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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-05
(54)【発明の名称】重鎖のみ抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231225BHJP
C12N 15/01 20060101ALI20231225BHJP
A01K 67/027 20240101ALI20231225BHJP
C12N 5/0781 20100101ALI20231225BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C12N15/01 Z ZNA
A01K67/027
C12N5/0781
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023560255
(86)(22)【出願日】2021-12-08
(85)【翻訳文提出日】2023-08-09
(86)【国際出願番号】 US2021072809
(87)【国際公開番号】W WO2022126113
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】20212890.6
(32)【優先日】2020-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523220385
【氏名又は名称】トリアンニ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100163784
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 健志
(72)【発明者】
【氏名】ワブル，マティアス
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
(57)【要約】
内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、Ｂ細胞が重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）の多様なレパートリーを発現するマウスを生産する方法であって、前記Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）の多様なレパートリーをＢ細胞が発現するマウスを生産する方法であって、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、上記方法。
【請求項2】
マウスが、抗原で免疫化されると、抗原特異的Ｂ細胞を活性化し、多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するプラズマ細胞へのそれらの分化を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に、好ましくは、配列番号７を含む内因性Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に位置付けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｃγ１遺伝子セグメントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＣＨ１ドメインの少なくとも一部が、ＢｉＰシャペロン結合ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
マウスが、不活性化または欠失した内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、好ましくは、マウスが、内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
内因性Ｃμ遺伝子セグメントが不活性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
内因性Ｃμ遺伝子セグメントが、機能喪失突然変異、Ｃμ遺伝子セグメントの一部の欠失、または１つもしくは複数の停止コドンを導入する１つもしくは複数の突然変異によって不活性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列、ならびに前記ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列と作動可能に連結している発現制御配列を含み、好ましくは、該発現制御配列がマウスのものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列が、抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換えられ、それにより、所定のＢ細胞において組み換えられたＶＨコード配列が得られ、該Ｂ細胞は、形質細胞へと分化すると、組み換えられたＶＨコード配列によってコードされる抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ａ）マウス胚性幹細胞を用意するステップと、ｂ）１つまたは複数の発現カセット内のＣγ遺伝子セグメントを含む核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを用意するステップと、
ｃ）該１つまたは複数のベクターを該細胞に導入するステップと、
ｄ）トランスジェニック細胞を選択するステップであって、ｂ）の配列が、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、ターゲティングされた組み入れによって該細胞の細胞ゲノムに組み込まれており、Ｃμ遺伝子セグメントが場合により不活性である、ステップと、
