚開始、残味、味覚のまろやかさ、又は砂糖の様な味覚を包含する。
【0063】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの食品関連特性は、感覚に影響を及ぼす特性である。本明細書で使用される場合、「適切に感覚に影響を及ぼす」という用語は、例えば、味覚によって決定される感覚的印象の変化を指す。感覚に影響を及ぼす特性としては、例えば、甘味度（砂糖の様な風味）、甘味動態（開始時間、残存する時間、味覚持続時間）、異味の欠如（例えば、金属味覚）、及び他の味覚のマスキング又は増強などの甘味プロファイルが挙げられる。例えば、改善された特性は、増加した甘味、低減した開始時間、又は低減した残味に関する。
【0064】
少なくとも１つの特性が感覚に影響を及ぼす特性であるいくつかの実施形態によれば、改変タンパク質は、砂糖代替物とみなすことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの食品関連特性は、甘味度、低減した開始時間、又は低減した残味のうちの少なくとも１つである。
【0065】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの食品関連特性は、安定性である。いくつかの実施形態において、安定性は、熱安定性、より長い貯蔵寿命、低ｐＨに対する安定性、塩濃度安定性、イオン強度安定性、又は脂肪含有若しくはタンパク質含有マトリックスにおける安定性のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの食品関連特性は、熱安定性である。
【0066】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの食品関連特性は、増加された貯蔵寿命安定性である。例えば、改変タンパク質は、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、更には１年にわたって安定であり得る。
【0067】
貯蔵寿命安定性は、示差走査熱量測定、示差走査蛍光定量法、円二色性、及び感覚分析によってテイスティングされる。いくつかの実施形態において、食品の味覚は維持され、タンパク質は無傷である。
【0068】
上記で詳述したように、改変ＭＮＥＩタンパク質は、少なくとも１つの追加の食品成分と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの食品関連特性は、改変ＭＮＥＩタンパク質と少なくとも１つの食品成分との間の相乗効果を指し得る。いくつかの実施形態によれば、該相乗効果は、味覚増強、味覚遮断、又は味覚改変に影響を及ぼし得る。食品成分の非限定的な例としては、人工若しくは天然の風味料、食品添加物、食用染料、防腐剤、増量剤、又は追加の砂糖添加物が挙げられる。食品成分は、味覚のマスキング又は増強効果を有し得る。
【0069】
本明細書に記載されるように、参照タンパク質は、味覚改変型タンパク質及び／又は味覚増強タンパク質及び／又は味覚タンパク質、具体的には甘味タンパク質である。味覚改変型タンパク質は、感覚プロファイルを改善し、例えば、非甘味物質、例えば、水及び酸味物質に甘味を添加し得る。本明細書で使用される場合、呈味タンパク質は、味覚受容体に結合し、味覚を誘発することが知られている。本明細書で使用される場合、甘味タンパク質は、甘味受容体に結合し、甘味の感覚を誘発することが知られている。甘味受容体の非限定的な例としては、１型メンバー１（ＴＡＳ１Ｒ１、ヒト遺伝子のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：ＴＳ１Ｒ１ ＨＵＭＡＮ）、味覚受容体１型メンバー２（ＴＡＳ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ２、ＴＲ２、ＵｎｉＰｒｏｔ－Ｑ８ＴＥ２３）、味覚受容体１型メンバー３（ＴＡＳ１Ｒ３、Ｔ１Ｒ３、ＵｎｉＰｒｏｔ－Ｑ７ＲＴＸ０）などの２つのサブユニットからなる味覚受容体ヘテロ二量体が挙げられる。
【0070】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、天然に存在するタンパク質である。いくつかの他の実施形態において、参照タンパク質は、熱帯植物などの植物に見られる。植物の非限定的な例としては、マビンロウ、オウブリ（oubli）、セレンディピティベリー（serendipity berry）、カテムフェ（katemfe）、ミラクルフルーツベリー、又はレンバ（lemba）のうちの少なくとも１つが挙げられる。
【0071】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、モネリンである。
【0072】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、Ａ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０２８８１）及びＢ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０２８８２）からなるモネリンである。
【0073】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、ＭＮＥＩである。
【0074】
野生型モネリンとＭＮＥＩとの主な違いは、Ｇｌｙ－Ｐｈｅジペプチドを使用して、２つのサブユニットをＭＮＥＩと呼ばれる単鎖モネリンに接続した領域である。
【0075】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、天然に見られない配列であり、したがって、合成タンパク質、又は操作されたタンパク質若しくはデザイナータンパク質と呼ばれる。合成タンパク質は、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列の全体若しくは一部（タンパク質のポリペプチド鎖の全て又は一部）、又はその一部を含み得る。例えば、参照タンパク質は、野生型タンパク質の少なくとも２つのポリペプチド鎖が他のアミノ酸によって共有結合されるように、天然に存在するタンパク質に対応する単一のポリペプチド鎖をもたらす、天然に存在するタンパク質の結合改変を含み得る。
【0076】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、ＭＮＥＩとして既知の改変モネリンタンパク質である。
【0077】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、単鎖モネリン（ＭＮＥＩ）タンパク質（配列番号４５）である。本明細書で言及されるＭＮＥＩアミノ酸番号は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ（Protein Databank、ＰＤＢ）ＩＤ２ｏ９ｕに従う。
【0078】
本明細書に記載の改変タンパク質は、様々な方法によって設計され得る。
【0079】
いくつかの実施形態において、タンパク質設計は、以下に更に記載されるように、コンピューターツールを使用して、又は専門的なタンパク質設計及び構造生物学方法、例えば、部位指向的変異誘発、タンパク質操作、若しくは指向進化によって行われる。本発明者らは、参照風味タンパク質、並びに配列及び／又は構造的特徴において参照風味タンパク質に対して局所的又は全体的な類似性を有する他のタンパク質の配列データ、構造データ、及び／又は進化データに基づくコンピューター方法論を開発した。本明細書において開発され、適用されるコンピューター方法は、本発明者らが、エネルギー的に有利であり、したがって、熱安定性、ハロ安定性（halostability）、ｐＨ安定性、貯蔵寿命、折り畳み、及び溶解性の特徴などの改善された形質を有すると予測される特定のアミノ酸置換を有するタンパク質を設計することを可能にした。具体的には、コンピュータータンパク質設計（Computational Protein Design、ＣＰＤ）を、受容体への機能的結合に必要でない参照タンパク質構造及び／又は配列内の特定の部位又は領域に適用した。更に、ＣＰＤは、本発明者らが、必要とされる改善された特徴に適合するアミノ酸の所定のセットへの置換を限定することを可能にした。アミノ酸の所定のセットは、入力データ、すなわち、ＣＰＤに供されるタンパク質の領域、並びに出力データ、すなわち、得られる改変タンパク質中に存在するアミノ酸の位置及び型の両方にある。
【0080】
例えば、ＣＰＤを使用することによって、「非理想的」アミノ酸（例えば、疎水性コア内の親水性アミノ酸又は外部表面領域上の疎水性アミノ酸）を「理想的」アミノ酸（例えば、外部表面領域中の親水性アミノ酸及び疎水性コア内の疎水性アミノ酸）で置き換えることが可能である。
【0081】
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、疎水性アミノ酸を外部表面領域上の親水性アミノ酸で置換することが、口腔への非特異的結合を低減し、残存する後味を低減することを示唆する。
【0082】
本明細書で開発された方法論は、「安定化置換」、例えば、タンパク質構造の全体的なエネルギーを減少させるアミノ酸置換を検索することを含む。全体的なエネルギーは、当技術分野で既知のアルゴリズムを適用することによって計算され得る。そのようなアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＯＳＰＲＥＹ（Ｍ．Ｈａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８；３９（３０）：２４９４－２５０７）、又はＥｎＣｏＭ（Ｆｒａｐｐｉｅｒ Ｖ，Ｃｈａｒｔｉｅｒ Ｍ，Ｎａｊｍａｎｏｖｉｃｈ ＲＪ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２Ｏ１５；４３（Ｗ１）：Ｗ３９５－４００）が挙げられる。これらのＣＰＤ法は、進化的配列及び構造的コンセンサス、規則的及び高温分子動力学（molecular dynamic、ＭＤ）、並びに他の動的シミュレーション、相関変異分析（correlated mutational analysis、ＣＭＡ）、表面静電分析、目視検査、並びに空洞、疎水性パッチ、満たされていない水素結合などの分析などの一連の直交法による集束及びフィルタリングを受ける。
【0083】
アミノ酸置換は、以下の考察に基づく：（ａ）表面静電電位及び表面上の疎水性パッチ（の欠如）、（ｂ）特定の範囲におけるタンパク質の等電点（ｐＩ）の保持、（ｃ）タンパク質内空洞の分析、（ｄ）高温又は室温動力学における相関変異分析、正常モード分析、及び二乗平均平方根変動（root mean square fluctuation、ＲＭＳＦ）を含む動的安定性、（ｅ）置換エネルギー学のエントロピー及び／又はエンタルピー構成要素、（ｆ）特定の置換の可視化、（ｇ）精選された多重配列整列（multiple sequence alignment、ＭＳＡ）の進化的保全分析によって反映されるような関連タンパク質のファミリーにおいて許容されるアミノ酸型、並びに（ｈ）低擬似エネルギーＣＰＤ計算に反映される置換の頻度。
【0084】
コンピューター方法は、以下のステップのうちの１つ以上を含む。
（１）多重配列整列（ＭＳＡ）又は多重構造整列。このステップでは、標的参照タンパク質又はその断片との類似性を有するＤＮＡ配列及び／又はタンパク質配列が、公開データベースにおいて照会される。得られた結果に基づいて、多重配列整列（ＭＳＡ）又は多重構造整列が構築され、保存率が計算される。ＭＳＡ結果に従って、行われるべきＣＰＤのレベルに関する決定がなされる。非保存ポジションでは、全てのアミノ酸（システインを伴う又は伴わない）がＣＰＤにおいて許容されるが、より保存されたポジションでは、ＣＰＤは、類似した特性（電荷、サイズ、内部動力学など）を有する残基に限定される。このステップは、生物物理学的知識及び保存データに基づいて各ポジションにおける置換を限定することを伴う。ＭＳＡは、配列に沿った各位置が、おそらくアミノ酸の置換又は欠失又は挿入の潜在的確率を考慮に入れて、各アミノ酸の相対存在量と相関する方法で記載されるポジション特異的置換マトリックス（Position Specific Substitution Matrix、ＰＳＳＭ）を生じ得る。
（２）タンパク質機能分析及び構造－機能－動力学関係の分析。このステップでは、（活性、構造、結合などに対する）既知の影響を有する置換のデータベースが、事前知識を使用して構築される。以前の知識に基づいて、タンパク質の安定性及び／又は機能を妨害することが既知の置換及び置換隣接ポジション（例えば、０．５～１ｎｍの距離）は、ＣＰＤ中に限定され、置換されない。
（３）ＣＰＤ。このステップは、ＲＯＳＥＴＴＡ、ＯＳＰＲＥＹ、ＳＣＷＲＬ、ＰｙＭｏｌ、ＡｌｐｈａＦｏｌｄなどの指定されたソフトウェアによって部分的に行われる。決定論的ＣＰＤを行う前に、参照タンパク質３Ｄ構造／モデルのエネルギーを最小化する。ＣＰＤは、１つのアミノ酸が別のアミノ酸によって置き換えられる部位指向的アミノ酸置き換え、又は異なる長さを有するタンパク質をもたらすような他のアミノ酸配列によるタンパク質領域の置き換えを含み得る。後者は、アブイニシオ方法によってループなどの領域を再構築することによって、又は他のタンパク質から領域を取り出すことによって行うことができ、この方法は、「グラフト化」と呼ばれ得る。各参照タンパク質について、複数のモデルが考慮される。
（４）選択：最低エネルギーを有するタンパク質のモデルが収集される。ＭＳＡはこれらのモデル上で組み立てられ、保存配列が決定される。生物化学的及び生物物理学的事前知識に基づいて、置換のサブセットが選択される。これらのサブセットは、ＣＰＤ中に高頻度で出現する１つ以上のポジションでの置き換えを表す。次いで、各サブセットをタンパク質の３Ｄ構造上でモデル化し、エネルギーを最小化する。次いで、最低エネルギーサブセットが、更なるコンピューター的及び実験的検証のために選択される。
（１）多重配列整列（ＭＳＡ）又は多重構造整列。このステップでは、標的参照タンパク質又はその断片との類似性を有するＤＮＡ配列及び／又はタンパク質配列が、公開データベースにおいて照会される。得られた結果に基づいて、多重配列整列（ＭＳＡ）又は多重構造整列が構築され、保存率が計算される。ＭＳＡ結果に従って、行われるべきＣＰＤのレベルに関する決定がなされる。非保存ポジションでは、全てのアミノ酸（システインを伴う又は伴わない）がＣＰＤにおいて許容されるが、より保存されたポジションでは、ＣＰＤは、類似した特性（電荷、サイズ、内部動力学など）を有する残基に限定される。このステップは、生物物理学的知識及び保存データに基づいて各ポジションにおける置換を限定することを伴う。ＭＳＡは、配列に沿った各位置が、おそらくアミノ酸の置換又は欠失又は挿入の潜在的確率を考慮に入れて、各アミノ酸の相対存在量と相関する方法で記載されるポジション特異的置換マトリックス（Position Specific Substitution Matrix、ＰＳＳＭ）を生じ得る。
（２）タンパク質機能分析及び構造－機能－動力学関係の分析。このステップでは、（活性、構造、結合などに対する）既知の影響を有する置換のデータベースが、事前知識を使用して構築される。以前の知識に基づいて、タンパク質の安定性及び／又は機能を妨害することが既知の置換及び置換隣接ポジション（例えば、０．５～１ｎｍの距離）は、ＣＰＤ中に限定され、置換されない。
（３）ＣＰＤ。このステップは、ＲＯＳＥＴＴＡ、ＯＳＰＲＥＹ、ＳＣＷＲＬ、ＰｙＭｏｌ、ＡｌｐｈａＦｏｌｄなどの指定されたソフトウェアによって部分的に行われる。決定論的ＣＰＤを行う前に、参照タンパク質３Ｄ構造／モデルのエネルギーを最小化する。ＣＰＤは、１つのアミノ酸が別のアミノ酸によって置き換えられる部位指向的アミノ酸置き換え、又は異なる長さを有するタンパク質をもたらすような他のアミノ酸配列によるタンパク質領域の置き換えを含み得る。後者は、アブイニシオ方法によってループなどの領域を再構築することによって、又は他のタンパク質から領域を取り出すことによって行うことができ、この方法は、「グラフト化」と呼ばれ得る。各参照タンパク質について、複数のモデルが考慮される。
（４）選択：最低エネルギーを有するタンパク質のモデルが収集される。ＭＳＡはこれらのモデル上で組み立てられ、保存配列が決定される。生物化学的及び生物物理学的事前知識に基づいて、置換のサブセットが選択される。これらのサブセットは、ＣＰＤ中に高頻度で出現する１つ以上のポジションでの置き換えを表す。次いで、各サブセットをタンパク質の３Ｄ構造上でモデル化し、エネルギーを最小化する。次いで、最低エネルギーサブセットが、更なるコンピューター的及び実験的検証のために選択される。
【0085】
ＣＰＤにおいて使用される考慮事項のうちの１つは、受容体結合部位、並びに結合領域及びその近傍においてアミノ酸を置換するかどうかである。味覚受容体結合に重要なアミノ酸残基の決定は、一般に、様々なアミノ酸の単一点置換によって行われ得る。本明細書の実施例において詳述されるように、本発明者らは、味覚受容体に対する推定結合部位を特徴付けるためにコンピューター分析を使用した。本発明者らは、参照タンパク質及び改変タンパク質に結合する味覚受容体中のいくつかの新規の結合部位を特定した。
