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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-04
(54)【発明の名称】増加した免疫原性を有する改変パラポックスウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 15/863 20060101AFI20231222BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20231222BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231222BHJP
A61K 39/275 20060101ALI20231222BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20231222BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231222BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231222BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231222BHJP
C12N 15/39 20060101ALN20231222BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20231222BHJP
C12N 15/44 20060101ALN20231222BHJP
C12N 15/47 20060101ALN20231222BHJP
C12N 15/33 20060101ALN20231222BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231222BHJP
C12N 15/19 20060101ALN20231222BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231222BHJP
【ＦＩ】
C12N15/863 Z ZNA
C12N7/01
C12N5/10
A61K39/275
A61K35/76
A61P37/04
A61K48/00
A61K31/7088
C12N15/39
C12N15/50
C12N15/44
C12N15/47
C12N15/33
C12N15/31
C12N15/19
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538102
(86)(22)【出願日】2021-12-14
(85)【翻訳文提出日】2023-06-21
(86)【国際出願番号】 EP2021085775
(87)【国際公開番号】W WO2022136034
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】20216201.2
(32)【優先日】2020-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523057910
【氏名又は名称】プライム ベクター テクノロジーズ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】アマン，ラルフ
(72)【発明者】
【氏名】サロモン，フェルディナンド
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA45
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C085AA03
4C085DD62
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB09
4C087AA01
4C087AA02
4C087CA12
4C087CA20
4C087NA14
4C087ZB09
(57)【要約】
本発明は、増加した免疫原性を有する、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクター、前記改変パラポックスウイルスを含む生物学的細胞、前記改変パラポックスウイルスベクターおよび／または前記細胞を含む、医薬組成物、好ましくはワクチン、ならびに前記改変パラポックスウイルスの新規使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
「アンキリンリピート１」（ＡＮＫ－１）をコードするウイルスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に少なくとも１つの機能的変異を含む改変パラポックスウイルスであって、前記ウイルスは、前記機能的変異を有さない同一のベクターと比較して増加した免疫原性を含む、改変パラポックスウイルス。
【請求項2】
前記機能的変異は、非変異ＡＮＫ－１よりもＡＮＫ－１の活性の低下をもたらす、請求項１に記載の改変パラポックスウイルス。
【請求項3】
パラポックスウイルスベクターである、請求項１または２に記載の改変パラポックスウイルス。
【請求項4】
前記パラポックスウイルスはＰａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓ（Ｏｒｆウイルス、ＯＲＦＶ）であるか、または前記パラポックスウイルスベクターはＯＲＦＶベクターである、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
【請求項5】
前記ＯＲＦＶは、Ｄ１７０１株、好ましくはＤ１７０１－Ｖ株のものである、請求項４に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
【請求項6】
前記ＡＮＫ－１は、ウイルスオープンリーディングフレーム１２６（ＯＲＦ１２６）によってコードされ、好ましくは、前記ＯＲＦは、ヌクレオチド位置ｎｔ２２．０５５±１００～ｎｔ２３．５４６±１００に位置している、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
【請求項7】
以下をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター：（１）導入遺伝子をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、および
（２）前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーター。
【請求項8】
前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、前記ＡＮＫ－１をコードするウイルスＯＲＦに挿入されており、または／および、前記ＡＮＫ－１をコードするウイルスＯＲＦは、前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列によって置き換えられている、請求項６に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルス。
【請求項9】
導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を２つ以上含み、好ましくは導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の数は、２、３、４、またはそれ以上からなる群から選択される、請求項６～８のいずれか一項に記載のパラポックスウイルスベクター。
【請求項10】
前記プロモーターは、初期ＯＲＦＶプロモーターである、請求項６～９のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
【請求項11】
前記初期ＯＲＦＶプロモーターは、配列番号１（ｅＰ１）、配列番号２（ｅＰ２）、配列番号３（「最適化された初期」）、配列番号４（７．５ｋＤａプロモーター）、および配列番号５（ＶＥＧＦ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター。
【請求項12】
前記導入遺伝子は、以下の抗原の群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクター：－ウイルス抗原、好ましくは、
スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原；
糖タンパク質（ＲａｂＧ）を含む、狂犬病ウイルス抗原；
核タンパク質（ＮＰ）、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、Ａ型インフルエンザ抗原；
－腫瘍抗原、好ましくはＨＰＶ選択的ウイルス腫瘍抗原を含む、ウイルス腫瘍抗原；
－ＨＰＶ選択的ウイルス腫瘍関連抗原を含む、ウイルス腫瘍関連抗原を含む、腫瘍関連抗原；
－寄生虫抗原、好ましくはマラリア原虫抗原；
－サイトカイン；
－哺乳動物、好ましくは哺乳動物レシピエントに由来する（originated）か、または由来する（derived）、タンパク質。
【請求項13】
先行する請求項のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターを含む、生物学的細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはＶｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または抗原提示細胞。
【請求項14】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変パラポックスウイルスもしくはパラポックスウイルスベクター、または／および、請求項１３に記載の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物、好ましくはワクチン。
【請求項15】
生物、好ましくは哺乳動物またはヒトにおける免疫応答の誘導のための、ＡＮＫ－１をコードするウイルスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に少なくとも１つの機能的変異を含む改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本発明は、増加した免疫原性を有する、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクター、前記改変パラポックスウイルスを含む生物学的細胞、前記改変パラポックスウイルスベクターおよび／または前記細胞を含む、医薬組成物、好ましくはワクチン、ならびに前記改変パラポックスウイルスの新規使用に関する。
【0002】
改変ウイルス、例えばウイルスベクターは、バイオサイエンス、医学およびプロセス工学において複数の用途を有する。例えば、ウイルスベクターベースのワクチンは、任意の種類の抗原ペプチドに対する細胞性および体液性の免疫応答を引き起こすことが期待されている。ポックスウイルス科のパラポックスウイルス属において、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓ（Ｏｒｆウイルス；ＯＲＦＶ）Ｄ１７０１－Ｖ株は、ベクタープラットフォーム技術の開発に特に好ましい様々な特性を含み、様々なワクチン接種アプローチを促進することが示された。
【0003】
しかしながら、改変ウイルスまたはウイルスベクターの技術分野において見出すことができる１つの問題は、低い免疫原性である。低い免疫原性は、ウイルスベクターベースのワクチンの有効性を低下させる。この問題に対処するための現在の戦略は、ワクチンの免疫応答を改善する薬理学的または免疫学的薬剤と併せて、免疫調節エレメントの実施またはウイルスベクターの製剤化を使用する。しかしながら、これらのアプローチは、完全には成功していない。いくつかのウイルスベクターは、パッケージング能力が限られており、免疫調節エレメントの発現は、ウイルスを操作不能にすることが非常に多い。さらに、アジュバントは、ワクチン接種された生物に対してしばしば毒性であり、そのため、ウイルスベクターベースのワクチン接種は、副作用を伴うことが多い。
【0004】
この背景に対して、当技術分野で知られている問題が低減されるか、または回避さえされる、ウイルスベクターベースのワクチンおよび他の適用の有効な製造のために使用することができる、新規の改変ウイルス、特にウイルスベクターを提供することが当技術分野で必要とされている。
【0005】
したがって、本発明の根底にある目的は、免疫調節エレメントの包含またはアジュバントを有するベクターの製剤化を必要としない、増加した免疫原性を特徴とする、そのような改変ウイルスまたはウイルスベクターをそれぞれ提供することである。
【0006】
本発明は、「アンキリンリピート１」（ＡＮＫ－１）をコードするウイルスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に少なくとも１つの機能的変異を含む、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクターであって、前記ベクターは、前記機能的変異を有さない同一のベクターと比較して増加した免疫原性を含む、改変パラポックスウイルス、好ましくはパラポックスウイルスベクターを提供することによって、これらおよび他のニーズを満たす。
【0007】
本発明によれば、「パラポックスウイルス」は、ポックスウイルス科およびコルドポックスウイルス亜科のウイルスの属である。ポックスウイルス科の全てのメンバーと同様に、それらは、楕円形の比較的大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである。パラポックスウイルスは、それらを他のポックスウイルスと区別する特有の螺旋コートを有する。パラポックスウイルスは、哺乳動物の広い選択を含む脊椎動物、およびヒトに感染する。本発明によれば、全ての種類のパラポックスウイルスが適しているが、Ｏｒｆウイルスが好ましい。
【0008】
本発明によれば、「改変」パラポックスウイルスは、野生型のカウンターパートに対して技術的に改変されたパラポックスウイルス由来ウイルスを指す。
【0009】
本発明によれば、「パラポックスウイルスベクター」は、パラポックスウイルスゲノムベースであるか、またはパラポックスウイルスゲノムからなり、生物学的細胞、好ましくは哺乳動物細胞およびヒト細胞のトランスフェクションのために形成され、さらに好ましくは生物学的細胞における（への）導入遺伝子または外来遺伝子の輸送および／または発現のためにも形成された、ベクターまたはプラスミドを指す。
【0010】
本発明によると、「アンキリンリピート１」（ＡＮＫ－１）は、ループによって分けられた２つのアルファヘリックスからなるタンパク質モーチブ（motives）の群に属し、最初、酵母Ｃｄｃ１０およびショウジョウバエノッチにおけるシグナル伝達タンパク質において発見された。しかしながら、アンキリンリピート（ＡＮＫ）は、生物界を通して至るところに存在し、しかしながら、ポックスウイルス科、特にコロドポックスウイルスを除くほとんどのウイルスにおいて不在である。モチーフは、タンパク質－タンパク質相互作用を促進するために重要であり且つＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ（ＯＲＦ１２３、－１２６（ＡＮＫ－１）、－１２８（ＡＮＫ－２）および－１２９（ＡＮＫ－３））によってコードされる４つのタンパク質において見出される、タンデムリピートコンセンサスドメインからなる。多量の細胞内ＡＮＫタンパク質が、細胞－細胞シグナル伝達、細胞骨格の全体性（integrity）、転写の制御および細胞周期、炎症性応答、またはタンパク質輸送に関与していると記載されており、ただ少し、ポックスウイルスのＡＮＫタンパク質の機能について知られている。これら４つのタンパク質は、特定の基質を基質結合ドメインを介してＳＣＦ１ユビキチンリガーゼに動員し得、したがって、細胞のユビキチン－プロテアソーム機構を活用し得るＦ－ボックス様モチーフを有している、ということが実証されている。これらのタンパク質のうちの１つ、ＯＲＦ１２６がコードするＡＮＫ－１タンパク質は、必須のアンキリンリピート８および９を介して、ミトコンドリアと共局在することが示された。それにもかかわらず、生理学的な結果は未だ実証されていない。さらに、最近の研究は、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）経路に対する、ＯＲＦＶがコードするＡＮＫタンパク質の影響を報告した。この経路は、低酸素症に対する細胞応答の制御において重要な役割を担っているが、下流の対象様脈管形成－および抗－アポトーシスプログラムは、ウイルスの病因に有利に働く。ＨＩＦ阻害因子（ＦＩＨ）が、増強されたＨＩＦの活性化をもたらすＯＲＦＶ感染に対するＡＮＫタンパク質によって、隔離されたということが示されている。
【0011】
本発明によれば、「機能的変異」は、非変異野生型と比較して、活性および／または機能の変化をもたらす、遺伝子およびコードされたタンパク質の遺伝子変化を指す。機能的変異には、ノックアウト、ポイント、欠失、フレームシフト、および置換変異などが含まれるが、これらに限定されず、これらは全て、ＡＮＫ－１機能の変化をもたらし、それぞれ、機能不全のＡＮＫ－１が結果となるか、またはＡＮＫ－１の発現が抑制、低減、または回避され得る。
