▶ アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカルの特許一覧 ▶ アシスタンス ピュブリク−オピトー ドゥ パリの特許一覧 ▶ サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィクの特許一覧 ▶ フォンダシオン・イマジネの特許一覧 ▶ ユニヴェルシテ ドゥ パリの特許一覧 ▶ ユニヴェルシテ・デ・アンティユ・エ・ドゥ・ラ・ギュイヤーヌの特許一覧 ▶ エタブリスマン フランセ デュ サンの特許一覧
特表2024-500049先天性ＧＰＩ欠損症のバイオマーカーとしてのＥＭＭ抗原の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-04
(54)【発明の名称】先天性ＧＰＩ欠損症のバイオマーカーとしてのＥＭＭ抗原の使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20231222BHJP
G01N 33/80 20060101ALI20231222BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/80
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023533811
(86)(22)【出願日】2021-12-08
(85)【翻訳文提出日】2023-06-02
(86)【国際出願番号】 EP2021084699
(87)【国際公開番号】W WO2022122785
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】20306520.6
(32)【優先日】2020-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】591140123
【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(71)【出願人】
【識別番号】595040744
【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(71)【出願人】
【識別番号】515028470
【氏名又は名称】フォンダシオン・イマジネ
【氏名又は名称原語表記】ＦＯＮＤＡＴＩＯＮ ＩＭＡＧＩＮＥ
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】515210293
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・デ・アンティユ・エ・ドゥ・ラ・ギュイヤーヌ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥＳ ＡＮＴＩＬＬＥＳ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＧＵＹＡＮＥ
(71)【出願人】
【識別番号】512217400
【氏名又は名称】エタブリスマン フランセ デュ サン
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ペイラール，ティエリー
(72)【発明者】
【氏名】アソウシ，スリム
(72)【発明者】
【氏名】エルミーヌ，オリヴィエ
(72)【発明者】
【氏名】コリン－アロノヴィッセ，イヴ
(72)【発明者】
【氏名】デュヴァル，ロマン
(72)【発明者】
【氏名】ル・ヴァン・キム，カロリーヌ
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA02
2G045DA36
2G045FB03
(57)【要約】
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）は、１５０種以上のタンパク質を細胞表面に係留する糖脂質である。ＧＰＩ生合成に関わる数種の遺伝子の病原性バリアントが、先天性ＧＰＩ欠損症（ＩＧＤ）障害を引き起こす。ここで、本発明者らは、ＧＰＩ修飾に関与する遺伝子であるＰＩＧＧのホモ接合性ヌル対立遺伝子が、珍しいＥｍｍ陰性の血液表現型の原因であることを報告した。ＧＰＩトランスアミダーゼ経路とＧＰＩリモデリング経路の両方に欠陥があるＫ５６２細胞の一団を使用して、本発明者らは、その分子学的基礎が数十年間未解明のままであるＥｍｍ抗原が、遊離ＧＰＩによってのみ担持されること、そして、そのエピトープがＧＰＩ骨格の第２および第３のエタノールアミンから構成されることを実証する。重要なことに、本発明者らは、数人のＩＧＤ患者におけるＥｍｍ発現の減少が、ＧＰＩ欠陥の指標となることを示す。概して、本発明者らの知見は、Ｅｍｍを新規の血液型系として確立し、ヒトの遊離ＧＰＩの生物学的機能を理解する上で重要な意味を持つ。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
先天性グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）欠損症のバイオマーカーとしてのＥｍｍ抗原の使用。
【請求項2】
対象における先天性グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）欠損症を診断する方法であって、前記対象から得られた赤血球細胞の試料におけるＥｍｍ抗原の発現を検出することを含む、ここでＥｍｍ抗原の発現の変化を検出することが、前記対象が先天性ＧＰＩ欠損症を患っていることを示す、方法。
【請求項3】
知的障害および／またはてんかんを特徴とする先天性ＧＰＩ欠損症を診断するための、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＧＰＩアンカー型タンパク質の発現が対象の赤血球細胞において減少していない場合の先天性ＧＰＩ欠損症を診断するための、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
血液細胞における少なくとも１つのＧＰＩ－ＡＰの発現が対象のＧＰＩ欠陥を反映しない場合の先天性ＧＰＩ欠損症を診断するための、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
ＧＰＩ－ＡＰが、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＦＬＡＥＲおよびＣＤ１６からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
発作性夜間ヘモグロビン尿症を診断するための、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野：
本発明は、医薬の分野に存する。
本発明は、医薬の分野に存する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景：
Ｅｍｍ陰性の珍しい血液表現型は、１９７３年に最初に記載されたが、依然として未知の遺伝学的基礎を有する最後の血液型の１つである（Ｅｍｍは、現在、高頻度赤血球細胞抗原の９０１シリーズに含まれる）。抗Ｅｍｍは、珍しく、そして、報告されている抗Ｅｍｍ抗体のうちの６つが輸血歴のない男性で発見されたことから天然に存在する抗体であると思われる１。Ｅｍｍ陰性表現型は、劣性形質として遺伝すると考えられている１。Ｅｍｍ抗原の正確な性質は、これまでのところ謎のままであるが、その発現が発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）患者由来の赤血球細胞（ＲＢＣ）において強く減少しているので、Ｅｍｍ抗原は、ＲＢＣ膜中のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質（ＧＰＩ－ＡＰ）上にあると推定されている２。ＰＮＨは、ＰＩＧＡ遺伝子の体細胞変異によって引き起こされる後天性ＧＰＩ欠損症であるが３、ただし、それがＰＩＧＴ遺伝子の体細胞変異とヘテロ接合性生殖細胞変異の組み合わせによって引き起こされる数人の患者は除く４、５。ＧＰＩは、補体阻害性糖タンパク質（ＣＤ５９）を含む１５０種以上の異なるタンパク質を細胞表面につなぎ留める糖脂質であり、そして、ＰＩＧＡおよびＰＩＧＴを含めたホスファチジルイノシトールグリカン（ＰＩＧ）遺伝子と称される少なくとも２２個の遺伝子がＧＰＩ－ＡＰの合成に関与する６。ＧＰＩ－ＡＰのアンカリングは、小胞体（ＥＲ）でのＧＰＩ前駆体の合成、ＧＰＩへのタンパク質付着、ならびにＥＲおよびゴルジ体でのＧＰＩ－ＡＰ複合体のリモデリングを含む多工程プロセスである７～９。また、ＥＲで合成されるＧＰＩ分子のいくつかが、細胞表面に輸送され、遊離の非結合ＧＰＩとして発現されることも知られている１０。現在までに、ＰＩＧ／ＰＧＡＰ（Post GPI Attachment to proteins）遺伝子の生殖細胞変異が、多発先天奇形-筋緊張低下-けいれん症候群（ＭＣＡＨＳ）および高ホスファターゼ血症－精神遅滞症候群（ＨＰＭＲＳ）／Ｍａｂｒｙ症候群を含む様々な先天性ＧＰＩ欠損症（ＩＧＤ）障害および表現型を引き起こすと報告されている１１。