【0086】
ＣＰＤにおける別の考慮事項は、受容体への結合に必要とされる機能的可塑性を保持する一方で、熱安定性を増加させることであり、これは、多くの場合、タンパク質剛性化に本質的に関連する。タンパク質は、受容体を活性化するために、いくつかの立体構造変化（「機能的可塑性」としても既知）を受けなければならない。したがって、本発明者らは、機能的可塑性が保持されなければならない領域を保存しながら剛性化することができる領域に焦点を当てた。
【0087】
改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質（アミノ酸配列）に基づいており、したがって、改変ＭＮＥＩタンパク質に関して本明細書に記載の任意の特徴／特性／特徴付けは、参照対応ＭＮＥＩタンパク質に対して提供されることに留意しなければならない。
【0088】
本明細書に記載されるように、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質（参照アミノ酸配列）に対して、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも１８個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。
【0089】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質（参照アミノ酸配列）に対して、２～２０個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入、２～１０個のアミノ酸置換、３～１０個のアミノ酸置換、３～６個のアミノ酸置換を含む。本明細書で使用される範囲は、例えば、３～６が３、４、５、及び６を含むような範囲の限界を含む。
【0090】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号４５に記載の配列を有する参照ＭＮＥＩタンパク質に対して、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも１８個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
【0091】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質のアミノ酸配列と４０％～９８％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照アミノ酸配列と９０％～９８％同一のアミノ酸配列を含む。
【0092】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照アミノ酸配列と６０％～９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照アミノ酸配列と７０％～９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0093】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0094】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列と９０％～９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0095】
２つ以上のアミノ酸配列間の同一性％は、２つ以上の配列を比較し、最大一致について整列させた場合に決定される。本開示の文脈において、同一性％を有する本明細書に記載されるような配列（アミノ酸）は、同一性が計算される参照配列と同じ機能／活性を有するとみなされる。
【0096】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質のアミノ酸配列と４０％～９８％類似したアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照アミノ酸配列と９０％～９８％の類似性のアミノ酸配列を含む。
【0097】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照アミノ酸配列と６０％～９０％の類似性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照アミノ酸配列と７０％～９０％類似したアミノ酸配列を含む。
【0098】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0099】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列と９０％～９８％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0100】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号１～２１のうちの１つに記載のアミノ酸配列、そのバリアント、又は前述の断片を含む。特に、改変ＭＮＥＩタンパク質は、配列番号１、４、１６、１９、若しくは２４のうちの１つに記載のアミノ酸配列、そのバリアント、又は前述の断片を含み得る。改変ＭＮＥＩタンパク質はまた、配列番号１～２１のうちの１つ、特に配列番号１、４、１６、１９、又は２４のうちの１つと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一の配列を含み得る。
【0101】
本明細書で使用される場合、配列類似性又は配列相同性は、類似した物理化学的特性を有して保存されているアミノ酸、例えば、ロイシン及びイソロイシンの量（％）を指す。
【0102】
配列同一性の決定において、ギャップはカウントされず、配列同一性は、２つのうちの短い方の配列に対するものである。この文脈において、参照ＭＮＥＩタンパク質（アミノ酸配列）の長さは、改変ＭＮＥＩタンパク質（アミノ酸配列）と同じであってもよいし、改変ＭＮＥＩタンパク質（アミノ酸配列）と異なっていてもよいことに留意しなければならない。
【0103】
「アミノ酸配列」及び／又は「ポリペプチド鎖」という用語は、アミノ酸配列又はポリペプチド鎖を有するタンパク質を記載するために使用される。したがって、「参照タンパク質」という用語は、「参照アミノ酸配列」という用語に相当し、「改変タンパク質」という用語は、「改変アミノ酸配列」という用語に相当する。「アミノ酸配列」及び／又は「ポリペプチド鎖」という用語は、３Ｄ構造を有する配列、並びに３Ｄ構造を有しない配列を包含することに留意しなければならない。
【0104】
本開示に関連して本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、短縮された、すなわち、少なくとも１つのアミノ酸が欠如している完全長タンパク質に由来するタンパク質又はペプチドに関する。そのような断片は、タンパク質の一次配列の少なくとも１０個超、例えば、２０個、又は３０個以上の連続するアミノ酸を含み得る。
【0105】
本開示で使用される場合、「バリアント」という用語は、例えば、置換、欠失、挿入、又は化学改変によるアミノ酸配列の改変を含むタンパク質又はペプチドの誘導体に関する。そのような改変は、いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドの機能性を低減しない。そのようなバリアントは、１つ以上のアミノ酸が、それらのそれぞれのＤ－立体異性体によって、又はオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、及びノルバリンなどの天然に存在する２０個のアミノ酸以外のアミノ酸によって置き換えられているタンパク質を含む。しかしながら、そのような置換は、保存的であってもよく、すなわち、アミノ酸残基が化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えられる。
【0106】
コンピューター最適化プロセスの一部として、改変タンパク質は、エネルギー的考慮、すなわち、低エネルギーを有する配列に基づいて、コンピューター分析、生物情報学分析、又は構造－生物学分析の後に、アミノ酸配列の大きな出力集団から選択され得る。
【0107】
エネルギー計算は、アミノ酸配列全体に適用され得るか、又は代替的に、タンパク質内の特定の領域又は選択されたアミノ酸に限定され得る。後者（異なる領域又は選択されたアミノ酸）において、情報を統合して、タンパク質全体を測定することができる。
【0108】
アミノ酸配列（例えば、改変タンパク質）の各々１つの計算は、ロゼッタエネルギー単位（ＲＥＵ）を使用することなどによって、物理ベース（生物物理学的方法としても既知）と、統計ベースの潜在性（知識ベースの潜在性又は情報学的方法としても既知）とを組み合わせることによって行われ得る。ロゼッタエネルギー単位（ＲＥＵ）は、ロゼッタソフトウェアのアルゴリズムであり、コンピューターモデリング及びタンパク質構造分析のためのアルゴリズムのパッケージである。ロゼッタソフトウェアは、デノボタンパク質設計、酵素設計、リガンドドッキング、並びに生物学的高分子及び高分子複合体の構造予測を含む、コンピューター生物学における注目すべき科学的進歩を可能にする。ロゼッタエネルギー関数は、いかなる実際の物理エネルギー単位とも一致しない、物理ベースの潜在性と、統計ベースの潜在性との組み合わせである。ロゼッタエネルギーは、恣意的な尺度であり、ＲＥＵ（「ロゼッタエネルギー単位」）と呼ばれることもある。
【0109】
いくつかの実施形態において、ＲＥＵは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むタンパク質配列全体について計算され得る。いくつかの他の実施形態において、ＲＥＵは、タンパク質配列全体の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む少なくとも１つの領域について計算され得る。いくつかの他の実施形態において、ＲＥＵは、タンパク質配列全体における少なくとも１つのアミノ酸置換について計算され得る。
【0110】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１８２未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される約－１９０のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される約－１９５のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１９５未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１９６未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１９７未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１９８未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される約－１９８のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１９８．４未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－２００未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表されるより低い－２０３のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－２０６．４未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－２１０未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－２１４．６未満のエネルギーを有する。
【0111】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－２７０．１１未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－－３００未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－３５０未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－４００未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－４１０未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－４１８未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－４２０未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－４３０未満のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－４３３未満のエネルギーを有する。
【0112】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１８２～ＲＥＵで表される約－２１４．６のエネルギーを有する。いくつかの他の実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１９５～ＲＥＵで表される約－２１４．６のエネルギーを有する。いくつかの他の実施形態において、改変タンパク質は、ＲＥＵで表される－１９７～ＲＥＵで表される約－２１４．６のエネルギーを有する。
【0113】
本明細書に記載されるように、改変タンパク質は、タンパク質の様々な領域におけるアミノ酸置換又は欠失から生じ得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質の領域」は、タンパク質配列（アミノ酸配列）又は構造の一部であるアミノ酸配列又は構造モチーフを指す。タンパク質領域の非限定的な例としては、タンパク質表面、タンパク質コア、タンパク質ループ、二次構造エレメント、二次構造キャッピング、ジスルフィド、結合部位、リンカー、疎水性パッチ、又はタンパク質疎水性領域が挙げられる。
【0114】
参照タンパク質におけるアミノ酸置換は、特定のタンパク質領域又は配列に限定されない。アミノ酸置換を含み得る参照タンパク質の領域は、参照タンパク質表面、疎水性コア、又はループ領域と呼ばれる領域（二次構造が欠如している領域としても示される）、二次構造のエッジ（二次構造キャッピング領域としても示される）、ジスルフィド領域、結合部位領域、リンカー領域、及び疎水性パッチ領域を含む。
【0115】
本明細書で使用される場合、「参照表面領域」、「参照コア領域」、又は「参照ジスルフィド結合又はループ領域」は、参照ＭＮＥＩタンパク質であり得る参照タンパク質の対応する領域を指し得る。
【0116】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、参照タンパク質構造及び／又は配列内の限定された領域内で置換され得る。いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、表面領域において置換され得る。いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、コア領域において置換され得る。いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、ジスルフィド結合によって置換され得る。いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、ループ領域において置換され得る。いくつかの実施形態において、２つ以上のアミノ酸の置き換えは、参照タンパク質の表面上に位置する。
【0117】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、受容体に対する参照タンパク質の予測される又は既知の結合部位に隣接するエリアにない限定された領域で置換され得る。この文脈において、「隣接する」は、結合界面から４～７Åを意味し得る。
【0118】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、参照タンパク質構造及び／又は配列内の異なる領域で置換され得る。いくつかの実施形態において、参照タンパク質は、少なくとも表面領域、コア領域、ジスルフィド結合若しくはループ領域、又はそれらの任意の組み合わせにおいて置換され得る。
【0119】
本明細書で使用される場合、タンパク質表面領域は、部分的又は完全な溶媒接触可能性を有するエリア（ＳＡＳＡ－溶媒接触可能表面エリア）である。本明細書で使用される場合、タンパク質コア領域は、５０％未満、又は内部コアについては２０％未満のアミノ酸相対ＳＡＳＡ（溶媒接触可能表面エリア）を有する溶媒に接触可能でないエリアである。
