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特表2024-500133アデノ随伴ウイルスベクターを含む改善された医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-04
(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルスベクターを含む改善された医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/76 20150101AFI20231222BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20231222BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20231222BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20231222BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20231222BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20231222BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231222BHJP
A61K 38/37 20060101ALI20231222BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20231222BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231222BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20231222BHJP
【ＦＩ】
A61K35/76
A61P7/04
A61K9/08
A61K47/02
A61K47/10
A61K47/36
A61K48/00
A61K38/37
C12N15/864 100Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/35
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537242
(86)(22)【出願日】2021-12-17
(85)【翻訳文提出日】2023-08-18
(86)【国際出願番号】 US2021064222
(87)【国際公開番号】W WO2022133324
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/127,826
(32)【優先日】2020-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508241200
【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】593141953
【氏名又は名称】ファイザー・インク
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】コナー，ジェシカ アイリーン
(72)【発明者】
【氏名】クロフォード，リンジー アン
(72)【発明者】
【氏名】ダミッツ，ロバート
(72)【発明者】
【氏名】デイビス，ブレンダン マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ホッジ，コディ マイケル
(72)【発明者】
【氏名】キメル ザ セカンド，マイケル リーランド
(72)【発明者】
【氏名】クレシ ウィラード，ティハミ
(72)【発明者】
【氏名】ラムジー，フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】ソーン，ダニエル ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】ヤング，アンソニー リー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB13
4C076CC14
4C076DD23
4C076DD26
4C076DD38
4C076EE23
4C076EE30
4C076FF11
4C076FF18
4C076FF36
4C076FF61
4C076FF63
4C076GG45
4C076GG50
4C084AA13
4C084DC15
4C084MA02
4C084MA05
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA10
4C084ZA531
4C084ZA532
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA02
4C087MA05
4C087MA17
4C087MA66
4C087NA03
4C087NA05
4C087NA10
4C087ZA53
(57)【要約】
本発明は、組換えＡＡＶおよび１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。前記組成物は、他のＡＡＶ組成物と比較して改善された安定性および半減期を有する
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、
塩化カリウム（ＫＣｌ）、
リン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、
リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、
塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、
ポリオール、および
ポロキサマー
を含む、医薬組成物であって、適宜、前記医薬組成物が、約０．１ｍＭ未満の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物。
【請求項2】
前記ポリオールが、ショ糖である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記医薬組成物が、約０．１～約２．０ｍＭの塩化マグネシウムを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記医薬組成物が、約０．５ｍＭまたはそれ以上の塩化マグネシウムを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記医薬組成物が、約１．４ｍＭの塩化マグネシウムを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記医薬組成物が、約１．３ｍＭ以上の塩化マグネシウムを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記医薬組成物が、約１５０～約２００ｍＭ、適宜、約１７２ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記医薬組成物が、約２．５～約３．０ｍＭ、適宜、約２．７ｍＭの塩化カリウムを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記医薬組成物が、約５～約１０ｍＭ、適宜、約８ｍＭのリン酸二ナトリウムを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記医薬組成物が、約１．０～約２．０ｍＭ、適宜、約１．５ｍＭのリン酸一カリウムを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記医薬組成物が、約０．５％～約２％（ｗ／ｖ）、適宜、約１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記医薬組成物が、約０．０１％～約０．１％（ｗ／ｖ）、適宜、約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、約１７１．８１ｍＭの塩化ナトリウム、
約２．６８ｍＭの塩化カリウム、
約８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、
約１．４７ｍＭのリン酸一カリウム、
約１．４０ｍＭの塩化マグネシウム、
約１．００％（ｗ／ｖ）のショ糖、および
約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８
を含む、医薬組成物であって、適宜、前記医薬組成物が、約０．１ｍＭ未満の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物。
【請求項15】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、 約１７２ｍＭの塩化ナトリウム、
約２．６８ｍＭの塩化カリウム、
約８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、
約１．４７ｍＭのリン酸一カリウム、
約０．４９ｍＭの塩化マグネシウム、
約１．００％（ｗ／ｖ）のショ糖、および
約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８
を含む、医薬組成物であって、適宜、前記医薬組成物が、約０．１ｍＭ未満の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物。
【請求項16】
前記ｒＡＡＶが、治療タンパク質のための発現カセットを含むゲノムを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記治療タンパク質が、ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のための発現カセットを含むゲノムを含む、前記ｒＡＡＶベクター、約１７１．８１ｍＭの塩化ナトリウム、
約２．６８ｍＭの塩化カリウム、
約８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、
約１．４７ｍＭのリン酸一カリウム、
約１．４０ｍＭの塩化マグネシウム、
約１．００％（ｗ／ｖ）のショ糖、および
約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８
を含む、医薬組成物であって、適宜、前記医薬組成物が、約０．１ｍＭ未満の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物。
【請求項19】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド発現のための発現カセットを含むゲノムを含む、前記ｒＡＡＶ、約１７２ｍＭの塩化ナトリウム、
約２．６８ｍＭの塩化カリウム、
約８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、
約１．４７ｍＭのリン酸一カリウム、
約０．４９ｍＭの塩化マグネシウム、
約１．００％（ｗ／ｖ）のショ糖、および
約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８
を含む、医薬組成物であって、適宜、前記医薬組成物が、約０．１ｍＭ未満の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物。
【請求項20】
前記ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、配列番号１を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項21】
前記ｒＡＡＶのゲノムが、配列番号２または配列番号２のヌクレオチド１３１～５０２４を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項22】
前記医薬組成物が、前記ｒＡＡＶを、１ｍＬあたり約１．０Ｅ＋１２～約１．０Ｅ＋１４ベクターゲノム（ｖｇ）、適宜、１ｍＬあたり約１．０Ｅ＋１３～約５．０Ｅ＋１３ｖｇで含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項23】
前記医薬組成物が、１ｍＬあたり約１．０Ｅ＋１３ｖｇを含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項24】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ６カプシドタンパク質を含み、適宜、ＡＡＶ２の逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
５～１０ｍＬ、適宜、６．４ｍＬの請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を含む、バイアル。
【請求項26】
シクロオレフィンコポリマーからなる、請求項２５に記載のバイアル。
【請求項27】
前記バイアルが、所定位置に熱可塑性エラストマー共栓が付いた、請求項２５または２６に記載のバイアル。
【請求項28】
治療タンパク質を必要とする患者を治療する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物を前記患者に投与することを特徴とする、方法。
【請求項29】
増加を必要とするヒト対象における第ＶＩＩＩ因子の血清レベルを増加させる方法であって、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２５～２７のいずれか１項に記載のバイアルの全含有量を、前記ヒト対象に静脈内に投与することを特徴とする、方法。
【請求項30】
前記ヒト対象が、血友病Ａに罹っている、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
治療を必要とするヒト対象における血友病Ａを治療する方法であって、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２５～２７のいずれか１項に記載のバイアルの全含有量を、前記ヒト対象に静脈内に投与することを特徴とする、方法。
【請求項32】
請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法におけるヒト対象の治療薬の製造のための、請求項１～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項33】
請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法におけるヒト対象の治療に使用するための、請求項１～２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる２０２０年１２月１８日に提出の米国出願番号６３／１２７，８２６からの優先権を請求する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる２０２０年１２月１８日に提出の米国出願番号６３／１２７，８２６からの優先権を請求する。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全が参照により本明細書に取り込まれる配列表を含む。ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月１日に作成され、025297_WO029_SL.txtとの名称で１９，９６７バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全が参照により本明細書に取り込まれる配列表を含む。ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月１日に作成され、025297_WO029_SL.txtとの名称で１９，９６７バイトのサイズである。