【0012】
本発明によれば、「免疫原性」は、パラポックスウイルスベクターがヒトの動物の体内で免疫応答を引き起こす能力、すなわち、体液性および／または細胞媒介性の免疫応答を誘導する能力である。免疫原性は、当業者に周知の様々な方法によって測定することができる。そのような方法の概要は、Madhwa et al. (2015), Immunogenicity assessment of biotherapeutic products: An over-view of assays and their utility, Biologicals Vol. 43, Is. 5, pp. 298-306に見られる。
【0013】
本発明者らは、機能的に変異した、好ましくは不活性化したＡＮＫ－１を有するパラポックスウイルスベクターが、非変異カウンターパートベクターまたは野生型ウイルスのそれぞれと比較して、特定の固体および上昇した免疫原性を特徴とすることを認識することができた。増加した免疫原性は、末梢血単核細胞を活性化するか、またはインビトロで抗原特異的免疫応答を誘導するベクターの能力によって実証された。同時に、本発明者らは、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターが依然として優れた増殖挙動を示し、誘導遺伝子または外来遺伝子を発現する能力を有することを見出した。本発明者らによって行われた分析は、ベクターベースのワクチンの設計のための高い可能性を実証する。
【0014】
同定された増加した免疫原性により、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターは、腫瘍溶解性ウイルスまたはベクター、免疫刺激剤、遺伝子治療のためのツール、または不活性化ウイルスなどの他のアプリケーションにも、それぞれ十分に適格である。
【0015】
本発明者らの知見は驚くべきものであり、当業者によって予想することができなかった。ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦは、機能性および複製可能性またはパラポックスウイルスゲノムにとって、結果として、パラポックスウイルスベースのベクターにとって必須であるか、または少なくとも好ましいと想定することができた。言い換えれば、パラポックスウイルスベクターにおいて、ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦ無しですますことができないことを想定することができた。さらに、ウイルスＯＲＦにおける機能的変異は、典型的には免疫原性の欠失をもたらし、それは、パラポックスウイルスにおいてＡＮＫ－１をコードするＯＲＦを変異させる場合、同一の効果を予想することができた。したがって、当該技術分野は、本発明が指し示す方向とは反対の方向を指す。
【0016】
本発明の根底にある問題は、これによって完全に達成される。
【0017】
本発明の一実施形態では、機能的変異は、非変異ＡＮＫ－１よりもＡＮＫ－１の活性の低下をもたらす。
【0018】
本実施形態は、それぞれ、ＡＮＫ－１の機能の欠失（機能の欠失の変異）をもたらすか、または野生型カウンターパートと比較して、ＡＮＫ－１の発現または活性の有意な低下をもたらす、ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦにおける任意の種類の遺伝子変化を含む。したがって、本実施形態は、完全な不活性化である必要がないＡＮＫ－１機能の下方制御を包含する。しかしながら、ＡＮＫ－１の完全な不活性化またはゼロまでの活性の減少が、本発明の一実施形態において好ましい。変異には、ノックアウト、ポイント、欠失、フレームシフト、および置換変異などが含まれるが、これらに限定されず、これらは全て、ＡＮＫ－１機能の不活性化をもたらし、それぞれ、機能不全のＡＮＫ－１が結果となるか、またはＡＮＫ－１の発現が抑制、低減、または回避され得る。
【0019】
本発明の一実施形態では、改変パラポックスウイルスは、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓ（Ｏｒｆウイルス、ＯＲＦＶ）であるか、またはパラポックスウイルスベクターはＰａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓ（Ｏｒｆウイルス、ＯＲＦＶ）ベクターである。
【0020】
Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓまたはＯｒｆウイルス（ＯＲＦＶ）は、パラポックスウイルスの属のプロトタイプであり、ポックスウイルス科に属する。ＯＲＦＶは、エンベロープを有し、かつ、羊毛の球を思い出させる形態であって、約２６０×１６０ｎｍの平均サイズを有する形態を有している複合体ｄｓＤＮＡウイルスである。それらは高いＧＣ含量および約１３０～１５０ｋｂｐのサイズを有する直鎖状ＤＮＡゲノムを含み、その中央領域はＩＴＲ領域（「逆方向末端反復」）によって両側が区切られ、両ＤＮＡ一本鎖を互いに共有結合的に連結するヘアピン構造で終わる。ゲノムの中央領域には、主にウイルスの複製および形態形成に必須であり、かつポックスウイルスの間で高度に保存されている遺伝子が、主に存在する。対照的に、ＩＴＲ領域には、宿主範囲、病原性および免疫調節を大きく決定し、したがってウイルスを特徴付ける、いわゆる非保存毒性遺伝子が存在する。
【0021】
ＯＲＦＶは、組換えワクチンの産生にとって興味深いものとなり、他の技術よりもそれを好む様々な特徴を有する。オルソポックスウイルスに比べて、ＯＲＦＶは、ヒツジおよびヤギを含む非常に狭い天然の宿主指向性を特徴とする。結果として、ワクシニアおよびアデノウイルスの最も一般的なウイルスベクターにおいて観察され得るような、自然感染によって引き起こされる、ヒトにおけるベクターに対する「前免疫」の阻害は、ほとんど除外され得る。さらに、例外的に弱く短寿命のＯＲＦＶ特異的ベクター免疫は、さらなる病原体を標的としたＯＲＦＶベースのワクチンによる非常に効果的なブースターおよび／またはリフレッシュワクチン接種または免疫化を可能にする。
【0022】
本発明の別の実施形態では、前記ＯＲＦＶは、Ｄ１７０１株、好ましくはＤ１７０１－Ｖ株のものである。
【0023】
この手法は、弱毒化され、宿主において漸近感染のみを引き起こすそのようなウイルスまたはベクターが使用されるという利点を有する。本発明によれば、Ｄ１７０１－ＢおよびＤ１７０１－Ｖを含む、Ｄ１７０１の全ての変異体がカバーされるが、後者が好ましい。Ｄ１７０１－Ｖ株の特徴は、Rziha et al. (2019；l.c.)に開示されている。
【0024】
別の実施形態では、前記ＡＮＫ－１は、ウイルスオープンリーディングフレーム１２６（ＯＲＦ１２６）によってコードされ、好ましくは、前記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ヌクレオチド位置ｎｔ２２．０５５±１００～ｎｔ２３．５４６±１００に位置している。
【0025】
この手法で、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１においてＡＮＫ－１をコードする不活性化の標的として特定のオープンリーディングフレームが提供される。したがって、当業者は、変異の場所の詳細な情報を受け取る。この文脈において、示されたヌクレオチド位置は、図２ｂに示されるように、Rziha, H.-J.の公開されていないデータによって決定されるように、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖゲノムの右側部分によってコードされるＤＮＡ配列を含む、３１．８０５ｎｔを指す。
【0026】
さらなる実施形態では、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターは、以下をさらに含む：
（１）導入遺伝子をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、および
（２）導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーター。
（１）導入遺伝子をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、および
（２）導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーター。
【0027】
本発明によれば、「導入遺伝子」、または同義的に外来遺伝子は、パラポックスウイルスゲノムに由来しない遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
【0028】
本発明によれば、「プロモーター」は、本発明のパラポックスウイルスベクターにおける導入遺伝子の調節された発現を可能にするそのような核酸部分を指す。好ましくは、それはＯＲＦＶプロモーター、すなわち、野生型ＯＲＦＶゲノムに存在するプロモーターもしくはそれに由来するプロモーター、または、ポックスウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどの人工プロモーターを指す。
【0029】
この手法は、本発明に係るウイルスまたはベクターが、抗原などの任意の外来タンパク質の産生のための遺伝的ツールとして使用されるという利点を有する。ベクターの優れた免疫原性特性と共に、そのような実施形態は、ワクチン組成物の活性物質または構成要素としての本発明に係るウイルスまたはベクターの適性を改善する。
【0030】
本発明のなおさらなる実施形態では、前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、前記ＡＮＫ－１をコードするウイルスＯＲＦに挿入されており、および／または、代替的に、前記ＡＮＫ－１をコードするウイルスＯＲＦは、前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列によって置き換えられている。
【0031】
本発明によれば、「前記ＡＮＫ－１をコードするウイルスＯＲＦに挿入されている」は、ＡＮＫ－１をコードする配列またはオープンリーディングフレームが、それぞれ、任意の位置で欠失または開かれ、そのプロモーターと共に導入遺伝子をコードする配列が挿入されていることを意味する。ＡＮＫ－１コード配列の部分は、前記手順によって除去されてもよいし、除去されなくてもよい。本発明によれば、「前記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列によって置き換えられている」は、ＡＮＫ－１をコードするウイルスＯＲＦ全体がウイルスまたはベクターから除去され、配列ギャップがそのプロモーターと共に導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を受け取ることを意味する。本実施形態は、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の挿入がＡＮＫ－１の機能的変異または不活性化を提供するという利点を有する。
【0032】
別の実施形態では、本発明に係る前記改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を２つ以上含み、好ましくは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列の数は、２、３、４、またはそれ以上からなる群から選択される。
【0033】
本実施形態では、それぞれの導入遺伝子または導入遺伝子をコードする配列はすべて、ＡＮＫ－１をコードするウイルスＯＲＦ中に位置することができる。しかしながら、代替的に、様々な導入遺伝子をコードする配列は、ウイルスまたはベクターゲノムまたはコンストラクト中の同一のまたは異なる位置の他の場所にそれぞれ位置することもできる。挿入遺伝子座毎において、複数の外来遺伝子、好ましくは、２、３、４、またはそれ以上の外来遺伝子を発現させることができる。例えば、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１またはＤ１７０１－Ｖにおいて、導入遺伝子をコードする配列は、好ましくは、ウイルスＯＲＦｓ１１２、１１９、１２６などのいずれかに位置することができる。
【0034】
この手法は、本発明に係る単一の改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターによって、複数の外来または導入遺伝子を発現させることができるという利点を有する。本実施形態は、同時に多数の抗原性構造体に対して向けられた、多価ワクチンの製造に特に適している。
【0035】
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの別の実施形態では、プロモーターは、初期ＯＲＦプロモーターであり、好ましくは、配列番号１（ｅＰ１）、配列番号２（ｅＰ２）、配列番号３（最適化された「初期」）、配列番号４（７．５ｋＤａのプロモーター）、および配列番号５（ＶＥＧＦ）から選択される、ヌクレオチド配列を含む。
【0036】
この手法は、導入遺伝子の高発現レベルおよび発現の標的制御を可能にするそのようなプロモーターが使用されるという利点を有する。プロモーターｅＰ１およびｅＰ２は、本発明者らによって開発され、Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.)に公開されている。残りのプロモーターは、ワクシニアウイルスに由来し、他の繋がりにおいて、Davidson and Moss (1989), Structure of Vacciniavirus late promoters, J. Mol. Biol., Vol. 210, pp- 771-784、およびYang et al. (2011), Genome-wide analysis of the 5′ and 3′ ends of Vaccinia Virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated and anomalous transcripts, J. Virology, Vol. 85, No. 12, pp. 5897-5909、Broyles (2003), Vaccinia virus transcription, J. Gene. Virol., Vol. 84, No. 9, pp. 2293-2303に記載されている。本発明者らの知見によれば、Ｐ２は、ｅＰ１と比較して発現強度の有意な増加を引き起こす。これは、プロモーターｅＰ１がワクシニアウイルスからのコンセンサス配列に１００％対応するが、ｅＰ２は対応しないため、驚くべきことであった。ＯＲＦＶ（パラポックス）における「最適である」ワクシニアウイルスプロモーター（オルソポックス）の低発現は矛盾しており、驚くべきことである。ｅＰ２プロモーターが強い発現をもたらすことも驚くべきことである。
【0037】
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの別の実施形態では、導入遺伝子は以下の抗原の群から選択される：
－ウイルス抗原、好ましくは、
スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原；
糖タンパク質（ＲａｂＧ）を含む、狂犬病ウイルス抗原；
核タンパク質（ＮＰ）、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、Ａ型インフルエンザ抗原；
－腫瘍抗原、好ましくはＨＰＶ選択的ウイルス腫瘍抗原を含む、ウイルス腫瘍抗原；
－ＨＰＶ選択的ウイルス腫瘍関連抗原を含む、ウイルス腫瘍関連抗原を含む、腫瘍関連抗原；
－寄生虫抗原、好ましくはマラリア原虫抗原；
－サイトカイン；
－哺乳動物、好ましくは哺乳動物レシピエントに由来する（originated）か、または由来する（derived）、タンパク質。
－ウイルス抗原、好ましくは、
スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原；
糖タンパク質（ＲａｂＧ）を含む、狂犬病ウイルス抗原；
核タンパク質（ＮＰ）、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、Ａ型インフルエンザ抗原；
－腫瘍抗原、好ましくはＨＰＶ選択的ウイルス腫瘍抗原を含む、ウイルス腫瘍抗原；
－ＨＰＶ選択的ウイルス腫瘍関連抗原を含む、ウイルス腫瘍関連抗原を含む、腫瘍関連抗原；
－寄生虫抗原、好ましくはマラリア原虫抗原；
－サイトカイン；
－哺乳動物、好ましくは哺乳動物レシピエントに由来する（originated）か、または由来する（derived）、タンパク質。
【0038】
この手法は、特にワクチンの製造のための特に重要な抗原が、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターを介して発現可能であるという利点を有する。
【0039】