【0120】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照表面領域に対して、表面領域において１０％～９８％、２０％～９８％、３０％～９８％、４０％～９８％、５０％～９０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0121】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照疎水性コア（疎水性パッチ）領域に対して、疎水性コア（疎水性パッチ）領域において、１０％～９８％、２０％～９８％、３０％～９８％、４０％～９８％、５０％～９０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0122】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照疎水性コア（疎水性パッチ）領域に対して、疎水性コア（疎水性パッチ）領域において、１０％～９８％、２０％～９８％、３０％～９８％、４０％～９８％、５０％～９０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0123】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照表面領域に対して、表面領域において３（３）～４０（４０）個のアミノ酸置換、４～３０個、５～３０個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【0124】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照表面領域に対して、表面領域において少なくとも１（１）個、２（２）個、３（３）個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は少なくとも３０個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【0125】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照コア領域に対して、コア領域において２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0126】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照アミノ酸配列コア領域に対して、コア領域において２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％類似したアミノ酸配列を含む。
【0127】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照コア領域に対して、コア領域において１～５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【0128】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照中の受容体に結合する参照領域に対して、受容体に結合する領域（受容体結合部位）において９０％、９５％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0129】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照受容体結合部位に対して、受容体結合部位において９０％、９５％、又は９８％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【0130】
いくつかの実施形態において、参照タンパク質の受容体結合部位は、改変タンパク質において置換されていない。
【0131】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合のうちの少なくとも１つが除去され、それらの周りの領域が、除去されたジスルフィド結合の各々の周りの８～２０個の置換で再設計される。
【0132】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるそれらの一般的に既知の３文字記号又は１文字記号のいずれかによって言及され得る。本明細書で使用される場合、アミノ酸置換（置き換え）は、１つのアミノ酸から異なるアミノ酸への変化を指す。これは、典型的には、非同義ミスセンスの変異によって引き起こされるＤＮＡ配列における点変異に起因し、これは、コドン配列を変化させて、参照とは異なるアミノ酸をコードする。アミノ酸の置き換えは、一般に、置き換えられたアミノ酸がどの程度類似又は非類似であるか、かつ配列又は構造におけるそれらのポジションに依存して、タンパク質の機能又は構造に影響を及ぼし得る。例えば、アミノ酸置換は、サイズ、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、かさ高さ（又は柔軟性）、ベータ－分岐、特定の二次構造若しくは特定の溶媒接触可能性領域に存在する傾向、芳香族性、特定の結合相互作用（水素結合、塩橋、極性及び非極性相互作用）を付与する能力、ｐＫ、砂糖及び他の翻訳後改変物に結合する能力、並びに／又は関与する残基の両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。
【0133】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置き換えであり得る。そのような置き換えは、１つのアミノ酸の、類似した特性を示す別のアミノ酸への変化を包含する。保存的アミノ酸の置き換え（保存的アミノ酸「置換」又は保存的アミノ酸変異とも示される）は、所与のアミノ酸を、類似した生物化学的、構造的、及び／又は化学的特性を有する異なるアミノ酸に変化させる、タンパク質におけるアミノ酸の置き換えである。
【0134】
例えば、アミノ酸は、それらの構造及びそれらの側鎖（Ｒ基）の一般的な化学的特徴に基づいて、６つの主要なクラスに分類され得る。
脂肪族：イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、
ヒドロキシル又は硫黄／セレン含有：セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、トレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、
環状：プロリン（Ｐ）
芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
塩基性：ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）
酸性及びそれらのアミド：アスパルテート（Ｄ）、グルタメート（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
脂肪族：イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、
ヒドロキシル又は硫黄／セレン含有：セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、トレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、
環状：プロリン（Ｐ）
芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
塩基性：ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）
酸性及びそれらのアミド：アスパルテート（Ｄ）、グルタメート（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
【0135】
更に、以下の群の各々は、互いに保存的置換である他の例示的なアミノ酸を含有する。
１）非常に小さい：アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）負電荷：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）極性（アミド化カルボキシル側鎖）：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）正電荷：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
６）芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、及び場合によってはヒスチジン（Ｈ）、
７）小極性：セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、
８）硫黄含有：システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
９）小：Ａｌａ（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）。
１）非常に小さい：アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）負電荷：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）極性（アミド化カルボキシル側鎖）：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）正電荷：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
６）芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、及び場合によってはヒスチジン（Ｈ）、
７）小極性：セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、
８）硫黄含有：システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
９）小：Ａｌａ（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）。
【0136】
１０）ベータ－分岐：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、及び場合によってはスレオニン（Ｔ）、
１１）極性：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
１１）極性：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
【0137】
それにもかかわらず、複数のアミノ酸インデックスをもたらすアミノ酸の多数のクラスターが存在し、各々がアミノ酸の特徴の異なる態様を強調し、例えば、ａａインデックスデータベースｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ａａｉｎｄｅｘ／における数百のそのようなインデックスを参照されたい。結果として、保存的置き換えのいくつかは、飲食業界における工業的使用のためのタンパク質適合性のための他の重要な特徴、例えば、舌への非特異的結合又は他の感覚プロフィール態様を表し得る。
【0138】
追加の保存分析は、以下に基づく。
－非極性「疎水性」アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）、及びリジン（Ｋ）からなる群から選択され、
－「極性」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）からなる群から選択され、
－「正電荷」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択され、かつ
－「酸性」アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びグルタミン（Ｑ）からなる群から選択される。
－非極性「疎水性」アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）、及びリジン（Ｋ）からなる群から選択され、
－「極性」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）からなる群から選択され、
－「正電荷」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択され、かつ
－「酸性」アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びグルタミン（Ｑ）からなる群から選択される。
【0139】
いくつかの実施形態において、置き換えは、ラジカル置き換えである。ラジカル置き換え（置換）は、アミノ酸の、異なる特性を有する別のアミノ酸への交換である。
【0140】
参照タンパク質と改変タンパク質との間の配列類似性及び／又は配列同一性の程度は、一般に、改変タンパク質の特性に影響を及ぼし得る。例えば、多数の置換は、結合動態、折り畳み動態、溶解性、熱安定性、ハロ安定性、ｐＨ安定性、貯蔵寿命、非水性粒子（例えば、食品マトリックス中のタンパク質若しくは脂肪、又は口腔内の疎水性領域）への結合、３Ｄ構造、並びにその活性及び関連する特性に影響を及ぼし得る。本明細書において開発及び適用されるコンピューター方法は、改善された改変タンパク質をもたらす置換のための推定アミノ酸残基の完全な理解を提供する。
【0141】
いくつかの態様によれば、参照タンパク質は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＭＮＥＩである。以下の実施例１に示されるように、ＣＰＤ分析は、置換又は欠失の標的としていくつかのアミノ酸を明らかにした。
【0142】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的置換である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ラジカル置換である。いくつかの実施形態において、２つ以上のアミノ酸が置換される。
【0143】
複数の変異を含む、ＭＮＥＩにおけるアミノ酸置換が以前に報告された。例えば、Ｚｈｅｎｇらは、改善された甘味及び安定性を有する新規の二重変異体ＭＮＥＩベースのタンパク質を報告した。具体的には、Ｚｈｅｎｇらは、ＭＮＥＩにおける単一置換Ｅ２Ｎが、３倍改善された甘味及びわずかに低減した安定性をもたらしたことを実証した。Ｚｈｅｎｇらは、Ｅ２Ｎ置換（例えば、Ｅ２Ｎ／Ｅ２３Ａ、Ｅ２Ｎ／Ｙ６５Ｒ）に加えて追加の置換、Ｅ２３Ａ、又はＹ６５Ｒを導入しても甘味に影響を及ぼさないことを更に示した。
【0144】
いくつかの実施形態において、ＭＮＥＩである参照タンパク質における少なくとも３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも２つ又は少なくとも３つは、保存的置換である。
【0145】
本明細書に記載されるように、本明細書に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質は、改善された食品関連特性を有する。改変タンパク質の甘味度（砂糖の様な風味）、異味の欠如、低減した開始時間、及び低減した残味などのタンパク質の甘味プロファイルは、当技術分野で既知の任意の既知の味覚試験によって決定され得る。例えば、スクロース又は他の甘味料の甘味との比較は、味覚パネルによって行われ得、甘味度は、以下の実施例において詳述されるように等級付けされ得る。
【0146】
比較は、例えば、甘味の感覚を誘発するのに必要な最小濃度、又は甘味プロファイル、甘味開始時間、残味、口当たり、後味、異味、及び望ましくない味覚のマスキングなどの特徴を含む甘味プロファイル評価を決定することによって、スクロースなどの既知の甘味料と比較して、改変タンパク質の閾値を決定することによって行われ得る。
【0147】
本明細書で使用される場合、甘味に影響を及ぼす特性という用語は、約０．２８ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ以上の甘味閾値、約１～２０秒間、時には２～１８秒間、時には２～４秒間の甘味持続時間のうちの少なくとも１つによって決定される甘味感覚を包含する。
【0148】
改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質の様に、甘味受容体に結合する。
【0149】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、重量基準で砂糖よりも３００～１６，０００高い知覚される甘味閾値を有する。
【0150】
