特表2023-554641線維芽細胞様滑膜細胞媒介性関節リウマチの有効な管理のための組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-28
(54)【発明の名称】線維芽細胞様滑膜細胞媒介性関節リウマチの有効な管理のための組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/12 20060101AFI20231221BHJP
A61K 36/324 20060101ALI20231221BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231221BHJP
A61K 31/19 20060101ALI20231221BHJP
A61K 31/715 20060101ALI20231221BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231221BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20231221BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20231221BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20231221BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20231221BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20231221BHJP
A23L 29/281 20160101ALI20231221BHJP
A23G 3/34 20060101ALI20231221BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20231221BHJP
【ＦＩ】
A61K31/12
A61K36/324
A61P43/00 105
A61K31/19
A61K31/715
A61P19/02
A61K9/20
A61K9/48
A61K9/06
A61K9/10
A61P43/00 121
A23L33/105
A23L29/281
A23G3/34 101
C12N5/071 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537122
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-08-07
(86)【国際出願番号】 US2021063689
(87)【国際公開番号】W WO2022133020
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/126,920
(32)【優先日】2020-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501394435
【氏名又は名称】サミ－サビンサ グループ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100212509
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 知子
(72)【発明者】
【氏名】マジード ムハンメド
(72)【発明者】
【氏名】ナガブシャナム カリアナム
(72)【発明者】
【氏名】ムンドクール ラクシュミ
【テーマコード（参考）】
4B014
4B018
4B041
4B065
4C076
4C086
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
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4B014GK04
4B014GK05
4B014GL03
4B014GL10
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(57)【要約】
開示した発明は、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖、遊走の阻害に使用するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞における不均衡を調節するための組成物及び方法も開示する。開示した組成物は、２０～５０％のＢＤＭＣ、１０～２５質量％のＤＭＣ、及び３０～５０質量％のクルクミンを含み、ボスウェル酸及び多糖を３５～５０質量％及び３５～４５質量％の範囲でさらに含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走の阻害に使用するための組成物。
【請求項2】
組成物が２０～５０質量％のＢＤＭＣ、１０～２５質量％のデメトキシクルクミン（ＤＭＣ）、及び３０～５０質量％のクルクミンを含み、組成物中の総クルクミノイドが２０～９５質量％の範囲である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項3】
個々に使用する場合に、組成物中のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、又はクルクミノイドの濃度が１０～１００μｇ／ｍＬからなる範囲から選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項4】
組成物がボスウェリア・セラータ（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ ｓｅｒｒａｔａ）からのボスウェル酸（Ｂ）及び多糖（ＰＳ）をさらに含み、ボスウェル酸が、ボスウェル酸を３５～５０質量％、β－ボスウェル酸を２０～３０質量％、３－アセチル－１１－ケト－β－ボスウェル酸（ＡＫＢＡ）を１２質量％、及び多糖を３５～４５質量％の範囲で含む、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項5】
個々に使用する場合に、ボスウェル酸、多糖の濃度が１０～１００μｇ／ｍＬからなる範囲から選択される、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項6】
濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド組成物及びＢＰＳが１～４：４～１の比の組合せで存在する、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項7】
線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の阻害が、細胞周期阻害、炎症性マーカーのレベルの減少、及びアポトーシスの促進によってもたらされる、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項8】
細胞周期阻害がＧ０／Ｇ１期にある、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項9】
アポトーシスをＢａｘ対Ｂｃｌ－２の比として測定する、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項10】
炎症性マーカーが、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＣＣＬ－５、ＭＭＰ－３、及びカテプシンからなる群から選択される、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項11】
線維芽細胞様滑膜細胞の阻害が関節炎スコアの改善をもたらす、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項12】
対象が哺乳動物である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項13】
２０質量％以上で存在する濃縮ＢＤＭＣを含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための組成物。
【請求項14】
組成物が２０～５０質量％のＢＤＭＣ、１０～２５質量％のＤＭＣ、及び３０～５０質量％のクルクミンを含み、組成物中の総クルクミノイドが２０～９５質量％の範囲である、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項15】
個々に使用する場合に、組成物中のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、又はクルクミノイドの濃度が、４０ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）～１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）の体重からなる範囲から選択される、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項16】
組成物がボスウェリア・セラータからのボスウェル酸（Ｂ）及び多糖（ＰＳ）をさらに含み、ボスウェル酸が、ボスウェル酸を３５～５０質量％、β－ボスウェル酸を２０～３０質量％、３－アセチル－１１－ケト－β－ボスウェル酸（ＡＫＢＡ）を１２質量％、及び多糖を３５～４５質量％の範囲で含む、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項17】
個々に使用する場合に、ボスウェル酸、多糖の濃度が４０ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）～１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）からなる範囲から選択される、請求項１６に記載の使用のための組成物。
【請求項18】
濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド組成物及びＢＰＳが１～４：４～１の比の組合せで存在する、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項19】
不均衡を、Ｔh１７細胞を低下させ、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させることによって調節し、それによってＴh１７／Ｔｒｅｇ比を減少させる、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項20】
安定化剤、生体利用能エンハンサー及び抗酸化剤、薬学的又は栄養補助食品的又は薬用化粧品的に許容される賦形剤及びエンハンサーをさらに含み、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー、又は食料品の形態で経口投与する、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項21】
２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための組成物。
【請求項22】
組成物が２０～５０質量％のビスデメトキシクルクミン、１０～２５質量％のデメトキシクルクミン、及び３０～５０質量％のクルクミンを含み、組成物中の総クルクミノイドが２０～９５質量％の範囲である、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【請求項23】
