特表 2024-500005 オスミウムでタグ付けされた相補的プローブを使用するアトモルＤＮＡ／ＲＮＡオリゴ検出のためのすぐに使用可能なナノ細孔プラットフォーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-04

(54)【発明の名称】オスミウムでタグ付けされた相補的プローブを使用するアトモルＤＮＡ／ＲＮＡオリゴ検出のためのすぐに使用可能なナノ細孔プラットフォーム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20231222BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20231222BHJP

   C12Q 1/6816 20180101ALI20231222BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20231222BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12Q1/6869 Z ZNA

C12Q1/6816 Z

C12Q1/6876 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023521109

(86)(22)【出願日】2020-10-05

(85)【翻訳文提出日】2023-05-15

(86)【国際出願番号】 US2020054271

(87)【国際公開番号】W WO2022075965

(87)【国際公開日】2022-04-14

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523123145

【氏名又は名称】カナヴァリオティ アナスタシア

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】カナヴァリオティ アナスタシア

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR90

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本明細書において、生体試料中の核酸標的分子の存在を検出するための方法が提供される。ある特定の態様では、方法は、（ｉ）核酸標的分子を含む生体試料と、（ｉｉ）置換または非置換の四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）－２，２’－ビピリジン基（ＯｓＢｐ基）に共有結合された少なくとも１つのピリミジン残基を含むオスミル化一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとを含む、試験試料を接触させることを含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料中の核酸標的分子の存在を検出するための方法であって、
（ａ）（ｉ）核酸標的分子を含む生体試料と、（ｉｉ）置換または非置換の四酸化オスミウム（ＯｓＯ_４）－２，２’－ビピリジン基（ＯｓＢｐ基）に共有結合された少なくとも１つのピリミジン残基を含むオスミル化一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとを含む、試験試料を接触させる工程であって、前記プローブの配列が、ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成を可能にするために、前記核酸標的分子の配列に少なくとも部分的に相補的であり、
任意選択で、少なくとも１つのオスミル化ピリミジン残基が、チミジン残基（Ｔ）である、
前記接触させる工程、
（ｂ）前記試験試料においてハイブリダイズしていないオスミル化プローブがナノ細孔を通り抜ける事象の数を検出するために、ナノ細孔デバイスを使用する工程、ならびに
（ｃ）（ｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが前記核酸標的の不在下でナノ細孔を通り抜ける、対応するプローブ試料事象の数と比較する工程であって、プローブ試料事象の数と比べた、前記試験試料において検出された事象の数の低減が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び前記試験試料における前記核酸標的分子の存在を示す、前記比較する工程、
（ｃ）（ｉｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、いずれのオスミル化プローブも含まない対応するベースライン試料のノイズと比較する工程であって、前記ベースライン試料のノイズと比べた、前記試験試料において検出された事象の数の増加の欠如が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び前記試験試料における前記核酸分子の存在を示す、前記比較する工程、及び／または
（ｃ）（ｉｉｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが既知の量の前記核酸標的分子の存在下でナノ細孔を通り抜ける、対応する対照試料事象の数と比較する工程であって、対照試料事象の数と比べた、前記試験試料において検出された事象の数の低減が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成の増加、及び前記対照試料を超える、前記試験試料におけるより高い量の前記核酸標的分子の存在を示すか、または同じ量のプローブを使用した対照試料事象の数と比べた、前記試験試料において検出された事象の数の増加が、より多い非ハイブリダイズプローブ、したがって、前記対照試料と比較した前記試験試料におけるより低い量の前記核酸標的分子を示す、前記比較する工程
を含み、
任意選択で、
前記ナノ細孔デバイスは、前記プローブの検出のために前記プローブがタンパク質、ナノ粒子、ホモポリマー、もしくはポリペプチドにコンジュゲートされることを必要としないか、または前記プローブがタンパク質、ナノ粒子、ホモポリマー、もしくはポリペプチドにコンジュゲートされず、
及び／または
検出が、前記ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体がナノ細孔を遮断することによってもたらされる長い遮断をカウントすることによって、またはナノ細孔内のハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の融解によって達成されることがない、
前記方法。

【請求項2】

（ｃ）（ｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが核酸標的の不在下でナノ細孔を通り抜ける、対応するプローブ試料事象の数と比較する工程であって、プローブ試料事象の数と比べた、前記試験試料において検出された事象の数の低減が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び前記試験試料における前記核酸標的分子の存在を示す、前記比較する工程、及び／または
（ｃ）（ｉｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、いずれのオスミル化プローブも含まない対応するベースライン試料のノイズと比較する工程であって、前記ベースライン試料のノイズと比べた、前記試験試料において検出された事象の数の増加の欠如が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び前記試験試料における前記核酸分子の存在を示す、前記比較する工程
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｃ）（ｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが核酸標的の不在下でナノ細孔を通り抜ける、対応するプローブ試料事象の数と比較する工程
を含み、プローブ試料事象の数と比べた、前記試験試料において検出された事象の数の低減が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び前記試験試料における前記核酸標的分子の存在を示す、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

対応するプローブ試料事象の数が、前記試験試料における事象の数の検出時に、１つ以上のプローブ試料において同時に検出された事象の数であり、及び／または所与の量のプローブについての所定値であり、
任意選択で、所与の量のプローブについてのプローブ試料事象の数の前記所定値が、経験的に決定されているか、または理論的に決定されており、
さらに任意選択で、プローブ試料事象の数が検出された後、前記プローブ試料における前記オスミル化プローブを生体試料と組み合わせて試験試料を作製し、次いで、前記試験試料における事象の数を、プローブ試料事象の数に対する比較のために検出する、
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

（ｃ）（ｉｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、いずれのオスミル化プローブも含まない対応するベースライン試料のノイズと比較する工程
を含み、前記ベースライン試料のノイズと比べた、前記試験試料において検出された事象の数の増加の欠如が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び前記試験試料における前記核酸分子の存在を示す、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

対応するベースライン試料のノイズが、前記試験試料における事象の数の検出時に、１つ以上のベースライン試料において同時に決定され、及び／またはベースライン試料のある特定の組成物についての所定のノイズ値であり、
任意選択で、ベースライン試料の前記所定のノイズ値は、経験的に決定されているか、または理論的に決定されており、
さらに任意選択で、ベースライン試料のノイズが決定された後、前記オスミル化プローブが、前記試験試料を作製するために前記ベースライン試料に添加され、次いで、前記試験試料についての事象の数が、前記ベースライン試料のノイズに対する比較のために検出される、
請求項１、２、または５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

（ｃ）（ｉｉｉ）前記試験試料において検出された事象の数を、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが既知の量の前記核酸標的分子の存在下でナノ細孔を通り抜ける、対応する対照試料事象の数と比較する工程
を含み、対照試料事象の数と比べた、前記試験試料において検出された事象の数の低減が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成の増加、及び対照試料を超える、前記試験試料におけるより高い量の前記核酸標的分子の存在を示すか、または同じ量のプローブを使用した対照試料事象の数と比べた、前記試験試料において検出された事象の数の増加が、より多い非ハイブリダイズプローブ、したがって、前記対照試料と比較した前記試験試料におけるより低い量の前記核酸標的分子を示す、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

対応する対照試料事象の数が、前記試験試料における事象の数の検出時に、１つ以上の対照試料において同時に検出された事象の数であり、及び／または所与の量の核酸標的分子と混合された所与の量のプローブについての所定値であり、
任意選択で、所与の量の核酸標的分子と混合された所与の量のプローブについての対照試料事象の数の前記所定値が、経験的に決定されているか、または理論的に決定されている、
請求項１または７に記載の方法。

【請求項9】

前記試験試料における前記プローブの量が、前記試験試料における標的核酸分子の量とほぼ等しいか、またはそれ未満である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＯｓＢｐ基における２，２’－ビピリジンが置換されており、
任意選択で、前記ＯｓＢｐ基における２，２’－ビピリジンが、１つ以上のメチル基またはエチル基で置換されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

（ｉ）前記プローブがＤＮＡであり、任意選択で、前記核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つが２’－ＯＭｅ－デオキシリボースであるか、または
（ｉｉ）前記プローブがＲＮＡであり、任意選択で、前記核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つが２’－ＯＭｅ－リボースである、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記オスミル化プローブが、約１２～５０ヌクレオチドの長さを有し、
任意選択で、前記標的核酸分子の配列に少なくとも部分的に相補性である前記プローブの部分が、３ヌクレオチド以上の連続した自己相補性配列を欠く、及び／または不定形である／自己ハイブリダイズしない、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記核酸標的が、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、断片化コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡであり、任意選択で、前記非コードＲＮＡが、約３００塩基未満の長さであり、
任意選択で、
前記核酸標的分子が、一本鎖核酸分子である、及び／または
前記一本鎖オリゴヌクレオチドプローブが工程（ａ）において一本鎖標的分子にハイブリダイズすることができるように、前記方法が、一本鎖核酸鎖を形成するために前記試料における二本鎖核酸を変性させることをさらに含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

（ｉ）前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化ピリミジン残基を含み、任意選択で、前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、
（ｉｉ）前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含み、任意選択で、前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、
及び／または
（ｉｉｉ）前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端または３’末端に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）を含み、任意選択で、前記５’末端または３’末端のアデノシン残基のうちの１つ以上が前記標的核酸分子にハイブリダイズせず、任意選択で、前記５’末端及び３’末端のアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）のいずれも前記標的核酸分子にハイブリダイズしない、
請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

（ｉ）前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端または３’末端に位置する少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含み、任意選択で、前記５’末端または３’末端のピリミジン残基のうちの１つ以上が標的核酸分子にハイブリダイズせず、任意選択で、前記５’末端及び３’末端のピリミジン残基のいずれも前記標的核酸分子にハイブリダイズせず、
任意選択で、前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端または３’末端に位置する少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、任意選択で、前記５’末端または３’末端のチミジン残基（Ｔ）のうちの１つ以上が前記標的核酸分子にハイブリダイズせず、任意選択で、前記５’末端及び３’末端のチミジン残基（Ｔ）のいずれも前記標的核酸分子にハイブリダイズせず、
及び／または
（ｉｉ）前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端または３’末端のいずれかに位置しない２つ以上の隣接するオスミル化ピリミジン残基を含まず、
任意選択で、前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端または３’末端のいずれかに位置しない２つ以上の隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含まない、
請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記標的に相補的である前記オリゴヌクレオチドプローブ分子の配列内の前記ピリミジン残基の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されていない、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記オリゴヌクレオチドプローブ分子中のチミジン残基（Ｔ）の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されており、
及び／または
チミジン（Ｔ）以外の、前記プローブ中に存在するピリミジンの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されていない、
請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記プローブがＤＮＡであるが、前記５’末端または３’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、前記プローブ配列中の少なくとも１つのチミジン残基（Ｔ）が、ウリジン（Ｕ）、２’－ＯＭｅＵ（ｍＵ）、またはデオキシウリジン（ｄＵ）残基に置き換えられており、
任意選択で、前記５’末端または３’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、前記プローブ配列中のチミジン残基（Ｔ）の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ウリジン（Ｕ）、２’－ＯＭｅＵ（ｍＵ）、またはデオキシウリジン（ｄＵ）残基に置き換えられている、
請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

２，２’－ビピリジン－ＯｓＯ_４コンジュゲートプローブを形成するために、置換または非置換の２，２’－ビピリジン及びＯｓＯ_４（オスミル化試薬）を含む水溶液をオリゴヌクレオチドプローブと反応させること、及び任意選択で、前記コンジュゲートプローブを過剰のオスミル化試薬から精製することによって、前記オスミル化プローブが調製され、
任意選択で、前記溶液中の２，２’－ビピリジン／ＯｓＯ_４の比が、約０．８０／１．０、０．８５／１．０、０．９０／１．０、０．９５／１．０、０．９７／１．０、０．９８／１．０、０．９９／１．０、１．０／１．０、１．０／０．９９、１．０／０．９８、１．０／０．９７、１．０／０．９５、１．０／０．９０、１．０／０．８５、１．０／０．８０、それらの間の任意の範囲、ほぼ等モル、または等モルである、
請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記オスミル化プローブが、（ｄＴ（ＯｓＢｐ））_ｎオリゴの、前記プローブの５‘末端または３‘末端へのライゲーションによって調製され、ここで、ｎは、２、３、または４である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記ナノ細孔デバイスが、オスミル化及び非オスミル化一本鎖核酸の電圧駆動トランスロケーションは可能にするが、二本鎖核酸のトランスロケーションは防止し、任意選択で、
前記ナノ細孔デバイスが、約１．３ｎｍ～約７．１ｎｍの最小細孔径を有するナノ細孔を利用し、及び／または
前記ナノ細孔デバイスが、Ｐｈｉ２９、α溶血素、アエロリジン、ＭｓｐＡ、ＣｓＧｇ、ＰＡ６３、ＣｌｙＡ、ＦｈｕＡ、もしくはＳＰＰ１タンパク質ナノ細孔、または前記天然に存在するタンパク質ナノ細孔のいずれかの生物工学的バージョンを利用する、
請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

少なくとも－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶ、または少なくとも約－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶの電圧が、前記標的の存在を検出するために適用され、
－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶのいずれか、または約－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶのいずれかと、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶのいずれか、または約－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶのいずれかとの間の電圧が、前記標的の存在を検出するために適用され、
－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、－１６０ｍＶ、もしくは－１５０ｍＶ未満、または約－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、－１６０ｍＶ、もしくは－１５０ｍＶ未満の電圧が適用された後に、前記電圧が、前記標的の存在を検出するために適用され、及び／または
－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶのいずれか、または約－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶのいずれかと、１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶ、－１５０ｍＶのいずれか、または約１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶ、－１５０ｍＶのいずれかとの間の電圧が前記試料に適用された後に、前記電圧が、前記試料における前記標的の存在を検出するために適用される、
請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記プローブが前記ナノ細孔を介して自由にトランスロケーションされたかどうかを決定するため、時間記録によって報告される前記プローブの通過によってもたらされる事象をカウントするためにアルゴリズムを使用することを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記ナノ細孔デバイスが、異なるオスミル化プローブ間の区別、及び／または前記試験試料中の複数の異なる核酸標的の多重検出を可能にする、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記試験試料中の１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、１００ａＭ、１０ａＭ、１ａＭ、もしくは０．１ａＭ未満、または約１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、１００ａＭ、１０ａＭ、１ａＭ、もしくは０．１ａＭ未満の量の前記核酸標的を検出することができ、
前記試験試料中の少なくとも０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭ、または少なくとも約０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭの量の前記核酸標的を検出することができ、及び／または
前記試験試料中の０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、もしくは１００ｆＭのうちのいずれか、または約０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、もしくは１００ｆＭのうちのいずれかと、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭのうちのいずれか、または約１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭのうちのいずれかとの間の量の前記核酸標的を検出することができる、
請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記試験試料及び／または生体試料における前記核酸標的分子の量について定量的である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

置換または非置換の四酸化オスミウム（ＯｓＯ_４）－２，２’－ビピリジン基（ＯｓＢｐ基）に共有結合された少なくとも１つのピリミジン残基を含み、
任意選択で、少なくとも１つのオスミル化ピリミジン残基が、チミジン残基（Ｔ）である、
オスミル化一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ分子。

【請求項28】

前記ＯｓＢｐ基が置換されており、
任意選択で、前記ＯｓＢｐ基における２，２’－ビピリジンが、１つ以上のメチル基またはエチル基で置換されている、
請求項２７に記載のプローブ。

【請求項29】

（ｉ）前記プローブがＤＮＡであり、任意選択で、前記核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つが２’－ＯＭｅ－デオキシリボースであるか、または
（ｉｉ）前記プローブがＲＮＡであり、任意選択で、前記核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つが２’－ＯＭｅ－リボースである、
請求項２７または２８に記載のプローブ。

【請求項30】

前記オスミル化プローブが、約１２～５０ヌクレオチドの長さを有し、
任意選択で、前記プローブが３ヌクレオチド以上の連続した自己相補性配列を欠き、及び／または不定形である／自己ハイブリダイズしない、
請求項２７～２９のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項31】

（ｉ）前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化ピリミジン残基を含み、任意選択で、前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、
（ｉｉ）前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含み、任意選択で、前記オスミル化プローブが、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、
及び／または
（ｉｉｉ）前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端または３’末端に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）を含み、任意選択で、前記５’末端または３’末端のアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）のうちの１つ以上が前記標的核酸分子にハイブリダイズせず、任意選択で、前記５’末端及び３’末端のアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）のいずれも前記標的核酸分子にハイブリダイズしない、
請求項２７～３０のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項32】

（ｉ）前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’または３’末端に位置する少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含み、任意選択で、前記５’または３’末端のピリミジン残基のうちの１つ以上が標的核酸分子にハイブリダイズせず、
任意選択で、前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端または３’末端に位置する少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、任意選択で、前記５’末端または３’末端のチミジン残基（Ｔ）のうちの１つ以上が前記標的核酸分子にハイブリダイズせず、任意選択で、前記５’末端及び３’末端のチミジン残基（Ｔ）のいずれも前記標的核酸分子にハイブリダイズせず、
及び／または
（ｉｉ）前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端にも３’末端にも位置しない２つ以上の隣接するオスミル化ピリミジン残基を含まず、
任意選択で、前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端にも３’末端にも位置しない２つ以上の隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含まない、
請求項２７～３１のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項33】

前記５’末端での隣接するピリミジン残基でも３’末端での隣接するピリミジン残基でもない、前記オリゴヌクレオチドプローブ分子中の前記ピリミジン残基の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されていない、請求項２７～３２のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項34】

前記オリゴヌクレオチドプローブ分子中のチミジン残基（Ｔ）の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されており、
及び／または
チミジン（Ｔ）以外の、前記プローブ中に存在するピリミジンの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されていない、
請求項２７～３２のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項35】

前記プローブがＤＮＡであるが、前記５’末端または３’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、前記プローブ配列中の少なくとも１つのチミジン残基（Ｔ）が、ウリジン（Ｕ）、２’－ＯＭｅ－ウリジン（ｍＵ）、またはデオキシウリジン（ｄＵ）残基に置き換えられており、
任意選択で、前記５’末端または３’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、前記プローブ配列中のチミジン（Ｔ）残基の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ウリジン（Ｕ）、２’－ＯＭｅ－ウリジン（ｍＵ）、またはデオキシウリジン（ｄＵ）残基に置き換えられている、
請求項２７～３４のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項36】

（ｉ）前記オスミル化プローブが、前記プローブの５’末端に位置する少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、
（ｉｉ）前記プローブがＤＮＡであるが、前記５’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、前記プローブ配列中のチミジン残基（Ｔ）が、ウリジン（Ｕ）、２’－ＯＭｅ－ウリジン（ｍＵ）、またはデオキシウリジン（ｄＵ）残基に置き換えられており、任意選択で、
チミジン（Ｔ）以外の、前記プローブに存在するピリミジンの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されておらず、及び／または
前記核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つが、２’－ＯＭｅ－デオキシリボースである、
請求項２７～３５のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項37】

２，２’－ビピリジン－ＯｓＯ_４コンジュゲートプローブを形成するために置換または非置換の２，２’－ビピリジン及びＯｓＯ_４（オスミル化試薬）を含む水溶液をオリゴヌクレオチドプローブと反応させること、及び任意選択で、前記コンジュゲートプローブを過剰のオスミル化試薬から精製することによって、前記オスミル化プローブが調製され、
任意選択で、前記溶液中の２，２’－ビピリジン／ＯｓＯ_４の比が、約０．８０／１．０、０．８５／１．０、０．９０／１．０、０．９５／１．０、０．９７／１．０、０．９８／１．０、０．９９／１．０、１．０／１．０、１．０／０．９９、１．０／０．９８、１．０／０．９７、１．０／０．９５、１．０／０．９０、１．０／０．８５、１．０／０．８０、ほぼ等モル、または等モルである、
請求項２７～３６のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項38】

前記オスミル化プローブが、（ｄＴ（ＯｓＢｐ））_ｎオリゴの、前記プローブの５’末端または３’末端へのライゲーションによって調製され、ここで、ｎは、２、３、または４である、請求項２７～３６のいずれか１項に記載のプローブ。

【請求項39】

請求項２７～３８のいずれか１項に記載のプローブと、前記プローブにハイブリダイズすることができる対照核酸標的分子とを含む、キット。

【請求項40】

前記対照核酸標的が、ｃｔＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、断片化コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡの核酸配列を含み、任意選択で、前記非コードＲＮＡが、約３００塩基未満の長さである、請求項３９に記載のキット。

【請求項41】

ナノ細孔デバイスを用いた核酸標的分子の検出のための、請求項２７～３８のいずれか１項に記載のプローブの使用であって、前記核酸標的分子が、任意選択で、ｃｔＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または非コードＲＮＡであり、任意選択で、前記非コードＲＮＡが、約３００塩基未満の長さである、前記使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

電子的に提出された配列表への参照
本出願とともに提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：６８８１２＿１９９７３８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：６７５５バイト、作成日：２０２０年１０月２日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府が支援する研究開発に関する声明
本発明は、ＮＩＨ／ＮＨＧＲＩ、ＳＢＩＲプログラムにより授与された助成金＃Ｒ４３ＨＧ０１０８４１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

背景
液体生検として知られる採血または他の体液試料（Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ，Ａ．Ｊ．，Ｕｎｇｅｒｅｒ，Ｖ．，＆Ｈｏｌｄｅｎｒｉｅｄｅｒ，Ｓ．（２０１９）、Ｖｉｄａｌ，Ｊ．，Ｔａｕｓ，Ａ．，＆Ｍｏｎｔａｇｕｔ，Ｃ．（２０２０）、Ｐｏｓ，Ｏ．，Ｂｉｒｏ，Ｏ．，Ｓｚｅｍｅｓ，Ｔ．，＆Ｎａｇｙ，Ｂ．（２０１８）、Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｕｔｚ，Ｅ．，Ｂｅｃｋ，Ｊ．，＆Ｗａｌｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．（２０１９）、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｍ．，＆Ｔｓｕｉ，Ｄ．（２０１８）、Ｇｉａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｌ．，Ｋａｓｉｍｉｒ－Ｂａｕｅｒ，Ｓ．，＆Ｌｉａｎｉｄｏｕ，Ｅ．Ｓ．（２０１８）、Ｓａｔｙａｌ，Ｕ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ａ．，＆Ａｂｂｏｓｈ，Ｐ．Ｈ．（２０１９）、Ｆｉｎｏｔｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）、Ｖａｌｐｉｏｎｅ，Ｓ．，＆Ｃａｍｐａｎａ，Ｌ．（２０１９）、及びＫｗａｐｉｓｚ Ｄ．（２０１７））は、個体の健康状態、疾患の進行、個体が手術後に疾患がないかどうか、さらにはある特定の療法の戦略が有望と思われるかどうかに関する適切な情報を含む（Ｖｉｄａｌ，Ｊ．，Ｔａｕｓ，Ａ．，＆Ｍｏｎｔａｇｕｔ，Ｃ．（２０２０））。液体生検は、外科的／腫瘍生検よりも手順の侵襲性がはるかに低い。体液には無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が含まれており、その分画は腫瘍（循環腫瘍ＤＮＡ；ｃｔＤＮＡ）に由来し得る。２０１６年、ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎは、治療選択を可能にするためのコンパニオン診断試験として、非小細胞肺癌の患者におけるＥＧＦＲ活性化変異についての最初の液体生検試験を承認した（Ｋｗａｐｉｓｚ Ｄ．（２０１７））。無細胞ＤＮＡは、健康な個体と比較して、罹患個体では断片化して短いと考えられている（Ｐｏｓ，Ｏ．，Ｂｉｒｏ，Ｏ．，Ｓｚｅｍｅｓ，Ｔ．，＆Ｎａｇｙ，Ｂ．（２０１８））。ＤＮＡに加えて、体液は、２０～３００ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲の転移ＲＮＡ由来断片及び非コードＲＮＡオリゴを含む（Ｋｉｍ ＨＫ，Ｙｅｏｍ ＪＨ，Ｋａｙ ＭＡ．（２０２０）、Ｐｏｌｌｅｒ Ｗ，ｅｔ．ａｌ．（２０１８）、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｖ．，Ｐｒｉｙａｎｋａ，Ｋ．，＆Ｔｕｌｉ，Ｈ．Ｓ．（２０２０）、Ｍｅｓｅｕｒｅ，Ｄ．，Ｄｒａｋ Ａｌｓｉｂａｉ，Ｋ．，Ｎｉｃｏｌａｓ，Ａ．，Ｂｉｅｃｈｅ，Ｉ．＆Ｍｏｒｉｌｌｏｎ，（２０１５））。その中には、マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして知られている、１７～２５ｎｔの長さの一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡの群がある。それらは、２０年前に発見され、タンパク質の転写後発現を制御する小さい調節因子であることが証明された（Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．（２００１）、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００４））。ｍｉＲＮＡは、体液において高度に保存され、驚くほど安定している（（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ｍａｌｌ，Ｃ．，Ｒｏｃｋｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｄｕｒｂｉｎ－Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．，＆Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ｈ．（２０１３））。現在、２，３００を超えるヒトｍｉＲＮＡが知られており（Ａｌｌｅｓ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１９））、１００，０００を超える科学出版物の主題である。ｍｉＲＮＡの上方調節または下方調節は、がん、心疾患、腎疾患、肥満、糖尿病などを含む様々なヒト疾患と関連している（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００４））。ｍｉＲＮＡは、個別化医療におけるバイオマーカー（Ｆａｒａｚｉ，Ｔ．Ａ．，Ｈｏｅｌｌ，Ｊ．Ｉ．，Ｍｏｒｏｚｏｖ，Ｐ．，＆Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２０１３）、Ｐｏｇｒｉｂｎｙ，Ｉ．Ｐ．（２０１７））、及び潜在的な治療薬（Ｒｕｐａｉｍｏｏｌｅ，Ｒ．＆Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．（２０１７））として提案されている。体液は、微量のｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、断片化コードＲＮＡ（Ｋｉｍ ＨＫ，Ｙｅｏｍ ＪＨ，Ｋａｙ ＭＡ．（２０２０））、非コードＲＮＡ（Ｐｏｌｌｅｒ Ｗ，ｅｔ．ａｌ．（２０１８））、及びｍｉＲＮＡを含み、これらは、検査のための簡便で検証された高感度のアッセイを必要とする（Ｆｉｎｏｔｔｉ，（２０１８）、Ｖａｌｐｉｏｎｅ，Ｓ．，＆Ｃａｍｐａｎａ，Ｌ．（２０１９）、Ｒａａｂｅ，Ｃ．，Ｔａｎｇ Ｔ．，Ｂｒｏｓｉｕｓ Ｊ．，＆Ｒｏｚｈｄｅｓｔｖｅｎｓｋｙ，Ｔ．（２０１４））。「低分子ＲＮＡ」の特定及び定量化のための現在の技術には、マイクロアレイ、ＮＧＳ配列決定（Ｉｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔまたはＩｌｌｕｍｉｎａ（低分子ＲＮＡ－ｓｅｑ））、及びこれまでに大きな成功を収めて用いられてきたｑＲＴ－ＰＣＲベースの方法が含まれる（Ｆｅｒｒａｃｉｎ，Ｍ．，＆Ｎｅｇｒｉｎｉ，Ｍ．（２０１８）、Ｖａｌｉｈｒａｃｈ，Ｌ．，Ａｎｄｒｏｖｉｃ，Ｐ．，＆Ｋｕｂｉｓｔａ，Ｍ．（２０２０）、Ｇｉｎｅｓ，Ｇ．，Ｍｅｎｅｚｅｓ，Ｒ．，Ｘｉａｏ，Ｗ．，Ｒｏｎｄｅｌｅｚ，Ｙ．，Ｔａｌｙ，Ｖ．（２０２０））。しかしながら、これらの技術は、実質的な基礎構造及び熟練した人材を必要とし、ポイントオブケア検査には適しておらず、家庭での検査には問題外である。

