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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】プログラム可能なトランスポザーゼおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231220BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20231220BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20231220BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20231220BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/55
C12N9/22
C12N9/10
C12N15/09 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537585
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-08-07
(86)【国際出願番号】 EP2021086348
(87)【国際公開番号】W WO2022129438
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】20214696.5
(32)【優先日】2020-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21209719.0
(32)【優先日】2021-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523227812
【氏名又は名称】ユニバーシタット ポンペウ ファブラ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】グエル カーゴル，マルク
(72)【発明者】
【氏名】サンチェス－メヒアス ガルシア，アヴェンシア
(72)【発明者】
【氏名】パラレス マスミティア，マリア
(72)【発明者】
【氏名】イヴァンチッチ ジェルマノビッチ，ディミトリエ
(72)【発明者】
【氏名】ラメ，アマル
(57)【要約】
本開示は、以下を含む組成物をベースとした効率的かつ正確なプログラム可能な遺伝子送達技術を提供する：（ｉ）標的核酸配列を結合して切断することができる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質；または第１のタンパク質をコードする核酸構築物；および（ｉｉ）トランスポザーゼを含む、またはトランスポザーゼからなる第２のタンパク質；または第２のタンパク質をコードする核酸構築物；ここで、トランスポザーゼは、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。
【選択図】図なし
【選択図】図なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）標的核酸配列を結合して切断することができる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質；または前記第１のタンパク質をコードする核酸構築物；および（ｉｉ）トランスポザーゼを含む、またはトランスポザーゼからなる第２のタンパク質；または前記第２のタンパク質をコードする核酸構築物；を含む組成物であって、
ここで、前記トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである、組成物。
【請求項2】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が、任意によりリンカーを介して互いに融合して融合タンパク質を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記第１のタンパク質が、任意によりリンカーを介して、前記第２のタンパク質のＣ末端部に融合されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記トランスポザーゼが、未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異、および／または未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記１つ以上のアミノ酸変異が、Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、およびＤ４５０Ｎからならない、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記１つ以上のアミノ酸変異が、Ｍ１９４、Ｄ４５０、Ｔ５６０、Ｓ５６４、Ｓ５７３、Ｓ５９２、またはＦ５９４の位置で切除活性を増大させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｍ１９４Ｖおよび／またはＤ４５０Ｎの中から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記１つ以上のアミノ酸変異が、Ｍ１９４またはＤ４５０の位置で切除活性を増大させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｍ１９４Ｖおよび／またはＤ４５０Ｎの中から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記１つ以上のアミノ酸変異が、位置Ｒ２７５、Ｒ２７７、Ｒ３４７、Ｒ３７２、Ｋ３７５、Ｒ３７６、Ｅ３７７、および／またはＥ３８０におけるＤＮＡ結合活性を低下させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｒ２７５Ａ、Ｒ２７７、Ｒ３４７Ｓ、Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａの中から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記１つ以上のアミノ酸変異が、位置Ｒ３７２、Ｋ３７５、Ｒ３７６、Ｅ３７７、および／またはＥ３８０におけるＤＮＡ結合活性を低下させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａの中から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃが、二重変異Ｎ３４７ＳおよびＤ４５０Ｎを含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異が、以下のアミノ酸置換のうちの１つまたはアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物：Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｍ１９４Ｖ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ１９４Ｖ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ、Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３８８Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｗ４６５Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｖ３４Ｍ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｔ４３Ｉ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ａ４１１Ｔ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２Ｇ；位置番号は、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、典型的には、前記修飾されたトランスポザーゼは、配列番号２～８、１０～１８、および１３５～１４９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【請求項12】
前記組成物は、第２のトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第３のタンパク質、または前記第３のタンパク質をコードする核酸構築物をさらに含み；ここで、前記第２のトランスポザーゼは、配列番号９を有する高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ、または配列番号９を有する前記高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのいずれかである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記第１、第２および第３のタンパク質が、任意によりリンカーを介して、互いに融合して三重融合タンパク質を形成する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記第１のタンパク質が、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、またはそれらからなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記第１のタンパク質が、活性ＤＮＡ切断ドメインおよびガイドＲＮＡ結合ドメインを含み、配列番号３１の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、配列番号７２の黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、配列番号７４のＣｐｆ１、配列番号２９のカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、配列番号７０の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、配列番号７５のＣａｓＸ、または配列番号７６の黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ニッカーゼに対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも１００％の同一性を有するヌクレアーゼタンパク質であり、好ましくは、前記第１のタンパク質が、配列番号７２の黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）および配列番号３１の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）からなる群から選択されるＣａｓ９タンパク質である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
ガイドＲＮＡと、ゲノムに挿入するための外因性核酸とをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
前記トランスポザーゼが、前記ガイドＲＮＡに含まれる少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合できるＲＮＡ結合タンパク質に融合され、任意により、前記ＲＮＡ結合タンパク質は、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ＭＣＰ）であり、前記ガイドＲＮＡは、好ましくは配列番号１５３と少なくとも７５％の同一性を共有するＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記外因性核酸が、典型的には５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する大きいＤＮＡ断片である、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記組成物が、ナノ粒子中に含まれる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
請求項２～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、典型的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする核酸。
【請求項21】
細胞のゲノムへの外因性核酸配列の部位特異的組み込みのためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物、ガイドＲＮＡ、および前記外因性核酸を前記細胞に送達することを含む方法。
【請求項22】
細胞のゲノムへの前記外因性核酸配列の部位特異的組み込みによる疾患の治療に使用するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物、ガイドＲＮＡ、および外因性核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子編集および遺伝子療法の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
がん、発達障害、および一部の感染症などの多くの疾患は、共通の遺伝的異常およびエピジェネティックな異常を有する。遺伝子療法は、細胞に遺伝物質を導入して、ゲノムを直接標的にして編集し、遺伝的機能不全細胞を修正し、それによって関連疾患を治癒するように設計されている。
【0003】
遺伝子編集ツールボックスは、ここ数年で大幅に拡大しており、遺伝子療法に加えて、必要な対象における障害を治療するために欠損遺伝子を修復する有望なツールも含む。
【0004】
伝統的に、遺伝子編集は、ゲノム内の目的の配列に二本鎖破断（ＤＳＢ）を誘導する人工エンドヌクレアーゼの設計に基づく１。細胞は、次の２つの主要な経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）のいずれかを介してＤＳＢを修復する２。最近では、ＤＳＢに依存しない編集も開発されている。デアミナーゼ、すなわち塩基エディタ（ＢＥ）３を使用して、ＤＮＡ塩基を直接編集することに基づく方法、および、逆転写酵素（ＲＴ）、すなわちプライムエディタ（ＰＥ）４を利用してＤＮＡ塩基をｉｎ ｓｉｔｕ置換することに基づく方法も利用できるようになった。
【0005】
しかし、病理学的遺伝的欠陥は、数塩基から大きな欠失まで多岐にわたり得る。塩基エディタまたはプライムエディタは、少数の塩基のみを標的にしており、ＨＤＲベースの編集は、サイズに合わせた拡張は十分でない５。ＮＨＥＪをベースにした方法論は、相同性非依存性標的組み込み（ＨＩＴＩ）などとして開発されている６。この方法は、数キロベースの挿入に対して実証されているが、非常に大規模な編集に対しては依然として非効率的である５。ＨＩＴＩは、エクソンを送達するために働き得るが、ジストロフィン（約１４ｋｂ）またはラミニン－α２（約９ｋｂ）などの遺伝子のｃＤＮＡを確実に送達するには十分な効率ではない可能性がある。
【0006】
高精度ＣＲＩＳＰＲプログラム可能なトランスポゾンは、細菌で報告されている７、８が、哺乳動物細胞では利用できない。ジンクフィンガーまたは化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を哺乳動物適合性ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）またはｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼに融合するこれまでの試みでは、比較的低レベルの精度でシステムが送達された９－１１。ＰＢシステムは、効率がサイズに応じて適切に調整され１２、変異に依存しない技術であり、ＤＮＡ修復機構への依存性が低いことにより、あらゆる組織で働くため、遺伝子療法にとって魅力的なツールである。
【0007】
したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで、哺乳動物細胞に標的遺伝子を送達するための新規システムを開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0008】
特定のプログラム可能なトランスポザーゼおよび標的遺伝子編集におけるそれらの使用は、ＷＯ２０２０２５０１８１に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0009】
本開示は、ここで、以下を含む組成物をベースとしたさらに効率的かつ正確なプログラム可能な遺伝子送達技術を提供する：（ｉ）標的核酸配列を結合して切断することができる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質；または第１のタンパク質をコードする核酸構築物；および（ｉｉ）トランスポザーゼを含む、またはトランスポザーゼからなる第２のタンパク質；または第２のタンパク質をコードする核酸構築物；ここで、トランスポザーゼは、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。このような技術は、小さい核酸断片のみでなく、大きい核酸断片も送達できる能力を有する。本発明者らは、哺乳動物細胞およびｉｎ ｖｉｖｏマウス肝臓においてこの技術を試験し、驚くべきことにそれらすべてにおいて、高効率（５～１０％）の部位指向性組み込みを達成した。
【0010】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）標的核酸配列を結合して切断することができる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質；または第１のタンパク質をコードする核酸構築物；および（ｉｉ）トランスポザーゼを含む、またはトランスポザーゼからなる第２のタンパク質；または第２のタンパク質をコードする核酸構築物；を含み、ここで、トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。
【0011】
一実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、任意によりリンカーを介して、互いに融合して融合タンパク質を形成する。一実施形態では、第１のタンパク質は、任意によりリンカーを介して、第２のタンパク質のＣ末端部に融合される。
【0012】
一実施形態では、トランスポザーゼは、未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異、および／または未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。
【0013】
一実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、およびＤ４５０Ｎからならない。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、Ｍ１９４、Ｄ４５０、Ｔ５６０、Ｓ５６４、Ｓ５７３、Ｓ５９２、またはＦ５９４の位置で切除活性を増大させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｍ１９４Ｖおよび／またはＤ４５０Ｎの中から選択される。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、Ｍ１９４またはＤ４５０の位置で切除活性を増大させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｍ１９４Ｖおよび／またはＤ４５０Ｎの中から選択される。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、位置Ｒ２７５、Ｒ２７７、Ｒ３４７、Ｒ３７２、Ｋ３７５、Ｒ３７６、Ｅ３７７、および／またはＥ３８０におけるＤＮＡ結合活性を低下させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｒ２７５Ａ、Ｒ２７７、Ｒ３４７Ｓ、Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａの中から選択される。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、位置Ｒ３７２、Ｋ３７５、Ｒ３７６、Ｅ３７７、および／またはＥ３８０におけるＤＮＡ結合活性を低下させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａの中から選択される。
【0014】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、二重変異Ｎ３４７ＳおよびＤ４５０Ｎを含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応する。一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異は、以下のアミノ酸置換のうちの１つまたはアミノ酸置換の組み合わせを含み：Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｍ１９４Ｖ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ１９４Ｖ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ、Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３８８Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｗ４６５Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｖ３４Ｍ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｔ４３Ｉ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ａ４１１Ｔ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２Ｇ；位置番号は、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応し、典型的には、修飾されたトランスポザーゼは、配列番号２～８、１０～１８、および１３５～１４９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【0015】
一実施形態では、組成物は、第２のトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第３のタンパク質、または第３のタンパク質をコードする核酸構築物をさらに含み；ここで、第２のトランスポザーゼは、配列番号９を有する高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ、または配列番号９を有する高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのいずれかである。一実施形態では、第１、第２、および第３のタンパク質は、任意によりリンカーを介して、互いに融合して三重融合タンパク質を形成する。
【0016】
一実施形態では、第１のタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、第１のタンパク質は、活性ＤＮＡ切断ドメインおよびガイドＲＮＡ結合ドメインを含み、配列番号３１の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、配列番号７２の黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、配列番号７４のＣｐｆ１、配列番号２９のカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、配列番号７０の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、配列番号７５のＣａｓＸ、または配列番号７６の黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９ニッカーゼに対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも１００％の同一性を有するヌクレアーゼタンパク質であり、好ましくは、第１のタンパク質は、配列番号７２の黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）および配列番号３１の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）からなる群から選択されるＣａｓ９タンパク質である。
【0017】
一実施形態では、組成物は、ガイドＲＮＡ、およびゲノムに挿入するための外因性核酸をさらに含む。
【0018】
一実施形態では、トランスポザーゼは、ガイドＲＮＡに含まれる少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合できるＲＮＡ結合タンパク質に融合され、任意により、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ＭＣＰ）であり、ガイドＲＮＡは、好ましくは配列番号１５３と少なくとも７５％の同一性を共有するＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列を含む。
【0019】
一実施形態では、外因性核酸は、典型的には５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する大きいＤＮＡ断片である。
【0020】
一実施形態では、組成物は、ナノ粒子中に含まれる。
【0021】
本発明はまた、本明細書に開示される融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸、典型的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態に関する。
【0022】
本発明はまた、外因性核酸配列を細胞のゲノムに部位特異的に組み込むためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明の組成物、ガイドＲＮＡ、および外因性核酸を細胞に送達することを含む方法に関する。
【0023】
本発明はまた、細胞のゲノムへの外因性核酸配列の部位特異的組み込みによる疾患の治療に使用するための、本発明の組成物、ガイドＲＮＡ、および外因性核酸に関する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】プログラム可能なトランスポザーゼ技術：ｃａｓ９（赤色）は、操作されたＰＢトランスポザーゼドメイン（ピンク色）と結合される。実験で使用した変異体、およびＰＢのコアモデル内の対応する位置（位置５６３は、Ｃ－ｔ上にあり、このモデルには含まれない）の表を示す。
【図2】図２Ａは、ｃａｓ９のバリアントに対するプログラム可能なトランスポザーゼの依存性を示す。ヌクレアーゼｃａｓ９とＰＢとの融合は、ｄｅａｄ ｃａｓ９（ｄｃａｓ９）またはニッカーゼｃａｓ９（ｎｃａｓ９）との融合とは対照的に、標的挿入および全挿入において優れた結果を示す。青色は、標的挿入を示し、黄色は、オフターゲット挿入を示す。図２Ｂは、ＰＢのバリアントのプログラム可能なトランスポザーゼ依存性を示す。ＤＮＡ結合が減少した切除が増強された変異体は、最良のオンターゲット：オフターゲット比を示す（オレンジ色）。オンターゲット挿入は、ＡＡＶ部位（緑色）およびＴＲＡＣ部位（青色）で実施した。図２Ｃは、様々なリンカーの試験を示す。リンカーの長さおよびトポロジーは、Ｓｐｃａｓ９およびＰＢ融合のオンターゲット活性に顕著な影響を与えることはない。
【図3】Ｈｅｒｓｈｅｙレポーター細胞株：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、１つのスプライシングアクセプターおよびｇＲＮＡ標的部位が先行するＧＦＰのＣ末端断片を含むように操作された。ＰＢトランスポゾンは、ＣＡＧプロモーター、ＧＦＰのＮ末端断片、その後にスプライシングドナーを組み合わせて生成された。灰色の三角形は、ＰＢ ＩＴＲ；ＳＡ：スプライシングアクセプター；ＳＤ：スプライシングドナー；標的：標的挿入部位；＊挿入プロセスにより破壊されるＩＴＲ。
【図4】図４Ａは、ＰＢのバリアントのプログラム可能なトランスポザーゼ依存性を示す。ＤＮＡ結合を減少させるための様々な変異と関連した切除が増強された変異体４５０は、最良のオンターゲットを示す。Ｒ３７２およびＲ３７６のＡへの同時変異は、十分に許容されない。Ｅ３７７は、ＤＮＡ結合に関与しないが、Ａへの変異は、Ｋ３７５およびＲ３７６のＡへの変異時に、その領域での負電荷の蓄積を回避するのに有益であり得る。図４Ｂでは、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａは、標的ＤＮＡへの結合の減少の結果として、ＰＢの組み込み活性を低下させる（Ｄ４５０Ｎでも同様に観察される）。オフターゲット組み込みの試験は進行中である。
【図5】二本鎖破断およびプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが標的挿入に影響を及ぼす。効率的なオンターゲット挿入には、挿入部位における二本鎖破断およびＰＢの共局在が必要である。
【図7】ｃａｓ９を含まないＰＢ Ｋ３７５Ａ＿Ｒ３７６Ａ＿Ｅ３７７Ａ＿Ｅ３８０Ａ＿Ｄ４５０Ｎの挿入活性。標的挿入機構をさらに調査するために、ｈｙＰＢ Ｋ３７５Ａ＿Ｒ３７６Ａ＿Ｅ３７７Ａ＿Ｅ３８０Ａ＿Ｄ４５０Ｎをｃａｓ９なしでクローニングし、ｈｅｋ２９３Ｔ細胞でＲＦＰトランスポゾンを使用して、その挿入効率をｈｙＰＢ ＷＴと比較して試験した。結果は、融合ｃａｓ９がないと、この変異体は挿入活性がないことを示している。
【図8】Ａ Ｇｕｉｄｅ－ｓｅｑを使用した標的挿入部位の特徴評価を示す。プログラム可能なトランスポザーゼは、複数のインデルによってＩＴＲ部位を不活化することにより、不可逆的な挿入を生じさせる。Ｂ Ｇｕｉｄｅ－ｓｅｑを使用した挿入部位全体の特徴評価を示す。オンターゲット挿入のみがＴＣＲ遺伝子座において検出された（上のパネル）。サンガー配列決定は、４つのクローンについて示している（下のパネル）。
【図9】Ｇｕｉｄｅ－ｓｅｑによる挿入プロファイリングのプログラム可能なトランスポザーゼの特徴評価により、ｈｙＰＢ変異体とＣａｓ９との組み合わせが、正確なトランスポゾン挿入を実施したことが示された。
【図10】Ｃａｓ９誘導ＨＤＲなどの他の標的挿入プラットフォームに対するＣａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎのベンチマークを示す（３００ｂｐ相同アームを使用した）。
【図11】マウス肝臓におけるＣａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎのｉｎ ｖｉｖｏ展開を示す。ｑＰＣＲによって測定された相対コピー数を報告する。
【図12】プログラム可能なトランスポザーゼは、ＣａｓＸ、ＣｊＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＳａＣａｓ９などの様々なＣａｓバリアントを使用して操作でき、その一部は、標的部位におけるプログラム可能な挿入という点でＳｐＣａｓ９と同様の結果を達成した。試験したＣａｓバリアントの各々は、３つの独立したｇＲＮＡを使用して、スプリットＧＦＰレポーター細胞株の特定の標的領域を標的にした。
【図13】Ｃａｓ９と単一のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ－ＴＣＲ１またはＡＡＶＳ１－３）、またはニッカーゼＣａｓ９、および近くの位置を標的とする２つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ－ＴＣＲ１およびＡＡＶＳ１－３）ならびに修飾されたｈｙＰＢ（変異体Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４０５Ｎ）と融合したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン（ＺｎＦ）による二本鎖破断により、標的挿入がもたらされる。効率的なオンターゲット挿入には、挿入部位における二本鎖破断およびＰＢの共局在が必要である。これは、ヌクレアーゼＣａｓ９またはニッカーゼＣａｓ９による二重切断によって達成され得る。
【図14】プログラム可能なトランスポザーゼは、２つのｈｙＰＢドメインおよびＣａｓ９ヌクレアーゼの二量体ポリペプチドとして操作でき、Ｃａｓ９－ｈｙＰＢと比較して、より優れたプログラム可能な挿入が得られる。スプリットＧＦＰレポーター細胞株は、標的部位へのスプリットＧＦＰトランスポゾンのプログラム可能な挿入に使用した。ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎの変異体は、Ｃａｓ９への単量体または二量体融合のために使用されている。条件：１－挿入機構としてｈｙＰＢのみを使用する陰性対照；２：ｐｃＤＮＡ発現ベクターにおけるＣａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎの陽性対照；３：レンチウイルス発現ベクターにおけるＣａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎの陽性対照；４：Ｃ末端でｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎの２ユニットに融合させたＣａｓ９ヌクレアーゼ；５：一方はＣ末端に、他方はＮ末端において、ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎの２つのユニットに融合させたＣａｓ９ヌクレアーゼ。
【図15】プログラム可能な転位が生じた細胞の選択を数サイクル行うことで、ライブラリーから最適な変異体の組み合わせを選択することができた。Ｃａｓ９に融合した場合にＣａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎよりも濃縮度、およびプログラム可能な挿入能力が高いいくつかの変異体を同定した。
【図16】選択のサイクルが進むにつれて、オンターゲット効率が向上する。各サイクルから選択されたバルクバリアントを、ＡＡＶＳ１を標的とするｇＲＮＡおよび１／２ＧＦＰトランスポゾンと共にレポーター細胞株に同時トランスフェクトした。プラスミドの量は、クローニング効率を正規化するためにＰＢコピー数によって補正した。
【図17】（Ａ）上位に選択された候補のオンターゲット効率を示す。最後のサイクルから選択された９６個のランダムクローンの中から最も高いオンターゲット活性に基づいて、６個の個別の候補を選択した。個々のオンターゲット活性をＣａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎと比較した。（Ｂ）上位のオンターゲット活性バリアントにおける主要なＰＢ残基を示すロゴを示す。
【図18】相同性非依存性標的挿入（ＨＩＴＩ）に対するＣａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ（ＦｉＣＡＴ）のベンチマークを示す。
【図19】４つの異なるヌクレアーゼタンパク質を使用したＦｉＣＡＴ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎのプログラム可能な挿入活性を示す。ＳｐＣａｓ９は、ｇＲＮＡ－ＴＲＡＣ－１のみによるプログラム可能な挿入の対照として使用する（左）。各ヌクレアーゼは、１／２ＧＦＰレポーター細胞株への標的挿入のために３つの独立したｇＲＮＡ（１～３）と共に使用した。