個々に使用する場合に、組成物中のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、又はクルクミノイドの濃度が４０ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）～１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）から選択される、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【請求項24】
組成物がボスウェリア・セラータからのボスウェル酸（Ｂ）及び多糖（ＰＳ）をさらに含み、ボスウェル酸及び多糖（ＢＰＳ）が、それぞれ３５～５０質量％及び３５～４５質量％の範囲で存在する、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【請求項25】
個々に使用する場合に、ボスウェル酸、多糖の濃度が４０ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）～１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）の範囲から選択される、請求項２４に記載の使用のための組成物。
【請求項26】
濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド組成物及びＢＰＳが１～４：４～１の比の組合せで存在する、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【請求項27】
哺乳動物における関節リウマチの管理が、線維芽細胞様滑膜細胞の増殖及び遊走の阻害、Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節、炎症性マーカーのレベルの減少、アポトーシスの促進、並びに関節炎スコアの改善によってもたらされる、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【請求項28】
組成物が、安定化剤、生体利用能エンハンサー及び抗酸化剤、薬学的又は栄養補助食品的又は薬用化粧品的に許容される賦形剤及びエンハンサーをさらに含み、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー、又は食料品の形態で経口投与する、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれている、２０２０年１２月１７日に出願の米国仮特許出願６３１２６９２０号の優先権を主張するＰＣＴ出願である。
本発明は、一般に、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖、遊走の阻害に使用するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞における不均衡を調節するための組成物及び方法も開示する。さらにより詳細には、本発明は、ボスウェリア・セラータ（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ ｓｅｒｒａｔａ）からのボスウェル酸及び多糖をさらに含む、２０～５０％のＢＤＭＣ、１０～２５質量％のＤＭＣ、及び３０～５０質量％質量％のクルクミンを含む組成物を開示する。
本出願は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれている、２０２０年１２月１７日に出願の米国仮特許出願６３１２６９２０号の優先権を主張するＰＣＴ出願である。
本発明は、一般に、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖、遊走の阻害に使用するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞における不均衡を調節するための組成物及び方法も開示する。さらにより詳細には、本発明は、ボスウェリア・セラータ（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ ｓｅｒｒａｔａ）からのボスウェル酸及び多糖をさらに含む、２０～５０％のＢＤＭＣ、１０～２５質量％のＤＭＣ、及び３０～５０質量％質量％のクルクミンを含む組成物を開示する。
【背景技術】
【0002】
滑膜炎症及び関節損傷によって引き起こされる、遺伝的及び環境的要因の間の複雑な相互作用によって引き起こされる自己免疫性滑膜疾患である関節リウマチ（ＲＡ）臨床徴候。線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）は、滑膜、可動関節の空間を裏打ちする軟組織、腱鞘、及び滑液包の、関節内に位置する間葉細胞である（Nygaard, G., Firestein, G.S. Restoring synovial homeostasis in rheumatoid arthritis by targeting fibroblast-like synoviocytes. Nat Rev Rheumatol 16, 316-333 (2020)）。滑膜の内膜の裏打ち中のＦＬＳは、炎症を永続化させるサイトカイン及び軟骨破壊に寄与するプロテアーゼの生成において主要な役割を果たす。内膜の裏打ち層は、２種の細胞種、すなわち、Ａ型又はマクロファージ様滑膜細胞及びＢ型又はＦＬＳから構成される。滑膜の内膜の裏打ち層中に存在するＦＬＳの役割は、細胞外基質（ＥＣＭ）並びに軟骨表面を潤滑及び栄養を与えるための滑液の組成を制御することである。様々な研究により、ＲＡにおいて、Ａ型細胞が優勢となって炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子を生成し、立ち代わってこれが局所的ＦＬＳを活性化させ、ＩＬ－６、プロスタノイド、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の生成を誘導することが示されている。このプロセスは、自己分泌／パラ分泌ネットワークによって起動される細胞外基質の破壊を引き起こして、滑膜炎を永続化させる。ＲＡがＦＬＳの生存を促進し、アポトーシスを通じた欠失を防止することも文書化されている（Bartok B, Firestein GS: Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 2010; 233:233-255）。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）／Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）細胞間のバランスがＲＡの進行に関連づけられている。Ｔｈ１７細胞は、組織破壊及び関節軟骨損傷に手を貸すＩＬ－１７Ａ及びＴＮＦ－αを分泌することによって炎症促進反応を媒介する一方で、Ｔｒｅｇは抗炎症反応を媒介し、自己免疫寛容の状態を維持する。この不均衡が、数例として多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、ＳＬＥを含むいくつかの自己免疫疾患の根底にある原因であると考えられている（Li, C. et al. (Arsenic trioxide improves Treg and Th17 balance by modulating STAT3 in treatment-naive rheumatoid arthritis patients. Int. Immunopharmacol. 73, 539-551, 2019）。さらに、合成疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）及び生物学的ＤＭＡＲＤを個々に又は組み合わせてのいずれかで使用するＲＡの現在の処置は、治療戦略を提供するが、過敏症、特に免疫関連のものを含む、顕著な副作用を示す。有効かつ非免疫変調性である治療標的を発見するために、この領域において相当な研究努力がなされている（Kohler et al. Current Therapeutic Options in the Treatment of Rheumatoid Arthritis, J. Clin. Med. 8, 1-15 (2019)。
【0003】
Ｒｉｚａｌｄｙらは、クルクマ・ロンガ（ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）及びボスウェリア・セラータの抽出物が骨関節炎において治療上の利点を有することを示しているが（Rizaldy et al. A randomized Controlled Trial of Curcuma Longa and Boswellia Serrata Extract in Osteoarthritis. Global Journal of Medical Research: H Orthopedic and Musculoskeletal System 19(3)）、この論文は、この活性を司っている経路及び因子を明らかにしていない。さらに、骨関節炎における単離した関節を標的化することとＲＡにおけるいくつかの関節を標的化することは全く異なる。
Ｓｖｅｎｓｓｏｎらは、ＴＮＦ阻害剤、並びにＦｃ－Ｉｇ１及びＩｇ２を含む非免疫調節性抗ＦＬＳ手法を通じて、組合せ療法が、より良好な有効性及びより少ない副作用で、関節炎に対して有効に働いたことを再確認した（Svensson et al. Synoviocyte-targeted therapy synergizes with TNF inhibition in arthritis reversal. Sci. Adv. 6, eaba4353, Pgs. 1-17 (2020)）。
Ｓｖｅｎｓｓｏｎらは、ＴＮＦ阻害剤、並びにＦｃ－Ｉｇ１及びＩｇ２を含む非免疫調節性抗ＦＬＳ手法を通じて、組合せ療法が、より良好な有効性及びより少ない副作用で、関節炎に対して有効に働いたことを再確認した（Svensson et al. Synoviocyte-targeted therapy synergizes with TNF inhibition in arthritis reversal. Sci. Adv. 6, eaba4353, Pgs. 1-17 (2020)）。
【0004】
Ｓｈａｉｋｈらは、関節リウマチ処置においてクルクミンが、他のクルクミノイドと比較してより高い抗炎症性作用を有していたことを示した。さらに、彼らは、ＤＭＣ及びＢＤＭＣがターメリック中のクルクミンの効果を妨害したことを示した（Shaikh et al. Does Curcumin Analogues, Demethoxycurcumin and Bisdemethoxycurcumin (BDMC), Enhance the Therapeutic efficacy of Curcumin in the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA), Nat. Prod. Chem. 8(6), Pgs. 1-9, 2020）。
