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特表2023-554526６’－シアリルラクトースの生産のためのシアリルトランスフェラーゼ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】６’－シアリルラクトースの生産のためのシアリルトランスフェラーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231220BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20231220BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231220BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231220BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231220BHJP
C12N 1/13 20060101ALI20231220BHJP
C12P 19/12 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/10 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N1/13
C12P19/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538000
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(85)【翻訳文提出日】2023-08-18
(86)【国際出願番号】 EP2020087660
(87)【国際公開番号】W WO2022135700
(87)【国際公開日】2022-06-30
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511149751
【氏名又は名称】クリスチャン．ハンセン・ハー・エム・オー・ゲー・エム・ベー・ハー
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イェネバイン，シュテファン
(72)【発明者】
【氏名】ワルテンベルク，ディルク
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF03
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA19
4B064CC24
4B064CD09
4B064DA10
4B065AA01X
4B065AA49Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA83X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB06
4B065BB08
4B065BB15
4B065BB16
4B065CA20
4B065CA41
(57)【要約】
６’－シアリルラクトースの発酵生産のための酵素、組成物、遺伝子操作された細胞及び方法が開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
６’－シアリルラクトースの生産において使用するためのα－２，６－シアリルトランスフェラーゼであって、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼである、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ。
【請求項2】
α－２，６－シアリルトランスフェラーゼが、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０又は少なくとも３００のアミノ酸の一続きにわたって、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ。
【請求項3】
α－２，６－シアリルトランスフェラーゼが、配列番号１又は配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ。
【請求項4】
６’－シアリルラクトースの生産のための遺伝子操作された細胞であって、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項5】
細胞が、原核細胞及び真核細胞からなる群から選択され、好ましくは酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項４に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項6】
α－２，６－シアリルトランスフェラーゼが、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０又は少なくとも３００のアミノ酸の一続きにわたって、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４又は５に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項7】
α－２，６－シアリルトランスフェラーゼが、配列番号１又は配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項8】
細胞が、本明細書において前述されたラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する、請求項４～７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ａ）少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１及び２のうちの任意の１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号３及び配列番号４によって表されるヌクレオチド配列；
ｄ）ａ）～ｃ）に記載されるヌクレオチド配列のうちの任意の１つに相補的なヌクレオチド配列；並びに
ｅ）ストリンジェントな条件下において、ａ）～ｄ）に記載されるヌクレオチド配列のうちの任意の１つとハイブリッド形成するヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
【請求項9】
細胞内で６’－シアリルラクトースを生産するための方法であって、・６’－シアリルラクトースの生産のための遺伝子操作された細胞を提供することであって、前記細胞は、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている、提供すること；
・培養培地中で及び６’－シアリルラクトースの生産を許容する条件下で前記細胞を培養すること；並びに
・前記６’－シアリルラクトースを任意に回収すること、
を含む、方法。
【請求項10】
培養培地が、グルコース、フルクトース、スクロース及びグリセロールからなる群から選択される少なくとも１つの炭素源を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
培養培地が、ラクトース、ガラクトース及びシアル酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含有する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
６’－シアリルラクトースが、培養培地及び／又は細菌細胞から回収される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸付加されたオリゴ糖の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
１５０を超える構造的に異なるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）が、これまでに同定されている。ＨＭＯは総ヒト乳栄養素の僅かな量に相当するにすぎないが、母乳で育てられた乳児の発達に対するそれらの有益な効果が、過去数十年にわたって明らかとなった。
【0003】
ＨＭＯの中でも、シアル酸付加されたＨＭＯ（ＳＨＭＯ）は、腸病原性細菌及びウイルスに対する乳児の抵抗性を支えることが観察された。興味深いことに、最近の研究は、早期産児における最も一般的で致死的な疾患の１つである壊死性腸炎に対する長鎖ＳＨＭＯの保護的効果をさらに実証した。さらに、ＳＨＭＯは、乳児の脳の発達及びその認知能力を支えると考えられている。また、シアル酸付加されたオリゴ糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を含む様々な病原性微生物のエンテロトキシンを中和することが示されている。さらに、シアル酸付加されたオリゴ糖は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）による腸のコロニー形成を妨害し、それによって胃潰瘍及び十二指腸潰瘍を予防又は阻害することができることが見出された。
【0004】
ヒトの乳中のシアル酸付加されたオリゴ糖の中で、３’－シアリルラクトース、６’－シアリル－ラクトース、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｃ及びジシアリルラクト－Ｎ－テトラオースが最も一般的なメンバーである。
【0005】
シアル酸付加されたオリゴ糖は複雑な構造を有するので、それらの化学的又は（化学）酵素的合成は困難であり、広範囲の困難、例えば立体化学の制御、特異的結合の形成、供給原料の入手可能性などを伴う。その結果、市販のシアル酸付加されたオリゴ糖は、天然源での量が少ないため極めて高価であった。
【0006】
ＳＨＭＯＳが商業的に入手できないことを克服するために、シアル酸付加されたオリゴ糖を生産するための微生物の代謝改変操作において努力が行われてきたが、これは、このアプローチが産業的規模でＨＭＯを生産するための最も有望な方法であると思われるためである。
【0007】
微生物発酵は、少なくとも１つの異種グリコシルトランスフェラーゼを、（過剰）発現する遺伝子改変された微生物を使用する。培地中で及び微生物が異種グリコシルトランスフェラーゼを発現することを許容する条件下でこのような微生物を培養すると、ＨＭＯが、微生物によって生産され得そして培養培地又は細胞可溶化物から回収され得る。
【0008】
しかしながら、シアリルトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼは、通例、幅広い基質を使用するので、所望のオリゴ糖を産生するためのグリコシルトランスフェラーゼの（過剰）発現は、通常望ましくない副生成物をもたらす。典型的には、これらの副生成物もオリゴ糖であるが、生産物の商業的使用のためには所望のオリゴ糖調製物から除去されなければならない。しかしながら、所望のオリゴ糖からそのような副生成物を除去することは困難かつ面倒である場合がある。
【0009】