Ｅｍｍ陰性の珍しい血液表現型は、１９７３年に最初に記載されたが、依然として未知の遺伝学的基礎を有する最後の血液型の１つである（Ｅｍｍは、現在、高頻度赤血球細胞抗原の９０１シリーズに含まれる）。抗Ｅｍｍは、珍しく、そして、報告されている抗Ｅｍｍ抗体のうちの６つが輸血歴のない男性で発見されたことから天然に存在する抗体であると思われる１。Ｅｍｍ陰性表現型は、劣性形質として遺伝すると考えられている１。Ｅｍｍ抗原の正確な性質は、これまでのところ謎のままであるが、その発現が発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）患者由来の赤血球細胞（ＲＢＣ）において強く減少しているので、Ｅｍｍ抗原は、ＲＢＣ膜中のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質（ＧＰＩ－ＡＰ）上にあると推定されている２。ＰＮＨは、ＰＩＧＡ遺伝子の体細胞変異によって引き起こされる後天性ＧＰＩ欠損症であるが３、ただし、それがＰＩＧＴ遺伝子の体細胞変異とヘテロ接合性生殖細胞変異の組み合わせによって引き起こされる数人の患者は除く４、５。ＧＰＩは、補体阻害性糖タンパク質（ＣＤ５９）を含む１５０種以上の異なるタンパク質を細胞表面につなぎ留める糖脂質であり、そして、ＰＩＧＡおよびＰＩＧＴを含めたホスファチジルイノシトールグリカン（ＰＩＧ）遺伝子と称される少なくとも２２個の遺伝子がＧＰＩ－ＡＰの合成に関与する６。ＧＰＩ－ＡＰのアンカリングは、小胞体（ＥＲ）でのＧＰＩ前駆体の合成、ＧＰＩへのタンパク質付着、ならびにＥＲおよびゴルジ体でのＧＰＩ－ＡＰ複合体のリモデリングを含む多工程プロセスである７～９。また、ＥＲで合成されるＧＰＩ分子のいくつかが、細胞表面に輸送され、遊離の非結合ＧＰＩとして発現されることも知られている１０。現在までに、ＰＩＧ／ＰＧＡＰ（Post GPI Attachment to proteins）遺伝子の生殖細胞変異が、多発先天奇形-筋緊張低下-けいれん症候群（ＭＣＡＨＳ）および高ホスファターゼ血症－精神遅滞症候群（ＨＰＭＲＳ）／Ｍａｂｒｙ症候群を含む様々な先天性ＧＰＩ欠損症（ＩＧＤ）障害および表現型を引き起こすと報告されている１１。
【0003】
発明の概要：
本発明は、特許請求の範囲によって定義される。特に、本発明は、先天性ＧＰＩ欠損症のバイオマーカーとしてのＥｍｍ抗原の使用に関する。
本発明は、特許請求の範囲によって定義される。特に、本発明は、先天性ＧＰＩ欠損症のバイオマーカーとしてのＥｍｍ抗原の使用に関する。
【0004】
発明の詳細な説明：
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）は、１５０種以上のタンパク質を細胞表面に係留する糖脂質である。ＧＰＩ生合成に関わる数種の遺伝子の病原性バリアントが、先天性ＧＰＩ欠損症（ＩＧＤ）障害を引き起こす。ここで、本発明者らは、ＧＰＩ修飾に関与する遺伝子であるＰＩＧＧのホモ接合性ヌル対立遺伝子が、珍しいＥｍｍ陰性の血液表現型の原因であることを報告した。ＧＰＩトランスアミダーゼ経路とＧＰＩリモデリング経路の両方に欠陥があるＫ５６２細胞の一団を使用して、本発明者らは、その分子学的基礎が数十年間未解明のままであるＥｍｍ抗原が、遊離ＧＰＩによってのみ担持されること、そして、そのエピトープがＧＰＩ骨格の第２および第３のエタノールアミンから構成されることを実証する。重要なことに、本発明者らは、数人のＩＧＤ患者におけるＥｍｍ発現の減少が、ＧＰＩ欠陥の指標となることを示す。概して、本発明者らの知見は、Ｅｍｍを新規の血液型系として確立し、ヒトの遊離ＧＰＩの生物学的機能を理解する上で重要な意味を持つ。
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）は、１５０種以上のタンパク質を細胞表面に係留する糖脂質である。ＧＰＩ生合成に関わる数種の遺伝子の病原性バリアントが、先天性ＧＰＩ欠損症（ＩＧＤ）障害を引き起こす。ここで、本発明者らは、ＧＰＩ修飾に関与する遺伝子であるＰＩＧＧのホモ接合性ヌル対立遺伝子が、珍しいＥｍｍ陰性の血液表現型の原因であることを報告した。ＧＰＩトランスアミダーゼ経路とＧＰＩリモデリング経路の両方に欠陥があるＫ５６２細胞の一団を使用して、本発明者らは、その分子学的基礎が数十年間未解明のままであるＥｍｍ抗原が、遊離ＧＰＩによってのみ担持されること、そして、そのエピトープがＧＰＩ骨格の第２および第３のエタノールアミンから構成されることを実証する。重要なことに、本発明者らは、数人のＩＧＤ患者におけるＥｍｍ発現の減少が、ＧＰＩ欠陥の指標となることを示す。概して、本発明者らの知見は、Ｅｍｍを新規の血液型系として確立し、ヒトの遊離ＧＰＩの生物学的機能を理解する上で重要な意味を持つ。
【0005】
したがって、本発明は、先天性グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）欠損症のバイオマーカーとしてのＥｍｍ抗原の使用に関する。
【0006】
特に、本発明は、対象における先天性グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）欠損症を診断する方法であって、前記対象から得られた赤血球細胞の試料におけるＥｍｍ抗原の発現を検出することを含む、ここでＥｍｍ抗原の発現の変化を検出することが、前記対象が先天性ＧＰＩ欠損症を患っていることを示す、方法に関する。
【0007】
本明細書において使用される場合、「グリコシルホスファチジルイノシトール」または「ＧＰＩ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、１５０種以上のタンパク質を細胞表面に係留する糖脂質のことを指し、そして、「ＧＰＩアンカー型タンパク質」または「ＧＰＩ－Ａｐ」と称されるこれらのタンパク質は、シグナル伝達経路において、酵素、接着分子、補体制御因子およびコレセプターとして多種多様な機能を果たす。それゆえ、ＧＰＩ－ＡＰの表面レベルの低下または異常なＧＰＩ－ＡＰ構造は、グリコシルホスファチジルイノシトール欠損症を含む多様な症状（variable manifestations）をもたらし得る。
【0008】
本明細書において使用される場合、「先天性グリコシルホスファチジルイノシトール欠損症」または「先天性ＧＰＩ欠損症」という用語は、ＧＰＩ－ＡＰの表面レベルの低下または異常なＧＰＩ－ＡＰ構造を特徴とする臨床的かつ遺伝的に異質な病態の一群に関する。この用語はまた、「グリコシルホスファチジルイノシトール生合成欠陥」または「ＧＰＩＢＤ」とも呼ばれる。完全なＧＰＩ欠損症は致死的であるものの、２００６年以降、ＧＰＩ機構を伴う障害がいくつか特定されており、これはハイポモルフィック変異によって引き起こされると考えられている（例えば、Chiyonobu, T., Inoue, N., Morimoto, M., Kinoshita, T., & Murakami, Y. (2014). Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor deficiency caused by mutations in PIGW is associated with West syndrome and hyperphosphatasia with mental retardation syndrome. Journal of Medical Genetics, 51(3), 203-207を参照のこと）。前記障害について、その表現型は、高ホスファターゼ血症および知的障害（ＩＤ）によって特徴付けられ、これらの障害は、しばしば「高ホスファターゼ血症－知的障害（以前は「精神遅滞」）症候群」またはＭａｂｒｙ症候群と呼ばれる。特に、本発明の方法は、知的障害および／またはてんかんを特徴とする先天性ＧＰＩ欠損症を診断するのに特に適する。
【0009】
特に、本発明の方法は、ＧＰＩアンカー型タンパク質の発現が対象の赤血球細胞において減少している場合の先天性ＧＰＩ欠損症を診断するのに特に適する。より特定すると、本発明の方法は、血液細胞におけるＧＰＩ－ＡＰ（例えば、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＦＬＡＥＲ、ＣＤ１６など）の発現が対象のＧＰＩ欠陥を反映しない場合の先天性ＧＰＩ欠損症を診断するのに特に適する。
【0010】
特に、本発明の方法はまた、発作性夜間ヘモグロビン尿症を診断するのに特に適する。
【0011】
本明細書において使用される場合、赤血球としても知られる「赤血球細胞」または「ＲＢＣ」という用語は、毛細血管網を介した代謝的に活性な細胞への酸素の運搬および該細胞からの二酸化炭素の除去を担っている高度に特殊化された細胞である。これらは、窪んだ円盤の形状であり、直径が平均で約８～１０ミクロンである。ＲＢＣのいくつかの表現型マーカーが記載されており、典型的には、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ１００、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１１７；ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４７、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ９９、ＣＤ１０８、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＣＤ２２２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、モノカルボン酸トランスポーター１（ＭＣＴ１）およびＣＤ２３３を含む。より特定すると、成熟ＲＢＣの表現型マーカーは、ＣＤ２３５ａ、Ｂａｎｄ３、ＲＨタンパク質、ＧＹＰＣ／Ｄ、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＤ１０８、ＣＤ４４、ＣＤ４７、Ｇｌｕｔ１、およびＭＣＴ１を含む。
【0012】
本明細書において使用される場合、「Ｅｍｍ抗原」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Daniels GL, Taliano V, Klein MT, McCreary J. Emm. A red cell antigen of very high frequency. Transfusion. 1987;27(4):319-321に記載されている抗原のことを指す。特に、実施例において実証しているように、そのエピトープは、遊離ＧＰＩ骨格の第２および第３のエタノールアミンから構成される。いくつかの抗Ｅｍｍ抗体が先行技術に記載されている（例えば、Daniels GL, Taliano V, Klein MT, McCreary J. Emm. A red cell antigen of very high frequency. Transfusion. 1987;27(4):319-321を参照のこと）。
【0013】
典型的には、Ｅｍｍ抗原の発現の変化は、対照の参照レベル（例えば、健康な個体において測定される）と比較した前記発現の減少または増加からなる。