【図20】ミニサークルルシフェラーゼトランスポゾンの肝臓への組み込みを示す。ミニサークルルシフェラーゼトランスポゾン、Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、およびＦｉＣＡＴ（Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ）ｍＲＮＡを流体力学的注入によって送達し、ルシフェラーゼシグナルをモニターした。
【図21】（ａ）ＣａｓＸ（左）およびＣｐｆ１（中央）による編集活性、（ｂ）ＳａＣａｓ９（左）、ＣｊＣａｓ９（中央）による編集活性を示す。インデルを含むリードの平均％＋／－ＳＤを２つのテクニカルリピートで示し、Ｎ＝３の生物学的反復の代表的な画像を示す。ＴＲＡＣ－１部位を標的とするＳｐＣａｓ９を参考として使用した（右）。
【図22】選択サイクル全体でのオンターゲット効率の向上を示す。（Ａ）各サイクルから選択されたバルクバリアントを、ＡＡＶＳ１を標的とするｇＲＮＡおよび１／２ＧＦＰトランスポゾンと共にレポーター細胞株に同時トランスフェクトした。プラスミドの量は、クローニング効率を正規化するためにＰＢコピー数によって補正した。（Ｂ）各サイクルのバルクバリアントを発現するレンチウイルスを生成し、レポーター細胞株を感染させるために使用した。
【図23】ｇＲＮＡ ｔｃｒ１と１／２ＧＦＰ ＭＣトランスポゾンを同時トランスフェクトしたｃａｓ９＿ＰＢライブラリー濃縮の４サイクルおよび５サイクル後に、バルクバリアントから単離した１つの変異体のＦｉＣＡＴ（ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ）と比較した、特異的標的組み込みを示す。
【図24】１／２ＧＦＰレポーター細胞株での標的挿入のためのＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のいずれかと融合させた二量体ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎのプログラム可能な挿入活性を示す。
【図25】１／２ＧＦＰレポーター細胞株における標的挿入のためのプログラム可能な挿入活性の相対的比較を示す。（Ａ）ＳｐＣａｓ９タンパク質と融合させたｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ（左）とＳｐＣａｓ９を別途添加したＭＣＰタンパク質と融合したｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ（右）の比較を示す。（Ｂ）ＳｐＣａｓ９を別途添加したＭＣＰタンパク質に融合させた３つのｈｙＰＢ変異体（Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ；Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；およびＲ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ）間の比較を示す。
【図26】１／２ＧＦＰレポーター細胞株における標的挿入のためのプログラム可能な挿入活性の比較を示す。（Ａ）ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０ＮとＳｐＣａｓ９タンパク質との共発現（左）と、ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０ＮおよびＳｐＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質（右）との比較を示す。（Ｂ）ＳｐＣａｓ９と共発現した３つのｈｙＰＢ変異体（Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ；Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；およびＲ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ）間の相対的比較を示す。
【図27】ＳｐＣａｓおよびｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを含む第１の融合タンパク質と、ＭＣＰタンパク質およびｈｙＰＢ変異体（Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ；Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；およびＲ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ）を含む第２の融合タンパク質との共発現による１／２ＧＦＰレポーター細胞株における標的挿入のためのプログラム可能な挿入活性の相対的比較を示す。
【図28】ＳｐＣａｓおよびｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを含む融合タンパク質と、３つのｈｙＰＢ変異体（Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ；Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；およびＲ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ）との共発現による１／２ＧＦＰレポーター細胞株における標的挿入のためのプログラム可能な挿入活性の相対的比較を示す。
【図29】ｈｙＰＢ Ｒ２７２Ａ－Ｋ２７５Ａ－Ｄ４５０Ｎの二量体に融合したＳｐＣａｓ９（左）と、第１のｈｙＰＢ Ｒ２７２Ａ－Ｋ２７５Ａ－Ｄ４５０Ｎおよび第２のｈｙＰＢ変異体に融合したＳｐＣａｓ９（右）との間の、１／２ＧＦＰレポーター細胞株における標的挿入のためのプログラム可能な挿入活性の比較を示す。
【0025】
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形および複数形の参照が含まれる。したがって、例えば、「剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及には、単一の剤および複数のそのような剤が含まれる。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形および複数形の参照が含まれる。したがって、例えば、「剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及には、単一の剤および複数のそのような剤が含まれる。
【0026】
「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は、単量体ヌクレオチドから構成される、または単量体ヌクレオチドを含む任意の分子を指すために互換的に使用され得る。核酸は、オリゴヌクレオチドであってもポリヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの混合物であり得る。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾され得るか、または人工的であり得る。ヌクレオチド配列には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、さらにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらの配列の各々は、分子骨格の変化により、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオエートヌクレオチドを使用してもよい。他のデオキシヌクレオチド類似体としては、限定されないが、本開示のヌクレオチドにおいて使用され得る、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’－ホスホルアミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート、ならびにそれらの２’－Ｏ－アリル類似体および２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。
【0027】
「導入遺伝子」という用語は、外因性核酸配列、特に遺伝子産物をコードする外因性のＤＮＡまたはｃＤＮＡを指す。遺伝子産物は、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質であり得る。遺伝子産物のコード領域（ＣＤＳ）に加えて、導入遺伝子は、発現を促進または増強するために、例えば、プロモーター、エンハンサー（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インスレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナルおよび／または他の機能的エレメント（複数可）など、１つ以上の操作配列を含むか、またはそれらに関連付けられていてもよい。本開示の実施形態は、特に明記しない限り、任意の既知の好適なプロモーター、エンハンサー（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インスレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナル（複数可）、および／または他の機能エレメントを利用してもよい。好適なエレメントおよび配列は、当業者にはよく知られている。
【0028】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義的に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【0029】
「結合タンパク質」という用語は、別の分子に非共有結合により結合することができるタンパク質を指す。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、同じタンパク質の１つ以上の分子に結合して、ホモ二量体、ホモ三量体などを形成できる、および／または異なるタンパク質（複数可）の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上のタイプの結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。
【0030】
「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性または不活性なＤＮＡ切断ドメイン、および／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔をあけられた短いパリンドロームリピート）関連ヌクレアーゼとも呼ばれることもある。ＣＲＩＳＰＲは、移動性の遺伝エレメント（ウイルス、転移因子、およびコンジュゲートプラスミド）に対する防御を提供する適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行する可動エレメントに相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写されて、プロセシングされて、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）となる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを正しくプロセシングするには、トランスコードされた低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９タンパク質を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、リボヌクレアーゼ３を利用したｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのプロセシングのガイドとして機能する。続いて、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な線状または環状ｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼにより切断する。ｃｒＲＮＡに相補的ではない標的鎖は、エンドヌクレオチド分解的に最初に切断され、次に３’－５’エキソヌクレアーゼによりトリミングされる。自然界では、ＤＮＡ結合および切断には典型的には、タンパク質および両方のＲＮＡを必要とする。しかし、一本鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単に「ｇＮＲＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の態様を１つのＲＮＡ種に組み込むように操作できる。
【0031】
Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列内の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識し、自己と非自己とを区別するのに役立つ。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者によく知られている。Ｃａｓ９オルソログは、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含むがこれらに限定されない様々な種で記載されている。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであり、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列には、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３（ＲＮＡＢｉｏｌ．１０（５）：７２６－３７）に開示されている生物および遺伝子座に由来するＣａｓ９配列が含まれ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性な（例えば、不活化された）ＤＮＡ切断ドメインを有する。ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ９タンパク質は、「ｄＣａｓ９」タンパク質（ヌクレアーゼ「ｄｅａｄ」Ｃａｓ９の略）と互換的に称され得る。不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはその断片）を生成するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７（６０９６）：８１６－８２１；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｃｅｌｌ．１５２（５）：１１７３－８３を参照、それぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【0033】
「ジンクフィンガータンパク質」という用語は、１つ以上のジンクフィンガーを介して、配列特異的方法でＤＮＡを結合するタンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインを指し、これらは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化されるジンクフィンガータンパク質の結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。「ジンクフィンガータンパク質」という用語は、多くの場合、「ＺＦＰ」と略される。
【0034】
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工制限酵素を指す。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の固有の配列を標的にすることが可能になる。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、多くの場合、「ＺＦＮ」または「ＺＮＰ」と略される。
【0035】
本明細書で使用される「アミノ酸配列」または「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。特に指定しない限り、アミノ酸残基のポリマーは、任意の長さであり得る。
【0036】
本明細書で使用する「外因性」という用語は、細胞内に天然には存在しないが、１つ以上の遺伝的、生化学的または他の方法によって細胞に導入できる分子を指す。細胞内の天然の存在は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定することもできる。したがって、例えば、筋肉の初期発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導された分子は、非熱ショック細胞にとっては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能型、または正常に機能する内因性分子の機能不全型を含み得る。
【0037】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階で特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。追加の内因性分子には、例えば、転写因子および酵素などのタンパク質を含み得る。
【0038】
「標的配列」または「標的核酸配列」または「標的部位」は、結合するにあたって十分な条件が存在する限り、結合分子が結合する、例えばゲノム中の核酸の一部を定義する配列である。例えば、配列５’－ＧＡＡＴＴＣ－３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【0039】
「融合」という用語は、２つ以上のサブユニット分子が連結している分子を指す。いくつかの実施形態では、２つの間の連結は、共有結合である；あるいは、２つの間の連結は非共有結合であり、例えば分子間相互作用に依存し得る。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子であっても、異なる化学タイプの分子であってもよい。
【0040】
「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。例えば、１つのタンパク質ドメインは、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に位置し、したがってそれぞれ「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」を形成し得る。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、核酸配列によって完全にコードされ得る一本鎖ポリペプチドであり、ペプチド結合によって直接、または任意によりペプチドリンカーを介して共有結合により連結した少なくとも２つのタンパク質ドメインを含む。
【0041】
本明細書で使用される「遺伝子」または「ゲノム」という用語は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびにそのような調節配列が、コード配列および／または転写される配列に隣接しているか否かに関係なく、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【0042】
「真核」細胞という用語としては、これらに限定されないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
【0043】
本明細書で使用される「連結された」という用語は、２つ以上の構成成分（配列エレメントなど）が並置されていることを指し、この場合、構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが、他の構成成分の少なくとも１つに発揮される機能を媒介できるように配置されている。
【0044】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」とは、それぞれ、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多い、少ない、または同じ数の残基を有することができ、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含むことができる。
【0045】
本明細書で使用される「トランスフェクト」という用語は、真核細胞または原核細胞または生物への核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の導入を指す。
【0046】
「切断」という用語は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むがこれらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖状の切断および二本鎖状切断は、両方とも可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断イベントの結果として生じ得る。ＤＮＡの切断により、平滑末端またはスタッガー末端のいずれかが産生され得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡの切断のために使用される。
【0047】
「特異性」という用語は、選択された配列に対して一定の配列同一性を共有する配列を選択的に結合する能力を指す。
【0048】
「挿入」および「組み込み」という用語は、第２の核酸配列またはゲノムもしくはその一部への核酸配列の付加を指す。挿入または組み込みに関して「特異的」、「部位特異的」、「標的化された」、および「オンターゲット（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され、第２の核酸の特定の部位またはゲノムもしくはその一部の特定の部位への核酸の挿入を指す。逆に、用語「ランダム」、「非標的」および「オフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｅｄ）」は、望ましくない部位への核酸の非特異的かつ意図しない挿入を指す。「合計」または「全体」という用語は、挿入の合計数を指す。
【0049】
「変異」という用語は、配列、例えば核酸またはアミノ酸配列内の残基の別の残基による置換を指す；および／または核酸もしくはアミノ酸配列内の１つ以上の残基の欠失もしくは挿入を指す。変異は、典型的には、元の残基を同定し、その後配列内の残基の位置を特定し、次に新たに置換された残基の同一性を特定することによって本明細書に記載される。本明細書で提供されるアミノ酸置換（変異）を作製するための様々な方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ Ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）によって提供される。好ましい実施形態では、タンパク質における変異という用語は、アミノ酸置換を指す。
【0050】
「トランスポザーゼ」という用語は、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製転位機構によってゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。
【0051】
「修飾された」という用語は、対応する未修飾のタンパク質または核酸配列とは異なるタンパク質または核酸配列を指す。
【0052】
「リンカー」という用語は、２つの隣接する分子または部分を連結する化学基または分子を指す。
【0053】
本明細書で使用する「ベクター」および「プラスミド」という用語は、例えば第２の目的のポリヌクレオチドを保有することができ、例えば遺伝子配列を標的細胞に移入することができる任意のポリヌクレオチドを指す。したがって、この用語には、ベクターを組み込むのみでなく、クローニング、発現ビヒクルも含む。特に、本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、核酸の発現を指示することができる任意のポリヌクレオチドを指す。いくつかの態様では、「ベクター」および「プラスミド」という用語は、「核酸構築物」という用語と互換的に使用される。
【0054】
本明細書で使用される場合、２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数を考慮して、配列によって共有される同一位置の数に対応されたものであり（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数ｘ１００）、各ギャップの長さは、２つの配列を最適に整列させるために導入する必要がある。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記のとおり数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【0055】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１－１７、１９８８）を使用して決定することができ、これは、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する。あるいは、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３，１９７０）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用して決定できる。ギャップウェイトは、１６、１４、１２、１０、８、６、または４、長さウェイトは、１、２、３、４、５、または６を使用する。
【0056】
２つのヌクレオチドアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えばデフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムなどのアルゴリズムを使用して決定することもできる。
【0057】
本明細書で使用される「組換え」または「操作された」という用語は、人工的に作製されたタンパク質または核酸配列を指す。
【0058】
本明細書で使用される「対象」という用語は、個々の生物、例えば個々の哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの実施形態では、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの実施形態では、対象は、研究動物である。
【0059】
「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、本明細書に記載されているように、疾患または障害、またはそれらの１つ以上の症状を逆転、軽減、発症を遅らせる、または進行を阻害することを目的とした臨床介入を指す。本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、本明細書に記載されているように、疾患または障害、またはそれらの１つ以上の症状を逆転、軽減、発症を遅らせる、または進行を阻害することを目的とした臨床介入を指す。いくつかの実施形態では、治療は、１つ以上の症状が発現した後、および／または疾患が診断された後に施し得る。他の実施形態では、例えば、症状の予防、発症の可能性の低下、または発症の遅延、または疾患の発症もしくは進行の阻害のために、症状がない場合に治療を施し得る。例えば、症状の発症前に（例えば、症状歴の見地から、かつ／または遺伝的もしくは他の感受性因子の見地から）、治療を感受性のある個体に施すことができる。治療は、症状が解消した後も継続して、例えば、これらの再発を予防または遅延させ得る。
【発明を実施するための形態】
【0060】
本発明は、
（ｉ）標的核酸配列を結合して切断することができる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質；または第１のタンパク質をコードする核酸構築物；
（ｉｉ）トランスポザーゼを含む、またはトランスポザーゼからなる第２のタンパク質；または第２のタンパク質をコードする核酸構築物；を含む組成物に関し、
ここで、トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。
（ｉ）標的核酸配列を結合して切断することができる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質；または第１のタンパク質をコードする核酸構築物；
（ｉｉ）トランスポザーゼを含む、またはトランスポザーゼからなる第２のタンパク質；または第２のタンパク質をコードする核酸構築物；を含む組成物に関し、
ここで、トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。
【0061】
操作されたジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および最近ではＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼなどの現在のゲノム操作ツールは、ゲノム内の配列特異的ＤＮＡ切断に影響を与える。このプログラム可能な切断により、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による切断部位でのＤＮＡの変異、または相同性指向修復（ＨＤＲ）による切断部位周囲のＤＮＡの置換が生じ得る。
【0062】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、ジンクフィンガータンパク質、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【0063】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼおよびジンクフィンガータンパク質を含むまたはそれらからなる群から選択される。
【0064】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。
【0065】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、限定されないが、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、またはカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）；他のいくつかの好適な例は、下記に記載される）、またはそのバリアント（例えば、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）またはｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９））、Ｃａｓ１２ａタンパク質、Ｃａｓ１２ｂタンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはＣａｓＸタンパク質（そのバリアントおよび機能的断片を含む）である。
【0066】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、そのバリアントおよび機能的断片を含むＣａｓ９タンパク質である。
【0067】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、配列特異的二本鎖破断（ＤＳＢ）を介して、遺伝子を不活化するまたは修飾するための非常に効果的なツールである。これらのＤＳＢは、細胞のＤＮＡ損傷応答機構によって認識され、内因性ＤＳＢ修復経路によって修復できる。主な修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）であり、多くの場合、フレームシフト変異が生じ、遺伝子の機能が破壊される可能性がある小さな挿入および／または欠失が生じる。この経路を利用して、遺伝子ノックアウト変異を生成することができる。あるいは、修復鋳型（例えば、ラミニン－α２タンパク質、その機能的バリアントまたはその断片をコードする導入遺伝子を含む、またはそれらからなる核酸構築物など）の存在下で、損傷は、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、シームレスに修復することができる。しかし、注目すべき進歩にもかかわらず、正確な遺伝子修飾を導入するためのＨＤＲ媒介ゲノム編集は、ＮＨＥＪ媒介遺伝子破壊よりも効率がはるかに低い。さらに、ＨＤＲ経路による大規模な数ｋｂの置換は困難をもたらし、選択および／または大集団の細胞選別が必要になる。したがって、ＨＤＲ経路は現在、主として遺伝子内の主要な領域の局所的な置換に限定して用いられているが、大きな全長遺伝子には用いられていない。上で説明したように、本発明は、この欠点を解決する。
【0068】
一実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、（ｉ）活性ＤＮＡ切断ドメインおよび（ｉｉ）ガイドＲＮＡ結合ドメインを含む。
【0069】
既知のＣａｓ９タンパク質の中でも、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質は、ゲノム操作のツールとして、広く使用されている。このＣａｓ９タンパク質は、２つの異なるヌクレアーゼドメインを含む大きいマルチドメインタンパク質である。
【0070】
一実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、コリネバクテリウム・ウルセランス（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓ：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）配列番号１９；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓ：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）配列番号２０；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１２８４．１）配列番号２１；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１７８６１．１）配列番号２２；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１８４６．１）配列番号２３；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１３１４．１）配列番号２４；Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１８０１０．１）配列番号２５；Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓｉ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１８７２１．１）配列番号２６；ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＹＰ＿８２０８３２．１）配列番号２７；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿４７２０７３．１）配列番号２８；カンピロバクター・ジェジュニ（ＣｊＣａｓ９）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＹＰ＿００２３４４９００．１）配列番号２９（配列番号８１によってコードされる）；髄膜炎菌（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＹＰ＿００２３４２１００．１）配列番号３０；黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）配列番号７２（配列番号７７によってコードされる）；および化膿連鎖球菌（ＳｐＣａｓ９）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１７０５３．１）配列番号３１由来のＣａｓ９タンパク質を含むかまたはそれからなる群から選択される。
【0071】
