▶ ジェネラル ナノセラピューティクス エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-28
(54)【発明の名称】免疫媒介性疾患の治療のための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 47/69 20170101AFI20231221BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20231221BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20231221BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231221BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20231221BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20231221BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231221BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231221BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20231221BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20231221BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231221BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231221BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231221BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231221BHJP
【ＦＩ】
A61K47/69
A61K38/20
A61K38/18
A61K35/17
A61K38/10
A61K38/16
A61P37/06
A61P37/02
A61P17/00
A61P21/04
A61P21/00
A61P1/00
A61P7/06
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P3/10
A61P43/00 121
A61K45/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023529922
(86)(22)【出願日】2021-11-23
(85)【翻訳文提出日】2023-06-30
(86)【国際出願番号】 US2021060612
(87)【国際公開番号】W WO2022115474
(87)【国際公開日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】63/118,863
(32)【優先日】2020-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】523180458
【氏名又は名称】ジェネラル ナノセラピューティクス エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ホーウィッツ，デイビッド エー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC09
4C076CC14
4C076CC18
4C076EE24A
4C076EE41
4C076EE48A
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084DA14
4C084DA42
4C084DB52
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZA55
4C084ZA66
4C084ZA89
4C084ZA94
4C084ZA96
4C084ZB07
4C084ZB08
4C084ZB11
4C084ZB15
4C084ZC35
4C084ZC75
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB43
4C087DA32
4C087MA52
4C087MA55
4C087MA66
4C087NA05
4C087ZA55
4C087ZA66
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB07
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB15
4C087ZC35
(57)【要約】
免疫媒介性障害の予防と治療のために、ｉｎ ｖｉｖｏで複数の抑制性の調節性細胞集団を誘導し、増殖させる新規ナノ粒子プラットフォームを開発した。これらには、自己免疫疾患、移植片対宿主病、及び移植拒絶反応が含まれる。増殖される調節性細胞には、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方が含まれる。ナノ粒子は、Ｔ細胞とＮＫ細胞を標的とする人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）として機能し、それらに、調節性細胞の生成、機能、増殖に必要な必須の刺激とサイトカインを提供する。これは、現在使用されている有毒な免疫抑制剤や生物学的薬剤を使用せずに達成される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者における免疫媒介性障害の治療方法であって、（ｉ）少なくとも１つの合成ポリマーナノ粒子、（ｉｉ）少なくとも１つの標的化薬、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの刺激剤を含む、寛容原性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）組成物を、前記患者に投与することを含む、前記治療方法。
【請求項2】
患者における免疫媒介性障害の予防方法であって、（ｉ）少なくとも１つの合成ポリマーナノ粒子、（ｉｉ）少なくとも１つの標的化薬、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの刺激剤を含む、寛容原性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）組成物を、前記患者に投与することを含む、前記予防方法。
【請求項3】
前記少なくとも１つの標的化薬が、Ｔ細胞を標的とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つの標的化薬が、ＮＫ細胞を標的とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つの標的化薬が、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を標的とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つの標的化薬が、ＮＫＴ細胞を標的とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項7】
前記少なくとも１つの標的化薬が、ＣＤ３を標的とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記少なくとも１つの標的化薬が、ＣＤ２を標的とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも１つの標的化薬が、ＣＤ３及びＣＤ２を標的とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記少なくとも１つの標的化薬が、局所環境でＴＧＦ－βを産生するように前記患者の細胞を誘導する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも１つの標的化薬が抗体である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記少なくとも１つの標的化薬が、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、及びＦｃフラグメントが不活化されているかまたは存在しない抗ＣＤ３抗体からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記少なくとも１つの標的化薬がアプタマーである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記アプタマーが、ＴＣＲ－ＣＤ３に結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記少なくとも１つの刺激剤が、サイトカインを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記少なくとも１つの刺激剤が、ＩＬ－２を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記少なくとも１つの刺激剤が封入されている、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記方法が、機能的調節性細胞の複数の集団となるように前記患者のリンパ球を誘導する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記患者におけるＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞の両方を、Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記方法が、調節性ＮＫ細胞を生成し、前記免疫媒介性障害を抑制する数まで増殖させる、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記方法が、１つ以上のリンパ球集団を生成し、前記免疫媒介性障害を抑制する数まで増殖させる、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記患者のＮＫ細胞が、ＴＧＦ－β産生調節性ＮＫ細胞になる、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記Ｔ細胞が、ＴＧＦ－β産生調節性Ｔ細胞になる、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記サイトカインがＴＧＦ－βであり、前記ＴＧＦ－βが、前記ナノ粒子に封入されるか、または前記ナノ粒子が、ｉｎ ｖｉｖｏで前記局所環境において調節性細胞を誘導する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記免疫媒介性障害が、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、皮膚筋炎、及びシェーグレン症候群からなる群から選択される少なくとも１つの抗体媒介性自己免疫疾患である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記免疫媒介性障害が、１型糖尿病、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強皮症からなる群から選択される少なくとも１つの細胞媒介性自己免疫疾患である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記免疫媒介性障害が移植関連疾患である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記免疫媒介性障害が、外来臓器移植の拒絶反応である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記免疫媒介性障害が移植片対宿主病である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記方法を、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記患者への投与が、非経口送達を使用する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記非経口送達が静脈内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記非経口送達が筋肉内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記非経口送達が皮下である、請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
前記患者への投与が、経口送達を使用する、請求項１～３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項37】
前記少なくとも１つの合成ポリマーナノ粒子が、グリシド、リポソーム、及びデンドリマーからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記ａＡＰＣを、少なくとも１つのディフェンシンと組み合わせる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２７日に出願された米国特許出願第６３／１１８，８６３号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年１１月２７日に出願された米国特許出願第６３／１１８，８６３号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
本明細書では、治療のためのナノ粒子（ＮＰ）製剤の製造方法及び使用方法、ならびに抗体及び細胞媒介性自己免疫疾患、移植片対宿主病、及び固形臓器移植拒絶反応を含む免疫媒介性障害を治療するための組成物、特にナノ粒子製剤を記載する。
【背景技術】
【0003】
免疫媒介性疾患は、外来細胞または自己免疫細胞が身体の自己細胞を攻撃する場合に発症する。これらには、自己免疫疾患、移植片対宿主病、外来固形臓器移植の拒絶反応などが含まれる。自己免疫疾患は、通常は静止状態の自己反応性免疫細胞が活性化され、身体の自己細胞を攻撃する場合に発症する。身体の広範囲の部分に影響を与える自己免疫疾患は、８０種類以上存在する。一般的な自己免疫疾患には、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、炎症性腸疾患、及び甲状腺疾患が含まれる。移植片対宿主病は、外来の造血幹細胞を血液悪性腫瘍の治療に使用する場合に発症する。外来固形臓器移植は、適切な免疫抑制がなければ拒絶される。異常な自己免疫疾患では、患者は適切な診断を受けるまでに何年も苦しむ可能性がある。これらの疾患のほとんどには治療法が存在しない。症状を軽減するために生涯にわたる治療が必要な場合もある。これらの疾患を合わせると、米国では２，４００万人以上が罹患している。さらに８００万人が自己抗体を有しており、自己免疫疾患を発症する可能性があることを示している。研究によると、これらの疾患は遺伝的要因と環境的要因の間の相互作用によって生じる可能性が高いことが示されている。性別、人種、及び民族の特徴は、自己免疫疾患を発症する可能性と関連している。自己免疫疾患は、人々が特定の環境にさらされた場合に、さらによく見られる。
【0004】
多くの自己免疫疾患は、同様の症状を有する。このため、医療提供者が自己免疫疾患を診断し、特定の自己免疫疾患を識別することが困難になる。多くの場合、最初の症状は、疲労、筋肉痛、及び微熱である。自己免疫疾患の典型的な徴候は炎症であり、発赤、熱、痛み、及び腫れを引き起こし得る。この疾患には、悪化する場合の再発、症状が改善または消失する場合の寛解が存在し得る。治療は、疾患によって異なるが、ほとんどの場合、重要な目標の１つは、炎症を軽減することである。医師は、免疫応答を低下させるコルチコステロイドまたは他の薬物を処方することがある。
【0005】
ＳＬＥなどの自己免疫疾患を治療するための組成物及び方法を開発することが緊急に必要とされている。したがって、本明細書の開示の目的は、慢性自己免疫疾患の治療のための組成物を提供し、狼瘡、移植片対宿主病、及び他の慢性免疫媒介性疾患の治療方法を提供することである。
【発明の概要】
【0006】
一態様では、本開示は、（ｉ）少なくとも１つの合成ポリマーナノ粒子、（ｉｉ）少なくとも１つの標的化薬、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの刺激剤を含む免疫寛容原性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）組成物を患者に投与することを含む、患者における免疫媒介性障害の治療方法を提供する。
【0007】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、Ｔ細胞を標的とする。
【0008】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＮＫ細胞を標的とする。
【0009】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を標的とする。
【0010】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＮＫＴ細胞を標的とする。
【0011】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＣＤ３を標的とする。
【0012】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＣＤ２を標的とする。
【0013】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＣＤ３及びＣＤ２を標的とする。
【0014】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、患者の細胞が局所環境でＴＧＦ－βを産生するように誘導する。
【0015】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は抗体である。
【0016】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、及び不活化されたかまたは欠失したＦｃフラグメントを有する抗ＣＤ３抗体からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーである。
【0017】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬はアプタマーである。
【0018】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＴＣＲ－ＣＤ３に結合する。
【0019】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、サイトカインを含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、ＩＬ－２を含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、封入される。
【0022】
いくつかの実施形態では、本方法は、患者のリンパ球が機能的調節細胞の複数の集団になるように誘導する。
【0023】
いくつかの実施形態では、本方法は、患者のＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の両方がＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるよう誘導する。
【0024】
いくつかの実施形態では、本方法は、調節性ＮＫ細胞を生成し、免疫媒介性障害が抑制される数まで増殖させる。
【0025】
いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のリンパ球集団を生成し、免疫媒介性障害が抑制される数まで増殖させる。
【0026】
いくつかの実施形態では、患者のＮＫ細胞は、ＴＧＦ－β産生調節性ＮＫ細胞になる。
【0027】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＧＦ－β産生調節性Ｔ細胞となる。
【0028】
いくつかの実施形態では、サイトカインはＴＧＦ－βであり、ＴＧＦ－βがナノ粒子に封入されるか、またはナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで局所環境において調節性細胞を誘導する。
【0029】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、皮膚筋炎、及びシェーグレン症候群からなる群から選択される少なくとも１つの抗体媒介性自己免疫疾患である。
【0030】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、１型糖尿病、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強皮症からなる群から選択される少なくとも１つの細胞媒介性自己免疫疾患である。
【0031】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植関連疾患である。
【0032】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、外来臓器移植の拒絶反応である。
【0033】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植片対宿主病である。
【0034】
いくつかの実施形態では、本方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する。
【0035】
いくつかの実施形態では、本方法を、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する。
【0036】
いくつかの実施形態では、患者への投与は、非経口送達を使用する。
【0037】
いくつかの実施形態では、非経口送達は静脈内送達である。
【0038】
いくつかの実施形態では、非経口送達は筋肉内である。
【0039】
いくつかの実施形態では、非経口送達は皮下である。
【0040】
いくつかの実施形態では、患者への投与に、経口送達を使用する。
【0041】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの合成ポリマーナノ粒子は、グリシド、リポソーム、及びデンドリマーからなる群から選択される。
【0042】
いくつかの実施形態では、ａＡＰＣを、少なくとも１つのディフェンシンと組み合わせる。
【0043】
別の態様では、本開示は、（ｉ）少なくとも１つの合成ポリマーナノ粒子、（ｉｉ）少なくとも１つの標的化薬、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの刺激剤を含む寛容原性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）組成物を患者に投与することを含む、患者における免疫媒介性障害の予防方法を提供する。
【0044】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、Ｔ細胞を標的とする。
【0045】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＮＫ細胞を標的とする。
【0046】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を標的とする。
【0047】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＮＫＴ細胞を標的とする。
【0048】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＣＤ３を標的とする。
【0049】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＣＤ２を標的とする。
【0050】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、ＣＤ３及びＣＤ２を標的とする。
【0051】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、患者の細胞が局所環境でＴＧＦ－βを産生するように誘導する。
【0052】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は抗体である。
【0053】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、及び不活性化または欠失したＦｃフラグメントを有する抗ＣＤ３抗体からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーである。
【0054】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬はアプタマーである。
【0055】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＴＣＲ－ＣＤ３に結合する。
【0056】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、サイトカインを含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、ＩＬ－２を含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、封入される。
【0059】
いくつかの実施形態では、本方法は、患者のリンパ球が機能的調節性細胞の複数の集団になるように誘導する。
【0060】
いくつかの実施形態では、本方法は、患者のＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の両方がＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導する。
【0061】
いくつかの実施形態では、本方法は、調節性ＮＫ細胞を生成し、免疫媒介性障害が抑制される数まで増殖させる。
【0062】
いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のリンパ球集団を生成し、免疫媒介性障害が抑制される数まで増殖させる。
【0063】
いくつかの実施形態では、患者のＮＫ細胞は、ＴＧＦ－β産生調節性ＮＫ細胞になる。
【0064】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＧＦ－β産生調節性Ｔ細胞になる。
【0065】
いくつかの実施形態では、サイトカインはＴＧＦ－βであり、ＴＧＦ－βがナノ粒子に封入されるか、またはナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで局所環境において調節性細胞を誘導する。
【0066】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、皮膚筋炎、及びシェーグレン症候群からなる群から選択される少なくとも１つの抗体媒介性自己免疫疾患である。
【0067】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、１型糖尿病、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強皮症からなる群から選択される少なくとも１つの細胞媒介性自己免疫疾患である。
【0068】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植関連疾患である。
【0069】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、外来臓器移植の拒絶反応である。
【0070】
いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植片対宿主病である。
【0071】
いくつかの実施形態では、本方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する。
【0072】
いくつかの実施形態では、本方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施する。
【0073】
いくつかの実施形態では、患者への投与に、非経口送達を使用する。
【0074】
いくつかの実施形態では、非経口送達は静脈内送達である。
【0075】
いくつかの実施形態では、非経口送達は筋肉内である。
【0076】
いくつかの実施形態では、非経口送達は皮下である。
【0077】
いくつかの実施形態では、患者への投与に、経口送達を使用する。
【0078】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの合成ポリマーナノ粒子は、グリシド、リポソーム、及びデンドリマーからなる群から選択される。
【0079】
いくつかの実施形態では、ａＡＰＣを、少なくとも１つのディフェンシンと組み合わせる。
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図1】ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有する抗ＣＤ２及び抗ＣＤ４でコーティングされたナノ粒子（ＮＰ）が寛容原性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）として機能したことを示す。これらは、親ＤＢＡ２ Ｔ細胞を注射した後の（ＣＤ５６／ＢＬ６×ＤＢＡ２）Ｆ１ハイブリッドマウスにおいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを増加させ、狼瘡様症候群を予防した。これらのＮＰ ａＡＰＣは、抗ＤＮＡ産生を抑制し、重篤な腎疾患を予防した。しかしながら、ＮＫ細胞が枯渇すると、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの増加が妨げられ、ループス腎炎の重症度が増加した。Ａは、ＤＢＡ／２ｃ細胞の投与後に（Ｃ５６／ＢＬ６×ＤＢＡ２）Ｆ１マウスに投与された、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含む寛容原性の抗ＣＤ２／４コーティングＮＰ（寛容原性のＮＰ ａＡＰＣ）の処置スケジュール及び用量を示す。Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの増加を示す。Ｃは、ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの増加を示す。Ｄは、タンパク尿によって示される４週間での腎炎の発症を示す。寛容原性ａＡＰＣはタンパク尿を顕著に阻害した。しかしながら、抗アシアロＧＭ１抗体でＮＫ細胞を枯渇させると、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇの増加が阻害され、タンパク尿の量がＮＰを投与しなかった動物に比べて有意に増加した。記号はマウスの様々な群を表し（群あたりｎ＝６）、エラーバーは平均値±ＳＥＭを示す。末梢ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ（Ｂ）及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ（Ｃ）の割合も、処置後の指定の時点で示す。空のＮＰとサイトカインを充填したＮＰの比較では、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０５であり、ＮＫ細胞を枯渇させたマウス（抗アシアロＧＭ１、ａ－ａｓＧＭ１）または枯渇させなかったマウスの間の§Ｐ＜０．０４である。Ｄは、図２Ｂ～２Ｃのマウスについて示された時点でのタンパク尿を示す。空のＮＰ対ＮＰ ａＡＰＣ間では＊Ｐ＜０．０５であり、ＮＫ細胞を枯渇させたか（抗ａＧＭ１）、または枯渇させずに、サイトカイン充填ＮＰで処置したマウス間の比較では、§Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００５である。ＮＫ細胞の枯渇により、循環ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの数が顕著に減少し、ナノ粒子で処置したマウスにおいて腎疾患が悪化した（図１Ｂ～２Ｃ）。Ａ～Ｇ（より具体的にはＥ～Ｇ）のパネルは、ＮＫ細胞の枯渇が血清抗ｄｓＤＮＡ自己抗体レベルの増加と関連していることを示している。逆に、ＣＤ２（ＮＫ）標的化ＮＰによる処置は、抗ＤＮＡ自己抗体産生の抑制と関連している。抗アシアロＧＭ１を投与することにより、ＮＫ細胞を枯渇させた。ＳＬＥ誘導（時間０）の２週間後及び４週間後に、個々のマウスのモニタリング及び群の平均値を報告する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図2】Ａ～Ｂは、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを充填したＣＤ２標的化ＮＰでの処置後、狼瘡様疾患を有するＢＤＦ１マウスにおいて宿主ＮＫ細胞が数値的に増加することを示す。対照は、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを充填した非コーティングＮＰ及び空の非コーティングＮＰであった。上の２つのパネル（Ａ及びＢ）は処置ごとのＮＰの総量であり、下の２つのパネル（Ｃ及びＤ）は、各回のＮＰの用量である。Ａ～Ｂは、ＮＰ ａＡＰＣの投与後４週間の間のＮＫ細胞の増加を示す。Ａは、各週におけるＮＫ細胞の増加割合を、Ｂは、ＮＫ細胞の絶対数の増加を示す。記号は、所与のＮＰ ａＡＰＣの総用量を示す。Ｂは、同じ処置を受けたマウスにおけるＮＫ細胞の総数（平均＋ＳＥ）を示す。空のＮＰで処置したＳＬＥ ＢＤＦ１マウスとの比較におけるＰ値＝＊＜０．００５、＊＊０．０００５。Ｃ～Ｄは、個々のマウスへの各注射で投与したＮＰの用量を示す。記号は、未処置のＢＤＦ１マウス（「非ＳＬＥ」、四角）、またはＩＬ－２及びＴＧＦ－βが封入された様々な用量のＮＰで処置した狼瘡ＢＤＦ１マウス（丸、非コーティングＮＰ、三角 １ｍｇ、ひし形 ２ｍｇ、逆三角 ４ｍｇ）を示す。これらの増加は、統計的にも有意である。
【図3】ＮＰ ａＡＰＣの投与後、宿主由来のＮＫ細胞が顕著に増加したことを示す。ＩＬ－２を充填し、抗ＣＤ２抗体をコーティングしないまま（対照）か、またはコーティングしたＮＰでの処置後のフローサイトメトリーによるモニタリング。Ｈ－２マーカーの使用により、ＤＢＡ／２ドナー（Ｈ－２Ｋｂ－）由来とＢＤＦ１レシピエント（Ｈ－２Ｋｂ＋）由来のＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）を区別することができた。
【図4】ＣＤ２（ＮＫ）標的化ＮＰで処置したＢＤＦ１マウスのループス腎炎からの防御が、ＮＫ細胞及びＴＧＦ－βに依存することを示す。新規ＴＧＦ－β依存性調節性ＮＫ細胞を記載する。Ａは、ＮＫ細胞の枯渇が、ＢＤＦ１マウスのタンパク尿を加速することを示している。０日目（ＳＬＥの誘導）から２週間、４日ごとに１００ｕｌの抗アシアロＧＭ１を投与することによって、ＮＫ細胞を枯渇させた。マウス（各群ｎ＝６）をＳＬＥ誘導後８週間モニタリングした。データは、平均値＋ＳＥを示す。ＮＫ枯渇抗アシアロＧＭ１の存在下または非存在下でＮＫ細胞標的化ＮＰを投与されたＢＤＦ１マウスの比較における４週目及び６週目、及び、空の非標的化ＮＰを投与されたマウス対ＮＫ細胞枯渇マウスの比較における４週目で、＊Ｐ＜０．０１。Ｂは、抗ＴＧＦ－β抗体、抗アシアロＧＭ１抗体、またはその両方の組み合わせをＢＤＦ１狼瘡マウス（１群あたりｎ＝６）に投与すると、抗ＣＤ２標的化ＮＰによる処置に関連するＮＫ細胞媒介の防御効果が無効になることを示している。腎機能は、血清クレアチニンによって評価した。これは、抗ＴＧＦ－β抗体または対照（ｃｔｒ）抗体による処置の２週間後に測定した。＊Ｐ＜０．０４。Ｃは、ＮＫ細胞の防御効果がＴＧＦ－β依存的であることを示している。抗ＣＤ２標的化ａＡＰＣによるマウスの処置後、ＮＫ細胞を単離した。一部をＴＧＦ－β ｓｉＲＮＡで処理し、他をＲＮＡスクランブル対照で処理した。各セットの２．５×１０６個のＮＫ細胞を同系ＢＤＦ１マウスに移入し、次いで狼瘡の発症を誘導した。移植後２週間で血清クレアチニンを測定した。＊Ｐ＜０．０１。ａＡＰＣを投与したマウス由来のＮＫ細胞は、二次宿主において慢性腎疾患の発症を予防した。ＮＫ細胞のＴＧＦ－βメッセージをサイレンシングしたマウスにおいて血清クレアチンが増加したことは、これらのＮＫ細胞の防御効果がＴＧＦ－β依存性であることを示している。
【図5】ａＡＰＣがヒトＴｒｅｇを増殖させることもできることを示す。健康なボランティア由来のＰＢＭＣを、抗ＣＤ３／２８ビーズと共に、０．２ビーズ／細胞の比率で５日間培養した。ＩＬ－２及びＴＧＦ－βが充填され、Ｔ細胞に対する抗体（抗ＣＤ３／２８）でコーティングされていないか、またはそれらで修飾された１００μｇ／ｍｌのＮＰが、実験培養物に含まれていた。培地のみ、及びＮＰなし（非刺激）または充填されないままのＮＰ（空）を含む培養物を、陰性対照とし、可溶性ＩＬ－２及びＴＧＦ－βの存在下での抗ＣＤ３／２８を含む培養物を、陽性対照とした。これらのＮＰの添加は寛容原性のａＡＰＣとして機能し、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ（Ａ）及びＣＤ８＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ（Ｂ）を増加させた Ｐ＜０．０５。