【0014】
赤血球細胞上のＥｍｍ抗原の発現を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、典型的には、実施例に記載するようなイムノアッセイの使用を伴う。特に、細胞表面（すなわち、赤血球細胞表面）でのＥｍｍ抗原などの特定の表面マーカーの発現を検出するための標準的な方法は、当技術分野において周知である。典型的には、赤血球細胞表面でのＥｍｍの発現レベルを測定することからなる工程は、対象から赤血球細胞の集団を収集すること、およびＥｍｍ抗原に対して指向される少なくとも１つの特異な結合パートナーを使用することからなることができ、ここで、前記赤血球細胞に、前記Ｅｍｍ抗原に対する前記結合パートナーが結合する。
【0015】
本明細書において使用される場合、「Ｅｍｍ抗原に対して指向される結合パートナー」という用語は、Ｅｍｍ抗原に高親和性で結合可能な任意の分子（天然か天然でないか問わず）のことを指す。前記結合パートナーとしては、抗体、アプタマーおよびペプチドが挙げられるが、それらに限定されない。
【0016】
結合パートナーは、前記Ｅｍｍ抗原に対して特異的に指向されるポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る、抗体であり得る。いくつかの実施態様では、結合パートナーは、アプタマーのセットであり得る。本発明のポリクローナル抗体またはその断片は、適切な抗原またはエピトープを、例えば、とりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスから選択される宿主動物に投与することによる公知の方法に従って作製することができる。抗体産生を高めるために、当技術分野において公知の様々なアジュバントを使用することができる。本発明を実施する際に有用な抗体は、ポリクローナルであることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、培養中の連続的な細胞株によって抗体分子の産生をもたらす任意の技術を使用して調製および単離することができる。産生および単離のための技術としては、元来のハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；およびＥＢＶ－ハイブリドーマ技術が挙げられるが、それらに限定されない。
【0017】
抗体またはアプタマーなどの本発明の結合パートナーは、検出可能な分子または物質、例えば、優先的には蛍光分子、または放射性分子、または当技術分野において公知の任意の他のラベルで標識されてよい。ラベルは、当技術分野において公知であり、一般的にシグナルを（直接的か間接的かのいずれかで）もたらす。
【0018】
本明細書において使用される場合、抗体またはアプタマーに関する「標識された」という用語は、検出可能な物質、例えば、フルオロフォア［例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５）］）または放射性物質を抗体またはアプタマーにカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体またはアプタマーの直接的な標識化、ならびに検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を包含することが意図される。
【0019】
好ましくは、Ｅｍｍ抗原に対する抗体は、フルオロフォアにすでにコンジュゲートされている（例えば、ＦＩＴＣコンジュゲートされているおよび／またはＰＥコンジュゲートされている）。前述のアッセイでは、結合パートナー（すなわち、抗体またはアプタマー）を固体支持体に結合させてもよい。固体表面は、Ｅｍｍ抗原に対する抗体が被覆されたマイクロタイトレーションプレートであることもできる。赤血球細胞試料のインキュベーション後、Ｅｍｍ結合パートナーに特異的に結合した赤血球細胞を、一般的な赤血球細胞マーカーに対する抗体で検出してもよい。あるいは、固体表面は、活性化ビーズ、磁気応答ビーズなどのビーズであってもよい。ビーズは、ガラス、プラスチック、ポリスチレンおよびアクリルを含むがそれらに限定されない種々の材料から製造されていてよい。加えて、ビーズは、好ましくは、蛍光標識される。いくつかの実施態様では、蛍光ビーズは、Becton Dickinson Biosciences（San Jose, California）から入手可能なTruCount（商標）チューブに含有されるものである。
【0020】
本発明によれば、フローサイトメトリーの方法が、赤血球細胞表面でのＥｍｍ抗原のレベルを測定するための好ましい方法である。前記方法は、当技術分野において周知である。例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がそれゆえ使用されてよい。典型的には、赤血球細胞の表面でのＥｍｍ抗原のレベルを測定するために、以下の実施例に記載するようなＦＡＣＳ法を使用してよい。
【0021】
対象が先天性ＧＰＩ欠損症と診断された場合、医師は最も正確な治療を処方することができる。特に、対象にＨＤＣＡ阻害剤が投与される。本明細書において使用される場合、「ＨＤＡＣ阻害剤」という用語は、１つ以上のＨＤＡＣのデアセチラーゼ機能を阻害可能な分子のことを指す。ＨＤＡＣ阻害剤は、当技術分野において周知であり、トリフルオロアセチルチオフェン－カルボキサミド、ツバシン、ツバスタチンＡ、ＷＴ １６１、ＰＣＩ－３４０５１、ＭＣ１５６８、ＭＣ１５７５、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ボリノスタットまたはＳＡＨＡとしても知られる）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、Ｍ３４４、スクリプタイド（Sriptaid）、トラポキシン、デプシペプチド（ロミデプシンとしても知られる）、ＭＳ２７５（エンチノスタット）、４－フェニルイミダゾール、ＭＣ１２９３、ドロキシノスタット、クルクミン、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、ＭＧＣＤ０１０３（モセチノスタット）、パルテノリドおよびジビノスタット（ＩＴＦ２３５７）が挙げられるが、それらに限定されない。特に、発作の場合、患者に、抗てんかん薬が投与される。本明細書において使用される場合、「抗てんかん薬」または「ＡＥＤ」という用語は、一般に、発作の頻度または可能性を低下させる薬理学的物質を包含する。抗てんかん薬（ＡＥＤ）のセットを含め多くの薬物クラスがあり、多くの異なる作用機序が示されている。例えば、いくつかの薬物治療は、発作閾値を上昇させると考えられており、それにより、脳が発作を起こす可能性を低下させる。他の薬物治療は、神経の群発活性の広がりを停滞させ、発作活動の伝播または広がりを防止する傾向がある。ベンゾジアゼピン類などのいくつかのＡＥＤは、ＧＡＢＡ受容体を介して作用し、神経の活性を全体的に抑制する。しかしながら、他のＡＥＤは、ニューロンのカルシウムチャネル、ニューロンのカリウムチャネル、ニューロンのＮＭＤＡチャネル、ニューロンのＡＭＰＡチャネル、ニューロンの代謝調節型チャネル、ニューロンのナトリウムチャネル、および／またはニューロンのカイナイトチャネルをモジュレートすることによって作用し得る。
【0022】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに例証される。しかしながら、これらの実施例および図面は、決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0023】
方法：
対象
すべてが抗Ｅｍｍを有する３名のＥｍｍ陰性個体（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）の試料を、地元の倫理委員会（CPP Ile-de-France II）およびフランス研究省（ref. DC-2016-2872）による承認を受けた国立血液型リファレンスセンター（National Reference Center for Blood Group）（CNRGS, Paris, France）の凍結保存レアリファレンスマテリアルコレクションから得た。ＩＧＤ患者は、Polywebを介して募集し、ネッケル病院（Paris, France）およびアンドレ・ミニョー病院（Versailles, France）から来た。参加者とその法定代理人の両方からインフォームドコンセントを得た。血液を研究目的に使用することに同意したフランス血液機構（Etablissement Francais du Sang）（ＥＦＳ）の血液ドナー志願者のＲＢＣ試料を、Ｅｍｍ陽性対照として使用した。
対象
すべてが抗Ｅｍｍを有する３名のＥｍｍ陰性個体（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）の試料を、地元の倫理委員会（CPP Ile-de-France II）およびフランス研究省（ref. DC-2016-2872）による承認を受けた国立血液型リファレンスセンター（National Reference Center for Blood Group）（CNRGS, Paris, France）の凍結保存レアリファレンスマテリアルコレクションから得た。ＩＧＤ患者は、Polywebを介して募集し、ネッケル病院（Paris, France）およびアンドレ・ミニョー病院（Versailles, France）から来た。参加者とその法定代理人の両方からインフォームドコンセントを得た。血液を研究目的に使用することに同意したフランス血液機構（Etablissement Francais du Sang）（ＥＦＳ）の血液ドナー志願者のＲＢＣ試料を、Ｅｍｍ陽性対照として使用した。
【0024】
血清学的検査