一実施形態では、本明細書で野生型Ｃａｓ９タンパク質に言及する場合、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、別段の指定がない限り、配列番号３１を有する化膿連鎖球菌由来のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）に対応する。
【0072】
一実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、「Ｃａｓ９バリアント」であってもよい。本明細書で使用される「Ｃａｓ９バリアント」は、本明細書に記載のＣａｓ９タンパク質と相同性を共有するタンパク質であり、その断片が含まれる。
【0073】
一実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、配列番号３１を有する野生型Ｃａｓ９タンパク質、または配列番号１９～３０もしくは７２を有する他の任意のＣａｓ９タンパク質に対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、または少なくとも約９９．９％であり得る。
【0074】
一実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、１つまたはいくつかのアミノ酸置換を有するＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含む。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインには、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメインの２つのサブドメインが含まれることが知られている。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに相補的な鎖を切断するが、ＲｕｖＣ１サブドメインは、非相補鎖を切断する。
【0075】
これらのサブドメイン内の変異により、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性がサイレンシングされ得る。例えば、置換Ｄ１０ＡおよびＨ８４１Ａは、配列番号３１を有する化膿連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性を完全に不活化することが知られており、その結果、ｓｇＲＮＡによってプログラムされた方法でＤＮＡを結合する能力を依然として保持しているｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が生じる。原則として、ｄＣａｓ９は、別のタンパク質またはドメインに融合したときに、適切なｓｇＲＮＡと共発現するのみで、そのタンパク質を事実上あらゆるＤＮＡ配列に標的化できる。一実施形態では、ｄＣａｓ９タンパク質は、配列番号６６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ｄＣａｓ９タンパク質は、配列番号７１に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこのアミノ酸配列からなる。
【0076】
Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）に関しては、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内での点変異（Ｄ１０Ａ）が異なるＣａｓ９ヌクレアーゼのバリアントであり、ＤＮＡにニックを入れることはできるが、切断することはできない。一実施形態では、ｎＣａｓ９タンパク質は、配列番号６５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ｎＣａｓ９タンパク質は、配列番号７０に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなる。いくつかの実施形態では、ＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａｎＣａｓ９）は、配列番号８０に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａｎＣａｓ９）は、配列番号７６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0077】
一実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９の断片を含み、これにより、断片が、配列番号３１を有する野生型Ｃａｓ９タンパク質、または配列番号１９～３０もしくは７２を有する任意の他のＣａｓ９タンパク質の対応する断片に対して、少なくとも約７０％同一である、少なくとも約８０％同一である、少なくとも約９０％同一である、少なくとも約９５％同一である、少なくとも約９６％同一である、少なくとも約９７％同一である、少なくとも約９８％同一である、少なくとも約９９％同一である、少なくとも約９９．５％同一である、または少なくとも約９９．９％同一であるようになる。
【0078】
一実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、ＤＮＡ切断ドメインまたはガイドＲＮＡ結合ドメインのうちの１つのみを含む。
【0079】
一実施形態では、例示的なＣａｓ９バリアントは、ヒト化Ｃａｓ９（ｈＣａｓ９）またはそのバリアントもしくは機能的断片である。本明細書で使用される場合、「ヒト化Ｃａｓ９」または「ｈＣａｓ９」という用語は、ヒト細胞用に配列最適化されたＣａｓ９タンパク質を指す。
【0080】
一実施形態では、ｈＣａｓ９タンパク質は、配列番号６４に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ｈＣａｓ９タンパク質は、配列番号６９に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0081】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ｃｐｆ１タンパク質である。一実施形態では、ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号７８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号７４に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0082】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＣａｓＸタンパク質である。一実施形態では、ＣａｓＸは、配列番号７９に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ＣａｓＸは、配列番号７５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0083】
以下でさらに詳しく説明するが、本開示の特定の態様は、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、特にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、特に本明細書に記載のＣａｓ９タンパク質のいずれかをコードする核酸構築物を含むベクターまたはプラスミド（例えば、発現ベクター、パッケージングベクターなど）にも関し；ベクターまたはプラスミドは、好ましくは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞における発現に好適である。
【0084】
一実施形態では、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）である。
【0085】
ジンクフィンガータンパク質は、配列特異的方法でＤＮＡに結合できるタンパク質である。ＺＦＰは、真核生物に不均一に分布している。ＺＦＰは、ＤＮＡ認識、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合に関与していることが確認されている。ジンクフィンガータンパク質の特定の分類は、折り畳まれたドメインのタンパク質骨格の全体的な形状を考慮した「折り畳み群」に基づく。ジンクフィンガーの最も一般的な「折り畳み群」は、Ｃ２Ｈ２またはＣｙｓ２Ｈｉｓ２様（「古典的なジンクフィンガー」）、トレブルクレフ（ｔｒｅｂｌｅ ｃｌｅｆ）、およびジンクリボンである。これらのタンパク質を特徴付ける代表的なモチーフは、Ｌｉ＆Ｌｉｕ，２０２０（Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２１（４）：１３６１）の表１に開示されており、この表は参照により本明細書に組み込まれる。
【0086】
ＺＦＰは、ゲノム内の特定のゲノムＤＮＡ配列に結合できる任意のＺＦＰ、そのバリアントまたは機能的断片であり得る。ＺＦＰの非限定的な例としては、Ｃ２Ｈ２、ｇａｇナックル、トレブルクレフ（ｔｒｅｂｌｅ ｃｌｅｆ）、ジンクリボン、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６様、もしくはＴＡＺ２ドメイン様、またはそれらの任意の組み合わせから選択される折り畳み群またはジンクフィンガーモチーフを含むＺＦＰが挙げられる。一実施形態では、ＺＦＰは、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガータンパク質である。
【0087】
一実施形態では、ＺＦＰは、操作されたＺＦＰである。操作されたジンクフィンガーアレイをＤＮＡ切断ドメイン（通常は、ＦｏｋＩの切断ドメイン）に融合して、ジンクフィンガーヌクレアーゼを生成できる。このようなジンクフィンガーとＦｏｋＩの融合体は、ゲノム操作に有用な試薬となっている。
【0088】
ＺＦＰは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含むことができる。ＺＦＰは、２～１２、２～１０、２～８、３～８、４～８、または５～８のジンクフィンガードメインを含むことができる。一実施形態では、ＺＦＰは、６つのジンクフィンガードメインを含む。
【0089】
一般的なモジュラーアセンブリプロセスでは、それぞれが３塩基対のＤＮＡ配列を認識できる個別のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対から１８塩基対の長さの範囲の標的部位を認識する３フィンガー、４、５、または６フィンガーアレイを生成することが含まれる。別の方法では、２フィンガーモジュールを使用して、最大６つの個別のジンクフィンガーを含むジンクフィンガーアレイを生成する。
【0090】
一実施形態では、ＺＦＰの結合ドメインは、目的の配列に結合するように操作することができる。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するＺＦＰと比較して、改善された結合特異性を有し得る。
【0091】
一実施形態では、ＺＦＰをコードする例示的な核酸配列は、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、または配列番号３８を含むか、またはこれらからなる。一実施形態では、これらの配列によってコードされる例示的なアミノ酸配列は、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、または配列番号３９を含むか、またはそれらからなる。
【0092】
一実施形態では、ＺＦＰは、配列番号３３、３５、３７または３９のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0093】
一実施形態では、ＺＦＰは、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインを有しない。Ｇａｌ４は、ＣＧＧ－Ｎ１１－ＣＣＧに結合し、ここで、Ｎは、任意の塩基であり得る。このタンパク質は、ガラクトースをグルコースに変換するために使用される酵素をコードするＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、およびＭＥＬ１などのガラクトース誘導遺伝子の遺伝子発現のための正の制御因子である。これは、これらの遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ－Ｇ）にある１７塩基対の配列を認識する。したがって、Ｇａｌ４は、ゲノム内の非常に高頻度の短配列を認識するために、部位特異的ではない。一実施形態では、ＺＦＰは、部位特異的になるように操作されたＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインを有する。
【0094】
以下にさらに詳述するように、本開示の特定の態様は、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＺＦＰをコードする核酸構築物を含むベクターまたはプラスミド（例えば、発現ベクター、パッケージングベクターなど）に向けられ；ベクターまたはプラスミドは、好ましくは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞における発現に好適である。
【0095】
本発明によれば、第２のタンパク質は、トランスポザーゼを含むか、またはトランスポザーゼからなる。
【0096】
トランスポゾンは、転位を受けることができる染色体セグメント、例えば、宿主ＤＮＡ内に相補的配列が存在しない場合でも全体として転座することができるＤＮＡである。トランスポゾンは、ヒト細胞内で長い範囲のＤＮＡ操作を行うために使用できる。哺乳動物細胞で使用される一般的なトランスポゾンシステムとしては、これらに限定されないが、不活性トランスポゾンから再構築されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）、および蛾イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）から単離されたＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）が挙げられる。ＰｉｇｇｙＢａｃは、ＳＢよりも転位活性が高く、瘢痕なく切除され得る。
【0097】
ネイティブＤＮＡトランスポゾンには典型的には、トランスポザーゼタンパク質をコードする１つの遺伝子が含まれており、トランスポザーゼ結合部位を有する逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接している。それらの転位中に、トランスポザーゼタンパク質は、これらのＩＴＲを認識し、ランダムな方法でエレメントの切除およびその後の他の場所への再組み込みを触媒する。さらに、これらのトランスポゾンの一部は、遺伝子療法プロトコルで使用するために適応され得、二成分システムとして使用され、プラスミドには、目的のＤＮＡ配列がトランスポゾンＩＴＲ間に配置される発現カセットが含まれ、トランスポザーゼ酵素またはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたそのｍＲＮＡをコードする配列を含む同時トランスフェクトされたプラスミドによって誘導されて、宿主ゲノムに導入することができる。本開示によれば、トランスポゾンに基づくシステムは、細胞内での治療遺伝子としての導入遺伝子の安定した組み込みおよび持続的な発現を効率よく媒介するために使用される。
【0098】
本開示のトランスポザーゼまたは修飾されたトランスポザーゼは、外因性核酸をゲノムの特定の部位に挿入できる任意のトランスポザーゼであり得る。本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載の方法および戦略を使用して設計されたトランスポザーゼ融合タンパク質を提供する。本開示のいくつかの実施形態は、そのようなトランスポザーゼもしくは修飾されたトランスポザーゼをコードする核酸、および／またはそれらを含む融合タンパク質を提供する。本開示のいくつかの実施形態は、トランスポザーゼもしくは修飾されたトランスポザーゼをコードするそのような核酸構築物を含むプラスミドもしくは発現ベクター、および／またはそれを含む融合タンパク質を提供する。
【0099】
トランスポザーゼの非限定的な例としては、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、高活性型Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、および高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられる。
【0100】
一実施形態では、トランスポザーゼは、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、配列番号９に対応する、または配列番号６７によってコードされる高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである（本開示では、ｈｙＰＢまたは単にＰＢとも呼ばれる）。
【0101】
一実施形態では、トランスポザーゼは、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである。
【0102】
本明細書で使用される場合、「修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ」とは、配列番号９の野生型高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、典型的には１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下のアミノ酸置換を含むトランスポザーゼを指す。より具体的には、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、（ｉ）野生型高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼと比較して、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸置換、および／または（ｉｉ）野生型高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼと比較して、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９で表される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【0103】
いくつかの実施形態では、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼに対する１つ以上の変異は、三重変異Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎからならず、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃのアミノ酸番号に対応する。
【0104】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、アミノ酸位置番号［１９４～２００］、［２１４～２２２］、［４３４～４４２］または［４４６～４５６］、例えば、位置Ｄ１９８、Ｄ２０１、Ｒ２０２、Ｍ２１２および／またはＳ２１３におけるアミノ酸置換（位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する）によって規定される領域内のアミノ酸変異の中から選択される、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、位置４５０、５６０、５６４、５７３、５８９、５９２、および／または５９４のアミノ酸変異の中から選択される、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異を含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する。
【0107】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、Ｍ１９４および／またはＤ４５０の位置のアミノ酸変異の中から選択される切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異を含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくは、アミノ酸置換は、Ｍ１９４Ｖおよび／またはＤ４５０Ｎの中から選択される。
【0108】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む。
【0109】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、位置２５４、２７５、２７７、３４７、３７２、３７５、および／または４６５のアミノ酸変異の中から選択される、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する。
【0110】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、Ｒ２７５、Ｎ３４７、Ｒ３７２、Ｋ３７５、Ｒ３７６、Ｅ３７７、およびＥ３８０から選択される、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する。
【0111】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、Ｒ３７２、Ｋ３７５、Ｒ３７６、Ｅ３７７、およびＥ３８０から選択されるＤＮＡ結合活性を低下させる１つ以上のアミノ酸変異を含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａの中から選択される。
【0112】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、Ｎ３４７、Ｒ３７２、およびＫ３７５から選択されるＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくは、アミノ酸置換Ｎ３４７Ｓ、Ｎ３４７Ａ、Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａの中から選択され、より好ましくはアミノ酸置換Ｎ３４７Ｓ、Ｎ３４７Ａの中から選択される。
【0113】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、上記で定義した切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異；および上記で定義したＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、位置Ｄ４５０での切除活性を増大させるための少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに位置Ｎ３４７、Ｒ３７２およびＫ３７５においてＤＮＡ結合活性を低下させるための少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃの修飾されたトランスポザーゼは、二重変異Ｎ３４７ＳおよびＤ４５０Ｎ、または三重変異Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２ＡおよびＫ３７５Ａを含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する。より好ましい実施形態では、高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃの修飾されたトランスポザーゼは、二重変異Ｎ３４７ＳおよびＤ４５０Ｎを含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する。
【0115】
いくつかの実施形態では、前述の実施形態で開示した修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、アミノ酸位置番号［１５８～１６９］によって画定される領域に少なくとも１つの変異、例えばＡ１６６Ｓおよび／または位置Ｙ５２７、Ｒ５１８、Ｋ５２５、Ｎ４６３における少なくとも１つの変異をさらに含む。
【0116】
典型的には、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、配列番号１の修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、１つ以上のアミノ酸置換、配列番号９と比較して、典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下のアミノ酸置換を有する配列番号９の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのバリアントである。
【0118】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃは、以下の位置３４、４３、１１７、２０２、２３０、２４５、２６８、２７５、２７７、２８７、２９０、３１５、３２５、３４１、３４６、３４７、３５０、３５１、３５６、３５７、３８８、４０９、４１１、４１２、４３２、４４７、４６０、４６１、４６５、５１７、５６０、５６４、５７１、５７３、５７６、５８６、５８７、５８９、５９２、および／または５９４のアミノ酸変異のうちの１つ以上をさらに含む。位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する。
【0119】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、以下の変異または変異の組み合わせを含む：Ｖ３４Ｍ、Ｔ４３Ｉ、Ｙ１７７Ｈ、Ｒ２０２Ｋ、Ｓ２３０Ｎ、Ｒ２４５Ａ、Ｄ２６８Ｎ、Ｋ２８７Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｋ２８７Ａ／Ｋ２９０Ａ、Ｒ３１５Ａ、Ｇ３２５Ａ、Ｒ３４１Ａ、Ｄ３４６Ｎ、Ｎ３４７Ａ、Ｎ３４７Ｓ、Ｔ３５０Ａ、Ｓ３５１Ｅ、Ｓ３５１Ｐ、Ｓ３５１Ａ、Ｋ３５６Ｅ、Ｎ３５７Ａ、Ｒ３８８Ａ、Ｋ４０９Ａ、Ａ４１１Ｔ、Ｋ４１２Ａ、Ｋ４３２Ａ、Ｄ４４７Ａ、Ｄ４４７Ｎ、Ｄ４５０Ｎ、Ｒ４６０Ａ、Ｋ４６１Ａ、Ｗ４６５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｔ５６０Ａ、Ｓ５６４Ｐ、Ｓ５７１Ｎ、Ｓ５７３Ａ、Ｋ５７６Ａ、Ｈ５８６Ａ、Ｉ５８７Ａ、Ｍ５８９Ｖ、Ｓ５９２Ｇ、またはＦ５９４Ｌ、Ｄ４５０Ｎ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ、Ｋ４０９Ａ／Ｋ４１２Ａ、Ｒ４６０Ａ／Ｋ４６１Ａ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２ＧおよびＲ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ。
【0120】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、以下のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含む：Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｍ１９４Ｖ、Ｍ１９４Ｖ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ、Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３８８Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｗ４６５Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｖ３４Ｍ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｔ４３Ｉ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ａ４１１Ｔ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２Ｇ；位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する。
【0121】
本開示に従って使用するための非常に好ましい修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼとしては、以下のアミノ酸置換の組み合わせを含む修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられる：Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３８８Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｗ４６５Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｖ３４Ｍ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｔ４３Ｉ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ａ４１１Ｔ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２ＧおよびＲ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ；位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する。
【0122】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、以下のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含む：Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２Ｇ；位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する。
【0123】
より好ましい実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、以下のアミノ酸置換の組み合わせを含む：Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２Ｇ；位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する。
【0124】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、配列番号１～８、１０～１８、および１３５～１４９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【0125】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、配列番号１～８および１０～１８のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【0126】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、配列番号９０～９９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【0127】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、配列番号１３５～１４９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、配列番号１３５～１４０のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、配列番号１４１～１４９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【0128】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、保存された触媒トライアドに関与するｈｙＰＢと比較して、例えば、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸番号に対応するアミノ酸２６８および／または３４６（例えば、Ｄ２６８Ｎおよび／またはＤ３４６Ｎ）に１つ以上の変異を含み得る。
【0129】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、切除に重要なｈｙＰＢと比較して、例えば、配列番号９または配列番号１２のアミノ酸番号に対応するアミノ酸２８７、２８７／２９０および／または４６０／４６１（例えば、Ｋ２８７Ａ、Ｋ２８７Ａ／Ｋ２９０Ａ、および／またはＲ４６０Ａ／Ｋ４６１Ａ）における１つ以上の変異を含み得る。
【0130】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、標的結合に関与するｈｙＰＢと比較して、配列番号９または配列番号１３のアミノ酸番号に対応する、例えば、アミノ酸３５１、３５６、および／または３７９（例えば、Ｓ３５１Ｅ、Ｓ３５１Ｐ、Ｓ３５１Ａ、および／またはＫ３５６Ｅ）での１つ以上の変異を含み得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、組み込みに重要なｈｙＰＢと比較して、配列番号９または配列番号１４のアミノ酸番号に対応する、例えば、アミノ酸５６０、５６４、５７１、５７３、５８９、５９２、および／または５９４（例えば、Ｔ５６０Ａ、Ｓ５６４Ｐ、Ｓ５７１Ｎ、Ｓ５７３Ａ、Ｍ５８９Ｖ、Ｓ５９２Ｇ、および／またはＦ５９４Ｌ）に１つ以上の変異を含み得る。
【0132】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、アライメントに関与するｈｙＰＢと比較して、配列番号９または配列番号１５のアミノ酸番号に対応する、例えば、アミノ酸３２５、３４７、３５０、３５７および／または４６５（例えば、Ｇ３２５Ａ、Ｎ３４７Ａ、Ｎ３４７Ｓ、Ｔ３５０Ａおよび／またはＷ４６５Ａ）での１つ以上の変異を含み得る。
【0133】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、十分に保存されているｈｙＰＢと比較して、例えば、配列番号９または配列番号１６のアミノ酸番号に対応するアミノ酸５７６および／または５８７（例えば、Ｋ５７６Ａおよび／またはＩ５８７Ａ）において、１つ以上の変異を含むことができる。
【0134】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、Ｚｎ２＋結合に関与するｈｙＰＢと比較して、例えば、配列番号９または配列番号１７のアミノ酸番号に対応する５８６（例えば、Ｈ５８６Ａ）において、１つ以上の変異を含み得る。
【0135】
いくつかの実施形態では、プログラム可能なトランスポザーゼは、組み込みに関与するｈｙＰＢと比較して、例えば、配列番号９または配列番号１８のアミノ酸番号に対応する３１５、３４１、３７２、および／または３７５（例えば、Ｒ３１５Ａ、Ｒ３４１Ａ、Ｒ３７２Ａ、および／またはＫ３７５Ａ）において、１つ以上の変異を含み得る。
【0136】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、配列番号９で表される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、ゲノムへのＤＮＡの組み込みの特異性が高いために選択される。いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８に関して本明細書に開示される修飾のうちの１つ以上を有するアミノ酸配列を含み、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８で表される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を保持する。