【図6】マウス細胞と同様に、ＩＬ－２を含有するＮＰのみが、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇを誘導することができることを示す。Ｔｒｅｇを誘導するために、抗ＣＤ３及びＣＤ２８で修飾されたＴ細胞を標的としたＮＰと共にヒトＰＢＭＣを培養した。Ａは、ＩＬ－２のみを封入したＴ細胞標的化ＮＰが、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの増殖を促進したことを示している。＊Ｐ＜０．０５。Ｂは、Ｔ細胞を標的とするこれらのａＡＰＣ ＮＰによって誘導されたＣＤ４＋ Ｔｒｅｇが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、共培養したＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞の増殖（左）及びＩＦＮ－γ産生（右）を抑制したことを示す。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆの比率０：１（エフェクターＴ細胞のみで刺激）での比較において、＊Ｐ＜０．０５。
【図7】Ｔ細胞標的化寛容原性ａＡＰＣ ＮＰがｉｎ ｖｉｖｏでヒトＴｒｅｇを増殖させることもできることを示すグラフである。免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＮＳＧ）を、ヒトＰＢＭＣを導入することによってヒト化した。ＮＰ寛容原性ａＡＰＣの投与は、ヒトＴｒｅｇを増殖させ、ＧＶＨＤを抑制した。ＮＳＧマウスを６匹ずつの２つの群に分けた。ＰＢＭＣの移入後、黒丸はａＡＰＣ ＮＰを投与したマウスを示し、白丸は空のＮＰを投与したマウスを示す。Ａ及びＢは、ａＡＰＣの移入後に、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇの両方が顕著に増加したことを示している。ＮＰは最初の２週間に投与されたが、驚くべきことに、実験が５０日目に終了した時点でも、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇの両方のレベルの増加が依然として検出可能であった（＊＝ｐ＜０．５）。Ｃは、これらのマウスにおけるヒトＢ細胞活性のエビデンスを示している。空のＮＰを投与したマウスではヒトＩｇＧレベルの顕著な上昇が認められたが、ａＡＰＣを投与したマウスでは観察されなかった（＊＝ｐ＜０．５）。
【図8】Ａ～Ｃは、ヒトＰＢＭＣを移入してヒト化した後の免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＮＳＧ）に、Ｔ細胞標的化寛容原性ａＡＰＣ ＮＰを投与することによって誘導し、増殖させたＴｒｅｇの防御効果を示すグラフである。Ａ～Ｅは、ヒト抗マウスＧＶＨＤに対するａＡＰＣの効果を示す。×印の線は、ヒトＰＢＭＣを投与しなかった対照マウスを示す。三角は空のＮＰＳを投与されたマウスを示し、白丸はａＡＰＣ ＮＰを投与されたマウスを示す。ａＡＰＣ ＮＰで防御されたマウスは、ヒトＰＢＭＣの移入後も体重が減少せず（Ａ）、疾患スコアは減少し（Ｂ）、処置されたマウスは、ＮＰを投与していないか、または空のＮＰを投与したマウスと比較して生存期間が延長された（Ｃ）。＊は、２つの群間の統計的に有意な結果を示す（ｐ＜０．０５）。対照マウスは、対照と比較してＧＶＨＤの皮膚症状を発現した（Ｄ）。Ｅは、対照と比較した、肺、肝臓及び結腸における炎症性浸潤を示す。
【図9】抗ＣＤ２及び抗ＣＤ３でコーティングされたＮＰがヒトＴｒｅｇを誘導するために、ＴＧＦ－βを含む必要がないことを示す。それらは、ＴＧＦ－βを局所環境に提供する。ヒトＰＢＭＣ（０．５×１０５）／ウェルをＵ底プレートで５日間培養した。ビオチン化抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、または両方の組み合わせ（２ｕｌ／ｍｌ）をＰＬＧＡ ＮＰの表面に結合させた。ＩＬ－２とＴＧＦ－βの両方を含むか、またはＩＬ－２のみを含むこれらのＮＰの５０ｕｇ／ｍｌをＰＢＭＣに添加した。他の刺激の非存在下では、ＴＧＦ－βを含むＮＰと含まないＮＰは、ＣＤ４ｒｅｇでは少なくとも２倍の増加、ＣＤ８ｒｅｇでは４倍の増加を誘導した（Ａ及びＢ）。抗ＴＧＦ－βを培養物に添加すると、この増加はなくなった。この結果から、Ｔｒｅｇを誘導するためにＩＬ－２とＴＧＦ－βの両方が必要であり、ＮＰはＴｒｅｇを誘導するために必要な外来性ＴＧＦ－βを誘導したことが示された。抗ＣＤ３は、Ｔ細胞によるこのサイトカインの産生を誘導することができ、抗ＣＤ２もＮＫ細胞のＴＧＦ－β産生を誘導することができることが知られている。あるいは、局所環境内の酸性ＮＰは、存在する潜在的なＴＧＦ－βを活性型に変換することができる。したがって、これらの研究は、ＴＧＦ－βがＮＰに封入される必要がないというエビデンスを示している。
【図10】ＩＬ－２のみを含む抗ＣＤ３（Ｆａｂ’）２コーティングＮＰが、ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇを誘導することができることを示す。末梢Ｔｒｅｇは、主にナイーブＴ細胞から誘導されるため、磁気ビーズ（ＡｕｔｏＭＡＣＳを介して）を使用してＰＢＭＣからＣＤ４５ＲＯ＋細胞を除去した。これらの細胞を、ＩＬ－２を封入し、抗ＣＤ３ Ｆ（ａｂ’）２（ｘ軸）をコーティングするか、または何もコーティングしていない（対照、なし）ＮＰ ２００μｇ／ｍｌと共に、Ｕ底９６ウェルプレートにおいて、５×１０５細胞／ウェルの濃度で、完全培地中で培養した。グラフは、５日間の培養後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞コンパートメント内のＦｏｘＰ３＋細胞数の増加を示している。＊Ｐ＜０．０１。
【図11】ＩＬ－２を含有するリンパ球標的化ＮＰのみが、免疫不全マウスをヒト抗マウス移植片対宿主病から防御することができるが、データはまた、防御がＴＧＦ－βの産生に依存していることを示している。パネルＡは、ヒト抗マウスＧＶＨＤに対するＩＬ－２及びＴＧＦ－βを充填したＮＰの投与による以前の防御効果を示す。ｘでラベルされた線の生存曲線は、空のＮＰを投与した対照を示す。黒丸の線は、ＩＬ－２及びＴＧＦ－β ＮＰを投与した動物による生存率の増加を示す。アスタリスク付きの線は、ａｌｋ５阻害剤によるＴＧＦ－βシグナル伝達の遮断が、ＮＰの防御効果を無効にするだけでなく、生存期間も短縮することを示している。パネルＢは、ＩＬ－２のみを含有するＮＰが、ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害によって遮断される同様の防御効果を有することを示している。
【発明を実施するための形態】
【0081】
Ｉ．序論
全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）は、遺伝的要因及び環境的要因が免疫恒常性の破壊の原因となる免疫調節障害である。ＳＬＥでは、通常は静止状態にある自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞が活性化され、ＳＬＥにおいて機能が損なわれた特殊な細胞である調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）による抑制を含めて、末梢寛容機構による抑制がなされなくなる（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ａｎｄ Ｌａ Ｃａｖａ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，Ｉｎ：Ｔｓｏｋｏｓ（Ｅｄ．），Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｂａｓｉｃ，ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；２０１６，５５－６２）。
全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）は、遺伝的要因及び環境的要因が免疫恒常性の破壊の原因となる免疫調節障害である。ＳＬＥでは、通常は静止状態にある自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞が活性化され、ＳＬＥにおいて機能が損なわれた特殊な細胞である調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）による抑制を含めて、末梢寛容機構による抑制がなされなくなる（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ａｎｄ Ｌａ Ｃａｖａ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，Ｉｎ：Ｔｓｏｋｏｓ（Ｅｄ．），Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｂａｓｉｃ，ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；２０１６，５５－６２）。
【0082】
現在、ＳＬＥ（及び他の自己免疫疾患）の治療には、炎症誘発性サイトカイン、エフェクター細胞、またはシグナル伝達経路を標的とする薬剤が含まれる（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ），２０１１；４７：２８９－３０２）。これらの薬剤は、疾患の進行を阻止することができるが、疾患を止めるために必要な補整的調節経路も標的とするため、寛解をもたらすことはほとんどない。ＳＬＥを治療する他の試みでは、免疫系を「リセット」して寛解を引き起こそうとした。例えば、リンパ系細胞の枯渇とそれに続く自家幹細胞移植は、ＳＬＥにおける疾患の寛解の延長をもたらすが、この戦略は術後の患者の死亡率と関連している（Ｂｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ，２００６；２９５：５２７－３５）。
【0083】
自己免疫疾患、特に１型糖尿病において、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞を使用する複数のアプローチが研究中である（Ｇｉｔｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ，２０１６；７１：７８－８７）が、大量のＴｒｅｇ細胞を調製するには技術的に煩雑な手順が必要であることに加えて、ｉｎ ｖｉｖｏで機能的に安定した状態を保持する自家Ｔｒｅｇ細胞が必要であるといった欠点がある。調節性ＣＤ８細胞及びＮＫ細胞、ならびに寛容原性抗原提示細胞の養子移入は、治療効果をもたらす可能性があるが、これらの細胞を利用する方法論は開発されていない。
【0084】
Ｔ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とするナノ粒子（ＮＰ）は、免疫寛容を誘導するために使用されている。寛容原性ペプチドまたはＡＰＣを標的としたペプチドとラパマイシンを封入したポリマーＮＰは、ＴＧＦ－β依存性のＴｒｅｇ誘導を介して自己免疫性糖尿病及び多発性硬化症の動物モデルにおける疾患を予防／逆転させた（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２０１４；２５：２１４８－６０；Ｍａｌｄｏｎａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１５；１１２：１５６－６５）。Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＶ（ＣａＭＫ４）阻害剤の免疫抑制薬を、ＮＰを介して送達することにより、マウスＳＬＥが改善された（Ｌｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１３，１２３：１７４１－９；Ｏｔｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５；１９５：５５３３－７；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１８；１２８：３４４５－５９）。
【0085】
ＭＨＣペプチドでコーティングされた酸化鉄ＮＰは、ＩＦＮ－γ産生Ｔｈ１細胞をＩＬ－１０産生Ｔｒ１細胞に変換することができ、自己免疫疾患のマウスモデルに治療効果をもたらす（Ｃｌｅｍｅｎｔｅ－Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１６；５３０：４３４－４０）。ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇは、樹状細胞（ＤＣ）を誘導して寛容原性を獲得し、二次宿主を防御したが（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１２；４：４０９－１９）、その系には、複数の治療薬を送達することができないなどの制約があり、ヒトの自己免疫疾患で遭遇するＭＨＣの多様性に適合するには、異なるＭＨＣ特異的ペプチドが必要となるであろう。また、酸化鉄の長期蓄積は有毒である。
【0086】
本出願は、確立された免疫媒介性障害を予防または治療する細胞となるように複数の免疫細胞集団を直接誘導するための方法及び組成物を提供する。Ｔ細胞は、抗原に直接反応できないため、未熟な細胞を抑制性の調節性細胞に完全に誘導することができる寛容原性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）として機能するナノ粒子を投与する。Ｔ細胞とＮＫ細胞の場合、ＩＬ－２とＴＧＦ－βを使用した継続的な刺激が必要である。ａＡＰＣは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激、ＩＬ－２、及びＴＧＦ－βの３つの要素すべてを提供する。現在、ＩＬ－２のみを封入することを使用することができることが見出された（図９～１１）。抗ＣＤ２及びＣＤ３は、局所環境でＴ細胞に必要なＴＧＦ－βを誘導することができる。抗ＣＤ２は、ＮＫ細胞がＴＧＦ－βを産生するように誘導し、ＮＫ細胞がＴＧＦ－β依存性調節性細胞になるように誘導することもできる。
【0087】
ＩＬ－２を充填した抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２コーティングＮＰは両方とも、調節性細胞の生成及び増殖に必要な刺激及びサイトカインを提供することができるが、機構は異なる可能性がある。ＮＰ ａＡＰＣを使用してこれらの細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法は、免疫媒介性疾患の複数の適応症に対する安全で実用的な治療アプローチを提供する。
【0088】
Ｔ細胞は抗原刺激に直接応答することができず、この目的のために抗原提示細胞（ＡＰＣ）を必要とする。ナノ粒子は、寛容原性の人工抗原提示細胞またはａＡＰＣとして機能する。以前に、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１１；８：１４３－５２）は、ＰＬＧＡ ＮＰを抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８でコーティングし、ＮＰにＩＬ－２を充填して免疫原性ａＡＰＣを作製した。したがって、ＮＰは、免疫原性ａＡＰＣまたは寛容原性ａＡＰＣのいずれかになるように製剤化することができる。
【0089】
ＮＰは、ＡＰＣを標的にしてＴｒｅｇを増殖させることができるが、ＮＰはＴｒｅｇを直接誘導させ、または増殖させることもできる。Ｔ細胞の分化は、Ｔ細胞受容体の刺激の強さによって部分的に決定される。強い刺激は免疫原性であり、エフェクターＴ細胞を産生するが、同じ経路による弱い刺激は寛容原性であり、調節性Ｔ細胞を産生し得る。したがって、ＮＰをコーティングする抗体の組成を変更すると、免疫原性ａＡＰＣを本明細書に記載の寛容原性ａＡＰＣに切り替えることができる。
【0090】
最も防御的なＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。これらのＴｒｅｇは、その誘導、適合性及び生存のために、継続的な刺激とサイトカインＩＬ－２及びＴＧＦ－βを必要とする（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，２００６；２１２：８－２７）。ＳＬＥでは、これらのＴｒｅｇが機能不全になる。ＩＬ－２とＴＧＦ－βの産生も狼瘡では減少しており、この欠損がＴｒｅｇ機能不全に寄与している可能性がある。したがって、免疫細胞ＩＬ－２及びＴＧＦ－βをｉｎ ｖｉｖｏで提供する方法は、狼瘡におけるＩＬ－２欠損を修正し、狼瘡における治療用Ｔｒｅｇを誘導し、増殖させ得る。しかしながら、ＴＧＦ－βには多面発現性の特性があり、有害な副作用を引き起こし得る。したがって、この効果のためには、局所環境において外来性ＴＧＦ－βを誘導するナノ粒子を使用することが望ましい。
【0091】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の両方を増殖させ、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＧＦ－β依存性ナチュラルキラー（ＮＫ）調節性応答を誘導する寛容原性ナノ粒子プラットフォームが開発されている。これらの複数の調節性細胞集団は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患や移植片対宿主病などの外来移植疾患を含む慢性免疫媒介性疾患を抑制する。
【0092】
本明細書に示すように、Ｔ細胞は抗原に直接応答することができない。これらは、陽性エフェクター細胞または陰性サプレッサー細胞または調節性細胞への分化を誘導するために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を必要とする。調節性細胞は、エフェクター細胞の活性を調節し、静止状態の自己反応性細胞が自己免疫を引き起こすのを予防する。ナノ粒子は、Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ細胞）を標的とする寛容原性の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）となるように配合される。これらのａＡＰＣを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４＋及びＣＤ８＋ならびに調節性ＮＫ細胞を誘導及び増殖させる方法が開発されている。このプラットフォームは、サイトカインであるＩＬ－２、ＴＧＦ－β、ならびにこれらの調節性細胞集団の生成、機能、及び生存に不可欠な継続的な刺激を提供する。
【0093】
ナノ粒子は、放出用にＩＬ－２を封入し、好ましくは、ＮＰをコーティングする抗体を使用してＣＤ２及び／またはＣＤ３を発現する細胞を標的とする。抗ＣＤ２は、Ｔ細胞とＮＫ細胞を標的とするが、抗ＣＤ３は、Ｔ細胞のみを標的とする。これらの抗体によって提供される免疫刺激、及びＮＰによって放出されるＩＬ－２の効果は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞のＴＧＦ－βの産生を誘導するか、局所環境に存在する潜在的なＴＧＦ－βを活性化する。刺激と産生されたサイトカインの累積効果により、未分化のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞がＴｒｅｇに、ＮＫ細胞がＴＧＦ－β依存性調節性細胞になるように誘導し、これは、免疫媒介性疾患に対して治療効果を有する。
【0094】
ｉｎ ｖｉｖｏで注射された抗ＣＤ３は、サイトカイン放出症候群を含む有毒な副作用を引き起こし得る。これらの副作用は、抗体のＦｃ部分によって媒介される。この毒性を除去するために、治療特性を変えることなくこの抗体のＦｃフラグメントを除去することができる。
【0095】
いくつかの例では、ＩＬ－２のみを充填した抗ＣＤ３（Ｆａｂ’）２または抗ＣＤ２コーティングＮＰが調節性細胞を誘導する能力を有することが示されている。ＮＰが標的細胞にＴＧＦ－βの産生を誘導したことを示すために、一例として、ＴＧＦ－βの抗体中和により、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを誘導する能力が消失することを示す。別の例では、ＩＬ－２のみを含有する抗ＣＤ２コーティングＮＰが治療用のＴＧＦ－β依存性ＮＫ細胞を誘導することが示されている。ＴＧＦ－βには多くの多面的効果があるため、このサイトカインを局所的に産生させるこの修飾は、治療薬として使用する場合、これらのＮＰの安全性を顕著に向上させるはずである。ＴＧＦ－βをナノ粒子に封入する必要はない。
【0096】
この系の有効性は、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）動物モデルを使用して最初に示された。ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入したポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子（ＮＰ）を、最初に抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体でコーティングし、ＤＢＡ／２ Ｔ細胞を（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１（ＢＤＦ１）マウスに移入することによって、誘発される狼瘡様疾患のマウスに投与した。ＤＢＡ／２ Ｔ細胞は、親Ｂ細胞を刺激して、致死性狼瘡様疾患を引き起こす抗体を産生する。ＮＰ投与後、Ｔｒｅｇの末梢頻度をフローサイトメトリーによってｅｘ ｖｉｖｏでモニタリングした。疾患の進行は、ＥＬＩＳＡにより血清抗ｄｓＤＮＡ抗体を測定することによって評価した。腎炎は、タンパク尿及び腎組織病理として評価した。
【0097】
ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入し、抗ＣＤ２／４抗体でコーティングしたＮＰでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇが誘導されたが、コーティングなしの場合は誘導されなかった。正常マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ研究により、狼瘡を有するＢＤＦ１マウスにおいて試験したＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを増殖させるためのＮＰの投与計画を決定した。ＩＬ－２及びＴＧＦβを封入し、抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体でコーティングしたＮＰの投与により、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇが増加し、抗ＤＮＡ抗体の産生が顕著に抑制され、腎疾患が減少した。
【0098】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇのみが治療に関与していたわけではない。ＴＧＦ－β依存性調節性ＮＫ細胞も関与していた。抗ＣＤ２／４を結合させたＮＰで処置したマウスを抗アシアロＧＭ１抗体で処置してＮＫ細胞を枯渇させた。この処置は、ＮＰによって誘導されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの数を減少させ、それらの治療効果を完全に消失させるだけでなく、自己免疫疾患の重症度も増加させた。抗ＤＮＡ抗体の力価は未処置マウスよりも高く、腎疾患（タンパク尿）は未処置マウスよりも多かった。したがって、ＮＰによって誘導されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの増加に加えて、防御性ＮＫ細胞も明らかに誘導され、これらの細胞の枯渇は、ＮＰの防御効果を完全に取り除き、狼瘡の症状を悪化させた。
【0099】
マウス細胞を用いた研究に加えて、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βまたはＩＬ－２単独を含有する寛容原性ａＡＰＣでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、ヒトＴ細胞がＴｒｅｇになるように誘導された。例としては、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８（これは、追加の共刺激を提供した）でコーティングされたＰＬＧＡ ＮＰであった。これらの抗体でコーティングしたＮＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを誘導した。さらに、免疫不全マウスにヒトＰＢＭＣを輸血し、ＩＬ－２のみを封入したａＡＰＣを３週間にわたって投与したところ、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇが顕著に増加し、それが５か月間持続し、これらの調節性細胞の防御効果により、これらのマウスのほとんどは、その後起こる致命的なヒト抗マウス移植片疾患から生き残ることができた。
【0100】
これらの結果は、ヒトの全身性自己免疫疾患におけるこの技術の用途を強調している。自己免疫疾患では、ＴＣＲ刺激は自己抗原によるものである。ＳＬＥ、１型糖尿病、及び多発性硬化症などの自己免疫疾患では、ａＡＰＣ ＮＰに組み込まれると寛容原性ペプチドに変換され得る病原性ペプチドが報告されている。同種幹細胞移植及び同種移植では、外来同種抗原が免疫原性抗原提示細胞によって処理され、Ｔ細胞に提示され、これがキラー細胞となり、移植片対宿主病や移植拒絶反応を引き起こす。このため、拒絶反応を媒介する免疫細胞を除去するために、移植前に有毒な免疫抑制剤を使用する。この有毒な前処理手順と、移植後の拒絶反応を防ぐために必要な免疫抑制薬を排除することが望ましいであろう。寛容原性ａＡＰＣがリンパ球に直接作用してＴｒｅｇを誘導することにより、これらの目的を達成することができる。
【0101】
同種異系臓器移植片の拒絶反応を回避するために、移植前にこれらのａＡＰＣナノ粒子で処理すると、ＣＤ４ Ｔｒｅｇ、ＣＤ８ Ｔｒｅｇ、及びＴＧＦ－β依存性調節性ＮＫ細胞が生成される。これらは、未成熟な抗原提示樹状細胞と相互作用し、それらが寛容原性になるように誘導する。したがって、移植後、ａＡＰＣは、移植された外来同種抗原を処理する寛容原性樹状細胞をサポートし、移植を拒絶するキラーＴ細胞の代わりに移植の生存を促進する同種抗原特異的Ｔｒｅｇを誘導する。したがって、本明細書に記載の方法は、同種幹細胞及び固形臓器移植に現在使用されている有毒なコルチコステロイド及び免疫抑制剤の使用を著しく削減または排除するであろう。ＮＰ ａＡＰＣは、ＧＶＨＤ及び固形臓器移植の適応症の治療または予防に使用することができる。
【0102】
ＩＩ．定義
本明細書における免疫応答とは、外来抗原または自己抗原に対する宿主応答を意味する。本明細書で使用する用語「異常な免疫応答」または「免疫媒介性障害」は同じ意味であり、免疫系が自己と非自己を区別できないこと、または宿主を外来抗原から防御できないことを意味する。言い換えれば、異常な免疫応答または免疫媒介性障害とは、患者の症状を引き起こす不適切に調節された免疫応答である。「不適切に調節される」とは、不適切に誘発され、不適切に抑制され、及び／または応答性がないことを意味する。異常な免疫応答には、生物自身の組織に対する抗体の産生、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、及びＴＧＦ－βの産生障害、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γの過剰な産生によって引き起こされる組織損傷及び炎症、ならびに細胞傷害性及び非細胞傷害性の作用機序によって引き起こされる組織損傷が含まれるが、これらに限定されない。これらすべての事象において、病的な免疫細胞は、通常であればこの病的な細胞をネガティブに制御して働きを抑える他の免疫細胞による制御を逃れる。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、特定の免疫細胞を標的とし、それらを抑制性の調節性細胞となるように誘導し、その数を増加させる配合ナノ粒子を使用する。これらの調節性細胞は免疫系を「リセット」し、病的な免疫細胞の活動を停止させる。Ｔ細胞が調節性細胞になるように誘導する調節性組成物には、継続的な刺激を提供する薬剤、ならびにサイトカインＩＬ－２及びＴＧＦ－βが含まれる。
本明細書における免疫応答とは、外来抗原または自己抗原に対する宿主応答を意味する。本明細書で使用する用語「異常な免疫応答」または「免疫媒介性障害」は同じ意味であり、免疫系が自己と非自己を区別できないこと、または宿主を外来抗原から防御できないことを意味する。言い換えれば、異常な免疫応答または免疫媒介性障害とは、患者の症状を引き起こす不適切に調節された免疫応答である。「不適切に調節される」とは、不適切に誘発され、不適切に抑制され、及び／または応答性がないことを意味する。異常な免疫応答には、生物自身の組織に対する抗体の産生、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、及びＴＧＦ－βの産生障害、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γの過剰な産生によって引き起こされる組織損傷及び炎症、ならびに細胞傷害性及び非細胞傷害性の作用機序によって引き起こされる組織損傷が含まれるが、これらに限定されない。これらすべての事象において、病的な免疫細胞は、通常であればこの病的な細胞をネガティブに制御して働きを抑える他の免疫細胞による制御を逃れる。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、特定の免疫細胞を標的とし、それらを抑制性の調節性細胞となるように誘導し、その数を増加させる配合ナノ粒子を使用する。これらの調節性細胞は免疫系を「リセット」し、病的な免疫細胞の活動を停止させる。Ｔ細胞が調節性細胞になるように誘導する調節性組成物には、継続的な刺激を提供する薬剤、ならびにサイトカインＩＬ－２及びＴＧＦ－βが含まれる。
【0103】
本明細書に記載の「インターロイキン－２」（ＩＬ－２）は、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種であるインターロイキンである。これは、免疫を担当する白血球（白血球、多くの場合リンパ球）の活動を調節する１５．５～１６ｋＤａのタンパク質である。ＩＬ－２は、微生物感染に対する体の自然な応答の一部であり、異物（「非自己」）と「自己」を識別する。ＩＬ－２は、リンパ球が発現するＩＬ－２受容体に結合することによってその効果を媒介する。ＩＬ－２の主な供給源は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞と活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞である。ＩＬ－２はサイトカインファミリーのメンバーであり、各メンバーは４つのαヘリックスバンドルを有し、このファミリーには、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１も含まれる。ＩＬ－２は、主にＴ細胞に対する直接的な影響を介して、免疫系の主要な機能である寛容性及び免疫性において重要な役割を果たしている。Ｔ細胞が成熟する胸腺では、特定の未成熟Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞への分化を促進することにより、自己免疫疾患が予防され、調節性Ｔ細胞は、体内の正常な健康な細胞を攻撃するように抗原刺激されている他のＴ細胞を抑制する。ＩＬ－２はまた、最初のＴ細胞が抗原によって刺激された場合に、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞とメモリーＴ細胞への分化を促進し、体が感染症と戦うのを支援する。他の極性サイトカインと共に、ＩＬ－２は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ１及びＴｈ２リンパ球への分化を刺激するが、一方でＴｈ１７及び濾胞性Ｔｈリンパ球への分化を妨げる。その発現と分泌は厳密に制御されており、免疫応答の増強及び抑制における一時的な正及び負のフィードバックループの一部として機能する。ＩＬ－２は、抗原によって選択されたＴ細胞クローンの数と機能の増大に依存するＴ細胞免疫記憶の発達におけるその役割を通じて、細胞媒介性免疫の持続において重要な役割を果たす。
【0104】
ＩＬ－２は、α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）及びγ（ＣＤ１３２）と呼ばれる３本の鎖からなる複合体であるＩＬ－２受容体を介してシグナルを伝達する。γ鎖はすべてのファミリーメンバーで共有されている。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）αサブユニットは、低い親和性（Ｋｄ約１０－８Ｍ）でＩＬ－２に結合する。ＩＬ－２とＣＤ２５の相互作用は、単独では細胞内鎖が短いためシグナル伝達を引き起こさないが、ＩＬ－２Ｒ親和性を１００倍増加させる能力がある（β及びγサブユニットに結合した場合）。ＩＬ－２Ｒのβ及びγサブユニットのヘテロ二量体化は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に不可欠である。ＩＬ－２は、中親和性二量体ＣＤ１２２／ＣＤ１３２ ＩＬ－２Ｒ（Ｋｄ約１０－９Ｍ）または高親和性三量体ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２ ＩＬ－２Ｒ（Ｋｄ約１０－１１Ｍ）のいずれかを介してシグナル伝達することができる。二量体ＩＬ－２Ｒは、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって発現されるが、調節性Ｔ細胞及び活性化Ｔ細胞は、高レベルの三量体ＩＬ－２Ｒを発現する。非Ｔｒｅｇの刺激を最小限に抑えるＩＬ－２のバリアントを含む、様々な形態のＩＬ－２を本開示において使用してもよい。
【0105】
多面発現性ポリペプチドである「トランスフォーミング成長因子β」（ＴＧＦ－β）は、胚発生、成体幹細胞分化、免疫調節、創傷治癒、及び炎症を含む複数の生物学的プロセスを調節する。ＴＧＦ－βファミリーメンバーは、プレプロペプチド前駆体として合成され、その後プロセシングされて、ホモ二量体またはヘテロ二量体として分泌される。このファミリーのほとんどのリガンドは、膜貫通セリン／スレオニンキナーゼ受容体及びＳｍａｄタンパク質を介してシグナルを伝達し、細胞機能を調節する。ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の特定の構成要素の変化は、がん、自己免疫疾患、組織線維症、及び心血管病理などの広範な病理に寄与し得る。ＴＧＦ－βは、様々な程度の構造的相同性と細胞機能に対する重要な効果を有する、密接に関連したポリペプチドのファミリーに属している。トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）ファミリーのメンバーは、Ｉ型及びＩＩ型二重特異性キナーゼ受容体のヘテロ四量体複合体を介してシグナルを伝達する。受容体の活性化と安定性は、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化などの翻訳後修飾、ならびに細胞表面及び細胞質内の他のタンパク質との相互作用によって制御される。ＴＧＦ－β受容体の活性化は、核に移行して転写因子として機能するＳｍａｄ複合体の形成を介したシグナル伝達、ならびにＥｒｋ１／２、ＪＮＫ、及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路、ならびにＳｒｃチロシンキナーゼ、ホスファチジルイノシトール３’－キナーゼ、及びＲｈｏ ＧＴＰアーゼなどの非Ｓｍａｄ経路を介したシグナル伝達を誘導する。ＴＧＦ－βファミリーメンバーの結合は、２つのＩ型受容体と２つのＩＩ型受容体のヘテロ四量体複合体の集合を誘導する。ヒトＩ型受容体は７つ、ＩＩ型受容体は５つ存在し、ＴＧＦ－βファミリーの個々のメンバーは、Ｉ型受容体とＩＩ型受容体の特徴的な組み合わせに結合する。これらの受容体は、かなり小さなシステインに富んだ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン、及びキナーゼドメインを有し、しかしながら、ＢＭＰ ＩＩ型受容体を除き、チロシンキナーゼ受容体とは対照的に、キナーゼドメインのカルボキシ末端部分は非常に短い。Ｉ型及びＩＩ型受容体のリガンド誘導性オリゴマー化は、グリシン及びセリン残基が豊富な膜近傍ドメイン（ＧＳドメイン）領域におけるＩ型受容体のＩＩ型受容体リン酸化を促進し、そのキナーゼの活性化を引き起こす。活性化されたＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体は、受容体によって活性化された（Ｒ）－Ｓｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、したがって、ＴＧＦ－β、アクチビン、及びｎｏｄａｌは一般に、Ｓｍａｄ２及び３のリン酸化を誘導するが、ＢＭＰは一般に、Ｓｍａｄ１、５をリン酸化する。活性化されたＲ－Ｓｍａｄは、次いで共通メディエーターＳｍａｄ４と三量体複合体を形成し、核に移行して他の転写因子、コアクチベーター、及びコリプレッサーと協働して特定の遺伝子の発現を制御する。Ｅｒｋ１／２、ＪＮＫ、及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路、チロシンキナーゼＳｒｃ、ホスファチジルイノシトール－３’（ＰＩ３）－キナーゼ、ならびにＲｈｏ ＧＴＰアーゼなどのＴＧＦ－βファミリーのメンバーによって活性化される非Ｓｍａｄシグナル伝達経路も存在する。
【0106】
本明細書で使用する場合、用語「生体適合性」及び「生物学的に適合」とは、一般に、その代謝産物または分解産物と共に、レシピエントに対して一般に非毒性であり、レシピエントにいかなる重大な悪影響も引き起こさない材料を指す。一般的に言えば、生体適合性材料とは、患者に投与した場合に重大な炎症反応や免疫反応を誘発しない材料である。
【0107】