標準的な赤血球凝集試験を抗Ｅｍｍ反応性の評価およびＲＢＣ型判定に使用した。抗Ｅｍｍは、１９８６年に原著論文１に記載された２名の親族でない男性（Ｐ１およびＰ３）から供給された。パパイン処理ＲＢＣに対する２２℃での間接抗グロブリンゲル試験（ID-Card LISS/Coombs; DiaMed, Bio-Rad, headquartered in Hercules, CA, USA）によって、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３血清は、それぞれ、３＋（力価８、スコア３５）、３＋（力価１２８、スコア７２）および３＋（力価８、スコア３５）で反応することが分かった。Ｐ２の血清試料由来のヒトポリクローナル抗Ｅｍｍを３種のＯ型パパイン処理ＲＢＣのプールに吸着させ、続いて、Gamma ELU-KIT IIデバイス（Immucor Inc. Norcross, GA, USA）で酸溶出試験を行うことによって、抗Ｅｍｍ溶出液を調製した。Ｅｍｍ陽性およびＥｍｍ陰性ＲＢＣを使用して溶出液のＥｍｍ特異性をチェックし、ＡＢＯ抗体の混入がないこともチェックした。Ｐ２からの溶出液の抗体クラスおよびサブクラスのフローサイトメトリーによる調査は、ＩｇＧ３抗体と合致した。
標準的な赤血球凝集試験を抗Ｅｍｍ反応性の評価およびＲＢＣ型判定に使用した。抗Ｅｍｍは、１９８６年に原著論文１に記載された２名の親族でない男性（Ｐ１およびＰ３）から供給された。パパイン処理ＲＢＣに対する２２℃での間接抗グロブリンゲル試験（ID-Card LISS/Coombs; DiaMed, Bio-Rad, headquartered in Hercules, CA, USA）によって、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３血清は、それぞれ、３＋（力価８、スコア３５）、３＋（力価１２８、スコア７２）および３＋（力価８、スコア３５）で反応することが分かった。Ｐ２の血清試料由来のヒトポリクローナル抗Ｅｍｍを３種のＯ型パパイン処理ＲＢＣのプールに吸着させ、続いて、Gamma ELU-KIT IIデバイス（Immucor Inc. Norcross, GA, USA）で酸溶出試験を行うことによって、抗Ｅｍｍ溶出液を調製した。Ｅｍｍ陽性およびＥｍｍ陰性ＲＢＣを使用して溶出液のＥｍｍ特異性をチェックし、ＡＢＯ抗体の混入がないこともチェックした。Ｐ２からの溶出液の抗体クラスおよびサブクラスのフローサイトメトリーによる調査は、ＩｇＧ３抗体と合致した。
【0025】
全エクソームシーケンシングおよびデータ解析
MagnaPureシステム（Roche）を使用して白血球からゲノムＤＮＡを抽出した。Sure Select Human All Exon Kit（Agilent Technologies）を用いてエクソーム捕捉を実施した。製造業者による推奨に従って、超音波処理装置（Covaris）で断片化された３μgのゲノムＤＮＡから、Agilent Sure Select Human All Exon（58 Mb, V6）ライブラリーを調製した。バーコード化されたエクソームライブラリーを集め、HiSeq2500システム（Illumina Inc. San Diego, CA, USA）により配列決定し、ペアエンドリードを生成した。デマルチプレクシング後、Burrows-Wheeler Aligner（ＢＷＡ）を用いて、配列をヒトゲノム参照（NCBI build 37, hg19 version）上にマッピングした。３名の発端者のエクソームライブラリーについて得られた平均カバレッジ深度は、＞１２０倍であり、標的エクソン塩基の＞＝９６％および＞＝９４％が少なくとも１５および３０の独立したシーケンシングリードによってカバーされた（１５倍で＞＝９６％、３０倍で＞＝９４％）。Genome Analysis Toolkit（ＧＡＴＫ）、SAMtools、およびPicard toolsを用いてバリアントコールを行った。単一ヌクレオチドバリアントは、GATK Unified Genotyperを用いてコールしたが、インデルは、GATK IndelGenotyper_v2を用いてコールした。リードカバレッジ２３％およびPhredスケール品質２０％を有するすべてのバリアントをフィルタアウトした。社内アノテーションソフトウェアプログラムであるPolyWebを用いて、すべてのバリアントをアノテーションして、フィルタリングした。
MagnaPureシステム（Roche）を使用して白血球からゲノムＤＮＡを抽出した。Sure Select Human All Exon Kit（Agilent Technologies）を用いてエクソーム捕捉を実施した。製造業者による推奨に従って、超音波処理装置（Covaris）で断片化された３μgのゲノムＤＮＡから、Agilent Sure Select Human All Exon（58 Mb, V6）ライブラリーを調製した。バーコード化されたエクソームライブラリーを集め、HiSeq2500システム（Illumina Inc. San Diego, CA, USA）により配列決定し、ペアエンドリードを生成した。デマルチプレクシング後、Burrows-Wheeler Aligner（ＢＷＡ）を用いて、配列をヒトゲノム参照（NCBI build 37, hg19 version）上にマッピングした。３名の発端者のエクソームライブラリーについて得られた平均カバレッジ深度は、＞１２０倍であり、標的エクソン塩基の＞＝９６％および＞＝９４％が少なくとも１５および３０の独立したシーケンシングリードによってカバーされた（１５倍で＞＝９６％、３０倍で＞＝９４％）。Genome Analysis Toolkit（ＧＡＴＫ）、SAMtools、およびPicard toolsを用いてバリアントコールを行った。単一ヌクレオチドバリアントは、GATK Unified Genotyperを用いてコールしたが、インデルは、GATK IndelGenotyper_v2を用いてコールした。リードカバレッジ２３％およびPhredスケール品質２０％を有するすべてのバリアントをフィルタアウトした。社内アノテーションソフトウェアプログラムであるPolyWebを用いて、すべてのバリアントをアノテーションして、フィルタリングした。
【0026】
細胞培養
Ｋ５６２細胞を、１０％補体除去（５６℃－３０分）ウシ胎児血清および抗生物質（１００ユニット/mLのペニシリンおよび１００μg/mLのストレプトマイシン）を補充したＩＭＤＭ、２５mM ＨＥＰＥＳおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）中、３７℃、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で培養した。本発明者らのＫ５６２細胞株の認証は、Eurofins MWGによって実施した。
Ｋ５６２細胞を、１０％補体除去（５６℃－３０分）ウシ胎児血清および抗生物質（１００ユニット/mLのペニシリンおよび１００μg/mLのストレプトマイシン）を補充したＩＭＤＭ、２５mM ＨＥＰＥＳおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）中、３７℃、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で培養した。本発明者らのＫ５６２細胞株の認証は、Eurofins MWGによって実施した。
【0027】
フローサイトメトリー
融解させたＲＢＣまたはＫ５６２細胞をＰＢＳ（Gibco）中で３回洗浄し、次いで、０．５％ウシ血清アルブミンを補充した低イオン強度バッファーに再懸濁し、抗Ｅｍｍ溶出液（１：２）またはマウスモノクローナル抗ＣＤ５９（１：１００；BD Pharmingen）とインキュベートした。抗Ｅｍｍ標識は抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（１：１００；Beckman Coulter）により明らかにし、抗ＣＤ５９標識は抗マウスＩｇＧ－ＰＥ（１：１００；Beckman Coulter）により明らかにした。FACSCantoIIフローサイトメーター（BD Bioscience）およびFlowJoソフトウェアを、それぞれデータ収集および解析に使用した。
融解させたＲＢＣまたはＫ５６２細胞をＰＢＳ（Gibco）中で３回洗浄し、次いで、０．５％ウシ血清アルブミンを補充した低イオン強度バッファーに再懸濁し、抗Ｅｍｍ溶出液（１：２）またはマウスモノクローナル抗ＣＤ５９（１：１００；BD Pharmingen）とインキュベートした。抗Ｅｍｍ標識は抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（１：１００；Beckman Coulter）により明らかにし、抗ＣＤ５９標識は抗マウスＩｇＧ－ＰＥ（１：１００；Beckman Coulter）により明らかにした。FACSCantoIIフローサイトメーター（BD Bioscience）およびFlowJoソフトウェアを、それぞれデータ収集および解析に使用した。
【0028】
免疫蛍光共焦点顕微鏡検査
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience（商標））を製造業者の説明書に従って使用して、Ｋ５６２細胞を固定および透過処理した。簡単に述べると、５×１０６個の細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１×Fix/Permバッファー中にて室温で３０分間インキュベートし、１×Permバッファー中で２回洗浄した。次いで、細胞を、１×Permバッファー中で抗Ｅｍｍ抗体（１：２）と氷上で１２０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、Alexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Invitrogen）と氷上で６０分間インキュベートした。１×Permバッファー中でのさらなる一連の洗浄後、試料（０．１×１０６個の細胞）をスライドガラス上にサイトスピンし、１０μLのProLong（商標）Diamond Antifade Mountant with DAPI（Molecular Probes）を加えた後、ガラスを封止した。Zeiss LSM 700レーザー走査共焦点顕微鏡上で６３×対物レンズを用いて観察を行った。