【0004】

過去３０年間、固体またはタンパク質ナノ細孔のいずれかを使用したナノ細孔ベースの技術が急増している（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｒａｎｄｉｎ，Ｅ．，Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｄ．＆Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．（１９９６）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｔ．Ｚ．，Ｇｕｎｄｌａｃｈ，Ｊ．Ｈ．＆Ｔｒｏｌｌ，Ｍ．（２００７）、Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｈｅｒｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｄ．，Ｊａｐｒｕｎｇ，Ｄ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．（２０１０）、Ｈａｑｕｅ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．，Ｌｉａｎｇ，Ｘ．Ｊ．＆Ｇｕｏ，Ｐ．Ｓ（２０１３）、Ｆｕｌｌｅｒ Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｌａｓｚｌｏ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓウェブサイト：ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ下）。２０１４年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）は、コンピュータ及びインターネットが利用可能である限り、ＤＮＡ及びＲＮＡを事実上どこでも配列決定する最初のポータブルナノ細孔デバイスを導入し、商業化した（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｗｅｂｓｉｔｅ：ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ下）。ＯＮＴ技術は、２つの電解質充填区画を分離する平面脂質二重層膜に挿入された、サブ２ｎｍの直径を有するＣｓＧｇタンパク質ナノ細孔（Ｃａｏ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１４））に基づく（図１Ａ）。２つの区画にわたって電圧を適用すると、時間の関数（ｉ－ｔ）として記録される、細孔を介した電解質イオン（Ｉ_ｏ）の一定の流れにつながる。細孔を通る単一の分子の通過は、Ｉ_ｏをより低いレベルの残留イオン電流（Ｉ_ｒ）に低減する。これは、（Ｉ_ｒ）及び滞留時間（τ）を有する「事象」として記録される（図１Ｂ）。現在、ＯＮＴプラットフォームは、独占的にＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定に使用されている（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓウェブサイト：ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ下）が、同等のナノ細孔プラットフォームが、単一分子分析に首尾よく用いられている（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，＆Ｌｏｕ，Ｊ．（２０２０）、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．，Ｊａｎｇｒａ，Ｓ．＆Ｙａｄａｖ，Ｎ．Ｒ．（２０１８）、Ｗａｎｕｎｕ Ｍ，Ｄａｄｏｓｈ Ｔ，Ｒａｙ Ｖ，Ｊｉｎ Ｊ，ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｌ，Ｄｒｎｄｉｃ Ｍ．（２０１０）、Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．＆Ｗａｎｇ Ｙ．（２０１３）、Ａｒａｔａ，Ｈ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｋ．，＆Ｍａｅｄａ，Ｍ．（２０１４）、Ｈｅｎｌｅｙ，Ｒ．Ｙ．，Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｐａｇａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．＆Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．（２０１５）、Ｘｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｚａｈｉｄ，Ｏ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｒｕｚｉｃｋａ，Ｊ．Ａ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｗ．＆Ｈａｌｌ，Ａ．Ｒ．（２０１６）、Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６）、Ｔｉａｎ，Ｋ．，Ｓｈｉ，Ｒ．，Ｇｕ，Ａ．，Ｐｅｎｎｅｌｌａ，Ｍ．，＆Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．（２０１７）、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｒａｎａ，Ａ．，Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｙ．，Ｃｚｙｚｙｋ－Ｋｒｚｅｓｋａ，Ｍ．Ｆ．，＆Ｅｓｆａｎｄｉａｒｉ，Ｌ．（２０１７）、Ｈｕａｎｇ，Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｋ．，Ｓｏｓｋｉｎｅ，Ｍ．，Ｗｌｏｋａ，Ｃ．＆Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．（２０１７）、Ｇａｌｅｎｋａｍｐ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｏｓｋｉｎｅ，Ｍ．，Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．，Ｗｌｏｋａ，Ｃ．＆Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．（２０１８）、Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９）、Ｃａｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）、Ｈａｏ，Ｗ．，Ｈａｏｒａｎ Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ Ｙ．，＆Ｙｏｎｇｘｉｎ，Ｌ．（２０１９））。

【0005】

ＯＮＴは、２種類のフローセルを担持するポータブルナノ細孔デバイスを提供しており、５１２のチャンネルを有するＭｉｎＩＯＮ及び１２６チャンネルを有するＦｌｏｎｇｌｅはすべて同時に監視される（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓウェブサイト：ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓの下）。ＯＮＴは、２００ヌクレオチド（ｎｔ）の最小長を有するＤＮＡ及びＲＮＡの直接配列決定のためにこれらのデバイスを宣伝している（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓウェブサイト：ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓの下）。しかしながら、今日まで、ＯＮＴプロトコルに従って２００ｎｔより短いＲＮＡを配列決定する試みは、１００ｎｔ反復を有する長いＤＮＡを産生するための環状化及びローリングサークル増幅がなく（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆Ｓｏｈ，Ｈ．Ｔ．（２０１９））、不成功と思われる（Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１９））。生体流体で利用可能なＤＮＡ／ＲＮＡの大部分は、２００ｂｐの範囲で推定される長さで断片化され（Ｐｏｓ，Ｏ．，Ｂｉｒｏ，Ｏ．，Ｓｚｅｍｅｓ，Ｔ．，＆Ｎａｇｙ，Ｂ．（２０１８））、ｍｉＲＮＡは非常に短く（Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．（２００１））、したがって、直接ＯＮＴ配列決定プロトコルに適していない。いくつかの他の実験的ナノ細孔プラットフォームが、ｍｉＲＮＡプロファイリングに首尾よく使用されているが、それらは、商業的利用に適していることが示されていない。したがって、アクセス可能で、すぐに使用可能な、比較的安価で、特別なスキル及び基礎構造を必要としない技術の必要性が残存する。

【発明の概要】

【0006】

概要
本明細書において、生体試料中の核酸標的分子の存在を検出するための方法が提供される。ある特定の態様では、方法は、（ａ）（ｉ）核酸標的分子を含む生体試料と、（ｉｉ）置換または非置換の四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）－２，２’－ビピリジン基（ＯｓＢｐ基）に共有結合された少なくとも１つのピリミジン残基を含むオスミル化一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとを含む、試験試料を接触させる工程であって、プローブの配列が、ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成を可能にするために、核酸標的分子の配列に少なくとも部分的に相補的である、接触させる工程、（ｂ）試験試料においてハイブリダイズしていないオスミル化プローブがナノ細孔を通り抜ける事象の数を検出するためにナノ細孔デバイスを使用する工程、ならびに（ｃ）（ｉ）試験試料において検出された事象の数を、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが核酸標的の不在下でナノ細孔を通り抜ける、対応するプローブ試料事象の数と比較する工程であって、プローブ試料事象の数と比べた、試験試料において検出された事象の数の低減が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び試験試料における核酸標的分子の存在を示す、比較する工程、（ｃ）（ｉｉ）試験試料において検出された事象の数を、いずれのオスミル化プローブも含まない対応するベースライン試料のノイズと比較する工程であって、ベースライン試料のノイズと比べた、試験試料において検出された事象の数の増加の欠如が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び試験試料における核酸分子の存在を示す、比較する工程、及び／または（ｃ）（ｉｉｉ）試験試料において検出された事象の数を、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが既知の量の核酸標的分子の存在下でナノ細孔を通り抜ける、対応する対照試料事象の数と比較する工程であって、対照試料事象の数と比べた、試験試料において検出された事象の数の低減が、工程（ａ）におけるハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成の増加、及び対照試料を超える、試験試料におけるより高い量の核酸標的分子の存在を示すか、または同じ量のプローブを使用した対照試料事象の数と比べた、試験試料において検出された事象の数の増加が、より多い非ハイブリダイズプローブ、したがって、対照試料と比較した試験試料におけるより低い量の核酸標的分子を示す、比較する工程、を含む。ある特定の態様では、少なくとも１つのオスミル化ピリミジンは、チミン残基（Ｔ）である。

【0007】

さらに、ある特定の態様は、本開示のオスミル化プローブと、プローブにハイブリダイズすることができる対照核酸標的分子と、を含むキット、及びナノ細孔デバイスを用いた核酸標的分子の検出のためのそのようなプローブの使用を提供し、核酸標的分子は、任意選択で、ｃｔＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または非コードＲＮＡであり、任意選択で、非コードＲＮＡは、約３００塩基未満の長さである。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】２つの電解質充填区画を分離する平面二重層脂質膜内のナノ細孔の概略図。フローセルに一定の電圧を適用することにより、ナノ細孔を通るイオンの通過が誘導され、測定可能なイオン電流が生成される。

【図1B】細孔を介した電解質イオン（Ｉ_ｏ）の一定の流れが分子の通過によって中断される電圧駆動イオンチャネル実験から得られたｉ－ｔトレース。これらの分子は、残留イオン電流Ｉ_ｒ及び滞留時間τを有する「事象」として現れる。

【図1C】ＯｓＢｐ標識反応：ＯｓＯ_４及び２，２－ビピリジン（ｂｉｐｙ）は、低い会合定数を有するが、それらの混合物は、ピリミジンのＣ５－Ｃ６二重結合に付加され、安定したコンジュゲートを形成する。ＯｓＢｐの付加は、天然核酸が吸収しない３１２ｎｍの範囲で吸収する発色団を生成する（実施例を参照）。

【図1D】提案された診断試験の背後にある概念の図解。ｓｓＤＮＡ及びｓｓＲＮＡは、ナノ細孔を通り抜け、それらはデバイスの比較的遅い取得速度と比較してより速く通り抜けるため、少ないカウントしか示さない。ｄｓ核酸は大きすぎ、このナノ細孔を通り抜けない。ｓｓ天然核酸よりもかさばっているにもかかわらず、オスミル化ｓｓ核酸は細孔を通過するが、デバイスの取得速度と比較してより遅く、結果的に多数の事象を生成する。相補的核酸（標的）を含む試料にオスミル化核酸（プローブ）を添加すると、プローブ及び標的がハイブリッドを形成する。標的の濃度がプローブの濃度と等しいかまたはそれよりも高い場合、プローブはハイブリダイズされる。次いで、プローブは細孔を通り抜けることを防止され、ほとんどまたは全く事象が観察されない。試料中に標的が存在しないことは、プローブが細孔を自由に通り抜けている間にプローブによって生成される多数の事象によって証明される。

【図2A】Ｆｌｏｎｇｌｅ ＯＮＴデバイスを用いて行われた電圧駆動イオンチャネル（ナノ細孔）実験；＞９０％ＯＮＴ緩衝液中の試料。同じＦｌｏｎｇｌｅフローセルを使用して－２００ｍＶで１時間：（ｉ）５μＭのプローブＴ８（ＲＮＡ）、及び（ｉｉ）各々５μＭのＴ８（ＲＮＡ）及びｄ（ＣＴ）_１０の混合物。これらの２つの分子は、互いに部分的にのみ相補的であることは注目に値する。事象のカウント（複数可）は、ＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔソフトウェアを使用して取得し、ＭＩＮＫＮＯＷで取得した生のｆａｓｔ－５ファイルデータを分析し報告した（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．，＆Ｋａｎｇ，Ａ．公共リポジトリ：ワールドワイドウェブのｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔのＲＮＡ（ＯｓＢｐ）事象検出Ｐｙｔｈｏｎパッケージを参照、段階を追ったインストール手順については、ワールドワイドウェブのｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ．ｍｄを参照。実施例を参照）。カウントは、０．０５のビンサイズでＩ_ｒ／Ｉ_ｏの関数としてプロットされた。（Ａ）下に記載されるデータの取得及び分析。

【図2B】Ｆｌｏｎｇｌｅ ＯＮＴデバイスを用いて行われた電圧駆動イオンチャネル（ナノ細孔）実験；＞９０％ＯＮＴ緩衝液中の試料。同じＦｌｏｎｇｌｅフローセルを使用して－１９０ｍＶで２時間：（ｉ）５μＭのプローブｄｍｉＲ１２２、（ｉｉ）各々５μＭのｄｍｉＲ１２２及びｍｉＲＮＡ１２２の混合物、及び（ｉｉｉ）－１８０ｍＶで１時間、異なるＦｌｏｎｇｌｅフローセルを使用して、各々１０μＭのｍｉＲＮＡ１２２及びｍｉＲＮＡ１４０の混合物。ｄｍｉＲ１２２が４つのＯｓＢｐ部分を担持し、その配列がｍｉＲＮＡ１２２に完全に相補的であることは注目に値する。

【図3A】オスミル化プローブと標的との間のハイブリダイゼーションを試験するための代替アプローチ。ｓｓＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを鋳型として、及びＤＮＡポリメラーゼを使用したオスミル化プライマーの酵素的伸長；時点は５分、１０分、及び２０分で得られた。プライマー及びＭ１３ｒｅｖ（－４８）は陰性対照として使用しなかった。ＢＪ１を除いて、他のすべてのオスミル化プライマーが、陽性対照Ｍ１３ｆｗｄ（６０９７）と同等の酵素的伸長を示す。ＢＪ１による伸長の不在は、３’末端にＴ（ＯｓＢｐ）が存在することに起因する。

【図3B】オスミル化プローブと標的との間のハイブリダイゼーションを試験するための代替アプローチ。異なる試料の分析からの重複ＨＰＬＣプロファイル、試料は約９０％ＯＮＴ緩衝液中約５μＭである。すべての試料に同じＨＰＬＣ方法Ｂを使用した（実施例を参照）。インタクトなｓｓオリゴ及びｄｓオリゴは、鋭いピークとして現れるが、オスミル化オリゴ及び１本のオスミル化鎖を有するハイブリッドは、広いピークとして現れる。ハイブリッドは、ｓｓ核酸と比較して後に溶出する。試料組成：インタクトなＢＪ２、プライマーＭ１３ｆｏｒ（－４１）のインタクトな補体。それらの等モル混合物のＨＰＬＣプロファイルは、ハイブリダイゼーションと一致する。

【図3C】オスミル化プローブと標的との間のハイブリダイゼーションを試験するための代替アプローチ。異なる試料の分析からの重複ＨＰＬＣプロファイル、試料は約９０％ＯＮＴ緩衝液中約５μＭである。すべての試料に同じＨＰＬＣ方法Ｂを使用した（実施例を参照）。インタクトなｓｓオリゴ及びｄｓオリゴは、鋭いピークとして現れるが、オスミル化オリゴ及び１本のオスミル化鎖を有するハイブリッドは、広いピークとして現れる。ハイブリッドは、ｓｓ核酸と比較して後に溶出する。試料組成：ｍｉＲＮＡ２１、８ｄＴ（ＯｓＢｐ）部分を担持するプローブ２１ＥＸＴ、及び２つの等モル混合物。ＮＯハイブリダイゼーションと一致する混合物のＨＰＬＣプロファイルは、プローブのらせん構造を歪め、ｄｓ形成を防止する可能性が高い２２ｎｔの配列内の６つの多数の単一ＯｓＢｐタグに起因する。

【図3D】オスミル化プローブと標的との間のハイブリダイゼーションを試験するための代替アプローチ。異なる試料の分析からの重複ＨＰＬＣプロファイル、試料は約９０％ＯＮＴ緩衝液中約５μＭである。すべての試料に同じＨＰＬＣ方法Ｂを使用した（実施例を参照）。インタクトなｓｓオリゴ及びｄｓオリゴは、鋭いピークとして現れるが、オスミル化オリゴ及び１本のオスミル化鎖を有するハイブリッドは、広いピークとして現れる。ハイブリッドは、ｓｓ核酸と比較して後に溶出する。試料組成は、これらの試料において、ＢＪ２が６つのｄＴ（ＯｓＢｐ）部分（３１２ｎｍで広い形状及び吸光度を有する第１のピーク）を担持することを除いて、（Ｂ）下のものと実質的に同じである。混合物のＨＰＬＣプロファイルは、ＯｓＢｐ部分の大部分が隣接しているという事実に起因して、ハイブリダイゼーションと一致しているため、配列の残りの部分は依然として標的とハイブリダイズすることができる。

【図4A】ＨＰＬＣ及びナノ細孔によって試験された同じ試料；＞９０％ＯＮＴ緩衝液中の試料。ＯＮＴ緩衝液中約０．２ｎｍｏｌｅの試料の重複ＨＰＬＣプロファイル、（ｉ）プローブＢＪ１、（ｉｉ）標的は、ここではるかに高い負荷で示される、（ｉｉｉ）約０．２ｎｍｏｌｅのプローブ及びプローブに対して約３０％過剰の標的の混合物（ハイブリッド）。混合物のＨＰＬＣプロファイルは、ハイブリダイゼーションと一致する。

【図4B】ＨＰＬＣ及びナノ細孔によって試験された同じ試料；＞９０％ＯＮＴ緩衝液中の試料。（Ｂ）及び（Ｄ）それぞれ、（Ａ）及び（Ｃ）と同じ試料を使用して、ＭｉｎＩＯＮフローセルを用いて１時間にわたるナノ細孔実験を行った。（Ｂ）の試料をそのまま使用し、（Ｄ）の試料は、ＯＮＴ緩衝液において１０００倍または１００倍希釈した後に使用した。（Ｂ）プローブＢＪ１を－１８０ｍＶ（破線トレース）で試験し、少ないカウントしか示さなかった。試料を添加せず、電圧を－２２０ｍＶに上げ、－２２０ｍＶ（固体トレース）で追加のナノ細孔実験を実施し、カウントは１００，０００を超えた。ＢＪ１で得られたカウントとは対照的に、ハイブリッド試料は、著しく少ないカウントしか示さなかった（固体トレース（すべてｘ軸に近い）は、－１９０ｍＶで１時間試験した）。プローブ試料と比較してハイブリッド試料でのより低いカウントの観察は、ＨＰＬＣ結果と一致して、（Ｂ）及び（Ｄ）のいずれかの標的の特定を示唆する。０．３８ｐｍｏｌｅ負荷でのＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）プローブを用いたナノ細孔実験は、サブｐｍｏｌｅレベルでのプローブ検出可能性を示唆する。

【図4C】ＨＰＬＣ及びナノ細孔によって試験された同じ試料；＞９０％ＯＮＴ緩衝液中の試料。約０．２ｎｍｏｌｅの負荷のプローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）、及び（ｉｉ）相補的標的、相補的プライマーＭ１３ｆｏｒ（－４１）とのその約等モル混合物の重複ＨＰＬＣプロファイル。標的は、プローブに対して５％過剰で、小さなピークとして特定された。混合物（ハイブリッド）のＨＰＬＣプロファイルは、ｄｓ形成と一致する。これら２つの試料のＨＰＬＣプロファイルは、２７２及び３１２ｎｍの両方で示される（実施例を参照）。

【図4D】ＨＰＬＣ及びナノ細孔によって試験された同じ試料；＞９０％ＯＮＴ緩衝液中の試料。（Ｂ）及び（Ｄ）それぞれ、（Ａ）及び（Ｃ）と同じ試料を使用して、ＭｉｎＩＯＮフローセルを用いて１時間にわたるナノ細孔実験を行った。（Ｂ）の試料をそのまま使用し、（Ｄ）の試料は、ＯＮＴ緩衝液において１０００倍または１００倍希釈した後に使用した。（Ｄ）同じフローセルを使用したナノ細孔実験：（ｉ）対照／緩衝液試験（－１８０ｍＶで０．７５時間試験）、（ｉｉ）０．３８ｐｍｏｌｅ負荷でプローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）（２時間－２１０ｍＶで試験）、（ｉｉｉ）３．８ｐｍｏｌｅ負荷でプローブと標的との等モル混合物（１時間－２１０ｍＶで試験）。プローブ試料と比較してハイブリッド試料でのより低いカウントの観察は、ＨＰＬＣ結果と一致して、（Ｂ）及び（Ｄ）のいずれかの標的の特定を示唆する。０．３８ｐｍｏｌｅ負荷でのＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）プローブを用いたナノ細孔実験は、サブｐｍｏｌｅレベルでのプローブ検出可能性を示唆する。（ｄ）のハイブリッド試料を用いた実験は、ハイブリッドが持続時間及び適用電圧の実験条件下で持続することを示す。図２Ａ下に記載されるデータ取得及び分析。

【図5A】１５％ヒト血清－８５％ＯＮＴ緩衝液における改良されたプローブ設計及びプローブ検出を試験するナノ細孔実験。同じフローセルで行われた３つの連続したナノ細孔実験。（ｉ）緩衝液試験、－１８０ｍＶで０．７５時間、（ｉｉ）プローブ２ＸｄｍｉＲ１２２は－１８０ｍＶで１．５時間試験した（破線）、及び（ｉｉｉ）試料を添加せず、電圧を－２２０ｍＶに上げ、１．５時間実験を行った。この一連の実験は、少なくともこのプローブが１．５時間にわたる実験中でも－１８０ｍＶでＯＮＴナノ細孔を通過していないという確かな証拠を提供した。加えて、このプローブは、－２２０ｍＶの適用電圧下で細孔を通り抜け、検出可能な事象のカウントが高いことを図示する。

【図5B】１５％ヒト血清－８５％ＯＮＴ緩衝液における改良されたプローブ設計及びプローブ検出を試験するナノ細孔実験。約半分、すなわち、２５０の作業ナノ細孔のみを担持する、同じであるが以前に使用されたフローセルを用いて４つの連続したナノ細孔実験を行った。（ｉ）－１８０ｍＶでの緩衝液試験、（ｉｉ）５μＭ（０．３８ｎｍｏｌｅに対応する）の通常の負荷と比較して、３倍少ない負荷のプローブ１２２ＥＸＴを－１８０ｍＶで試験した（破線）、（ｉｉｉ）試料を添加せず、電圧を－２２０ｍＶに上げる、及び（ｉｖ）（ｉｉ）と同じ負荷のプローブ１２２ＥＸＴを有するが、１５％ヒト血清－８５％ＯＮＴ緩衝液で調製した新しい試料。

【図5C】１５％ヒト血清－８５％ＯＮＴ緩衝液における改良されたプローブ設計及びプローブ検出を試験するナノ細孔実験。（ｉ）インタクトなｍｉＲＮＡ１２２、（ｉｉ）０．５μＭ（典型的な５μＭの試料濃度と比較して１０倍低い濃度）のプローブ２ＸｄｍｉＲ１２２、及び（ｉｉｉ）プローブ対標的＝１：２（またプローブ中０．５μＭの濃度）の混合物（ハイブリッド）のＨＰＬＣプロファイル。ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して、＞９０％のＯＮＴ緩衝液中の３つすべての試料を２６０ｎｍで監視した（実施例を参照）。図５Ｄに示されるナノ細孔実験のために、後者の２つの試料をそのまま使用した。