ｅ）該トランスジェニック細胞を利用して、該トランスジェニック細胞から誘導されたトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれかに記載の方法によって取得可能なマウスであって、その内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内に、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流のトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、マウス。
【請求項13】
少なくとも２つのＶＨ、２つのＤ、および２つのＪＨであるヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列のレパートリーを含むＶＨ重鎖遺伝子座を含む、請求項１２に記載のマウス。
【請求項14】
内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、請求項１２または１３に記載のマウス。
【請求項15】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なマウスに由来するＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現するＢ細胞レパートリー。
【請求項16】
ＶＨドメインの異なる様々な抗原特異的ＨＣＡｂを発現する、請求項１５に記載のＢ細胞レパートリー。
【請求項17】
抗原特異的ＶＨドメインを含む抗体を生産する方法であって、ａ）抗原でマウスを免疫化するステップであって、該マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、それにより、抗原特異的ＨＣＡｂを発現する細胞のレパートリーをもたらす、ステップと、
ｂ）レパートリーから、抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを発現する細胞を選択するステップと、
ｃ）ＨＣＡｂから抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列を決定するステップと、
ｄ）抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法。
【請求項18】
Ｂ細胞レパートリーまたはＶＨを含む分子のレパートリーの生産のための方法における、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のマウスの使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）コンストラクト、ＨＣＡｂを発現するトランスジェニックマウス、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでそれらを生産する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体は、（ｉ）多様な分子形態の抗原をターゲティングすることができる精緻な結合特性を呈し、（ｉｉ）望ましい薬物動態を有するため、処置されたヒトおよび動物において良好に忍容される生理学的分子であり、かつ（ｉｉｉ）感染因子を自然に撃退する強力な免疫学的特性に関連付けられることから、重要な生物学的医薬として出現した。さらに、体内に自然状態では存在しない事実上あらゆる異物に対する特異的抗体応答を容易に展開することができる抗体を実験室動物から迅速に単離するための確立された技術が存在する。
【0003】
抗体は、その最も基本的な形態では、同一の軽（Ｌ）鎖と各々が対になった、２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されている。Ｈ鎖およびＬ鎖の両方のＮ末端は、可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）からなり、これらが合わさって、独特な抗原結合特異性を有する対になったＨ－Ｌ鎖をもたらす。抗体のＶＨおよびＶＬドメインをコードするエキソンは、生殖系列ＤＮＡには存在しない。代わりに、各ＶＨエキソンが、Ｈ鎖遺伝子座（Ｉｇｈ）に存在するランダムに選択されたＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの組換えによって生成される。同様に、個々のＶＬエキソンは、軽鎖遺伝子座（Ｉｇｌ）におけるランダムに選択されたＶおよびＪ遺伝子セグメントの染色体再構成によって産生される（マウスＩｇｈ遺伝子座、Ｉｇｌカッパ遺伝子座（ＩｇｋまたはＩｇκ）およびＩｇラムダ遺伝子座（ＩｇｌまたはＩｇλ、図１）の概略図を参照されたい（Ｔｏｎｅｇａｗａ、Ｎａｔｕｒｅ、３０２：５７５、１９８３；Ｂａｓｓｉｎｇら、Ｃｅｌｌ、１０９補遺：Ｓ４５、２００２）。マウスゲノムは、Ｈ鎖を発現することができる２つの対立遺伝子（各親から１つの対立遺伝子）、カッパ（κ）Ｌ鎖を発現することができる２つの対立遺伝子、およびラムダ（λ）Ｌ鎖を発現することができる２つの対立遺伝子を含む。Ｈ鎖遺伝子座には、複数のＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントがあり、また、両方のＬ鎖遺伝子座には、複数のＶおよびＪ遺伝子がある。各免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のＪ遺伝子の下流には、抗体の定常領域（Ｃ）をコードする１つまたは複数のエキソンが存在する。重鎖遺伝子座には、異なる抗体クラス（アイソタイプ）の発現のためのエキソンも存在する。マウスでは、コードされるアイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、およびＩｇＡであり、ヒトでは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２である。
【0004】
