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▶ フォンダツィオーネ ディ レリジオーネ エ ディ クルト “カサ ソッリエーヴォ デラ ソッフェレンツァ” － オペラ ディ サン ピオ ダ ピエトレルチーナの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-27
(54)【発明の名称】高侵襲性肺腺癌のための予後診断方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20231220BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20231220BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20231220BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALN20231220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12N15/113 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6837 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023559151
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-08-07
(86)【国際出願番号】 EP2021085141
(87)【国際公開番号】W WO2022122994
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】20213323.7
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＣ ＯＳ
２．ＪＡＶＡ
(71)【出願人】
【識別番号】523222172
【氏名又は名称】フォンダツィオーネ ディ レリジオーネ エ ディ クルト “カサ ソッリエーヴォ デラ ソッフェレンツァ” － オペラ ディ サン ピオ ダ ピエトレルチーナ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ビアンキ，ファブリツィオ
(72)【発明者】
【氏名】ダマ，エリサ
(72)【発明者】
【氏名】メロッキ，バレンティナ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR62
4B063QS25
(57)【要約】
本発明は、好ましくは新鮮凍結、ホルマリン固定またはパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された標本における、初期（ステージＩ）疾患を含む高侵襲性肺腺癌（ＡＤＣ）の予後診断のためのｍｉＲＮＡバイオマーカーに基づく方法に関する。より詳細には本発明はＡＤＣの予後リスク層別化のための、好ましくは高侵襲性初期肺腺癌（すなわちＣ１－ＡＤＣ）を有する患者を同定するための方法における、７－ｍｉＲＮＡ、１４－ｍｉＲＮＡまたは１９－ｍｉＲＮＡ予後シグネチャーの使用に言及する。
【選択図】図３ａおよび図３ｂ
【選択図】図３ａおよび図３ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）対象からの生体試料において、配列ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（配列番号１９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ（配列番号３）；ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ（配列番号１４）およびｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ（配列番号１８）を含む１９種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、または配列ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（配列番号１９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ（配列番号２０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ（配列番号２１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号２２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ（配列番号２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ（配列番号２５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ（配列番号２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ（配列番号２７）およびｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ（配列番号２８）を含む１４種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、または配列ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ（配列番号１５）およびｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）を含む７種類のｍｉＲＮＡのそれぞれの量を検出する工程を含む、高侵襲性肺腺癌（Ｃ１－ＡＤＣ）に罹患している患者を同定するためのインビトロまたはエクスビボ方法。
【請求項2】
工程ａ）で得られたデータを正規化する工程ｂ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記患者を高侵襲性肺腺癌に罹患している対象の予測されるクラスまたは非高侵襲性肺腺癌（非Ｃ１－ＡＤＣ）に罹患している対象のクラスのいずれかに分類する工程ｃ）をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記高侵襲性肺腺癌に罹患している患者は前記疾患の初期（ステージＩ）である患者を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記生体試料は組織試料または体液であり、好ましくは前記組織試料は新鮮な組織試料、凍結させた組織試料またはＦＦＰＥ組織試料であり、かつ前記体液は血清または血漿である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記肺腺癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
工程ａ）における前記ｍｉＲＮＡは、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ、カスタムマイクロアレイ、またはＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術から選択される分子バーコード付加によるデジタル検波によって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
工程ｂ）において報告される前記データの前記正規化は、前記ｍｉＲＮＡをＲＮＡシークエンシングによって検出する場合には以下に報告されているスキームに従って行う、請求項１に記載の方法。【表1】
・各試料（ｊ）の各ｍｉＲＮＡ（ｉ）の正規化カウントｉｊは前記生カウントｉｊと各試料ｊに特有のサイズ係数ｊとの比として計算し、各試料に特有のサイズ係数ｊはその試料の全ての比係数ｉｊの中央値として計算し、比係数ｉｊは生カウントｉｊと特定のｍｉＲＮＡｉに対する全ての生カウントｉｊの幾何平均ｊとの比を表す）
【請求項9】
工程ｂ）において報告される前記データの前記正規化は、前記ｍｉＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲによって検出する場合には以下に報告されているスキームに従って行う、請求項１に記載の方法。【表2】
・各試料（ｊ）の各ｍｉＲＮＡ（ｉ）の前記正規化Ｃｔｉｊ（サイクル閾値）は前記生Ｃｔｉｊと各試料ｊに特有のスケーリング係数ｊ（ＳＦ）との差として計算し、前記スケーリング係数は前記試料において参照として使用されるｍｉＲＮＡ「ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ」の生Ｃｔと２１．８７に等しい定数との差を表す）
【請求項10】
工程ｃ）の高侵襲性肺腺癌に罹患している対象または非高侵襲性肺腺癌に罹患している対象の前記クラスの前記分類は、以下の式：【数1】
ここでは、
・ＲＮＡシークエンシングによって分析される１９－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝－８．２０２９＋（－０．２６５１＊ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ）＋（０．１７０９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ）＋（０．１４４３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．０２００＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ）＋（０．０４６４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．２２９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ）＋（０．１２８５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ）＋（０．３９３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ）＋（－０．２２２０＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ）＋（－０．１８７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（０．１５３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０３２６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（－０．３０３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ）＋（－０．１６７２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ）＋（０．１５２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．１１３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５２２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．１３１４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ）＋（０．０４９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）であり、
・ＲＮＡシークエンシングによって分析される１４－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝－５．４４１４＋（－０．１０２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ）＋（－０．０４８６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ）＋（０．２８２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ）＋（０．１９７７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．０２０１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１９０８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ）＋（－０．５０７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ）＋（０．０３８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ）＋（－０．３３１２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（－０．０４７５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ）＋（０．１８９５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５６０６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．２６６３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ）＋（０．０４３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）であり、かつ
・ＲＮＡシークエンシングによって分析されるモデル７－ｍｉＲＮＡでは、
ｚ＝－８．５２１０＋（０．１１７１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．２２３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．１３４１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１５５４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０５８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（０．３６２２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．４６８３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）であるか、