本発明の別の主題は、本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターを含む、生物学的細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはＶｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または抗原提示細胞に関する。
【0040】
Ｖｅｒｏ細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、現在、本発明に係る改変ウイルスまたはベクターの産生のために使用されている。しかしながら、宿主では、ウイルスは抗原提示細胞として取り込まれる。
【0041】
本発明の別の主題は、本発明の改変パラポックスウイルスもしくはパラポックスウイルスベクター、および／または、本発明の細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む、組成物、好ましくは医薬組成物に関する。医薬組成物は、好ましくはワクチン、さらに好ましくは多価ワクチン、免疫刺激剤、遺伝子治療のためのツールなどであり得る。
【0042】
薬学的に許容可能な担体は、当技術分野において周知である。薬学的に許容可能な担体には、安定剤、結合剤、希釈剤、塩、アジュバント、緩衝剤、脂質などが含まれるが、これらに限定されない。概要は、Rowe (2020), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 9thedition, Pharmaceutical Pressに見出すことができる。
【0043】
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの特性、利点、特徴、およびさらなる発展は、本発明の細胞および本発明の組成物に、対応する方法で適用される。
【0044】
本発明の別の主題は、生物、好ましくは哺乳動物またはヒトにおける免疫応答の誘導のための、ＡＮＫ－１をコードするウイルスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における少なくとも１つの不活性化変異を含む改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの、使用に関する。
【0045】
本発明に係る改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの特性、利点、特徴、およびさらなる発展は、対応する方法で本発明の使用に適用される。
【0046】
前述の特徴および以下に説明される特徴は、それぞれの場合に示される組み合わせにおいてのみ使用されるのではなく、本発明の範囲から逸脱しない、他の組み合わせにおいて、または単離された位置においても使用されることができることが理解されるべきである。
【0047】
〔実施形態〕
ここで、本発明を、本発明の追加の特徴、特性、および利点をもたらす実施形態の方法によってさらに説明する。実施形態は純粋な例示的性質のものであり、本発明の範囲（scope）または範囲（range）を限定するものではない。特定の実施形態において言及された特徴は、本発明の特徴であり、特定の実施形態において適用可能ではないが、本発明の任意の実施形態の文脈において単離された方法でもある一般的な特徴として見られてもよい。添付の図面を参照すると、以下が示される。
ここで、本発明を、本発明の追加の特徴、特性、および利点をもたらす実施形態の方法によってさらに説明する。実施形態は純粋な例示的性質のものであり、本発明の範囲（scope）または範囲（range）を限定するものではない。特定の実施形態において言及された特徴は、本発明の特徴であり、特定の実施形態において適用可能ではないが、本発明の任意の実施形態の文脈において単離された方法でもある一般的な特徴として見られてもよい。添付の図面を参照すると、以下が示される。
【0048】
図１：ｐＤｅｌ１２６－２－ＡｃＧＦＰのプラスミドチャート。
【0049】
図２：Ｄ１７０１－ＶゲノムにおけるＯＲＦ１２６欠失の図画による説明。Ａ）Rziha et al. (2019; l.c.)によって最近公開されたＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ株のゲノムマップを示す。Ｂ）ゲノムの右側部分によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＤＮＡ配列を含む３１．８０５ｎｔを、Rziha, H.-J.の公開されていないデータによって決定した。Ｃ）各遺伝子欠失によって影響を受けるゲノム部位の拡大。対応する配列を配列番号６に示す。
【0050】
図３：ＧＦＰは、Ｄｅｌ１２６に安定的に組み込まれている。Ｖｅｒｏ細胞におけるＶＣｈ１２６ＧＦＰの継代１回、５回、１０回、１５回、および２０回後の１２６ＰＣＲは、遺伝子１２６の定常的な欠失を示し（Ａ）、一方、ｄ１２６ＰＣＲは、Ｄｅｌ１２６遺伝子座に挿入されたＧＦＰに特異的な１３６０ｂｐの断片をもたらす（Ｂ）。１％アガロースゲル；ｎｉ＝非感染Ｖｅｒｏ細胞からのＤＮＡ；Ｍ＝使用準備済み １ｋｂ Ｌａｄｄｅｒ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。
【0051】
図４：ｐＤｅｌ１２６のプラスミドチャート。
【0052】
図５：新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰは、Ｖｅｒｏ細胞においてＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの発現を誘導する。新たなＤｅｌ部位組換え体および参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰによる感染の５日後に、単一プラークの蛍光顕微鏡検査を行った。明視野顕微鏡、単一ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙチャネルから得られた画像、ならびにマージされた画像が示され、スケールバーは５００μｍを表す。
【0053】
図６：Ｄｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰにおける導入遺伝子ｇｆｐおよびｍｃｈｅｒｒｙの遺伝的安定性。１０回の連続継代（Ｐ１～Ｐ１０）の間、感染したＶｅｒｏ細胞によるフルオロフォアの発現を、感染後７２時間後の単一プラーク計数によって決定した。単一のＧＦＰの発現プラークの頻度（Ａ）および単一のｍＣｈｅｒｒｙの発現プラークの頻度（Ｂ）、ならびに単一の蛍光を示すプラークの全頻度（Ｃ）を、９６ウェル限界希釈から得られたＤｅｌ部位組換え体当たり３つのウイルスクローンについて示す。単一の蛍光プラークの平均の全頻度を計算し、（Ｄ）にプロットした。
【0054】
図７：Ｄｅｌ部位組換え体の単一段階増殖曲線。感染細胞（ＭＯＩ１）を洗浄し、吸着の２時間後（０ｈｐｉ）、および、示された感染後の時間（hours post infection；ｈｐｉ）に回収し、一方、全細胞ライセートをＶｅｒｏ細胞上に滴定してウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ）を決定した。組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰのウイルス増殖曲線は、１２０時間後にコントロールのＶＣｈＤ１２ＧＦＰと同等のウイルス力価に達する。
【0055】
図８：Ｖｅｒｏ細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。Ｖｅｒｏ細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２４ｈｐｉおよび４８ｈｐｉに回収した。ＧＦＰの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析によって決定し、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰのそれに対して正規化した。３つの独立した実験の２回の繰り返しを示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応なしｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【0056】
図９：単球性ＴＨＰ－１細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。ＴＨＰ－１細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２４ｈｐｉおよび４８ｈｐｉに回収した。ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａ）およびＧＦＰ（Ｂ）の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析によって決定し、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰのそれに対して正規化した。それぞれの独立した試験の平均値を計算し、９５％の信頼区間を持つ対応なしｔ検定を用いて統計解析を行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
図１０：ｍｏＤＣｓにおけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。ｍｏＤＣｓを新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２４ｈｐｉおよび４８ｈｐｉに回収した。ＧＦＰの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析によって決定し、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰのそれに対して正規化した。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応なしｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
図１１：ヒトｍｏＤＣｓの感染率および生存率。１０人の異なるドナーのｍｏＤＣｓを、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照組み替え体ＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させた。５つの独立に実施された実験および平均のそれぞれについて、ｍＣｈｅｒｒｙ発現（Ａ）およびＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色（Ｂ）によってそれぞれ決定した、感染細胞および生存細胞の割合を示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応ありｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
図１２：新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰによる、ヒトｍｏＤＣｓの活性化。５人の異なるドナーのｍｏＤＣｓを、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照組み替え体ＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させた。感染細胞の割合をｍＣｈｅｒｒｙ発現によって決定し、非感染細胞に対して正規化することにより、フローサイトメトリーを経て、ＣＤ４０（ａ）、ＣＤ８０（ｂ）、ＣＤ８３（ｃ）、ＣＤ８６（ｄ）およびＨＬＡ－ＤＲ（ｅ）によるｍｏＣＤｓの相対的な活性化の分析が可能となった。５つの独立に実施された実験および平均のそれぞれについて、発現強度の変化を示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応ありｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
図１３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦＶ組換え体によって刺激された体液性および細胞性免疫応答。Ｎ－またはＳ１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を発現する１０７ＰＦＵのコントロールのＯＲＦＶ組換え体、またはＯＲＦ１２６欠失を含むＯＲＦＶベクターにより、２週間の間隔で２回、ＣＤ１マウスを免疫した。Ａ）－Ｂ）ＯＲＦＶベクターによって誘導されたＮ－およびＳ１－特異的結合総ＩｇＧを、２回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｃ）脾臓細胞においてＯＲＦＶベクターによって引き起こされたＳ１－特異的細胞性応答を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ測定によって測定した。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較試験による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、コントロールのＯＲＦＶ群と比較した結合抗体エンドポイント力価間の差、またはＩＦＮ－γスポット形成ユニット（ＰＦＵ）間の差、を評価した。
図１０：ｍｏＤＣｓにおけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。ｍｏＤＣｓを新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２４ｈｐｉおよび４８ｈｐｉに回収した。ＧＦＰの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析によって決定し、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰのそれに対して正規化した。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応なしｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
図１１：ヒトｍｏＤＣｓの感染率および生存率。１０人の異なるドナーのｍｏＤＣｓを、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照組み替え体ＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させた。５つの独立に実施された実験および平均のそれぞれについて、ｍＣｈｅｒｒｙ発現（Ａ）およびＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色（Ｂ）によってそれぞれ決定した、感染細胞および生存細胞の割合を示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応ありｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
図１２：新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰによる、ヒトｍｏＤＣｓの活性化。５人の異なるドナーのｍｏＤＣｓを、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照組み替え体ＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させた。感染細胞の割合をｍＣｈｅｒｒｙ発現によって決定し、非感染細胞に対して正規化することにより、フローサイトメトリーを経て、ＣＤ４０（ａ）、ＣＤ８０（ｂ）、ＣＤ８３（ｃ）、ＣＤ８６（ｄ）およびＨＬＡ－ＤＲ（ｅ）によるｍｏＣＤｓの相対的な活性化の分析が可能となった。５つの独立に実施された実験および平均のそれぞれについて、発現強度の変化を示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応ありｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
図１３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦＶ組換え体によって刺激された体液性および細胞性免疫応答。Ｎ－またはＳ１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を発現する１０７ＰＦＵのコントロールのＯＲＦＶ組換え体、またはＯＲＦ１２６欠失を含むＯＲＦＶベクターにより、２週間の間隔で２回、ＣＤ１マウスを免疫した。Ａ）－Ｂ）ＯＲＦＶベクターによって誘導されたＮ－およびＳ１－特異的結合総ＩｇＧを、２回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｃ）脾臓細胞においてＯＲＦＶベクターによって引き起こされたＳ１－特異的細胞性応答を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ測定によって測定した。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較試験による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、コントロールのＯＲＦＶ群と比較した結合抗体エンドポイント力価間の差、またはＩＦＮ－γスポット形成ユニット（ＰＦＵ）間の差、を評価した。