【0137】
いくつかの実施形態では、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号６７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＳＢ１００トランスポザーゼは、配列番号６８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
【0138】
いくつかの実施形態では、ＳＢ１００トランスポザーゼは、配列番号７３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0139】
いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、１つ以上の変異を含む修飾されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、高活性型Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼまたはＳＢ１００における１つ以上の変異は、以下に対応する：配列番号９または配列番号７３のＬ２５Ｆ、Ｒ３６Ａ、Ｉ４２Ｋ、Ｇ５９Ｄ、Ｉ２１２Ｋ、Ｎ２４５Ｓ、Ｋ２５２ＡおよびＱ２７１Ｌ。
【0140】
特定の実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、Ｈｉｍａｒ１Ｃ９変異体ではない。
【0141】
本開示の特定の態様は、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞における発現に適した本開示のトランスポザーゼまたは修飾されたトランスポザーゼを含む核酸構築物を含むベクターまたはプラスミド（例えば、発現ベクターまたはパッケージングベクター）を対象とする。いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、Ｃａｓ９との融合タンパク質として発現する。いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼは、別個のベクターからのＣａｓ９と共発現するが、同じ細胞に送達される。いくつかの実施形態では、修飾されたトランスポザーゼまたはそれを含む融合タンパク質は、細胞への送達のためにレンチウイルス粒子にパッケージングされる。
【0142】
実施例に示すとおり、新たに開発された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ変異ライブラリーを使用して、特定の標的転位を実施する修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃを同定した。このようなライブラリーを使用して、陽性の標的転位を有する修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃを同定した。
【0143】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸２４５、２７５、２７７、３２５、３４７、３５１、３７２、３７５、３８８、４５０、４６５、５６０、５６４、５７３、５８９、５９２、５９４から選択されるアミノ酸のうちの１つ以上の変異を含むことができる。
【0144】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ変異は、以下から選択されるアミノ酸修飾のうちの１つ以上を含むことができる：配列番号９のアミノ酸番号に対応するＲ２４５Ａ、Ｒ２７５Ａ、Ｒ２７７Ａ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ、Ｇ３２５Ａ、Ｎ３４７Ａ、Ｎ３４７Ｓ、Ｓ３５１Ｅ、Ｓ３５１Ｐ、Ｓ３５１Ａ、Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３８８Ａ、Ｄ４５０Ｎ、Ｗ４６５Ａ、Ｔ５６０Ａ、Ｓ５６４Ｐ、Ｓ５７３Ａ、Ｍ５８９Ｖ、Ｓ５９２Ｇ、またはＦ５９４Ｌ。
【0145】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸修飾Ｄ４５０Ｎを含む。
【0146】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号１に対応し、アミノ酸修飾Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、およびＤ４５０を含む。
【0147】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸修飾Ｒ２４５ＡおよびＤ４５０を含む。
【0148】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸修飾Ｒ２４５Ａ、Ｇ３２５Ａ、およびＳ５７３Ｐを含む。
【0149】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸修飾Ｒ２４５Ａ、Ｇ３２５Ａ、Ｄ４５０およびＳ５７３Ｐを含む。
【0150】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸修飾Ｎ３４７ＳまたはＮ３４７Ａを含む。
【0151】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸修飾Ｎ３４７ＳおよびＤ４５０Ｎを含む。
【0152】
他の場合、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸番号に対応するアミノ酸修飾Ｎ３４７ＡおよびＤ４５０Ｎを含む。一実施形態では、この修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。
【0153】
前に述べたように、本明細書に開示されるエレメントに融合できるが、単独でまたは異なるエレメントと組み合わせて使用することもできる修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが本明細書に提供される。トランスポザーゼは、本発明者らによって生成された。したがって、配列番号９のアミノ酸配列を含む修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが提供され、
－位置３４のアミノ酸は、ＶまたはＭであり、
－位置４３のアミノ酸は、ＴまたはＩであり、
－位置１７７のアミノ酸は、ＹまたはＨであり、
－位置２０２のアミノ酸は、ＲまたはＫであり、
－位置２３０のアミノ酸は、ＳまたはＮであり、
－位置２４５のアミノ酸は、Ａであり、
－位置２６８のアミノ酸は、ＤまたはＮであり、
－位置２７７のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置２７５のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置２７７のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置３２５のアミノ酸は、ＡまたはＧであり、
－位置３４７のアミノ酸は、ＳまたはＡであり、
－位置３５１のアミノ酸は、Ｅ、Ｐ、またはＡであり、
－位置３７２のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置３７５のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置３８８のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置４０９のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置４１１のアミノ酸は、ＡまたはＴであり、
－位置４１２のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置４５０のアミノ酸は、ＤまたはＮであり、
－位置４６０のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置４６５のアミノ酸は、ＷまたはＡであり、
－位置５１７のアミノ酸は、ＳまたはＡであり、
－位置５６０のアミノ酸は、ＴまたはＡであり、
－位置５６４のアミノ酸は、ＰまたはＳであり、
－位置５７１のアミノ酸は、ＳまたはＮであり、
－位置５７３のアミノ酸は、ＳまたはＡであり、
－位置５７６のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置５８６のアミノ酸は、ＨまたはＡであり、
－位置５８７のアミノ酸は、ＩまたはＡであり、
－位置５８９のアミノ酸は、ＭまたはＶであり、
－位置５９２のアミノ酸は、ＧまたはＳである、および／または、
－位置５９４のアミノ酸は、ＬまたはＦである。
－位置３４のアミノ酸は、ＶまたはＭであり、
－位置４３のアミノ酸は、ＴまたはＩであり、
－位置１７７のアミノ酸は、ＹまたはＨであり、
－位置２０２のアミノ酸は、ＲまたはＫであり、
－位置２３０のアミノ酸は、ＳまたはＮであり、
－位置２４５のアミノ酸は、Ａであり、
－位置２６８のアミノ酸は、ＤまたはＮであり、
－位置２７７のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置２７５のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置２７７のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置３２５のアミノ酸は、ＡまたはＧであり、
－位置３４７のアミノ酸は、ＳまたはＡであり、
－位置３５１のアミノ酸は、Ｅ、Ｐ、またはＡであり、
－位置３７２のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置３７５のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置３８８のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置４０９のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置４１１のアミノ酸は、ＡまたはＴであり、
－位置４１２のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置４５０のアミノ酸は、ＤまたはＮであり、
－位置４６０のアミノ酸は、ＲまたはＡであり、
－位置４６５のアミノ酸は、ＷまたはＡであり、
－位置５１７のアミノ酸は、ＳまたはＡであり、
－位置５６０のアミノ酸は、ＴまたはＡであり、
－位置５６４のアミノ酸は、ＰまたはＳであり、
－位置５７１のアミノ酸は、ＳまたはＮであり、
－位置５７３のアミノ酸は、ＳまたはＡであり、
－位置５７６のアミノ酸は、ＫまたはＡであり、
－位置５８６のアミノ酸は、ＨまたはＡであり、
－位置５８７のアミノ酸は、ＩまたはＡであり、
－位置５８９のアミノ酸は、ＭまたはＶであり、
－位置５９２のアミノ酸は、ＧまたはＳである、および／または、
－位置５９４のアミノ酸は、ＬまたはＦである。
【0154】
本開示はまた、特にｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子療法における医薬品として使用するための、本明細書に提供される修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼに関する。
【0155】
一実施形態において、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、直接的またはリンカーを介して間接的に互いに融合して、融合タンパク質を形成し、ここで、第１のタンパク質は、標的核酸配列を結合して切断することができる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質（上記のとおり）を含むか、またはそれからなり、第２のタンパク質は、トランスポザーゼ（上記のとおり）を含むか、またはそれからなる。
【0156】
一方では部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質に関連し、他方ではトランスポザーゼに関連する任意の実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質の場合に準用して適用される。
【0157】
したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、以下を含むか、またはそれらからなる：
（ｉ）上述のとおり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを含むか、またはそれらからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
（ｉ）上述のとおり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを含むか、またはそれらからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
【0158】
一実施形態では、融合タンパク質は、以下を含むか、またはそれらからなる：
（ｉ）上述のとおり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼまたはジンクフィンガータンパク質を含む、またはそれらからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
（ｉ）上述のとおり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼまたはジンクフィンガータンパク質を含む、またはそれらからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
【0159】
一実施形態では、融合タンパク質は、以下を含むか、またはそれらからなる：
（ｉ）上述のとおり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを含む、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
（ｉ）上述のとおり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを含む、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
【0160】
一実施形態では、融合タンパク質は、以下を含むか、またはそれらからなる：
（ｉ）上述のとおり、Ｃａｓ９タンパク質またはそのバリアントを含む、またはそれらからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
（ｉ）上述のとおり、Ｃａｓ９タンパク質またはそのバリアントを含む、またはそれらからなる第１のタンパク質、および
（ｉｉ）上述のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる第２のタンパク質。
【0161】
一実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、融合タンパク質中でいずれの順序でも配向することができる。
【0162】
一実施形態では、融合タンパク質は、直接的またはリンカーを介して間接的に、第２のタンパク質のＣ末端部に融合された第１のタンパク質を含むか、またはそれからなる。換言すれば、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のものを含むか、またはそれらからなる：（ｉ）第２のタンパク質（すなわち、トランスポザーゼ）；（ｉｉ）任意により、リンカー；および（ｉｉｉ）第１のタンパク質（すなわち、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、好ましくはＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ；より好ましくはＣａｓ９タンパク質またはそのバリアント）。
【0163】
一実施形態では、融合タンパク質は、直接的またはリンカーを介して間接的に、第２のタンパク質のＮ末端部に融合された第１のタンパク質を含むか、またはそれからなる。換言すれば、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のものを含むか、またはそれらからなる：（ｉ）第１のタンパク質（すなわち、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、好ましくはＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ；より好ましくはＣａｓ９タンパク質またはそのバリアント）；（ｉｉ）任意により、リンカー；および（ｉｉｉ）第２のタンパク質（すなわち、トランスポザーゼ）。
【0164】
一実施形態では、融合タンパク質は、リンカーを含む。
【0165】
リンカーの好適な例としては、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間（任意の順序で）のペプチドリンカーが挙げられる。
【0166】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＳ）ｎ、配列番号１３３を有する（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、配列番号１３４を有する（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ＸＴＥＮリンカー、および（ＸＰ）ｎモチーフ、およびこれらのいずれかの組み合わせを含むかまたはそれからなる群から選択され、式中、ｎは独立して１～５０の整数である。
【0167】
一実施形態では、リンカーは、１２～２４アミノ酸長であるか、または３６～７２ヌクレオチド長の核酸配列によってコードされる。
【0168】
一実施形態では、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーまたは（ＧＧＳ）ｎリンカーである。
【0169】
一実施形態では、リンカーは、表１に示されるリンカーの中から選択される。
【表1】
【0170】
一実施形態では、リンカーは、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、またはそれらの組み合わせを含む、またはこれらからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、それぞれ、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２の例示的な核酸配列によってコードされる。
【0171】
一実施形態では、リンカーは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；配列番号４８の例示的な核酸配列によってコードされる。
【0172】
また、本明細書では、本開示で提供される核酸構築物のいずれかの発現から得られる融合タンパク質も提供される。
【0173】
一実施形態では、融合タンパク質は、三重融合タンパク質である。
【0174】
このような三重融合タンパク質は、以下を含むか、またはそれらから構成され得る：
－１つの第１のタンパク質（すなわち、１つの部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質）および２つの第２のタンパク質（すなわち、２つのトランスポザーゼ）；または
－２つの第１のタンパク質（すなわち、２つの部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質）および１つの第２のタンパク質（すなわち、１つのトランスポザーゼ）。
－１つの第１のタンパク質（すなわち、１つの部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質）および２つの第２のタンパク質（すなわち、２つのトランスポザーゼ）；または
－２つの第１のタンパク質（すなわち、２つの部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質）および１つの第２のタンパク質（すなわち、１つのトランスポザーゼ）。
【0175】
一実施形態では、三重融合体は、１つの第１のタンパク質（すなわち、１つの部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質）および２つの第２のタンパク質（すなわち、２つのトランスポザーゼ）を含むか、またはそれらからなり、三重融合体は、Ｎ末端からＣ末端まで：
－（ｉ）部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）第１のトランスポザーゼ、（ｉｉｉ）第２のトランスポザーゼ；または
－（ｉ）第１のトランスポザーゼ；（ｉｉ）部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉｉ）第２のトランスポザーゼ；または
－（ｉ）第１のトランスポザーゼ；（ｉｉ）第２のトランスポザーゼ、（ｉｉｉ）部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む。
－（ｉ）部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）第１のトランスポザーゼ、（ｉｉｉ）第２のトランスポザーゼ；または
－（ｉ）第１のトランスポザーゼ；（ｉｉ）部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉｉ）第２のトランスポザーゼ；または
－（ｉ）第１のトランスポザーゼ；（ｉｉ）第２のトランスポザーゼ、（ｉｉｉ）部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む。
【0176】
一実施形態では、第１および第２のトランスポザーゼは同一である。一実施形態では、第１のトランスポザーゼと第２のトランスポザーゼは、異なる。例えば、第１のトランスポザーゼは、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼであり得、第２のトランスポザーゼは、本明細書に記載の修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのいずれかから選択される修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼであり得る。あるいは、第１および第２のトランスポザーゼは、両方とも、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼであり得るが、それぞれが本明細書に記載の異なる置換または置換の異なる組み合わせを有する。
【0177】
一実施形態では、第１および第２のトランスポザーゼは、機能的二量体を形成することができる。
【0178】
一実施形態では、三重融合体は、２つの第１のタンパク質（すなわち、２つの部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質）および１つの第２のタンパク質（すなわち、１つのトランスポザーゼ）を含むか、またはそれらからなり、三重融合体は、Ｎ末端からＣ末端まで：
－（ｉ）第１の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質；（ｉｉｉ）トランスポザーゼ；または
－（ｉ）第１の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質；（ｉｉ）トランスポザーゼ、（ｉｉｉ）第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、または、
－（ｉ）トランスポザーゼ；（ｉｉ）第１の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉｉ）第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む。
－（ｉ）第１の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉ）第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質；（ｉｉｉ）トランスポザーゼ；または
－（ｉ）第１の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質；（ｉｉ）トランスポザーゼ、（ｉｉｉ）第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、または、
－（ｉ）トランスポザーゼ；（ｉｉ）第１の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｉｉｉ）第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む。
【0179】
一実施形態では、第１および第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、同一である。一実施形態では、第１および第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、異なる。例えば、第１の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得、第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、本明細書に記載されるＣａｓ９タンパク質バリアントのいずれかから選択される、Ｃａｓ９タンパク質のバリアントであり得る。あるいは、第１および第２の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質の両方は、Ｃａｓ９タンパク質バリアントであり得るが、それぞれが異なるバリアントである。
【0180】
一実施形態では、三重融合タンパク質は、任意により、そのタンパク質のうちの２つの間、または３つのタンパク質の間にリンカーを含む。
【0181】
また、本明細書では、以下を含む融合タンパク質も開示される：
（ｉ）第２のタンパク質は、トランスポザーゼを含むか、またはトランスポザーゼからなる；または上記の第２のタンパク質をコードする核酸構築物、および
（ｉｉ）少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合することができるＲＮＡ結合タンパク質；またはそのＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸構築物。
（ｉ）第２のタンパク質は、トランスポザーゼを含むか、またはトランスポザーゼからなる；または上記の第２のタンパク質をコードする核酸構築物、および
（ｉｉ）少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合することができるＲＮＡ結合タンパク質；またはそのＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸構築物。
【0182】
一実施形態では、融合タンパク質は、上記のようにリンカーを含む。
【0183】
一実施形態では、第２のタンパク質は、トランスポザーゼを含むか、またはトランスポザーゼからなり、トランスポザーゼは、配列番号９を有する高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。一実施形態では、第２のタンパク質は、トランスポザーゼを含むか、またはトランスポザーゼからなり、このトランスポザーゼは、配列番号９を有する高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃである。特に、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃは、本明細書に開示されるもののいずれかであり得る。
【0184】
一実施形態では、トランスポザーゼ／ＲＮＡ結合タンパク質融合体は、上記のとおり、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質にさらに融合することができる。
【0185】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ＭＣＰ）またはその断片である。
【0186】
いくつかの実施形態では、ＭＣＰは、配列番号１５１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する（例えば、配列番号１５０の核酸配列によってコードされる）。
【0187】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合することができ、ＲＮＡ配列は、テトラループを含む。「テトラループ」という用語は、「ステムループ」および「ヘアピンループ」という用語と同じ意味で使用される。
【0188】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのテトラループは、ＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列である。
【0189】
いくつかの実施形態では、テトラループは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内に含まれる。特定の実施形態では、上記のとおり、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成している。
【0190】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも１つのＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つ以上のＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列を含む。
【0191】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列を含むｇＲＮＡは、配列番号１５３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する（例えば、配列番号１５２のＤＮＡ配列によってコードされる）。
【0192】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質中のＭＣＰは、Ｃａｓ９タンパク質に非共有結合により結合したｇＲＮＡ自体に含まれる少なくとも１つのＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列に非共有結合により結合する；特に、融合タンパク質のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体への結合は、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの切除活性を、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって特異的に認識される部位に向ける。
【0193】
以下にさらに詳述するように、本開示の特定の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸構築物を含むベクターまたはプラスミド（例えば、発現ベクター、パッケージングベクターなど）にも向けられ；ベクターまたはプラスミドは、好ましくは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞における発現に好適である。
【0194】
本発明によれば、組成物は、第１のタンパク質および／または第２のタンパク質（または両方を含む融合タンパク質）を、上記のとおりタンパク質として、またはこれらのタンパク質をコードする核酸構築物として含むことができる。
【0195】
核酸配列の標的編集、例えば、ゲノムＤＮＡへの特異的修飾の導入（例えば、外因性核酸の挿入）は、ヒトの遺伝性疾患を治療するための有望なアプローチである。この目的を達成するために、本発明者らは、所望の修飾の組み込みにおいて非常に効率的である；オフターゲット活性が最小限である；およびヒトゲノム内の部位を正確に編集するようにプログラムすることができるゲノム編集に使用するための改良された核酸構築物を提供することを目的とした。
【0196】
したがって、本出願の特定の態様は、外因性核酸、例えば目的の遺伝子（ＧＯＩ）のゲノムへの部位特異的挿入を改善する際に使用するための核酸構築物を対象とする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、治療遺伝子、例えば治療タンパク質をコードする遺伝子である。目的の治療遺伝子の例としては、嚢胞性線維症疾患を治療するためのＣＦＴＲ遺伝子（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療するためのＳＭＮ１遺伝子（運動神経細胞生存１）；骨粗鬆症および骨折を予防するためのＬＲＰ５遺伝子（ＬＤＬ受容体関連タンパク質５）バリアントＧ１７１Ｖ；およびアルツハイマー病の素因を軽減するためのＡＰＰ遺伝子（アミロイドベータ前駆体タンパク質）バリアントＡ６７３Ｔが挙げられる。
【0197】
いくつかの実施形態では、挿入のための外因性核酸（例えば、ＧＯＩ）は、最大約１０ｋｂ、最大約１５ｋｂ、最大約２０ｋｂの長さ、最大約２５ｋｂの長さ、最大約３０ｋｂの長さ、最大約３５ｋｂの長さ、または最大約４０ｋｂの長さであり得る。
【0198】
いくつかの実施形態では、挿入するための外因性核酸は、最大１０ｋｂ、最大１５ｋｂ、最大２０ｋｂの長さ、最大２５ｋｂの長さ、最大３０ｋｂの長さ、最大３５ｋｂの長さ、または最大４０ｋｂの長さ、例えば、約１ｋｂ～約４０ｋｂ、約１ｋｂ～約３９ｋｂ、約１～約３８ｋｂ、約１ｋｂ～約３７ｋｂ、約１ｋｂ～約３６ｋｂ、または約１ｋｂ～約３５ｋｂ、例えば、より好ましくは５～２５ｋｂであり、典型的には、８～２０ｋｂであり得る。
【0199】
一実施形態では、本発明の組成物は、以下を含むかまたは以下からなる：
ａ．上述の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる、上述の第１のタンパク質をコードする核酸構築物；
ｂ．上述したように、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる、第２のタンパク質をコードする核酸構築物。
ａ．上述の部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる、上述の第１のタンパク質をコードする核酸構築物；
ｂ．上述したように、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはそれからなる、第２のタンパク質をコードする核酸構築物。
【0200】
別の実施形態では、本発明の組成物は、上記のとおり、（ｉ）部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質、および（ｉｉ）上記のとおり、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃであるトランスポザーゼを含む、またはこのトランスポザーゼからなる第２のタンパク質を含むか、またはこれらからなる上記の融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む、またはそれからなる。
【0201】
一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸構築物は、上記のとおり、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間、または三重融合タンパク質の場合、そのタンパク質のうちの２つの間、または３つのタンパク質の間のリンカーをコードする核酸配列をさらに含む。
【0202】