感覚プロファイルは、経時的な味覚強度を示す味覚動態、すなわち、開始持続時間（味覚を感じるまでの時間）、味覚持続時間、及び残味の時間（ガウステールに対応する）を含む。追加の特徴としては、異味（例えば、他の受容体への結合に起因する）、味覚のまろやかさ、金属味及び他の副味、他の成分との相乗効果（例えば、ステビアなどの他の風味又は望ましくない味覚のマスキング及び増強）、口当たり、渋味などが挙げられる。
【0151】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、以下のうちの少なくとも１つが参照タンパク質に対して、等しいか又は改善されていることを特徴とする：（１）構造的熱安定性、（２）機能的熱安定性、（３）ｐＨ安定性、（４）水若しくは部分的に水性の環境（例えば、脂肪を含有する食品）における溶解性、又は（５）貯蔵寿命安定性。
【0152】
本明細書に記載の改変タンパク質は、甘味、並びに経口送達用製品の調製において甘味料として使用され得る他の味覚効果（望ましくない味覚のマスキング、より少ない後味、より少ない残味、より少ない異味、旨味、より良好な口当たり）を特徴とする。
【0153】
改変タンパク質は、風味改変剤又は風味増強剤として使用され得る。
【0154】
本明細書に記載の改変タンパク質は、経口製品として使用するためのものである。いくつかの実施形態において、製品は、食製品若しくは飲料製品、栄養補助食物製品、又は薬剤である。製品の調製のために、本明細書に記載のタンパク質は、任意の食品グレードの添加物と組み合わされ得る。食製品又は飲料製品は、微粉末、凍結乾燥物、顆粒、錠剤などを含むがこれらに限定されない任意の固体乾燥形態で提供及び使用され得る。いくつかの実施形態において、本組成物は、液体形態で、例えば、水中の溶質（水溶液）として提供される。
【0155】
改変タンパク質を含む製品は、様々な用途を有し得る。これとしては、（以下の各々は、本開示の別々の実施形態を構成する）、飲食業界（果実及び野菜ジュース及びネクター、清涼ドリンク、レディ・トゥ・ドリンク飲料、シロップ、機能性ドリンク、スポーツドリンクなど）において、乳産業、すなわち、乳製品、ヨーグルト、及びプディングにおいて、製薬産業において、自然療法産業、機能性食品産業（例えば、機能性食品バー）、並びに他のヘルスケア製品（例えば、練り歯磨き及びマウスウォッシュ）、菓子類、キャンディー、及びガム産業、野菜（例えば、ケチャップ又はソース）、又は賦形剤若しくは添加物として風味改変組成物の使用を必要とする任意の他の用途において甘味料、風味料、増強剤、マスキング剤、及び風味特徴を有するタンパク質としての利用が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0156】
いくつかの実施形態によれば、追加の食品成分は、スクロース、フルクトース、グルコース、アガベネクター、玄米シロップ、ナツメヤシ糖、蜂蜜、メープルシロップ、糖蜜、ラカンカ、糖アルコール、希少砂糖、ステビオールグリコシド、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウム、及び食物繊維からなる群から選択される。
【0157】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照タンパク質に対して、等しいか又は改善された構造的熱安定性を有する。
【0158】
「構造的熱安定性」又は「熱安定性」という用語は、本明細書で使用される場合、参照タンパク質の温度より高い温度でその３Ｄ構造を保持する改変タンパク質の能力を指す。タンパク質の３Ｄ構造安定性は、円偏光二色性（Circular Dichroism、ＣＤ）、又は示差走査蛍光定量法（Differential Scanning Fluorimetry、ＤＳＦ）若しくは示差走査熱量測定（Differential Scanning Calorimetry、ＤＳＣ）などの熱シフトアッセイ、又は塩化グアニジニウムなどのタンパク質変性剤を用いる滴定などの、当技術分野で既知の任意の方法によって測定され得る。３Ｄタンパク質構造は、タンパク質機能に影響を与え得る。注目すべきことに、食製品及び飲料製品に必要とされる貯蔵寿命及び熱安定性は、構造的熱安定性に関連する可能性があり、異なる測定可能なものからなり、例えば、低温殺菌（又は消費者包装された良好な最終製品の調製中の熱処理）は、異なるプロトコルによって適用することができ、非常に短時間にわたってタンパク質構造を保持する耐熱性に関連する。
【0159】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照タンパク質に対して、等しいか又はより高い機能的熱安定性を有する。「機能的熱安定性」という用語は、本明細書で使用される場合、改変タンパク質が、参照タンパク質と比較して、高温への曝露後にその機能を保持する能力を指す。
【0160】
いくつかの実施形態において、本明細書の改変タンパク質は、より高い温度で、又はより高い温度に限られた時間曝露した後に、その甘味効果を維持することができる。換言すれば、室温を超える温度、時には最大５０℃、時には最大１００℃、又は更には最大１５０℃の温度に製品を曝露した後に、甘味又は感覚プロファイルに明らかな変化がない。タンパク質の機能、例えば、甘味は、タンパク質がその味覚を感じることができる温度まで冷却された後、感覚試験によって測定され得る。
【0161】
いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、参照タンパク質に対して、等しいか又はより高いｐＨ安定性を有する。ｐＨ安定性は、参照タンパク質に対して、より広いｐＨ範囲での改変タンパク質の長期安定性を指し、すなわち、改変タンパク質は、製品を３～８の任意のｐＨ、時には４～８のｐＨに曝露した後に３Ｄ構造及び／又は機能を維持する。例えば、コーラのようなソーダは、２．３～２．５のｐＨを有し、このｐＨでは、甘味タンパク質の一部は不安定であり、すぐに又は飲料の通常の貯蔵寿命よりも短い時間の後に機能性を失う。
【0162】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質よりも高い溶解性を有する。溶解性は、水性、部分的に水性、又は非水性の環境、例えば、脂肪を含有する食品であり得る。
【0163】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質に対して改善された貯蔵寿命を有する。改善された貯蔵寿命は、製品を最大１５０℃の任意の温度、時には４℃～１５０℃の任意の温度、又は１００°に曝露した後に、本組成物を含む製品の甘味（機能）の変化又は物理的劣化（例えば、色の変化、相分離など）が感知されないことを指す。
【0164】
いくつかの他の実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質に対して、等しいか改善されている、以下のうちの少なくとも１つを特徴とする：（１）折り畳み動態、（２）タンパク質の翻訳後改変（例えば、グリコシル化又はアセチル化）パターンが、参照タンパク質と異なり、（３）ジスルフィド結合の数が、ジスルフィド結合を有しない参照ＭＮＥＩタンパク質に対してより多い。
【0165】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、参照ＭＮＥＩタンパク質に対して、等しいか又はより高い折り畳み動態を有する。すなわち、折り畳まれていない構造又は部分的に折り畳まれた構造からのタンパク質折り畳み速度は、（例えば、分子動力学によって、又は実験的インビトロ若しくはインビボ方法によってインシリコで評価されるように）より速い。あるいは、より速い折り畳み動態は、例えば、変性剤滴定（例えば、塩化グアニジニウム及び／又は高濃度尿素）又は他の方法による変性実験におけるより遅い、折り畳まれていない動態を指す。
【0166】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、評価される宿主生物における参照ＭＮＥＩタンパク質に対して、等しいか又はより高い発現収率を特徴とする。
【0167】
いくつかの実施形態において、改変ＭＮＥＩタンパク質は、８．６～９．５のｐＩ値を有する。
【0168】
本明細書に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質は、甘味、並びに経口送達用製品の調製において甘味料として使用され得る他の味覚効果（望ましくない味覚のマスキング、より少ない後味、より少ない残味、より少ない異味、より少ない残味の開始、及び旨味）を特徴とする。
【0169】
改変ＭＮＥＩタンパク質は、風味改変剤又は風味増強剤として使用され得る。
【0170】
本明細書に記載の改変ＭＮＥＩタンパク質は、経口製品として使用するためのものである。いくつかの実施形態において、製品は、食製品、栄養補助食製品、又は薬剤である。製品の調製のために、本明細書に記載のタンパク質は、任意の食品グレードの添加物と組み合わされ得る。食製品は、微粉末、凍結乾燥物、顆粒、錠剤などを含むがこれらに限定されない任意の固体乾燥形態で提供及び使用され得る。いくつかの実施形態において、本組成物は、液体形態で、例えば、水中の溶質（水溶液）として提供される。
【0171】
改変ＭＮＥＩタンパク質を含む製品は、様々な用途を有し得る。これとしては、（以下の各々は、本開示の別々の実施形態を構成する）、飲食業界（果実及び野菜ジュース及びネクター、清涼ドリンク、レディ・トゥ・ドリンク飲料、シロップ、機能性ドリンク、スポーツドリンクなど）において、乳産業、すなわち、乳製品、ヨーグルト、及びプディングにおいて、製薬産業において、自然療法産業、機能性食品産業、並びに他のヘルスケア製品（例えば、練り歯磨き及びマウスウォッシュ）、菓子類、キャンディー、及びガム産業、野菜（例えば、ケチャップ又はソース）、又は賦形剤若しくは添加物として風味改変組成物の使用を必要とする任意の他の用途において甘味料、風味料、増強剤、又はマスキング剤としての利用が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0172】
製品は、追加の食品成分を含み得る。いくつかの実施形態において、食品成分は、甘味料、例えば、ステビオールグリコシドである。本明細書に記載の改変タンパク質とステビオールグリコシドとの組み合わせは、相乗効果を生み出す。したがって、いくつかの実施形態において、製品は、配列番号１～２１によって示される少なくとも１つの改変タンパク質及びステビオールグリコシドを含む。
【0173】
ステビア（本明細書において、ステビオールグリコシド又はその混合物と示される）及び／又はその変種が、０．５°Ｂｘ～８°Ｂｘスクロース当量の範囲で本発明の改変タンパク質と組み合わされる場合、改変タンパク質は、スクロース甘味の３０％～７０％の置き換えを表す。知覚される甘味強度は、０．５°Ｂｘ～８°Ｂｘのスクロース当量でステビア溶液の少なくとも１００％である。知覚される残存感覚プロファイルは、０．５°Ｂｘ～８°Ｂｘのスクロース当量でステビア溶液の１００％よりも優れている。
【0174】
知覚される酸味感覚プロファイルは、０．５°Ｂｘ～８°Ｂｘのスクロース当量でステビア溶液の１００％よりも優れている。
【0175】
いくつかの実施形態によれば、追加の食品成分は、スクロース、アガベネクター、玄米シロップ、ナツメヤシ糖、蜂蜜、メープルシロップ、糖蜜、ラカンカ、糖アルコール、希少砂糖、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウム、及び食物繊維からなる群から選択される。
【0176】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の配合物は、後味若しくは異風味（例えば、金属味若しくは甘草味）が減少、排除、若しくはマスキングされたか、又は苦味が減少、排除、若しくはマスキングされたか、又は甘味の残存が減少、排除、若しくはマスキングされた砂糖の様な味覚プロファイルを提供する。
【0177】
本発明による改変ＭＮＥＩタンパク質は、当技術分野で既知の任意の方法によって生成され得、例えば、タンパク質は、合成的に、組み換えＤＮＡ技術によって、又は発酵槽、植物、植物カルス、若しくは他の生物反応器を介した微生物におけるタンパク質生成によって生成され得ることに留意しなければならない。いくつかの実施形態において、改変タンパク質は、細菌、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて生成され得る。いくつかの他の実施形態において、改変タンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの産生酵母において生成され得る。いくつかの他の実施形態において、改変タンパク質は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの糸状菌において生成され得る。
【0178】
「酵母菌及び糸状菌」という用語としては、任意のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｈｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｙｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、任意のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗ ｅｎｓ ｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられるが、これらに限定されない。
【0179】
いくつかの実施形態において、選択されたアミノ酸配列のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ及びＤＮＡレベルで最適化される。ＲＮＡレベルでは、これは、リボソームへの迅速な挿入を確実にするためのＲＮＡ二次構造の最小化を含む。ＤＮＡレベルでは、これは、宿主生物に対するコドン最適化を含む（ＲＮＡレベル最適化を考慮に入れる）。コドン使用の最適化は、発現される各アミノ酸に対して宿主生物において最も豊富なｔＲＮＡを使用することを優先する。
【0180】
上記に関して、提供される場合、例えば、１０％、５０％、１２０％、５００％などのパーセンテージ値は、「倍数変化」値、すなわち、それぞれ０．１、０．５、１．２、５などと交換可能であることが理解されるべきである。
【0181】
本明細書で使用される場合、全ての科学用語及び技術用語は、別段の指定がない限り、当技術分野で一般的に使用される意味を有する。本明細書で提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
【0182】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（having）」、及びそれらの活用形は、「含むが、これらに限定されない」ことを意味する。「から本質的になるという用語は、組成物、方法、又は構造が、追加の成分、ステップ、及び／又は部分を含み得るが、追加の成分、ステップ、及び／又は部分が、特許請求される組成物、方法、又は構造の基本的かつ新規の特徴を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、言及された値よりも最大１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、場合によっては最大２０％高く又は低く逸脱し得る値を示し、逸脱範囲は整数値を含み、適用可能な場合、非整数値も同様に連続範囲を構成する。
【0183】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示物を含むことを留意しなければならない。
【0184】
本明細書で使用される場合、「溶液」は、副構成成分（溶質）が主構成成分（溶媒）内に均一に分布されている液体混合物を指す。懸濁液又は濁った混合物とは対照的に、溶液は透明であり、粒子状物質を含まない。
【0185】
本明細書で使用される場合、「シロップ」又は「飲料シロップ」は、流体、典型的には水が添加されて、レディ・トゥ・ドリンク飲料又は「飲料」を形成する飲料前駆体を指す。典型的には、シロップ対水の体積比は、１：３～１：８、より典型的には１：４～１：６である。水に対するシロップの体積比も「スロー」として表される。飲料業界で一般的に使用される比率である１：５の比率は、「１＋５スロー」として知られている。
【0186】
配合物は、「そのまま」又は他の甘味料、風味料、及び食品成分と組み合わせて使用され得る。
【0187】
甘味料の非限定的な例としては、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、ステビオールビオシド、ルブソシド、並びにＳｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ植物に見られる他のステビオールグリコシド、及びそれらの混合物、ステビア抽出物、ラカンカ（Luo Han Guo）抽出物、モグロシド、高フルクトースコーンシロップ、コーンシロップ、転化砂糖、フルクトオリゴ糖、イヌリン、イヌロオリゴ糖、カップリング砂糖、マルトオリゴ糖、マルトデキスチン（maltodextin）、コーンシロップ固形物、グルコース、麦芽糖、スクロース、ラクトース、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース、糖アルコールが挙げられる。
