特表 2023-554525 オリゴ糖を生成するための、ラクトース内部移行の低減を保有する微生物細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-27

(54)【発明の名称】オリゴ糖を生成するための、ラクトース内部移行の低減を保有する微生物細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20231220BHJP

   C12P 19/44 20060101ALI20231220BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20231220BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12P19/44

C12N15/31

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537997

(86)(22)【出願日】2021-12-22

(85)【翻訳文提出日】2023-08-18

(86)【国際出願番号】 EP2021087337

(87)【国際公開番号】W WO2022136568

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】20216485.1

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511149751

【氏名又は名称】クリスチャン．ハンセン・ハー・エム・オー・ゲー・エム・ベー・ハー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フレリクマン，ヘニング

(72)【発明者】

【氏名】トレッチェル，クリスティアーン

(72)【発明者】

【氏名】ワルテンベルク，ディルク

(72)【発明者】

【氏名】イェネバイン，シュテファン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AF04

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA10

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA21

4B065CA41

(57)【要約】

目的のオリゴ糖を産生するための遺伝子操作された微生物細胞であって、ラクトースの輸送活性の低下を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体を保有する、遺伝子操作された微生物細胞、及び前記遺伝子操作された微生物細胞を使用することによってオリゴ糖を生産する方法が開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的のオリゴ糖を生産するための遺伝子操作された微生物細胞であって、外因性ラクトースを内部移行するためのラクトースパーミアーゼを含み、前記ラクトースパーミアーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較してラクトースの内部移行の低下を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体である、遺伝子操作された微生物細胞。

【請求項2】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物細胞。

【請求項3】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体が、配列番号１で表されるラクトースパーミアーゼに関するアミノ酸位置２９２、２９３及び２９３の少なくとも１つに塩基性アミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子操作された微生物細胞。

【請求項4】

塩基性アミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン及びリジンからなる群より選択される、請求項３に記載の遺伝子操作された微生物細胞。

【請求項5】

ａ）請求項１～４のいずれか一項に定義される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列；
ｃ）ａ）又はｂ）に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
からなる群のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞。

【請求項6】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体をコードするヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項５に記載の遺伝子操作された微生物細胞。

【請求項7】

－ヌクレオチド活性化糖の細胞内生合成のための少なくとも１つの代謝経路；及び
－ドナー基質としてのヌクレオチド活性化単糖からアクセプター分子としてのラクトース又はオリゴ糖に単糖部分を細胞内転移するための少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ、
をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞。

【請求項8】

目的のオリゴ糖の生産のための請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物細胞の使用であって、目的のオリゴ糖が、その還元末端にラクトース部分を含む、使用。

【請求項9】

目的のオリゴ糖を生産するための方法であって、目的のオリゴ糖が、微生物細胞において合成され、
－請求項１～７のいずれか一項に定義されるオリゴ糖の細胞内生合成のための遺伝子操作された微生物細胞を提供すること；
－培地中、外因性ラクトースの存在下で、及び細胞が目的のオリゴ糖を細胞内合成することを可能にする条件下で、遺伝子操作された細胞を培養すること；及び
－培養培地又は細胞から目的のオリゴ糖を回収すること
を含む、方法。

【請求項10】

オリゴ糖が、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、２’，３－ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＩ（ＬＮｎＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＶ（ＬＮｎＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パララクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐａｒａＬＮＨ）、パララクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐａｒａＬＮｎＨ）、ジフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＤＦ－ＬＮｎＨ）、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩ、ラクト－Ｎ－フコシルヘキサオースＩＩ、パララクト－Ｎ－フコシルヘキサオース（ｐａｒａＬＮＨ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースａ（Ｆ－ＬＳＴ－ａ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースｂ（Ｆ－ＬＳＴ－ｂ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースｃ（Ｆ－ＬＳＴ－ｃ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースｃ、ジシアリル－ラクト－Ｎ－フコペンタオース、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（３Ｆ－３’－ＳＬ）、３－フコシル－６’－シアリルラクトース（３Ｆ－６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩ、３’－シアリルラクトース（３－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６－ＳＬ）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ－ｂ）、シラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＳＴ－ｃ）、ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳ－ＬＮＴ）、ジシアリル－ラクト－Ｎ－フコペンタオース（ＤＳ－ＬＮＦＰ Ｖ）、ラクト－Ｎ－ネオジフコキサオースＩ（ＬＮｎＤＦＨ Ｉ）、３’－ガラクトシルラクトース（３’－ＧＬ）、６’－ガラクトシルラクトース（６’－ＧＬ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物細胞によるラクトースの内部移行に関する。より具体的には、本発明はラクトース死滅（ｌａｃｔｏｓｅ ｋｉｌｌｉｎｇ）の現象に関し、微生物細胞のラクトース死滅を低減又は緩和するための手段及び方法を提供する。本発明はまた、オリゴ糖及び複合糖質の生産において、ラクトース死滅に耐性である微生物細胞を使用する利点に関する。

【背景技術】

【0002】

炭水化物（糖類とも呼ばれる）は、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖の４つの化学群に分類される生体分子である。炭水化物は、タンパク質若しくはポリペプチドに結合している（糖タンパク質と呼ばれる）又は脂質に結合している（糖脂質と呼ばれる）場合、遊離形態又は複合糖質の形態で存在し得る。炭水化物の別の分類は、それらの生理学的効果に基づく。単糖類を人体に提供する炭水化物は、「消化可能な」炭水化物として定義され、「消化不可能な」炭水化物は、ヒトの小腸での消化に抵抗性である。

【0003】

オリゴ糖は、炭水化物の中で多様な分子群を構成する。本明細書で使用される場合、「オリゴ糖」という用語は、典型的には、グリコシド結合によって互いに結合している、少なくとも３つの単糖部分からなるが、１２以下の単糖部分、好ましくは１０以下の単糖部分からなる高分子糖分子を指す。オリゴ糖は、単糖部分の直鎖からなっていてもよく、又は分枝分子であってもよく、少なくとも１つの単糖部分は、グリコシド結合によってそれに結合した少なくとも３つの単糖部分を有する。オリゴ糖の単糖部分は、アルドース（例えば、アラビノース、キシロース、リボース、デスオキシリボース、リキソース、グルコース、イドース、ガラクトース、タロース、アロース、アルトロース、マンノース）、ケトース（例えば、リブロース、キシルロース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、デオキシ糖（例えば、ラムノース、フコース、キノボース）、デオキシ－アミノ糖（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチル－マンノサミン、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン）、ウロン酸（例えば、ガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｓａｕｒｅ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｓａｕｒｅ））及びケトアルドン酸（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸）からなる群から選択することができる。