本明細書で使用する場合、用語「生分解性ポリマー」とは、一般に、生理的条件下での酵素作用及び／または加水分解によって分解または侵食され、より小さな単位または化学種となり、対象によって、代謝、排除、または排泄され得るポリマーを指す。分解時間は、ポリマー組成、多孔性などの形態、粒子寸法、及び環境の関数である。
【0108】
本明細書で使用する場合、用語「両親媒性」とは、分子が親水性部分と疎水性部分の両方を有する特性を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、疎水性部分に共有結合した親水性部分を有する。いくつかの形態では、親水性部分は水に可溶性であるが、疎水性部分は水に不溶性である。さらに、親水性部分及び疎水性部分は、形式的な正電荷または形式的な負電荷を有していてもよい。しかしながら、全体としては、親水性または疎水性のいずれかである。両親媒性化合物は、両親媒性ポリマーとすることができ、それにより、親水性部分は親水性ポリマーであり得、疎水性部分が疎水性ポリマーであり得る。
【0109】
本明細書で使用する場合、用語「平均粒径」または「平均粒度」は、粒子の集団における粒子の統計的平均粒子径（直径）を指す。本質的に球形の粒子の直径は、物理的直径または流体力学的直径を指し得る。非球形粒子の直径は、流体力学的直径を優先的に参照してもよい。本明細書で使用する場合、非球形粒子の直径は、粒子の表面上の２点間の最大直線距離を指し得る。平均粒径は、動的光散乱などの当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。
【0110】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなく、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、担体、賦形剤、組成物、及び／または剤形を指す。
【0111】
本明細書で使用する場合、用語「封入された」及び「組み込まれた」とは、１つ以上の薬剤、または他の材料に関して使用する場合、ポリマー組成物に組み込まれることとして当技術分野で認識される。特定の実施形態では、これらの用語には、所望の用途においてそのような薬剤の放出、例えば徐放、を可能にする組成物にそのような薬剤を組み込むか、製剤化するか、または他の方法で含めることが含まれる。これらの用語は、薬剤または他の材料をポリマー粒子に組み込む任意の方法を意図しており、例えば、そのようなポリマーの単量体への結合（共有結合、イオン結合、または他の結合相互作用による）、物理的混合、薬剤をポリマーのコーティング層に包み込むこと、及びそのような単量体を重合の一部にしてポリマー製剤を取得すること、ポリマーマトリックス全体に分散させること、（共有結合または他の結合相互作用によって）ポリマーマトリックスの表面に付加すること、ポリマーマトリックスの内部に封入することなどが含まれる。用語「共組み込み」または「共封入」とは、対象の組成物中に複数の活性薬剤または他の材料と、少なくとも１つの他の薬剤または他の材料を組み込むことを指す。
【0112】
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」及び「低減する」とは、活性、発現、または症状を低減または低下させることを指す。これは、活性、発現、または症状の完全な阻害または低下、または部分的な阻害または低下であり得る。阻害または低減は、対照または標準レベルと比較することができる。
【0113】
本明細書で使用する場合、用語「治療」または「治療すること」とは、疾患の１つ以上の症状を治療するために組成物を対象または系に投与することを指す。対象への組成物の投与の効果は、限定されないが、病態の特定の症状の停止、病態の症状の軽減または予防、病態の重症度の軽減、病態の完全な除去、特定の事象または特性の発現または進行の安定化または遅延、あるいは特定の事象または特性が発生する可能性の最小化であり得る。
【0114】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、及び「予防的治療」とは、特定の有害な病態、障害、または疾患を発症するリスクがあるか、感受性があるか、または罹りやすく、したがって、症状及び／またはその根本的な原因の発生の予防に関連する、臨床的に無症候性の個体への薬剤または組成物の投与を指す。
【0115】
本明細書で使用する場合、用語「薬剤」とは、体内で局所的及び／または全身的に作用する生理学的または薬理学的に活性な物質を指す。活性薬剤は、疾患または障害の治療（例えば、治療薬）、予防（例えば、予防薬）、栄養補給（例えば、栄養補助食品）、または診断（例えば、診断薬）のために患者に投与される物質である。この用語には、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、及び類似体を含むがこれらに限定されない、薬剤の薬学的に許容される薬理学的に活性な誘導体も包含される。
【0116】
本明細書で使用する用語「小分子」とは、一般に、分子量が約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、または約１０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機分子を指す。
【0117】
本明細書で使用する用語「免疫調節薬」とは、抗原に対する免疫応答を調節するが、抗原ではないか、または抗原に由来しない薬剤を指す。本明細書で使用する場合、「調節する」とは、免疫応答を誘導、増強、抑制、寛容化、指示、または再指示することを指す。
【0118】
本明細書で使用する用語「有効量」及び「治療有効量」は、本明細書に記載のナノ粒子、治療薬、及び医薬組成物に適用される場合、同じ意味で使用され、所望の治療結果をもたらすために必要な量を指す。例えば、有効量とは、組成物及び／または治療薬、または医薬組成物の投与対象の疾患の症状を治療、治癒、または軽減するのに有効なレベルである。求められる特定の治療目標に対する有効量は、治療しようとする疾患及びその重症度及び／または発症／進行の段階、使用する特定の化合物及び／または抗腫瘍薬、または医薬組成物のバイオアベイラビリティ及び活性、投与経路または投与方法及び対象における導入部位を含む様々な要因によって異なる。
【0119】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の記載がない限り、その範囲内にあるそれぞれの個別の値を個別に参照する簡略的な方法として機能することを単に意図しており、それぞれの個別の値は、あたかも本明細書中に個別に記載されているかのように本明細書に援用される。
【0120】
用語「約」の使用は、およそ±１０％の範囲で記載された値を上回るか下回る値を記述することを意図している。
【0121】
ＩＩＩ．製剤
Ａ．ナノ粒子
本開示で使用するナノ粒子は、約４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約６０～約４５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、または約３５０ｎｍの平均直径を有する。粒径は、任意の適切な方法で測定してもよい。適切な方法としては、動的光散乱（ＤＬＳ）、極低温透過電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）、または中性子線小角散乱（ＳＡＮＳ）が挙げられる。
Ａ．ナノ粒子
本開示で使用するナノ粒子は、約４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約６０～約４５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、または約３５０ｎｍの平均直径を有する。粒径は、任意の適切な方法で測定してもよい。適切な方法としては、動的光散乱（ＤＬＳ）、極低温透過電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）、または中性子線小角散乱（ＳＡＮＳ）が挙げられる。
【0122】
１．合成ポリマーナノ粒子
ナノ粒子のポリマーマトリックスは、１つ以上のポリマー、コポリマー、またはブレンド及びデンドリマーから形成され得る。ポリマーマトリックスの組成と形態を変えることにより、様々な放出制御特性を達成することができ、１つ以上の活性薬剤の適度の一定用量を長期間にわたって送達することができる。好ましくは、ポリマーマトリックスは生分解性である。ポリマーマトリックスは、１日～１年、より好ましくは１日～２６週間、より好ましくは１日～２０週間、最も好ましくは１日～４週間の期間内に分解するように選択することができる。いくつかの態様では、ポリマーマトリックスは、数時間～５週間、より好ましくは１日～３週間、より好ましくは１日～１５日、最も好ましくは１日～７日の期間内に分解するように選択することができる。
ナノ粒子のポリマーマトリックスは、１つ以上のポリマー、コポリマー、またはブレンド及びデンドリマーから形成され得る。ポリマーマトリックスの組成と形態を変えることにより、様々な放出制御特性を達成することができ、１つ以上の活性薬剤の適度の一定用量を長期間にわたって送達することができる。好ましくは、ポリマーマトリックスは生分解性である。ポリマーマトリックスは、１日～１年、より好ましくは１日～２６週間、より好ましくは１日～２０週間、最も好ましくは１日～４週間の期間内に分解するように選択することができる。いくつかの態様では、ポリマーマトリックスは、数時間～５週間、より好ましくは１日～３週間、より好ましくは１日～１５日、最も好ましくは１日～７日の期間内に分解するように選択することができる。
【0123】
一般に、合成ポリマーが好ましいが、天然ポリマーを使用してもよい。代表的なポリマーとして、ポリヒドロキシ酸（ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸））、ポリ３－ヒドロキシ酪酸またはポリ４－ヒドロキシ酪酸などのポリヒドロキシアルカノエート、ポリカプロラクトン、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（グリコリド－コ－カプロラクトン）、チロシンポリカーボネートなどのポリカーボネート、ポリアミド（合成ポリアミド及び天然ポリアミドを含む）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びプルロニック（ポリエチレンオキシドポリプロピレングリコールブロックコポリマー）などのポリ（アルキレンオキシド）、ポリアクリル酸、ならびにそれらの誘導体、コポリマー、及びブレンドが挙げられる。
【0124】
本明細書で使用する場合、「誘導体」には、当業者によって日常的に行われる、上記のポリマー主鎖に対する、化学基の置換、付加及び他の修飾を有するポリマーが含まれる。タンパク質、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、プロラミン、例えば、ゼイン、ならびに多糖類、例えば、アルギン酸塩及びペクチンを含む天然ポリマーもポリマーマトリックスに組み込まれ得る。特定の場合では、ポリマーマトリックスが天然ポリマーを含む場合、天然ポリマーは、加水分解によって分解する生体ポリマーである。
【0125】
いくつかの実施形態では、コア粒子のポリマーマトリックスは、１つ以上の架橋性ポリマーを含み得る。架橋性ポリマーは、粒子形成後にポリマーマトリックスを架橋することができる１つ以上の光重合性基を含み得る。適切な光重合性基の例としては、ビニル基、アクリレート基、メタクリレート基、及びアクリルアミド基が挙げられる。光重合性基は、存在する場合、架橋性ポリマーの主鎖内、架橋性ポリマーの１つ以上の側鎖内、架橋性ポリマーの１つ以上の末端、またはそれらの組み合わせに組み込まれ得る。
【0126】
コア粒子のポリマーマトリックスは、特定の用途に有効な薬物放出速度を含む特性を有する粒子が形成されるように、様々な分子量を有するポリマーから形成され得る。
【0127】
いくつかの実施形態では、ポリマーマトリックスは、脂肪族ポリエステル、または１つ以上の脂肪族ポリエステルセグメントを含むブロックコポリマーから形成される。好ましくは、ポリエステルまたはポリエステルセグメントは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）ＰＧＡ、またはポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）である。ポリエステルセグメントの分解速度、及び多くの場合、対応する薬物放出速度は、数日（純粋なＰＧＡの場合）～数か月（純粋なＰＬＡの場合）まで変化する可能性があり、これは、ポリエステルセグメント内のＰＬＡ対ＰＧＡの比率を変動させることにより、容易に操作することができる。さらに、ＰＧＡ、ＰＬＡ、及びＰＬＧＡは、ヒトに対して安全に使用することができることが確立されており、これらの材料は、薬物送達系を含むヒトの臨床用途で３０年以上使用されている。
【0128】
好ましい天然ポリマーの例としては、タンパク質、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、及びプロラミン、例えばゼイン、ならびに多糖類、例えば、アルギン酸塩、キトサン、セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース誘導体、及びポリヒドロキシアルカノエート、例えば、ポリヒドロキシ酪酸が挙げられる。粒子のｉｎ ｖｉｖｏ安定性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共重合したポリ（ラクチド－コ－グリコリド）などのポリマーを使用することにより、製造中に調整することができる。ＰＥＧが外表面に露出している場合、ＰＥＧの親水性によりこれらの物質が循環する時間が長くなる可能性がある。
【0129】
好ましい非生分解性ポリマーの例としては、エチレン酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、コポリマー及びそれらの混合物が挙げられる。好ましい生分解性ポリマーの例としては、ポリエステルまたはポリエステルセグメント、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）ＰＧＡ、またはポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。
【0130】
２．脂質ベースのナノ粒子
リポソームは、水性区画によって分離された同心のリン脂質二重層からなる球状小胞である。リポソームは細胞表面に付着し、分子膜を形成する。脂質小胞は、１つ（単層）または複数（多層）のリン脂質二重層で区切られた１つ以上の水性コンパートメントを含む。リポソームは、様々な化学療法剤の薬物担体として広く研究されている（このテーマに関しては何千もの科学論文が発表されている）。
リポソームは、水性区画によって分離された同心のリン脂質二重層からなる球状小胞である。リポソームは細胞表面に付着し、分子膜を形成する。脂質小胞は、１つ（単層）または複数（多層）のリン脂質二重層で区切られた１つ以上の水性コンパートメントを含む。リポソームは、様々な化学療法剤の薬物担体として広く研究されている（このテーマに関しては何千もの科学論文が発表されている）。
【0131】
リポソームは、１つ以上の脂質を含有する。脂質は、生理学的ｐＨで中性、アニオン性、またはカチオン性脂質であり得る。好適な中性及びアニオン性脂質としては、ステロール及び脂質、例えば、コレステロール、リン脂質、リゾ脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質、またはペグ化脂質が挙げられるが、これらに限定されない。中性及びアニオン性脂質には、１，２－ジアシル－グリセロ－３－ホスホコリンを含むが、これに限定されるホスファチジルコリン（ＰＣ）（卵ＰＣ、ダイズＰＣなど）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、糖脂質、スフィンゴリン脂質、例えば、スフィンゴミエリン及びスフィンゴ糖脂質（１－セラミジルグルコシドとしても知られる）、例えば、セラミドガラクトピラノシド、ガングリオシド及びセレブロシド、カルボン酸基を含む脂肪酸、ステロール、例えば、コレステロール、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ジオレイルホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデシルホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２－ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及び１，２－ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を含むが、これに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。脂質には、脂質の様々な天然（例えば、組織由来Ｌ－α－ホスファチジル、卵黄、心臓、脳、肝臓、ダイズ）及び／または合成（例えば、飽和及び不飽和１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－アシル－２－アシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジヘプタノイル－ＳＮ－グリセロ－３－ホスホコリン）誘導体も含まれる。一実施形態では、リポソームは、ホスファジチルコリン（ＰＣ）頭部基、好ましくはスフィンゴミエリンを含む。好ましい実施形態では、リポソームは、ＤＰＰＣを含む。好ましい実施形態では、リポソームは、中性脂質、好ましくは１，２－ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
【0132】
リポソームは、通常、水性コアを有する。水性コアは、水、または水とアルコールの混合物を含有し得る。好適なアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール（イソプロパノールなど）、ブタノール（ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノールなど）、ペンタノール（アミルアルコール、イソブチルカルビノールなど）、ヘキサノール（１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノールなど）、ヘプタノール（１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、３－ヘプタノール、及び４－ヘプタノールなど）、またはオクタノール（１－オクタノールなど）またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0133】
３．デンドリマー様粒子
本明細書で使用する用語「デンドリマー」は、内部コア、この開始コアに規則的に結合した繰り返しユニットの内部層（または「世代」）、及び最も外側の世代に結合した末端基の外部表面を有する分子アーキテクチャを含むが、これらに限定されない。デンドリマーの例としては、ＰＡＭＡＭ、ポリエステル、ポリリジン、及びＰＰＩが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、カルボキシル、アミン、及びヒドロキシル末端を有することができ、第１世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第２世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第３世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第６世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第７世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第８世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第９世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、または第１０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーを含む、任意の世代のデンドリマーであり得る。使用に適したデンドリマーとしては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、及び／または芳香族ポリエーテルデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様の化学的性質を有していてもよく、または異なる化学的性質を有していてもよい（例えば、第１のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含み得るが、第２のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーを含み得る）。いくつかの実施形態では、第１または第２のデンドリマーは、追加の薬剤をさらに含んでいてもよい。マルチアームＰＥＧポリマーは、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を有する少なくとも２つの分枝を有するポリエチレングリコールを含むが、ただし、実施形態はこのクラスに限定されず、スクシンイミジルまたはマレイミド末端などの他の末端基を有するＰＥＧポリマーを使用することができる。分子量１０ｋＤａ～８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。
本明細書で使用する用語「デンドリマー」は、内部コア、この開始コアに規則的に結合した繰り返しユニットの内部層（または「世代」）、及び最も外側の世代に結合した末端基の外部表面を有する分子アーキテクチャを含むが、これらに限定されない。デンドリマーの例としては、ＰＡＭＡＭ、ポリエステル、ポリリジン、及びＰＰＩが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、カルボキシル、アミン、及びヒドロキシル末端を有することができ、第１世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第２世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第３世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第６世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第７世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第８世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第９世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、または第１０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーを含む、任意の世代のデンドリマーであり得る。使用に適したデンドリマーとしては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、及び／または芳香族ポリエーテルデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様の化学的性質を有していてもよく、または異なる化学的性質を有していてもよい（例えば、第１のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含み得るが、第２のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーを含み得る）。いくつかの実施形態では、第１または第２のデンドリマーは、追加の薬剤をさらに含んでいてもよい。マルチアームＰＥＧポリマーは、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を有する少なくとも２つの分枝を有するポリエチレングリコールを含むが、ただし、実施形態はこのクラスに限定されず、スクシンイミジルまたはマレイミド末端などの他の末端基を有するＰＥＧポリマーを使用することができる。分子量１０ｋＤａ～８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。
【0134】
デンドリマー複合体は、複数のデンドリマーを含む。例えば、デンドリマー複合体は、第３のデンドリマーを含むことができ、その場合、第３のデンドリマーは、少なくとも１つの他のデンドリマーと複合体を形成している。さらに、第３の薬剤が、第３のデンドリマーと複合体を形成することができる。別の実施形態では、第１及び第２のデンドリマーが、それぞれ第３のデンドリマーと複合体を形成し、第１及び第２のデンドリマーがＰＡＭＡＭデンドリマーであり、第３のデンドリマーがＰＯＰＡＭデンドリマーである。本発明の趣旨から逸脱することなく、追加のデンドリマーを組み込むことができる。複数のデンドリマーを使用する場合、複数の薬剤を組み込むこともできる。これは、互いに複合体を形成するデンドリマーの数によって制限されない。
【0135】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＡＭＡＭデンドリマー」とは、アミドアミンビルディングブロックを有する、異なるコアを含み得るポリ（アミドアミン）デンドリマーを意味する。それらの製造方法は当業者に公知であり、一般に、中央の開始コアの周りに樹状β－アラニンユニットの同心円状のシェル（世代）を生成する２段階反復反応シーケンスを含む。このＰＡＭＡＭコアシェルアーキテクチャは、付加されたシェル（世代）に応じて直径が線形に成長する。一方、表面基は、樹状分枝の計算に従って、各世代において指数関数的に増幅する。これらは、世代Ｇ０～１０において、５つの異なるコア型及び１０個の表面官能基で利用可能である。デンドリマー分枝ポリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリグリセロール、ポリエステル、ポリエーテル、ポリリシン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチドデンドリマーからなり得る。デンドリマーは、胆汁酸塩を含む複数の用途に応用されている理想的な両親媒性界面活性剤でもある。デンドリマーと胆汁酸塩の凝集体も一種の混合ミセルであり、親水性の頭部と疎水性の尾部を備えた従来の界面活性剤とは異なる特性を有する。いくつかの実施形態では、デンドリマーは、ＷＯ２００９／０４６４４６に記載されているように、ナノ粒子の形態である。
【0136】
４．粒子の作製方法
ナノ粒子を調製するための一般的な技術としては、溶媒蒸発、溶媒除去、自己組織化、噴霧乾燥、転相、コアセルベーション、及び低温キャスティングが挙げられるが、これらに限定されない。粒子配合の好適な方法を以下に簡潔に述べる。ｐＨ調整剤、崩壊剤、保存剤、及び抗酸化剤を含む薬学的に許容される賦形剤を、粒子形成中に、任意選択で粒子に組み込むことができる。
ナノ粒子を調製するための一般的な技術としては、溶媒蒸発、溶媒除去、自己組織化、噴霧乾燥、転相、コアセルベーション、及び低温キャスティングが挙げられるが、これらに限定されない。粒子配合の好適な方法を以下に簡潔に述べる。ｐＨ調整剤、崩壊剤、保存剤、及び抗酸化剤を含む薬学的に許容される賦形剤を、粒子形成中に、任意選択で粒子に組み込むことができる。
【0137】
Ａ．溶媒蒸発
本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒に溶解する。次いで、薬物を含有する有機溶液を、ポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水溶液に懸濁する。得られるエマルジョンを、有機溶媒の大部分が蒸発して固体ナノ粒子が残るまで撹拌する。得られるナノ粒子を水で洗浄し、凍結乾燥機で一晩乾燥させる。この方法により、異なる径及び形態のナノ粒子が得られる。
本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒に溶解する。次いで、薬物を含有する有機溶液を、ポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水溶液に懸濁する。得られるエマルジョンを、有機溶媒の大部分が蒸発して固体ナノ粒子が残るまで撹拌する。得られるナノ粒子を水で洗浄し、凍結乾燥機で一晩乾燥させる。この方法により、異なる径及び形態のナノ粒子が得られる。
【0138】
特定のポリ無水物などの不安定なポリマーを含む薬剤は、水が存在することにより、製造プロセス中に分解する可能性がある。これらのポリマーの場合、完全に無水の有機溶媒中で実施する以下の２つの方法を使用することができる。
【0139】
Ｂ．溶媒除去
溶媒除去を使用して、加水分解的に不安定な薬物から粒子を調製することもできる。本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒に分散または溶解する。次いで、この混合物を有機油（シリコン油など）中で撹拌することによって懸濁して、エマルジョンを形成する。エマルジョンから固体粒子が形成され、その後、これを上清から単離することができる。この技術で生成される球体の外部形態は、薬物の性質に大きく依存する。
溶媒除去を使用して、加水分解的に不安定な薬物から粒子を調製することもできる。本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒に分散または溶解する。次いで、この混合物を有機油（シリコン油など）中で撹拌することによって懸濁して、エマルジョンを形成する。エマルジョンから固体粒子が形成され、その後、これを上清から単離することができる。この技術で生成される球体の外部形態は、薬物の性質に大きく依存する。
【0140】
Ｃ．噴霧乾燥
本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を塩化メチレンなどの有機溶媒に溶解する。溶液を、圧縮ガス流によって駆動される微粉化ノズルを通してポンプ輸送し、得られるエアロゾルを、空気の加熱サイクロン内で懸濁し、微小液滴から溶媒を蒸発させて粒子を形成させる。本方法を使用して、０．１～１０ミクロンの範囲の粒子を取得することができる。
本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を塩化メチレンなどの有機溶媒に溶解する。溶液を、圧縮ガス流によって駆動される微粉化ノズルを通してポンプ輸送し、得られるエアロゾルを、空気の加熱サイクロン内で懸濁し、微小液滴から溶媒を蒸発させて粒子を形成させる。本方法を使用して、０．１～１０ミクロンの範囲の粒子を取得することができる。
【0141】
Ｄ．転相
転相を使用して薬物から粒子を形成することができる。本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を「良好な」溶媒に溶解し、その溶液を強力な非溶媒に注ぎ、好ましい条件下で薬物が自発的にマイクロ粒子またはナノ粒子を生成するようにする。本方法は、例えば、約１００ナノメートル～約１０ミクロンを含む広範囲の径の（一般的に狭い粒度分布を有する）ナノ粒子を生成するために使用することができる。
転相を使用して薬物から粒子を形成することができる。本方法では、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）を「良好な」溶媒に溶解し、その溶液を強力な非溶媒に注ぎ、好ましい条件下で薬物が自発的にマイクロ粒子またはナノ粒子を生成するようにする。本方法は、例えば、約１００ナノメートル～約１０ミクロンを含む広範囲の径の（一般的に狭い粒度分布を有する）ナノ粒子を生成するために使用することができる。
【0142】
Ｅ．コアセルベーション
コアセルベーションを使用した粒子形成技術は、当技術分野で、例えば、ＧＢ－Ｂ－９２９ ４０６、ＧＢ－Ｂ－９２９ ４０ １、ならびに米国特許第３，２６６，９８７号、同第４，７９４，０００号、及び同第４，４６０，５６３号において公知である。コアセルベーションは、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）溶液を２つの非混和性液相に分離することを含む。１つの相は、高濃度の薬物を含む高密度コアセルベート相であり、第２の相は、低濃度の薬物を含む。高密度コアセルベート相内で、薬物はナノスケールまたはマイクロスケールの液滴を形成し、それが硬化して粒子になる。コアセルベーションは、温度変化、非溶媒の添加、微量塩の添加（単純コアセルベーション）、または別のポリマーの添加によるポリマー間複合体の形成（複合コアセルベーション）によって誘発され得る。
コアセルベーションを使用した粒子形成技術は、当技術分野で、例えば、ＧＢ－Ｂ－９２９ ４０６、ＧＢ－Ｂ－９２９ ４０ １、ならびに米国特許第３，２６６，９８７号、同第４，７９４，０００号、及び同第４，４６０，５６３号において公知である。コアセルベーションは、薬物（またはポリマーマトリックス及び１つ以上の薬物）溶液を２つの非混和性液相に分離することを含む。１つの相は、高濃度の薬物を含む高密度コアセルベート相であり、第２の相は、低濃度の薬物を含む。高密度コアセルベート相内で、薬物はナノスケールまたはマイクロスケールの液滴を形成し、それが硬化して粒子になる。コアセルベーションは、温度変化、非溶媒の添加、微量塩の添加（単純コアセルベーション）、または別のポリマーの添加によるポリマー間複合体の形成（複合コアセルベーション）によって誘発され得る。
【0143】
Ｆ．自己組織化
自己組織化のためのナノ粒子を形成するために、数多くの方法及び材料が使用されている。例えば、Ｇｕ，ｅｔ ａｌ．，では、自己組織化によるＰＬＧＡ－ＰＥＧ／ＰＬＧＡ混合ナノ粒子の形成について記載している。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｆｅｂ １９；１０５（７）：２５８６－２５９１を参照のこと。ＮＰは、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び活性薬剤の末端間結合からなる両親媒性トリブロックコポリマーの自己組織化によって、製剤化された。
自己組織化のためのナノ粒子を形成するために、数多くの方法及び材料が使用されている。例えば、Ｇｕ，ｅｔ ａｌ．，では、自己組織化によるＰＬＧＡ－ＰＥＧ／ＰＬＧＡ混合ナノ粒子の形成について記載している。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｆｅｂ １９；１０５（７）：２５８６－２５９１を参照のこと。ＮＰは、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び活性薬剤の末端間結合からなる両親媒性トリブロックコポリマーの自己組織化によって、製剤化された。
【0144】
ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマーを使用して粒子を調製することができる。様々な種類のブロックコポリマーを合成することができるが、最も一般的に合成されるブロックコポリマーは、ＡＢ、ＢＡＢ、またはＡＢＡブロック構造を有し、ＡとＢは、それぞれＰＥＧブロックとＰＬＧＡブロックを表す。これらのコポリマーを製造するための合成方法は十分に確立されており、多くのブロックコポリマーがＡｋｉｎａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｋｉｎａｉｎｃ．ｃｏｍ）及びＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）などの企業から市販されている。低分子量及び／または高ＰＥＧ／ＰＬＧＡ比を有するブロックコポリマーは水溶性であるが、高分子量及び／または低ＰＥＧ／ＰＬＧＡ比を有するブロックコポリマーは水に不溶性である。ブロックコポリマーは、裸のＰＬＧＡよりも親水性が高く、タンパク質などの親水性高分子の送達により適していると考えられている。
【0145】
ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマーは、それらの両親媒性の性質により、水性媒体中に分散すると、それらは自己組織化してミセル形態になる。ＰＥＧは親水性コロナとして機能し、一方、ＰＬＧＡは疎水性コアとして機能する。ポリマーミセルには、パクリタキセルなどの水性疎水性薬物を組み込むことができる。ポリマーミセルは、薬物の血中滞留時間を延長し、全身毒性を軽減し、薬物を作用部位に導くことができる。
【0146】
ナノ沈殿は、ナノ粒子を調製するための別の方法である。ポリ（エチレングリコール）－ポリ（ラクチド－コ－グリコール酸）（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）両親媒性コポリマーがナノ粒子へ自己組織化する特性、及びその多用途な構造により、ナノ沈殿はその調製に最適な方法の１つとなっている。
【0147】
ＩＶ．標的化薬
本開示のナノ粒子は、少なくとも１つの標的化薬と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＣＤ２を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＣＤ３を対象とする。いくつかの実施形態では、複数の標的化薬を使用してもよい。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＣＤ２及びＣＤ３を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、Ｔ細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＮＫ細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＮＫＴ細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を対象とする標的化薬は、Ｔ細胞の表面上の受容体を標的とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞を対象とする標的化薬は、ＮＫ細胞の表面上の受容体を標的とする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、及び不活化されたかまたは欠失したＦｃフラグメントを有する抗ＣＤ３抗体からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーである。抗ＣＤ２及び抗ＣＤ３は、ＮＫＴ細胞も標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３を標的とすることにより、ＮＫＴ細胞が調節性Ｔ細胞になるように誘導される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３を標的とすることにより、ＮＫＴ細胞がＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導される。