Ｍａｋｕｃｈらは、ＲＡについてのクルクミンの包括的な総説を提供するが、作用機構及び細胞集団に対するその効果はさらなる研究を要することを明らかにした（The Immunomodulatory and Anti-Inflammatory Effect of Curcumin on Immune Cell Populations, Cytokines, and In Vivo Models of Rheumatoid Arthritis, Pharmaceuticals, 14, Pgs. 1-18, 2021）。Ｋｌｏｅｓｃｈらは、高濃度のクルクミンを用いたＦＬＳの処置が細胞生存度の劇的な減少をもたらし、アポトーシスを誘導したことを示した。しかし、クルクミンの分子機構は不明確であった。（kloesch et al. Anti-Inflammatory and Apoptotic Effects of the Polyphenol Curcumin on Human Fibroblast-like Synoviocytes, 15, Pgs. 400-405 (2013)）。
Ｍａｋｕｃｈらは、ＲＡについてのクルクミンの包括的な総説を提供するが、作用機構及び細胞集団に対するその効果はさらなる研究を要することを明らかにした（The Immunomodulatory and Anti-Inflammatory Effect of Curcumin on Immune Cell Populations, Cytokines, and In Vivo Models of Rheumatoid Arthritis, Pharmaceuticals, 14, Pgs. 1-18, 2021）。Ｋｌｏｅｓｃｈらは、高濃度のクルクミンを用いたＦＬＳの処置が細胞生存度の劇的な減少をもたらし、アポトーシスを誘導したことを示した。しかし、クルクミンの分子機構は不明確であった。（kloesch et al. Anti-Inflammatory and Apoptotic Effects of the Polyphenol Curcumin on Human Fibroblast-like Synoviocytes, 15, Pgs. 400-405 (2013)）。
【0005】
ＷＯ ２０２１／０９０１５４号は、ウィタノライド濃縮アシュワガンダ、ＢＤＭＣ濃縮クルクミン、及びＡＫＢＡ濃縮ボスウェリア属（Boswellia）を包含する骨関節炎の組合せ処置を含む。しかし、これは非免疫調節効果のＦＬＳ経路は包含しない。
同様に、ＡＵ２０１０／３４５３３８ Ｂ２号は、関節炎を含む炎症状態に使用するための、ボスウェリア属抽出物及びクルクマ属（curcuma）の種を含む相乗的な組成物を包含するが、どのような具体的な経路も包含していない。
本質的には、現在の手法と共に作用し、免疫系を抑制せずに疾患制御を改善させることができる、ＲＡのための安全、毒性がより低い、かつ有効である処置の、満たされていない必要性が存在する。さらに、処置が天然の薬草に基づいていれば、ＲＡ処置の免疫調節効果に関連する副作用の多くに打ち勝つことができる。
同様に、ＡＵ２０１０／３４５３３８ Ｂ２号は、関節炎を含む炎症状態に使用するための、ボスウェリア属抽出物及びクルクマ属（curcuma）の種を含む相乗的な組成物を包含するが、どのような具体的な経路も包含していない。
本質的には、現在の手法と共に作用し、免疫系を抑制せずに疾患制御を改善させることができる、ＲＡのための安全、毒性がより低い、かつ有効である処置の、満たされていない必要性が存在する。さらに、処置が天然の薬草に基づいていれば、ＲＡ処置の免疫調節効果に関連する副作用の多くに打ち勝つことができる。
【発明の概要】
【0006】
本発明の目的
個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸（Ｂ）、又は多糖（ＰＳ）を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走の阻害に使用するための方法及び組成物を開示することが、本発明の主な目的である。別の目的は、濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド及びＢＰＳの組成物を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞の増殖及び遊走の阻害に使用するための方法及び組成物を開示することである。
本発明のさらに別の主な目的は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための方法及び組成物を開示することである。別の目的は、濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物を使用して、哺乳動物におけるＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の緩和に使用するための方法及び組成物を開示することである。
本発明の別の主な目的は、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための方法及び組成物を開示することであり、前記方法は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む組成物を投与することを含む。別の目的は、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための方法及び組成物を開示することであり、前記方法は、濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物を投与することを含む。
個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸（Ｂ）、又は多糖（ＰＳ）を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走の阻害に使用するための方法及び組成物を開示することが、本発明の主な目的である。別の目的は、濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド及びＢＰＳの組成物を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞の増殖及び遊走の阻害に使用するための方法及び組成物を開示することである。
本発明のさらに別の主な目的は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための方法及び組成物を開示することである。別の目的は、濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物を使用して、哺乳動物におけるＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の緩和に使用するための方法及び組成物を開示することである。
本発明の別の主な目的は、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための方法及び組成物を開示することであり、前記方法は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む組成物を投与することを含む。別の目的は、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための方法及び組成物を開示することであり、前記方法は、濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物を投与することを含む。
【0007】
概要
本発明は、ＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、若しくは多糖を個々に、又は濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド組成物及びボスウェル酸多糖の組合せのいずれかの、対象におけるＦＬＳの増殖、遊走の阻害、及び哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための方法及び組成物を包含することによって、背景技術中で言及した前述の課題を広く解決する。
本発明の第１の態様は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走の阻害に使用するための組成物に関する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。
本発明は、ＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、若しくは多糖を個々に、又は濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド組成物及びボスウェル酸多糖の組合せのいずれかの、対象におけるＦＬＳの増殖、遊走の阻害、及び哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための方法及び組成物を包含することによって、背景技術中で言及した前述の課題を広く解決する。
本発明の第１の態様は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走の阻害に使用するための組成物に関する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。
【0008】
本発明のさらに別の態様は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための組成物を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを投与することも包含する。
本発明の別の態様は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための組成物を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを投与することも包含する。
本発明の別の態様は、哺乳動物ＦＬＳを、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む組成物と接触させるステップを含む、哺乳動物における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走を阻害する方法を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。
本発明のさらに別の態様は、ａ）Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔｒｅｇの不均衡を有する哺乳動物を同定するステップと、ｂ）個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、多糖を含む組成物を投与するステップとを含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の不均衡を調節するための方法を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。
本発明の別の態様は、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための組成物を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを投与することも包含する。
本発明の別の態様は、哺乳動物ＦＬＳを、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む組成物と接触させるステップを含む、哺乳動物における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走を阻害する方法を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。