【0004】

ビフィズス菌及び／又は乳酸桿菌によって選択的に代謝される能力を有する非消化性オリゴ糖は、プレバイオティクスと呼ばれる。プレバイオティックオリゴ糖を消費する利点には、便秘の軽減、結腸がんになるリスクの低減、胃腸管での病原体の阻害、ミネラル吸収の増加、免疫系の調節、短鎖脂肪酸及びビタミンの産生、血中コレステロール及び脂質のレベルの低下、並びに腸内の微生物バランスの改善が含まれる。プレバイオティックオリゴ糖の特定の群は、いわゆる「ヒトミルクオリゴ糖」（ＨＭＯ）である。

【0005】

ヒトミルクオリゴ糖は、ヒトミルク中に存在する非消化性オリゴ糖の複合混合物を構成する。ヒトミルクは、そのオリゴ糖含有量及び組成に関して独特である。これまでに、１５０を超える構造的に異なるＨＭＯが同定されている。大部分のＨＭＯは、その還元末端のラクトース部分を特徴とする。多くのＨＭＯは、非還元末端にフコース部分及び／又はシアル酸部分を含有する。より一般的に言えば、ＨＭＯが由来する単糖は、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｌ－フコース及びＮ－アセチルノイラミン酸である。

【0006】

プレバイオティックオリゴ糖は、チコリ及びアーチチョークなどの天然源から得ることができるか、又はインビトロで化学合成若しくは酵素的合成によって製造することができる。オリゴ糖、特にいくつかのＨＭＯの工業規模の生産に関しては、ＨＭＯはそれらの天然源からはほとんど得ることができないので、目的のオリゴ糖が遺伝子操作された微生物細胞によって産生される発酵法が開発された。個々のＨＭＯの工業規模の発酵生産により、これらのプレバイオティクス化合物は食品産業にとって利用可能になり、その結果、ＨＭＯは乳児用調製粉乳の栄養補助剤として利用可能になる。

【0007】

オリゴ糖の発酵生産、すなわち目的のオリゴ糖、特にＨＭＯの生産において、遺伝子操作された細菌は、典型的には（ｉ）外因性炭素源及び（ｉｉ）外因性ラクトースの存在下で培養される。本明細書で使用される「外因性」という用語は、目的のオリゴ糖を産生するための遺伝子操作された細菌の培養前及び／又は培養中に、遺伝子操作された細菌の培養培地中に存在する及び／又は添加される化合物を指す。典型的には、そのような化合物が培養培地に添加されるが、他の実施形態では、該化合物は、培養培地中に存在する及び／又は添加された微生物細胞によって産生もされ得る。ラクトースは、ＨＭＯの還元末端で二糖部分を構成し、典型的には、遺伝子操作された細菌により細胞内で合成される個々のＨＭＯを有するための出発分子である。

【0008】

ラクトース（β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→４）－Ｄ－グルコース）は、乳畜のミルク中に見出される天然に存在する糖である。ラクトースは、グルコース部分とガラクトース部分とから構成される二糖である。乳児哺乳動物は、母親により授乳され、ラクトースが豊富な乳を飲む。乳児の腸内では、酵素のラクターゼ（β－Ｄ－ガラクトシダーゼ）がラクトースをその構成成分である単糖類のグルコースとガラクトースとに加水分解し、これを吸収することができる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を含む多くの腸内細菌は、炭素源としてグルコースを好み、グルコースが利用できない場合、ラクトースを効果的に消化することができる。

【0009】

ラクトース部分をその還元末端に有する目的のオリゴ糖の微生物細胞による細胞内生合成のために、ラクトースがその単糖に分解されないか又は過度に分解されずに、前記オリゴ糖生合成に利用可能になるように細胞内ラクトースプールを確立することが望ましい。細胞内ラクトースプールを提供する１つの選択肢は、ラクトースを分解又は変換する酵素をコードする細菌の（１又は複数の）内因性遺伝子の欠失又は機能的不活性化である。例示的な遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃＺ及び／又はｌａｃＡである。ｌａｃＺ遺伝子はラクトースを加水分解するβ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）をコードし、ｌａｃＡはアセチル－ＣｏＡからβ－ガラクトシドにアセチル基を転移する酵素であるβ－ガラクトシドトランスアセチラーゼ（ＬａｃＡ）をコードする。

【0010】

しかしながら、微生物細胞内の細胞内ラクトースプールを増加させることには欠点が伴う。そのような欠点の１つは、ラクトース死滅と呼ばれる現象である。ラクトース死滅は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がラクトース限定増殖培地からラクトース含有増殖培地に移されると、細菌細胞膜を横切るラクトースの急速な内部移行のために、それらの大部分が死滅する特異な現象である。ラクトース死滅の現象は、微生物細胞が発酵培地に接種されたときに前記発酵培地がラクトースを含有するか、及び／又はラクトースが発酵の過程で連続的又は少なくとも１回のボーラスのいずれかで発酵培地に添加されるかどうかにかかわらず、外因性ラクトースが発酵培地に大量に供給される発酵スキームを使用した、還元末端にラクトース部分を有するＨＭＯなどのオリゴ糖の発酵生産に特に関連する。ラクトース死滅は、ラクトースが発酵培地に供給されたときに発酵槽内の微生物細胞培養物の増殖及び生産性を少なくとも遅らせるので、目的のオリゴ糖又は複合糖質の発酵生産のために、ラクトース死滅に耐性である微生物細胞を使用することが望ましい。

【0011】

特殊製品の微生物生産のためのラクトース死滅の欠点を克服する試みにおいて、国際公開第２０１６／０７５２４３号は、ラクトース輸送体の発現レベルがラクトース負荷に耐え、前記ラクトース輸送体の野生型発現カセットにより得られたラクトース流入の少なくとも５０％を保持する微生物をもたらすように、微生物内のラクトース輸送体の発現を改変させることによって微生物をラクトース死滅に耐性にすることを提案している。

【0012】

しかしながら、ラクトースパーミアーゼと、ｂｇｌオペロン及び他の非ＰＴＳ糖パーミアーゼ発現の調節にも関与するホスホエノールピルビン酸：炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系の酵素ＩＩＩ^Ｇｌｃとが相互作用することが知られているので、細菌細胞におけるＬａｃＹなどのラクトースパーミアーゼの発現レベルの低下は、細菌細胞の増殖に影響を及ぼし得る。

