(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-28
(54)【発明の名称】遺伝子改変細胞追跡用ペプチドマーカー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20231221BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20231221BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231221BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20231221BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20231221BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231221BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231221BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231221BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231221BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/113 Z ZNA
C07K19/00
C07K16/18
C07K14/705
C12N5/10
A61K35/17
A61P35/00
A61P43/00 105
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537498
(86)(22)【出願日】2021-12-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-16
(86)【国際出願番号】 US2021073057
(87)【国際公開番号】W WO2022140774
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】63/129,480
(32)【優先日】2020-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/170,196
(32)【優先日】2021-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522014792
【氏名又は名称】ネオジン セラピューティクス ビー．ブイ．
(74)【代理人】
【識別番号】110003694
【氏名又は名称】弁理士法人有我国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カーステン リンネマン
(72)【発明者】
【氏名】トマス クイルマン
(72)【発明者】
【氏名】ギャビン エム．ベンドル
(72)【発明者】
【氏名】イェルン ダブリュ．ジェイ．ファン ヘイスト
(72)【発明者】
【氏名】シャンジュン コン
(72)【発明者】
【氏名】レーク ヨセフス エゲルモン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB211
4C084ZB261
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB21
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
(57)【要約】
注入した遺伝子改変細胞の管理を可能にするためには、遺伝子改変細胞が、そのような細胞を未改変細胞のプール中で検出するために使用可能なマーカーを発現していることが有用である。いくつかの態様は、ＴＣＲ定常ドメインと、ＴＣＲ定常ドメイン中に存在し、検出および同定が可能な配列を含む外因性アミノ酸変種を含む標識タンパク質に関する。他の態様は、ＴＣＲ鎖に結合した抗体エピトープに関する。標識タンパク質と抗体エピトープはいずれも、遺伝子改変細胞を追跡するのに用いることができる。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標識タンパク質であって、ＴＣＲ定常ドメイン；および
ＴＣＲ定常ドメイン中に存在し、検出および同定が可能な配列を含む外因性アミノ酸変種を含んでいる、標識タンパク質。
【請求項2】
前記ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常ドメインを含む、請求項１の標識タンパク質。
【請求項3】
前記外因性アミノ酸変種が前記ＴＣＲ定常ドメインの配列に変異を含み、必要に応じて、前記標識タンパク質がｈｕＴＲＢＣ１－ｍｕｒ６またはｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕｒ６を含む、請求項１の標識タンパク質。
【請求項4】
前記ＴＣＲ定常ドメインが一つの種に由来し、前記外因性アミノ酸変種が別の種に由来する、請求項１の標識タンパク質。
【請求項5】
前記ＴＣＲ定常ドメインがヒトに由来し、前記外因性アミノ酸変種が非ヒト種に由来する、請求項４の標識タンパク質。
【請求項6】
前記非ヒト種がマウスである、請求項５の標識タンパク質。
【請求項7】
前記ＴＣＲ定常ドメインが前記ヒトＴＲＢＣ２遺伝子によってコードされている配列を含む、請求項３の標識タンパク質。
【請求項8】
前記外因性アミノ酸変種が前記マウスＴＣＲ Ｃβドメインの配列を含む、請求項３の標識タンパク質。
【請求項9】
前記変異が１０のアミノ酸変異を含む、請求項３の標識タンパク質。
【請求項10】
前記変異が非連続的配列を形成する、請求項９の標識タンパク質。
【請求項11】
１０のアミノ酸変異が、配列番号８の付番方法によって、Ｋ４Ｒ、Ｆ７Ｔ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ１０６Ｅ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、Ａ１１４Ｐと番号づけられる、請求項９の標識タンパク質。
【請求項12】
前記変異が６のアミノ酸変異を含む、請求項３の標識タンパク質。
【請求項13】
６のアミノ酸変異がＫ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓであり、必要に応じて前記標識タンパク質が配列番号２７を含む、請求項１２の標識タンパク質。
【請求項14】
前記外因性アミノ酸変種を抗体、ナノボディ、Ｆａｂ断片またはダーピン（ＤＡＲＰｉｎ）によって検出および同定することが可能な、請求項１の標識タンパク質。
【請求項15】
前記外因性アミノ酸変種が抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７－５９７で検出および同定することが可能な、請求項１の標識タンパク質。
【請求項16】
そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、請求項１～１５のいずれか１項に記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
【請求項17】
前記遺伝子改変細胞が遺伝子改変Ｔ細胞を含む、請求項１６の標識タンパク質。
【請求項18】
前記遺伝子改変Ｔ細胞が治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されたＴ細胞を含む、請求項１７の標識タンパク質。
【請求項19】
治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された前記Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、請求項１８の標識タンパク質。
【請求項20】
治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された遺伝子改変Ｔ細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、ここで前記標識タンパク質が前記マウスＴＣＲ Ｃβドメインに由来し、そして、前記ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメイン中に存在するアミノ酸を変異させることによって前記ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインに導入される、標識タンパク質。
【請求項21】
癌治療用新規ＴＣＲ遺伝子で改変した細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、請求項１～２０のいずれか１項に記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか１項に記載の標識タンパク質を有する遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いられるキットであって、前記標識タンパク質を認識する抗体を含む、キット。
【請求項23】
前記遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、前記請求項２２のキット。
【請求項24】
前記Ｔ細胞が治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている、請求項２３のキット。
【請求項25】
治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている前記Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、請求項２４のキット。
【請求項26】
そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞への１つ以上の搭載物の標的化送達に用いられる標識タンパク質であって、請求項１～１５のいずれか１項に記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
【請求項27】
１つ以上の搭載物の前記送達が、抗体、抗体模倣タンパク質または他の任意の抗原結合足場への接合によって達成される、請求項２６の標識タンパク質。
【請求項28】
前記抗体が抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７－５９７である、請求項２７の標識タンパク質。
【請求項29】
前記１つ以上の搭載物がタンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である、請求項２６の標識タンパク質。
【請求項30】
前記送達される搭載物がサイトカインである、請求項２６の標識タンパク質。
【請求項31】
前記サイトカインがＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの群から選択される、請求項３０の標識タンパク質。
【請求項32】
前記サイトカインの配列が、その天然の受容体分子との相互作用を調節するように改変されている、請求項３０の標識タンパク質。
【請求項33】
前記サイトカインがＴ細胞によって発現される受容体分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項３０の標識タンパク質。
【請求項34】
前記搭載物がＴ細胞によって発現される受容体分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項２６の標識タンパク質。
【請求項35】
前記アゴニストがＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７またはＣＤ２７８に結合する、請求項３４の標識タンパク質。
【請求項36】
前記アンタゴニストがＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体に結合する、請求項３４の標識タンパク質。
【請求項37】
前記搭載物が、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する小分子である、請求項２６の標識タンパク質。
【請求項38】
前記小分子が、ＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体いずれかのシグナル伝達を阻害する、請求項３７の標識タンパク質。
【請求項39】
前記搭載物が、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する核酸である、請求項２６の標識タンパク質。
【請求項40】
前記核酸がｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項３９の標識タンパク質。
【請求項41】
前記搭載物が二重または三重特異性抗体である、請求項２６の標識タンパク質。
【請求項42】
標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するための方法であって、前記１つ以上の搭載物と前記標識タンパク質に特異的に結合する結合剤とを含む複合体を得ること、および
前記遺伝子改変細胞と前記複合体とを接触させること
を含む、方法。
【請求項43】
前記結合剤が、抗体、抗体模倣タンパク質、または他の任意の抗原結合足場である、請求項４２の方法。
【請求項44】
前記１つ以上の搭載物が、タンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である、請求項４２の方法。
【請求項45】
そのような抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、ここで前記抗体エピトープがＴＣＲ鎖またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合している、抗体エピトープ。
【請求項46】
前記抗体エピトープが、ＴＣＲ鎖のＣ末端もしくはＮ末端またはＣＡＲのＣ末端もしくはＮ末端に結合している、請求項４５の抗体エピトープ。
【請求項47】
前記抗体エピトープが、ＴＣＲ鎖またはＣＡＲに挿入される、請求項４５の抗体エピトープ。
【請求項48】
前記遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、請求項４５の抗体エピトープ。
【請求項49】
Ｔ細胞が、治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されている、請求項４８の抗体エピトープ。
【請求項50】
治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されているＴ細胞が癌の治療に用いられる、請求項４９の抗体エピトープ。
【請求項51】
前記抗体エピトープが、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖を連結するために、またはＣＡＲと他の遺伝子によってコードされているタンパク質とを連結するために用いられる、請求項４５の抗体エピトープ。
【請求項52】
２Ａペプチド配列、ＨＡ．１１エピトープタグ、ＦＬＡＧエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープタグ、Ｖ５エピトープタグ、または２Ａペプチドと同数までのアミノ酸を含有するペプチドを含む、請求項４５の抗体エピトープ。
【請求項53】
前記２Ａペプチドが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａであり得る、請求項５２の抗体エピトープ。
【請求項54】
２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、前記２Ａペプチド配列が全長２Ａ配列ではない、請求項４５の抗体エピトープ。
【請求項55】
前記ペプチド配列が、配列番号１（ＣＧＤＶＥＥＮＰＧ）またはそれと少なくとも７５％同一の配列を含む、請求項５４の抗体エピトープ。
【請求項56】
前記抗体エピトープが、モノクローナル抗２Ａペプチド抗体３Ｈ４によって同定され得る、請求項５４または５５の抗体エピトープ。
【請求項57】
治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている遺伝子改変Ｔ細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、請求項４５～５６のいずれか１項に記載の抗体エピトープを含む、抗体エピトープ。
【請求項58】
癌治療用新規ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子によって改変された細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、請求項４５～５６のいずれか１項に記載の抗体エピトープを含んでいる、抗体エピトープ。
【請求項59】
遺伝子改変細胞の検出に用いられるキットであって、請求項４５～５６のいずれか１項に記載の抗体エピトープを含んでいる、キット。
【請求項60】
前記遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、請求項５９のキット。
【請求項61】
前記Ｔ細胞が、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている、請求項６０のキット。
【請求項62】
治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている前記Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、請求項６１のキット。
【請求項63】
２Ａペプチド配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を発現することが可能なヌクレオチド配列を含んでいる遺伝子構築物であって、ここで前記構築物が単一の読み取り枠から複数のタンパク質を発現するように構成されており、かつ、前記ヌクレオチド配列が前記遺伝子構築物の大きさを２５アミノ酸より大きくしない、遺伝子構築物。
【請求項64】
前記２Ａペプチド配列が、２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、前記２Ａペプチド配列が全長２Ａ配列ではない、請求項６３の遺伝子構築物。
【請求項65】
前記２Ａペプチド配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号６の配列、または配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号６と少なくとも７５％同一の配列を含む、請求項６４の遺伝子構築物（配列番号２＝ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号３＝ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号６＝ＧＤＶＥＥＮＰＧ）。
【請求項66】
請求項１～１５のいずれか１項に記載の標識タンパク質、または請求項５３～５５のいずれか１項に記載の抗体エピトープ、または請求項６３～６５のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を含んでいる、遺伝子改変細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
国外または国内の優先権を主張する全ての出願が、本出願とともに提出される出願データシートで特定されており、３７ＣＦＲ１．５７に基づいて、それらは参照することにより本明細書に組み入れられる。
国外または国内の優先権を主張する全ての出願が、本出願とともに提出される出願データシートで特定されており、３７ＣＦＲ１．５７に基づいて、それらは参照することにより本明細書に組み入れられる。
【0002】
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２１年１２月２０日に作成され、サイズが５７,９４３バイトの「ＮＴＢＶ．０１６ＷＯ．ｘｍｌ」と題するファイルとして提供される。電子形式の配列表に含まれる情報は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２１年１２月２０日に作成され、サイズが５７,９４３バイトの「ＮＴＢＶ．０１６ＷＯ．ｘｍｌ」と題するファイルとして提供される。電子形式の配列表に含まれる情報は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
細胞治療とは、患者に生細胞を注入する、移植する、または埋め込むことで、例えば、免疫療法では細胞媒介免疫によって癌細胞と闘うＴ細胞を移植することで、あるいは病気組織を再生するために幹細胞を移植することで、薬効を得る治療法である。
【発明の概要】
【0004】
本明細書に記載のいくつかの態様は、ＴＣＲ定常ドメインと、ＴＣＲ定常ドメインの中に存在し、検出および同定可能な配列を含む外因性アミノ酸変種とを含んでいる標識タンパク質に関する。
【0005】
いくつかの態様では、標識タンパク質を遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いることが可能である。標識タンパク質すなわちタンパク質マーカーは、マーカーとして機能させることができ；このマーカーを見つけることによって、標識タンパク質を有する任意の細胞を、検出、単離、または低減することができる。標識タンパク質は、好適な抗体によって同定することが可能なエピトープペプチドを含む場合がある。
【0006】
本明細書に記載のいくつかの態様は、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された遺伝子改変Ｔ細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質に関し、ここでこの標識タンパク質はマウスＴＣＲ Ｃβドメインに由来し、そして、ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメイン中に存在するアミノ酸を変異させることによって、ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインに導入される。
【0007】
いくつかの態様では、癌治療用の新規ＴＣＲ遺伝子によって改変された細胞を検出、単離または低減するための標識タンパク質であって、本明細書で提供する態様のいずれか１つの標識タンパク質を含む、標識タンパク質を提供する。
【0008】
いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの標識タンパク質を有する遺伝子改変細胞を検出、単離または低減するために用いられる、その標識タンパク質を認識する抗体または結合剤を含む、キットに関する。
【0009】
いくつかの態様は、そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するために用いられる標識タンパク質であって、本明細書に記載の態様のいずれか一つの標識タンパク質を含む、標識タンパク質に関する。
【0010】
いくつかの態様は、標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するための方法に関する。この方法は、ａ）１つ以上の搭載物と、標識タンパク質に特異的に結合する結合剤とを含む複合体を得ること、およびｂ）遺伝子改変細胞と複合体とを接触させること、を含む。
【0011】