【0188】
風味料の非限定的な例としては、クランベリー、レモン、オレンジ、バナナ、ブドウ、ナシ、パイナップル、ガラナ、リンゴ、マンゴー、ビターアーモンド、コーラ、シナモン、砂糖、わたあめ、及びバニラ風味料が挙げられる。
【0189】
他の食品成分の非限定的な例としては、風味料、酸味料、有機及びアミノ酸、着色剤、増量剤、改変デンプン、ガム、質感剤、防腐剤、抗酸化剤、乳化剤、安定剤、増粘剤、並びにゲル化剤が挙げられる。
【0190】
本明細書で使用される場合、語句「砂糖の様な特徴」、「砂糖の様な味」、「砂糖の様な甘味」、「砂糖みたい」、及び「砂糖の様」は同義である。砂糖の様な特徴は、スクロースの特徴に類似した任意の特徴を含み、これとしては、最大応答、風味プロファイル、時間プロファイル、順応挙動、口当たり、濃度／応答関数挙動、味覚及び風味／甘味相互作用、空間パターン選択性、並びに温度効果が挙げられるが、これらに限定されない。これらの特徴は、スクロースの味覚が天然及び合成高効力甘味料の味覚とは異なる程度である。特徴がより砂糖の様であるかどうかは、専門家の感覚パネルによる砂糖及び機能性味覚改善組成物の評価によって決定される。そのような評価は、本組成物の特徴における類似性を定量化する。組成物がより砂糖の様な味覚を有するかどうかを決定するための好適な手順は、当技術分野でよく知られている。
【0191】
本明細書で使用される場合、「風味」又は「風味特徴」という用語は、味覚、匂い、及び／又は質感の構成要素の組み合わされた感覚認知である。本明細書で使用される場合、「増強する」という用語は、風味特徴の感覚認知を、その性質を変化させることなく、増大させること、強化すること、強調すること、拡大すること、及び強化することを含む。本明細書で使用される場合、「改変する」という用語は、そのような特徴の質又は持続時間が不十分であった場合に、風味特徴の感覚認知を変更すること、変化させること、抑制すること、低下させること、高めること、及び補足することを含む。
【0192】
本明細書で使用される場合、「味覚改変型タンパク質（taste-modifying protein、ＴＭＰ）」は、甘味、旨味などであるがこれらに限定されない基本味覚の置換物として作用するタンパク質、並びにブロッカー、増強剤、マスキング剤、並びに風味特徴を有するタンパク質として定義される。
【0193】
本発明における「高効力甘味料」は、スクロースと比較して強い甘味を有するタンパク質を意味し、天然に存在するタンパク質、組み換えタンパク質、又はこれらの組み合わせであり得る。高効力甘味料は、同量のスクロースの５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１００００倍以上、５００００倍以上、１０００００倍以上の甘味を示す。
【0194】
本明細書で使用される場合、「栄養機能構成成分」は、ヒトに対する栄養素を指し、ミネラル、有機酸、ビタミン、ポリフェノール、タンパク質、アミノ酸、食物繊維、及び糖質（糖類を除く）からなる群から選択されるいずれか１つ以上を指す。
【0195】
本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、熱又は他のプロセス（可能な構造変化ではあるが）後の機能（例えば、甘味）の保存を指す。
【0196】
本明細書で使用される場合、「機能的安定性」という用語は、乾燥形態、水形態、又は緩衝液形態における純粋な材料の化学的安定性ではなく、配合物又は消費者包装された良好な条件における安定性、及び機能的感覚特性を維持する安定性を指す。
【0197】
本明細書で使用される場合、「食料品」という用語は、飲料、菓子製品、チューインガム製品、又は食製品を含む任意の食用口腔組成物を意味する。
【0198】
本明細書で使用される場合、「飲料」という用語は、任意の飲用可能な液体又は半液体を意味し、例えば、風味付き水、清涼ドリンク、果実ドリンク、コーヒーベースのドリンク、茶ベースのドリンク、ジュースベースのドリンク、ミルクベースのドリンク、ゼリードリンク、炭酸又は非炭酸ドリンク、アルコール又は非アルコールドリンクが挙げられる。
【0199】
本明細書で使用される場合、「経口摂取可能な組成物」及び「甘味組成物」は同義であり、ヒト又は動物の口に接触する物質を指し、これとしては、口に取り込まれ、続いて口から排出される物質、及び飲まれる、食べられる、飲み込まれる、又は他の方法で摂取される物質が挙げられ、一般に許容可能な範囲で使用される場合、ヒト又は動物の消費に安全である。これらの組成物としては、食品、飲料、医薬品、機能性食品、口腔衛生品／化粧品などが挙げられる。これらの製品の非限定的な例としては、コーラ、ジンジャーエール、ルートビア、サイダー、果実風味清涼ドリンク（例えば、レモン－ライム、クランベリー、又はオレンジなどの柑橘類風味清涼ドリンク）などの非炭酸及び炭酸清涼ドリンク（carbonated soft drink、ＣＳＤ）、粉末清涼ドリンクなど、果実又は野菜に由来する果実ジュース、絞ったジュースなどを含む果実ジュース、果実粒子を含有する果実ジュース、果実飲料、果実ジュース飲料、果実ジュースを含有する飲料、果実風味料を有する飲料、野菜ジュース、野菜を含有するジュース、及び果実と野菜とを含有する混合ジュース、スポーツドリンク、エネルギードリンク、ニアウォーター、及び同様のドリンク（例えば、天然又は合成風味料を有する水）、コーヒー、ココア、茶、緑茶、ウーロン茶などの茶類又は飲料、ミルク飲料、ミルク構成成分含有コーヒー、カフェオレ、ミルク茶、果実ミルク飲料、飲用ヨーグルト、乳酸菌飲料などのミルク構成成分含有飲料、乳製品、焼き菓子製品、ヨーグルト、ジェリー、グミ、飲用ジェリー、プディング、ババロア、ブランマンジェ、ケーキ、ブラウニー、ムース、ピーナッツバターなどのデザート、茶の時間又は食後に食べられる加糖食製品又は飲料製品、冷凍食品、冷たい菓子類、例えば、アイスクリーム類、例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトースアイスなど（ミルク製品に甘味料及び様々な他の種類の原料を添加して、得られた混合物を攪拌及び冷凍した食製品又は飲料製品）、及び冷菓類、例えば、シャーベット、デザートアイスなど（砂糖液に様々な他の種類の原料を添加して、得られた混合物を攪拌及び冷凍した食製品又は飲料製品）、アイスクリーム、一般的な菓子類、例えば、ケーキ、クラッカー、ビスケット、あんこの詰め物が入ったパンなどの焼き菓子類又は蒸し菓子類、餅及びスナック、卓上製品、一般的な砂糖菓子、例えば、チューインガム（例えば、チクル又はその置換物（ゴム又は特定の食用天然合成樹脂又はワックスを含む）などの実質的に非水溶性の咀嚼可能なガムベースを含む組成物を含む）、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、ミント、ヌガーキャンディ、ジェリービーンなど、果実風味のソース、チョコレートソースなどを含むソース、食用ゲル、バタークリーム、小麦ペースト、ホイップクリームなどを含むクリーム、いちごジャム、マーマレードなどを含むジャム、甘いパンなどを含むパン類又は他のデンプン製品、スパイス、焼肉、焼き鳥、バーベキュー肉などに使用される調味醤油、並びにトマトケチャップ（ケチャップ）、ソース、ヌードルスープなどを含む一般調味料、加工農産物製品、畜産製品、又は魚介類、ソーセージなどの食肉加工製品、レトルト食品又は飲料製品、ピクルス、保存食品、醤油、嗜好品、副食品、ポテトチップス、クッキーなどのスナック類、シリアル製品、経口投与又は口腔内で使用される薬物、医薬部外品、及び栄養補助食物（例えば、ビタミン、咳止めシロップ、のど飴、咀嚼医薬品錠、アミノ酸、苦味のある薬物又は医薬品、酸味料など）であって、薬物が固体、液体、ゲル、又はエアロゾル形態、例えば、丸剤、錠剤、スプレー、カプセル、シロップ、ドロップ、トローチ剤、粉末などであり得る、薬物、医薬部外品、及び栄養補助食物、パーソナルケア製品、例えば、口腔内で使用される口腔用組成物、例えば、口内清涼剤、うがい剤、口内洗浄剤、練り歯磨き、歯研磨剤、歯磨き剤、口腔スプレー、歯のホワイトニング剤など、栄養補助食物、動物飼料、並びに疾患（例えば、心血管疾患及び高血中コレステロールレベル、糖尿病、骨粗鬆症、炎症、又は自己免疫障害）の予防及び治療を含む、医学的又は健康的利益を提供し得る任意の食品又は食品の一部を含む機能性製品。
【0200】
本明細書で使用される場合、ステビアは、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｂｅｒｔｏｎｉ）（ブラジル及びパラグアイ原産のＡｓｔｅｒａｃａｅ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）科の多年生低木）の一般名である。ステビア葉、葉の水性抽出物、及びステビアから単離された精製ステビオールグリコシドは、ノンカロリー及び天然起源の両方として望ましい甘味料として開発されてきた。Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａから単離されたステビオールグリコシドとしては、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、及びレバウジオシドＦが挙げられる。
【0201】
Ｒｅｂ Ｍ（レバウジオシドＸとも呼ばれる）、（１３－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－ベータ－Ｄ－グル－コピラノシル）オキシ］エントカウル－１６－エン１９－オイック酸－［（２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グ－ルコピラノシル）エステル］は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａから単離され、特徴付けられた。
【0202】
本明細書に記載されるように、食品又は飲料組成物は、改善された食品又は飲料関連特性を有する。本組成物の甘味度、異味の欠如、低減した開始時間、及び低減した残味などの本組成物の甘味プロファイルは、当技術分野で既知の任意の既知の味覚試験によって決定され得る。例えば、スクロース又は他の甘味料の甘味との比較は、感覚パネルによって行われ得、甘味度は、以下の実施例において詳述されるように等級付けされ得る。
【0203】
非限定的な実施例
実施例１：ＭＮＥＩベースのタンパク質の設計
ＭＮＥＩベースのタンパク質の設計を以下のように行った：単鎖モネリン、ＭＮＥＩ（配列番号４５）は、約１１ｋＤの分子量及び約８．７のｐＩを有する９６個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。
実施例１：ＭＮＥＩベースのタンパク質の設計
ＭＮＥＩベースのタンパク質の設計を以下のように行った：単鎖モネリン、ＭＮＥＩ（配列番号４５）は、約１１ｋＤの分子量及び約８．７のｐＩを有する９６個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。
【0204】
コンピューター方法
上記のように、コンピューター分析及びヒト－専門家分析は、コンピューター的に、専門家によって、実験的に、又はこれらの方法の組み合わせによって更に分析され得る低減した配列空間を提供する。そのような分析は、個々のアミノ酸、アミノ酸のクラスター、又は他の組み合わせに適用され得る。
上記のように、コンピューター分析及びヒト－専門家分析は、コンピューター的に、専門家によって、実験的に、又はこれらの方法の組み合わせによって更に分析され得る低減した配列空間を提供する。そのような分析は、個々のアミノ酸、アミノ酸のクラスター、又は他の組み合わせに適用され得る。
【0205】
コンピューター的タンパク質設計（ＣＰＤ）プロセスの間、アミノ酸の置き換え及び／又は欠失は、受容体結合部位の一部である可能性が低い特定の領域、例えば、ヘリックスの周り、タンパク質コアを形成するベータ－シートの非曝露側、又はＭＮＥＩを野生型モネリンから区別する操作されたループにおいて許容された。ロゼッタ実行は、６００Ｋモデルをもたらした。全てのモデルのエネルギーが引き出されたとき、結果グラフは、ロジット関数の形態を有した。ロジット関数（対数オッズとしても既知）は、オッズの対数ｐ／（１－ｐ）であり、式中、ｐは、確率である。これは、シグモイド「ロジスティック」関数の逆である。
【0206】
更なる分析のために、５Ｋの最低モデルを選択した。置き換えの数（ＭＮＥＩと比較して）をＲＥＵの関数としてプロットすると、ガウス分布が得られ、集団が正常であり、更なる分析に有効であることが示された。
【0207】
ＭＮＥＩにおけるループ設計
ＭＮＥＩ中のＹ４７－Ｋ５６ループ（すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｈｅペプチド）は、柔軟なループであり、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションによってｐＨ＝２及び７で実証される。このループは、モネリンにとって天然ではなく、天然モネリンの２つのサブユニット（鎖Ａ及び鎖Ｂ）のリンカーとして導入された。このようにして、ＭＮＥＩを生成した。導入されたループは、甘味に影響を有せず、したがって、ＭＮＥＩは、モネリンと同じ甘味を有するが、ＭＮＥＩは、より高いＴｍ（溶融温度）を有し、ループがタンパク質安定性に対して有し得る影響を例示する（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ａｕｇ；９（４）：４９４－９）。ループの重要性を特定して、本発明者らは、収率、安定性、及び感覚プロファイルを増加させるためにループを再設計及び短縮した。
ＭＮＥＩ中のＹ４７－Ｋ５６ループ（すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｈｅペプチド）は、柔軟なループであり、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションによってｐＨ＝２及び７で実証される。このループは、モネリンにとって天然ではなく、天然モネリンの２つのサブユニット（鎖Ａ及び鎖Ｂ）のリンカーとして導入された。このようにして、ＭＮＥＩを生成した。導入されたループは、甘味に影響を有せず、したがって、ＭＮＥＩは、モネリンと同じ甘味を有するが、ＭＮＥＩは、より高いＴｍ（溶融温度）を有し、ループがタンパク質安定性に対して有し得る影響を例示する（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ａｕｇ；９（４）：４９４－９）。ループの重要性を特定して、本発明者らは、収率、安定性、及び感覚プロファイルを増加させるためにループを再設計及び短縮した。
【0208】
手順：
グラフト化
ＭＮＥＩのループ及び２つの隣接するベータ－シートの３Ｄ構造整列に続いて、２つの類似したタンパク質を特定した。これらのＰＤＢに基づいて、４つのモデルを構築し、ロゼッタを使用して最小化した。
グラフト化
ＭＮＥＩのループ及び２つの隣接するベータ－シートの３Ｄ構造整列に続いて、２つの類似したタンパク質を特定した。これらのＰＤＢに基づいて、４つのモデルを構築し、ロゼッタを使用して最小化した。
【0209】
サイズベース及びアブ－イニシオモデリング
上記で概説したグラフト化手順とは別に、物理的及び生物物理学的考察に基づいて、追加のループ変更を得た。ＭＮＥＩ安定性に対するループ長の影響を研究するために、Ｒｏｓｅｔｔａ又はＳｗｉｓｓ－ＰＤＢ－ＶｉｅｗｅｒなどのＣＰＤソフトウェアを使用して、様々な長さを有するループをモデル化した。ループモデリングは、ＭＮＥＩ配列を使用する物理的考察に基づいて、又は相同性モデリングに基づいて行われた。次いで、各モデルをエネルギー最小化し、ＧＲＯＭＯＳ９６ ４３Ｂ １力場を使用してエネルギーを計算した。この分析に基づいて、６つ、５つ、及び４つの残基を有するループを、これらの長さを有するループがエネルギー的により好ましいことが見出されたため、更に試験した。
上記で概説したグラフト化手順とは別に、物理的及び生物物理学的考察に基づいて、追加のループ変更を得た。ＭＮＥＩ安定性に対するループ長の影響を研究するために、Ｒｏｓｅｔｔａ又はＳｗｉｓｓ－ＰＤＢ－ＶｉｅｗｅｒなどのＣＰＤソフトウェアを使用して、様々な長さを有するループをモデル化した。ループモデリングは、ＭＮＥＩ配列を使用する物理的考察に基づいて、又は相同性モデリングに基づいて行われた。次いで、各モデルをエネルギー最小化し、ＧＲＯＭＯＳ９６ ４３Ｂ １力場を使用してエネルギーを計算した。この分析に基づいて、６つ、５つ、及び４つの残基を有するループを、これらの長さを有するループがエネルギー的により好ましいことが見出されたため、更に試験した。
【0210】
熱安定性