本開示によれば、第１および第２のタンパク質、または第１および第２のタンパク質を含む、またはそれらからなる融合タンパク質は、外因性核酸の部位特異的挿入を可能にする、および／または促進する。
【0203】
いくつかの実施形態は、以下のいずれかを含むプラスミドまたはベクター（例えば、発現ベクターなど）を対象とする：
－第１のタンパク質をコードする核酸構築物；または
－第２のタンパク質をコードする核酸構築物；または
－第１のタンパク質をコードする核酸構築物および第２のタンパク質をコードする核酸構築物；または
－融合タンパク質または三重融合タンパク質をコードする核酸構築物。
－第１のタンパク質をコードする核酸構築物；または
－第２のタンパク質をコードする核酸構築物；または
－第１のタンパク質をコードする核酸構築物および第２のタンパク質をコードする核酸構築物；または
－融合タンパク質または三重融合タンパク質をコードする核酸構築物。
【0204】
いくつかの実施形態では、プラスミドは、パッケージングプラスミドである。いくつかの実施形態では、プラスミドは、キャプシドタンパク質、例えば、ｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、ウイルスエンベロープのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第２のプラスミド（エンベローププラスミド）と外因性核酸導入遺伝子を含む核酸構築物を含む第３のプラスミドと組み合わされ、ここで、組み合わせが産生細胞株（例えば、真核細胞、原核細胞および／または細胞株）に導入される場合、外因性核酸導入遺伝子をコードする核酸構築物と、第１のタンパク質、第２のタンパク質、第１のタンパク質と第２のタンパク質の両方、または融合タンパク質のいずれかをコードする核酸構築物を含むウイルス粒子が産生される。
【0205】
いくつかの実施形態では、プラスミドは、キャプシドタンパク質、例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ（パッケージングプラスミドであって、パッケージングプラスミドには機能的インテグラーゼが欠如している）をコードするポリヌクレオチドを含む第２のプラスミドと、ウイルスエンベロープのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第３のプラスミド（エンベローププラスミド）と、外因性核酸導入遺伝子を含む核酸構築物を含む第４のプラスミドと組み合わされ、この組み合わせが産生細胞株（例えば、真核細胞および原核細胞および／または細胞株）に導入されると、外因性核酸導入遺伝子を含む核酸構築物と、第１のタンパク質、第２のタンパク質、第１のタンパク質と第２のタンパク質の両方、または融合タンパク質のいずれかをコードする核酸構築物を含むウイルス粒子が産生される。
【0206】
一実施形態では、第１のタンパク質、第２のタンパク質、第１および第２の両方のタンパク質または融合タンパク質、および／または外因性核酸導入遺伝子は、レンチウイルス粒子を使用して細胞に送達される。
【0207】
一実施形態では、核酸構築物は、標的核酸配列を結合するように操作された部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含む、またはそれからなる第１のタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、外因性核酸導入遺伝子のゲノムへの挿入を可能にするトランスポザーゼを含む、またはトランスポザーゼからなる第２のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、任意により、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間のリンカーをコードする核酸配列を含む第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質は、上述したように、ジンクフィンガータンパク質またはＣａｓ９タンパク質またはそのバリアントであり、および／または第２のタンパク質は、上述のように、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである。
【0208】
融合タンパク質を産生するための好適なリンカーの例は、上記に記載されている。
【0209】
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質が第２のタンパク質とは別のプラスミドから発現されるため、リンカーは必要ない。
【0210】
一実施形態では、リンカーを使用する代わりに、第１および／または第２のポリヌクレオチド配列は、それぞれ第１および第２のタンパク質をコードする核酸を含み、それらの末端の少なくとも１つに、リンカーの機能を果たす追加のヌクレオチドをさらに含む。
【0211】
一実施形態では、核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態である。
【0212】
また、本明細書では、本開示で提供される核酸構築物のいずれかを含むベクターも提供される。特に、ベクターは、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞における発現に好適である。また、本明細書では、本開示で提供される核酸構築物またはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供される。
【0213】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、宿主細胞内で発現する。好適な宿主細胞としては、これらに限定されないが、真核細胞および原核細胞および／または細胞株が挙げられる。このような宿主細胞またはそのような細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。
【0214】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、微生物に由来する。本明細書に開示される特定の方法に有用な微生物としては、例えば、細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および植物が挙げられる。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。好適な真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、および藻類細胞が挙げられる。
【0215】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、コンピテント宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、天然にコンピテントである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、例えば塩化カルシウムおよび熱ショックを使用するプロセスによってコンピテントにされる。使用される細胞は、任意の細胞コンピテント、特に真核細胞、特に哺乳動物、例えばヒトまたは動物であり得る。それらは、体細胞性幹または胚性幹または分化したものであり得る。いくつかの態様では、細胞には、２９３Ｔ細胞、線維芽細胞、肝細胞、筋細胞（骨格、心臓、平滑細胞、血管など）、上皮細胞の神経細胞（ニューロン、グリア細胞、星状細胞）、腎臓細胞、眼球細胞などが含まれる。これには、昆虫、植物細胞、酵母、または原核細胞も含まれ得る。さらに、初代細胞を単離し、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）またはヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）による治療後の治療対象への再導入のためにｅｘ ｖｉｖｏで使用してもよい。好適な初代細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、および限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴリンパ球などの他の血液細胞サブセットが挙げられる。好適な細胞としては、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経幹細胞および間葉幹細胞などの幹細胞も挙げられる。
【0216】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示される核酸構築物を含むプラスミドでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、核酸構築物を含むプラスミドは、パッケージングプラスミドである。いくつかの実施形態では、核酸構築物を含むプラスミドは、キャプシドタンパク質、例えばｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（ｉ）核酸構築物を含むプラスミドと、宿主細胞内でこれと組み合わされる、（ｉｉ）ウイルスエンベロープのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（エンベローププラスミド）と；（ｉｉｉ）外因性核酸配列（例えば、ＧＯＩ）を含むプラスミドとでトランスフェクトされ、産生されるウイルス粒子は、外因性核酸、例えばＧＯＩ、ならびに第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含む。
【0217】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（ｉ）核酸構築物を含むプラスミドと、これと組み合わされる、（ｉｉ）キャプシドタンパク質、例えば、ｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドをさらに含む核酸構築物を含むプラスミド（パッケージングプラスミド、ここで、パッケージングプラスミドは機能的なインテグラーゼを欠いている）と；（ｉｉｉ）ウイルスエンベロープのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（エンベローププラスミド）と、（ｉｖ）外因性核酸配列（例えば、ＧＯＩ）を含むプラスミドとでトランスフェクトされ、産生されるウイルス粒子は、外因性核酸、例えばＧＯＩ、ならびに第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含む。
【0218】
さらなる実施形態では、ベクター、例えば、本開示によるレンチウイルスベクターは、本開示の核酸構築物および外因性核酸によってコードされる第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を生物、例えば哺乳動物、より具体的には目的の哺乳動物標的細胞に送達するために使用することができる。第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含むレンチウイルスベクターは、例えば肝臓細胞（例えば肝細胞）、筋細胞、脳細胞、腎細胞、網膜細胞、および造血細胞などの様々な細胞型に形質導入することができる。いくつかの実施形態では、本開示の標的細胞は、「非分裂」細胞である。これらの細胞としては、通常は分裂しない神経細胞などの細胞が挙げられる。しかし、本開示が非分裂細胞（これらに限定されないが、筋細胞、白血球、脾臓細胞、肝臓細胞、眼細胞、上皮細胞など）に限定されることは意図するものではない。
【0219】
特定の実施形態では、パッケージングされた第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）が、例えば生物のＤＮＡの遺伝子編集のために生物に投与される。いくつかの実施形態では、生物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、生物は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、生物は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、生物は、げっ歯類である。いくつかの実施形態では、生物は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの実施形態では、生物は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの実施形態では、生物は、研究動物である。いくつかの実施形態では、生物は、遺伝子操作されており、例えば、遺伝子操作された非ヒト対象である。生物は、いずれの性別であってもよく、あらゆる発達段階にあり得る。
【0220】
核酸、例えば外因性核酸をゲノムに挿入するための方法が記載されている。例えば、Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ４（１０８）：１５３１－１５３６（２０１１）；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４（３８）：１２０４－１２１６（２００９）；Ｋｅｔｔｌｕｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．９（１９）：１６３６－１６４４（２０１１）；Ｓｋｉｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．２０（９２）：１－２３（２０１３）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２５：Ｅ２２７９－Ｅ２２８７（２０１３）；Ｍａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１（６）：７５３－７６１（２００９）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（１０）：９５７－９６３；Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．１４（２８８）：１－１５（２０１６）；Ｇｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４７：２３０９－２３１８（２０１４）；Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｉｎｓ．３（１）：３３－４１（２０１７）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．６４９：３５３－３６３（２０１０）；Ｚｈａｏ Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．９：２３０－２４１（２０１７）；Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１１（３）（２０１９）；およびＮａｌｄｉｎｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（１０）：７２７－７２８（２０１６）を参照、これらはその各々が、参照により本明細書に組み込まれる。
【0221】
本開示は、ゲノムの特定の部位に核酸（典型的には外因性核酸）を挿入するための、第１のタンパク質および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）をコードする核酸構築物を提供する。本発明はまた、ゲノムの特定の部位に外因性核酸を挿入するための第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を提供する。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性核酸は、最大長５ｋｂ、最大長１０ｋｂ、最大長１５ｋｂ、長さ２０ｋｂ、最大長２５ｋｂ、最大長３０ｋｂ、最大長３５ｋｂ、または最大長４０ｋｂ、特に長い核酸の場合、例えば５ｋｂ～２５ｋｂ、典型的には８ｋｂ～２０ｋｂであり得る。
【0222】
別の実施形態では、ゲノムへの部位特異的核酸挿入のための方法が提供される。
【0223】
したがって、本開示は、外因性核酸配列を細胞のゲノムに部位特異的に組み込むための方法に関し、本方法は、
（ｉ）本明細書に開示される第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）、または本明細書に開示される核酸構築物、
（ｉｉ）細胞のゲノムに組み込まれる外因性核酸、および
（ｉｉｉ）細胞のゲノムへの外因性核酸の部位特異的組み込みを決定するためのガイドＲＮＡを含む組成物を細胞に送達することを含み；
第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）が細胞のゲノム内での特定のゲノムＤＮＡ配列に結合することにより、ゲノムの切断およびガイドＲＮＡによって決定される、細胞のゲノムへの外因性核酸配列の部位特異的組み込みが生じる。
（ｉ）本明細書に開示される第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）、または本明細書に開示される核酸構築物、
（ｉｉ）細胞のゲノムに組み込まれる外因性核酸、および
（ｉｉｉ）細胞のゲノムへの外因性核酸の部位特異的組み込みを決定するためのガイドＲＮＡを含む組成物を細胞に送達することを含み；
第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）が細胞のゲノム内での特定のゲノムＤＮＡ配列に結合することにより、ゲノムの切断およびガイドＲＮＡによって決定される、細胞のゲノムへの外因性核酸配列の部位特異的組み込みが生じる。
【0224】
本方法の特定の実施形態では、外因性核酸は、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、典型的には５～２５ｋｂ、好ましくは、８～２０ｋｂで構成されるサイズの核酸断片である。
【0225】
本方法の特定の実施形態では、外因性核酸は、遺伝性障害の欠損を修正するために、それを必要とする対象のゲノムに挿入される治療用導入遺伝子である。
【0226】
本方法の特定の実施形態では、組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、典型的には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくは遺伝性障害を患うヒト対象から得られたヒト細胞において送達される。
【0227】
本方法の特定の実施形態では、本組成物は、典型的には遺伝性障害の治療的処置のために、それを必要とする哺乳動物、例えばヒト対象にｉｎ ｖｉｖｏで送達される。
【0228】
いくつかの実施形態では、本方法は、標的ＤＮＡを、本明細書に記載のＣａｓ９およびトランスポザーゼを含む融合タンパク質のいずれかと接触させることを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡを、２つの連結されたポリペプチド（ｉ）Ｃａｓ９；および（ｉｉ）トランスポザーゼを含む融合タンパク質と接触させることを含み、活性型Ｃａｓ９は、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡの領域にハイブリダイズするｇＲＮＡを結合する。
【0229】
いくつかの実施形態では、本方法は、標的ＤＮＡを、本明細書に記載のＺＦＰおよびインテグラーゼを含む融合タンパク質のいずれかと接触させることを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡを、２つの連結されたポリペプチド（ｉ）ＺＦＰ；および（ｉｉ）インテグラーゼを含む融合タンパク質と接触させることを含み、活性型ＺＦＰは、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡの領域にハイブリダイズする。
【0230】
いくつかの実施形態では、第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）は、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルス粒子を使用して、標的ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡを含む生物および／または細胞に送達される。
【0231】
レンチウイルスをパッケージングするための方法が記載されている。Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ ｅｔ ａｌ．９（６）：１－１３（２０１４）；Ｖｏｅｌｋｅｌ ｅｔ ａｌ．１０７（１７）：７８０５－７８１０（２０１０）；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．８０（４）１９３９－１９４８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．９（８）：１－９（２０１４）；Ｍａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１（６）：７５３－７６１（２００９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ｈ Ｋｕｔｎｅｒ１，ｅｔ ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ４（４）：４９５（２００９）を参照、そのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【0232】
典型的には、レンチウイルス送達システムは、ウイルス疾患を引き起こすために必要とされる遺伝子成分を含まない完全なウイルスを産生するために使用される、別々のプラスミド上に異なるレンチウイルス遺伝子を有する分割システムを使用する。例えば、１つのプラスミド（エンベローププラスミド）は、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）のタンパク質をコードすることができ；別のプラスミド（パッケージングプラスミド）は、キャプシドタンパク質（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）ならびに逆転写酵素および／またはインテグラーゼのような酵素をコードすることができ；さらに、さらなるプラスミド（トランスファープラスミド）は、（ゲノム組み込みのための）長末端反復配列およびｐｓｉ配列（遺伝子をウイルスにパッケージングするためのシグナルを示す）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む。これらのプラスミドが同時に細胞に導入された場合、疾患を引き起こすために必要なウイルス遺伝子を持たずに、目的の遺伝子を含むウイルスが産生される。
【0233】
本開示の特定の態様では、本発明のレンチウイルスベクター（または粒子）は、許容細胞（２９３Ｔ細胞など）にｉｎ ｖｉｔｒｏで、レンチウイルスベクターゲノムの特定の成分を含むプラスミド、およびポリペプチドＧＡＧ、ＰＯＬおよびエンベロープタンパク質（複数可）またはレトロウイルス粒子の形成を可能にするのに十分なこれらのポリペプチドの一部をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列をトランスで提供する少なくとも１つの他のプラスミドでトランスフェクトすることによる、分割システム、例えばトランス相補システム（ベクター／パッケージングシステム）によって取得可能である。
【0234】
一例として、宿主細胞は、ａ）レンチウイルスｇａｇおよびｐｏｌ配列を含むパッケージングプラスミド、ｂ）エンベロープタンパク質（複数可）（ＶＳＶ－Ｇなど）をコードする遺伝子を含む第２のプラスミド（エンベロープ発現プラスミドまたはシュードタイピングｅｎｖプラスミド）、ｃ）５’と３’との間のＬＴＲ配列、ｐｓｉキャプシド化配列、および導入遺伝子を含むプラスミドベクター、ならびにｄ）本明細書に開示の第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）をコードする核酸構築物を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）をコードする核酸構築物は、別個のプラスミドではなくパッケージングプラスミド上にある。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ ｃＤＮＡをコードする核酸は、従来技術およびデータベースで入手可能なウイルス遺伝子配列から、従来の技術に従って有利に調製することができる。
【0235】
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、本明細書に記載の核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、本明細書に記載される第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含む。
【0236】
プラスミド中で使用されるプロモーターは、同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、プラスミドトランス相補システムにおいて、コートタンパク質のｇａｇおよびｐｏｌの発現を促進するためのエンベローププラスミドおよびプラスミドベクターのそれぞれ、ベクターゲノムのｍＲＮＡおよび導入遺伝子は、同一であっても異なっていてもよいプロモーターである。このようなプロモーターは、遍在性プロモーター、または特異的プロモーター、例えばウイルスプロモーターＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターおよびＵ６もしくはＨ１などのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、あるいはｅｎｖ、ｇａｇおよびｐｏｌをコードするヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス）のプロモーターから有利に選択することができる。
【0237】
本開示のレンチウイルスベクターの産生のために、本明細書に記載のプラスミドを宿主細胞に導入することができ、ウイルスが産生され、回収される。好適な細胞としては、これらに限定されないが、真核細胞および原核細胞および／または細胞株が挙げられる。このような細胞またはそのような細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。
【0238】
宿主細胞がプラスミドでトランスフェクトされ、本開示のレンチウイルスベクター（または粒子）が産生されると、本開示のレンチウイルスベクター（または粒子）を細胞の上清から精製することができる。濃度を高めるためのレンチウイルスベクターの精製は、密度勾配精製（例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ））、クロマトグラフィー技術（例えば、カラムまたはバッチクロマトグラフィー）、または超遠心分離などの任意の好適な方法によって達成することができる。例えば、本発明のベクターは、２回または３回のＣｓＣｌ密度勾配精製ステップに供することができる。ベクターは、望ましくは、細胞を溶解することと、ライセートをクロマトグラフィー樹脂に適用することと、クロマトグラフィー樹脂からウイルスを溶出させることと、本開示のレンチウイルスベクターを含む画分を収集することと、を含む方法を使用して、感染細胞から精製させる。
【0239】
レンチウイルスベクターの送達方法が記載されている。例えば、Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．１４（２８８）：１－１５（２０１６）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（１０）：９５７－９６３；Ｍａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１（６）：７５３－７６１（２００９）；Ｓｋｉｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．２０（９２）：１－２３（２０１３）を参照されたい。
【0240】
第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）またはそれをコードする核酸構築物を含むレンチウイルスベクターは、任意の経路によって対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達され得る。
【0241】
いくつかの実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで送達され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物によってコードされる第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含むレンチウイルスベクターを使用して、目的の遺伝子を送達する、および／または対象のＤＮＡにおける遺伝的欠陥を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、非経口的に、好ましくは血管内（静脈内を含む）で対象に投与される。非経口的投与する場合、ベクターは、滅菌水溶液または分散液などの注射に好適である薬学的ビヒクル中で与えられることが好ましい。
【0242】
いくつかの実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
【0243】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物によってコードされる第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含むレンチウイルスベクターを使用して、目的の遺伝子を送達する、および／または対象のＤＮＡにおける遺伝的欠陥を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、細胞が対象から除去され、本開示の核酸構築物によってコードされる第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含むレンチウイルスベクターが、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に投与されて、細胞のＤＮＡを修飾させる。次に、修飾されたＤＮＡを保持する細胞が拡張され、対象に再注入される。特定の実施形態では、本開示の核酸構築物によってコードされる第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含むレンチウイルスベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法に使用して、患者の自家Ｔ細胞を遺伝子修飾させて、腫瘍抗原に特異的なＣＡＲを発現させることができる。さらなる実施形態では、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで拡張させ、患者に再注入させる。いくつかの実施形態では、改変されたＴ細胞は、より特異的にがん細胞を標的とする。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ内で複製することができ、その結果、長期間の持続が得られる。
【0244】
本開示のレンチウイルスベクター、または本開示のレンチウイルスベクターを使用してｅｘ ｖｉｖｏで修飾された細胞の投与後、対象をモニタリングして、導入遺伝子の発現を検出することができる。治療の用量および期間は、治療対象の状態または疾患に応じて個別に決定される。本発明のベクターにおける目的の遺伝子の投与によって産生される遺伝子発現に基づいて、様々な状態または疾患を治療することができる。本発明の方法を使用して送達されるベクターの投与量は、宿主による所望の応答および使用されるベクターに応じて変化するであろう。
【0245】
一部の遺伝子療法用途では、遺伝子療法ベクターが特定の組織タイプに対して高い特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所定の細胞型に対する特異性を有するように修飾させ得る。リガンドは、目的の細胞型に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。
【0246】
本開示の特定の態様は、外因性核酸配列を生物のゲノムＤＮＡに挿入する方法に関し、本方法は、生物のゲノム内の特定のゲノムＤＮＡ配列を特定することと；本開示の核酸構築物を含むレンチウイルス粒子を生物に投与して、特定のゲノムＤＮＡ配列に結合させて、外因性核酸をゲノムＤＮＡに挿入することと、を含み、ここで、外因性核酸は、特定のゲノムＤＮＡ配列において、組み込まれる。
【0247】
本開示の特定の態様は、単一コピーまたは複数コピーの外因性核酸配列の細胞への制御された部位特異的組み込みのための方法に関し、本方法は、ａ）本開示の核酸構築物、ベクター、または第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を細胞に送達することと、ｂ）外因性核酸を細胞に送達することと、を含み、ここで、第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）が、細胞のゲノム内で、特定のゲノムＤＮＡ配列に結合することにより、ゲノムの切断および外因性核酸の１つ以上のコピーの細胞のゲノムへの組み込みが生じる。いくつかの態様では、細胞への送達は、レンチウイルス粒子によって行われる。
【0248】
いくつかの戦略を使用して、組み込み部位を試験して、指向性組み込みに最適な機構をスクリーニングできる。
【0249】
本明細書に開示される修飾トランスポゾンの分析には、プロモーター、ＧＦＰのコード配列の半分、およびゲノム内の標的挿入部位の下流にスプライス部位ドナーを有するレポーター細胞株を使用することができる。例えば、レンチウイルスペイロードには、融合インテグラーゼバリアントを有し、その後に逆位スプライス部位アクセプターおよびＧＰＦの残りの半分を有することができる。ＧＦＰの発現は、直接挿入が起こり、ＧＦＰ含有ｍＲＮＡが、挿入部位および組み込まれたペイロードから生成され、このｍＲＮＡのスプライシングによって完全なＧＦＰ ＣＤＳがもたらされるときに生じる。
【0250】
ＶＰＲトランス相補システムは、組み込み変異体のスクリーニングおよび比較にも使用され得る。トランス相補システムは、発現して、粒子にロードされたときに、自身の組み込みを促進する融合インテグラーゼバリアントを含むレンチウイルスペイロードの標的挿入に使用でき、ＶＰＲ融合を使用してウイルス粒子にロードされるであろう。これは、粒子の産生に使用されるパッケージングベクター内にコードされた組み込み欠陥ＩＮをトランスで補完する。ＩＣまたはＦＩＳＨプローブなど、組み込みマッピングに使用できる他の方法。標的挿入は、ＴＣＲａまたはＲＦＰ標的破壊、または標的スプライス部位組み込みによるＧＦＰ活性化によってスクリーニングすることもできる。
【0251】
クロマチン内の挿入領域および標的領域を同時染色するＦＩＳＨアプローチでは、Ｈｅｋ２９３Ｔゲノム内の目的のトランスポゾン遺伝子の場所を特定するための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが実施され得る。Ｈｅｋ２９３Ｔは、１）ＧＯＩ－トランスポゾン、２）プログラム可能なトランスポザーゼ、および３）ｇＲＮＡを用いて、ＰＰＰ１Ｒ１２にトランスフェクトされ得る。プローブは、ＰＰＰ１Ｒ１２遺伝子、ＣＤ４６遺伝子（陰性対照として）、およびＧＯＩを標的とするように設計されており、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡからＮｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ）を使用して合成され得る。