いくつかの態様は、ＴＣＲ鎖に挿入されるか、またはＴＣＲ鎖の一部を構成し得る抗体エピトープに関する。いくつかの態様においてエピトープは、そのような抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞を検出するために用いることができ、ここでこの抗体エピトープは、ＴＣＲ鎖またはキメラ抗原受容体に結合されている。いくつかの態様において抗体エピトープは２Ａペプチド配列、ＨＡ．１１エピトープタグ、ＦＬＡＧエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープタグ、またはＶ５エピトープタグを含む。いくつかの態様において抗体エピトープはＴＣＲ鎖の定常ドメインに挿入され、ＴＣＲの可変ドメインには挿入されない。いくつかの態様において抗体エピトープは、ＴＣＲ鎖の１つ以上の位置でアミノ酸を変異させることによって導入されるが、ＴＣＲ鎖に外因性の付加的なアミノ酸を付加することによっては導入されない。
【0012】
いくつかの態様は、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された遺伝子改変Ｔ細胞を検出するために用いられる抗体エピトープであって、前述した態様のいずれか一つの抗体エピトープを含む、抗体エピトープに関する。
【0013】
いくつかの態様は、癌治療用の新規ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子によって改変された細胞を検出するために用いられる抗体エピトープであって、前述した態様のいずれか一つの抗体エピトープを含む、抗体エピトープに関する。
【0014】
いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞を検出するために用いられるキットに関する。
【0015】
いくつかの態様は、２Ａペプチド配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を発現することが可能なヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物に関し、ここでこの構築物は単一の読み取り枠から複数のタンパク質を発現するように構成されており、かつ、ヌクレオチド配列は遺伝子構築物の大きさを２５アミノ酸より大きくしない。本明細書で使用する場合、関連するペプチドの文脈における「遺伝子」は、そのペプチド配列をコードしている核酸配列を指し、それ以上のものを指すものではない。
【0016】
いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に関する。
【0017】
本発明のこれらのおよび他の特徴、側面、および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲を参照することにより、より深く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＴＣＲ定常ドメインエピトープの模式図。
【図2A】抗体エピトープがＴＣＲ鎖のＣ末端に結合している抗体エピトープの模式図を示す。
【図2B】抗体エピトープがＴＣＲ鎖のＮ末端に結合している抗体エピトープの模式図を示す。
【図2C】抗体エピトープがＴＣＲ鎖に挿入されている抗体エピトープの模式図を示す。
【図2D】抗体エピトープがＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を連結するために用いられている抗体エピトープの模式図を示す。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の位置は入れ替えてもよい。
【図3】種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。データは、全長マウスＴｒｂｃ２配列を用いた場合には、ＴＣＲを発現させるのに外因性ポリＡシグナルが有効であること、およびＨ５７抗体によって、全長マウスＴｒｂｃ２配列を発現している細胞を認識できることを示している。
【図4】種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。データは、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識を可能にするには、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基、ならびにＦＧループをヒトＴＲＢＣ２配列に組み入れるだけで十分なことを示している。
【図5】種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。データは、Ｈ５７抗体による認識を可能にするには、マウスＴｒｂｃ２ Ａストランドに由来する６のアミノ酸残基とＦＧループが必要であることを示している。
【図6】種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。データは、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識を可能にするには、マウスＴｒｂｃ２ Ａストランドに由来する６のアミノ酸残基とＦＧループをヒトＴＲＢＣ２配列に組み入れるだけで十分なことを示している。
【図7】種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。データは、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体によって検出できることを示している。
【図8】種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。データは、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体によって検出できること、そしてこの２Ａペプチドの染色とＴＣＲ Ｖβ１３．１の染色との間に相関があることを示している。
【図9】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するようにレトロウイルスを介して形質導入したヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。データは、２Ａペプチド配列を含むＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体によって検出できること、そしてこの２Ａペプチドの染色と同じ構築物中に存在する形質導入マーカータンパク質（Ｌｙ６Ｇ）の染色との間に相関があることを示している。
【図10】２Ａペプチド抗体３Ｈ４を産生するのに用いた免疫原の配列を示す（配列番号１）。
【図11】Ｔ２Ａペプチド配列を示す（配列番号２）。
【図12】Ｐ２Ａペプチド配列を示す（配列番号３）。
【図13】Ｈ５７抗体によって検出可能なマウスＴＣＲエピトープを有するヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインの配列を示す（配列番号４）。
【図14】３Ｈ４抗体によって検出可能なＴ２Ａペプチドエピトープに連結されたヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインの配列を示す（配列番号５）。
【図15】Ｔ２ＡまたはＰ２Ａペプチド配列の断片を示す（配列番号６）。
【図16】Ｅ２ＡまたはＦ２Ａペプチド配列の断片を示す（配列番号７）。
【図17】ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインの配列を示す（配列番号８）。
【図18】抗体を加えずに、またはＨ５７、Ｈ５７－ＩＬ２、もしくはＨ５７－ＩＬ２ｖを加えてプレインキュベーションした後、標識したＨ５７抗体で染色したｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲジャーカット細胞のＦＡＣＳ分析のヒストグラムを示す。本図における染色の減少は、プレインキュベーションによる抗体または融合タンパク質の結合を反映したものである。
【図19】抗体を加えずに、またはＨ５７、Ｈ５７－ＩＬ２、もしくはＨ５７－ＩＬ２ｖを加えてプレインキュベーションした後、標識したＨ５７抗体で染色したｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲ初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析のヒストグラムおよび拮抗濃度曲線を示す。本図における染色の減少は、プレインキュベーションによる抗体または融合タンパク質の結合を反映したものである。
【図20】ＩＬ２を認識する標識抗体によって染色したｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲ初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析のヒストグラムおよび結合濃度曲線を示す。
【図21】ＩＬ２、Ｈ５７－ＩＬ２、またはＨ５７－ＩＬ２ｖ融合タンパク質に応答して発現したＣＤ２５およびＣＤ６９によって測定した、刺激応答のＦＡＣＳプロットを示す。
【図22】ＩＬ２、Ｈ５７－ＩＬ２、またはＨ５７－ＩＬ２ｖ融合タンパク質の濃度変化に応答したＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を示す。
【図23】ＩＬ２、Ｈ５７－ＩＬ２、またはＨ５７－ＩＬ２ｖ融合タンパク質に応答したセルトレースバイオレット（ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ）によって測定した増殖の増加を示すＦＡＣＳ分析のヒストグラムである。
【図24】ＩＬ２、Ｈ５７－ＩＬ２、またはＨ５７－ＩＬ２ｖ融合タンパク質の濃度変化に応答したセルトレースバイオレットによって測定した増殖の増加を示す。
【図25】Ｈ５７と、ｍｕＴＲＢＣ２、ｈｕＴＲＢＣ１－Ｍｕｒ６、およびｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４を発現している細胞のヒトＴＣＲβ定常ドメインに結合する抗体との結合に関するＦＡＣＳプロットを示す。
【図26A】ｍｕＴＲＢＣ２、ｈｕＴＲＢＣ２、およびｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲを発現している初代Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γとＩＬ２の増加を示す。標的細胞に負荷したＮＹ－ＥＳＯペプチドの濃度変化に応じたＩＦＮ－γの濃度変化を示す。
【図26B】ｍｕＴＲＢＣ２、ｈｕＴＲＢＣ２、およびｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲを発現している初代Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γとＩＬ２の増加を示す。最も高濃度のペプチド負荷した個々の実験においてマーカー（ＩＦＮ－γ）を発現していた細胞の割合のドットプロットを示す。
【図26C】ｍｕＴＲＢＣ２、ｈｕＴＲＢＣ２、およびｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲを発現している初代Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γとＩＬ２の増加を示す。標的細胞に負荷したＮＹ－ＥＳＯペプチドの濃度変化に応じたＩＬ２の濃度変化を示す。
【図26D】ｍｕＴＲＢＣ２、ｈｕＴＲＢＣ２、およびｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲを発現している初代Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γとＩＬ２の増加を示す。最も高濃度のペプチド負荷した個々の実験においてマーカー（ＩＬ２）を発現していた細胞の割合のドットプロットを示す。
【図27A】ｍｕＴＲＢＣ２、ｈｕＴＲＢＣ２、およびｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲを発現しているＴ細胞と共培養した間の標的細胞数の経時変化を示す。
【図27B】最も長期間（７２時間）共培養したときの個々の実験における、残存した関連細胞数のドットプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
上述した発明の概要、および発明を実施するための形態、ならびに後述する特許請求の範囲において、本発明の特定の特徴に言及した。本明細書における本発明の開示は、そのような特定の特徴のすべての可能な組み合わせを含むと理解される。例えば、特定の特徴が本発明の特定の側面もしくは態様、または特定の請求項の文脈において開示される場合、その特徴はまた、可能な範囲で、本発明の他の特定の側面および態様と組み合わせて、および／または本発明の他の特定の側面および態様の文脈で、ならびに本発明一般において使用することが可能である。
【0020】
細胞治療には、患者に細胞を注入、あるいは移植する治療が含まれる。遺伝子改変Ｔ細胞はそのような材料の一つである。注入した遺伝子改変Ｔ細胞の管理を可能にするにあたっては、未改変細胞のプール中にあっても、遺伝子改変Ｔ細胞がそのようなＴ細胞を検出するのに使用可能なマーカーを発現することが有用である。そのようなマーカーは、製造工程においてうまく改変できたＴ細胞を単離するのに用いることができたり、あるいは、患者に投与された後に、それらのＴ細胞を追跡したり、または低減させたりできることが理想的である。さらに、そのようなマーカーは非免疫原性であり、また、治療用遺伝子構築物の天然の一部を構成するものでなくてはならない。そのようなマーカーは例えば、抗体がそれに結合可能なエピトープを形成することができるポリペプチドであり得る。
【0021】
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いることが可能な標識タンパク質に関する。標識タンパク質すなわちタンパク質マーカーは、マーカーとして機能させることができ；このマーカーを見つけることで、標識タンパク質を含む任意の細胞を検出、単離または低減することができる。いくつかの態様において標識タンパク質は、ＴＣＲ定常ドメインと、ＴＣＲ定常ドメイン中に存在し、検出および同定が可能な配列を含む外因性アミノ酸変種とを含む。
【0022】
いくつかの態様は、そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するために用いられる標識タンパク質であって、本明細書に記載の態様のいずれか一つの標識タンパク質を含む、標識タンパク質に関する。
【0023】
いくつかの態様は、ＴＣＲ鎖に挿入されるか、またはＴＣＲ鎖の一部を構成し得る抗体エピトープに関する。いくつかの態様においてエピトープは、そのような抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞の検出に使用可能であり、ここでこの抗体エピトープはＴＣＲ鎖またはキメラ抗原受容体に結合されている。
定義
定義
【0024】
本明細書全体を通じて「含む」という用語、または「含まれる」もしくは「含んでいる」などの変形は、言及している要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むことを意味し、他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外しないものと理解される。
【0025】
以下の用語および方法の説明は、本開示をより良く説明するため、および当業者が本開示を実施する際の指針とするために提供される。単数形の「１つ」、「１種」、および「この」は、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、１つまたは２つ以上を指す。例えば、「核酸分子を含んでいる」という用語は、単一のまたは複数の核酸分子を含むもので、「少なくとも１つの核酸分子を含んでいる」という句と同等であるとみなされる。「または」という用語は、文脈からそうではないことが明らかでない限り、記載された代替要素の単一の要素または２つ以上の要素の組合せを指す。本明細書で使用する場合、「含む」は「包含する」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含んでいる」とは、追加の要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを包含する」ことを意味する。特段の指定のない限り、本定義が他に存在し得る定義と異なる可能性がある場合には、本明細書で提供される定義が優先される。
【0026】
特段の記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全てのヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）の識別子（ＩＤ）は、その全体が参照により組み込まれる。本開示の実施または試験には、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等のものを使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定することを意図していない。
【0027】
「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、Ｔ細胞すなわちＴリンパ球の表面に存在し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子にペプチドとして結合した抗原を認識する分子を意味する。ＴＣＲは２種類のタンパク質鎖から構成されている（つまり、ヘテロ二量体である）。ヒトの場合、９５％のＴ細胞においてＴＣＲはアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖（それぞれＴＲＡとＴＲＢによってコードされている）から構成されているが、５％のＴ細胞ではＴＣＲはガンマとデルタ（γ／δ）鎖（それぞれＴＲＧとＴＲＤによってコードされている）から構成されている。この比率は、個体発生時や疾患状態（白血病など）の過程で変化し、また、生物種によっても異なる。それぞれのＴＣＲ鎖は２つの細胞外ドメイン、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域、から構成されている。定常領域は細胞膜に近接していて、膜貫通領域と短い細胞質尾部が続くもので、一方、可変領域はペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方の可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる、３つの超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。いくつかの態様では、ＣＤＲ３が主な抗原認識領域である。いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖遺伝子はＶおよびＪを含み、ＴＣＲβ鎖遺伝子は、ＴＣＲの多様性に寄与するＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成して２本の鎖の間のリンクを形成している短い連結配列から構成される。
【0028】
「治療用ＴＣＲ」または「治療用ＴＣＲ遺伝子」という用語は、所望の機能、例えば、宿主の免疫系が病気と闘うことを促進できることなどの機能を仲介する、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の特定の組合せを指す場合がある。治療用ＴＣＲ遺伝子は、ファージ、酵母、またはＴ細胞提示系によって組換えＴＣＲライブラリーとして発現されるインビトロの変異型ＴＣＲ鎖から選択することができる。治療用ＴＣＲ遺伝子は、自己由来であっても同種異系であってもよい。
【0029】
「癌」という用語は、分化能の消失を伴う特徴的な退形成、速い増殖速度、周辺組織への浸潤、および転移能を示す悪性新生物を意味する。「癌」という用語は、対象における制御不能な細胞の増殖を特徴とする疾患を含むものとする。いくつかの態様では、「癌」および「腫瘍」という用語は同じ意味で用いられる。いくつかの態様において「腫瘍」という用語は、良性すなわち非悪性の増殖を指す。
【0030】
本明細書で使用する場合、「新生抗原」という用語は、腫瘍特異的なゲノム変異に由来する抗原を指す。例えば新生抗原は、腫瘍試料中で非同義一塩基変異に起因する変異型タンパク質が発現することによって、または変異誘発性のフレームシフトに起因する別の読み取り枠が発現することによって生じる場合がある。このため、新生抗原は病的状態に関連し得る。いくつかの態様において「変異型タンパク質」は、正規のアミノ酸配列の同じ位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸を少なくとも１つの含むタンパク質を指す。いくつかの態様において変異型タンパク質は、正規のアミノ酸配列に対して、挿入、欠失、置換、読み取り枠シフトによって生じるアミノ酸の包含、またはそれらの任意の組合せを含む。
【0031】
「抗体」は、少なくとも免疫グロブリン可変領域の軽鎖または重鎖のいずれかを含むポリペプチドであり、抗原のエピトープを特異的に認識して結合するものを指す。いくつかの態様において抗体は重鎖および軽鎖からなり、それぞれの鎖は、可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、共に、抗体によって認識される抗原に結合する役割を果たす。抗体という用語は、インタクトな免疫グロブリン、ならびにそのバリアントおよび部分、例えばＦａｂ'断片、Ｆ（ａｂ）'２断片、およびインタクトな免疫グロブリンに由来する他の任意の分子を含む。
【0032】
「遺伝子改変細胞」とは、バイオテクノロジーを用いてその遺伝子構造を変化させた細胞のことである。このような変化には、改良されたもしくは新規の生物を生み出すための、種の中でのおよび種を越えた遺伝子の移動などがある。新しいＤＮＡは、組換えＤＮＡ法を用いて目的の遺伝物質を単離し、コピーするか、またはＤＮＡを人工的に合成することによって得られる。
【0033】
「遺伝子改変Ｔ細胞」とは、バイオテクノロジーを用いてその遺伝子構造を変化させたＴ細胞のことである。
【0034】
本明細書では、エピトープペプチド、エピトープタンパク質、および抗体エピトープは同じ意味で用いられる。個別に命名した特定のエピトープについては、この名称は、エピトープという語またはエピトープという語を含む句と置き換えて用いることもできる。「ｍｕｒ６」と命名したエピトープであれば、この名称は、文脈上適切であれば、ｈｕＴＲＢＣ１－Ｍｕｒ６またはｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６のいずれかを指す場合がある。
標識タンパク質に関する様々な態様
標識タンパク質に関する様々な態様
【0035】
本明細書に記載のいくつかの態様は、遺伝子改変細胞を検出、単離または低減するために用いることが可能な標識タンパク質に関する。標識タンパク質すなわちタンパク質マーカーはマーカーとして機能させることができ；このマーカーを見つけることで、標識タンパク質を含む任意の細胞を検出、単離または低減することができる。標識タンパク質は、好適な抗体によって同定することが可能なエピトープペプチドを含む場合がある。いくつかの態様では、標識タンパク質を細胞を刺激するのに用いることができる。いくつかの態様では標識タンパク質を、遺伝子改変Ｔ細胞の検出、単離または低減を可能にするためにＴ細胞に導入する。いくつかの態様では標識タンパク質を、改変Ｔ細胞を刺激できるように、Ｔ細胞に導入する。いくつかの態様では、サイトカイン、核酸および小分子などを含むがこれらには限定されない成分を送達するための「ハンドル」を作製するために、標識タンパク質をＴ細胞に導入する。いくつかの態様において標識タンパク質は刺激するためには用いられない。
【0036】
いくつかの態様の模式図を図１に示す。いくつかの態様において図１に示すＴＣＲ定常ドメインはＴＣＲαまたはＴＣＲβの定常ドメインであり得る。ＴＣＲ定常ドメインの全長またはＴＣＲ定常ドメインの一部分のみを用いることができる。
【0037】