【図5D】１５％ヒト血清－８５％ＯＮＴ緩衝液における改良されたプローブ設計及びプローブ検出を試験するナノ細孔実験。同じフローセル上での連続したナノ細孔実験。（ｉ）緩衝液試験、－２２０ｍＶで１時間、（ｉｉ）プローブ２ＸｄｍｉＲ１２２、－２２０ｍＶで３時間、及び（ｉｉｉ）プローブに対して過剰のｍｉＲＮＡ１２２とのハイブリッド試料を－２２０ｍＶで１時間試験した。この実験は、３時間にわたる実験を介してではあるが、２ＸｄｍｉＲ１２２の検出における感度を確認し、標的とのハイブリダイゼーションが、非常に低減したカウント、すなわち、サイレンシングをもたらすことを確認する。図２Ａ下に記載されるナノ細孔実験についてのデータ取得及び分析。

【図6A】複合混合物中のｍｉＲＮＡ２１の標的化。ＨＰＬＣ方法Ｂで分析した２つの試料のＨＰＬＣプロファイル（実施例を参照）：（ｉ）０．１５ｎｍｏｌｅ負荷でのプローブｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）、及び（ｉｉ）０．３０ｎｍｏｌｅのプローブ負荷でのこのプローブとｍｉＲＮＡ２１との１：２の混合物。プローブのＨＰＬＣプロファイルは２つのピークを示し、より大きいピークは小さいピークの後に溶出する。このプロファイルは、平均して１分子当たり２．８５ＯｓＢｐ部分の決定された値と一致する、つまり、この調製物は、２つのＯｓＢｐタグを有する分子、及び３つのＯｓＢｐタグを有する分子を含む。プローブ対標的が１：２の混合物のＨＰＬＣプロファイルは、幅広くむしろ複雑なピークの後に溶出する単一のむしろ鋭いピークを示す。鋭いピークが過剰なｍｉＲＮＡ２１標的に対応することが確認された。我々は、幅広い複雑なピークを、すべて標的に相補的であるが、それらのそれぞれが異なる核酸塩基でＯｓＢｐ部分を担持する、１つの標的及び多くのプローブの結果である複数のハイブリッドであると考える。クロマトグラフィーは、そのような短いオスミル化オリゴでトポ異性体を分解するため、これらのハイブリッドを分解すると仮定するのは妥当である（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））（実施例ではＨＰＬＣ方法Ｂ）。プローブと混合物試料との間の異なるＨＰＬＣプロファイルの観察は、ハイブリダイゼーションと一致する。

【図6B】複合混合物中のｍｉＲＮＡ２１の標的化。４つのナノ細孔ＭｉｎＩＯＮは、（Ａ）でＨＰＬＣにより分析した正確な試料を使用して、それらのうちの２つを実験する。（ｉ）プローブｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）は、－１８０ｍＶで２時間試験し、１００，０００を超える事象を示した、（ｉｉ）このプローブとｍｉＲＮＡ２１との１：２の混合物は、－１８０ｍＶで１時間試験し、無視できるカウントを示した（ハイブリッド）。２つの追加の実験は、プローブｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）及びｍｉＲＮＡ２１とのそのハイブリッドのトランスロケーション特性における過剰な非標的ＲＮＡの影響を試験した。過剰な非標的ＲＮＡは、プローブと比較して１０倍高い負荷であり、等モル量のｍｉＲＮＡ１４０及び１００ｎｔの長さのＲＮＡから構成された。過剰な非標的ＲＮＡの存在下でのナノ細孔実験、（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ２１とのハイブリッド（１時間、－１８０ｍＶ）、及び（ｉｖ）プローブｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）（２時間、－２００ｍＶ）。ＯＮＴプロトコルに従って、このフローセルがすでに動作していた時間を相殺するために、ここではより高い電圧を使用した。存在する場合、ハイブリッドに対する過剰な非標的ＲＮＡの影響は、カウントが少なすぎるため、検出できない。プローブに対する過剰な非標的ＲＮＡの影響は、プロファイルシフトであり、２倍低減したカウントであるように思われるが、この低減は、同様に約２倍低減した作業ナノ細孔の数に起因し得る。プローブｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）は、いずれの隣接するオスミル化ｄＴを含まないため、－１８０ｍＶの適用電圧で効率的にトランスロケーションすることに留意した。図２Ａ下に記載されるデータ取得及び分析。

【図7A】一桁のアトモル負荷でｍｉＲＮＡ１４０またはｍｉＲＮＡ２１を標的とするナノ細孔実験。同じフローセルで行われた連続したナノ細孔実験：（ｉ）緩衝液試験、－２１０ｍＶで１時間、（ｉｉ）４７ｆｍｏｌｅの負荷のプローブ１４０ＥＸＴ（ｍＵ）、－２１０ｍＶで１．５ｈ。

【図7B】一桁のアトモル負荷でｍｉＲＮＡ１４０またはｍｉＲＮＡ２１を標的とするナノ細孔実験。連続するナノ細孔実験は、２００未満の作業ナノ細孔を有する同じ使用されたフローセルで行われた：（ｉ）緩衝液試験、－２１０ｍＶで１時間、（ｉｉ）３．５ａｍｏｌｅ負荷のプローブ１４０ＥＸＴ（ｍＵ）、－２１０ｍＶで１．５時間、及び（ｉｉｉ）それぞれ３．５ａｍｏｌｅ負荷の１４０ＥＸＴ（ｍＵ）及びｍｉＲＮＡ１４０の等モル混合物（ハイブリッド）、－２１０ｍＶで１．５時間。

【図7C】一桁のアトモル負荷でｍｉＲＮＡ１４０またはｍｉＲＮＡ２１を標的とするナノ細孔実験。ＨＰＬＣ方法Ｂ（実施例）を使用した、プローブ２１ＥＸＴ（ｍＵ）及び標的ｍｉＲＮＡ２１の等モル濃度を有する試料のＨＰＬＣプロファイル。単一ピークの出現は、ハイブリダイゼーションと一致する。２つの異なる波長で監視された試料は、オスミル化プローブの存在に起因する３１２ｎｍでの吸光度を示す。

【図7D】一桁のアトモル負荷でｍｉＲＮＡ１４０またはｍｉＲＮＡ２１を標的とするナノ細孔実験。同じフローセルを用いた連続したナノ細孔実験；試料を、最初にＨＰＬＣにより試験し、次いで、プローブ及びハイブリッドについて、それぞれ１０^９または３×１０^８倍のＯＮＴ緩衝液で希釈した（実施例を参照）。（ｉ）緩衝液試験、（ｉｉ）０．９ａｍｏｌｅのプローブ２１ＥＸＴ（ｍＵ）、及び（ｉｉｉ）それぞれ２．８ａｍｏｌｅ負荷のプローブ２１ＥＸＴ（ｍＵ）とｍｉＲＮＡ２１との１：１の混合物（ハイブリッド）。ハイブリッドは、プローブと比較して劇的に少ないカウントを示す。図２Ａ下に記載されるナノ細孔実験についてのデータ取得及び分析。

【図8-1】ｆａｓｔ－５ファイルでＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔソフトウェアを実行することによって得られた、ｔｓｖファイルの試料。左、試料プローブＴ８（ＲＮＡ）、右、試料は、ｄ（ＣＴ）_１０：Ｔ８（ＲＮＡ）＝１：１の混合物であり、両方とも約９０％ＯＮＴ緩衝液中にある（実験条件については図２Ａを参照）。

【図8-2】ｆａｓｔ－５ファイルでＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔソフトウェアを実行することによって得られた、ｔｓｖファイルの試料。左、試料プローブＴ８（ＲＮＡ）、右、試料は、ｄ（ＣＴ）_１０：Ｔ８（ＲＮＡ）＝１：１の混合物であり、両方とも約９０％ＯＮＴ緩衝液中にある（実験条件については図２Ａを参照）。

【図9】１５～６０秒の範囲の２つのナノ細孔実験からのＩ－ｔ記録。上、プローブＴ８（ＲＮＡ）、２つの異なるチャネルからのｉ－ｔ記録。下、ｄ（ＣＴ）_１０：Ｔ８（ＲＮＡ）＝１：１の混合物、上と同じ２つのチャネルからのｉ－ｔ記録。Ｘ軸を横切る垂直線（＝０ｐＡ）は、事象ではなく、電圧反転によって機器が生成した線である。上の記録は複数の深い事象を示し、下の記録は少ない浅い事象を示す。浅い事象は、細孔を通り抜けずに細孔の開口部でぶつかる分子に起因し、「Ａｌｌ Ｉ_ｒ／Ｉ_ｏ＜０．６」を選択するとカウントされない（図８及び実施例を参照）。

【図10A】約９０％のＯＮＴ緩衝液中の試料溶媒中の個々の構成要素及びそれらの１：１混合物のＨＰＬＣプロファイル。２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示される右上のプロファイルにおけるオスミル化プローブ及びハイブリッドを除いて、すべてのＨＰＬＣプロファイルは２６０ｎｍで示される。ハイブリダイゼーションは、主ピークが個々の構成要素の後に溶出する混合物ＨＰＬＣプロファイルによって明らかである。２つのインタクトなオリゴ、ＢＪ１、及びその相補的なインタクトなオリゴ（補体プライマーＭ１３ｆｏｒ（－２０））について示されるハイブリダイゼーション。インタクトなオリゴの別の対との同等の結果については、図３Ｂを参照されたい。

【図10B】約９０％のＯＮＴ緩衝液中の試料溶媒中の個々の構成要素及びそれらの１：１混合物のＨＰＬＣプロファイル。２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示される右上のプロファイルにおけるオスミル化プローブ及びハイブリッドを除いて、すべてのＨＰＬＣプロファイルは２６０ｎｍで示される。ハイブリダイゼーションは、主ピークが個々の構成要素の後に溶出する混合物ＨＰＬＣプロファイルによって明らかである。３０ｎｔのうち５つのＯｓＢｐを有するプローブＢＪ１、及びその相補的なインタクトなオリゴ（相補プライマーＭ１３ｆｏｒ（－２０））について示されるハイブリダイゼーション。

【図10C】約９０％のＯＮＴ緩衝液中の試料溶媒中の個々の構成要素及びそれらの１：１混合物のＨＰＬＣプロファイル。２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示される右上のプロファイルにおけるオスミル化プローブ及びハイブリッドを除いて、すべてのＨＰＬＣプロファイルは２６０ｎｍで示される。ハイブリダイゼーションは、主ピークが個々の構成要素の後に溶出する混合物ＨＰＬＣプロファイルによって明らかである。部分ハイブリダイゼーションのみが、３５ｎｔのうち１１のＯｓＢｐを有するインタクトなＢＪ１及びその相補的オスミル化補体プライマーＭ１３ｆｏｒ（－２０）について示される。

【図10D】約９０％のＯＮＴ緩衝液中の試料溶媒中の個々の構成要素及びそれらの１：１混合物のＨＰＬＣプロファイル。２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示される右上のプロファイルにおけるオスミル化プローブ及びハイブリッドを除いて、すべてのＨＰＬＣプロファイルは２６０ｎｍで示される。ハイブリダイゼーションは、主ピークが個々の構成要素の後に溶出する混合物ＨＰＬＣプロファイルによって明らかである。ハイブリダイゼーションは、３５ｎｔのうち６つのＯｓＢｐを有するインタクトなＢＪ２及びその相補的オスミル化補体プライマーＭ１３ｆｏｒ（－４１）について示される。ＨＰＬＣ方法Ｂを分析に使用する（実施例を参照）。

【図11】プローブＢＪ２及びＢＪ４を用いたナノ細孔実験は、－１８０ｍＶでは事象をほとんど示さず、－２２０ｍＶでは多数の事象を示す。－１８０ｍＶ（破線トレース）で試験されたプローブＢＪ２及びＢＪ４は、無視できるカウント数を示す。新しい試料を添加せず、電圧を－２２０ｍＶに上げ、－２２０ｍＶでプローブを試験し（固体トレース）、多数の事象を検出した。両方のプローブ試料を、０．２ｎｍｏｌｅの負荷で使用した。同じフローセル上で、－１８０ｍＶでＢＪ２、－２２０ｍＶでＢＪ２、－１８０ｍＶでＢＪ４、及び－２２０ｍＶでＢＪ４の順で実験を実施した。各実験の持続時間は１時間であった。図２Ａ下に記載されるデータ取得及び分析。異なる適用電圧でのカウントにおける劇的な違いは、これらのプローブ及び類似する設計の他のプローブが、より低い電圧で独自のＣｓＧｇナノ細孔を通り抜けず、トランスロケーションに約－２２０ｍＶの高い適用電圧を必要とすることを明確に示唆する。

【図12】プローブ２１ＥＸＴを使用した（８Ｔ（ＯｓＢｐ）を用いて、表１の配列を参照）ｍｉＲＮＡ２１またはｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５の１：１の混合物（非ハイブリッド）のＨＰＬＣプロファイル。試料溶媒としての約９０％のＯＮＴ緩衝液中の試料。ＨＰＬＣ方法Ｂ（実施例）で得られるＨＰＬＣプロファイル。混合物試料のＨＰＬＣプロファイルは、２つの構成要素のＨＰＬＣプロファイルの合計と厳密に一致し、これら２つの場合において検出可能なハイブリダイゼーションがないという証拠を提供する。これら２つの場合の違いは、付加されたＡ１５尾部のため、ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５がｍｉＲＮＡ２１と比較して数分後に溶出することである。

【図13】－１８０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２２０ｍＶで、各々１０μＭのインタクトなｍｉＲＮＡ１２２とｍｉＲＮＡ１４０との混合物で観察されたカウントに対する適用電圧の影響。－１８０ｍＶで示されるデータは、図２Ｂ（Ｆｌｏｎｇｌｅ）と同じデータであるが、ＭｉｎＩＯＮはＦｌｏｎｇｌｅと比較して約１０倍の作業チャネルを有するため、１０で乗算することによって正規化される。適用電圧の増加により、事象のカウントがわずかに低減し、より速いトランスロケーション及び検出可能性の低減と一致する。－２２０ｍＶで１０μＭのｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５を用いた実験は、ｍｉＲＮＡ１２２及びｍｉＲＮＡ１４０の組み合わせと同等のカウントを示すが、Ａ_１５尾部を有さないｍｉＲＮＡと比較して異なるプロファイルを示す。インタクトなＲＮＡに対する電圧の影響は、この研究で試験したプローブの大半に対する電圧の影響とは全く対照的である。－２００～－２２０ｍＶの対照／緩衝液では、検出可能なカウントの差は認められない。

【図14】配列中のＵの数の関数として、Ｔが欠けているオリゴにおけるオスミル化ピリミジンの数について良好な直線相関が得られた。相関は、配列がＤＮＡ、ＲＮＡであるかどうか、または塩基のすべてまたは一部に２’－ＯＭｅ基を担持するかどうかに大きく依存しないように見える（表１を参照）。線形相関を使用して、任意の所与の配列について、プロトコルｃ当たりのオスミル化ピリミジンの数を推定してもよい。線形相関は、デオキシウリジン（ｄＵ）が、デオキシシチジン（ｄＣ）と比較して４．７倍速くオスミル化されるという観察（Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））、及びわずかなパーセンテージのオスミル化ピリミジンをもたらすのみであり、実質的に１００％オスミル化されたオリゴをもたらさないプロトコルｃの条件に起因する。

【図15】ＨＰＬＣ方法Ａを使用した、４つのインタクトなＭ１３プライマー及びそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体のＨＰＬＣプロファイル（実施例を参照）。試料溶媒としての水中のオリゴの分析。これらのオリゴのＴ－オスミル化を、プロトコルｏを使用して行った（実施例を参照）。オスミル化オリゴが複数のピークとして現れる理由は、Ｃ５－Ｃ６二重結合へのＯｓＢｐの上または下の付加がトポ異性体につながるためであり、このクロマトグラフィーが分解する。

【図16】ＨＰＬＣ方法Ａを使用した４つのインタクトなＢＪ１－４及びそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体のＨＰＬＣプロファイル。試料溶媒としての水中のオリゴの分析。これらのオリゴのＴ－オスミル化を、プロトコルｏを使用して行った（実施例を参照）。

【図17】２６０ｎｍで示される（－２０）のプライマーＭ１３及び（－４１）のプライマーＭ１３の２つのインタクトな補体、ならびにＨＰＬＣ方法Ｂを使用して２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体のＨＰＬＣプロファイル（実施例を参照）。試料溶媒としての水中のオリゴの分析。簡潔には、ＨＰＬＣ方法Ｂは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡ ＰａｃＰＡ２００ＨＰＬＣカラムを、０．４５ｍＬ／分の流量及び１５℃のカラム区画の２×２５０ｍｍ構成で使用している。溶媒は、水性ｐＨ８．０±０．２移動相Ａ（ＭＰＡ）及び２５ｍＭのＴＲＩＳ．ＨＣＬ緩衝液を含む移動相Ｂ（ＭＰＢ）であり、ＭＰＢは、１．５ＭのＮａＣｌである。初期条件は９０％ＭＰＡ～１０％ＭＰＢであり、勾配は２０分で１０％～５０％ＭＰＢである。カラム平衡を含む総分析時間は３０分である。これらのオリゴのＴ－オスミル化を、プロトコルｏを使用して行った（実施例のセクションを参照）。右のプロファイルは、非定型であるが、確認された結果、すなわち、親のインタクトな核酸と比較して後で溶出するオスミル化コンジュゲートを示す。

【図18A】２６０ｎｍで示されるＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）（Ａ）及びＢＪ２ ＡＴ（ＯＭｅ）（Ｂ）、ならびにＢＪ１ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｃ）及びＢＪ２ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｄ）、ならびに２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体のＨＰＬＣプロファイル（表１の配列）。ＨＰＬＣ方法Ｂで得られたＨＰＬＣプロファイル（図１７及び実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。プローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）を用いて行われたナノ細孔実験は、比較的低いプローブ負荷で多数のカウントを有する優れたトランスロケーション特性を示した（図４Ｄ）。

【図18B】２６０ｎｍで示されるＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）（Ａ）及びＢＪ２ ＡＴ（ＯＭｅ）（Ｂ）、ならびにＢＪ１ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｃ）及びＢＪ２ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｄ）、ならびに２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体のＨＰＬＣプロファイル（表１の配列）。ＨＰＬＣ方法Ｂで得られたＨＰＬＣプロファイル（図１７及び実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。プローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）を用いて行われたナノ細孔実験は、比較的低いプローブ負荷で多数のカウントを有する優れたトランスロケーション特性を示した（図４Ｄ）。

【図18C】２６０ｎｍで示されるＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）（Ａ）及びＢＪ２ ＡＴ（ＯＭｅ）（Ｂ）、ならびにＢＪ１ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｃ）及びＢＪ２ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｄ）、ならびに２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体のＨＰＬＣプロファイル（表１の配列）。ＨＰＬＣ方法Ｂで得られたＨＰＬＣプロファイル（図１７及び実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。プローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）を用いて行われたナノ細孔実験は、比較的低いプローブ負荷で多数のカウントを有する優れたトランスロケーション特性を示した（図４Ｄ）。

【図18D】２６０ｎｍで示されるＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）（Ａ）及びＢＪ２ ＡＴ（ＯＭｅ）（Ｂ）、ならびにＢＪ１ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｃ）及びＢＪ２ＥＸＴ（ｍＵ）（Ｄ）、ならびに２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体のＨＰＬＣプロファイル（表１の配列）。ＨＰＬＣ方法Ｂで得られたＨＰＬＣプロファイル（図１７及び実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。プローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）を用いて行われたナノ細孔実験は、比較的低いプローブ負荷で多数のカウントを有する優れたトランスロケーション特性を示した（図４Ｄ）。

【図19A】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１４０、及びｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５（これらは、－５ｐ配列である）及びそれらの対応する部分的にオスミル化された誘導体のＨＰＬＣプロファイル。異なる材料を異なる試料負荷で分析する。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５にはオスミル化プロトコールｏを、他の３つのｍｉＲＮＡにはプロトコールｃを使用した（表１及び実施例を参照）。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５の分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ａ、及び他の３つのｍｉＲＮＡの分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ｂ（実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。

【図19B】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１４０、及びｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５（これらは、－５ｐ配列である）及びそれらの対応する部分的にオスミル化された誘導体のＨＰＬＣプロファイル。異なる材料を異なる試料負荷で分析する。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５にはオスミル化プロトコールｏを、他の３つのｍｉＲＮＡにはプロトコールｃを使用した（表１及び実施例を参照）。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５の分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ａ、及び他の３つのｍｉＲＮＡの分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ｂ（実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。

【図19C】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１４０、及びｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５（これらは、－５ｐ配列である）及びそれらの対応する部分的にオスミル化された誘導体のＨＰＬＣプロファイル。異なる材料を異なる試料負荷で分析する。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５にはオスミル化プロトコールｏを、他の３つのｍｉＲＮＡにはプロトコールｃを使用した（表１及び実施例を参照）。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５の分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ａ、及び他の３つのｍｉＲＮＡの分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ｂ（実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。

【図19D】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ１４０、及びｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５（これらは、－５ｐ配列である）及びそれらの対応する部分的にオスミル化された誘導体のＨＰＬＣプロファイル。異なる材料を異なる試料負荷で分析する。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５にはオスミル化プロトコールｏを、他の３つのｍｉＲＮＡにはプロトコールｃを使用した（表１及び実施例を参照）。ｍｉＲＮＡ２１－Ａ_１５の分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ａ、及び他の３つのｍｉＲＮＡの分析に使用されるＨＰＬＣ方法Ｂ（実施例を参照）。試料溶媒としての水中の材料。

【図20A】２６０ｎｍでのインタクトなｄｍｉＲ２１及び２７２ｎｍ及び３１２ｎｍでのＴ－オスミル化生成物のＨＰＬＣプロファイル。

【図20B】インタクトな２１ＥＸＴ及びそのＴ－オスミル化生成物のＨＰＬＣプロファイル。オスミル化は、ＯｓＯ_４の添加後にｂｉｐｙを溶解した初期のプロセスである、２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルｏ（４０分）を使用して実施された（実施例を参照）。分析のために水中の材料、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図21A】２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルｂ（３０分）及び３．９４ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルｃ（３０分）を使用した、ｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）のオスミル化生成物のＨＰＬＣプロファイル。５．２５ｍＭのＯｓＢｐを使用した３０分間のインキュベーションを伴う第３のプロトコル（ｄ）を使用して、ナノ細孔実験のためにこのプローブをオスミル化した（図６Ｂ）。これは、ｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）がＴを含まず、プロトコルｂ及びｃを使用すると、非常に低レベルのオスミル化及び検出可能性が低下するため、必要であった。

【図21B】２つの異なるプロトコルを用いたプローブ２１ＥＸＴ（ｍＵ）インタクト及びそのオスミル化生成物；２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルａ（４５分）を使用する調製物１、及び２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルｂ（３０分）を使用する調製物２。

【図21C】ハイブリッドのＨＰＬＣプロファイルをプローブ単独のＨＰＬＣプロファイル（Ｂ、上記）と比較し、それらが異なることを確認するために、図７Ｃを繰り返す。分析は、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して行った（実施例を参照）。