本開示のナノ粒子は、少なくとも１つの標的化薬と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＣＤ２を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＣＤ３を対象とする。いくつかの実施形態では、複数の標的化薬を使用してもよい。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＣＤ２及びＣＤ３を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、Ｔ細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＮＫ細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＮＫＴ細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を対象とする標的化薬は、Ｔ細胞の表面上の受容体を標的とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞を対象とする標的化薬は、ＮＫ細胞の表面上の受容体を標的とする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的化薬は、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、及び不活化されたかまたは欠失したＦｃフラグメントを有する抗ＣＤ３抗体からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーである。抗ＣＤ２及び抗ＣＤ３は、ＮＫＴ細胞も標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３を標的とすることにより、ＮＫＴ細胞が調節性Ｔ細胞になるように誘導される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３を標的とすることにより、ＮＫＴ細胞がＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導される。
【0148】
ナノ粒子は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上で発現するＣＤ２を標的とするか、またはＴ細胞上で発現するＣＤ３を標的とする。ＣＤ２とＣＤ３は両方とも、リンパ球の活性化を誘導し、分化に影響を与え得るシグナル伝達受容体である。Ｔｒｅｇは、誘導のために刺激を必要とし、機能と生存のためには継続的な刺激を必要とする。標的化部分は、核酸（例えば、アプタマー）、ポリペプチド（例えば、抗体）、糖タンパク質、小分子、炭水化物、脂質などであってもよい。例えば、標的化部分は、一般にポリペプチドなどの特定の標的に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその類似体もしくは誘導体）であるアプタマーであってもよい。一般に、アプタマーの標的化機能は、アプタマーの三次元構造に基づいている。いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗体または抗体断片などのポリペプチドである。
【0149】
好ましい一実施形態では、粒子は、ＣＤ２を発現するナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞を標的とする。別の好ましい実施形態では、粒子は、ＣＤ３を発現するＴ細胞を標的とする。通常、標的化分子は、Ｔ細胞などの生物学的に機能的な細胞クラスに特異的な表面マーカーを利用する。例えば、Ｔ細胞は、多くの細胞表面マーカー、例えばＣＤ２（膜貫通分子であり、Ｔ細胞の活性化、ＴまたはＮＫを介した細胞溶解、活性化した末梢Ｔ細胞のアポトーシス、及びＴ細胞によるサイトカイン産生において重要な役割を果たす免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーメンバーである）を発現する。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体のシグナル伝達成分であり、抗原提示細胞が発現するペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する。分子を標的とすることにより、標的細胞または組織内にナノ粒子または他の送達ビヒクルが内部移行する可能性がある。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子または他の送達ビヒクルは、エンドサイトーシスを媒介することができる細胞表面受容体を標的とすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、レクチン媒介エンドサイトーシスを介して標的化され得る。
【0150】
いくつかの実施形態では、標的化薬は、標的に特異的に結合できることに加えて、刺激剤としても作用する。例えば、ＣＤ２またはＣＤ３を標的とすることにより、ＴＦＧ－βの産生を刺激することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３を標的とすることにより、細胞表面上でＣＤ３を発現する細胞の増殖及び／または分化が刺激され得る。
【0151】
Ａ．抗体
いくつかの実施形態では、ナノ粒子を、１つ以上の抗体が含まれるように修飾する。細胞表面の１つ以上のエピトープ、他のリガンド、またはアクセサリー分子に直接結合することによって機能する抗体を、ナノ粒子に直接または間接的に結合させることができる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｔ細胞の表面上に発現する受容体などの特定の細胞型の表面の受容体に対する親和性を有する。抗体は、抗体結合ナノ粒子の細胞取り込み、もしくは抗体結合ナノ粒子の細胞内移行、またはその両方を可能にし、増強し、あるいは媒介する細胞表面の１つ以上の標的受容体に結合し得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子を、１つ以上の抗体が含まれるように修飾する。細胞表面の１つ以上のエピトープ、他のリガンド、またはアクセサリー分子に直接結合することによって機能する抗体を、ナノ粒子に直接または間接的に結合させることができる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｔ細胞の表面上に発現する受容体などの特定の細胞型の表面の受容体に対する親和性を有する。抗体は、抗体結合ナノ粒子の細胞取り込み、もしくは抗体結合ナノ粒子の細胞内移行、またはその両方を可能にし、増強し、あるいは媒介する細胞表面の１つ以上の標的受容体に結合し得る。
【0152】
任意の特異的抗体を使用してナノ粒子を修飾することができる。例えば、抗体には、標的細胞上のエピトープに結合する抗原結合部位が含まれ得る。「標的」細胞への抗体の結合により、１つ以上の異なる機構を介して、標的細胞タンパク質による会合したナノ粒子の取り込みが増強または誘導され得る。
【0153】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、エピトープに特異的に結合する。エピトープは線状エピトープであり得る。エピトープは、１つの細胞型に特異的であることも、複数の異なる細胞型で発現することもできる。抗体またはその抗原結合断片は、標的細胞の表面の３次元表面特徴、形状、または三次構造を含む立体構造エピトープに結合することができる。
【0154】
任意のクラスの全免疫グロブリン、その断片、及び少なくとも抗体の抗原結合可変ドメインを含む合成タンパク質を含む、様々なタイプの抗体及び抗体断片を使用して、ナノ粒子を標的とすることができる。抗体は、ＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプなどであり得る。抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディなどを含む、抗原結合断片の形態であり得る。
【0155】
抗体は、天然の抗体、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどから単離及び／または精製された抗体であり得る。あるいは、抗体は、遺伝子改変された抗体、例えば、ヒト化抗体であり得る。抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナル（ｍＡｂ）であり得る。モノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片（標的抗原に特異的に結合し、及び／または所望の生物学的活性を示す限り）の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。組換え手段、例えばアミノ酸の欠失、付加、及び／または置換によって抗体を改変して、所望の機能を媒介する抗体の有効性を高めることもできる。置換は保存的置換であり得る。例えば、抗体の定常領域内の少なくとも１つのアミノ酸を、異なる残基で置換することができる（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９５８５７２、及びＡｎｇａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５－０８（１９９３）を参照のこと）。いくつかの場合では、補体依存性細胞傷害性などの望ましくない活性を軽減するために変更が加えられる。抗体は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対する結合特異性を有する二重特異性抗体であり得る。いくつかの実施形態では、エピトープは同じ抗原に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープは、２つの異なる抗原に由来する。二重特異性抗体には、二重特異性抗体断片が含まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：６４４４－４８（１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと）。
【0156】
好ましい実施形態では、標的化薬は、ＣＤ３及び／またはＣＤ２発現細胞を認識及び／または結合する抗体またはその抗原結合断片である。ＣＤ２及びＣＤ３抗体は、当技術分野で公知である（例えば、Ａｂｃａｍカタログ番号１Ｅ７８．Ｇ４（抗ＣＤ２）ａｂ５６９０（抗ＣＤ３）及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ１８５６１（抗ＣＤ２）、ＭＡＢ１００（抗ＣＤ３）。いくつかの実施形態では、標的化薬は、ＣＤ３またはＣＤ２の細胞外部分を標的とする。ＣＤ３及びＣＤ２のドメイン、ならびにこれらのドメインに対応する核酸またはタンパク質配列は、当技術分野で公知である。ヒトＣＤ３及びＣＤ２の核酸配列及びタンパク質配列は、当技術分野で公知である。例えば、表１に示す配列を参照されたい（これらは参照により本明細書に援用される）。
【表1】
【0157】
ナノ粒子を特定のエピトープ（例えば、標的抗原の特定のドメイン）に標的化する抗体は、当技術分野で公知の任意の手段によって生成することができる。抗体の生成及び産生のための例示的な説明には、Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，最新版）が挙げられる。インタクトなＩｇ分子の断片は、酵素消化及び組換え手段を含む当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。
【0158】
Ｂ．アプタマー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子または他の送達ビヒクルを、１つ以上の種類の細胞、組織、臓器、または微小環境への優先的な標的化に寄与し得るアプタマーと複合体化させるか、またはアプタマーを組み込む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ナノ粒子または他の送達ビヒクルの、細胞内への内在化を増強することができる（例えば、アプタマーが細胞表面マーカーに結合する場合）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子または他の送達ビヒクルを、１つ以上の種類の細胞、組織、臓器、または微小環境への優先的な標的化に寄与し得るアプタマーと複合体化させるか、またはアプタマーを組み込む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ナノ粒子または他の送達ビヒクルの、細胞内への内在化を増強することができる（例えば、アプタマーが細胞表面マーカーに結合する場合）。
【0159】
アプタマーは、膜貫通タンパク質、糖及び核酸を含む様々な生体分子を高い親和性及び特異性で認識する、明確に定義された３次元構造に折り畳まれる短い一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド（６～２６ｋＤａ）である（Ｙｕ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．，２７（７）：２８６－９８（２０１０））。ナイーブアプタマープール（標的に対してまだ選択されていない）の高い配列と立体構造の多様性により、標的に結合するアプタマーが発見される可能性が高くなる。アプタマーは、好ましくは、特異的な方式で標的分子と相互作用する。通常、アプタマーは、長さが１５～５０塩基の範囲の小さな核酸であり、ステムループやＧカルテットなどの定義された二次及び三次構造に折り畳まれる。アプタマーは、ＡＴＰやテオフィリンなどの小分子だけでなく、逆転写酵素やトロンビンなどの大きな分子にも結合することができる。アプタマーは、１０－１２Ｍ未満のＫｄで標的分子に非常に強固に結合することができる。アプタマーは、１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満のＫｄで標的分子に結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高い特異性で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子と、分子上の単一位置のみが異なる別の分子との間で、結合親和性において１０，０００倍を超える差を有するアプタマーが単離されている。アプタマーは、バックグラウンド結合分子でのＫｄに比べて、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍低い、標的分子でのＫｄを有することが好ましい。ポリペプチドなどの分子の比較を行う場合、バックグラウンド分子は、異なるポリペプチドであることが好ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の代わりに、ＴＣＲ－ＣＤ３に結合するアプタマーを使用する。本開示で使用してもよいアプタマーの例は、Ｚｕｍｒｕｔ ＨＥ，ｅｔ ａｌ Ａｎｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５１２：１－７，２０１６，ＤＯＩ １０．１０１６／ｊに記載されており、参照により本明細書に援用される。
【0160】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、限定されないが、ＣＤ２またはＣＤ３などの細胞表面タンパク質または膜貫通タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアプタマーは、限定されないが、ＣＤ２またはＣＤ３などの細胞表面タンパク質及び／または膜貫通タンパク質に特異的に結合する。
【0161】
好ましい標的化薬は、同じ結合特異性を有する抗体、ヒト化抗体、またはそれらの抗体断片である。これらは、粒子の表面、または粒子を形成するポリマーに結合しているため、標的化薬は、粒子の表面に出現する。
【0162】
好適な架橋剤を、以下の表１及び２に開示する。他の好適な架橋剤としては、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンが挙げられる。
【0163】
連続マトリックス中の添加剤の任意の好適な化学修飾を使用して、粒子を官能化してもよい。一例は、銅を含まないクリックケミストリーであり、これを用いて、粒子の表面を官能化して、リンカー、ペプチド、抗体、及び蛍光レポーター分子または放射性標識レポーター分子などの任意の目的のリガンドまたは部分と結合させることができる。
【0164】
好ましい実施形態では、係留部分を含む粒子及び／または係留された粒子は、係留部分をコア粒子に、係留された粒子をコア粒子に、係留部分を係留された粒子に、または係留部分及び係留された粒子をコア粒子に連結するための結合部分を表面上に有し得る。結合部分は、タンパク質、ペプチド、または小分子もしくは短いポリマーであってもよい。結合部分は架橋剤であってもよい。架橋剤は、化学反応性、スペーサー長、及び材質によって分類される。
【表2】
【表3】
【0165】
Ｖ．刺激剤
ポリマーナノ粒子は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞の増殖及び／または機能を誘導または増加させることができる１つ以上の刺激剤を含む。ナノ粒子はまた、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、防御性ＮＫ細胞の集団を誘導または増加させ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の刺激剤を、送達するために、ナノ粒子内に充填するか、封入するか、またはナノ粒子の表面に直接的または間接的に（例えば、共有結合または非共有結合で）結合させる。好ましい実施形態では、刺激剤は、免疫調節薬、成長因子またはサイトカインである。いくつかの実施形態では、刺激剤はＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、刺激剤はＴＧＦ－βである。いくつかの実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βである。ＩＬ－２及びＴＧＦ－βは、ＣＤ４及び他のＴ細胞がＴｒｅｇになるように誘導するのに必要である（Ｃｈｅｎ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：１８７５－８６，２００３）。いくつかの実施形態では、刺激剤は治療剤である。いくつかの実施形態では、刺激剤は予防剤である。いくつかの実施形態では、刺激剤を、他の活性薬剤として本明細書のＣ節の下に記載する。
ポリマーナノ粒子は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞の増殖及び／または機能を誘導または増加させることができる１つ以上の刺激剤を含む。ナノ粒子はまた、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、防御性ＮＫ細胞の集団を誘導または増加させ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の刺激剤を、送達するために、ナノ粒子内に充填するか、封入するか、またはナノ粒子の表面に直接的または間接的に（例えば、共有結合または非共有結合で）結合させる。好ましい実施形態では、刺激剤は、免疫調節薬、成長因子またはサイトカインである。いくつかの実施形態では、刺激剤はＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、刺激剤はＴＧＦ－βである。いくつかの実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βである。ＩＬ－２及びＴＧＦ－βは、ＣＤ４及び他のＴ細胞がＴｒｅｇになるように誘導するのに必要である（Ｃｈｅｎ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：１８７５－８６，２００３）。いくつかの実施形態では、刺激剤は治療剤である。いくつかの実施形態では、刺激剤は予防剤である。いくつかの実施形態では、刺激剤を、他の活性薬剤として本明細書のＣ節の下に記載する。
【0166】
好ましい実施形態では、ナノ粒子は、ＩＬ－２と組み合わせてＴＧＦ－βを含有する。最も好ましい実施形態では、ＩＬ－２のみがナノ粒子に充填されるか、またはナノ粒子によって封入される。最も好ましい実施形態では、ＩＬ－２は、Ｔｒｅｇを刺激するが、非Ｔｒｅｇは刺激しないように修飾されている（Ｓｐａｎｇｌｅｒ ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１：２０９４－２１０６、２０１８）。ＣＤ２及び／またはＣＤ３リガンドを標的とするナノ粒子は、Ｔｒｅｇの誘導に必要なＴＧＦ－βを誘導する。
【0167】
図７～１２に示す実験は、ａＡＰＣがヒトＴｒｅｇを誘導することを示す。これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでａＡＰＣ ＮＰを使用して、ヒトＴ細胞が抑制性のＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇになるようにも誘導され得ることを示している。
【0168】
Ａ．ＴＧＦ－β
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーは、増殖、分化、遊走、及び生存を含む多面的な細胞機能を調節する多面発現性サイトカインのファミリーである。ＴＧＦ－βスーパーファミリーは、モデルトランスフォーミング成長因子βファミリー及び他のファミリー、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、アクチビン（ＡＣＴ）、インヒビン（ＩＮＨ）、及びグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む、大規模かつ継続的に拡張されている調節性ポリペプチドの群である（Ｗａｎ Ｙ．ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２２０：１９９－２１３（２００７））。
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーは、増殖、分化、遊走、及び生存を含む多面的な細胞機能を調節する多面発現性サイトカインのファミリーである。ＴＧＦ－βスーパーファミリーは、モデルトランスフォーミング成長因子βファミリー及び他のファミリー、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、アクチビン（ＡＣＴ）、インヒビン（ＩＮＨ）、及びグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む、大規模かつ継続的に拡張されている調節性ポリペプチドの群である（Ｗａｎ Ｙ．ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２２０：１９９－２１３（２００７））。
【0169】
モデルＴＧＦ－βファミリーには、３つのアイソフォーム、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３が含まれる。これらのアイソフォームは、同様の機能を共有する一方で、空間的及び時間的に依存して、示差的に発現する。免疫系では、ＴＧＦ－β１が主に発現するアイソフォームである。ＴＧＦ－βは、不活性型であるプレプロＴＧＦ－β前駆体として合成される。活性型ＴＧＦ－βを遊離させ、細胞表面結合型または可溶型のいずれかにおいてその機能を発揮できるようにするには、追加の刺激が必要である（Ｗａｎ Ｙ．ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ Ｒ；２００７））。
【0170】
形質転換された腫瘍細胞の増殖因子として同定されたＴＧＦ－βは、実際、上皮細胞や線維芽細胞などの非形質転換細胞の増殖を阻害する。ＴＧＦ－βは、Ｔ細胞などの適応免疫成分と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの自然免疫成分を制御する。ＴＧＦ－βは、Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）系統の分化を濃度依存的な様式で促進することができる。ＴＧＦ－βは、炎症細胞の機能の阻害とＴｒｅｇ細胞の機能の促進という２つの手段を通じて免疫応答を抑制する（Ｗａｎ Ｙ．ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ Ｒ；２００７））。後者に関しては、ＴＧＦ－βは、Ｆｏｘｐ３の発現を誘導することにより、Ｔｒｅｇ細胞の生成を促進し、免疫応答を阻害する。初期の研究で、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞が抑制活性を獲得するにはＴＧＦ－βが必要かつ十分であることが示された。
【0171】
ＴＧＦ－β１のタンパク質配列、ｍＲＮＡ配列、及び遺伝子配列は、当技術分野で公知である。
【0172】
例えば、ヒトＴＧＦ－β１のタンパク質配列は以下の通りである：
ＭＰＰＳＧＬＲＬＬＬＬＬＬＰＬＬＷＬＬＶＬＴＰＧＲＰＡＡＧＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡ
ＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＥＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＥＴＨＮＥＩ
ＹＤＫＦＫＱＳＴＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＥＬＲＥＡＶＰＥＰＶＬＬＳＲＡＥＬＲＬＬＲＬＫＬＫＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲ
ＹＬＳＮＲＬＬＡＰＳＤＳＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＳＲＧＧＥＩＥＧＦＲＬＳＡＨＣＳＣＤＳＲＤＮＴＬＱＶＤＩＮＧＦＴ
ＴＧＲＲＧＤＬＡＴＩＨＧＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＱＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩ
ＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱ
ＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ（配列番号１、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０１１３７）。
ＭＰＰＳＧＬＲＬＬＬＬＬＬＰＬＬＷＬＬＶＬＴＰＧＲＰＡＡＧＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡ
ＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＥＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＥＴＨＮＥＩ
ＹＤＫＦＫＱＳＴＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＥＬＲＥＡＶＰＥＰＶＬＬＳＲＡＥＬＲＬＬＲＬＫＬＫＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲ
ＹＬＳＮＲＬＬＡＰＳＤＳＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＳＲＧＧＥＩＥＧＦＲＬＳＡＨＣＳＣＤＳＲＤＮＴＬＱＶＤＩＮＧＦＴ
ＴＧＲＲＧＤＬＡＴＩＨＧＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＱＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩ
ＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱ
ＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ（配列番号１、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０１１３７）。
【0173】
ヒトＴＧＦ－β１の例示的なｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡとして示される）は以下のとおりである：
ＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＧＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＴＣＡＣＴＡＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡ（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０００１２５．１；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＴＧＦＢ１ ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ）
ＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＧＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＴＣＡＣＴＡＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡ（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０００１２５．１；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＴＧＦＢ１ ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ）
【0174】
ＴＧＦ－β１の遺伝子配列は、ヒト染色体１９ｑ１３．２、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１３３６４．１上のＤＮＡ配列の一部として存在する。ＴＧＦ－β１と同様に、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３のタンパク質配列、ｍＲＮＡ配列、及び遺伝子配列は、当技術分野で公知である。ＴＧＦ－β１の上記の配列及びそのバリアント（例えば、天然のバリアント）、類似体、または誘導体、ならびにＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３のバリアント（例えば、天然のバリアント）、類似体、または誘導体のいずれも、組成物、製剤、及び方法に従ってＴＧＦ－β分子を提供する際に使用することができる。さらに、組換えヒトＴＧＦ－βタンパク質は、複数のベンダーから市販されている。例えば、組換えヒトＴＧＦ－β１は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号１００－２１）及びＡｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ５００３６）から入手可能である。
【0175】
Ｂ．ＩＬ－２
好ましい実施形態では、ナノ粒子は、ＴＧＦ－βと組み合わせてＩＬ－２を含有する。インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、免疫刺激機能と免疫調節機能の両方を備えているため、免疫応答の制御と末梢自己寛容の維持において重要な役割を果たす。ＩＬ－２シグナルは、分化、免疫応答、及び恒常性維持の間に様々なリンパ球サブセットに影響を与える。ＩＬ－２は、主にＴ細胞増殖因子として作用し、Ｔ細胞の増殖と生存、ならびにエフェクターＴ細胞とメモリーＴ細胞の生成に不可欠である。例えば、ＩＬ－２による刺激は、調節性Ｔ（ＴＲｅｇ）細胞の維持と、抗原媒介活性化後のＣＤ４＋Ｔ細胞から規定のエフェクターＴ細胞サブセットへの分化に重要である。
好ましい実施形態では、ナノ粒子は、ＴＧＦ－βと組み合わせてＩＬ－２を含有する。インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、免疫刺激機能と免疫調節機能の両方を備えているため、免疫応答の制御と末梢自己寛容の維持において重要な役割を果たす。ＩＬ－２シグナルは、分化、免疫応答、及び恒常性維持の間に様々なリンパ球サブセットに影響を与える。ＩＬ－２は、主にＴ細胞増殖因子として作用し、Ｔ細胞の増殖と生存、ならびにエフェクターＴ細胞とメモリーＴ細胞の生成に不可欠である。例えば、ＩＬ－２による刺激は、調節性Ｔ（ＴＲｅｇ）細胞の維持と、抗原媒介活性化後のＣＤ４＋Ｔ細胞から規定のエフェクターＴ細胞サブセットへの分化に重要である。
【0176】
ＩＬ－２は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１を含む、構造的に関連するサイトカインファミリーに属する、１５～１６ＫＤａの４つのαヘリックスバンドルのサイトカインである。ＩＬ－２サイトカインは、複数の免疫学的効果を示し、様々な形態のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、特に単量体、二量体、及び三量体に結合することによって作用する。ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、及びＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２）サブユニットの会合により、三量体の高親和性ＩＬ－２Ｒαβγが生じる。ＣＤ２５は、ＩＬ－２への高い親和性結合を与え、一方、βサブユニットとγサブユニット（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、及び休止期ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞で発現する）は、シグナル伝達を媒介する。ＣＤ２５の発現は、免疫抑制性の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖に必須であると思われる一方で、細胞溶解性のＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞は、ＣＤ２５の非存在下でＩＬ－２に応答して、ＩＬ－２Ｒβγ結合によって、増殖し、標的細胞を殺傷することができる（Ｍｏｒｔａｒａ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：２９０５（２０１８））。ＩＬ－２と単量体ＩＬ－２Ｒ（ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５））の相互作用はシグナルを誘導しないが、二量体（ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）及びＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２））ならびに三量体（ＩＬ－２Ｒαβγ）のＩＬ－２Ｒはいずれも、ＩＬ－２に結合すると下流のシグナル伝達を引き起こす（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６（１２）：７６３－７７７（２０１５））。調節性Ｔ細胞は、ＩＬ－２Ｒαβγ複合体を介してＩＬ－２に効率的に応答することができる（Ｍｏｒｔａｒａ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
【0177】
ＩＬ－２Ｒが誘発されると、ＩＬ－２媒介シグナル伝達が、以下を含む３つの主要な経路を介して起こる：（ｉ）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）－シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）、（ｉｉ）ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－ＡＫＴ、及び（ｉｉｉ）マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0178】