【0252】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾されたトランスポザーゼを含む第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）は、例えばＧｅｎｅｔｒａｐアッセイによって決定したときに、野生型トランスポザーゼ（または対応する野生型トランスポザーゼを含む融合タンパク質）と比較して、ゲノムへの外因性核酸の挿入の特異性が改善される。いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または任意の他の許容可能な細胞は、以下のプラスミドまたはペイロードを有するレンチウイルス粒子でトランスフェクトまたは形質導入される：（ｉ）ＤＮＡの特定の領域を標的とするｇＲＮＡを含むプラスミド、（ｉｉ）第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）をコードし、第２のタンパク質が修飾されたトランスポザーゼである、本開示の核酸構築物を含むプラスミド、および（ｉｉｉ）プロモーターを欠くレポータータンパク質、例えば、ＧＦＰをコードする核酸配列を含むｇｅｎｅｔｒａｐプラスミド。いくつかの実施形態では、ｇｅｎｅｔｒａｐプラスミドは、逆方向反復を有するトランスポゾンをさらに含む。
【0253】
いくつかの実施形態では、ＧＦＰ挿入を含む細胞のパーセントは、フローサイトメトリーによって決定することができる。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質が修飾されたトランスポザーゼである第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）は、対応する野生型タンパク質と比較して、ＧＦＰの挿入を含む細胞のパーセントを少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％増加させる。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質が修飾されたトランスポザーゼである第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）は、ＧＦＰの挿入を含む細胞のパーセントを約１５～３０％増加させる。
【0254】
いくつかの実施形態では、標的部位での挿入のパーセントおよび標的部位でのカバー率（挿入部位あたりのリード数）は、ゲノムＤＮＡ抽出およびウイルスＬＴＲに特異的なオリゴヌクレオチドを用いた標的配列決定によって決定することができる。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質が修飾されたトランスポザーゼである第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）は、対応する野生型タンパク質と比較して、標的部位での挿入のパーセントを少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加させる。いくつかの実施形態では、標的部位での挿入のパーセントは、約１０～１００倍増加する。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質が修飾されたトランスポザーゼである第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）は、対応する野生型タンパク質と比較して、標的部位におけるカバー率（挿入部位あたりのリード数）を、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１６０倍、少なくとも１７０倍、少なくとも１８０倍、少なくとも１９０倍、または少なくとも２００倍増加させる。いくつかの実施形態では、標的部位におけるカバー率（挿入部位あたりのリード数）は、少なくとも１００倍である。
【0255】
いくつかの実施形態では、標的部位での挿入のパーセントおよび標的部位でのカバー率（挿入部位あたりのリード数）は、ゲノムＤＮＡ抽出およびウイルス挿入ＬＴＲに特異的なオリゴヌクレオチドを用いた標的配列決定によって決定することができる。
【0256】
本開示の第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含むレンチウイルスベクターの可能な用途としては、遺伝子療法、すなわち任意の哺乳動物細胞、特にヒト細胞における遺伝子導入が含まれる。これは、分裂細胞または静止細胞、肝臓、膵臓、筋肉、心臓などの中心器官または末梢器官に属する細胞であり得る。遺伝子療法により、神経栄養因子、酵素、転写因子、受容体などのタンパク質の発現が可能になり得る。本発明によるレンチウイルスベクターは、研究目的にも特に好適であり得る。
【0257】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物、第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）、および／またはレンチウイルスベクターは、疾患を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝子療法の恩恵を受けることができる遺伝性障害である。
【0258】
いくつかの実施形態では、第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）、またはそれらをコードする核酸構築物、または以下に開示されるキットもしくは組成物、または第１および第２のタンパク質（別々に、または上記の融合タンパク質の一部として）を含むレンチウイルスベクター、または本開示による核酸構築物は、医薬品として使用することができる。
【0259】
本開示によるレンチウイルスベクターは、対象における遺伝性疾患を治療するのに特に好適であり得る。
【0260】
本発明は、
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ、
（ｉｉ）トランスポザーゼ、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸、を含む組成物にも関し、
ここで、トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃである。
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ、
（ｉｉ）トランスポザーゼ、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸、を含む組成物にも関し、
ここで、トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃである。
【0261】
一実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異は、アミノ酸置換Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎを含む。
【0262】
好ましい実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異は、アミノ酸置換Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎを含まない。
【0263】
いくつかの実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異は、以下のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含み：Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３８８Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｗ４６５Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｖ３４Ｍ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｔ４３Ｉ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ａ４１１Ｔ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２Ｇ、位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する。
【0264】
好ましい実施形態では、修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異は、以下のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含み：Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７７Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５７３Ａ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｓ２３０Ｎ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｇ３２５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｓ３５１Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ、Ｙ１７７Ｈ／Ｒ２７５Ａ／Ｇ３２５Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｓ５９２Ｇ、位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する。
【0265】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＳａＣａｓ９タンパク質である。
【0266】
本発明はまた、以下をコードする核酸を含む組成物にも関する：
（ｉ）上記のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ、
（ｉｉ）上記のトランスポザーゼ、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
（ｉ）上記のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ、
（ｉｉ）上記のトランスポザーゼ、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
【0267】
いくつかの実施形態では、組成物の核酸は、好適な発現ベクターを介して細胞内で発現する。本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターとしては、コスミド、プラスミド（例えば、裸であるかまたはリポソームに含まれる）、および組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野で公知であるすべてのものが含まれる。
【0268】
好ましい実施形態では、２つの核酸は、同じ細胞または細胞集団内で共発現される。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、同時に共発現される。別の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸が最初に発現する。別の実施形態では、トランスポザーゼをコードする核酸が最初に発現する。
【0269】
本発明は、以下を含む組成物にもさらに関する：
（ｉ）本明細書に開示されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスポザーゼを含む融合タンパク質、またはそれをコードする核酸、
（ｉｉ）本明細書に開示されるトランスポザーゼ、またはそれをコードする核酸、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
（ｉ）本明細書に開示されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスポザーゼを含む融合タンパク質、またはそれをコードする核酸、
（ｉｉ）本明細書に開示されるトランスポザーゼ、またはそれをコードする核酸、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
【0270】
本発明は、以下を含む組成物にもさらに関する：
（ｉ）本明細書に開示されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスポザーゼを含む第１の融合タンパク質、またはそれをコードする核酸、
（ｉｉ）少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合するように操作されたＲＮＡ結合タンパク質と、本明細書に開示されるトランスポザーゼ、またはそれをコードする核酸とを含む第２の融合タンパク質、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
（ｉ）本明細書に開示されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスポザーゼを含む第１の融合タンパク質、またはそれをコードする核酸、
（ｉｉ）少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合するように操作されたＲＮＡ結合タンパク質と、本明細書に開示されるトランスポザーゼ、またはそれをコードする核酸とを含む第２の融合タンパク質、
（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
【0271】
本開示は、本明細書に記載の開示された方法を実施するための組成物も提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示で定義される核酸構築物またはベクター、およびパッケージングベクターに含まれるかまたは結合される、ゲノムに挿入するための外因性核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【0272】
本開示はさらに、以下を含む組成物に関する：
（ｉ）本明細書に開示されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスポザーゼを含む融合タンパク質、またはこの融合タンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｉｉ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
（ｉ）本明細書に開示されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスポザーゼを含む融合タンパク質、またはこの融合タンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｉｉ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
【0273】
特定の実施形態では、目的の核酸または遺伝子は、典型的には５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する大きいＤＮＡ断片である。
【0274】
また、本開示により、本明細書に記載の開示された方法を実施するためのキットも提供される。キットは、本明細書に記載の核酸構築物または融合タンパク質を含むことができる。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載の核酸構築物または融合タンパク質を含むレンチウイルス粒子を含むことができる。
【0275】
本キットは、本発明の方法を実践するためにキットの構成要素を使用するための指示書をさらに含むことができる。本発明の方法を実践するための指示書は、通常、好適な記録媒体に記録される。例えば、指示書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷され得る。したがって、指示書は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素のラベル（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに関連する）内に存在し得る。他の実施形態では、指示書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示書は、キット内に存在しないが、遠隔ソースから、例えばインターネットを介して指示書を得るための手段が提供される。この実施形態の一例は、指示書を閲覧できる、および／または指示書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るためのこの手段も適切な基材に記録される。
【0276】
本開示は、典型的には、以下を含むキットに関する：
第１の組成物であって、
（ｉ）第１の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第１の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７０のＳｐＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、本明細書で定義される第１の融合タンパク質、または第１の融合タンパク質をコードする核酸、および
（ｉｉ）第１の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第１の組成物と、
第２の組成物であって、
（ｉｉｉ）第２の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第２の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７６のＳａＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、本明細書で定義される第２の融合タンパク質、または第２の融合タンパク質をコードする核酸、および
（ｉｖ）第２の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第２の組成物と、
任意により、ゲノムに挿入するための核酸、例えば５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する核酸、
ここで、第１および第２の融合タンパク質は、ヘテロ二量体化を形成し、ゲノムＤＮＡ領域の隣接部位で第１および第２の誘導型ＲＮＡによって決定される二重切断を形成することができ、任意により隣接部位間に核酸を挿入することができる。
第１の組成物であって、
（ｉ）第１の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第１の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７０のＳｐＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、本明細書で定義される第１の融合タンパク質、または第１の融合タンパク質をコードする核酸、および
（ｉｉ）第１の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第１の組成物と、
第２の組成物であって、
（ｉｉｉ）第２の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第２の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７６のＳａＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、本明細書で定義される第２の融合タンパク質、または第２の融合タンパク質をコードする核酸、および
（ｉｖ）第２の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第２の組成物と、
任意により、ゲノムに挿入するための核酸、例えば５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する核酸、
ここで、第１および第２の融合タンパク質は、ヘテロ二量体化を形成し、ゲノムＤＮＡ領域の隣接部位で第１および第２の誘導型ＲＮＡによって決定される二重切断を形成することができ、任意により隣接部位間に核酸を挿入することができる。
【0277】
特定の実施形態では、組成物またはキットは、ミニサークル、プラスミドまたはウイルスベクター、特に非組み込みウイルスベクター、例えば非組み込みレンチウイルスベクター中に外因性核酸を含む。
【0278】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物またはキットは、ナノ粒子中に含まれる。
【0279】
特定の実施形態では、本組成物は、以下を含む核酸組成物である：
（ｉ）本明細書に開示される融合タンパク質をコードする核酸構築物、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｉｉ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
（ｉ）本明細書に開示される融合タンパク質をコードする核酸構築物、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、および
（ｉｉｉ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸。
【0280】
特定の実施形態では、本キットは、以下を含む：
・（ｉ）本明細書に開示される第１の融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、第１の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第１の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７０のＳｐＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、核酸構築物、および
（ｉｉ）第１の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第１の組成物と、
・（ｉｉｉ）本明細書に開示される第２の融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、ここで、第２の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第２の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７６のＳａＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、核酸構築物、および
（ｉｖ）第２の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第２の組成物。
・（ｉ）本明細書に開示される第１の融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、第１の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第１の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７０のＳｐＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、核酸構築物、および
（ｉｉ）第１の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第１の組成物と、
・（ｉｉｉ）本明細書に開示される第２の融合タンパク質をコードする核酸構築物であって、ここで、第２の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第２の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７６のＳａＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、核酸構築物、および
（ｉｖ）第２の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第２の組成物。
【0281】
特定の実施形態では、キットまたは組成物は、特にヒトにおける障害の治療において、例えば、それを必要とするヒト対象における遺伝子欠損を治療するための薬物として使用するためのものである。
【0282】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、送達方法に応じて、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質の形態であり、外因性核酸をコードするポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態である。特に、外因性核酸をコードするポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡの形態である。
【0283】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、ウイルスを含まず、パッケージングベクターは、ナノ粒子、例えばポリマーまたは脂質ナノ粒子である。パッケージングベクターは、組成物のエレメントに結合する担体であってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、特にレンチウイルス粒子に含まれる。
【0284】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、（ａ）ＲＮＡの形態の本明細書に記載の核酸構築物（例えば、Ｃａｓ９およびトランスポザーゼを含む）、（ｂ）必要に応じてガイドＲＮＡ（例えば、別個の直鎖一本鎖ＲＮＡ分子として）、および（ｃ）パッケージングベクターに含まれるか、パッケージングベクターに結合した、ＤＮＡ形態（例えばベクター）で挿入するための外因性遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
【0285】
いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）タンパク質の形態の本明細書に記載の融合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９およびトランスポザーゼを含む）、（ｂ）必要に応じてガイドＲＮＡ（例えば、別個の直鎖一本鎖ＲＮＡ分子として）であって、ここで、融合タンパク質およびガイドＲＮＡはリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する、ガイドＲＮＡ、および（ｃ）パッケージングベクターに含まれるかまたはパッケージングベクターに結合する、ＤＮＡ形態（例えばベクター）で挿入するための外因性遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
【0286】
いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）ＤＮＡの形態の本明細書に記載の核酸構築物（例えば、Ｃａｓ９およびトランスポザーゼを含む）、（ｂ）必要に応じてガイドＲＮＡ（例えば、別個の直鎖ＲＮＡ分子として、またはベクター内のＤＮＡとして）、および（ｃ）パッケージングベクターに含まれる、またはパッケージングベクターに結合する、ＤＮＡ形態（例えばベクター）で挿入するための外因性遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
【0287】
いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）タンパク質の形態の本明細書に記載の融合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９およびインテグラーゼを含む）、（ｂ）必要に応じてガイドＲＮＡ（例えば、融合タンパク質と複合体を形成する別個のＲＮＡ分子として）、および（ｃ）パッケージングベクターに含まれるか、パッケージングベクターに結合した、挿入するための外因性遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、パッケージングベクターは、レンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、（ａ）融合タンパク質は、ｇａｇ－ｐｏｌまたはＶＰＲ（ウイルスタンパク質Ｒ）によってレンチウイルスカプシドに結合される。いくつかの実施形態では、（ｃ）ポリヌクレオチドは、インテグラーゼのペイロードとしてのＲＮＡの形態である。
【0288】
特定の実施形態では、ＺＦＰが使用される場合、（ｂ）ガイドＲＮＡは必要とされ得ない。
【0289】
本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合するように操作されたＲＮＡ結合タンパク質、ゲノムへの外因性核酸の挿入を可能にするＤＮＡ結合タンパク質、および第１のタンパク質と第２のタンパク質をつなぐリンカーを含む融合タンパク質、
（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質、および
（ｉｉｉ）融合タンパク質の結合のための少なくとも１つの特異的なＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ、
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸、を含む組成物であって、
ここで、ＤＮＡ結合タンパク質は、本開示の修飾されたトランスポザーゼであり、典型的には、未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異、および配列番号９による未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃである、組成物にもさらに関する。
（ｉ）少なくとも１つの特定のＲＮＡ配列に結合するように操作されたＲＮＡ結合タンパク質、ゲノムへの外因性核酸の挿入を可能にするＤＮＡ結合タンパク質、および第１のタンパク質と第２のタンパク質をつなぐリンカーを含む融合タンパク質、
（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質、および
（ｉｉｉ）融合タンパク質の結合のための少なくとも１つの特異的なＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ、
（ｉｖ）目的の核酸または遺伝子、例えばゲノムに挿入するための外因性核酸、を含む組成物であって、
ここで、ＤＮＡ結合タンパク質は、本開示の修飾されたトランスポザーゼであり、典型的には、未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異、および配列番号９による未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃである、組成物にもさらに関する。
【0290】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ＭＣＰ）である。
【0291】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＭＣＰによって認識される少なくとも１つのＲＮＡ配列は、テトラループである。本明細書で使用される場合、用語「テトラループ」は、用語「ステムループ」および「ヘアピンループ」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡテトラループは、ＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列である。
【0292】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つのＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つ以上のＭＳ２ ＲＮＡテトラループ結合配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「２つ以上」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれ以上を意味する。
【0293】
様々な実施形態が特許請求の範囲に記載されている。いくつかの追加の実施形態を以下に開示する。
【0294】
Ｅ１．
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼからなる第１のタンパク質と、
（ｉｉ）トランスポザーゼからなる第２のタンパク質と、
（ｉｉｉ）任意により、第１のタンパク質と第２のタンパク質とをつなぐリンカーと、を含み、
ここで、前記トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃであり、
前記第１のタンパク質は、前記第２のタンパク質のＣ末端部に直接的に、またはリンカーを介して間接的に融合されている、融合タンパク質。
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼからなる第１のタンパク質と、
（ｉｉ）トランスポザーゼからなる第２のタンパク質と、
（ｉｉｉ）任意により、第１のタンパク質と第２のタンパク質とをつなぐリンカーと、を含み、
ここで、前記トランスポザーゼは、配列番号９の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃであり、
前記第１のタンパク質は、前記第２のタンパク質のＣ末端部に直接的に、またはリンカーを介して間接的に融合されている、融合タンパク質。
【0295】
Ｅ２．前記トランスポザーゼが、未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、切除活性を増大させるための１つ以上のアミノ酸変異、および未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、ＤＮＡ結合活性を低下させるための１つ以上のアミノ酸変異を含む、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃである、実施形態１に記載の融合タンパク質。
【0296】
Ｅ３．切除活性を増大させるための前記１つ以上のアミノ酸変異が、アミノ酸位置番号［１９４～２００］、［２１４～２２２］、［４３４～４４２］または［４４６～４５６］、例えば、位置Ｄ１９８、Ｄ２０１、Ｒ２０２、Ｍ２１２またはＳ２１３におけるアミノ酸置換（位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する）によって画定される領域内のアミノ酸変異の中から選択される、実施形態２に記載の融合タンパク質。
【0297】
Ｅ４．前記１つ以上のアミノ酸変異が、Ｍ１９４またはＤ４５０の位置で切除活性を増大させる前記アミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃの前記アミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｍ１９４Ｖおよび／またはＤ４５０Ｎの中から選択される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0298】
Ｅ５．前記１つ以上のアミノ酸変異は、位置Ｒ３７２、Ｋ３７５、Ｒ３７６、Ｅ３７７、および／またはＥ３８０におけるＤＮＡ結合活性を低下させるアミノ酸置換の中から選択され、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応し、好ましくはアミノ酸置換Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａの中から選択される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0299】