例えば、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）及びフォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から細菌種由来のいくつかのシアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａＴ）が今日までに同定及び性質決定されている他、哺乳動物及びウイルス由来からも、同定及び性質決定されている。シアリルトランスフェラーゼは、一般に、タンパク質配列類似性に基づいて６つのグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）ファミリーに分類されている。すべての真核生物及びウイルスのシアリルトランスフェラーゼはＧＴファミリー２９に分類されるのに対して、細菌のＳｉａＴはＧＴ４、ＧＴ３８、ＧＴ４２、ＧＴ５２又はＧＴ８０ファミリーの１つに分類される。さらに、シアリルトランスフェラーゼ及びポリシアリルトランスフェラーゼは、それらが形成するグリコシド結合によって、例えばα－２，３－、α－２，６－及びα－２，８－シアリルトランスフェラーゼに区別することができる。これらのシアリルトランスフェラーゼはすべて、シチジン５’－一リン酸シアル酸（例えば、ＣＭＰ－ＮｅｕＮＡｃ）から様々なアクセプタ分子、通常はガラクトース（Ｇａｌ）部分、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分又はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分又は別のシアル酸（Ｓｉａ）部分にシアル酸残基を転移する。
【0010】
いくつかの細菌α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは過去に十分に性質決定されており、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）の生産に適していることが既に証明されている。微生物性６’－ＳＬ生産のために最も一般的に使用される酵素は、海洋細菌に由来する：フォトバクテリウム属種（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＪＴ－ＩＳＨ－２２４のＰｓｔ－６、フォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ）ＪＴ０１６０のＳｔ０１６０、フォトバクテリウム・レイオグナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）ＪＴ－ＳＨＩＺ－１１９のＰｌｓＴ６及びフォトバクテリウム・レイオグナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）ＪＴ－ＳＨＩＺ－１４５のＰｌｓＴ６。しかしながら、これらの公知の細菌α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、望ましくない副生成物としてジシアリルラクトースも生産する。
【0011】
Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４５（２０１０）１３９４－１３９９）は、海洋細菌フォトバクテリウム属種（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＪＴ－ＩＳＨ－２２４のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする、操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞による６’－シアリルラクトースの生産を、開示している。この酵素の特異性の低さ（広いアクセプタ／ドナー基質受容性）のために、６，６’－ジシアリルラクトース及びＫＤＯ－ラクトースなどの副生成物が培養中に形成される。シアリルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を下方制御することによってのみ、これらの炭水化物副生成物の蓄積を制限することができる。しかしながら、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子発現の下方制御は、製造過程の生産性のみならずその産業上の利用可能性を制限するので、望ましくない妥協である。
【0012】
Ｍｅｈｒ ａｎｄ Ｗｉｔｈｅｒｓ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２６（２０１６）：３５３－３５９）は、代表的なα－２，６－シアリルトランスフェラーゼであるフォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ）ＪＴ０１６０のＳｔ０１６０及びフォトバクテリウム属種（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＪＴ－ＩＳＨ－２２４のＰｓｔ－６を使用して、グリコシルトランスフェラーゼファミリー８０由来の細菌シアリルトランスフェラーゼのシアリダーゼ活性（シアル酸付加された炭水化物の脱シアリル化／加水分解）及びトランスシアリダーゼ活性（シアル酸付加された炭水化物からアクセプタ基質へのシアル酸残基の転移）を記載している。６’－シアリルラクトースなどの異なるシアル酸付加生成物の生産のための過程におけるシアリルトランスフェラーゼの所望の用途を考慮すると、生成物の変換及び／又は分解をもたらす酵素活性は、明らかに非生産的である。
【0013】
先行技術は、産業的規模での６’－シアリルラクトースなどのシアル酸付加されたオリゴ糖の経済的生産に対する大きな制約を明確に開示している。特に、先行技術は、６’－シアリルラクトース産生細菌株によるジシアリルラクトースの形成を実行可能な様式でどのように防止するかについて教示していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４５ （２０１０） １３９４－１３９９）
【非特許文献2】Ｍｅｈｒ ａｎｄ Ｗｉｔｈｅｒｓ （Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２６ （２０１６）：３５３－３５９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
したがって、本発明の目的は、産業的規模での微生物発酵による６’－シアリルラクトースの生産のための改善された方法であって、ジシアリルラクトースなどの望ましくない副生成物の同時形成が防止されるか又は少なくとも有意に低減される方法を、提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【0016】
この目的は、酵素によって触媒されるシアリル化反応のための基質としてシアリルラクトースに対して低い特異性を示すか又は特異性を示さないα－２，６－シアリルトランスフェラーゼの同定、及び６’－シアリルラクトースの生産におけるそれらの使用の提供によって解決される。したがって、本明細書では、とりわけ、６’－シアリルラクトースの生産のための酵素、組成物、遺伝子操作された細胞及び方法が提供される。
【0017】
第１の態様によれば、６’－シアリルラクトースの生産において使用するためのα－２，６－シアリルトランスフェラーゼであって、前記α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼである、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼが、提供される。
【0018】
第２の態様によれば、６’－シアリルラクトースの生産のための遺伝子操作された細胞であって、前記細胞は、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている細胞が、提供される。
【0019】
第３の態様によれば、６’－シアリルラクトースの発酵生産のための方法であって、６’－シアリルラクトースの生産のための遺伝子操作された細胞を提供すること、ここで、前記細胞は、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている；培養培地中で及び６’－シアリルラクトースの生産を許容する条件下で前記細胞を培養すること；並びに前記６’－シアリルラクトースを任意に回収すること、を含む方法が、提供される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図2】図２は、シアリルトランスフェラーゼｐｌｓＴ６（Ｆ）をコードする操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（実施例２に記載）の培養後に検出可能な炭水化物を示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す。Ｓ：標準物質。
【図3】図３は、ドナー基質としてＣＭＰ－ＮｅｕＮＡｃを提供し、アクセプタ基質として２０ｍＭラクトースを提供した場合の、様々な酵素のシアリルトランスフェラーゼ活性を示す、例示的なインビトロアッセイからの薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
第１の態様によれば、６’－シアリル－ラクトースの生産のためのα－２，６－シアリルトランスフェラーゼが提供される。
【0022】
本明細書で使用される「６’－シアリルラクトース」（６’－ＳＬ）という用語は、単糖残基グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）及びＮ－アセチルノイラミン酸／シアル酸（ＮｅｕＮＡｃ）からなる三糖であって、図１に示される化学構造ＮｅｕＮＡｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃを有する化合物を形成する、三糖を指す。
【0023】
本明細書で使用される「シアリルトランスフェラーゼ」という用語は、シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができるポリペプチドを指す。「シアリルトランスフェラーゼ活性」とは、ドナー基質、典型的にはＣＭＰ－ＮｅｕＮＡｃからアクセプタ分子へのＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基の転移を指す。「シアリルトランスフェラーゼ」という用語は、本明細書に記載されるシアリルトランスフェラーゼの機能的断片、本明細書に記載されるシアリルトランスフェラーゼの機能的バリアント及び機能的バリアントの機能的断片を含む。これに関して「機能的」とは、断片及び／又はバリアントがシアリルトランスフェラーゼ活性を有することを意味する。シアリルトランスフェラーゼの機能的断片は、その天然に存在する遺伝子によってコードされるシアリルトランスフェラーゼの切断型を包含し、この切断型は、シアリルトランスフェラーゼ活性を有することができる。切断型の例は、典型的にはポリペプチドを特定の細胞内局在化に誘導するいわゆるリーダー配列を含まないシアリルトランスフェラーゼである。典型的には、このようなリーダー配列は、その細胞内輸送中にポリペプチドから除去され、天然に存在する成熟シアリルトランスフェラーゼには存在しない。
【0024】