本発明のさらに別の態様は、ａ）Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔｒｅｇの不均衡を有する哺乳動物を同定するステップと、ｂ）個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、多糖を含む組成物を投与するステップとを含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の不均衡を調節するための方法を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。
【0009】
本発明のさらに別の態様は、ａ）関節リウマチを有する対象を同定するステップと、ｂ）個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖を含む組成物を投与するステップとを含む、対象における関節リウマチの治療管理の方法を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。
本発明のより広い応用範囲は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、以下の詳細な説明及び具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、本発明に対する制限として解釈されるべきでなく、使用する試料の濃度範囲、クルクミノイドの誘導体／類似体、ＢＰＳ、実験条件、哺乳動物の選択を変えることなどの様々な変化及び改変を行うことは、当業者の技術範囲内にあり、この詳細な説明から本発明の精神及び範囲の範囲内に十分あることを理解されたい。
本発明のより広い応用範囲は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、以下の詳細な説明及び具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、本発明に対する制限として解釈されるべきでなく、使用する試料の濃度範囲、クルクミノイドの誘導体／類似体、ＢＰＳ、実験条件、哺乳動物の選択を変えることなどの様々な変化及び改変を行うことは、当業者の技術範囲内にあり、この詳細な説明から本発明の精神及び範囲の範囲内に十分あることを理解されたい。
【0010】
特許又は特許出願ファイルは、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面の本特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な費用の支払い後に事務局から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＦＬＳにおけるビメンチンの免疫染色を示す図である。
【図2】ＦＬＳにおけるビメンチンの免疫染色を示す図である。
【図3】１０、２０、及び４０μｇ／ｍＬのＡＣ３を使用した、ＦＬＳ増殖の濃度依存性阻害を示す図である。２０及び４０μｇ／ｍｌで、ＦＬＳ対照と比較してＰ＜０．０１。
【図4】１０、２０、及び４０μｇ／ｍＬでの用量依存的な様式のＡＣ３の阻害の百分率を示す図である。２０及び４０μｇ／ｍｌで、ＦＬＳ対照と比較してＰ＜０．０１。
【図5】クルクミノイド、ＡＣ３、Ｃ３、及びＢＰＳのうちのいずれかによるＦＬＳ増殖の阻害の比較効果を示す図である。ＢＰＳ以外は、ＦＬＳ対照と比較してＰ＜０．０１。
【図6】ＦＬＳ増殖の阻害におけるＡＣ３及びＢＰＳの効果を示す図である。ＡＣ３の組合せ及び組合せで、ＦＬＳ対照と比較してＰ＜０．０１。
【図7】クルクミノイド、ＡＣ３、Ｃ３、及びＢＰＳの細胞周期阻害を示す図である。
【図8】クルクミノイド、ＡＣ３、Ｃ３、及びＢＰＳのうちのいずれかで処理した場合の、Ｓ期にある細胞の百分率を示す図である。
【図9】ＡＣ３、ＢＰＳで個々に処理した場合、及び組合せとしての場合の、細胞の百分率を示す図である。
【図10】未処理（図１０）、クルクミン（図１１）、ＢＤＭＣ（図１２）、ＤＭＣ（図１３）、ＡＣ３（図１４）、Ｃ３（図１５）、ＢＰＳ（図１６）、それぞれ４０及び８０μｇ／ｍＬ（図１７）、それぞれ１０及び４０μｇ／ｍＬのＡＣ３とＢＰＳの組合せ（図１８）についての、ＦＡＣＳを使用した細胞周期阻害を示す図である。
【図11】同上
【図12】同上
【図13】同上
【図14】同上
【図15】同上
【図16】同上
【図17】同上
【図18】同上
【図19】クルクミノイド、ＡＣ３、Ｃ３、ＢＰＳ、及びＡＣ３＋ＢＰＳの組合せのうちのいずれかを使用した、アポトーシス促進を示唆するＢａｘ／Ｂｃｌ２の比を示す図である。ＡＣ３、Ｃｕｒ、及びＢＤＭＣで、ＦＬＳ対照と比較してＰ＜０．０１。ＤＭＣ及びＡＣ３＋ＢＰＳでＰ＜０．０５。
【図20】対照（図２０）、ＢＤＭＣ（図２１）、クルクミン（図２２）、ＤＭＣ（図２３）、ＡＣ３（図２４）、Ｃ３（図２５）がそれぞれ１５μｇ／ｍＬ、ＢＰＳ（図２６）、ＡＣ３（１０μｇ／ｍＬ、図２７）、ＢＰＳ（４０μｇ／ｍＬ、図２８）、及びＡＣ３＋ＢＰＳの組合せ（１０＋４０μｇ／ｍＬ、図２９）で処理した場合の、遊走アッセイにおけるＦＬＳの遊走及び浸潤を示す図である。図３０及び３１は遊走の阻害の百分率を示す。
【図21】同上
【図22】同上
【図23】同上
【図24】同上
【図25】同上
【図26】同上
【図27】同上
【図28】同上
【図29】同上
【図30】同上
【図31】同上
【図32】対照、ＲＡ対照、セレコキシブ対照、クルクミノイド、ＡＣ３、Ｃ３、ＢＰＳ、及びＡＣ３＋ＢＰＳの組合せで処理した場合の関節炎スコアを示す図である。ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図33】対照、ＲＡ、セレコキシブ、ＡＣ３、ＢＰＳ、及びＡＣ３＋ＢＰＳの組合せで処理した場合の、Ｔｈ17（図３３）、Ｔｒｅｇ（図３４）に対する調節効果、及びＴｈ17／Ｔｒｅｇの比（図３５）を示す図である。正常（図３６）、ＡＣ３（５０ｍｇ／ｋｇ、図３７）、ＡＣ３（１００ｍｇ／ｋｇ、図３８）、ＢＰＳ（４０ｍｇ／ｋｇ、図３９）、ＡＣ３＋ＢＰＳ（５０＋４０ｍｇ／ｋｇ、図４０）、ＡＣ３＋ＢＰＳ（１００＋４０ｍｇ／ｋｇ、図４１）、セレコキシブ（図４２）のＦＡＣＳ研究。
【図34】同上
【図35】同上
【図36】同上
【図37】同上
【図38】同上
【図39】同上
【図40】同上
【図41】同上
【図42】同上
【発明を実施するための形態】
【0012】
選択された定義
本出願中で使用するすべての用語は、別段に指定しない限りは、従来技術において知られている通常の意味を持つ。本発明において使用するいくつかの他の具体的な定義を以下に説明し、これらは本明細書全体にわたって適用される。特許請求の範囲は、別段に指定されない限りは、より広い定義を提供する。
本出願中で使用するすべての用語は、別段に指定しない限りは、従来技術において知られている通常の意味を持つ。本発明において使用するいくつかの他の具体的な定義を以下に説明し、これらは本明細書全体にわたって適用される。特許請求の範囲は、別段に指定されない限りは、より広い定義を提供する。
【0013】
本出願では、試料へのあらゆる参照は、治療効果をもたらす以下の薬剤の１種又は組合せのいずれかをいう。薬剤としては、クルクミン、ビスデメトキシクルクミン、及びデメトキシクルクミンのいずれかを一般にいうクルクミノイド、又は適切に言及された場合はいつでもその組合せが挙げられる。濃縮ＢＤＭＣ組成物とは、少なくとも２０質量％のＢＤＭＣを含むクルクミノイド組成物をいう。より詳細には、ＡＣ３とは、２０～５０質量％のビスデメトキシクルクミン、１０～２５質量％のデメトキシクルクミン、及び３０～５０質量％のクルクミンである組成物をいう。Ｃ３複合体はクルクミンが濃縮されており、７５～８１％のクルクミン、１５～１９％のデメトキシクルクミン、及び２．２～６．５％のビスデメトキシクルクミンである。ボスウェル酸は、ＵＳ６０／２６８，７１３号に開示されているようにボスウェリア・セラータから単離された天然抽出物であり、ＰＳは、ボスウェリア・セラータのガム樹脂からの多糖である。具体的には、ボスウェル酸（Ｂ）に言及する場合はいつでも、これは、β－ボスウェル酸を２０～３０質量％、３－アセチル－１１－ケト－β－ボスウェル酸を１２質量％（ＡＫＢＡ）を含有するように標準化された、３５～５０質量％の総ボスウェル酸含有量を含む。多糖（ＰＳ）に言及する場合はいつでも、これは、３５～４５質量％の多糖（ＰＳ）を含んで、ガラクトース、アラビノース、及びＤ－グルクロン酸からなる中性糖を含有する。（ボスウェリア・セラータ組成物は、Ｓａｍｉ－Ｓａｂｉｎｓａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ、インドＢａｎｇａｌｏｒｅからＢｏｓｗｅｌｌｉｎ（登録商標）ＰＳとして市販されている）
【0014】
治療管理すること又は管理とは、本発明中に開示した状態を有効に寛解させる状態をいう。本明細書中における対照へのあらゆる参照は、実験、包含する実施例に応じて未処理、ＲＡ対照、又はセレコキシブ対照のいずれかをいい、適切な場合はいつでも、対照の詳細が言及されている。
本発明は、一般に、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸（Ｂ）、又は多糖（ＰＳ）を含む、線維芽細胞様滑膜細胞の増殖、遊走の阻害、並びにＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための方法及び組成物を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。本発明はまた、前述の組成物を使用した、対象における関節リウマチの治療管理の方法も包含する。
最も好ましい実施形態では、本発明は、２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走の阻害に使用するための組成物を開示する。
本発明は、一般に、個々の濃度のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸（Ｂ）、又は多糖（ＰＳ）を含む、線維芽細胞様滑膜細胞の増殖、遊走の阻害、並びにＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節に使用するための方法及び組成物を包含する。濃縮ＢＤＭＣクルクミノイドとＢＰＳの組合せを含む組成物も包含する。本発明はまた、前述の組成物を使用した、対象における関節リウマチの治療管理の方法も包含する。
最も好ましい実施形態では、本発明は、２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む、対象における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走の阻害に使用するための組成物を開示する。
【0015】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明は、２０質量％以上のビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の不均衡の調節に使用するための組成物を開示する。本実施形態の関連する態様では、不均衡は、３．５のＲＡ対照と比較して、Ｔh１７／Ｔｒｅｇの比を好ましくは１、又はより好ましくはＴh１７／Ｔｒｅｇの比を０～１として（図３５）、Ｔh１７細胞を低下させ、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させることによって調節し（図３３～３５、実施例９）、０．５のセレコキシブ対照とほぼ同等に良好となる（図３５）。