ＭＮＥＩ配列の異なるバリエーションを構築し、各々のモデルのエネルギーをロゼッタによって予測した。更なる分析のために、最低エネルギー配列ＤＭ２８（４ｍｅｒループ、すなわち元のＭＮＥＩループを３アミノ酸短縮した４アミノ酸のループを有する）を選択し、１００Ｋ反復を有するロゼッタを使用してエネルギーＣＰＤ計算を行った。次いで、鋳型としてＤＭ２８を使用し、４ｍｅｒループを特定のアミノ酸置換と組み合わせて、追加のバリエーションを構築した（ＤＭ２９、ＤＭ３１、ＤＭ３２、及びＤＭ３３をもたらす、表３及び表４を参照されたい）。ＤＭ０９に基づいて、１つの追加のバリアントＤＭ３０を添加した。最低エネルギー配列ＤＭ３１を更なる分析のために選択した。
ＭＮＥＩ配列の異なるバリエーションを構築し、各々のモデルのエネルギーをロゼッタによって予測した。更なる分析のために、最低エネルギー配列ＤＭ２８（４ｍｅｒループ、すなわち元のＭＮＥＩループを３アミノ酸短縮した４アミノ酸のループを有する）を選択し、１００Ｋ反復を有するロゼッタを使用してエネルギーＣＰＤ計算を行った。次いで、鋳型としてＤＭ２８を使用し、４ｍｅｒループを特定のアミノ酸置換と組み合わせて、追加のバリエーションを構築した（ＤＭ２９、ＤＭ３１、ＤＭ３２、及びＤＭ３３をもたらす、表３及び表４を参照されたい）。ＤＭ０９に基づいて、１つの追加のバリアントＤＭ３０を添加した。最低エネルギー配列ＤＭ３１を更なる分析のために選択した。
【0211】
【表1】
【0212】
図３０～図３２は、ＰＤＢにおいて利用可能な結晶構造及び本発明者らによって解明されたＤＭ３１の結晶構造を使用して、ＤＭ３１の特性をＭＮＥＩの特性と比較する。これらの図は、新しいタンパク質ＤＭ３１をもたらす置換、挿入、及び欠失、並びにループ再設計が、タンパク質を著しくより剛性な構造エレメントを有しながら、より安定させたことを示唆する。安定性の増加は、ＭＮＥＩのループ構造と比較して、ＤＭ３１のコンパクトな再設計されたループ構造によって示唆される（図３０Ｂ）。更に、図３１Ａ及び図３１Ｂに示されるＢ因子分析は、ＤＭ３１のループ残基についての低減したＢ因子（図３１Ｂ）、並びに二次構造エレメントについての低減した平均（図３１Ａ）を実証する。Ｂ因子は不規則性を示すため、これらの結果は、ＤＭ３１の安定性の増加を実証する。
【0213】
図３２は、ＭＮＥＩにおける対応するループ（図３２Ａ、ＰＤＢ ＩＤ：２ｏ９ｕ）と比較して、より良好に最適化された水素結合、並びにＤＭ３１のこの領域における新しい結合（図３２Ｃ）を実証する、再設計されたループ及び隣接するベータ鎖における骨格媒介水素結合を示す。新しい水素結合は、不規則なループを置き換える安定したベータターンを示す。水素結合もまた表１Ｂに示される。この図は、ＤＭ３１に存在し、利用可能なＭＮＥＩ構造のうちの少なくとも１つには存在しない１９個の水素結合を例示する。表中の数字は、骨格窒素上の関与する水素と、アクセプターとしての骨格酸素との距離を示す。表は、ＭＮＥＩ（１．１５Ａの分解能）に利用可能な最高分解能構造である２ｏ９ｕ構造において、ＤＭ３１結晶構造（１．６オングストロームの分解能）と比較して水素結合が少なく、これらの結合のいくつかの最適化が（距離及び角度に関して）あまりされていないことを示唆している。図３１に記載されるＢ因子の増加を超えて、２ｏ９ｕ構造は、二重占有を有する３つの残基（Ｅ４、Ｍ４２、及びＥ４８）を有し、ＤＭ３１構造において剛性化されたこの高分解能構造における不規則性を強調する。
【0214】
図３０Ａの挿入図は、選択されたアミノ酸置換、並びに再設計されたループ領域を強調している。これらの変化は、デザイナータンパク質ＤＭ３１の増加した安定性及び甘味の基礎である。図３０Ａのループ領域を示す挿入図（図３０Ｂにも見られる）は、ループエリアの残基が新規の水素結合（図３２）を形成するだけでなく、近くの２つのベータ鎖の伸長にも関与していることを示しており、これも安定性の増加を示している。全体として、ベータターンによって連結された伸長されたベータ鎖による不規則なループの置き換えは、タンパク質のこの領域を剛性化し、溶融温度の著しい増加が示されるように、安定性の増加をもたらす。
【0215】
【表2】
【0216】
Ｂ因子（デバイ－ウォーラー因子）
温度因子、Ｂ因子、又は原子変位パラメータとしても既知のデバイウォーラー因子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に寄託された全てのＸ線構造中の全ての原子について含まれる。これらの値は、全てのタンパク質原子について与えられ、実験的電子密度マップから参照される原子の平均変位を指す。そのような混乱は、２つの異なる現象、すなわち、原子の温度依存振動によって引き起こされる動的不規則性、及び静的不規則性の結果である。
温度因子、Ｂ因子、又は原子変位パラメータとしても既知のデバイウォーラー因子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に寄託された全てのＸ線構造中の全ての原子について含まれる。これらの値は、全てのタンパク質原子について与えられ、実験的電子密度マップから参照される原子の平均変位を指す。そのような混乱は、２つの異なる現象、すなわち、原子の温度依存振動によって引き起こされる動的不規則性、及び静的不規則性の結果である。
【0217】
再モデル化ループの安定性を実証するために、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって調製された結晶構造に基づいて、ＤＭ０９及びＤＭ３１の値に対してＭＮＥＩ（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｏ９Ｕ、１ＩＶ７、５Ｚ１Ｐ）の構造の骨格Ｂ因子を比較した。各タンパク質について、骨格Ｂ因子値を最初に、Ｚ－スコア正規化を使用して別々に正規化した。
【0218】
正規化後、ＤＭ３１に導入されたループ設計（３個のアミノ酸の欠失）は、再設計されたループ中のＢ因子を、高いＢ因子を有するポジションを除去すること、及び隣接残基に影響を及ぼすことの両方によって減少させたことが明らかであった。
【0219】
図３１Ａ～図３１Ｂは、ＭＮＥＩ構造体、ＤＭ０９、及びＤＭ３１の正規化Ｂ因子を実証した。最初に、骨格Ｂ因子を、Ｚ－スコア正規化を使用して別々に各構造について正規化した。領域（Ａ）及びループ残基（Ｂ）による。
【0220】
結晶構造品質保証分析
ソフトウェアＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙは、タンパク質構造の生物物理学的特性に関する品質保証分析を事前形成する。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを使用して、ＭＮＥＩ構造を調べ、それらをＤＭ０９及びＤＭ３１の結晶構造と比較した。比較によって、ＤＭ３１が参照ＭＮＥＩ構造と比較して好ましい形質を有したことが実証された。留意すべきことに、ＤＭ３１は、不良な回転異性体を有せず、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙによれば、その回転異性体の９６％超が好ましい。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙが調べる別の態様は、異なるアミノ酸についてのこれらの角度の既知の統計的分布に関連する骨格二面角の組み合わせである。これらの分布に関して、ＤＭ３１は、外れ値角度を有せず、９７パーセントを超える好ましい値を実証する。
ソフトウェアＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙは、タンパク質構造の生物物理学的特性に関する品質保証分析を事前形成する。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを使用して、ＭＮＥＩ構造を調べ、それらをＤＭ０９及びＤＭ３１の結晶構造と比較した。比較によって、ＤＭ３１が参照ＭＮＥＩ構造と比較して好ましい形質を有したことが実証された。留意すべきことに、ＤＭ３１は、不良な回転異性体を有せず、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙによれば、その回転異性体の９６％超が好ましい。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙが調べる別の態様は、異なるアミノ酸についてのこれらの角度の既知の統計的分布に関連する骨格二面角の組み合わせである。これらの分布に関して、ＤＭ３１は、外れ値角度を有せず、９７パーセントを超える好ましい値を実証する。
【0221】
【表3】
【0222】
水素結合：ループ領域にベータ－ターンを導入する
タンパク質は、それらの二次構造も決定する水素結合によって安定化される。ＰｙＭｏｌを使用して、ＤＭ３１、ＤＭ０９、及び代表的な高品質ＭＮＥＩ構造、ＰＤＢ ｉｄ ２Ｏ９Ｕの結晶構造の水素結合を分析した。この分析によって、Ｅ４８とＥ５１（ＭＮＥＩにおけるＥ５４に相当）との間のデザイナーループ領域に新しい水素結合が存在することが明らかになった。この導入された結合は、ループ領域を安定化することを目的とした設計の結果であり、ＭＮＥＩ構造に見られるランダムコイル不安定ループよりもはるかにより安定している従来の剛性ＩＩ型ベータ－ターンをもたらした。
タンパク質は、それらの二次構造も決定する水素結合によって安定化される。ＰｙＭｏｌを使用して、ＤＭ３１、ＤＭ０９、及び代表的な高品質ＭＮＥＩ構造、ＰＤＢ ｉｄ ２Ｏ９Ｕの結晶構造の水素結合を分析した。この分析によって、Ｅ４８とＥ５１（ＭＮＥＩにおけるＥ５４に相当）との間のデザイナーループ領域に新しい水素結合が存在することが明らかになった。この導入された結合は、ループ領域を安定化することを目的とした設計の結果であり、ＭＮＥＩ構造に見られるランダムコイル不安定ループよりもはるかにより安定している従来の剛性ＩＩ型ベータ－ターンをもたらした。
【0223】
【0224】
図３３は、ＤＭ３１ループ構造がベータ－ターンの構造的定義：ＤＭ３１設計ループの構造、及び概略的ベータ－ターンと一致することを示す。
【0225】
実施例２：ＭＮＥＩデザイナータンパク質ＤＭ１３～ＤＭ３３のクローニング、発現、及び特徴付け。
組み換えＭＮＥＩタンパク質を、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）で誘導されたＴ７プロモーター下でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３＋）において生成した。この系を使用して、ＭＮＥＩタンパク質を高密度発酵プロセスにおいて細胞質タンパク質（溶解性画分）として発現させた。デザイナーＭＮＥＩ（Designer MNEI、ＤＭ）は、最大１１％のアミノ酸置換を有する設計されたタンパク質である。２つのＤＭ分子が、本発明の発明者に対して国際公開第２０１９／２１５７３０号に開示された（ＤＭ０８及びＤＭ０９）。両方のタンパク質は、ＭＮＥＩの２位、２３位、及び６５位に３つの置換を含有し、より高い熱安定性及び増加した安定性をもたらす。
組み換えＭＮＥＩタンパク質を、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）で誘導されたＴ７プロモーター下でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３＋）において生成した。この系を使用して、ＭＮＥＩタンパク質を高密度発酵プロセスにおいて細胞質タンパク質（溶解性画分）として発現させた。デザイナーＭＮＥＩ（Designer MNEI、ＤＭ）は、最大１１％のアミノ酸置換を有する設計されたタンパク質である。２つのＤＭ分子が、本発明の発明者に対して国際公開第２０１９／２１５７３０号に開示された（ＤＭ０８及びＤＭ０９）。両方のタンパク質は、ＭＮＥＩの２位、２３位、及び６５位に３つの置換を含有し、より高い熱安定性及び増加した安定性をもたらす。
【0226】
本発明は、３５位、３６位、及び７０位でＤＭ０８又はＤＭ０９のいずれかに、２位及び２３位で置き換えを逆転させて、又は逆転させずに、最大３つの余分なアミノ酸置換を添加するように生成された新規のＤＭ分子を開示する。更に、モネリンＢ鎖とＡ鎖とを接続するループから４つのアミノ酸が除去された２つの固有のＤＭ分子を生成した（ＤＭ２８及びＤＭ２９）。次いで、３６位及び７０位での置換を新たに設計されたループと組み合わせて、３つの追加のバリアントを生成した（ＤＭ３１、ＤＭ３２、及びＤＭ３３）。ＤＭ０９（ＤＭ３０）に対して単一のアミノ酸置換のみを有する１つの追加のバリアントを生成した。
【0227】
全てのＤＭをＥ．Ｃｏｌｉ発酵で生成し、９５％超のレベルまで精製した。
【0228】
クローニング
ＤＭ０８及びＤＭ０９の配列に基づく部位指向的変異誘発（site-directed mutagenesis、ＳＤＭ）を使用して、ＤＭ１３～ＤＭ３３を作り出した。
ＤＭ０８及びＤＭ０９の配列に基づく部位指向的変異誘発（site-directed mutagenesis、ＳＤＭ）を使用して、ＤＭ１３～ＤＭ３３を作り出した。
【0229】
ＤＭ２８～３３におけるループ除去について、類似した方法で欠失を行った。表２は、このプロセスに使用されたプライマーを列挙する。全ての最終構築物配列を確認した。
【0230】
【表4】
【0231】
ＤＭ１３～ＤＭ３３及びＤＭ－３、８～１２のヌクレオチド配列を表３に列挙する。
【0232】
【表5】
【0233】
発酵
全てのＤＭクローンを、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢｉｏＳｔａｔＢ系を使用する３Ｌ容器又はＳｏｌａｒｉｓ Ｊｕｐｉｔｅｒ系の２Ｌ容器中での発酵に供した。いくつかのＤＭクローンを、ＶＴＴ（Ｆｉｎｌａｎｄ）及びＳｃｉＶａｃ（Ｉｓｒａｅｌ）でアウトソーシングすることによって生成した。全ての発酵は、「Ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」ｂｙ Ａｒｉｅ Ｇｅｅｒｌｏｆ－ＥＭＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇ ２９ Ｊａｎｕａｒｙ ２００８に基づくプロトコルに従った。
全てのＤＭクローンを、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢｉｏＳｔａｔＢ系を使用する３Ｌ容器又はＳｏｌａｒｉｓ Ｊｕｐｉｔｅｒ系の２Ｌ容器中での発酵に供した。いくつかのＤＭクローンを、ＶＴＴ（Ｆｉｎｌａｎｄ）及びＳｃｉＶａｃ（Ｉｓｒａｅｌ）でアウトソーシングすることによって生成した。全ての発酵は、「Ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」ｂｙ Ａｒｉｅ Ｇｅｅｒｌｏｆ－ＥＭＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇ ２９ Ｊａｎｕａｒｙ ２００８に基づくプロトコルに従った。
【0234】
精製
全てのＤＭ試料を、以下のステップを使用して精製した。
１．圧力均質機による溶解。
２．マルチモード樹脂上でのタンパク質の捕捉、同じ緩衝液中の増加するＮａＣｌ濃度での溶出。
３．以下の群からの樹脂を使用する少なくとも１つの研磨ステップ：
１．イオン交換。
２．疎水性相互作用。
３．サイズ排除。
４．最終微生物濾過（０．２μｍ）及び－２０℃での保存。
全てのＤＭ試料を、以下のステップを使用して精製した。
１．圧力均質機による溶解。
２．マルチモード樹脂上でのタンパク質の捕捉、同じ緩衝液中の増加するＮａＣｌ濃度での溶出。
３．以下の群からの樹脂を使用する少なくとも１つの研磨ステップ：
１．イオン交換。
２．疎水性相互作用。
３．サイズ排除。
４．最終微生物濾過（０．２μｍ）及び－２０℃での保存。
【0235】
特徴付け
精製レベル
精製レベルを、ゲル電気泳動、続いてクーマシー染色及び濃度測定分析を使用して評価した。５０～５００ｎｇ／レーンのＢＳＡ標準曲線を使用して、２０ｐｇ／レーンの各タンパク質を流すことによって、濃度測定による分析を行った。全ての試料において、最大汚染は、３％（すなわち、９７％純度）に達した。
精製レベル
精製レベルを、ゲル電気泳動、続いてクーマシー染色及び濃度測定分析を使用して評価した。５０～５００ｎｇ／レーンのＢＳＡ標準曲線を使用して、２０ｐｇ／レーンの各タンパク質を流すことによって、濃度測定による分析を行った。全ての試料において、最大汚染は、３％（すなわち、９７％純度）に達した。
【0236】
甘味評価
プロの感覚パネルは、０＝全く甘くない、及び１００＝非常に甘いという、０～１００の尺度（大きさの推定）で、砂糖溶液で最初に較正されたパネリストを含む。較正後、テイスティング者は、検証されたテイスティングプロトコルに従って同じ尺度で試験試料を等級付けした。スクロースの線形尺度を、２°Ｂｘ、４°Ｂｘ、６°Ｂｘ、及び８°Ｂｘの濃度で得た。
ブリックス（Ｂｒｉｘ、Ｂｘ）＝ｇｒ／１００ｍｌ。
初期甘味評価を、選択された効力Ｘ４０００で各試験において、６°Ｂｘの砂糖、ＤＭ０９、及び新たに選択されたＤＭと比較することによって行った。全ての希釈を水のみで行った。試料を、６°Ｂｘスクロース及びＤＭ０９を対照として使用して、異なる機会に専門家パネルによって評価した（図１）。