胎児肝臓および成体骨髄におけるＢ細胞の発達中、Ｈ鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントを含む２つの相同染色体のうちの１つでまず遺伝子再構成が起こる。ｐｒｅ－Ｂ細胞では、結果として生じたＶＨエキソンがその後、μＨ鎖の定常領域をコードするエキソンにＲＮＡレベルでスプライスされる。ｐｒｅ－Ｂ細胞によって合成されるμＨ鎖のほとんどは、小胞体（ＥＲ）に保持され、μＨ鎖の部分的にアンフォールドしたＣＨ１ドメインと常在性ＥＲシャペロンＢｉＰとの間の非共有結合性相互作用によって最終的に分解される（ＨａａｓおよびＷａｂｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３０６：３８７～９、１９８３；Ｂｏｌｅら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０２：１５５８、１９８６）。しかしながら、ごく一部のμ鎖は、インバリアントなλ５およびＶｐｒｅＢタンパク質から構成されるサロゲート軽鎖複合体と会合し、ＢｉＰを置き換え、μＨ鎖／λ５／ＶｐｒｅＢ複合体が、Ｉｇα／βシグナル伝達分子と一緒に、ｐｒｅＢ細胞受容体（ｐｒｅＢＣＲ）としてＥＲを出て、分泌経路を通って形質膜まで移動することを可能にする（Ｕｂｅｌｈａｒｔら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９３：３、２０１６）。
【0005】
その次に、１つのＬ鎖対立遺伝子において、機能的なＬ鎖が産生されるまでの時間でＶＪ再構成が起こり、その後、Ｌ鎖ポリペプチドが、ＢｉＰを完全に置き換え、μＨ鎖と会合して、抗原の完全に機能的なＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を形成することができ、それによって未成熟型Ｂ細胞が形成される。
【0006】
不完全にアセンブルされたＩｇ分子の細胞表面発現または分泌を防止するＥＲのクオリティコントロール機構はかなり厳密であり、したがって、ＨＬ、ＨＨＬ、またはＨＨなどの分子は、完全なＨ２Ｌ２構造へのアセンブリによってレスキューされなければ、通常ＥＲに保持され、分解される（この系は、主にＩｇＨ鎖の保持に重点を置くため、遊離Ｌ鎖がしばしば分泌され得る）。しかしながら、重鎖病（ＨＣＤ）と呼ばれる稀なＢ細胞増殖性障害では、遊離したモノクローナルＨ鎖が分泌され得ることが数十年にわたって知られている（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３７：３３２、１９６４）。ＨＣＤにおけるＨ鎖は切断されており、その後の構造研究は、ＣＨ１ドメインがほとんどの場合で欠失していることを示した（Ｃｏｒｃｏｓら、Ｂｌｏｏｄ、１１７：６９９１、２０１１）。機構的に、ＣＨ１欠失は、ＢｉＰとの抑制性相互作用からＨ鎖を自由にし、したがってその分泌を可能にし、また、Ｌ鎖とのジスルフィド結合による共有結合性会合を防止し、したがってＨＣＤタンパク質はＨＨ二量体である。重鎖のみ抗体（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ Ａｂｓ；ＨＣＡｂ）は、疾患以外の状況でも見出されることがある。ｉ）通常のラクダの血清ＩｇＧのおよそ７５％はＨＣＡｂからなり、これは、ＣＨ１ドメインを欠いており、また、ＶＬドメインとの効果的な会合を防止する構造的に改変されたＶＨドメインを有する（ｄｅ ｌｏｓ Ｒｉｏｓら、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３３：２７、２０１５）。ｉｉ）κおよびλの両方のＬ鎖遺伝子座が不活性化されたマウスは、血清ＩｇＧを依然として生産するが、この抗体の生産には、Ｂ細胞ＤＮＡにおけるＣＨ１ドメインをコードするエキソンの欠失をもたらす、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）におけるエラーが必要である（Ｚｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０４：３２７１、２００７）。
【0007】
ＨＣＡｂは、安定性が高く、従来の免疫グロブリンよりも小さいため、治療薬として魅力的である。ＶＬ抗原結合部分によって妨げられない、この分子のＶＨ抗原結合部分は、さもなければ従来の抗体がアクセスできない、ウイルスおよびＧ結合タンパク質受容体上の酵素活性部位およびエピトープを含む、タンパク質構造のポケット内のエピトープを認識することができる。例えば、内因性ＶＨ遺伝子がラクダＶＨ遺伝子に置換され、ＣＨ１コードエキソンが欠失しているマウスから誘導されたラクダベースのＨＣＡｂは、そのような抗体の潜在的な供給源である。しかしながら、そのようなＨＣＡｂには、それらが治療薬として使用される可能性のあるヒトおよび他の動物においてラクダＶＨドメインが免疫原性であるという不利点がある。内因性ＶＨ遺伝子が、対応するヒトのものに置換されているマウスが存在し、κおよびλＬ鎖遺伝子座の不活性化と組み合わせて、ＨＣＡｂの供給源となり得る。しかしながら、そのような抗体の生産は、免疫応答中のＣＳＲにおける比較的低頻度のエラーに依存し、したがって効率的ではない。
【0008】
重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖が対になった従来の抗体の結合部位の大きさは、ターゲットエピトープの溝または凹部に適合するには大きすぎる場合がある。ＨＣＡｂの結合部位の幅の縮小は、「困難な」エピトープ、例えば、酵素の活性部位にアクセスするのに役立ち得る。別の使用において、ＨＣＡｂは、二重特異性抗体の生産を容易にする。Ｌ鎖が存在しないことにより、特異性の喪失をもたらす「Ｌ鎖スクランブリング」が防止される。Ｌ鎖を伴わないＨ鎖からなる（ヒト）免疫グロブリンを生産するトランスジェニックマウスは、所望の抗原特異性を有するそのような抗体の発見に有用である。
【0009】
しかしながら、上述のように、軽鎖の非存在下では、自然状態の重鎖は形質細胞によって分泌されない。これは、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインがシャペロンタンパク質ＢｉＰに結合され、したがって小胞体の内腔に留められるためである。重鎖病におけるような、またはエンジニアリングによる、ＣＨ１の欠失は、ジスルフィド結合した二量体としてのＨ鎖の分泌を可能にする。
【0010】