【背景技術】
【0003】
遺伝子治療は、遺伝病を治療するための有望な方法である。これは、前記患者に対して欠陥遺伝子の健全なコピーを導入するか、または異常に機能している変異遺伝子を不活性にする。遺伝子治療研究の特に目的とされる遺伝子疾患は、血友病Ａである。伝統的血友病とも呼ばれる血友病Ａは、凝血プロセスが第ＶＩＩＩ因子をコードする欠損または欠陥遺伝子により異常となるＸ連鎖遺伝病である。血友病Ａ患者は、内部（例えば、関節および筋肉内）または外部（例えば、軽い切り傷、外傷、または歯科的処置による）で出血しうる。第ＶＩＩＩ因子の正常な血漿レベルは、５０％～１００％の範囲である。軽度の血友病Ａは、血液中で第ＶＩＩＩ因子の６％～４９％のレベルによって特徴付けられ；患者は、一般的に、重症の傷害、外傷、または外科的手術後にのみ出血する。中程度の血友病Ａは、血液中で第ＶＩＩＩ因子の１％～５％のレベルによって特徴付けられ；患者は、損傷後の出血エピソードを示す。重症の血友病Ａは、血液中で第ＶＩＩＩ因子の１％未満のレベルによって特徴付けられ；患者は、損傷後の出血を経験し、さらに、多くの場合、関節および筋肉における頻発する自然出血を示す。世界血友病連盟のウェブサイトも参照のこと。血友病Ａは、一般に、補充第ＶＩＩＩ因子を用いて（出血に応じて）必要に応じてか、または予防的に治療される。ある患者は、前記補充因子に対する同種抗体（阻害剤としても知られている）を生じてしまい、これにより治療が無効となる。現在の療法は、頻度の高い静脈内注射を要するために負担が大きく、発展途上国では供給源に限りもある。よって、遺伝子治療は、血友病Ａの治療に有望な方法を提供する。
【0004】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子治療における遺伝子送達のプラットフォームとして研究されてきた。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科ディペンドパルボウイルス属に属する小さい非エンベロープウイルスである。前記ウイルスは、３つのカプシドタンパク質－ウイルスタンパク質（ＶＰ）１、ＶＰ２、およびＶＰ３から構築されたカプシドにパッケージされた単一鎖ＤＮＡゲノムから構成される。臨床使用のためのｒＡＡＶ調製物の医薬組成物への製剤化は、課題であった。一般的に用いられるｒＡＡＶ製剤は、長年または研究室で生じさせたストレス試験中に目視可能な沈殿物を形成することが観察されてきた。解決されずに残されてきたこれらの沈殿物は、患者の安全性に対するリスクを示す。いくつかのｒＡＡＶ製剤で観察された物理的安定性の問題はまた、保存、輸送、および患者への投与に要する半減期に関する生成物の有効性に否定的な影響を及ぼしうる（例えば、Wright et al., Molecular Therapy (2005) 12(1):171-8; Croyle et al., Gene Therapy (2001) 8:1281-90を参照のこと）。よって、遺伝子治療の治療可能性が十分に発揮されるようなｒＡＡＶベクターのための改善された製剤を開発する必要性が存在している。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、臨床投与に適した安定なｒＡＡＶベクター製剤を提供する。ある態様において、本開示は、ｒＡＡＶベクター、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、リン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、ポリオール（例えば、ショ糖）、およびポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を含む医薬組成物であって、適宜、約０．１ｍＭ以下の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物を提供する。
【0006】
ある実施態様において、前記組成物は、約０．１～約２．０ｍＭ（例えば、約０．５ｍＭまたはそれ以上、約１．３ｍＭまたはそれ以上、あるいは約１．４ｍＭ）の塩化マグネシウムを含む。
【0007】
ある実施態様において、前記組成物は、約１５０～約２００ｍＭ、適宜、約１７２ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【0008】
ある実施態様において、前記組成物は、約２．５～約３．０ｍＭ、適宜、約２．７ｍＭの塩化カリウムを含む。
【0009】
ある実施態様において、前記組成物は、約５～約１０ｍＭ、適宜、約８ｍＭのリン酸二ナトリウムを含む。
【0010】
ある実施態様において、前記組成物は、約１．０～約２．０ｍＭ、適宜、約１．５ｍＭのリン酸一カリウムを含む。
【0011】
ある実施態様において、前記組成物は、約０．５％～約２％（ｗ／ｖ）、適宜、約１％（ｗ／ｖ）のショ糖を含む。
【0012】
ある実施態様において、前記組成物は、約０．０１％～約０．１％（ｗ／ｖ）、適宜、約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８を含む。
【0013】
特定の実施態様において、本開示は、ｒＡＡＶベクター、約１７１．８１ｍＭの塩化ナトリウム、約２．６８ｍＭの塩化カリウム、約８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、約１．４７ｍＭのリン酸一カリウム、約１．４０ｍＭの塩化マグネシウム、約１．００（ｗ／ｖ）％のショ糖、および約０．０５（ｗ／ｖ）％のポロキサマー１８８を含む医薬組成物であって、適宜、約０．１ｍＭ未満の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物を提供する。
【0014】
他のある実施態様において、本開示は、ｒＡＡＶベクター、約１７２ｍＭの塩化ナトリウム、約２．６８ｍＭの塩化カリウム、約８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、約１．４７ｍＭのリン酸一カリウム、約０．４９ｍＭの塩化マグネシウム、約１．００（ｗ／ｖ）％のショ糖、および約０．０５（ｗ／ｖ）％のポロキサマー１８８を含む医薬組成物であって、適宜、約０．１ｍＭ未満の塩化カルシウムを含み、約７．１～約７．５のｐＨである、医薬組成物を提供する。
【0015】
ある実施態様において、本発明の組成物におけるｒＡＡＶには、治療タンパク質、例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（例えば、配列番号１）のための発現カセットを含むゲノムが含まれる。特定の実施態様において、ＡＡＶゲノムには、配列番号２または配列番号２のヌクレオチド１３１～５，０２４が含まれる。
【0016】
ある実施態様において、前記組成物は、ｒＡＡＶを１ｍＬあたり約１．０Ｅ＋１２～約１．０Ｅ＋１４ベクターゲノム（ｖｇ）、適宜、１ｍＬあたり約１．０Ｅ＋１３～約５．０Ｅ＋１３ｖｇ（例えば、１ｍＬあたり約１．０Ｅ＋１３ｖｇ）で含む。
【0017】
ある実施態様において、前記ｒＡＡＶは、（例えば、ＡＡＶ６カプシドを有する）ＡＡＶ６カプシドタンパク質を含む。ある実施態様において、前記ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ２に由来する逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。
【0018】
別の態様において、本開示は、５～１０ｍＬ、適宜、６．４ｍＬの本発明の組成物を含むバイアルを提供する。前記バイアルは、例えば、シクロオレフィンコポリマーから構成されていてもよく、および／または所定位置に熱可塑性エラストマー共栓が付いていてもよい。
【0019】
別の態様において、本開示は、治療タンパク質を必要とする患者を治療する方法であって、本発明の組成物を前記患者に投与することを特徴とする方法を提供する。ある実施態様において、本開示は、第ＶＩＩＩ因子の血清レベルの増加を必要とするヒト対象（例えば、血友病Ａに罹っているヒト対象）における第ＶＩＩＩ因子の血清レベルを増加させる方法であって、ｒＡＡＶがヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである治療組成物を、前記ヒト対象に静脈内投与することを特徴とする方法を提供する。このような治療方法で使用するための医薬組成物、およびこのような方法で使用するための医薬の製造のための前記組成物の使用もまた提供される。
【0020】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施態様および態様を示すが、例示として記載されるものであって、限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図4A】図４Ａは、複数回の凍結／解凍サイクル後のＡＡＶ６ベクター製剤のベクターゲノム（ｖｇ）力価および感染力価を示す。示されるエラーバーは、ＭＡＤＬＳによる粒子濃度のＮ≧３試料測定からの±パーセンテージＲＳＤ、あるいはｖｇ力価の±許容される試験変動、平均組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）、ＥＬＩＳＡ、およびＳＥ－ＬＣである。ＲＳＤ：相対標準偏差。ＭＡＤＬＳ：多角度動的光散乱法。ＳＥ－ＬＣ：サイズ排除液体クロマトグラフィー。
【発明を実施するための形態】
【0022】
（発明の詳細な説明）
本開示は、ＡＡＶベクターおよび１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明のＡＡＶベクター組成物は、ゲノムが目的のタンパク質（例えば、治療タンパク質）の発現カセットを保有するｒＡＡＶを含んでいてもよい。本発明者らは、予想外なことに、カルシウムを実質的に含まない（例えば、製剤中に添加されたカルシウムを含まない）ＡＡＶベクター製剤が、従来の組成物と比較して、改善された安定性および半減期を示すことを知見した。カルシウムは、典型的に、ＡＡＶ組成物の安定性を改善するという従来の考え方によりこれまでの製剤に含まれてきた（例えば、Turnbull et al., Hum Gene Ther. (2000) 11(4):629-35; Cotmore et al., J Virol. (2010) 84(4):1945-56を参照のこと）。本発明者らは、本発明のＡＡＶベクター組成物が、改善された外観（例えば、透明度および無色）、より安定なｐＨ、および少ない凝集（凍結／解凍サイクルおよび促進された安定性条件下での製品の品質特性によって決定される）を有することを知見した。カルシウムを含まずに製剤化されたＡＡＶベクター製品が良好な製品安定性を示すことから、カルシウムイオンは、製品の機能または安定性に必要とされない。
本開示は、ＡＡＶベクターおよび１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明のＡＡＶベクター組成物は、ゲノムが目的のタンパク質（例えば、治療タンパク質）の発現カセットを保有するｒＡＡＶを含んでいてもよい。本発明者らは、予想外なことに、カルシウムを実質的に含まない（例えば、製剤中に添加されたカルシウムを含まない）ＡＡＶベクター製剤が、従来の組成物と比較して、改善された安定性および半減期を示すことを知見した。カルシウムは、典型的に、ＡＡＶ組成物の安定性を改善するという従来の考え方によりこれまでの製剤に含まれてきた（例えば、Turnbull et al., Hum Gene Ther. (2000) 11(4):629-35; Cotmore et al., J Virol. (2010) 84(4):1945-56を参照のこと）。本発明者らは、本発明のＡＡＶベクター組成物が、改善された外観（例えば、透明度および無色）、より安定なｐＨ、および少ない凝集（凍結／解凍サイクルおよび促進された安定性条件下での製品の品質特性によって決定される）を有することを知見した。カルシウムを含まずに製剤化されたＡＡＶベクター製品が良好な製品安定性を示すことから、カルシウムイオンは、製品の機能または安定性に必要とされない。
【0023】
Ｉ．組換えＡＡＶの調製
本明細書に記載のウイルス調製物は、いずれかの公知の生成系、例えば、哺乳類細胞ＡＡＶ生成系（例えば、２９３ＴまたはＨＥＫ２９３細胞に基づく系）および昆虫細胞ＡＡＶ生成系（例えば、ｓｆ９昆虫細胞を基づく系および／またはバキュロウイルスのヘルパーベクターを用いた系）によって得られてもよい。前記ウイルス調製物は、細胞培養物を、不連続の塩化セシウム密度グラジエントなどの周知技術を用いて精製されてもよい（例えば、 Grieger, Mol Ther Methods Clin Dev. (2016) 3:16002を参照のこと）。
本明細書に記載のウイルス調製物は、いずれかの公知の生成系、例えば、哺乳類細胞ＡＡＶ生成系（例えば、２９３ＴまたはＨＥＫ２９３細胞に基づく系）および昆虫細胞ＡＡＶ生成系（例えば、ｓｆ９昆虫細胞を基づく系および／またはバキュロウイルスのヘルパーベクターを用いた系）によって得られてもよい。前記ウイルス調製物は、細胞培養物を、不連続の塩化セシウム密度グラジエントなどの周知技術を用いて精製されてもよい（例えば、 Grieger, Mol Ther Methods Clin Dev. (2016) 3:16002を参照のこと）。
【0024】
本発明の組成物は、様々なＡＡＶセロタイプ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１１、ならびにこれらの変異型、ハイブリッド、キメラまたは偽型のうちのいずれかまたは組み合わせのＡＡＶを含んでいてもよい。「偽型」または「クロスパッケージ」ｒＡＡＶは、例えば、ウイルスの形質導入効率または指向性プロファイルを変化させるために、カプシドが、別のＡＡＶセロタイプのカプシドで置換されている組換えＡＡＶを意味する（例えば、Balaji et al., J Surg Res. (2013) 184(1):691-8を参照のこと）。「キメラ」または「ハイブリッド」ｒＡＡＶは、カプシドが、異なるセロタイプに由来するカプシドタンパク質から構成されるか、および／またはカプシドタンパク質が、異なるセロタイプに由来する配列を有するキメラタンパク質である組換えＡＡＶを意味する（例えば、セロタイプ１および２；例えば、Hauck et al., Mol Ther. (2003) 7(3):419-25を参照のこと。例えば、本発明の組成物は、ＩＴＲなどのゲノムが、ＡＡＶ２などのあるセロタイプに由来するが、カプシドが、別のセロタイプ（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９、またはＡＡＶ２／６／９）に由来する組換えＡＡＶを含んでいてもよい。例えば、米国特許第７，１９８，９５１および９，５８５，９７１号を参照のこと。
【0025】
ＩＩ．組換えＡＡＶの製剤
精製されると、ＡＡＶ調製物は、所望される成分を含む組成物を得るために、例えば、タンジェンシャルフロー濾過、通常のフロー濾過（攪拌式セルを使用）、ゲル濾過、透析、カラムクロマトグラフィー、および／または脱塩カラムを通した緩衝剤交換によって本明細書に記載されるように製剤化することができる。一例として、精製されたウイルス調製物は、まず限外濾過（ＵＦ）、続いて透析濾過（ＤＦ）によって所望される製剤化水溶液の１０倍またはそれ以上の等価容量で濃縮されうる。下記の実施例も参照のこと。