いくつかの態様において標識タンパク質は、ＴＣＲ定常ドメインと、ＴＣＲ定常ドメイン中に存在し、検出および同定が可能な配列を含む外因性アミノ酸変種とを含む。いくつかの態様においてアミノ酸変種は、ＴＣＲの特異性と感受性を保つために、ＴＣＲ可変ドメインよりもＴＣＲ定常ドメインに導入される。いくつかの態様において抗体エピトープはＴＣＲ鎖の定常ドメインに挿入され、ＴＣＲの可変ドメインには挿入されない。いくつかの態様において抗体エピトープは、ＴＣＲ鎖の１つ以上の位置でアミノ酸を変異させることによって導入されるが、ＴＣＲ鎖に外因性の付加的なアミノ酸を付加することによっては導入されない。
【0038】
検出および同定することが可能とは、分子生物学的な技術またはその他の関連技術によって発見または同定することが可能であることを意味する。例えば、標識タンパク質が特定の抗体に結合し、次いで、フローサイトメトリー、ＩＨＣ、免疫蛍光顕微鏡、ウェスタンブロット、およびＥＬＩＳＡなどを含むがこれらには限定されない標準的な分子生物学的な技術によって検出および同定することが可能な場合、この標識タンパク質は検出および同定することが可能である。いくつかの態様では標識タンパク質は細胞表面に発現するので、細胞外抗体結合に利用できる。
【0039】
外因性アミノ酸変種とは、ＴＣＲ定常ドメインの種に天然には見られないアミノ酸配列を指す。外因性アミノ酸変種は、別の種に由来するアミノ酸配列であっても、または人工の配列であってもよい。外因性アミノ酸変種はさらに、連続したアミノ酸配列であっても、または非連続的なアミノ酸配列であってもよい。例えば、いくつかの態様では、ＴＣＲ定常ドメインがある種に由来し、および外因性アミノ酸変種が別の種に由来する。いくつかの態様では、ＴＣＲ定常ドメインがヒトに由来し、外因性アミノ酸変種が非ヒト種に由来する。いくつかの態様において非ヒト種はマウスである。
【0040】
外因性アミノ酸変種は、ＴＣＲ定常ドメインの特定のアミノ酸を変異させることによって作出可能である。例えば、ヒトＴＣＲ定常ドメインの特定のアミノ酸を変異させ、それによってヒトＴＣＲ定常ドメインのアミノ酸配列の一部をマウスＴＣＲの配列に変化させることができる。この方法では、標識タンパク質を構成するアミノ酸の総数を天然のヒトＴＣＲ定常タンパク質と同数に維持しながら、マウスエピトープをヒトＴＣＲ定常ドメインに導入し、標識タンパク質を得ることができる。したがって、この手法の利点の一つとして、この方法では、標識タンパク質の大きさが天然のヒトＴＣＲ定常ドメインよりも大きくならないことが挙げられる。加えて、標識タンパク質はＴＣＲβの定常ドメインに組み入れられるため、ＴＣＲそのものと同様の安定性と発現を有する。さらに、全長マウスＴＣＲ定常ドメインを使用するよりも、マウスＴＣＲ定常ドメインから選択したいくつかのアミノ酸を導入することで、標識タンパク質の免疫原性を下げられる可能性がある。いくつかの態様において変異は１０のアミノ酸変異を含む。いくつかの態様において変異は６のアミノ酸変異を含む。いくつかの態様において変異は、２つのＴＣＲ定常ドメインのうちの１つにだけ導入される。
【0041】
外因性アミノ酸変種を他の方法によってＴＣＲ定常ドメインに導入することもできる。例えば、１つ目の種のＴＣＲ定常ドメインのアミノ酸配列の一部を、同数のアミノ酸を有する２つ目の種のＴＣＲ定常ドメインに挿入して、配列を置換することによって、標識タンパク質を作製することができる。この手法によっても、標識タンパク質の大きさは２つ目の種の天然のＴＣＲ定常ドメインよりも大きくならない。
【0042】
いくつかの態様においてＴＣＲ定常ドメインはヒトＴ細胞受容体β定常２（ＴＲＢＣ２）遺伝子によってコードされている配列を含む。いくつかの態様において外因性アミノ酸変種はマウスＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＣＲ Ｃβドメイン）の配列を含む。いくつかの態様において外因性アミノ酸変種は、Ｋ４Ｒ、Ｆ７Ｔ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ１０６Ｅ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、Ａ１１４Ｐの１０のアミノ酸変異のうちの１つ以上を含む。いくつかの態様において外因性アミノ酸変種は、これらの変異のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０を含む。
【0043】
遺伝子改変細胞を単一細胞レベルで未改変細胞から速やかに識別するためには、改変細胞に特有のタンパク質マーカーを検出する抗体試薬が有用である。既に公表されている研究によって、ヒトＴＣＲ可変ドメインをマウスＴＣＲ定常ドメインに結合させたハイブリッドマウス化ＴＣＲが機能し、抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７によって検出可能であることが示されている（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、米国癌学会誌（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）、２００６）。本明細書で使用する場合「Ｈ５７」は、任意の抗体または、本明細書に記載の選択的結合特徴を保持し、かつ、少なくともＨ５７の可変領域を有するその抗原結合断片を指し得る。この抗体はヒトＴＣＲ Ｃβドメインには結合しないため、マウス化ＴＣＲを発現している改変Ｔ細胞だけを同定することができる。このような全長ＴＣＲ定常ドメインをマウス化することの欠点としては、導入されたＴＣＲ遺伝子の免疫原性が高まる可能性があること（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、臨床癌研究（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）、２０１０）、およびこの方法では、治療用ＴＣＲ遺伝子をヒトＴＣＲαまたはＴＣＲβの定常遺伝子座のエクソンにインフレームでノックインできないことが挙げられる。このような制限を克服するために、いくつかの態様では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子の配列中の１０のアミノ酸を入れ替えた（Ｋ４Ｒ、Ｆ７Ｔ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ１０６Ｅ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、Ａ１１４Ｐ、ここで番号付けは、アンサンブルゲノムブラウザー（Ｅｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒ）の遺伝子ＴＲＢＣ２（ＥＮＳＧ０００００２１１７７２）に準ずる）「最小化」マウスエピトープ含有ＴＣＲ Ｃβドメインを生成する。いくつかの態様においてこれら残基の番号付けは配列番号８における番号配置を参照する。したがって、「配列番号８内で番号付けされたように」という言及は、配列そのものではなく、配列番号８内でのアミノ酸の位置の付番方法を指す。これら１０のアミノ酸のうち、Ｋ４とＦ７はＴＣＲ ＣβのＡストランドの一部であり、Ｙ３７はＴＣＲ ＣβのＢストランドの一部であり、そしてＮ１０６－Ａ１１４はＴＣＲ ＣβのＦＧループの一部である（ササダ（Ｓａｓａｄａ）ら、実験医学雑誌（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ）、２００２）。いくつかの態様では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子配列中の６のアミノ酸を入れ替えた（Ｋ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ）「最小化」マウスエピトープ含有ＴＣＲ Ｃβドメインを生成した（「ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６」）。これらのマウスエピトープ含有ＴＣＲβ鎖は全長ヒトＴＣＲα鎖と効率的に対合し、ＴＣＲ改変Ｔ細胞の検出、単離および低減を可能にするＨ５７抗体によって、細胞表面で検出される。さらに、これらのマウスエピトープ含有ＴＣＲβ鎖は、治療用ＴＣＲ遺伝子をヒトＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常遺伝子座のエクソンにインフレームでノックインすることにも適合する。
【0044】
いくつかの態様において外因性アミノ酸変種は、抗体、ナノボディ、Ｆａｂ断片またはダーピンによって検出および同定することができる。単一ドメイン抗体としても知られるナノボディは、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片であり、抗体全体と同様に、特定の抗原に選択的に結合することができる。ダーピン（ＤＡＲＰｉｎ、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の頭文字をとったもの）は、標識タンパク質との結合に高い特異性と高い親和性を典型的に示す遺伝子改変された抗体模倣タンパク質であり；ダーピンは、天然において高親和性のタンパク質間相互作用を仲介するタンパク質群である天然に生じるアンキリンタンパク質に由来する。いくつかの態様において外因性アミノ酸変種はある特定の抗体に結合し、そしてそのような抗体によって検出および同定することが可能な抗体エピトープを含む。エピトープは連続した配列であってもまたは非連続な配列であってもよい。いくつかの態様では、ＴＲＢＣ２の４番目および１０８－１１３番目はマウス由来である。いくつかの態様における標識タンパク質によるＴＣＲ改変Ｔ細胞の検出は、フローサイトメトリーによって検出可能な抗体染色に基づくものである。
【0045】
いくつかの態様において外因性アミノ酸変種は抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７によって検出および同定することができる。Ｈ５７は、マウスＴＣＲ Ｃβドメインに特異的に結合するが、ヒトＴＣＲ Ｃβドメインには結合しない。ヒトＴＣＲ ＣβドメインにＨ５７によって検出可能なマウスエピトープを導入すると、得られた標識タンパク質は、天然のヒトＴＣＲ Ｃβドメインを有するタンパク質から区別することができる。他種のＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常ドメイン（それぞれＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ）に存在する任意の抗体エピトープドメインを、例えばマウス抗ラットＴＣＲ αβ抗体Ｒ７３によって検出可能な抗体エピトープを、同じような様式で用いてもよい。
【0046】
いくつかの態様では、ヒトＴＲＡＣまたはＴＲＢＣのアミノ酸の標的突然変異を用いて人工の抗体エピトープを作製し、それに対する抗体を産生してもよい。
【0047】
いくつかの態様では標識タンパク質を提供する。標識タンパク質は、そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いることができ、前述した任意の態様の標識タンパク質を含む。いくつかの態様において遺伝子改変細胞は遺伝子改変Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において遺伝子改変Ｔ細胞は治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されたＴ細胞を含む。「治療用ＴＣＲ遺伝子」という用語は、所望の機能、例えば、宿主の免疫系が病気と闘うことを促進できることなどの機能を仲介する、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の特定の組合せを指す場合がある。
【0048】
現在利用可能な技術に基づくＴＣＲ改変Ｔ細胞を検出するための手法には様々な欠点がある。典型的なところでは、ＴＣＲ改変Ｔ細胞中でのＴＣＲタンパク質の発現が、ＭＨＣ多量体またはＴＣＲ Ｖドメインに特異的な抗体によって検出されることが挙げられる（アルトマン（Ａｌｔｍａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００６；ファイント（Ｆａｉｎｔ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１９９９）。加えて、ＴＣＲ Ｃβドメイン特異的抗体は、パン（ｐａｎ）－αβＴＣＲ抗体として（クローンＩＰ２６；ショバー（Ｓｃｈｏｂｅｒ）ら、ネイチャー・バイオメディカル・エンジニアリング（Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ）、２０１９）、またはヒトＴＲＢＣ１ドメイン（クローンＪＯＶＩ－１；マシオシア（Ｍａｃｉｏｃｉａ）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）、２０１７）もしくはマウスＴｒｂｃ１／２ドメイン（クローンＨ５７；モール（Ｍａｌｌ）ら、米国癌学会誌、２０１６）を有するＴＣＲを検出するために利用されてきている。しかしながら、ＭＨＣ多量体は各ＴＣＲの特異性に対して特異的に生成する必要があり、ＨＬＡアレル拘束性によって特定のＴＣＲには用いることができず；ＴＣＲ Ｖドメイン特異的抗体は特定のＴＣＲ Ｖドメインにしか用いることができず；ＴＣＲ Ｖドメイン特異的抗体とＴＣＲ Ｃβドメイン特異的抗体は、ＴＣＲ改変Ｔ細胞が同じＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ Ｃβドメインを利用する他のＴ細胞のプール中に存在する時には利用できない。加えて、大きなマウスタンパク質配列によって免疫原性が高まる可能性があることから、全長のマウスＴＣＲ定常ドメインの利用は望ましくなく；さらに、全長のマウスＴＣＲ定常ドメインに基づく治療用ＴＣＲ遺伝子構築物はヒトＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常遺伝子座にインフレームで組み込むことができないため、効率的に発現させるためには外因性ポリＡシグナルと共送達する必要がある。その結果、全長のマウスＴＣＲ定常ドメインに必要な遺伝子鋳型のサイズが大きくなり、部位特異的ノックインアプローチを利用した場合の遺伝子導入効率に悪影響を及ぼす可能性がある。
【0049】
同様に、現在利用可能な技術に基づくＴＣＲ改変Ｔ細胞を単離するための手法にも様々な欠点がある。そのような手法は、何らかの抗体を使用する単離方法を利用している（例えば、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズを使った単離を利用している）。もっとも一般的なところでは、ＴＣＲ改変Ｔ細胞の単離は、ＭＨＣ多量体に基づく試薬によって実施される（ナベル（Ｋｎａｂｅｌ）ら、ネイチャー・メディシン、２００２）。前述したように、ＭＨＣ多量体は各ＴＣＲの特異性に対して特異的に生成する必要があり、ＨＬＡアレル拘束性によって特定のＴＣＲには用いることができない。他の単離方法としては、以下のものが挙げられる：
－ＴＣＲ抗原結合ドメイン中に配置された抗体エピトープの利用（例えば、キーバック（Ｋｉｅｂａｃｋ）ら、米国科学アカデミー紀要、２００８による記載がある）。アミノ酸の付加や修飾は、結合ドメインの構造を変化させる可能性があるため、ＴＣＲ抗原の微細な特異性やＴＣＲの感度に干渉することが想定される。従ってこの概念は、個々のＴＣＲについて実現に向けた研究が必要であり、いくつかのＴＣＲについては抗原結合に影響を与える可能性が高い。
－ＴＣＲ ＶドメインまたはヒトＴＲＢＣ１に特異的な抗体の利用。これもまた前述したように、このような試薬は特定のＴＣＲ Ｖドメインにしか利用できず、また、ＴＣＲ改変Ｔ細胞が同じＴＣＲ ＶドメインまたはヒトＴＲＢＣ１を利用する他のＴ細胞のプール中に存在する時には利用できない。
－治療用ＴＣＲ遺伝子とともに発現される細胞表面マーカータンパク質の利用、例えば、切断型ＬＮＧＦＲまたはＥＧＦＲタンパク質の共発現の利用。しかしながら、このような細胞表面マーカーを含めると導入遺伝子のサイズが大きくなり、遺伝子改変の効率やその後の導入遺伝子の発現が損なわれるだけでなく、改変したＴ細胞の免疫原性が高まる可能性がある。
－ＴＣＲ抗原結合ドメイン中に配置された抗体エピトープの利用（例えば、キーバック（Ｋｉｅｂａｃｋ）ら、米国科学アカデミー紀要、２００８による記載がある）。アミノ酸の付加や修飾は、結合ドメインの構造を変化させる可能性があるため、ＴＣＲ抗原の微細な特異性やＴＣＲの感度に干渉することが想定される。従ってこの概念は、個々のＴＣＲについて実現に向けた研究が必要であり、いくつかのＴＣＲについては抗原結合に影響を与える可能性が高い。
－ＴＣＲ ＶドメインまたはヒトＴＲＢＣ１に特異的な抗体の利用。これもまた前述したように、このような試薬は特定のＴＣＲ Ｖドメインにしか利用できず、また、ＴＣＲ改変Ｔ細胞が同じＴＣＲ ＶドメインまたはヒトＴＲＢＣ１を利用する他のＴ細胞のプール中に存在する時には利用できない。
－治療用ＴＣＲ遺伝子とともに発現される細胞表面マーカータンパク質の利用、例えば、切断型ＬＮＧＦＲまたはＥＧＦＲタンパク質の共発現の利用。しかしながら、このような細胞表面マーカーを含めると導入遺伝子のサイズが大きくなり、遺伝子改変の効率やその後の導入遺伝子の発現が損なわれるだけでなく、改変したＴ細胞の免疫原性が高まる可能性がある。
【0050】
加えて、現在利用可能な技術に基づくＴＣＲ改変Ｔ細胞を低減させるための手法にもまた、様々な欠点がある。ＴＣＲ療法やＣＡＲ療法を含む養子Ｔ細胞療法のための「安全スイッチ」が数多く報告されており、報告されたシステムとしては、以下のものが挙げられる：
－ＴＣＲ抗原結合ドメイン中に配置された抗体エピトープの利用（例えば、キーバックら、米国科学アカデミー紀要、２００８による記載がある）。この概念は、個々のＴＣＲについて試験する必要があり、一部のＴＣＲについては抗原結合に影響を与える可能性が高い。
－単純ヘルペスウイルスＴＫ（ボニーニ（Ｂｏｎｉｎｉ）ら、サイエンス、１９９７；シセリ（Ｃｉｃｅｒｉ）ら、ランセット・オンコロジー（Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ）、２００９）または誘導性カスパーゼ９（ストラーソフ（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２００５；ディスタシ（ＤｉＳｔａｓｉ）ら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）、２０１１）などの、インビボで選択的に活性化できるさらなる導入遺伝子の利用。しかしながら、このようなマーカーを含めると、細胞内に導入する必要がある導入遺伝子のサイズが大きくなり、遺伝子改変の効率とその後の導入遺伝子の発現が損なわれる可能性がある。
－ＴＣＲ抗原結合ドメイン中に配置された抗体エピトープの利用（例えば、キーバックら、米国科学アカデミー紀要、２００８による記載がある）。この概念は、個々のＴＣＲについて試験する必要があり、一部のＴＣＲについては抗原結合に影響を与える可能性が高い。
－単純ヘルペスウイルスＴＫ（ボニーニ（Ｂｏｎｉｎｉ）ら、サイエンス、１９９７；シセリ（Ｃｉｃｅｒｉ）ら、ランセット・オンコロジー（Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ）、２００９）または誘導性カスパーゼ９（ストラーソフ（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２００５；ディスタシ（ＤｉＳｔａｓｉ）ら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）、２０１１）などの、インビボで選択的に活性化できるさらなる導入遺伝子の利用。しかしながら、このようなマーカーを含めると、細胞内に導入する必要がある導入遺伝子のサイズが大きくなり、遺伝子改変の効率とその後の導入遺伝子の発現が損なわれる可能性がある。
【0051】
現在利用可能な技術と比較して、本明細書で提供されるいくつかの態様は、以下に挙げる利点のうちの１つ以上を提供することができる：
１．免疫原性の低さ：いくつかの態様では、ヒトＴＲＢＣドメインに限られた数のアミノ酸変異を導入する。コーエンら、米国癌学会誌、２００６に記載されているように、全長マウスＴｒｂｃ２遺伝子は、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子と比較して、３３の異なるアミノ酸を含んでいる。一方、いくつかの態様に記載するように、マウスエピトープ含有ＴＲＢＣ２遺伝子は、ヒトとは異なるマウス由来のアミノ酸を、１０以下、例えば９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、または２つだけ含む。
２．全ヒトＴＣＲに対する広範かつ汎用的な有用性：ＴＣＲ Ｖドメイン特異的抗体、ＭＨＣ多量体またはＴＣＲフレームワークの修飾などの代替技術とは異なり、本明細書に記載のいくつかの態様は、ＴＣＲ Ｖドメインの使用、ＭＨＣ拘束性および抗原特異性とは無関係に全てのＴＣＲに利用することができる。
３．高い特異性での検出：いくつかの態様では、内在性ＴＣＲ鎖を遺伝的にノックアウトしなくても、高い特異性でＴＣＲ改変Ｔ細胞を検出することができる。ＴＣＲ Ｖドメイン特異的抗体やヒトＴＲＢＣ１特異的抗体などの代替技術では内在性ＴＣＲ鎖の大部分と特異的に反応してしまい、ＴＣＲ改変Ｔ細胞の正確な検出および特異的な単離、または低減が妨げられる可能性がある。
４．ヒトＴＣＲ遺伝子座のエクソンに治療用ＴＣＲ遺伝子をインフレームでノックインすることができる：例えば、ショバーら（ネイチャー・バイオメディカル・エンジニアリング、２０１９）によって記載されている、全長マウス化Ｔｒｂｃ遺伝子を使った治療用ＴＣＲ構築物のＴＣＲα遺伝子座へのノックインでは、全長マウス化Ｔｒａｃ遺伝子と、外因性転写終結因子としてのウシ成長ホルモン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）のポリ（Ａ）配列とを共送達する必要がある。対して、いくつかの態様において記載のマウスエピトープ含有ＴＲＢＣ２遺伝子を利用するＴＣＲβ鎖は、全長ヒトＴＣＲα鎖と効率的に対合できるため、ＴＣＲα遺伝子座エクソンへのインフレームでのノックインおよび内在性転写終結因子と適合する。このことは、治療用遺伝子構築物の大きさがおよそ５００塩基対小さくなり、それによって遺伝子改変の工程における効率が高まることを意味している。
５．治療用ＴＣＲ遺伝子カセットの大きさの実質的な増加を回避する：いくつかの態様は、選択したヒトＴＣＲ定常ドメインのいくつかのアミノ酸を、マウスの対応物に変異させることに基づいている。ＴＣＲ改変Ｔ細胞の検出、単離および／または低減に用いられる代替技術には、付加的なタンパク質の利用が含まれる（例えば、切断型ＥＧＦＲ、切断型ＬＮＧＦＲ、ＨＳＶ－ＴＫおよび誘導性カスパーゼ９）。それによって、送達される導入遺伝子の大きさが増大し、遺伝子改変の効率やそれに続く導入遺伝子の発現が損なわれる可能性がある。さらに、導入遺伝子に細胞表面で発現する付加的なタンパク質を含めることによって、改変Ｔ細胞の免疫原性が高まる可能性がある。
１．免疫原性の低さ：いくつかの態様では、ヒトＴＲＢＣドメインに限られた数のアミノ酸変異を導入する。コーエンら、米国癌学会誌、２００６に記載されているように、全長マウスＴｒｂｃ２遺伝子は、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子と比較して、３３の異なるアミノ酸を含んでいる。一方、いくつかの態様に記載するように、マウスエピトープ含有ＴＲＢＣ２遺伝子は、ヒトとは異なるマウス由来のアミノ酸を、１０以下、例えば９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、または２つだけ含む。
２．全ヒトＴＣＲに対する広範かつ汎用的な有用性：ＴＣＲ Ｖドメイン特異的抗体、ＭＨＣ多量体またはＴＣＲフレームワークの修飾などの代替技術とは異なり、本明細書に記載のいくつかの態様は、ＴＣＲ Ｖドメインの使用、ＭＨＣ拘束性および抗原特異性とは無関係に全てのＴＣＲに利用することができる。