ＩＬ－２は、低用量（例えば、ヒトでは１日１回、１．５×１０６～３×１０６ＩＵ）でもＴｒｅｇを刺激することができる。低用量のＩＬ－２は、自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、及びクリオグロブリン血症性血管炎、ならびに移植片拒絶反応及び慢性移植片対宿主病の治療に適していると提案されており、これは、これらの病態が、多くの場合、ＩＬ－２シグナル伝達の低下、及びエフェクターＴ細胞に対するＴｒｅｇの相対的な欠損を特徴とすることが報告されているためである（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。逆に、高用量のＩＬ－２は、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞を含む抗腫瘍細胞傷害性リンパ球を刺激することから、高用量のＩＬ－２（例えば、ヒトにおいて、６×１０５～７．２×１０５ＩＵ／ｋｇ体重、１日３回、１サイクルあたり最大１４回投与）が、転移がんに対する免疫療法に使用されている（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＩＬ－２がエフェクターＴ細胞を刺激する可能性を回避するために、ＩＬ－２は、Ｔｒｅｇのみを刺激するように改変されている（Ｓｐａｎｇｌｅｒ ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１：２０９４－２１０６，２０１８）。
【0179】
ＩＬ－２のタンパク質配列、ｍＲＮＡ配列、及び遺伝子配列は、当技術分野で公知である。
【0180】
例えば、ヒトＩＬ－２のタンパク質配列は、以下のとおりである：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬ
ＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥ
ＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ６０５６８）。
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬ
ＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥ
ＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ６０５６８）。
【0181】
ヒトＩＬ－２の例示的なｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡとして示される）は以下のとおりである：
ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡ（配列番号４；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｓ７７８３４．１；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＬ－２ ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ）
ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡ（配列番号４；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｓ７７８３４．１；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＩＬ－２ ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ）
【0182】
ＩＬ－２の遺伝子配列は、ヒト染色体４ｑ２７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１６７７９．１）上のＤＮＡ配列の一部として存在し得る。
【0183】
上記の配列及びそのバリアント（例えば、天然のバリアント）、類似体、または誘導体のいずれも、組成物、製剤、及び方法に従って、ＩＬ－２分子を提供する際に使用することができる。さらに、組換えヒトＩＬ－２タンパク質は複数の販売業者から市販されており、組成物、製剤及び方法に従って使用することができる。例えば、組換えヒトＩＬ－２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号２００－０２）から、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン）として入手可能である。
【0184】
Ｃ．他の活性薬剤
自己抗原ペプチド：抗原特異的調節性細胞を誘導するａＡＰＣの特異性を高めるために、ＳＬＥ、１型糖尿病、多発性硬化症、及び他の自己免疫疾患の発症に関与する病原性ペプチドが同定されている。これらを、ＮＰに結合させるか、または封入することができる。タンパク質抗原またはペプチド抗原、及び持続性の抗原特異的免疫寛容を誘導する寛容原性免疫調節薬であるラパマイシンを担持する合成生分解性ナノ粒子は、多発性硬化症のマウスモデルを治療するために使用されている（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ ＲＡ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１２：１５６－６５，２０１５）。ＳＬＥでは、これらのペプチドは、アポトーシス細胞由来のヌクレオソーム内の５つの重要な自己エピトープを含み、これらは、ヒストン（Ｈ）領域のＨ１２２－４２、Ｈ３８２－１０５、Ｈ３１１５－１３５、Ｈ４１６－３９、及びＨ４７１－９４に存在する。これらのペプチドは、ＳＬＥを有する患者及び様々なマウス系統の自己免疫Ｔ細胞及びＢ細胞によって認識され、すべての主要なＭＨＣ分子がこれらのエピトープに無差別に結合する（Ｄａｔｔａ ＳＫ Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９８７：７９－９０，２００３）。ＳＬＥ Ｔ細胞によって認識されるもう１つのペプチドは、複数のＢＷＦ１ ＩｇＧ抗体のＶＨ領域由来のＴ細胞刺激アミノ酸配列をＤＮＡへ定義するアルゴリズムに基づいて構築された人工ペプチド（「コンセンサス」ペプチド［ｐＣＯＮＳ］）である。（Ｈａｈｎ ＢＨ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４４：４３８－４４１，２００１）。１型糖尿病では、単一または複数の病原性膵臓ペプチドには、島細胞ペプチド、インスリンペプチド、及びプロインスリンペプチドが含まれる。これらには、ＧＡＤ（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）ペプチドが含まれる（Ｒｏｅｐ ＢＯ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ７：６５－７４，２０１９）。
自己抗原ペプチド：抗原特異的調節性細胞を誘導するａＡＰＣの特異性を高めるために、ＳＬＥ、１型糖尿病、多発性硬化症、及び他の自己免疫疾患の発症に関与する病原性ペプチドが同定されている。これらを、ＮＰに結合させるか、または封入することができる。タンパク質抗原またはペプチド抗原、及び持続性の抗原特異的免疫寛容を誘導する寛容原性免疫調節薬であるラパマイシンを担持する合成生分解性ナノ粒子は、多発性硬化症のマウスモデルを治療するために使用されている（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ ＲＡ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１２：１５６－６５，２０１５）。ＳＬＥでは、これらのペプチドは、アポトーシス細胞由来のヌクレオソーム内の５つの重要な自己エピトープを含み、これらは、ヒストン（Ｈ）領域のＨ１２２－４２、Ｈ３８２－１０５、Ｈ３１１５－１３５、Ｈ４１６－３９、及びＨ４７１－９４に存在する。これらのペプチドは、ＳＬＥを有する患者及び様々なマウス系統の自己免疫Ｔ細胞及びＢ細胞によって認識され、すべての主要なＭＨＣ分子がこれらのエピトープに無差別に結合する（Ｄａｔｔａ ＳＫ Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９８７：７９－９０，２００３）。ＳＬＥ Ｔ細胞によって認識されるもう１つのペプチドは、複数のＢＷＦ１ ＩｇＧ抗体のＶＨ領域由来のＴ細胞刺激アミノ酸配列をＤＮＡへ定義するアルゴリズムに基づいて構築された人工ペプチド（「コンセンサス」ペプチド［ｐＣＯＮＳ］）である。（Ｈａｈｎ ＢＨ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４４：４３８－４４１，２００１）。１型糖尿病では、単一または複数の病原性膵臓ペプチドには、島細胞ペプチド、インスリンペプチド、及びプロインスリンペプチドが含まれる。これらには、ＧＡＤ（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）ペプチドが含まれる（Ｒｏｅｐ ＢＯ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ７：６５－７４，２０１９）。
【0185】
ディフェンシン：ディフェンシンは、植物及び動物の自然免疫系のペプチド成分である。それらは、α、β、及びθのサブグループに分類され得る。ＲＴＤ－１と呼ばれるθディフェンシンは、非常に強力な抗炎症性及び寛容原性特性を有する小さな環状の１０アミノ酸ペプチドであり、ａＡＰＣに充填または封入することができる（Ｓｅｌｓｔｅｄ ＭＥ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５５２－５５７，２００５）。
【0186】
組成物（例えば、ＴＧＦ－β及び／またはＩＬ－２が充填されたナノ粒子または他の送達ビヒクルを含む）は、１つ以上の追加の薬剤を含み得る。追加の薬剤には、免疫抑制剤及び抗炎症剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0187】
抗炎症剤は、非ステロイド系、ステロイド系、またはそれらの組み合わせであり得る。代表的なステロイド系抗炎症薬として、グルココルチコイド、プロゲスチン、ミネラルコルチコイド、コルチコステロイド、及びデキサメタゾンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な非ステロイド系抗炎症薬として、限定されないが、ケトロラック、ネパフェナク、ジクロフェナク、オキシカム（ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなど）及びサリチル酸塩（アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリリセート、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサール、フェンドサルなど）が挙げられる。
【0188】
免疫抑制剤としては、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェニレート、及びラパマイシンが挙げられる。
【0189】
ＶＩ．使用方法
本開示は、免疫媒介性障害を治療及び予防するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、免疫媒介性障害を予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、免疫媒介性障害を治療する。
本開示は、免疫媒介性障害を治療及び予防するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、免疫媒介性障害を予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、免疫媒介性障害を治療する。
【0190】
いくつかの実施形態では、使用方法は、ＴＧＦ－β依存性機構を介してＢＤＦ１マウスにおける狼瘡様疾患を抑制するＮＫ細胞の増殖を誘導するための、ＩＬ－２を充填したＣＤ２標的化ＮＰを含む。
【0191】
全身性自己免疫疾患における病原性自己抗体の産生を抑制するために、いくつかの戦略が設計されている。現在のところ、ほとんどのアプローチは、病原性エフェクター細胞とそれらを制御する通常の細胞の両方に広範な影響を与える薬物または生物学的薬剤によるものであるが、発明者らのアプローチは、調節性細胞を選択的に誘導し、増殖させる方法によるものである。ＳＬＥにおける寛容誘発アプローチの使用は、一般に、免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏ条件調整または循環Ｔｒｅｇプールのｉｎ ｖｉｖｏでの増殖のいずれかを介して、免疫調節性適応免疫細胞の誘導に焦点を当ててきた。最初のアプローチでは、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞を標的とするために、抗ＣＤ４及び／またはＣＤ２でコーティングされ、寛容原性サイトカインを含有するＮＰを使用した。これらのＮＰは、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇを誘導し、マウスの狼瘡様疾患を予防した。これらの研究では、疾患からの防御に寄与する追加の免疫細胞集団の関与が予想外に観察された。これらは、細胞表面ＣＤ２も発現するＮＫ細胞であった。狼瘡様疾患を発症したマウスからＮＫ細胞を枯渇させると、ＮＰ ａＡＰＣの防御効果が消失した。これらのマウスでは、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇの増殖が抑制され、抗ＤＮＡ産生が増加し、これらのマウスは対照よりも重度の腎疾患を発症した（図１及び４を参照のこと）。ＮＫ細胞では、ＣＤ２は、細胞活性化のためにＣＤ１６と相乗的に作用し、この分子は、抗体応答の制御に重要であり、ＮＫ細胞は、ヘルパーＴ細胞レベルとＢ細胞レベルの両方で調節することができる。ＮＫ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインを産生することも知られており、ＴＧＦ－βの主要なリンパ球供給源である（ＴＧＦ－βの不活性前駆体とＮＫ細胞によって自発的に産生される活性ＴＧＦ－βの両方である）。抗ＣＤ２／抗ＣＤ１６抗体刺激後、ＮＫ細胞は、大量のＴＧＦ－β及びＩＬ－１０を産生し、抗ＣＤ２抗体単独は、ＴＧＦ－β産生を増加させ（ＳＬＥでは減少する）、自己抗体産生のＮＫ細胞媒介抑制を促進する。ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害により、ＮＫ細胞媒介性防御効果が消失する養子移入実験で示されたように、抗ＣＤ２抗体は、ＴＧＦ－β依存性機構を介してＮＫ細胞の自己抗体産生が抑制されるように誘導した（図１１を参照のこと）。
【0192】
ＣＤ２に関するほとんどの研究は、Ｔ細胞上でのこの分子の発現に焦点を当てている。例えば、多発性硬化症に罹患している自己免疫対象において抗ＣＤ２抗体を使用することにより、良性の急性免疫抑制が同定されたが、これはレシピエントのＴ細胞に対する影響としてのみ調査された。同様に、ＣＤ２特異的融合タンパク質アレファセプトは、自己免疫性糖尿病患者において免疫抑制活性を発揮することが判明し、その発見は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）とエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）の枯渇に起因するとされたが、ＮＫ細胞では調査は行われなかった。もう一つの考察は、抗ＣＤ２抗体によるＮＫ細胞のライゲーションは、免疫細胞のバイスタンダー動員において長期持続活性を有するサイトカイン濃度の局所的増加を促進する可能性があるということである。これに関連して、ＮＰは、内在性潜在型ＴＧＦ－βの活性型への変換を促進する可能性がある局所的な酸性微小環境を作り出し、その結果、局所的な貯蔵量（環境内及び／またはＮＰ内）が枯渇した後でもＴＧＦ－β活性を増強する。
【0193】
組成物及び製剤は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのナイーブＣＤ４細胞からＴｒｅｇへの分化を誘導する方法、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞の増殖及び／または機能を誘導または増加させる方法、及び／またはＮＫ細胞の集団を誘導または増加させる方法で使用するための医薬組成物（例えば、薬学的に許容される緩衝液、担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた上記の組成物または製剤のいずれか）として調製され得る。
【0194】
組成物及び製剤は、炎症性疾患または障害、自己免疫疾患または障害の治療、移植片寛容の誘導または増加、移植片拒絶反応の治療、ならびにＴ細胞、ＮＫ細胞、抗原提示細胞、またはそれらの組み合わせの活性を調節することによって軽減または改善され得る症状を伴うアレルギー及び他の病気の治療に有用な治療的免疫抑制戦略に使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、組成物を投与した対象における抗ＤＮＡ抗体（例えば、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体）産生を減少させるか、または腎疾患を軽減することができる。
【0195】
治療方法は、１つ以上の薬剤（例えば、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β）を、対象における１つ以上の標的化された細胞または組織に送達するナノ粒子を含有する有効量の医薬組成物を対象（例えば、ヒト患者）に投与することを含み得る。例えば、自己免疫疾患または障害（例えば、ＳＬＥ）を有する対象を、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを送達し、抗ＣＤ２抗体及び／または抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片で標的化されたナノ粒子を含有する、有効量の医薬組成物を対象に投与することによって治療することができる。
【0196】
本方法は、最初に、細胞内にまたは細胞の微小環境に薬剤を送達するために、ＴＧＦ－β、ＩＬ－２、及び任意選択で１つ以上の他の薬剤を充填した、ＣＤ２及び／またはＣＤ４を標的化したナノ粒子（または別の送達ビヒクル）を用いた。最近では、本方法は、ＣＤ２及び／またはＣＤ３を標的としたナノ粒子を用いている。本方法は、通常、薬剤を担持した粒子を１つ以上の細胞と接触させることを含む。この接触はｉｎ ｖｉｖｏでもｅｘ ｖｉｖｏでも行うことができる。治療方法に使用する場合、組成物及び製剤を、治療的または予防的に対象に投与することができる。
【0197】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のリンパ球が機能的調節細胞の複数の集団になるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のリンパ球がＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のリンパ球が非Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のＣＤ４及びＣＤ８細胞がＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞となるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞が非Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のＮＫ細胞が非Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のＮＫＴ細胞がＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞になるように誘導する。非Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の例には、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βを産生するＴｒ１細胞、及びＴＧＦ－βのみを産生するＴｒｅｇ３細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、調節性ＮＫ細胞を生成し、免疫媒介性障害を抑制する数まで増殖させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者のＮＫ細胞がＴＧＦ－β産生調節性ＮＫ細胞になるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、Ｔ細胞がＴＧＦ－β産生調節性Ｔ細胞になるように誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ＮＫＴ細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ヘルパーＴ細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、Ｔｈ１細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、Ｔｈ２細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、Ｔｈ１７細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ＦＴＨ（濾胞性ヘルパーＴ）細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ヘルパーＴ細胞の機能を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、Ｔｈ１細胞の機能を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、Ｔｈ２細胞の機能を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、Ｔｈ１７細胞の機能を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ＦＴＨ（濾胞性ヘルパーＴ）細胞の機能を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ＩｇＧの産生を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ＩｇＧレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、自己抗体の産生を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、自己抗体レベルを低下させる。細胞機能及び／または表現型の変化を測定するために使用されるアッセイの例としては、フローサイトメトリー、ＣＹＴＯＦマスサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、及びＤＮＡまたはＲＮＡ分析が挙げられるが、これらに限定されない。これら及び他のアッセイは、ＴＧＦ－β及び／またはＩＬ－２及び／または任意選択で１つ以上の他の薬剤を充填したＣＤ２及び／またはＣＤ３標的化ナノ粒子で処置することによる細胞型または機能の変化を判定するために使用され得る。
【0198】
Ａ．免疫媒介性障害の予防及び治療
治療を受ける対象は、免疫媒介性の障害、または病態に罹患していてもよい。免疫媒介性障害のいくつかの例としては、糖尿病、自己免疫疾患などの免疫系障害、炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、１つ以上のアレルギー、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、組成物及び方法は、糖尿病、自己免疫疾患などの免疫系障害、炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、１つ以上のアレルギー、またはそれらの組み合わせの１つ以上の症状を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、組成物及び方法は、抗体媒介性障害である自己免疫疾患を治療するために使用することができる。抗体媒介性障害である自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、皮膚筋炎、及びシェーグレン症候群などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は細胞媒介性自己免疫疾患である。細胞媒介性自己免疫障害の例には、１型糖尿病、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強皮症が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植関連疾患である。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、外来臓器移植の拒絶反応である。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を、免疫媒介性障害を治療するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物を、治療的に投与する。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を、免疫媒介性障害を予防するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物を予防的に投与する。ＳＬＥ、関節リウマチ、及び１型糖尿病などの自己免疫疾患では、臨床疾患が発症する何年も前に自己抗体が出現することが判明している。一部の患者では、これらの抗体の数と量によって疾患の臨床発症を予測する。これらの患者にａＡＰＣを投与すると、臨床疾患の発症を予防できる可能性がある。
治療を受ける対象は、免疫媒介性の障害、または病態に罹患していてもよい。免疫媒介性障害のいくつかの例としては、糖尿病、自己免疫疾患などの免疫系障害、炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、１つ以上のアレルギー、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、組成物及び方法は、糖尿病、自己免疫疾患などの免疫系障害、炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、１つ以上のアレルギー、またはそれらの組み合わせの１つ以上の症状を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、組成物及び方法は、抗体媒介性障害である自己免疫疾患を治療するために使用することができる。抗体媒介性障害である自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、皮膚筋炎、及びシェーグレン症候群などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は細胞媒介性自己免疫疾患である。細胞媒介性自己免疫障害の例には、１型糖尿病、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、及び強皮症が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植関連疾患である。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。いくつかの実施形態では、免疫媒介性障害は、外来臓器移植の拒絶反応である。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を、免疫媒介性障害を治療するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物を、治療的に投与する。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を、免疫媒介性障害を予防するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物を予防的に投与する。ＳＬＥ、関節リウマチ、及び１型糖尿病などの自己免疫疾患では、臨床疾患が発症する何年も前に自己抗体が出現することが判明している。一部の患者では、これらの抗体の数と量によって疾患の臨床発症を予測する。これらの患者にａＡＰＣを投与すると、臨床疾患の発症を予防できる可能性がある。
【0199】
１．自己免疫疾患
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、自己免疫性及び炎症性の疾患または障害を治療または予防するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、自己免疫性及び炎症性の疾患または障害を治療または予防するために使用することができる。
【0200】
治療または予防することができる例示的な自己免疫性／炎症性の疾患または障害としては、アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経失調症、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経ニューロン障害（ＡＭＡＮ）、Ｂａｌｏ病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）または好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、苔癬硬化症、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、ムーレン潰瘍、ミュシャ・ハーベルマン病、多巣性運動神経障害（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視床神経筋炎、好中球症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、顔面半側萎縮症、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺症候群Ｉ型、ＩＩ、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田症候群、及びウェゲナー肉芽腫症（または多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ））が挙げられるが、これらに限定されない。
ａ．Ｉ型糖尿病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、Ｉ型糖尿病を治療または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態では、インスリン産生細胞を対象に移植することができ、その後、移植拒絶反応を軽減または阻害するための１つ以上の薬剤（例えば、ＴＧＦ－β及びＩＬ－２）を含む有効量の組成物を対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、膵島抗原を、寛容誘発剤と共にナノ粒子または他の送達ビヒクル内に一緒に封入することができ、インスリン産生細胞に対する寛容を誘導するために使用することができる。好ましくは、インスリン産生細胞は、β細胞または島細胞である。いくつかの実施形態では、インスリン産生細胞は、インスリンを産生するように改変された組換え細胞である。
ａ．Ｉ型糖尿病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、Ｉ型糖尿病を治療または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態では、インスリン産生細胞を対象に移植することができ、その後、移植拒絶反応を軽減または阻害するための１つ以上の薬剤（例えば、ＴＧＦ－β及びＩＬ－２）を含む有効量の組成物を対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、膵島抗原を、寛容誘発剤と共にナノ粒子または他の送達ビヒクル内に一緒に封入することができ、インスリン産生細胞に対する寛容を誘導するために使用することができる。好ましくは、インスリン産生細胞は、β細胞または島細胞である。いくつかの実施形態では、インスリン産生細胞は、インスリンを産生するように改変された組換え細胞である。
【0201】
２．移植関連疾患
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、移植関連疾患を治療または予防するために使用することができる。移植関連疾患の例としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば、骨髄移植に起因するものなど）、移植片移植拒絶反応、慢性拒絶反応、及び固形臓器、皮膚、膵島、筋肉、肝細胞、ニューロンを含む、組織または細胞の同種または異種移植に関連する免疫障害が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の急性拒絶反応を治療または予防するために、及び臓器移植の慢性拒絶反応を逆転させるために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の急性拒絶反応を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の急性拒絶反応を予防するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の慢性拒絶反応を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の慢性拒絶反応を予防するために使用することができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、固形臓器移植の拒絶反応の治療に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、幹細胞移植に関連する合併症の治療に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、幹細胞移植に関連する合併症の予防に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、同種異系造血幹細胞移植に関連する合併症の治療に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、同種異系造血幹細胞移植に関連する合併症の予防に有用である。ＧＶＨＤは、同種造血幹細胞移植に関連する主要な合併症であり、移植された骨髄内の機能的な免疫細胞がレシピエントを「異物」と認識し、免疫学的攻撃を開始する。好ましい実施形態では、必要とする対象に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つ以上の症状を治療または緩和するために有効量の組成物を投与することによって、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、ＧＶＨＤに関連する１つ以上の症状を緩和する。好ましい実施形態では、必要とする対象に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つ以上の症状を予防するために有効量の組成物を投与することによって、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、ＧＶＨＤに関連する１つ以上の症状を緩和する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、移植関連疾患を治療または予防するために使用することができる。移植関連疾患の例としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば、骨髄移植に起因するものなど）、移植片移植拒絶反応、慢性拒絶反応、及び固形臓器、皮膚、膵島、筋肉、肝細胞、ニューロンを含む、組織または細胞の同種または異種移植に関連する免疫障害が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の急性拒絶反応を治療または予防するために、及び臓器移植の慢性拒絶反応を逆転させるために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の急性拒絶反応を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の急性拒絶反応を予防するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の慢性拒絶反応を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、臓器移植の慢性拒絶反応を予防するために使用することができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、固形臓器移植の拒絶反応の治療に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、幹細胞移植に関連する合併症の治療に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、幹細胞移植に関連する合併症の予防に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、同種異系造血幹細胞移植に関連する合併症の治療に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、同種異系造血幹細胞移植に関連する合併症の予防に有用である。ＧＶＨＤは、同種造血幹細胞移植に関連する主要な合併症であり、移植された骨髄内の機能的な免疫細胞がレシピエントを「異物」と認識し、免疫学的攻撃を開始する。好ましい実施形態では、必要とする対象に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つ以上の症状を治療または緩和するために有効量の組成物を投与することによって、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、ＧＶＨＤに関連する１つ以上の症状を緩和する。好ましい実施形態では、必要とする対象に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つ以上の症状を予防するために有効量の組成物を投与することによって、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、ＧＶＨＤに関連する１つ以上の症状を緩和する。