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience（商標））を製造業者の説明書に従って使用して、Ｋ５６２細胞を固定および透過処理した。簡単に述べると、５×１０６個の細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１×Fix/Permバッファー中にて室温で３０分間インキュベートし、１×Permバッファー中で２回洗浄した。次いで、細胞を、１×Permバッファー中で抗Ｅｍｍ抗体（１：２）と氷上で１２０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、Alexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Invitrogen）と氷上で６０分間インキュベートした。１×Permバッファー中でのさらなる一連の洗浄後、試料（０．１×１０６個の細胞）をスライドガラス上にサイトスピンし、１０μLのProLong（商標）Diamond Antifade Mountant with DAPI（Molecular Probes）を加えた後、ガラスを封止した。Zeiss LSM 700レーザー走査共焦点顕微鏡上で６３×対物レンズを用いて観察を行った。
【0029】
ウエスタンブロット
ＳＤＳバッファー（Tris-HCl pH ６．８、５％ＳＤＳ、０．２mM ＥＤＴＡ）中でホモジナイズおよび超音波処理することによって細胞溶解物を調製した。Pierce BCA Protein Assay Kitを使用してタンパク質の定量を実施した。試料を２×Tricine-SDSサンプルバッファー中で混合し、煮沸し、Novex（商標）１６％ Tricine Protein Gelsで分離した。次いで、試料をニトロセルロース膜上に転写し、ミルクを用いて室温で６０分間ブロッキングし、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ中で希釈した抗ＣＤ５９（１／５００；Santa Cruz Biotechnology, sc-133170）、抗Ｅｍｍ（１：１０）または抗アクチン（１：１０００；Cell Signaling, #5125）で一晩プローブ反応を行った。ケミルミネッセンスキット（Clarity Western ECL Substrate, Bio-Rad）を使用して、免疫複合体を抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Abliance）または抗マウスＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）により明らかにした。
ＳＤＳバッファー（Tris-HCl pH ６．８、５％ＳＤＳ、０．２mM ＥＤＴＡ）中でホモジナイズおよび超音波処理することによって細胞溶解物を調製した。Pierce BCA Protein Assay Kitを使用してタンパク質の定量を実施した。試料を２×Tricine-SDSサンプルバッファー中で混合し、煮沸し、Novex（商標）１６％ Tricine Protein Gelsで分離した。次いで、試料をニトロセルロース膜上に転写し、ミルクを用いて室温で６０分間ブロッキングし、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ中で希釈した抗ＣＤ５９（１／５００；Santa Cruz Biotechnology, sc-133170）、抗Ｅｍｍ（１：１０）または抗アクチン（１：１０００；Cell Signaling, #5125）で一晩プローブ反応を行った。ケミルミネッセンスキット（Clarity Western ECL Substrate, Bio-Rad）を使用して、免疫複合体を抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Abliance）または抗マウスＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）により明らかにした。
【0030】
ＣＤ５９の免疫沈降
Ｅｍｍ陽性およびＥｍｍ陰性の対象由来のＲＢＣゴーストを、ＰＢＳ／ＢＳＡ中でマウスモノクローナル抗ＣＤ５９抗体（１：５０；BD Pharmagen）と４℃で一晩インキュベートした。試料を、溶解バッファー（５０mM Tris-HCl pH ８、１５０mM ＮａＣｌ、０．５％Igepal、０．２５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．００２５％ＳＤＳ）中、氷上で６０分間溶解し、溶解物を遠心分離（４℃で１５０００ｇを１５分間）によって清澄化した。UltraLink Immobilized Protein A/G（Pierce）を用いて免疫複合体を精製し、免疫沈降したタンパク質を２×Tricine-SDSサンプルバッファー中に９５℃で５分間溶出させ、上記の通りウエスタンブロットによって分析した。
Ｅｍｍ陽性およびＥｍｍ陰性の対象由来のＲＢＣゴーストを、ＰＢＳ／ＢＳＡ中でマウスモノクローナル抗ＣＤ５９抗体（１：５０；BD Pharmagen）と４℃で一晩インキュベートした。試料を、溶解バッファー（５０mM Tris-HCl pH ８、１５０mM ＮａＣｌ、０．５％Igepal、０．２５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．００２５％ＳＤＳ）中、氷上で６０分間溶解し、溶解物を遠心分離（４℃で１５０００ｇを１５分間）によって清澄化した。UltraLink Immobilized Protein A/G（Pierce）を用いて免疫複合体を精製し、免疫沈降したタンパク質を２×Tricine-SDSサンプルバッファー中に９５℃で５分間溶出させ、上記の通りウエスタンブロットによって分析した。
【0031】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＫ５６２におけるＰＩＧＡ、ＰＩＧＧ、ＰＩＧＮ、ＰＩＧＯ、ＰＩＧＳおよびＭＰＰＥ１の破壊
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術による遺伝子編集を過去に記載されている通り実施した１２、１３。ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）発現ベクターをAddgeneから購入した（プラスミド#48139）。各遺伝子に対して、３つのＲＮＡガイドをCRISPRdirect：http://crispr.dbcls.jp/により選択した１４。オリゴヌクレオチドを、ＢｂｓＩで線形化したＰＸ４５９プラスミドにライゲーションした。各クローニングガイド配列の完全性を、ＰＸ４５９プラスミドシーケンシングプライマーを用いたサンガーシーケンシングによってチェックした。得られたプラスミドをNucleoBond Xtra Midi Plus EF（Macheray-Nagel）を用いて精製した。Nucleofector II（キットV-T-016プログラム-Lonza）を使用して、５マイクログラムのプラスミドを１０６個のＫ－５６２細胞にエレクトロポーションした。エレクトロポーションの４８時間前に、細胞を１５０，０００個の細胞/mLの密度で播種した。生存率は、トランスフェクション当日、＞９５％であった。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトしたＫ５６２細胞を、培養培地中でピューロマイシン（３～４日の間、３～５μg/mL）と共に選択が行われるまで成長させた。次いで、細胞をピューロマイシンなしで成長させた。トランスフェクションの１５日後、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ酵素（New England Biolabs）を使用して標的エクソンにおけるＩＮＤＥＬイベントの発生を評価した。Ｋ５６２ ＷＴ細胞は、ガイドＲＮＡ－ガイドなしでＣａｓ９ヌクレアーゼのみトランスフェクトしたＫ５６２細胞に相当する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術による遺伝子編集を過去に記載されている通り実施した１２、１３。ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）発現ベクターをAddgeneから購入した（プラスミド#48139）。各遺伝子に対して、３つのＲＮＡガイドをCRISPRdirect：http://crispr.dbcls.jp/により選択した１４。オリゴヌクレオチドを、ＢｂｓＩで線形化したＰＸ４５９プラスミドにライゲーションした。各クローニングガイド配列の完全性を、ＰＸ４５９プラスミドシーケンシングプライマーを用いたサンガーシーケンシングによってチェックした。得られたプラスミドをNucleoBond Xtra Midi Plus EF（Macheray-Nagel）を用いて精製した。Nucleofector II（キットV-T-016プログラム-Lonza）を使用して、５マイクログラムのプラスミドを１０６個のＫ－５６２細胞にエレクトロポーションした。エレクトロポーションの４８時間前に、細胞を１５０，０００個の細胞/mLの密度で播種した。生存率は、トランスフェクション当日、＞９５％であった。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトしたＫ５６２細胞を、培養培地中でピューロマイシン（３～４日の間、３～５μg/mL）と共に選択が行われるまで成長させた。次いで、細胞をピューロマイシンなしで成長させた。トランスフェクションの１５日後、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ酵素（New England Biolabs）を使用して標的エクソンにおけるＩＮＤＥＬイベントの発生を評価した。Ｋ５６２ ＷＴ細胞は、ガイドＲＮＡ－ガイドなしでＣａｓ９ヌクレアーゼのみトランスフェクトしたＫ５６２細胞に相当する。