【0013】

その観点から、ラクトース死滅には耐性であるが、ラクトースパーミアーゼの発現レベルの低下による有害作用の影響を受けない微生物株を開発することが望ましい。

【0014】

驚くべきことに、微生物細胞において野生型ＬａｃＹの代わりにＬａｃＹラクトースパーミアーゼの特定の変異体の発現がラクトース死滅に対する微生物細胞の耐性を増加させるが、ＬａｃＹ及びその変異体の発現レベルがそのままで変化しないこと、並びにそのようなＬａｃＹ変異体を保有する微生物細胞がオリゴ糖の発酵生産に有用であることが見出された。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】国際公開第２０１６／０７５２４３号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0016】

第１の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼの変異体が提供される。

【0017】

第２の態様では、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。

【0018】

第３の態様では、ラクトースを内部移行することができ、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体を保有する、遺伝子操作された細菌細胞が提供される。

【0019】

第４の態様では、目的のオリゴ糖の生産のための、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体を保有する遺伝子操作された細菌細胞の使用が提供される。

【0020】

第５の態様では、目的のオリゴ糖を生産する方法であって、前記目的のオリゴ糖が、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体を保有する、遺伝子操作された細菌細胞において合成される方法が提供される。

【0021】

第６の態様では、細菌細胞におけるラクトース死滅の影響を緩和する方法であって、細菌細胞の内因性ラクトースパーミアーゼを、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体と置き換えることを含む方法が提供される。

【0022】

第７の態様では、内部移行されたラクトースからの細胞内オリゴ糖生合成の有効性を改善するための方法であって、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体によって置き換えられた内因性ラクトースパーミアーゼを有する、遺伝子操作された細菌細胞の使用を含む方法が提供される。

【0023】

第８の態様では、細菌細胞において目的のオリゴ糖を生産する信頼性を改善する方法であって、目的のオリゴ糖の細胞内生合成のための宿主細胞である遺伝子操作された細菌細胞の使用を含み、前記細菌宿主細胞が、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体によって置き換えられた内因性ラクトースパーミアーゼを有する方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ Ｄａｔａｂａｓｅに存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ラクトースパーミアーゼＬａｃＹのアミノ酸配列（エントリ番号Ｐ０２９２０；エントリバージョン１８０；ＵｎｉＰｒｏｔリリース番号２０２０年１０月０７日の２０２０＿０５）であり、添付の配列表の配列番号１としても存在する。

【図2】Ｓｏｎｄｅｊ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｅｏｋ，Ｙ．－Ｊ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｌａｃｔｏｓｅ Ｐｅｒｍｅａｓｅ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９９）９６：７，３５２５－３５３０から適合させた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の細胞質膜内の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ラクトースパーミアーゼＬａｃＹのトポロジーの概略図である。

【図3】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体との大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での相対的発現量を示すカラムチャートである。

【図4】異なる量のラクトースの存在下での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の増殖に対する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しているＬａｃＹ変異体の影響を示すカラムグラフである。

【図5A】インビトロアッセイにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ及びラクトースの輸送活性が低下しているその変異体の輸送活性を示すカラムグラフを示す。

【図5B】インビトロアッセイにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ及びラクトースの輸送活性が低下しているその変異体の輸送活性を示すカラムグラフを示す。

【図6】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ又はラクトースの輸送活性が低下しているその変異体を発現する細菌株のＬＮＴ生産性を示すグラフである。

【図7】ＬＮＴ生産中の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ又はラクトースの輸送活性が低下しているその変異体を発現する細菌細胞の増殖動態を示すグラフである。

【図8】異なるラクトースパーミアーゼ変異体の疎水性及び予測される膜貫通ドメインを表す図である。

【図9】異なるラクトースパーミアーゼ変異体の疎水性及び予測される膜貫通ドメインを表す図である。

【図10】ラクトースパーミアーゼ変異体の疎水性及び予測される膜貫通ドメインを表す図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

驚くべきことに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの特定の変異体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性の低下を示し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹのそのような変異体を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞はラクトース死滅に対する感受性が低いため、そのような変異体を、培養培地への外因性ラクトースの添加を必要とするオリゴ糖の発酵生産に有利に使用できることが本発明者らによって見出された。

【0026】

第１の態様によれば、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体が提供される。変異体の輸送活性の低下は、野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの代わりにそのような変異体を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によるラクトース内部移行レベルの低下を引き起こす。

【0027】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹは、いわゆる主要促進因子スーパーファミリー（ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）（Ｅ．Ｃ．２．Ａ．１．５．１）の膜タンパク質である。ＬａｃＹは、β－ガラクトシド及びプロトンを細胞内に共輸送するために細胞膜を横切るプロトン勾配を利用する共輸送体である。したがって、ＬａｃＹは、ラクトース、メリビオース、ラクツロース及び類似体のメチル－１－チオ－β，Ｄ－ガラクトピラノシド（ＴＭＧ）を輸送することができるが、スクロース又はフルクトースを輸送することはできない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹのβ－ガラクトシド輸送活性の動態を表１に示す。

【0028】

【表1】

【0029】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹは、膜輸送の分子詳細を理解する上でプロトタイプとなっている。そのアミノ酸配列、すなわち、「野生型」大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹのアミノ酸配列は、図１に示され、配列番号１で表される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２９２０、１９８６年７月２１日にＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースに統合、２０２０年６月１７日に最終修正）のＬａｃＹのアミノ酸配列である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹは、４１７アミノ酸残基長のアミノ酸鎖からなるタンパク質であり、計算質量は４６，５０３Ｄａである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹは、膜貫通ヘリックス優先性及び予測膜貫通ヘリックス位置をグラフの下側のボックスに示す図９Ａ及び図１０Ａから推測することができるように、膜タンパク質二次構造予測サーバーＳＰＬＩＴ ４．０（ｓｐｌｉｔｂｉｏｉｎｆ．ｐｍｆｓｔ．ｈｒ／ｓｐｌｉｔ／４／）によって予測される１２個の膜貫通ドメインを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹのより詳細なトポロジーを表２に提供し、図２に示す。

【0030】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの突然変異誘発分析により、いくつかのアミノ酸残基がラクトース輸送の機能性を維持するために置き換え不可能であることが明らかになった。これらのアミノ酸残基及びラクトース輸送におけるそれらの機能を表３に提供する。

【0031】

【表2】

【0032】

【表3】

【0033】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの突然変異誘発分析からも、特定のアミノ酸残基がラクトース輸送に必須ではないと思われることが明らかになった。これらの非必須アミノ酸残基を表４に特定する。