本開示のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、Ｎ－アセチルノイラミン酸残基をドナー基質からアクセプタ分子に転移することができる。異種シアリルトランスフェラーゼに関して「することができる」という用語は、異種シアリルトランスフェラーゼのシアリルトランスフェラーゼ活性を、異種シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を有するために適切な反応条件が必要とされるという場合に限って、指す。適切な反応条件が存在しない場合、異種シアリルトランスフェラーゼは、その酵素活性を有さないが、適切な反応条件が回復したときにその酵素活性を保持し、その酵素活性を有する。適切な反応条件には、適切なドナー基質の存在、適切なアクセプタ分子の存在、必須の補因子（例えば一価又は二価イオンなど）の存在、適切な範囲のｐＨ値、適切な温度などが含まれる。異種シアリルトランスフェラーゼの酵素反応をもたらすあらゆる因子についての最適値が満たされる必要はないが、反応条件は、異種シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を発揮するようなものでなければならない。したがって、「することができる」という用語は、異種シアリルトランスフェラーゼの酵素活性が不可逆的に損なわれている任意の条件を除外し、任意のそのような条件への異種シアリルトランスフェラーゼの曝露も除外される。代わりに、「することができる」とは、許容的な反応条件（シアリルトランスフェラーゼがその酵素活性を発揮するために必要なすべての要件）がシアリルトランスフェラーゼに提供されれば、シアリルトランスフェラーゼが酵素的に活性である、すなわちそのシアリルトランスフェラーゼ活性を有することを意味する。
【0025】
シアリルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼが形成するグリコシド結合の種類で区別することができる。本明細書で使用される場合、「α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ」及び「α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ガラクトース又はアクセプタ分子のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸を付加するポリペプチド及びそれらの酵素活性を指す。同様に、「α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ」及び「α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ガラクトース又はアクセプタ分子のガラクトース残基にα－２，６結合でシアル酸を付加するポリペプチド及びそれらの酵素活性を指す。
【0026】
本開示のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、ラクトース受容性シアリルトランスフェラーゼである。したがって、二糖ラクトースは、ドナー基質ＣＭＰ－ＮｅｕＮＡｃからのＮｅｕＮＡｃ部分の転移のための、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼのアクセプタ基質である。
【0027】
本開示のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、シアリルラクトース、すなわち３’－ＳＬ又は６’－ＳＬを基質として受容しない。より具体的には、本開示のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、実施例３において本明細書の以下で記載されるインビトロシアリル化反応によって決定された場合に、ドナー基質としてのＣＭＰ－ＮｅｕＮＡｃからのＮｅｕＮＡｃ部分の転移のためのアクセプタ基質としても、前記シアリルラクトースからアクセプタ基質としてのラクトースへのＮｅｕＮＡｃ部分の転移のためのドナー基質としても、シアリルラクトースを受容しない。したがって、本開示のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、ジシアリルラクトースの形成を触媒することができない。さらに、本開示のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、トランスシアリダーゼ活性を有さない。
【0028】
本開示のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0030】
配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列は、推定的シアリル－トランスフェラーゼについて検索されたゲノムデータベースから明らかにされた。配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）由来の推定遺伝子によってコードされることが見出された。
【0031】
様々な実施形態では、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、又は少なくとも３００のアミノ酸からなるアミノ酸の一続きを含む。
【0032】
一実施形態では、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0033】
いくつかの実施形態において、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、配列番号１又は配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む。
【0034】
配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列は、推定的シアリルトランスフェラーゼについて検索されたゲノムデータベースから検索された。配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）属の細菌細胞のゲノム中に存在するヌクレオチド配列によってコードされることが見出された。前記ヌクレオチド配列は、データベースからのそれらの検索の時点では注釈付けされなかったが、それまでの間、推定的シアリルトランスフェラーゼとして注釈付けされた。しかしながら、推定的シアリルトランスフェラーゼとしての注釈付けは、それらの酵素活性の同定又は分類なしに行われた。
【0035】
第２の態様によれば、細胞中での６’－シアリルラクトースの生産のための遺伝子操作された細胞であって、前記細胞は本明細書で前述したラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有する、細胞が提供される。様々な態様において、細胞は、前記ラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。
【0036】
本明細書で使用される「遺伝子操作された」という用語は、分子生物学的方法を使用した細胞の遺伝的構成の改変を指す。細胞の遺伝的構成の改変には、種の境界内での及び／又は種の境界を越える遺伝子の移入、ヌクレオチド、トリプレット、遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター並びに遺伝子発現を媒介及び／又は調節する他のヌクレオチド配列の挿入、欠失、置換及び／又は改変が含まれ得る。細胞の遺伝的構成の改変は、特定の所望の特性を有する遺伝子改変された生物を生成することを目的とする。遺伝子操作された細胞は、細胞の天然の（遺伝子操作されていない）形態には存在しない１つ以上の遺伝子を含有することができる。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列を挿入し、欠失し、又は改変するために、細胞の遺伝性情報中に外因性核酸分子を導入するための及び／又は外因性核酸分子（組換え、異種）を挿入するための技術は、当業者に公知である。遺伝子操作された細胞は、細胞の天然形態で存在する１つ以上の遺伝子を含有することができ、前記遺伝子は改変され、人工的手段によって細胞中に再導入される。「遺伝子操作された」という用語はまた、細胞に対して内因性であり、細胞から核酸分子を取り出すことなく改変された核酸分子を含有する細胞を包含する。このような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異及び関連技術によって得られるものが含まれる。
【0037】
いくつかの実施形態において、ラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは異種α－２，６－シアリルトランスフェラーゼである。
【0038】
本明細書で使用される「異種」という用語は、細胞又は生物にとって外来であるポリペプチド、アミノ酸配列、核酸分子又はヌクレオチド配列、すなわち、前記細胞又は生物には天然に存在しないポリペプチド、アミノ酸配列、核酸分子又はヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「異種配列」又は「異種核酸」又は「異種ポリペプチド」は、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に（例えば、異なる種に）由来するもの、又は同じ供給源に由来する場合には、その元の形態から改変されているものである。したがって、プロモーターに機能的に連結された異種核酸は、プロモーターが由来するものとは異なる供給源に由来するか、又は同じ供給源に由来する場合には、その元の形態から改変されている。異種配列は、例えば形質移入、形質転換、コンジュゲーション又は形質導入によって、宿主微生物宿主細胞のゲノムに安定に導入され得、したがって遺伝子改変宿主細胞を表し得る。配列を導入すべき宿主細胞に応じた技術が適用され得る。様々な技術が当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に開示されている。したがって、「異種ポリペプチド」は、細胞内に天然には存在しないポリペプチドであり、「異種シアリルトランスフェラーゼ」は、細胞内に天然には存在しないシアリルトランスフェラーゼである。
【0039】
遺伝子操作された細胞は、原核細胞又は真核細胞である。好ましくは、遺伝子操作された細胞は微生物細胞である。適切な微生物細胞には、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞及び真菌細胞が含まれる。
【0040】
追加の及び／又は代替の実施形態では、微生物細胞は原核細胞、好ましくは細菌細胞、より好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクトテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スポロラクトバチルス属種（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ミクロモモスポラ属種（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される細菌細胞である。適切な細菌種は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・リュングダウリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パンテア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、パンテア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。
【0041】