アイソタイプスイッチ、アイソタイプ転換、またはクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）としても知られる免疫グロブリンクラススイッチは、Ｂ細胞による免疫グロブリンの生産を、アイソタイプＩｇＭからアイソタイプＩｇＧなど、１つのアイソタイプから別のものに変化させる生物学的機構である。このプロセスにおいて、抗体重鎖の定常領域部分は変化するが、重鎖の可変領域は同じ状態を保つ。可変領域が変化しないため、クラススイッチは抗原特異性に影響しない。その代わり、抗体は、同じ抗原への親和性を保持するが、そのＦｃ領域を介して、異なるエフェクター分子と相互作用し得る。
【0011】
クラススイッチは、膜結合抗体分子（Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）を介した成熟型Ｂ細胞の活性化後に起こり、様々なクラスの抗体を生成し、これらはすべて、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスの結果として未成熟型Ｂ細胞によって発現される元の抗体と同じ可変ドメインをもつが、重鎖に異なる定常ドメインを有する。
【0012】
ナイーブ野生型成熟型Ｂ細胞は、野生型免疫グロブリン遺伝子座における最初の２つの重鎖セグメントであるＩｇＭ（Ｃμ）およびＩｇＤ（Ｃδ）の両方を生産する。抗原による活性化の後、これらのＢ細胞は増殖する。これらの活性化Ｂ細胞がＣＤ４０およびサイトカイン受容体（両方ともＴヘルパー細胞によってモジュレートされる）を介して特定のシグナル伝達分子に遭遇すると、抗体クラススイッチが起こり、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥ抗体が生産される。クラススイッチ中、免疫グロブリン重鎖の定常領域は変化するが、可変領域、したがって抗原特異性は同じ状態を保つ。そのため、同じ活性化Ｂ細胞由来の異なる娘細胞が、異なるアイソタイプまたはサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）の抗体を生産することができる。
【0013】
細胞培養下でＨＣＡｂを生産するための様々な免疫グロブリン修飾形態が想定され、エンジニアリングされ得るが、重鎖のみ（ＨＣＯ）のトランスジェニックマウスの場合、Ｂリンパ球の発達を念頭に置く必要がある。Ｂ細胞は、造血幹細胞からｐｒｏ－Ｂ、ｐｒｅ－Ｂおよび未成熟型Ｂ細胞への分化によって日々生成されている。修飾された免疫グロブリンがこの分化順序をサポートしなければ、Ｂ細胞は生成されない。
【0014】
ラマ、トランスジェニックマウスおよびラットにおけるＨＣＯ抗体の報告は、Ｈ鎖がＬ鎖と対にならないＢ細胞が発生し得ることを示した。しかしながら、ＣＨ１が欠失する必要があり、ラマでは、Ｌ鎖を伴わないＨ鎖は、カノニカルなＶＨ領域のものとは異なるＶＨ構造を有する。後者の事実は、すべてのヒトＶＨドメインがＨＣＯ Ｂ細胞の発達をサポートするとは限らないことを示した。
【0015】
ＷＯ２０１９０１８７７０Ａ１は、ＶＨドメインならびに免疫グロブリン定常ドメインＣＬおよびＣＨ１からなる抗原結合部を含む単鎖ＶＨ抗体を開示する。
ＷＯ２０１４／１４１１９２Ａ２は、重鎖のみ抗体およびそれを生産するトランスジェニック非ヒト動物の生成を開示する。そのような抗体では、ＣＨ１ドメインが欠如している。
ＷＯ２０１４／１４１１９２Ａ２は、重鎖のみ抗体およびそれを生産するトランスジェニック非ヒト動物の生成を開示する。そのような抗体では、ＣＨ１ドメインが欠如している。
【0016】
ＵＳ８７５４２８７Ｂ２は、ＣＨ１ドメインが欠如した重鎖抗体を生産するマウス、およびＣＨ１ドメインをコードする核酸を欠失させる生殖系列修飾を含むトランスジェニックマウスを開示する。
【0017】
ＶＪＣＬノックアウトニワトリにおける会合した軽鎖をもたない重鎖のみ抗体の発現が、Ｓｃｈｕｓｓｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４６：２１３７、２０１６）によって説明されている。
【0018】
Ｋｌｅｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：１４７３、１９７９）は、軽鎖の単離された可変ドメインおよび定常ドメインと、免疫グロブリンＧのＦｄ’フラグメントとの相互作用を説明している。
【0019】
ＷＯ２０１１／０７２２０４Ａ１は、機能的なＣμセグメントを含むトランスジェニックマウスを開示する。結果として、抗原受容体としてカノニカルなＩｇＭを有する成熟型Ｂ細胞が正常に発達する。しかしながら、ゲノムの下流Ｃγセグメントでは、ＣＨ１ドメインが欠如している。免疫応答中に抗体のクラスが（所望の）γ鎖にスイッチすると、これらの鎖はＬ鎖と対になることができない。Ｈ鎖クラススイッチにおいて、ＶＨは維持されるが、ＣＨは交換される。これには２つの効果がある：（ｉ）特異性がＨ鎖とＬ鎖の組み合わせによって定義された抗体をもつ細胞が、もはや刺激されず、死ぬことになり、（ｉｉ）不対ＶＨは構造的に存続不可能であるため、特異性がＨ鎖によって主に定義された細胞が死ぬ可能性がある。したがって、このマウスでは、ＶＨの選択が「延期される」、すなわち免疫応答中に起こる。
【0020】
ＷＯ２００７０９６７７９Ａ２は、クラス特異的重鎖のみ抗体の生産のためのトランスジェニックマウスの使用を説明しており、前記マウスは、複数の異種ＶＨ重鎖遺伝子座を含み、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、１つまたは複数のＶ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＤ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＪ遺伝子セグメント、および発現したときにＣＨ１ドメインを含まない重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含む。
【0021】
ＷＯ２００９０１３６２０Ａ２は、ヒトＶセグメントをマウス重鎖遺伝子座に組み込むことによる、完全にヒトの可溶性ＶＨドメインの生産を説明しており、ここで、マウスＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、ヒト由来のＶ、ＤおよびＪセグメントに置換され、免疫グロブリン重鎖エフェクター定常領域は、ＣＨ１を欠いている免疫グロブリン重鎖エフェクター定常領域に置換される。