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、本発明は、２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための組成物を開示する。本実施形態の関連する態様では、哺乳動物における関節リウマチの管理は、線維芽細胞様滑膜細胞の増殖及び遊走の阻害、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節、炎症性マーカーのレベルの減少、並びにアポトーシスの促進によってもたらされる。本実施形態の関連する態様では、関節炎スコアの改善がもたらされる。線維芽細胞様滑膜細胞の阻害及び遊走、Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節、炎症性マーカーのレベルの減少、アポトーシスの促進、並びに関節炎スコアの改善の範囲及び詳細は、関連する実施形態中に説明されている。
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、本発明は、２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む、哺乳動物における関節リウマチの治療管理に使用するための組成物を開示する。本実施形態の関連する態様では、哺乳動物における関節リウマチの管理は、線維芽細胞様滑膜細胞の増殖及び遊走の阻害、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節、炎症性マーカーのレベルの減少、並びにアポトーシスの促進によってもたらされる。本実施形態の関連する態様では、関節炎スコアの改善がもたらされる。線維芽細胞様滑膜細胞の阻害及び遊走、Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節、炎症性マーカーのレベルの減少、アポトーシスの促進、並びに関節炎スコアの改善の範囲及び詳細は、関連する実施形態中に説明されている。
【0016】
本発明の別の最も好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物ＦＬＳを、２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む組成物と接触させるステップを含む、哺乳動物における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の増殖及び遊走を阻害する方法を開示する。
本発明の別の最も好ましい実施形態では、本発明は、ａ）Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴｒｅｇの不均衡を有する哺乳動物を同定するステップと、ｂ）２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む組成物を投与するステップとを含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡を調節する方法を開示する。本実施形態の関連する態様では、不均衡は、３．５のＲＡ対照と比較して、Ｔh１７／Ｔｒｅｇの比を好ましくは１、又はより好ましくはＴh１７／Ｔｒｅｇの比を０～１として（図３５）、Ｔh１７細胞を低下させ、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させることによって調節する（図３３～３５、実施例９）。
本発明の別の最も好ましい実施形態では、本発明は、ａ）Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴｒｅｇの不均衡を有する哺乳動物を同定するステップと、ｂ）２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む組成物を投与するステップとを含む、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡を調節する方法を開示する。本実施形態の関連する態様では、不均衡は、３．５のＲＡ対照と比較して、Ｔh１７／Ｔｒｅｇの比を好ましくは１、又はより好ましくはＴh１７／Ｔｒｅｇの比を０～１として（図３５）、Ｔh１７細胞を低下させ、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させることによって調節する（図３３～３５、実施例９）。
【0017】
本発明のさらに別の最も好ましい実施形態では、ａ）関節リウマチを有する対象を同定するステップと、ｂ）２０質量％以上で存在する濃縮ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含む組成物を投与するステップとを含む、対象における関節リウマチの治療管理の方法を開示する。本実施形態の関連する態様では、哺乳動物における関節リウマチの管理は、線維芽細胞様滑膜細胞の増殖及び遊走の阻害、哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）及びＴ細胞（Ｔｒｅｇ）において不均衡を調節すること、炎症性マーカーのレベルの減少、並びにアポトーシスの促進によってもたらされる。本実施形態の関連する態様では、関節炎スコアの改善がもたらされる。線維芽細胞様滑膜細胞の阻害及び遊走、Ｔ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節、炎症性マーカーのレベルの減少、アポトーシスの促進、並びに関節炎スコアの改善の範囲及び詳細は、関連する実施形態中に説明されている。
【0018】
組成物が２０～５０質量％のＢＤＭＣ、１０～２５質量％のデメトキシクルクミン（ＤＭＣ）、及び３０～５０質量％のクルクミンを含む、ＦＬＳの増殖及び阻害に関連する実施形態では、組成物中の総クルクミノイドは２０～９５質量％の範囲である。本発明の本実施形態の関連する態様では、組成物はボスウェリア・セラータからのボスウェル酸（Ｂ）及び多糖（ＰＳ）をさらに含み、ボスウェル酸及び多糖（ＢＰＳ）は、それぞれ３５～５０質量％及び３５～４５質量％の範囲で存在する。本発明の本実施形態及び他の実施形態の別の関連する態様では、個々に使用する場合に、組成物中のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、多糖の濃度は、１０～１００μｇ／ｍＬからなる範囲から選択される。本発明の本態様及び他の関連する実施形態では、組成物は、ＢＤＭＣクルクミノイドが濃縮された組成物を含み、ＢＰＳは、それぞれ１：１の比、又は好ましくは１：２の比、又は好ましくは１：３の比、又は好ましくは１：４の比、又は好ましくは４：１の比、又は好ましくは３：１の比、又は好ましくは２：１の比の組合せで存在する。本発明の本実施形態の関連する態様では、Ｃ３及びＢＰＳを、上記指定した範囲としての組合せとして使用する。指定した範囲内の組合せを見つける、又は適切な範囲を見つけることは、一般的な知識であり当業者に知られている。さらに、本発明の本態様及び他の実施形態では、より好ましくは、ＡＣ３を単独で又はＢＰＳと組み合わせて使用する。本発明の本実施形態及び他の実施形態のさらなる態様では、個々に使用する場合に、ＢＤＭＣ、クルクミン、ＤＭＣ、ＢＰＳ、ＡＣ３、Ｃ３の濃度は、１０～１００μｇ／ｍＬの範囲、又は好ましくは２０～８０μｇ／ｍＬの範囲、又は好ましくは４０～６０μｇ／ｍＬで使用する。
【0019】
本発明の本実施形態及び他の前述の実施形態の関連する態様では、線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の阻害は、細胞周期阻害、炎症性マーカーのレベルの減少、アポトーシスの促進、及び関節炎スコアの改善によってもたらされる。本実施形態の関連する態様では、試料を用いた処理の後、ＦＬＳ増殖の阻害は、未処理の対照と比較して１０～９０％の範囲、又はより好ましくは５０～９０％の範囲、又は最も好ましくは６０～９０％の範囲である（図３～６、実施例２）。本発明の本実施形態の関連する態様では、試料を用いた処理の後、細胞周期阻害はＧ０／Ｇ１期にあり、Ｓ期にある細胞の百分率は、１～２０％の範囲、又はより好ましくは１～１０％の範囲、又は最も好ましくは１～５％の範囲である（図７～９、実施例３）。本発明の本実施形態の関連する態様では、炎症性マーカーは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＣＣＬ－５、ＭＭＰ－３、及びカテプシンからなる群から選択される。本実施形態のさらなる一態様では、それぞれの試料を用いた処理の後、炎症性マーカーの発現レベルは、未処理の対照と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％低下する（表３、実施例４）。本実施形態のさらなる一態様では、炎症性マーカーＩＬ６のＥＬＩＳＡ研究により、ＡＣ３とＢＰＳの組合せが、ＡＣ３又はＢＰＳを個々に使用した場合と比較してより良好な阻害を示したことが示された（実施例４）。本実施形態のさらなる一態様では、試料を用いた処理の後、１の未処理の対照と比較して、１～１．５の範囲のＢａｘ／Ｂｃｌ２比の増加、又は好ましくは１．２５～１．５の範囲の比の増加で、アポトーシスが促進される（図１９、実施例５）。本実施形態のさらなる一態様では、ＦＬＳの遊走は試料を用いた処理の後に阻害され（図２０～３１、実施例６）、遊走の阻害は、未処理の対照と比較して、４０～８０％の範囲、又は好ましくは５０～８０％の範囲、又はより好ましくは５０～７０％の範囲であり（図３０）、ＡＣ３＋ＢＰＳの組合せは、個々の処理と比較して有効であった（図３１）。本実施形態の別の態様では、試料を用いた処理の後、関節炎スコアは、未処理の対照と比較して、１～３の範囲、より好ましくは１～２の範囲である（図３２、実施例８、ＲＡ対照は３．５であり、陽性対照セレコキシブは１である）。
【0020】
哺乳動物の脾臓中のＴ－ヘルパー１７（Ｔh１７）、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における不均衡の調節及び哺乳動物におけるＲＡの治療管理に関連する実施形態では、組成物は、個々に使用する場合に、組成物中のＢＤＭＣ、ＤＭＣ、クルクミン、クルクミノイド、ボスウェル酸、又は多糖の濃度は、好ましくは、４０ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）～１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）からなる範囲、又は好ましくは５０～１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）からなる範囲から選択される。関連する実施形態では、濃縮ＢＤＭＣクルクミノイド組成物及びＢＰＳは、それぞれ１：１の比、又は好ましくは１：２の比、又は好ましくは１：３の比、又は好ましくは１：４の比、又は好ましくは４：１の比、又は好ましくは３：１の比、又は好ましくは２：１の比の組合せで存在する。
本発明の別の関連する実施形態では、組成物は、安定化剤、生体利用能エンハンサー及び抗酸化剤、薬学的又は栄養補助食品的又は薬用化粧品的に許容される賦形剤及びエンハンサーをさらに含み、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー、又は食料品の形態で経口投与するために適切に配合されている（実施例１０）。投与のための適切な配合物を見つけ出すことは、当業者の技術範囲内に十分ある。