【0202】
ａ．移植片対宿主病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、移植片対宿主病を予防または治療するために使用することができる。移植片関連疾患の例としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば、骨髄移植に起因するものなど）が挙げられる。好ましい実施形態では、必要とする対象に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関連する１つ以上の症状を緩和するために有効量の組成物を投与することによって、本組成物を使用して、ＧＶＨＤの１つ以上の症状を予防、治療、または緩和するために、。ＧＶＨＤは、ドナー組織（移植片）に存在する免疫細胞が宿主自身の組織を攻撃する場合に、幹細胞移植後の患者に発生する免疫病態である。ＧＶＨＤは、同種造血幹細胞移植に関連する主要な合併症であり、移植された骨髄内の機能的な免疫細胞がレシピエントを「異物」と認識し、免疫学的攻撃を開始する。特定の状況下では輸血でも発生し得る。ＧＶＨＤの症状には、皮膚の発疹、皮膚の色や質感の変化、下痢、吐き気、肝機能の異常、皮膚の黄変、感染症に対する感受性の増加、ドライアイ、眼の炎症、及び口の過敏または口渇症などが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、移植片対宿主病を予防または治療するために使用することができる。移植片関連疾患の例としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば、骨髄移植に起因するものなど）が挙げられる。好ましい実施形態では、必要とする対象に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関連する１つ以上の症状を緩和するために有効量の組成物を投与することによって、本組成物を使用して、ＧＶＨＤの１つ以上の症状を予防、治療、または緩和するために、。ＧＶＨＤは、ドナー組織（移植片）に存在する免疫細胞が宿主自身の組織を攻撃する場合に、幹細胞移植後の患者に発生する免疫病態である。ＧＶＨＤは、同種造血幹細胞移植に関連する主要な合併症であり、移植された骨髄内の機能的な免疫細胞がレシピエントを「異物」と認識し、免疫学的攻撃を開始する。特定の状況下では輸血でも発生し得る。ＧＶＨＤの症状には、皮膚の発疹、皮膚の色や質感の変化、下痢、吐き気、肝機能の異常、皮膚の黄変、感染症に対する感受性の増加、ドライアイ、眼の炎症、及び口の過敏または口渇症などが含まれるが、これらに限定されない。
【0203】
ｂ．移植片拒絶反応
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、移植片拒絶反応を予防または治療するために使用することができる。固形臓器、皮膚、膵島、筋肉、肝細胞、ニューロンなどの組織または細胞の同種または異種移植片を含む外来組織の移植には、急性及び慢性の移植片拒絶反応を回避または治療するために有毒な免疫抑制剤の慢性投与が必要である。近年、同種異系幹細胞と臓器移植片の組み合わせにより、免疫抑制剤を中止した後に、移植片の混合キメラ現象、寛容性、及び生存が生じ得る（Ｄｕｒａｎ－Ｓｔｒｕｕｃｋ Ｒ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １０１：２７４－８３，２０１７）。ナノ粒子は、免疫抑制剤を低用量で送達するために使用されている。好ましい実施形態では、組成物及び方法を、現在の薬剤の毒性を伴わずに、急性及び慢性の移植片拒絶反応を予防するために使用することができる。これらの方法は、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを提供して、Ｔｒｅｇを誘導し、維持する。ここで、ナノ粒子にはＩＬ－２とＴＧＦ－βの両方が含まれる。ナノ粒子の一部は、標的リンパ球に結合するだけでなく、抗原提示細胞によって貪食される。ナノ粒子に封入されたＴＧＦ－βは、これらのＡＰＣが寛容原性になるように誘導する（Ｋｏｓｉｅｗｉｃｚ ＭＭ ＆ Ａｌａｒｄ Ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓ．３０：１５５－７０，２００６）。臓器提供者に適合するペプチドＭＨＣ抗原の皮下注射を移植前及び移植後継続的に追加すると、移植片拒絶反応を予防し、重度の有毒な副作用を伴う免疫抑制剤の使用を回避するために必要な、同種抗原特異的Ｔｒｅｇを維持するために必要なＴ細胞受容体刺激が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を、移植片拒絶反応を予防または治療するために使用することができる。固形臓器、皮膚、膵島、筋肉、肝細胞、ニューロンなどの組織または細胞の同種または異種移植片を含む外来組織の移植には、急性及び慢性の移植片拒絶反応を回避または治療するために有毒な免疫抑制剤の慢性投与が必要である。近年、同種異系幹細胞と臓器移植片の組み合わせにより、免疫抑制剤を中止した後に、移植片の混合キメラ現象、寛容性、及び生存が生じ得る（Ｄｕｒａｎ－Ｓｔｒｕｕｃｋ Ｒ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １０１：２７４－８３，２０１７）。ナノ粒子は、免疫抑制剤を低用量で送達するために使用されている。好ましい実施形態では、組成物及び方法を、現在の薬剤の毒性を伴わずに、急性及び慢性の移植片拒絶反応を予防するために使用することができる。これらの方法は、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを提供して、Ｔｒｅｇを誘導し、維持する。ここで、ナノ粒子にはＩＬ－２とＴＧＦ－βの両方が含まれる。ナノ粒子の一部は、標的リンパ球に結合するだけでなく、抗原提示細胞によって貪食される。ナノ粒子に封入されたＴＧＦ－βは、これらのＡＰＣが寛容原性になるように誘導する（Ｋｏｓｉｅｗｉｃｚ ＭＭ ＆ Ａｌａｒｄ Ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓ．３０：１５５－７０，２００６）。臓器提供者に適合するペプチドＭＨＣ抗原の皮下注射を移植前及び移植後継続的に追加すると、移植片拒絶反応を予防し、重度の有毒な副作用を伴う免疫抑制剤の使用を回避するために必要な、同種抗原特異的Ｔｒｅｇを維持するために必要なＴ細胞受容体刺激が提供される。
【0204】
Ｂ．有効量
医薬組成物の有効量または治療有効量は、疾患または障害の１つ以上の症状を予防、治療、抑制もしくは緩和するのに十分な、さもなければ所望の薬理学的及び／または生理学的効果、例えば、ＳＬＥなどの疾患または障害の根底にある病態生理学的メカニズムの１つ以上の軽減、阻害、または逆転を提供するのに十分な用量であり得る。
医薬組成物の有効量または治療有効量は、疾患または障害の１つ以上の症状を予防、治療、抑制もしくは緩和するのに十分な、さもなければ所望の薬理学的及び／または生理学的効果、例えば、ＳＬＥなどの疾患または障害の根底にある病態生理学的メカニズムの１つ以上の軽減、阻害、または逆転を提供するのに十分な用量であり得る。
【0205】
いくつかの実施形態では、医薬組成物（例えば、ＩＬ－２±ＴＧＦ－β及びＩＬ－２を充填した抗ＣＤ２または抗ＣＤ３コーティングナノ粒子を含有する）の投与は、自己免疫疾患もしくは障害、炎症性疾患もしくは障害、またはアレルギーの１つ以上の症状を予防、治療、または緩和する。したがって、投与量は、レシピエントにおいて所望の効果を達成するのに有効な量として表すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、医薬組成物の量は、発疹、吐き気、炎症、下痢、またはそれらの組み合わせを予防、軽減、または緩和するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、医薬組成物の量は、対象においてナイーブＣＤ４細胞からＴｒｅｇへの分化を誘導するのに有効である。いくつかの実施形態では、医薬組成物の量は、対象におけるＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の増殖及び／または機能を誘導または増加させるのに有効な量である。いくつかの実施形態では、医薬組成物の量は、抗ＤＮＡ抗体（例えば、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体）の産生を低減または抑制し、及び／または腎疾患を低減するのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法または組成物は、ＳＬＥの１つ以上の症状を軽減する。例えば、医薬組成物の量は、タンパク尿の重症度を予防、遅延、もしくは軽減するか、抗核自己抗体（ＡＮＡ）の産生を減少させるか、異常なリンパ増殖を減少させるか、糸球体腎炎を予防、遅延、もしくは軽減するか、血中尿素濃度の上昇を軽減、予防、もしくは遅延させるか、またはそれらの組み合わせに有効である。これらの効果は、乾癬や関節リウマチなどの複数の自己免疫疾患の治療にも望ましい。
【0206】
必要とされる医薬組成物の有効量は、対象の種、年齢、体重及び全身状態、治療する障害の重症度、及びその投与様式に応じて、対象ごとに異なるであろう。したがって、すべての医薬組成物について正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、当業者であれば、本明細書の教示を踏まえて日常的な実験のみを使用して、適切な量を決定することができる。例えば、医薬組成物を投与するための有効な用量及びスケジュールは経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技術の範囲内である。いくつかの形態では、組成物の投与の用量範囲は、対象が罹患している疾患または障害の１つ以上の症状の軽減または緩和をもたらすのに十分な量である。
【0207】
用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど多量であるべきではない。一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別、投与経路、他の薬剤がレジメンに含まれるかどうか、治療する疾患の種類、段階、及び部位によって異なる。禁忌があった場合には、個々の医師が投与量を調整することができる。治療に使用する組成物の有効用量は、特定の治療の過程で増加または減少し得ることも理解されるであろう。診断アッセイの結果から、用量の変更を行うことができ、明らかになる。
【0208】
用量は変動させることができ、１日または数日間にわたって、毎日１回以上の用量の投与で投与することができる。特定のクラスの医薬品の適切な用量に関するガイダンスは文献に記載されている。最適な投与スケジュールは、対象または患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者であれば、最適な用量、投与方法、及び反復率を容易に決定することができる。最適な用量は、個々の医薬組成物の相対的な効力に応じて変化し得、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが判明したＥＣ５０に基づいて推定することができる。
【0209】
一般に、毎日０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量レベルを哺乳動物に投与する。一般に、静脈内注射または注入の場合、用量はより少なくてもよい。一般に、個体に投与するナノ粒子に結合した活性薬剤の総量は、同じ望ましいまたは意図された効果のために投与されなければならない非結合の活性薬剤の量よりも少ないであろう。特定の患者に対する最適な用量及び治療レジメンは、当業者であれば、疾患の徴候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、単位用量は、静脈内注射用の単位剤形である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子中のＩＬ－２の総量は、標準的な（非ナノ粒子）ＩＬ－２非経口注射によって投与される用量の１０００倍少ない。いくつかの実施形態では、単位用量は、経口投与用の単位剤形である。いくつかの実施形態では、単位用量は、吸入用の単位剤形である。
【0210】
治療は、１つ以上の所望の治療目標、例えば、治療開始時と比較した疾患の１つ以上の症状の軽減を達成するのに十分な時間継続することができる。治療は、所望の期間継続することができ、患者の治療（例えば、抗炎症治療）の進行をモニタリングするための既知の任意の手段を使用して治療の進行をモニタリングすることができる。いくつかの実施形態では、投与を、治療中、毎日、または毎週、または週の一部ごとに行う。いくつかの実施形態では、治療レジメンを、最長２、３、４もしくは５日、週、または月にわたって、または最長６か月にわたって、または６か月を超えて、例えば最長１年、２年、３年、または最長５年にわたって実施する。
本明細書に記載の方法による医薬組成物の特定の用量の投与の有効性は、疾患、障害、及び／または病態（例えば、ＳＬＥ）の治療を必要とする対象の状態の評価に有用であることが知られている、病歴、徴候、症状、及び客観的な臨床検査の特定の特徴を評価することによって判定することができる。これらの徴候、症状、及び客観的な臨床検査は、そのような患者を治療する医師、または当技術分野で実験を行う研究者には知られているように、治療または予防する特定の疾患または病態に応じて様々に異なる。例えば、適切な対照群との比較、及び／または一般集団または特定の個体における疾患の正常な進行に関する知識に基づいた場合、（１）対象の身体状態が改善されていることが示され、（２）疾患または病態の進行が安定化、遅延、または逆転することが示され、または（３）疾患または病態を治療するための他の薬剤の必要性が低下または不要になる場合、特定の治療レジメンは有効であるとみなされる。いくつかの実施形態では、有効性は、治療後の特定の時点（例えば、１～５日、週または月）における生活の質スコアの尺度として評価される。
本明細書に記載の方法による医薬組成物の特定の用量の投与の有効性は、疾患、障害、及び／または病態（例えば、ＳＬＥ）の治療を必要とする対象の状態の評価に有用であることが知られている、病歴、徴候、症状、及び客観的な臨床検査の特定の特徴を評価することによって判定することができる。これらの徴候、症状、及び客観的な臨床検査は、そのような患者を治療する医師、または当技術分野で実験を行う研究者には知られているように、治療または予防する特定の疾患または病態に応じて様々に異なる。例えば、適切な対照群との比較、及び／または一般集団または特定の個体における疾患の正常な進行に関する知識に基づいた場合、（１）対象の身体状態が改善されていることが示され、（２）疾患または病態の進行が安定化、遅延、または逆転することが示され、または（３）疾患または病態を治療するための他の薬剤の必要性が低下または不要になる場合、特定の治療レジメンは有効であるとみなされる。いくつかの実施形態では、有効性は、治療後の特定の時点（例えば、１～５日、週または月）における生活の質スコアの尺度として評価される。
【0211】
Ｃ．投与様式
組成物（例えば、ＴＧＦ－β及びＩＬ－２、またはＩＬ－２のみを１つ以上の追加の薬剤とともに充填した抗ＣＤ２及び／またはＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を含有する）のいずれかを、薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて治療的に使用することができる。本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた１つ以上の化合物からなる医薬組成物に都合よく製剤化することができる。例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ最新版を参照のこと。これは、本明細書に記載の治療薬の製剤の調製と併せて使用することができ、参照により本明細書に援用される、典型的な担体及び医薬組成物を調製する従来の方法を開示している。これらは、最も典型的に、組成物をヒトに投与するための標準的な担体であろう。一態様では、ヒト及び非ヒトの場合、これらには、滅菌水、生理食塩水、及び生理学的ｐＨの緩衝溶液などの溶液が含まれる。他の治療薬は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与することができる。
組成物（例えば、ＴＧＦ－β及びＩＬ－２、またはＩＬ－２のみを１つ以上の追加の薬剤とともに充填した抗ＣＤ２及び／またはＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を含有する）のいずれかを、薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて治療的に使用することができる。本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた１つ以上の化合物からなる医薬組成物に都合よく製剤化することができる。例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ最新版を参照のこと。これは、本明細書に記載の治療薬の製剤の調製と併せて使用することができ、参照により本明細書に援用される、典型的な担体及び医薬組成物を調製する従来の方法を開示している。これらは、最も典型的に、組成物をヒトに投与するための標準的な担体であろう。一態様では、ヒト及び非ヒトの場合、これらには、滅菌水、生理食塩水、及び生理学的ｐＨの緩衝溶液などの溶液が含まれる。他の治療薬は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与することができる。
【0212】
本明細書に記載の医薬組成物には、選択した活性薬剤（複数可）に加えて、これらに限定されないが、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含めることができる。
【0213】
１つ以上の薬剤を充填したナノ粒子を含有する医薬組成物は、局所治療が望まれるのか全身治療が望まれるのか、及び治療する領域に応じて、複数の方法で対象に投与することができる。したがって、例えば、医薬組成物は、膣内、直腸内、鼻腔内、経口、吸入により、または非経口的に、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内、動脈内、リンパ内、静脈内、くも膜下腔内、及び気管内経路で、対象に投与することができる。
【0214】
非経口投与を使用する場合、それは一般に注射によって特徴付けられる。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液もしくは懸濁液に適した固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。非経口投与の別のアプローチには、一定の用量が維持されるような徐放または持続放出系の使用が含まれる。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。好適な非経口投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入及び血管系へのカテーテル注入）、組織周囲及び組織内注射（例えば、眼内注射、網膜内注射、または網膜下注射）、皮下注入（浸透圧ポンプなどによる）を含む皮下注射または沈着、カテーテルまたは他の配置装置（例えば、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状材料を含むインプラント）による直接塗布が含まれる。
【0215】
非経口投与用の製剤には、緩衝液、希釈剤、及び他の適切な添加剤を含むこともできる無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体及び栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルブドウ糖をベースにしたものなど）などが含まれる。防腐剤及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在させることができる。
【0216】
医薬組成物（例えば、ＴＧＦ－β及びＩＬ－２またはＩＬ－２のみ、任意選択で１つ以上の追加の薬剤を充填した抗ＣＤ２及び／またはＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を含む）の投与は、局所化するか（すなわち、特定の領域、生理学的な系、組織、臓器、もしくは細胞型）または全身性とすることができる。
【0217】
いくつかの好ましい実施形態では、本開示の医薬組成物を、非経口送達によって投与する。いくつかの好ましい実施形態では、非経口送達は静脈内送達である。いくつかの好ましい実施形態では、非経口送達は筋肉内である。いくつかの好ましい実施形態では、非経口送達は皮下である。いくつかの好ましい実施形態では、本開示の医薬組成物を経口送達によって投与する。
【0218】
Ｄ．併用療法
いくつかの実施形態では、組成物及び製剤を、１つ以上の治療薬、診断薬、及び／または予防薬と組み合わせて、それを必要とする対象に投与する。例えば、ＩＬ－２またはＩＬ－２とＴＧＦ－βを充填した抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を使用して、１つ以上の治療薬、診断薬、及び／または予防薬と組み合わせて、有効量のＴＧＦ－β及びＩＬ－２を送達することができる。あるいは、ＩＬ－２のみを充填した抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を、１つ以上の診断薬及び／または予防薬と併用して局所的にＴＧＦ－βを産生することができる。一つの好ましい実施形態は、寛容原性ａＡＰＣ ＮＰと、炎症誘発性サイトカイン、メタロプロテイナーゼ及び／または炎症性マクロファージを抑制する抗炎症剤との組み合わせである。
いくつかの実施形態では、組成物及び製剤を、１つ以上の治療薬、診断薬、及び／または予防薬と組み合わせて、それを必要とする対象に投与する。例えば、ＩＬ－２またはＩＬ－２とＴＧＦ－βを充填した抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を使用して、１つ以上の治療薬、診断薬、及び／または予防薬と組み合わせて、有効量のＴＧＦ－β及びＩＬ－２を送達することができる。あるいは、ＩＬ－２のみを充填した抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を、１つ以上の診断薬及び／または予防薬と併用して局所的にＴＧＦ－βを産生することができる。一つの好ましい実施形態は、寛容原性ａＡＰＣ ＮＰと、炎症誘発性サイトカイン、メタロプロテイナーゼ及び／または炎症性マクロファージを抑制する抗炎症剤との組み合わせである。
【0219】
用語「組み合わせ」または「組み合わせた」は、２つ以上の薬剤の共投与、同時投与、または連続投与のいずれかを指すために使用される。したがって、組み合わせは、一緒に（例えば、混合物として）、別々ではあるが同時に（例えば、同じ対象に別々の静脈ラインを介して）、または連続的に（例えば、化合物または薬剤の１つを最初に投与し、続いて第２のものを投与する）のいずれかで投与することができる。追加の治療薬、診断薬、及び／または予防薬は、対象に局所的または全身的に投与することができ、あるいは装置上または装置内にコーティングまたは組み込むことができる。
【0220】
追加の薬剤は、治療する疾患または障害に基づいて選択することができ、抗体、ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症薬、ＴＮＦ－α遮断薬、免疫抑制薬、サイトカイン、ケモカイン、ディフェンシン、及び／または成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、追加の治療薬、診断薬、及び／または予防薬は、Ｔｒｅｇの活性または産生を増加させる薬剤である。
【0221】
いくつかの実施形態では、本開示は、ディフェンシンとの併用治療を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＴＤ－１との併用治療を提供する（Ｔｏｎｇａｏｎｋｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５１：６５７－６７，２０１９）。いくつかの実施形態では、プレバイオティクスをナノ粒子に封入して、併用治療を提供してもよい。
【0222】
好ましい実施形態では、治療薬、診断薬、及び／または予防薬は、治療する対象が罹患している疾患または障害の治療に臨床的に使用される薬剤から選択される。例えば、治療を必要とする対象におけるＳＬＥの１つ以上の症状を治療するために、本方法は、組成物の併用投与（例えば、ＩＬ－２及びＴＧＦ－β、ならびにＳＬＥを治療するために使用する１つ以上の薬剤、例えば、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、ナブメトン、セレコキシブ、コルチコステロイド、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ベリムマブ、及び抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン及びクロロキン）を充填した、抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子）を提供する。あるいは、局所的にＴＧＦ－βを産生する、ＩＬ－２のみを充填した抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子を、狼瘡を治療するために上記で使用される薬剤の１つ以上と併用することができる。
【0223】
ＶＩＩ．キット
上述の組成物及び他の材料は、方法を実施するか、または方法の実施を補助するのに有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで一緒にパッケージすることができる。所与のキット内の構成要素が、方法において一緒に使用されるように設計され、適合していることは有用である。キットには、例えば、組成物の用量の供給物が含まれ得る。活性薬剤は、単独で（例えば、凍結乾燥して）、または医薬組成物中に供給され得る。活性薬剤は、単位用量で存在することも、投与前に希釈する必要があるストックで存在することもできる。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体の供給物を含む。キットはまた、構造、機械、器具（例えば、投与用）などの製造物、及び提供される医薬組成物と共に使用するための組成物、化合物、材料などを含み得る。好ましい実施形態では、キットは、活性薬剤または組成物を投与するための器具、例えば注射器を含む。キットは、上記の使用において組成物を投与するための印刷された説明書を含み得る。例えば、キットは、ＩＬ－２±ＴＧＦ－β、ＩＬ－２、１つ以上の追加の薬剤、またはそれらの組み合わせを充填した、抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子の１つ以上の用量単位、ならびに使用説明書を含み得る。
上述の組成物及び他の材料は、方法を実施するか、または方法の実施を補助するのに有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで一緒にパッケージすることができる。所与のキット内の構成要素が、方法において一緒に使用されるように設計され、適合していることは有用である。キットには、例えば、組成物の用量の供給物が含まれ得る。活性薬剤は、単独で（例えば、凍結乾燥して）、または医薬組成物中に供給され得る。活性薬剤は、単位用量で存在することも、投与前に希釈する必要があるストックで存在することもできる。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体の供給物を含む。キットはまた、構造、機械、器具（例えば、投与用）などの製造物、及び提供される医薬組成物と共に使用するための組成物、化合物、材料などを含み得る。好ましい実施形態では、キットは、活性薬剤または組成物を投与するための器具、例えば注射器を含む。キットは、上記の使用において組成物を投与するための印刷された説明書を含み得る。例えば、キットは、ＩＬ－２±ＴＧＦ－β、ＩＬ－２、１つ以上の追加の薬剤、またはそれらの組み合わせを充填した、抗ＣＤ２及び／または抗ＣＤ３でコーティングされたナノ粒子の１つ以上の用量単位、ならびに使用説明書を含み得る。
【0224】
本開示は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。これらは、ＤＢＡ／２マウスから（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１（ＢＤＦ１）への脾細胞の移入によって誘発される狼瘡様疾患を発症したマウスが、Ｔ細胞に標的化されたＩＬ－２とＴＧＦ－βを充填したＮＰで処置することにより、狼瘡疾患の発現が有意に減少し、生存率が増加したことを示している。ＮＰによって付与される防御効果は、Ｔ細胞のみに起因するものではなく、ＮＰがＣＤ２＋細胞を標的とすることから、追加の免疫細胞も関与する。ＮＰによるＢＤＦ１マウスの狼瘡様疾患の抑制に主に寄与するのは、ＮＫ細胞とこれらの細胞によって産生されるＴＧＦ－βである。研究ではまた、ＩＬ－２のみを含有するＮＰを使用してｅｘ ｖｉｖｏでＮＫ細胞の増殖を誘導することができ、その後、自己免疫疾患患者の治療に使用することができることも示されている（ＮＫ細胞がＴＧＦ－βを産生）。前述の実施例では、抗ＣＤ２抗体を使用してＣＤ８＋細胞を標的としているが、これは、ＣＤ２がｉｎ ｖｉｖｏで効果を有し、抗ＣＤ２抗体がＣＤ３刺激後にＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを誘導する能力を有するためであり（Ｏｃｈａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５；１７４：６９９３－７００５）、これは、抗ＣＤ２抗体及びＣＤ２特異的融合タンパク質アレファセプトが自己免疫疾患の患者において免疫抑制効果を有するという見解と一致している（Ｈａｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８８；１４１：１３１－８；Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１５；１２５：３２８５－９６）。
【実施例】
【0225】
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１．標的化ナノ粒子の調製及び特性評価。
材料及び方法：ポリ（乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ））ＮＰを、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５；５９：１７２－８１に記載されているように調製した。簡潔に述べると、６０ｍｇのＰＬＧＡ（Ｄｕｒｅｃｔ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）をガラス試験管中で３ｍｌのクロロホルムに溶解した。２．５μｇのＴＧＦ－β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ）の存在下または非存在下で、担体フリーの１．２５μｇのＩＬ－２を含有する水溶液２００μｌを滴加すると、一次エマルジョンが得られ、これを超音波処理し、４ｍｌの４．７％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び０．６２５ｍｇ／ｍｌのアビジン－パルミチン酸複合体を含有し、連続的にボルテックスされたガラス試験管へ滴加した。得られた二重エマルジョンを氷浴中で超音波処理し、その後、２００ｍｌの０．２５％ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）を含有するビーカーに移した。粒子を室温で３時間撹拌して硬化させ、その後、１８，０００ｇでペレット化し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水へ再懸濁するサイクルにより、３回洗浄した。洗浄したＮＰを液体窒素中で急速冷凍し、凍結乾燥することで、使用するまで－２０℃で長期保存できるようにした。ＮＰ調製物を、物理的特性、封入品質、及び放出速度について検査した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏによる動的光散乱を使用して粒度を定量化した。ＮＰは、２４５．３±２．２ｎｍの流体力学直径を有し、多分散性指数が低いことが判明したが、これは、比較的狭い粒度分布を有する均一なＮＰ集団であることを示している。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でＮＰを破壊した後、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキットにより、また、上清を分析することによって、サイトカインの封入及び放出をチェックした。細胞標的化については、ＮＰをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、１ｍｇのＮＰに対して５～１０μｇの比率で、ビオチン化抗ＣＤ２抗体（クローンＲＭ２－５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共に、使用前に１０分間インキュベートした。
実施例１．標的化ナノ粒子の調製及び特性評価。
材料及び方法：ポリ（乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ））ＮＰを、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５；５９：１７２－８１に記載されているように調製した。簡潔に述べると、６０ｍｇのＰＬＧＡ（Ｄｕｒｅｃｔ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）をガラス試験管中で３ｍｌのクロロホルムに溶解した。２．５μｇのＴＧＦ－β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ）の存在下または非存在下で、担体フリーの１．２５μｇのＩＬ－２を含有する水溶液２００μｌを滴加すると、一次エマルジョンが得られ、これを超音波処理し、４ｍｌの４．７％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び０．６２５ｍｇ／ｍｌのアビジン－パルミチン酸複合体を含有し、連続的にボルテックスされたガラス試験管へ滴加した。得られた二重エマルジョンを氷浴中で超音波処理し、その後、２００ｍｌの０．２５％ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）を含有するビーカーに移した。粒子を室温で３時間撹拌して硬化させ、その後、１８，０００ｇでペレット化し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水へ再懸濁するサイクルにより、３回洗浄した。洗浄したＮＰを液体窒素中で急速冷凍し、凍結乾燥することで、使用するまで－２０℃で長期保存できるようにした。ＮＰ調製物を、物理的特性、封入品質、及び放出速度について検査した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏによる動的光散乱を使用して粒度を定量化した。ＮＰは、２４５．３±２．２ｎｍの流体力学直径を有し、多分散性指数が低いことが判明したが、これは、比較的狭い粒度分布を有する均一なＮＰ集団であることを示している。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でＮＰを破壊した後、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキットにより、また、上清を分析することによって、サイトカインの封入及び放出をチェックした。細胞標的化については、ＮＰをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、１ｍｇのＮＰに対して５～１０μｇの比率で、ビオチン化抗ＣＤ２抗体（クローンＲＭ２－５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共に、使用前に１０分間インキュベートした。
【0226】
最初に、抗ＣＤ４抗体でＮＰをコーティングすることによってＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とし、また、ＣＤ２を介したＩＬ－２及びＴＧＦ－βによるｅｘ ｖｉｖｏでのＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの誘導が報告されていることから（Ｈｏｒｗｉｔｚ，ＤＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２０１９；７１：６３２－６４０）、抗ＣＤ２抗体でコーティングすることによってＣＤ８＋Ｔ細胞を標的としたＮＰを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇ誘導のためのＴ細胞へのＩＬ－２及びＴＧＦ－βの標的送達の治療効果を調べた。ＣＤ４ｒｅｇは強力な抑制効果を有するが、単独及びＣＤ４＋ Ｔｒｅｇとの併用の両方でのＳＬＥにおけるＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの防御効果（Ｄｉｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ，２０１０；９：５６０－８；Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５；１７５：７７２８－３７）。
【0227】