【0022】
ＷＯ２０１５１４３４１４Ａ２は、重鎖定常領域遺伝子配列の免疫グロブリン定常領域ＣＨ１遺伝子における欠失と、少なくとも１つの非再構成ＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの非再構成ＪＬ遺伝子セグメントによる１つまたはすべての内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの置換とを含むマウスを説明している。
【0023】
ＷＯ２０１９１８４０１４Ａ１は、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの代わりに免疫グロブリン遺伝子座に導入され、ＣＨ１ドメインの欠失（図１参照）を含むトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含むマウスを説明している。ＥＰ２４１１４０８Ｂ１およびＵＳ９３５３１７９Ｂ２は、ランダムに組み入れられたＶＨおよびＶＨＨ遺伝子座を含むトランスジェニックマウスを説明している。ランダムに組み入れられた免疫グロブリンの（および他の）遺伝子座の問題、すなわち挿入された導入遺伝子の非生理学的レベルの発現および不安定性（喪失または機能のサイレンシング）は、前世紀の８０年代から記録されてきた。
【0024】
ＨＣＡｂの安定な生産のための効率的で対費用効果の高い方法が必要とされている。より具体的には、抗原特異的ＨＣＡｂを生産することが可能なトランスジェニック非ヒト動物が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0025】
この概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される特定の概念を簡略化された形態で紹介するために提供される。この概要は、特許請求される主題の重要または本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、特許請求される主題の範囲を限定するために使用されることを意図したものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、用途、および利点は、添付の図面に示され、添付の特許請求の範囲で定義される態様を含め、以下の詳細な説明の記述から明らかとなるであろう。
【0026】
本発明の目的は、トランスジェニック動物においてか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養においてかを問わず、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）およびかかる様々なＨＣＡｂを発現するＢ細胞レパートリーを効率的かつ容易に生産するための手段、コンストラクト、および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0027】
この目的は、本件の特許請求の範囲の対象によって、また本明細書にさらに記載されるように解決される。
本発明によれば、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、Ｂ細胞が重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）の多様なレパートリーを発現するマウスを生産する方法が提供され、ここで、Ｃγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む。
本発明によれば、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、Ｂ細胞が重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）の多様なレパートリーを発現するマウスを生産する方法が提供され、ここで、Ｃγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む。
【0028】
具体的には、前記マウスを抗原で免疫化すると、マウスは、多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するＢ細胞レパートリーを発現する。具体的には、抗原でマウスを免疫化すると、抗原特異的Ｂ細胞が、抗原特異的ＨＣＡｂを分泌する形質細胞へと分化する。
【0029】
具体的には、抗原で免疫化されると、マウスは、抗原特異的Ｂ細胞を活性化し、多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するプラズマ細胞へのそれらの分化を誘導する。
具体的には、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、抗原で免疫化されると多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するＢ細胞レパートリーを発現するマウスを生産する方法が提供され、ここで、Ｃγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む。
具体的には、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、抗原で免疫化されると多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するＢ細胞レパートリーを発現するマウスを生産する方法が提供され、ここで、Ｃγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む。
【0030】