本発明の別の関連する実施形態では、組成物は、安定化剤、生体利用能エンハンサー及び抗酸化剤、薬学的又は栄養補助食品的又は薬用化粧品的に許容される賦形剤及びエンハンサーをさらに含み、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー、又は食料品の形態で経口投与するために適切に配合されている（実施例１０）。投与のための適切な配合物を見つけ出すことは、当業者の技術範囲内に十分ある。
【実施例】
【0021】
（実施例１）
線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の単離及び培養：以下の方法に従って、滑膜組織をコラーゲン誘導性関節炎ラットから無菌的条件下で得た（Jinjun Zhao, Qingqing Ouyang, Ziyou Hu,Qin Huang, Jing Wu, Ran Wang and Min Yang. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports 5: 171-175, 2016）。
ＦＬＳを滑膜組織から酵素消化によって単離した。手短に述べると、組織を顕微手術用ハサミで１ｍｍ3ブロックに分けた。その後、組織を、酵素消化のために、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中に０．１％のコラゲナーゼＩＩ型酵素を用いて、３７℃で４５分間、軌道攪拌インキュベーター（２００ｒｐｍ）中でインキュベートした。
線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の単離及び培養：以下の方法に従って、滑膜組織をコラーゲン誘導性関節炎ラットから無菌的条件下で得た（Jinjun Zhao, Qingqing Ouyang, Ziyou Hu,Qin Huang, Jing Wu, Ran Wang and Min Yang. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports 5: 171-175, 2016）。
ＦＬＳを滑膜組織から酵素消化によって単離した。手短に述べると、組織を顕微手術用ハサミで１ｍｍ3ブロックに分けた。その後、組織を、酵素消化のために、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中に０．１％のコラゲナーゼＩＩ型酵素を用いて、３７℃で４５分間、軌道攪拌インキュベーター（２００ｒｐｍ）中でインキュベートした。
【0022】
インキュベーション時間の後、チューブを激しく１～２分間渦攪拌して細胞を遊離させ、１００μｍのメッシュストレーナーを使用して濾過した。濾液を５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離し、細胞を、１０％のＦＢＳ並びに１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを添加したＤＭＥＭ中に再懸濁させ、３７℃、５％のＣＯ2下の加湿インキュベーター中で培養した。抗ビメンチン抗体（ＰＡ５－２７２３１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた細胞形態学的及び免疫細胞化学的染色に基づくＦＬＳ同定の後（図１及び２）、４～７継代の細胞をさらなる研究のために使用した。
【0023】
（実施例２）
ＷＳＴ－１増殖アッセイ：ＷＳＴ－１アッセイを使用して、ＦＬＳ増殖に対する様々な試料の効果を測定した。ＦＬＳを５×１０3個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。その後、細胞を、図３～６に示すように様々な濃度の試料（ＡＣ３、Ｃ３、Ｃｕｒ、ＢＤＭＣ、ＤＭＣ、ＢＰＳ）を用いて７２時間処理した。処理期間の後、無血清ＤＭＥＭ培養培地で１：１０に希釈した１００μｌのＷＳＴ－１試薬（５０１５９４４００１、Ｓｉｇｍａ、米国）をそれぞれのウェルに加え、３７℃、５％のＣＯ2下で２時間インキュベートした。６１０ｎｍの参照波長を用いて、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＡＣ３は、用量依存的な様式で、２０μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬでＦＬＳ増殖のより良好な阻害を示した（図３及び４）。ＦＬＳ増殖の阻害におけるクルクミノイド類似体の比較研究は、２０μｇ／ｍＬでＢＤＭＣ＞クルクミン＞ＤＭＣの傾向を示した一方で（図５）、ＢＰＳは１０％の阻害しか示さず、組合せは、Ｂｏｓｗｅｌｌｉｎ ＰＳ（ＢＰＳ）又はＡＣ３を個々に使用した場合よりもはるかに有効であった（図６）。
ＷＳＴ－１増殖アッセイ：ＷＳＴ－１アッセイを使用して、ＦＬＳ増殖に対する様々な試料の効果を測定した。ＦＬＳを５×１０3個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。その後、細胞を、図３～６に示すように様々な濃度の試料（ＡＣ３、Ｃ３、Ｃｕｒ、ＢＤＭＣ、ＤＭＣ、ＢＰＳ）を用いて７２時間処理した。処理期間の後、無血清ＤＭＥＭ培養培地で１：１０に希釈した１００μｌのＷＳＴ－１試薬（５０１５９４４００１、Ｓｉｇｍａ、米国）をそれぞれのウェルに加え、３７℃、５％のＣＯ2下で２時間インキュベートした。６１０ｎｍの参照波長を用いて、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＡＣ３は、用量依存的な様式で、２０μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬでＦＬＳ増殖のより良好な阻害を示した（図３及び４）。ＦＬＳ増殖の阻害におけるクルクミノイド類似体の比較研究は、２０μｇ／ｍＬでＢＤＭＣ＞クルクミン＞ＤＭＣの傾向を示した一方で（図５）、ＢＰＳは１０％の阻害しか示さず、組合せは、Ｂｏｓｗｅｌｌｉｎ ＰＳ（ＢＰＳ）又はＡＣ３を個々に使用した場合よりもはるかに有効であった（図６）。
【0024】
（実施例３）
細胞周期の分析：ＦＬＳ細胞（８×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。無血清培地中で２４時間同期させた後、細胞を、試料の存在あり又はなしで、ＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ中で２４時間処理した。処理期間の後、細胞を収集し、氷冷ＰＢＳ中に懸濁させた。遠心分離の後、渦攪拌しながら７０％の氷冷エタノールをペレットに滴下することによって細胞を固定し、４℃で３０分間保管した。細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間、３７℃、暗所で染色した。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａフローサイトメーター）によって分析した。クルクミノイドのうちＡＣ３、ＢＤＭＣがＦＬＳ複製の最大阻害を示し（図７、８、１２、及び１４）、ＦＬＳはＧ０／Ｇ１期で停止していた。Ｂｏｓｗｅｌｌｉｎ ＰＳ（ＢＰＳ）は、８０μｇ／ｍＬのみで阻害を示した（図８、図１６）。図９に例示するように、細胞周期阻害に対する組合せ（ＡＣ３＋ＢＰＳ）の効果は、使用した個々の試料（ＡＣ３及びＢＰＳ）よりも良好であった。
細胞周期の分析：ＦＬＳ細胞（８×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。無血清培地中で２４時間同期させた後、細胞を、試料の存在あり又はなしで、ＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ中で２４時間処理した。処理期間の後、細胞を収集し、氷冷ＰＢＳ中に懸濁させた。遠心分離の後、渦攪拌しながら７０％の氷冷エタノールをペレットに滴下することによって細胞を固定し、４℃で３０分間保管した。細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間、３７℃、暗所で染色した。ＤＮＡ含有量をフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａフローサイトメーター）によって分析した。クルクミノイドのうちＡＣ３、ＢＤＭＣがＦＬＳ複製の最大阻害を示し（図７、８、１２、及び１４）、ＦＬＳはＧ０／Ｇ１期で停止していた。Ｂｏｓｗｅｌｌｉｎ ＰＳ（ＢＰＳ）は、８０μｇ／ｍＬのみで阻害を示した（図８、図１６）。図９に例示するように、細胞周期阻害に対する組合せ（ＡＣ３＋ＢＰＳ）の効果は、使用した個々の試料（ＡＣ３及びＢＰＳ）よりも良好であった。
【0025】
（実施例４）
炎症性マーカーの測度：ＦＬＳ細胞（８×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えラットＴＮＦ－α（カタログ番号４００－１４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国ニュージャージー州）を用いて、様々な濃度の試料の存在あり又はなしで、ＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ中で６時間及び２４時間誘導して、試料の抗炎症効果を評価した。クルクミンは、炎症性マーカー（ＩＦＮγ、ＣＣＬ－５、ＭＭＰ－３、及びカテプシン、表２）を抑制することによってより良好な抗炎症活性を示した一方で、ＢＤＭＣはＴＮＦ－αにおいて最も有効であり、最も重要なことに、ＡＣ３とＢＰＳの組合せがすべての中で最も有効であった（表２）。
ＥＬＩＳＡ：２４時間のインキュベーション期間の後、培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ方法によって炎症性マーカーＩＬ６について評価した。１０μｇ／ｍＬ（ＡＣ３）及び４０μｇ／ｍＬ（ＢＰＳ）の濃度では、阻害は、ＡＣ３及びＢＰＳを個々に使用した場合の３及び１％と比較して、組合せとして使用した場合は２０％であった。
炎症性マーカーの測度：ＦＬＳ細胞（８×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えラットＴＮＦ－α（カタログ番号４００－１４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国ニュージャージー州）を用いて、様々な濃度の試料の存在あり又はなしで、ＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ中で６時間及び２４時間誘導して、試料の抗炎症効果を評価した。クルクミンは、炎症性マーカー（ＩＦＮγ、ＣＣＬ－５、ＭＭＰ－３、及びカテプシン、表２）を抑制することによってより良好な抗炎症活性を示した一方で、ＢＤＭＣはＴＮＦ－αにおいて最も有効であり、最も重要なことに、ＡＣ３とＢＰＳの組合せがすべての中で最も有効であった（表２）。
ＥＬＩＳＡ：２４時間のインキュベーション期間の後、培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ方法によって炎症性マーカーＩＬ６について評価した。１０μｇ／ｍＬ（ＡＣ３）及び４０μｇ／ｍＬ（ＢＰＳ）の濃度では、阻害は、ＡＣ３及びＢＰＳを個々に使用した場合の３及び１％と比較して、組合せとして使用した場合は２０％であった。