【0057】
〔１．緒言〕
本発明は、生物における増加した免疫応答の誘導のためのツール、およびさらなる開発において誘導遺伝子または外来遺伝子の発現のためのツール、としての改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの使用に関する。単一のパラポックスウイルスベクターへの複数の導入遺伝子の挿入を可能にするために、本発明はまた、導入遺伝子発現のための挿入部位としての、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓ（Ｏｒｆウイルス、ＯＲＦＶ）Ｄ１７０１株およびＤ１７０１－Ｖ株におけるＯＲＦ１２６などの「アンキリンリピート１」（ＡＮＫ－１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の適合性に関する。新規な欠失変異体を、挿入されたＡｃＧＦＰ（ＧＦＰ）レポーターコンストラクトの遺伝的安定性、それらの増殖挙動、およびインビトロで異なる標的細胞において導入遺伝子発現を誘導する能力の詳細な特徴付けに供した。さらに、変異体の免疫原性を、末梢血単核細胞および抗原提示細胞を活性化する、またはインビトロおよびインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するその能力によって分析した。まとめると、実施された分析は、ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦのノックアウトをパラポックスウイルスゲノムに組み込むことによって、多価単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。したがって、レポーター遺伝子ＧＦＰとのオープンリーディングフレームの交換は、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に顕著な免疫原性特性をももたらした。
本発明は、生物における増加した免疫応答の誘導のためのツール、およびさらなる開発において誘導遺伝子または外来遺伝子の発現のためのツール、としての改変パラポックスウイルスまたはパラポックスウイルスベクターの使用に関する。単一のパラポックスウイルスベクターへの複数の導入遺伝子の挿入を可能にするために、本発明はまた、導入遺伝子発現のための挿入部位としての、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓ（Ｏｒｆウイルス、ＯＲＦＶ）Ｄ１７０１株およびＤ１７０１－Ｖ株におけるＯＲＦ１２６などの「アンキリンリピート１」（ＡＮＫ－１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の適合性に関する。新規な欠失変異体を、挿入されたＡｃＧＦＰ（ＧＦＰ）レポーターコンストラクトの遺伝的安定性、それらの増殖挙動、およびインビトロで異なる標的細胞において導入遺伝子発現を誘導する能力の詳細な特徴付けに供した。さらに、変異体の免疫原性を、末梢血単核細胞および抗原提示細胞を活性化する、またはインビトロおよびインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するその能力によって分析した。まとめると、実施された分析は、ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦのノックアウトをパラポックスウイルスゲノムに組み込むことによって、多価単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。したがって、レポーター遺伝子ＧＦＰとのオープンリーディングフレームの交換は、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に顕著な免疫原性特性をももたらした。
【0058】
〔２．導入〕
ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ株は、Ｄ１７０１－Ｂ株を適用したウシ腎臓細胞株ＢＫ－ＫＬ３Ａから得られ、アフリカ緑色サル細胞株Ｖｅｒｏでの成長のための適応後に、いくつかのゲノム再編成が示された；Cottone, R., et al. (1998), Analysis of genomic rearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf virus strain D1701, Virus Research 56(1), p. 53-67；Rziha, H.J., et al. (2000), Generation of recombinant parapoxviruses: non-essential genes suitable for insertion and expression of foreign genes, Journal of Biotechnology 83(1), p. 137-145。これらのゲノム再構成は、株の複製に必須ではなく、欠失領域Ｄ（Ｄ遺伝子座）などの導入遺伝子発現に適していることが示された遺伝子の欠失を含む；Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.)。さらに、血管新生因子ＶＥＧＦ－Ｅは、ヒツジにおける血性病変の誘導に関与する主要な病原性決定因子であると予測されRziha, H.J., et al. (2000; l.c.)、したがって、異なる宿主においていくつかのウイルス性疾患に対する高い予防効果を有する長期持続性免疫を誘発するＯＲＦＶ組換え体を作製するために、挿入部位として使用された。これらの成功裏に使用された挿入部位に加えて、導入遺伝子発現に潜在的に適した他の遺伝子が、Ｄ１７０１－Ｖゲノムの末端において同定されていた。ポックスウイルスの中心領域は一般に、位置、間隔、および配向において保存された必須遺伝子をコードするので、これらの領域は、病原性、病因、または宿主範囲に影響を及ぼす因子をコードし、インビトロ増殖には不可欠であると考えられる。これらの因子は、宿主によって誘発される細胞性および体液性の免疫応答の最適な誘導を妨害すると予測されるが、これらの免疫調節遺伝子の欠失は、Ｄ１７０１－Ｖベクターの免疫原性をさらに増強し得る。したがって、本研究は、「ＮＦ－κＢインヒビター」をコードする遺伝子の欠失、および導入遺伝子発現のための挿入部位としてのその使用に焦点を当てる。
ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ株は、Ｄ１７０１－Ｂ株を適用したウシ腎臓細胞株ＢＫ－ＫＬ３Ａから得られ、アフリカ緑色サル細胞株Ｖｅｒｏでの成長のための適応後に、いくつかのゲノム再編成が示された；Cottone, R., et al. (1998), Analysis of genomic rearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf virus strain D1701, Virus Research 56(1), p. 53-67；Rziha, H.J., et al. (2000), Generation of recombinant parapoxviruses: non-essential genes suitable for insertion and expression of foreign genes, Journal of Biotechnology 83(1), p. 137-145。これらのゲノム再構成は、株の複製に必須ではなく、欠失領域Ｄ（Ｄ遺伝子座）などの導入遺伝子発現に適していることが示された遺伝子の欠失を含む；Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.)。さらに、血管新生因子ＶＥＧＦ－Ｅは、ヒツジにおける血性病変の誘導に関与する主要な病原性決定因子であると予測されRziha, H.J., et al. (2000; l.c.)、したがって、異なる宿主においていくつかのウイルス性疾患に対する高い予防効果を有する長期持続性免疫を誘発するＯＲＦＶ組換え体を作製するために、挿入部位として使用された。これらの成功裏に使用された挿入部位に加えて、導入遺伝子発現に潜在的に適した他の遺伝子が、Ｄ１７０１－Ｖゲノムの末端において同定されていた。ポックスウイルスの中心領域は一般に、位置、間隔、および配向において保存された必須遺伝子をコードするので、これらの領域は、病原性、病因、または宿主範囲に影響を及ぼす因子をコードし、インビトロ増殖には不可欠であると考えられる。これらの因子は、宿主によって誘発される細胞性および体液性の免疫応答の最適な誘導を妨害すると予測されるが、これらの免疫調節遺伝子の欠失は、Ｄ１７０１－Ｖベクターの免疫原性をさらに増強し得る。したがって、本研究は、「ＮＦ－κＢインヒビター」をコードする遺伝子の欠失、および導入遺伝子発現のための挿入部位としてのその使用に焦点を当てる。
【0059】
（アンキリンリピート１（ＡＮＫ－１）－ＯＲＦ１２６
「アンキリンリピート１」（ＡＮＫ－１）は、ループによって分けられた２つのアルファヘリックスからなるタンパク質モーチブ（motives）の群に属し、最初、酵母Ｃｄｃ１０およびショウジョウバエノッチにおけるシグナル伝達タンパク質において発見された。しかしながら、アンキリンリピート（ＡＮＫ）は、生物界を通して至るところに存在し、しかしながら、ポックスウイルス科、特にコロドポックスウイルスを除くほとんどのウイルスにおいて存在しない（Herbert, M.H. et al. (2015), Poxviral ankyrin proteins. Viruses 7(2): p. 709-38.を参照されたし）。モチーフは、タンパク質－タンパク質相互作用を促進するために重要であり且つＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ（ＯＲＦ１２３、－１２６（ＡＮＫ－１）、－１２８（ＡＮＫ－２）および－１２９（ＡＮＫ－３））によってコードされる４つのタンパク質において見出される、タンデムリピートコンセンサスドメインからなる（Rziha, H.-J., et al. (2019), Genomic Characterization of Orf Virus Strain D1701-V (Parapoxvirus) and Development of Novel Sites for Multiple Transgene Expression. Viruses 11(2): p. 127；およびRziha, H.J., et al. (2003), Relatedness and heterogeneity at the near-terminal end of the genome of a parapoxvirus bovis 1 strain (B177) compared with parapoxvirus ovis (Orf virus). J. Gen. Virol. 84(Pt 5): p. 1111-6.を参照されたし）。多量の細胞内ＡＮＫタンパク質が、細胞－細胞シグナル伝達、細胞骨格の全体性（integrity）、転写の制御および細胞周期、炎症性応答、またはタンパク質輸送に関与していると記載されており（Mosavi, L.K., et al. (2004), The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition. Protein Sci. 13(6): p. 1435-48）、ただ少し、ポックスウイルスのＡＮＫタンパク質の機能について知られている。これら４つのタンパク質は、特定の基質を基質結合ドメインを介してＳＣＦ１ユビキチンリガーゼに動員し得、したがって、細胞のユビキチン－プロテアソーム機構を活用し得るＦ－ボックス様モチーフを有している、ということが実証されている（Sonnberg, S., et al. (2008), Poxvirus ankyrin repeat proteins are a unique class of F-box proteins that associate with cellular SCF1 ubiquitin ligase complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 105(31): p. 10955-60.を参照されたし）。これらのタンパク質のうちの１つ、ＯＲＦ１２６がコードするＡＮＫ－１タンパク質は、必須のアンキリンリピート８および９を介して、ミトコンドリアと共局在することが示された。それにもかかわらず、生理学的な結果は未だ実証されていない（Lacek, K., et al. (2014), Orf virus (ORFV) ANK-1 protein mitochondrial localization is mediated by ankyrin repeat motifs. Virus Genes 49(1): p. 68-79.を参照されたし）。さらに、最近の研究は、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）経路に対する、ＯＲＦＶがコードするＡＮＫタンパク質の影響を報告した（Chen, D.Y., et al. (2017), Ankyrin Repeat Proteins of Orf Virus Influence the Cellular Hypoxia Response Pathway. J. Virol. 91(1).を参照されたし）。この経路は、低酸素症に対する細胞応答の制御において重要な役割を担っているが、下流の対象様脈管形成－および抗－アポトーシスプログラムは、ウイルスの病因に有利に働く（Cuninghame, S., R. et al. (2014), Hypoxia-inducible factor 1 and its role in viral carcinogenesis. Virology 456-457: p. 370-83.を参照されたし）。それらの研究において、Ｃｈｅｎらは、ＨＩＦ阻害因子（ＦＩＨ）が、増強されたＨＩＦの活性化をもたらすＯＲＦＶ感染に対するＡＮＫタンパク質によって、隔離されたということを示すことができた（Chen et al. (2017; l.c.)を参照されたし）。