【0032】
プラスミド構築および細胞トランスフェクション
ヒトＰＩＧＧ ＷＴ ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｃ－ｅＧＦＰベクター（GeneScriptによって提供される）において得て、ｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）にサブクローニングした。ＰＩＧＧ Ｈ２１６Ｙ変異体ｃＤＮＡを得るために、Agilent QuikChange部位特異的変異導入キットを製造業者の説明書に従って使用した。
ヒトＰＩＧＧ ＷＴ ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｃ－ｅＧＦＰベクター（GeneScriptによって提供される）において得て、ｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）にサブクローニングした。ＰＩＧＧ Ｈ２１６Ｙ変異体ｃＤＮＡを得るために、Agilent QuikChange部位特異的変異導入キットを製造業者の説明書に従って使用した。
【0033】
Ｋ５６２ ＰＩＧＧ ＫＯ細胞に、Amaxa（登録商標）Cell Line Nucleofector（登録商標）Kit V（Lonza）を製造業者の説明書に従って使用して、５μgのｐＣＥＰ４－Ｅｍｐｔｙ、ｐＣＥＰ４－ｈＰＩＧＧＷＴまたはｐＣＥＰ４－ｈＰＩＧＧＨ２１４Ｙをトランスフェクトした。ハイグロマイシンＢ（０．２mg/mL、Invitrogen）による選択の１０日後、安定したトランスフェクタントを得た。
【0034】
脂質吸着
Ｅｍｍ陽性およびＥｍｍ陰性の対象由来の融解させたＲＢＣを、１％メタノールを含有するＰＢＳ中、ブタ脳極性脂質抽出物（Avanti）０．５mgと１２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、Ｅｍｍ抗原の表面レベルをフローサイトメトリーによって解析した。
Ｅｍｍ陽性およびＥｍｍ陰性の対象由来の融解させたＲＢＣを、１％メタノールを含有するＰＢＳ中、ブタ脳極性脂質抽出物（Avanti）０．５mgと１２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、Ｅｍｍ抗原の表面レベルをフローサイトメトリーによって解析した。
【0035】
結果
ＰＩＧＧは、Ｅｍｍ血液型の基礎をなす
Ｅｍｍ血液型抗原の分子学的基礎を特定するために、３名の親族でないＥｍｍ陰性非ＰＮＨ発端者（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）由来のゲノムＤＮＡで全エクソームシーケンシングを実施した。バリアント－フィルタリング戦略は、共通遺伝子ＰＩＧＧ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１１２７１７８）の３つの変異の特定へと導いた。発端者１は、ホモ接合性バリアントｃ．６４０Ｃ＞Ｔ；（ｐ．Ｈｉｓ２１４Ｔｙｒ）を保有し（データ示さず）、これは、公開データベースおよび社内データベース（イマジン研究所、Polyweb）には存在しない。発端者２は、イントロン５のスプライスドナー部位の＋１位でのＧ欠失についてホモ接合性であった（ｃ．９０１＋１ｄｅｌＧ）（データ示さず）。スプライス変異は、gnomADにおいて、対立遺伝子頻度が９／２４８２６８で、ヘテロ接合状態でのみ報告されている。発端者３は、エクソン６が除去された４kbの欠失を保有する（データ示さず）。ＰＩＧＧは、ＧＰＩの第２のマンノース上の側鎖修飾の付加に関与する、９８３個のアミノ酸タンパク質であるＧＰＩエタノールアミンリン酸（ＥｔＮＰ）トランスフェラーゼ２（ホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＧとしても知られる）をコードする１５。特異的な抗Ｅｍｍ抗体溶出液を用いたＥｍｍ陰性ＲＢＣのフローサイトメトリー解析により、ＰＩＧＧが変異したＲＢＣにおいてＥｍｍ抗原が存在しないことが確認された一方で、ＧＰＩ－ＡＰ ＣＤ５９は正常に発現していた（データ示さず）。次に、Ｅｍｍ発現がＰＩＧＧによって制御されることを立証するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチを使用し、Ｋ５６２細胞においてこの遺伝子を不活化した。注目すべきことに、フローサイトメトリー解析は、ＰＩＧＧノックアウト細胞におけるＥｍｍ発現の強い減少とＣＤ５９の正常な発現を明らかにした（データ示さず）。加えて、Ｐ１発端者において見いだされたｐ．Ｈｉｓ２１４Ｔｙｒバリアントを有するＰＩＧＧ ｃＤＮＡは、これらの細胞においてＥｍｍの表面存在量を救済できなかったが、野生型（ＷＴ）ＰＩＧＧの過剰発現は、それが可能であった（データ示さず）。ＧＰＩ生合成は、ＥＲ膜上で行われるが、非透過処理のＷＴ細胞およびＰＩＧＧ欠損細胞の免疫蛍光染色は、Ｅｍｍ抗原の細胞表面発現を確認した（データ示さず）。これらの結果は、ＰＩＧＧ遺伝子がＥｍｍ血液型抗原の基礎をなすことを示す。
ＰＩＧＧは、Ｅｍｍ血液型の基礎をなす
Ｅｍｍ血液型抗原の分子学的基礎を特定するために、３名の親族でないＥｍｍ陰性非ＰＮＨ発端者（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）由来のゲノムＤＮＡで全エクソームシーケンシングを実施した。バリアント－フィルタリング戦略は、共通遺伝子ＰＩＧＧ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１１２７１７８）の３つの変異の特定へと導いた。発端者１は、ホモ接合性バリアントｃ．６４０Ｃ＞Ｔ；（ｐ．Ｈｉｓ２１４Ｔｙｒ）を保有し（データ示さず）、これは、公開データベースおよび社内データベース（イマジン研究所、Polyweb）には存在しない。発端者２は、イントロン５のスプライスドナー部位の＋１位でのＧ欠失についてホモ接合性であった（ｃ．９０１＋１ｄｅｌＧ）（データ示さず）。スプライス変異は、gnomADにおいて、対立遺伝子頻度が９／２４８２６８で、ヘテロ接合状態でのみ報告されている。発端者３は、エクソン６が除去された４kbの欠失を保有する（データ示さず）。ＰＩＧＧは、ＧＰＩの第２のマンノース上の側鎖修飾の付加に関与する、９８３個のアミノ酸タンパク質であるＧＰＩエタノールアミンリン酸（ＥｔＮＰ）トランスフェラーゼ２（ホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＧとしても知られる）をコードする１５。特異的な抗Ｅｍｍ抗体溶出液を用いたＥｍｍ陰性ＲＢＣのフローサイトメトリー解析により、ＰＩＧＧが変異したＲＢＣにおいてＥｍｍ抗原が存在しないことが確認された一方で、ＧＰＩ－ＡＰ ＣＤ５９は正常に発現していた（データ示さず）。次に、Ｅｍｍ発現がＰＩＧＧによって制御されることを立証するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチを使用し、Ｋ５６２細胞においてこの遺伝子を不活化した。注目すべきことに、フローサイトメトリー解析は、ＰＩＧＧノックアウト細胞におけるＥｍｍ発現の強い減少とＣＤ５９の正常な発現を明らかにした（データ示さず）。加えて、Ｐ１発端者において見いだされたｐ．Ｈｉｓ２１４Ｔｙｒバリアントを有するＰＩＧＧ ｃＤＮＡは、これらの細胞においてＥｍｍの表面存在量を救済できなかったが、野生型（ＷＴ）ＰＩＧＧの過剰発現は、それが可能であった（データ示さず）。ＧＰＩ生合成は、ＥＲ膜上で行われるが、非透過処理のＷＴ細胞およびＰＩＧＧ欠損細胞の免疫蛍光染色は、Ｅｍｍ抗原の細胞表面発現を確認した（データ示さず）。これらの結果は、ＰＩＧＧ遺伝子がＥｍｍ血液型抗原の基礎をなすことを示す。
【0036】
Ｅｍｍ抗原は、遊離ＧＰＩに相当する
Ｅｍｍ抗原は、ＰＩＧＡ遺伝子の体細胞ヌル変異によって引き起こされるＰＮＨ ＩＩＩ型細胞において発現されないことから２、本発明者らは、ＰＩＧＡ欠損Ｋ５６２細胞においてＥｍｍ発現を調べた。予想通り、これらの細胞は、ＣＤ５９およびＥｍｍ抗原を喪失しており（データ示さず）、このことから、Ｅｍｍ発現がＧＰＩに関連することが確認される。次に、Ｅｍｍ抗原がＧＰＩ骨格によって担持されるかまたはＧＰＩに付着しているタンパク質によって担持されるかを検討するために、本発明者らは、タンパク質へのＧＰＩ付着を担っているＧＰＩ－トランスアミダーゼ複合体の主要タンパク質であるＰＩＧＳを不活化した１６。興味深いことに、フローサイトメトリー解析は、Ｋ５６２細胞におけるＰＩＧＳのノックアウトが、Ｅｍｍ発現を強く増加させ、そして、予想通り、ＣＤ５９発現を無効にすることを示した（データ示さず）。したがって、透過処理した細胞の免疫蛍光染色は、Ｅｍｍの細胞内局在がＰＩＧＳ不活化後に細胞表面にシフトしたことを示し（データ示さず）、このことは、Ｅｍｍが、ＧＰＩに付着しているタンパク質によって担持されないことを示している。
Ｅｍｍ抗原は、ＰＩＧＡ遺伝子の体細胞ヌル変異によって引き起こされるＰＮＨ ＩＩＩ型細胞において発現されないことから２、本発明者らは、ＰＩＧＡ欠損Ｋ５６２細胞においてＥｍｍ発現を調べた。予想通り、これらの細胞は、ＣＤ５９およびＥｍｍ抗原を喪失しており（データ示さず）、このことから、Ｅｍｍ発現がＧＰＩに関連することが確認される。次に、Ｅｍｍ抗原がＧＰＩ骨格によって担持されるかまたはＧＰＩに付着しているタンパク質によって担持されるかを検討するために、本発明者らは、タンパク質へのＧＰＩ付着を担っているＧＰＩ－トランスアミダーゼ複合体の主要タンパク質であるＰＩＧＳを不活化した１６。興味深いことに、フローサイトメトリー解析は、Ｋ５６２細胞におけるＰＩＧＳのノックアウトが、Ｅｍｍ発現を強く増加させ、そして、予想通り、ＣＤ５９発現を無効にすることを示した（データ示さず）。したがって、透過処理した細胞の免疫蛍光染色は、Ｅｍｍの細胞内局在がＰＩＧＳ不活化後に細胞表面にシフトしたことを示し（データ示さず）、このことは、Ｅｍｍが、ＧＰＩに付着しているタンパク質によって担持されないことを示している。
【0037】