標的化のために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でＮＰを標的濃度で新たに調製し、使用の１０分前に１ｍｇのＮＰに対して抗体２μｇの濃度比で、ビオチン化した標的化抗体と反応させた。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏによる動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、ＮＰの粒度を定量化した。サイトカインの封入と放出を、ＤＭＳＯ中で粒子を破壊した後に、または放出試験アリコートの上清分析によって、ＢＤ ＯＰＴＥＩＡ（商標）ＥＬＩＳＡキットによって測定した。放出アッセイでは、ＰＢＳ中のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ１２７の１ｗｔ／ｖ％溶液を放出緩衝液として使用して、放出されたサイトカインの安定化を促進し、チューブ表面への結合及び捕捉／検出抗体の結合能力の損失を防止する。放出アッセイは、放出緩衝液中の粒子の１ｍｇ／ｍｌアリコートを使用して実施した。各時点で、アリコートを微量遠心分離機で遠心分離し、上清を粒子ペレットから単離した。次いで、ペレットを次の時点まで新鮮な放出緩衝液中に再懸濁した。上清試料は研究の終了まで凍結し、その時点でＥＬＩＳＡ分析を実施した。
【0228】
結果：
サイトカイン封入ＮＰを、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５；５９：１７２－８１及びＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１１；８：１４３－５２に記載されているように、物理的特性、封入品質、及び放出速度の検査を通じて特性評価した。動的光散乱により、ＮＰは、２４５．３＋２．２ｎｍの平均±ＳＤの流体力学的直径を有し、多分散性指数が低いことが判明したが（平均±ＳＤ：０．０６±０．０１）、これは、比較的狭い粒度分布を有する均一なＮＰ集団であることを示している。ＤＭＳＯを使用してＮＰを破壊した後、ＥＬＩＳＡによってサイトカインの封入を測定した。サイトカイン標準を使用して標準曲線を作成したが、すべてのウェルに、５％容量／容量のＤＭＳＯ及び適切な濃度の空のＮＰが含まれるように補充した。本方法を使用して、ＮＰには、平均±ＳＤで、ＮＰ１ｍｇあたり７．４±０．４ｎｇのＴＧＦ－β及び１．９±０．１ｎｇのＩＬ－２が含まれていることがわかった。ＴＧＦ－βについては、封入効率（％）は１７．８±１．１であった。ＩＬ－２については９．１±０．４であった。
サイトカイン封入ＮＰを、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５；５９：１７２－８１及びＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１１；８：１４３－５２に記載されているように、物理的特性、封入品質、及び放出速度の検査を通じて特性評価した。動的光散乱により、ＮＰは、２４５．３＋２．２ｎｍの平均±ＳＤの流体力学的直径を有し、多分散性指数が低いことが判明したが（平均±ＳＤ：０．０６±０．０１）、これは、比較的狭い粒度分布を有する均一なＮＰ集団であることを示している。ＤＭＳＯを使用してＮＰを破壊した後、ＥＬＩＳＡによってサイトカインの封入を測定した。サイトカイン標準を使用して標準曲線を作成したが、すべてのウェルに、５％容量／容量のＤＭＳＯ及び適切な濃度の空のＮＰが含まれるように補充した。本方法を使用して、ＮＰには、平均±ＳＤで、ＮＰ１ｍｇあたり７．４±０．４ｎｇのＴＧＦ－β及び１．９±０．１ｎｇのＩＬ－２が含まれていることがわかった。ＴＧＦ－βについては、封入効率（％）は１７．８±１．１であった。ＩＬ－２については９．１±０．４であった。
【0229】
ＴＧＦ－β及びＩＬ－２を充填したＮＰからの両サイトカインの放出、及びＩＬ２のみを含有するＮＰからのこのサイトカインの放出は、最初の２４時間の間にバースト放出を示し、その後、試験した１４日間の経過にわたって、より緩やかでより持続的な放出特性を示した。
【0230】
実施例２．ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有するナノ粒子を用いたマウスにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞の誘導条件
材料及び方法：Ｔ細胞増殖のために、１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞から選別したＣＤ３＋Ｔ細胞（磁気ビーズでネガティブ選択した）を、プレートに結合させた抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の非存在下（対照）または存在下で、７２時間、完全ＲＰＭＩ培地（１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０％熱不活化ウシ胎仔血清）中で、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、２×１０５細胞／ウェルの濃度で３７℃にて培養した。Ｔｒｅｇ細胞は、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する細胞として定義した。
材料及び方法：Ｔ細胞増殖のために、１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞から選別したＣＤ３＋Ｔ細胞（磁気ビーズでネガティブ選択した）を、プレートに結合させた抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の非存在下（対照）または存在下で、７２時間、完全ＲＰＭＩ培地（１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０％熱不活化ウシ胎仔血清）中で、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、２×１０５細胞／ウェルの濃度で３７℃にて培養した。Ｔｒｅｇ細胞は、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する細胞として定義した。
【0231】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０を使用して、統計解析を実施した。パラメトリック検定は、独立ｔ検定を使用して行い、ノンパラメトリック検定は、データが正規分布していない場合に使用した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【0232】
結果：
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞を同時に誘導するために、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入したＰＬＧＡ ＮＰを、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５；５９：１７２－８１で使用されていた量で使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ細胞を誘導するＩＬ－２及びＴＧＦ－βを傍分泌的にＴ細胞に送達するために、抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体でコーティングされたスカラー用量のＮＰを、培養物中のマウス精製ＣＤ３＋細胞に添加した。５０μｇ／ｍｌのＮＰによる抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の出現頻度の有意な増加を促進した。この刺激は、Ｔｒｅｇを最大限に増加させるために必要であった。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞を同時に誘導するために、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入したＰＬＧＡ ＮＰを、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５；５９：１７２－８１で使用されていた量で使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ細胞を誘導するＩＬ－２及びＴＧＦ－βを傍分泌的にＴ細胞に送達するために、抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体でコーティングされたスカラー用量のＮＰを、培養物中のマウス精製ＣＤ３＋細胞に添加した。５０μｇ／ｍｌのＮＰによる抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の出現頻度の有意な増加を促進した。この刺激は、Ｔｒｅｇを最大限に増加させるために必要であった。
【0233】
実施例３：ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有するナノ粒子を用いた、マウスにおける治療用ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ誘導のためのｉｎ ｖｉｖｏ条件の確立。
材料及び方法：
マウス：Ｃ５７Ｂｌ／６、ＤＢＡ／２、及びＢＡＬＢ／ｃマウス（ＤＯ１１．１０、Ｈ２ｄを含む）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスをモニタリングして、フローサイトメトリーにより循環Ｔｒｅｇの出現頻度を測定した。血清試料は、眼窩後採血によって採取した。マウスは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の特定の病原体フリーの施設で飼育した。実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
材料及び方法：
マウス：Ｃ５７Ｂｌ／６、ＤＢＡ／２、及びＢＡＬＢ／ｃマウス（ＤＯ１１．１０、Ｈ２ｄを含む）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスをモニタリングして、フローサイトメトリーにより循環Ｔｒｅｇの出現頻度を測定した。血清試料は、眼窩後採血によって採取した。マウスは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の特定の病原体フリーの施設で飼育した。実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【0234】
フローサイトメトリー：上記のように実施した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または脾細胞を標準手順に従って単離し、単一の細胞懸濁液を、蛍光色素をコンジュゲートした抗体の組み合わせを使用した表現型分析に使用した。Ｆｃブロッキング後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、及びＧｒ－１に対する蛍光標識抗マウス抗体（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）またはアイソタイプ対照抗体を染色に使用し、その後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータ取得し、続いてＦＬＯＷＪＯ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して分析した。ＦｏｘＰ３の細胞内染色では、まず細胞表面マーカーの発現について細胞を染色し、その後、固定／透過処理を行い、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３染色キットを使用して、製造元の説明書に従ってＦｏｘＰ３を染色した。
【0235】
８～１０週齢のＢＤＦ１マウス由来のＰＢＭＳを、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）顆粒球（Ｇｒｌ）、単球（ＣＤ１１ｂ＋）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）、及びＣＤ３＋Ｔ細胞（さらにＣＤ８＋細胞及びＣＤ４＋細胞として分類される）としてゲーティングした。
【0236】
抗原性刺激に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞応答を、オボアルブミン３２３－３３９ペプチド（ＯＶＡ３２３－３３９、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で実施した。ＤＯ１１．１０マウス由来の脾細胞を、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入したＮＰ（抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体でコーティングされているか、またはコーティングされていない）の存在下または非存在下で、１０μｇ／ｍｌのＯＶＡ３２３－３３９と共に培養した。Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６上で細胞を回収する前の最後の１６時間に３Ｈ－チミジンを添加した。刺激指数は、抗原刺激したウェルの１分あたりの平均カウント数（ｃｐｍ）／培地のみのウェルの平均ｃｐｍとして計算した。これらの研究は、寛容原性ＮＰが従来の抗原に対するＴ細胞応答を変化させるかどうかを調べるために実施した。
【0237】
統計解析は、前述のように実施した。
【0238】
結果：
ＮＰの総量（すべてＩＬ－２及びＴＧＦβを封入する）を一定に保持し、抗ＣＤ２／ＣＤ４でコーティングされたＮＰでの処置を、抗ＣＤ２抗体のみまたは抗ＣＤ４抗体のみでコーティングされたＮＰでの処置と比較した。充填投与の後、最初の１２日間は３日または６日ごとに１．５ｍｇのＮＰを注射した。１週間後、両群のマウスにさらに１．５ｍｇのＮＰを投与した。２１日目の循環ＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ細胞の分析により、３日ごとにＮＰを投与された動物のみがＴｒｅｇ細胞の有意な増加を示したことが明らかになった。
ＮＰの総量（すべてＩＬ－２及びＴＧＦβを封入する）を一定に保持し、抗ＣＤ２／ＣＤ４でコーティングされたＮＰでの処置を、抗ＣＤ２抗体のみまたは抗ＣＤ４抗体のみでコーティングされたＮＰでの処置と比較した。充填投与の後、最初の１２日間は３日または６日ごとに１．５ｍｇのＮＰを注射した。１週間後、両群のマウスにさらに１．５ｍｇのＮＰを投与した。２１日目の循環ＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ細胞の分析により、３日ごとにＮＰを投与された動物のみがＴｒｅｇ細胞の有意な増加を示したことが明らかになった。
【0239】
抗ＣＤ４抗体でコーティングされたＮＰは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞を増殖させたが、抗ＣＤ２／ＣＤ４によるＮＰコーティングはこの効果を増強した。重要なことに、ＮＰ上に抗ＣＤ２抗体及び抗ＣＤ４抗体を独立してコーティングすることはＴｒｅｇ細胞の増殖に効果的ではないため、コーティング抗体は同じＮＰに結合させる（共コーティングする）必要がある。
【0240】
抗ＣＤ２抗体でコーティングされたＮＰもＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘＰ３発現を増強したが、抗ＣＤ２／ＣＤ４でコーティングされたＮＰとは異なり、本実験ではＣＤ２５発現を有意に増加させることができなかった。しかしながら、抗ＣＤ２抗体でコーティングされたＮＰは、ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を有意に増殖させ、抗ＣＤ２抗体でコーティングされたＮＰによって誘導されたＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合は、抗ＣＤ２／ＣＤ４でコーティングされたＮＰから誘導された細胞の割合よりも高かった。これは、共コーティングされた系における抗ＣＤ２抗体のＮＰごとのコーティングが低下し、ＣＤ４＋Ｔ細胞への競合結合が増加したためである可能性がある。Ｔｒｅｇ細胞の増殖のためのこの処置は、抗原刺激に対するＴ細胞全体の応答性に影響を与えなかったが、これは、ＣＤ２またはＣＤ４共受容体へのＮＰの結合がＴ細胞受容体を介した活性化を妨げないことを示している。
【0241】
実施例４：ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有するナノ粒子を用いた、狼瘡を有するＢＤＦ１マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ研究。
材料及び方法
フローサイトメトリー及び統計解析は、前述のように実施した。
材料及び方法
フローサイトメトリー及び統計解析は、前述のように実施した。
【0242】
マウス：雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス及び雄ＤＢＡ／２マウスを、（Ｃ５７Ｂｌ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１（ＢＤＦ１）マウスを生成するために飼育した。Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４；１７２：１５３１－９に従って、８週齢で親ＤＢＡ／２細胞の移入によってＢＤＦ１マウスに疾患の発症を誘発した。レシピエントマウスでは、宿主の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原の認識により、リンパ球過形成と抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）抗体の産生亢進が引き起こされ、その後、免疫複合体糸球体腎炎が引き起こされる。ＤＢＡ／２細胞の移入後、ＢＤＦ１マウスに、対照としてビヒクル、またはＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入し、コーティングしないまま（対照）とするか、または抗ＣＤ２及び抗ＣＤ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたＰＬＧＡ ＮＰを腹腔内（ＩＰ）注射した。マウスを隔週でモニタリングして、フローサイトメトリーによって循環Ｔｒｅｇ細胞の出現頻度を測定した。血清試料を眼窩後採血によって採取した。タンパク尿を、ＡＬＢＵＳＴＩＸ（登録商標）ストリップ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して測定した。マウスは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の特定の病原体フリーの施設で飼育した。実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【0243】
抗二本鎖ＤＮＡ抗体のＥＬＩＳＡ：抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）抗体レベルのＥＬＩＳＡ測定は、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのキットを使用し、製造元の説明書に従って実施した。光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、４５０ｎｍで測定した。
【0244】
組織学：Ｌｏｕｒｅｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１６；１１３：１０６３７－４２に従って、腎臓切片（厚さ４μｍ）をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。糸球体活動スコア及び尿細管間質活動スコアによる病理学的変化の評価では、０～３のスケールを使用して切片を盲検法でスコア付けした（０＝病変なし、１＝糸球体の＜３０％に病変あり、２＝糸球体の３０～６０％に病変あり、及び３＝糸球体の＞６０％に病変あり）。糸球体活動スコアには、糸球体の増殖、核崩壊、フィブリノイド壊死、炎症細胞、細胞性半月体、及びヒアリン沈着物が含まれる。尿細管間質活性スコアには、間質炎症、尿細管細胞壊死及び／または平坦化、ならびに尿細管内腔の上皮細胞またはマクロファージが含まれる。生のスコアを平均して各特徴の平均スコアを取得し、平均スコアを合計して平均スコアを取得し、そこから複合腎生検スコアを取得した（Ｆｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２００７；５６：１９４５－５３）。間接的な免疫蛍光研究では、切片を冷アセトンで５分間固定し、洗浄し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングした後、ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。
【0245】
結果：狼瘡を有するＢＤＦ１マウスにおいて治療プロトコルに従った場合、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入した抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体でコーティングされたＮＰでの処置により、循環ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞の数が増加した。合計量７．５ｍｇのＮＰを使用した場合、狼瘡疾患の症状に対する防御が観察された。
【0246】
ＢＤＦ１マウスでは、ＤＢＡ／２細胞の移入後の疾患の発症は急速であり、移入後２週間までに抗ＤＮＡ自己抗体が出現し、６週間までに免疫複合体糸球体腎炎によるタンパク尿が出現する（Ｖｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ，１９８８；９：２０７－１３；Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５；１５５：２３９６－４０６；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４；１７２：１５３１－９）。マウスには、１９日間にわたって７．５ｍｇの抗ＣＤ２／４コーティングされたＮＰを投与した。スケジュールを図１Ａ）に示す。これらのＮＰは、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇを顕著に増加させた（図１Ｂ～１Ｃ）。この用量スケジュールは、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞の約２倍の増加、及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞の約４倍の増加と関連していたが、他の免疫細胞集団の出現頻度の変化とは関連しておらず、２週目及び４週目での抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の産生における統計的に有意な減少（図１Ｅ（ｐ＜０．０５）及びタンパク尿の減少（図２Ｃ）ｐ＜０．０５と関連していた。
【0247】
ＩＬ－２／ＴＧＦ－βを封入した７．５ｍｇのＮＰによってＢＤＦ１マウスを処置したところ、非コンジュゲートＮＰを投与したＢＤＦ１マウスと比較して、循環免疫細胞の複数の集団の出現頻度に有意な変化は生じなかった。
【0248】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３発現Ｔｒｅｇ細胞の増殖、ならびに抗ＤＮＡ自己抗体及びタンパク尿の発症からマウスを防御するために、ＮＰは標的化される必要があった。同等の用量で投与したＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有する非コーティングＮＰには、これらの影響はまったくなかった。ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入したＴ細胞標的化ＮＰで処置したマウスにおけるタンパク尿の減少は、糸球体の保存とＩｇＧ沈降の減少を示す腎臓の組織病理学的変化に反映されていた。逆に、対照マウス（非標的化ＮＰで処置したマウスを含む）は、ループス腎炎に特徴的な糸球体細胞過形成及び増殖性変化、ならびに腎疾患スコアの悪化に関連するＩｇＧ沈降を示した。
【0249】
要約すると、マウスにおける狼瘡発現を抑制するのに十分なほどｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞の両方を増殖させることができるＮＰを開発した。抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体でコーティングすると、ＮＰは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に結合して、両方の細胞型を、狼瘡を有していないマウスにおいて、及び狼瘡を有するＢＤＦ１マウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができ、その結果、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体レベルが、後者では免疫複合体糸球体腎炎が低下する。
【0250】
いくつかの寛容誘発戦略では、抗ＤＮＡを含む病原性自己抗体の産生を抑制するループスＴｒｅｇ細胞の能力を増強する。これらには、Ｔｒｅｇ細胞の誘導及び増殖、またはＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの両方を誘導する寛容原性ペプチドの投与が含まれる（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｌａ Ｃａｖａｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４；１７３：３５４２－８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７；１７８：７６４９－５７；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５；１７４：３２４７－５５；Ｓｈａｒａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００８；１８１：３２４３－５１；Ｓｃａｌａｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９；２４：ｅ６０３１）。ヒトＳＬＥにおけるＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの機能改善が疾患の寛解と関連していることは知られているが、ＳＬＥにおけるＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの免疫療法の可能性は十分に検討されていない（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２；１８９：２１１８－３０；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９；１８３：６３４６－５８）。ＩＬ－２及びＴＧＦ－βは、ＣＤ８＋細胞がＴｒｅｇになるように誘導することができ（Ｈｉｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９４；１８０：１９３７）、ヒト化マウスにおいて防御活性を有する（Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３；１４９：４５０－６３）。ＢＤＦ１マウスの狼瘡様疾患を抑制するために、ｅｘ ｖｉｖｏで誘導されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの両方を、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βと併用した場合、その治療効果は、マウスをＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ単独で処置した場合よりもはるかに強力であり、ループス自己免疫の抑制におけるＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの重要な役割を示している（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４；１７２：１５３１－９）。
【0251】
機構的に、観察された抗ＣＤ２抗体と抗ＣＤ４抗体の相互作用は、相互に排他的ではない２つの可能性を示している：１）標的細胞へナノスケール試薬と共に抗体を投与することにより、多価性がもたらされ（すなわち、標的に抗体の複数のコピーが結合することにより、結合力が増加し、したがって薬理学的効果が高まる）、２）ＩＬ－２及びＴＧＦ－βの標的化された近位放出により、Ｔｒｅｇの局所的増殖が促進される。これに関連して、ＮＰから放出される封入剤は、標的細胞からナノスケールの距離内で最も効果的である。
【0252】
細胞界面の「平坦化」は、粒子との相互作用について以前に数学的にモデル化されており、細胞－粒子界面におけるサイトカイン蓄積の大きさが有意に増大することが示されている（Ｌａｂｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５；１１：１０１９－２８；Ｌａｂｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｓｃｉ，２０１２；７４：１１４－１２３；Ｓｔｅｅｎｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１１；２８６：３４８８３－９２）。この「放出後のパラクリン作用」現象は、抗ＣＤ２及び抗ＣＤ４抗体を介した標的化、したがってライゲーションにより、粒子とＴ細胞をナノスケールのリガンド受容体距離内に近づけ、高い有効性で細胞に作用することができるサイトカインの局所濃度を増加させることができることを示唆している（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１５；５９：１７２－８１）。この現象は人工抗原提示の系で検証されており、ＮＰに封入されたＩＬ－２が１０００倍高濃度の可溶性ＩＬ－２と同等のＴ細胞刺激効果を有することが示された。さらに、ＮＰは、内在性の潜在型ＴＧＦ－βを活性型に変換することができる局所的な酸性微小環境を作り出し、これにより、ＮＰ内のＴＧＦ－β貯蔵量が枯渇した後でも、Ｔｒｅｇの増殖を延長する際にＩＬ－２を増強する可能性がある。総合すると、これらの特徴は、微量の用量で局所レベルでサイトカインを送達し、高用量に関連する毒性を軽減し、その一方で高い生物活性を維持する、ナノ粒子送達系の使用における利点を示す。
【0253】
ＣＤ２はＮＫ細胞でも発現するため、狼瘡様症候群の重症度に対するＮＫ細胞枯渇の影響を測定した。記号は、マウスの様々な群を表す（群あたりｎ＝６）。エラーバーは、平均値±ＳＥＭを示す。図１Ｂは、処置後の指定の時点での末梢ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ（図１Ｂ）及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ（図１Ｃ）の割合を示す。図１Ｂ及び１Ｃは、ＮＫ細胞の枯渇により、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを充填し、抗ＣＤ２／ＣＤ４抗体で修飾されたＮＰによって誘導されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの増殖が減少することを示している。空のＮＰとサイトカインを充填したＮＰの比較において、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０５、ＮＫ細胞を枯渇させたマウス（抗アシアロＧＭ１、ａ－ａｓＧＭ１）または枯渇させなかったマウスの比較において、§Ｐ＜０．０４。これらの研究により、ＮＫ細胞がＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇの増加をサポートし、寛容原性ＮＰの防御効果に密接に関与していることが明らかになった。図１Ｄは、図１Ｂ～Ｃのマウスについて示された時点でのタンパク尿を示す。ＮＫ細胞の枯渇は、ＮＰの防御効果を消失させるだけでなく、腎疾患を有意に悪化させた（ＮＫ細胞を枯渇させたサイトカイン充填ＮＰで処置したマウス（ａａＧＭ１）と枯渇させなかったマウスとの比較にいて、＊＊Ｐ＜０．００５）。これらの結果は、ＮＫ細胞が、ＢＤＦ１マウスにおけるＮＰの寛容原性活性を調節することを示している。
【0254】
要約すると、抗ＣＤ２／４でコーティングされたＮＰの治療効果はＮＫ細胞に依存していた。ＮＫ細胞の枯渇は、Ｔｒｅｇの増加とその防御効果を阻害するだけでなく、疾患の重症度も増加させた。これらの結果は、防御的なＮＫ細胞の役割に関するさらなる研究を促した。ＮＫは、細胞傷害特性に加えて免疫調節特性も有する）。ＮＫ細胞は、細胞表面に高レベルのＣＤ２分子を発現する。抗ＣＤ２は、ＮＫ細胞を刺激してＴＧＦ－βを産生させ（Ｏｈｔｓｕｔｋａ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：２５３９－４５，１９９８）、ＴＧＦ－βを介したＢ細胞による抗体産生を阻害することができる。抗ＣＤ２でコーティングされたａＡＰＣは、可溶性抗ＣＤ２よりもはるかに持続的な効果を有する可能性がある。したがって、これらのａＡＰＣは、強力な抑制性の調節性ＮＫ細胞を誘導し、維持させる可能性がある。
【0255】
実施例５：ＢＤＦ１マウスをループス腎炎から防御する際の、標的化寛容原性人工抗原提示ナノ粒子（ａＡＰＣ）によって誘導されるＴＧＦ－β依存性ＮＫ細胞の役割。
材料及び方法：
ＢＤＦ１マウスは、前述の実施例と同じである。
材料及び方法：
ＢＤＦ１マウスは、前述の実施例と同じである。
【0256】
ＮＰを、コーティングされないまま（対照）とするか、または実施例４に示される実験の継続として、ビオチン化抗ＣＤ２抗体及びビオチン化抗ＣＤ４抗体で修飾した（クローンＧＫ１．５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。当初、それらにはＩＬ－２とＴＧＦ－βが充填されていた。しかしながら、抗ＣＤ２がＮＫ細胞によるＴＧＦ－βの産生を誘導することができるため、後の実験では抗ＣＤ２のみをコーティングし、ＩＬ－２のみを充填したＮＰを使用した。
【0257】
標準プロトコルに従って、１×１０８個のＤＢＡ／２脾細胞をＢＤＦ１マウスに移入することにより、８週齢において、狼瘡様疾患を誘発した。ＤＢＡ／２脾細胞の移植後、個々のＢＤＦ１マウスにビヒクル（対照として）またはＩＬ－２／ＴＧＦ－βもしくはＩＬ－２を充填した１ｍｇ ＰＬＧＡ ＮＰを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。以前と同様に、ＮＰ投与のプロトコルは、以下のとおりであった：０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、及び１９日目。
【0258】
一連の実験において、１００μｌのＮＫ枯渇抗アシアロＧＭ１または対照ウサギ血清（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を４日間隔でマウスに腹腔内投与した。ＦＩＴＣ標識抗ＮＫ１．１抗体（クローンＰＫ１３６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したフローサイトメトリーによって、９０％を上回るＮＫ枯渇の効力が評価された。循環免疫細胞のフローサイトメトリー、ならびに血清抗ｄｓＤＮＡ抗体（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｌ．，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）及びクレアチニン（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のＥＬＩＳＡ測定を含む分析のために、眼窩後採血によって得られた血液を使用して週ごとにマウスをモニタリングした。タンパク尿は、Ａｌｂｕｓｔｉｘストリップ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｒｖｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）を使用して測定した。一連の実験では、１００μｇの抗ＴＧＦ－μｇ抗体（クローン１Ｄ１１．１６．８、ＴＧＦ－βの３つのアイソフォームすべてに対する中和抗体（１５．２時間の循環中半減期を有する））または同量のアイソタイプ対照抗体（クローンＰ３．６．２．８．１）（いずれもＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ）を、０日目から２週間にわたって、個々のマウスに１日おきに腹腔内投与した。マウスを用いたすべての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【0259】
フローサイトメトリー：末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または脾細胞を標準手順に従って単離し、単一細胞懸濁液を赤血球溶解後の表現型分析に使用した。Ｆｃブロッキング後、ＮＫ１．１（ＦＩＴＣ標識）またはＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ（ＰＥ標識）に対する抗マウス抗体（クローン２８－８－６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、またはアイソタイプ対照抗体を染色に使用した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でデータ取得した後、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用してデータ解析を実施した。