あるいは代わりとして
・ｑＲＴ－ＰＣＲによって分析される７－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝２．２９２０＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ＊０．１２９５）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ＊０．０９２０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ＊－０．１３１０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ＊－０．２１１６）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ＊－０．２７２４）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ＊０．２７１７）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ＊０．０４１３）である、
前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
より短い全生存期間を有する患者および／またはより短い無病生存期間を有する患者および／または治療に応答する患者および／または限定されるものではないが初期疾患（ステージＩ）を有する患者を含むことができる転移性疾患を有する患者から選択される、予後不良の高侵襲性肺腺癌の群に含まれる患者の同定のための前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
より長い全生存期間を有する患者および／またはより長い無病生存期間を有する患者および／または治療に応答する患者および／または限定されるものではないが初期疾患（ステージＩ）を有する患者を含むことができる転移性疾患を有しない患者から選択される、予後良好の非高侵襲性肺腺癌の群に含まれる患者の同定のための前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
白金製剤による組み合わせ、好ましくはシスプラチン、カルボプラチン＋ゲムシタビン、ビノレルビン、タキサンまたはカンプトテシンなどの第３世代の薬剤、分子標的薬、免疫療法、放射線療法またはそれらの組み合わせから選択される全身性術後補助化学療法から選択される、肺腺癌（Ｃ１－ＡＤＣ）の予後リスク層別化および／または外科手術後の他の治療選択肢の特定のための前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
シークエンシングのためのマルチウェルプレート、マイクロアレイまたはライブラリーと、請求項１に記載の１９種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、１４種類のｍｉＲＮＡのそれぞれまたは７種類のｍｉＲＮＡのそれぞれの量を検出するのに適したプライマーおよび／またはプローブとを含む、高侵襲性肺腺癌に罹患している患者を同定するのに使用するためのキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、好ましくは新鮮凍結、ホルマリン固定またはパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された標本における初期（ステージＩ）疾患を含む高侵襲性肺腺癌（ＡＤＣ）の予後診断のためのｍｉＲＮＡバイオマーカーに基づく方法に関する。より詳細には本発明は、ＡＤＣの予後リスク層別化のための、好ましくは高侵襲性初期肺腺癌（すなわちＣ１－ＡＤＣ）を有する患者を同定するための方法における７－ｍｉＲＮＡ、１４－ｍｉＲＮＡまたは１９－ｍｉＲＮＡ予後シグネチャーの使用に言及する。
【背景技術】
【0002】
最近の世界的な肺癌データは、２０１８年に２０９万の新しい症例および１７６万人の死亡の疾病負荷を示している［１］。肺癌の主な種類はいくつかの異質の腫瘍サブタイプを含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（８０～８５％）によって代表され、そのうち肺腺癌（ＡＤＣ）は全ての肺癌症例の約４０％を占めている。禁煙キャンペーンおよび大規模ＣＴスクリーニングプログラムの実施などの一次および二次予防戦略により、約２０％の肺癌死亡率の低下（ＮＥＬＳＯＮおよびＮＬＳＴ試験で観察）および進行性肺癌のステージシフトが生じた［２，３］。しかし肺癌の高レベルの分子不均一性により、大部分の高侵襲性初期腫瘍の転移性播種が増加する（約３０～５０％）［４］。
【0003】
ＡＤＣの徹底的な分子および機能特性評価は、特異的分子のサブタイプにおける腫瘍不均一性の情況を説明するのに役立つことができ、これは他の治療選択肢を提案することができる。本発明者らは最近になって、より進行性の癌に似ている独特の遺伝子／タンパク質発現および遺伝子変化を伴う腫瘍すなわちＣ１－ＡＤＣのサブセットを同定する、ステージＩのＡＤＣのための１０－遺伝子予後シグネチャーについて記載した［５，６］。この予後遺伝子シグネチャーは、新鮮凍結、ホルマリン固定またはパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された標本における定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＲＮＡシークエンシング、あるいは直接デジタル検波（例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術）によって測定することができる［６］。
【0004】
この１０－遺伝子シグネチャーの臨床的解釈を助けるために、ここでは本発明者らは、特に高侵襲性初期肺腺癌を有する患者を同定するためのＡＤＣの予後リスク層別化のために、この１０種類の遺伝子の代用物としてｍｉＲＮＡシグネチャーを提供する。ｍｉＲＮＡベースの予後シグネチャーは、診断目的のために日常的に使用されるＦＦＰＥ試料から抽出した場合に低品質のｍＲＮＡを使用することに関する問題を克服するであろう。実際に、ｍｉＲＮＡなどのより短い非翻訳ＲＮＡ分子は厳しい条件に対してより抵抗性があり［７，８］、かつｑＲＴ－ＰＣＲを含む発現プロファイリング方法の大部分と適合可能である。
【0005】
いくつかの先行技術は、肺癌などの癌を診断するためにｍｉＲＮＡの検出の使用を開示している。しかし、高侵襲性ＡＤＣサブタイプすなわちＣ１－ＡＤＣを有する患者を検出するために有効に機能し、かつ新鮮凍結、ホルマリン固定またはパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された標本を使用する場合にも適用することができる特異的ｍｉＲＮＡシグネチャーに基づく予後診断方法を開示している先行技術文献は存在しない。
【0006】
例えば国際公開第２０１２／０８９６３０Ａ１号は、３４種類のｍｉＲＮＡのリスト内の少なくとも５種類のｍｉＲＮＡを検出することにより、生物学的流体において初期肺癌を有する症状が現れていない高リスクの個体を同定するための方法を開示している。
【0007】
国際公開第２０１６／０３８１１９号およびＢｉａｎｃｈｉ Ｆら［１４］は、その患者から得られた血液試料において異なるｍｉＲＮＡの存在量の減少および増加を検出することにより対象において肺癌を診断するための方法を開示しており、その存在は、限定されるものではないが低線量コンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）などの他の当該技術分野において承認されている方法よりも癌の早期検出を提供する。
【0008】
従って、予後バイオマーカーならびに分子標的／免疫療法ではなく全身性術後補助化学療法（すなわち白金製剤による）から最終的に恩恵を受けることができる初期高侵襲性肺癌を有する患者を同定するための方法であって、異なる種類の体液またはＦＦＰＥ標本などの組織試料に適用することもできる方法の必要性に迫られている。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】データセットおよび分析を用いた研究設計のフローチャート。
【図2】ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホートのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現プロファイル分析。（ａ）１０－遺伝子発現シグネチャーの階層的クラスタリング分析。Ｃ１～Ｃ４クラスターがレジェンドに従って色づけられている。年齢、性別、喫煙状況およびステージがレジェンドに従って色づけられている。（ｂ）Ｃ１～Ｃ４クラスターによって層別化された３年間の全生存期間についてのカプラン・マイヤー曲線。Ｃ１対非Ｃ１患者（Ｃ２～Ｃ４）の比較のためにログランクｐ値が示されている。（ｃ）１９－ｍｉＲＮＡ（実線）および１４－ｍｉＲＮＡ（破線）モデルの偽陽性率および真陽性率を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。その曲線下面積（ＡＵＣ）が報告されている。（ｄ）１９－、１４－および７－ｍｉＲＮＡモデルおよび対応する標的遺伝子から得られたｍｉＲＮＡのネットワーク。長方形は遺伝子（ｍＲＮＡ）を表し、楕円形は１９－ｍｉＲＮＡモデルからのｍｉＲＮＡを表し、円は１４－ｍｉＲＮＡモデルからのｍｉＲＮＡを表し、六角形は１４－および１９－ｍｉＲＮＡモデルの両方からのｍｉＲＮＡを表す。（ｅ）ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホートにおける７－ｍｉＲＮＡの階層的クラスタリング。Ｃ１および非Ｃ１腫瘍（１０－遺伝子シグネチャーに従って定められる）がレジェンドに従って色づけられている。予測されるＣ１および非Ｃ１腫瘍がレジェンドに従って色づけられている（７－ｍｉＲＮＡロジスティックモデルに従って定められる）。
【図3】７－ｍｉＲＮＡモデルの検証。（ａ）７－ｍｉＲＮＡモデルの偽陽性率および真陽性率を示すＲＯＣ曲線。そのＡＵＣが報告されている。（ｂ）Ｃ１（薄灰色のドット）および非Ｃ１（黒色のドット）患者におけるＣ１予測確率に関する箱ひげ図。予測確率は１９－、１４－および７－ｍｉＲＮＡモデルによって計算されている。ウィルコクソン・マンホイットニー検定のｐ値が報告されている。（ｃ）７－ｍｉＲＮＡシグネチャーによって標的化される遺伝子ネットワークと有意に重複していることが分かった上位１０個の遺伝子セットのバブルプロット。バブルサイズは統計的有意性（ＦＤＲ ｑ値の－Ｌｏｇ）に比例しており、カラーコードは重複していることが分かった遺伝子の数を指す。Ｘ軸に、遺伝子のクエリセット（ｋ）と重複している遺伝子セットサイズ（Ｋ）との重複比（ｋ／Ｋ）。（ｄ）ＣＳＳコホートの１０－遺伝子発現のヒートマップ。Ｃ１および非Ｃ１腫瘍がレジェンドに従って色づけられている。リスクスコアは１０－遺伝子リスクモデルに基づいて計算されている。（ｅ）全ステージ（実線の黒色の線）またはステージＩ腫瘍のみ（破線の薄灰色の線）に関するＣＳＳコホートにおける７－ｍｉＲＮＡモデルの偽陽性率および真陽性率を示すＲＯＣ曲線。そのＡＵＣが報告されている。（ｆ）全ステージの腫瘍およびステージＩの腫瘍に関するＣＳＳコホートにおけるＣ１（薄灰色のドット）および非Ｃ１（黒色のドット）腫瘍におけるＣ１予測確率に関する箱ひげ図。予測確率は７－ｍｉＲＮＡモデルによって計算されている。ウィルコクソン・マンホイットニー検定のｐ値が報告されている。
【図4】１４および１９種類のｍｉＲＮＡのシグネチャーから得られたＡＵＣ。１４－および１９－ｍｉＲＮＡモデルのＡＵＣを等しい長さのランダムシグネチャーと比較するために適用される設計のフローチャート。１４および１９種類のｍｉＲＮＡのランダムリストについての中央値、第１の四分位数（Ｑ１）、第３の四分位数（Ｑ３）、最小（ｍｉｎ）および最大（ｍａｘ）ＡＵＣが報告されている。１００種類のランダムシグネチャーについてのＡＵＣの正規分布；ＡＵＣ＝０．５における破線の垂直線；１４－および１９－ｍｉＲＮＡモデルのＡＵＣにおける実線の垂直線；塗り潰されている黒色の領域は１００種類のランダムシグネチャーについてのｍｉｎ－ｍａｘ ＡＵＣ範囲に対応している。ＤＥは差次的発現の略である。
【図5】表Ｓ１Ａ。ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホート。Ｃ１対非Ｃ１患者の比較においてＤＥＳｅｑ２による有意に調節された２００種類のｍｉＲＮＡ。
【図6】表Ｓ１Ｂ。ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホート。Ｃ１対非Ｃ１患者の比較においてＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓによる有意に調節された９０種類のｍｉＲＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【0010】
定義
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての専門用語、記号および他の科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は明確性のため、および／またはすぐに参照できるように本明細書において定められており、従って本明細書にそのような定義を含めることは、当該技術分野において一般に理解される定義に関してかなりの違いを表すものと解釈されるべきではない。
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての専門用語、記号および他の科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は明確性のため、および／またはすぐに参照できるように本明細書において定められており、従って本明細書にそのような定義を含めることは、当該技術分野において一般に理解される定義に関してかなりの違いを表すものと解釈されるべきではない。
【0011】
本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節において役割を有する、植物、動物およびいくつかのウイルスに見られる約２２ヌクレオチドの小さい非翻訳ＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子内に相補配列を有する塩基対を介してその機能を与える。