野生型Ｂ細胞では、ＩｇＭおよびＩｇＤが共発現されるが、これは成熟型Ｂ細胞では末梢（脾臓など）で起こり、骨髄で発達しているＢ細胞では起こらない。不活性化されたＣμ遺伝子セグメントの下流に位置するＣγ遺伝子セグメントは、Ｂ細胞の発達中に発現されない可能性がある。Ｂ細胞の発達にはＩｇ重鎖が必要であるため、不活性化されたＣμ遺伝子セグメントの下流にＣγ遺伝子セグメントを含むマウスは、Ｂ細胞をまったく作らない可能性がある。Ｃγ遺伝子セグメントがＣμ遺伝子セグメントの代わりにＩｇ重鎖遺伝子座に導入された場合、ミスフォールドしたデルタ重鎖が小胞体（ＥＲ）に存在することになるため、軽鎖依存性であるＩｇＤの共発現は、Ｂ細胞にとって有害となり得る。これによりＥＲストレスが生じ、アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）が活性化する可能性がある。ＵＰＲは、タンパク質の恒常性を回復させることを目的とし、回復されなければ、Ｂ細胞はアポトーシス細胞死を起こす。具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントの内因性位置の上流にＣγ遺伝子セグメントを位置付けることにより、ｐｒｅ－Ｂ細胞は、Ｃγ含有ｐｒｅＢＣＲを発現する。これには、軽鎖なしで安定に発現され得るＶＨ－Ｃγ重鎖の正の選択が生じるという著しい利点がある。軽鎖と二量化しない不安定であるバージョンのＶＨ－Ｃγ重鎖を発現するＰｒｅ－Ｂ細胞は、ｐｒｅＢＣＲを形成することができず、したがって選択から除外され、ＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現する改善されたＢ細胞レパートリーがもたらされる。
【0031】
具体的には、該マウスは、前記Ｂ細胞レパートリーを生産することが可能である、かかる組換え免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む細胞を含む。
具体的には、少なくとも欠失しているＣＨ１ドメインの前記一部は、ＣＨ１ドメインの全部または一部、特に、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列全体の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、または１００％のうちのいずれか１つを含む。具体的には、Ｃγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の欠失を含み、該一部はシャペロン結合ドメインであり、特に、前記一部は、ＢｉＰに結合された１つまたは複数のアミノ酸である。
具体的には、少なくとも欠失しているＣＨ１ドメインの前記一部は、ＣＨ１ドメインの全部または一部、特に、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列全体の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％、または１００％のうちのいずれか１つを含む。具体的には、Ｃγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の欠失を含み、該一部はシャペロン結合ドメインであり、特に、前記一部は、ＢｉＰに結合された１つまたは複数のアミノ酸である。
【0032】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＨＣＡｂは、ＣＨ１ドメインを欠いており、特にＩｇＧ ＣＨ１ドメインを欠いている。特定の実施形態によれば、該マウスはＣＨ１ドメインの一部を発現することが可能であり得るが、該一部は、ＣＬドメインと対になることが可能である機能的なＣＨ１ドメインを含まない。
【0033】
さらなる特定の実施形態によれば、本明細書に記載されるＨＣＡｂは、シャペロン結合ドメイン、特にＢｉＰシャペロン結合ドメインが欠如したＣＨ１ドメインを含む。具体的には、該マウスは、ＣＨ１ドメインの少なくともかかるシャペロン結合ドメインが欠失したＨＣＡｂを発現するようにエンジニアリングされる。
【0034】
本明細書に記載されるマウスの細胞によって分泌されるＨＣＡｂは、可溶性または膜結合型であり得る。ＣＨ１ドメインのすべてまたは少なくとも一部を欠失させることにより、発現されるＨＣＡｂは、重鎖のみ抗体コンストラクトの細胞表面発現または分泌を典型的に防止するＥＲクオリティコントロール機構によって小胞体（ＥＲ）内に保持されない。具体的には、ＥＲシャペロンＢｉＰは、本発明のＨＣＡｂをＥＲ内に保持しない。
【0035】
具体的には、Ｃγ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内でＥμメジャーイントロンエンハンサーの下流に、好ましくは、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内でＪコード配列の下流に位置する、具体的には配列番号７を含む、内因性マウスＥμメジャーイントロンエンハンサーの下流に位置付けられる。
【0036】
本明細書に記載されるように、Ｃγ遺伝子セグメントは、突然変異していてもしていなくてもよいＣμ遺伝子セグメントの上流に位置付けられる。具体的には、Ｃγ遺伝子セグメントは、野生型重鎖遺伝子座内でＣμ遺伝子セグメントが置かれる位置の上流に位置付けられる。具体的には、Ｃγ遺伝子セグメントは、本明細書に記載されるマウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で、Ｃμ遺伝子セグメントの上流かつＪＨ遺伝子セグメントの下流にある。
【0037】
ナイーブ野生型成熟型Ｂ細胞は、野生型免疫グロブリン遺伝子座における最初の２つの重鎖セグメントであるＩｇＭ（Ｃμ）およびＩｇＤ（Ｃδ）の両方を生産する。本明細書に記載されるように、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内でＣμ遺伝子セグメントの上流にＣγ遺伝子セグメントを位置付けることにより、本明細書に記載されるマウスのナイーブ成熟型Ｂ細胞がＩｇＧ型のＨＣＡｂを生産し、抗原による活性化の後、これらのＢ細胞が増殖する。驚くべきことに、本明細書に記載される免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞は、正常に発達し、ＩｇＧ型の膜結合型または可溶性ＨＣＡｂを生産することができる。したがって、本発明は、ＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現する改善されたＢ細胞レパートリーを提供する。