【0034】

【表4】

【0035】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼの変異体は、同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で本質的に同じレベルで発現された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの内部移行が低下している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼの変異体によるラクトースの内部移行レベルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼによって提供されるラクトース内部移行レベルと比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％低下する。いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体によるラクトースの内部移行レベルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較して、５ｍＭの外因性ラクトース濃度で約３０％低下する。「約３０％」という用語は、範囲の下端で２６％、２７％、２８％又は２９％、上端で３４％、３３％、３２％又は３１％と理解される。

【0036】

ラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0037】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、ラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの膜貫通ヘリックスＩＸ中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＬａｃＹの膜貫通ヘリックスＩＸ中のアミノ酸置換は、膜貫通ヘリックスＩＸ中の１つ以上の中性アミノ酸残基のそれぞれを、塩基性アミノ酸残基で置換することである。

【0038】

特定の実施形態では、膜貫通ヘリックスＩＸ中のアミノ酸置換は、ロイシン残基（Ｌｅｕ、Ｌ）の少なくとも１つを塩基性アミノ酸残基で置き換えることを含むか、又はそれからなる。膜貫通ヘリックスＩＸ中の前記ロイシン残基は、図１及び配列番号１に示されるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹに関して２９２、２９３及び２９４の位置にあるロイシン残基である。塩基性アミノ酸残基は、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）からなる群より選択されるアミノ酸である。

【0039】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体は、そのような変異体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較して２９２、２９３及び２９４の位置の少なくとも１つに塩基性アミノ酸残基を保有することを条件として、本明細書において前述したＬａｃＹ（Ｌ２９２Ｒ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９２Ｋ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９２Ｈ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｋ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｈ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９４Ｒ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９４Ｋ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９４Ｈ）及びそれらの変異体からなる群から選択される。したがって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹの変異体は、括弧内に示されるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹに関する位置にアミノ酸置換を有する。

【0040】

好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体は、２９３位（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹに関して）のロイシン残基のアルギニン残基による置換（ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）と命名される）を含む。

【0041】

さらなる実施形態及び／又は代替的な実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体は、ＳＰＬＩＴ ４．０サーバー（ｓｐｌｉｔｉｎｆｏ．ｐｍｆｓｔ．ｈｒ／ｓｐｌｉｔ／４／）を使用して分析した場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹにおいて膜貫通ドメインＩＸとＸとを互いに分離するペリプラズムループＰ９を表すアミノ酸配列が、膜貫通ドメインＩＸとＸとを互いに分離するアミノ酸のストレッチとしてもはや同定されず、その結果、変異体の予測されたトポロジーが膜貫通ドメインＩＸとＸとの単一の膜貫通ドメインへの融合を示すという点で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹの膜トポロジーと比較して改変された膜トポロジーを示す。したがって、これらの変異体は、非膜貫通ループによって互いに分離された合計１１個の膜貫通ドメインを示す。

【0042】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較してラクトースの内部移行レベルが低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体は、前記変異体の機能性断片、すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列と比較した場合、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端が切断されているか、並びに／又はアミノ酸配列内に欠失を示すが、ラクトース輸送活性を示すラクトースパーミアーゼも含む。いくつかの実施形態では、切断型は、配列番号１のＬ２９２、Ｌ２９３及びＬ２９４に対応するロイシン残基の少なくとも１つが塩基性アミノ酸残基で置換されていることを含む。塩基性アミノ酸残基は、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）からなる群より選択されるアミノ酸である。

【0043】

驚くべきことに、膜貫通ヘリックスＩＸのアミノ酸配列中の３つのロイシン残基のうちの１つ以上のそれぞれが塩基性アミノ酸残基で置換されていることを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞と比較して、前記変異体を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によるラクトースの内部移行レベルの低下をもたらすことが見出された。しかしながら、ラクトースの内部移行は、本明細書において前述した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体の１つを発現する細菌細胞において無効にはされない。

【0044】

第２の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性レベルが低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹをコードするヌクレオチド配列を配列番号２で表す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において前述したＬａｃＹ変異体のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列である。

【0045】

いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列に関して２９２、２９３及び２９４のアミノ酸位置のうちの１つ以上について、ロイシン残基をコードするコドン（すなわち、ＣＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）又はＴＴ（Ａ／Ｔ））の代わりに、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＣＡＣ及びＣＡＴからなる群より選択されるコドンを含む。

【0046】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２で表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0047】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、核酸分子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹと比較して輸送活性が低下していて、かつ配列番号２で表されるヌクレオチド配列、及び／又は配列番号１で表されるアミノ酸配列に関して２９２、２９３及び２９４の位置の１つ以上のアミノ酸残基をコードするコドンが塩基性アミノ酸残基をコードするコドンで置き換えられている、配列番号２で示されるヌクレオチド配列の変異体で表されるヌクレオチド配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0048】

本明細書で使用される「ハイブリダイズする」という用語は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）に記載されているように、従来の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、６５℃において４×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、その後、６５℃において０．１×ＳＳＣ中で合計１時間の複数回の洗浄である。あまりストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件は、例えば、３７℃において４×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、その後、室温において１×ＳＳＣ中での複数回洗浄である。本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語はまた、０．２５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ ７．２、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ ＢＳＡ中６８℃において１６時間ハイブリダイズし、その後６８℃において２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳで２回洗浄することも意味し得る。

【0049】

核酸分子は、組換え又は合成の核酸分子である。核酸分子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって得られるアンプリコンなどの直鎖状核酸分子、酵母人工染色体などの染色体として存在してもよく、又はプラスミド、コスミド若しくは細菌人工染色体などの環状核酸分子として存在してもよい。

【0050】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、ラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹの変異体をコードするヌクレオチド配列は、前記核酸分子を含有する遺伝子操作された微生物細胞において、ラクトースパーミアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を行う発現制御配列に作動可能に連結される。

【0051】

本明細書で使用される「作動可能に連結される」という用語は、ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列である、ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、調節因子、転写因子結合部位、転写ターミネーター、リボソーム結合部位のアレイ）との間の機能的連結を指す。したがって、「プロモーター」という用語は、通常ＤＮＡポリマーにおいて遺伝子に「先行」し、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供するＤＮＡ配列を示す。「調節因子」ＤＮＡ配列もまた、通常所与のＤＮＡポリマーにおいて遺伝子の「上流側」にあり（すなわち、先行し）、転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質に結合する。集合的に「プロモーター／調節因子」又は「制御」ＤＮＡ配列と呼ばれ、機能性ＤＮＡポリマー中の選択された遺伝子（又は一連の遺伝子）に先行するこれらの配列は、遺伝子の転写（及び最終的な発現）が起こるかどうかを決定するために協働する。ＤＮＡポリマー中で遺伝子の後に「続き」、ｍＲＮＡへの転写の終結のためのシグナルを提供するＤＮＡ配列は、転写「ターミネーター」配列と呼ばれる。