【0012】
本明細書における「シグネチャー」という用語は、バイオマーカーとして使用されるいくつかのｍｉＲＮＡ（すなわち転写物）の組み合わせから得られる発現パターンを指す。
【0013】
本明細書における「ＦＦＰＥ標本」という用語は、ホルマリンに固定され、かつパラフィン包埋された組織試料を指す。
【0014】
本明細書における「ＡＵＣ」という用語は、様々な分類閾値における二項分類モデルの性能を示すグラフであるＲＯＣ曲線下面積（受信者動作特性曲線）を指す。
【0015】
本明細書で使用される群「Ｃ１」または「Ｃ１－ＡＤＣ」における患者という用語は、予後不良を経験している患者（すなわち、より短い全生存期間を有し、かつ／またはより短い無病生存期間を有し、かつ／または治療に応答し、かつ／または転移性疾患を有する）を含む高侵襲性肺腺癌に罹患している患者を含み、限定されるものではないが初期疾患（すなわちステージＩ）を有する患者を含むことができ、群「非Ｃ１」または「非Ｃ１－ＡＤＣ」に含まれる患者は、非高侵襲性肺腺癌に罹患しているか予後良好の患者であり（すなわち、より長い全生存期間を有し、かつ／またはより長い無病生存期間を有し、かつ／または治療に応答し、かつ／または転移性疾患を有しない）、これは限定されるものではないが初期疾患（すなわちステージＩ）を有する患者を含むことができる。
【0016】
本明細書における「高侵襲性」という用語は、予後不良の（すなわち、より短い全生存期間を有し、かつ／またはより短い無病生存期間を有し、かつ／または治療に応答し、かつ／または転移性疾患を有する）患者において診断される癌を指す。
【0017】
本明細書における「予後診断」という用語は、予後良好／予後不良の患者を区別するための能力を指す。
【0018】
本明細書における「バイオマーカー」という用語（生物学的マーカーの省略形）は、生物学的指標（例えば転写物、すなわちｍｉＲＮＡ）および／またはいくつかの生物学的状態または条件の指標を指す。
【0019】
「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、「オープン」用語（すなわち、「限定されるものではないが、～を含む」を意味する）として理解されるべきであり、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」または「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」）などの用語のサポートとしてもみなされるべきである。
【0020】
本明細書における「ＴＣＧＡ」という用語は、癌ゲノムアトラス（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）データベースを指し、ここでは全部で３３の異なる種類の腫瘍に関する分子データ（例えば、遺伝子およびタンパク質発現、遺伝子突然変異、メチル化プロファイル、コピー数多型）が公衆に入手可能にされた（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ－ｎｃｉ／ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ／ｃｃｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ－ｇｅｎｏｍｉｃｓ／ｔｃｇａ）。
【0021】
本明細書における「ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤ」という用語は、そのデータが癌ゲノムアトラスデータベースにおいて入手可能である肺腺癌（ＬＵＡＤ）患者の特定のコホートを指す。
【0022】
本明細書における「ＣＳＳ」という用語は、ＩＲＣＳＳ Ｃａｓａ Ｓｏｌｌｉｅｖｏ ｄｅｌｌａ Ｓｏｆｆｅｒｅｎｚａ病院に登録されている肺腺癌患者のコホートを指す。
【0023】
驚くべきことに、１９－ｍｉＲＮＡまたは１４－ｍｉＲＮＡシグネチャー、あるいは好ましくは７－ｍｉＲＮＡシグネチャーにより、別名「Ｃ１－ＡＤＣ」または「Ｃ１」という初期疾患を含む高侵襲性肺腺癌に罹患している患者を同定することができることを見出した。発現プロファイルおよびひいてはそのようなｍｉＲＮＡの量は、ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、あるいはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたは直接デジタル検波（例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術）によって測定することができ、異なる体液または組織試料に適用することができ、ＦＦＰＥ試料にも適用することができ、主にＦＦＰＥ試料におけるｍＲＮＡの不安定性／分解に関する欠点を克服する。
【0024】
ここでは本発明者らは、肺癌患者の大きいコホート（ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤ；Ｎ＝５１０）のＲＮＡ－ｓｅｑ（ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡプロファイル）データ分析に依存する多層手法を適用し、これにより本発明者らは肺腺癌患者において予後診断用ｍｉＲＮＡシグネチャーを同定することが可能になった。そのようなシグネチャーは高侵襲性疾患をスコア化する際に高い正解率（０．７９～０．８５の範囲のＡＵＣ）を示し、分子マルチバイオマーカー分類法において使用することができる。重要なことに、ネットワークベースの手法を用いて本発明者らはｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ調節ネットワークを再構築し、かつ癌関連経路と重複している様々な遺伝子を制御する、ＦＦＰＥ試料においても機能する７種類のｍｉＲＮＡの最小シグネチャーを同定した。
【0025】
得られた結果は、肺癌の予後診断のためのｍｉＲＮＡベースのバイオマーカーの信頼性および臨床ルーチンにおけるｍｉＲＮＡバイオマーカーの適用に基づく分類法におけるそれらの使用についてさらに実証している。
【0026】
より詳細には、本発明者らは、ステージＩ疾患を含むＡＤＣにおいて先に記載されている１０－遺伝子予後シグネチャーを再現する７－、１４－および１９－ｍｉＲＮＡの代用ｍｉＲＮＡシグネチャーを得た［６］。７－、１４－および１９－ｍｉＲＮＡシグネチャーは全て高侵襲性「Ｃ１－ＡＤＣ」疾患を同定するために有効であった（ＡＵＣ＝０．７９～０．８５）。注目すべきことに、７－ｍｉＲＮＡシグネチャーにおける全てのｍｉＲＮＡはＦＦＰＥ試料の大部分において検出され（Ｃｔ＜４０；表Ｓ２）、これにより低品質のｍＲＮＡに使用した場合に証明されるより高い安定性が確認された［９］。
【0027】
重要なことに、それらの手法において本発明者らは、高侵襲性ステージＩ腫瘍（「Ｃ１」）を特徴とする特に精選されたｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ対によるネットワーク再構築戦略を採用した。そのような手法により、１４－および１９－ｍｉＲＮＡモデル（図２ｃおよび図３ａ）に匹敵する正解率でＣ１を非Ｃ１腫瘍から層別化することができ、かつ重要なことに「Ｃ１」トランスクリプトームと相互作用する７種類のｍｉＲＮＡのコアを選択することが可能になった。これは肺癌の進行に関連づけられているｍｉＲＮＡによって制御される分子機構を捉えるのに適切である。
【0028】
実際に本発明者らは、「７－ｍｉＲＮＡネットワーク」と癌関連経路を表すいくつかの遺伝子セットとの間に大きい重複を観察した（図３ｃ）。
【0029】
究明された新しい方法の利点は、初期疾患を含む高侵襲性肺腺癌のスクリーニングのための信頼できる予後診断方法である点にある。特に前記方法は日常的な臨床設定において、
・診断目的のために日常的に使用される例えばＦＦＰＥ試料から抽出した場合に低品質のｍＲＮＡを使用することに関する問題を克服することができ、
・その後の死亡率の低下と共に、再発および予後不良を経験し得る治療（すなわち外科手術、外科手術＋術後補助化学療法、外科手術＋放射線療法あるいはそれらの組み合わせ）後にＡＤＣを有する患者の割合を区別することができ、
・複数の遺伝子発現プロファイリングプラットフォーム（すなわちＲＮＡｓｅｑ、定量的リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、分子バーコード付加によるデジタル検波）と共に使用することができ、
・前記方法の特異性を増大させる特異的転写物配列を分析し、
・ｍｉＲＮＡベースの診断のために臨床現場即時検査（ＰＯＣＴ）において実施することができ、
・少量の生物学的物質（最大１～１０ナノグラムの精製された核酸）を用いて転写物の量を測定することができる
という望ましいいくつかの特性を示す。
・診断目的のために日常的に使用される例えばＦＦＰＥ試料から抽出した場合に低品質のｍＲＮＡを使用することに関する問題を克服することができ、
・その後の死亡率の低下と共に、再発および予後不良を経験し得る治療（すなわち外科手術、外科手術＋術後補助化学療法、外科手術＋放射線療法あるいはそれらの組み合わせ）後にＡＤＣを有する患者の割合を区別することができ、
・複数の遺伝子発現プロファイリングプラットフォーム（すなわちＲＮＡｓｅｑ、定量的リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、分子バーコード付加によるデジタル検波）と共に使用することができ、
・前記方法の特異性を増大させる特異的転写物配列を分析し、
・ｍｉＲＮＡベースの診断のために臨床現場即時検査（ＰＯＣＴ）において実施することができ、
・少量の生物学的物質（最大１～１０ナノグラムの精製された核酸）を用いて転写物の量を測定することができる
という望ましいいくつかの特性を示す。
【0030】
従って本発明の一実施形態では、高侵襲性肺腺癌（Ｃ１－ＡＤＣ）に罹患している患者を同定するためのインビトロまたはエクスビボ方法であって、
ａ．対象からの生体試料において、配列ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（配列番号１９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ（配列番号１４）およびｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ（配列番号１８）を含む１９種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、または配列ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（配列番号１９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ（配列番号２０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ（配列番号２１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号２２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ（配列番号２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ（配列番号２５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ（配列番号２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ（配列番号２７）およびｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ（配列番号２８）を含む１４種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、または配列ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ（配列番号１５）およびｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）を含む７種類のｍｉＲＮＡのそれぞれの量を検出する工程を含む方法が提供される。
ａ．対象からの生体試料において、配列ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（配列番号１９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ（配列番号１４）およびｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ（配列番号１８）を含む１９種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、または配列ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（配列番号１９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ（配列番号２０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ（配列番号２１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号２２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ（配列番号２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ（配列番号２５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ（配列番号２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ（配列番号２７）およびｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ（配列番号２８）を含む１４種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、または配列ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ（配列番号２３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ（配列番号１５）およびｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ（配列番号１７）を含む７種類のｍｉＲＮＡのそれぞれの量を検出する工程を含む方法が提供される。