【図22A】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ１２２プローブ及び２７２及び３１２ｎｍでのそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体（実際のプローブ）のＨＰＬＣプロファイル。オスミル化プロトコルｏを使用して、ｄｍｉＲ１２２、２ＸｄｍｉＲ１２２、及び１２２ＥＸＴをオスミル化した。ｄｍｉＲ１２２（ＯＭｅ）は、任意のＴを有さず、プロトコルｂまたはｃを使用してオスミル化した（配列及びプロトコルについては表１を参照）。分析のために材料は水中にあり、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図22B】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ１２２プローブ及び２７２及び３１２ｎｍでのそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体（実際のプローブ）のＨＰＬＣプロファイル。オスミル化プロトコルｏを使用して、ｄｍｉＲ１２２、２ＸｄｍｉＲ１２２、及び１２２ＥＸＴをオスミル化した。ｄｍｉＲ１２２（ＯＭｅ）は、任意のＴを有さず、プロトコルｂまたはｃを使用してオスミル化した（配列及びプロトコルについては表１を参照）。分析のために材料は水中にあり、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図22C】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ１２２プローブ及び２７２及び３１２ｎｍでのそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体（実際のプローブ）のＨＰＬＣプロファイル。オスミル化プロトコルｏを使用して、ｄｍｉＲ１２２、２ＸｄｍｉＲ１２２、及び１２２ＥＸＴをオスミル化した。ｄｍｉＲ１２２（ＯＭｅ）は、任意のＴを有さず、プロトコルｂまたはｃを使用してオスミル化した（配列及びプロトコルについては表１を参照）。分析のために材料は水中にあり、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図22D】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ１２２プローブ及び２７２及び３１２ｎｍでのそれらの対応するＴ－オスミル化誘導体（実際のプローブ）のＨＰＬＣプロファイル。オスミル化プロトコルｏを使用して、ｄｍｉＲ１２２、２ＸｄｍｉＲ１２２、及び１２２ＥＸＴをオスミル化した。ｄｍｉＲ１２２（ＯＭｅ）は、任意のＴを有さず、プロトコルｂまたはｃを使用してオスミル化した（配列及びプロトコルについては表１を参照）。分析のために材料は水中にあり、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図23A】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ１４０プローブ及び２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するオスミル化誘導体（実際のプローブ）のＨＰＬＣプロファイル。２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたオスミル化プロトコルｏ（４０分）（初期のプロセス、ｂｉｐｙは、ＯｓＯ_４の添加前に溶解されなかった）を使用したｄｍｉＲ１４０（Ａ）及び２ＸｄｍｉＲ１４０（Ｂ）のＨＰＬＣプロファイル。（Ｃ）２つの異なるプロトコルを用いたプローブ１４０ＥＸＴ（ｍＵ）インタクト及びそのオスミル化生成物；２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルａ（４５分）を使用する調製物２、及び２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルｂ（３０分）を使用する調製物１。分析のために水中の材料、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図23B】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ１４０プローブ及び２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するオスミル化誘導体（実際のプローブ）のＨＰＬＣプロファイル。２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたオスミル化プロトコルｏ（４０分）（初期のプロセス、ｂｉｐｙは、ＯｓＯ_４の添加前に溶解されなかった）を使用したｄｍｉＲ１４０（Ａ）及び２ＸｄｍｉＲ１４０（Ｂ）のＨＰＬＣプロファイル。（Ｃ）２つの異なるプロトコルを用いたプローブ１４０ＥＸＴ（ｍＵ）インタクト及びそのオスミル化生成物；２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルａ（４５分）を使用する調製物２、及び２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルｂ（３０分）を使用する調製物１。分析のために水中の材料、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図23C】２６０ｎｍで示されるインタクトなｍｉＲＮＡ１４０プローブ及び２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示されるそれらの対応するオスミル化誘導体（実際のプローブ）のＨＰＬＣプロファイル。２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたオスミル化プロトコルｏ（４０分）（初期のプロセス、ｂｉｐｙは、ＯｓＯ_４の添加前に溶解されなかった）を使用したｄｍｉＲ１４０（Ａ）及び２ＸｄｍｉＲ１４０（Ｂ）のＨＰＬＣプロファイル。（Ｃ）２つの異なるプロトコルを用いたプローブ１４０ＥＸＴ（ｍＵ）インタクト及びそのオスミル化生成物；２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルａ（４５分）を使用する調製物２、及び２．６３ｍＭのＯｓＢｐを用いたプロトコルｂ（３０分）を使用する調製物１。分析のために水中の材料、ＨＰＬＣ方法Ｂを使用して分析を行った（実施例を参照）。

【図24A】部分的にオスミル化した１００ｎｔ ＲＮＡ及びオスミル化プロトコルｃを使用した１００ｎｔ ＲＮＡ（ОＭｅ）のＨＰＬＣプロファイル。（表１及び実施例を参照）

【図24B】プロトコルｂを使用したＴ－オスミル化ｄ（ＣＴ）_１０のＨＰＬＣプロファイル。試料溶媒としての水中の材料。ＨＰＬＣ方法Ｂをすべての試料に使用し、ＨＰＬＣプロファイルを２７２ｎｍ及び３１２ｎｍで示す。オスミル化プロトコル及びＨＰＬＣ方法は、実施例に見出すことができる。

【図25A】部分的にオスミル化された２２ｎｔ ＲＮＡのＨＰＬＣプロファイル。（Ａ）相補的ｍｉＲＮＡ２１及び（Ｂ）相補的ｍｉＲＮＡ１２２。オスミル化プロトコルｃを、３．９４ｍＭのＯｓＢｐで３０分使用した。

【図25B】部分的にオスミル化された２２ｎｔ ＲＮＡのＨＰＬＣプロファイル。（Ａ）相補的ｍｉＲＮＡ２１及び（Ｂ）相補的ｍｉＲＮＡ１２２。オスミル化プロトコルｃを、３．９４ｍＭのＯｓＢｐで３０分使用した。

【図26A】（Ａ）右側のＨＰＬＣプロファイルと直接比較するために、図６Ａを繰り返す。（Ｂ）１５％の血清－８５％のＯＮＴ緩衝液中の３つの試料のＨＰＬＣプロファイル：分析前のｍｉＲＮＡ１４０の２分間のインキュベーション、分析前の１００ｎｔ ＲＮＡの３０分間のインキュベーション。より長いインキュベーションは、１００ｎｔ ＲＮＡの分解が、ｍｉＲＮＡ１４０の分解と比較してより極端なように見える理由である。約５％の水－９５％のＯＮＴ緩衝液（Ａ）中のｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）（ＯｓＢｐ）：ｍｉＲＮＡ２１＝１：２の混合物及び１５％の血清－８５％のＯＮＴ緩衝液（Ｂ）中の同じ混合物。ＨＰＬＣプロファイルは同等であるように見え、ハイブリッドが１５％の血清－８５％のＯＮＴ緩衝液中での分解がわずかであることを示唆する。ＨＰＬＣ方法Ｂをこれらの分析に使用する（実施例を参照）。

【図26B】（Ａ）右側のＨＰＬＣプロファイルと直接比較するために、図６Ａを繰り返す。（Ｂ）１５％の血清－８５％のＯＮＴ緩衝液中の３つの試料のＨＰＬＣプロファイル：分析前のｍｉＲＮＡ１４０の２分間のインキュベーション、分析前の１００ｎｔ ＲＮＡの３０分間のインキュベーション。より長いインキュベーションは、１００ｎｔ ＲＮＡの分解が、ｍｉＲＮＡ１４０の分解と比較してより極端なように見える理由である。約５％の水－９５％のＯＮＴ緩衝液（Ａ）中のｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）（ＯｓＢｐ）：ｍｉＲＮＡ２１＝１：２の混合物及び１５％の血清－８５％のＯＮＴ緩衝液（Ｂ）中の同じ混合物。ＨＰＬＣプロファイルは同等であるように見え、ハイブリッドが１５％の血清－８５％のＯＮＴ緩衝液中での分解がわずかであることを示唆する。ＨＰＬＣ方法Ｂをこれらの分析に使用する（実施例を参照）。

【発明を実施するための形態】

【0009】

詳細な説明
すぐ下に定義される用語は、本明細書を参照することによりその全体がより完全に定義される。説明的なサポートを提供するために必要な範囲で、添付の特許請求の範囲の主題及び／または文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0010】

定義
本明細書に記載され特許請求される例示的な態様及び実施形態は、本明細書に具体的に開示されている、または開示されていない任意の列挙された特徴、要素、または工程の不在下で適切に実施され得ることが、本明細書のすべての読者によって理解されよう。

【0011】

「ａ」または「ａｎ」という用語のエンティティは、そのエンティティの１つ以上を指し、例えば、「プローブ（ａ ｐｒｏｂｅ）」は、１つ以上の「プローブ（ｐｒｏｂｅｓ）」を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では同義に使用することができる。

【0012】

本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、特定された特徴または構成要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない特定の開示とみなされるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの句で使用される場合、「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの句で使用される場合、「及び／または」は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、及びＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。

【0013】

態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という言語を用いて本明細書に記載される場合は常に、「からなる」及び／または「から本質的になる」という用語で説明される他の類似の態様も提供されることが理解される。

【0014】

別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示の関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。例えば、別途指定されない限り、「相補的な」塩基対は、Ａ／Ｔ、Ａ／Ｕ、及びＧ／Ｃ塩基対合を指す。

【0015】

数値範囲は範囲を定義する数を含む。「及びその間の任意の範囲」などによって明確に特定されない場合でも、値のリスト、すなわち、１、２、３、または４が列挙されている場合、本開示は、値の間の任意の範囲、すなわち、１～３、１～４、２～４などを具体的に含む。

【0016】

本明細書で提供される見出しは、単に参照を容易にするためのものであり、本明細書全体を参照することによって得ることができる本開示の様々な態様または態様の限定ではない。

【0017】

本明細書で使用される場合、「同一性」、すなわち、本明細書で開示されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対する「同一性パーセント」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列間の、または２つ以上のヌクレオチド配列間の関係を指す。ある配列の位置が、比較配列の対応する位置の同じ核酸塩基またはアミノ酸によって占められている場合、その配列はその位置で「同一である」と言われる。「配列同一性」のパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸が両方の配列に存在する位置の数を決定して、「同一である」位置の数を得ることによって計算される。次に、「同一である」位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、１００を掛けて、「配列同一性」のパーセンテージを得る。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される。比較のために配列を最適に整列させるために、比較ウィンドウ内のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分は、参照配列が一定に保たれている間、ギャップと呼ばれる付加または欠失を含み得る。最適なアライメントは、ギャップがあっても、参照配列と比較配列の間に可能な限り多くの「同一である」位置を生成するアライメントである。２つの配列間の「配列同一性」パーセンテージは、すなわち、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能であり、プログラムがＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列比較用）及びＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列比較用）（プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１２）：５８７３－５８７７，１９９３）のアルゴリズムに基づく）のプログラムを組み込んだ「ＢＬＡＳＴ」のプログラムを使用して決定することができる。

【0018】

本明細書で使用される場合、核酸分子を指す場合の「相補的」という用語は、当該技術分野で理解されるように、相補的なワトソン－クリック塩基対合の標準的な定義が与えられている。

【0019】

「核酸」という用語は、当業者に周知の用語であり、本明細書において、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むように使用される。別途指定されない限り、「核酸」分子及び「ポリヌクレオチド」は、同義に使用され得る。核酸は、従来のホスホジエステル結合または非従来の結合（すなわち、ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＰＮＡ）に見出されるようなアミド結合）を含むことができる。「単離された」核酸とは、対象から得られたゲノムＤＮＡの試料など、その天然環境から除去された核酸分子を意図する。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に生成されたそのような分子がさらに含まれる。

【0020】

本明細書で使用される場合、「インタクト」または「天然」という用語は、オリゴヌクレオチドを指す場合、オリゴヌクレオチドがオスミル化されていないことを意味する。

【0021】

本明細書で使用される場合、「生体試料」は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルス、真菌、または他の多細胞型もしくは単一細胞の生命形態などの対象に由来する試料である。ある特定の態様では、生体試料は、採血、尿試料の収集、または組織もしくは液体生検などによって、対象から直接得ることができる。ある特定の態様では、生体試料は、犯罪現場で収集された生物学的証拠などから間接的に取得され得る。ある特定の態様では、生体試料は、血液、血漿、リンパ液、唾液、尿、羊水、髄液などの体液である。ある特定の態様では、生体試料は、溶液中に懸濁された、溶解された、または流体試料中で再構成された組織または細胞などに由来する構成要素を含む流体試料である。「複合混合物」とは、核酸、タンパク質、炭水化物などの様々な構成要素及び／または様々な核酸分子を含む試料を意味する。

【0022】

本明細書で使用される場合、「事象」または「カウント」は、ナノ細孔デバイスの２つの区画にわたって電圧を適用することによって検出され、細孔を介して電解質イオン（Ｉ_ｏ）の一定の流れをもたらし、これは時間の関数（ｉ－ｔ）として記録される。細孔を通る単一の分子の通過は、Ｉ_ｏをより低いレベルの残留イオン電流（Ｉ_ｒ）に低減する。これは、（Ｉ_ｒ）及び滞留時間（τ）を有する「事象」として記録される（図１Ｂ）。

【0023】

Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）からのポータブルナノ細孔デバイスは、電圧駆動型イオンチャネル測定を行うことによって、複合混合物中のＤＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド（標的）を検出するために別の目的で使用され得ることが発見されている。標的の検出及び定量化を、本開示の独自の相補的プローブを使用することによって可能にした。検証された標識技術を使用して、プローブは、プローブと標的との間の強力なハイブリダイゼーションを維持する方法で、かさばるオスミウムタグ（四酸化オスミウム２，２’－ビピリジン）でタグ付けされる。タグ付けされていないオリゴは、デバイスの取得速度と比較して比較的速くナノ細孔を通り抜け、ベースラインと同等の事象のカウントを示す。カウントは、例えば、公的に利用可能なソフトウェアＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔ（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．，＆Ｋａｎｇ，Ａ．、公共リポジトリ内のＲＮＡ（ＯｓＢｐ）事象検出Ｐｙｔｈｏｎパッケージ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ、段階的インストール手順については、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ．ｍｄを参照）によって報告され得る。かさばるオスミウムタグの存在により、オスミウムタグ付けされたプローブはよりゆっくりと通り抜け、ベースラインに対して複数のカウントを生成し、さらに一桁のアトモル（ａｍｏｌｅ）範囲でさえ検出することができる。しかしながら、標的の存在下では、プローブは「サイレンシング」される。サイレンシングは、本開示の実用的な目的のために、適用される条件下でナノ細孔を通り抜けないと考えられる二本鎖複合体に起因する。したがって、開示されるすぐに使用可能なプラットフォームは、例えば、体液中のポイントオブケア循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片化ＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）検出及び定量化の要件を満たすために、診断試験として調整することができる。

【0024】

本開示の態様は、塩基間の識別を強化するために、核酸の選択的標識（本明細書ではタグ付けとも呼ばれる）を利用し（Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６）、Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９）、Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１５））、標識／タグとして四酸化オスミウム２，２’－ビピリジン（ＯｓＢｐ）を利用する。ＯｓＢｐは、プリンに対して反応性ではなく、ＤＮＡまたはＲＮＡにおけるホスホジエステル結合を切断しない。ＯｓＢｐは、ピリミジンのＣ５－Ｃ６二重結合に付加され、ピリミジン環を切断することなく、２つの強いＣ－Ｏ結合を形成する（図１Ｃ）（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｈ．，Ｂｅｅｒ，Ｍ．＆Ｍａｒｚｉｌｌｉ，Ｌ．Ｇ．（１９７７）、Ｐａｌｅｃｅｋ Ｅ．（１９９２）、Ｒｅｓｋｅ Ｔ．，Ｓｕｒｋｕｓ，Ａ－Ｅ．，Ｄｕｗｅｎｓｅｅ，Ｈ．＆Ｆｌｅｃｈｓｉｇ Ｇ．－Ｕ．（２００９）、Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６）、Ｄｅｂｎａｔｈ，Ｔ．Ｋ．＆Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．（２０１８））。チミジン（Ｔ）に対するＯｓＢｐの反応性は、デオキシシチジン（ｄＣ）及びデオキシウリジン（ｄＵ）に対する反応性と比較して、それぞれ２８倍及び７．５倍高い（Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））。他のピリミジンの存在下でＴを選択的に標識するための標識条件プロトコルが開発されている（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２））。さらに、本発明者は、短い及び長いＤＮＡ及びＲＮＡにおける標識の程度を測定するためのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法を開発した（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６）；実施例を参照）。電圧駆動型イオンチャネル測定は、ＳｉＮ固体状態ナノ細孔（Ｈｅｎｌｅｙ，Ｒ．Ｙ．，Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｐａｇａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．＆Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．（２０１５））、α－溶血素ナノ細孔（Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））、ならびにＭｉｎＩＯＮにおけるＣｓＧｇナノ細孔（Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９））を使用して行い、３つのプラットフォームすべてが、オスミル化核酸のトランスロケーションを可能にし、それらを天然の核酸から明確に区別することを実証した。区別は、著しく低いＩ_ｒ及びより長いτを有する事象として現れ、例えば、オリゴヌクレオチドを標識するＯｓＢｐ部分の数及び／または位置を増加させることによって増加させることができる。天然ＤＮＡ及びＲＮＡの複合混合物中のＯｓＢｐタグ付けされたオリゴを単離し、検出し、カウントするために、これらの特徴を利用した。

【0025】

図１Ｄは、複合混合物中の標的オリゴのナノ細孔に基づく特定及び定量化の背後にある概念を図示する。本開示のある特定の態様は、本明細書の他の箇所で詳細に記載されるように、ハイブリダイズされた二本鎖複合体を作製するのに十分である、核酸標的分子に少なくとも部分的に相補的である、特別に設計されたＯｓＢｐタグ付けされたオリゴ（プローブ）により可能となる。プローブとしての相補的オリゴの使用は、いくつかの実験的ナノ細孔プラットフォームで検証されている（Ｗａｎｕｎｕ Ｍ，Ｄａｄｏｓｈ Ｔ，Ｒａｙ Ｖ，Ｊｉｎ Ｊ，ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｌ，Ｄｒｎｄｉｃ Ｍ．（２０１０）、Ｘｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｚａｈｉｄ，Ｏ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｒｕｚｉｃｋａ，Ｊ．Ａ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｗ．＆Ｈａｌｌ，Ａ．Ｒ．（２０１６）、Ｔｉａｎ，Ｋ．，Ｓｈｉ，Ｒ．，Ｇｕ，Ａ．，Ｐｅｎｎｅｌｌａ，Ｍ．，＆Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．（２０１７）、Ｈａｏ，Ｗ．，Ｈａｏｒａｎ Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ Ｙ．，＆Ｙｏｎｇｘｉｎ，Ｌ．（２０１９））。しかしながら、これらのプラットフォームは、プローブがタンパク質（Ｗａｎｕｎｕ Ｍ，Ｄａｄｏｓｈ Ｔ，Ｒａｙ Ｖ，Ｊｉｎ Ｊ，ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｌ，Ｄｒｎｄｉｃ Ｍ．（２０１０））、ナノ粒子（Ｈａｏ，Ｗ．，Ｈａｏｒａｎ Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ Ｙ．，＆Ｙｏｎｇｘｉｎ，Ｌ．（２０１９））、ホモポリマー（Ｘｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１６））、またはポリペプチド（Ｔｉａｎ，Ｋ．，Ｓｈｉ，Ｒ．，Ｇｕ，Ａ．，Ｐｅｎｎｅｌｌａ，Ｍ．，＆Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．（２０１７））にコンジュゲートされているという事実によって複雑になる。これらのプラットフォームにおける検出は、ナノ細孔に入るときの二本鎖ハイブリッド複合体の衝突、及び実質的に「詰まる」ことによってもたらされる長い遮断をカウントすることに依存する。これらの方法のいずれも、商業的利用可能性に達せず、それらのより広範な使用を妨げる。ハイブリッドの検出に基づく初期のアプローチとは対照的に（Ｗａｎｕｎｕ Ｍ，Ｄａｄｏｓｈ Ｔ，Ｒａｙ Ｖ，Ｊｉｎ Ｊ，ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｌ，Ｄｒｎｄｉｃ Ｍ．（２０１０）、Ｘｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｚａｈｉｄ，Ｏ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｒｕｚｉｃｋａ，Ｊ．Ａ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｗ．＆Ｈａｌｌ，Ａ．Ｒ．（２０１６）、Ｔｉａｎ，Ｋ．，Ｓｈｉ，Ｒ．，Ｇｕ，Ａ．，Ｐｅｎｎｅｌｌａ，Ｍ．，＆Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．（２０１７）、Ｈａｏ，Ｗ．，Ｈａｏｒａｎ Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ Ｙ．，＆Ｙｏｎｇｘｉｎ，Ｌ．（２０１９））、本開示の態様は、比較的遅い取得速度によって容易になるオスミル化プローブのトランスロケーションを検出する（例えば、限定されないが、ＭｉｎＩＯＮ（３．０１２ｋＨｚサンプリング速度、１ミリ秒当たり３データポイントの報告に相当する））（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｗｅｂｓｉｔｅ：ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ下）。遅いサンプリング速度は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの多くの、大半の、またはすべてのトランスロケーション事象を見落とすが、ＯｓＢｐタグ付けされたプローブのトランスロケーションに対応する事象は検出される。核酸標的分子（例えば、相補的プローブ結合パートナー）の不在下で、オスミル化プローブは、ナノ細孔を通り抜け、検出可能な事象を生成する。核酸標的分子の存在下で、プローブは、標的とのハイブリダイズされた複合体（例えば、１：１の二本鎖ハイブリッド）を形成する。ハイブリダイズされた分子は、ナノ細孔を通過せず、通り抜けない（図１Ｄ）。したがって、ハイブリダイズされたＯｓＢｐタグ付けされたプローブは「サイレンシング」される。しかしながら、ある特定の態様では、ハイブリダイズされた複合体は、「詰ま」らず、非ハイブリダイズ一本鎖核酸が細孔を通過するのを防止しない。これは、例えば、そのような非生産的な「詰まり」の発生からナノ細孔を解放するために、電圧の自動反転を組み込むことによって達成することができる。したがって、試料中の核酸標的分子の存在または不在を検出する、それについて試験する、及び／またはそれを決定するために、電圧駆動実験を行うことによってナノ細孔プラットフォームまたはデバイス上で実行することができる特定の試料に、オスミル化プローブを添加する。試料中の核酸標的分子の欠如は、ある特定の態様では、ナノ細孔を介したタグ付けされたプローブのトランスロケーションに起因する多数の事象の検出から解釈され得る。試料中の核酸標的分子の存在は、ある特定の態様では、タグ付けされたプローブと標的との間のハイブリッド形成により、事象の不在から解釈され得る。標的の定量化は、タグ付けされたプローブの既知の濃度及び１：１のハイブリッド形成に基づき得る。

【0026】

配列の中央にＴ（ＯｓＢｐ）部分が存在することは、多くの潜在的なｃｔＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のそのような標的によって共有される特徴ではない。したがって、本開示のプローブのある特定の態様では、配列中の１つ、いくつか、またはすべてのＴは、ウリジン（Ｕ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、または２’－ＯＭｅ－ウリジン（ｍＵ）で置き換えられる。さらに、ある特定の態様では、１つ、いくつか、またはすべての塩基は、２’－ＯＭｅとして修飾される。ある特定の態様では、１つ以上の隣接するＴ（ＯｓＢｐ）が、プローブオリゴの３’末端または５’末端に付加される。また、いくつかの態様では、１つ以上の追加のｄＡが、プローブオリゴの３’末端または５’末端に付加される。ＴをＵ、ｄＵ、またはｍＵに置き換えることにより、核酸標的分子へのハイブリダイゼーションを妨げる可能性のある、相補性配列内のＯｓＢｐの存在が低減または排除される。

【0027】

ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと比較してより安定であることが知られている。したがって、例えば、ある特定の態様では、ＲＮＡベースのプローブは、試験される生体試料にプローブを添加した後にＤＮＡを標的にすることができる。ある特定の態様では、ＤＮＡ（例えば、ｄｓＤＮＡ）は、比較的短く、例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２８、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド未満の長さである。ある特定の態様では、方法は、例えば、ｄｓＤＮＡ標的分子を変性させる、及び／またはプローブの任意の二次構造を除去するために、ＲＮＡベースのプローブが核酸標的分子にハイブリダイズする前の変性工程を含む。ＲＮＡプローブは、図２Ａの（Ｉ_ｒ／Ｉ_ｏ）_ｍａｘと、プローブを表す他のすべての図における対応する（Ｉ_ｒ／Ｉ_ｏ）_ｍａｘとの比較によって示されるように、ＤＮＡベースのプローブと比較して異なるナノ細孔プロファイルを示す。この機能は、一度に２つ以上のターゲットを試験するためのプローブ多重化につながる可能性がある。同様に、３つの隣接するＴを欠くｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）のようなプローブは－１８０ｍＶでトランスロケーションすることが見られたが、３つの隣接するＴを有するプローブは－２２０ｍＶを必要とする。そのような区別、例えば、電圧、電流、時間などの結果としてのプローブ間のトランスロケーションの違い、ならびにプローブのオスミル化の量及び／または位置に基づいて、プローブを多重化するために利用することができる。異なるナノ細孔プロファイルは、どのプローブがサイレンシングされているかを明らかにする。たった１つのプローブで、試験は、プローブ単独の事象の合計カウントを、プローブと未知の試料との混合物の事象の合計カウントと比較することによって、標的の存在／不在を決定的に特定することができる。多重化試験では、例えば、どのプローブが欠如しているかを決定するために、カウントをヒストグラムとしてプロットすることができる。したがって、本開示のある特定の態様は、同じ試験試料内でも一度に２つ以上の核酸標的分子を試験するための多重化を提供する。

【0028】

本開示のある特定の態様は、例えば、ポータブルの市販のナノ細孔デバイスを使用して行われるイオンチャネル単一分子実験を提供する。試験した標的は、ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴであり、ある特定の態様では、９桁の検出範囲を示した。この感度は、例えば１１μＬの生体試料からの１桁のアトモル標的感度に匹敵する。これらの特性は、体液中に見出されるｃｔＤＮＡ及びｍｉＲＮＡなどの高希釈試料の検出及び定量化を可能にする。