【0260】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション及びリアルタイムＰＣＲ：ｓｉＲＮＡトランスフェクションのプロトコル。簡潔に述べると、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）のＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用して単離した未処理のＮＫ細胞を、１２ウェルプレートで１０％ウシ胎仔血清を含有する完全培地に播種し、その２４時間後に、陽性対照としてＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡと、マウス、ラット、またはヒトの遺伝子配列と有意な配列類似性を有しない陰性対照ｓｉＲＮＡも含むＳｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＩＩキットを使用して、マウスＴｇｆｂ１に対するＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を移入した（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＩＩキット）。ｓｉＰＯＲＴアミン形質移入薬をＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、追加の対照として単独で使用するか、インキュベート前に１０ｎＭのｓｉＲＮＡ（Ｔｇｆｂ１または対照）と室温で３０分間混合した。選別されたＮＫ細胞をｓｉＲＮＡ複合体でトランスフェクトした後、ＢＤＦ１マウスに移入した。養子移入の前にｓｉＲＮＡトランスフェクションの効率を制御するために、少量のアリコートを、全ＲＮＡの単離のためにＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解した。１００ｎｇのＲＮＡを、記載されているプライマーとプローブの組み合わせを使用して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのワンステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と共に使用した。相対定量のために、全ＲＮＡを使用して各プライマー及びプローブセットの標準曲線を作成した。ＧＡＰＤＨは、各実験セットで内在性対照として使用した。すべての試料は、２つ組で実行した。
【0261】
統計解析：統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０）を使用して実施した。パラメトリック検定は、スチューデントｔ検定を使用して実施し、ノンパラメトリック検定は、データが正規分布していない場合に使用した。０．０５未満のＰ値を、有意であるとみなした。
【0262】
結果
ＮＫ細胞は、ナノ粒子で処置したＢＤＦ１狼瘡マウスにおいて増殖し、宿主由来である
ＮＫ細胞は、ナノ粒子で処置したＢＤＦ１狼瘡マウスにおいて増殖し、宿主由来である
【0263】
図２Ａ～２Ｄは、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを充填したＣＤ２標的化ＮＰでの処置後、狼瘡様疾患を有するＢＤＦ１においてＮＫ細胞が用量依存的増殖を示すことを実証している。対照は、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを充填した非コーティングＮＰ及び空の非コーティングＮＰであった。図３Ａは、個々の未処置ＢＤＦ１マウス（「非ＳＬＥ」、四角）、またはＩＬ－２及びＴＧＦ－βを封入した異なる用量のＮＰで処置した狼瘡ＢＤＦ１マウス（丸 空のＮＰ、三角 ５ｍｇ、菱形 １０ｍｇ、逆三角 ２０ｍｇ）におけるＰＢＭＣ中の循環ＮＫ細胞の割合を示す。図２Ｂ及び２Ｄは、同じ処置を受けたマウスにおけるＮＫ細胞の総数を、平均＋ＳＥと共に示す。空のＮＰで処置したＳＬＥ ＢＤＦ１マウスとの比較におけるＰ＝＊＜０．００５、＊＊０．０００５。
【0264】
図３は、ＮＰでの処置後にＢＤＦ１狼瘡マウスにおいて増殖するＮＫ細胞が宿主由来であることを示す（Ｈ－２Ｋｂ＋）。増殖したＮＫ細胞集団が宿主（ＢＤＦ１マウス）に由来するのか、ドナー（ＤＢＡ／２ マウス）に由来するのかを理解するために、フローサイトメトリーを使用して、増殖したＮＫ細胞上のＨ－２分子の表面発現を評価した。レシピエントＢＤＦ１狼瘡マウスの親のハプロタイプは、Ｈ－２ｂ（Ｃ５７ＢＬ／６）及びＨ－２ｄ（ＤＢＡ／２）であるため、ＤＢＡ／２マウスから移入されたＨ－２ｄ脾細胞は、抗Ｈ－２ｂ抗体で染色されない。したがって、Ｈ－２ｂ ＮＫ細胞は、宿主由来のもののみでなければならない。フローサイトメトリー分析からは、ＮＰ投与により２週間でＨ－２ｂ（宿主）ＮＫ細胞の数が増加し、４週間でさらに増加したことが示された（図２）。ＮＰを投与しなかったＢＤＦ１マウスでは、循環 Ｈ－２ｂ細胞の増加も、Ｈ－２ｄドナーＮＫ細胞の増加もなかった。したがって、ＮＰ処置ＢＤＦ１狼瘡マウスにおけるＮＫ細胞の増殖は、宿主由来ＮＫ細胞の（相対及び絶対）数の増加の結果であった。
【0265】
ＮＰ媒介性のＮＫ細胞の増殖は、ＢＤＦ１マウスにおける抗ｄｓＤＮＡ抗体の抑制及び狼瘡の疾患症状の軽減と関連する。
【0266】
狼瘡の病因における自己抗体の中心的な役割、及びＮＫ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＢ細胞の抗体産生を抑制することができるという発見があったことから、ＢＤＦ１狼瘡マウスにおける自己抗体レベルに対するＮＫ細胞の考えられる影響を調べた。さらに、抗ＣＤ２抗体がＮＫ細胞によるＴＧＦ－βの産生を誘導することから、ＮＫ細胞によるこのサイトカインの産生がＮＰに封入されたサイトカインの代わりとなる可能性について評価した。ＩＬ－２のみを含有するＮＰを用いた実験では、ＮＫ細胞は、ＮＰを投与したＢＤＦ１狼瘡マウスの自己抗体の血清レベルに顕著な影響を与えた（図２Ａ～２Ｃ）。
【0267】
図１Ｅ～１Ｇは、ＢＤＦ１狼瘡マウスにおけるＮＫ細胞の枯渇が、ＩＬ－２を充填したＣＤ２（ＮＫ）標的化ＮＰの防御効果を無効化し、また、血清抗ｄｓＤＮＡ自己抗体レベルの増加と関連していたことを示す。図１Ｅ～１Ｇは、ＩＬ－２を充填したＣＤ２（ＮＫ）標的化ＮＰによるＢＤＦ１マウスの処置が抗ＤＮＡ自己抗体の抑制と関連していることを示す。抗アシアロＧＭ１の投与によるこれらのマウスからのＮＫ細胞の枯渇は、ＮＰの防御効果を無効化するだけでなく、血清抗ｄｓＤＮＡ自己抗体のレベルの増加にも関連している。記号：丸 ＮＰＳなしだがＰＢＭＣあり、四角 空の非標的化ＮＰ、三角 ＮＫ標的化ＮＰＳ、ならびに黒三角 ＮＫ標的化ＮＰＳ及び抗アシアロＧＭ１（抗ｄｓＤＮＡレベル（吸光度）に対してプロットした）。個々のマウス及び群の平均値のモニタリング結果を、ＳＬＥの誘導（時間０）後の０週目（図１Ｅ）、２週目（図１Ｆ）、及び４週目（図１Ｇ）に報告する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0268】
図４Ａは、ＣＤ２（ＮＫ）標的化ＮＰで処置したＢＤＦ１マウスのループス腎炎からの防御がＮＫ細胞に依存することを示す。図４Ａは、ＮＫ細胞の枯渇がＢＤＦ１狼瘡マウスのタンパク尿を加速することを示している。０日目（ＳＬＥの誘導）から２週間にわたって、４日ごとに１００μｌの抗アシアロＧＭ１を投与することにより、ＮＫ細胞を枯渇させた。マウス（群あたりｎ＝６）をＳＬＥの誘導後８週間モニタリングした。データは、平均値＋ＳＥを示す；ＮＫ枯渇抗アシアロＧＭ１の存在下または非存在下で、ＮＫ細胞に標的化されたＮＰを投与したＢＤＦ１マウスの４週目と６週目における比較、及び空の非標的ＮＰを投与したマウスとＮＫ細胞を枯渇させたマウスの４週目における比較で、＊Ｐ＜０．０１。
【0269】
ＢＤＦ１狼瘡マウスにおける腎臓の症状に対して有益な効果を有するＴＧＦ－β依存性ＮＫ細胞の同定
【0270】
ＮＫ細胞は、２つの主要な群に分けることができる。ほとんどはキラー細胞であるが、主にサイトカインを産生するサブセットも存在する。ほとんどは大量のインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を産生するが、一部にはＩＬ－１０またはＴＧＦ－βを産生するものが記載されている。ＴＧＦ－βがＢＤＦ１狼瘡マウスにおける自己免疫応答の抑制に寄与するかどうかを調べるために、ＢＤＦ１マウスにおけるループス腎炎に対するＴＧＦ－β阻害の効果を試験した。これらの実験での読み取り値は、血清クレアチニンレベルの測定であった。血清クレアチニンの増加は、腎臓損傷の早期指標であり、腎不全及びループス腎炎における末期腎疾患への進行を反映している。抗ＴＧＦ－β抗体と共にＮＫ標的化ＮＰを投与したＢＤＦ１狼瘡マウスと、無関係な対照抗体を投与したマウスとの比較により、ＴＧＦ－βの阻害が血清クレアチニンレベルの有意な増加と関連していることが示された（図４Ｂ）。ＮＫ細胞の関与する役割は、抗アシアロＧＭ１でＮＫ細胞を枯渇させたＢＤＦ１狼瘡マウスにおける血清クレアチニンの上昇の発見によって確認された（図４Ｂ）。抗アシアロＧＭ１抗体と抗ＴＧＦ－β抗体の組み合わせが血清クレアチニンレベルに影響を及ぼさなかったという発見は、共通のメカニズムを示唆していた（図４Ｂ）。
【0271】
ＮＫ細胞がＢＤＦ１マウスを腎疾患から防御するＴＧＦ－βの供給源である可能性を試験するために、マウスをＮＫ標的化ＮＰで処理し、次いでループス腎炎を発症しているマウスへの養子移入のために選別した。一部のＮＫ細胞のＴＧＦ－β産生能力は、ｓｉＲＮＡ技術によって無効化された。対照では、スクランブルｓｉＲＮＡを転写させた。ＴＧＦ－βが十分な２．５×１０６個のＮＫ細胞をＢＤＦ１狼瘡マウスに養子移入すると、血清クレアチニンレベルは上昇せず、マウスは腎疾患から防御された（図４Ｃ）。同数のＧＦ－β欠損（ＴＧＦ－β ｓｉＲＮＡ）ＮＫ細胞を投与したＢＤＦ１マウスには防御は存在しなかった（図４Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＢＤＦ１マウスにおけるＮＫ細胞の疾患防御効果がＴＧＦ－β依存性であることを示している。
【0272】
実施例６：ａＡＰＣによるヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの誘導のための条件の確立
材料及び方法
ＰＬＧＡナノ粒子の調製：ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子（ＮＰ）を上記のように調製した。調製後、物理的特性、封入品質、及び放出速度の検査を通じて、ＮＰを特性評価した。動的光散乱により、ＮＰは、２４５±２ｎｍの平均±ＳＤ流体力学的直径を有し、多分散性指数が低いことが判明し、これは、比較的狭い粒度分布を有する均一なＮＰ集団であることを示している。ＤＭＳＯを使用してＮＰを破壊した後、ＥＬＩＳＡによってサイトカインの封入を測定し、また、サイトカイン標準を使用して標準曲線を作成したが、すべてのウェルに、５％容量／容量のＤＭＳＯ及び適切な濃度の空のＮＰが含まれるように補充した。ＮＰには、平均±ＳＤで、ＮＰ１ｍｇあたり７．４±０．４ｎｇのＴＧＦ－β及び１．９±０．１ｎｇのＩＬ－２が含まれていた。細胞標的化については、ＰＢＳで希釈したＮＰを、使用前に、関連するビオチン化標的化抗体（抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、またはＣＤ３）と共に、２μｇ抗体／ｍｇ ＮＰの濃度比で、１０分間インキュベートした。
材料及び方法
ＰＬＧＡナノ粒子の調製：ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子（ＮＰ）を上記のように調製した。調製後、物理的特性、封入品質、及び放出速度の検査を通じて、ＮＰを特性評価した。動的光散乱により、ＮＰは、２４５±２ｎｍの平均±ＳＤ流体力学的直径を有し、多分散性指数が低いことが判明し、これは、比較的狭い粒度分布を有する均一なＮＰ集団であることを示している。ＤＭＳＯを使用してＮＰを破壊した後、ＥＬＩＳＡによってサイトカインの封入を測定し、また、サイトカイン標準を使用して標準曲線を作成したが、すべてのウェルに、５％容量／容量のＤＭＳＯ及び適切な濃度の空のＮＰが含まれるように補充した。ＮＰには、平均±ＳＤで、ＮＰ１ｍｇあたり７．４±０．４ｎｇのＴＧＦ－β及び１．９±０．１ｎｇのＩＬ－２が含まれていた。細胞標的化については、ＰＢＳで希釈したＮＰを、使用前に、関連するビオチン化標的化抗体（抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、またはＣＤ３）と共に、２μｇ抗体／ｍｇ ＮＰの濃度比で、１０分間インキュベートした。
【0273】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離：ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって健康な成人ボランティアのヘパリン添加静脈血から調製し、移入実験のために新鮮に使用するか、またはＵ底ウェルプレートにおいて、完全ＡＩＭ Ｖ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で、０．５×１０６／ウェルの濃度で、５日間培養した。ヒト献血者が関与するすべてのプロトコルは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のＩＲＢによって承認された。いくつかの実験では、ＰＢＭＣを、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及びＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍｌ）または抗ＴＧＦ－β（１Ｄ１１）（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ製）と共に培養した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイは、標準プロトコルに従って実施した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ／－ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ ＩｓｏｌａｔｉｏｎキットＩＩを使用して、製造元の説明書に従って、ネガティブ選択によって純度＞９５％に単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞は、同じキットを使用して単離されたＴｒｅｇ（陽性画分）との３日間の共培養においてレスポンダー細胞とした。培養上清を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＦＮ－γ含有量について分析した。分析の１６時間前に３Ｈ－チミジン（１μＣｉ／ウェル）を添加した後、液体シンチレーションカウンターで増殖を評価した。
【0274】
フローサイトメトリー：ヒトＰＢＭＣまたは磁気ビーズで選別された細胞を、以下のＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰまたはＡＰＣをコンジュゲートした抗ヒト抗体を用いて、標準手順に従って染色した：ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ２５（ＭＥＭ－１８１）、ＣＤ１２７（ｅＢｉｏＲＤＲ５）、ＦｏｘＰ３（ＰＣＨ１０１）、またはアイソタイプ対照。すべての抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）においてデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して分析した。
【0275】
マウス：ヒト－マウス異種移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデル。この疾患は、ヒトＰＢＭＣの移入後にレシピエントＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒ共通γ鎖－／－（ＮＳＧ）マウスにおいて発症する。ＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、マイクロアイソレーターケージ内で特定の病原体フリー条件下で飼育し、オートクレーブ処理した餌と滅菌水を自由摂取させた。１０７個の新鮮なヒトＰＢＭＣをインスリン注射器内で２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、８～１２週齢の個々の無調整ＮＳＧマウスに、尾静脈を介して静脈内注射した。マウスには、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で修飾された１．５ｍｇのＩＬ－２／ＴＧＦ－βを充填したＮＰの静脈内投与（個別に）も行い、これは、ヒトＰＢＭＣを移入した日に開始した：０、３、６、９、１２日目。対照マウスには、上記のＮＰ処置マウスと同じ条件下で、コーティングされていない空のＮＰまたはＰＢＳを投与した。実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って実施した。無気力及び／または毛づくろいの欠如、運動性の低下または多呼吸と併発して前かがみの姿勢を発症した動物を安楽死させ、殺処分時に生存のエンドポイントを記録した。以下の５つのパラメータのそれぞれを、存在しない場合は０、存在する場合は１として評価する検証済みのスコアリングシステムを使用して疾患をモニタリングした：１）初期体重の＞１０％を超える体重減少、２）前かがみの姿勢、３）皮膚病変（斑状脱毛症）、４）毛並みの悪化、５）下痢。死亡したマウスは、実験終了までに合計スコア５の判定を受けた。末梢血（ＰＢＭＣを分離するためのフローサイトメトリー用）及び血漿を０日目、４日目、１４日目及び５０日目に採取した。ヒトＩｇＧの血漿濃度をＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。組織学的評価のために、ＰＢＭＣの移入後５０日目に、肺、肝臓、及び結腸を回収した。組織をホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片をヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【0276】
統計解析：統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０を使用して実施した。パラメトリック検定は、スチューデントｔ検定を使用して実施し、ノンパラメトリック検定は、データが正規分布していない場合に使用した。動物のカプランマイヤー生存曲線の差異をログランク検定によって解析した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【0277】
結果：ａＡＰＣ ＮＰによるヒトＴ細胞へのサイトカインのパラクリン送達は、機能的Ｔｒｅｇの誘導及び増殖をもたらす
【0278】
ＮＰが、Ｔ細胞共受容体ＣＤ４またはＣＤ８の関与なしに、すなわち、ＴＣＲ刺激の存在下でヒトＴ細胞に寛容原性サイトカインを送達する寛容原性ａＡＰＣとして作用することによって、寛容原性Ｔ細胞プログラムを誘導できるかどうかを調査した。寛容原性サイトカインを充填し、抗ＣＤ３／２８抗体でコーティングされたＮＰは、ＣＤ４＋（図５Ａ）及びＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ（図５Ｂ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に増殖させ、ＮＰがヒトＴ細胞からＴｒｅｇへの分化を誘導可能な無細胞ａＡＰＣとして作用し得ることが示された。
【0279】
ＮＰによるＴ細胞へのＩＬ－２及びＴＧＦ－βの送達により、ヒトＴ細胞からＴｒｅｇへの分化が可能になることが判明したため、プロセスに対するＴＧＦ－βの相対的な寄与を、ＮＰを介したＴｒｅｇ増殖におけるその役割を評価することによって評価した。抗ＴＧＦ－β抗体または無関係の対照抗体を含む並行培養物において、ＩＬ－２／ＴＧＦ－βを充填し、抗ＣＤ３／２８で修飾したＮＰと共にインキュベートしたヒトＰＢＭＣから誘導され、増殖させたＴｒｅｇの数を比較した。
【0280】
図６Ａは、ＴＧＦ－βをナノ粒子に封入する必要がなかったというさらなるエビデンスを示す。ＩＬ－２のみを充填したＮＰは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを誘導した。エフェクターＴ細胞の増殖及び炎症促進性サイトカインの産生をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制する能力によって示されるように、ａＡＰＣ ＮＰで誘導されたＴｒｅｇは機能性であった（図６Ｂ）。
【0281】
実施例７：ヒト抗マウス移植片対宿主病からヒト化ＮＳＧマウスを防御するａＡＰＣ ＮＰによるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの誘導。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇの抑制活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抑制活性と相関しない可能性がある。同種移植片拒絶におけるＴｒｅｇの既知の防御効果を利用して、ａＡＰＣ ＮＰの免疫療法の可能性をヒト抗マウスＧｖＨＤのマウスモデルで試験した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇの抑制活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抑制活性と相関しない可能性がある。同種移植片拒絶におけるＴｒｅｇの既知の防御効果を利用して、ａＡＰＣ ＮＰの免疫療法の可能性をヒト抗マウスＧｖＨＤのマウスモデルで試験した。
【0282】
材料及び方法
免疫不全ＮＯＤ ＳＣＩＤ（ＮＳＧ）マウスをこれらの実験にも使用した。ＮＳＧマウスを６匹ずつの２つの群に分けた。両方の群に１０７個のヒトＰＢＭＣを静脈内投与した。ヒトＴ細胞は、致死的なヒト抗マウス移植片対宿主病を引き起こす。マウスの一方の群には、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有し、抗ＣＤ３で修飾されたａＡＰＣ ＮＰ（黒丸）を投与し、もう一方の群には空のＮＰ（白丸）を投与した。これらは、ヒトＰＢＭＣの移植日から開始して０、３、６、９、１２日目に投与した。
免疫不全ＮＯＤ ＳＣＩＤ（ＮＳＧ）マウスをこれらの実験にも使用した。ＮＳＧマウスを６匹ずつの２つの群に分けた。両方の群に１０７個のヒトＰＢＭＣを静脈内投与した。ヒトＴ細胞は、致死的なヒト抗マウス移植片対宿主病を引き起こす。マウスの一方の群には、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有し、抗ＣＤ３で修飾されたａＡＰＣ ＮＰ（黒丸）を投与し、もう一方の群には空のＮＰ（白丸）を投与した。これらは、ヒトＰＢＭＣの移植日から開始して０、３、６、９、１２日目に投与した。
【0283】
結果：
図７Ａ～７Ｃは、ＩＬ－２を封入したＴ細胞標的化ＮＰを投与したマウスが、ＣＤ４＋（図７Ａ）及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ（図７Ｂ）の両方のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を有し、空のＮＰのみを投与した対照マウスとは異なり、ヒトＩｇＧが増加しなかった（図７Ｃ）ことを示している。
図７Ａ～７Ｃは、ＩＬ－２を封入したＴ細胞標的化ＮＰを投与したマウスが、ＣＤ４＋（図７Ａ）及びＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ（図７Ｂ）の両方のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を有し、空のＮＰのみを投与した対照マウスとは異なり、ヒトＩｇＧが増加しなかった（図７Ｃ）ことを示している。
【0284】
図８Ａ～８Ｃは、ａＡＰＣ－ＮＰ処置マウスの有効性を示す。ａＡＰＣ ＮＰで防御されたマウスは、ＮＰを投与しなかったマウスまたは空のＮＰを投与したマウスと比較して、ヒトＰＢＭＣの移植後に体重が減少せず（図８Ａ）、疾患スコアが減少し（図８Ｂ）、生存期間が延長された（図８Ｃ）。ａＡＰＣを投与したマウスは、ＧＶＨＤの皮膚症状を発症しなかった（図８Ｄ）。最後に、ａＡＰＣ ＮＰを投与したＮＳＧマウスの肺、肝臓、及び結腸の組織病理学は、対照マウスと比較して有意な防御を示した（図８Ｅ）。
【0285】
実施例８：外来固形臓器移植の拒絶反応を予防するａＡＰＣ ＮＰによるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの誘導。
材料及び方法
ＰＬＧＡナノ粒子の調製：実施例６と同じ
材料及び方法
ＰＬＧＡナノ粒子の調製：実施例６と同じ
【0286】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離：実施例６と同じ
【0287】
フローサイトメトリー：実施例６と同じ
【0288】
結果：慢性腎不全に罹患している４９歳の男性が、ハプロタイプ一致の兄弟から腎臓を移植された。移植前に行われた混合リンパ球反応により、レシピエントのＣＤ４＋Ｔ細胞がドナーの非Ｔ細胞の存在下で増殖したことが明らかになった。移植の３日前に、ＩＬ－２を充填し、抗ＣＤ２コーティングされたＰＬＧＡ ＮＰを投与した。移植当日にもう１回投与し、この投与を３週間にわたって３日ごとに繰り返した。移植当日、手術に伴う炎症反応を最小限に抑えるために５０ｍｇのソルメドロールを投与した。その後、ステロイドを数日間で減薬し、週の終わりに中止した。ＮＰの投与後、末梢血中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ及びＮＫ細胞の数が有意に増加した。移植された腎臓は移植後も完全に機能し、その後の血清クレアチニンの上昇は最小限にとどまり、正常に戻った。拒絶反応エピソードを治療するために、共刺激分子遮断薬やシロリムスを導入する必要はなかった。移植後にレシピエントのＣＤ４＋Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでドナーの非Ｔ細胞で刺激したところ、増殖応答は認められなかった。しかしながら、レスポンダー細胞からＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを枯渇させると、増殖応答が戻った。血清クレアチニンの上昇を予防するために必要な継続的な刺激とサイトカインを提供するには、毎週～隔週での皮下ＮＰが必要であった。
【0289】
実施例９．ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔｒｅｇの生成に必要なＴＧＦ－βを局所環境において誘導する、ＩＬ－２のみを含有するナノ粒子寛容原性抗原提示細胞（ａＡＰＣａ）
材料及び方法
ヒト末梢血単核球（０．５×１０６／ウェル）をＵ底９６ウェルプレートで培養した。細胞を、ＩＬ－２またはＩＬ－２とＴＧＦ－β（５０ｕｇ／ｍｌ）を含有し、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、または抗ＣＤ２／３ ＮＰでコーティングされたＮＰで刺激した。一部のウェルには、抗ＴＧＦ－β ＬＡＰ １０ｕｇ／ｍｌが含まれていた。対照は、刺激されていないＰＢＭＣであった。細胞を５日間培養し、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３について染色されたＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を測定した。
材料及び方法
ヒト末梢血単核球（０．５×１０６／ウェル）をＵ底９６ウェルプレートで培養した。細胞を、ＩＬ－２またはＩＬ－２とＴＧＦ－β（５０ｕｇ／ｍｌ）を含有し、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、または抗ＣＤ２／３ ＮＰでコーティングされたＮＰで刺激した。一部のウェルには、抗ＴＧＦ－β ＬＡＰ １０ｕｇ／ｍｌが含まれていた。対照は、刺激されていないＰＢＭＣであった。細胞を５日間培養し、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３について染色されたＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を測定した。
【0290】
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０を使用して実施した。
結果：抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、または両方の組み合わせのいずれかでコーティングされたＮＰは、ＣＤ４及びＣＤ８＋細胞によって発現されるＣＤ２５とＦｏｘｐ３を増加させた。ＩＬ－２のみを含有するＮＰは、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有するＮＰよりもＦｏｘｐ３を増加させた。しかしながら、抗ＴＧＦ－βの添加によりこの効果は無効化された。グラフは、４回の別々の実験の平均を示している。ＮＰの添加に起因するＦｏｘｐ３の増加は、抗ＴＧＦ－βの効果ｐ＜０．０５と同様に、有意であった ｐ＜０．０５（図９Ａ、９Ｂ）。ＩＬ－２のみを封入した抗ＣＤ３（Ｆａｂ’）２修飾ＮＰもＴｒｅｇを誘導することができた。図１０Ａ、１０Ｂは、これらのａＡＰＣがＣＤ４及びＣＤ８Ｔｒｅｇを顕著に増加させたことを示している（＊ｐ＜０．０１）。したがって、ＩＬ－２のみを充填した抗ＣＤ２修飾ＮＰと抗ＣＤ３修飾ＮＰは両方とも、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの生成に必要なＴＧＦ－βを局所環境において誘導することができる。
結果：抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、または両方の組み合わせのいずれかでコーティングされたＮＰは、ＣＤ４及びＣＤ８＋細胞によって発現されるＣＤ２５とＦｏｘｐ３を増加させた。ＩＬ－２のみを含有するＮＰは、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有するＮＰよりもＦｏｘｐ３を増加させた。しかしながら、抗ＴＧＦ－βの添加によりこの効果は無効化された。グラフは、４回の別々の実験の平均を示している。ＮＰの添加に起因するＦｏｘｐ３の増加は、抗ＴＧＦ－βの効果ｐ＜０．０５と同様に、有意であった ｐ＜０．０５（図９Ａ、９Ｂ）。ＩＬ－２のみを封入した抗ＣＤ３（Ｆａｂ’）２修飾ＮＰもＴｒｅｇを誘導することができた。図１０Ａ、１０Ｂは、これらのａＡＰＣがＣＤ４及びＣＤ８Ｔｒｅｇを顕著に増加させたことを示している（＊ｐ＜０．０１）。したがって、ＩＬ－２のみを充填した抗ＣＤ２修飾ＮＰと抗ＣＤ３修飾ＮＰは両方とも、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの生成に必要なＴＧＦ－βを局所環境において誘導することができる。
【0291】
これらの実施例は、ＰＬＧＡ ＮＰが、機能的ヒトＴｒｅｇ及びマウスＴｒｅｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ増殖のための無細胞ａＡＰＣとして使用することができることを実証している。ＡＰＣがＭＨＣ／抗原複合体を介してＴＣＲに結合し、Ｔリンパ球に共刺激シグナルを提供すると、細胞の分化と機能の活性化が起こる。合成プラットフォームとして使用される、ａＡＰＣによるこのプロセスの複製によって、ＡＰＣとＴ細胞の間の自然な相互作用を再現することができ、Ｔ細胞へのシグナル伝達と、Ｔ細胞へのＩＬ－２のパラクリン送達（ａＡＰＣと同様の）を含む適応免疫応答の開始が可能になる。寛容原性免疫応答を促進するためにペイロードを封入したａＡＰＣを使用すると、有意な免疫療法の潜在的効果が得られる。ＰＬＧＡが生体適合性であり、臨床現場で良好な安全特性を示しているという事実からは、このアプローチの臨床への急速な技術移転の可能性がさらに想定される。
【0292】
ａＡＰＣ ＮＰを用いたヒトＴｒｅｇの増殖には、標的化されていない作用を担うサイトカインによる全身処理によるＴｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏ誘導に伴う有害な影響を制限するという利点があったが、これらのＮＰは、抗原特異性の構成要素を含んでいなかった。抗ＣＤ２８抗体と共にペプチド／ＭＨＣを発現する常磁性鉄－デキストランＮＰとは異なり、ポリクローナル及び非抗原特異的Ｔｒｅｇの誘導は、ＳＬＥなどの病態において有利である可能性があり、その場合、慢性的な全身性自己免疫応答が複数の自己抗原を標的にしなければならず、ポリクローナルＴｒｅｇが疾患を抑制する。
【0293】
この戦略は、Ｔｒｅｇベースのアプローチの治療的使用に関して複数の用途を有し得る。一般に、十分な数のＴｒｅｇをｉｎ ｖｉｖｏに注入する前に、末梢血中を循環する少数のＴｒｅｇをｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる必要がある。これには、多大なコストと特定の技術要件が伴う。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴｒｅｇは時間の経過とともに不安定になる可能性があるため、患者に対して繰り返しの治療が必要になることがよくある。さらに、自己免疫患者の慢性炎症は、エフェクターＴ細胞に移入されたＴｒｅｇの表現型の逆転を促進し、時間の経過と共にＴｒｅｇの効力が低下する可能性がある。その代わりに、ａＡＰＣ ＮＰは、ヒト化マウスで示されているように、長期にわたる有効性を伴う持続的なＴｒｅｇ活性を提供することができ、自己免疫環境における炎症誘発性応答を抑制するヒトＴｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏでの増殖のための新規免疫療法様式を表している。
【0294】
まとめると、すべての免疫媒介性障害は、組織損傷を引き起こす異常な免疫細胞を特徴とする。これらの細胞は、それらを抑制するはずの調節性細胞の制御から逃れている。記載されている新規無細胞抗原提示細胞ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｔ細胞、またはＴ細胞とＮＫ細胞を標的とする無細胞抗原提示細胞（ａＡＰＣ）として機能する。ａＡＰＣは、それらに刺激とサイトカインを提供し、細胞が機能的な調節性細胞になるように誘導する。これらのａＡＰＣを継続的に使用すると、これらの調節性細胞が増殖し、異常な免疫細胞の制御を取り戻す数に達することが可能になる。この戦略は、免疫系を「リセット」して免疫障害を終結させる。さらに、この新規アプローチにより、重篤な副作用を伴う現在の免疫抑制剤や生物学的薬剤の使用が回避される。
【0295】
実施例１０：外来臓器移植の拒絶反応を予防または治療するための、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有するナノ粒子
ＭＨＣ不適合外来臓器の移植の２週間前に、レシピエントに、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有し、抗ＣＤ２で修飾されたナノ粒子を３日ごとに投与し、ドナーと適合するＭＨＣペプチドを皮下注射する。これらの手順により、ドナーとレシピエントの間の混合リンパ球反応で示され得る同種異系抗原特異的Ｔｒｅｇが生成される。レシピエントのＴ細胞は、ドナーＡＰＣの存在下では増殖しない。Ｔｒｅｇの存在は、ドナーＰＢＭＣのＣＤ２５＋細胞を枯渇させることによって示される。この除去により、レシピエントＴ細胞がドナーＡＰＣに応答できるようになる。このドナーの同種抗原に対するＴ細胞の非応答性についてのエビデンスによれば、臓器移植片は最小限の免疫抑制でレシピエントにおいて生存するはずである。移植後、皮下ＭＨＣペプチドを繰り返し投与すると、寛容を維持する同種抗原特異的Ｔｒｅｇの数が増加する（Ｚｈｅｎｇ ＳＧ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２７９－８９）２００６。免疫抑制剤の併用は必要ない。臓器移植後の血清ＩＬ－２受容体の毎週の測定では、移植拒絶反応が発生している場合は増加が示され、さらなるナノ粒子及びＭＨＣペプチド治療の必要性が示される（Ｒａｓｏｏｌ Ｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄ ６：８－１３，２０１５）。
ＭＨＣ不適合外来臓器の移植の２週間前に、レシピエントに、ＩＬ－２及びＴＧＦ－βを含有し、抗ＣＤ２で修飾されたナノ粒子を３日ごとに投与し、ドナーと適合するＭＨＣペプチドを皮下注射する。これらの手順により、ドナーとレシピエントの間の混合リンパ球反応で示され得る同種異系抗原特異的Ｔｒｅｇが生成される。レシピエントのＴ細胞は、ドナーＡＰＣの存在下では増殖しない。Ｔｒｅｇの存在は、ドナーＰＢＭＣのＣＤ２５＋細胞を枯渇させることによって示される。この除去により、レシピエントＴ細胞がドナーＡＰＣに応答できるようになる。このドナーの同種抗原に対するＴ細胞の非応答性についてのエビデンスによれば、臓器移植片は最小限の免疫抑制でレシピエントにおいて生存するはずである。移植後、皮下ＭＨＣペプチドを繰り返し投与すると、寛容を維持する同種抗原特異的Ｔｒｅｇの数が増加する（Ｚｈｅｎｇ ＳＧ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２７９－８９）２００６。免疫抑制剤の併用は必要ない。臓器移植後の血清ＩＬ－２受容体の毎週の測定では、移植拒絶反応が発生している場合は増加が示され、さらなるナノ粒子及びＭＨＣペプチド治療の必要性が示される（Ｒａｓｏｏｌ Ｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄ ６：８－１３，２０１５）。
【0296】
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】