【0052】

第３の態様によれば、遺伝子操作された微生物細胞、好ましくは目的のオリゴ糖を生産するための遺伝子操作された微生物細胞が提供され、前記微生物細胞はラクトースを内部移行することができ、すなわち該微生物細胞は、ラクトースが微生物細胞の環境に存在する場合にラクトースを内部移行する。遺伝子操作された微生物細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下している、ラクトースの内部移行のためのラクトースパーミアーゼの変異体を保有する。

【0053】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、本明細書において前述したラクトースパーミアーゼを保有する。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼは、膜貫通ドメインＩＸ中のロイシン残基の少なくとも１つが塩基性アミノ酸に置き換えられた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体である。

【0054】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、微生物細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較して輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較して輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、ラクトースパーミアーゼの発現のためのものである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較して輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼの発現のために、核酸分子のヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0055】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較して輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼ以外の他のいかなるラクトースパーミアーゼも保有しない。

【0056】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、ヌクレオチド活性化糖の細胞内生合成のための少なくとも１つの代謝経路を含む。ヌクレオチド活性化糖は、ＧＤＰ－フコース、ＣＭＰ－ＮｅｕＮＡｃ、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルコース、ＧＤＰ－マンノース、ＵＤＰ－グルコサミン又はＵＤＰ－ガラクトサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンであり得る。

【0057】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、ドナー基質としてのヌクレオチド活性化単糖から単糖部分をアクセプター分子に転移するための少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼを含む。グリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択され得る。アクセプター分子は、ラクトース及び還元末端にラクトース部分を有するオリゴ糖からなる群から選択される。

【0058】

第４の態様によれば、目的のオリゴ糖の生産のための、本明細書において前述した遺伝子操作された微生物細胞の使用が提供される。

【0059】

本明細書で使用される場合、「目的のオリゴ糖」という用語は、産生されることが意図されているオリゴ糖を指す。

【0060】

本明細書で使用される「オリゴ糖」という用語は、３～２０個の単糖残基からなる糖分子を指し、前記単糖残基のそれぞれは、グリコシド結合によって前記単糖単位の少なくとも１つの他のものに結合している。オリゴ糖は、単糖残基の直鎖であってもよいし、単糖残基の分枝鎖であってもよい。

【0061】

いくつかの実施形態では、目的のオリゴ糖は、その還元末端にラクトース部分を含むオリゴ糖である。さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、所望のオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。

【0062】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、所望のオリゴ糖は、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、２’，３－ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＩ（ＬＮｎＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＶ（ＬＮｎＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パララクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐａｒａＬＮＨ）、パララクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐａｒａＬＮｎＨ）、ジフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＤＦ－ＬＮｎＨ）、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩ、ラクト－Ｎ－フコシルヘキサオースＩＩ、パララクト－Ｎ－フコシルヘキサオース（ｐａｒａＬＮＨ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースａ（Ｆ－ＬＳＴ－ａ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースｂ（Ｆ－ＬＳＴ－ｂ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースｃ（Ｆ－ＬＳＴ－ｃ）、フコシル－ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースｃ、ジシアリル－ラクト－Ｎ－フコペンタオース、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（３Ｆ－３’－ＳＬ）、３－フコシル－６’－シアリルラクトース（３Ｆ－６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩ、３’－シアリルラクトース（３－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６－ＳＬ）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ－ｂ）、シラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＳＴ－ｃ）、ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳ－ＬＮＴ）、ジシアリル－ラクト－Ｎ－フコペンタオース（ＤＳ－ＬＮＦＰ Ｖ）、ラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩ（ＬＮｎＤＦＨ Ｉ）、３’－ガラクトシルラクトース（３’－ＧＬ）、６’－ガラクトシルラクトース（６’－ＧＬ）からなる群から選択されるＨＭＯ及び／又はオリゴ糖である。

【0063】

遺伝子操作された微生物宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。適切な微生物宿主細胞には、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞及び真菌細胞が含まれる。

【0064】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、原核細胞は細菌細胞、好ましくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）及びスポロラクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属の細菌から選択される細菌細胞である。適切な細胞種は、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーモフィルス（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．ラテロスポルス（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ミコイデス（Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃ．ユングダリ（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、Ｃ．オートエタノゲナム（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．サーモフィルス（Ｅ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルウィニア・ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）））、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．デルブルエッキィ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ラムノーサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ブルガリカス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ジェンセニー（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カルトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロピオニバクテリウム・フリューデンレイッヒイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。

【0065】

さらなる実施形態及び／又は代替の実施形態では、真核細胞は酵母細胞、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、特に、サッカロミセス・セレビシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ヤロウィア属 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐ．）、及びシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）からなる群から選択される酵母細胞である。

【0066】

別の態様によれば、目的のオリゴ糖の生産方法であって、目的のオリゴ糖が遺伝子操作された微生物細胞中で／遺伝子操作された微生物細胞によって合成される方法が提供される。次いで、方法は、目的のオリゴ糖を合成するための遺伝子操作された微生物細胞を提供することを含み、ここで、該遺伝子操作された微生物細胞は、本明細書において前述した遺伝子操作された微生物細胞である。遺伝子操作された微生物細胞は、培養培地において、遺伝子操作された微生物細胞が目的のオリゴ糖を合成するのに適した条件下で培養される。目的のオリゴ糖の生合成のために、遺伝子操作された微生物細胞は外因性ラクトースの存在下で培養される。本方法は、遺伝子操作された微生物細胞によって合成された目的のオリゴ糖を回収する工程をさらに含む。目的のオリゴ糖は、遺伝子操作された微生物細胞及び／又は培養培地から回収される。

【0067】

別の態様によれば、細菌細胞のラクトース死滅の影響を緩和するための方法であって、細菌細胞の内因性ラクトースパーミアーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼと置き換える工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ラクトースパーミアーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しており、本明細書において前述した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼの変異体である

【0068】

いくつかの実施形態では、内因性ラクトースパーミアーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼと置き換えることは、微生物細胞の（１又は複数の）内因性ラクトースパーミアーゼ遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子で置き換えることによって行われる。

【0069】

細菌細胞の内因性ラクトースパーミアーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ラクトースパーミアーゼＬａｃＹと比較してラクトースの輸送活性が低下しているラクトースパーミアーゼと置き換えることは、外因性ラクトースに曝露された場合、特に高濃度の外因性ラクトースに曝露された場合、細菌細胞の死滅を低減又は防止する。ラクトース死滅に対する微生物細胞の耐性を評価するために使用される場合の「高濃度のラクトース」という用語は、微生物細胞を培養するための培養培地中少なくとも５ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭ、最も好ましくは約２５ｍＭのラクトース濃度を意味する。