【0029】

本明細書において、生体試料中の核酸標的分子の存在を検出するための方法が提供される。当業者は、以下に記載される方法のいずれかについて、核酸標的試料を検出するための基準が満たされない場合、類似の方法を使用して、生体試料中の核酸標的分子の不在を検出／検証することもできることを認識するであろう。ある特定の態様では、方法は、（ｉ）核酸標的分子を含む生体試料と、（ｉｉ）置換または非置換の四酸化オスミウム（ＯｓＯ_４）－２，２’－ビピリジン基（ＯｓＢｐ基）に共有結合された少なくとも１つのピリミジン残基を含むオスミル化一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとを含む、試験試料を接触させることを含む。ある特定の態様では、置換は、ＯｓＢｐの２，２’－ビピリジン上で生じる。ある特定の態様では、試験試料は、生体試料が希釈される試料緩衝液を含む。試料緩衝液の組成は、ナノ細孔デバイス／システムの種類、生物学的試料の種類などに応じて変化し得、状況ごとに決定することができる。生体試料は、一般に、試験試料の体積の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が試料緩衝液であり、体積の残りは生体試料及び／またはプローブを含む溶液であるように希釈される。しかしながら、当業者は、使用される生体試料の体積が小さいほど、存在し得る核酸標的分子の量が小さく、したがって、より高い感度を必要とすることを認識するであろう。オスミル化ピリミジンは、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシウリジン（ｄＵ）、ウリジン（Ｕ）、またはこれらの誘導体であり得る。ある特定の態様では、少なくとも１つのオスミル化ピリミジン残基は、チミジン残基（Ｔ）である。ある特定の態様では、プローブの配列は、ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成を可能にするのに十分である、核酸標的分子の配列に少なくとも部分的に相補的である。ある特定の態様では、プローブの配列の少なくとも一部分は、核酸標的分子の配列の少なくとも一セグメントに完全に相補的である。ナノ細孔デバイスを使用して、試験試料において、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブがナノ細孔を通り抜ける事象の数を検出する。次いで、試験試料において検出された事象の数をいくつかの他の値に対して比較して、試験試料中の核酸標的分子の存在、またはいくつかの態様では、不在を決定するかまたは間接的に検出することができる。ある特定の態様では、試験試料中の核酸標的分子の唯一の潜在的な供給源は、生体試料に起因するものであり、試験試料中の核酸標的分子の検出は、生体試料中の核酸標的分子を検出する。ナノ細孔システム上でオリゴヌクレオチドを検出する従来の方法とは異なり、本開示のナノ細孔デバイス／システムは、プローブの検出のためにプローブがタンパク質、ナノ粒子、ホモポリマー、またはポリペプチドにコンジュゲートされていることを必要としない。したがって、ある特定の態様では、プローブは、タンパク質、ナノ粒子、ホモポリマー、またはポリペプチドにコンジュゲートされていない。さらに、従来のナノ細孔検出方法とは異なり、検出は、ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体がナノ細孔を遮断することによってもたらされる長い遮断をカウントすることによって、またはナノ細孔内のハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の融解によって達成されることはない。

【0030】

（ｉ）ある特定の態様では、試験試料において検出された事象の数は、「対応するプローブ試料事象の数」と比較され得る。対応するプローブ試料事象の数は、プローブ試料において検出されるか、または理論的にプローブ試料について検出されるべきものであり、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブは、核酸標的の不在下でナノ細孔を通り抜ける。より詳細に説明され、本明細書の他の箇所の代表的な実施例に示されるように、標的試料中の核酸標的分子の存在（生体試料由来の、または対照として添加されるなど）は、相補的なオスミル化プローブとのハイブリダイゼーションをもたらし、したがって、プローブを「サイレンシング」する（それがナノ細孔を通り抜けることを防止し、検出可能な事象をもたらす）。したがって、プローブ試料事象の数と比べた、試験試料において検出された事象の数の低減は、ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、したがって試験試料中の核酸標的分子の存在を示す。非ハイブリダイズプローブはナノ細孔を通り抜け、検出可能な事象をもたらすため、核酸標的分子の存在下で、プローブのすべてがハイブリダイズされない場合であっても、ある特定の態様では、プローブの量は、試験試料中の核酸標的の量を大きく超えてはならないか、または超えてはならない。ある特定の態様では、プローブの量は、試験試料中の核酸標的の量とほぼ等しいか、またはそれ未満であるべきである。ある特定の態様では、標的核酸分子とその相補的プローブとの間のハイブリダイゼーションの強度も考慮に入れることができる。当業者は、利用可能な情報及び日常的な実験に基づいて、特定の種類の試料中の核酸標的分子のおおよその量を決定することができ、最適な結果を得るために使用するプローブの量をさらに精緻化することができる。ある特定の態様では、事象の数の低減は、観察された低減が試験試料中の核酸標的分子の存在及びプローブ／標的ハイブリッドの形成によるものであると確信を持って推定するために、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍である。この信頼レベルは、例えば、プローブ／標的ごと、試験条件ごと、及びナノ細孔デバイスごとに変化し得、所与のシステムの日常的な実験によって決定することができる。したがって、ある特定の態様では、試験試料において検出された事象の数と、対応するプローブ試料事象の数との間の事象の数の低減は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍の低減である。

【0031】

ある特定の態様では、対応するプローブ試料事象の数は、試験試料における事象の数の検出時に、１つ以上のプローブ試料において同時に検出された事象の数である。同時に検出されるとは、当業者が、試験試料における事象の検出及びプローブ試料における事象の検出が同じ試験または実験の一部として実行されるが、必ずしも並行して生じるとは限らないとみなすような、同じ一般的な期間内を意味する。ある特定の態様では、試験試料及びプローブ試料における事象の同時検出は、変動性を低減するために、同じロットからなどの共通の試薬を使用するであろう。ある特定の態様では、同時検出に使用される試薬は、キットにおいて一緒に提供される。

【0032】

ある特定の態様では、対応するプローブ試料事象の数は、所与の量のプローブについての所定値である。所与の量のプローブについてのプローブ試料事象の数の所定値は、既知の量のプローブを用いてプローブ試料で試験を実行し、例えば、ある特定の種類のナノ細孔デバイスで、及びある特定の条件下、例えば、ナノ細孔デバイスの電流、電圧、時間、緩衝液条件、使用年数、及び／または使用量などで生成される事象の数を検出することによって、経験的に決定することができる。次いで、この所定値を、類似する条件下で様々な試験試料において検出された事象の数に対する比較目的で使用することができる。この所定値は、同じまたは類似する量のプローブを有する試験試料との比較に使用され得るか、または値は、異なる量のプローブに対して外挿され得る。所与の量のプローブについての対応するプローブ試料事象の数の所定値はまた、理論的に決定されてもよい。理論的決定は、実験的観察によって情報を得てもよいが、必要ではない。

【0033】

ある特定の態様では、オスミル化プローブ試料事象の数は、プローブ試料においてナノ細孔デバイスによって検出され、次いで、プローブ試料におけるオスミル化プローブは、生体試料と組み合わされて、試験試料を作製する。次いで、この試験試料における事象の数が、検出されたオスミル化プローブ試料事象の数に対する比較のために、ナノ細孔デバイスによって検出され得る。

【0034】

（ｉｉ）ある特定の態様では、試験試料において検出された事象の数は、いずれのオスミル化プローブも含まない対応するベースライン試料の「ノイズ」と比較することができる。当業者であれば、オスミル化プローブが存在しない場合であっても、またいずれの生体試料が存在しない試料緩衝液自体についてであっても、ナノ細孔システムは、本明細書で「ノイズ」と呼ばれるある特定の数の事象を示すことを理解するであろう。当業者であれば、このノイズは、本方法に非限定的である様々な方法（例えば、ノイズをゼロにするために器具を較正するなど）で説明することができることも理解するであろう。より詳細に説明され、本明細書の他の箇所の代表的な実施例に示されるように、標的または対照試料中の核酸標的分子の存在（生体試料由来の、または対照として添加されるなど）は、相補的なオスミル化プローブとのハイブリダイゼーションをもたらし、したがって、プローブを「サイレンシング」する（それがナノ細孔を通り抜けることを防止し、検出可能な事象をもたらす）。したがって、対応するベースライン試料のノイズと比べた、試験試料において検出された事象の数の増加の欠如は、ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、したがって、試験試料中の核酸分子の存在を示す。非ハイブリダイズプローブはナノ細孔を通り抜け、検出可能な事象をもたらすため、核酸標的分子の存在下で、プローブのすべてがハイブリダイズされない場合であっても、ある特定の態様では、プローブの量は、試験試料中の核酸標的の量を大きく超えてはならないか、または超えてはならない。ある特定の態様では、プローブの量は、試験試料中の核酸標的の量とほぼ等しいか、またはそれ未満であるべきである。ある特定の態様では、標的核酸分子とその相補的プローブとの間のハイブリダイゼーションの強度を考慮に入れることができる。当業者は、利用可能な情報及び日常的な実験に基づいて、特定の種類の試料中の核酸標的分子のおおよその量を決定することができ、最適な結果を得るために使用するプローブの量をさらに精緻化することができる。ある特定の態様では、ベースライン試料における事象の数と比べた、試験試料における事象の数の増加の欠如は、観察された低減が、試験試料中の核酸標的分子の存在及びプローブ／標的ハイブリッドの形成に起因すると確信を持って推定するために、２倍未満、３倍未満、または４倍未満の増加を意味する。この信頼レベルは、例えば、プローブ／標的ごと、試験条件ごと、及びナノ細孔デバイスごとに変化し得、所与のシステムの日常的な実験によって決定することができる。したがって、ある特定の態様では、ベースライン試料における事象の数に対して、試験試料における事象の数の増加の欠如は、２倍未満、３倍未満、または４倍未満の増加を意味する。

【0035】

ある特定の態様では、対応するベースライン試料のノイズは、試験試料における事象の数の検出時に、１つ以上のベースライン試料において同時に決定される。同時に検出されるとは、当業者が、試験試料における事象の検出及びベースライン試料におけるノイズの決定が同じ試験または実験の一部として生じるが、必ずしも並行して生じるとは限らないとみなすような、同じ一般的な期間内を意味する。ある特定の態様では、試験試料における事象の検出及びベースライン試料におけるノイズの決定は、変動性を低減するために、同じロットからなどの共通の試薬を使用するであろう。ある特定の態様では、同時検出に使用される試薬は、キットにおいて一緒に提供される。

【0036】

ある特定の態様では、対応するベースライン試料のノイズは、所定値である。例えば、ある特定の態様では、所定値は、試料のある特定の組成（例えば、試料緩衝液の種類、生体試料の種類、試験試料中の生体試料の濃度など）について予め決められていてもよい。ベースライン試料中のノイズの所定値は、既知の組成を有する試料上で試験を実行し、例えば、ある特定の種類のナノ細孔デバイス上で、及びある特定の条件下、例えば、電流、電圧、時間、緩衝液条件、ナノ細孔デバイスの使用年数などで、ノイズの量を決定することによって経験的に決定され得る。次いで、この所定値を、類似する条件下で様々な試験試料において検出された事象の数に対する比較目的で使用することができる。この所定値は、同じまたは類似する組成を有する試験試料との比較に使用され得るか、または値は、異なる組成、例えば、より高いまたはより低い濃度の生体試料に対して外挿され得る。ある特定の組成の対応するベースライン試料のノイズの所定値は、理論的に決定することもできる。理論的決定は、実験的観察によって情報を得てもよいが、必要ではない。

【0037】

ある特定の態様では、対応するベースライン試料のノイズは、ナノ細孔デバイス／システムについて決定され、次いで、オスミル化プローブは、試験試料を作製するために、生体試料を含むものなどのベースライン試料に添加される。次いで、この試験試料における事象の数が、ベースライン試料のノイズの量に対する比較のために、ナノ細孔デバイスによって検出され得る。

【0038】

（ｉｉｉ）ある特定の状況では、核酸標的分子及び相補的オスミル化プローブを含む試料、特に、例えば、対照試料中の核酸標的分子の量が既知である試料を対照として使用することが有用であり得る。したがって、ある特定の態様では、試験試料において検出される事象の数は、ハイブリダイズしていないオスミル化プローブが、既知の量の核酸標的分子及び／または既知の量のオスミル化プローブの存在下でナノ細孔を通り抜ける、対応する対照試料事象の数と比較され得る。上述のプローブ試料及び試験試料の使用と一致して、対応する対照試料事象の数と比べた、試験試料において検出される事象の数の低減は、ハイブリダイズされたプローブ／標的複合体の形成、及び対照試料を超える、試験試料中のより高い量の核酸標的分子の存在を示す。そのような対照試料の使用は、生体試料の不在下でも、核酸標的分子とその相補的プローブとの間のハイブリダイゼーションを探索するために使用することができ、また、所与の量の核酸標的分子に使用するプローブの最適量を滴定及び／または決定するために使用することができる。そのような使用は、生体試料中の核酸標的分子の量を検出する定量的方法を開発するために使用することができる。

【0039】

上記のように、オリゴヌクレオチドプローブ内のピリミジンに結合されるＯｓＢｐ中の２，２’－ビピリジンは、置換されるか、または非置換でもよい。ある特定の態様では、それは、例えば、１つ以上のメチル基またはエチル基で置換される。

【0040】

ある特定の態様では、核酸標的分子は、バイオマーカーであり得る、及び／または健康、年齢、もしくは表現型に関連する遺伝子型、または特定の疾患もしくは疾患状態を示し得る。ある特定の態様では、核酸標的は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、断片化コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡである。ある特定の態様では、非コードＲＮＡは、約３００塩基未満の長さである。ある特定の態様では、核酸標的分子は、一本鎖核酸分子である。ある特定の態様では、核酸標的分子は、一本鎖核酸分子として生体試料中に見出される。ある特定の態様では、生体試料中に見出されるように、核酸標的分子は、二本鎖核酸分子の鎖である。したがって、ある特定の態様では、方法は、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖標的分子にハイブリダイズすることができるように、プローブを含む試験試料中の二次構造で二本鎖核酸及び／または核酸を変性させて、一本鎖核酸鎖を形成することを含む。

【0041】

本明細書の他の箇所で詳細に説明されるように、ある特定の態様では、ナノ細孔デバイスは、オスミル化及び非オスミル化一本鎖核酸の電圧駆動トランスロケーションは可能にするが、二本鎖核酸のトランスロケーションは防止する。本明細書に開示される方法は、市販のナノ細孔デバイスを使用して行うことができるが、それらは、ナノ細孔デバイスの種類に限定されない。ある特定の態様では、ナノ細孔デバイスは、約１．３ｎＭ～約７．１ｎＭの最小細孔径を有するナノ細孔を利用する。ある特定の態様では、ナノ細孔デバイスは、Ｐｈｉ２９、α溶血素、アエロリジン、ＭｓｐＡ、ＣｓＧｇ、ＰＡ６３、ＣｌｙＡ、ＦｈｕＡ、もしくはＳＰＰ１タンパク質ナノ細孔、またはその生物工学的誘導体を利用する。

【0042】

本明細書の他の箇所で説明されるように、電圧は、ナノ細孔自体、オスミル化プローブの設計、試料組成、ナノ細孔デバイスの使用年数及び／または使用量などの要因に応じて変化する。さらに、異なる電圧を適用して、他のものではなく、ナノ細孔を通してある特定の核酸を特異的に駆動する、例えば、オスミル化プローブを検出するために必要な電圧を適用する前に、細孔を横切る非オスミル化一本鎖核酸を駆動するか、または多重試験などの異なる設計のオスミル化プローブを区別することができる。ある特定の態様では、約少なくとも－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶ、または少なくとも約－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶの電圧が、標的の存在を決定するために適用される。ある特定の態様では、－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶのいずれか、または約－１８０ｍＶ、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶのいずれかと、－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶのいずれか、または約－１９０ｍＶ、－２００ｍＶ、－２１０ｍＶ、－２２０ｍＶ、－２３０ｍＶ、もしくは－２４０ｍＶ、もしくは－２５０ｍＶのいずれかとの間の電圧が、標的の存在を決定するために適用される。ある特定の態様では、－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、－１６０ｍＶ、もしくは－１５０ｍＶ未満、または約－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、－１６０ｍＶ、もしくは－１５０ｍＶ未満の電圧が適用された後に、電圧が、標的の存在を決定するために適用される。ある特定の態様では、－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶのいずれか、または約－２００ｍＶ、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶのいずれかと、－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶ、－１５０ｍＶのいずれか、または約－１９０ｍＶ、－１８０ｍＶ、－１７０ｍＶ、もしくは－１６０ｍＶ、－１５０ｍＶのいずれかとの間の電圧が適用された後に、電圧が、標的の存在を決定するために適用される。当業者であれば、特定のナノ細孔デバイス及び組み込まれたナノ細孔の特徴に応じて、この電圧は負ではなく正であってもよく、絶対的にははるかに高い可能性があることを認識するであろう。

【0043】

また、本明細書の他の箇所で詳細に説明されるように、ある特定の態様では、方法は、プローブがナノ細孔を介して自由にトランスロケーションされたかどうかを決定するため、時間記録によって報告されるプローブの通過によってもたらされる事象をカウントするためにアルゴリズムを使用することを含む。ある特定の態様では、ナノ細孔デバイスは、異なるオスミル化プローブの区別、及び試験試料中の複数の異なる核酸標的の多重検出を可能にする。

【0044】

本明細書に開示される方法及びプローブを使用して、ある特定の態様では、方法は、試験試料中の１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、１００ａＭ、１０ａＭ、１ａＭ、もしくは０．１ａＭ未満、または約１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、１００ａＭ、１０ａＭ、１ａＭ、もしくは０．１ａＭ未満の量の核酸標的を検出することができる。ある特定の態様では、方法は、試験試料中の少なくとも０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭ、または少なくとも約０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭの量の核酸標的を検出することができる。また、ある特定の態様では、方法は、試験試料中の０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、もしくは１００ｆＭのうちのいずれか、または約０．１ａＭ、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、もしくは１００ｆＭのうちのいずれかと、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭのうちのいずれか、または約１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭ、もしくは１ｐＭのうちのいずれかとの間の量の核酸標的を検出することができる。

【0045】

ある特定の態様では、方法は、試験試料及び／または生体試料における核酸標的分子の量について定量的である。

【0046】

本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の方法のいずれかで核酸標的分子を検出する際に使用するためのプローブの設計に描かれる。

【0047】

ある特定の態様では、プローブはＤＮＡである。ある特定の態様では、ＤＮＡ骨格は修飾される。例えば、ある特定の態様では、核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つは、２’－ＯＭｅ－デオキシリボースである。例えば、核酸骨格内の糖の１、２、３、４、５以上、または５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％以上、または１００％が、２’－ＯＭｅ－デオキシリボースである。

【0048】

ある特定の態様では、プローブはＲＮＡである。ある特定の態様では、ＲＮＡ骨格は修飾される。例えば、ある特定の態様では、核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つは、２’－ＯＭｅ－リボースである。例えば、核酸骨格内の糖の１、２、３、４、５以上、または５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％以上、または１００％が、２’－ＯＭｅ－リボースである。

【0049】

オスミル化プローブの長さは、核酸標的分子の長さだけでなく、合成の容易さ及びコスト、生じるオスミル化の量、ならびにハイブリダイゼーション（例えば、より長いプローブは、例えば、非常に短いプローブよりも、標的に対してより大きな特異性及びより相補的な塩基対合を有することができる）などの考慮事項のために調整することができる。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３５、４０、５０、６０、または７５のいずれか～約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３５、４０、５０、６０、７５、または１００のいずれかの長さを有する。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、約１２～５０ヌクレオチドの長さを有する。標的核酸分子の検出は、オスミル化プローブとのハイブリッドプローブ／標的複合体を形成することによって達成されるため、及びナノ細孔を通したプローブのトランスロケーションがその一本鎖形態であるため、ある特定の態様では、プローブがそれ自体、特に標的との相補性領域で自己ハイブリダイズしないことが好ましい。したがって、ある特定の態様では、核酸標的分子の配列に少なくとも部分的に相補的であるプローブの部分は、３ヌクレオチド以上の連続した自己相補的配列を欠く。ある特定の態様では、核酸標的分子の配列に少なくとも部分的に相補的であるプローブの部分は、不定形である。ある特定の態様では、核酸標的分子の配列に少なくとも部分的に相補的であるプローブの部分は、自己ハイブリダイズしない。

【0050】

ある特定の態様では、オスミル化一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ分子は、置換または非置換の四酸化オスミウム（ＯｓＯ_４）－２，２’－ビピリジン基（ＯｓＢｐ基）に共有結合された少なくとも１つのピリミジン残基を含む。ある特定の態様では、少なくとも１つのオスミル化ピリミジン残基は、チミジン残基（Ｔ）である。オスミル化の量（オスミル化ピリミジンの数）は、プローブがどのようにナノ細孔を通り抜けるか、したがって、それが事象としてどのように検出され得るか、及びそれがナノ細孔を通り抜ける非オスミル化一本鎖核酸とどのように区別され得るかに影響することが発見されている。ある特定の実施形態では、オスミル化プローブは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化ピリミジン残基を含む。ある特定の実施形態では、オスミル化プローブは、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化ピリミジン残基を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、ある特定の方法は、好ましくは、他のピリミジンよりもチミジン残基（Ｔ）をオスミル化し、したがって、オリゴヌクレオチドプローブをオスミル化するためのさらにより繊細なアプローチを可能にする。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含む。プローブ上のオスミル化残基の量／数に加えて、互いに対するオスミル化残基の位置は、プローブがどのようにナノ細孔を通り抜けるかにも影響を及ぼし得る。１つの残基上のＯｓＢｐ基は、隣接する残基上のＯｓＢｐ基の移動の自由度を妨げる可能性があり、したがって、プローブがＯｓＢｐ基が付着した状態でナノ細孔をどの程度容易に通り抜けることができるかを妨げる可能性がある。３つの隣接する残基は、中間残基の移動をさらに制限する。したがって、ある特定の態様では、オスミル化プローブは、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含む。さらに、オリゴヌクレオチドプローブの末端へのデオキシアデノシン（ｄＡ）またはアデノシン（Ａ）残基の付加は、ナノ細孔の通り抜けを助けることができる。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端または３’末端に少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）を含むか、またはそれらを含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの３’末端に少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）を含むか、またはそれを含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端に少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアデノシン残基（ｄＡまたはＡ）を含むか、またはそれを含む。ある特定の態様では、当該５’末端または３’末端アデノシン残基（ｄＡまたはＡ）のうちの１つ以上は、核酸標的分子にハイブリダイズしない。

【0051】

残基のオスミル化、特に核酸標的分子に相補的または少なくとも部分的に相補的であるプローブの部分内でのオスミル化は、核酸標的分子とのハイブリダイゼーションを妨げる可能性がある。これを回避及び／またはハイブリダイゼーションを強化するために、オスミル化チミジン残基などのオスミル化ピリミジンを、オリゴヌクレオチドプローブ配列の非相補性領域（例えば、５’末端または３’末端）に位置付けること、及び／または核酸標的に相補的なプローブの領域内のチミジン残基を他のピリミジンと置き換えること、及びある特定の反応条件下で、チミジン残基が他のピリミジンよりも優先的にオスミル化され得るという事実を利用することが有用であり得る。

【0052】

ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端にも３’末端にも位置しない２つ以上の隣接するオスミル化ピリミジン残基を含まない。また、ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端にも３’末端にも位置しない２つ以上の隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含まない。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’または３’末端に位置する、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’または３’末端に位置する２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化ピリミジン残基を含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端または３’末端に位置する、少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含む。ある特定の態様では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端または３’末端に位置する２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含む。ある特定の態様では、当該５’末端または３’末端の隣接するピリミジン残基のうちの１つ以上は、核酸標的分子にハイブリダイズしない。ある特定の態様では、当該５’末端及び３’末端の隣接するピリミジン残基のいずれも、核酸標的分子にハイブリダイズしない。前述の態様のうちのある特定の態様では、隣接するオスミル化ピリミジン／チミジン残基は、プローブの５’末端に位置する。前述の態様のうちのある特定の態様では、隣接するオスミル化ピリミジン／チミジン残基は、プローブの３’末端に位置する。

【0053】

本明細書に開示されるように、ある特定の態様では、チミジン残基（Ｔ）は、他のピリミジンよりも優先的にオスミル化され得る。したがって、ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプローブ分子中のチミジン残基（Ｔ）の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化され、ある特定の態様では、チミジン（Ｔ）以外のプローブ中に存在するピリミジンの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がオスミル化されていない。ＤＮＡ残基チミジン（Ｔ）及びＲＮＡ残基ウリジン（Ｕ）は両方とも、アデノシン（Ａ）に相補的である。ある特定の態様では、プローブはＤＮＡであるが、５’末端または３’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、プローブ配列中の少なくとも１つのチミジン残基（Ｔ）は、ウリジン（Ｕ）またはデオキシウリジン（ｄＵ）または２’－ＯＭｅ－ウリジン（ｍＵ）残基に置き換えられている。ある特定の態様では、５’末端または３’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、プローブ配列中のチミジン（Ｔ）残基の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、ウリジン残基（Ｕ、ｄＵ、またはｍＵ）に置き換えられている。結果として、チミジン（Ｔ）がウリジン（Ｕ）で置換されることにより、相補的核酸標的分子にハイブリダイズするが、プローブの３’末端または５’末端に隣接するオスミル化チミジンを含むプローブの領域に、任意のオスミル化チミジン残基（Ｔ）をあまり含まないか、または含まないオリゴヌクレオチドプローブが得られる。