【0031】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、工程ａ）で得られたデータを正規化する工程ｂ）をさらに含む。
【0032】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、患者を高侵襲性肺腺癌に罹患している対象のクラスまたは非高侵襲性肺腺癌（非Ｃ１－ＡＤＣ）に罹患している対象のクラスのいずれかに分類する工程ｃ）をさらに含む。
【0033】
好ましくは、高侵襲性肺腺癌に罹患している対象のクラスは初期疾患（ステージＩ）にある患者を含む。
【0034】
より好ましくは、肺腺癌は非小細胞肺腺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【0035】
本発明によれば、前記ｍｉＲＮＡの検出は、それぞれ１つが１種類のｍｉＲＮＡの配列に選択的なプライマーおよび／またはプローブを用いるハイブリダイゼーションによって行う。
【0036】
本発明の好ましい実施形態によれば、工程ａ）における前記ｍｉＲＮＡの量は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ、カスタムマイクロアレイ、またはＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術から選択される分子バーコード付加によるデジタル検波によって計算する。
【0037】
好ましくは、工程ａ）の定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、検出されるｍｉＲＮＡのそれぞれに特異的プライマーおよび／またはプローブを用いて行う。
【0038】
好ましくは、１９－ｍｉＲＮＡ、１４－ｍｉＲＮＡまたは７－ｍｉＲＮＡシグネチャー中に存在する各ｍｉＲＮＡを逆転写し（すなわちＲＴ反応）、次いで増幅させる（すなわちｑＰＣＲ）ために、前記特異的プライマーおよびプローブを設計する。ＲＴ反応は当該試料中に存在する成熟ｍｉＲＮＡを伸長させるためにアダプター配列の３’ポリＡテーリングおよび５’ライゲーションに基づいているか［１６］、あるいはｍｉＲＮＡ特異的ステムループプライマーを用いるものであってもよい［１７］。
【0039】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ量は、ＦＦＰＥブロックからのＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット（ＱＩＡＧＥＮ社）または他のＲＮＡ抽出方法および他の体液試料または組織試料からのＲＮＡ抽出方法から選択される従来のＲＮＡ抽出方法を用いて抽出されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡとして測定する。
【0040】
好ましくは、ＲＮＡシークエンシングはそこからのｍｉＲＮＡがサイズに従って選択される１０ｎｇのトータルＲＮＡを用いて行う。ｍｉＲＮＡシークエンシングライブラリーは、ｍｉＲＮＡを特異的なシークエンシングアダプターとライゲーションし、かつそれらをｃＤＮＡに変換することにより構築する。次いで、好ましくはＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームを用いる合成によるシークエンシングをｍｉＲＮＡライブラリー調製に適用する。
【0041】
好ましくは、１０ｎｇのトータルＲＮＡを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行い、これは、アダプター配列の３’ポリＡテーリングおよび５’ライゲーションを用いて、あるいは特異的ステムループプライマーを用いて逆転写し、その後に本発明に従って分析される任意のｍｉＲＮＡシグネチャーのために選択されたｍｉＲＮＡ特異的プライマーおよびプローブを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ分析する。
【0042】
より好ましくは、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析はＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）およびＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡアッセイを用いて行うか、あるいは本発明に従って分析される任意のｍｉＲＮＡシグネチャーのために選択された特異的プライマーおよびプローブを用いる定量的ＲＴ－ＰＣＲ類似方法により行う。
【0043】
好ましくは、Ｐｏｌｙ（Ａ）テーリング、アダプターライゲーション、ＲＴ反応およびｍｉＲ－Ａｍｐは、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）または類似方法の説明書に従って行う。
【0044】
好ましくは、ｈｓａ－ｍｉＲ１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９；配列番号２９：ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ）をｑＲＴ－ＰＣＲ反応における標準参照として使用する。
【0045】
本発明によれば、工程ｂ）において報告されるデータの正規化は、ｍｉＲＮＡをＲＮＡシークエンシングによって定量化する場合には以下に報告されているスキームに従って行う。
ここでは
・各試料（ｊ）の各ｍｉＲＮＡ（ｉ）の正規化カウントｉｊは各試料ｊに特有の生カウントｉｊおよびサイズ係数ｊの比として計算する；各試料に特有のサイズ係数ｊはその試料の全ての比係数ｉｊの中央値として計算する；比係数ｉｊは、生カウントｉｊと特定のｍｉＲＮＡＩに対する全ての生カウントｉｊの幾何平均ｊとの比を表す
【表1】
・各試料（ｊ）の各ｍｉＲＮＡ（ｉ）の正規化カウントｉｊは各試料ｊに特有の生カウントｉｊおよびサイズ係数ｊの比として計算する；各試料に特有のサイズ係数ｊはその試料の全ての比係数ｉｊの中央値として計算する；比係数ｉｊは、生カウントｉｊと特定のｍｉＲＮＡＩに対する全ての生カウントｉｊの幾何平均ｊとの比を表す
【0046】
本発明によれば、工程ｂ）に報告されているデータの正規化は、ｍｉＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲによって定量化する場合には以下に報告されているスキームに従って行う。
ここでは、
・各試料（ｊ）の各ｍｉＲＮＡ（ｉ）の正規化Ｃｔｉｊ（サイクル閾値）は生Ｃｔｉｊと各試料ｊに特有のスケーリング係数ｊ（ＳＦ）との差として計算する；このスケーリング係数は、当該試料において参照として使用されるｍｉＲＮＡ「ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ」の生Ｃｔと２１．８７に等しい定数との差を表す。
【表2】
・各試料（ｊ）の各ｍｉＲＮＡ（ｉ）の正規化Ｃｔｉｊ（サイクル閾値）は生Ｃｔｉｊと各試料ｊに特有のスケーリング係数ｊ（ＳＦ）との差として計算する；このスケーリング係数は、当該試料において参照として使用されるｍｉＲＮＡ「ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ」の生Ｃｔと２１．８７に等しい定数との差を表す。
【0047】
本発明によれば、ｍｉＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイによって定量化する場合には、工程ｂ）で報告される生データの正規化はＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ ｍｉＲＮＡ Ａｒｒａｙに従って行い、ここではＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して、最後のｍｉＲＢａｓｅリリースにおいて全ての成熟ｍｉＲＮＡ配列の発現を調べる。
【0048】
本発明によれば、ｍｉＲＮＡを直接デジタル定量化（例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ社、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析）によって定量化する場合には、工程ｂ）で報告される生データの正規化はｍｉＲＮＡ発現の直接マルチプレックス測定に基づくデジタル色分けバーコード技術に従って行う。
【0049】
本発明の方法によれば、工程ｃ）の高侵襲性肺腺癌に罹患している対象または非高侵襲性肺腺癌に罹患している対象の予測されるクラスの分類は、以下の式：
によって計算し、
式中、
・ＲＮＡシークエンシングによって分析される１９－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝－８．２０２９＋（－０．２６５１＊ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ）＋（０．１７０９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ）＋（０．１４４３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．０２００＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ）＋（０．０４６４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．２２９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ）＋（０．１２８５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ）＋（０．３９３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ）＋（－０．２２２０＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ）＋（－０．１８７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（０．１５３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０３２６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（－０．３０３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ）＋（－０．１６７２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ）＋（０．１５２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．１１３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５２２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．１３１４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ）＋（０．０４９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）であり、
・ＲＮＡシークエンシングによって分析される１４－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝－５．４４１４＋（－０．１０２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ）＋（－０．０４８６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ）＋（０．２８２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ）＋（０．１９７７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．０２０１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１９０８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ）＋（－０．５０７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ）＋（０．０３８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ）＋（－０．３３１２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（－０．０４７５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ）＋（０．１８９５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５６０６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．２６６３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ）＋（０．０４３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）であり、かつ
・ＲＮＡシークエンシングによって分析されるモデル７－ｍｉＲＮＡでは、
ｚ＝－８．５２１０＋（０．１１７１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．２２３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．１３４１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１５５４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０５８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（０．３６２２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．４６８３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）であるか、
あるいは代わりとして