精製されると、ＡＡＶ調製物は、所望される成分を含む組成物を得るために、例えば、タンジェンシャルフロー濾過、通常のフロー濾過（攪拌式セルを使用）、ゲル濾過、透析、カラムクロマトグラフィー、および／または脱塩カラムを通した緩衝剤交換によって本明細書に記載されるように製剤化することができる。一例として、精製されたウイルス調製物は、まず限外濾過（ＵＦ）、続いて透析濾過（ＤＦ）によって所望される製剤化水溶液の１０倍またはそれ以上の等価容量で濃縮されうる。下記の実施例も参照のこと。
【0026】
製剤の溶液は、等張化剤、安定化剤、界面活性剤、および緩衝剤を含んでいてもよい。緩衝剤には、例えば、酢酸塩、コハク酸塩（例えば、コハク酸二ナトリウム六水和物）、コハク酸、グルコン酸、クエン酸塩、ヒスチジン、酢酸、リン酸塩、リン酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、酒石酸、マレイン酸塩、マレイン酸、グリシン、乳酸塩、乳酸、炭酸水素塩、カルボン酸、安息香酸ナトリウム、安息香酸、エデト酸塩、イミダゾール、トリス、およびこれらの混合物が含まれうる。ある実施態様において、製剤化溶液には、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムが、例えば、それぞれ、約１５０～２００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ、約１５５ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１６８ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７１ｍＭ、約１７１．１ｍＭ、約１７１．２ｍＭ、約１７１．３ｍＭ、約１７１．４ｍＭ、約１７１．５ｍＭ、約１７１．６ｍＭ、約１７１．７ｍＭ、約１７１．８ｍＭ、約１７１．９ｍＭ、または約１７２ｍＭ）および約２．５－３．０ｍＭ（例えば、約２．５ｍＭ、約２．６ｍＭ、約２．６１ｍＭ、約２．６１ｍＭ、約２．６３ｍＭ、約２．６４ｍＭ、約２．６５ｍＭ、約２．６６ｍＭ、約２．６７ｍＭ、約２．６８ｍＭ、約２．６９ｍＭ、または約２．７ｍＭ、約２．８ｍＭ、約２．９ｍＭ、約３．０ｍＭ）で含まれる。
【0027】
製剤化溶液は、例えば、リン酸二ナトリウムおよび／またはリン酸一カリウムによってリン酸緩衝化されていてもよい。ある実施態様において、製剤化溶液中の総リン酸イオン濃度は、約８～１２ｍＭ（例えば、約９．６ｍＭまたは約９．５７ｍＭ）である。ある実施態様において、製剤化溶液は、約５～１０ｍＭ（例えば、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約７．９ｍＭ、約８ｍＭもしくは約８．１ｍＭ、約８．２ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、または約１０ｍＭ）のリン酸二ナトリウムおよび約１～２ｍＭ（例えば、約１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４５ｍＭ、約１．４７ｍＭ、約１．４８ｍＭ、約１．４９ｍＭ、約１．５、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９Ｍｍ、または約２ｍＭ）のリン酸一カリウムを含む。製剤は、約６．５～８．０（例えば、約７．１～７．５、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、または約７．５）のｐＨであってもよい。
【0028】
製剤化溶液は、マグネシウムを含んでいてもよいが、添加されたカルシウムを含まない。ある実施態様において、製剤化溶液は、約０．１～２．０ｍＭ（例えば、約０．５～約１．４ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．４２ｍＭ、約０．４４ｍＭ、約０．４５ｍＭ、約０．４６ｍＭ、約０．４７ｍＭ、約０．４８ｍＭ、約０．４９ｍＭ、約０．５、約０．５５ｍＭ、または約０．６ｍＭ）の塩化マグネシウムを含む。製剤化溶液は、添加されたカルシウムを含まず、医薬組成物はＡＡＶ調製物から調製されるが、製剤化溶液は、ＡＡＶ製造および精製プロセスで持ち越されている追跡量のカルシウムを有しうる。例えば、医薬組成物は、比色分析アッセイによって測定されると、約０．１０ｍＭ未満（例えば、約０．０９、０．０７、０．０５、０．０３、または０．０１ｍＭ未満）のカルシウムを含みうる。ある実施態様において、医薬組成物は、比色分析アッセイによって測定されると、検出できないカルシウムを含む。ある実施態様において、医薬組成物は、カルシウムを含まない（すなわち、０ｍＭのカルシウム）。
【0029】
製剤化溶液は、ポリオール、例えば、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリトリトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、キシリトール、グリセロール、ラクチトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イノシトール、フルクトース、グリコール、マンノース、ショ糖、ソルボース、キシロース、乳糖、マルトース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルスターチ、水溶性グルカン、またはこれらの混合物を含んでいてもよい。ある実施態様において、製剤化溶液は、約０．５％～２％（例えば、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１％）（ｗ／ｖ）ショ糖を含む。
【0030】
製剤化溶液は、非イオンまたはイオン性親水性界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤の例は、ポリソルベート、ポロキサマー、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、ステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、ラウラミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、イソステアラミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、イソステアラミドプロピルジメチルアミン、ココイルメチルタウリンナトリウム、オレオイルメチルタウリン二ナトリウム、ジヒドロキシプロピル ＰＥＧ－５リノールアンモニウムクロリド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ソルビタンモノステアレート（例えば、Ｓｐａｎｓ）、グリセロールの酸エステル、およびこれらの混合物である。ある実施態様において、界面活性剤は、ポリソルベート（ＰＳ）２０、ＰＳ－２１、ＰＳ－４０、ＰＳ－６０、ＰＳ－６１、ＰＳ－６５、ＰＳ－８０、ＰＳ－８１、ＰＳ－８５、ＰＥＧ－３３５０、ポロキサマー１８８、およびこれらの混合物であってもよい。ある実施態様において、製剤化溶液は、ポロキサマー１８８を約０．０１％～０．１％（例えば、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、または約０．１％）（ｗ／ｖ）で含む。
【0031】
ある実施態様において、医薬組成物は、製剤Ｆ２またはＦ３中にＡＡＶベクターを含む。Ｆ２およびＦ３の成分を下記表Ａに示す。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（カルシウムおよびマグネシウムを含む）は、細胞培養のために一般的に用いられる製剤である。Ｆ０は、別の従来のカルシウムを含有する製剤である。下記実施例に示されるように、Ｆ２およびＦ３は、ＡＡＶを製剤化するとＤＰＢＳおよびＦ０より優れている。
表Ａ．製剤の比較
表Ａ．製剤の比較
【表1】
【0032】
本明細書で用いられるように、製剤中の様々な成分の濃度は、小数点０、１、または２で表されうる。よって、例えば、Ｆ２において、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＣｌ２、およびショ糖の濃度は、それぞれ、１７１．８０（または１７１．８もしくは１７２）ｍＭ、２．６８（もしくは２．７）ｍＭ、８．１０（または８．１もしくは８）ｍＭ、１．４７（もしくは１．５）ｍＭ、０．４９（もしくは０．５）ｍＭ、および１．００％（または１．０％もしくは１％）（ｗ／ｖ）として表されてもよい。Ｆ３において、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＣｌ２、およびショ糖の濃度は、それぞれ、１７１．８０（または１７１．８もしくは１７２）ｍＭ、２．６８（もしくは２．７）ｍＭ、８．１０（または８．１もしくは８）ｍＭ、１．４７（もしくは１．５）ｍＭ、１．４０（または１．４）ｍＭ、および１．００％（または１．０％もしくは１％）（ｗ／ｖ）として表されてもよい。
【0033】
医薬組成物は、１つまたはそれ以上の保存剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、亜硫酸塩、ソルビン酸塩、安息香酸塩、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノキシエタノール、および／またはパラベン（例えば、メチルパラベン）をさらに含んでいてもよい。ある実施態様において、医薬組成物は、添加される保存剤は含まれない。
【0034】
医薬組成物は、医薬組成物の有効性を高める他の試薬を含んでいてもよい。医薬組成物は、送達ベヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル剤、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、および小胞を含みうる。
【0035】
ＩＩＩ．典型的な組換えＡＡＶ
典型的な実施態様において、本開示は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法のためのｒＡＡＶベクターを含む改善された医薬組成物を提供する。ＰＦ－０７０５５４８０／ＳＢ－５２５（または本明細書では、「ＳＢ－５２５」）と称されるｒＡＡＶベクターは、２／６シュードセロタイプのものであって、ＡＡＶ６カプシドおよびＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）を有する組換えゲノムを含む。ＳＢ－５２５のゲノムは、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のＢドメイン欠失（ＢＤＤ）型をコードする発現カセットを保有する。例えば、ＷＯ２０１７／０７４５２６（配列番号３７）を参照のこと。ＳＢ－５２５は、静脈内（ＩＶ）用量として投与され、血友病Ａ患者における第ＶＩＩＩ因子タンパク質の長期間の肝臓産生を提供するための肝臓特異性を有する。ＷＯ２０２０／０２８８３０を参照のこと。分泌型ＦＶＩＩＩタンパク質は、承認された組換え抗血友病因子（Ｒｅｆａｃｔｏ（登録商標）およびＸｙｎｔｈａ（登録商標））と同一のアミノ酸配列を有する。
典型的な実施態様において、本開示は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法のためのｒＡＡＶベクターを含む改善された医薬組成物を提供する。ＰＦ－０７０５５４８０／ＳＢ－５２５（または本明細書では、「ＳＢ－５２５」）と称されるｒＡＡＶベクターは、２／６シュードセロタイプのものであって、ＡＡＶ６カプシドおよびＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）を有する組換えゲノムを含む。ＳＢ－５２５のゲノムは、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のＢドメイン欠失（ＢＤＤ）型をコードする発現カセットを保有する。例えば、ＷＯ２０１７／０７４５２６（配列番号３７）を参照のこと。ＳＢ－５２５は、静脈内（ＩＶ）用量として投与され、血友病Ａ患者における第ＶＩＩＩ因子タンパク質の長期間の肝臓産生を提供するための肝臓特異性を有する。ＷＯ２０２０／０２８８３０を参照のこと。分泌型ＦＶＩＩＩタンパク質は、承認された組換え抗血友病因子（Ｒｅｆａｃｔｏ（登録商標）およびＸｙｎｔｈａ（登録商標））と同一のアミノ酸配列を有する。
【0036】
ＳＢ－５２５のゲノムは、ヒト第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤ型のための発現カセットを含み、下記に示されるアミノ酸配列を有する：
【表2】
【0037】
配列番号１のシグナルペプチド部分は、上記ボックスで示され、タンパク質が分泌されるときに切り離される。
【0038】
ＳＢ－５２５ゲノムは、以下のヌクレオチド配列を含む：
【表3】
【表4】
【0039】
上記配列において、左側（５’）ＩＴＲ（ＡＡＶ２ ＩＴＲ）は、ヌクレオチド１～１３０に及び、右側（３’）ＩＴＲ（ＡＡＶ２ ＩＴＲ）は、ヌクレオチド５０２５～５１３２に及ぶ。両ＩＴＲをボックスで示す。
【0040】
ＩＶ．組換えＡＡＶ製剤の使用
本発明の医薬組成物は、使用のためのバイアル（例えば、予め処理されたガラスバイアルまたはＣＯＰバイアル）および説明書を含む製品（例えば、キット）によって供給されうる。ある実施態様において、各バイアルは、０．５～５０ｍＬ（例えば、１～１０ｍＬ）中にＡＡＶの１ｍＬあたり約１Ｅ＋１１～１Ｅ＋１５ｖｇを含む。ある実施態様において、各バイアルは、５Ｅ＋１２～１Ｅ＋１４／ｍＬ（例えば、１Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ）を含む。ある実施態様において、各バイアルは、６ｍＬ中に６Ｅ＋１３ｖｇを含む。
本発明の医薬組成物は、使用のためのバイアル（例えば、予め処理されたガラスバイアルまたはＣＯＰバイアル）および説明書を含む製品（例えば、キット）によって供給されうる。ある実施態様において、各バイアルは、０．５～５０ｍＬ（例えば、１～１０ｍＬ）中にＡＡＶの１ｍＬあたり約１Ｅ＋１１～１Ｅ＋１５ｖｇを含む。ある実施態様において、各バイアルは、５Ｅ＋１２～１Ｅ＋１４／ｍＬ（例えば、１Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ）を含む。ある実施態様において、各バイアルは、６ｍＬ中に６Ｅ＋１３ｖｇを含む。
【0041】
前記組成物は、患者に１回またはそれ以上投与されてもよい。例えば、前記組成物は、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、または１年未満の間隔で患者に投与されてもよい。ある実施態様において、前記組成物は、２年、５年、７年、１０年、または１５年未満の間隔で患者に投与されてもよい。前記医薬組成物は、治療される疾患に適切な経路によりそれを必要とする患者に提供されてもよい。例えば、前記組成物は、静脈内注射、動脈内注射、脳内注射、腹腔内注射、門脈注射、または筋肉内注射により投与されてもよい。例えば、ＳＢ－５２５医薬組成物は、１Ｅ＋１１～１Ｅ＋１５ｖｇ／ｋｇ、例えば、１Ｅ＋１１～１Ｅ＋１４（例えば、１Ｅ＋１２～１Ｅ＋１４）ｖｇ／ｋｇで血友病Ａ患者に静脈内に提供されてもよい。ある実施態様において、ＳＢ－５２５医薬組成物は、５Ｅ＋１１、６Ｅ＋１１、７Ｅ＋１１、８Ｅ＋１１、９Ｅ＋１１、１Ｅ＋１２、２Ｅ＋１２、３Ｅ＋１２、４Ｅ＋１２、５Ｅ＋１２、６Ｅ＋１２、７Ｅ＋１２、８Ｅ＋１２、９Ｅ＋１２、１Ｅ＋１３、２Ｅ＋１３、３Ｅ＋１３、４Ｅ＋１３、５Ｅ＋１３、６Ｅ＋１３、７Ｅ＋１３、８Ｅ＋１３、９Ｅ＋１３、または１Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇで血友病Ａ患者に静脈内に提供されてもよい。ある実施態様において、ＳＢ－５２５組成物は、約６Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇの用量で血友病Ａ患者に静脈内に提供される。