【0054】

本開示の方法で使用するためのオスミル化オリゴヌクレオチドプローブの設計に組み込むことができる特徴の多くの組み合わせが存在する。１つの代表的な設計では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端に位置する少なくとも２つ、３つ、または４つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含むか、またはそれを含み、プローブはＤＮＡであるが、５’末端に位置する隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、プローブ配列中のチミジン残基（Ｔ）は、ウリジン残基（Ｕ、ｄＵ、またはｍＵ）に置き換えられており、チミジン（Ｔ）以外の、プローブ中に存在するピリミジンの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、オスミル化されていない。さらに、ある特定の態様では、核酸骨格内の糖のうちの少なくとも１つは、２’－ＯＭｅ－デオキシリボースである。別の代表的な設計では、オスミル化プローブは、プローブの５’末端に位置する３つの隣接するオスミル化チミジン残基（Ｔ）を含み、プローブはＤＮＡであるが、５’末端に位置する３つの隣接するチミジン残基（Ｔ）以外の、プローブ配列中のチミジン残基（Ｔ）は、ウリジン残基（Ｕ、ｄＵ、またはｍＵ）に置き換えられており、チミジン（Ｔ）以外の、プローブ中に存在するすべてのピリミジンは、オスミル化されていない。さらに、ある特定の態様では、核酸骨格内の糖のうちの一部またはすべては、２’－ＯＭｅ－デオキシリボースである。

【0055】

本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ある特定の態様では、オスミル化プローブは、置換または非置換の２，２’－ビピリジン及びＯｓＯ_４（オスミル化試薬）を含む水溶液をオリゴヌクレオチドと反応させて、２，２’－ビピリジン－ＯｓＯ_４コンジュゲートプローブを形成することによって調製することができる。ある特定の態様では、コンジュゲートプローブは、過剰なオスミル化試薬から精製される。ある特定の態様では、溶液中の２，２’－ビピリジン／ＯｓＯ_４の比は、等モルまたはほぼ等モルである。例えば、ある特定の態様では、溶液中の２，２’－ビピリジン／ＯｓＯ_４の比は、約０．８０／１．０、０．８５／１．０、０．９０／１．０、０．９５／１．０、０．９７／１．０、０．９８／１．０、０．９９／１．０、１．０／１．０、１．０／０．９９、１．０／０．９８、１．０／０．９７、１．０／０．９５、１．０／０．９０、１．０／０．８５、または１．０／０．８０である。オスミル化プローブを調製する代替方法が存在し、想定される。例えば、ある特定の態様では、オスミル化プローブは、（ｄＴ（ＯｓＢｐ））_ｎオリゴの、プローブの５’末端または３’末端へのライゲーションによって調製され、ここで、ｎは、２、３、または４である。

【0056】

本明細書において、本開示の方法を行うための試薬を含むキットが提供される。ある特定の態様では、キットは、本開示のオスミル化プローブと、プローブにハイブリダイズすることができる対照核酸標的分子とを含む。ある特定の態様では、対照核酸標的は、ｃｔＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、断片化コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡの核酸配列を含む。ある特定の態様では、非コードＲＮＡは、約３００塩基未満の長さである。

【0057】

また、本明細書において、ナノ細孔デバイスを用いた核酸標的分子の検出のための本開示のプローブの使用も提供され、核酸標的分子は、任意選択で、ｃｔＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、断片化コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡである。ある特定の態様では、非コードＲＮＡは、約３００塩基未満の長さである。

【実施例】

【0058】

材料及び方法
オリゴ及び他の試薬
カスタムメイドのＲＮＡオリゴを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｇｒｏｕｐ）から購入した。カスタムメイドのデオキシオリゴを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。それらのオスミル化誘導体の配列及びＵＶ／Ｖｉｓ特性を表１に列挙する。オリゴの純度は、ＨＰＬＣによって試験され、典型的には、＞８５％であることが見出された。オリゴは、典型的には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの、ＤＥＰＣ処理されていない、Ａｍｂｉｏｎヌクレアーゼを含まない水で１００または２００μＭのストック溶液に希釈し、－２０℃で保存した。インタクトなオリゴ及びオスミル化オリゴの両方の分析からのＨＰＬＣプロファイルは、本明細書の他の箇所に含まれる。緩衝液ＤＮａｓｅを含まない及びＲＮＡｓｅを含まないＴＲＩＳ．ＨＣｌ１．０Ｍ ｐＨ８．０ ＵｌｔｒａｐｕｒｅをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ＨＰＬＣ移動相を調製するために使用した。ＮａＣｌ結晶ＡＣＳ ｍｉｎ ９９．０％を、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから得た。ＨＰＬＣ移動相の調製には、Ａｌｈａｍｂｒａからの蒸留水を使用した。４％四酸化オスミウム水溶液（各２ｍＬのアンプル中０．１５７５ＭのＯｓＯ_４）を、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。２，２’－ビピリジン９９＋％（ｂｉｐｙ）を、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ヒト雄ＡＢ血漿由来のヒト血清及びＮａＯＨ １Ｎバイオ試薬を、Ｓｉｇｍａから購入した。ｓｓ Ｍ１３ｍｐ１８、プライマーＭ１３（ｆｗｄ６０９７）、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１、及びＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（３’～５エキソ）（Ｍ０２１２）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）から厚意で提供された。

【0059】

本開示のプローブを限定するものではないが、費用及び製品品質の考慮事項は、ほとんどの例示的な実験のためのプローブとして、ＲＮＡオリゴよりもＤＮＡを選択することをもたらした。これらの実験は、プローブの設計を最適化して一般的な適用性を実現し、利用可能なナノ細孔システム（例えば、ＯＮＴ／ＣｓＧｇナノ細孔）によって適切に検出できるようにすることを中心に展開した。ある特定の態様では、一桁のアトモルレベルでｍｉＲＮＡ標的の同定に成功したプローブは、核酸標的分子に相補的または少なくとも部分的に相補的な配列、配列内のＴを置き換える２’－ＯＭｅＵ（ｍＵ）、５’末端に３つの追加の隣接するＴ残基、及び３’末端に３つのｄＡ残基を有する。オリゴをオスミル化して、分子当たり４～５つのＯｓＢｐタグを付加し、それらのうちの３つが５’末端を占め、他の１つまたは２つが配列内でランダムに割り当てられる。プローブの一方の末端に重度の混雑があるため、この例示的なプローブのトランスロケーション及び検出には、－２１０±１０ｍＶの範囲の印加電圧が必要であった。この特徴は、－２１０ｍＶで診断実験を行う前に、－１８０ｍＶでの非標的材料の枯渇を可能にするため、有利であった。プローブはまた、異なるナノ細孔プロファイルを示すプローブ設計を使用するときに多重化され得る。１５％ヒト血清における予備実験は、プローブ及び得られるハイブリッドがそのような培地中で安定であることを示唆し、ナノ細孔プラットフォームを有するＯｓＢｐを使用して体液試料から短いＤＮＡ及びＲＮＡを同定するための実現可能性を示す。

【0060】

実施例１
（ピリミジン）ＯｓＢｐは発色団である
核酸の選択的標識は、品質管理のためのアッセイを必要とする。ＯｓＢｐのＣ５－Ｃ６ Ｐｙ二重結合への付加及びＰｙ（ＯｓＢｐ）の形成により、３００～３２０ｎｍの波長範囲で新しい発色団が作成され（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２））、核酸はわずかな吸光度を示す。この観察は、デオキシオリゴトレーニングセットを使用して利用され、オスミル化の程度は、次の式を使用して測定され得ることを示した：Ｒ（３１２／２７２）＝２×（オスミル化ピリミジンの数／ヌクレオチドの総ｎｔ）（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２））。値Ｒ（３１２／２７２）は、２７２ｎｍで観察されたピーク吸光度に対する３１２ｎｍで観察されたピーク吸光度の比である（ピーク形状は、鋭い、または幅広い、または複数のピークであり得る）（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））。効果を最大化し、異なるピリミジンによる寄与を均等化するために、波長３１２ｎｍ及び２７２ｎｍを選択した（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））。２７２ｎｍでの吸光度は、インタクトな核酸またはオスミル化核酸のいずれかについて、実質的に２６０ｎｍの吸光度の約７５％である。３１２ｎｍでの吸光度の代わりに比Ｒを使用することで、測定を正規化し、器具サンプリングの変動を最小限に抑える。

【0061】

オリゴトレーニングセットを用いて実験することによって推定されるように、観察された値Ｒ（３１２／２７２）＝２×（ピリミジンの数／ヌクレオチド総数）の場合、オスミル化は、実質的に１００％完了し、すべてのピリミジンは、１つのＯｓＢｐ部分を担持する（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））。観察されたＲ（３１２／２７２）＜２×（ピリミジンの数／ヌクレオチド総数）の場合、オスミル化は部分的であり、オスミル化ピリミジンまたはＯｓＢｐ部分の数は、同じ方程式に基づいて計算され得る（表１を参照）。部分的オスミル化では、方程式から得られる数は、平均して、ＯｓＢｐ部分を指す。分子は、整数数のＯｓＢｐ部分を担持し、したがって、いくつかの分子は、より少ない量を有し、いくつかの分子は、算出値を超える値が統計的に偏りのない様式で分布している。オスミル化はランダムに起こるが、ピリミジンに対するＯｓＢｐの相対反応性に依存することが示されている。オスミル化に対する相対反応性は、デオキシリボオリゴＴ／ｄＣ＝２８、ｄＵ／ｄＣ＝３．７５、したがってＴ／ｄＵ＝７．５（Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，（２０１６））を使用し、かつリボオリゴＵ／Ｃ＝４．７及び５－ＭｅＵ／Ｃ＝４４を使用して、水中で２６℃での動力学的測定によって決定され、したがって、５－ＭｅＵ／Ｕ＝９．３であり、５－ＭｅＵは、Ｔと同一の核酸塩基を担持する（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６））。Ｔに対するＯｓＢｐの反応性が著しく高いため、ｄＵまたはＵ及びｄＣまたはＣと比較して、条件は、すべてのＴを実質的に１００％オスミル化することが見出され、一方、いくつかのｄＵ及び非常に少ないｄＣがオスミル化される（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２））。この劇的に高い反応性は、プローブの５’末端に３つのＴを付加し、配列中のＴをｄＵまたはｍＵに置き換え、以下に詳述するように製造プロセスを最適化することによって利用された。

【0062】

実施例２
ＯｓＢｐ核酸の製造
ＯｓＢｐ試薬は、２０ｍＬのシンチレーションバイアルで１５．７ｍＭのｂｉｐｙ（４９．２ｍｇ）当量を量り、１８ｍＬの水を添加し、ｂｉｐｙが溶解するまで室温で撹拌し、続いてアンプルに供給された２ｍＬの４％ＯｓＯ_４溶液の全含有量を移すことによって調製した。ＯｓＯ_４（プロトコルａ、ｂ、ｃ、及びｄ）の添加前に水中でｂｉｐｙを溶解すると、ＯｓＯ_４（プロトコルｏ）の添加後にｂｉｐｙを溶解することと比較して、より一貫した強力な調製がもたらされる。転送は、安全フード内でガラスピペットを使用して行った（ＭＳＤＳ及び情報は、ＵＣＬＡ化学学部への次のリンクから入手される。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ｓａｆｅｔｙ／ｓｏｐ／ＳＯＰ＿Ｏｓｍｉｕｍ＿Ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ．ｐｄｆを参照）。得られた溶液は、水性２０ｍＬの１５．７５ｍＭ ＯｓＢｐ（０．４％）ストック溶液（ＯｓＯ_４及びｂｉｐｙ中の等モル）である。ＯｓＢｐストック溶液の濃度は、水中のｂｉｐｙの溶解度によって制限され、複合体が低い会合定数を有するため、ＯｓＯ_４を添加してもそれを増加させない。ＯｓＢｐ複合体は、ＣＥ（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２））によって測定されるように、合計のおおよそ５％を表す。この調製及びＯｓＢｐを使用した任意の他の作業は、換気の良い場所のストッパー付きガラス製バイアル中で実施されるように注意する必要がある。ＯｓＯ_４及び／またはＯｓＢｐの残留溶液をトウモロコシ油と混合して、未反応のＯｓＯ_４を中和し、特定の地域の規制に基づいて適切に廃棄することができる（ＭＳＤＳ及び情報は、ＵＣＬＡ化学学部への次のリンクから入手される。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ｓａｆｅｔｙ／ｓｏｐ／ＳＯＰ＿Ｏｓｍｉｕｍ＿Ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ．ｐｄｆを参照）。調製したばかりのＯｓＢｐストック溶液をＨＰＬＣバイアルに分注し、－２０℃で保管した。各バイアルは、４℃で保管され、効力を失うことなく１ヶ月間使用され得る。典型的なピペット先端は、ＯｓＢｐ標識された核酸の製造に使用され得る。ＯｓＢｐストック溶液は、既知の反応を実行することによって、最初の使用前に検証する必要がある。オスミル化反応では、モノマー当量中の反応性ピリミジンよりも２０倍過剰のＯｓＢｐを使用して、擬似一次速度論を確実にし、プロトコルの使用の成功を保証した。製造条件、すなわち、ＯｓＢｐ濃度及び標識持続時間は、Ｔの存在、ならびにＴのみのすべてのピリミジン、またはＤＮＡ中のｄＣ及びｄＵのほんの一部、ならびにＲＮＡ中のＣ及びＵのほんの一部をオスミル化することの所望の結果に応じて著しく変化する。本研究の目的のため、Ｔ－オスミル化が必要な場合はプロトコルｂを推奨し、Ｕ及びＣの部分的オスミル化が必要な場合はプロトコルｃまたはプロトコルｄを推奨する。これらの選択は、表１に特定されるように、追加のプロトコル（ｏ及びａ）を試験することによって促進された。オスミル化反応のクエンチングは、精製時に発生する。過剰なＯｓＢｐからの精製は、スピンカラム（ＴｒｉｍＧｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＴＣ－１００ＦＣ）を製造元の取扱説明書に従って行った。簡単に言えば、スピンカラムに製造元の独自の溶液を充填し、４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、得られた溶液及び微量遠心管を廃棄する。次いで、４０～１２０μＬのオスミル化反応混合物をスピンカラムに移し、きれいな微量遠心管を使用して４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離する。遠心した溶液は、精製されたオスミル化オリゴである。この精製方法は、試料の体積／濃度を保持し、オリゴの１００％近くの回収を達成する。

【0063】

チミジン（Ｔ）－オスミル化の推奨プロトコルｂは、水中の２．６ｍＭ ＯｓＢｐで室温で３０±２分間インキュベートすることである（ｂの下の表を参照）。ｄＴを担持しないプローブの部分的なＵ－及びＣ－オスミル化のための推奨プロトコルは、水中の３．９ｍＭ ＯｓＢｐで室温で３０±２分（ｃの下の表１を参照）または５．２ｍＭ ＯｓＢｐプロトコルで３０±２分（ｄの下の表１を参照）である。追加の２つのプロトコルを試験したが、これらはあまり最適でないことが判明した。ＯｓＯ_４添加前にｂｉｐｙを水に溶解せず、２．６ｍＭ ＯｓＢｐで４０分間のインキュベーション（ｏの下の表１を参照）を使用したプロトコル、及び２．６ｍＭ ＯｓＢｐで４５分間のインキュベーションを使用したプロトコル（ａの下の表１を参照）。２’－ＯＭｅ基の存在は、約５０％の２’－ＯＭｅ塩基を担持する１００ｎｔ ＲＮＡ及び１００ｎｔ ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）についての同等のオスミル化程度によって見られるように、オスミル化の程度に著しく影響を及ぼさない。オスミル化の程度は、図１４に見られるように、オリゴ中のＵの数によって影響され得る。これは、ｄＵに対するＯｓＢｐの反応性は、ｄＣに対する反応性と比較して３．７５倍高く、Ｕに対するＯｓＢｐの反応性は、Ｃに対する反応性と比較して４．７倍高いからである。なぜなら、オスミル化プロトコルがｄＵ（ＯｓＢｐ）の完了に至らないからであるか、またはｍＵ（ＯｓＢｐ）がｄＣ（ＯｓＢｐ）よりも動力学的に好ましく、Ｕ（ＯｓＢｐ）がＣ（ＯｓＢｐ）よりも好ましいからである。プロトコルｂでは、他のピリミジンのオスミル化は、Ｔ－オスミル化と比較してわずかであるが、プロトコルｃでは、Ｕ、ｄＵ、ｍＵ及びｄＣに対するオスミル化の程度は測定可能である。図１４は、ＯｓＢｐ部分の数と、２２ｎｔ～１００ｎｔのオリゴにまたがるオリゴ中に存在するＵの数との間の線形相関を示差する。グラフの傾斜＝０．４３を使用して、シーケンス中のＵの数に基づいて、任意のオリゴのプロトコルｃでのオスミル化の程度を推定することができる。

【0064】

１２０μＬのガラスインサートを取り付けた２ｍＬのＨＰＬＣバイアルを使用して、製造反応を行った。これらのインサートから反応生成物を除去し、それを精製スピンカラムに移すには、長くて狭い２０μＬのピペット先端が必要である。オスミル化核酸は、対応する核酸と同様に安定であり、ＯｓＢｐ標識は、非反応性である。それらは、１．５ｍＬの微量遠心管中で、－２０℃で長年にわたり保管することができる。２．６、３．９及び５．２ｍＭの濃度は、それぞれ、１５．７５ｍＭのＯｓＢｐストック溶液の１／６、１／４及び１／３希釈液に対応する。これら２つのプロトコルからの逸脱は、表に含まれ、プロトコルｏ及びａとして識別される。ｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）などの任意のＴを含まないプローブを用いてより高い程度のオスミル化を達成し、それを検出可能なプローブとするために、追加のプロトコル（ｄ）を使用した（図２１Ａの簡単な説明を参照）。

【0065】

実施例３
酵素伸長反応
ＤＮＡポリメラーゼがオスミル化プライマーを伸長する能力を、未修飾及びオスミル化オリゴヌクレオチドにアニールされたｓｓＭ１３ｍｐ１８を使用してインビトロで調べた。ｓｓＭ１３ｍｐ１８を４２ｎＭの濃度で、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中の０．４２μＭプライマーと混合した。試料を９０℃に３０秒間加熱し、０．１℃／秒で２５℃に冷却した。重合反応は、これらのアニールされた複合体（８．４ｎＭのｓｓＭ１３ｍｐ１８）、１．２５Ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１、各０．２５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰ、０．０２５ｍＭのα－［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ、ならびに７．７Ｕ／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（３’－５’エキソ－）を含有した（ＮＥＢ、Ｍ０２１２）。反応物を３７℃でインキュベートし、標識されたｄＣＭＰの組込みを、酸沈殿アッセイによってモニタリングした。時点は、５分、１０分、及び２０分で取った。

【0066】

図３Ａに見られるように、オリゴヌクレオチドが添加されなかった場合、またはオリゴヌクレオチドであるプライマーＭ１３ｒｅｖ（－４８）がｓｓＭ１３ｍｐ１８に相補的でなかった場合、組込みは注目されなかった。対照的に、ＤＮＡテンプレートにアニーリングすると予測されたほとんどのオリゴヌクレオチドは、オスミル化した場合でも、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡテンプレート上での約１ラウンドの複製に対応する最大の組込みで、堅牢な組込みをもたらした。Ｍ１３（ｆｗｄ６０９７）、ＢＪ２、ＢＪ３、及びＢＪ４について言及される組込みは、ＢＪ３及びＢＪ４内の内部単一塩基のミスマッチにもかかわらず、同等であった（表１の配列を参照）。ＢＪ２、ＢＪ３及びＢＪ４の全体的な同等のオスミル化レベルにもかかわらず、ＢＪ１の組込みレベルは、おそらく末端３’－Ｔ（ＯｓＢｐ）残基にＯｓＢｐが存在することに起因して、著しく低いことが注目された。ＢＪ１をＭ１３（ｆｗｄ６０９７）と混合した対照実験は、ＢＪ１との低い組込みの原因としての可溶性阻害剤を考慮に入れずに完全な組込みを示した（データ図示せず）。

【0067】

実施例４
ＨＰＬＣ法
オリゴ純度を評価するＨＰＬＣ法を開発し、ここでは、表１に列挙されたオリゴの純度を評価するために使用した。この方法を最適化し、混合物中の２つのオリゴ間のハイブリダイゼーションを評価するために使用した。この方法の検証は、ハイブリダイズすることが知られているインタクトなオリゴの１：１混合物を使用して実施した（図３Ｂ及び図１０Ａを参照）。分析は、サーモスタット付きオートサンプラーを使用して自動的に実施した。ＵＶ－ｖｉｓ領域２００～４５０ｎｍ内のダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を使用して、ＨＰＬＣピークを検出し、同定した。クロマトグラムを、２６０、２７２、及び３１２ｎｍで記録し、ここで選択的に報告した。試料をＲＮＡｓｅを含まない水で調製したが、緩衝液は調製しなかった。

【0068】

ＨＰＬＣ分析には、バイナリポンプを装備したＡｇｉｌｅｎｔ１１００／１２００ＬＣ ＨＰＬＣ、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）、１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙオートサンプラー／サーモスタット、及びデータ取得及び処理のためのＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアＲｅｖ．Ｂ．０４．０１ＳＰ１を使用した。試料分析には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｄｉｏｎｅｘ）からのＩＥＸ ＨＰＬＣカラムＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００を２×２５０ｍｍ構成で使用した。機器及びカラムの性能は、研究試料の分析前及び後に、毎回標準を使用して適格性を確認した。ＨＰＬＣ法は、ｐＨ８での水性ＯＮＴ緩衝液中おおよそ９０％の試料、及び３５℃でのカラムサーモスタットにおけるハイブリダイゼーションを評価するために開発された。このＨＰＬＣ法（ＨＰＬＣ法Ｂとして識別される）は、０．４５ｍＬ／分の流量を有するＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００カラム、移動相Ａ（ＭＰＡ）水性２５ｍＭ ＴＲＩＳ．ＨＣｌ ｐＨ８緩衝液、２５ｍＭ ＴＲＩＳ．ＨＣｌ ｐＨ８緩衝液中の移動相Ｂ（ＭＰＢ）水性１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０分で１０％ＭＰＢから５０％ＭＰＢへの勾配、ならびに洗浄及び初期条件、すなわち９０％ＭＰＡへの平衡のための追加の１０分を使用する。フローセルの温度を模倣するために、カラム温度を３５℃に設定した。１００ｎｔ ＲＮＡを含めるために、クロマトグラフィーをＨＰＬＣ法Ｃに修飾した。具体的には、勾配をより急勾配にし、２０分で１０％ＭＰＢから７５％ＭＰＢにし、他はすべてそのままにした。おおよそ中性のｐＨのために、長い１００ｎｔ ＲＮＡは、混合物に似た広いピークとして溶出する。これは、水性ｐＨ８が、先に報告されたように、長いＲＮＡの様々なコンフォメーションを変性させないからである（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９））。ＯＮＴ緩衝液は、このクロマトグラフィーにおいて空隙体積中で溶出し、試料の分析に干渉しないＵＶ－Ｖｉｓ成分を有する。試料注入量は、典型的には５μＬであり、１０μＬを超えなかった。ハイブリダイゼーション試験は、ＯＮＴ緩衝液中の試料または錯化を好む任意の他の培地と併せて使用することができる。オリゴ及びそれらのオスミル化誘導体のうちのいくつかを、ＨＰＬＣ法Ａとして特定された方法を使用して分析したが、これは、オリゴ純度分析（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９））に推奨されているが、ハイブリダイゼーションを試験するのには適していない。ＨＰＬＣ法Ａは、０．４５ｍＬ／分の流量を有するＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００カラム、及び３０℃のカラム温度を使用する。０．０１Ｎ ＮａＯＨを含む移動相Ａ（ＭＰＡ）水性ｐＨ１２．０±０．２、０．０１Ｎ ＮａＯＨを含むｐＨ１２．０±０．２中の移動相Ｂ（ＭＰＢ）水性１．５Ｍ ＮａＣｌ、１２分で２０％ＭＰＢから９５％ＭＰＢへの勾配、ならびに洗浄及び初期条件、すなわち８０％ＭＰＡへの平衡のための追加の８分。