この知見を確認するために、次いで、本発明者らは、抗Ｅｍｍ抗体を、作製したＫＯ Ｋ５６２細胞株のウエスタンブロット分析に使用した。興味深いことに、１８０～１０kDaの領域でＧＰＩ－ＡＰに対応する特異的なバンドは検出されなかったが、ＷＴ Ｋ５６２細胞では１０kDaマーカーの下に特異的なバンドが出現し、ＰＩＧＧおよびＰＩＧＡ ＫＯ細胞では出現しなかった（データ示さず）。フローサイトメトリーデータによれば、Ｅｍｍバンドの強度は、ＰＩＧＳ ＫＯ細胞において増強された（データ示さず）。これらの結果は、Ｅｍｍ抗原が、非結合ＧＰＩ（遊離ＧＰＩ）によって担持されることを示しており、このことは、極性脂質抽出物（おそらく非結合ＧＰＩ糖脂質を含有する）とインキュベーションした際のＥｍｍ陰性および対照ＲＢＣのＥｍｍ標識の増加によってさらに裏付けられた（データ示さず）。加えて、ＰＩＧＧはＥｍｍ発現の基礎をなすので、本発明者らは、抗Ｅｍｍが、遊離ＧＰＩの第２のマンノース上のＥｔＮＰを認識すると結論付ける。しかしながら、ＰＩＧＧによって転移されるこのＥｔＮＰは、ＧＰＩがタンパク質に付着した後にホスホジエステラーゼＰＧＡＰ５（ＭＰＰＥ１遺伝子によってコードされる）によって除去され、ほとんどの成熟ＧＰＩ－ＡＰに存在しない（データ示さず）９。ＧＰＩ－ＡＰ中のＥｔＮＰ２の存在がＥｍｍ発現の増加を招くのかどうかを判定するために（データ示さず）、本発明者らは、ＰＧＡＰ５欠損細胞（ＭＰＰＥ１ ＫＯ細胞）を作製し、抗Ｅｍｍを用いてこれらを分析した。フローサイトメトリーおよび免疫蛍光分析は、ＰＧＡＰ５不活化がＥｍｍの発現を増加させないが、ＧＰＩ－ＡＰは正常に発現することを示した（データ示さず）。ＣＤ５９およびＥｍｍの正常発現は、ウエスタンブロット分析によって確認されたが、このことは、Ｅｍｍバンドの移動プロファイルが未変化のままであることも示している（データ示さず）。
【0038】
最後に、Ｅｍｍ陰性および対照ＲＢＣ由来のＣＤ５９の免疫沈降を実施した。予想通り、Ｅｍｍ抗原は、Ｅｍｍ陽性ＲＢＣ由来のＣＤ５９と共沈降しなかった（データ示さず）。これらのすべてのデータは、抗Ｅｍｍが、ＧＰＩ－ＡＰ中の第２のＥｔＮＰを認識しないことを示し、Ｅｍｍ抗原が、遊離ＧＰＩによって担持されることを確認した。
【0039】
Ｅｍｍエピトープは、遊離ＧＰＩの第２および第３のＥｔＮＰから構成される
ＧＰＩのコア骨格は、３つのＥｔＮＰ、３つのマンノース（Ｍａｎ）、１つのＮ－アセチル化されていないグルコサミン、およびイノシトールリン脂質によって形成される。各マンノースは、１つのＥｔＮＰ基によって修飾される。ＥｔＮＰのＭａｎ１、Ｍａｎ２およびＭａｎ３への転移は、それぞれ、３つのＥｔＮＰトランスフェラーゼＰＩＧＮ、ＰＩＧＧおよびＰＩＧＯによって触媒される（データ示さず）１５、１７、１８。ＥｔＮＰ２に加え、ＥｔＮＰ１および／またはＥｔＮＰ３も、抗Ｅｍｍによって認識される遊離ＧＰＩエピトープの一部であるかどうかを判定するために、本発明者らは、ＰＩＧＮおよびＰＩＧＯ ＫＯ細胞を作製した。フローサイトメトリー解析は、ＷＴ Ｋ５６２細胞におけるＰＩＧＮのノックアウトが、細胞表面抗Ｅｍｍ染色を弱く増加させる一方で、ＰＩＧＯの不活化は、Ｅｍｍの発現を完全に無効にすることを示した（データ示さず）。フローサイトメトリー結果は、抗Ｅｍｍを用いた細胞溶解物のウエスタンブロット分析によって確認された（データ示さず）。概して、本発明者らは、Ｅｍｍエピトープが、遊離ＧＰＩの第２および第３のＥｔＮＰから構成されることを実証する。
ＧＰＩのコア骨格は、３つのＥｔＮＰ、３つのマンノース（Ｍａｎ）、１つのＮ－アセチル化されていないグルコサミン、およびイノシトールリン脂質によって形成される。各マンノースは、１つのＥｔＮＰ基によって修飾される。ＥｔＮＰのＭａｎ１、Ｍａｎ２およびＭａｎ３への転移は、それぞれ、３つのＥｔＮＰトランスフェラーゼＰＩＧＮ、ＰＩＧＧおよびＰＩＧＯによって触媒される（データ示さず）１５、１７、１８。ＥｔＮＰ２に加え、ＥｔＮＰ１および／またはＥｔＮＰ３も、抗Ｅｍｍによって認識される遊離ＧＰＩエピトープの一部であるかどうかを判定するために、本発明者らは、ＰＩＧＮおよびＰＩＧＯ ＫＯ細胞を作製した。フローサイトメトリー解析は、ＷＴ Ｋ５６２細胞におけるＰＩＧＮのノックアウトが、細胞表面抗Ｅｍｍ染色を弱く増加させる一方で、ＰＩＧＯの不活化は、Ｅｍｍの発現を完全に無効にすることを示した（データ示さず）。フローサイトメトリー結果は、抗Ｅｍｍを用いた細胞溶解物のウエスタンブロット分析によって確認された（データ示さず）。概して、本発明者らは、Ｅｍｍエピトープが、遊離ＧＰＩの第２および第３のＥｔＮＰから構成されることを実証する。
【0040】
Ｅｍｍ抗原の表面発現は、ＩＧＤ患者由来のＲＢＣにおいて変化する
重要なことに、Ｅｍｍ抗原の発現レベルは、ＧＰＩ生合成に関与するいくつかの遺伝子の制御下にあり、このことは、ＰＩＧ遺伝子の機能喪失型変異が、弱いＥｍｍ血液表現型と関連し得ることを示唆している。この点は、少なくとも２１個のＰＩＧ遺伝子の生殖細胞変異によって引き起こされるＩＧＤを有する患者由来の細胞を分析するのに非常に重要である。ＩＧＤ患者では、血液細胞におけるＧＰＩ－ＡＰの発現レベルは、遺伝子欠陥の指標となることはほとんどなく、臨床表現型の重症度と相関しなかった１９。この知見は、ＰＩＧＧの病原性Ｈｉｓ２１４Ｔｙｒ変異によって潜在的に引き起こされる知的障害および筋緊張低下１を患っていても（データ示さず）、Ｐ１発端者由来のＲＢＣでＣＤ５９が正常発現された（データ示さず）ことによって確認される。それに反して、Ｅｍｍ陰性表現型（データ示さず）は、ＧＰＩ生合成の欠陥を示した。したがって、本発明者らは、ＩＧＤに関与する他のＰＩＧ遺伝子の病原性変異が、ＲＢＣ表面でのＥｍｍ抗原の低発現と関連するかどうかを調査することにした。ＩＧＤ患者は、パリのネッケル病院で臨床的検討を行い、Polywebインターフェースを介してイマジン研究所のエクソームデータベースから選択した（データ示さず）。ＰＩＧＮ患者は、４歳で重度のてんかん発作により突然死した女児であった。彼女は、全般的発達遅延を有し、難治性てんかん、重度の筋緊張低下および筋萎縮症を患っていた。エクソームシーケンシングは、ＰＩＧＮ遺伝子の病原性変異ｃ．２８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９５Ｇｌｎ）を特定した（データ示さず）。この変異は、ＭＣＡＨＳを有する患者で過去に記載されている２０。彼女のＲＢＣのフローサイトメトリー解析は、対照ＲＢＣの場合と比較して、ＣＤ５９の正常な発現レベルおよびＥｍｍ発現のわずかな増加を示した（データ示さず）。これらのＲＢＣにおけるＥｍｍ発現の増加は、ＰＩＧＮ欠損Ｋ５６２細胞株と一致する（データ示さず）。ＰＩＧＯ患者は、知的障害、脳萎縮症、筋緊張低下および遅延性精神運動発達を患っているエジプト人の血縁親の１０歳の息子である（データ示さず）。ＰＩＧＯのｃ．２３Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ８Ｐｒｏ）バリアントは、別のＩＧＤ患者で報告されている（ＣｌｉｎＶａｒデータベース、ｒｓ７５５１９１２６３）。興味深いことに、この患者由来のＲＢＣのフローサイトメトリー解析は、Ｅｍｍ発現の強い減少を示した一方で、ＣＤ５９発現は、無関係の対照の場合と比較してわずかに低下した（データ示さず）。最後に、ＰＩＧＡ患者は、不応性てんかんおよび重度の発達遅延（言語発達および運動能力の遅延を含む）を患っている６歳の男児である；彼は、寝たきりで、アイコンタクトができない（データ示さず）。この患者は、母性病原性変異ｃ．２４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８１Ｃｙｓ）を保有し、これは、ＭＣＡＨＳを有する別の患者で報告された２１。フローサイトメトリー解析は、ＰＩＧＡの生殖細胞変異ｃ．２４１Ｃ＞Ｔがこの患者の異常な発達の原因であるが、この変異が成熟ＲＢＣにおけるＥｍｍおよびＣＤ５９発現に深刻な影響を及ぼさないことを示した（データ示さず）。まとめると、ＰＩＧＧおよびＰＩＧＯ遺伝子の病原性バリアントから生じる臨床的特徴は、ＲＢＣにおけるＥｍｍの発現変化によって裏付けられた一方で、ＧＰＩ－ＡＰの発現は変化しなかった。
重要なことに、Ｅｍｍ抗原の発現レベルは、ＧＰＩ生合成に関与するいくつかの遺伝子の制御下にあり、このことは、ＰＩＧ遺伝子の機能喪失型変異が、弱いＥｍｍ血液表現型と関連し得ることを示唆している。この点は、少なくとも２１個のＰＩＧ遺伝子の生殖細胞変異によって引き起こされるＩＧＤを有する患者由来の細胞を分析するのに非常に重要である。ＩＧＤ患者では、血液細胞におけるＧＰＩ－ＡＰの発現レベルは、遺伝子欠陥の指標となることはほとんどなく、臨床表現型の重症度と相関しなかった１９。この知見は、ＰＩＧＧの病原性Ｈｉｓ２１４Ｔｙｒ変異によって潜在的に引き起こされる知的障害および筋緊張低下１を患っていても（データ示さず）、Ｐ１発端者由来のＲＢＣでＣＤ５９が正常発現された（データ示さず）ことによって確認される。それに反して、Ｅｍｍ陰性表現型（データ示さず）は、ＧＰＩ生合成の欠陥を示した。したがって、本発明者らは、ＩＧＤに関与する他のＰＩＧ遺伝子の病原性変異が、ＲＢＣ表面でのＥｍｍ抗原の低発現と関連するかどうかを調査することにした。ＩＧＤ患者は、パリのネッケル病院で臨床的検討を行い、Polywebインターフェースを介してイマジン研究所のエクソームデータベースから選択した（データ示さず）。ＰＩＧＮ患者は、４歳で重度のてんかん発作により突然死した女児であった。彼女は、全般的発達遅延を有し、難治性てんかん、重度の筋緊張低下および筋萎縮症を患っていた。エクソームシーケンシングは、ＰＩＧＮ遺伝子の病原性変異ｃ．２８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９５Ｇｌｎ）を特定した（データ示さず）。この変異は、ＭＣＡＨＳを有する患者で過去に記載されている２０。彼女のＲＢＣのフローサイトメトリー解析は、対照ＲＢＣの場合と比較して、ＣＤ５９の正常な発現レベルおよびＥｍｍ発現のわずかな増加を示した（データ示さず）。これらのＲＢＣにおけるＥｍｍ発現の増加は、ＰＩＧＮ欠損Ｋ５６２細胞株と一致する（データ示さず）。ＰＩＧＯ患者は、知的障害、脳萎縮症、筋緊張低下および遅延性精神運動発達を患っているエジプト人の血縁親の１０歳の息子である（データ示さず）。ＰＩＧＯのｃ．２３Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ８Ｐｒｏ）バリアントは、別のＩＧＤ患者で報告されている（ＣｌｉｎＶａｒデータベース、ｒｓ７５５１９１２６３）。興味深いことに、この患者由来のＲＢＣのフローサイトメトリー解析は、Ｅｍｍ発現の強い減少を示した一方で、ＣＤ５９発現は、無関係の対照の場合と比較してわずかに低下した（データ示さず）。最後に、ＰＩＧＡ患者は、不応性てんかんおよび重度の発達遅延（言語発達および運動能力の遅延を含む）を患っている６歳の男児である；彼は、寝たきりで、アイコンタクトができない（データ示さず）。この患者は、母性病原性変異ｃ．２４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８１Ｃｙｓ）を保有し、これは、ＭＣＡＨＳを有する別の患者で報告された２１。フローサイトメトリー解析は、ＰＩＧＡの生殖細胞変異ｃ．２４１Ｃ＞Ｔがこの患者の異常な発達の原因であるが、この変異が成熟ＲＢＣにおけるＥｍｍおよびＣＤ５９発現に深刻な影響を及ぼさないことを示した（データ示さず）。まとめると、ＰＩＧＧおよびＰＩＧＯ遺伝子の病原性バリアントから生じる臨床的特徴は、ＲＢＣにおけるＥｍｍの発現変化によって裏付けられた一方で、ＧＰＩ－ＡＰの発現は変化しなかった。