・ｑＲＴ－ＰＣＲによって分析される７－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝２．２９２０＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ＊０．１２９５）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ＊０．０９２０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ＊－０．１３１０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ＊－０．２１１６）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ＊－０．２７２４）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ＊０．２７１７）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ＊０．０４１３）である。
【数1】
式中、
・ＲＮＡシークエンシングによって分析される１９－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝－８．２０２９＋（－０．２６５１＊ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ）＋（０．１７０９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ）＋（０．１４４３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．０２００＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ）＋（０．０４６４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．２２９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ）＋（０．１２８５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ）＋（０．３９３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ）＋（－０．２２２０＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ）＋（－０．１８７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（０．１５３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０３２６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（－０．３０３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ）＋（－０．１６７２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ）＋（０．１５２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．１１３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５２２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．１３１４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ）＋（０．０４９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）であり、
・ＲＮＡシークエンシングによって分析される１４－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝－５．４４１４＋（－０．１０２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ）＋（－０．０４８６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ）＋（０．２８２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ）＋（０．１９７７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．０２０１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１９０８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ）＋（－０．５０７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ）＋（０．０３８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ）＋（－０．３３１２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（－０．０４７５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ）＋（０．１８９５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５６０６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．２６６３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ）＋（０．０４３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）であり、かつ
・ＲＮＡシークエンシングによって分析されるモデル７－ｍｉＲＮＡでは、
ｚ＝－８．５２１０＋（０．１１７１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．２２３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．１３４１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１５５４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０５８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（０．３６２２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．４６８３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）であるか、
あるいは代わりとして
・ｑＲＴ－ＰＣＲによって分析される７－ｍｉＲＮＡのモデルでは、
ｚ＝２．２９２０＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ＊０．１２９５）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ＊０．０９２０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ＊－０．１３１０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ＊－０．２１１６）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ＊－０．２７２４）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ＊０．２７１７）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ＊０．０４１３）である。
【0050】
好ましい実施形態によれば、工程ｃ）は、限定されるものではないが初期疾患（ステージＩ）を含むことができる高侵襲性肺腺癌に罹患している対象の予測されるクラスに患者を分類する。
【0051】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、より短い全生存期間を有する患者および／またはより短い無病生存期間を有する患者、および／または治療に応答する患者、および／または限定されるものではないが初期疾患（ステージＩ）を有する患者を含むことができる転移性疾患を有する患者から選択される、予後不良の高侵襲性肺腺癌の群に含まれる患者を同定する。
【0052】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、より長い全生存期間を有する患者、および／またはより長い無病生存期間を有する患者、および／または治療に応答する患者、および／または限定されるものではないが初期疾患（ステージＩ）を有する患者を含むことができる転移性疾患を有しない患者から選択される、予後良好の非高侵襲性肺腺癌の群に含まれる患者を同定する。
【0053】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の方法は肺腺癌を有する患者の予後リスク層別化のため、および／または白金製剤による組み合わせ、好ましくはシスプラチン、カルボプラチン＋ゲムシタビン、ビノレルビン、タキサンまたはカンプトテシンなどの第３世代の薬剤、分子標的薬、免疫療法、放射線療法またはそれらの組み合わせから選択される全身性術後補助化学療法から選択される外科手術後の他の治療選択肢を特定するために使用する。
【0054】
好ましくは、本発明の方法では生体試料は組織試料または体液である。
【0055】
より好ましくは、前記組織試料は新鮮な組織試料、凍結させた組織試料またはＦＦＰＥ組織試料である。
【0056】
より好ましくは、前記体液は血清または血漿である。
【0057】
さらなる実施形態は、本発明に係る方法を行うためのマイクロアレイ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、シークエンシングベースの技術またはデジタル分子バーコード付加ベースの技術である。
【0058】
さらなる実施形態は、マルチウェルプレートと、検出されるｍｉＲＮＡのそれぞれのための特異的プライマーおよび／またはプローブとを含む本発明に係る方法を行うためのキットである。
【0059】
好ましくは、検出されるｍｉＲＮＡのそれぞれを増幅するための本発明の方法において使用されるプライマーおよびプローブは、表１２に列挙されているアッセイで使用されるプライマーおよびプローブに対応する。
【0060】
さらなる好ましい実施形態は、マルチウェルプレート、マイクロアレイまたはシークエンシングのためのライブラリーと、請求項１に記載の１９種類のｍｉＲＮＡのそれぞれ、１４種類のｍｉＲＮＡのそれぞれまたは７種類のｍｉＲＮＡのそれぞれの量を検出するのに適したプライマーおよび／またはプローブとを含む、高侵襲性肺腺癌に罹患している患者を同定するのに使用するためのキットである。
【0061】
結果
１．ｍｉＲＮＡシグネチャーの同定
本発明者らは、図１に要約されている多層手法を開発し、これにより本発明者らはＡＤＣ患者の予後診断のための代用ｍｉＲＮＡベースシグネチャーを同定することが可能になった。
割合は四捨五入により合計１００にすることできなかった；１年齢に関する情報が不明の１９人の患者；２上皮内腺癌を有する１人の患者；３ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホート中の経過観察が不明の９人の患者；４３人の死亡を除外した：１人の死亡日は不明であり、２人は外科手術から３０日以内に死亡した。
１．ｍｉＲＮＡシグネチャーの同定
本発明者らは、図１に要約されている多層手法を開発し、これにより本発明者らはＡＤＣ患者の予後診断のための代用ｍｉＲＮＡベースシグネチャーを同定することが可能になった。
【表3】
【0062】
ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホート（Ｎ＝５１５）患者の１０－遺伝子シグネチャーを用いた階層的クラスタリング分析により、以前の発見と一貫する４つの主流派、すなわちＣ１（Ｎ＝２０１）、Ｃ２（Ｎ＝９８）、Ｃ３（Ｎ＝３９）およびＣ４（Ｎ＝１７７）クラスター（図２ａ）が明らかになった［６］。３年間の全生存期間の分析により、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４クラスター間で有意差がないことが分かり（ステージＩおよび進行したステージにおけるログランク試験ｐ値はそれぞれｐ＝０．９０およびｐ＝０．４８であった）、従ってそれらを非Ｃ１クラスターにまとめた。Ｃ１患者は、ステージＩ（ｐ値＝０．００１０）およびより進行したステージ（ｐ＝０．００６１）の両方においてより悪い予後を示した（図２ｂ）。
【0063】
次いで本発明者らは、入手可能なｍｉＲＮＡ発現データを用いて、ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホートの５１５人のＡＤＣのうち５１０人のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを行った。本発明者らは、Ｃ１および非Ｃ１患者において差次的に発現されるｍｉＲＮＡを同定するために他の統計学的手法としてＤＥＳｅｑ２ＲパッケージおよびＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ（方法の箇所を参照）の両方を使用した。本発明者らは全部で３８２種類のｍｉＲＮＡを分析し、そのうち２００種はＤＥＳｅｑ２によって、９０種はＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓによって差次的に発現されることが分かった（それぞれ表Ｓ１Ａおよび表Ｓ１Ｂ、図５および図６を参照）。
【0064】
２つのセットにおいて全部で８７種類のｍｉＲＮＡが重複していた。次いでＬａｓｓｏ正則化を適用してＣ１を非Ｃ１腫瘍から層別化することができる最適化されたｍｉＲＮＡベースシグネチャーを同定した。１４－ｍｉＲＮＡ（９０種類のｍｉＲＮＡセットから）および１９－ｍｉＲＮＡ（２００種類のｍｉＲＮＡセットから）の２種類のシグネチャーが得られ（重複している５種類のｍｉＲＮＡ；表２）、これはＣ１／非Ｃ１癌患者層別化において高い正解率を示した（それぞれの交差検証ＡＵＣ＝０．８１およびＡＵＣ＝０．８５；図２ｃ）。