【0042】
ある実施態様において、患者は、重度または中等度の血友病Ａに罹っている。さらなるある実施態様において、患者は、阻害因子（第ＶＩＩＩ因子に対する同種抗体）を有していない。ある実施態様において、患者は、ＡＡＶ６に対する中和抗体を有していない。患者は、成人もしくは青年患者（≧１２歳）または小児患者（＜１２歳）であってもよい。
【0043】
本明細書で他で定義されない限り、本開示に関して用いられる科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するべきである。例示の方法および材料が下記で記載されるが、本明細書に記載の方法および材料と同様または同等のものもまた本開示の実施または試験で用いることができる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載される心臓病学、医学、医薬品化学および製薬化学、ならびに細胞生物学に関して用いられる命名法および技術は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、当該技術分野で一般的に実施されるように、または本明細書に記載されるように行われる。さらに、他に文脈上必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むべきであり、複数形の用語は単数形を含むべきである。本明細書および実施態様を通して、単語「有する（have）」および「含む（comprise）」、あるいは「（has）」、「（having）」、「（comprises）」または「（comprising）」などの変化形は、記載される整数または整数群を含むことを意味するが、他の整数または整数群を排除するものではないことが認められる。本明細書で記載の全ての刊行物および他の参考資料は、参照によりそれらの全体が取り込まれる。Although 多くの文献が本明細書で引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれもが当該技術分野における技術常識の一部を形成することを認めるわけではない。本明細書で用いられるように、１つまたはそれ以上の目的の値に適用される用語「およそ」または「約」は、記載される参照値に類似する値を意味する。ある実施態様において、前記用語は、特に示されていないか、または文脈から明らかでない限り、記載される参照値のいずれかの方向（異常または以下）における１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に入る値の範囲を意味する。
【0044】
本発明がより理解され得るために、下記の実施例が説明されている。これらの実施例は、単に例示を目的とするものであって、いずれの方法においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0045】
下記の実施例は、本発明者らが、現在のＳＢ－５２５製剤が、生物学的製品の半減期および長期安定性を評価するための一般的な試験である凍結／解凍サイクリングにより沈殿物を形成することを知見した研究を記載する。本発明者らはまた、沈殿物が緩衝液製剤のみ（すなわち、活性のウイルスベクター成分を含まない緩衝液製剤）で形成されたことを知見した。よって、本発明者らは、この課題を解決する新規製剤を見出した。
【0046】
本研究において、ＳＢ－５２５ウイルス調製物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬにて、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ショ糖、および０．０５％ Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８（ポロキサマー１８８）を加え、５ｍＬで６ｍＬのＡｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓクリスタルクローズドバイアルに密封して調製し、製剤化し、≦－６５℃で保存した。安定性試験では、ＳＢ－５２５組成物を－０℃、５℃、および２５℃で２４ヶ月間安定性にかけた（表５）。非制御の凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）の５サイクル（表１）および２４時間攪拌（ＡＧ）（表２）も行った。製剤（ＤＰ）品質特性を表５～表８に従って分析した。
【0047】
実施例１：凍結／解凍サイクリングおよび攪拌試験
材料と方法
ＳＢ－５２５は、下記成分：０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ） ポロキサマー１８８（ｐＨ７．３６）を含む製剤化緩衝液中で１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ（公称上）にて供した。２３個のバイアルを－７０℃、１１個を５℃、および８個を２５℃で保存した。
材料と方法
ＳＢ－５２５は、下記成分：０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ） ポロキサマー１８８（ｐＨ７．３６）を含む製剤化緩衝液中で１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ（公称上）にて供した。２３個のバイアルを－７０℃、１１個を５℃、および８個を２５℃で保存した。
【0048】
凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）サイクリング試験では、試料を、表１で示されるように、３サイクルまたは５サイクルの非制御のＦ／Ｔで周期させた。
表１．ＤＰ非制御Ｆ／Ｔ周期
表１．ＤＰ非制御Ｆ／Ｔ周期
【表5】
【0049】
攪拌試験では、試料を表２で示されるように室温で攪拌した。
表２．ＤＰ攪拌設定
表２．ＤＰ攪拌設定
【表6】
【0050】
－７０℃、５℃、２５℃それぞれで保存したバイアルを、（ｉ）外観（液体）、ｐＨ、動的光散乱法（ＤＬＳ）、および高精度液中パーティクルカウンター（ＨＩＡＣ）；（ｉｉ）ｖｇ同一性（ｑＰＣＲ）、ｖｇ力価（ｑＰＣＲ）、カプシド力価（ＥＬＩＳＡ）、カプシド同一性（ＥＬＩＳＡ）、および感染力価（ＴＣＩＤ５０）；（ｉｉｉ）インビトロＦＶＩＩＩ活性（生物アッセイ）；または（ｉｖ）ＵＶ２６０／２８０、還元ＣＥ－ＳＤＳ、ＳＥＣ力価_２６０／２８０について分析した。
【0051】
Ｆ／Ｔ周期にかけた試料を、（ｉ）外観（液体）、ｐＨ、モル浸透圧濃度、ＤＬＳ、ＨＩＡＣ；（ｉｉ）ｖｇ力価（ｑＰＣＲ）、カプシド力価および同一性（ＥＬＩＳＡ）、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および感染力価（ＴＣＩＤ５０）；または（ｉｉｉ）ＵＶ２６０／２８０、ＳＥＣ力価_２６０／２８０、ＲＰ－ＨＰＬＣ、インビトロＦＶＩＩＩ活性（生物アッセイ）、および還元ＣＥ－ＳＤＳについて分析した。
【0052】
２４時間攪拌（ＡＧ）にかけた試料を、（ｉ）外観（液体）、ｐＨ、モル浸透圧濃度、ＤＬＳ、およびＨＩＡＣ；（ｉｉ）ｖｇ力価（ｑＰＣＲ）、カプシド力価および同一性（ＥＬＩＳＡ）、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、感染力価（ＴＣＩＤ５０）；または（ｉｉｉ）ＵＶ２６０／２８０、ＳＥＣ力価_２６０／２８０、ＲＰ－ＨＰＬＣ、インビトロＦＶＩＩＩ活性（生物アッセイ）、および還元ＣＥ－ＳＤＳについて分析した。
【0053】
結果
ＳＢ－５２５のＤＰ安定性、非制御Ｆ／Ｔの５サイクル、および２４時間攪拌群からの結果を以下に記載する。
ＳＢ－５２５のＤＰ安定性、非制御Ｆ／Ｔの５サイクル、および２４時間攪拌群からの結果を以下に記載する。
【0054】
下記表３で示されるように、試料を１ヶ月間まで試験条件で保存した場合、色、透明度、ｐＨ、流体力学半径（ＤＬＳによって測定）、ｖｇ力価、カプシド力価、カプシド純度（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定）、感染力価、ＵＶ２６０／２８０（空：全カプシド比率の代替測定）、および生物学的活性（相対％効力）においてあまり変化がなかった。５℃および２５℃で目視可能な粒子に変化があった。全ての試料を凍結し、Ｔゼロ（Ｔ０）で白く不透明に見えた。
表３．安定性結果
表３．安定性結果
【表7】
【表8】
【0055】
表４で示されるように、全ての保存条件で１ヶ月後にカプシド純度にあまり変化がなかった。
表４．カプシド純度の安定性結果
表４．カプシド純度の安定性結果
【表9】
【0056】
表５で示されるように、全ての保存条件で１ヶ月後の高分子種（ＨＭＷＳ）の凝集または形成はあまりなかった（ＮＭＴ：未満；ＬＯＱ：定量の限界）。
表５．１ヶ月後のＳＥＣ力価安定性結果
目的、加速、およびストレス保存条件
表５．１ヶ月後のＳＥＣ力価安定性結果
目的、加速、およびストレス保存条件
【表10】
【0057】
表６で示されるように、全ての保存条件で１か月後に（ＨＩＡＣによる）肉眼で見えない粒子はあまり増加していなかった。全ての時点において、≧１０μｍおよび≧２５μｍの範囲に関して（許容基準は、１容器あたり＞１０μｍで６，０００粒子未満および１容器当たり＞２５μｍで６００粒子である）、ＵＳＰ＜７８７＞標準以下の粒子を示した。
表６．ＨＩＡＣ安定性の結果
表６．ＨＩＡＣ安定性の結果
【表11】
【0058】
表７で示されるように、Ｆ／Ｔ／ＡＧストレスにより色、透明度、ｐＨ、流体力学半径（ＤＬＳにより測定）、ｖｇ力価、カプシド力価、感染力価、ＵＶ２６０／２８０（空：全カプシド比率の代替測定）、カプシド純度（ＲＰ－ＨＰＬＣにより測定）、および生物学的活性（相対％効力）においてあまり変化がなかった。Ｆ／Ｔにおいて目視可能な粒子に変化があった。
表７．サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧの結果
表７．サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧの結果
【表12】
【0059】
表８で示されるように、Ｆ／Ｔ／ＡＧストレスによる還元ＣＥ－ＳＤＳにおいてあまり変化がなかった。
表８．５サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧのＣＥ－ＳＤＳ還元の結果
表８．５サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧのＣＥ－ＳＤＳ還元の結果
【表13】
【0060】
表９で示されるように、Ｆ／Ｔ／ＡＧストレスにより攪拌／ＨＭＷＳ製剤にあまり変化がなかった。
表９．５サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧのＳＥＣ力価の結果
表９．５サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧのＳＥＣ力価の結果
【表14】
【0061】
表１０で示されるように、Ｆ／Ｔにより（ＨＩＡＣによる）目視不可能な粒子が顕著に増加した。Ｆ／Ｔによる粒子は、≧１０μｍおよび≧２５μｍの範囲に関して、ＵＳＰ＜７８７＞標準以上であったが；ＡＧによる粒子は、≧１０μｍおよび≧２５μｍの範囲に関して、ＵＳＰ＜７８７＞標準以下であった。
表１０．５サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧのＨＩＡＣ結果
表１０．５サイクル非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間ＡＧのＨＩＡＣ結果
【表15】
【0062】
上記結果により、ＳＢ－５２５試料は、－７０℃、５℃、または２５℃で１ヶ月まで保存した場合、色、透明度、ｐＨ、流体力学半径（動的光散乱法により測定）、ｖｇ力価、カプシド力価、感染力価、空：全カプシド比（ＵＶ２６０／２８０により測定）、生物学的活性（相対％効力）、カプシド純度（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、還元ＣＥ－ＳＤＳおよびＲＰ－ＨＰＬＣにより測定）、またはウイルス粒子力価においてあまり変化を示さなかったことが示される。また、Ｆ／ＴもしくはＡＧストレスのいずれにより色、透明度、ｐＨ、流体力学半径（動的光散乱法により測定）、ｖｇ力価、カプシド力価、感染力価、空：全カプシド比（ＵＶ２６０／２８０により測定）、生物学的活性（相対％効力）、カプシド純度（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、還元ＣＥ－ＳＤＳ、ＲＰ－ＨＰＬＣにより測定）、またはウイルス粒子力価においてあまり変化がなかった。しかしながら、Ｆ／Ｔにより（ＨＩＡＣによる）目視不可能な粒子において顕著に増加し、５℃および２５℃の保存１ヶ月後に目視可能な粒子が増加した。前記試験は、これらの結果により１ヶ月で終了した。
【0063】
実施例２：Ｆ／Ｔ後のＤＰバイアルにおける粒子状物質の特徴付け
ＳＢ－５２５製剤の上記安定性試験からの試料（粒子状物質が観察された）を単離および同定のためにさらに分析した。
ＳＢ－５２５製剤の上記安定性試験からの試料（粒子状物質が観察された）を単離および同定のためにさらに分析した。
【0064】
５凍結／解凍サイクルを経た製剤試料（「５Ｆ／Ｔ後のＤＰ」）および２５℃で１ヶ月間保存させた試料（２５℃で１Ｍ後のＤＰ）を分析した。粒子状物質を０．８μｍの金フィルター上で単離した。次いで、これを、前記フィルター上でＫｅｙｅｎｃｅ ＶＨＸ６０００デジタル顕微鏡を１５０ｘの倍率で用いて部分リング照明下で画像化した。続いて、該フィルターをフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）顕微鏡に移し、スペクトルを前記物質について得た。ＦＴＩＲスペクトルを、公知のスペクトルに関するＫｎｏｗＩｔＡｌｌデータベースと比較した。２５℃で１Ｍ後のＤＰ試料の一部もまた、該フィルターからガラススライドに削ぎ落し、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＭＥ６００偏光顕微鏡を用いて直線偏光および直交ポラー下で画像化した。前記金フィルターの一部を切り取り、ＥＤＳモジュールを搭載したＪＥＯＬ６０００ＳＥＭで分析した。前記試料もまた、ラマン顕微鏡解析により分析した。
【0065】
全ての試料について、デジタルイメージングにより、半結晶物に見える白色の固形物が示された。直交ポラー下において、「５Ｆ／Ｔ後のＤＰ」試料では、複屈折が示されず、このことは、アモルファス物質または等方晶のいずれかであることが示す。ＳＥＭ／ＥＤＳ分析により、大部分が酸素、リンおよびカルシウムであることが示された。ＦＴＩＲ分析により、前記物質が塩として同定されたが、さらなる同定が必要であった。ラマン顕微鏡により、リン酸カルシウムのピーク特性を検出できたが、このことは、全ての試料における白色粒子状物質がリン酸カルシウムであることを示す。図１Ａ－Ｆは、粒子特徴付け試験の概要である。
【0066】
実施例３：ＳＢ－５２５の再製剤化