プロの感覚パネルは、０＝全く甘くない、及び１００＝非常に甘いという、０～１００の尺度（大きさの推定）で、砂糖溶液で最初に較正されたパネリストを含む。較正後、テイスティング者は、検証されたテイスティングプロトコルに従って同じ尺度で試験試料を等級付けした。スクロースの線形尺度を、２°Ｂｘ、４°Ｂｘ、６°Ｂｘ、及び８°Ｂｘの濃度で得た。
ブリックス（Ｂｒｉｘ、Ｂｘ）＝ｇｒ／１００ｍｌ。
初期甘味評価を、選択された効力Ｘ４０００で各試験において、６°Ｂｘの砂糖、ＤＭ０９、及び新たに選択されたＤＭと比較することによって行った。全ての希釈を水のみで行った。試料を、６°Ｂｘスクロース及びＤＭ０９を対照として使用して、異なる機会に専門家パネルによって評価した（図１）。
【0237】
ＤＳＦ及びＤＳＣ分析－熱感度
ナノテンパープロメテウス（Nanotemper Prometheus）を使用する示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって相対Ｔｍを決定した。ＤＳＦは、容易で迅速かつ正確な、タンパク質の安定性及び凝集の分析のための方法である。ＤＳＦは、タンパク質中のトリプトファン及びチロシン残基の蛍光の変化を検出する。トリプトファン及びチロシン残基の蛍光は、それらの近接環境に強く依存する。タンパク質コンフォメーションの変化は、蛍光変化として反映される。蛍光比（３３０／３５０）の一次導関数を使用して、変曲点を決定する。二次レポーターフルオロフォアが必要とされないため、タンパク質溶液は、緩衝液組成とは無関係に、２５０ｍｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたって分析することができる。ＤＭ１３～３３を、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で分析した。
ナノテンパープロメテウス（Nanotemper Prometheus）を使用する示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって相対Ｔｍを決定した。ＤＳＦは、容易で迅速かつ正確な、タンパク質の安定性及び凝集の分析のための方法である。ＤＳＦは、タンパク質中のトリプトファン及びチロシン残基の蛍光の変化を検出する。トリプトファン及びチロシン残基の蛍光は、それらの近接環境に強く依存する。タンパク質コンフォメーションの変化は、蛍光変化として反映される。蛍光比（３３０／３５０）の一次導関数を使用して、変曲点を決定する。二次レポーターフルオロフォアが必要とされないため、タンパク質溶液は、緩衝液組成とは無関係に、２５０ｍｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたって分析することができる。ＤＭ１３～３３を、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で分析した。
【0238】
表４は、改変型タンパク質ＤＭ１３～ＤＭ３３の特性を要約する。結果は、タンパク質甘味及び熱安定性の制御におけるいくつかのアミノ酸の役割を示す。Ｅ２、Ｅ２３、及びＹ６５に加えて、７０位のロイシンをイソロイシンで置換すると、Ｔｍが２℃増加した。安定性は、３６位のリジンをスレオニンで置換することによって更に増加したが、この置換はまた、タンパク質甘味の低減を引き起こした。４アミノ酸ループをもたらすループ設計は、約７～１０℃のＴｍの増加で表される安定性の増加をもたらした。
【0239】
【表6】
【0240】
結論：Ｔｍ及び甘味レベルに対する特定のポジションの影響
Ｅ２－Ｎで置換＝＞Ｔｍ及び甘味の増加（ＤＭ２２とＤＭ２３又はＤＭ２０とＤＭ２１との比較）。
Ｅ２３－Ａ又はＶで置換＝＞Ｔｍの増加（ＤＭ１３とＤＭ１５又はＤＭ１７とＤＭ２２との比較）。甘味に対して及ぼす明確な影響はない（他の置換のバックグラウンドに対して）。
Ｅ２３－Ａ対Ｖで置換＝＞（ＤＭ０９とＤＭ２７との比較）。
Ｅ２３－Ｉで置換＝＞Ｔｍの増加（ＤＭ１３とＤＭ１５又はＤＭ１７とＤＭ２２との比較）。甘味に対して及ぼす明確な影響はない。
Ｎ３５－Ｔで置換＝＞いずれのパラメータに対しても及ぼす明確な影響はない。
Ｋ３６－Ｔで置換＝＞Ｔｍの増加、甘味の強い低減（ＤＭ１４とＤＭ１７、ＤＭ２４とＤＭ１４、又はＤＭ１３とＤＭ１６との比較）
Ｙ６５－Ｒ対Ｋで置換＝：＞（ＤＭ０８とＤＭ２７との比較）
Ｌ７０－Ｉで置換＝＞Ｔｍのわずかな増加、甘味に対して及ぼす明確な影響はない（ＤＭ０９とＤＭ１４又はＤＭ０８とＤＭ１３との比較）。
Ｅ２－Ｎで置換＝＞Ｔｍ及び甘味の増加（ＤＭ２２とＤＭ２３又はＤＭ２０とＤＭ２１との比較）。
Ｅ２３－Ａ又はＶで置換＝＞Ｔｍの増加（ＤＭ１３とＤＭ１５又はＤＭ１７とＤＭ２２との比較）。甘味に対して及ぼす明確な影響はない（他の置換のバックグラウンドに対して）。
Ｅ２３－Ａ対Ｖで置換＝＞（ＤＭ０９とＤＭ２７との比較）。
Ｅ２３－Ｉで置換＝＞Ｔｍの増加（ＤＭ１３とＤＭ１５又はＤＭ１７とＤＭ２２との比較）。甘味に対して及ぼす明確な影響はない。
Ｎ３５－Ｔで置換＝＞いずれのパラメータに対しても及ぼす明確な影響はない。
Ｋ３６－Ｔで置換＝＞Ｔｍの増加、甘味の強い低減（ＤＭ１４とＤＭ１７、ＤＭ２４とＤＭ１４、又はＤＭ１３とＤＭ１６との比較）
Ｙ６５－Ｒ対Ｋで置換＝：＞（ＤＭ０８とＤＭ２７との比較）
Ｌ７０－Ｉで置換＝＞Ｔｍのわずかな増加、甘味に対して及ぼす明確な影響はない（ＤＭ０９とＤＭ１４又はＤＭ０８とＤＭ１３との比較）。
【0241】
ループ設計－Ｅ５０、Ｆ５２、Ｒ５３の欠失＝＞Ｔｍの大きな増加、甘味に対して及ぼす明確な影響はない。
【0242】
実施例３：モネリンデザイナータンパク質ＤＭ１３についての甘味強度及び安定性の感覚評価
ＭＮＥＩ（図２Ａ）と比較したＤＭ１３（図２Ｂ）、ＤＭ２８（図２Ｃ）、及びＤＭ３１（図２Ｄ）の甘味強度の用量応答を行った。パネリストは最初に、０＝全く甘くない、及び１００＝非常に甘いという、０～１００の尺度（大きさの推定）で、砂糖溶液で較正された。スクロースの線形尺度を、２°Ｂｘ、４°Ｂｘ、６°Ｂｘ、及び８°Ｂｘの濃度で得た。ブリックス（Ｂｘ）＝ｇｒ／１００ｍｌ。較正後、テイスティング者は、検証されたテイスティングプロトコルに従って同じ尺度で、増加濃度で試験試料を等級付けした。
ＭＮＥＩ（図２Ａ）と比較したＤＭ１３（図２Ｂ）、ＤＭ２８（図２Ｃ）、及びＤＭ３１（図２Ｄ）の甘味強度の用量応答を行った。パネリストは最初に、０＝全く甘くない、及び１００＝非常に甘いという、０～１００の尺度（大きさの推定）で、砂糖溶液で較正された。スクロースの線形尺度を、２°Ｂｘ、４°Ｂｘ、６°Ｂｘ、及び８°Ｂｘの濃度で得た。ブリックス（Ｂｘ）＝ｇｒ／１００ｍｌ。較正後、テイスティング者は、検証されたテイスティングプロトコルに従って同じ尺度で、増加濃度で試験試料を等級付けした。
【0243】
図２によって実証するように、ＤＭ１３、ＤＭ２８、及びＤＭ３１は、ＭＮＥＩよりも４倍甘い。
【0244】
クエン酸緩衝液中、９５℃で３０秒間の熱処理
クエン酸緩衝液（ｐＨ＝３）をサーモミックス中で９５℃に予熱した。９５℃で、ＤＭ１３（５°Ｂｘイソスイートの濃度で）を緩衝溶液に添加し、この温度で３０秒間維持した。３０秒後、溶液を直ちに冷凍庫で冷却した。
クエン酸緩衝液（ｐＨ＝３）をサーモミックス中で９５℃に予熱した。９５℃で、ＤＭ１３（５°Ｂｘイソスイートの濃度で）を緩衝溶液に添加し、この温度で３０秒間維持した。３０秒後、溶液を直ちに冷凍庫で冷却した。
【0245】
専門家パネル（ｎ＝１５）は、製品をテイスティングし、甘味強度を０～１００の尺度で評価した。各々の処理された製品を、参照（加熱無しの同じ溶液）と比較してテイスティングした。全ての製品をコード番号で提供した。図４に示すように、ＤＭ１３は、９５℃のクエン酸緩衝液中で３０秒間安定している。
【0246】
クエン酸緩衝液中、９０℃で１０分間の熱処理
クエン酸緩衝液（ｐＨ３）をサーモミックスで９０℃に予熱した。９０℃で、ＤＭ１３（５°Ｂｘイソスイートの濃度で）を緩衝溶液に添加し、この温度で適宜に１分、３分、及び１０分間維持した。
クエン酸緩衝液（ｐＨ３）をサーモミックスで９０℃に予熱した。９０℃で、ＤＭ１３（５°Ｂｘイソスイートの濃度で）を緩衝溶液に添加し、この温度で適宜に１分、３分、及び１０分間維持した。
【0247】
適当な時間の後、溶液を直ちに冷凍庫で冷却した。
【0248】
専門家パネルは製品をテイスティングし、甘味強度を０～１００の尺度で評価した。処理した製品を、参照（加熱せずに同じ溶液）と比較してテイスティングした。全ての製品をコード番号で提供した。図３に示すように、ＤＭ１３は、９０℃のクエン酸緩衝液中で１０分間安定している。
【0249】
２１℃及び３２℃で８週間後のＤＭ１３甘味安定性
ＤＭ１３の貯蔵寿命安定性を、クエン酸緩衝液（０．１１３％クエン酸、０．０１６％クエン酸三ナトリウム、９９．９％水）中、２１℃及び３２℃で４週間及び８週間試験した。ＤＭ１３を５ブリックス当量（効力１：４０００）で添加した。
ＤＭ１３の貯蔵寿命安定性を、クエン酸緩衝液（０．１１３％クエン酸、０．０１６％クエン酸三ナトリウム、９９．９％水）中、２１℃及び３２℃で４週間及び８週間試験した。ＤＭ１３を５ブリックス当量（効力１：４０００）で添加した。
【0250】
【0251】
実施例４：デザイナー－ＭＮＥＩ（ＤＭ）タンパク質を有するケチャップ及びプレーンヨーグルト配合物
ＤＭタンパク質を有するケチャップの配合を表５に提示する。
ＤＭタンパク質を有するケチャップの配合を表５に提示する。
【0252】
【表7】
【0253】
ＤＭタンパク質を有するヨーグルトの配合を表６に提示する。
【0254】
【表8】
【0255】
試験方法－味覚タンパク質の専門家パネル
全ての感覚評価を、分析的識別のための訓練された専門家パネルを使用して決定した。感覚専門家パネルを、潜在的なテイスターのスクリーニングプロセスによって確立した。ＩＳＯ標準（ＩＳ ８５８６－１）に従って行われたスクリーニング試験は、テイスターの感覚感受性、一貫性、及び感覚記憶を調べた。パネルを十分に訓練し、較正する。高い性能結果を維持するために、選択されたパネルを定期的に訓練する。
全ての感覚評価を、分析的識別のための訓練された専門家パネルを使用して決定した。感覚専門家パネルを、潜在的なテイスターのスクリーニングプロセスによって確立した。ＩＳＯ標準（ＩＳ ８５８６－１）に従って行われたスクリーニング試験は、テイスターの感覚感受性、一貫性、及び感覚記憶を調べた。パネルを十分に訓練し、較正する。高い性能結果を維持するために、選択されたパネルを定期的に訓練する。
【0256】
ケチャップ及びプレーンヨーグルトプロトタイプの感覚プロファイル－試験手順：
各カテゴリー（ケチャップ／プレーンヨーグルト）について、専門家パネルによって感覚語彙を決定した。カテゴリーからの広範囲の製品をテイスティングし、カテゴリーを記載する全ての関連感覚属性を上げることによって、感覚語彙を構築した。製品を最もよく記載するために、可能な限り多様な言語を使用する。
各カテゴリー（ケチャップ／プレーンヨーグルト）について、専門家パネルによって感覚語彙を決定した。カテゴリーからの広範囲の製品をテイスティングし、カテゴリーを記載する全ての関連感覚属性を上げることによって、感覚語彙を構築した。製品を最もよく記載するために、可能な限り多様な言語を使用する。
【0257】
感覚語彙を有した後、アンケートにおいて製品を記載するために使用されるキー属性を選択する。
【0258】
ケチャップ及びプレーンヨーグルトについての感覚プロファイルの構築：パネリストは、用語集から選択された全ての属性にわたって固定基準点（０）を用いて、二元尺度（－３～＋３）で各試験製品を基準品に対して評価した。試験製品が特定の属性（例えば、より甘い、より濃厚など）について基準品より「多い」と評価された場合、正の評価（＋１、＋２、又は＋３）を得、特定の属性（例えば、より甘くない、あまり濃厚ではないなど）について基準品より「少ない」と評価された場合、負の評価（－１、－２、又は－３）を得た。属性の前及び間に、テイスティング者はミネラルウォーターで口をすすぎ、無塩クラッカー及びキュウリを食べ、再び水を飲むように要求された。
【0259】
結果
ケチャッププロトタイプ
図６に実証するように、添加された砂糖が６９％低減したケチャッププロトタイプは、ＤＭ０９を有するケチャッププロトタイプと比較して、より甘くなく、より酸味があり、より塩味があり、舌により強い刺痛を有する。
ケチャッププロトタイプ
図６に実証するように、添加された砂糖が６９％低減したケチャッププロトタイプは、ＤＭ０９を有するケチャッププロトタイプと比較して、より甘くなく、より酸味があり、より塩味があり、舌により強い刺痛を有する。
【0260】
図７は、添加された砂糖が６９％低減したケチャッププロトタイプが、全糖ケチャッププロトタイプと比較して、より甘くなく、より酸味があり、かつより明るい色を有することを示す。
【0261】
ＤＭ０９を有するケチャップ（添加された砂糖が６９％低減した）が、全糖ケチャッププロトタイプに非常に類似した感覚プロファイルを有することが実証された（図８）。
【0262】
図９は、ＤＭ２８を有するケチャップが、より多くの「遅発性」及びより多くの粘着性を有することを除いて、ＤＭ０９を有するケチャップと比較して類似した感覚プロファイルを有することを実証する。
【0263】
図１８は、ＤＭ０３１を有するケチャップ（添加された砂糖が６９％低減した）が、ＤＭ０９を有するケチャップに非常に類似した感覚プロファイルを有することを実証する。
【0264】
１ヶ月後の貯蔵寿命後に、ＤＭ０９を有するケチャップが、その甘味を失わない。製品に生じる変化は、１ヶ月の貯蔵寿命後のケチャップに典型的なものである（より暗い色、より調味された、より酸味のある、より濃厚な、より滑らかでない質感）（図１０）。
【0265】
ヨーグルトプロトタイプ
図１１に実証するように、添加された砂糖が３３％低減したプレーンヨーグルトが、ＤＭ０９を有し、かつ添加された砂糖が３３％低減したプレーンヨーグルトより甘くない。
図１１に実証するように、添加された砂糖が３３％低減したプレーンヨーグルトが、ＤＭ０９を有し、かつ添加された砂糖が３３％低減したプレーンヨーグルトより甘くない。
【0266】
図１２は、ＤＭ０９を有するプレーンヨーグルト（添加された砂糖が３３％低減した）が、全糖ヨーグルトプロトタイプに類似した感覚プロファイルを有することを実証する。
【0267】
図１３に示すように、ＤＭ２８を有するイチゴヨーグルトが、わずかにより酸味があることを除いて、ＤＭ０９を有するイチゴヨーグルトに類似した感覚プロファイルを有する。
【0268】
図１９は、ＤＭ３１を有するイチゴヨーグルトが、ＤＭ０９を有するイチゴヨーグルトに類似した感覚プロファイルを有することを実証する。
【0269】
図１４は、２週間の貯蔵寿命後に、ＤＭ０９を有するプレーンヨーグルトが、ＤＭ０９を有する新鮮なプレーンヨーグルトに類似した感覚プロファイルを有することを実証する。
【0270】
実施例５：甘味料の組み合わせ
甘味料についての感覚プロファイル－試験手順：
多くの甘味料及び甘味料の組み合わせをスクリーニングした。最良の結果を有する甘味料の組み合わせは、ステビア対ステビア＋ＤＭ０９、並びにラカンカとステビアとの組み合わせ対ラカンカ、ステビア、及びＤＭ０９の組み合わせであった。各甘味溶液は、５°Ｂｘに相当する最終濃度にあった（２つの甘味料の組み合わせにおいて、各甘味料は、２．５°Ｂｘに相当する濃度にあり、３つの甘味料の組み合わせにおいて、各甘味料は、１．７°Ｂｘに相当する濃度にあった）。
甘味料についての感覚プロファイル－試験手順：
多くの甘味料及び甘味料の組み合わせをスクリーニングした。最良の結果を有する甘味料の組み合わせは、ステビア対ステビア＋ＤＭ０９、並びにラカンカとステビアとの組み合わせ対ラカンカ、ステビア、及びＤＭ０９の組み合わせであった。各甘味溶液は、５°Ｂｘに相当する最終濃度にあった（２つの甘味料の組み合わせにおいて、各甘味料は、２．５°Ｂｘに相当する濃度にあり、３つの甘味料の組み合わせにおいて、各甘味料は、１．７°Ｂｘに相当する濃度にあった）。
【0271】
アンケートにおける感覚属性を、パネリストの予備的なテイスティングによって決定した。
【0272】
各甘味料溶液についての感覚プロファイルの構築：パネリストは、各試験溶液（甘味料＋ＤＭ０９／ＤＭ２８）を、基準液（ＤＭ０９／ＤＭ２８を有しない甘味料）に対して、選択された属性にわたって固定基準点（０）を用いて二元尺度（－３～＋３）で評価した。試験製品が特定の属性（例えば、より甘い、より残味があるなど）について基準品より「多い」と評価された場合、正の評価（＋１、＋２、又は＋３）を得、特定の属性（例えば、より残味がないなど）について基準品より「少ない」と評価された場合、負の評価（－１、－２、又は－３）を得た。
【0273】
テイスティングの前及び間に、テイスティング者はミネラルウォーターで口をすすぎ、無塩クラッカー及びキュウリを食べ、再び水を飲むように要求された。
【0274】
レモン風味ドリンクプロトタイプ
ＤＭタンパク質を有するレモン風味ドリンクの配合を表７～表８に提示する。
ＤＭタンパク質を有するレモン風味ドリンクの配合を表７～表８に提示する。
【0275】
【表9】
【0276】
【表10】
【0277】
結果