３．高い特異性での検出：いくつかの態様では、内在性ＴＣＲ鎖を遺伝的にノックアウトしなくても、高い特異性でＴＣＲ改変Ｔ細胞を検出することができる。ＴＣＲ Ｖドメイン特異的抗体やヒトＴＲＢＣ１特異的抗体などの代替技術では内在性ＴＣＲ鎖の大部分と特異的に反応してしまい、ＴＣＲ改変Ｔ細胞の正確な検出および特異的な単離、または低減が妨げられる可能性がある。
４．ヒトＴＣＲ遺伝子座のエクソンに治療用ＴＣＲ遺伝子をインフレームでノックインすることができる：例えば、ショバーら（ネイチャー・バイオメディカル・エンジニアリング、２０１９）によって記載されている、全長マウス化Ｔｒｂｃ遺伝子を使った治療用ＴＣＲ構築物のＴＣＲα遺伝子座へのノックインでは、全長マウス化Ｔｒａｃ遺伝子と、外因性転写終結因子としてのウシ成長ホルモン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）のポリ（Ａ）配列とを共送達する必要がある。対して、いくつかの態様において記載のマウスエピトープ含有ＴＲＢＣ２遺伝子を利用するＴＣＲβ鎖は、全長ヒトＴＣＲα鎖と効率的に対合できるため、ＴＣＲα遺伝子座エクソンへのインフレームでのノックインおよび内在性転写終結因子と適合する。このことは、治療用遺伝子構築物の大きさがおよそ５００塩基対小さくなり、それによって遺伝子改変の工程における効率が高まることを意味している。
５．治療用ＴＣＲ遺伝子カセットの大きさの実質的な増加を回避する：いくつかの態様は、選択したヒトＴＣＲ定常ドメインのいくつかのアミノ酸を、マウスの対応物に変異させることに基づいている。ＴＣＲ改変Ｔ細胞の検出、単離および／または低減に用いられる代替技術には、付加的なタンパク質の利用が含まれる（例えば、切断型ＥＧＦＲ、切断型ＬＮＧＦＲ、ＨＳＶ－ＴＫおよび誘導性カスパーゼ９）。それによって、送達される導入遺伝子の大きさが増大し、遺伝子改変の効率やそれに続く導入遺伝子の発現が損なわれる可能性がある。さらに、導入遺伝子に細胞表面で発現する付加的なタンパク質を含めることによって、改変Ｔ細胞の免疫原性が高まる可能性がある。
【0052】
いくつかの態様では、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されたＴ細胞は癌の治療に用いられる。いくつかの態様において癌は固形癌である。治療用ＴＣＲ遺伝子は、インビトロで変異され、ファージ、酵母またはＴ細胞提示系によって組換えＴＣＲライブラリーとして発現されたＴＣＲ鎖から選択することができる。治療用ＴＣＲ遺伝子とは、個別の患者ごとの癌生検に由来する新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子をも指し得る。そのような新生抗原ＴＣＲ遺伝子は、同定された後、遺伝子工学によって患者のＴ細胞に導入され、それによって、Ｔ細胞の抗原特異性が腫瘍新生抗原に向けられる。最終的に遺伝子改変Ｔ細胞は、癌を治療するために静脈内注入によって患者に戻される。これらの態様は、改変養子Ｔ細胞療法に適した全ての癌に適用できる。
【0053】
いくつかの態様では、治療用ＴＣＲ遺伝子構築物中に標識タンパク質を入れるために、マウスエピトープをヒトＴＣＲ Ｃβドメインに導入して、遺伝子改変Ｔ細胞内に導入されたＴＣＲを抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７によって検出できるようにする。Ｈ５７は、クボ（Ｋｕｂｏ）ら、米国免疫学会誌（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１９８９によって最初に報告された抗体である。いくつかの態様では、Ｈ５７－５９７が用いられる。Ｈ５７－５９７は、ＴＣＲβ鎖のＣ領域エピトープを指向するハムスターｍＡｂである。Ｈ５７－５９７抗体はγ／δＴＣＲを有するＴ細胞とは交差反応しない。固定化されたまたは可溶性のＨ５７－５９７抗体は、α／βＴＣＲを有するＴ細胞を活性化し得る。本明細書に記載のいくつかの態様は、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された遺伝子改変Ｔ細胞を検出、単離または低減するために用いられる標識タンパク質に関し、ここで標識タンパク質はマウスＴＣＲ Ｃβドメインに由来し、そしてヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメイン中に存在するアミノ酸を変異させることによって、ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインに導入される。
【0054】
いくつかの態様では、癌治療用の新規ＴＣＲ遺伝子で改変された細胞を検出、単離または低減するための標識タンパク質であって、本明細書で提供する態様のいずれか一つの標識タンパク質を含む、標識タンパク質を提供する。
【0055】
いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの標識タンパク質を有する遺伝子改変細胞を検出、単離または低減するために用いられる、その標識タンパク質を認識する抗体または結合剤を含む、キットに関する。いくつかの態様においてキットは、マウスエピトープ含有ＴＣＲβ鎖を発現しているＴ細胞を単離または低減するために使用可能な、Ｈ５７抗体に結合した磁気ビーズを含む。いくつかの態様においてキットは、組織内の遺伝子改変細胞を検出するための染色剤を含む。いくつかの態様では、遺伝子改変細胞はＴ細胞を含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞は治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている。いくつかの態様では、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されたＴ細胞は癌の治療に用いられる。
標的化送達に用いる標識タンパク質に関する様々な態様
標的化送達に用いる標識タンパク質に関する様々な態様
【0056】
いくつかの態様は、そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するために用いられる標識タンパク質であって、本明細書に記載の態様のいずれか一つの標識タンパク質を含む、標識タンパク質に関する。
【0057】
いくつかの態様において１つ以上の搭載物の送達は、抗体、抗体模倣タンパク質または他の任意の抗原結合足場への接合によって達成される。いくつかの態様において１つ以上の搭載物の送達は、Ｈ５７抗体への接合によって達成される。
【0058】
いくつかの態様では、送達される搭載物はタンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である。いくつかの態様において搭載物は二重または三重特異性抗体である。
【0059】
いくつかの態様において送達される搭載物はサイトカインである。いくつかの態様において送達される搭載物は、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの群から選択される。いくつかの態様においてサイトカインは、その配列が、その天然の受容体分子との相互作用を調節するように、改変されている。
【0060】
いくつかの態様において搭載物は、Ｔ細胞によって発現される受容体分子のアゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの態様においてアゴニストは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７またはＣＤ２７８に結合する。いくつかの態様においてアンタゴニストは、ＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体に結合する。
【0061】
いくつかの態様において搭載物は、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する小分子である。いくつかの態様において小分子は、ＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体いずれかのシグナル伝達を阻害する。
【0062】
いくつかの態様において搭載物は、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する核酸である。いくつかの態様において核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む。
【0063】
いくつかの態様は、標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するための方法に関する。この方法は、ａ）１つ以上の搭載物と、標識タンパク質に特異的に結合する結合剤とを含む複合体を得ること、およびｂ）遺伝子改変細胞と複合体とを接触させること、を含む。
【0064】
いくつかの態様において結合剤は、抗体、抗体模倣タンパク質、または他の任意の抗原結合足場である。
【0065】
いくつかの態様において１つ以上の搭載物は、タンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である。
【0066】
本明細書において認識されているように、現在利用可能な技術に基づく改変Ｔ細胞に搭載物を標的化送達するための手法には様々な欠点がある。ほとんどの手法が、細胞表面に存在する内在性マーカーに結合する抗体（例えばＣＤ３ｅまたはＰＤ－１）を用いて、マウスＴ細胞または非改変ヒトＴ細胞のいずれかを標的とするものである。いくつかの研究は、脂溶性のトレーサー蛍光色素であるＤｉＤで標識したペグ化リポソームに抗Ｔｈｙ１．１Ｆ（ａｂ'）２断片を結合させて、蛍光リポソームを養子移植したマウスＴ細胞に標的化したことを報告している（チョン（Ｚｈｅｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）、２０１３）。別の研究は、ＴＧＦβＲ１阻害剤であるＳＢ５２５３３４を負荷したペグ化リポソームに抗Ｔｈｙ１．１Ｆ（ａｂ'）２断片を結合させて、ＴＧＦβ受容体阻害を養子移植したマウスＴ細胞に標的化させたことを報告している（チョンら、エー・シー・エス・ナノ（ＡＣＳ Ｎａｎｏ）、２０１７）。その他に、ＰＬＧＡに基づくナノ粒子をペグ化し、ＴＧＦβＲ１阻害剤であるＳＤ－２０８を負荷し、それに抗ＰＤ－１Ｆ（ａｂ'）２断片を結合させたものを使って、ＴＧＦβ受容体阻害をマウスＴ細胞に標的化させた報告もある（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄ）ら、ネイチャー・コミュニケーションズ（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ）、２０１７）。他には、抗ＣＤ３εＦ（ａｂ'）２断片を、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）逆方向反復と隣接しているＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子をコードしているプラスミドと機能亢進性ピギーバックｉＰＢ７トランスポザーゼ遺伝子をコードしているプラスミドの２つのＤＮＡプラスミドを負荷したナノ粒子に結合させ、これを使って、ＣＡＲ ＤＮＡ構築物をマウスＴ細胞に標的化させた記述もある（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈ）、２０１７）。その他に、Ｆｏｘｏ１３Ａ変異型転写因子をコードしているｍＲＮＡを負荷したナノ粒子に抗ＣＤ３ε抗体を結合させて、転写因子のｍＲＮＡをヒトＴ細胞に標的化させた報告もある（モフェット（Ｍｏｆｆｅｔｔ）ら、ネイチャー・コミュニケーションズ、２０１７）。これ以外にも、ＴＧＦβＲ１阻害剤であるＳＢ５２５３３４を負荷した両親媒性金ナノ粒子に抗ＣＤ８α ＶＨＨナノボディを結合させて、ＴＧＦβ受容体阻害をマウスＴ細胞に標的化させた報告がある（ヤング（Ｙａｎｇ）ら、バイオマテリアルズ・サイエンス（Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ）、２０１９）。しかしながらこれらの技術は、養子Ｔ細胞療法に用いられる改変ヒトＴ細胞に搭載物を標的化送達するための解決策を提供するものではない。
【0067】
ＩＬ－２Ｒβγには結合するがＩＬ－２Ｒαには結合しないように改変された変異型ＩＬ－２ポリペプチド（ＩＬ２ｖ）に融合させた抗ＰＤ－１抗体を使用して、ＩＬ－２サイトカイン活性をヒトＴ細胞およびＮＫ細胞に標的化することを可能にする技術もある（ＷＯ／２０１８／１８４９６４、２０１８）。他の研究は、抗ＣＤ８α抗体と、野生型マウスＩＦＮ－αよりもマウス細胞上での活性がおよそ１００分の１に低下するように改変された変異型ヒトＩＦＮ－αとを融合させて、サイトカインであるＩ型インターフェロンの活性をマウスＴ細胞およびｃＤＣ１ ＤＣへと標的化させたことについて記述している（ヒュッゲ（Ｈｕｙｇｈｅ）ら、エンボ・モレキュラー・メディシン（ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ）、２０２０）。その他にも、抗ＰＤ－１抗体と、活性が野生型遊離ＩＬ－２１の１０００分の１未満になるように改変された変異型ＩＬ－２１ポリペプチドとを融合させて、サイトカインであるＩＬ－２１の活性をヒトＴ細胞へと標的化させた報告もある（シェン（Ｓｈｅｎ）ら、フロンティアーズ・イン・イムノロジー（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２０２０）。しかしながらこれらの技術は、養子Ｔ細胞療法で用いられる改変ヒトＴ細胞にサイトカイン活性を標的化送達するための解決法を提供するものではない。
【0068】
いくつかの研究では、導入された切断型ＨＥＲ２マーカー遺伝子に結合するダーピンを使って、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を標的としている。これには、ＩＬ－２Ｒβγには結合するがＩＬ－２Ｒαとは結合しないように改変されたネオ－２／１５およびＩＬ－２ならびにＩＬ－１５模倣物と、抗ＨＥＲ２ダーピンＧ３とを融合させたものを使って、サイトカインであるＩＬ－２とＩＬ－１５を、形質導入マーカー遺伝子として切断型ＨＥＲ２を発現しているヒトＣＡＲ Ｔ細胞に標的化することが含まれる（リオン（Ｌｅｕｎｇ）ら、ＡＡＣＲ２０２０、要旨番号２２２２、２０２０）。しかしながら、養子Ｔ細胞療法に用いられる改変ヒトＴ細胞には、治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子に加えてさらなるマーカー遺伝子を共導入することはないため、この方法は、養子Ｔ細胞療法に用いられる改変ヒトＴ細胞にサイトカイン活性を標的化送達するための解決策を提供するものではない。
【0069】
本明細書に記載のいくつかの態様は、前述した欠点のうちの１つ以上を克服し得る。本明細書に記載の種々の態様は、さらなるマーカー遺伝子の導入を必要とせずに、従って、治療用遺伝子カセットの大きさを増大することなく、遺伝子編集効率を最大化しながら、改変ヒトＴ細胞を標的とするものである。
【0070】
いくつかの態様においてＴＣＲ Ｃβドメインマウスエピトープの態様は、さらなるマーカー遺伝子を導入する必要がなく、従って、治療用遺伝子カセットの大きさを増大させることなく、遺伝子編集効率を補助しながら改変ヒトＴ細胞を標的とすることができるという点で、前述した技術とは異なる。
２Ａペプチドエピトープに関する様々な態様
２Ａペプチドエピトープに関する様々な態様
【0071】
いくつかの態様は、ＴＣＲ鎖に挿入されるか、またはＴＣＲ鎖の一部を構成し得る抗体エピトープに関する。いくつかの態様においてエピトープは、そのような抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞を検出するために用いることができ、ここで抗体エピトープは、ＴＣＲ鎖またはキメラ抗原受容体に結合されている。いくつかの態様において遺伝子改変細胞は、抗体エピトープを含有するペプチドをコードしているヌクレオチド構築物を含む。いくつかの態様において遺伝子改変細胞の検出は、フローサイトメトリーによって検出可能な抗体染色に基づくものである。抗体は、抗体エピトープに特異的に結合および認識し得る。
【0072】
図２Ａ～２Ｄに示すように、いくつかの態様において抗体エピトープはＴＣＲ鎖のＣ末端またはＮ末端に結合されており、ここでＴＣＲ鎖は定常鎖または可変鎖のいずれであってもよい。他の態様では、抗体エピトープはＴＣＲ鎖に挿入される。いくつかの態様では、抗体エピトープはＴＣＲαとＴＣＲβ鎖とを連結するのに用いられる。いくつかの態様では、抗体エピトープの配置はＴＣＲ鎖を発現させる順番に依存する。いくつかの態様には、抗体エピトープ配列を有するタンパク質をコードしている、ＴＣＲ以外の遺伝子が含まれ得る。例としては、例えばＴ細胞の機能を調節するために二番目の導入遺伝子に融合される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）導入遺伝子が挙げられる。いくつかの態様には、２つ以上の抗体エピトープが含まれ得る。いくつかの態様は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の抗体エピトープを有する場合があり、ここでそれぞれの抗体エピトープは、同じであってもまたは異なっていてもよい。これらの態様においては、エピトープを特異的に検出できる抗体がある限り、いかなる抗体エピトープをも用いることができる。いくつかの態様において用いられる抗体はフローサイトメトリーでの使用に適合するものである。いくつかの態様では、抗体エピトープはＴＣＲ定常ドメインのＣ末端に結合されるため、細胞内部に局在する。これによって抗体エピトープが抗体媒介性免疫応答を利用できないため、免疫原性が低下する。いくつかの態様において抗体エピトープは、ＴＣＲの特異性と感受性への干渉を回避するために、ＴＣＲ定常ドメインに結合される。
【0073】
いくつかの態様において遺伝子改変細胞はＴ細胞を含む。いくつかの態様においてＴ細胞は、治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されている。いくつかの態様において治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されているＴ細胞は癌の治療に用いられる。「治療用ＴＣＲ遺伝子」という用語は、所望される機能、例えば、宿主の免疫系が疾患と戦うのを促進できるなどの機能を媒介する、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の特定の組み合わせを指す場合がある。
【0074】
いくつかの態様において抗体エピトープは２Ａペプチド配列、ＨＡ．１１エピトープタグ、ＦＬＡＧエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープタグ、またはＶ５エピトープタグを含む。これらのエピトープタグは、フローサイトメトリー適合性の抗体を使って、特異的に検出することができる。いくつかの態様において抗体エピトープは、２Ａペプチドと同数までのアミノ酸を含有するペプチドを含む。当業者であれば、２Ａペプチドと同数までのアミノ酸を含む限り、いかなるエピトープタグをも抗体エピトープの作製に用いてもよいことを理解する。
【0075】
２Ａペプチド、または２Ａ自己切断型ペプチドとは、ウイルスに由来する、１８～２２アミノ酸長のペプチドである。生命科学の研究では、２Ａペプチドファミリーのうちの４つのメンバーが用いられることが多く、それらは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。Ｐ２Ａはブタテッショウウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）－１ ２Ａに由来し；Ｔ２Ａはゾセア・アシグナ（ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａに由来し；Ｅ２Ａはウマ鼻炎Ａ（ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａ）ウイルスに由来し；Ｆ２Ａは口蹄疫（ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス１８に由来する。
【0076】
いくつかの態様において２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａであってよい。いくつかの態様では２Ａペプチドは２つの目的を有する：１つ目は、２つのタンパク質配列の発現を結びつけられるようにすることで；２つ目は、その２つのタンパク質配列のうちの少なくとも１つを検出できるようにするため、である。本明細書で使用する「遺伝子」とは、２Ａペプチドなどのペプチドのうちの１つをコードすることに関して用いられる場合、そのペプチド（例えば２Ａペプチド）をコードするヌクレオチド配列を指す。これは、天然に生じる遺伝子の配列を指すことを意図するものではなく、関連するペプチドをコードする核酸配列の省略表現を意味する。
【0077】
いくつかの態様において抗体エピトープは、２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、ここで２Ａペプチド配列は全長２Ａ配列ではない。
【0078】
いくつかの態様においてペプチド配列は配列番号１の配列（ＣＧＤＶＥＥＮＰＧ）を含む。いくつかの態様においてペプチド配列は配列番号６の配列（ＧＤＶＥＥＮＰＧ）を含む。いくつかの態様においてペプチド配列は配列番号７の配列（ＧＤＶＥＳＮＰＧ）を含む。いくつかの態様においてペプチド配列は、配列番号１と少なくとも７５％同一の配列を含む。
【0079】
いくつかの態様において抗体エピトープはモノクローナル抗２Ａペプチド抗体３Ｈ４によって同定することができる。３Ｈ４は、近年、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）によって開発された抗体であり、ウェスタンブロット法（ユー（Ｙｕ）ら、バイラシズ（Ｖｉｒｕｓｅｓ）、２０２０）、免疫沈降、および免疫組織染色／免疫蛍光法に用いることができる。
【0080】
いくつかの態様は、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された遺伝子改変Ｔ細胞の検出に用いる抗体エピトープであって、前述した態様のいずれか一つの抗体エピトープを含む、抗体エピトープに関する。
【0081】
いくつかの態様は、癌治療用の新規ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子で改変された細胞を検出するための抗体エピトープであって、前述した態様のいずれか一つの抗体エピトープを含む、抗体エピトープに関する。
【0082】
いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞を検出するために用いられるキットに関する。いくつかの態様において遺伝子改変細胞はＴ細胞を含む。いくつかの態様においてＴ細胞は治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている。いくつかの態様において、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されているＴ細胞は癌の治療に用いられる。いくつかの態様においてキットは、抗体エピトープに特異的に結合する抗体または結合剤を含む。いくつかの態様において抗体または結合剤は、蛍光または検出可能なマーカーを含む場合がある。
【0083】
いくつかの態様は、２Ａペプチド配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を発現することが可能な遺伝子を含む遺伝子構築物に関し、ここで構築物は、単一の読み取り枠から複数のタンパク質を発現するように構成されており、かつ、遺伝子は遺伝子構築物の大きさを２５アミノ酸より大きくしない。
【0084】