この実施例は、上記で見られた沈殿物の問題を回避できる新規ＳＢ－５２５製剤を試験する実験を記載する。これらの実験により、（１）カルシウムを除去し、（２）カルシウムおよびマグネシウムを除去し、または（３）ショ糖を８．５％まで増加させて再製剤化した場合のＳＢ－５２５ＤＰの短期安定性を評価した。これらの変更により、粒子の発生を、（１）粒子の供給源を除去することにより、（２）ＭｇＣｌ２の溶解性の懸念により二価陽イオンの両方を除去することにより、または（３）凍結／解凍ストレスに対する製剤の安定性を増加させることにより、それぞれ防ぐことが記載される。２つのパイロットバッチは、表面積対体積（ＳＡ／Ｖ）充填について最悪の場合の条件を追跡するために、６ｍＬのＡＴバイアルに２．５ｍＬで緩衝液交換し、充填させた。充填／最終化後、バイアルを５非制御凍結／解凍サイクル（周囲に対して≦－６５℃）にかけ、続いて、≦－６５℃（意図した保存）、２－８℃（ストレス；液体保存）、２５℃（加速；液体保存）、および４０℃（攻撃的／強制的分解条件；液体保存）で安定性にかけた。これらの条件は、製剤間の差異が明確となることを予測して選択した。
この実施例は、上記で見られた沈殿物の問題を回避できる新規ＳＢ－５２５製剤を試験する実験を記載する。これらの実験により、（１）カルシウムを除去し、（２）カルシウムおよびマグネシウムを除去し、または（３）ショ糖を８．５％まで増加させて再製剤化した場合のＳＢ－５２５ＤＰの短期安定性を評価した。これらの変更により、粒子の発生を、（１）粒子の供給源を除去することにより、（２）ＭｇＣｌ２の溶解性の懸念により二価陽イオンの両方を除去することにより、または（３）凍結／解凍ストレスに対する製剤の安定性を増加させることにより、それぞれ防ぐことが記載される。２つのパイロットバッチは、表面積対体積（ＳＡ／Ｖ）充填について最悪の場合の条件を追跡するために、６ｍＬのＡＴバイアルに２．５ｍＬで緩衝液交換し、充填させた。充填／最終化後、バイアルを５非制御凍結／解凍サイクル（周囲に対して≦－６５℃）にかけ、続いて、≦－６５℃（意図した保存）、２－８℃（ストレス；液体保存）、２５℃（加速；液体保存）、および４０℃（攻撃的／強制的分解条件；液体保存）で安定性にかけた。これらの条件は、製剤間の差異が明確となることを予測して選択した。
【0067】
ＳＢ－５２５ウイルスを、清澄化したバルクハーベストから精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ショ糖、および０．０５％ Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８（ポロキサマー１８８）を含む）中に約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬで製剤化し、バイアルに充填し、≦－６５℃で保存した。
【0068】
材料および方法
ＳＢ－５２５製剤化バルク原薬には、０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ） ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ） ポロキサマー１８８中でＳＢ－５２５（１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ（公称上））が含まれ（ｐＨ７．０～７．６）、滅菌濾過し、１２５ｍＬのＨＤＰＥボトル中において≦－６５℃で保存した。Ｎａ２ＨＰＯ４（リン酸ナトリウム，二塩基，無水）、ＫＨ２ＰＯ４（リン酸二水素カリウム）、ＣａＣｌ２（塩化カルシウム二水和物）、およびＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム六水和物）の供給元は、ＪＴ ＢａｋｅｒまたはＦｉｓｃｈｅｒであった。ポロキサマー１８８の供給元は、ＢＡＳＦであった。保存バイアルは、一次包装施栓、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）の所定位置熱可塑性エラストマー栓および黄色の蓋を備えたバイアルである６ｍＬのＡｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＴ）クローズドクリスタルバイアル（Ａｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｃａｔ＃ＶＩＡ－０６００００）であった。ＤＰ充填前に、製剤化されたバルク原薬（ＦＢＤＳ）を１２５ｍＬの高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ボトルに充填し、≦－６５℃で凍結した。次いで、ボトル周囲温度で融解し、緩衝液交換し、濾過し、６ｍＬのＡＴバイアルにＡｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｍ１ユニットを用いてＤＰ充填した。１つのパイロットバッチ物質を、合計１０交換体積において、５０ｋＤａのフィルターユニットを用いて約４０ｐｓｉの圧力でＴＦＦにより緩衝液交換した。次のパイロットバッチを、合計１０交換体積において、５０ｋＤａのＮＭＷ ＰＥＳフィルター上でアミコン攪拌式セルを用いて約４０ｐｓｉで緩衝液交換した。これらの２つの交換方法は、これまで、ＡＡＶについてあまり物質を喪失し、または吸収することなく用いられてきた。
ＳＢ－５２５製剤化バルク原薬には、０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ） ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ） ポロキサマー１８８中でＳＢ－５２５（１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ（公称上））が含まれ（ｐＨ７．０～７．６）、滅菌濾過し、１２５ｍＬのＨＤＰＥボトル中において≦－６５℃で保存した。Ｎａ２ＨＰＯ４（リン酸ナトリウム，二塩基，無水）、ＫＨ２ＰＯ４（リン酸二水素カリウム）、ＣａＣｌ２（塩化カルシウム二水和物）、およびＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム六水和物）の供給元は、ＪＴ ＢａｋｅｒまたはＦｉｓｃｈｅｒであった。ポロキサマー１８８の供給元は、ＢＡＳＦであった。保存バイアルは、一次包装施栓、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）の所定位置熱可塑性エラストマー栓および黄色の蓋を備えたバイアルである６ｍＬのＡｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＴ）クローズドクリスタルバイアル（Ａｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｃａｔ＃ＶＩＡ－０６００００）であった。ＤＰ充填前に、製剤化されたバルク原薬（ＦＢＤＳ）を１２５ｍＬの高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ボトルに充填し、≦－６５℃で凍結した。次いで、ボトル周囲温度で融解し、緩衝液交換し、濾過し、６ｍＬのＡＴバイアルにＡｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｍ１ユニットを用いてＤＰ充填した。１つのパイロットバッチ物質を、合計１０交換体積において、５０ｋＤａのフィルターユニットを用いて約４０ｐｓｉの圧力でＴＦＦにより緩衝液交換した。次のパイロットバッチを、合計１０交換体積において、５０ｋＤａのＮＭＷ ＰＥＳフィルター上でアミコン攪拌式セルを用いて約４０ｐｓｉで緩衝液交換した。これらの２つの交換方法は、これまで、ＡＡＶについてあまり物質を喪失し、または吸収することなく用いられてきた。
【0069】
前記ＡＴバイアルを、約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬの目標で２.５ｍＬ充填し、≦－６５℃から周囲条件に非制御の速度で凍結／解凍を５回繰り返し、次いで非ＧＭＰ保存ユニット中で安定性にかけた。バイアルを表１１に概略される安定性実施（pull）スケジュールにかけ、表１２に記載の方法によって試験した。試験した製剤を表１３に概略する。
表１１．カプシド純度安定性スケジュール
表１２．分析試験
表１３．製剤
表１１．カプシド純度安定性スケジュール
【表16】
【表17】
【表18】
【0070】
結果
製剤の特徴付け
正しい製剤が達成されたことを確認するために、ＳＢ－５２５ＤＰ製剤を、オスモル濃度、Ｐ１８８濃度、ショ糖濃度、およびカプシド比および純度（還元ＣＧＥによる）について調べるために試験した。Ｍ０５－Ｍ０８についてのこれらの試験結果を下記表１４に示す。カプシド純度および比は、ｒＣＧＥによって測定されるように、あまり相違は示されなかった。オスモル濃度は、ショ糖レベルに応じて予測される範囲内である。Ｍ０５－Ｍ０８試料は、Ｐ１８８の正しい濃度を示した。さらに、カルシウムおよびマグネシウムの濃度は、ＣＥＤＥＸにより全ての製剤について予測される範囲内であることが確認された。
表１４．製剤の特徴付け
製剤の特徴付け
正しい製剤が達成されたことを確認するために、ＳＢ－５２５ＤＰ製剤を、オスモル濃度、Ｐ１８８濃度、ショ糖濃度、およびカプシド比および純度（還元ＣＧＥによる）について調べるために試験した。Ｍ０５－Ｍ０８についてのこれらの試験結果を下記表１４に示す。カプシド純度および比は、ｒＣＧＥによって測定されるように、あまり相違は示されなかった。オスモル濃度は、ショ糖レベルに応じて予測される範囲内である。Ｍ０５－Ｍ０８試料は、Ｐ１８８の正しい濃度を示した。さらに、カルシウムおよびマグネシウムの濃度は、ＣＥＤＥＸにより全ての製剤について予測される範囲内であることが確認された。
表１４．製剤の特徴付け
【表19】
【0071】
ベクターゲノム力価（ｖｇ／ｍＬ）
Ｍ０５－Ｍ０８のベクターゲノム力価の結果を下記の表１５で示す。≦－６５℃および２～８℃条件では、４週間の保存後にあまり変化は見られなかった。４０℃で３日間の後、Ｃａ／Ｍｇを含まない製剤は、ベクターゲノム力価が減少傾向であることが示された。この結果は、実験上のばらつきの範囲内と考えられるが、この製剤のｖｐ力価およびＵＶ２６０／２８０の結果と一致する。
表１５．ゲノム力価（ｖｇ／ｍＬ）
Ｍ０５－Ｍ０８のベクターゲノム力価の結果を下記の表１５で示す。≦－６５℃および２～８℃条件では、４週間の保存後にあまり変化は見られなかった。４０℃で３日間の後、Ｃａ／Ｍｇを含まない製剤は、ベクターゲノム力価が減少傾向であることが示された。この結果は、実験上のばらつきの範囲内と考えられるが、この製剤のｖｐ力価およびＵＶ２６０／２８０の結果と一致する。
表１５．ゲノム力価（ｖｇ／ｍＬ）
【表20】
【0072】
目視外観
全ての製剤は、それぞれ色度および透明度標準であるＢ９色およびオパールエッセンス参照１と同等もしくはそれ以下を示し、全ての時点および条件について白黒背景に対する外観検査に使用した（例えば、Ph. Eur. 7.0, 20201, 20202 (01/2008)；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ色度参照溶液Ｂを参照のこと）。目視外観の結果により、「コントロール」製剤（Ｍ０５）のみが、２５℃で１週間以上の間、または４０℃で３日間またはそれ以上置いた場合に数えきれないほど多い（ＴＭＴＣ）白色薄片状粒子を示したことが示される。Ｍ０６およびＭ０７製剤は、ＴＭＴＣ目視可能な粒子をわずかに示したが；これらの試料の粒子状態全てが繊維状粒子であった。これらの粒子は本試験では同定しなかったが、繊維状粒子は、リン酸カルシウムの特徴である薄片状粒子に対して、外因性粒子（例えば、フィルター粒子）の特徴が強い。また、繊維状／外因性粒子の外観は、ＤＰが厳密に管理された環境条件下で生成されない研究室での開発試験では無視できる。
全ての製剤は、それぞれ色度および透明度標準であるＢ９色およびオパールエッセンス参照１と同等もしくはそれ以下を示し、全ての時点および条件について白黒背景に対する外観検査に使用した（例えば、Ph. Eur. 7.0, 20201, 20202 (01/2008)；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ色度参照溶液Ｂを参照のこと）。目視外観の結果により、「コントロール」製剤（Ｍ０５）のみが、２５℃で１週間以上の間、または４０℃で３日間またはそれ以上置いた場合に数えきれないほど多い（ＴＭＴＣ）白色薄片状粒子を示したことが示される。Ｍ０６およびＭ０７製剤は、ＴＭＴＣ目視可能な粒子をわずかに示したが；これらの試料の粒子状態全てが繊維状粒子であった。これらの粒子は本試験では同定しなかったが、繊維状粒子は、リン酸カルシウムの特徴である薄片状粒子に対して、外因性粒子（例えば、フィルター粒子）の特徴が強い。また、繊維状／外因性粒子の外観は、ＤＰが厳密に管理された環境条件下で生成されない研究室での開発試験では無視できる。
【0073】
累積目視不可能な粒子
ＨＩＡＣによる目視不可能な累積粒子分析により、目視不可能な粒子数が顕著な製剤は「コントロール」製剤のみでことが示され、これにより、攻撃的な安定性条件（より高い温度でより長期間）で増加する傾向にあることが示された。他の製剤（Ｍ０６－Ｍ０８）では、時間または条件に関わらずわずかな粒子数のみが示された。
ＨＩＡＣによる目視不可能な累積粒子分析により、目視不可能な粒子数が顕著な製剤は「コントロール」製剤のみでことが示され、これにより、攻撃的な安定性条件（より高い温度でより長期間）で増加する傾向にあることが示された。他の製剤（Ｍ０６－Ｍ０８）では、時間または条件に関わらずわずかな粒子数のみが示された。
【0074】
機能的生物アッセイ（効力）
機能的ＦＶＩＩＩ生物アッセイ結果を下記表１６に示す。結果は、試料が≦－６５℃または２－８℃のいずれかの条件で維持した場合に効力にあまり変化がないことが示された。２５℃では、４週間後の全ての製剤（Ｍ０５－Ｍ０８）で効力が減少する傾向にあった。４０℃では、３日後のＣａ／Ｍｇを含まない製剤で効力が顕著に減少した。
表１６．機能的生物アッセイ（相対効力）
機能的ＦＶＩＩＩ生物アッセイ結果を下記表１６に示す。結果は、試料が≦－６５℃または２－８℃のいずれかの条件で維持した場合に効力にあまり変化がないことが示された。２５℃では、４週間後の全ての製剤（Ｍ０５－Ｍ０８）で効力が減少する傾向にあった。４０℃では、３日後のＣａ／Ｍｇを含まない製剤で効力が顕著に減少した。
表１６．機能的生物アッセイ（相対効力）
【表21】
【0075】
ＳＥＣ
ＳＥＣ結果を下記に示す。凝集割合の結果を下記表１７に示す。≦－６５℃、２～８℃、または２５℃の安定性条件で凝集にあまり傾向は見られなかった。４０℃では、Ｃａ／Ｍｇを含まない製剤について、１ヶ月後に７％未満のＨＭＷＳと凝集が増加傾向にあった。「カルシウムを含まない」製剤では、４０℃で１ヶ月後に約３％のＨＭＷＳが示された。他の製剤では、≦－６５℃または２～８℃で５週間、２５℃で４週間、および４０℃で１週間まで置いた場合に凝集にあまり増加は示されなかった。
表１７．ＳＥＣによる凝集の濃度（％ＨＭＷＳ）
ＳＥＣ結果を下記に示す。凝集割合の結果を下記表１７に示す。≦－６５℃、２～８℃、または２５℃の安定性条件で凝集にあまり傾向は見られなかった。４０℃では、Ｃａ／Ｍｇを含まない製剤について、１ヶ月後に７％未満のＨＭＷＳと凝集が増加傾向にあった。「カルシウムを含まない」製剤では、４０℃で１ヶ月後に約３％のＨＭＷＳが示された。他の製剤では、≦－６５℃または２～８℃で５週間、２５℃で４週間、および４０℃で１週間まで置いた場合に凝集にあまり増加は示されなかった。
表１７．ＳＥＣによる凝集の濃度（％ＨＭＷＳ）
【表22】
【0076】