図１５に示すように、ステビア及びＤＭ０９を有する水溶液は、同じ甘味レベル当量で、ステビアを単独で有する水溶液より甘い。図１６は、ラカンカ、ステビア、及びＤＭ０９の組み合わせを有する水溶液が、同じ甘味レベル当量で、ラカンカ及びステビアのみを有する水溶液と比較して、より甘く、より短い「遅発性」であることを実証する。
図１５に示すように、ステビア及びＤＭ０９を有する水溶液は、同じ甘味レベル当量で、ステビアを単独で有する水溶液より甘い。図１６は、ラカンカ、ステビア、及びＤＭ０９の組み合わせを有する水溶液が、同じ甘味レベル当量で、ラカンカ及びステビアのみを有する水溶液と比較して、より甘く、より短い「遅発性」であることを実証する。
【0278】
図１７に示すように、レモン風味ドリンク（ステビアを有する５０％の添加砂糖低減（５°Ｂｘ当量）が、ステビア及びＤＭ０９（各々２．５°Ｂｘ当量）に非常に類似した感覚プロファイルを有する。
【0279】
実施例６：デザイナーモネリン（ＤＭ）タンパク質を有するチューインガムプロトタイプ
チューインガムは、通常、ガムベース、軟化剤、甘味料、及び風味料から構成される。ガムベースは、チューインガムにその「咀嚼」を与えるものである。それは、ガムに所望の質感を与える食品グレードのポリマー、ワックス、及び軟化剤の組み合わせから作製される。
チューインガムは、通常、ガムベース、軟化剤、甘味料、及び風味料から構成される。ガムベースは、チューインガムにその「咀嚼」を与えるものである。それは、ガムに所望の質感を与える食品グレードのポリマー、ワックス、及び軟化剤の組み合わせから作製される。
【0280】
ＤＭタンパク質を有するチューインガムの配合を表９に提示する。
【0281】
【表11】
【0282】
調製指示：
最初に、ガムベースを加熱し、溶融した塊をミキサーに入れる。
最初に、ガムベースを加熱し、溶融した塊をミキサーに入れる。
【0283】
次に、成分１～１３を継続した混合中に徐々に添加する。
【0284】
次いで、塊を混練して、ガムを滑らかにし、形成し、成形する。
【0285】
糖アルコール及び人工甘味料を含有する参照チューインガム試料を、甘味タンパク質が添加された同量の糖アルコール及び人工甘味料を有するチューインガム試料と比較する。
【0286】
０．０１～０．０５重量％の甘味タンパク質をレシピに添加した。
【0287】
甘味タンパク質効力は、４０００～８０００であり、４８～５６ブリックスに相当する。
【0288】
感覚パネル：
チューインガムの感覚プロファイルを、分析的識別のための訓練された専門家パネルを使用して構築した。
チューインガムの感覚プロファイルを、分析的識別のための訓練された専門家パネルを使用して構築した。
【0289】
パネリストは、試験した各チューインガム製品を、アンケートにおける全ての属性にわたって評価した。３０秒後、２分後、及び４分後に属性を測定した。
【0290】
製品の前及び間に、テイスティング者はミネラルウォーターで口をすすぎ、無塩クラッカー及びキュウリを食べ、再び水を飲むように要求された。
【0291】
結果
図２０に示すように、ＤＭ０９を有するチューインガムが、３０秒間の咀嚼後にＤＭ０９を有しないチューインガムより甘い。
図２０に示すように、ＤＭ０９を有するチューインガムが、３０秒間の咀嚼後にＤＭ０９を有しないチューインガムより甘い。
【0292】
実施例７：デザイナーＭＮＥＩ（ＤＭ）タンパク質を有するピーナッツバタープロトタイプ
ＤＭタンパク質を有するピーナッツバターの配合を表１０に提示する。
ＤＭタンパク質を有するピーナッツバターの配合を表１０に提示する。
【0293】
【表12】
【0294】
全ての成分を混合物が均質になるまで混合する。
【0295】
結果
図２１に示すように、ＤＭ０９、５０％の砂糖低減を有するピーナッツバターが、全糖ピーナッツバターに非常に類似した感覚プロファイルを有する。
図２１に示すように、ＤＭ０９、５０％の砂糖低減を有するピーナッツバターが、全糖ピーナッツバターに非常に類似した感覚プロファイルを有する。
【0296】
実施例８：デザイナーＭＮＥＩ（ＤＭ）タンパク質を有するアイスコーヒープロトタイプ
ＤＭタンパク質を有するアイスコーヒーの配合を表１１に提示する。
ＤＭタンパク質を有するアイスコーヒーの配合を表１１に提示する。
【0297】
【表13】
【0298】
コーヒー、砂糖、マルトデキストリン、及びＤＭ０９を混合して、組み合わせ混合物とする。次いで、混合物が均質になるまで、７～９ｇの混合物を８９～９４ｇのミルクと混合する。
【0299】
結果
図２２に示すように、ＤＭ０９（７０％の砂糖低減）を有するアイスコーヒーが、ＤＭを有しないアイスコーヒー（７０％の砂糖低減）より甘い。
図２２に示すように、ＤＭ０９（７０％の砂糖低減）を有するアイスコーヒーが、ＤＭを有しないアイスコーヒー（７０％の砂糖低減）より甘い。
【0300】
実施例９：クランベリージュースプロトタイプ
ＤＭタンパク質を有するクランベリージュースの配合を表１２～表１５に提示する。
ＤＭタンパク質を有するクランベリージュースの配合を表１２～表１５に提示する。
【0301】
【表14】
【0302】
【表15】
【0303】
【表16】
【0304】
【表17】
【0305】
結果
図２３は、クランベリージュース（４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ０９）が、全糖クランベリージュースに類似した甘味を有することを実証する。図２４は、ＤＭ２８を有するクランベリージュースが、ＤＭ０９を有するクランベリージュースより甘いことを実証する。図２５は、クランベリージュース（４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ３１）が、４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ０９を有するクランベリージュースに類似した感覚プロファイルを有することを実証する。
図２３は、クランベリージュース（４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ０９）が、全糖クランベリージュースに類似した甘味を有することを実証する。図２４は、ＤＭ２８を有するクランベリージュースが、ＤＭ０９を有するクランベリージュースより甘いことを実証する。図２５は、クランベリージュース（４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ３１）が、４０％の砂糖低減、ステビア、及びＤＭ０９を有するクランベリージュースに類似した感覚プロファイルを有することを実証する。
【0306】
実施例１０：乾燥クランベリー及びモモレザープロトタイプ
ＤＭタンパク質を有する乾燥クランベリーの配合を表１６～表１８に提示する。
ＤＭタンパク質を有する乾燥クランベリーの配合を表１６～表１８に提示する。
【0307】
【表18】
【0308】
クランベリーを、クランベリーが４５～６０°Ｂｘ（全糖適用の場合）又は２０～３０°Ｂｘ（ＤＭ適用の場合）に達するまで、最大６時間１：３の比で注入シロップに浸漬し、次いでクランベリーを７０～８６°Ｂｘ（全糖適用の場合）又は３３～４５°Ｂｘ（ＤＭ適用の場合）に達するまで、７０～１２０℃でオーブン乾燥させた。
【0309】
【表19】
【0310】
クランベリーを４５～６０°Ｂｘ（全糖適用の場合）又は２５～３８°Ｂｘ（ＤＭ適用の場合）に達するまで、最大６時間１：３の比で注入シロップに浸漬し、次いでクランベリーを７４～８４°Ｂｘ（全糖適用の場合）又は４２～５４°Ｂｘ（ＤＭ適用の場合）に達するまで、７０～１２０℃でオーブン乾燥させた。
【0311】
【表20】
【0312】
クランベリーを、クランベリーが４５～６０°Ｂｘ（全糖適用の場合）又は２０～３０°Ｂｘ（ＤＭ適用の場合）に達するまで、２～６時間１：３の比で注入シロップに浸漬した。次いで、クランベリーを７０～１２０℃でオーブン乾燥させる。乾燥は、クランベリーが全糖適用の場合は７０～８６°Ｂｘ又はＤＭ適用の場合は３３～４５°Ｂｘに達すると完了したとみなす。２時間後、クランベリーをオーブンから取り出し、混合物（マルトデキストリン及び乾燥ＤＭ０９）を乾燥クランベリー上に噴霧する（混合物噴霧量は、１０％の添加砂糖に相当し、全糖レシピからこの量を計算した）。クランベリーをオーブンに戻し入れ、７０～１２０℃で更に１０～３０分間更に乾燥させる。
【0313】
ＤＭ０９を有するモモレザーの配合を表１９に提示する。
【0314】
【表21】
【0315】
モモを剥き、種を除去した。剥いたモモを、フードプロセッサー内でクエン酸とブレンドして滑らかなペーストにした。次いで、ＤＭ０９を均質ブレンドに添加した。混合物を注ぎ、滑らかにして薄い均一な層にし、乾燥するまで脱水炉中で、４０℃で９～１０時間乾燥させた。乾燥したモモレザーを取り出し、冷却した。レザーを巻いて、気密容器に保存した。
【0316】
結果
図２６は、乾燥クランベリー（５０％の砂糖低減及びＤＭ０９）が、乾燥クランベリー（５０％の砂糖低減）と比較してより甘いことを実証する。
図２６は、乾燥クランベリー（５０％の砂糖低減及びＤＭ０９）が、乾燥クランベリー（５０％の砂糖低減）と比較してより甘いことを実証する。
【0317】
図２７は、ＤＭ０９を有するモモレザーが、ＤＭ０９を有しないモモレザーより甘いことを実証する。
【0318】
実施例１１：デザイナーＭＮＥＩ（ＤＭ）タンパク質を有するアイス緑茶プロトタイプ
ＤＭタンパク質を有するアイス緑茶の配合を表２０に提示する。
ＤＭタンパク質を有するアイス緑茶の配合を表２０に提示する。
【0319】
【表22】
＊＊緑茶バッグを９５℃の水中に１．５分間浸漬することによって、緑茶抽出物を作製する。
【0320】
結果
図２８に示すように、４０％の添加砂糖低減＋ＤＭ０９及びステビアを有するアイス緑茶が、ステビアを有しない４０％の添加砂糖低減を有するアイス緑茶と比較してより甘い。
図２８に示すように、４０％の添加砂糖低減＋ＤＭ０９及びステビアを有するアイス緑茶が、ステビアを有しない４０％の添加砂糖低減を有するアイス緑茶と比較してより甘い。
【0321】
実施例１２：デザイナーＭＮＥＩ（ＤＭ）タンパク質を有するマラビプロトタイプ
ＤＭタンパク質を有するマラビの配合を表２１に提示する。
ＤＭタンパク質を有するマラビの配合を表２１に提示する。
【0322】
【表23】
【0323】
ミルク、クリーム、砂糖、及びバラ水を１００℃に加熱した。その間、コーン粉を水と混合した。液体が１００℃に達したら、コーン粉を添加し、混合した。温度が６０℃に下がったら、ＤＭ３１を添加し、混合した。デザートを給仕皿に注ぎ、冷却した。
【0324】
結果
図２９に示すように、５０％の添加砂糖低減＋ＤＭ３１を有するマラビが、５０％の添加砂糖低減を有するマラビと比較してより甘い。
図２９に示すように、５０％の添加砂糖低減＋ＤＭ３１を有するマラビが、５０％の添加砂糖低減を有するマラビと比較してより甘い。
【0325】
実施例１３：インビトロ消化性研究
消化性研究の目的は、消化後の胃腸管において、甘味料として使用されるＤＭタンパク質の結末を決定することであった。試験したタンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）における精密発酵によって生成されたＤＭ３１タンパク質であった。
消化性研究の目的は、消化後の胃腸管において、甘味料として使用されるＤＭタンパク質の結末を決定することであった。試験したタンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）における精密発酵によって生成されたＤＭ３１タンパク質であった。
【0326】
インビトロ消化性静的モデルを、ＩＮＦＯＧＥＳＴのプロトコル（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １４，９９１－１０１４（２０１９））に従って行った。
【0327】
インシリコアレルゲン性分析を、消化モデルの終わりに得られた消化ペプチドに対して行った。
【0328】
消化性サイクルは、経口消化（Ｍ）、胃消化（Ｇ）、及び十二指腸消化（Ｄ）を含む。使用した消化酵素：胃ペプシン（模擬胃流体（Simulated Gastric Fluid、ＳＧＦ）中で調製－（２，０００Ｕ／ｍｌ ＳＧＦ））、消化十二指腸酵素を、模擬十二指腸流体（Simulated Duodenal Fluid、ＳＤＦ）－トリプシン（１００Ｕ／ｍＬ ＳＤＦ）、及びキモトリプシン（２５Ｕ／ｍＬ ＳＤＦ）中で調製した。陽性対照は、既知の完全に消化可能なタンパク質、α－ラクトアルブミンであった。陰性対照は、タンパク質の存在を有しなかった。
【0329】
使用した試料分析：タンパク質ＳＤＳゲル－各消化相のタンパク質試料を１６．５％ＳＤＳ ＰＡＧＥトリシンタンパク質ゲル上で泳動させ、クーマシーブルーを使用して染色した。
【0330】
質量分光ペプチドの特定：各サイクルの２回の反復、Ｇ及びＤを、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅプラス（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してＳｍｏｌｌｅｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ，ＴｅｃｈｎｉｏｎにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析し、ＤＭの配列に対するＤｉｓｃｏｖｅｒソフトウェア及び宿主微生物（Ｅ－ｃｏｌｉ）データベースによって特定した。
【0331】
結果
図３４に示すように、ＤＭ３１タンパク質は、胃相の終わりに部分的に消化され、十二指腸相の終わりに完全に消化される。ＩＮＦＯＧＥＳＴプロトコルを使用した静的モデルによって得られた結果は、生理的消化性プロセスの間のＤＭタンパクの消化性を明確に実証する。
図３４に示すように、ＤＭ３１タンパク質は、胃相の終わりに部分的に消化され、十二指腸相の終わりに完全に消化される。ＩＮＦＯＧＥＳＴプロトコルを使用した静的モデルによって得られた結果は、生理的消化性プロセスの間のＤＭタンパクの消化性を明確に実証する。
【0332】
ＤＭ－３１消化の間、腸管内で産生されるペプチドは、アレルゲン性リスクを有しない。結果は、ＤＭ－３１消化がいかなる安全性の懸念とも関連しないことを実証する。
【配列表フリーテキスト】
【0333】
配列番号１： 合成配列
配列番号２： 合成配列
配列番号３： 合成
配列番号４： 合成
配列番号５： 合成
配列番号６： 合成
配列番号７： 合成
配列番号８： 合成
配列番号９： 合成
配列番号１０： 合成
配列番号１１： 合成
配列番号１２： 合成
配列番号１３： 合成
配列番号１４： 合成
配列番号１５： 合成
配列番号１６： 合成
配列番号１７： 合成
配列番号１８： 合成
配列番号１９： 合成
配列番号２０： 合成
配列番号２１： 合成
配列番号２２： 合成
配列番号２３： 合成
配列番号２４： 合成
配列番号２５： 合成
配列番号２６： 合成
配列番号２７： 合成
配列番号２８： 合成
配列番号２９： 合成
配列番号３０： 合成
配列番号３１： 合成
配列番号３２： 合成
配列番号３３： 合成
配列番号３４： 合成
配列番号３５： 合成
配列番号３６： 合成
配列番号３７： 合成
配列番号３８： 合成
配列番号３９： 合成
配列番号４０： 合成
配列番号４１： 合成
配列番号４２： 合成
配列番号４３： 合成
配列番号４４： 合成
配列番号４５： 合成
配列番号４６： 合成
配列番号４７： 合成
配列番号４８： 合成
配列番号４９： 合成
配列番号５０： 合成
配列番号５１： 合成
配列番号５２： 合成
配列番号２： 合成配列
配列番号３： 合成
配列番号４： 合成
配列番号５： 合成
配列番号６： 合成
配列番号７： 合成
配列番号８： 合成
配列番号９： 合成
配列番号１０： 合成
配列番号１１： 合成
配列番号１２： 合成
配列番号１３： 合成
配列番号１４： 合成
配列番号１５： 合成
配列番号１６： 合成
配列番号１７： 合成
配列番号１８： 合成
配列番号１９： 合成
配列番号２０： 合成
配列番号２１： 合成
配列番号２２： 合成
配列番号２３： 合成
配列番号２４： 合成
配列番号２５： 合成
配列番号２６： 合成
配列番号２７： 合成
配列番号２８： 合成
配列番号２９： 合成
配列番号３０： 合成
配列番号３１： 合成
配列番号３２： 合成
配列番号３３： 合成
配列番号３４： 合成
配列番号３５： 合成
配列番号３６： 合成
配列番号３７： 合成
配列番号３８： 合成
配列番号３９： 合成
配列番号４０： 合成
配列番号４１： 合成
配列番号４２： 合成
配列番号４３： 合成
配列番号４４： 合成
配列番号４５： 合成
配列番号４６： 合成
配列番号４７： 合成
配列番号４８： 合成
配列番号４９： 合成
配列番号５０： 合成
配列番号５１： 合成
配列番号５２： 合成
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30A】
【図30B】
【図31A】
【図31B】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図34A】
【図34B】
【配列表】
【国際調査報告】