いくつかの態様において２Ａペプチド配列は、２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一な配列を含む。この２Ａペプチド配列は全長２Ａ配列ではない。いくつかの態様において２Ａペプチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号６の配列、または配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号６と少なくとも７５％同一の配列を含む（配列番号２＝ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号３＝ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号６＝ＧＤＶＥＥＮＰＧ）。
【0085】
遺伝子改変Ｔ細胞を用いる細胞治療では、それらＴ細胞の抗原特異性を再指示（リダイレクト）する必要がある。Ｔ細胞の抗原特異性を再指示するためには、外因性のＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列の両方を導入する必要がある。従って遺伝子改変効率を最大化するためには、治療用ＴＣＲ遺伝子構築物は、２つのＴＣＲ遺伝子を同時に容易に発現するものでなくてはならない。このことを達成する方法の一つが、２つのタンパク質を単一の読み取り枠から等モル比で共発現させることができる２Ａ自己切断型ペプチド配列の利用である（リャン（Ｒｙａｎ）およびドリュー（Ｄｒｅｗ）、エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ）、１９９４）。注目すべきことに、２Ａペプチドに基づくＴＣＲ導入遺伝子は、ＩＲＥＳに基づくＴＣＲ導入遺伝子よりも高い発現と機能性を示し（ライセガン（Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ）、２００８）、これは、導入したＴＣＲ鎖の対合性が高いためだろうと考えられている。
【0086】
いくつかの態様では、治療用ＴＣＲ遺伝子構築物中で、ＴＣＲ ＣαドメインまたはＴＣＲ Ｃβドメイン（発現の順序による）に共有結合させた介在性エピトープ（例えばマーカーまたは標識）配列、例えば２Ａペプチド配列を使用して、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖が共発現される。通常、哺乳類細胞中には２Ａペプチド配列は存在しないため、そのようなペプチドは、遺伝子改変Ｔ細胞を追跡するためのタンパク質マーカーとしても機能し得る。改変Ｔ細胞を未改変Ｔ細胞から区別するためには、単一細胞レベルで改変Ｔ細胞を検出することが可能な抗体試薬を用いることができる。モノクローナル抗２Ａペプチド抗体３Ｈ４を使って治療用ＴＣＲ遺伝子を検出することが可能な、フローサイトメトリーに基づく染色手順が開発されている。２ＡペプチドマーカーはＴＣＲβ鎖の細胞内ドメインに共有結合しているため、この染色手順を膜透過性細胞において実施することが重要である。これら２Ａペプチド結合型ＴＣＲβ鎖により、３Ｈ４抗体を使って効率的にＴＣＲ改変Ｔ細胞を検出することが可能になり、野生型Ｔ細胞に由来するバックグラウンドシグナルも非常に低く抑えられる。さらに、これらの２Ａペプチド結合型ＴＣＲβ鎖は、治療用ＴＣＲ遺伝子をヒトＴＣＲ遺伝子座のエクソンにインフレームでノックインするのにも適合する。
【0087】
現在利用可能な技術と比較して、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を検出、単離または低減するための、本明細書の様々な態様で記載の抗体エピトープに基づくタンパク質マーカーは、以下のような利点を有する：（ａ）治療用遺伝子構築物の大きさを２５アミノ酸より大きくしない、（ｂ）免疫原性を最小限に抑えられる、（ｃ）ＴＣＲの抗原特異性に応じた最適化の必要なしに、全ての治療用ＴＣＲ遺伝子に用いることができる、および（ｄ）全長ヒトＴＣＲ定常ドメインの利用と適合する。細胞内に局在することから、このマーカーは検出には適しているが、治療用ＴＣＲを発現するように改変されたＴ細胞を単離する、または低減させるためには適していない。
【0088】
より具体的には、２Ａペプチドエピトープを含む抗体エピトープに関する、現在利用可能な技術を上回る利点としては、いくつかの態様において、以下のうちの１つ以上が挙げられ得る：
１．免疫原性の低さ：本開示の発明では、代替技術、例えば全長マウスＴＣＲ定常ドメインなどと比較して、限られた数のアミノ酸変異だけを導入する。注目すべきは、２Ａペプチド配列はウイルスに由来するが、免疫適格性の個体では、免疫応答を誘導しないようである（アーバー（Ａｒｂｅｒ）ら、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２０１３）。
２．全ヒトＴＣＲに対する広範かつ汎用的な有用性：ＴＣＲの抗原特異性に応じた最適化の必要なしに、全ての治療用ＴＣＲ遺伝子に用いることができる。
３．高い特異性での検出：詳細は実施例３および４で見ることができる。
４．ヒトＴＣＲ遺伝子座のエクソンに治療用ＴＣＲ遺伝子をインフレームでノックインすることができる。
５．治療用ＴＣＲ遺伝子カセットの実質的な増加を回避する：２Ａペプチドは小さいため、２Ａペプチドを付加しても導入遺伝子の大きさは実質的に変化しない。より大きな導入遺伝子を使用すると、通常、組み込み効率が下がり、遺伝子を送達する最中のＤＮＡ毒性が上がるため、このことは重要である。
１．免疫原性の低さ：本開示の発明では、代替技術、例えば全長マウスＴＣＲ定常ドメインなどと比較して、限られた数のアミノ酸変異だけを導入する。注目すべきは、２Ａペプチド配列はウイルスに由来するが、免疫適格性の個体では、免疫応答を誘導しないようである（アーバー（Ａｒｂｅｒ）ら、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２０１３）。
２．全ヒトＴＣＲに対する広範かつ汎用的な有用性：ＴＣＲの抗原特異性に応じた最適化の必要なしに、全ての治療用ＴＣＲ遺伝子に用いることができる。
３．高い特異性での検出：詳細は実施例３および４で見ることができる。
４．ヒトＴＣＲ遺伝子座のエクソンに治療用ＴＣＲ遺伝子をインフレームでノックインすることができる。
５．治療用ＴＣＲ遺伝子カセットの実質的な増加を回避する：２Ａペプチドは小さいため、２Ａペプチドを付加しても導入遺伝子の大きさは実質的に変化しない。より大きな導入遺伝子を使用すると、通常、組み込み効率が下がり、遺伝子を送達する最中のＤＮＡ毒性が上がるため、このことは重要である。
【0089】
いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に関する。いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞に関する。いくつかの態様は、前述した態様のいずれか一つの遺伝子構築物を含んでいる遺伝子改変細胞に関する。
【0090】
標識タンパク質または抗体エピトープは、任意の好適な細胞に導入することができる。好適な細胞としては、これらに限定するものではないが、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、および細菌が挙げられる。いくつかの態様では好適な担体として、ウイルス、酵母、細菌、およびファージが挙げられる。本開示では、簡略化のために全体を通じて「細胞」という用語を用いるが、本明細書では、このような「細胞」の開示は全て、様々な形態のＴ細胞（例えば不死化Ｔ細胞）、酵母および細菌だけでなく、より広く、ウイルスやファージを含む任意の担体にも用いられ得ることを意図している。従って、本明細書で使用される「細胞」（コンビナトリアルライブラリーを導入してもよい細胞に関連する）についての開示は、真核細胞、原核細胞を含む場合があり、また、ウイルスやファージを担体として用いることができる選択肢も指す。細胞は、細胞株であっても、不死化細胞であっても、または初代細胞であってもよい。いくつかの態様において細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞由来である。いくつかの態様では、細胞の集団は不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において細胞は、その細胞の機能特性の内在的な発現またはバックグラウンドの発現を抑制するまたは除去するために改変、例えば遺伝子改変、される。いくつかの態様において細胞は、標識タンパク質または抗体エピトープが導入された時に、その細胞の機能特性を示す能力が向上するように改変、例えば遺伝子改変、される。いくつかの態様において細胞は、培地での集団の成長および／または維持が促進されるように改変、例えば遺伝子改変、される。いくつかの態様において細胞集団は、細胞に少なくとも１つの機能特性を付与する内在性ポリペプチドを含まない。いくつかの態様において細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８のうちの１つ以上の発現を、導入するまたは増強するまたは除去するまたは抑制するように遺伝子改変される。いくつかの態様において遺伝子改変細胞はＴ細胞である。
【0091】
【0092】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【0093】
図３は、種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。ｈｕＴＲＢＣ１は全長ヒトＴＲＢＣ１配列を；ｍｕＴｒｂｃ２はポリＡシグナルを除去した全長マウスＴｒｂｃ２配列を；ｍｕＴｒｂｃ２－ＢＧＨｐＡはＢＧＨのポリＡシグナルを付加した全長マウスＴｒｂｃ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ１－ｍｕＦＧは、マウスＴｒｂｃ２のＦＧループ（推定Ｈ５７結合エピトープ；ワン（Ｗａｎｇ）ら、エンボ・ジャーナル、１９９８）を組み込んだヒトＴＲＢＣ１配列を示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰとＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した。このデータは、全長マウスＴｒｂｃ２配列を使用した場合、ＴＣＲの発現にポリＡシグナルが有用であること、およびＨ５７抗体によって全長マウスＴｒｂｃ２配列を発現している細胞を認識できることを示している。しかしながら、ヒトＴＲＢＣ１配列にマウスＴｒｂｃ２のＦＧループを組み込んでも、ＴＣＲを発現させることはできるが、Ｈ５７抗体による認識には十分でなかった。
【0094】
図４は、種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。ｈｕＴＲＢＣ１は全長ヒトＴＲＢＣ１配列を；ｍｕＴｒｂｃ２－ＢＧＨｐＡはＢＧＨポリＡシグナルを付加した全長マウスＴｒｂｃ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕＡＢＦＧはマウスＴｒｂｃ２ ＡとＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループ（推定Ｈ５７結合エピトープ；ワンら、エンボ・ジャーナル、１９９８およびササダら、実験医学雑誌、２００２）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰとＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド）とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した。このデータは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループをヒトＴＲＢＣ２配列に組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示している（アミノ酸変異はＫ４Ｒ、Ｆ７Ｔ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ１０６Ｅ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、Ａ１１４Ｐとなっている）。
【0095】
図５は、種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。ｈｕＴＲＢＣ２は全長のヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕＡＢＦＧは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループ（推定Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｒ４Ｋは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｒ４Ｋ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｔ７Ｆは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｔ７Ｆ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｆ３７Ｙは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｆ３７Ｙ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｅ１０６Ｎは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｅ１０６Ｎ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｋ１０８Ｅは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｋ１０８Ｅ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｐ１１０Ｔは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｐ１１０Ｔ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｅ１１１Ｑは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｅ１１１Ｑ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｇ１１２Ｄは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｇ１１２Ｄ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｓ１１３Ｒは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｓ１１３Ｒ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｐ１１４Ａは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｐ１１４Ａ）ヒトＴＲＢＣ２配列を示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰとＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド）とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した。データは、Ｈ５７抗体による認識を可能にするためには、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６のアミノ酸残基とＦＧループが必要なことを示している（アミノ酸はＲ４、Ｋ１０８、Ｐ１１０、Ｅ１１１、Ｇ１１２、およびＳ１１３となっている）。
【0096】
図６は、種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。ｈｕＴＲＢＣ２は全長のヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕ１０は、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループ（推定Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕ６は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕ７は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する７つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ＋Ｔ７）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの６日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド）とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した。データは、ヒトＴＲＢＣ２配列に、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示している（アミノ酸変異は、Ｋ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓとなっている）。
【0097】
図７は、種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。模擬エレクトロポレーションはエレクトロポレーションを行っていない細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰはＴＲＡＣ ＲＮＰのみをエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋環状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと環状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋直鎖状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと直鎖状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞を示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１０日後に細胞を回収し、透過処理した後に、非抱合型マウス抗２Ａペプチド抗体（クローン３Ｈ４、カタログ番号ＮＢＰ２－５９６２７、ノバス・バイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））とＢＶ４２１ラット抗マウスＩｇＧ１抗体（クローンＡ８５－１、カタログ番号５６２５８０、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使った染色により、ＦＡＣＳ分析を行った。全ての染色において、ＢＤ透過／洗浄（Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ）緩衝液（１倍）を使用した。データは、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変したヒト初代Ｔ細胞を、抗２Ａペプチド抗体で検出できることを示している。
【0098】
図８は、種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。模擬エレクトロポレーションはエレクトロポレーションを行っていない細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰはＴＲＡＣ ＲＮＰのみをエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋環状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと環状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋直鎖状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと直鎖状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化した後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１１日後に細胞を回収し、透過処理した後、非抱合型マウス抗２Ａペプチド抗体（クローン３Ｈ４、カタログ番号ＮＢＰ２－５９６２７、ノバス・バイオロジカルズ）、ＢＶ４２１ラット抗マウスＩｇＧ１抗体（クローンＡ８５－１、カタログ番号５６２５８０、ＢＤバイオサイエンス）およびＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）を使った染色によるＦＡＣＳ分析を行った。全ての染色において、ＢＤ透過／洗浄緩衝液（１倍）を使用した。データは、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変したヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体で検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色とＴＣＲ Ｖβ１３．１の染色との間に相関があることを示している。
【0099】
図９は、ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するようにレトロウイルスを介して形質導入したヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を示している。模擬形質導入は形質転換されていない細胞を；Ｌｙ６Ｇ－Ｐｕｒｏは、Ｌｙ６Ｇ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ構築物を有するレトロウイルスで形質転換した細胞を；１ｓｔ Ｇｅｎ ＣＡＲ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐｕｒｏは、１ｓｔ Ｇｅｎ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ構築物を有するレトロウイルスで形質転換した細胞を；２ｎｄ Ｇｅｎ ＣＡＲ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐｕｒｏは、２ｎｄ Ｇｅｎ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ構築物を有するレトロウイルスで形質転換した細胞を示す。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、前述したようにレトロウイルスを感染させた。形質導入の１４日後に細胞を回収し、透過処理した後、非抱合型マウス抗２Ａペプチド抗体（クローン３Ｈ４、カタログ番号ＮＢＰ２－５９６２７、ノバス・バイオロジカルズ）、ＢＶ４２１ラット抗マウスＩｇＧ１抗体（クローンＡ８５－１、カタログ番号５６２５８０、ＢＤバイオサイエンス）およびＰＥ／ダズル（Ｄａｚｚｌｅ）５９４抗Ｌｙ６Ｇ抗体（クローン１Ａ８、カタログ番号１２７６４７、バイオレジェンド）を使った染色によるＦＡＣＳ分析を行った。全ての染色において、ＢＤ透過／洗浄緩衝液（１倍）を使用した。データは、２Ａペプチド配列を含むＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体によって検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色と同じ構築物中に含まれる形質導入マーカータンパク質（Ｌｙ６Ｇ）の染色との間に相関が見られることを示している。
【0100】