代替の実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞である。酵母細胞は、好ましくは、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミコプシス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ属種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、クルイベロマイセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）、ロドトルラ属種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐ．）及びシゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）からなる群から選択される。
【0042】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、本明細書で前述したラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有し、発現するように形質転換されている。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、
ａ）少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１及び２のうちの任意の１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号３及び配列番号４によって表されるヌクレオチド配列；
ｄ）ａ）～ｃ）に記載されるヌクレオチド配列のうちの任意の１つに相補的なヌクレオチド配列；並びに
ｅ）ａ）～ｄ）に記載されるヌクレオチド配列のうちの任意の１つとハイブリッド形成するヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
ａ）少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１及び２のうちの任意の１つによって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号３及び配列番号４によって表されるヌクレオチド配列；
ｄ）ａ）～ｃ）に記載されるヌクレオチド配列のうちの任意の１つに相補的なヌクレオチド配列；並びに
ｅ）ａ）～ｄ）に記載されるヌクレオチド配列のうちの任意の１つとハイブリッド形成するヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
【0043】
本明細書で使用される「ハイブリッド形成する」という用語は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）に記載されているように、通例の条件下、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成することを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、６５℃の４×ＳＳＣ中でのハイブリッド形成、及びその後の、６５℃の０．１×ＳＳＣ中で合計１時間の複数回の洗浄である。より低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、３７℃の４×ＳＳＣ中でのハイブリッド形成、及びその後の、室温の１×ＳＳＣ中での複数回洗浄である。本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、０．２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ中、６８℃で１６時間のハイブリッド形成、及びその後の、６８℃で２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄２回も意味することができる。
【0044】
遺伝子操作された細胞において、ラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、遺伝子操作された細胞におけるラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を行う発現調節配列に機能的に連結されている。
【0045】
本明細書で使用される「機能的に連結された」という用語は、ラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列、核酸発現調節配列（プロモーター、オペレーター、エンハンサー、制御因子、転写因子結合部位のアレイ、転写ターミネーター、リボソーム結合部位など）との間での機能的連結を指し、発現調節配列は、ラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。したがって、「プロモーター」という用語は、ＤＮＡポリマー中の遺伝子に通常「先行し」、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供するＤＮＡ配列を示す。同じく、通常、所与のＤＮＡポリマー中の遺伝子の「上流」に存在する（すなわち、先行する）「制御因子」ＤＮＡ配列は、転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質を結合する。「プロモーター／制御因子」又は「調節」ＤＮＡ配列と総称される、機能性ＤＮＡポリマー中の選択された遺伝子（又は一連の遺伝子）に先行するこれらの配列は、遺伝子の転写（及び最終的な発現）が起こるかどうかを決定するために協力する。ＤＮＡポリマー中の遺伝子に「後続」し、ｍＲＮＡへの転写の終結のためのシグナルを提供するＤＮＡ配列は、転写「ターミネーター」配列と呼ばれる。
【0046】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－ガラクトース及びＧＤＰ－フコースからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド活性化された糖の増加した産生を有する。好ましくは、少なくとも１つの遺伝子操作された細胞は、前記ヌクレオチド活性化された糖の１つ以上の増加した産生を有するように遺伝子操作されている。前記ヌクレオチド活性化された糖の少なくとも１つの産生は、前記ヌクレオチド活性化された糖の少なくとも１つの増加した産生を有するように遺伝子操作される前のその細胞における同じヌクレオチド活性化された糖の産生と比較して、遺伝子操作された細胞において増加する。
【0047】
追加の及び／又は代替の実施形態では、細胞は、遺伝子操作される前の細胞と比較して、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、グルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ、シアル酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＵＤＰ－ガラクトース－４－エピメラーゼ、ガラクトース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコース合成酵素及びフコセキナーゼ／Ｌ－フコース－１－リン酸－グアニルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素活性を有することができるポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作されている。
【0048】
前記遺伝子の１つ以上の過剰発現は、遺伝子操作された細胞中の対応する酵素の量を増加させ、したがって細胞中の対応する酵素活性を増加させて、前記ヌクレオチド活性化された糖の少なくとも１つの細胞内産生を増強する。
【0049】
好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された細胞において前記ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を行う少なくとも１つの核酸発現調節配列に機能的に連結されている。
【0050】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、グルタミン：フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧｌｍＳ）、好ましくは異種のグルタミン：フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するグルタミン：フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｃｃ．ｎｏ．ＮＰ＿４１８１８５）、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｌｍＳの機能的バリアントを有する。最も好ましくは、機能的バリアントは、例として変異体ｇｌｍＳ遺伝子によってコードされるような、野生型酵素が示すグルコサミン－６－リン酸阻害に対して有意に低下した感受性を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｌｍＳのバージョンである（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．７（２００５）：２０１－２１４．）。
【0051】
酵素グルタミン：フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１６）は、グルタミンを使用したフルクトース－６－リン酸のグルコサミン－６－リン酸への転化を触媒する。この酵素反応は、通例、ヘキソサミン生合成経路の第１の段階であると考えられる。グルタミン：フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼの代替名は、Ｄ－フルクトース－６－リン酸アミドトランスフェラーゼ、ＧＦＡＴ、グルコサミン－６－リン酸シンターゼ、ヘキソースリン酸アミノトランスフェラーゼ及びＬ－グルタミン－Ｄ－フルクトース－６－リン酸アミドトランスフェラーゼである。
【0052】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、グルコサミン－６－リン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｇｎａ１）、好ましくは異種グルコサミン－６－リン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルコサミン－６－リン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ａｃｃ．ｎｏ．ＮＰ＿１１６６３７）、又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｇｎａ１の機能的バリアントを含む。しかしながら、グルコサミン－６－リン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、それらの推定アミノ酸配列及びこれらのグルコサミン－６－リン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、様々な異なる種から公知であり、同じく適切なグルコサミン－６－リン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼとして使用され得る。