「アンキリンリピート１」（ＡＮＫ－１）は、ループによって分けられた２つのアルファヘリックスからなるタンパク質モーチブ（motives）の群に属し、最初、酵母Ｃｄｃ１０およびショウジョウバエノッチにおけるシグナル伝達タンパク質において発見された。しかしながら、アンキリンリピート（ＡＮＫ）は、生物界を通して至るところに存在し、しかしながら、ポックスウイルス科、特にコロドポックスウイルスを除くほとんどのウイルスにおいて存在しない（Herbert, M.H. et al. (2015), Poxviral ankyrin proteins. Viruses 7(2): p. 709-38.を参照されたし）。モチーフは、タンパク質－タンパク質相互作用を促進するために重要であり且つＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ（ＯＲＦ１２３、－１２６（ＡＮＫ－１）、－１２８（ＡＮＫ－２）および－１２９（ＡＮＫ－３））によってコードされる４つのタンパク質において見出される、タンデムリピートコンセンサスドメインからなる（Rziha, H.-J., et al. (2019), Genomic Characterization of Orf Virus Strain D1701-V (Parapoxvirus) and Development of Novel Sites for Multiple Transgene Expression. Viruses 11(2): p. 127；およびRziha, H.J., et al. (2003), Relatedness and heterogeneity at the near-terminal end of the genome of a parapoxvirus bovis 1 strain (B177) compared with parapoxvirus ovis (Orf virus). J. Gen. Virol. 84(Pt 5): p. 1111-6.を参照されたし）。多量の細胞内ＡＮＫタンパク質が、細胞－細胞シグナル伝達、細胞骨格の全体性（integrity）、転写の制御および細胞周期、炎症性応答、またはタンパク質輸送に関与していると記載されており（Mosavi, L.K., et al. (2004), The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition. Protein Sci. 13(6): p. 1435-48）、ただ少し、ポックスウイルスのＡＮＫタンパク質の機能について知られている。これら４つのタンパク質は、特定の基質を基質結合ドメインを介してＳＣＦ１ユビキチンリガーゼに動員し得、したがって、細胞のユビキチン－プロテアソーム機構を活用し得るＦ－ボックス様モチーフを有している、ということが実証されている（Sonnberg, S., et al. (2008), Poxvirus ankyrin repeat proteins are a unique class of F-box proteins that associate with cellular SCF1 ubiquitin ligase complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 105(31): p. 10955-60.を参照されたし）。これらのタンパク質のうちの１つ、ＯＲＦ１２６がコードするＡＮＫ－１タンパク質は、必須のアンキリンリピート８および９を介して、ミトコンドリアと共局在することが示された。それにもかかわらず、生理学的な結果は未だ実証されていない（Lacek, K., et al. (2014), Orf virus (ORFV) ANK-1 protein mitochondrial localization is mediated by ankyrin repeat motifs. Virus Genes 49(1): p. 68-79.を参照されたし）。さらに、最近の研究は、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ）経路に対する、ＯＲＦＶがコードするＡＮＫタンパク質の影響を報告した（Chen, D.Y., et al. (2017), Ankyrin Repeat Proteins of Orf Virus Influence the Cellular Hypoxia Response Pathway. J. Virol. 91(1).を参照されたし）。この経路は、低酸素症に対する細胞応答の制御において重要な役割を担っているが、下流の対象様脈管形成－および抗－アポトーシスプログラムは、ウイルスの病因に有利に働く（Cuninghame, S., R. et al. (2014), Hypoxia-inducible factor 1 and its role in viral carcinogenesis. Virology 456-457: p. 370-83.を参照されたし）。それらの研究において、Ｃｈｅｎらは、ＨＩＦ阻害因子（ＦＩＨ）が、増強されたＨＩＦの活性化をもたらすＯＲＦＶ感染に対するＡＮＫタンパク質によって、隔離されたということを示すことができた（Chen et al. (2017; l.c.)を参照されたし）。
【0060】
〔３．材料および方法〕
（新たなＤｅｌ部位組換え体の作製および特性評価）
本研究で使用されるＯＲＦＶ組換え体を作製するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから合成され得られた導入遺伝子をトランスファープラスミドにクローニングした。ＯＲＦＶゲノムへの導入遺伝子の安定な組み込みは、ヌクレオフェクションによるトランスフェクションおよびその後のＶｅｒｏ細胞の感染後に、トランスファープラスミドと親ウイルスのゲノムＤＮＡとの間の相同組換えによって達成された。
（新たなＤｅｌ部位組換え体の作製および特性評価）
本研究で使用されるＯＲＦＶ組換え体を作製するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから合成され得られた導入遺伝子をトランスファープラスミドにクローニングした。ＯＲＦＶゲノムへの導入遺伝子の安定な組み込みは、ヌクレオフェクションによるトランスフェクションおよびその後のＶｅｒｏ細胞の感染後に、トランスファープラスミドと親ウイルスのゲノムＤＮＡとの間の相同組換えによって達成された。
【0061】
（トランスファープラスミドの作製）
ＤＮＡインサートならびにプラスミドベクターを同一の制限酵素を用いて消化し、目的の断片を精製し、ライゲーションした。続いて、細菌を、ライゲーションしたプラスミドで形質転換し、コロニーを選択してトランスファープラスミドを作製した。検証のために、制限酵素を用いたコントロール消化の後にアガロースゲル電気泳動を行い、一方、挿入特異的プライマーを用いたＤＮＡ配列決定により、プラスミドベクターへの導入遺伝子の正しい挿入が確認された。以下の表は、作製されたトランスファープラスミドをまとめたものであり、一方、プラスミドチャートおよび対応する配列（配列番号７）を図１に示す。
ＤＮＡインサートならびにプラスミドベクターを同一の制限酵素を用いて消化し、目的の断片を精製し、ライゲーションした。続いて、細菌を、ライゲーションしたプラスミドで形質転換し、コロニーを選択してトランスファープラスミドを作製した。検証のために、制限酵素を用いたコントロール消化の後にアガロースゲル電気泳動を行い、一方、挿入特異的プライマーを用いたＤＮＡ配列決定により、プラスミドベクターへの導入遺伝子の正しい挿入が確認された。以下の表は、作製されたトランスファープラスミドをまとめたものであり、一方、プラスミドチャートおよび対応する配列（配列番号７）を図１に示す。
【0062】
【表1】
【0063】
（ＯＲＦＶ感染Ｖｅｒｏ細胞のトランスフェクション）
組換え体ＯＲＦＶの作製は、Ｖｅｒｏ細胞を、ＯＲＦＶによる感染の前にトランスファープラスミドでトランスフェクトする２つのステップに従った。トランスフェクションは、ヌクレオフェクションと呼ばれるエレクトロポレーションに基づくトランスフェクション法によって行った。トランスファープラスミドおよびＯＲＦＶゲノム上の相同配列に起因して、インサートは、相同組換えを介してＯＲＦＶゲノムに組み込まれ得る。この目的のために、Ｖｅｒｏ細胞を、トリプシンを用いて分離し、５ｍｌのＮＦ停止溶液中に再懸濁し、計数した。それぞれのトランスフェクションバッチについて、２．５×１０６細胞を１．５ｍｌエッペンドルフカップに移し、６３ｒｃｆで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを１００μｌのトランスフェクション溶液（１：４．５の比率で混合された、ＡｍａｘａトランスフェクションキットのトランスフェクションサプリメントおよびＣＬＢトランスフェクションバッファー）に再懸濁し、２μｇのプラスミドＤＮＡを補充し、トランスフェクションキュベットに移した。トランスフェクションのために、ＣＬＢトランスフェクションデバイスを使用した。続いて、ヌクレオフェクションされた細胞をＮＦ停止溶液中に再懸濁し、パスツールピペットを用いて６ｍｌの予熱したＶｅｒｏ細胞培地を含むＴ２５細胞培養フラスコに移した。細胞を直ちに親ウイルス（ＭＯＩ１）に３７℃および５％ＣＯ２で４時間感染させ、６ｍｌの予熱したＰＢＳを用いて洗浄し、新鮮なＶｅｒｏ細胞培地中、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ウイルスプラークまたは細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察することができた場合、細胞を、－８０℃および水浴中３７℃で、それぞれ、３回凍結および解凍し、細胞を破壊し、ウイルスの子孫を放出させた。
組換え体ＯＲＦＶの作製は、Ｖｅｒｏ細胞を、ＯＲＦＶによる感染の前にトランスファープラスミドでトランスフェクトする２つのステップに従った。トランスフェクションは、ヌクレオフェクションと呼ばれるエレクトロポレーションに基づくトランスフェクション法によって行った。トランスファープラスミドおよびＯＲＦＶゲノム上の相同配列に起因して、インサートは、相同組換えを介してＯＲＦＶゲノムに組み込まれ得る。この目的のために、Ｖｅｒｏ細胞を、トリプシンを用いて分離し、５ｍｌのＮＦ停止溶液中に再懸濁し、計数した。それぞれのトランスフェクションバッチについて、２．５×１０６細胞を１．５ｍｌエッペンドルフカップに移し、６３ｒｃｆで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを１００μｌのトランスフェクション溶液（１：４．５の比率で混合された、ＡｍａｘａトランスフェクションキットのトランスフェクションサプリメントおよびＣＬＢトランスフェクションバッファー）に再懸濁し、２μｇのプラスミドＤＮＡを補充し、トランスフェクションキュベットに移した。トランスフェクションのために、ＣＬＢトランスフェクションデバイスを使用した。続いて、ヌクレオフェクションされた細胞をＮＦ停止溶液中に再懸濁し、パスツールピペットを用いて６ｍｌの予熱したＶｅｒｏ細胞培地を含むＴ２５細胞培養フラスコに移した。細胞を直ちに親ウイルス（ＭＯＩ１）に３７℃および５％ＣＯ２で４時間感染させ、６ｍｌの予熱したＰＢＳを用いて洗浄し、新鮮なＶｅｒｏ細胞培地中、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ウイルスプラークまたは細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察することができた場合、細胞を、－８０℃および水浴中３７℃で、それぞれ、３回凍結および解凍し、細胞を破壊し、ウイルスの子孫を放出させた。
【0064】
（ＯＲＦＶ組換え体の選択）
相同組換えは、トランスファープラスミドの挿入とＯＲＦＶゲノム中の標的領域との間で約１：１００００の比率で起こる事象である。このまれな事象を選択し、組換え体ＯＲＦＶを親ウイルスから分離するために、異なる選択方法を使用することができる。
相同組換えは、トランスファープラスミドの挿入とＯＲＦＶゲノム中の標的領域との間で約１：１００００の比率で起こる事象である。このまれな事象を選択し、組換え体ＯＲＦＶを親ウイルスから分離するために、異なる選択方法を使用することができる。
【0065】
（ＯＲＦＶ組換え体のＦＡＣＳに基づく選択）
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による選択は、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光標識の損失または獲得に基づく。この目的のために、３×１０５Ｖｅｒｏ細胞を、３ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地を含む６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションのライセートを連続希釈の感染に使用し、３７℃および５％ＣＯ２で２０～２４時間行った。最適な選択方法を確実にするために、約１～５％の低い感染率を有する細胞を回収し、４００ｒｃｆで５分間遠心分離した。続いて、細胞を１ｍｌのＰＢＥを有するスライス（thrice）で洗浄し、最終的には５００μｌのＰＢＥに再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳｊａｚｚ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、１５０μｌのＶｅｒｏ細胞培地中で、ウェル当たり１０４Ｖｅｒｏ細胞を含む９６ウェルプレート中で、単一細胞ＦＡＣＳ選別を行った。３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、組換え体ＯＲＦＶの単一ウイルスプラークを示すウェルを、さらなる増殖および分析のために採取することができた。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による選択は、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光標識の損失または獲得に基づく。この目的のために、３×１０５Ｖｅｒｏ細胞を、３ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地を含む６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションのライセートを連続希釈の感染に使用し、３７℃および５％ＣＯ２で２０～２４時間行った。最適な選択方法を確実にするために、約１～５％の低い感染率を有する細胞を回収し、４００ｒｃｆで５分間遠心分離した。続いて、細胞を１ｍｌのＰＢＥを有するスライス（thrice）で洗浄し、最終的には５００μｌのＰＢＥに再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳｊａｚｚ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、１５０μｌのＶｅｒｏ細胞培地中で、ウェル当たり１０４Ｖｅｒｏ細胞を含む９６ウェルプレート中で、単一細胞ＦＡＣＳ選別を行った。３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、組換え体ＯＲＦＶの単一ウイルスプラークを示すウェルを、さらなる増殖および分析のために採取することができた。
【0066】
（限界希釈によるＯＲＦＶ組換え体の選択）
ＦＡＣＳに基づく選別またはＭＡＣＳ選択後の組換えウイルスのさらなる選択および精製を、限界希釈によって行った。この目的のために、２５ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地中の２×１０６Ｖｅｒｏ細胞を、１２ウェルピペッティングリザーバーに分割し、ここで、最初のウェルおよび残りのウェルは、それぞれ、３ｍｌまたは２ｍｌの細胞液のいずれかを含んでいた。最初のウェルに、ＭＡＣＳ選択の３×１０５細胞または５０～１００μｌのウイルスライセートのいずれかを補充し、最初のウェルから最後のウェルまでそれぞれ１：３に希釈した。それぞれの希釈液の１５０μｌを９６ウェルプレートの対応するウェルに移し、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。７２時間後、単一ウイルスプラークを含むウェルを、（蛍光）顕微鏡法によるさらなる処理のために選択することができた。
ＦＡＣＳに基づく選別またはＭＡＣＳ選択後の組換えウイルスのさらなる選択および精製を、限界希釈によって行った。この目的のために、２５ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地中の２×１０６Ｖｅｒｏ細胞を、１２ウェルピペッティングリザーバーに分割し、ここで、最初のウェルおよび残りのウェルは、それぞれ、３ｍｌまたは２ｍｌの細胞液のいずれかを含んでいた。最初のウェルに、ＭＡＣＳ選択の３×１０５細胞または５０～１００μｌのウイルスライセートのいずれかを補充し、最初のウェルから最後のウェルまでそれぞれ１：３に希釈した。それぞれの希釈液の１５０μｌを９６ウェルプレートの対応するウェルに移し、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。７２時間後、単一ウイルスプラークを含むウェルを、（蛍光）顕微鏡法によるさらなる処理のために選択することができた。
【0067】
（連続継代による遺伝的安定性の決定）
フルオロフォアコード部位の遺伝的安定性を調べるために、それぞれのＯＲＦＶ組換え体の１０回の連続継代を行った。このために、５×１０５Ｖｅｒｏ細胞を、３ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地を含む６ウェルプレートに播種した。最初に、限界希釈で１つの単一のプラークを示すウイルスライセートを連続希釈での感染に使用し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて３７℃および５％ＣＯ２で７２時間、３ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地中でインキュベートした。Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、１００～２００個のプラークを示すウェルについて、蛍光プラーク数を決定した。次に、細胞を－８０℃で凍結し、ＲＴで解凍し、５０μｌのウイルスライセートを使用して、上記のように新しく播種されたＶｅｒｏ細胞を感染させた。
フルオロフォアコード部位の遺伝的安定性を調べるために、それぞれのＯＲＦＶ組換え体の１０回の連続継代を行った。このために、５×１０５Ｖｅｒｏ細胞を、３ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地を含む６ウェルプレートに播種した。最初に、限界希釈で１つの単一のプラークを示すウイルスライセートを連続希釈での感染に使用し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて３７℃および５％ＣＯ２で７２時間、３ｍｌのＶｅｒｏ細胞培地中でインキュベートした。Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、１００～２００個のプラークを示すウェルについて、蛍光プラーク数を決定した。次に、細胞を－８０℃で凍結し、ＲＴで解凍し、５０μｌのウイルスライセートを使用して、上記のように新しく播種されたＶｅｒｏ細胞を感染させた。
【0068】