本明細書において、２つ以上の定義されたステップを含む方法に言及する場合、これら定義されたステップは、いかなる順序で実施しても、または同時に実施してもよい（文脈からその可能性が排除される場合を除く）。また方法には、定義されたいずれかのステップの前に、定義された２つのステップの間に、または定義された全てのステップの後に実施される（文脈からその可能性が排除される場合を除く）、１つ以上の他のステップを含めてもよい。
【0101】
いくつかの態様では、以下のアレンジメントのうちのいずれかが想定される。
１．標識タンパク質であって、
ＴＣＲ定常ドメイン；および
ＴＣＲ定常ドメイン中に存在し、検出および同定が可能な配列を含む外因性アミノ酸変種を含んでいる、標識タンパク質。
２．該ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常ドメインを含む、アレンジメント１の標識タンパク質。
３．該外因性アミノ酸変種が該ＴＣＲ定常ドメインの配列に変異を含み、必要に応じて、該標識タンパク質がｈｕＴＲＢＣ１－ｍｕｒ６またはｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕｒ６を含む、アレンジメント１の標識タンパク質。
４．該ＴＣＲ定常ドメインが一つの種に由来し、該外因性アミノ酸変種が別の種に由来する、アレンジメント１の標識タンパク質。
５．該ＴＣＲ定常ドメインがヒトに由来し、該外因性アミノ酸変種が非ヒト種に由来する、アレンジメント４の標識タンパク質。
６．該非ヒト種がマウスである、アレンジメント５の標識タンパク質。
７．該ＴＣＲ定常ドメインが該ヒトＴＲＢＣ２遺伝子によってコードされている配列を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
８．該外因性アミノ酸変種が該マウスＴＣＲ Ｃβドメインの配列を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
９．該変異が１０のアミノ酸変異を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
１０．該変異が非連続的配列を形成する、アレンジメント９の標識タンパク質。
１１．１０のアミノ酸変異が、配列番号８の付番方法によって、Ｋ４Ｒ、Ｆ７Ｔ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ１０６Ｅ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、Ａ１１４Ｐと番号づけられる、アレンジメント９の標識タンパク質。
１２．該変異が６のアミノ酸変異を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
１３．６のアミノ酸変異がＫ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓであり、必要に応じて該標識タンパク質が配列番号２７を含む、アレンジメント１２の標識タンパク質。
１４．該外因性アミノ酸変種を抗体、ナノボディ、Ｆａｂ断片またはダーピン（ＤＡＲＰｉｎ）によって検出および同定することが可能な、アレンジメント１の標識タンパク質。
１５．該外因性アミノ酸変種が抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７－５９７で検出および同定することが可能な、アレンジメント１の標識タンパク質。
１６．そのような標識タンパク質を発現している該遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、アレンジメント１～１５のいずれか１つに記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
１７．該遺伝子改変細胞が遺伝子改変Ｔ細胞を含む、アレンジメント１６の標識タンパク質。
１８．該遺伝子改変Ｔ細胞が治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されたＴ細胞を含む、アレンジメント１７の標識タンパク質。
１９．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された該Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント１８の標識タンパク質。
２０．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された遺伝子改変Ｔ細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、ここで該標識タンパク質が該マウスＴＣＲ Ｃβドメインに由来し、そして、該ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメイン中に存在するアミノ酸を変異させることによって該ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインに導入される、標識タンパク質。
２１．該癌治療用新規ＴＣＲ遺伝子で改変した細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、アレンジメント１～２０のいずれか１つに記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
２２．アレンジメント１～２１のいずれか１つに記載の標識タンパク質を有する遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いられるキットであって、該標識タンパク質を認識する抗体を含む、キット。
２３．該遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、アレンジメント２２のキット。
２４．該Ｔ細胞が治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている、アレンジメント２３のキット。
２５．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている該Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント２４のキット。
２６．そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞への１つ以上の搭載物の標的化送達に用いられる標識タンパク質であって、アレンジメント１～１５のいずれか１つに記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
２７．１つ以上の搭載物の該送達が、抗体、抗体模倣タンパク質または他の任意の抗原結合足場への接合によって達成される、アレンジメント２６の標識タンパク質。
２８．該抗体が抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７－５９７である、アレンジメント２７の標識タンパク質。
２９．該１つ以上の搭載物がタンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３０．該送達される搭載物がサイトカインである、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３１．該サイトカインがＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの群から選択される、アレンジメント３０の標識タンパク質。
３２．該サイトカインの配列が、その天然の受容体分子との相互作用を調節するように改変されている、アレンジメント３０の標識タンパク質。
３３．該サイトカインがＴ細胞によって発現される受容体分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、アレンジメント３０の標識タンパク質。
３４．該搭載物がＴ細胞によって発現される受容体分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３５．該アゴニストがＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７またはＣＤ２７８に結合する、アレンジメント３４の標識タンパク質。
３６．該アンタゴニストがＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体に結合する、アレンジメント３４の標識タンパク質。
３７．該搭載物が、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する小分子である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３８．該小分子が、ＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体いずれかのシグナル伝達を阻害する、アレンジメント３７の標識タンパク質。
３９．該搭載物が、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する核酸である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
４０．該核酸がｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、アレンジメント３９の標識タンパク質。
４１．該搭載物が二重または三重特異性抗体である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
４２．標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するための方法であって、
該１つ以上の搭載物と該標識タンパク質に特異的に結合する結合剤とを含む複合体を得ること、および
該遺伝子改変細胞と該複合体とを接触させること
を含む、方法。
４３．該結合剤が、抗体、抗体模倣タンパク質、または他の任意の抗原結合足場である、アレンジメント４２の方法。
４４．該１つ以上の搭載物が、タンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である、アレンジメント４２の方法。
４５．そのような抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、ここで該抗体エピトープがＴＣＲ鎖またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合している、抗体エピトープ。
４６．該抗体エピトープが、ＴＣＲ鎖のＣ末端もしくはＮ末端またはＣＡＲのＣ末端もしくはＮ末端に結合している、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
４７．該抗体エピトープが、ＴＣＲ鎖またはＣＡＲに挿入される、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
４８．該遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
４９．Ｔ細胞が、治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されている、アレンジメント４８の抗体エピトープ。
５０．治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されているＴ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント４９の抗体エピトープ。
５１．該抗体エピトープが、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖を連結するために、またはＣＡＲと他の遺伝子によってコードされているタンパク質とを連結するために用いられる、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
５２．２Ａペプチド配列、ＨＡ．１１エピトープタグ、ＦＬＡＧエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープタグ、Ｖ５エピトープタグ、または該２Ａペプチドと同数までのアミノ酸を含有するペプチドを含む、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
５３．該２Ａペプチドが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａであり得る、アレンジメント５２の抗体エピトープ。
５４．２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、該２Ａペプチド配列が全長２Ａ配列ではない、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
５５．該ペプチド配列が、配列番号１（ＣＧＤＶＥＥＮＰＧ）またはそれと少なくとも７５％同一の配列を含む、アレンジメント５４の抗体エピトープ。
５６．該抗体エピトープが、モノクローナル抗２Ａペプチド抗体３Ｈ４によって同定され得る、アレンジメント５４または５５の抗体エピトープ。
５７．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている遺伝子改変Ｔ細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、アレンジメント４５～５６のいずれか１つに記載の抗体エピトープを含む、抗体エピトープ。
５８．癌治療用新規ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子によって改変された細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、アレンジメント４５～５６のいずれか１つに記載の抗体エピトープを含んでいる、抗体エピトープ。
５９．遺伝子改変細胞の検出に用いられるキットであって、アレンジメント４５～５６のいずれか１つに記載の抗体エピトープを含んでいる、キット。
６０．該遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、アレンジメント５９のキット。
６１．該Ｔ細胞が、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている、アレンジメント６０のキット。
６２．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている該Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント６１のキット。
６３．２Ａペプチド配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を発現することが可能なヌクレオチド配列を含んでいる遺伝子構築物であって、ここで該構築物が単一の読み取り枠から複数のタンパク質を発現するように構成されており、かつ、該ヌクレオチド配列が該遺伝子構築物の大きさを２５アミノ酸より大きくしない、遺伝子構築物。
６４．該２Ａペプチド配列が、２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、該２Ａペプチド配列が全長２Ａ配列ではない、アレンジメント６３の遺伝子構築物。
６５．該２Ａペプチド配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号６の配列、または配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号６と少なくとも７５％同一の配列を含む、アレンジメント６４の遺伝子構築物（配列番号２＝ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号３＝ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号６＝ＧＤＶＥＥＮＰＧ）。
６６．アレンジメント１～１５のいずれか１つに記載の標識タンパク質、またはアレンジメント５３～５５のいずれか１つに記載の抗体エピトープ、またはアレンジメント６３～６５のいずれか１つに記載の遺伝子構築物を含んでいる、遺伝子改変細胞。
１．標識タンパク質であって、
ＴＣＲ定常ドメイン；および
ＴＣＲ定常ドメイン中に存在し、検出および同定が可能な配列を含む外因性アミノ酸変種を含んでいる、標識タンパク質。
２．該ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲαまたはＴＣＲβ定常ドメインを含む、アレンジメント１の標識タンパク質。
３．該外因性アミノ酸変種が該ＴＣＲ定常ドメインの配列に変異を含み、必要に応じて、該標識タンパク質がｈｕＴＲＢＣ１－ｍｕｒ６またはｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕｒ６を含む、アレンジメント１の標識タンパク質。
４．該ＴＣＲ定常ドメインが一つの種に由来し、該外因性アミノ酸変種が別の種に由来する、アレンジメント１の標識タンパク質。
５．該ＴＣＲ定常ドメインがヒトに由来し、該外因性アミノ酸変種が非ヒト種に由来する、アレンジメント４の標識タンパク質。
６．該非ヒト種がマウスである、アレンジメント５の標識タンパク質。
７．該ＴＣＲ定常ドメインが該ヒトＴＲＢＣ２遺伝子によってコードされている配列を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
８．該外因性アミノ酸変種が該マウスＴＣＲ Ｃβドメインの配列を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
９．該変異が１０のアミノ酸変異を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
１０．該変異が非連続的配列を形成する、アレンジメント９の標識タンパク質。
１１．１０のアミノ酸変異が、配列番号８の付番方法によって、Ｋ４Ｒ、Ｆ７Ｔ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ１０６Ｅ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、Ａ１１４Ｐと番号づけられる、アレンジメント９の標識タンパク質。
１２．該変異が６のアミノ酸変異を含む、アレンジメント３の標識タンパク質。
１３．６のアミノ酸変異がＫ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓであり、必要に応じて該標識タンパク質が配列番号２７を含む、アレンジメント１２の標識タンパク質。
１４．該外因性アミノ酸変種を抗体、ナノボディ、Ｆａｂ断片またはダーピン（ＤＡＲＰｉｎ）によって検出および同定することが可能な、アレンジメント１の標識タンパク質。
１５．該外因性アミノ酸変種が抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７－５９７で検出および同定することが可能な、アレンジメント１の標識タンパク質。
１６．そのような標識タンパク質を発現している該遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、アレンジメント１～１５のいずれか１つに記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
１７．該遺伝子改変細胞が遺伝子改変Ｔ細胞を含む、アレンジメント１６の標識タンパク質。
１８．該遺伝子改変Ｔ細胞が治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されたＴ細胞を含む、アレンジメント１７の標識タンパク質。
１９．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された該Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント１８の標識タンパク質。
２０．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変された遺伝子改変Ｔ細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、ここで該標識タンパク質が該マウスＴＣＲ Ｃβドメインに由来し、そして、該ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメイン中に存在するアミノ酸を変異させることによって該ヒトＴＣＲ Ｃβ２ドメインに導入される、標識タンパク質。
２１．該癌治療用新規ＴＣＲ遺伝子で改変した細胞の検出、単離または低減に用いられる標識タンパク質であって、アレンジメント１～２０のいずれか１つに記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
２２．アレンジメント１～２１のいずれか１つに記載の標識タンパク質を有する遺伝子改変細胞の検出、単離または低減に用いられるキットであって、該標識タンパク質を認識する抗体を含む、キット。
２３．該遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、アレンジメント２２のキット。
２４．該Ｔ細胞が治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている、アレンジメント２３のキット。
２５．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている該Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント２４のキット。
２６．そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞への１つ以上の搭載物の標的化送達に用いられる標識タンパク質であって、アレンジメント１～１５のいずれか１つに記載の標識タンパク質を含む、標識タンパク質。
２７．１つ以上の搭載物の該送達が、抗体、抗体模倣タンパク質または他の任意の抗原結合足場への接合によって達成される、アレンジメント２６の標識タンパク質。
２８．該抗体が抗マウスＴＣＲ Ｃβ抗体Ｈ５７－５９７である、アレンジメント２７の標識タンパク質。
２９．該１つ以上の搭載物がタンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３０．該送達される搭載物がサイトカインである、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３１．該サイトカインがＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの群から選択される、アレンジメント３０の標識タンパク質。
３２．該サイトカインの配列が、その天然の受容体分子との相互作用を調節するように改変されている、アレンジメント３０の標識タンパク質。
３３．該サイトカインがＴ細胞によって発現される受容体分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、アレンジメント３０の標識タンパク質。
３４．該搭載物がＴ細胞によって発現される受容体分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３５．該アゴニストがＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７またはＣＤ２７８に結合する、アレンジメント３４の標識タンパク質。
３６．該アンタゴニストがＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体に結合する、アレンジメント３４の標識タンパク質。
３７．該搭載物が、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する小分子である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