【0070】

別の態様によれば、微生物細胞中で、又は微生物細胞によって目的のオリゴ糖を生産する有効性及び／又は信頼性を改善する方法であって、遺伝子操作された微生物細胞を、目的のオリゴ糖の生合成のために外因性ラクトースの存在下で培養スル必要がある方法が提供される。この方法は、目的のオリゴ糖の生産のために本明細書において前述した微生物細胞を提供する工程を含む。前記微生物細胞は、ラクトースの輸送活性が低下している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの変異体を保有する。微生物細胞は、外因性ラクトースを内部移行することによって目的のオリゴ糖を合成することができる。微生物細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹを保有する微生物細胞と比較して、微生物細胞によるラクトース内部移行レベルが低いため、外因性ラクトースの添加／存在に対する感受性が低い。したがって、微生物細胞の培養及び／又は微生物細胞によるオリゴ糖の産生は、外因性ラクトースの存在及び／又は添加に対する感受性が低い。

【0071】

微生物細胞中又は微生物細胞によるオリゴ糖の産生をより効率的及び／又はより信頼性の高いものにすることは、大規模／工業生産方法において特に興味深い。「大規模」及び「工業的」という用語は、目的のオリゴ糖の生産を、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１万Ｌ、５万Ｌ、１０万Ｌ又はさらには２０万Ｌを超える発酵ブロスの体積での微生物発酵によって行うことを示す。

【0072】

本発明を特定の実施形態に関して図面を参照して説明するが、本発明はそれに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、明細書及び特許請求の範囲における第１、第２などの用語は、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも時間的、空間的、序列的、又は他の様式で順序を説明するためのものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換的であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載又は図示されている以外の順序で作業できることを理解されよう。

【0073】

特許請求の範囲で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、その後に列挙される手段に限定されるものではなく、他の要素又は工程を排除するものではないと解釈されるべきであることに留意されたい。したがって、明言された特徴、整数、工程又は言及された構成要素の存在を指定するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の他の特徴、整数、工程若しくは構成要素、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを備える装置」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではない。これは、本発明に関して、単に装置の関連構成要素がＡ及びＢであることを意味する。

【0074】

本明細書を通して「一実施形態」又は「ある実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における「一実施形態では」又は「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではないが、そうであってもよい。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な様式で組み合わせることができる。

【0075】

同様に、本発明の例示的な実施形態の説明において、本発明の様々な特徴は、本開示を簡素化し、様々な発明の態様のうちの１つ以上の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図、又はその説明にまとめられることがあることを理解されたい。しかしながら、この開示方法が、特許請求される発明が、各請求項に明示的に列挙されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の前述の開示された実施形態のすべての特徴よりも少ない。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、この詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項は、本発明の個別の実施形態として独立している。

【0076】

さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが、他の特徴を含まず、異なる実施形態の特徴の組み合わせは本発明の範囲内であり、当業者によって理解されるように、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、以下の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも、任意の組み合わせで使用することができる。

【0077】

さらに、実施形態のいくつかは、コンピュータシステムのプロセッサによって、又は機能を実行する他の手段によって実施することができる方法又は方法の要素の組み合わせとして本明細書に記載されている。したがって、そのような方法又は方法の要素を実行するために必要な命令を有するプロセッサは、該方法又は方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、装置実施形態の本明細書に記載の要素は、本発明を実施する目的で要素によって実行される機能を実行するための手段の一例である。

【0078】

本明細書で提供される説明及び図面には、多数の具体的な詳細が記載されている。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細なしでも実施され得ることが理解されよう。他の例では、この説明の理解を不明瞭にしないために、周知の方法、構造、及び技術は詳細に示されていない。

【0079】

次に、本発明を、本発明のいくつかの実施形態の詳細な説明によって説明する。本発明の他の実施形態は、本発明の真の精神又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成することができ、本発明は添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されることは明らかである。

【実施例】

【0080】

［実施例１］ ＬＣ／ＭＳ分析
ＬＣトリプル四重極ＭＳ検出システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－８０５０）を使用した多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によって、生成されるラクト－Ｎ－テトラオースの同一性を判定した。前駆体イオンを選択し、四重極１で分析した後、アルゴンを用いた衝突誘起フラグメンテーション（ＣＩＤ）及び四重極３でのフラグメントイオンの選択を行った。中間体及び最終生成物代謝産物の選択されたトランジション及び衝突エネルギーを表５に列挙する。

【0081】

【表5】

【0082】

粒子を含まない培養上清又は細胞質画分中のオリゴ糖ＬＮＴを、中性糖又は酸性糖の両方についてＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ、２．１Å ５０ｍｍ）を使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離した。０．１％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウムを含むＨ_２Ｏの定組成流で中性糖を溶出した。ＨＰＬＣシステムは、中性糖の溶出のために８℃で作動するＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ＳＩＬ－３０ＡＣ_ＭＰオートサンプラー、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＤポンプ、及び３５℃で作動するＳｈｉｍａｄｚｕ ＣＴＯ－２０ＡＣカラムオーブンを包含し、酸性糖の溶出のために５０℃に調整した。ＬＮＴの分析のために、１μｌを機器に注入した。流速は、５分の実行時間に相当する０．３ｍＬ／分に設定した。ＬＮＴを負イオンモードで分析した。質量分析計をユニット分解能で操作した。衝突エネルギー、Ｑ１及びＱ３ｐｒｅ－ｂｉａｓを各分析物に対して最適化した。定量方法は、市販の標準（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ及びＥｌｉｃｉｔｙｌ）を用いて確立した。

【0083】

［実施例２］ 最小培養培地
所望のオリゴ糖を生産するために細胞を増殖させるために使用した培養培地は、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１２ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）ＳＯ_４、０．３ｇ／Ｌ クエン酸、０．１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４×７ Ｈ_２Ｏ及び０．０１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２×６ Ｈ_２Ｏを含有し、１ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（５４．４ｇ／Ｌ クエン酸アンモニウム鉄、９．８ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２×４ Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ_２×６ Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ_２×２ Ｈ_２Ｏ、１．９ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２×４ Ｈ_２Ｏ、１．１ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４×２ Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＳｅＯ_３、１．５ｇ／Ｌ ＮｉＳＯ_４×６ Ｈ_２Ｏ）を添加した。培地のｐＨを７．０に調整した。細胞による所望のオリゴ糖の合成及びラクトースに対する細胞の感受性を試験するために、ラクトースを１０ｍＭ～２５ｍＭの濃度で培地に添加した。