（ドナー血液からのＰＢＭＣｓの単離）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、テュービンゲンの献血センターから得られた献血から単離することができた。まず、血液をＰＢＳで総体積１００ｍｌに希釈した。次に、５０ｍｌチューブ中の４×１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌを、それぞれ２５ｍｌの希釈血液で重ね合わせ、７００×ｇおよびＲＴで２０分間遠心分離した。密度勾配遠心分離後の白色層の形成によって同定することができる白血球を２つの５０ｍｌチューブに移し、それぞれに５０ｍｌの体積までＰＢＳを補充した。４００×ｇおよびＲＴで１０分間遠心分離した後、細胞ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３００×ｇおよびＲＴで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣｓをマージし、５０ｍｌの体積までＰＢＳを補充し、細胞数を決定した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、テュービンゲンの献血センターから得られた献血から単離することができた。まず、血液をＰＢＳで総体積１００ｍｌに希釈した。次に、５０ｍｌチューブ中の４×１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌを、それぞれ２５ｍｌの希釈血液で重ね合わせ、７００×ｇおよびＲＴで２０分間遠心分離した。密度勾配遠心分離後の白色層の形成によって同定することができる白血球を２つの５０ｍｌチューブに移し、それぞれに５０ｍｌの体積までＰＢＳを補充した。４００×ｇおよびＲＴで１０分間遠心分離した後、細胞ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３００×ｇおよびＲＴで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣｓをマージし、５０ｍｌの体積までＰＢＳを補充し、細胞数を決定した。
【0069】
（ＰＢＭＣｓからの単球の単離）
ＰＢＭＣｓから単球を単離する原理は、単球によるＣＤ１４の発現に依存する。したがって、ＰＢＭＣｓを３００×ｇおよびＲＴで１０分間遠心分離し、ペレットを４ｍｌのＰＢＥおよび１００μｌのα－ＣＤ１４マイクロビーズに再懸濁した。懸濁液を４℃で１５分間インキュベートし、ＰＢＥで平衡化したＬＳカラムにロードした。カラムを３ｍｌのＰＢＥで３回洗浄した後、ＣＤ１４＋単球を５ｍｌのＰＢＥでカラムから溶出し、計数することができた。
ＰＢＭＣｓから単球を単離する原理は、単球によるＣＤ１４の発現に依存する。したがって、ＰＢＭＣｓを３００×ｇおよびＲＴで１０分間遠心分離し、ペレットを４ｍｌのＰＢＥおよび１００μｌのα－ＣＤ１４マイクロビーズに再懸濁した。懸濁液を４℃で１５分間インキュベートし、ＰＢＥで平衡化したＬＳカラムにロードした。カラムを３ｍｌのＰＢＥで３回洗浄した後、ＣＤ１４＋単球を５ｍｌのＰＢＥでカラムから溶出し、計数することができた。
【0070】
単球のｍｏＤＣｓへの分化
精製した単球の樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）への分化は、５日間、３７℃および５％ＣＯ２で、８６ｎｍ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４による刺激で行った。
精製した単球の樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）への分化は、５日間、３７℃および５％ＣＯ２で、８６ｎｍ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４による刺激で行った。
【0071】
（フローサイトメトリー）
生存率および感染率、ならびに、表面および細胞内分子の発現を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。試料の調製および蛍光標識抗体による細胞の染色を、９６ウェルＵ底プレート中で行い、一方、遠心分離を４℃および４００×ｇで５分間行った。感染率を決定するために、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、５０μｌのＰＦＥＡに再懸濁させるか、または任意にＦＡＣＳ分析のために固定した。
生存率および感染率、ならびに、表面および細胞内分子の発現を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。試料の調製および蛍光標識抗体による細胞の染色を、９６ウェルＵ底プレート中で行い、一方、遠心分離を４℃および４００×ｇで５分間行った。感染率を決定するために、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、５０μｌのＰＦＥＡに再懸濁させるか、または任意にＦＡＣＳ分析のために固定した。
【0072】
（Ｆｃ受容体の阻害）
非特異的抗体結合を防止するために、Ｆｃ受容体を発現する細胞を、染色手順の前に、製造業者の説明書に従ってＦｃブロックで処理した。
非特異的抗体結合を防止するために、Ｆｃ受容体を発現する細胞を、染色手順の前に、製造業者の説明書に従ってＦｃブロックで処理した。
【0073】
（マルチマーによる染色）
マルチマーは、抗原特異的Ｔ細胞を同定および定量するために頻繁に使用される。テトラマーは、蛍光標識されたストレプトアビジン複合体に結合した４つの組換えＭＨＣ分子からなる。対照的に、デキストラマーは、いくつかのフルオロフォアおよびＭＨＣ分子を保有するデキストラン骨格からなる。マルチマーは、特定のＴ細胞によって認識されるペプチド－ＭＨＣ複合体を形成するために、目的のペプチドがロードされ、したがって、フローサイトメトリーによって検出することができる。このために、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのテトラマー溶液またはＰＢＳにそれぞれ再懸濁した。５０μｌのテトラマー溶液で染色する前に、ＰＥ結合ＨＬＡテトラマーをテトラマーバッファーと１：５０で混合し、１３．０００×ｇで１０分間遠心分離した。デキストラマーによる染色は、デキストラマーをＰＢＳと１：１０の比で混合することによる同一の手順に従った。インキュベートは、ＲＴで３０分間、暗所で行った。
マルチマーは、抗原特異的Ｔ細胞を同定および定量するために頻繁に使用される。テトラマーは、蛍光標識されたストレプトアビジン複合体に結合した４つの組換えＭＨＣ分子からなる。対照的に、デキストラマーは、いくつかのフルオロフォアおよびＭＨＣ分子を保有するデキストラン骨格からなる。マルチマーは、特定のＴ細胞によって認識されるペプチド－ＭＨＣ複合体を形成するために、目的のペプチドがロードされ、したがって、フローサイトメトリーによって検出することができる。このために、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのテトラマー溶液またはＰＢＳにそれぞれ再懸濁した。５０μｌのテトラマー溶液で染色する前に、ＰＥ結合ＨＬＡテトラマーをテトラマーバッファーと１：５０で混合し、１３．０００×ｇで１０分間遠心分離した。デキストラマーによる染色は、デキストラマーをＰＢＳと１：１０の比で混合することによる同一の手順に従った。インキュベートは、ＲＴで３０分間、暗所で行った。
【0074】
（細胞生存率の測定）
細胞生存率は、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色によって決定した。Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａは、生細胞に浸透することはできないが、損なわれた膜を有する細胞に入るアミン反応性蛍光色素である。したがって、それは、生存哺乳類細胞と死滅哺乳類細胞とを区別するために使用することができる。Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色のために、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＰＢＳで１：４００に希釈）に、３０分間４℃で、暗所で再懸濁した。
細胞生存率は、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色によって決定した。Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａは、生細胞に浸透することはできないが、損なわれた膜を有する細胞に入るアミン反応性蛍光色素である。したがって、それは、生存哺乳類細胞と死滅哺乳類細胞とを区別するために使用することができる。Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色のために、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＰＢＳで１：４００に希釈）に、３０分間４℃で、暗所で再懸濁した。
【0075】
（細胞外抗体染色）
表面分子発現の分析のために、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、ＰＦＥＡ中の５０μｌの新しく調製された抗体混合物に再懸濁し、３０分間４℃で、暗所でインキュベートした。
表面分子発現の分析のために、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、ＰＦＥＡ中の５０μｌの新しく調製された抗体混合物に再懸濁し、３０分間４℃で、暗所でインキュベートした。
【0076】
（細胞内サイトカイン染色）
細胞内サイトカインの検出のために、細胞を１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡで処理して、タンパク質の分泌を防ぎ、それぞれの合成ペプチドで１２～１４時間刺激した。細胞内サイトカイン染色の前に、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、５０μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで３０分間、４℃で、暗所でインキュベートすることによって透過処理した。次に、細胞を再懸濁し、２００μｌのＰｅｒｍｗａｓｈで２回洗浄し、その後、３０分間４℃で、暗所で、Ｐｅｒｍｗａｓｈ中の５０μｌの抗体混合物で染色した。
細胞内サイトカインの検出のために、細胞を１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡで処理して、タンパク質の分泌を防ぎ、それぞれの合成ペプチドで１２～１４時間刺激した。細胞内サイトカイン染色の前に、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、５０μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで３０分間、４℃で、暗所でインキュベートすることによって透過処理した。次に、細胞を再懸濁し、２００μｌのＰｅｒｍｗａｓｈで２回洗浄し、その後、３０分間４℃で、暗所で、Ｐｅｒｍｗａｓｈ中の５０μｌの抗体混合物で染色した。
【0077】
（細胞の固定）
４時間を超える保存のために、細胞を固定した。このために、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、５０μｌのＰＦＥＡ＋１％ホルムアルデヒドに再懸濁し、４℃で暗所に保存した。試料の分析は１０日以内に行った。
４時間を超える保存のために、細胞を固定した。このために、細胞を２００μｌのＰＦＥＡで２回洗浄し、５０μｌのＰＦＥＡ＋１％ホルムアルデヒドに再懸濁し、４℃で暗所に保存した。試料の分析は１０日以内に行った。
【0078】
（マウス免疫）
少なくとも６週齢の非近交系ＣＤ１マウス（Ｎ＝１０）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、ドイツのテュービンゲン大学のバイオセーフティレベル１の動物施設に収容した。すべての動物は、良い動物操作、並びに、地方の動物実験および倫理委員会の指針に従い、厳密に従い取り扱われた－実験はプロジェクトライセンス（Ｎｒ．ＩＭ１／２０Ｇ）に基づいて実施された。マウスは、１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＯＲＦＶ組換え体で、２週間の間隔で２回、前脛骨の筋肉内（ｉ．ｍ．）に免疫化された。体液性免疫分析のための血液試料を、ブースター免疫の２週間後に後眼窩の出血によって収集した。動物を人道的に安楽死させた後、細胞性免疫分析のための脾細胞を、ブースター免疫の２週間後に収集し、標準的な手順によって単離した。
少なくとも６週齢の非近交系ＣＤ１マウス（Ｎ＝１０）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、ドイツのテュービンゲン大学のバイオセーフティレベル１の動物施設に収容した。すべての動物は、良い動物操作、並びに、地方の動物実験および倫理委員会の指針に従い、厳密に従い取り扱われた－実験はプロジェクトライセンス（Ｎｒ．ＩＭ１／２０Ｇ）に基づいて実施された。マウスは、１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＯＲＦＶ組換え体で、２週間の間隔で２回、前脛骨の筋肉内（ｉ．ｍ．）に免疫化された。体液性免疫分析のための血液試料を、ブースター免疫の２週間後に後眼窩の出血によって収集した。動物を人道的に安楽死させた後、細胞性免疫分析のための脾細胞を、ブースター免疫の２週間後に収集し、標準的な手順によって単離した。
【0079】
ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ測定
ＥＬＩＳＯＰ測定は、マウスＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳキット（ＡＬＰ）（カタログ番号：３３２１－４ＡＰＷ－１０、Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｓｃｈｗｅｄｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従って、行った。ウェルあたり、２×１０５脾臓細胞を、最終濃度２μｇ／ｍｌのＳ１ペプチドのオーバーラッピングプール（カタログ番号：１３０－１２７－０４１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、２１時間、刺激した。発達したスポットを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ５ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ， ＵＳＡ）およびＩｍｍｎｏＳｐｏｔソフトウェアを使用して、自動的に計測した。
ＥＬＩＳＯＰ測定は、マウスＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳキット（ＡＬＰ）（カタログ番号：３３２１－４ＡＰＷ－１０、Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｓｃｈｗｅｄｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従って、行った。ウェルあたり、２×１０５脾臓細胞を、最終濃度２μｇ／ｍｌのＳ１ペプチドのオーバーラッピングプール（カタログ番号：１３０－１２７－０４１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、２１時間、刺激した。発達したスポットを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ５ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ， ＵＳＡ）およびＩｍｍｎｏＳｐｏｔソフトウェアを使用して、自動的に計測した。
【0080】
〔４．結果〕
（新たなＤｅｌ部位組換え体の作製）
トランスファープラスミドの作製に成功した後、新たなＯＲＦＶ組換え体を、方法に詳細に記載されるように作製した。したがって、プラスミドｐＤｅｌ１２６－２－ＡｃＧＦＰをヌクレオフェクションによってＶｅｒｏ細胞に移入し、その後、親ウイルスＶ１２－Ｃｈｅｒｒｙに感染させた。ＯＲＦＶゲノム中の相同配列およびトランスファープラスミドの挿入隣接領域のため、相同組換えは、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖゲノム中のＧＦＰによるＯＲＦ１２６の安定な交換をもたらした（図２）。Ｄ１７０１－Ｖ（Rziha, H.-J.、公開されていない、図２Ｂ）のＤＮＡ配列を含む３１．８０５ｎｔの右側部分におけるＯＲＦ１２６の正確な位置を以下の表に示す：
（新たなＤｅｌ部位組換え体の作製）