【0041】
考察：
この研究における主な知見は、遊離の非結合ＧＰＩが、ＲＢＣ表面で発現され、Ｅｍｍ血液抗原を担持することである。これまで、ＧＰＩは、ＹＴ、ＤＯ、ＣＲＯＭ、ＪＭＨ、ＣＤ５９およびＫＡＮＮＯを含む６つの他の血液型系の発現に関与するとされている２、２２、２３。しかしながら、Ｅｍｍは、ＧＰＩ骨格によって担持される唯一の抗原であり、ＧＰＩに結合しているタンパク質には担持されない。ＧＰＩは、ＥＲにおいて合成されるが、哺乳動物細胞ならびにトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）および熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）などの寄生虫において、細胞表面にいくつかのＧＰＩ前駆体の存在が報告されている２４、２５。マラリア原虫（Plasmodium）の遊離ＧＰＩは、高免疫原性であり、マラリア流行地域の住民に寄生虫特異的ＩｇＧ反応を誘発する２５。一貫して、本発明者らの新たに特徴付けた抗遊離ＧＰＩである抗Ｅｍｍは、すべてのＥｍｍ陰性患者において天然に存在する抗体として記載されることが多かった。加えて、抗Ｅｍｍは、３つのＥｔＮＰを含有するＧＰＩ前駆体を認識するが、第２および第３のＥｔＮＰだけがそのエピトープに含まれる。ＰＩＧＧによって転移される第２のＥｔＮＰは、ＰＧＡＰ５によって除去される成熟ＧＰＩ－ＡＰに存在しない一過性の側鎖である（データ示さず）９。ＰＧＡＰ５欠損細胞におけるＥｍｍの正常な表面発現は、抗Ｅｍｍが、遊離ＧＰＩに特異的であるという事実と合致する。概して、本発明者らは、遊離ＧＰＩが、ヒトの赤血球細胞表面で発現され、細胞膜の正常な構成要素であるという明確な証明を提供する。ヒト細胞における遊離ＧＰＩの生理学的役割についてほとんど知られていないが、本発明者らは、最近、ＰＩＧＴ変異を有するＰＮＨ患者における遊離ＧＰＩの病理学的効果を報告している５。ＰＩＧＴ欠損は、ＮＬＲＰ３インフラマソームおよび補体の活性化を増強する非結合遊離ＧＰＩの異常な蓄積をもたらす。ＰＩＧＡ－ＰＮＨとＰＩＧＴ－ＰＮＨは共にＧＰＩ－ＡＰ欠損を特徴とするが、これらは、異なる分子変化を呈する。ＰＩＧＳと同じく、ＰＩＧＴは、ＥＲにおいてＧＰＩがタンパク質に付着する際に関与するＧＰＩトランスアミダーゼである１６。ＰＩＧＡは、ＧＰＩ生合成の最初の工程に必要とされる；それゆえ、ＰＩＧＡ欠損細胞ではＧＰＩ前駆体は生成されない（データ示さず）。一貫して、Ｅｍｍ抗原（遊離ＧＰＩ）は、ＰＩＧＳ ＫＯ細胞において高発現されるが（データ示さず）、ＰＩＧＡ－ＰＮＨ ＲＢＣには存在しない２。概して、抗Ｅｍｍは、ＧＰＩ欠陥を検出するための新しい有用なツールとして現れ、Ｅｍｍの表現型判定を、ＰＮＨ疾患の診断のためのＧＰＩ－ＡＰ分析に関連付けることができる。
この研究における主な知見は、遊離の非結合ＧＰＩが、ＲＢＣ表面で発現され、Ｅｍｍ血液抗原を担持することである。これまで、ＧＰＩは、ＹＴ、ＤＯ、ＣＲＯＭ、ＪＭＨ、ＣＤ５９およびＫＡＮＮＯを含む６つの他の血液型系の発現に関与するとされている２、２２、２３。しかしながら、Ｅｍｍは、ＧＰＩ骨格によって担持される唯一の抗原であり、ＧＰＩに結合しているタンパク質には担持されない。ＧＰＩは、ＥＲにおいて合成されるが、哺乳動物細胞ならびにトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）および熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）などの寄生虫において、細胞表面にいくつかのＧＰＩ前駆体の存在が報告されている２４、２５。マラリア原虫（Plasmodium）の遊離ＧＰＩは、高免疫原性であり、マラリア流行地域の住民に寄生虫特異的ＩｇＧ反応を誘発する２５。一貫して、本発明者らの新たに特徴付けた抗遊離ＧＰＩである抗Ｅｍｍは、すべてのＥｍｍ陰性患者において天然に存在する抗体として記載されることが多かった。加えて、抗Ｅｍｍは、３つのＥｔＮＰを含有するＧＰＩ前駆体を認識するが、第２および第３のＥｔＮＰだけがそのエピトープに含まれる。ＰＩＧＧによって転移される第２のＥｔＮＰは、ＰＧＡＰ５によって除去される成熟ＧＰＩ－ＡＰに存在しない一過性の側鎖である（データ示さず）９。ＰＧＡＰ５欠損細胞におけるＥｍｍの正常な表面発現は、抗Ｅｍｍが、遊離ＧＰＩに特異的であるという事実と合致する。概して、本発明者らは、遊離ＧＰＩが、ヒトの赤血球細胞表面で発現され、細胞膜の正常な構成要素であるという明確な証明を提供する。ヒト細胞における遊離ＧＰＩの生理学的役割についてほとんど知られていないが、本発明者らは、最近、ＰＩＧＴ変異を有するＰＮＨ患者における遊離ＧＰＩの病理学的効果を報告している５。ＰＩＧＴ欠損は、ＮＬＲＰ３インフラマソームおよび補体の活性化を増強する非結合遊離ＧＰＩの異常な蓄積をもたらす。ＰＩＧＡ－ＰＮＨとＰＩＧＴ－ＰＮＨは共にＧＰＩ－ＡＰ欠損を特徴とするが、これらは、異なる分子変化を呈する。ＰＩＧＳと同じく、ＰＩＧＴは、ＥＲにおいてＧＰＩがタンパク質に付着する際に関与するＧＰＩトランスアミダーゼである１６。ＰＩＧＡは、ＧＰＩ生合成の最初の工程に必要とされる；それゆえ、ＰＩＧＡ欠損細胞ではＧＰＩ前駆体は生成されない（データ示さず）。一貫して、Ｅｍｍ抗原（遊離ＧＰＩ）は、ＰＩＧＳ ＫＯ細胞において高発現されるが（データ示さず）、ＰＩＧＡ－ＰＮＨ ＲＢＣには存在しない２。概して、抗Ｅｍｍは、ＧＰＩ欠陥を検出するための新しい有用なツールとして現れ、Ｅｍｍの表現型判定を、ＰＮＨ疾患の診断のためのＧＰＩ－ＡＰ分析に関連付けることができる。
【0042】
ＧＰＩの生合成障害は、いくつかの異なる遺伝的機序によって引き起こされる。ＰＮＨ疾患では、ＧＰＩ欠損症は、造血幹細胞（ＨＳＣ）において起こるＰＩＧＡの体細胞ヌルまたはほぼヌル変異によって引き起こされる。それに反して、ＰＩＧＡおよび他のＰＩＧ遺伝子の生殖細胞変異は、ＩＧＤを引き起こす２６。ＰＩＧＡのヌル生殖細胞変異は、胚致死性であると考えられており２７、このことは、本発明者らの患者において見いだされたｐ．Ａｒｇ８１Ｃｙｓが、残存機能を有することを示唆している（データ示さず）。過去の知見２８と合致して、本発明者らのＰＩＧＡ－ＩＧＤ患者由来のＲＢＣにおけるＣＤ５９発現は、強く影響を受けることはなく、このことは、血管内溶血および赤血球の障害が存在しないことと一致する。ＩＧＤ患者におけるＧＰＩ－ＡＰ欠陥は、しばしば、赤血球よりも顆粒球に対してより顕著であり、このことは、ＰＩＧ遺伝子の生殖細胞変異の影響が組織特異的であることを示唆している。この知見に沿って、異なる哺乳動物組織および細胞株の間でＧＰＩ構造に多くの違いが見いだされ、このことから、ＧＰＩアンカーが組織特異的な様式で制御され得ることが示唆される。実際に、ＩＧＤの最も目立つ臨床症状は、発作、発達遅延／知的障害、脳萎縮症および筋緊張低下を含めた神経学的症状である１１。おそらく、ＧＰＩ－ＡＰの部分的な低下は、ｈｉＰＳＣモデルにおいて実証されたように、造血よりもニューロンの発達においてより耐容性が低い２９。一方で、Ｅｍｍ陰性患者に見いだされるＰＩＧＧのホモ接合性ヌル対立遺伝子は、胚致死性を引き起こすことはないが、ＩＧＤを引き起こす（データ示さず）。興味深いことに、これらの変異は、遊離ＧＰＩの完全な欠如をもたらし、ＲＢＣとＰＩＧＧ ＫＯ細胞の両方でＧＰＩ－ＡＰの発現変化はない（データ示さず）。加えて、本発明者らは、ＰＩＧＯ－ＩＧＤ患者におけるＧＰＩ欠陥が、ＲＢＣにおけるＥｍｍの発現変化によっても検出される一方で、ＧＰＩ－ＡＰの発現は変化しないことを示した。これらの知見は、ＰＩＧＧとＰＩＧＯの両遺伝子がＥｍｍのエピトープ構造に関与していることと一致する（データ示さず）。この病理におけるＲＢＣ表面でのＥｍｍ発現の関連性を立証するために、他のＰＩＧ変異を有するＩＧＤ患者でのさらなる分析が必要である。
【0043】
結論として、本発明者らは、Ｅｍｍ抗原がＲＢＣ表面の遊離ＧＰＩによって担持されるという遺伝子と細胞の両方に関する証拠を提供し、Ｅｍｍを新規のヒト血液型系として確立する。抗Ｅｍｍが天然に存在することは、数多くの微生物で報告されている遊離ＧＰＩの高免疫原性と合致し３０、３１、いくつかの感染性因子に対する防御にこの抗体が潜在的役割を果たすことを示唆している。これらの知見は、ヒトの遊離ＧＰＩの生物学的機能およびＧＰＩの細胞内移動を理解する上で重要な意味を持つ。ＧＰＩ－ＡＰ発現研究と比較したＥｍｍ表現型判定アプローチの臨床的意義を評価するために、ＩＧＤおよびＰＮＨ患者でのパイロット研究が必要であろう。
【0044】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【0045】
【表1】
【国際調査報告】