【0053】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸ホスファターゼ、好ましくはＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸（ＧｌｃＮＡｃ６Ｐ）のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）への転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼを発現する。ＨＡＤ様スーパーファミリーは、細菌酵素ハロ酸デヒドロ－ゲナーゼに由来して命名され、ホスファターゼを含む。ＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの適切なホスファターゼは、フルクトース－１－リン酸ホスファターゼ（ＹｑａＢ、ａｃｃ．ｎｏ．ＮＰ＿４１７１７５）及びα－Ｄ－グルコース１－リン酸ホスファターゼ（ＹｉｈＸ、ａｃｃ．ｎｏ．ＮＰ＿４１８３２１）からなる群から選択され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｑａＢ及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｉｈＸ酵素は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｐに対しても作用すると考えられる（Ｌｅｅ，Ｓ．－Ｗ．及びＯｈ，Ｍ．－Ｋ．（２０１５）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２８：１４３－１５０）。一実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ－６－リン酸のＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼは、遺伝子操作された細胞における異種酵素である。追加の及び／又は代替の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｑａＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｉｈＸ及びこれらの機能的バリアントからなる群から選択される。
【0054】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。追加の及び／又は代替の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。追加の及び／又は代替の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フルクトース－１－リン酸ホスファターゼ又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）α－Ｄ－グルコース１－リン酸ホスファターゼ又はこれら２つの酵素のうちの１つの機能的断片をコードする。
【0055】
追加の及び／又は代替の実施形態では、天然に存在しない細胞は、ＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼ若しくは前記ＨＡＤホスファターゼの機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように、及び／又はＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼ若しくはその機能的バリアントを含むように遺伝子操作されている。
【0056】
ＧｌｃＮＡｃ６ＰのＧｌｃＮＡｃへの転化を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの適切な糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｑａＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｉｈＸ及びその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列の群から選択され得る。
【0057】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ、好ましくはシネコシスティス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３（ａｃｃ．ｎｏ．ＢＡＬ３５７２０）の異種Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼＳｌｒ１９７５を有する。
【0058】
Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．８）は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のＮ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）への転化を触媒する酵素である。本酵素は、炭水化物及びそれらの誘導体に対して作用するラセマーゼである。この酵素クラスの体系名は、Ｎ－アシル－Ｄ－グルコサミン２－エピメラーゼである。本酵素は、アミノ糖代謝及びヌクレオチド糖代謝に関与する。
【0059】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、シアル酸シンターゼ又はその機能的バリアント、好ましくはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ａｃｃ．ｎｏ．ＡＦ３０５５７１）の異種シアル酸シンターゼＮｅｕＢを含む。
【0060】
シアル酸シンターゼ又はＮ－アセチルノイラミネートシンターゼ又はＮ－アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＥＣ ２．５．１．５６）は、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）を使用してＮ－アセチル－マンノサミンのＮ－アセチルノイラミン酸への転化を触媒する酵素である。Ｎ－アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＮｅｕＢ）は、ｎｅｕＢ遺伝子によってコードされる。
【0061】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、細胞の野生型よりも多くのＰＥＰを合成する。追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、増強されたＰＥＰ生合成経路を有するように遺伝子操作されている。好ましくは、遺伝子操作された細胞は、例えばホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードするｐｐｓＡ遺伝子（ａｃｃ．ｎｏ．ＡＣＴ４３５２７）が過剰発現されるという点で、及び／又は遺伝子操作された細胞がホスホエノールピルビン酸シンターゼ又はその機能的バリアントの発現を可能にするヌクレオチド配列の少なくとも１つのさらなるコピーを含有するという点で、増加したホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を有するように遺伝子操作されている。ｐｐｓＡの過剰発現は、より多くのＰＥＰがシアル酸の生産のために利用可能であるように、細胞内ＰＥＰ合成を増強する。例えば、適切なホスホエノールピルビン酸シンターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｐｓＡである。
【0062】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＣＭＰ－シアル酸シンテターゼ又はその機能的バリアント、好ましくはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ａｃｃ．ｎｏ．ＡＦ３０５５７１）の異種ＣＭＰ－シアル酸シンテターゼＮｅｕＡを含む。
【0063】
細胞内で過剰発現されている前記ＣＭＰ－シアル酸シンテターゼは、ＣＭＰ活性化シアル酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するためにシアル酸上にＣＭＰ残基を転移することができる。
【0064】
追加の及び／又は代替の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作される前の細胞と比較して、β－ガラクトシダーゼ活性、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ、Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ及びＮ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素活性を欠くか、又は減少した活性を有する。
【0065】
追加の及び／又は代替の実施形態では、β－ガラクトシダーゼ、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ、Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ－アセチルマンノ
サミン－６－リン酸エピメラーゼ及びＮ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の１つ以上が、遺伝子操作された細胞のゲノムから欠失されているか、又はβ－ガラクトシダーゼ、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ、Ｎ－アセチル－マンノサミンキナーゼ、Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ及びＮ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の１つ以上の発現が遺伝子操作された細胞において不活性化されている。
サミン－６－リン酸エピメラーゼ及びＮ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の１つ以上が、遺伝子操作された細胞のゲノムから欠失されているか、又はβ－ガラクトシダーゼ、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ、Ｎ－アセチル－マンノサミンキナーゼ、Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ及びＮ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の１つ以上の発現が遺伝子操作された細胞において不活性化されている。
【0066】
追加の及び／又は代替の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子操作細胞は、機能的ラクトースパーミアーゼ、機能的フコースパーミアーゼ及び機能的シアル酸輸送体（取り込み輸送体）からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含み、好ましくは、機能的ラクトースパーミアーゼ、機能的フコースパーミアーゼ及び機能的シアル酸輸送体（取り込み輸送体）からなる群から選択されるものをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、発現する。
【0067】
追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ及びα－２，６－シアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する。
【0068】