【0038】
具体的には、ＩｇＧ型のＨＣＡｂは、ＩｇＧフレームワーク、特にヒトまたはマウスのフレームワークを含むＶＨドメイン、および／またはＩｇＧ抗体のものである抗体定常ドメインによって特徴付けられる。具体的には、ＩｇＧ型のＨＣＡｂは、任意のＩｇＧサブタイプ、例えば、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｃ、ＩｇＧ２ｂ、もしくはＩｇＧ３サブタイプのいずれか、またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプのいずれかのものである。
【0039】
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流に組み入れられ、したがって、Ｃγ遺伝子セグメントが免疫グロブリン重鎖遺伝子座内でＣμ遺伝子セグメントの下流に置かれる、野生型細胞におけるそれぞれの場所とは異なる場所にある。
【0040】
特定の実施形態において、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメント、具体的には、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失によって修飾され、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で、それが天然には見出されない場所、すなわち内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流に組み込まれたマウスＣγ遺伝子セグメントは、内因性核酸配列から誘導される。
【0041】
異なる特定の態様によれば、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、合成核酸などの外因性核酸であり、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流に組み入れられる。
【0042】
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、哺乳動物由来のもの、好ましくは齧歯類由来のもの、最も好ましくはマウス由来のものである。
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、ヒト由来のものである。
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、ヒト由来のものである。
【0043】
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、トランスジェニックＣγ１、Ｃγ２ａ／ｃ、Ｃγ２ｂ、もしくはＣγ３遺伝子セグメントを含むか、またはそれからなる。
【0044】
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、トランスジェニックＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、もしくはＣγ４遺伝子セグメントを含むか、またはそれからなる。
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスまたはヒトのＣγ１遺伝子セグメントである。
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスまたはヒトのＣγ１遺伝子セグメントである。
【0045】
具体的には、本明細書に記載されるマウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座、特に、マウスゲノム内で内因性位置にあるものである。
【0046】
本明細書で提供される方法の特定の態様によれば、本明細書に記載されるマウスまたは本明細書に記載されるＢ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＣμ遺伝子セグメントは、不活性である。具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、機能喪失突然変異、例えば、停止コドンの導入、またはＣμ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列の一部の欠失により、不活性である。好ましくは、Ｃμ遺伝子セグメントは全体的に欠失するのではなく、その一部のみが欠失する。具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインの欠失によって不活性である。
【0047】
ある特定の場合では、遺伝子座が転写されるとき、ＶＤＪエキソンがＣμ遺伝子セグメントにスプライスされる。これは、軽鎖依存性μ重鎖の生産をもたらし得る。具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントを不活性にすることにより、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーの質がさらに改善される。
【0048】
具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、内因性Ｃμ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列全体、または前記配列の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％のうちのいずれか１つであるその一部の欠失により、不活性である。
【0049】
具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、好ましくはそのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのいずれか１つまたはすべてに、機能喪失突然変異、欠失、または不活性化突然変異、好ましくは停止コドンの導入を含む。好ましくは、Ｃμ遺伝子セグメントは、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに停止コドンを含む。