Ｅ６．前記修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃが、位置Ｄ４５０での切除活性を増大させるための少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに位置Ｒ３７２およびＫ３７５においてＤＮＡ結合活性を低下させるための少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、前記高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃの修飾されたトランスポザーゼは、三重変異Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２ＡおよびＫ３７５Ａを含み、位置番号は、配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのアミノ酸番号に対応する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0300】
Ｅ７．前記修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃが、アミノ酸位置番号［１５８～１６９］によって画定される領域に少なくとも１つの変異、例えばＡ１６６Ｓおよび／または位置Ｙ５２７、Ｒ５１８、Ｋ５２５、Ｎ４６３において少なくとも１つの変異をさらに含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0301】
Ｅ８．前記修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃが、配列番号１の前記修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0302】
Ｅ９．前記修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃが、１つ以上のアミノ酸置換、典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下のアミノ酸置換を有する配列番号１の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃのバリアントである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0303】
Ｅ１０．前記修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃが、位置番号２４５、２６８、２７５、２７７、２８７、２９０、３１５、３２５、３４１、３４６、３４７、３５０、３５１、３５６、３５７、３８８、４０９、４１２、４３２、４４７、４６０、４６１、４６５、５１７、５６０、５６４、５７１、５７３、５７６、５８６、５８７、５８９、５９２、および／または５９４において、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含み、位置番号は、前記高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列の前記アミノ酸番号（配列番号９）に対応する、実施形態１～９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0304】
Ｅ１１．前記修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異が、以下のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含み：Ｒ２４５Ａ、Ｄ２６８Ｎ、Ｒ２７５Ａ、Ｒ２７７Ａ、Ｋ２８７Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｋ２８７Ａ／Ｋ２９０Ａ、Ｒ３１５Ａ、Ｇ３２５Ａ、Ｒ３４１Ａ、Ｄ３４６Ｎ、Ｎ３４７Ａ、Ｎ３４７Ｓ、Ｔ３５０Ａ、Ｓ３５１Ｅ、Ｓ３５１Ｐ、Ｓ３５１Ａ、Ｋ３５６Ｅ、Ｎ３５７Ａ、Ｒ３８８Ａ、Ｋ４０９Ａ、Ｋ４１２Ａ、Ｋ４３２Ａ、Ｄ４４７Ａ、Ｄ４４７Ｎ、Ｄ４５０Ｎ、Ｒ４６０Ａ、Ｋ４６１Ａ、Ｗ４６５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｔ５６０Ａ、Ｓ５６４Ｐ、Ｓ５７１Ｎ、Ｓ５７３Ａ、Ｋ５７６Ａ、Ｈ５８６Ａ、Ｉ５８７Ａ、Ｍ５８９Ｖ、Ｓ５９２Ｇ、またはＦ５９４Ｌ、Ｄ４５０Ｎ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ、Ｋ４０９Ａ／Ｋ４１２Ａ、Ｒ４６０Ａ／Ｋ４６１Ａ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２ＧおよびＲ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ、位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応する、実施形態１０に記載の融合タンパク質。
【0305】
Ｅ１２．前記修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ変異が、以下のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含み：Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｍ１９４Ｖ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ１９４Ｖ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ、Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３８８Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｗ４６５Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ；位置番号は、高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃ配列のアミノ酸番号（配列番号９）に対応し、典型的には、前記修飾されたトランスポザーゼは、配列番号１～８および１０～１８のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態１０に記載の融合タンパク質。
【0306】
Ｅ１３．前記リンカーが、ＸＴＥＮ配列またはＧＧＳ配列、好ましくはＸＴＥＮ配列を含むペプチドリンカーである、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0307】
Ｅ１４．前記リンカーが、典型的には配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１のいずれかから選択される、３～５０アミノ酸長を有するペプチドリンカーである、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0308】
Ｅ１５．前記第１のタンパク質が、活性ＤＮＡ切断ドメインおよびガイドＲＮＡ結合ドメインを含むＣａｓ９タンパク質である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0309】
Ｅ１６．前記第１のタンパク質が、活性ＤＮＡ切断ドメインおよびガイドＲＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼタンパク質であり、配列番号３１の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９、配列番号７２のＳａＣａｓ９、配列番号７４のＣｐｆ１、配列番号２９のＣｊＣａｓ９、配列番号７０のＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、配列番号７５のＣａｓＸまたは配列番号７６のＳａＣａｓ９ニッカーゼに対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、または少なくとも１００％の同一性を有する、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0310】
Ｅ１７．前記第１のタンパク質が、配列番号７２のＳａＣａｓ９または配列番号３１の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９からなる群から選択されるＣａｓ９タンパク質である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0311】
Ｅ１８．
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはニッカーゼからなる第１のタンパク質と、
（ｉｉ）第１のトランスポザーゼからなる第２のタンパク質と、
（ｉｉｉ）第２のトランスポザーゼからなる第３のタンパク質と、
（ｉｖ）任意により、第１および第２のタンパク質と第２および第３のタンパク質との間のペプチドリンカーと、を含む三重融合タンパク質であって、
前記第１および第２のトランスポザーゼが、例えば実施形態３～１２のいずれか１つに記載のとおり、同一のまたは異なる修飾されたＰｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼの配列を有する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはニッカーゼからなる第１のタンパク質と、
（ｉｉ）第１のトランスポザーゼからなる第２のタンパク質と、
（ｉｉｉ）第２のトランスポザーゼからなる第３のタンパク質と、
（ｉｖ）任意により、第１および第２のタンパク質と第２および第３のタンパク質との間のペプチドリンカーと、を含む三重融合タンパク質であって、
前記第１および第２のトランスポザーゼが、例えば実施形態３～１２のいずれか１つに記載のとおり、同一のまたは異なる修飾されたＰｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼの配列を有する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0312】
Ｅ１９．前記第１のタンパク質が、配列番号３３のジンクフィンガータンパク質である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0313】
Ｅ２０．
（ｉ）実施形態１～１９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡと、
（ｉｉｉ）ゲノムに挿入するための外因性核酸と、を含む組成物。
（ｉ）実施形態１～１９のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡと、
（ｉｉｉ）ゲノムに挿入するための外因性核酸と、を含む組成物。
【0314】
Ｅ２１．前記外因性核酸が、典型的には５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する大きいＤＮＡ断片である、実施形態２０に記載の組成物。
【0315】
Ｅ２２．キットであって、
（ｉ）
－実施形態１または１８のいずれか１つに記載の第１の融合タンパク質、または前記第１の融合タンパク質をコードする核酸であって、前記第１の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第１の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７０のＳｐＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、第１の融合タンパク質、または前記第１の融合タンパク質をコードする核酸、および
－第１の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）
－実施形態１～１８のいずれか１つに記載の第２の融合タンパク質、または第２の融合タンパク質をコードする核酸であって、第２の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第２の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７６のＳａＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、第２の融合タンパク質、または第２の融合タンパク質をコードする核酸、および
－第２の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）
任意により、ゲノムに挿入するための外因性核酸、例えば５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する外因性核酸と、を含み、
ここで、前記第１および第２の融合タンパク質は、ヘテロ二量体化を形成し、ゲノムＤＮＡ領域の隣接部位で前記第１および第２の誘導型ＲＮＡによって決定される二重切断を形成することができ、任意により前記隣接部位間に前記外因性核酸を挿入することができる、キット。
（ｉ）
－実施形態１または１８のいずれか１つに記載の第１の融合タンパク質、または前記第１の融合タンパク質をコードする核酸であって、前記第１の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第１の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７０のＳｐＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、第１の融合タンパク質、または前記第１の融合タンパク質をコードする核酸、および
－第１の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）
－実施形態１～１８のいずれか１つに記載の第２の融合タンパク質、または第２の融合タンパク質をコードする核酸であって、第２の融合タンパク質が、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃに融合された第２の誘導型ＲＮＡニッカーゼＣａｓ９、典型的には配列番号７６のＳａＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を含む、第２の融合タンパク質、または第２の融合タンパク質をコードする核酸、および
－第２の誘導型ＲＮＡ核酸を含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）
任意により、ゲノムに挿入するための外因性核酸、例えば５ｋｂ～２５ｋｂ、より好ましくは８ｋｂ～２０ｋｂのサイズを有する外因性核酸と、を含み、
ここで、前記第１および第２の融合タンパク質は、ヘテロ二量体化を形成し、ゲノムＤＮＡ領域の隣接部位で前記第１および第２の誘導型ＲＮＡによって決定される二重切断を形成することができ、任意により前記隣接部位間に前記外因性核酸を挿入することができる、キット。
【0316】
Ｅ２３．前記外因性核酸が、ミニサークル、プラスミドまたはウイルスベクター、特に非組み込みウイルスベクター、例えば非組み込みレンチウイルスベクター中に含まれる、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の組成物またはキット。
【0317】
Ｅ２４．前記組成物が、ナノ粒子中に含まれる、実施形態２０～２３のいずれか１つに記載の組成物またはキット。
【0318】
Ｅ２５．修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼであって、未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、切除活性を増大させるための少なくとも１つのアミノ酸変異、および／または未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較して、ＤＮＡ結合活性を低下させるための少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、
ここで、切除活性を増大させるための前記少なくとも１つの変異は、位置１９４におけるＭのアミノ酸置換、典型的にはＭ１９４Ｖである、および／またはＤＮＡ結合活性を低下させるための前記少なくとも１つのアミノ酸変異は、位置Ｒ３７６、Ｅ３７７、およびＥ３８０、典型的には、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａにおける前記アミノ酸置換の中から選択される、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼ。
ここで、切除活性を増大させるための前記少なくとも１つの変異は、位置１９４におけるＭのアミノ酸置換、典型的にはＭ１９４Ｖである、および／またはＤＮＡ結合活性を低下させるための前記少なくとも１つのアミノ酸変異は、位置Ｒ３７６、Ｅ３７７、およびＥ３８０、典型的には、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、および／またはＥ３８０Ａにおける前記アミノ酸置換の中から選択される、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼ。
【0319】
Ｅ２６．配列番号９の未修飾の高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃと比較したときに、以下の変異の組み合わせを含む、修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼ：Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３７６Ａ／Ｅ３７７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｍ１９４Ｖ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ１９４Ｖ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ、Ｓ３５１Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｋ３７５Ａ／Ｒ３８８Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｗ４６５Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｍ５８９Ｖ／Ｓ５９２Ｇ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｗ４６５Ａ／Ｍ５８９Ｖ、Ｒ２７５Ａ／３２５Ａ／Ｒ３７２Ａ／Ｔ５６０Ａ、Ｎ３４７Ａ／Ｄ４５０Ｎ、Ｎ３４７Ｓ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５７３Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２０２Ｋ／Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｋ３７５Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｓ５９２Ｇ、Ｒ２７５Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ／Ｒ２７７Ａ／Ｎ３４７Ｓ／Ｒ３７２Ａ／Ｄ４５０Ｎ／Ｔ５６０Ａ／Ｓ５６４Ｐ／Ｆ５９４Ｌ。
【0320】
Ｅ２７．以下からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異をさらに含む、実施形態２５または２６に記載の修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼ：位置２４５でＡであるアミノ酸、位置２７５でＲまたはＡであるアミノ酸、位置２７７でＲまたはＡであるアミノ酸、位置３２５でＡまたはＧであるアミノ酸、位置３４７でＮまたはＡであるアミノ酸、位置３５１でＥ、Ｐ、またはＡであるアミノ酸、位置３７２でＲであるアミノ酸、位置３７５でＡであるアミノ酸、位置４５０でＤまたはＮであるアミノ酸、位置４６５でＷまたはＡであるアミノ酸、位置５６０でＴまたはＡであるアミノ酸、位置５６４でＰまたはＳであるアミノ酸、位置５７３でＳまたはＡであるアミノ酸、位置５９２でＧまたはＳであるアミノ酸、かつ位置５９４でＬまたはＦであるアミノ酸。
【0321】
Ｅ２８．配列番号９の未修飾の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の追加の修飾を含み、前記修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃが、配列番号９の高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃと比較して、ＤＮＡ結合活性の低下および／または切除活性の増大を示す、実施形態２５または２６の修飾された高活性型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ。
【0322】
Ｅ２９．実施形態１～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸、典型的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。
【0323】
Ｅ３０．配列番号１１０～１１２からなる群から選択される配列またはそれらの対応するｍＲＮＡ配列を含む、実施形態２８の融合タンパク質をコードする核酸。
【0324】
Ｅ３１．実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の修飾された高活性型Ｐｉｇｇｙｂａｃをコードする核酸。
【0325】
Ｅ３２．実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の核酸を含む発現ベクター。
【0326】
Ｅ３３．実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の核酸、または実施形態３２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【0327】
Ｅ３４．外因性核酸配列を細胞のゲノムに部位特異的に組み込むための方法であって、本方法は、
（ｉ）実施形態１～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の核酸、
（ｉｉ）前記細胞の前記ゲノムに組み込まれる外因性核酸、および
（ｉｉｉ）前記細胞の前記ゲノムへの前記外因性核酸の部位特異的組み込みを決定するためのガイドＲＮＡを含む組成物を前記細胞に送達することを含み；
前記融合タンパク質が、前記細胞の前記ゲノム内での前記特定のゲノムＤＮＡ配列に結合することにより、前記ゲノムの切断および前記ガイドＲＮＡによって決定される、前記細胞の前記ゲノムへの前記外因性核酸配列の部位特異的組み込みが生じる、方法。
（ｉ）実施形態１～１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の核酸、
（ｉｉ）前記細胞の前記ゲノムに組み込まれる外因性核酸、および
（ｉｉｉ）前記細胞の前記ゲノムへの前記外因性核酸の部位特異的組み込みを決定するためのガイドＲＮＡを含む組成物を前記細胞に送達することを含み；
前記融合タンパク質が、前記細胞の前記ゲノム内での前記特定のゲノムＤＮＡ配列に結合することにより、前記ゲノムの切断および前記ガイドＲＮＡによって決定される、前記細胞の前記ゲノムへの前記外因性核酸配列の部位特異的組み込みが生じる、方法。
【0328】
Ｅ３５．前記外因性核酸は、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、典型的には５～２５ｋｂ、好ましくは、８～２０ｋｂで構成されるサイズの核酸断片である、実施形態３４に記載の方法。
【0329】
Ｅ３６．前記外因性核酸は、遺伝性障害の欠損を修正するために、それを必要とする対象のゲノムに挿入される治療用導入遺伝子である、実施形態３４または３５に記載の方法。
【0330】
Ｅ３７．前記組成物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、典型的には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくは遺伝性障害を患うヒト対象から得られたヒト細胞において送達される、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の方法。
【0331】
Ｅ３８．前記組成物が、典型的には遺伝性障害の治療的処置のために、それを必要とする哺乳動物、例えばヒト対象にｉｎ ｖｉｖｏで送達される、実施形態３４～３７のいずれか１つに記載の方法。
【0332】
Ｅ３９．外因性核酸配列を生物のゲノムＤＮＡに挿入する方法であって、実施形態２０～２４のいずれか１つに記載の１つ以上の組成物またはキットを前記生物に投与することであって、これにより、前記１つ以上の組成物またはキットに含まれる前記融合タンパク質が、特定のゲノムＤＮＡ配列に結合し、前記組成物に含まれる前記外因性核酸の前記ゲノムＤＮＡへの挿入が可能になることを含み；
ここで、前記外因性核酸は、前記生物、例えば、それを必要とする非ヒト生物またはヒト対象の細胞の前記ゲノムの特定の部位に組み込まれる、方法。
実施例
ここで、前記外因性核酸は、前記生物、例えば、それを必要とする非ヒト生物またはヒト対象の細胞の前記ゲノムの特定の部位に組み込まれる、方法。
実施例
【0333】
プログラム可能なトランスポザーゼを実現するために、本発明者らの設計原理は、ＣＲＩＳＰＲシステムの正確なゲノム標的化と、挿入および切除活性の増強および標的ＤＮＡ結合活性の低下を呈するＰＢバリアントとを組み合わせることを試みた。本発明者らは、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９とＰＢトランスポザーゼとを融合することから開始した（図１）。ＰＢおよびＳｐＣａｓ９バリアントの多様なライブラリーを構築し（図２ａ、ｂ、ｃ）、ここでは、ＰＢバリアント、３つのＳｐＣａｓ９バリアント（ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９（ｃａｓ９）、ｄｅａｄ ＳｐＣａｓ９（ｄｃａｓ９）、ニッカーゼＳｐＣａｓ９（ｎｃａｓ９））、および６つのリンカー（４ｘＧＧＳ、５ｘＧＧＳ、７ｘＧＧＳ、８ｘＧＧＳ、ＸＴＥＮ、ＦＯＫＩ）のライブラリーを試験した。
【0334】
ＰＢトランスポザーゼの様々な部分を多様化させた。特に重点を置いたのは、トランスポザーゼと標的ＤＮＡの相互作用に関与する可能性のある１５個のアルギニンおよびリジン残基に囲まれた３個のアスパラギン酸残基（Ｄ２６８、Ｄ３４６、Ｄ４４７）の触媒トライアドによって形成される触媒コアドメインである１４。過去に調査した高活性型９に加えて、ＰＢの切除および組み込み活性に影響を与え得る追加の残基１５を多様化した（配列番号１～Ｎ）。最も性能の高い変異体を単離するために、オンターゲット組み込み時のエメラルドＧＦＰ（ｅｍＧＦＰ）再構成に基づいて、ターゲット遺伝子を挿入するための高感度レポーターシステムを開発した。スプライシングアクセプターが先行するプロモーターのないｅｍＧＦＰのＣ末端（Ｃ－ｔ）半分をＨｅｋ２９３Ｔ細胞のゲノムに挿入して、レポーター細胞株（Ｈｅｒｓｈｅｙと短縮される）を構築した。相補的な「挿入トラップレポーター」は、上流プロモーターおよびｅｍＧＦＰのＮ末端（Ｎ－ｔ）の最初の半分、その後のスプライスドナー、そしてこれらすべてをＰＢ逆方向反復が隣接するようにコードし、構築された。特異的なｇＲＮＡ誘導型ｃａｓ９は、ＰＢにＮ－ｔ半分をＣ－ｔ半分に隣接して挿入するように指示し、得られた転写産物のスプライシングにより、緑色蛍光の生成が生じる（図３）。ｃａｓ９－ＰＢキメラタンパク質のライブラリーを構築し、「挿入トラップレポーター」およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に、Ｈｅｒｓｈｅｙレポーターを含む細胞にトランスフェクトした。より高度にプログラム可能な挿入を示すバリアントを、同じレポーター細胞株を使用して、別々に試験した（図２ａ、２ｂ、４ａ、４ｂ）。このアッセイでは、ｅｍＧＦＰのＮ－ｔ半分および上流に完全なＲＦＰ配列を含む二重トランスポゾンを使用して、オンターゲット活性（ｅｍＧＦＰ陽性細胞）および総転位活性（ＲＦＰ陽性細胞）を試験した。オンターゲット対オフターゲットの比は、ＲＦＰ陽性細胞の総パーセンテージ（総挿入活性）に対して、ｅｍＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（オンターゲット活性）を除算することによって計算した。
【0335】
Ｈｅｒｓｈｅｙ細胞株中でのオンターゲットおよびオフターゲット転位について、ＰＢバリアントに融合させたｃａｓ９バリアントの様々な組み合わせを試験した。ｉ）無傷のヌクレアーゼ活性を有するｃａｓ９（図２Ａ）、およびｉｉ）切除活性が増大およびｉｉｉ）ｔ－ＤＮＡ結合活性が低下したＰＢバリアント（図２Ｂ；図４Ａ、図４Ｂ）を含むＮｔｅｒ－ｃａｓ９－ＰＢ－Ｃｔｅｒ融合体において、最高レベルのプログラム可能な挿入が観察された。正確かつ効率的な標的挿入を達成するには、３つのパラメーターすべてが重要であることが観察された。第１に、ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性の要件は、ＰＢに融合したｎｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）およびｄｃａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）による標的挿入の効率が著しく低いことによって示された（図２Ａ）。標的化組み込みの促進におけるｃａｓ９の二本鎖破断（ＤＳＢ）活性の役割をさらに調べるために、トランスポゾンの指向性局在化のためにジンクフィンガー－ＰＢ融合体を使用することによって、オンサイトターゲティングとＤＳＢ活性を分離し、独立したＣａｓ９ヌクレアーゼによりオンサイトＤＳＢで補完した。Ｚｎｆ－ＰＢ融合体は、標的挿入活性を全く示さないか、または非常に低い標的挿入活性を呈したが、ｇＲＮＡ誘導型ｃａｓ９を用いて、Ｚｎｆ結合部位の近くに、ＤＳＢを導入することと組み合わせることにより回復した（図５）。これらの結果は、ＰＢ近傍でのｃａｓ９によるＤＳＢの生成がＰＢの挿入活性を促進し、挿入部位における標準的なＴＴＡＡの要件を回避するメカニズムと一致する。実際、ｃａｓ９－ＰＢ挿入部位の分析では、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が、標的部位近くの小インデルの存在によって破壊されることが示された（図６）。この破壊の重要な結果は、ＰＢによる組み込みメカニズムの不可逆性である。ＩＴＲまたはＴＴＡＡが破壊されることによりトランスポゾンの可動性は、排除されるかまたは減少する１６。このメカニズムが、ｃａｓ９－ＰＢによるプログラム可能な挿入の効率に寄与している可能性が高く、ｃａｓ９の「検索」および「カット」活性と修飾されたＰＢの「ペースト」活性との組み合わせが、高レベルの精度に寄与する。第２に、高切除ＰＢ変異体は、より高度なプログラム可能な挿入に寄与していると考えられる（Ｄ４５０Ｎ、Ｍ１９４Ｖ；図２Ｂ、図４Ａ、図４Ｂ）。この切除の増強は、組み込みのために準備されたドナーＤＮＡ基質が増加した結果であり得る。さらに、好ましい切除基質が破壊されることにより、より高い切除活性を有するＰＢ変異体であっても十分な切除が妨げられ得る（図６）。第３に、ｔ－ＤＮＡ結合が減少しているＰＢ変異体は、最低のオフターゲットレベルをもたらした（図２Ｂ、図４Ａ、図４Ｂ）。この結果は、ＰＢ単独の挿入活性を不活性化するｃａｓ９－ＰＢ融合におけるｃａｓ９の配列特異的ＤＮＡ結合によって補完されるＰＢによる固有の非特異的ＤＮＡ結合の減少と一致している（図７）。
【0336】
ゲノムガイドアプローチを使用すると、Ｇｕｉｄｅ－ｓｅｑ１７ベースのプロトコルの修飾型を使用して、プログラム可能なトランスポザーゼ挿入部位およびオフターゲットレベルの特徴を明らかにすることができた（図８Ａ）。検出されたオンターゲット挿入はいずれもＴＴＡＡ部位では起こらず、ｃａｓ９によって生成されたＤＳＢ部位への組み込みがさらに明らかになり、結果として好ましい切除基質の喪失がもたらされた（図８Ｂ）。さらに、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするプログラム可能なトランスポザーゼ技術により修飾された細胞に対してＧｕｉｄｅ－ｓｅｑ解析を実施する。１～１０％の感度で、オンターゲットのすべての挿入を検出した（図９）。
【0337】
ｃａｓ９ベースのＨＤＲなどの正確な遺伝子送達のための現在の方法を使用してプログラム可能なトランスポザーゼ技術をベンチマークした（図１０）。プログラム可能なトランスポザーゼは、より高い効率を示し、大きいペイロードではギャップが拡大する。最良の変異体は、ＨＤＲよりも２倍の効率および高精度で挿入（最大８ｋｂ）を達成した。また、プログラム可能なトランスポザーゼと、Ｃａｓ９を触媒的に死んだ型のＰＢに融合させたＨＩＴＩバリアントと比較した。これは、ＳＢ１００トランスポザーゼのＤＮＡ結合ドメインを使用した同様のアプローチによって最近示唆されているように、ＤＮＡを挿入部位に動員するのに助けになり得る。プログラム可能なトランスポザーゼは、代替の補助ＨＩＴＩ法と比較して、２倍高い効率を呈する（図１８）。Ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルでプログラム可能なトランスポザーゼ活性を示すことを目的として、プログラム可能なトランスポザーゼのｍＲＮＡ型を構築した。ｉｎ ｖｉｖｏ ＪｅｔＰＥＩ試薬を使用して、Ｒｏｓａ２６ゲノムのセーフハーバーを標的としたプログラム可能なトランスポザーゼをマウス肝臓に送達し、内因性遺伝子と比較して導入遺伝子のコピー数が多いことが観察され（図１１）、導入遺伝子の発現を経時的に維持した（図２０）。
【0338】
要約すると、ＣＲＩＳＰＲ分子の認識、および修飾されたＰＢのＤＮＡカットアンドペースト活性による切断を組み合わせて、正確かつ効率的な遺伝子送達を実施するための効率的なツールを生成した。この技術は、ペイロードのサイズに合わせて非常に十分に拡張される。Ｈｅｋ２９３Ｔおよびマウス肝臓におけるその有効性を示した。プログラム可能なトランスポザーゼ技術を、高度な治療および他の用途のための治療遺伝子送達のための汎用プラットフォームとして構想している。
【0339】
ｈｙＰＢに融合させたＣａｓバリアントの結果
プログラム可能な転位を行うために操作されたｈｙＰＢの能力の特徴をさらに明らかにするために、試験するプログラム可能なトランスポザーゼのＳｐＣａｓ９モジュールを置換したが、他のＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有する異なる生物の構成要素であった（すなわち、配列番号７２のＳａＣａｓ９、配列番号７４のｃｐｆ１、配列番号７５のＣａｓＸ、および配列番号２９のＣｊＣａｓ９）。スプリットＧＦＰレポーターの上流領域を標的とする特異的なｇＲＮＡを設計し、Ｈｅｒｓｈｅｙ細胞株トランスフェクション用にクローニングした。（以下の表２を参照）。標的転位をＧＦＰ発現によって測定した（図１２）。
プログラム可能な転位を行うために操作されたｈｙＰＢの能力の特徴をさらに明らかにするために、試験するプログラム可能なトランスポザーゼのＳｐＣａｓ９モジュールを置換したが、他のＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有する異なる生物の構成要素であった（すなわち、配列番号７２のＳａＣａｓ９、配列番号７４のｃｐｆ１、配列番号７５のＣａｓＸ、および配列番号２９のＣｊＣａｓ９）。スプリットＧＦＰレポーターの上流領域を標的とする特異的なｇＲＮＡを設計し、Ｈｅｒｓｈｅｙ細胞株トランスフェクション用にクローニングした。（以下の表２を参照）。標的転位をＧＦＰ発現によって測定した（図１２）。