【0084】

［実施例３］ ラクトース感受性が低下したラクトース－Ｎ－テトラオース産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の生成
遺伝子操作によって、ラクトン－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）を産生することができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１の代謝操作誘導体（ＤＥ３）を得た。ラクトースに対する前記細菌ＬＮＴ産生株の感受性を低下させるために、この株の内因性ｌａｃＹ遺伝子を、ミスマッチオリゴヌクレオチドを使用することによって改変して、ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）をコードするｌａｃＹ変異体ｌａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を作製した。

【0085】

発現分析のために、上述の突然変異誘発アプローチから得られた個々のクローンを、振盪フラスコ中の２５ｍｌの無機塩培地に接種した。各クローンの発現分析を３回反復で行った。細菌細胞を、１２０ｒｐｍで一定に撹拌しながら、３０℃及び相対湿度８０％で増殖させた。２０時間の培養後、これらの前培養物の光学密度を決定し、本培養物を、２５ｍｌの無機塩培地中ＯＤ_６００が０．０５になるように播種した。本培養物を、前培養物を培養したのと同じ条件下で２０時間培養した。次いで、細菌細胞を遠心分離によって回収し、ＲＮＡの抽出及びその後のｑＰＣＲによる発現分析に使用した。発現レベルの相対定量化を、比較Δサイクル閾値法を使用して行い、計算した相対発現値をｇａｐＡに対して正規化し、対照として使用した親株における発現レベルと比較した。結果を図３に示す。ＬａｃＹ（図３、カラムＡ）の相対発現は、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）の相対発現と同レベルであった（図３、カラムＢ）。したがって、ラクトースパーミアーゼ変異体ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）をもたらす突然変異をｌａｃＹ遺伝子に導入しても、それぞれのラクトースパーミアーゼ遺伝子の発現は改変されなかった。

【0086】

ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有する細菌ＬＮＴ産生株のラクトース感受性を試験するために、前記株の個々のクローンを振盪フラスコ中の２５ｍｌの無機塩培地に接種した。細菌細胞を、１２０ｒｐｍで一定に撹拌しながら、３０℃及び８０％相対湿度で増殖させた。２０時間の培養後、この前培養物の光学密度を決定し、本培養物を、２５ｍｌの無機塩培地中ＯＤ_６００が０．３になるように播種した。培養物の接種の２時間後にラクトースを培養培地に添加して、最終濃度を１０又は２５ｍＭにした。ラクトース添加２０時間後に、本培養物の光学密度（ＯＤ_６００）を決定した。

【0087】

光学密度を図４に示す。この図により、ＬａｃＹを保有する細菌株（黒色のカラム）が、培養培地中ラクトース非存在下でラクトースパーミアーゼ変異体ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を保有する細菌株（白色のカラム）と同様の増殖を示すことが明らかである（カラムのサブセットＩ）。１０ｍＭラクトース（カラムのサブセットＩＩ）又は２５ｍＭラクトース（カラムのサブセットＩＩＩ）の存在下では、ＬａｃＹを保有する細菌細胞の増殖は、ラクトースの非存在下での増殖と比較して大幅に減少したが、ラクトースパーミアーゼ変異体ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を保有する細菌細胞の増殖は、それらの培養培地中１０ｍＭ又は２５ｍＭのラクトースの存在下で減少しなかった。

【0088】

［実施例４］ ^１４Ｃ標識ラクトースを使用した、ラクトース導入量の定量
ラクトース輸送を測定するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースパーミアーゼＬａｃＹの異なる変異体を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を３ｍｌ ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で２０時間培養した。これらの培養物からの細菌細胞ペレットを使用して、振盪フラスコ中の１００ｍｌの最小培地に接種した。これらの培養物をシェーカーにおいて３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、細菌細胞を遠心分離によって沈降させ、得られたペレットを新鮮な冷（４℃）培養培地で２回洗浄し、最後に冷培地に再懸濁した。細胞懸濁液の光学密度（ＯＤ_６００）を冷培地で５に設定し、内部移行アッセイに使用するまで細胞懸濁液を氷上で保存した。

【0089】

輸送アッセイの３分前に、細菌細胞を３７℃のサーモブロックに入れた。輸送アッセイを、^１４Ｃ標識ラクトース及び非放射標識ラクトースの混合物を０．５ｍＭラクトース及び５０，０００ｄｐｍの最終濃度まで添加することによって開始した。３０秒のインキュベーション時間後、ニトロセルロースフィルター（細孔径０．２２μＭ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ＤＥ）を含むフィルターシステムを使用して細菌細胞をそれらの培地から分離することによって輸送アッセイを停止した。フィルター上の細菌細胞を１００ｍＭ ＬｉＣｌで２回洗浄し、続いてフィルターを使用して、残存放射能をＴｒｉｃａｒｂ ２８００シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍａｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において定量した。この目的のために、フィルターをシンチレーションチューブ内に移し、６ｍｌのＲｏｔｉｓｚｉｎｔ ｅｃｏ ｐｌｕｓ（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ＤＥ）を重ねた。

【0090】

実験の第２セットでは、輸送アッセイを、^１４Ｃ標識ラクトース及び非放射標識ラクトースの混合物を５ｍＭラクトース及び５５０，０００ｄｐｍの最終濃度まで添加することによって開始した。６０秒のインキュベーション後、ろ過により細菌細胞を回収し、５ｍＭの非標識ラクトースを含有する培地３ｍｌで２回洗浄した。

【0091】

図５に見ることができるように、ＬａｃＹを保有する細菌細胞（黒色のカラム）は、ラクトースパーミアーゼ変異体ＬａｃＹを保有する細菌細胞（Ｌ２９３Ｒ）（白色のカラム）よりもはるかに多くの放射能が取り込まれており、図５Ａは０．５ｍＭの外因性ラクトース濃度でのラクトース内部移行を示し、図５Ｂは５ｍＭの外因性ラクトース濃度でのラクトース内部移行を示す。したがって、ラクトースパーミアーゼ変異体ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）は、ＬａｃＹと比較して減少しているが検出可能な細菌細胞へのラクトース取り込みをもたらす。

【0092】

［実施例５］ 実験室規模の発酵における、代謝操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるラクト－Ｎ－テトラオース産生
細菌株によるラクトース取り込みの減少及びラクトース感受性の減少がそのオリゴ糖産生に及ぼす影響を小規模発酵で分析した。したがって、ＬａｃＹを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株及びＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によるＬＮＴの発酵生産を３リットル規模で比較した。