ウイルス粒子の結果を下記表１８に示す。≦－６５℃、２～８℃、または２５℃の条件で維持した全ての製剤でウイルス粒子力価にあまり変化が示されなかった。しかしながら、４０℃では、３日および１週間後にＣａ／Ｍｇを含まない製剤の粒子力価に顕著な減少があった。他の製剤（Ｍ０５－Ｍ０６、Ｍ０８）では、≦－６５℃または２－８℃で５週間、２５℃で４週間、および４０℃で１週間まで維持した場合にウイルス粒子力価にあまり減少は示されなかった。
表１８．ＳＥＣによるウイルス粒子力価（ｖｐ／ｍＬ）
表１８．ＳＥＣによるウイルス粒子力価（ｖｐ／ｍＬ）
【表23】
【0077】
ＵＶ２６０／２８０比の結果を下記表１９に示す。ＵＶ２６０／２８０比について、４０℃で維持した場合にＣａ／Ｍｇを含まない製剤について減少傾向にあった。ＵＶ２６０／２８０は、空／全粒子比の代替測定と考えられている。他の製剤（Ｍ０５、Ｍ０６、およびＭ０８）では、示されるように、いずれの条件または時点でもＵＶ２６０／２８０比に全く変化が示されなかった。
表１９．ＳＥＣによるＵＶ２６０／２８０比
表１９．ＳＥＣによるＵＶ２６０／２８０比
【表24】
【0078】
ｐＨ
下記表２０に示されるように、全ての製剤についていずれかの条件および時点においてｐＨに変化はあまりなかった。
表２０．ｐＨ
下記表２０に示されるように、全ての製剤についていずれかの条件および時点においてｐＨに変化はあまりなかった。
表２０．ｐＨ
【表25】
【0079】
質量分析による特徴付け（脱アミド化）
質量分析により決定される脱アミド化の結果を表２１に示す。低温で保存した試料は５週間の試験期間で製剤間にあまり差異を示すことが予測されないことから、４０℃で保存した試料のみをとして本試験で用いた。
質量分析により決定される脱アミド化の結果を表２１に示す。低温で保存した試料は５週間の試験期間で製剤間にあまり差異を示すことが予測されないことから、４０℃で保存した試料のみをとして本試験で用いた。
【0080】
結果は、全ての製剤のＴ０としてコントロール製剤のＴ０を用いて示した。全ての脱アミド化部位について、ＡＡＶ ＶＰ１におけるＮ５７ＧおよびＮ９４Ｈのホットスポットは、４０℃で３週間にて脱アミド化の最も顕著に増加を示した２つである。他の部位でも脱アミド化の増加が示されたが、非常に少ない程度であった（示さず）。これらの２つのホットスポットは、導入効率に影響を与えることが予測されるため、特に重要である。Ｃａ／Ｍｇを含まない製剤により、脱アミド化に最も顕著な増加が示された。他の製剤（Ｍ０５、Ｍ０６、およびＭ０８）全てにおいても、４０℃で３日および３週間後に同様のレベルの脱アミド化の増加が示された。
表２１．質量分析法による脱アミド化（４０℃における％）
表２１．質量分析法による脱アミド化（４０℃における％）
【表26】
【0081】
結論
現在のＳＢ－５２５製剤における３つの可能な変更を施した製剤を評価した：カルシウムを含まない製剤、カルシウムもマグネシウムも含まない製剤、およびショ糖を高濃度で含む製剤。実施例１および２は、特に、凍結／解凍サイクリング、続いて２５℃で１週間以上または４０℃で３日間またはそれ以上のいずれかで安定性にかけた後に、緩衝液と製剤の両方で見られる非常に多くの白色薄片状粒子のランダムな発生を示す。前記粒子をリン酸カルシウムと同定した。
現在のＳＢ－５２５製剤における３つの可能な変更を施した製剤を評価した：カルシウムを含まない製剤、カルシウムもマグネシウムも含まない製剤、およびショ糖を高濃度で含む製剤。実施例１および２は、特に、凍結／解凍サイクリング、続いて２５℃で１週間以上または４０℃で３日間またはそれ以上のいずれかで安定性にかけた後に、緩衝液と製剤の両方で見られる非常に多くの白色薄片状粒子のランダムな発生を示す。前記粒子をリン酸カルシウムと同定した。
【0082】
本明細書の結果により、塩化カルシウムは、意図した保存条件またはストレス保存条件で製剤安定性のために必須ではない賦形剤であることが示される。また、「カルシウムを含まない」および「高ショ糖」製剤について４０℃で２週間まで、２５℃で４週間、ならびに５℃および－７０℃で５週間までの間であまり相違が見られなかった。しかしながら、製剤からのカルシウムおよびマグネシウムの両方の除去は、特に４０℃で維持した場合、ｖｇおよびｖｐ力価のより大きな減少ならびにより高い脱アミド化および凝集を示すことを含む、製剤品質特性に変化を生じさせることが観察された。さらに、５週間を通して、従来の（コントロール）製剤のみが白色薄片状粒子を示し続けたことがわかった。
【0083】
実施例４：ＳＢ－５２５のさらなる再製剤化
粒子の発生を防止するために、この実施例では、製剤に対して３タイプの変化を試験した：（１）ＦＴストレスに対する安定性を増加させるために、ショ糖濃度を１％から５～１０％に増加させること、（２）粒子の供給源を除去し、可能性のある溶解性問題を防止するために、二価陽イオンを除去すること、および（３）製剤のイオン強度を変化させるために、ＮａＣｌを増加させること。
粒子の発生を防止するために、この実施例では、製剤に対して３タイプの変化を試験した：（１）ＦＴストレスに対する安定性を増加させるために、ショ糖濃度を１％から５～１０％に増加させること、（２）粒子の供給源を除去し、可能性のある溶解性問題を防止するために、二価陽イオンを除去すること、および（３）製剤のイオン強度を変化させるために、ＮａＣｌを増加させること。
【0084】
より具体的には、この実施例の実験では、従来の（コントロール）製剤と比較して数種類の変化のうちの１つに対して再製剤化した場合のＳＢ－５２５緩衝液の安定性を評価した；すなわち、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、および０．０５％（ｗ／ｖ） ポロキサマー１８８、ｐＨ７．０～７．６。製剤を６ｍＬのＡＴバイアル内に５ｍＬで充填し、５非制御Ｆ／Ｔサイクル（周囲に対して≦－６５℃）にかけ、続いて２－８℃（加速；液体保存）および２５℃（ストレス；液体保存）で熱安定性にかけて、粒子形成に対する様々な緩衝液を評価した。
【0085】
試験設計
試験した製剤を、表２２に示されるように、塩化およびリン酸化ナトリウムおよびカリウムを水に加え、続いてショ糖を加えることにより製剤化した。必要に応じて、塩化マグネシウム、続いて塩化カルシウムを別の５０ｍＬ溶液中で調製し、より多い溶液に移す。次いで、ポロキサマー１８８を該溶液に加えた。次に、該製剤を適量にし、ｐＨを試験し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターに通して濾過した。
表２２．製剤
試験した製剤を、表２２に示されるように、塩化およびリン酸化ナトリウムおよびカリウムを水に加え、続いてショ糖を加えることにより製剤化した。必要に応じて、塩化マグネシウム、続いて塩化カルシウムを別の５０ｍＬ溶液中で調製し、より多い溶液に移す。次いで、ポロキサマー１８８を該溶液に加えた。次に、該製剤を適量にし、ｐＨを試験し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターに通して濾過した。
表２２．製剤
【表27】
【0086】
これらの製剤によりＡＴバイアルを５ｍＬで充填し、５非制御凍結／解凍サイクルにかけ、５℃または２５℃のいずれかで安定性にかけた。安定性実施スケジュールを表２３で概略する。前記表において、Ｘは、外観（液体）を示し；Ａは、オスモル濃度（凝固点降下）、導電率、粘度、および密度を示し；Ｂは、ＨＩＡＣによる光遮蔽法を示し；Ｃは、Ｐ１８８濃度を示し；ならびにＤは、ｐＨを示す。
表２３．安定性スケジュール ０１３９－Ｍ０３～－Ｍ０８
表２３．安定性スケジュール ０１３９－Ｍ０３～－Ｍ０８
【表28】
【0087】
製剤特性
ＳＢ－５２５緩衝液製剤を、導電率、オスモル濃度、密度、および粘度を決定するために試験した。Ｐ１８８濃度もまた、５℃保存の２．５週間、および２５℃の５日間で測定した。これらの試験の結果を下記表２４に示す。Ｍ０３－Ｍ０９についての導電率、オスモル濃度、密度、および粘度の結果は全て予想どおりであり－ショ糖のより多い量は、より高いオスモル濃度、密度、および粘度を生じ；より多いＮａＣｌは、より高いオスモル濃度および導電率を生じた。Ｐ１８８濃度の結果は、結果の各セットについての方法のばらつきの範囲内であり、正しいＰ１８８濃度が製剤化中に達成されたことを確認した。
表２４．製剤の特徴付け
ＳＢ－５２５緩衝液製剤を、導電率、オスモル濃度、密度、および粘度を決定するために試験した。Ｐ１８８濃度もまた、５℃保存の２．５週間、および２５℃の５日間で測定した。これらの試験の結果を下記表２４に示す。Ｍ０３－Ｍ０９についての導電率、オスモル濃度、密度、および粘度の結果は全て予想どおりであり－ショ糖のより多い量は、より高いオスモル濃度、密度、および粘度を生じ；より多いＮａＣｌは、より高いオスモル濃度および導電率を生じた。Ｐ１８８濃度の結果は、結果の各セットについての方法のばらつきの範囲内であり、正しいＰ１８８濃度が製剤化中に達成されたことを確認した。
表２４．製剤の特徴付け
【表29】
【0088】
ｐＨ
下記表２５で示されるように、ＦＴサイクリング中にいずれの製剤についてもｐＨにあまり変化は見られなかった。
表２５．ｐＨ結果
下記表２５で示されるように、ＦＴサイクリング中にいずれの製剤についてもｐＨにあまり変化は見られなかった。
表２５．ｐＨ結果
【表30】
【0089】
目視外観
全ての試料は、試験した各条件および時点においてＢ９色およびオパールエッセンス参照１と同等もしくはそれ以下を示した。目視外観の結果により、コントロール製剤（Ｍ０９）のみで５℃および２５℃の５日間から８週間までで数えきれないほど多い（ＴＭＴＣ）白色薄片状粒子が常に示された。５％のショ糖製剤は、ＴＭＴＣ目視可能な粒子のランダムな発生を示した。多くの試料もまた、１～５個の繊維状粒子を示した。これらの粒子は本試験では同定しなかったが、繊維状粒子は、リン酸カルシウムの特徴である薄片状粒子に対して、外因性粒子（例えば、フィルター粒子）の特徴が強い。また、繊維状／外因性粒子の外観は、ＤＰが厳密に管理された環境条件下で生成されない研究室での開発試験では無視できる。
全ての試料は、試験した各条件および時点においてＢ９色およびオパールエッセンス参照１と同等もしくはそれ以下を示した。目視外観の結果により、コントロール製剤（Ｍ０９）のみで５℃および２５℃の５日間から８週間までで数えきれないほど多い（ＴＭＴＣ）白色薄片状粒子が常に示された。５％のショ糖製剤は、ＴＭＴＣ目視可能な粒子のランダムな発生を示した。多くの試料もまた、１～５個の繊維状粒子を示した。これらの粒子は本試験では同定しなかったが、繊維状粒子は、リン酸カルシウムの特徴である薄片状粒子に対して、外因性粒子（例えば、フィルター粒子）の特徴が強い。また、繊維状／外因性粒子の外観は、ＤＰが厳密に管理された環境条件下で生成されない研究室での開発試験では無視できる。
【0090】
目視不可能な粒子数
ＨＩＡＣによる目視不可能な粒子分析により、顕著で一定の目視不可能な粒子数を示す製剤は、コントロール製剤（Ｍ０９）のみであることが示され、このことは、より高い安定性条件（２５℃）で保存を続けることにより悪化した。他の製剤（Ｍ０３－Ｍ０８）では、時間または条件に関わらず粒子数はあまり示されず、全体的な傾向が示されなかった。
ＨＩＡＣによる目視不可能な粒子分析により、顕著で一定の目視不可能な粒子数を示す製剤は、コントロール製剤（Ｍ０９）のみであることが示され、このことは、より高い安定性条件（２５℃）で保存を続けることにより悪化した。他の製剤（Ｍ０３－Ｍ０８）では、時間または条件に関わらず粒子数はあまり示されず、全体的な傾向が示されなかった。
【0091】
結論
この実施例は、従来の（コントロール）ＳＢ－５２５製剤とのいくつかの製剤の差異における凍結／解凍ストレスおよび熱安定性の効果を評価した。７つの異なる製剤をＡＴクリスタルクローズドバイアルに充填し、凍結／解凍サイクルにかけ、５℃および２５℃で８週間保存した。全ての試験条件を通して、コントロール製剤のみが常に白色薄片状粒子を示し続けた。
この実施例は、従来の（コントロール）ＳＢ－５２５製剤とのいくつかの製剤の差異における凍結／解凍ストレスおよび熱安定性の効果を評価した。７つの異なる製剤をＡＴクリスタルクローズドバイアルに充填し、凍結／解凍サイクルにかけ、５℃および２５℃で８週間保存した。全ての試験条件を通して、コントロール製剤のみが常に白色薄片状粒子を示し続けた。
【0092】
ＦＴサイクル後、いずれの製剤も目視可能な粒子形成もｐＨ変化もあまり示さず、それゆえ、全ての製剤を８週間にわたる５℃および２５℃における短期間安定性にかけた。安定性にかけたことにより、一定して目視可能な粒子を顕著に発生することが示されたのは、コントロール製剤（Ｍ０９）のみであった。前記粒子の結果が同等であったため（すなわち、目視可能な粒子があまり発生しないため）、「２００ｍＭ ＮａＣｌ」（Ｍ０３）、「５％ ショ糖」（Ｍ０４）、および「１０％ ショ糖」（Ｍ０６）製剤を続く再製剤化試験において選択しなかった。特に、「５％ ショ糖」製剤（Ｍ０４）では、白色薄片状粒子のいくらかの形成が示され、このことは、このショ糖濃度がＦＴストレスによる粒子の発生を防止するために十分ではない可能性を示し、および「１０％ ショ糖」（Ｍ０６）がその高い粘度による製造課題を導入してしまうことを示す。よって、これらの結果に基づくと、「８．５％ ショ糖」（Ｍ０５）、「カルシウムを含まない」（Ｍ０７）、および「カルシウムおよびマグネシウムを含まない」（Ｍ０８）製剤は、有望でありうる。
【0093】
実施例５：ＳＢ－５２５の最終製剤
ＳＢ－５２５（ＰＦ－０７０５５４８０）原薬（ＤＳ）の組成および説明を表２６に示す。前記製剤は、７．３±０．３の最終ｐＨであった。賦形剤濃度は、塩基緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）を加えることにより全体として、または部分的に得た。ＤＳ濃度の目標は、ＤＳ目標の５０－２５０％のＤＳ範囲で１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ（０．５Ｅ＋１３～２．５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ）であった。
表２６．ＳＢ－５２５原薬製剤の説明
ＳＢ－５２５（ＰＦ－０７０５５４８０）原薬（ＤＳ）の組成および説明を表２６に示す。前記製剤は、７．３±０．３の最終ｐＨであった。賦形剤濃度は、塩基緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）を加えることにより全体として、または部分的に得た。ＤＳ濃度の目標は、ＤＳ目標の５０－２５０％のＤＳ範囲で１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ（０．５Ｅ＋１３～２．５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ）であった。
表２６．ＳＢ－５２５原薬製剤の説明
【表31】
【0094】
ＳＢ－５２５（ＰＦ－０７０５５４８０）製剤の組成および説明を表２７に示す。前記ＤＰは、７．３±０．３の最終ｐＨであった。賦形剤濃度は、塩基緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）を加えることにより全体として、または部分的に得た。ＤＰ濃度の目標は、ＤＰ目標の３０－３００％のＤＰ範囲で１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ（０．３Ｅ＋１３～３．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ）であった。
表２７．ＳＢ－５２５原薬製剤の説明
表２７．ＳＢ－５２５原薬製剤の説明
【表32】
【0095】
容器および充填体積