【0069】

実施例５
ＭｉｎＩＯＮまたはＦｌｏｎｇｌｅ（ＯＮＴプラットフォーム）においてＣｓＧｇナノ細孔を用いた単一分子イオンチャネルコンダクタンス実験
ＯＮＴ指示に従って、必要に応じて、フローセルから気泡を除去するか、貯蔵溶液をＯＮＴフラッシュ緩衝液でフラッシュするか、試料を添加するか、またはフローセルを保管した。ＭｉｎＩＯＮ（７５μＬ試料）及びＦｌｏｎｇｌｅ（３０μＬ試料）の取扱説明書は、ＯＮＴウェブサイト上で見出されるプロトコルから入手する。Ｆｌｏｎｇｌｅフローセルにはアダプターが必要であるが、ＭｉｎＩＯＮフローセルと同じデバイスで動作する。ナノ細孔実験を実行するためのソフトウェアＭＩＮＫＮＯＷは、これらの実験に使用されるＭａｃＢｏｏｋ Ｐｒｏラップトップにダウンロードした。フローセルを試験し、実験を実行するために必要なすべての機能は、ＭＩＮＫＮＯＷソフトウェアツールを介して行われる。生データファイルをｆａｓｔ－５形式で取得し、次いでＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔソフトウェアによって分析した。実験用のｆａｓｔ－５ファイルのサイズは、フローセル及び実験期間に依存し、１．５～６ＧＢの間で変化する。Ｆａｓｔ－５ファイルは、実験が完了すると、ＭａｔＬａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓから）２Ｄ形式で直接視覚化することができる。ＭＩＮＫＮＯＷは、任意の選択したチャンネルを最大１０チャンネルまでリアルタイムで監視することができるため、ｉ－ｔ録画を見るために実験が行われるのを待つ必要はない。

【0070】

追加された試料は、タグ付けされていないオリゴ、オスミル化オリゴ、またはそれらの混合物のいずれかであった。濃度は、典型的には、ＯＮＴ緩衝液の８０％以上において１０μＭ以下のオリゴであった。ライブラリは調製されず、処理酵素も添加されなかったため、ここで報告されたすべてのトランスロケーションは、非支援電圧駆動型である。実験は１．５時間以上続かなかったが、同じ実験を停止し、後で、または新しい試料を追加せずに翌日に再開することによって延長することができた。１日当たり４時間を超えて同じフローセルを実行することを回避し、フローセルをＯＮＴ緩衝液中で一時的に保管した。新しい試料を実行する前に、フローセルを緩衝液で洗浄することは、次の実験の直前に行った。ほとんどの場合、最初の実験は、フローセルのベースラインを評価するための「緩衝液試験」であった。フローセルのナノ細孔が我々の実験条件下で１５時間を超えて続かなかったため、緩衝液試験の持続時間は可能な限り短く保たれた。ＯＮＴプロトコルに従って、オープンポアイオン電流（Ｉ_ｏ）を一定に保つ試みにおいて、印加電圧を５作業時間ごとに約１０ｍＶ上昇させた。これが、互いに比較された実験が一見異なる印加電圧で行われる理由である。ＭｉｎＩＯＮフローセルは、２０００個以上のナノ細孔を有するが、同時に監視されるのは５１２個のみである。フローセルの最初のいくつかの実験中、ナノ細孔は不活性になるが、新しい作用ナノ細孔に置き換えられる。したがって、最初の４～５回の実験は、実質的に同じ数の細孔で行われる。その後、作用ナノ細孔の数は、毎時５～１０％減少する。作用ナノ細孔のほとんどは、最低から最高まで５倍以内で同等の数の事象を示したが、わずかな割合で逸脱し、著しく高い事象数を記録したことは注目に値する。これらの細孔は「外れ値」と呼ばれ、ナノ細孔のおおよそ２．５％が外れ値であると推定された。ここで提示されているデータの分析には、すべてのチャネルが含まれる。すべての実験の追加分析は、外れ値を除外することによって行われ、実際のカウントが異なるにもかかわらず、傾向及び結論は、ここで提示されたものと同一である。

【0071】

実施例６
事象検出アルゴリズム－ＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔ
ｙを、単一のナノ細孔から得られた典型的な時系列を表す実数値の順序付きシーケンスとする。我々は、ｙの領域を２つの状態のうちの１つに分類する：オープンチャネルからの電流、Ｉ_ｏ（ナノ細孔が占有されていない）、及びいくつかのトランスロケーション事象が起こっているときの残留電流、Ｉ_ｒ。ＯｓＢｐタグ付きオリゴヌクレオチドに対応する単一のトランスロケーション事象のハイスループット特徴付けのために、我々は、ユーザが定義した閾値に基づいて、目的のすべての事象のｙ内の開始位置及び終了位置を決定することができるセグメンテーションアルゴリズムを提案する。分析パイプラインは、次の３つの工程に分けられる。
１．ベースライン電流推定
２．潜在的な候補事象の特定
３．事象の特徴に基づく事象フィルタリング

【0072】

最初に、ベースラインＩ_ｏ、ｂ_ｏは、オープン電流の推定下限と上限｛ｏ_ｌｏｗ、ｏ_ｕｐ｝との間のシグナル値の中央値を取ることによって確立する：ｂ_ｏ＝ｍｅｄ（｛ｉ：ｉ∈ｙ，ｏ_ｌｏｗ＜ｉ＜ｏ_ｕｐ｝）。

【0073】

信号ノイズは、使用されるナノ細孔プラットフォームに依存するが、オスミウムタグ付けされたオリゴからのＩ_ｏ状態とＩ_ｒ状態との間の急激な遷移は、事象検出パイプラインのための単一の閾値ベースのパーサーの使用を可能にする。このアプローチを使用すると、事象は、それらがローカルベースラインレベルから離れた設定閾値を超えた場合に識別される。閾値は、パラメータｂ_ａｌｌによって定義され、可能な限り多くのトランスロケーション事象を捕捉するのに十分な低さでなければならない。デフォルトでは、ｂａｌｌ＝ｂ_ｏ・（１－（１０・σ_ｏ／ｂ_ｏ））であり、式中、σ_ｏは、開放電流の信号ノイズを表す。ノイズ定数σ_ｏは、ｙを小さなセグメント（使用されるセグメントサイズ、ｎ＝１００，０００）に分割し、開放電流信号値σ（｛ｉ：ｉ∈ｙ，ｏ_ｌｏｗ＜ｉ＜ｏ_ｕｐ｝）の全体的標準偏差を計算することによって決定される。追加として、σ_ｏ値は、不安定なベースラインを有する細孔またはブロックされた細孔を検出するための有用な品質管理メトリックを提供する。

【0074】

最後に、有効なトランスロケーション事象の認定のために、２つのフィルタリング条件を識別された事象に適用した。フィルターは、パラメータ｛ｔ_ｍｉｎ，ｔ_ｍａｘ｝によって定義される最小及び最大事象長、ならびに最小残留電流の範囲｛ｂ_ｍｉｎ，ｂ_ｍａｘ｝に対応し、ｂ_ｏに関する比率として表される。事象長の閾値｛ｔ_ｍｉｎ，ｔ_ｍａｘ｝は、トランスロケーションの速度を監視するように調整することができるが、｛ｂ_ｍｉｎ，ｂ_ｍａｘ｝は、ＯｓＢｐタグ付き及びタグなしオリゴ種の分離を可能にする。τ_１及びτ_２は、ｙ内の任意の所与の事象の開始インデックス及び終了インデックスを表す。ｙ_{τ１：τ２}が潜在的なＯｓＢｐトランスロケーション事象として分類されるためには、以下の条件の両方が保持されなければならない。

事象検出パイプラインは、Ｐｙｔｈｏｎライブラリ、‘ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ’として利用可能である。クロスプラットフォームのグラフィカルユーザインターフェイスが含まれており、ＯＮＴバルクｆａｓｔ５ファイルからのトランスロケーション事象の直接レポートを可能にする（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ）。

【0075】

【表1】

【0076】

結果及び考察
この研究で使用された材料は、すべて最高純度の合成オリゴであり、表１に列挙されている。オスミル化プロトコルは、我々が開発した。インタクトな核酸及びオスミル化核酸を、検証されたＨＰＬＣ法（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９））によって社内でさらに特徴付けた。ナノ細孔実験は、フローセルのプライミング、試料の追加、電圧の選択、及び生のｉ－ｔトレースの取得方法に関する会社の指示に加えて、ＯＮＴデバイス及びＯＮＴが供給するフラッシュ緩衝液（ＯＮＴ緩衝液または緩衝液）を使用して実施した。試料ライブラリは調製されず、酵素補助は利用されなかった。特に断りのない限り、試料を９０～９５％ＯＮＴ緩衝液中で調製した。ここで報告されたナノ細孔実験は、３４～３５℃の範囲のファクトリープリセット、フローセル温度で実施された。すべてのチャネルの生のｉ－ｔトレース（ｆａｓｔ５ファイル）を捕捉し、ＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔソフトウェアを使用して分析した（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．，＆Ｋａｎｇ，Ａ．公共リポジトリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔにおけるＲＮＡ（ＯｓＢｐ）事象検出Ｐｙｔｈｏｎパッケージを参照、また段階的インストール手順については、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ．ｍｄを参照）。出力、ｔｓｖファイルは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して読み取る。これは、各チャネルのＩ_０値、ならびに選択された事象、及びＩ_ｒ／Ｉ_ｏが計算されるそれらのＩ_ｒ値を列挙する。また、各事象の開始時刻及び終了時刻をデータ時点で列挙する（図８－１、図８－２）。目的の事象を選択するために、ＯｓＢｐ＿ｄｅｔｅｃｔは、パラメータの手動設定を可能にする（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．，＆Ｋａｎｇ，Ａ．公共リポジトリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔにおけるＲＮＡ（ＯｓＢｐ）事象検出Ｐｙｔｈｏｎパッケージを参照、また段階的インストール手順については、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ．ｍｄを参照）。ここでは、滞留時間４≦τ≦３００データ時点または同等の１．３≦τ≦１００ｍｓ、及びわずかな残留イオン電流Ｉ_ｒ／Ｉ_ｏ≦０．５５の事象を選択した（図１Ｂ）。図２、図４、図５、図６、及び図７は、０．０５ｂｉｎを使用するＩ_ｒ／Ｉ_ｏの関数としての事象のカウント（カウントまたは事象として省略される）のヒストグラムを提示する。

【0077】

Ｆｌｏｎｇｌｅフローセルを使用したナノ細孔実験
図２は、Ｆｌｏｎｇｌｅフローセルを利用した結果を示す。図２Ａは、ハイブリッドを観察する最初の試みであった。ＭｉｎＩＯＮフローセルを用いた初期の研究から、Ｔ８、９個のピリミジン及び合計８個のＯｓＢｐタグを有する３２ｎｔ ＲＮＡ（表１の配列を参照）は、通り抜けるために高電圧を必要とし、複数のトランスロケーション事象を示し、

で最大カウントを示すイオン電流を重度に妨害することが知られていた。実験を繰り返すことは、ＭｉｎＩＯＮに関する以前の作業を実質的に複製した（Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９））。完全な補体ではないが、ｄ（ＣＴ）_１０は、Ｔ８と、８つのＧＣ対を含む２０ｎｔのうち１６を塩基対にすることができるため、ｄ（ＴＣ）_１０を使用してｄｓ複合体を形成した。プローブＴ８を用いた実験は、平均してチャネル当たり４００事象を示したが、プローブＴ８及びｄ（ＣＴ）_１０の１：１混合物を用いた実験は、いくつかのチャネルについてはチャネル当たり５０事象未満をもたらし、残りについては事象は報告されなかった（図９）。図２Ｂは、ｍｉＲＮＡ１２２の同定のための試験を示す（Ｌｉ，Ｘ－Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１７））。ここで使用されるプローブは、ｍｉＲＮＡ１２２の正確なデオキシ補体であるｄｍｉＲ１２２であり、４Ｔ（ＯｓＢｐ）を担持する（表１を参照）。プローブｄｍｉＲ１２２を有する試料は、単独で多数のカウントを示したが、このプローブとｍｉＲＮＡ１２２との近似等モル混合物を有する試料は、著しく少ないカウントを示した。ｍｉＲＮＡ２１（Ｔｈｕｍ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ｌａｉ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）、Ｆｕｌｃｉ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０２０））及びｍｉＲＮＡ１４０（Ｌｉ，Ｘ－Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１７））から構成される、ｍｉＲＮＡ負荷が４倍高い第３の試料もまた、プローブ試料と比較して少ないカウントを示した。後者は、ｍｉＲＮＡの複合体混合物における標的の同定が妥当であることを示唆する。これら及び他の実験は、図１Ｄに提示される概念の実現可能性を実証した。それらはまた、標的及びプローブの両方が、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得ることを明らかにし、その違いは、プローブが、オスミル化オリゴである一方で、標的は、オスミル化オリゴではないことである。更なる焦点は、ＲＮＡオリゴと比較してコストが低く、合成生成物の品質が高いため、ＤＮＡオリゴであるプローブに当てられた。

【0078】

標的とそのプローブとの間のハイブリダイゼーションを試験するための代替方法
オスミル化核酸とそれらのＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間のハイブリダイゼーションを試験するために、独立した手段を求めた。部分的にオスミル化されたテンプレートｓｓＭ１３ｍｐ１８を使用した未修飾プライマーの酵素ＤＮＡポリメラーゼ伸長は、ハイブリダイゼーションのための支援を得る最初の試みであったが、プライマーの伸長は検出できなかった（データ図示せず）。次いで、未修飾ｓｓＭ１３ｍｐ１８をテンプレートとして試験し、３０ｎｔ長さの相補的Ｔ（ＯｓＢｐ）プライマー、ＢＪ１、ＢＪ２、ＢＪ３、及びＢＪ４を使用した（表１及び図１１及び図１３を参照）。ＢＪ１は、３’末端でプライマーＭ１３ｆｏｒ（－２０）と同一の配列を担持し、５’末端で１３ｎｔ伸長される。ＢＪ２は、３’末端でプライマーＭ１３ｆｏｒ（－４１）と同一の配列を担持し、５’末端で６ｎｔ伸長される。ＢＪ３及びＢＪ４は、配列の中央における１つのミスマッチを除いて、ＢＪ２と同一の配列を有する。ＢＪ２、ＢＪ３、及びＢＪ４は、それぞれ６、５、及び７つのＴ（ＯｓＢｐ）塩基を担持していたが（表１を参照）、それらはすべて成功裏に伸長した（図３Ａ）ことから、Ｔ（ＯｓＢｐ）は、インタクトなｓｓＭ１３ｍｐ１８とプローブとの間の１：１のハイブリダイゼーションを禁止しなかったことが示唆される。対照的に、６つのＴ（ＯｓＢｐ）を有するＢＪ１は、おそらく３’末端にＴ（ＯｓＢｐ）塩基が存在し、酵素がそれにヌクレオチドを付加することができないことに起因して、伸長しなかった（図３Ａ）。ＢＪ１との伸長が依然として不在であることは、ハイブリダイゼーションの不在を必ずしも意味するものではない。

【0079】

これらの伸長実験は、ナノ細孔実験に使用されたものよりもはるかに低いと推定される塩濃度で行われ、それらはｓｓＭ１３ｍｐ１８に限定され、既知のプライマーと同一の配列を有するプローブの使用に限定された。ハイブリダイゼーション試験をｍｉＲＮＡ及び任意のＤＮＡ／ＲＮＡオリゴに拡張するために、我々は、本明細書の他の箇所に記載されるようなＨＰＬＣ法を開発した。このＨＰＬＣ法は、以下の修正を伴って、オリゴ純度を試験するために使用されるＨＰＬＣ法に基づいている。それは、（ｉ）試料溶媒としてのＯＮＴ緩衝液、及び（ｉｉ）３５℃のＨＰＬＣカラム温度を使用して、ＯＮＴ動作フローセルの温度を模倣する。ＨＰＬＣカラムパッキングはハイブリダイゼーションを妨げる可能性があり、したがって、すべてのＨＰＬＣベースの結果は純粋に示唆的であることに留意されたい。とは言え、ＨＰＬＣの結果とナノ細孔実験が互いに矛盾する例は観察されなかった。ハイブリダイゼーションを確認するには、３つの別個の試料のＨＰＬＣ分析が必要である。これら３つの試料は、（ｉ）プローブ、（ｉｉ）核酸標的分子、及び（ｉｉｉ）推定されたハイブリッドを含む２つの成分の１：１混合物を含む試料を含有する（図３Ｂ～３Ｄを参照）。ハイブリダイゼーションの不在は、２つの構成要素のＨＰＬＣプロファイルの「合計」と密接に重複する混合物試料のＨＰＬＣプロファイルと一致する（図３Ｃ）。ハイブリダイゼーションの証拠は、標的及びプローブのピークからよく分解され、典型的にはプローブまたは標的のいずれかより１～１．５分遅れて溶出するハイブリッドピークと一致する。加えて、プローブ及びハイブリッドピークは、ＯｓＢｐタグの存在により、３１２ｎｍで吸光度を示すが、標的ピークはそうではない。１：１混合物試料を、プローブが過剰になることを防止するために、わずかに過剰な標的を用いて意図的に調製した。このため、多くのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、ハイブリッド試料の分析は、ハイブリッドに起因する大きなピークに加えて、標的に起因するより小さなピークを含む。

【0080】

図３Ｂは、両方のオリゴが未修飾核酸である試料のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ここで、１：１混合物を有する試料のＨＰＬＣプロファイルは、上記の特徴に基づいて、強いハイブリダイゼーションと一致する。図３Ｄは、図３ＢのＨＰＬＣ分析の繰り返しであり、ＢＪ２は、現在オスミル化されており、それはプローブである。図３Ｄにおける１：１混合物の対応するＨＰＬＣプロファイルはまた、強いハイブリダイゼーションと一致する。同じＨＰＬＣ法は、ｍｉＲＮＡ２１及びプローブ２１ＥＸＴ（表１を参照）がハイブリダイズしないことを示した（図３Ｃ）。図３Ｃにおけるハイブリダイゼーションの不在は、プローブの配列内に存在する比較的多数のＯｓＢｐ部分（合計８ｄＴ、２１ｎｔ配列内に５ｄＴが見出される）に起因する。追加のハイブリダイゼーション試験により、プローブ上の多数のＯｓＢｐ部分の存在下でｄｓ複合体形成が禁止されるという仮説が確認された（図１０を参照）。分子中のＯｓＢｐ部分の数に加えて、実際の位置も重要である。ＢＪ１～４プローブで見られるように、比較的多数のＴ（ＯｓＢｐ）にもかかわらず、ハイブリダイゼーションは依然として強力である。これは、これらのタグが配列の小さな領域を占め、標的との二本鎖形成のために利用可能な２つのむしろ長い部分配列を残すためである可能性が最も高い。

【0081】

ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡオリゴ標的の存在下でプローブをサイレンシングする。
図２の実験を、５μＭ範囲のプローブ、標的、及びハイブリッド濃度を使用して実施した。ＭｉｎＩＯＮ及びＦｌｏｎｇｌｅフローセルの試料サイズは７５μＬ対３０μＬであるため、５μＭの濃度は、それぞれ、おおよそ０．３８対０．１５ｎｍｏｌｅの試料負荷に相当する。ＨＰＬＣ注入量は、典型的にはフローセル試料サイズと同じではないため、ナノ細孔実験の試料負荷は、ＨＰＬＣ分析の試料負荷と同じではないことに言及する価値がある。図４Ａは、５つのＴ（ＯｓＢｐ）を有するプローブＢＪ１及びその標的である相補的プライマーＭ１３ｆｏｒ（－２０）を使用した、上記のＨＰＬＣハイブリダイゼーション試験を示す。図４Ｂに示されるナノ細孔実験のために、プローブ及びハイブリッドの試料をそのまま使用した。我々は、３’末端におけるＴ（ＯｓＢｐ）塩基の存在に起因して、プローブＢＪ１が、ｓｓＭ１３ｍｐ１８をテンプレートとして使用して酵素的に伸長されなかったことに留意する。図４において、ハイブリダイゼーションは、プローブ試料で報告されたカウントと比較して、ハイブリッド試料について報告されたカウント数の大幅な減少によって示されるように、ＨＰＬＣ分析及びナノ細孔実験の両方によって文書化される。この効果は、（Ｉ_ｒ／Ｉ_ｏ）_ｍａｘに対して劇的であり、Ｉ_ｒ／Ｉ_ｏ範囲の残りの部分に対しては明確に検出可能である。

【0082】

印加電圧は重要なパラメータである
図４Ｂは、－１８０ｍＶの印加電圧でプローブＢＪ１を試験することにより、非常に低いカウントが示されることを示し、－１８０ｍＶでのプローブトランスロケーションが非効率であることを示唆する。新しい試料を添加せずに、電圧を－２２０ｍＶに上昇させると、－１８０ｍＶで得られたカウントと比較して劇的に多くのカウントが得られた。図１１は、プローブＢＪ２及びＢＪ４がＢＪ１と同じパターンに従うことを示す。この観察は、プローブ内の隣接するｄＴ（ＯｓＢｐ）の存在に起因し、ｄＴ（ＯｓＢｐ）が、すべての試験されたピリミジンの中で、最も低く観察された（Ｉ_ｒ／Ｉ_ｏ）_ｍａｘを示すという概念は、重度の混雑の強い指標である。隣接するＯｓＢｐ部分の重度の混雑は、ＲＮＡ及びＭｉｎＩＯＮ／ＣｓＧｇ（Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９））、ならびにＤＮＡ及びα－溶血素ナノ細孔（Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ（２０１６））を使用する初期の研究から結論された。プローブはデオキシオリゴであり、配列にいくつかのＴ塩基を含むため、立体障害が複合される。標識された核酸は、印加電圧降下によって導かれたＣｓＧｇ細孔に近づくことができるが、細孔を通り抜けるためには、一定の最小電圧が必要である。複数の実験により、独自のＣｓＧｇナノ細孔を介した我々のプローブの大部分の効率的なトランスロケーションのための印加電圧は、－２１０±１０ｍＶの範囲にあることが示唆された。プローブによる観察とは対照的に、インタクトなＤＮＡオリゴは、わずかなカウントを示し（Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６）、Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９））、標的／未修飾のｍｉＲＮＡは、漸増する電圧の関数としてわずかな減少傾向で測定可能なカウントを示す（図１３）。これは、デバイスの取得速度が１ｍｓ当たり３データポイントで一定のままであるため、電圧の増加により、より高速なトランスロケーションがもたらされ、また順に、より高速なトランスロケーションにより事象の不在がもたらされるという期待と一致している。天然ＲＮＡを有するカウントを検出可能にするために、総負荷は、最高のプローブ負荷よりも４倍高かった。我々の経験では、－１８０ｍＶと比較して－２２０ｍＶで長く持続しなかったタンパク質細孔を保護するために、－２２０ｍＶより高い電圧での実験は実施しなかった。我々のプローブが実質的に－１８０ｍＶでＣｓＧｇ細孔を通り抜けないという観察は、診断試験の利点である。これは、－１８０ｍＶで過剰な非標的核酸から試料を枯渇させる機会を提供し、次いで、新しい試料を添加することなく、複雑でないプローブの存在を検出する、または検出しないために－２２０ｍＶに電圧を上昇させる。

【0083】

高度に検出可能なプローブの一般的な設計
配列の中央にＴ（ＯｓＢｐ）部分が存在することは、多くの潜在的なｃｔＤＮＡ、またはｍｉＲＮＡ標的によって共有される特徴ではない。したがって、高度なプローブは、配列中のすべてのｄＴをｄＵに置き換え、一部またはすべての塩基を２’－ＯＭｅとして修飾し、５’末端に３つの隣接するｄＴ（ＯｓＢｐ）を付加し、場合によっては３’末端に３つの追加のｄＡを付加することによって設計された。３’末端におけるｄＡの付加は、細孔侵入を容易にするために一般的に使用される（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｒａｎｄｉｎ，Ｅ．，Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｄ．＆Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．（１９９６）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｔ．Ｚ．，Ｇｕｎｄｌａｃｈ，Ｊ．Ｈ．＆Ｔｒｏｌｌ，Ｍ．（２００７）、Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｈｅｒｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｄ．，Ｊａｐｒｕｎｇ，Ｄ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．（２０１０））。ＤＮＡ塩基を２’－ＯＭｅ塩基に置き換えることは、より強いハイブリダイゼーションをもたらすことが報告されている（Ｍａｊｌｅｓｓｉ，Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ Ｎ．Ｃ．＆Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｍ．（１９９８））。すべてのｄＴをｄＵに置き換えることは、配列内のＯｓＢｐの存在が最小限であることを保証する。これにより、配列内のＯｓＢｐ部分の可能な最小数がもたらされ、標的との最も妨害されないハイブリダイゼーションがもたらされる。ＢＪ１～４プローブの初期の実験によって示されるように、５’末端に３つの隣接するｄＴを付加すると、－１８０ｍＶの印加電圧ではプローブを検出できず、－２２０ｍＶの印加電圧では高度に検出可能になる。次いで、このプローブ設計は、超低標的負荷を有するナノ細孔実験において利用された。