【0026】
試用したキットはラットＩＬ－６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ５０６－０５であった。
ＲＴ－ＰＣＲ発現研究：６時間のインキュベーションの後、未処理及び処理した細胞からの全細胞性ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者の指示に従って単離し、続いて無ＲＮａｓｅ ＤＮａｓｅ Ｉ処理（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を行ってあらゆるゲノムＤＮＡを除去した。メッセンジャーＲＮＡの品質及び濃度を分光光度的に分析した（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｒｅｖｅｒｔ－ａｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造者の指示に従って、１マイクログラムの全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、使用まで－８０℃で保管した。
ＲＴ－ＰＣＲ発現研究：６時間のインキュベーションの後、未処理及び処理した細胞からの全細胞性ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者の指示に従って単離し、続いて無ＲＮａｓｅ ＤＮａｓｅ Ｉ処理（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を行ってあらゆるゲノムＤＮＡを除去した。メッセンジャーＲＮＡの品質及び濃度を分光光度的に分析した（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｒｅｖｅｒｔ－ａｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造者の指示に従って、１マイクログラムの全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、使用まで－８０℃で保管した。
【0027】
その後、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｉｎｄｉａから入手した具体的に設計されたプライマーを使用したｃＤＮＡの増幅のために、２０μｌの反応混合物を、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲマスターミックスを使用したＰＣＲに供し、内部対照として、ハウスキーピング遺伝子βアクチンをそれぞれの反応と共に同時増幅させた（表２）。ＰＣＲはＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ ９６（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）において実施し、遺伝子のＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の初期変性、続いて、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のプライマーのアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長、及び７２℃で３０秒間の最終冷却からなる３５サイクルであった（表１）。
【0028】
【表1】
【0029】
【表2】
【0030】
（実施例５）
アポトーシス分析－ＦＬＳアポトーシスはＲＴ－ＰＣＲ発現研究を用いて評価した。手短に述べると、ＦＬＳ細胞（８×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。無血清培地中で２４時間同期させた後、細胞を、試料の存在あり又はなしで、ＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ中で２４時間処理した。処理期間の後、細胞を収集し、全細胞性ＲＮＡを単離し、以前に言及したようにＲＴ－ＰＣＲ分析用に処理した（表３）。ＢＣｌ－２及びＢａｘタンパク質ファミリーは、アポトーシスの調節において中心的な役割を果たす。Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比は、アポトーシスに対する細胞の感受性を決定するレオスタットとして働くことができ、アポトーシスを受けている細胞はより高いＢａｘ／Ｂｃｌ－２の比を有する（図１９）。対照と比較して、クルクミノイドの中でＢＤＭＣ＞ＤＭＣ＞クルクミンであり、ＡＣ３複合体はＣ３複合体よりも良好であった（図１９）。
アポトーシス分析－ＦＬＳアポトーシスはＲＴ－ＰＣＲ発現研究を用いて評価した。手短に述べると、ＦＬＳ細胞（８×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、終夜、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートした。無血清培地中で２４時間同期させた後、細胞を、試料の存在あり又はなしで、ＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ中で２４時間処理した。処理期間の後、細胞を収集し、全細胞性ＲＮＡを単離し、以前に言及したようにＲＴ－ＰＣＲ分析用に処理した（表３）。ＢＣｌ－２及びＢａｘタンパク質ファミリーは、アポトーシスの調節において中心的な役割を果たす。Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比は、アポトーシスに対する細胞の感受性を決定するレオスタットとして働くことができ、アポトーシスを受けている細胞はより高いＢａｘ／Ｂｃｌ－２の比を有する（図１９）。対照と比較して、クルクミノイドの中でＢＤＭＣ＞ＤＭＣ＞クルクミンであり、ＡＣ３複合体はＣ３複合体よりも良好であった（図１９）。
【0031】
【表3】
【0032】
（実施例６）
遊走アッセイ－ＦＬＳの遊走及び浸潤は、滑膜炎及び骨破壊において重要な役割を果たす。ＦＬＳは局所的に遊走し、血流を通じて遠位領域及び関節に浸潤する場合もある。ＲＡ－ＦＬＳは、軟骨のマトリックス分解をさらに悪化させ、最終的には骨侵食をもたらす、ＭＭＰを分泌する。
ＦＬＳの遊走潜在性は、単純な引っ掻きアッセイ及びＦＬＳ遊走による創傷の閉鎖を評価することによって研究することができる。未処理のＦＬＳは遊走し、創傷を閉鎖させる一方で、処理したものでは閉鎖が遅延する（J Immunol March 1, 2014, 192 (5) 2063-2070）。ＦＬＳ細胞（５×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートして約８０～９０％の集密度に達成させ、その後、２００μｌのピペットチップで引っ掻くことによって傷をつけた。細片及び浮遊細胞の完全除去を確実にするために、細胞をＰＢＳで洗浄した。その後、細胞を、２％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中の様々な濃度の試料と共にインキュベートした。対照試料は、いかなる試料をも含まない、細胞及び培養培地を含有していた。細胞遊走は、Ｍａｇｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して単層ギャップの閉鎖を評価することによって評価した。創閉鎖の阻害の百分率を対照ウェルと比較して計算した。対照（図２０）と比較して、それぞれ１５μｇ／ｍＬのクルクミノイドの中で、ＢＤＭＣ（図２１）はＤＭＣ（図２３）、クルクミン（図２２）よりも良好であった一方で、ＡＣ３複合体（図２４）はＣ３複合体（図２５）よりも良好であり、ＡＣ３＋Ｂｏｓｗｅｌｌｉｎ ＰＳ（ＢＰＳ）（図２９）はＡＣ３（図２７）及びＢＰＳ（図２８）よりも良好であった。
遊走アッセイ－ＦＬＳの遊走及び浸潤は、滑膜炎及び骨破壊において重要な役割を果たす。ＦＬＳは局所的に遊走し、血流を通じて遠位領域及び関節に浸潤する場合もある。ＲＡ－ＦＬＳは、軟骨のマトリックス分解をさらに悪化させ、最終的には骨侵食をもたらす、ＭＭＰを分泌する。
ＦＬＳの遊走潜在性は、単純な引っ掻きアッセイ及びＦＬＳ遊走による創傷の閉鎖を評価することによって研究することができる。未処理のＦＬＳは遊走し、創傷を閉鎖させる一方で、処理したものでは閉鎖が遅延する（J Immunol March 1, 2014, 192 (5) 2063-2070）。ＦＬＳ細胞（５×１０4個の細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に播種し、３７℃、５％のＣＯ2下でインキュベートして約８０～９０％の集密度に達成させ、その後、２００μｌのピペットチップで引っ掻くことによって傷をつけた。細片及び浮遊細胞の完全除去を確実にするために、細胞をＰＢＳで洗浄した。その後、細胞を、２％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中の様々な濃度の試料と共にインキュベートした。対照試料は、いかなる試料をも含まない、細胞及び培養培地を含有していた。細胞遊走は、Ｍａｇｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して単層ギャップの閉鎖を評価することによって評価した。創閉鎖の阻害の百分率を対照ウェルと比較して計算した。対照（図２０）と比較して、それぞれ１５μｇ／ｍＬのクルクミノイドの中で、ＢＤＭＣ（図２１）はＤＭＣ（図２３）、クルクミン（図２２）よりも良好であった一方で、ＡＣ３複合体（図２４）はＣ３複合体（図２５）よりも良好であり、ＡＣ３＋Ｂｏｓｗｅｌｌｉｎ ＰＳ（ＢＰＳ）（図２９）はＡＣ３（図２７）及びＢＰＳ（図２８）よりも良好であった。
【0033】
（実施例７）
ラットにおける関節炎研究
マウスモデル（表４）コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）は、広く研究されている関節リウマチの自己免疫モデルである。このモデルでは、自己免疫関節炎は、完全フロイントアジュバント中に乳化させたＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を用いた免疫化によって誘導する。これらの動物は、ヒト自己免疫疾患関節リウマチといくつかの臨床的、組織学的、及び免疫学的な特長を共有する自己免疫媒介性多発性関節炎を発生する。ＣＩＩに対する免疫応答は、コラーゲン特異的Ｔ細胞の刺激、並びに免疫原（異種ＣＩＩ）及び自己抗原（マウス又はラットＣＩＩ）のどちらにも特異的な高い力価の抗体の産生の両方によって特徴づけられている。
ラットにおける関節炎研究
マウスモデル（表４）コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）は、広く研究されている関節リウマチの自己免疫モデルである。このモデルでは、自己免疫関節炎は、完全フロイントアジュバント中に乳化させたＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を用いた免疫化によって誘導する。これらの動物は、ヒト自己免疫疾患関節リウマチといくつかの臨床的、組織学的、及び免疫学的な特長を共有する自己免疫媒介性多発性関節炎を発生する。ＣＩＩに対する免疫応答は、コラーゲン特異的Ｔ細胞の刺激、並びに免疫原（異種ＣＩＩ）及び自己抗原（マウス又はラットＣＩＩ）のどちらにも特異的な高い力価の抗体の産生の両方によって特徴づけられている。