濾過した原薬を無菌高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ボトル中に包装した。該ＤＰを、所定位置に熱可塑性エラストマー共栓が付いたＡＴ１０ｍＬのシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）バイアル（Ａｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＶＩＡ－１０１８００）に充填した。ＤＳおよびＤＰを－６０℃～－９０℃で保存した。各バイアルには、６．４Ｅ＋１３（公称上、６．０Ｅ＋１３）ｖｇのＳＢ－５２５ＡＡＶとともに、６．４ｍＬのＤＰ（目的の抽出可能な体積６ｍＬ）が含まれた。
濾過した原薬を無菌高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ボトル中に包装した。該ＤＰを、所定位置に熱可塑性エラストマー共栓が付いたＡＴ１０ｍＬのシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）バイアル（Ａｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＶＩＡ－１０１８００）に充填した。ＤＳおよびＤＰを－６０℃～－９０℃で保存した。各バイアルには、６．４Ｅ＋１３（公称上、６．０Ｅ＋１３）ｖｇのＳＢ－５２５ＡＡＶとともに、６．４ｍＬのＤＰ（目的の抽出可能な体積６ｍＬ）が含まれた。
【0096】
ＤＰの特徴付け
ＳＢ－５２５ＤＰの粘度、オスモル濃度、密度、および導電率を測定した。密度は１.０１０６ｇ／ｍＬ（２０℃）であった。粘度は１．１１２ｃＰ（２０℃）であった。オスモル濃度は３７４ｍＯｓｍ／ｋｇであった。導電率は１７．８０ｍＳ／ｃｍ（２０℃）であった。
ＳＢ－５２５ＤＰの粘度、オスモル濃度、密度、および導電率を測定した。密度は１.０１０６ｇ／ｍＬ（２０℃）であった。粘度は１．１１２ｃＰ（２０℃）であった。オスモル濃度は３７４ｍＯｓｍ／ｋｇであった。導電率は１７．８０ｍＳ／ｃｍ（２０℃）であった。
【0097】
実施例６：ＡＡＶ６ウイルスベクター原薬製剤
下記実施例６～８は、様々な濃度の二価陽イオン塩を含むＡＡＶ２／６ウイルスベクター製剤を評価するために行ったさらなる再製剤化および加速安定性試験を記載する。前記実施例と同様に、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６カプシドおよび組換えゲノム（ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む）を有する。ここでのウイルスベクターは、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする導入遺伝子を保有する。この導入遺伝子は、ＩＤＵＡが欠失している患者、例えば、ハーラー症候群（リソソーム蓄積症）としても公知のムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ－Ｉ）の患者の助けとなる。ＡＡＶゲノムは、ＵＳ２０２０／０２４６４８６の表５における配列番号２８として示される。ウイルスゲノムは、ＡＡＶカプシド内に位置し、前記製剤に曝露されないため、実施例６～８での観察は、これまでの実施例のように、他の導入遺伝子を保有するＡＡＶ６ベクターに適用できると予測される。
下記実施例６～８は、様々な濃度の二価陽イオン塩を含むＡＡＶ２／６ウイルスベクター製剤を評価するために行ったさらなる再製剤化および加速安定性試験を記載する。前記実施例と同様に、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６カプシドおよび組換えゲノム（ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む）を有する。ここでのウイルスベクターは、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする導入遺伝子を保有する。この導入遺伝子は、ＩＤＵＡが欠失している患者、例えば、ハーラー症候群（リソソーム蓄積症）としても公知のムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ－Ｉ）の患者の助けとなる。ＡＡＶゲノムは、ＵＳ２０２０／０２４６４８６の表５における配列番号２８として示される。ウイルスゲノムは、ＡＡＶカプシド内に位置し、前記製剤に曝露されないため、実施例６～８での観察は、これまでの実施例のように、他の導入遺伝子を保有するＡＡＶ６ベクターに適用できると予測される。
【0098】
この試験はまた、凍結／解凍サイクル後に沈殿を形成しない新たな製剤を特定するために行った。様々な濃度の二価陽イオン塩を含む４つのＡＡＶ６ウイルスベクター原薬製剤の安定性を評価した。
【0099】
試験した製剤には、様々な濃度の二価陽イオン塩（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）を含有させた。上記に記載されるように、従来のＡＡＶ６製剤ならびに製剤緩衝液（ＡＡＶ６を含まない）は全て、複数回の凍結／解凍サイクル後に少量の目視可能な沈殿物の形成が見られた。沈殿した粒子は、リン酸カルシウム塩から構成されることを決定した。製剤が一般的な使用中に凍結／解凍サイクルを経るため、塩沈殿の可能性は、患者の安全性に対するリスクおよび製剤品質に対するリスクとなりうる。下記実施例６－８に示される試験は、このような沈殿の問題を有さない改善された製剤を見つけ出すことが目的であった。
【0100】
この試験において、ＡＡＶ６ウイルスベクター製剤の試料は、タンジェンシャルフロー濾過により異なる原薬製剤として調製し、試料を高濃度「スパイク緩衝液」でスパイクした。次いで、再製剤化した試料を様々な加速させた安定性条件下でインキュベートし、試料の品質特性をインキュベート後に測定した。品質特性の結果を適切に公知の方法変動性を考慮しつつ評価した。当該試験期間の異常値と傾向の結果を４つの製剤各々について特定した。合格（Pass）、中間（Neutral）、または失敗（Fail）のスコアを、各試験エンドポイントでの結果に基づいて各品質特性および製剤について割り当てた。最終的に、各４つの製剤の全体の品質特性安定性スコアを相互に比較した。試験を下記で詳細に記載する。
【0101】
試料調製
本明細書で調製したＡＡＶ６製剤には、下記表１に記載されるように、製剤化緩衝液Ｆ０中に懸濁させた約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ６ドナーベクターを含ませた。緩衝液Ｆ０は、二価陽イオンのカルシウム（ＣａＣｌ２として）およびマグネシウム（ＭｇＣｌ２として）、さらなる量の約３５ｍＭの塩化ナトリウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水の方法に基づき、１％ｗ／ｖ ショ糖および０．０５％ｗ／ｖ ポロキサマー１８８に製剤化させた。
本明細書で調製したＡＡＶ６製剤には、下記表１に記載されるように、製剤化緩衝液Ｆ０中に懸濁させた約１．０Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ６ドナーベクターを含ませた。緩衝液Ｆ０は、二価陽イオンのカルシウム（ＣａＣｌ２として）およびマグネシウム（ＭｇＣｌ２として）、さらなる量の約３５ｍＭの塩化ナトリウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水の方法に基づき、１％ｗ／ｖ ショ糖および０．０５％ｗ／ｖ ポロキサマー１８８に製剤化させた。
【0102】
前記ＡＡＶ６物質を別の緩衝液製剤に移すために、図２に示されるように、タンジェンシャルフロー濾過による緩衝液交換を行った。簡単に説明すると、緩衝液Ｆ０中に製剤化したＡＡＶ６製剤の数個のバイアルを融解し、単一の限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）リザーバーに移した。まず限外濾過を行って該物質を約２ｘに濃縮した。次いで、濃縮した物質を、少なくとも１０ｘ同等体積の製剤緩衝液Ｆ１で透析濾過した。図２で「Ａ」とラベルされた回収した中間体物質を、製剤緩衝液Ｆ１中で懸濁して約２．０Ｅ＋１３ｖｇコピー／ｍＬが含まれるはずである。
【0103】
次に、前記中間体ＵＦ／ＤＦ生成物「Ａ」を３つに分割し、３つの異なる緩衝液に製剤化した。３つのさらなる製剤緩衝液（Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３；表２８）は、塩化ナトリウム、ショ糖、およびポロキサマー１８８（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８）をさらに加えたダルベッコリン酸緩衝生理食塩水から調製した。これらの３つの緩衝液には、カルシウムが含まれず、代わりに異なる量のマグネシウムを含ませた。緩衝液Ｆ１には、カルシウム成分もマグネシウム成分も含ませず、緩衝液Ｆ２には、Ｆ０と等価モル濃度のマグネシウムを含ませ、および緩衝液Ｆ３には、緩衝液Ｆ０から除いたカルシウムのモルの割合を占めるさらなる量のマグネシウムを含ませた。
表２８．製剤緩衝液の組成
表２８．製剤緩衝液の組成
【表33】
【0104】
試料調製を簡便にし、異なる緩衝液の調製を可能にするために、緩衝液Ｆ２およびＦ３の６倍高い濃度の「スパイク緩衝液」を調製した。図３で示されるように、これらのＦ２およびＦ３「６ｘ濃度」緩衝液は、Ｆ１と１：５の比率で混合して緩衝液Ｆ２およびＦ３のそれぞれの目的の組成物を生成した。
【0105】
これらの製剤緩衝液を調製するために、各乾燥成分の重量を、マイクロバランスを用いて量りとった。前記成分を混合し、注射用脱イオン水に溶解させた。続いて、これらの緩衝液を、必要であれば、０．１Ｍ ＮａＯＨまたは０．１Ｍ ＨＣＩで目的のｐＨ範囲に滴定した。最終的に、これらの緩衝液をショ糖およびポロキサマー１８８と所望される濃度で製剤化した。
【0106】
調製した原薬製剤の組成を、確認のためにいくつかの半定量的測定で測定し、それらの結果を表２９に記載する。市販の比色分析アッセイを用いてＣａ２＋（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃａｔ＃Ｋ３８０－２５０）およびＭｇ２＋（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃａｔ＃Ｋ３８５－ｌ００）の濃度を測定した。両方の比色分析アッセイにおいて、前記試料濃度は、測定のダイナミック線形範囲内であり、調べたシグナルと算出された濃度は、理論上の試料組成と傾向が一致していた。決定的なことに、製剤Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３全てのカルシウムシグナルがアッセイネガティブコントロールと一致した。よって、これらの試料には、カルシウムが含まれておらず、ＴＦＦ試料の調製工程はＦ０出発物質中に存在するカルシウムを除去するのに効果的にあった。マグネシウム測定により、also confirmed Ｍｇ２＋もＴＦＦにより除去され、Ｆ２およびＦ３中で適切な濃度で添加されたことも確認された。
表２９．製剤化した原薬の実験上測定したパラメータ
表２９．製剤化した原薬の実験上測定したパラメータ
【表34】
【0107】
ｑＰＣＲもまた、ｖｇ力価を測定するために行い、多角度動的光散乱法（ＭＡＤＬＳ）を、粒子濃度を測定するために行った。再度、これらの結果は、試料の調製から予測される範囲であり、緩衝液交換と製剤化工程が意図されたとおりに行われたことを示す。
【0108】
バルク製剤化した生成物を濾過し、０．５ｍＬ／バイアルで２ｍＬの環化オレフィンポリマー（ＣＯＰ）バイアル（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａ／Ｄａｉｋｙｏ ＣＺ Ｃａｔ＃１９５５００５７）に充填した。
【0109】
試料インキュベーション
バイアルに入れた製剤を下記に記載の様々な条件でインキュベートした。凍結／解凍サイクリングは、表３０に記載の実施日に行った。
表３０．凍結／解凍サイクリング試料の実施日
バイアルに入れた製剤を下記に記載の様々な条件でインキュベートした。凍結／解凍サイクリングは、表３０に記載の実施日に行った。
表３０．凍結／解凍サイクリング試料の実施日
【表35】
【0110】
試料を「加速下、ストレス」条件（４０℃／７５％ 相対湿度（ＲＨ））または「加速下、周囲」条件（２５℃／６０％ ＲＨ）にそれらの実施日のＤ３、Ｄ７、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月にかけた。試料を２～８℃で保存し、それらの実施時の２４時間以内に分析した。
【0111】
全ての実施済み試料を、目的の試料を試験するために、ポリカルボネートフリップトップ遠心分離チューブに一定分量で分注した。一定分量を。２ヶ月未満で積極的に試験する間は２～８℃で保存した。実施日から合理的な時間内に試験しない場合、該一定分量を試験が行われ得るまで≦－６５℃で保存した。全ての保存試料および試験後の残りの材料を長期間保存のために≦－６５℃で保存した。
【0112】
実施例７：ＡＡＶ６原薬製剤の試験
試料は、表３１に記載の品質特性を含む試験を行った。略語を下記に示す：ＤＬＳ、動的光散乱法；ＭＡＤＬＳ、多角度動的光散乱法；ＨＭＷＳ、高分子量種；ＳＥ－ＬＣ、サイズ排除液体クロマトグラフィー；およびＡＥＸ－ＬＣ、陰イオン交換液体クロマトグラフィー。溶液の外観を、それらが清澄であり、無色であり、および粒子状物を含まないことを確認するために評価した。濁り、曇り、または目視可能な粒子を含む溶液は、評価基準に適合しなかった。
表３１．評価した製剤の品質特性
試料は、表３１に記載の品質特性を含む試験を行った。略語を下記に示す：ＤＬＳ、動的光散乱法；ＭＡＤＬＳ、多角度動的光散乱法；ＨＭＷＳ、高分子量種；ＳＥ－ＬＣ、サイズ排除液体クロマトグラフィー；およびＡＥＸ－ＬＣ、陰イオン交換液体クロマトグラフィー。溶液の外観を、それらが清澄であり、無色であり、および粒子状物を含まないことを確認するために評価した。濁り、曇り、または目視可能な粒子を含む溶液は、評価基準に適合しなかった。
表３１．評価した製剤の品質特性
【表36】
【0113】
初回試料
全ての開始製剤化製剤試料からの品質特性の結果を表３２および表３３に示す。結果を、全体、純度、および強度の品質特性カテゴリーによってグループ化した。
表３２．開始（ｔ０）試料における全体および純度の品質特性結果
表３３．開始（ｔ０）試料における濃度の品質特性結果
全ての開始製剤化製剤試料からの品質特性の結果を表３２および表３３に示す。結果を、全体、純度、および強度の品質特性カテゴリーによってグループ化した。
表３２．開始（ｔ０）試料における全体および純度の品質特性結果
【表37】
【表38】
【0114】
開始の感染力価の結果は、Ｆ３では、他の開始試料と比較して大抵低かった。これはまた、他の試料より顕著に高いｖｇ／ＴＣＩＤ比を示した。このことは、主に、ＴＣＩＤ５０アッセイのばらつきによるものであった。他の結果のいずれもあまり影響されていないようであった。
【0115】
凍結／解凍サイクル試料
４つの異なる製剤の凍結／解凍サイクリングによる試験結果を図４Ａ～Ｄに示す。データにより、凍結／解凍サイクリングは、４つの製剤全てにおいて、溶液ｐＨ、モノマーカプシドサイズ、試料サイズ分布、または全カプシド含量に影響を与えず、ＨＭＷＳまたは可溶性凝集物の量もあまり生じなかったことが示される。しかしながら、凍結／解凍サイクリングにより、開始Ｆ０コントロール製剤において目視外観が失敗した。５ｘＦ／Ｔサイクル後、小さい白色薄片の沈殿物が見られ、これらは以前に観察されたリン酸カルシウム沈殿物の特徴を有していた。これらの沈殿物は、製剤Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３で検出されなかった。前記データはまた、凍結／解凍サイクリングが、試験方法の変動性も考慮すると、いずれの製剤強度特性にあまり影響を与えないことも示す。