トランスファープラスミドの作製に成功した後、新たなＯＲＦＶ組換え体を、方法に詳細に記載されるように作製した。したがって、プラスミドｐＤｅｌ１２６－２－ＡｃＧＦＰをヌクレオフェクションによってＶｅｒｏ細胞に移入し、その後、親ウイルスＶ１２－Ｃｈｅｒｒｙに感染させた。ＯＲＦＶゲノム中の相同配列およびトランスファープラスミドの挿入隣接領域のため、相同組換えは、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖゲノム中のＧＦＰによるＯＲＦ１２６の安定な交換をもたらした（図２）。Ｄ１７０１－Ｖ（Rziha, H.-J.、公開されていない、図２Ｂ）のＤＮＡ配列を含む３１．８０５ｎｔの右側部分におけるＯＲＦ１２６の正確な位置を以下の表に示す：
【表2】
【0081】
次に、新たなＯＲＦＶ組換え体を、ＦＡＣＳ選別および限界希釈によって選択された感染ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現Ｖｅｒｏ細胞から単離することができた。ＤＮＡ単離、続いて挿入および遺伝子座特異的ＰＣＲタイピングにより、図３に示すように、精製されたＯＲＦＶ組換え体の遺伝的均一性をモニタリングすることができた。ここで、１２６およびｄ１２６ＰＣＲにより、ＯＲＦ１２６の欠失およびＧＦＰコード配列との交換の両方が証明された。その後、新たなＯＲＦＶ組換え体を、上記のようにラージスケールで増殖させた。
【0082】
組換えＯＲＦＶ欠失変異体も作製することができ、これは、ＧＦＰの挿入を伴わないＯＲＦ１２６の欠失、したがって、親ウイルスと比較して増強された免疫原性をもたらす機能欠失変異のＯＲＦ１２６遺伝子産物のみをもたらした。対応するトランスファープラスミドおよび配列は、図４および配列番号８に見出すことができる。
【0083】
（ＧＦＰは新たなＤｅｌ部位に安定的に挿入されている）
新たなＤｅｌ部位へ挿入されたＧＦＰの安定性を調べるために、Ｖｅｒｏ細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２０回の連続継代を行った。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は両方とも、図５に示されるように、この実験を通して新たなＤｅｌ部位組換え体によるＶｅｒｏ細胞感染に起因する単一プラーク中で蛍光顕微鏡によって観察することができた。
新たなＤｅｌ部位へ挿入されたＧＦＰの安定性を調べるために、Ｖｅｒｏ細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２０回の連続継代を行った。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は両方とも、図５に示されるように、この実験を通して新たなＤｅｌ部位組換え体によるＶｅｒｏ細胞感染に起因する単一プラーク中で蛍光顕微鏡によって観察することができた。
【0084】
さらに、ウイルスＤＮＡを、継代１回、５回、１０回、１５回、および２０回後に感染したＶｅｒｏ細胞から単離し、欠失した遺伝子特異的ならびに遺伝子座特異的ＰＣＲを行って、Ｄｅｌ遺伝子座の完全性を調べた。示されるように、２０回の継代の間に１２６ＰＣＲにおいてＯＲＦ１２６特異的２７３ｂｐ断片を検出することはできなかったが（図３Ａ）、欠失部位は、ｄ１２６ＰＣＲを用いてＤｅｌ１２６遺伝子座に挿入されたＧＦＰに特異的な１３６０ｂｐ断片を示した（図３Ｂ）。
【0085】
最後に、新たなＤｅｌ部位に挿入された導入遺伝子の安定性を、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ組換え体の３つの生物学的反復（ウイルスクローン）の１０回の連続継代の間に調べた。７２時間の感染後、１００～２００個のプラークを含むウェルを使用して、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙフルオロフォアの両方、またはＧＦＰもしくはｍＣｈｅｒｒｙのいずれかを発現する単一プラークの量を蛍光顕微鏡によって決定した。１０回の連続継代の間に１つのフルオロフォアのみを発現するプラークのパーセンテージを図６に示す。
【0086】
結果は、ＶＣｈ１２６ＧＦＰを用いて、１％未満の単一ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現プラークの頻度を実証している。まとめると、提示された結果は、ＧＦＰが新たなＤｅｌ部位組換え体に感染したＶｅｒｏ細胞において安定に発現し、予測されるゲノム遺伝子座において２０回の継代にわたって検出することができることを示唆している。さらに、新たなＤｅｌ部位またはｖｅｇｆ遺伝子座におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方の遺伝的安定性は、それぞれ、感染したＶｅｒｏ細胞の蛍光を研究する１０回の連続継代において検証された。それぞれの新たなＤｅｌ部位組換え体に感染したすべての計数された溶解性プラークの少なくとも９９％は１０回の継代後に同時にＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを発現したので、これらの結果は試験されたゲノム遺伝子座の遺伝的安定性を示している。
【0087】
（新たなＤｅｌ部位組換え体の増殖挙動の特性評価）
新たなＤｅｌ部位組換え体に導入された欠失が参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰと比較してＯＲＦＶ許容性Ｖｅｒｏ細胞におけるインビトロ増殖特性を変化させるかどうかを調べるために、単一工程の増殖曲線実験を行った。このために、Ｖｅｒｏ細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰに感染させ、２４時間後に約２０～２５％の感染率をもたらした。感染細胞を洗浄し、吸着の２時間後（０時間と指定）、または感染の６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１２０時間後に回収した。ウイルスライセートをＶｅｒｏ細胞上に滴定して、１ｍｌ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍｌ）で測定した感染性粒子の数を決定した。各組換え体について３回実験を行った。結果を図７に示す。
新たなＤｅｌ部位組換え体に導入された欠失が参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰと比較してＯＲＦＶ許容性Ｖｅｒｏ細胞におけるインビトロ増殖特性を変化させるかどうかを調べるために、単一工程の増殖曲線実験を行った。このために、Ｖｅｒｏ細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰに感染させ、２４時間後に約２０～２５％の感染率をもたらした。感染細胞を洗浄し、吸着の２時間後（０時間と指定）、または感染の６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１２０時間後に回収した。ウイルスライセートをＶｅｒｏ細胞上に滴定して、１ｍｌ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍｌ）で測定した感染性粒子の数を決定した。各組換え体について３回実験を行った。結果を図７に示す。
【0088】
Ｄｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰの増殖特性は、１２０ｈｐｉ後に約１０７ＰＦＵ／ｍｌの最終力価と同等に達する参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰについて得られたものに似ている。特に、ＶＣｈ１２６ＧＦＰの増殖曲線は、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰの増殖曲線について使用されるように、より低いウイルス入力を示し、実験を通してコントロールと比較して、わずかに減少した最終ウイルス力価のみを示した（図７）。それにもかかわらず、これらの結果は、ＶＣｈ１２６ＧＦＰが、許容性細胞株Ｖｅｒｏにおいて感染性子孫を産生することができるような複製効率であることを示唆している。
【0089】
（新たなＤｅｌ部位を用いた発現強度の分析）
新たなＤｅｌ部位組換え体による導入遺伝子発現の可能性を調べるために、ＯＲＦ１２６に組み込まれたレポーター遺伝子ＧＦＰ、およびｖｅｇｆ遺伝子座に挿入されたｍＣｈｅｒｒｙを使用し、Ｖｅｒｏ細胞、単球性細胞株ＴＨＰ－１およびヒト初代単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）のＯＲＦＶ感染後のそれらの発現強度を比較した。このために、細胞を播種し、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに２４時間または４８時間感染させた。続いて、ＦＡＣＳ分析を行い、細胞において発現されたＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ｍｏＤＣｓの分析のために、いくつかのドナーからの細胞を用いて実験を行い、個体間の差を推定した。新たなＤｅｌ部位組換え体の感染から同定されたＭＦＩを、同じ実験のＶＣｈＤ１２ＧＦＰ由来ＭＦＩの平均に対して正規化した。Ｖｅｒｏ細胞、ＴＨＰ－１細胞およびｍｏＤＣｓから得られた結果を、それぞれ図８、図９および図１０に示す。
新たなＤｅｌ部位組換え体による導入遺伝子発現の可能性を調べるために、ＯＲＦ１２６に組み込まれたレポーター遺伝子ＧＦＰ、およびｖｅｇｆ遺伝子座に挿入されたｍＣｈｅｒｒｙを使用し、Ｖｅｒｏ細胞、単球性細胞株ＴＨＰ－１およびヒト初代単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）のＯＲＦＶ感染後のそれらの発現強度を比較した。このために、細胞を播種し、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに２４時間または４８時間感染させた。続いて、ＦＡＣＳ分析を行い、細胞において発現されたＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ｍｏＤＣｓの分析のために、いくつかのドナーからの細胞を用いて実験を行い、個体間の差を推定した。新たなＤｅｌ部位組換え体の感染から同定されたＭＦＩを、同じ実験のＶＣｈＤ１２ＧＦＰ由来ＭＦＩの平均に対して正規化した。Ｖｅｒｏ細胞、ＴＨＰ－１細胞およびｍｏＤＣｓから得られた結果を、それぞれ図８、図９および図１０に示す。
【0090】
Ｖｅｒｏ細胞について、３つの独立した実験を２回繰り返して行った。図８に示されるように、ＶＣｈ１２６ＧＦＰによって誘導されたＧＦＰレベルは、参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰと比較して、２４時間後に有意に増強した。
【0091】
単球性ＴＨＰ－１細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの発現強度を、感染２４時間後の３～６回の反復を含む４回の独立した実験、および感染４８時間後の３回の反復を含む２回の独立した実験、のそれぞれにおいて分析した。ここで、ＶＣＨ１２６ＧＦＰに感染したＴＨＰ１細胞について、４８時間後、有意に増加したｍＣｈｅｒｒｙが、参照ウイルスに感染したそれらと比較して、検出された（図９Ａ）。さらに、図９Ｂにおいて実証されるように、ＧＦＰ発現は、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰと比較してＶＣｈ１２６ＧＦＰについて、２４時間後および４８時間後に有意に加速された。ＶＣｈＤ１２ＧＦＰと比較してこれらの上昇した導入遺伝子レベルを考慮すると、ＯＦ１２６に挿入された導入遺伝子はＴＨＰ－１細胞においてＤ遺伝子座によってコードされるものよりも強く発現されるのに対して、ＯＲＦ１２６の欠失はｖｅｇｆ遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子の発現を促進するように思われた。
【0092】
初代細胞において、参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰと比較して導入遺伝子の発現を研究するために、ｍｏＤＣｓを作製し、感染させた。３人のドナーのそれぞれについて、６つの技術的複製のＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ ＭＦＩｓが、感染２４時間後および４８時間後、ＦＡＣＳにより評価された。図１０において実証されるように、ＶＣｈ１２６ＧＦＰに感染させたｍｏＤＣｓにおいてＧＦＰ発現は、２４時間後に有意に増加し、４８時間後に有意に上昇し、したがって、ｍｏＤＣｓにおいて、Ｄ遺伝子座に起因するそれらと比較して、発現レベルは増加した。
【0093】
結論として、発現強度の分析は、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖによってコードされた選択されたＯＲＦｓの欠失およびｇｆｐによるその置換が、ｖｅｇｆ遺伝子座に挿入された導入遺伝子の発現の変化を引き起こすことを示す。特に、ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦ１２６の欠失は、挿入された導入遺伝子の発現動態に影響を及ぼすように思われる。ほとんどの新たなＤｅｌ部位組換え体によって誘導された蛍光レポーターＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの発現は減少したように見えたが、一方、ＶＣｈ１２６ＧＦＰ感染時にＴＨＰ－１およびｍｏＤＣｓにおいて同等またはより高い発現レベルが達成され得る。
【0094】
（新たなＤｅｌ部位組換え体による感染による樹状細胞の活性化）
以前に、Ｍｕｅｌｌｅｒら（２０１９年、準備中）は異なる導入遺伝子をコードするＤ１７０１－Ｖ ＯＲＦＶ組換え体の取り込みが、樹状細胞またはＰＢＭＣｓの範囲内での単球のような抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の活性化を変化させることができることを示すことができた。Ｄ１７０１－Ｖゲノムに導入されたＯＲＦ１２６欠失の影響力を明らかにするために、ｍｏＤＣｓをＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、一方、非感染細胞をネガティブコントロールとして供した。一人のドナーの中で極めて同等な感染率を示したｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の、活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ－ＤＲの発現をＦＡＣＳ分析によって決定するため、２４時間後、細胞を回収した。ＬＰＳ処理細胞および非感染細胞をコントロールとして供したが、それらの活性化マーカーの発現は、ｍＣｈｅｒｒｙネガティブ細胞において測定した。
以前に、Ｍｕｅｌｌｅｒら（２０１９年、準備中）は異なる導入遺伝子をコードするＤ１７０１－Ｖ ＯＲＦＶ組換え体の取り込みが、樹状細胞またはＰＢＭＣｓの範囲内での単球のような抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の活性化を変化させることができることを示すことができた。Ｄ１７０１－Ｖゲノムに導入されたＯＲＦ１２６欠失の影響力を明らかにするために、ｍｏＤＣｓをＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、一方、非感染細胞をネガティブコントロールとして供した。一人のドナーの中で極めて同等な感染率を示したｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の、活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ－ＤＲの発現をＦＡＣＳ分析によって決定するため、２４時間後、細胞を回収した。ＬＰＳ処理細胞および非感染細胞をコントロールとして供したが、それらの活性化マーカーの発現は、ｍＣｈｅｒｒｙネガティブ細胞において測定した。
【0095】
全体で、活性化マーカーの発現は、１０人の健康なドナーに由来するｍｏＤＣｓの感染ｍｏＤＣｓにおいて決定した。異なるドナーからのｍｏＤＣｓの感染率は、５％～２０％の範囲内であり、平均レベルが１０％から１５％までの間であった（図１１Ａ）。感染ｍｏＤＣｓの平均生存率は、感染率と相関関係が無く、約６０％のレベルであった。これらのデータを比較するため、活性化マーカーの発現を、非感染細胞から得られた幾何平均蛍光強度に対して正規化した。図１２ａおよびｂに示される結果は、活性化マーカーＣＤ４０およびＣＤ８０の相対的な発現は参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰまたはＶＣｈ１２６ＧＦＰによる感染時と有意な相違はない、ということを示している。しかしながら、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡＤＲの発現は、図１２ｃ、ｄおよびｅにおいて図示されるように、ＶＣｈ１２６ＧＦＰによるｍｏＤＣｓ感染後、有意に増加した。要約すれば、ＯＲＦＶ Ｄ１７０１－ＶにおけるＯＲＦ１２６の欠失は、分析した活性化マーカーの表面発現にポジティブな影響を与える。
【0096】
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦＶ組換え体のインビボ免疫原性）