【0065】
これらのｍｉＲＮＡベースのバイオマーカーの複雑性をさらに減らすために、本発明者らは、Ｃ１高侵襲性疾患を同定するために１４－および１９－ｍｉＲＮＡシグネチャーの同じ正解率を可能にする最小セットのｍｉＲＮＡを探した。
【0066】
ｉ）ｍｉＲＮＡの分子機能は、この場合はＣ１／非Ｃ１腫瘍において差次的に発現されるものである標的化ｍＲＮＡのネットワークに依存しており、ｉｉ）予後バイオマーカーは腫瘍進行に関与している機構に機能的に関連づけるべきであるという仮定を行った。従って本発明者らは、ＤＥＳｅｑ２（方法の箇所を参照）によってＣ１－ＡＤＣにおいて有意に（ｐ＜０．０５）調節されることが分かった２００種類のｍｉＲＮＡのセットおよび２９００種類のｍＲＮＡ遺伝子のセットを用いて、ＡＲＡＣＮｅ（正確な細胞ネットワークの再構築のためのアルゴリズム）（方法の箇所を参照）を行うことにより、Ｃ１腫瘍を特徴づけるｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡインタラクトームを探求した。本発明者らの分析は、技術的ばらつきを減らすためにＤＥＳｅｑ２によって同定された遺伝子に限定した。
【0067】
以下の規則を適用してＣ１ ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡインタラクトームを再構築した。すなわち、１）本発明者らは、ステージＩのためにＣ１腫瘍のみで産生され、かつ特異的であるが排他的ではないｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ対（Ｎ＝２８５８）を選択し、２）本発明者らはＣ１遺伝子を標的化することが予測されるｍｉＲＮＡ（Ｎ＝１７８７）を選択し、３）Ｃ１遺伝子とは逆の発現傾向を有し（Ｎ＝５９８）、４）本発明者らは少なくとも３種類のＣ１遺伝子と相互作用するｍｉＲＮＡ（Ｎ＝５２８）を選択した。
【0068】
同定したｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡネットワークのうち、本発明者らは、１９－ｍｉＲＮＡおよび１４－ｍｉＲＮＡシグネチャーの両方から得られた「ハブ」としての７種類のｍｉＲＮＡと相互作用するネットワークのセットを発見した（表２および図２ｄ）。この７－ｍｉＲＮＡシグネチャー（表Ｓ２）の階層的クラスタリング分析は、より高侵襲性のＣ１腫瘍における全体的に増加した発現を示した（図２ｅ）。重要なことに、７－ｍｉＲＮＡシグネチャーは、他の２種類のシグネチャーに匹敵し（図３ａ）、かつ本発明者らがＣ１予測確率における差を考慮した場合（図３ｂ）、Ｃ１／非Ｃ１患者層別化において０．７９の交差検証ＡＵＣを有していた。全ての３種類のシグネチャー（７－、１４－および１９－ｍｉＲＮＡ）から予測されるＣ１クラスは、１０－遺伝子によって同定されたＣ１患者に匹敵するリスクの増加と共に、全ステージの患者において死亡の危険の３年の有意な増加を示した（表３）。しかし本発明者らがステージＩのＡＤＣ患者への分析に焦点を当てた場合、本発明者らは、Ｃ１患者について死亡リスクの約２倍の増加と共に、７－ｍｉＲＮＡシグネチャーによって最良のリスク層別化が保持されることを示すスコアを得た（ＨＲ＝２．１１；９５％信頼区間：１．１１～４．００；ｐ＝０．０２２３）（表３）。極めて興味深いことに、癌進行に関連する分子機構を表す遺伝子セットに多く含まれているこれらの７種類のｍｉＲＮＡによって標的化される遺伝子のネットワークが有意であることが分かり（ＦＤＲ ｑ値＜０．０００１）、これにより本発明者らの初期の仮説が実証された（図３ｃ）。
【0069】
ＢＲＢから得られたモデルの１４種類のｍｉＲＮＡのうちの１２種を含むＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓによって同定された９０種類のｍｉＲＮＡの大部分（８７／９０、９７％）がＤＥＳｅｑ２によって発見された２００－ｍｉＲＮＡセットに含まれているにも関わらず、本発明者らはこの９０－ｍｉＲＮＡセットを用いてＡＲＡＣＮｅも行った。重複していない３種類のｍｉＲＮＡのうちｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐのみが、本発明者らが先に記載した全ての選択フィルタを通過した。しかし本発明者らはこのさらなるｍｉＲＮＡを７－ｍｉＲＮＡシグネチャーに追加し、かつＣ１／非Ｃ１患者層別化において交差検証を行った場合、予測性能は同じままであった（すなわち、ＡＵＣ＝０．７９）。
【表4】
【表5】
【表6】
【0070】
２．７－ｍｉＲＮＡシグネチャーの検証
最後に本発明者らは、ＩＲＣＣＳ Ｃａｓａ Ｓｏｌｌｉｅｖｏ ｄｅｌｌａ Ｓｏｆｆｅｒｅｎｚａ病院（ＣＳＳ）で集めた４４人の肺腺癌患者の外部コホートに対して７種類のｍｉＲＮＡシグネチャーの検証を行った。表１は、ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホート（５４％）に対して、ＣＳＳにおいてステージＩの腫瘍の過剰提示（７０％）を強調するＣＳＳコホートの患者および腫瘍特性を示す。本発明者らは１０－遺伝子シグネチャーを用いてＦＦＰＥ試料のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行い、相対的リスクスコアを計算してコホートをＣ１（Ｎ＝１６）および非Ｃ１（Ｎ＝２８）群（図３ｄ）に層別化した（方法の箇所を参照）。次に本発明者らは、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡアッセイを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行って、４４人のＡＤＣの同じコホートにおいて７－ｍｉＲＮＡシグネチャーもプロファイルし、ロジスティック回帰を用いて本発明者らは、７－ｍｉＲＮＡシグネチャーの発現プロファイルに基づいてモデルを再導出した（表Ｓ２）。７－ｍｉＲＮＡモデルは、０．７６のＡＵＣ（図３ｅ）およびＣ１予測確率における有意差（ｐ＝０．００２８）（図３ｆ）でＣ１を非Ｃ１腫瘍から層別化した。注目すべきことに、本発明者らが分析をステージＩ腫瘍に限定した場合、本発明者らは０．８１のＡＵＣ（図３ｅ）およびＣ１予測確率における有意差（ｐ＝０．０１０８）（図３ｆ）を示すスコアを得た。以下に報告されている表４～表７は、同定されたｍｉＲＮＡシグネチャーの詳細、それらの受入番号（ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）、それらの配列、調節傾向（Ｃ１対非Ｃ１）および使用したモデルの重みを提供している。
アッセイは、ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤ ＲＮＡシークエンシング実験において各ｍｉＲＮＡを同定するために使用されるコードを指し、Ａｃｃ．成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＢａｓｅ受入番号を指し、配列は成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を指し、ｍｉＲｂａｓｅ ＩＤは、ｍｉＲｂａｓｅデータベースにおける成熟ｍｉＲＮＡの名称を指し、比は、Ｃ１－ＡＤＣ試料における各ｍｉＲＮＡの発現中央値を非Ｃ１－ＡＤＣ試料における発現中央値で割ることにより計算した倍数変化を指し、ｐ値は、Ｃ１－ＡＤＣ試料と非Ｃ１－ＡＤＣ試料とを比較するＤＥＳｅｑ２のＷａｌｄ検定から計算した。全てのｍｉＲＮＡはＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整に基づくｑ値＜０．０５を有し、モデルの重みは予測されるクラスを計算するために使用される方程式における係数を指す。
アッセイは、ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤ ＲＮＡシークエンシング実験において各ｍｉＲＮＡを同定するために使用されるコードを指し、Ａｃｃ．成熟ｍｉＲＮＡは成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＢａｓｅ受入番号を指し、配列は成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を指し、ｍｉＲｂａｓｅ ＩＤはｍｉＲｂａｓｅデータベースにおける成熟ｍｉＲＮＡの名称を指し、比はＣ１－ＡＤＣ試料における各ｍｉＲＮＡの発現中央値を非Ｃ１－ＡＤＣ試料における発現中央値で割ることにより計算した倍数変化を指し、ｐ値はＣ１－ＡＤＣ試料と非Ｃ１－ＡＤＣ試料とを比較するＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓのパラメトリック試験から計算する。全てのｍｉＲＮＡは１００回の並べ替えに基づくｑ値＜０．０５を有し、モデルの重みは予測されるクラスを計算するために使用される方程式における係数を指す。
アッセイはＣＳＳ ｑＲＴ－ＰＣＲシークエンシング実験において各ｍｉＲＮＡを同定するために使用されるコードを指し、Ａｃｃ．成熟ｍｉＲＮＡは成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＢａｓｅ受入番号を指し、配列は成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を指し、ｍｉＲｂａｓｅ ＩＤはｍｉＲｂａｓｅデータベースにおける成熟ｍｉＲＮＡの名称を指し、比はＣ１－ＡＤＣ試料における各ｍｉＲＮＡの発現中央値を非Ｃ１－ＡＤＣ試料における発現中央値で割ることにより計算した倍数変化を指し、ｐ値はＣ１－ＡＤＣ試料と非Ｃ１－ＡＤＣ試料とを比較するウィルコクソン検定から計算し、モデルの重みは予測されるクラスを計算するために使用される方程式における係数を指す。
アッセイはＴＣＧＡ－ＬＵＡＤ ＲＮＡシークエンシング実験において各ｍｉＲＮＡを同定するために使用されるコードを指し、Ａｃｃ．成熟ｍｉＲＮＡは成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＢａｓｅ受入番号を指し、配列は成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を指し、ｍｉＲｂａｓｅ ＩＤはｍｉＲｂａｓｅデータベースにおける成熟ｍｉＲＮＡの名称を指し、比はＣ１－ＡＤＣ試料における各ｍｉＲＮＡの発現中央値を非Ｃ１－ＡＤＣ試料における発現中央値で割ることにより計算した倍数変化を指し、ｐ値は、Ｃ１－ＡＤＣ試料と非Ｃ１－ＡＤＣ試料とを比較するＤＥＳｅｑ２のＷａｌｄ検定から計算した。全てのｍｉＲＮＡはＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整に基づくｑ値＜０．０５を有し、モデルの重みは予測されるクラスを計算するために使用される方程式における係数を指す。
最後に本発明者らは、ＩＲＣＣＳ Ｃａｓａ Ｓｏｌｌｉｅｖｏ ｄｅｌｌａ Ｓｏｆｆｅｒｅｎｚａ病院（ＣＳＳ）で集めた４４人の肺腺癌患者の外部コホートに対して７種類のｍｉＲＮＡシグネチャーの検証を行った。表１は、ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤコホート（５４％）に対して、ＣＳＳにおいてステージＩの腫瘍の過剰提示（７０％）を強調するＣＳＳコホートの患者および腫瘍特性を示す。本発明者らは１０－遺伝子シグネチャーを用いてＦＦＰＥ試料のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行い、相対的リスクスコアを計算してコホートをＣ１（Ｎ＝１６）および非Ｃ１（Ｎ＝２８）群（図３ｄ）に層別化した（方法の箇所を参照）。次に本発明者らは、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡアッセイを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行って、４４人のＡＤＣの同じコホートにおいて７－ｍｉＲＮＡシグネチャーもプロファイルし、ロジスティック回帰を用いて本発明者らは、７－ｍｉＲＮＡシグネチャーの発現プロファイルに基づいてモデルを再導出した（表Ｓ２）。７－ｍｉＲＮＡモデルは、０．７６のＡＵＣ（図３ｅ）およびＣ１予測確率における有意差（ｐ＝０．００２８）（図３ｆ）でＣ１を非Ｃ１腫瘍から層別化した。注目すべきことに、本発明者らが分析をステージＩ腫瘍に限定した場合、本発明者らは０．８１のＡＵＣ（図３ｅ）およびＣ１予測確率における有意差（ｐ＝０．０１０８）（図３ｆ）を示すスコアを得た。以下に報告されている表４～表７は、同定されたｍｉＲＮＡシグネチャーの詳細、それらの受入番号（ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）、それらの配列、調節傾向（Ｃ１対非Ｃ１）および使用したモデルの重みを提供している。
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【0071】
３種類のシグネチャーのロジスティック回帰のパラメータおよびＣ１もしくは非Ｃ１群中の患者の群を含めるために使用される式が以下に表されている。
【0072】
モデル１９－ｍｉＲＮＡ（ＲＮＡシークエンシング）：
ｚ＝－８．２０２９＋（－０．２６５１＊ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ）＋（０．１７０９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ）＋（０．１４４３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．０２００＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ）＋（０．０４６４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．２２９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ）＋（０．１２８５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ）＋（０．３９３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ）＋（－０．２２２０＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ）＋（－０．１８７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（０．１５３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０３２６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（－０．３０３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ）＋（－０．１６７２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ）＋（０．１５２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．１１３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５２２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．１３１４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ）＋（０．０４９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）