【0340】
これらの結果は、別の一連の実験でも確認された。ＣｊＣａｓ９およびＬｂＣｐｆ１については、良好なプログラム可能な挿入活性が得られたが、ＣａｓＸは、本アッセイでは、任意のプログラム可能な組み込みが達成されなかった。注目すべきことに、ＳａＣａｓ９は、試験したＣａｓタンパク質の中で最も高いレベルのプログラム可能な挿入を有し、修飾されたｈｙＰＢに融合されたＳｐＣａｓ９と同様のレベルであった（図１９）。インデルを、使用した異なるＣａｓタンパク質、および各タンパク質に対して設計された３つの異なるｇＲＮＡに対してＩｌｕｍｉｎａ ＮＧＳによって決定し（図２１）、正規化目的で示した。
【0341】
これらの陽性結果から、プログラム可能な転位のために操作されたｈｙＰＢが任意の配列特異的ヌクレアーゼモジュールに有用であることが確認される。
【0342】
ＰＢ変異体の二量体に融合したＣａｓ９の追加の結果
転位を行う際に二量体として作用するＰＢの性質を考慮して、Ｃａｓ９とｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体との融合タンパク質の生成を試みた。これらの融合体のオンターゲット活性をＣａｓ９－ＰＢ変異体のみと比較した。構成Ｃａｓ９－ＰＢ－ＰＢの性能が優れていることが観察された。一方、構成ＰＢ－Ｃａｓ９－ＰＢは、Ｃａｓ９－ＰＢ単量体融合体を上回る性能ではなかった（図１４）。Ｃａｓ９への二量体融合では、クローニングおよび発現を容易にするために、記録された型のｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体を使用した。
転位を行う際に二量体として作用するＰＢの性質を考慮して、Ｃａｓ９とｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体との融合タンパク質の生成を試みた。これらの融合体のオンターゲット活性をＣａｓ９－ＰＢ変異体のみと比較した。構成Ｃａｓ９－ＰＢ－ＰＢの性能が優れていることが観察された。一方、構成ＰＢ－Ｃａｓ９－ＰＢは、Ｃａｓ９－ＰＢ単量体融合体を上回る性能ではなかった（図１４）。Ｃａｓ９への二量体融合では、クローニングおよび発現を容易にするために、記録された型のｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体を使用した。
【0343】
興味深いことに、二量体ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎに融合したＣａｓ９が、ＳｐＣａｓ９ではなくＳａＣａｓ９である場合、活性はさらに増大する（図２４）。二量体ｈｙＰＢを用いた場合のＳｐＣａｓ９を上回るＳａＣａｓ９の性能の向上は、単量体ｈｙＰＢを用いて得られた結果と一致する（図１２および図１９）。
【0344】
ＺＮＦ－ＰＢ変異体回復の結果
標的組み込みの促進において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼバリアント（Ｄ１０Ａ）による一本鎖切断を促進する一方で、オフターゲット部位での非誘導ＤＳＢによるオフターゲット活性を低下させる２つのｇＲＮＡの標的部位の近傍（４ヌクレオチド）で誘導される二本鎖破断（ＤＳＢ）活性の役割をさらに調査したいと考えた。Ｄ４５０Ｎ変異体およびＲ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体との融合により、トランスポゾンの指向性局在化のためにジンクフィンガー－ＰＢ融合体を使用し、独立したニッカーゼＣａｓ９による２つのオンサイト一本鎖破断、またはＣａｓ９ヌクレアーゼによる１つのＤＳＢでそれを補完した。
標的組み込みの促進において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼバリアント（Ｄ１０Ａ）による一本鎖切断を促進する一方で、オフターゲット部位での非誘導ＤＳＢによるオフターゲット活性を低下させる２つのｇＲＮＡの標的部位の近傍（４ヌクレオチド）で誘導される二本鎖破断（ＤＳＢ）活性の役割をさらに調査したいと考えた。Ｄ４５０Ｎ変異体およびＲ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体との融合により、トランスポゾンの指向性局在化のためにジンクフィンガー－ＰＢ融合体を使用し、独立したニッカーゼＣａｓ９による２つのオンサイト一本鎖破断、またはＣａｓ９ヌクレアーゼによる１つのＤＳＢでそれを補完した。
【0345】
Ｚｎｆ－ＰＢ融合体は、標的挿入活性が全く示されないか、または非常に低い標的挿入活性を呈した。これは、ヌクレアーゼまたはニッカーゼのいずれかである単一または二重ｇＲＮＡ誘導型ｃａｓ９を用いて、Ｚｎｆ結合部位近くにＤＳＢを導入することと組み合わせたときに回復した（図１３）。
【0346】
Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ変異体バリアントの結果
より高い効率でプログラム可能な転位を行うことができる変異体の組み合わせをさらに探索するために、スプリットＧＦＰレポーターシステムのプログラム可能な挿入によってＧＦＰが再構成される細胞の選択サイクルを数回実施した。興味深いことに、Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを上回るいくつかの組み合わせが観察された（図１５）。特に注目に値するのは、ｈｙＰＢのＡＡ：Ａ３５１－Ａ３７２－Ａ３７５－Ａ３８８－Ｎ４５０－Ａ４６５－Ａ５７３－Ｖ５８９－Ｇ５９２－Ｌ５９４（配列番号２としても同定される）（Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ（配列番号１）と比較して、陽性細胞集団が数倍豊富である）、また、程度は低いが、Ａ２４５－Ａ２７５－Ａ２７７－Ａ３７２－Ａ４６５－Ｖ５８９（配列番号３）およびＡ２７５－Ａ３２５－Ａ３７２－Ａ５６０（配列番号４）において、ｈｙＰＢで変異しているＣａｓ９に融合したｈｙＰＢのバリアントである。
より高い効率でプログラム可能な転位を行うことができる変異体の組み合わせをさらに探索するために、スプリットＧＦＰレポーターシステムのプログラム可能な挿入によってＧＦＰが再構成される細胞の選択サイクルを数回実施した。興味深いことに、Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを上回るいくつかの組み合わせが観察された（図１５）。特に注目に値するのは、ｈｙＰＢのＡＡ：Ａ３５１－Ａ３７２－Ａ３７５－Ａ３８８－Ｎ４５０－Ａ４６５－Ａ５７３－Ｖ５８９－Ｇ５９２－Ｌ５９４（配列番号２としても同定される）（Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ（配列番号１）と比較して、陽性細胞集団が数倍豊富である）、また、程度は低いが、Ａ２４５－Ａ２７５－Ａ２７７－Ａ３７２－Ａ４６５－Ｖ５８９（配列番号３）およびＡ２７５－Ａ３２５－Ａ３７２－Ａ５６０（配列番号４）において、ｈｙＰＢで変異しているＣａｓ９に融合したｈｙＰＢのバリアントである。
【0347】
別の一連の実験では、ＰｉｇｇｙＢａｃ ＤＮＡライブラリーがＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって産生され、ｃａｓ９と融合してレンチウイルスベクターにクローン化させ、ｓｔｂ４コンピテント細胞に形質転換され、１００倍のバリアントの複雑性が確保された。プラスミドをｍａｘｉｐｒｅｐによって精製し、レンチウイルスパッケージングプラスミドと共にＨｅｋ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。レンチウイルスを使用して、１／２ＧＦＰレポーター細胞株を感染させた。感染細胞に、１／２ＧＦＰトランスポゾンおよびＡＡＶＳ１配列を標的とするｇＲＮＡをトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーソーティングによって選択し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＢは、抽出されたｇＤＮＡから増幅され、レンチウイルスベクターに再クローニングされて、新しいサイクルを再開させた。最も性能の高いプログラム可能なトランスポザーゼバリアントを選択し、ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡおよびＭＣ１／２ＧＦＰと共に個別にトランスフェクトした。
【0348】
まず、９６個のバリアントのランダム選択を実施し、最も性能の高いバリアントを個別にスクリーニングした（図１６）。高いオンターゲット挿入に最良なＰＢアミノ酸バリアントの概要により、変異Ｄ４５０Ｎ、Ｒ３７２Ａ、およびＫ３７５Ａの重要性が確認される；しかし、標的効率の増加に寄与する他の重要な残基も強調している（図１７Ｂ）。最良のオンターゲット効率を有する６つのＰＢバリアントを選択した（図１７Ａ）。個々のオンターゲット活性は、ＦｉＣＡＴ（Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ）と比較して、以下のバリアントで大幅に向上した：Ｎ３４７Ａ－Ｄ４５０Ｎ；Ｎ３４７Ｓ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５７３Ａ－Ｆ５９４Ｌ；Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｓ５９２Ｇ；Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；およびＲ２７５Ａ－Ｒ２７７Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５６４Ｐ－Ｆ５９４Ｌ（両側ｔ検定）。
【0349】
この実験を繰り返して確認した（図２２Ａ）。また、本発明者らは、各サイクルのバルクバリアントを発現するレンチウイルスを産生し、ＰＢバリアントＣＮによって力価を補正するレポーター細胞株を感染させ、全サイクルにおいてオンターゲット効率の同様の増加を示した（図２２Ｂ）。単一変異体は、ｃａｓ９＿ＰＢライブラリー濃縮の４サイクルおよび５サイクル後にバルクバリアントから単離された。ＦｉＣＡＴ変異体、ｇＲＮＡ ｔｃｒ１、および１／２ＧＦＰ ＭＣトランスポゾンをオンターゲットレポーター細胞株にトランスフェクトすることにより、変異体を個別に試験した。最良のＦｉＣＡＴ変異体をＦｉＣＡＴ Ｒ３７２Ａ＿Ｋ３７５Ａ＿Ｄ４５０Ｎと比較して示す（図２３）。個々のオンターゲット活性は、ＦｉＣＡＴ（Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ）と比較して、以下のバリアントで大幅に向上した：Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；Ｒ２４５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５６４Ｐ－Ｓ５７３Ａ－Ｓ５９２Ｇ；Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ；Ｎ３４７Ａ－Ｄ４５０Ｎ；Ｒ２７７Ａ－Ｇ３２５Ａ－Ｎ３４７Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５６４Ｐ－Ｓ５７３Ａ－Ｓ５９２Ｇ－Ｆ５９４Ｌ；Ｎ３４７Ｓ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５７３Ａ－Ｆ５９４Ｌ；Ｖ３４Ｍ－Ｒ２７５Ａ－Ｇ３２５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｓ３５１Ａ－Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５６４Ｐ；Ｇ３２５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｓ５７３Ａ－Ｍ５８９Ｖ－Ｓ５９２Ｇ；Ｓ２３０Ｎ－Ｒ２７７Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ；Ｔ４３Ｉ－Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ａ４１１Ｔ－Ｄ４５０Ｎ；Ｇ３２５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｓ３５１Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｓ５７３Ａ－Ｍ５８９Ｖ－Ｓ５９２Ｇ；Ｙ１７７Ｈ－Ｒ２７５Ａ－Ｇ３２５Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５６４Ｐ－Ｓ５９２Ｇ。
【0350】
変異体Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎと比較して、変異体Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ、Ｒ２７５Ａ－Ｒ２７７Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｓ５６４Ｐ－Ｆ５９４ＬおよびＲ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌの優位性は、ＳｐＣａｓ９および２つのｈｙＰＢを含む三重融合タンパク質においてさらに示された（図２９）。
【0351】
Ｃａｓ９およびｈｙＰＢの非共有結合による連結の結果
リンカーを介したＣａｓ９とｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎとの共有結合による結合に加えて、ＭＳ２－ＭＣＰシステムを使用して、ＭＣＰタンパク質を結合するＭＳ２配列のテトラループを含む修飾されたｇＲＮＡを介して、Ｃａｓ９とＭＣＰタンパク質およびｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎからなる融合タンパク質とを連結する。
リンカーを介したＣａｓ９とｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎとの共有結合による結合に加えて、ＭＳ２－ＭＣＰシステムを使用して、ＭＣＰタンパク質を結合するＭＳ２配列のテトラループを含む修飾されたｇＲＮＡを介して、Ｃａｓ９とＭＣＰタンパク質およびｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎからなる融合タンパク質とを連結する。
【0352】
ＭＣＰ－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ融合タンパク質とＣａｓ９との組み合わせは、Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ融合タンパク質と比較して、プログラム可能な挿入活性が増加した（図２５Ａ）。さらに、ＭＣＰタンパク質をｈｙＰＢの他の変異体と融合させ、ＳｐＣａｓ９と組み合わせてプログラム可能な転位を行った。使用した両方のバリアント（Ｒ２０２Ｋ－Ｒ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ、およびＲ２７５Ａ－Ｎ３４７Ｓ－Ｒ３７２Ａ－Ｄ４５０Ｎ－Ｔ５６０Ａ－Ｆ５９４Ｌ）は、Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎの性能を上回った（図２５Ｂ）。
【0353】
プログラム可能な転位のためのＣａｓ９およびｈｙＰＢの脱共役の結果
また、リンカーまたはＭＳ２－ＭＣＰシステムを使用することなく、ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを使用して、ＳｐＣａｓ９の性能を試した。同じ細胞内で、ＳｐＣａｓ９およびｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを共発現させ、Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ融合タンパク質と比較して、プログラム可能な挿入活性の増加が記録された（図２６Ａ）。Ｃａｓ９に融合していないが同時に発現され、プログラム可能な転位の活性を達成するために互いに作用する、試験したｈｙＰＢ変異体バリアントの数を拡張した（図２６Ｂ）。
また、リンカーまたはＭＳ２－ＭＣＰシステムを使用することなく、ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを使用して、ＳｐＣａｓ９の性能を試した。同じ細胞内で、ＳｐＣａｓ９およびｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎを共発現させ、Ｃａｓ９－ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ融合タンパク質と比較して、プログラム可能な挿入活性の増加が記録された（図２６Ａ）。Ｃａｓ９に融合していないが同時に発現され、プログラム可能な転位の活性を達成するために互いに作用する、試験したｈｙＰＢ変異体バリアントの数を拡張した（図２６Ｂ）。
【0354】
Ｃａｓ９－ｈｙＰＢおよびＭＣＰ－ｈｙＰＢ融合タンパク質の共発現結果
単量体のうちの１つが非共有結合により連結している融合体の二量体型を得るために、ＭＣＰタンパク質に融合したｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体とＳｐＣａｓ９に融合したｈｙＰＢ変異体とを同時トランスフェクトした。ＳｐＣａｓ９に融合させたいくつかのｈｙＰＢ変異体を、特異的標的組み込みについて比較した（図２７）。
単量体のうちの１つが非共有結合により連結している融合体の二量体型を得るために、ＭＣＰタンパク質に融合したｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ変異体とＳｐＣａｓ９に融合したｈｙＰＢ変異体とを同時トランスフェクトした。ＳｐＣａｓ９に融合させたいくつかのｈｙＰＢ変異体を、特異的標的組み込みについて比較した（図２７）。
【0355】
Ｃａｓ９－ｈｙＰＢおよびｈｙＰＢバリアントの共発現の結果
同様の方法で、単量体のうちの１つが連結していない融合体の二量体型を得るために、ＳｐＣａｓ９ ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ融合タンパク質およびｈｙＰＢ変異体を独立して同時トランスフェクトした（図２８）。
同様の方法で、単量体のうちの１つが連結していない融合体の二量体型を得るために、ＳｐＣａｓ９ ｈｙＰＢ Ｒ３７２Ａ－Ｋ３７５Ａ－Ｄ４５０Ｎ融合タンパク質およびｈｙＰＢ変異体を独立して同時トランスフェクトした（図２８）。
【0356】
方法
クローニングおよびプラスミド。ランダム挿入モニタリング用のＲＦＰトランスポゾンＰＢ５１２－Ｂは、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃから購入した。ｈｙＰＢベクターは、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｐＣＭＶ＿ｈｙＰＢａｓｅ）から入手した９。プラスミドベクターｐＣＲＴＭ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（登録商標）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、ｃａｓ９、ｎｃａｓ９およびＳＰ－ｄｃａｓ９－ＶＰＲは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４１８１５、＃４１８１６、＃６３７９８）から得た。最後に、ＳＢ１００ＸおよびｐＴ４－ＨＢは、Ｄｒ．Ｚｓｕｚｓａｎａ Ｚｉｚｓｖａｋの厚意により寄贈された。ｇＲＮＡは、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して産生した。ｇｂｌｏｃｋ遺伝子断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、Ｕ６プロモーター、２０ｎｔ標的部位、ｇＲＮＡ足場およびターミネーターを含む。ｇＲＮＡ ＴＲＡＣは、研究室で設計および検証され、ｇＲＮＡ ａａｖｓ１－３配列は、以前に記載されている１８。
クローニングおよびプラスミド。ランダム挿入モニタリング用のＲＦＰトランスポゾンＰＢ５１２－Ｂは、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃから購入した。ｈｙＰＢベクターは、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｐＣＭＶ＿ｈｙＰＢａｓｅ）から入手した９。プラスミドベクターｐＣＲＴＭ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（登録商標）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、ｃａｓ９、ｎｃａｓ９およびＳＰ－ｄｃａｓ９－ＶＰＲは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４１８１５、＃４１８１６、＃６３７９８）から得た。最後に、ＳＢ１００ＸおよびｐＴ４－ＨＢは、Ｄｒ．Ｚｓｕｚｓａｎａ Ｚｉｚｓｖａｋの厚意により寄贈された。ｇＲＮＡは、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して産生した。ｇｂｌｏｃｋ遺伝子断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、Ｕ６プロモーター、２０ｎｔ標的部位、ｇＲＮＡ足場およびターミネーターを含む。ｇＲＮＡ ＴＲＡＣは、研究室で設計および検証され、ｇＲＮＡ ａａｖｓ１－３配列は、以前に記載されている１８。
【0357】
ｈｙＰＢおよびＰＢ ＲＦＰ１／２ｅｍＧＦＰ ＳＭＮ１トランスポゾンへのヌクレアーゼ、ニッカーゼ、およびｄｅａｄ ｃａｓ９の融合は、ＢｓｐＱＩ酵素および標準的な方法を使用したＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって実施した。
【0358】
Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）の説明書に従って、部位指向性変異誘発によって、ｃａｓ９に融合されたｈｙＰＢ配列（ｃａｓ９＿ＰＢプラスミド）に様々な変異を導入した。プライマーは、ｈｙＰＢ配列に対して次の変異を実現するために、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎを使用して設計された：Ｍ１９４Ｖ、Ｒ２４５Ａ、Ｇ３２５Ａ、Ｒ３７２Ａ、Ｋ３７５Ａ、Ｒ３７６Ａ、Ｅ３７７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｄ４５０Ｎ、Ｓ５６４Ｐ（配列番号９０～９９を参照）。すべてのプラスミドは、必要に応じて、入手可能である。ＰＢ１／２ｅｍＧＦＰ ＳＭＮ１は、ｅｍＧＦＰ配列の最初の半分とＳＭＮ１イントロン６配列をｐｉｇｇｙＢａｃアクセプターベクターに導入することによって得た。ｐＴ４ ＳＭＮ１ ２／２ｅｍＧＦＰは、ＳＢ１００Ｘトランスポゾンベクター中に、ＳＭＮ１イントロン６の第２の半分および部分的なｅｍＧＦＰを追加することによって得た。ＳＭＮ１を含むｅｍＧＦＰ配列は、Ｓｒｉ Ｋｏｓｕｒｉからの寄付であるＤＹＰ００４ｒｅｐｏｒｔｅｒ１９から得た。
【0359】
異なるサイズのトランスポゾンおよびＨＤＲ鋳型は、スプリットｅｍＧＦＰレポーターシステムの上流で部分ｃＤＮＡ（ＮＣ＿０００００６．１２）断片をクローニングすることによって生成された。
【0360】
細胞培養、トランスフェクション、およびエレクトロポレーション。Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣ２Ｃ１２細胞株（ＡＴＣＣ）を、高グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍ Ｆｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミンおよび１００Ｕペニシリン／０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用して、５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、ＧｌｕｔａｍａｘおよびＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および１０％ＦＢＳを添加したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ１６４０培地（ＲＰＭＩ）を使用して、５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で培養した。この細胞株は、Ｍａｎｅｌ Ｊｕａｎ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）から寄贈されたものである。Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション実験は、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン３０００試薬を使用するか、ＯｐｔｉＭｅｍでＤＮＡ－ＰＥＩ比１：３のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。細胞を前日に播種して、トランスフェクション日に７０％のコンフルエンシーに達した（通常、接着性ｐ１２ウェルプレートに２９０，０００細胞）。プラスミドＤＮＡの比率は、ｐ１２ウェルプレートに０．０７６ｐｍｏｌのプログラム可能なトランスポザーゼまたはＣａｓ９のいずれかを使用し、トランスポザーゼ１：ｇＲＮＡ２．５：トランスポゾン２．５またはＣａｓ９ １：ｇＲＮＡ２．５：ＨＤＲ鋳型２．５であった。
【0361】
ｅｍＧＦＰスプライシングに基づく再構成アッセイ。ｐＴ４ ＳＭＮ１ ２／２ｅｍＧＦＰを含むＨｅｋ２９３Ｔ細胞株は、ＳＢ１００ＸおよびｐＴ４ ＳＭＮ１ ２／２ｅｍＧＦＰ ＤＮＡ構築物のＰＥＩ媒介トランスフェクション、その後の単一クローン拡張およびＰＣＲ遺伝子型解析によって生成した（補足表３）。陽性クローンを選択して拡張し、その後のアッセイに使用した。ｅｍＧＦＰ再構成アッセイの場合、１２ウェルプレートに０．０７６ｐｍｏｌのプログラム可能なトランスポザーゼまたはｈｙＰＢと０．１９ｐｍｏｌのトランスポゾンおよびｇＲＮＡを使用して、プログラム可能なトランスポザーゼ、ｇＲＮＡ、およびトランスポゾンのプラスミドは、プログラム可能なトランスポザーゼ１：ｇＲＮＡ２．５：トランスポゾン２．５の比率でトランスフェクトされた。オンターゲット挿入は、トランスフェクションの５日後にｅｍＧＦＰ蛍光によって測定した。オフターゲット転位は、トランスフェクションの１５日後にＲＦＰ蛍光によって測定した。オンターゲット挿入は、ＰＢバリアント、ｇＲＮＡ、およびＰＢ１／２ＳＭＮ１ ＲＦＰ ｅｍＧＦＰ（最終的な構築物名を挿入）発現プラスミドを同時トランスフェクトすることにより、および（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．５３０／３０フィルターを備えた青色４８８ｎｍレーザーおよび６１０／２０フィルターを備えた黄緑色５６１ｎｍレーザー）測定されたｅｍＧＦＰ発現によって、１４日後（エピソーム崩壊の平均日数ｎを設定）のｅｍＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光を決定することにより測定した。
【0362】
挿入部位配列決定のためのジャンクションＰＣＲ。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｅｍＧＦＰで選別された細胞に対してジャンクションＰＣＲを実施した。選択された細胞には、レポーター細胞株上のＴＲＡＣ標的部位を標的とするＰＢ１／２ｅｍＧＦＰ ＳＭＮ１トランスポゾンがオンターゲット挿入されていた。ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。プライマーは、トランスポゾンの３’ＩＴＲ（順方向）と、レポーター細胞株の２／２ｅｍＧＦＰまたは内在性Ｔ細胞受容体（ＴＲＡＣ）（逆方向）のイントロンを標的として設計した（補足表４）。
【0363】
Ｇｕｉｄｅ－ＳＥＱ実験のバイオインフォマティクス解析。Ｉｌｌｕｍｉｎａの読み取りは、ｕｓｅａｒｃｈ２０を使用して、クラスター化し、ｂｗａ－ｍｅｍ２１を使用してリファレンスにマッピングさせた。オンターゲット挿入の特徴付けでは、ＰｙｔｈｏｎスクリプトおよびＳａｍｔｏｏｌｓ２２を使用して、標的挿入部位の５’および３’ジャンクションをカバーするリードを選択した。インデルの数は、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＡ２３を使用して取得した。オンターゲットおよびオフターゲット実験では、ベクターに対してマッピングさせたクラスター化リードが選択され、ｂｗａ－ｍｅｍを使用して参照ゲノムに対してマッピングさせた。挿入ピークの重要性は、ｍａｃｓ２２４アルゴリズムを使用して評価した。
【0364】
標的挿入に適応したＧｕｉｄｅ－ｓｅｑライブラリーの調製。適合したＧｕｉｄｅ－ｓｅｑ１５プロトコルの実装は、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｑ８００Ｒ３ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して５００ｂｐ断片に断片化することによって実施した。ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＫＲ０９６１－ｖ５．１６）および３μｇの断片化ゲノムＤＮＡを使用して、末端修復、Ａテーリング、およびＹアダプターのライゲーションを行い、その後１Ｘ比でＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズ精製を行った。アダプターライゲーション後、各サンプルを２つに分割し、ＧＳＰ５’またはＧＳＰ３’で増幅して、それぞれ５’および３’の接合部を捕捉した。５’および３’トランスポゾンとゲノムの接合部を捕捉するために、製造業者のプロトコルに従ってＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを実施した：最終容量２５μｌ中Ｐ５＿１およびＰＢ＿５＿ＧＳＰ１またはＰＢ＿３＿ＧＳＰ１を含むＰＣＲ１；および最終容量２５μｌ中Ｐ５＿２、ＰＢ＿５＿ＧＳＰ２またはＰＢ＿３＿ＧＳＰ２を含むＰＣＲ２。５’および３’ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズ精製、１Ｘ比で精製し、等モル比で混合し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２－５００サイクル（２ｘ２５０ｂｐペアエンド）で配列決定した。３μｌの１００μＭカスタムプライマーインデックス１およびリード２を配列決定反応に添加した。
【0365】
Ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス肝臓への標的挿入。動物実験手順は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋによって承認された。この研究には、生後８～１０週目のＣ５７ＢＬ／６Ｊを使用した。動物は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、雄および雌を区別することなく使用した。プログラム可能なトランスポザーゼｍＲＮＡは、製造業者の指示に従って、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生成した。Ｒｏｓａ２６ ｇＲＮＡ２５は、ＩＤＴから購入した。プログラム可能なトランスポザーゼｍＲＮＡ、Ｒｏｓａ２６を標的とするｇＲＮＡ、およびＰＢ５１２－Ｂトランスポゾンを１：１：２．５の比率で後眼窩から注入した。合計６０μｇの核酸をＮＰ比７で、ｉｎ ｖｉｖｏ－ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓトランスフェクション）と複合体化させた。注射後１０日後に動物を安楽死させ、肝臓を単離して均質化した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、肝臓サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔｆｒｃ内因性遺伝子に対するトランスポゾンの相対コピー数をｑＰＣＲによって得た（プライマーは、補足表１に記載）。ルシフェラーゼ発現のイメージングは、ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＦｉＣＡＴ－ｇＲＮＡ－トランスポゾンまたはトランスポゾン対照の投与後の様々な時点で実施した。製造業者の指示に従って、Ｄ－ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の腹腔内注射の５分後に画像を撮影した。
【0366】
ＰＢ構造モデリング。イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼタンパク質の３Ｄ構造は、Ｒｏｂｅｔｔａ Ｗｅｂタンパク質構造予測サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｒｏｂｅｔｔａ．ｂａｋｅｒｌａｂ．ｏｒｇ）によって得た。コアドメイン（１３１～５５０ａａ）は、埋め込みデカルト空間最小化および全原子最適化を備えたモンテカルロアルゴリズムに基づくＲｏｓｅｔｔａ比較モデリング法によって予測した２６。三次構造の折り畳みは、ＳＰＳｅｒｖｅｒおよびＰｒｏＳａ－Ｗｅｂの知識ベースの方法で分析および検証した（補足図２）。二次構造は、ＰＳＩＰＲＥＤおよびＨＨＰｒｅｄ機械学習ベース方法で解析した。次に、ＰＢのコアは、比較タンパク質モデリング法によって、ＰｙＭＯＬを使用して、精密化のためのモデリングを実施した。精密化プロセスは、ｐｉｇｇｙＢａｃモデルとウイルスＤＮＡおよび標的宿主ＤＮＡに結合したＨＩＶインテグラーゼテトラマーからなるＣｒｙｏ－ＥＭ ＨＩＶ－１鎖転移複合体インタソーム（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｕ１Ｃ）およびＸ線回折Ｔｎ５トランスポザーゼ複合体構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＭＵＳ２７）との重ね合わせによって誘導した。鎖転移ＤＮＡおよびドナーＤＮＡは、それぞれＨＩＶ－１インタソームとＴｎ５との重ね合わせから外挿した。タンパク質と接触する界面のヌクレオチドを二本鎖ＤＮＡとしてＸ３ＤＮＡで解析した。統計的ポテンシャルを使用して、タンパク質とＤＮＡとの間の相互作用をスコア化し、理論的なＰＷＭ２８を生成した。理論上のＰＷＭは、この界面内のすべての潜在的な二本鎖ＤＮＡ配列を試験し、統計的ポテンシャルでランク付けし、複数の配列アラインメントを作成するために上位を選択することによって得られる。本稿の提出中に、ｃｒｙｏ－ＥＭ構造が利用可能になった。これは、実施したモデリングと重要な一致を示している２９。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ鎖転移複合体のＣｒｙｏ－ＥＭ構造（ＰＤＢ ＩＤ：６Ｘ６７）により、モデルの一般的な折り畳みが確認され、仮説を立てたドメインが、ドナーおよび標的ＤＮＡとの接触に関与していることが確認された。
【0367】
【表2】
【0368】
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【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21a】
【図21b】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24】
【図25A】
【図25B】
【図26A】
【図26B】
【図27】
【図28】
【図29】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】