３８．該小分子が、ＴＧＦ－β受容体、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ビスタ、ステロイド受容体またはＡ１－、Ａ２Ａ－、Ａ２Ｂ－もしくはＡ３－アデノシン受容体いずれかのシグナル伝達を阻害する、アレンジメント３７の標識タンパク質。
３９．該搭載物が、Ｔ細胞の活性化、分化、増殖、生存またはエフェクター機能を調節する核酸である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
４０．該核酸がｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、アレンジメント３９の標識タンパク質。
４１．該搭載物が二重または三重特異性抗体である、アレンジメント２６の標識タンパク質。
４２．標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞に１つ以上の搭載物を標的化送達するための方法であって、
該１つ以上の搭載物と該標識タンパク質に特異的に結合する結合剤とを含む複合体を得ること、および
該遺伝子改変細胞と該複合体とを接触させること
を含む、方法。
４３．該結合剤が、抗体、抗体模倣タンパク質、または他の任意の抗原結合足場である、アレンジメント４２の方法。
４４．該１つ以上の搭載物が、タンパク質、小分子、核酸、リポソーム、またはナノ粒子である、アレンジメント４２の方法。
４５．そのような抗体エピトープを発現している遺伝子改変細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、ここで該抗体エピトープがＴＣＲ鎖またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合している、抗体エピトープ。
４６．該抗体エピトープが、ＴＣＲ鎖のＣ末端もしくはＮ末端またはＣＡＲのＣ末端もしくはＮ末端に結合している、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
４７．該抗体エピトープが、ＴＣＲ鎖またはＣＡＲに挿入される、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
４８．該遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
４９．Ｔ細胞が、治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されている、アレンジメント４８の抗体エピトープ。
５０．治療用ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入によって改変されているＴ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント４９の抗体エピトープ。
５１．該抗体エピトープが、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖を連結するために、またはＣＡＲと他の遺伝子によってコードされているタンパク質とを連結するために用いられる、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
５２．２Ａペプチド配列、ＨＡ．１１エピトープタグ、ＦＬＡＧエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープタグ、Ｖ５エピトープタグ、または該２Ａペプチドと同数までのアミノ酸を含有するペプチドを含む、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
５３．該２Ａペプチドが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａであり得る、アレンジメント５２の抗体エピトープ。
５４．２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、該２Ａペプチド配列が全長２Ａ配列ではない、アレンジメント４５の抗体エピトープ。
５５．該ペプチド配列が、配列番号１（ＣＧＤＶＥＥＮＰＧ）またはそれと少なくとも７５％同一の配列を含む、アレンジメント５４の抗体エピトープ。
５６．該抗体エピトープが、モノクローナル抗２Ａペプチド抗体３Ｈ４によって同定され得る、アレンジメント５４または５５の抗体エピトープ。
５７．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている遺伝子改変Ｔ細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、アレンジメント４５～５６のいずれか１つに記載の抗体エピトープを含む、抗体エピトープ。
５８．癌治療用新規ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子によって改変された細胞の検出に用いられる抗体エピトープであって、アレンジメント４５～５６のいずれか１つに記載の抗体エピトープを含んでいる、抗体エピトープ。
５９．遺伝子改変細胞の検出に用いられるキットであって、アレンジメント４５～５６のいずれか１つに記載の抗体エピトープを含んでいる、キット。
６０．該遺伝子改変細胞がＴ細胞を含む、アレンジメント５９のキット。
６１．該Ｔ細胞が、治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている、アレンジメント６０のキット。
６２．治療用ＴＣＲ遺伝子の導入によって改変されている該Ｔ細胞が癌の治療に用いられる、アレンジメント６１のキット。
６３．２Ａペプチド配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を発現することが可能なヌクレオチド配列を含んでいる遺伝子構築物であって、ここで該構築物が単一の読み取り枠から複数のタンパク質を発現するように構成されており、かつ、該ヌクレオチド配列が該遺伝子構築物の大きさを２５アミノ酸より大きくしない、遺伝子構築物。
６４．該２Ａペプチド配列が、２Ａペプチド配列断片またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、該２Ａペプチド配列が全長２Ａ配列ではない、アレンジメント６３の遺伝子構築物。
６５．該２Ａペプチド配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号６の配列、または配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号６と少なくとも７５％同一の配列を含む、アレンジメント６４の遺伝子構築物（配列番号２＝ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号３＝ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号６＝ＧＤＶＥＥＮＰＧ）。
６６．アレンジメント１～１５のいずれか１つに記載の標識タンパク質、またはアレンジメント５３～５５のいずれか１つに記載の抗体エピトープ、またはアレンジメント６３～６５のいずれか１つに記載の遺伝子構築物を含んでいる、遺伝子改変細胞。
【実施例】
【0102】
実施例１
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示す。
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示す。
【0103】
種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド）とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0104】
結果を図３に表す：ｈｕＴＲＢＣ１は全長ヒトＴＲＢＣ１配列を；ｍｕＴｒｂｃ２はポリＡシグナルを除去した全長マウスＴｒｂｃ２配列を；ｍｕＴｒｂｃ２－ＢＧＨｐＡはＢＧＨのポリＡシグナルを付加した全長マウスＴｒｂｃ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ１－ｍｕＦＧはマウスＴｒｂｃ２のＦＧループを組み込んだヒトＴＲＢＣ１配列を示す。
【0105】
このデータは、全長マウスＴｒｂｃ２配列を使用した場合、ＴＣＲの発現にポリＡシグナルが有用であること、およびＨ５７抗体によって全長マウスＴｒｂｃ２配列を発現している細胞を認識できることを示している。しかしながら、ヒトＴＲＢＣ１配列にマウスＴｒｂｃ２ＦＧループを組み込んでも、ＴＣＲを発現させることはできるが、Ｈ５７抗体による認識には十分でなかった。
【0106】
次に、ヒトＴＲＢＣ２配列に、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループを組み込んで試験した。同様に、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド）とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0107】
結果を図４に表す：ｈｕＴＲＢＣ１は全長ヒトＴＲＢＣ１配列を；ｍｕＴｒｂｃ２－ＢＧＨｐＡはＢＧＨのポリＡシグナルを付加した全長マウスＴｒｂｃ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕＡＢＦＧは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループを組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を示す。
【0108】
このデータは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループをヒトＴＲＢＣ２配列に組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示している（アミノ酸変異はＫ４Ｒ、Ｆ７Ｔ、Ｙ３７Ｆ、Ｎ１０６Ｅ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、Ａ１１４Ｐとなっている）。
【0109】
実施例２
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列に、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示す。
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列に、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示す。
【0110】
種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド）とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0111】
結果を図５に表す：ｈｕＴＲＢＣ２は全長のヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕＡＢＦＧはマウスＴｒｂｃ２のＡとＢストランドに由来する１０のアミノ酸とＦＧループ（推定Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｒ４Ｋは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｒ４Ｋ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｔ７Ｆは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｔ７Ｆ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｆ３７Ｙは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｆ３７Ｙ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｅ１０６Ｎは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｅ１０６Ｎ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｋ１０８Ｅは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｋ１０８Ｅ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｐ１１０Ｔは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｐ１１０Ｔ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｅ１１１Ｑは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｅ１１１Ｑ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｇ１１２Ｄは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｇ１１２Ｄ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｓ１１３Ｒは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｓ１１３Ｒ）ヒトＴＲＢＣ２配列を；ｍｕＡＢＦＧ Ｐ１１４Ａは、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する９のアミノ酸残基とＦＧループを組み込み、最小Ｈ５７結合エピトープを位置付けるために１つのアミノ酸残基をヒト対応物のものに戻した（Ｐ１１４Ａ）ヒトＴＲＢＣ２配列を示す。このデータは、Ｈ５７抗体による認識を可能にするためには、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６のアミノ酸残基とＦＧループが必要なことを示している（アミノ酸はＲ４、Ｋ１０８、Ｐ１１０、Ｅ１１１、Ｇ１１２、およびＳ１１３となっている）。
【0112】
次に、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの６日後に細胞を回収し、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号１０９２１２、バイオレジェンド）とＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）との共染色によって分析した後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0113】
結果を図６に表す：ｈｕＴＲＢＣ２は全長のヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕ１０は、マウスＴｒｂｃ２のＡおよびＢストランドに由来する１０のアミノ酸残基とＦＧループ（推定Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕ６は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を；ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕ７は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する７つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ＋Ｔ７）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２配列を示す。このデータは、ヒトＴＲＢＣ２配列に、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示している（アミノ酸変異は、Ｋ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓとなっている）。
【0114】
実施例３
本実施例では、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を、抗２Ａペプチド抗体で検出できることを示す。
本実施例では、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を、抗２Ａペプチド抗体で検出できることを示す。
【0115】
種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１０日後に細胞を回収し、透過処理した後に、非抱合型マウス抗２Ａペプチド抗体（クローン３Ｈ４、カタログ番号ＮＢＰ２－５９６２７、ノバス・バイオロジカルズ）とＢＶ４２１ラット抗マウスＩｇＧ１抗体（クローンＡ８５－１、カタログ番号５６２５８０、ＢＤバイオサイエンス）を使った染色により、ＦＡＣＳ分析を行った。全ての染色において、ＢＤ透過／洗浄緩衝液（１倍）を使用した。次いで、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0116】
結果を図７に表す：模擬エレクトロポレーションはエレクトロポレーションを行っていない細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰはＴＲＡＣ ＲＮＰのみをエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋環状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと環状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋直鎖状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと直鎖状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞を示す。このデータは、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変したヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体で検出できることを示している。
【0117】
実施例４
本実施例は、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変したヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体で検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色とＴＣＲ Ｖβ１３．１の染色との間に相関があることを示す。
本実施例は、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変したヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体で検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色とＴＣＲ Ｖβ１３．１の染色との間に相関があることを示す。
【0118】
種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導する修復鋳型をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１１日後に細胞を回収し、透過処理した後に、非抱合型マウス抗２Ａペプチド抗体（クローン３Ｈ４、カタログ番号ＮＢＰ２－５９６２７、ノバス・バイオロジカルズ）、ＢＶ４２１ラット抗マウスＩｇＧ１抗体（クローンＡ８５－１、カタログ番号５６２５８０、ＢＤバイオサイエンス）およびＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（クローンＨ１３１、カタログ番号３６２４０６、バイオレジェンド）を使った染色によるＦＡＣＳ分析を行った。全ての染色において、ＢＤ透過／洗浄緩衝液（１倍）を使用した。次いで、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0119】
結果を図８に表す：模擬エレクトロポレーションはエレクトロポレーションを行っていない細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰはＴＲＡＣ ＲＮＰのみをエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋環状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと環状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞を；ＴＲＡＣ ＲＮＰ＋直鎖状修復鋳型は、ＴＲＡＣ ＲＮＰと直鎖状修復鋳型をエレクトロポレーションした細胞を示す。このデータは、Ｔ２Ａペプチド配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変したヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体で検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色とＴＣＲ Ｖβ１３．１の染色との間に相関があることを示している。
【0120】
実施例５
本実施例では、２Ａペプチド配列を含むＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体によって検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色と同じ構築物中に含まれる形質導入マーカータンパク質（Ｌｙ６Ｇ）の染色との間に相関が見られることを示す。
本実施例では、２Ａペプチド配列を含むＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体によって検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色と同じ構築物中に含まれる形質導入マーカータンパク質（Ｌｙ６Ｇ）の染色との間に相関が見られることを示す。
【0121】
ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するようにレトロウイルスを介して形質導入したヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２日間活性化し、その後、前述したようにレトロウイルスを感染させた。形質導入の１４日後に細胞を回収し、透過処理した後、非抱合型マウス抗２Ａペプチド抗体（クローン３Ｈ４、カタログ番号ＮＢＰ２－５９６２７、ノバス・バイオロジカルズ）、ＢＶ４２１ラット抗マウスＩｇＧ１抗体（クローンＡ８５－１、カタログ番号５６２５８０、ＢＤバイオサイエンス）およびＰＥ／ダズル５９４抗Ｌｙ６Ｇ抗体（クローン１Ａ８、カタログ番号１２７６４７、バイオレジェンド）を使った染色によるＦＡＣＳ分析を行った。全ての染色において、ＢＤ透過／洗浄緩衝液（１倍）を使用した。次いで、ＦＡＣＳ分析を行った。
【0122】