第３の態様によれば、細胞における６’－シアリル－ラクトースの生産のための方法であって、
・６’－シアリルラクトースの生産のための遺伝子操作された細胞を提供することであって、前記細胞は、本明細書に前述されているラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、すなわち、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている、提供すること；
・培養培地中で及び６’－シアリルラクトースの生産を許容する条件下で前記細胞を培養すること；並びに
・前記６’－シアリルラクトースを任意に回収すること、
を含む、方法が提供される。
・６’－シアリルラクトースの生産のための遺伝子操作された細胞を提供することであって、前記細胞は、本明細書に前述されているラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、すなわち、配列番号１及び配列番号２によって表されるアミノ酸配列の１つと少なくとも１００のアミノ酸の一続きにわたって少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列を含むラクトース受容性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている、提供すること；
・培養培地中で及び６’－シアリルラクトースの生産を許容する条件下で前記細胞を培養すること；並びに
・前記６’－シアリルラクトースを任意に回収すること、
を含む、方法が提供される。
【0069】
６’－シアリルラクトースの生産のために、少なくとも１つの遺伝子操作された細胞は、培養培地中で、及び前記細胞における６’－シアリルラクトースの生産を許容する条件下で培養される。
【0070】
培養培地は、遺伝子操作された細胞のための少なくとも１つの炭素源を含有する。少なくとも１つの炭素源は、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース、グリセロール及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0071】
追加の及び／又は代替の実施形態では、培養培地は、ガラクトース、ラクトース及びシアル酸からなる群から選択される少なくとも１つを含有する。
【0072】
この方法は、培養培地中でのその培養中に少なくとも１つの遺伝子操作された細胞内で／細胞によって生産された６’－シアリルラクトースを回収する工程を含む。６’－シアリルラクトースは、遺伝子操作された細胞が例えば遠心分離によって除去された後に発酵ブロスから回収することができ、及び／又は例えば細胞が遠心分離によって発酵ブロスから採取され、細胞溶解工程に供されるという点で細胞から回収することができる。その後、６’－ＳＬは、当業者に公知の適切な技術によって、培養培地及び／又は細胞可溶化物からさらに精製することができる。適切な技術としては、精密濾過、限外濾過、透析濾過、擬似移動床式クロマトグラフ、電気透析、逆浸透、ゲル濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【0073】
特定の実施形態に関して及び図面を参照して本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、明細書及び特許請求の範囲における第１の、第２のなどの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも時間的に、空間的に、順位で、又は任意の他の様式で順序を記述するためのものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載又は図示されている以外の順序で動作することができることを理解されたい。
【0074】
特許請求の範囲で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、その後に列挙される手段に限定されると解釈されるべきではなく、他の要素又は工程を排除するものではないことに留意されたい。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、言及したとおりに記載された特徴、整数、工程又は構成要素の存在を指定するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の他の特徴、整数、工程又は構成要素、又はこれらのグループの存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを含む装置」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではない。これは、本発明に関して、装置の唯一の関連する構成要素がＡ及びＢであることを意味する。
【0075】
本明細書を通じて「一実施形態」又は「実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じた様々な箇所における「一実施形態では」又は「実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではないが、同じ実施形態を指すことはあり得る。さらに、特定の特徴、構造又は特性は、本開示から当業者に明らかであるように、１つ以上の実施形態において、任意の適切な様式で組み合わされ得る。
【0076】
同様に、本発明の例示的な実施形態の記述において、本発明の様々な特徴は、本開示を簡素化し、様々な発明の態様のうちの１つ以上の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図又はその記述にまとめられることがあることを理解すべきである。しかしながら、この開示方法は、特許請求される発明が各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の前述の開示された実施形態のすべての特徴よりも少ない。したがって、詳細な説明に後続する特許請求の範囲は、この詳細な説明に明示的に組み入れられ、各請求項は、本発明の別個の実施形態として独立している。
【0077】
さらに、本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが、他の特徴は含まないが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内であり、当業者によって理解されるように、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、以下の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれもが、任意の組み合わせで使用され得る。
【0078】
さらに、実施形態のいくつかは、コンピュータシステムのプロセッサによって、又は機能を実行する他の手段によって実施することができる方法又は方法の要素の組み合わせとして本明細書に記載されている。したがって、そのような方法又は方法の要素を実行するために必要な命令を有するプロセッサは、方法又は方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、装置実施形態の本明細書に記載されている要素は、本発明を実施する目的で要素によって実行される機能を実行するための手段の一例である。
【0079】
本明細書で提供される説明及び図面には、多数の具体的な詳細が記載されている。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細なしで実施され得ることが理解される。他の例では、この説明の理解を不明瞭にしないために、周知の方法、構造及び技術は詳細に示されていない。
【0080】
ここで、本発明のいくつかの態様の詳細な説明によって、本発明を説明する。本発明の他の実施形態は、本発明の真の精神又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成することが可能であり、本発明は添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されることは明らかである。
【実施例】
【0081】
［実施例１］
α－２，６－シアリルトランスフェラーゼの同定
文献及び公開データベースから、特徴付けられた又は推定されるシアリルトランスフェラーゼの遺伝子配列を取得した。さらに、公知のシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を鋳型配列として使用することによって配列類似性検索を行った。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、注釈付きとして、完全長形態で、又はシグナルペプチドが予測される場合、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く切断型バリアントとして、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協力によって合成された。
α－２，６－シアリルトランスフェラーゼの同定
文献及び公開データベースから、特徴付けられた又は推定されるシアリルトランスフェラーゼの遺伝子配列を取得した。さらに、公知のシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を鋳型配列として使用することによって配列類似性検索を行った。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、注釈付きとして、完全長形態で、又はシグナルペプチドが予測される場合、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く切断型バリアントとして、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協力によって合成された。
【0082】
推定シグナルペプチドの同定を可能にする適切なソフトウェアツールは当業者に公知である。
【0083】
遺伝子特異的プライマーを使用するＳＬＩＣによってｎｅｕＡとのオペロンとしてｐＤＥＳＴ１４中にシアリルトランスフェラーゼをサブクローニングし、一般的な種類のプラスミド：ｐＤＥＳＴ１４－ｓｉａＴ－ｎｅｕＡを得るか、又は制限部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを使用して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協力によってプラスミドｐＥＴ１１ａ中にシアリルトランスフェラーゼを直接サブクローニングした。両発現系は、ＩＰＴＧ誘導性遺伝子発現を可能にする。インビボ活性スクリーニングのために、シアル酸のデノボ合成が可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に、又はシアル酸取り込み輸送体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｎａｎＴ）及びＣＭＰ－シアル酸シンテターゼ（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｎｅｕＡ）をコードする株中にプラスミドを形質転換した。インビトロアッセイのために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）野生型又はｌａｃＺを欠くそのバリアントを使用した。
【0084】