【0084】

ＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）は、上記の特徴を有するように設計されたプローブである（表１の配列）。プローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）と相補的プライマーＭ１３ｆｏｒ（－４１）との間のハイブリダイゼーションを、５μＭの濃度範囲でＨＰＬＣによって試験した（図４Ｃ）。図４Ｃは、プローブ及びハイブリッド試料のＨＰＬＣ分析を提示する。ハイブリッド試料中の標的ピークは、プローブ上で約１０％過剰であるため、容易に識別される。２７２ｎｍ及び３１２ｎｍの両方の波長におけるＨＰＬＣプロファイルを示す。これらのプロファイルの綿密な検査は、ハイブリッドピークが、プローブにおける対応する寄与と比較して、３１２ｎｍでの寄与の約半分を有することを示す。これは、ハイブリッドの半分がプローブであり、半分が未修飾標的であるという予想と一致する。ＨＰＬＣによって試験された実際の試料をＯＮＴ緩衝液で希釈して、ナノ細孔によって試験された試料を生成した。この研究におけるこの希釈及びすべての希釈は、０．５ｍＬの微量遠心管中のＯＮＴ緩衝液を用いた連続した１：１０希釈によって行われた。プローブＢＪ２ ＴＡ（ＯＭｅ）を用いたナノ細孔実験は、ＨＰＬＣ試料と比較して１０００倍の希釈、すなわち、０．３８ｐｍｏｌｅのプローブ負荷で行った。ハイブリッドを用いた対応する実験は、３．７５ｐｍｏｌｅで、すなわち、１０倍高いハイブリッド負荷で実施した。高ハイブリッド負荷は、特に－２２０ｍＶ印加電圧の影響下、実験パラメータ下でハイブリッドの安定性を試験するために選択された。ハイブリッド試料は、プローブよりも１０倍も濃縮されているにもかかわらず、ハイブリッド実験から得られたカウントは、プローブ実験から得られたカウントと比較して明らかに少なく、ハイブリッド解離は、試験条件下では有意ではないことを示唆している（図４Ｄ）。

【0085】

ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡオリゴ標的の存在下でプローブをサイレンシングする。開発作業中に、いくつかのプローブ設計を調査した。それらの設計のうちの２つを用いた実験を図５に示す。プローブ２ＸｄｍｉＲ１２２は、８つのＴ（ＯｓＢｐ）を有する４４ｎｔオリゴであり、２つの融合ｄｍｉＲ１２２からなる（表１の配列）。プローブｄｍｉＲ１２２は、－１９０ｍＶ（図２Ｂ）で多数のカウントを示したが、プローブ２ＸｄｍｉＲ１２２は、－２２０ｍＶ（図５Ａ）を必要とした。２ＸｄｍｉＲ１２２は、２６ｎｔの部分配列内に各々３ＯｓＢｐを有する２つの４ｎｔ基を組み込むため、より高い電圧は、細孔内の重度の混雑の結果である可能性が最も高い。ｍｉＲＮＡ１２２と２ＸｄｍｉＲ１２２との間の効率的なハイブリダイゼーションは、ＨＰＬＣ（図５Ｃ）によって示され、プローブ試料と比較したハイブリッド試料のカウントの大幅な低下によって見られるように、ナノ細孔によって確認された（図５Ｄ）。そのような融合配列設計の利点は、ｍｉＲＮＡ標的に加えて、より長いＲＮＡに同一の塩基配列が存在する場合を利用することにある。２ＸｄｍｉＲ１２２は、ｍｉＲＮＡ１２２との４４ｎｔのｄｓ複合体を形成することができるが、より長いＲＮＡとの２２ｎｔのｄｓ複合体のみを形成することができるため、融合２ＸｄｍｉＲ１２２のような設計のプローブを使用することは、長いＲＮＡ標的よりもｍｉＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションを好み得る。

【0086】

図５Ｂは、プローブ１２２ＥＸＴ（表１の配列）によって例示される別のプローブ設計を示す。プローブ１２２ＥＸＴは、５’末端に３つの隣接するＴを付加したｄｍｉＲ１２２の同一の配列を有する。このプローブは、－１８０ｍＶ（破線トレース）でのナノ細孔実験と比較して見られるように、多数のカウント（実線トレース）を示すために－２２０ｍＶを必要とする。１５％のヒト血清及び８５％のＯＮＴ緩衝液中で調製された試料中のプローブ１２２ＥＸＴを用いて実施されたナノ細孔実験は、９５％を超えるＯＮＴ緩衝液中で調製された試料と比較して、低減したカウントを示す。カウントの低減は、血清の存在によるイオン強度の低下、及び／またはフローセルの老化及び／または血清干渉に起因し得る。より低いカウントにもかかわらず、プローブ１２２ＥＸＴは、ヒト血清などの体液を含有する未知の試料中の妨害されていないプローブ検出を示す対照／緩衝液試験から容易に区別される。

【0087】

ｍｉＲＮＡ２１は多くの疾患の重要なバイオマーカーであるため（Ｔｈｕｍ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ｋａｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）、Ｆｕｌｃｉ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００７））、その同定を試験した。ｍｉＲＮＡ２１及びプローブｄｍｉＲ２１（図示せず）または２１ＥＸＴを用いたＨＰＬＣ試験は、ｍｉＲＮＡ２１との検出可能なハイブリダイゼーションを示さなかった（図１２）。ハイブリッドを形成することができないことは、６より多くのＴ（ＯｓＢｐ）部分の存在と、これらの部分が２２ｎｔの配列に広がっているという事実とに起因していた。高度なプローブ設計により、ｍｉＲＮＡ２１と効率的にハイブリダイズするプローブが得られた。プローブｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）は、ｍｉＲＮＡ２１に相補的な２２ｎｔのオリゴであり、ここですべての塩基は２’－ＯＭｅであり、ＴはｄＵで置き換えられ、オスミル化は、平均して、１分子当たり２．８５ＯｓＢｐ部分の付加をもたらした（オスミル化プロトコルｄ、表１を参照）。オスミル化生成物は、主に２つまたは３つのＯｓＢｐ部分を有する分子、及び異なる塩基でのＯｓＢｐ部分を含有する分子（ここではトポ異性体と称される）を含有する混合物である（Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１９）、Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２））。クロマトグラフィーは、１つ、２つまたは３つのＯｓＢｐ部分を担持する分子を解像し、多くの場合、トポ異性体も解像する（Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．（２０１６）。このため、プローブのＨＰＬＣプロファイルは、２つのタグを有する分子及び３つのタグを有する分子に起因する２つの別個のピークからなる（図６Ａ）。同様に、ハイブリッドのＨＰＬＣプロファイルは、複数のピークとして現れる（図６Ａ）。ＨＰＬＣはまた、ＲＮＡ（下記を参照）の安定性、及び１５％のヒト血清及び８５％のＯＮＴ緩衝液を含有する試料溶媒中のｍｉＲＮＡ２１とｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）のハイブリッドの安定性を試験するために使用された。図２６Ｂは、試験されたＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲＮＡ１４０及び１００ｎｔ ＲＮＡが両方とも、数分以内に分解されたが、ハイブリッドピークは、実質的に変化しないままであり、我々のプローブとそれらのＲＮＡ標的との間に形成されたハイブリッドが、ヒト血清における実験の期間中に安定であると予想されることを示唆している。

【0088】

ハイブリダイゼーションは、プローブ及びハイブリッド試料で観察された別個のＨＰＬＣプロファイルと一貫している（図６Ａ）。ｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）は、３つの隣接するＴ（ＯｓＢｐ）を含有しないため、－１８０ｍＶでの印加電圧は、細孔を介してこのプローブをねじ切るのに十分であった。０．７５ｎｍｏｌｅのプローブ試料では多くの事象が報告され、１．５ｎｍｏｌｅのハイブリッド試料では著しく少ない（図６Ｂ、実線トレースを破線トレースと比較する）。ハイブリッドでのカウントは、緩衝液（図示せず）で得られたカウントに匹敵するように見える。追加のナノ細孔実験は、同一のプローブ及びハイブリッド負荷を用いるが、他のＲＮＡ成分の存在下で実施した。これらの成分は、プローブと比較して合計１０倍高い負荷で、非標的核酸、ｍｉＲＮＡ１４０、及び１００ｎｔ ＲＮＡであった。過剰な非標的ＲＮＡの有無にかかわらず、プローブ試料のナノ細孔プロファイルは別個であり、過剰な材料及び／または老化したフローセルによる影響を示唆する。それでも、非標的ＲＮＡの存在下での２つの実験は、プローブ試料の多数のカウントをハイブリッド試料の少数のカウント（第２の破線、第１の破線（ハイブリッド）とほとんど区別できない）と比較することによって、標的の効率的な同定を示す。この区別は、複合体混合物中の非標的ｍｉＲＮＡ及びより長いＲＮＡの存在が、標的同定を妨げないことを示唆する。

【0089】

バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの重要性のため（Ｌｉ，Ｘ－Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）、Ｔｈｕｍ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ｌａｉ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）、Ｋａｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）、Ｆｕｌｃｉ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０２０））、任意の標的配列に広く適用可能であり、最適なトランスロケーション特性を有するプローブ設計を用いて、超低負荷で実験を実施した。それぞれ、ｍｉＲＮＡ１４０及びｍｉＲＮＡ２１を標的とするプローブ１４０ＥＸＴｍＵ及び２１ＥＸＴｍＵを選択した。これらのプローブは、それらの標的に相補的な配列を有し、その配列内のＴをｍＵで置き換え、５’末端に３つの追加の隣接するｄＴ、及び３’末端に２つまたは３つの追加のｄＡを有する。これらのオリゴは、検証された標識化プロセスを使用してオスミル化した。このプロセスでは、分子当たり平均して４～５つのＯｓＢｐタグが追加され、それらのうち３つが５’末端を占め、他の１つまたは２つが配列内でランダムに割り当てられる（表１を参照）。プローブの一方の末端に重度の混雑があるため、プローブの効率的なトランスロケーション及び検出（上記の考察に従う）には、－２１０±１０ｍＶの範囲の印加電圧が必要であった。図７Ａは、１４０ＥＸＴ（ｍＵ）による４７ｆｍｏｌｅレベルでの優れた感度での検出を示し、図７Ｂは、３．５ａｍｏｌｅプローブ負荷のさらに高い感度でのこのプローブの検出を示す。標的ｍｉＲＮＡ１４０の同定は、３．５ａｍｏｌｅでもハイブリッド負荷を有するハイブリッドとプローブを比較することによっても明らかである。図７Ｃは、プローブ２１ＥＸＴ（ｍＵ）とｍｉＲＮＡ２１との間のハイブリッド試料のＨＰＬＣプロファイルを示し、次いで、ナノ細孔実験のために３×１０^８倍希釈し、２．７ａｍｏｌｅレベルでハイブリッドを試験した（図７Ｄ）。この研究で試験した最低負荷である０．９ａｍｏｌｅレベル（図７Ｄ）でナノ細孔実験を実施するために、２１ＥＸＴ（ｍＵ）プローブ試料（ＨＰＬＣプロファイルは図示せず）を１×１０^９倍希釈した。ｍｉＲＮＡ２１の同定は、図７Ｄにおいて、プローブカウントとハイブリッドのカウントとの視覚的比較によって明らかである。１４０ＥＸＴ（ｍＵ）プローブ（上部、６，０００に達する）で観察されたカウントが、２１ＥＸＴ（ｍＵ）プローブ（下部、２４，０００に達する）で観察されたカウントと比較して少ない理由は、少なくとも部分的には、作用細孔の約３０％しか持たなかった老化したフローセルに起因する。プローブ濃度が既知の量であるため、ここでは特定のプローブのＯＮＴ／ＯｓＢｐプラットフォームからプローブカウントの比例性が得られるかどうかを試験しなかった。最も重要なことは、標的の同定が、対照／緩衝液実験のカウントに匹敵する、わずかな数のカウントを示すナノ細孔プロファイルに基づいていることである。すべてのプローブをナノ細孔によって試験した主な理由は、異なるプローブ設計を比較し、高い検出性と高感度を確認したかったからである。

【0090】

ＯＮＴ／ＯｓＢｐナノ細孔プラットフォームの可能性
上記の実験では、プローブ負荷は０．３８ｎｍｏｌｅ～０．９ａｍｏｌｅの範囲であり、実質的に９桁に及んでいる。この範囲では、プローブ検出のための証拠が提示され、標的を含有する試料と含有しない試料との間の明確な区別が示される。ハイブリッドのカウントと比較して、プローブ単独での事象のカウントが３倍高いとして、より低い検出可能性の限界が提案されている。事象のカウントとプローブ濃度との間の比例性は、実験の期間が１～３時間の範囲に残り、試料負荷変動を反映しないため、ここでは試験されなかった。我々の試験は、ハイブリッドを検出せず、したがって、ハイブリッド分子を測定しないため、標的の定量化は、既知のプローブ負荷に依存する。試験には、目標負荷の推定値が必要であり、最初の実験の結果に応じて、次の実験でプローブ負荷を５倍以下またはそれ以上変化させることができる。ある特定の態様では、標的定量は、約３０％の精度で達成され得ると推定される。いくつかの代表的なプローブ設計が探索され、任意のｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡオリゴ標的に実質的に一致することができる１つの設計が提案された。このタイプのプローブは、１４０ＥＸＴ（ｍＵ）及び２１ＥＸＴ（ｍＵ）として同定された例を用いて、ａｍｏｌｅ負荷レベルで高い感度を示した。特異性を試験する試みは行われなかった。類似の配列を有する１つの標的と別の標的との間の区別は、ケースバイケースで対処する必要がある。ここで開発したＨＰＬＣ法は、標的と暫定的なプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価することができ、類似の配列を有する２つの標的間のプローブハイブリダイゼーションの範囲及び暫定的な区別を評価することもできる。ここでは、フローセルの温度はファクトリープリセット温度であったが、ナノ細孔タンパク質は、ある特定の温度範囲で安定していることが知られている。フローセルの温度は、ユーザの判断で放置された場合、特異性を改善する手段を提供することができる。また、独自のＯＮＴフラッシュ緩衝液を交換しなかった。後者は配列決定のために開発されたものであり、本発明を含む他の用途により好適であるように異なる緩衝液が開発されてもよい。

【0091】

予備実験により、ｍｉＲＮＡ２１とｄｍｉＲ２１（ＯＭｅ）とのハイブリッドは、１５％～８５％の血清－ＯＮＴ緩衝液中で比較的安定であり、プローブ１２２ＥＸＴは、１５％～８５％の血清－ＯＮＴ緩衝液中でナノ細孔によって検出可能であることが示された。これらの実験は、ＯＮＴ／ＯｓＢｐナノ細孔プラットフォームを血清試料と共に使用することが可能であることを示唆している。ＭｉｎＩＯＮフローセルが７５μＬの試料体積を使用し、１５％が血清である可能性があることを考慮すると、おおよそ１１μＬのヒト血清試料をナノ細孔実験で直接試験することができる。１１μＬのヒト血清試料が、約３ａｍｏｌｅのｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ１４０、または暫定的に任意の他のｍｉＲＮＡを含有すると仮定すると、本発明に従って設計されたプローブは、それを検出することができ、結果として、標的の存在／不在を検出するはずである。この文脈では、本発明の態様は、フォローアップ、臨床現場診断試験として適格である。
＊＊＊＊＊

【0092】

本開示の幅及び範囲は、上記の例示的な実施形態のうちのいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの同等物に従ってのみ、定義されるべきである。

【0093】

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４．Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｕｔｚ，Ｅ．，Ｂｅｃｋ，Ｊ．，＆Ｗａｌｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ－ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，４１（２），１１５－１２０、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９７／ＦＴＤ．０００００００００００００５６６（２０１９）。
５．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｍ．，＆Ｔｓｕｉ，Ｄ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２８－２２９，１６９－１７９、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｃｅｒｇｅｎ．２０１８．０２．００５（２０１８）。
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８．Ｆｉｎｏｔｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ ａｎｄ ＰＣＲ－ｆｒｅｅ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｒｅｖｉｅｗ）．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５３（４），１３９５－１４３４、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３８９２／ｉｊｏ．２０１８．４５１６（２０１８）。
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３０．Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｈｅｒｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｄ．，Ｊａｐｒｕｎｇ，Ｄ．＆Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｓｈｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７５，５９１－６２３、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００７６－６８７９（１０）７５０２２－９（２０１０）。
３１．Ｈａｑｕｅ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．，Ｌｉａｎｇ，Ｘ．Ｊ．＆Ｇｕｏ，Ｐ．Ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ．Ｎａｎｏ Ｔｏｄａｙ，８，５６－７４、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎａｎｔｏｄ．２０１２．１２．００８（２０１３）。
３２．Ｆｕｌｌｅｒ Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ－ｔａｇｇｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｒｒａｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１１３（１９），５２３３－５２３８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６０１７８２１１３（２０１６）。
３３．Ｌａｓｚｌｏ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｌｏｎｇ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ＤＮＡ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２，８２９－８３３、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ．２９５０（２０１４）。
３４．Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｗｅｂｓｉｔｅ：ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓの下。
３５．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎａｍｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１１１（５０）Ｅ５４３９－Ｅ５４４４、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１１９４２１１１（２０１４）。
３６．Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，＆Ｌｏｕ，Ｊ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｈｉｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ：ａ ｒｅｖｕｌｉｅｗ．Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ，２６，ｅ９２１０４０、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２６５９／ＭＳＭ．９２１０４０（２０２０）。
３７．Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．，Ｊａｎｇｒａ，Ｓ．＆Ｙａｄａｖ，Ｎ．Ｒ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ａｎｄ ｃｒｏｐ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６，４０、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９５１－０１８－０３６８－８（２０１８）。
３８．Ｗａｎｕｎｕ Ｍ，Ｄａｄｏｓｈ Ｔ，Ｒａｙ Ｖ，Ｊｉｎ Ｊ，ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｌ，Ｄｒｎｄｉｃ Ｍ．Ｒａｐｉｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｂｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｎ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｎｓｏｒｓ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０；５（１１）：８０７－８１４、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１０．２０２（２０１０）。
３９．Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．＆Ｗａｎｇ Ｙ．Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，１０２４，２５５－６８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－６２７０３－４５３－１＿２１（２０１３）。
４０．Ａｒａｔａ，Ｈ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｋ．，＆Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｒａｐｉｄ ｓｕｂ－ａｔｔｏｍｏｌｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ．Ａｎａｌ Ｓｃｉ，３０（１），１２９－１３５、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１１６／ａｎａｌｓｃｉ．３０．１２９（２０１４）。
４１．Ｈｅｎｌｅｙ，Ｒ．Ｙ．，Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｐａｇａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．＆Ｗａｎｕｎｕ，Ｍ．Ｏｓｍｉｕｍ－ｂａｓｅｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｂａｓｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ．ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，１０（１２），ｅ ０１４２１５５、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４２１５５（２０１５）。
４２．Ｘｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｓｈｉｄ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｂｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，８８，１０５４０－１０５４６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．６ｂ０２６２０（２０１６）。
４３．Ｚａｈｉｄ，Ｏ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｒｕｚｉｃｋａ，Ｊ．Ａ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｗ．＆Ｈａｌｌ，Ａ．Ｒ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｈｏｒｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ，１６（３），２０３３－２０３９、ｈｔｔｐｓ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．６ｂ００００１（２０１６）。
４４．Ｄｉｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．Ｓｉｎｇｌｅ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｒｉｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｍｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｖｉａ ｔｈｅ ａｒｕｆｗａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｎａｎｏｐｏｒｅ．Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ Ｊ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，７，９１－１０１、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３７６２／ｂｊｎａｎｏ．７．１１（２０１６）。
４５．Ｔｉａｎ，Ｋ．，Ｓｈｉ，Ｒ．，Ｇｕ，Ａ．，Ｐｅｎｎｅｌｌａ，Ｍ．，＆Ｇｕ，Ｌ．Ｑ．Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｂｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｉＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），１６３２，２５５－２６８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－４９３９－７１３８－１＿１７（２０１７）。
４６．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｒａｎａ，Ａ．，Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｙ．，Ｃｚｙｚｙｋ－Ｋｒｚｅｓｋａ，Ｍ．Ｆ．，＆Ｅｓｆａｎｄｉａｒｉ，Ｌ．（２０１７）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｔ ｆＭ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ Ｄｒｉｖｅｎ Ｎａｎｏｐｏｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８９（１７），９２０１－９２０８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．７ｂ０１９４４。
４７．Ｈｕａｎｇ，Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｋ．，Ｓｏｓｋｉｎｅ，Ｍ．，Ｗｌｏｋａ，Ｃ．＆Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．Ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｏｎｉｃ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ＦｒａＣ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８（１），９３５、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－０１００６－４（２０１７）。
４８．Ｇａｌｅｎｋａｍｐ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｏｓｋｉｎｅ，Ｍ．，Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｊ．，Ｗｌｏｋａ，Ｃ．＆Ｍａｇｌｉａ，Ｇ．Ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｆｒｏｍ ｂｏｄｉｌｙ ｆｌｕｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９（１）、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０６５３４－１（２０１８）。
４９．Ｓｕｌｔａｎ Ｍ．，Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｄｅｖｉｃｅ－ｂａｓｅｄ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｓｍｉｕｍ ｔａｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，９（１）：１４１８０、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－５０４５９－８（２０１９）。
５０．Ｃａｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｅｒｏｌｙｓｉｎ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１０，４９１８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１２６９０－９（２０１９）。
５１．Ｈａｏ，Ｗ．，Ｈａｏｒａｎ Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ Ｙ．，＆Ｙｏｎｇｘｉｎ，Ｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ＰＮＡ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ Ｆｅ３ Ｏ４－Ａｕ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９１（１２），７９６５－７９７０、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．９ｂ０２０２５（２０１９）。
５２．Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｎａｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙ（Ａ）ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１６（１２）：１２９７－１３０５、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９２－０１９－０６１７－２（２０１９）。
５３．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆Ｓｏｈ，Ｈ．Ｔ．Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，９１，６７８３－６７８９、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．９ｂ００８５６（２０１９）。
５４．Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．Ｏｓｍｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ，ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２６，１３４００３、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８８／０９５７－４４８４／２６／１３／１３４００３（２０１５）。
５５．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｈ．，Ｂｅｅｒ，Ｍ．＆Ｍａｒｚｉｌｌｉ，Ｌ．Ｇ．Ｏｓｍｉｕｍ－ｌａｂｅｌｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ ｗｉｔｈ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｏｎｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６（１），３３－３８（１９７７）。
５６．Ｐａｌｅｃｅｋ Ｅ．Ｐｒｏｂｉｎｇ ＤＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１２，１３９－１５５、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１５１８４４６（１９９２）。
５７．Ｒｅｓｋｅ Ｔ．，Ｓｕｒｋｕｓ，Ａ－Ｅ．，Ｄｕｗｅｎｓｅｅ，Ｈ．＆Ｆｌｅｃｈｓｉｇ Ｇ．－Ｕ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｕｒａｃｉｌ ｗｉｔｈ ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ．Ｍｉｃｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１６６（３－４），１９７－２０１、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００６０４－００９－０１９５－６（２００９）。
５８．Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，３３，３５２９－３５４３、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｅｌｐｓ．２０１２００２１４（２０１２）。
５９．Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．Ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅｓ ｍｅａｓｕｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ０．００１％ ｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｓＤＮＡ ｗｉｔｈ ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ．Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ Ｊ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，７，１４３４－１４４６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３７６２／ｂｊｎａｎｏ．７．１３５（２０１６）。
６０．Ｄｅｂｎａｔｈ，Ｔ．Ｋ．＆Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．Ｏｓｍｉｕｍ ｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＮＡ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，１９，１６５３－１６５６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１８００２７４（２０１８）。
６１．Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎ－ｍａｄｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，９（１），１０１９、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－３７６４２－ｚ（２０１９）。
６２．Ｋａｎａｖａｒｉｏｔｉ，Ａ．，＆Ｋａｎｇ，Ａ。公共リポジトリ内のＲＮＡ（ＯｓＢｐ）事象検出Ｐｙｔｈｏｎパッケージ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ、及び段階的インストール手順については、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋａｎｇａｒｏｏ９６／ｏｓｂｐ＿ｄｅｔｅｃｔ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ．ｍｄを参照。
６３．Ｍａｊｌｅｓｓｉ，Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ Ｎ．Ｃ．＆Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｍ．Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２６，２２２４－２２２９（１９９８）。
６４．Ｌｉ，Ｘ－Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌａｓｍａ ｍｉＲＮＡ－１２２，－１４０－３ｐ，－７２０，－２８６１，ａｎｄ－３１４９ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１２（９），ｅ０１８４２５６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１８４２５６（２０１７）。
６５．Ｔｈｕｍ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４５６，７２２４，９８０－９８４、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７５１１（２００８）。
６６．Ｌａｉ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１ ｉｎ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＪＡＳＮ，２６，４，８０５－８１６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１６８１／ＡＳＮ．２０１３１２１２７４（２０１５）。
６７．Ｋａｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｕｒｉｎｅ ｍｉＲ－２１－５ｐ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８，３４，５６３８９－５６３９７、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．１６９１６（２０１７）。
６８．Ｆｕｌｃｉ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ，１０９，１１，４９４４－５１、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００６－１２－０６２３９８（２００７）。
６９．Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲＮＡ－２１ ａｓ ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ２ ｃａｒｄｉｏｒｅｎａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，１０，４８９４、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－６１８３６－ｚ（２０２０）。
７０．ＭＳＤＳ及び情報は、ＵＣＬＡ化学学部の以下のリンクから得られる。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ｓａｆｅｔｙ／ｓｏｐ／ＳＯＰ＿Ｏｓｍｉｕｍ＿Ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ．ｐｄｆを参照。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【配列表】

2024500005000001.app

【国際調査報告】