ｚ＝－８．２０２９＋（－０．２６５１＊ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ）＋（０．１７０９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ）＋（０．１４４３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．０２００＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ）＋（０．０４６４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．２２９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ）＋（０．１２８５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ）＋（０．３９３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２３５５－３ｐ）＋（－０．２２２０＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ）＋（－０．１８７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（０．１５３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０３２６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（－０．３０３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－４７０９－３ｐ）＋（－０．１６７２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ）＋（０．１５２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．１１３２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５２２９＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．１３１４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５－３ｐ）＋（０．０４９７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）
【0073】
モデル１４－ｍｉＲＮＡ（ＲＮＡシークエンシング）：
ｚ＝－５．４４１４＋（－０．１０２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ）＋（－０．０４８６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ）＋（０．２８２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ）＋（０．１９７７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．０２０１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１９０８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ）＋（－０．５０７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ）＋（０．０３８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ）＋（－０．３３１２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（－０．０４７５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ）＋（０．１８９５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５６０６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．２６６３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ）＋（０．０４３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）
ｚ＝－５．４４１４＋（－０．１０２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ）＋（－０．０４８６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ）＋（０．２８２８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ）＋（０．１９７７＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．０２０１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１９０８＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ）＋（－０．５０７４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ）＋（０．０３８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ）＋（－０．３３１２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ）＋（－０．０４７５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５－３ｐ）＋（０．１８９５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ）＋（０．５６０６＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）＋（０．２６６３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ）＋（０．０４３５＊ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ）
【0074】
モデル７－ｍｉＲＮＡ（ＲＮＡシークエンシング）：
ｚ＝－８．５２１０＋（０．１１７１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．２２３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．１３４１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１５５４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０５８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（０．３６２２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．４６８３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）
ｚ＝－８．５２１０＋（０．１１７１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ）＋（０．２２３３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ）＋（０．１３４１＊ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ）＋（０．１５５４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ）＋（０．０５８４＊ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）＋（０．３６２２＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ）＋（０．４６８３＊ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ）
【0075】
モデル７－ｍｉＲＮＡ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）：
ｚ＝２．２９２０＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ＊０．１２９５）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ＊０．０９２０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ＊－０．１３１０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ＊－０．２１１６）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ＊－０．２７２４）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ＊０．２７１７）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ＊０．０４１３）
ｚ＝２．２９２０＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ＊０．１２９５）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ＊０．０９２０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ＊－０．１３１０）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ＊－０．２１１６）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ＊－０．２７２４）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ＊０．２７１７）＋（ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４－５ｐ＊０．０４１３）
【0076】
本明細書に示されている式を使用して、上に報告されているモデルを用いて選択された患者の予測されるクラスを同定する。
【数2】
【0077】
４．他の１４－および１９－ｍｉＲＮＡシグネチャーから得られたＡＵＣの評価
そこから７種類のｍｉＲＮＡシグネチャーが得られた１４－および１９－ｍｉＲＮＡシグネチャーが肺癌のより高侵襲性のサブタイプ（Ｃ１）を同定するために最も有効であることを実証するために、本発明者らは等しい長さ（１４および１９のｍｉＲＮＡ長さ）のランダムシグネチャーから得られた期待されるＡＵＣ分布に対して１４－および１９－ｍｉＲＮＡモデルのＡＵＣを比較した（図４）。特に本発明者らは、
・ＢＲＢ－Ａｒｒａｙ Ｔｏｏｌｓに従って差次的に発現されない２９２種類のｍｉＲＮＡ（表８）からの１４種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト、
・当該モデルの１４種類のｍｉＲＮＡを除外するＢＲＢ－Ａｒｒａｙ Ｔｏｏｌｓに従って差次的に発現される７６種類のｍｉＲＮＡ（表９）からの１４種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト、
・ＤＥＳｅｑ２ ｔｏｏｌに従って差次的に発現されない１８２種類のｍｉＲＮＡ（表１０）からの１９種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト、
・当該モデルの１９種類のｍｉＲＮＡを除外するＤＥＳｅｑ２ ｔｏｏｌに従って差次的に発現される１８１種類のｍｉＲＮＡ（表１１）からの１９種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト
を生成した。
そこから７種類のｍｉＲＮＡシグネチャーが得られた１４－および１９－ｍｉＲＮＡシグネチャーが肺癌のより高侵襲性のサブタイプ（Ｃ１）を同定するために最も有効であることを実証するために、本発明者らは等しい長さ（１４および１９のｍｉＲＮＡ長さ）のランダムシグネチャーから得られた期待されるＡＵＣ分布に対して１４－および１９－ｍｉＲＮＡモデルのＡＵＣを比較した（図４）。特に本発明者らは、
・ＢＲＢ－Ａｒｒａｙ Ｔｏｏｌｓに従って差次的に発現されない２９２種類のｍｉＲＮＡ（表８）からの１４種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト、
・当該モデルの１４種類のｍｉＲＮＡを除外するＢＲＢ－Ａｒｒａｙ Ｔｏｏｌｓに従って差次的に発現される７６種類のｍｉＲＮＡ（表９）からの１４種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト、