薄層クロマトグラフィー及び／又は質量分析を用いた生成物同定によって、スクリーニングした酵素の活性を決定した。
【0085】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析された試料をＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用した。ブタノール：アセトン：酢酸：Ｈ２Ｏ（３５／３５／７／２３（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の混合物を移動相として使用した。分離された物質の検出のために、ＴＬＣプレートをチモール試薬（９５ｍｌのエタノール中に溶解された０．５ｇのチモール、５ｍｌの硫酸を添加）に浸し、加熱した。
【0086】
質量分析は、ＬＣ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳ検出システムを使用してＭＲＭ（多重反応モニタリング）によって行った。四重極１ではプリカーサイオンを選択して分析し、フラグメンテーションはＣＩＤガスとしてアルゴンを使用してコリジョンセルにおいて行われ、四重極３ではフラグメントイオンの選択が行われる。炭水化物のクロマトグラフィー分離は、ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅガードカートリッジ（３．５μｍ、２．１×１０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）を備えたＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）で行った。ＨＰＬＣシステムのカラムオーブン温度は５０℃であった。移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル：Ｈ２Ｏで構成された。１μｌの試料を機器に注入して、実行を４００μｌ／分の流速で３．６０分間行った。炭水化物をＥＳＩ正イオン化モードでＭＲＭによって分析した。ラクトースは、ｍ／ｚ ３４１．００［Ｍ－Ｈ］のイオンを形成する。ラクトースのプリカーサイオンは、コリジョンセル内でフラグメントイオンｍ／ｚ １７９．１５、ｍ／ｚ １６１．１５及びｍ／ｚ １０１．０５にさらに断片化された。
【0087】
【表1】
【0088】
シアリルラクトースは、ｍ／ｚ ６５６．２［Ｍ＋Ｎａ］のイオンを形成する。シアリルラクトースのプリカーサイオンは、コリジョンセル内でフラグメントイオンｍ／ｚ ６１２．１５、ｍ／ｚ ３６５．１５及びｍ／ｚ ３１４．１５にさらに断片化された。ジシアリルラクトースは、ｍ／ｚ ９４２．４［Ｍ＋Ｈ＋ＮＨ３］のイオンを形成する。ジシアリルラクトースのプリカーサイオンは、コリジョンセル内でフラグメントイオンｍ／ｚ ２９２．３０、ｍ／ｚ ２７４．３０及びｍ／ｚ ６３４．０５にさらに断片化された。衝突エネルギー、Ｑ１及びＱ３プ Ｐｒｅ Ｂｉａｓを各分析物に対して個別に最適化した。
【0089】
表１に列挙されたすべての酵素について、ラクトースの存在下で発現及び／又はアッセイした場合に、６’－ＳＬの形成を確認することができた。
【0090】
［実施例２］
フォトバクテリウム・レイオグナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼｐｌｓＴ６をコードする遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いた６’－ＳＬの発酵生産
フォトバクテリウム・レイオグナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）由来のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ遺伝子（アクセッション番号ＢＡＩ４９４８４）のゲノム組み込みを含有する、組換え６’－シアリルラクトース合成大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺ）を使用して、６’－シアリルラクトース流加発酵を行った。ＣＭＰ－シアル酸の生合成を可能にする／増強するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のグルコサミン－６－リン酸シンターゼＧｌｍＳ、シネコシスティス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）由来のＮ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼＳｌｒ１９７５をコードする遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルコサミン６－リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔ）－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼＧｎａ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のホスホエノールピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔ）シンターゼＰｐｓＡ、Ｎ－アセチル－ノイラミン酸シンターゼＮｅｕＢ及びＣＭＰ－シアル酸シンテターゼＮｅｕＡ（後者はいずれもカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主中に、染色体に組み込んだ。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のラクトースパーミアーゼＬａｃＹをコードする遺伝子と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ由来の遺伝子ｃｓｃＢ（スクロースパーミアーゼ）、ｃｓｃＫ（フルクトキナーゼ）、ｃｓｃＡ（スクロース加水分解酵素）及びｃｓｃＲ（転写制御因子）とをＢＬ２１ゲノム中に組み込んだ。組み込まれた遺伝子の転写は、構成的プロモーター、テトラサイクリンプロモーターＰｔｅｔ又はＰＴ５プロモーターのいずれかから開始される。遺伝子ｇａｌＥ（ＵＤＰ－グルコース－４－エピメラーゼ）、ｇａｌＴ（ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）、ｇａｌＫ（ガラクトキナーゼ）及びｇａｌＭ（ガラクトース－１－エピメラーゼ）からなる機能的ｇａｌ－オペロンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からＢＬ ２１株のゲノムに移入した。
フォトバクテリウム・レイオグナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼｐｌｓＴ６をコードする遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いた６’－ＳＬの発酵生産
フォトバクテリウム・レイオグナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）由来のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ遺伝子（アクセッション番号ＢＡＩ４９４８４）のゲノム組み込みを含有する、組換え６’－シアリルラクトース合成大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺ）を使用して、６’－シアリルラクトース流加発酵を行った。ＣＭＰ－シアル酸の生合成を可能にする／増強するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のグルコサミン－６－リン酸シンターゼＧｌｍＳ、シネコシスティス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）由来のＮ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼＳｌｒ１９７５をコードする遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルコサミン６－リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔ）－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼＧｎａ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のホスホエノールピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔ）シンターゼＰｐｓＡ、Ｎ－アセチル－ノイラミン酸シンターゼＮｅｕＢ及びＣＭＰ－シアル酸シンテターゼＮｅｕＡ（後者はいずれもカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主中に、染色体に組み込んだ。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のラクトースパーミアーゼＬａｃＹをコードする遺伝子と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ由来の遺伝子ｃｓｃＢ（スクロースパーミアーゼ）、ｃｓｃＫ（フルクトキナーゼ）、ｃｓｃＡ（スクロース加水分解酵素）及びｃｓｃＲ（転写制御因子）とをＢＬ２１ゲノム中に組み込んだ。組み込まれた遺伝子の転写は、構成的プロモーター、テトラサイクリンプロモーターＰｔｅｔ又はＰＴ５プロモーターのいずれかから開始される。遺伝子ｇａｌＥ（ＵＤＰ－グルコース－４－エピメラーゼ）、ｇａｌＴ（ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）、ｇａｌＫ（ガラクトキナーゼ）及びｇａｌＭ（ガラクトース－１－エピメラーゼ）からなる機能的ｇａｌ－オペロンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からＢＬ ２１株のゲノムに移入した。
【0091】
Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ酵素（ＮａｇＡ）をコードするＮ－アセチルグルコサミン６－リン酸遺伝子の分解を防ぐために、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ（ＮａｇＢ）及びＮ－アセチルグルコサミン特異的ＰＴＳタンパク質ＩＩＡＢＣ（ＮａｇＥ）を染色体から欠失させた。さらに、マンノース、グルコース、グルコサミン及びＮ－アセチルグルコサミンのための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴＳ系の糖輸送体をコードするオペロンｍａｎＸＹＺ、並びにＮ－アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ－アセチル－マンノサミンキナーゼ、Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ及びシアル酸輸送体をそれぞれコードする遺伝子ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及びｎａｎＴを欠失させた。Ｎ－アセチル－ガラクトサミン－６－リン酸デアセチラーゼ酵素（ＡｇａＡ）をコードする遺伝子も欠失させた。
【0092】