４つの異なる製剤の凍結／解凍サイクリングによる試験結果を図４Ａ～Ｄに示す。データにより、凍結／解凍サイクリングは、４つの製剤全てにおいて、溶液ｐＨ、モノマーカプシドサイズ、試料サイズ分布、または全カプシド含量に影響を与えず、ＨＭＷＳまたは可溶性凝集物の量もあまり生じなかったことが示される。しかしながら、凍結／解凍サイクリングにより、開始Ｆ０コントロール製剤において目視外観が失敗した。５ｘＦ／Ｔサイクル後、小さい白色薄片の沈殿物が見られ、これらは以前に観察されたリン酸カルシウム沈殿物の特徴を有していた。これらの沈殿物は、製剤Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３で検出されなかった。前記データはまた、凍結／解凍サイクリングが、試験方法の変動性も考慮すると、いずれの製剤強度特性にあまり影響を与えないことも示す。
【0116】
２５℃／６０％ ＲＨ（周囲）加速下の試料
４つの異なる製剤の周囲条件（２５℃／６０％ ＲＨ）インキュベーションによる試験結果を図５Ａ－Ｄに示す。前記データは、外観およびｐＨが２５℃条件によって影響を受けなかったことを示す。試料サイズ分布は、広がっているように見え、多分散度（ＰＤＩ）が増加し、モノマーピーク平均サイズは、インキュベーション時間が長くなるにつれ少し増加した。高分子量種（ＨＭＷＳ）もまた、インキュベーション時間とともに形成され始めた。一般に、これらのＨＭＷＳは、ＤＬＳよりＳＥ－ＬＣによってより簡易に検出された。全および空カプシドの電荷分離は、２５℃でインキュベーションの１～２ヶ月後に喪失されているようであり、それゆえ、全カプシド％は、ＡＥＸ－ＬＣによって測定できなかった。カプシド力価およびモノマー濃度は、２５℃条件によって影響を受けず、ｖｇ力価も影響されているように見えなかった。ＴＣＩＤ５０は、Ｆ０、Ｆ１、およびＦ２について３ヶ月および６ヶ月の時点で減少したが、同一の結果はＦ３で観察されなかった。
４つの異なる製剤の周囲条件（２５℃／６０％ ＲＨ）インキュベーションによる試験結果を図５Ａ－Ｄに示す。前記データは、外観およびｐＨが２５℃条件によって影響を受けなかったことを示す。試料サイズ分布は、広がっているように見え、多分散度（ＰＤＩ）が増加し、モノマーピーク平均サイズは、インキュベーション時間が長くなるにつれ少し増加した。高分子量種（ＨＭＷＳ）もまた、インキュベーション時間とともに形成され始めた。一般に、これらのＨＭＷＳは、ＤＬＳよりＳＥ－ＬＣによってより簡易に検出された。全および空カプシドの電荷分離は、２５℃でインキュベーションの１～２ヶ月後に喪失されているようであり、それゆえ、全カプシド％は、ＡＥＸ－ＬＣによって測定できなかった。カプシド力価およびモノマー濃度は、２５℃条件によって影響を受けず、ｖｇ力価も影響されているように見えなかった。ＴＣＩＤ５０は、Ｆ０、Ｆ１、およびＦ２について３ヶ月および６ヶ月の時点で減少したが、同一の結果はＦ３で観察されなかった。
【0117】
４０℃／７５％ ＲＨストレス下の試料
４つの異なる製剤のストレス条件（４０℃／７５％ ＲＨ）インキュベーションによる試験結果を図６Ａ～Ｄに示す。前記データは、４０℃／７５％ ＲＨ条件が、いくつかの製剤品質特性に著しく大きな影響を与えたことを示す。粒子サイズ分布は、大幅に広がり、ＨＭＷＳが形成されていた。ＳＥ－ＬＣは、ＤＬＳよりより少量のＨＭＷＳの検出について感度が高いようであるが、大量のＨＭＷＳ（可能性のある高分子量種）が存在する場合、これらの粒子は、ＳＥ－ＬＣによって検出されなかった可能性がある。高分子量種は、濾過されたか、または前記検出器に到達するためにＬＣカラムを通過しなかった可能性がある。
４つの異なる製剤のストレス条件（４０℃／７５％ ＲＨ）インキュベーションによる試験結果を図６Ａ～Ｄに示す。前記データは、４０℃／７５％ ＲＨ条件が、いくつかの製剤品質特性に著しく大きな影響を与えたことを示す。粒子サイズ分布は、大幅に広がり、ＨＭＷＳが形成されていた。ＳＥ－ＬＣは、ＤＬＳよりより少量のＨＭＷＳの検出について感度が高いようであるが、大量のＨＭＷＳ（可能性のある高分子量種）が存在する場合、これらの粒子は、ＳＥ－ＬＣによって検出されなかった可能性がある。高分子量種は、濾過されたか、または前記検出器に到達するためにＬＣカラムを通過しなかった可能性がある。
【0118】
４０℃で３ヶ月後、全ての溶液は、恐らく大きい不溶性凝集物またはＨＭＷＳの形成により、濁って見え始めた。溶液ｐＨは、影響を受けていないようであった。ＴＣＩＤ５０は、４０℃／７５％ ＲＨにおける１ヶ月後の全ての試料で大幅に減少し、Ｆ３で見られた開始から最も少ない減少だった。
【0119】
実施例８：試験エンドポイント測定
試料内分析を各製剤について行った。各製剤内において、各品質特性についての各試験エンドポイント結果を、図７に記載されるように、許容および失敗基準に対してスコア化した。目的の安定性試験エンドポイントは以下のとおりである：１サイクルあたり≦－６５℃で１２時間未満および周囲温度で６時間未満の１０ｘ凍結／解凍サイクル、２５℃／６０％ ＲＨで３ヶ月、および４０℃／７５％ ＲＨで１ヶ月。各試験エンドポイントにおいて、図７に記載される品質特性は、公知の樹立された方法の変動性、ならびにこの試験で得られた全てのデータの全体的な評価に基づいて決定した。
試料内分析を各製剤について行った。各製剤内において、各品質特性についての各試験エンドポイント結果を、図７に記載されるように、許容および失敗基準に対してスコア化した。目的の安定性試験エンドポイントは以下のとおりである：１サイクルあたり≦－６５℃で１２時間未満および周囲温度で６時間未満の１０ｘ凍結／解凍サイクル、２５℃／６０％ ＲＨで３ヶ月、および４０℃／７５％ ＲＨで１ヶ月。各試験エンドポイントにおいて、図７に記載される品質特性は、公知の樹立された方法の変動性、ならびにこの試験で得られた全てのデータの全体的な評価に基づいて決定した。
【0120】
各製剤の試料間分析または相対評価を行うために、各品質特性についての各エンドポイントスコアを製剤ごとに比較した。１つの品質特性を考慮する場合、全体の合格（Pass）、中間（Neutral）、または失敗（Fail）スコアを、４つの考慮する製剤全体の相対エンドポイントスコアを全体として比較することにより各製剤について割り当てた。例えば、全てのエンドポイント結果が、所定の製剤について合格した許容基準を示した場合、全体の合格スコアを、その製剤についてのその品質特性について割り当てた。中間および失敗エンドポイント条件の数は、その製剤についての全体の品質特性スコアを割り当てる際に考慮した。外観などの一定の品質特性について、１つの失敗エンドポイントスコアで、その製剤についての全体の失敗をスコア化するのに十分である。モノマー濃度などの他の品質特性については、４０℃条件での１つの失敗エンドポイントが全ての製剤（Ｆ３を除く）に適用された；よって、この失敗エンドポイントは十分にスコア化されなかった。ＴＣＩＤ５０の結果には、情報のみが含まれ、スコアは割り当てられなかった。
【0121】
【0122】
加速した安定性試験の期間中の全体の品質特性スコアは、製剤Ｆ３およびＦ２が、Ｆ０およびＦ１より優れていることを示す。製剤Ｆ３は、最も優れているようであり、８つの全体の合格品質特性スコアと２つの中間スコアであった。製剤Ｆ２もまた、十分に優れていた。Ｆ０は、外観についての全体の失敗スコアを示し、この製剤を改善するという最初の目的が確認された。Ｆ１は、最も多い凝集物を示し、検出されたＨＭＷＳが最も多いようであった。
【0123】
実施例９：長期温度試験
製剤緩衝液中に１.００Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬで供されたＳＢ－５２５（ＰＦ－０７０５５４８０）製剤の安定性を長期の温度で試験した。製剤化緩衝液には、以下の成分が含有された：０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（ｐＨ７．４）。
製剤緩衝液中に１.００Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬで供されたＳＢ－５２５（ＰＦ－０７０５５４８０）製剤の安定性を長期の温度で試験した。製剤化緩衝液には、以下の成分が含有された：０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（ｐＨ７．４）。
【0124】
前記製剤を含むバイアルを、（ｉ）－７０℃で０日間（Ｔ０）、（ｉｉ）－１５０℃で３日間（Ｔ３日間）、および（ｉｉｉ）－１５０℃で１４日間（Ｔ１４日間）保存した。続いて、製剤試料を（ｉ）外観（液体）、（ｉｉ）還元ＣＥ－ＳＤＳ、（ｉｉｉ）ＳＥＣ力価＿２６０／２８０、および（ｉｖ）インビトロＦＶＩＩＩ活性（生物アッセイ）について分析した。製剤緩衝液試料もまた、（ｉ）容器完全性について分析した。
【0125】
下記表３５で示されるように、試料を－１５０℃で１４日間までの保存を含む試験条件で保存した場合、色、透明度、還元ＣＥ－ＳＤＳ、ＳＥＣ力価＿２６０／２８０（空：全カプシド比の代替測定）、または生物学的活性（相対％効力）にあまり変化はなかった。容器完全性について－１５０℃で１４日間の保存後に影響は見られなかった。
表３５．安定性結果
表３５．安定性結果
【表40】
【0126】
実施例１０：輸送想定および長期温度試験
衝撃、気圧、落下、および振動などの想定される輸送条件下でのＳＢ－５２５製剤の安定性を試験した。ＳＢ－５２５製剤を、下記成分を含む製剤化緩衝液中で１．００Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬで供した：０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（ｐＨ７．４）。
衝撃、気圧、落下、および振動などの想定される輸送条件下でのＳＢ－５２５製剤の安定性を試験した。ＳＢ－５２５製剤を、下記成分を含む製剤化緩衝液中で１．００Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬで供した：０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０５％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（ｐＨ７．４）。
【0127】
前記製剤を含む試験試料バイアルを、最悪の場合のグローバル輸送プロファイルを用いて、同時に適用される輸送危険（例えば、衝撃、気圧、落下、および振動）にかけた。コントロール試料バイアルは、同時に適用される輸送危険にかけなかった。刺激の一部として、試験バイアルを－３５℃で４０時間、その後、－７０℃でさらに４０時間保った。刺激後、コントロールおよび試験製剤バイアルを－７０℃で保存し、０日目（Ｔ０）、６ヶ月目（Ｔ６ヶ月）、および１０ヶ月目（Ｔ１０ヶ月）で試験した。製剤緩衝液バイアルを－７０℃で保存し、Ｔ０で試験した。製剤試料を、（ｉ）外観（液体）、（ｉｉ）還元ＣＥ－ＳＤＳ、（ｉｉｉ）ＳＥＣ力価＿２６０／２８０、および（ｉｖ）インビトロＦＶＩＩＩ活性（生物アッセイ）について分析した。製剤緩衝液試料を（ｉ）容器完全性について分析した。
【0128】
下記表３６で示されるように、試料を前記試験条件で１０ヶ月まで保存した場合、色、透明度、還元ＣＥ－ＳＤＳ、ＳＥＣ力価＿２６０／２８０（空：全カプシド比の代替測定）、または生物学的活性（相対％効力）にあまり変化はなかった。Ｔ０で容器完全性に影響はなかった。
表３６．安定性の結果
表３６．安定性の結果
【表41】
【0129】
実施例１１：製剤安定性データ－２４ヶ月
この試験の目的は、目的の保存温度（－７０℃）におけるＳＢ－５２５製剤の長期間（２４ヶ月）安定性を設定することであった。この試験において、ＳＢ－５２５製剤（ＤＰ）は、Ｓｆ９昆虫細胞から精製し、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、および０．０５％（ｗ／ｖ）ポロキサマーＰ１８８（ｐＨ７．３±０．３）中で目的の１．００Ｅ＋１３ベクターｖｇ／ｍＬで製剤化した。続いて、前記ＤＰを６．４ｍＬで１０ｍＬのＡｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＴ）クリスタルクローズドバイアルに充填し、－６０℃～－９０℃で保存した。
この試験の目的は、目的の保存温度（－７０℃）におけるＳＢ－５２５製剤の長期間（２４ヶ月）安定性を設定することであった。この試験において、ＳＢ－５２５製剤（ＤＰ）は、Ｓｆ９昆虫細胞から精製し、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１７２ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、および０．０５％（ｗ／ｖ）ポロキサマーＰ１８８（ｐＨ７．３±０．３）中で目的の１．００Ｅ＋１３ベクターｖｇ／ｍＬで製剤化した。続いて、前記ＤＰを６．４ｍＬで１０ｍＬのＡｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＴ）クリスタルクローズドバイアルに充填し、－６０℃～－９０℃で保存した。
【0130】
５サイクルの非制御Ｆ／Ｔおよび２４時間攪拌を含むＤＰ安定性試験による結果を図１０に示す。前記データにより、－７０℃で２４ヶ月、５℃で１２ヶ月、および２５℃／６０％ ＲＨで３ヶ月までに、色、透明度、ｐＨ、目視不可能な累積粒子状物質、カプシド純度およびＶＰ比（Ｒ－ＣＧＥによる）、％ＨＭＭＳおよびＵＶ２６０／２８０（ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる）、ならびにカプシド力価においてみられる明確な傾向がなかったことが示される。５℃で１２ヶ月の試料では、形態上、自然および非制御の実験条件（すなわち、オープンラボ空間）での試験において外来物であるように見える溶液中の「１つの長い繊維状粒子」が記録された；他の全ての試料では、「目視可能な粒子が基本的に含まれない」ことが記録された。５サイクルの非制御Ｆ／Ｔまたは２４時間攪拌後にこれらの品質特性に変化がないことが観察された。
【0131】
試験した全ての時点および条件について、ゲノム力価および感染したウイルス力価ならびに感染比についての結果の変動性は、予測した測定変動性の範囲内であり、明らかな傾向は示されなかった。感度と正確な安定性を示す方法であるインビトロ相対効力の結果は、２４ヶ月後に目的の保存条件（－７０℃）で効力がわずかに減少傾向を示したが、これらの結果は、臨床的な安定性許容基準の範囲内である。２５℃／６０％ ＲＨで３ヶ月および５℃で１２ヶ月の効力において安定性を示す減少傾向もまた見られた。
【0132】
また、容器完全性（ＣＣＩＴ）を、有効化したヘッドスペースアナライザーにより目的の保存条件（－７０℃）で１８ヶ月目に試験し、結果を記録した。６つの条件付きバイアルをこの解析に用いた。Ｐ１８８濃度もまた、－７０℃で１８ヶ月、５℃で１２ヶ月、および２５℃／６０％ ＲＨで３ヶ月までで安定であった。－７０℃で２４ヶ月においてＰ１８８濃度のわずかな減少が見られた。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C-1】
【図6C-2】
【図6D-1】
【図6D-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【配列表】
【国際調査報告】