・ＤＥＳｅｑ２ ｔｏｏｌに従って差次的に発現されない１８２種類のｍｉＲＮＡ（表１０）からの１９種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト、
・当該モデルの１９種類のｍｉＲＮＡを除外するＤＥＳｅｑ２ ｔｏｏｌに従って差次的に発現される１８１種類のｍｉＲＮＡ（表１１）からの１９種類のｍｉＲＮＡの１００ランダムリスト
を生成した。
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【0078】
選択されたシグネチャーのために使用される同じロジスティック回帰を各ランダムリストに適用し、対応するモデル性能をＡＵＣにより評価した。
【0079】
図４に示すように、これらのランダムシグネチャーを用いて得られたＡＵＣはどれも１４－および１９－ｍｉＲＮＡモデルを用いて得られたＡＵＣほど高くはなく、これは、モデル選択のために適用される方法が肺癌のＣ１サブタイプの診断用の最良のセットのｍｉＲＮＡを同定するために最も有効であることを実証している（図４）。
【0080】
材料および方法
本発明者らは、２０１８年時点のＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌ．ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）から５１５人の肺腺癌を有する患者のコホートを選択した。遺伝子およびｍｉＲＮＡ発現の両方のために全部で５１０の腫瘍をプロファイルした。発現分析のためにＬｏｇ２リードカウントを使用した。生存分析のために患者の経過観察情報を使用した。全生存期間は腫瘍再選択日からあらゆる原因での死亡までの時間として定めた。経過観察を３年で打ち切って、肺癌特有の死亡率に関する全死亡率の潜在的な過大評価を低下させた。
本発明者らは、２０１８年時点のＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌ．ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）から５１５人の肺腺癌を有する患者のコホートを選択した。遺伝子およびｍｉＲＮＡ発現の両方のために全部で５１０の腫瘍をプロファイルした。発現分析のためにＬｏｇ２リードカウントを使用した。生存分析のために患者の経過観察情報を使用した。全生存期間は腫瘍再選択日からあらゆる原因での死亡までの時間として定めた。経過観察を３年で打ち切って、肺癌特有の死亡率に関する全死亡率の潜在的な過大評価を低下させた。
【0081】
５１０人の患者のコホート全体について、１０－遺伝子シグネチャーに基づく階層的クラスタリング分析を行った。クラスタリングは、非中心相関（ｕｎｃｅｎｔｅｒｅｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）および重心連結（ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｌｉｎｋａｇｅ）ならびにＪａｖａ ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェア環境（バージョン１．１．６ｒ４；ｈｔｔｐ：／／ｊｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）と共にＭａｃ ＯＳ ＸのためのＣｌｕｓｔｅｒ ３．０（Ｃ ＣＬＵＳＴＥＲＩＮＧ ＬＩＢＲＡＲＹ １．５６）を用いて行った。４つの主流派を選択してクラスターを構築した。カプラン・マイヤー生存曲線をクラスターにより層別化し、ログランク試験ｐ値を計算した。Ｃ１クラスターをより悪い予後に関連づけ、全ての他のクラスターを１つにまとめた（非Ｃ１クラスター）。
【0082】
ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤデータセット（２２３７種類のｍｉＲＮＡ）の複雑性を減らし、かつ最も有益なデータを抽出して使用し、本発明者らは最も転写調節されたｍｉＲＮＡを選択した。本発明者らは、Ｃ１もしくは非Ｃ１のいずれかの少なくとも５０％の患者において生カウント＞０であるｍｉＲＮＡを選択し、全部で３８２種類のｍｉＲＮＡを同定した。本発明者らは複雑性低減を遺伝子にも適用し、本発明者らは全ての試料の中で最も変化しているもの（上位２５％の標準偏差）を選択し、全部で４８９９種類の遺伝子を同定した。ＤＥＳｅｑ２ Ｒパッケージを用いて本発明者らは、全部で２９００のＣ１腫瘍と非Ｃ１腫瘍との間で差次的に発現される遺伝子を同定した。
【0083】
ｍｉＲＮＡ発現によるクラス予測（Ｃ１クラスター対非Ｃ１クラスター）のために、ＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ［１０］およびＤＥＳｅｑ２（Ｒパッケージ）［１１］ツールを使用した。ＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓは、多変量並べ替え検定（１０００回のランダム並べ替え）、偽発見率評価の８０％の信頼レベル、偽陽性遺伝子の０．０５の最大許容割合と共に２サンプルｔ検定に基づく統計を使用する。ＤＥＳｅｑ２は、差次的に発現される転写物を同定するためにＷａｌｄ検定統計に基づいている。その後にＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓおよびＤＥＳｅｑ２ツールから得られた差次的に発現されるｍｉＲＮＡのリストをＬａｓｓｏ正則化により減らした。詳細には、離散結果としてのクラスター（Ｃ１クラスター対非Ｃ１クラスター）および説明変数としてのｍｉＲＮＡ発現を考慮して、ペナルティ付き無条件ロジスティック回帰を適用した。チューニングペナルティパラメータの最適化（５０回のシミュレーション）と共に交差検証した（１０倍の）対数尤度を使用して潜在的な過剰適合を制御した。
【0084】
差次的に発現される遺伝子（ＤＥＳｅｑ２で同定）およびｍｉＲＮＡ（ＤＥＳｅｑ２およびＢＲＢ－ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓの両方で同定）から開始して、本発明者らは１０００回のブートストラップと共にＡＲＡＣＮｅ［１２］を使用して、転写調節因子（すなわちｍｉＲＮＡ）と標的遺伝子との直接的な調節関係を推測した。ＡＲＡＣＮｅは全ての患者、すなわちステージＩの患者およびステージＩＩ～ＩＶの患者を用いて行った。ｍｉＲＮＡ標的遺伝子はｍｉＲＷａｌｋ３．０［１３］を用いて検索した。
【0085】
１９、１４および７種類のｍｉＲＮＡの３種類のシグネチャーについて、無条件ロジスティック回帰を用いてＣ１クラスターに含まれる確率を推測した。交差検証した受信者動作特性下面積を使用し、かつＣ１患者と非Ｃ１患者とのＣ１予測確率における差を評価することによりモデル性能を評価した（ウィルコクソン・マンホイットニー検定）。Ｃｏｘ回帰モデルを使用して、これらのｍｉＲＮＡシグネチャーの予後規則および元の１０－遺伝子シグネチャーのリスク層別化を再現するそれらの能力を評価した。
【0086】
７－ｍｉＲＮＡモデルの生物学における洞察を得るために、本発明者らはそれらの標的遺伝子に関連づけられた癌関連経路のエンリッチメントを確認する。本発明者らはＣＧＰ（化学的および遺伝的摂動、３３５８個の遺伝子セット）を調査することにより、８７種類の標的化遺伝子のリストを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ；ｖ７．２）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ａｎｎｏｔａｔｅ．ｊｓｐ）を調べた。ＪＭＰ１５．２．１（ＳＡＳ）ソフトウェアを用いてバブルプロット分析を行った。
【0087】
５１０人の患者、すなわち入手可能なｍｉＲＮＡ発現データを有するものについて、７－ｍｉＲＮＡシグネチャーの階層的クラスタリング分析を行った。非中心相関および重心連結、およびＪａｖａ ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェア環境（バージョン１．１．６ｒ４；ｈｔｔｐ：／／ｊｔｒｅｅｖｉｅｗ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）と共に、Ｍａｃ ＯＳ ＸのためのＣｌｕｓｔｅｒ ３．０（Ｃ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ １．５６）を用いてクラスタリングを行った。
【0088】
７種類のｍｉＲＮＡシグネチャーをリスク層別化のために最良のものとして同定し、従ってＩＲＣＣＳ Ｃａｓａ Ｓｏｌｌｉｅｖｏ ｄｅｌｌａ Ｓｏｆｆｅｒｅｎｚａ病院（ＣＳＳ、サン・ジョヴァンニ・ロトンド、イタリア）からの患者の外部コホートにおいて検証した。２０１７年２月から２０２０年２月までに、４４人の肺腺癌を有する患者がＣＳＳで外科手術を受けた。書面のインフォームドコンセントを全ての研究患者から得た。これらの患者の中に術前化学療法を受けたものはいなかった。医療記録の見直しにより臨床的情報を得た。患者の居住地のＶｉｔａｌ Ｒｅｃｏｒｄｓ Ｏｆｆｉｃｅｓを通して、あるいは患者または彼らの家族に直接連絡をとることにより生命状態を評価した。
【0089】
病理学者によって選択された適切な腫瘍細胞性（＞６０％）を有する代表的な腫瘍領域におけるＦＦＰＥブロックからの１つの組織コア（直径が１．５ｍｍ）をトータルＲＮＡ抽出のために処理した。トータルＲＮＡ抽出のためにＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を行って、１０－遺伝子シグネチャーをＤａｍａら［６］に記載されているように分析した。簡単に言うと、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１００００分光光度計を用いてＲＮＡを定量化し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて全部で２００ｎｇを逆転写し、製造業者の説明書に従ってＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて１０回のサイクルのために予め増幅した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ Ｆｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）において、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘおよび加水分解プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；プライマーについてはＤａｍａら［６］を参照）を用いて、１：１０で希釈した予め増幅したｃＤＮＡから開始してｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。９５℃で３０秒間の最初のインキュベーション、その後に９５℃で５秒間および６０℃で３０秒間の４５サイクルでサーマルサイクリングによる増幅を行った。ｍｉＲＮＡ発現分析のために、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて全部で１０ｎｇのＲＮＡを逆転写した。製造業者の説明書［１５］（すなわち：９５℃で３０秒間、９５℃で５秒間および６０℃で３０秒間の４５サイクル）に従い、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ Ｆｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中のＣａｒｄ Ｃｕｓｔｏｍ Ａｄｖａｎｃｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、Ｐｏｌｙ（Ａ）テーリング、アダプターライゲーション、ＲＴ反応およびｍｉＲ－Ａｍｐ（ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙを用いる）を行った。
【0090】
先に記載されている方法［６］を用いてＣＴ正規化のために、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐを標準参照として使用した。簡単に言うと、各試料（ｊ）の各ｍｉＲＮＡ（ｉ）の正規化ＣＴを生Ｃｔｉｊと各試料（ｊ）に特有のスケーリング係数（ＳＦ）との差として計算し、ＳＦｊは試料（ｊ）において参照として使用されるｍｉＲＮＡ「ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ」の生Ｃｔと２１．８７に等しい定数との差を表した。
【0091】
Ｄａｍａら［６］に記載されている１０－遺伝子リスクモデルに基づいてリスクスコアを各患者に割り当てた。リスクモデルを適用する前に、データを再スケーリングした（ｑ１－ｑ３の正規化）。６６パーセンタイル（６）よりも高いリスクスコアを有する患者をＣ１腫瘍として分類した。次に説明変数として７種類のｍｉＲＮＡを用いる無条件ロジスティック回帰（Ｃ１対非Ｃ１腫瘍）を適用し、受信者動作特性下面積を計算した。ウィルコクソン・マンホイットニー検定によりＣ１患者と非Ｃ１患者とのＣ１予測確率における差を評価した。
【0092】
全ての統計分析は、ＳＡＳソフトウェアのバージョン９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、ノースカロライナ州ケーリー）ならびにＲ３．３．１（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０１６）およびＪＭＰ１５（ＳＡＳ）を用いて行った。０．０５未満のｐ値は統計的に有意であるとみなした。
アッセイはｑＲＴ－ＰＣＲ実験において各ｍｉＲＮＡを同定するために使用されるコードを指し、「Ａｃｃ．成熟ｍｉＲＮＡ」は成熟ｍｉＲＮＡのｍｉＲＢａｓｅ受入番号を指し、「ｍｉＲｂａｓｅ ＩＤ」はｍｉＲｂａｓｅデータベースにおける成熟ｍｉＲＮＡの名称を指し、「シグネチャー」は各ｍｉＲＮＡが属する特異的なシグネチャーを指し、「ハウスキーピングｍｉＲＮＡ」はｑＲＴ－ＰＣＲ実験を正規化するために使用されるｍｉＲＮＡであり、「スパイクイン」ｍｉＲＮＡはｑＲＴ－ＰＣＲ実験の性能を制御するために使用されるｍｉＲＮＡである。
【表15】
【0093】
参考文献
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【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図5-5】
【図5-6】
【図5-7】
【図6-1】
【図6-2】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】