結果を図９に表す：模擬形質導入は形質転換されていない細胞を；Ｌｙ６Ｇ－Ｐｕｒｏは、Ｌｙ６Ｇ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ構築物を有するレトロウイルスで形質転換した細胞を；１ｓｔ Ｇｅｎ ＣＡＲ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐｕｒｏは、１ｓｔ Ｇｅｎ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ構築物を有するレトロウイルスで形質転換した細胞を；２ｎｄ Ｇｅｎ ＣＡＲ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐｕｒｏは、２ｎｄ Ｇｅｎ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－Ｌｙ６Ｇ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ構築物を有するレトロウイルスで形質転換した細胞を示す。このデータは、２Ａペプチド配列を含むＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現するように改変されたヒト初代Ｔ細胞を抗２Ａペプチド抗体によって検出できること、およびこの２Ａペプチドの染色と同じ構築物中に含まれる形質導入マーカータンパク質（Ｌｙ６Ｇ）の染色との間に相関が見られることを示している。
【0123】
実施例６
本実施例では、そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞への１つ以上の搭載物の標的化送達に用いることができる標識タンパク質を示す。１つ以上の搭載物の送達は、Ｈ５７抗体への接合によって達成される。
本実施例では、そのような標識タンパク質を発現している遺伝子改変細胞への１つ以上の搭載物の標的化送達に用いることができる標識タンパク質を示す。１つ以上の搭載物の送達は、Ｈ５７抗体への接合によって達成される。
【0124】
ＩＬ２ｖのＮ末端をＨ５７ ＩｇＧ ＦｃドメインのＣ末端に、必要に応じて（Ｇ４Ｓ）３リンカーペプチドを介して、融合させる。Ｆｃドメインには１つ以上のアミノ酸置換が含まれており、これによってＦｃ受容体への結合が弱まる。置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇとなっている（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに基づくＬＡＬＡＰＧ）。
【0125】
ヒトＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲを発現するように改変したＴＣＲノックアウトＣＤ８高発現ジャーカット細胞のＦＡＣＳ分析を行った。ＦＡＣＳ分析は、内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞についても実施した。ｈｕＴＲＢＣ２－ｍｕｒ６発現細胞を、種々の濃度のＨ５７抗体と、またはＨ５７－ＩＬ２もしくはＨ５７－ＩＬ２ｖイムノサイトカインと共に３０分間プレインキュベーションした。次いで、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲ－Ｃβ抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号５５３１７４、ＢＤバイオサイエンス）およびＦＩＴＣ抗ヒトＩＬ２抗体（クローン５３４４．１１１、カタログ番号３４０４４８、ＢＤバイオサイエンス）による染色を使って、細胞のＦＡＣＳ分析を行った。染色は、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中で行った。
【0126】
図１８は、ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ジャーカット細胞では、２０ｎｇ／ｍＬのＨ５７、ならびにＨ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖによってｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６とＡＰＣ抗マウスＴＣＲ－Ｃβ抗体との結合が阻害されることを示している。図１９は、Ｈ５７、ならびにＨ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖが、ヒト初代ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲ Ｔ細胞におけるｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６とＡＰＣ抗マウスＴＣＲ－Ｃβ抗体との結合を阻害することを示している。図２０に見られるように、Ｈ５７－ＩＬ２またはＨ５７－ＩＬ２ｖと共にインキュベーションしたｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ Ｔ細胞はＦＩＴＣ抗ヒトＩＬ２抗体で強く染色され、このことは、これらの細胞表面にＩＬ２が存在することを表している。Ｍｕｒ６エピトープを発現していないヒト初代ｈｕＴＲＢＣ２ １Ｇ４ Ｔ細胞をＨ５７－ＩＬ２やＨ５７－ＩＬ２ｖと共にインキュベーションした時にもＩＬ２の染色が見られたことから、イムノサイトカインによるＩＬ２のＭｕｒ６特異的標的化が示唆される。これらのデータは併せて、Ｈ５７－ＩＬ２抗体－およびＨ５７－ＩＬ２抗体－サイトカイン融合タンパクによるｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６定常ドメイン発現１Ｇ４ ＴＣＲ改変細胞へのサイトカインの標的化送達を、Ｍｕｒ６エピトープを使って媒介できることを示している。
【0127】
実施例７
本実施例では、Ｔ細胞の増殖に対するＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体の刺激能をインビトロで評価する。
本実施例では、Ｔ細胞の増殖に対するＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体の刺激能をインビトロで評価する。
【0128】
実施例６のＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体を、前もってＰＨＡと共に一晩活性化させておいたＣＦＳＥ標識初代ヒトＴ細胞に添加し、その後、細胞をさらに４日間培養する。対照としては、無関係な抗体－ＩＬ２ｖ複合体を用いる。４日後、ＣＦＳＥの希釈度を測定すること、ならびにフローサイトメトリーを使ってＴ細胞におけるＣＤ２５の発現上昇を測定することで、Ｔ細胞の増殖に対するＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体の刺激能を評価する。
【0129】
ＣＦＳＥの代替物を用いた実験では、内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にｈｕＴＲＢＣ２ １Ｇ４ ＴＣＲまたはｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインし、セルトレースバイオレット（Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＴＶ）で標識した初代ヒトＴ細胞に、実施例６のＨ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体を添加し、その後、細胞をさらに４日間培養した。対照としては、非標的化組換え体のＩＬ－２を用いる。翌日、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９とＣＤ２５の発現を測定することで、Ｈ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体の刺激能を評価した。ＰＥ抗ヒトＣＤ６９抗体（クローンＦＮ５０、カタログ番号５５７０５０、ＢＤバイオサイエンス）とＢＶ７１１抗ヒトＣＤ２５抗体（クローン２Ａ３、カタログ番号５６３１５９、ＢＤバイオサイエンス）との共染色によって、ＦＡＣＳ分析を行った。４日間培養した後、ＣＴＶの希釈度を測定し、フローサイトメトリーを使ってＴ細胞数を計数することで、Ｔ細胞の増殖に対するＨ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体の刺激能を評価した。染色は全て、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中で実施した。
【0130】
図２１は、ｈｕＴＲＢＣ２ １Ｇ４ ＴＣＲまたはｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインした初代ヒトＴ細胞を、１ｎＭのＩＬ２、Ｈ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖと共に１日間インキュベーションした後の、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を表すドットプロットである。図２２Ａおよび２２Ｂのグラフは、（イムノ）サイトカインの濃度を変えた場合のＣＤ６９発現Ｔ細胞の割合（図２２Ａ）およびＣＤ２５高発現Ｔ細胞の割合（図２２Ｂ）を示している。これらの結果は、Ｈ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体が、ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲ発現Ｔ細胞を強くかつ特異的に刺激することを示している。
【0131】
図２３のヒストグラムは、ｈｕＴＲＢＣ２ １Ｇ４ ＴＣＲまたはｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲをノックインした初代ヒトＴ細胞を１ｎＭのＩＬ２、Ｈ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖと４日間インキュベーションした後のＴ細胞におけるＣＴＶの希釈度を示している。さらに図２４は、ＣＴＶのＦＡＣＳ測定から、それぞれの（イムノ）サイトカイン濃度に対して、全細胞の平均蛍光強度を未分裂細胞の平均蛍光強度で除算し、その対数の二乗（２ｌｏｇ ｏｆ ＭＦＩｕｎｄｉｖｉｄｅｄ／ＭＦＩａｌｌ ｃｅｌｌｓ）として算出した平均増殖周期を示す。これらの結果は、ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６ １Ｇ４ ＴＣＲ発現Ｔ細胞では、Ｈ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖを使ったｍｕｒ６の標的化によってＴ細胞の増殖が特異的に促進されることを示している。これらのデータは併せて、１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞にＭｕｒ６エピトープがあることで、Ｈ５７－ＩＬ２およびＨ５７－ＩＬ２ｖイムノサイトカインによる特定のサイトカインの標的化が可能になり、それによって、エピトープ特異的なＴ細胞刺激が誘導されることを示している。
【0132】
実施例８
本実施例では、Ｈ５７－ＩＬ２ｖ複合体がインビボでどのようにして腫瘍の増殖や腫瘍内のＴ細胞の蓄積に影響をおよぼすかを示す。
本実施例では、Ｈ５７－ＩＬ２ｖ複合体がインビボでどのようにして腫瘍の増殖や腫瘍内のＴ細胞の蓄積に影響をおよぼすかを示す。
【0133】
ここではＮＳＧマウスを用いる。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ重症複合免疫不全ガンママウス）は、ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって開発・販売されている研究用免疫不全マウスの商標で、ＮＯＤ系統もここに含まれる。ＮＳＧマウスにＮＹ－ＥＳＯ－１＋Ａ３７５メラノーマ細胞を皮下移植し、次いで、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現初代ヒトＴ細胞を投与する。その後毎週、マウスにＨ５７－ＩＬ２ｖ複合体または溶媒対照を注入する。その後、腫瘍の増殖および腫瘍内のＴ細胞の蓄積に及ぼす影響を経時的に測定する。
【0134】
実施例９
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示す。
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示す。
【0135】
種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１特異的１Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。３人の健常提供者（ＢＣ４５、ＢＣ４６、およびＢＣ４８）由来のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（カタログ番号４０２０３Ｄ、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）サーモフィッシャーサイエンティフィック）で２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導するＤＮＡ修復鋳型を、ならびに内在性ＴＣＲβ鎖のノックアウトを先導するＴＲＢＣ ＲＮＰをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５日後に１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞を回収し、ＰＥ抗マウスＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＨ５７－５９７、カタログ番号５５３１７２、ＢＤバイオサイエンス）とブリリアント・バイオレット（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ）４２１抗ヒトＴＣＲ Ｃβ鎖抗体（クローンＩＰ２６、カタログ番号３０６７２２、バイオレジェンド）との共染色によるＦＡＣＳ分析を行った。
【0136】
結果を図２５に表す：ｍｕＴｒｂｃ２は全長マウスＴｒｂｃ２定常ドメイン配列を付加した１Ｇ４ ＴＣＲを示し；ｈｕＴＲＢＣ１－Ｍｕｒ６は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ１定常ドメイン配列を付加した１Ｇ４ ＴＣＲを示し；ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を付加した１Ｇ４ ＴＣＲを示す。このデータは、ヒトＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２配列に、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込むだけで、ＴＣＲの発現とＨ５７抗体による認識が可能になることを示している（アミノ酸変異はそれぞれ、ｈｕＴＲＢＣ１－Ｍｕｒ６はＮ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓ、およびｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６はＫ４Ｒ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１１０Ｐ、Ｑ１１１Ｅ、Ｄ１１２Ｇ、Ｒ１１３Ｓとなっている）。
【0137】
実施例１０
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込んでも、Ｔ細胞のサイトカイン産生として測定されるＴＣＲの機能が干渉されないことを示す。
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込んでも、Ｔ細胞のサイトカイン産生として測定されるＴＣＲの機能が干渉されないことを示す。
【0138】
種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１特異的１Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。３人の健常提供者（ＢＣ２０、ＢＣ９３、およびＢＣ９７）由来のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（カタログ番号４０２０３Ｄ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）で２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導するＤＮＡ修復鋳型を、ならびに内在性ＴＣＲβ鎖のノックアウトを先導するＴＲＢＣ ＲＮＰをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１２日後に１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞を回収し、１０１～１０７ｐｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度のＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）を負荷しておいたＪＹ標的細胞と共培養した。４時間共培養した後、ゴルジプラグ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）タンパク質輸送阻害剤（カタログ番号５５５０２８、ＢＤバイオサイエンス）を添加し、細胞をさらに１６時間、共培養した。次いで細胞を回収し、透過処理した後に、ＰＥ抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（クローン２５７２３．１１、カタログ番号３４０４５２、ＢＤバイオサイエンス）とＦＩＴＣ抗ヒトＩＬ－２抗体（クローン５３４４．１１１、カタログ番号３４０４４８、ＢＤバイオサイエンス）との共染色によるＦＡＣＳ分析を行った。全ての染色において、ＢＤ透過／洗浄緩衝液（１倍；カタログ番号５５５０２８、ＢＤバイオサイエンス）を使用した。
【0139】
結果を図２６Ａ～２６Ｄに表す：ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を付加した１Ｇ４ ＴＣＲを示し；ｈｕＴＲＢＣ２は、全長ヒトＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を付加した１Ｇ４ ＴＣＲを示し；ｍｕＴｒｂｃ２は、全長マウスＴｒｂｃ２定常ドメイン配列を付加した１Ｇ４ ＴＣＲを示し；未エレクトロポレーションは、改変していないＴ細胞を示す。図２６Ａは、異なる用量のペプチドに応じた、１人の代表的な健常提供者（ＢＣ９３）に由来するＴ細胞のＩＦＮ－γの産生を示す。符号は、各用量のペプチドにつき３回の技術的反復を行って算出したＩＦＮ－γ陽性Ｔ細胞の割合（％）の幾何平均を；エラーバーは幾何的な標準偏差を示す。図２６Ｂは、試験した内の最も高用量のペプチド（１０７ｐｇ／ｍＬ）に応じた、３人の健常提供者に由来するＴ細胞のＩＦＮ－γ産生のまとめを示す。符号は、各提供者由来のＴ細胞について３回の技術的反復を行って算出したＩＦＮ－γ陽性Ｔ細胞の割合（％）を、線はその幾何平均を示している。図２６Ｃは、異なる用量のペプチドに応じた、１人の代表的な健常提供者（ＢＣ９７）に由来するＴ細胞のＩＬ－２の産生を示す。符号は、各用量のペプチドにつき３回の技術的反復を行って算出したＩＬ－２陽性Ｔ細胞の割合（％）の幾何平均を；エラーバーは幾何的な標準偏差を示す。図２６Ｄは、試験した内の最も高用量のペプチド（１０７ｐｇ／ｍＬ）に応じた、３人の健常提供者に由来するＴ細胞のＩＬ－２産生のまとめである。符号は、各提供者由来のＴ細胞について３回の技術的反復を行って算出したＩＬ－２陽性Ｔ細胞の割合（％）を、線はその幾何平均を示している。これらのデータは併せて、ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６定常ドメインを発現している１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞は、ｈｕＴＲＢＣ２またはｍｕＴｒｂｃ２定常ドメインを発現している１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞と同等のサイトカイン産生を媒介できることを示しており、このことから、ヒトＴＲＢＣ２にＭｕｒ６エピトープを組み込んでもＴＣＲの機能は損なわれないことが示唆される。
【0140】
実施例１１
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２ Ａストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込んでも、Ｔ細胞の標的細胞死滅として測定されるＴＣＲの機能が干渉されないことを示す。
本実施例では、ヒトＴＲＢＣ２配列にマウスＴｒｂｃ２ Ａストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループを組み込んでも、Ｔ細胞の標的細胞死滅として測定されるＴＣＲの機能が干渉されないことを示す。
【0141】
種々の修復鋳型を使って内在性ＴＲＡＣ遺伝子座にＮＹ－ＥＳＯ－１特異的１Ｇ４ ＴＣＲをノックインしたヒト初代Ｔ細胞について、インキュサイト（ＩｎｃｕＣｙｔｅ）を使った生細胞の分析を行った。３人の健常提供者（ＢＣ２０、ＢＣ９３、およびＢＣ９７）由来のヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（カタログ番号４０２０３Ｄ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）で２日間活性化し、その後、ＴＲＡＣ ＲＮＰおよびＴＣＲのノックインを先導するＤＮＡ修復鋳型を、ならびに内在性ＴＣＲβ鎖のノックアウトを先導するＴＲＢＣ ＲＮＰをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１２日後に１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞を回収し、そしてインキュサイトＳ３生細胞解析システム（サートリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））内でＮＹ－ＥＳＯ－１＋Ａ３７５－ＧＦＰ＋腫瘍細胞と共培養して、生存しているＧＦＰ＋腫瘍細胞を２時間毎に、合計７２時間、定量した。
【0142】
結果を図２７Ａおよび２７Ｂに表す：ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６は、マウスＴｒｂｃ２のＡストランドに由来する６つのアミノ酸残基とＦＧループ（同定された最小Ｈ５７結合エピトープ）を組み込んだヒトＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含む１Ｇ４ ＴＣＲを示し；ｈｕＴＲＢＣ２は、全長ヒトＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含む１Ｇ４ ＴＣＲを示し；ｍｕＴｒｂｃ２は、全長マウスＴｒｂｃ２定常ドメイン配列を含む１Ｇ４ ＴＣＲを示し；未エレクトロポレーションは、改変していないＴ細胞を示す。図２７Ａでは、１人の代表的な健常提供者（ＢＣ９７）由来のＴ細胞による、Ａ３７５－ＧＦＰ＋腫瘍細胞死滅の動態を示している。符号は、それぞれの時点につき３回の技術的反復を行って算出した生存腫瘍細胞数の幾何平均を；エラーバーは幾何的な標準偏差を示す。図２７Ｂは、試験した最終時点（７２時間目）における、３人の健常提供者に由来するＴ細胞の相対Ａ３７５－ＧＦＰ＋腫瘍細胞死滅のまとめである。符号は、各提供者由来のＴ細胞について３回の技術的反復を行って算出した生存腫瘍細胞数を示し；線はその幾何平均を示している。相対腫瘍細胞数を算出するために、データを、１００％に設定した未エレクトロポレーションＴ細胞の幾何平均に対して標準化した。これらのデータは併せて、ｈｕＴＲＢＣ２－Ｍｕｒ６定常ドメインを発現している１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞が、ｈｕＴＲＢＣ２またはｍｕＴｒｂｃ２定常ドメインを発現している１Ｇ４ ＴＣＲ改変Ｔ細胞と同等の標的細胞死滅を媒介できることを示ており、このことから、ヒトＴＲＢＣ２にＭｕｒ６エピトープを組み込んでもＴＣＲの機能は損なわれないことが示唆される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図26C】
【図26D】
【図27A】
【図27B】
【配列表】
【国際調査報告】