６’－シアリルラクトースの発酵生産のために、７ｇｌ－１のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、７ｇｌ－１のＫ２ＨＰＯ４、２ｇｌ－１ＫＯＨ、０．３ｇｌ－１のクエン酸、５ｇｌ－１のＮＨ４Ｃｌ、１ｍｌｌ－１の消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３、Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）、０．１ｍＭＣａＣｌ２、８ｍＭＭｇＳＯ４、微量元素（０．１０１ｇｌ－１のニトリロ三酢酸、ｐＨ６．５、０．０５６ｇｌ－１のクエン酸第二鉄アンモニウム、０．０１ｇｌ－１のＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ－１のＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇｌ－１のＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ－１のホウ酸、０．００９ｇｌ－１のＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．００１ｇｌ－１のＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇｌ－１のＮａ２ＳｅＯ３、０．００２ｇｌ－１のＮｉＳＯ４×６Ｈ２Ｏ）及び炭素源として２％スクロースを含む限定鉱物塩培地中で株を増殖させた。
【0093】
スクロース供給（５００ｇｌ－１）に、８ｍＭＭｇＳＯ４、０．１ｍＭＣａＣｌ２、微量元素及び５ｇｌ－１のＮＨ４Ｃｌを補充した。６’－シアリルラクトース形成のために、２１６ｇ／ｌ－１のラクトース供給を使用した。アンモニア溶液（２５％ｖ／ｖ）を使用することによってｐＨを調節した。出発体積を参照して、５．５～７ｍＬ Ｌ－１ｈ－１のスクロース供給速度を適用することによって、７２時間、一定の通気及び撹拌下において３０℃で、硫加発酵を行った。生産過程の終了時に６’－シアリルラクトースに転化されなかったラクトースは、β－ガラクトシダーゼの添加により分解され、ラクトースの加水分解由来の単糖は生産株によって代謝された。かなりの量の６’－ＳＬが細菌細胞によって培養上清中に排泄された。しかしながら、これに加えて、ジシアリルラクトースが形成され（図２）、ジシアリルラクトースの形成は質量分析及び薄層クロマトグラフィーによって確認することができた。培養ブロス中の６’６－Ｄｉ－ＳＬの６’－ＳＬに対する比は、ＨＰＬＣによって決定され、約８％であった。
【0094】
発酵ブロス内の６’６－ジシアリルラクトース対６’－シアリルラクトースの比を推定するために、ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）に接続された屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）及びＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ ３．５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）を使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を実施した。溶出は、ｄｄＨ２Ｏ（酢酸でｐＨ４．２に調整）中７１％（ｖ／ｖ）ＡＣＮを用いて、３５℃及び１．４ｍｌ・分－１の流速でアイソクラティックに実施した。ＨＰＬＣ試料を滅菌濾過（孔径０．２２μｍ）し、注射前に５分間８０℃に加熱した。１０μｌの試料をカラムに適用した。６’－ＳＬ及び６’６－Ｄｉ－ＳＬの保持時間は、精製された標準を適用することによって決定した。６’６－Ｄｉ－ＳＬ対６’－ＳＬの比は、クロマトグラムにおける対応するピークのＡＵＣ（曲線下面積）の比率を求めることによって決定することができる。
【0095】
［実施例３］
６’－シアリルラクトースを生産するための新規α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ
ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）に由来するシアリルトランスフェラーゼは、ガラクトシド（例えば、ガラクトース又はラクトース）をアクセプタ基質として使用した場合に良好なシアリルトランスフェラーゼ活性を示し、その結果、海洋細菌に由来するα－２，６－シアリルトランスフェラーゼに対する代替物を明らかにした。注釈付けされた／推定されるＳ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）シアリルトランスフェラーゼがラクトース受容性酵素として以前に特徴付けられたことはなく、したがって、これまでのところ、Ｓ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）シアリルトランスフェラーゼは６’－ＳＬ生産のために適用されたことはなかった。
６’－シアリルラクトースを生産するための新規α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ
ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）に由来するシアリルトランスフェラーゼは、ガラクトシド（例えば、ガラクトース又はラクトース）をアクセプタ基質として使用した場合に良好なシアリルトランスフェラーゼ活性を示し、その結果、海洋細菌に由来するα－２，６－シアリルトランスフェラーゼに対する代替物を明らかにした。注釈付けされた／推定されるＳ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）シアリルトランスフェラーゼがラクトース受容性酵素として以前に特徴付けられたことはなく、したがって、これまでのところ、Ｓ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）シアリルトランスフェラーゼは６’－ＳＬ生産のために適用されたことはなかった。
【0096】
詳細な性質決定のために、インビトロ酵素アッセイを行った。
【0097】
したがって、アンピシリン１００μｇ ｍｌ－１を補充した２０ｍｌの２ＹＴ培地を充填した１００ｍｌの振盪フラスコ中において、シアリルトランスフェラーゼをコードするプラスミドを有するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を３０℃で増殖させた。培養物が０．１から０．３のＯＤ６００に達したら、０．３ｍＭＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導し、インキュベーションを１２～１６時間継続した。細胞を遠心分離によって採取し、ガラスビーズを使用して規定体積の５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ７．５中で機械的に破壊した。アッセイが開始するまで、タンパク質抽出物を氷上に保った。
【0098】
【表2】
【0099】
それらのシアリルトランスフェラーゼ特性を決定するために、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ及び様々な濃度の、ラクトース、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬなどのアクセプタ基質を含む２５μｌの総体積で、インビトロアッセイを行った。３μｌのタンパク質抽出物を添加してアッセイを開始し、最長１６時間継続した。生成物の形成を薄層クロマトグラフィーによって決定し、質量分析によって確認した。これらのインビトロアッセイの例示的な結果が図３、図４及び図５に示されている。フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）α－２，６－シアリルトランスフェラーゼは、ラクトース及び６’－ＳＬをそれぞれ６’－ＳＬ及びＤｉ－ＳＬに転化することができるのに対して、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）酵素は、ラクトースがアクセプタ基質として提供される場合、検出可能なα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ活性を専ら示す。要約された結果を表２に見ることができる。驚くべきことに、いずれのＳ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）シアリルトランスフェラーゼもジシアリルラクトースを形成することができなかった。
【0100】
シアリダーゼ／トランスシアリダーゼ活性を決定するために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び様々な濃度の３’－ＳＬ又は６’－ＳＬを含む２５μｌの総体積でインビトロアッセイを行った。３μｌのタンパク質抽出物を添加してアッセイを開始し、最長１６時間継続した。薄層クロマトグラフィー及び／又は質量分析によって、ラクトース及び／又はジシアリルラクトースの形成を決定した。海洋細菌に由来するシアリルトランスフェラーゼとは対照的に、Ｓ．スイス（Ｓ．ｓｕｉｓ）シアリルトランスフェラーゼはいずれも、３’－ＳＬ及び／又は６’－ＳＬをラクトース及び／又はジシアリルラクトースに転化することができなかった（表３）。
【0101】
【表3】
【0102】
［実施例４］
ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼｃｐｓ１６Ｑをコードする操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いた６’－ＳＬの発酵生産
実施例２に記載されるように代謝的に操作されているが、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）由来のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ遺伝子（アクセッション番号ＡＧＬ４８１１７）のゲノム組み込みを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を流加発酵に適用した。培養条件は、実施例２に記載されている。培養の中止後、実施例２に記載されている過程と同等のかなりの量の６’－ＳＬが培養上清中に検出可能であったが、ジシアリルラクトースは検出できなかった。
ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼｃｐｓ１６Ｑをコードする操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いた６’－ＳＬの発酵生産
実施例２に記載されるように代謝的に操作されているが、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）由来のα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ遺伝子（アクセッション番号ＡＧＬ４８１１７）のゲノム組み込みを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を流加発酵に適用した。培養条件は、実施例２に記載されている。培養の中止後、実施例２に記載されている過程と同等のかなりの量の６’－ＳＬが培養上清中に検出可能であったが、ジシアリルラクトースは検出できなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】