スパイク（Ｓ１）および核タンパク質（Ｎ）をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦＶ組換え体の免疫原性を、２回の筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫後の非近交系ＣＤ１マウスにおいて比較した。ブースター免疫後、すべてのワクチン群で高力価のＮ－およびＳ１－抗原特異的結合抗体が検出された（図１３）。ＯＲＦ１２６ノックアウトを有するＯＲＦＶ組換え体は、コントロールのＯＲＦＶと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ－およびＳ１－特異的結合抗体力価を引き起こした（図１３ＡおよびＢ）。一方、ＯＲＦ１２６ノックアウト変異体によるプライム・ブースト免疫化を受けたマウスは、２つの他の群と比較して、Ｔ－細胞を産生するＩＦＮ－γの最も高い数を示した（図１３Ｃ）。
スパイク（Ｓ１）および核タンパク質（Ｎ）をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦＶ組換え体の免疫原性を、２回の筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫後の非近交系ＣＤ１マウスにおいて比較した。ブースター免疫後、すべてのワクチン群で高力価のＮ－およびＳ１－抗原特異的結合抗体が検出された（図１３）。ＯＲＦ１２６ノックアウトを有するＯＲＦＶ組換え体は、コントロールのＯＲＦＶと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ－およびＳ１－特異的結合抗体力価を引き起こした（図１３ＡおよびＢ）。一方、ＯＲＦ１２６ノックアウト変異体によるプライム・ブースト免疫化を受けたマウスは、２つの他の群と比較して、Ｔ－細胞を産生するＩＦＮ－γの最も高い数を示した（図１３Ｃ）。
【0097】
〔５．概要〕
まとめると、新たなＤｅｌ部位組換え体について実施された分析は、ＯＲＦ１２６ノックアウトをＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖゲノムに組み込むことによって、多価、単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。ＯＲＦ１２６の欠失およびそれぞれのＤｅｌ部位へのレポーターコンストラクトＧＦＰの同時組み込みは、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に対する顕著な免疫原性特性にも起因した。したがって、ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦ１２６を欠く欠損変異体は、インビトロにおいてｍｏＤＣ活性化マーカーの発現増強、および、インビボにおいて参照変異体と比較して類似の体液性免疫応答および優れた細胞性免疫応答の誘発を刺激することが示された。さらに、Ｄｅｌ部位１２６に挿入されたＧＦＰの発現動態は、導入遺伝子の強い発現のためのその最適性が示されているもっとも強いレポーターレベルを導く。したがって、本研究の知見は、ｖｅｇｆ遺伝子座およびＤｅｌ部位１２６からいくつかの抗原および免疫調節エレメントを同時に発現するＯＲＦ１２６欠失を有する組換え体が強力で、持続的かつ効率的な細胞性および体液性免疫応答の誘導をもたらす、好ましい特性を有するＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖベクターワクチンの作製のための道を開き得る。
まとめると、新たなＤｅｌ部位組換え体について実施された分析は、ＯＲＦ１２６ノックアウトをＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖゲノムに組み込むことによって、多価、単一ベクターワクチンの設計の高い可能性を実証している。ＯＲＦ１２６の欠失およびそれぞれのＤｅｌ部位へのレポーターコンストラクトＧＦＰの同時組み込みは、所望の導入遺伝子を発現する安定なベクターの効率的な複製をもたらしただけでなく、新たに作製された組換え体に対する顕著な免疫原性特性にも起因した。したがって、ＡＮＫ－１をコードするＯＲＦ１２６を欠く欠損変異体は、インビトロにおいてｍｏＤＣ活性化マーカーの発現増強、および、インビボにおいて参照変異体と比較して類似の体液性免疫応答および優れた細胞性免疫応答の誘発を刺激することが示された。さらに、Ｄｅｌ部位１２６に挿入されたＧＦＰの発現動態は、導入遺伝子の強い発現のためのその最適性が示されているもっとも強いレポーターレベルを導く。したがって、本研究の知見は、ｖｅｇｆ遺伝子座およびＤｅｌ部位１２６からいくつかの抗原および免疫調節エレメントを同時に発現するＯＲＦ１２６欠失を有する組換え体が強力で、持続的かつ効率的な細胞性および体液性免疫応答の誘導をもたらす、好ましい特性を有するＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖベクターワクチンの作製のための道を開き得る。
【0098】
〔６．配列〕
配列番号１：ｅＰ１プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号２：ｅＰ２プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号３：「最適化された初期」プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号４：７．５ｋＤａのプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号５：ＶＥＧＦプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号６：Ｄ１７０１－Ｖ ＯＲＦ１２５－１２６－１２７（ｎｔ１－２３８０）のヌクレオチド配列
ＯＲＦ１２５：ｎｔ１－５１９
ＯＲＦ１２６：ｎｔ６２９－２１１９
ＯＲＦ１２０：ｎｔ２２０４－２７５８
配列番号７：ヌクレオチド配列ｐＤｅｌ１２６－４－２－ＡｃＧＦＰ（ｎｔ１－２０５７）
ＨＬ（ホモログの左腕）ＯＲＦ１２５：ｎｔ１－４４７
初期プロモーターｅＰ２：ｎｔ６３２－６６８
ＡｃＧＦＰ：ｎｔ７００－１４１６
ＨＲ（ホモログの右腕）ＯＲＦ１２７：ｎｔ１４８８－２０５７
配列番号８：ヌクレオチド配列ｐＤｅｌ１２６（ｎｔ１－１１３２）
ＨＬ（ホモログの左腕）ＯＲＦ１２５：ｎｔ１－４４７
ＨＲ（ホモログの右腕）ＯＲＦ１２７：ｎｔ５６３－１１３２
配列番号１：ｅＰ１プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号２：ｅＰ２プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号３：「最適化された初期」プロモーターのヌクレオチド配列
配列番号４：７．５ｋＤａのプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号５：ＶＥＧＦプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号６：Ｄ１７０１－Ｖ ＯＲＦ１２５－１２６－１２７（ｎｔ１－２３８０）のヌクレオチド配列
ＯＲＦ１２５：ｎｔ１－５１９
ＯＲＦ１２６：ｎｔ６２９－２１１９
ＯＲＦ１２０：ｎｔ２２０４－２７５８
配列番号７：ヌクレオチド配列ｐＤｅｌ１２６－４－２－ＡｃＧＦＰ（ｎｔ１－２０５７）
ＨＬ（ホモログの左腕）ＯＲＦ１２５：ｎｔ１－４４７
初期プロモーターｅＰ２：ｎｔ６３２－６６８
ＡｃＧＦＰ：ｎｔ７００－１４１６
ＨＲ（ホモログの右腕）ＯＲＦ１２７：ｎｔ１４８８－２０５７
配列番号８：ヌクレオチド配列ｐＤｅｌ１２６（ｎｔ１－１１３２）
ＨＬ（ホモログの左腕）ＯＲＦ１２５：ｎｔ１－４４７
ＨＲ（ホモログの右腕）ＯＲＦ１２７：ｎｔ５６３－１１３２
【図面の簡単な説明】
【0099】
【図1】ｐＤｅｌ１２６－２－ＡｃＧＦＰのプラスミドチャート。
【図2】Ｄ１７０１－ＶゲノムにおけるＯＲＦ１２６欠失の図画による説明。Ａ）Rziha et al. (2019; l.c.)によって最近公開されたＯＲＦＶ Ｄ１７０１－Ｖ株のゲノムマップを示す。Ｂ）ゲノムの右側部分によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＤＮＡ配列を含む３１．８０５ｎｔを、Rziha, H.-J.の公開されていないデータによって決定した。Ｃ）各遺伝子欠失によって影響を受けるゲノム部位の拡大。対応する配列を配列番号６に示す。
【図3】ＧＦＰは、Ｄｅｌ１２６に安定的に組み込まれている。Ｖｅｒｏ細胞におけるＶＣｈ１２６ＧＦＰの継代１回、５回、１０回、１５回、および２０回後の１２６ＰＣＲは、遺伝子１２６の定常的な欠失を示し（Ａ）、一方、ｄ１２６ＰＣＲは、Ｄｅｌ１２６遺伝子座に挿入されたＧＦＰに特異的な１３６０ｂｐの断片をもたらす（Ｂ）。１％アガロースゲル；ｎｉ＝非感染Ｖｅｒｏ細胞からのＤＮＡ；Ｍ＝使用準備済み １ｋｂ Ｌａｄｄｅｒ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。
【図4】ｐＤｅｌ１２６のプラスミドチャート。
【図5】新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰは、Ｖｅｒｏ細胞においてＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの発現を誘導する。新たなＤｅｌ部位組換え体および参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰによる感染の５日後に、単一プラークの蛍光顕微鏡検査を行った。明視野顕微鏡、単一ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙチャネルから得られた画像、ならびにマージされた画像が示され、スケールバーは５００μｍを表す。
【図6】Ｄｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰにおける導入遺伝子ｇｆｐおよびｍｃｈｅｒｒｙの遺伝的安定性。１０回の連続継代（Ｐ１～Ｐ１０）の間、感染したＶｅｒｏ細胞によるフルオロフォアの発現を、感染後７２時間後の単一プラーク計数によって決定した。単一のＧＦＰの発現プラークの頻度（Ａ）および単一のｍＣｈｅｒｒｙの発現プラークの頻度（Ｂ）、ならびに単一の蛍光を示すプラークの全頻度（Ｃ）を、９６ウェル限界希釈から得られたＤｅｌ部位組換え体当たり３つのウイルスクローンについて示す。単一の蛍光プラークの平均の全頻度を計算し、（Ｄ）にプロットした。
【図7】Ｄｅｌ部位組換え体の単一段階増殖曲線。感染細胞（ＭＯＩ１）を洗浄し、吸着の２時間後（０ｈｐｉ）、および、示された感染後の時間（hours post infection；ｈｐｉ）に回収し、一方、全細胞ライセートをＶｅｒｏ細胞上に滴定してウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ）を決定した。組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰのウイルス増殖曲線は、１２０時間後にコントロールのＶＣｈＤ１２ＧＦＰと同等のウイルス力価に達する。
【図8】Ｖｅｒｏ細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。Ｖｅｒｏ細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２４ｈｐｉおよび４８ｈｐｉに回収した。ＧＦＰの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析によって決定し、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰのそれに対して正規化した。３つの独立した実験の２回の繰り返しを示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応なしｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図9】単球性ＴＨＰ－１細胞におけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。ＴＨＰ－１細胞を新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２４ｈｐｉおよび４８ｈｐｉに回収した。ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａ）およびＧＦＰ（Ｂ）の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析によって決定し、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰのそれに対して正規化した。それぞれの独立した試験の平均値を計算し、９５％の信頼区間を持つ対応なしｔ検定を用いて統計解析を行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図10】ｍｏＤＣｓにおけるＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現の比較。ｍｏＤＣｓを新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照ウイルスＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させ、２４ｈｐｉおよび４８ｈｐｉに回収した。ＧＦＰの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ分析によって決定し、ＶＣｈＤ１２ＧＦＰのそれに対して正規化した。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応なしｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図11】ヒトｍｏＤＣｓの感染率および生存率。１０人の異なるドナーのｍｏＤＣｓを、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照組み替え体ＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させた。５つの独立に実施された実験および平均のそれぞれについて、ｍＣｈｅｒｒｙ発現（Ａ）およびＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色（Ｂ）によってそれぞれ決定した、感染細胞および生存細胞の割合を示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応ありｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図12】新たなＤｅｌ部位組換え体ＶＣｈ１２６ＧＦＰによる、ヒトｍｏＤＣｓの活性化。５人の異なるドナーのｍｏＤＣｓを、ＶＣｈ１２６ＧＦＰおよび参照組み替え体ＶＣｈＤ１２ＧＦＰに感染させた。感染細胞の割合をｍＣｈｅｒｒｙ発現によって決定し、非感染細胞に対して正規化することにより、フローサイトメトリーを経て、ＣＤ４０（ａ）、ＣＤ８０（ｂ）、ＣＤ８３（ｃ）、ＣＤ８６（ｄ）およびＨＬＡ－ＤＲ（ｅ）によるｍｏＣＤｓの相対的な活性化の分析が可能となった。５つの独立に実施された実験および平均のそれぞれについて、発現強度の変化を示す。統計解析は、９５％の信頼区間を持つ対応ありｔ検定を用いて行った：ｎｓ＝ｐ≧０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図13】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦＶ組換え体によって刺激された体液性および細胞性免疫応答。Ｎ－またはＳ１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を発現する１０７ＰＦＵのコントロールのＯＲＦＶ組換え体、またはＯＲＦ１２６欠失を含むＯＲＦＶベクターにより、２週間の間隔で２回、ＣＤ１マウスを免疫した。Ａ）－Ｂ）ＯＲＦＶベクターによって誘導されたＮ－およびＳ１－特異的結合総ＩｇＧを、２回目の免疫化後に、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｃ）脾臓細胞においてＯＲＦＶベクターによって引き起こされたＳ１－特異的細胞性応答を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ測定によって測定した。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較試験による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、コントロールのＯＲＦＶ群と比較した結合抗体エンドポイント力価間の差、またはＩＦＮ－γスポット形成ユニット（ＰＦＵ）間の差、を評価した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】