【0093】

発酵の第１セットでは、各細菌株を、２０ｍＭラクトースを含有する発酵ブロス中の前培養物から接種した。ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は増殖に何ら問題を示さなかったが、野生型ＬａｃＹを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ｓｔａｉｎ）は増殖に著しい遅延を示し（データ非掲載）、この実験アプローチはＬＮＴ産生を比較するのに適していないと言える。さらに、ラクトースレベルは、連続ラクトース供給（３．２ｍｌ／Ｌ／時）を適用することによって、ＯＤ_６００の逆行を引き起こすことなく、また、明らかなラクトースに起因する細胞溶解を引き起こすことなく、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の培養物において高く維持することができる。

【0094】

ラクトースの存在下でＬａｃＹを有する細菌の増殖の著しい遅延にもかかわらず、異なるＬＮＴ産生株のＬＮＴ産生を比較するために、ラクトースを欠く培養培地に菌株を接種した。これらの培養物では、ラクトース供給物（２．５ｍｌ／Ｌ／時）をバッチ相の終わりに開始した。しかしながら、より低いラクトース供給物を使用したにもかかわらず、ＯＤ_６００の低下が、ＬａｃＹを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において４０時間後に観察された。

【0095】

小規模発酵の結果を図６及び図７に表す。図６は、ＬａｃＹの代わりにＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有する細菌株（ｘ）と比較した、ＬａｃＹ を有する細菌株（●）のＬＮＴ産生の相対量を示し、それらの培養培地中での両株の増殖を図７に示す。

【0096】

ＬａｃＹ を有するＬＮＴ産生株（●）の増殖は約２５時間後に著しく損なわれるが、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有するＬＮＴ産生株（ｘ）は発酵全体を通して規則的な増殖動態を示し、培養物の光学密度はより高くなる（図７）。

【0097】

驚くべきことに、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有する株（ｘ）から得られたＬＮＴの収率は、図６から推測できるように、ＬａｃＹ を有するＬＮＴ産生株（●）から得られた収率より高かった。ＬａｃＹを有するＬＮＴ産生株を使用した１２０時間の発酵におけるＬＮＴ量を１００％に設定した。

【0098】

ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の、バッチ培地中のラクトースを処理する能力により、この株は、ＬＮＴの産生をより速く開始することができ、したがって、野生型ＬａｃＹを有する対照株より多くのＬＮＴを産生できる。しかしながら、ラクトース感受性の低下の最大の利点は、オリゴ糖産生のためにラクトースを供給した際の細胞溶解のリスク及び発酵の全損の可能性を巧みに回避する能力である。

【0099】

［実施例６］ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹ変異体の膜トポロジーの決定
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹの様々な変異体のアミノ酸配列が、以下の論文においてＳＰＬＩＴ ４．０サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｌｉｔｂｉｏｉｎｆ．ｐｍｆｓｔ．ｈｒ／ｓｐｌｉｔ／４／）を使用してそれらの膜貫通二次構造の予測に供されており、その中に記載されている：
Ｊｕｒｅｔｉｃ，Ｄ．，Ｚｏｒａｎｉｃ，Ｌ．，Ｚｕｃｉｃ，Ｄ．”Ｂａｓｉｃ ｃｈａｒｇｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｐｏｌｏｇｙ” Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．６２０－６３２，２００２．
Ｊｕｒｅｔｉｃ，Ｄ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｋ．，Ｔｒｉｎａｊｓｔｉｃ，Ｎ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｗ．”Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３３，２５５－２７３（１９９３）．
Ｊｕｒｅｔｉｃ，Ｄ．，Ｌｕｃｉｃ，Ｂ．，Ｚｕｃｉｃ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｒｉｎａｊｓｔｉｃ，Ｎ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｓｃａｌｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．” Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．４０５－４４５．Ｅｄｉｔｏｒ：Ｐａｒｋａｎｙｉ，Ｃ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８．（ＳＰＬＩＴ ３．１の結果がその論文に記載されている）
Ｊｕｒｅｔｉｃ，Ｄ．，Ｚｕｃｉｃ，Ｄ．，Ｌｕｃｉｃ，Ｂ．ａｎｄ Ｔｒｉｎａｊｓｔｉｃ，Ｎ．”Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｕｒｉｅｄ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４，ｐｐ．２７９－２９４，１９９８．（ＳＰＬＩＴ ３．１の結果が、同様にその論文に記載されている）
Ｊｕｒｅｔｉｃ，Ｄ．ａｎｄ Ｌｕｃｉｎ Ａ．”Ｔｈｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｌｉｃａｌ ｔｕｒｎｓ ｗｉｔｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ．” Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．４，ｐｐ．５７５－５８５，１９９８．（ＳＰＬＩＴ ３．５の結果がその論文に記載されている）
Ｊｕｒｅｔｉｃ，Ｄ．，Ｊｅｒｏｎｃｉｃ，Ａ．ａｎｄ Ｚｕｃｉｃ，Ｄ．”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ＳＰＬＩＴ．” Ｃｒｏａｔｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．４，ｐｐ．９７５－９９７，１９９９．
Ｊｕｒｅｔｉｃ，Ｄ．，Ｊｅｒｏｎｃｉｃ，Ａ．ａｎｄ Ｚｕｃｉｃ，Ｄ．”Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ．” Ｐｅｒｉｏｄｉｃｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｏｒｕｍ １０１，Ｎｏ ４，３３９－３４７，１９９９．

【0100】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹの疎水性を図８Ａ及び図９Ａに示し、疎水性の評価により、曲線下のボックスＩ～ＸＩＩで示すように、ラクトースパーミアーゼ内に１２個の膜貫通ドメインが存在することが明らかになった。変異体ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｈ）の疎水性の評価は膜貫通ドメインの数の変化を示さなかったが（図９Ｂ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹ変異体ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）（図９Ｃ）及びＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｋ）（図９Ｄ）、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹ変異体ＬａｃＹ（Ｌ２９２Ｒ）（図８Ｂ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９４Ｒ）及びＬａｃＹ（Ｌ２９２Ｒ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９３Ｒ）、ＬａｃＹ（Ｌ２９４Ｒ）（図１０）は、膜貫通ドメインの予測においてペリプラズムループＰ９（図２）が考慮されないような、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬａｃＹに関して野生型膜貫通ドメインＩＸ及びＸの単一膜貫通ドメインへの融合をもたらす変化した疎水性を示すことが見出された。しかし、ＬａｃＹ変異体の膜トポロジーの予測変化は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ＬａｃＹの膜トポロジーと比較して、ＬａｃＹ変異体によるラクトースの膜貫通輸送を完全には無効にしない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2023554525000001.app

【国際調査報告】