【0034】
【表4】
【0035】
関節炎を、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を用いて１：１の比で乳化した２型コラーゲン（ニワトリ胸骨軟骨、Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｃ９３０１）を投与することによって誘導した。０日目に、ラットに、尾の基部に２００μＬ（２００μｇ／動物）のコラーゲン－ＦＩＡ乳剤を皮内注射した（初回免疫化）。ブースター注射には、乳剤を上記と同じように調製し、７日目に与える１００μＬ（１００μｇ／動物）のコラーゲン－ＦＩＡ乳剤で注射した。試験試料を０日目から２０日目まで投与した。
（実施例８）
関節炎スコア 関節炎スコア付けの標準方法を使用して、４つすべての足の腫脹及び紅班の度合を評価した。０－徴候なし、１－発赤で浮腫なし、２－発赤で緩和な浮腫あり、３－発赤で重篤な浮腫あり、４－発赤、重篤な浮腫、及び硬直した動き。ＡＣ３とＢＰＳの組合せ（図３２）は、それぞれ１００及び４０ｍｇ／ｋｇの濃度で有効であった。セレコキシブは、関節リウマチ対照と共に陽性対照として使用した。
（実施例８）
関節炎スコア 関節炎スコア付けの標準方法を使用して、４つすべての足の腫脹及び紅班の度合を評価した。０－徴候なし、１－発赤で浮腫なし、２－発赤で緩和な浮腫あり、３－発赤で重篤な浮腫あり、４－発赤、重篤な浮腫、及び硬直した動き。ＡＣ３とＢＰＳの組合せ（図３２）は、それぞれ１００及び４０ｍｇ／ｋｇの濃度で有効であった。セレコキシブは、関節リウマチ対照と共に陽性対照として使用した。
【0036】
（実施例９）
脾臓細胞の脾臓単離におけるＴｒｅｇ及びＴｈ１７の分析：リンパ球単離のために、脾臓をコラーゲン誘導性関節炎ラットから無菌的条件下で得た。脾臓を、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含有するＰＢＳで２回洗浄し、顕微手術用ハサミで小片に切断し、シリンジのプランジャー末端を用いてホモジネートし、１００μｍのメッシュストレーナーを使用して濾過した。濾液を５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離し、ＰＢＳで１～２洗浄し、その後、１×１０6個の細胞／ｍｌを、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地中に懸濁させた。不均衡は、３．５のＲＡ対照と比較して、Ｔh１７／Ｔｒｅｇの比を好ましくは１、又はより好ましくはＴh１７／Ｔｒｅｇの比を０～１として（図３５）、Ｔh１７細胞を低下させ、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させることによってもたらされる（図３３～３５）。
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析：Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞を評価するために、単離したリンパ球を、４時間、２０ｎｇ／ｍＬの酢酸ミリスチン酸ホルボール（Ｐ８１３９、Ｓｉｇｍａ）及び５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン、及び製造者によって提案された濃度の、モネンシンを含有するタンパク質輸送阻害剤であるＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（５５４７２４、ＢＤ）で刺激した。
脾臓細胞の脾臓単離におけるＴｒｅｇ及びＴｈ１７の分析：リンパ球単離のために、脾臓をコラーゲン誘導性関節炎ラットから無菌的条件下で得た。脾臓を、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含有するＰＢＳで２回洗浄し、顕微手術用ハサミで小片に切断し、シリンジのプランジャー末端を用いてホモジネートし、１００μｍのメッシュストレーナーを使用して濾過した。濾液を５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離し、ＰＢＳで１～２洗浄し、その後、１×１０6個の細胞／ｍｌを、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地中に懸濁させた。不均衡は、３．５のＲＡ対照と比較して、Ｔh１７／Ｔｒｅｇの比を好ましくは１、又はより好ましくはＴh１７／Ｔｒｅｇの比を０～１として（図３５）、Ｔh１７細胞を低下させ、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させることによってもたらされる（図３３～３５）。
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析：Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞を評価するために、単離したリンパ球を、４時間、２０ｎｇ／ｍＬの酢酸ミリスチン酸ホルボール（Ｐ８１３９、Ｓｉｇｍａ）及び５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン、及び製造者によって提案された濃度の、モネンシンを含有するタンパク質輸送阻害剤であるＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（５５４７２４、ＢＤ）で刺激した。
【0037】
刺激の後、細胞を収集し、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ集団を評価するために２×１０5個の細胞を異なるチューブに分割した。分析のために使用した抗体希釈率は、それぞれの製造者によって推奨された通りであった。Ｔｈ１７集団を評価するために、細胞を最初にＦＩＴＣマウス抗ラットＣＤ３（５５９９７５、ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＡＰＣマウス抗ラットＣＤ４（５５００５７、ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体で染色した。Ｔｒｅｇ集団を評価するために、細胞を最初にＡＰＣマウス抗ラットＣＤ４（５５００５７、ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＢＶ４２１マウス抗ラットＣＤ２５（５６５６０８、ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体で染色した。それぞれの表面染色抗体の添加に続いて、チューブを３０分間、４℃、暗所でインキュベートした。表面染色の後、固定及び透過処理溶液（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、５５４７２２）を使用して、製造者の指示に従って、細胞を固定及び透過処理（ｐｅｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）し、サポニン含有緩衝液（ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ、５５４７２３）中に再懸濁させた。固定及び透過処理に続いて、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞を、ＰＥコンジュゲート抗マウス／ラットＩＬ－１７Ａ（１２－７１７７－８１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＥコンジュゲート抗ＦＯＸＰ３（１２－５７７３－８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体のそれぞれと、３０分間、４℃、暗所でインキュベートした。その後、細胞をサポニン含有緩衝液で２回洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁させた後、フローサイトメトリー分析を行った。ＦＣＭはＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【0038】
（実施例１０）
配合物：組成物を薬学的／栄養補助食品的許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤、安定化剤、分散性ガム、生体利用能エンハンサー又は担体と共に配合し、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー、又は食料品の形態で経口投与する。
配合物：組成物を薬学的／栄養補助食品的許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤、安定化剤、分散性ガム、生体利用能エンハンサー又は担体と共に配合し、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ、散剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー、又は食料品の形態で経口投与する。
【0039】
関連する態様では、生体利用能エンハンサーは、ピペリン（ＢｉｏＰｅｒｉｎｅ（登録商標））、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、及びナリンギンの群から選択される。別の関連する態様では、安定化剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ亜硫酸水素ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸、及びトコフェロールからなる群から選択される。さらに別の関連する態様では、分散性ガムは、寒天、アルギネート、カラゲナン、アラビアガム、グアルガム、イナゴマメガム、コンニャクガム、キサンタンガム、及びペクチンからなる群から選択される。
表５～９は、ビスデメトキシクルクミンを含有する栄養補助食品配合物の例示的な例を提供する。
表５～９は、ビスデメトキシクルクミンを含有する栄養補助食品配合物の例示的な例を提供する。
【0040】
【表5】
【0041】
【表6】
【0042】
【表7】
【0043】
【表8】
【0044】
【表9】
【0045】
上記配合物は単なる例示的な例であり、前記目的を意図する、上記活性成分を含有するあらゆる配合物が均等物であるとみなされる。
本発明の他の改変及び変動は、前述の開示及び教示から当業者に明らかであろう。したがって、本発明の特定の実施形態のみを本明細書中に具体的に記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに数々の改変をそれに行ってよく、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきであることが、明らかであろう。
本発明の他の改変及び変動は、前述の開示及び教示から当業者に明らかであろう。したがって、本発明の特定の実施形態のみを本明細書中に具体的に記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに数々の改変をそれに行ってよく、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきであることが、明らかであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【配列表】
【国際調査報告】