【0050】
本明細書で提供される方法の特定の態様によれば、本明細書に記載されるマウスまたは本明細書に記載されるＢ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるμスイッチ（Ｓ）領域は、不活性である。具体的には、本明細書に記載されるマウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性Ｉｇｈ遺伝子座内に典型的に存在するμスイッチ（Ｓ）領域をコードするヌクレオチド配列の機能喪失突然変異、欠失、または不活性化突然変異を含む。具体的には、機能的なＳ領域をもたないＩｇｈ遺伝子座は、アイソタイプスイッチを起こすことができない。
【0051】
具体的には、本明細書に記載されるＢ細胞がアイソタイプスイッチを起こした場合、軽鎖依存性重鎖アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥが生産される可能性がある。これは、本明細書に記載されるＢ細胞の死をもたらし得る。したがって、アイソタイプスイッチを防止することにより、Ｂ細胞レパートリーをさらに改善することができる。
【0052】
特定の実施形態において、さらなる重鎖アイソタイプのＣＨドメインが、好ましくは機能喪失突然変異、欠失、または不活性突然変異の導入により、不活性化される。具体的には、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座の定常領域遺伝子セグメントは、好ましくはそれらのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのいずれか１つまたはすべてに、機能喪失突然変異、欠失、または不活性化突然変異、好ましくは停止コドンの導入を含む。
【0053】
特定の態様によれば、本明細書に記載される方法に従って生産されたマウスは、不活性化または欠失した内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。具体的には、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスは、内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む。そのようなマウスは、軽鎖をもたないＨＣＡｂを発現することによって特徴付けられる。
【0054】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法に従って生産されたマウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列、ならびにＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列の発現を制御するように作動可能に連結している発現制御配列を含む。具体的には、発現制御配列はマウスのものである。
【0055】
本明細書で提供される方法の特定の態様では、Ｂ細胞の発達中に、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列が、ＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換わる。発達している各Ｂ細胞は、組換えおよびＨＣＡｂとしての発現のために、１つのＶＨ、１つのＤ、および１つのＪＨ遺伝子セグメントをランダムに選択する。成熟すると、マウスにおける数百万のＢ細胞の各々が、特定の抗原を認識し、その抗原に遭遇すれば活性化される。
【0056】
具体的には、ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列は、抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換えられ、それにより、所定のＢ細胞において組み換えられたＶＨコード配列が得られ、このＢ細胞は、組み換えられたＶＨコード配列によってコードされる抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能である。
【0057】
具体的には、ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列は、抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換えられ、それにより、Ｂ細胞において組み換えられたＶＨコード配列が得られ、このＢ細胞の子孫は、組み換えられたＶＨコード配列によってコードされる抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能である。
【0058】
具体的には、ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列は、抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換えられ、それにより、Ｂ細胞において組み換えられたＶＨコード配列が得られ、このＢ細胞は、形質細胞、特にプラズマ細胞へと分化すると、組み換えられたＶＨコード配列によってコードされる抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能である。
【0059】
本明細書で提供される方法の特定の態様では、本明細書に記載されるマウスが抗原で免疫化された後、その抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＢ細胞は、活性化し、抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能な形質細胞へと分化する。
【0060】
具体的には、本明細書に記載されるマウスのＢ細胞によって分泌されるＨＣＡｂは、抗原特異的ＶＨ結合ドメインと、ＣＨ１ドメインを欠いているかまたはＣＨ１ドメインの一部のみを含むかもしくはそれからなるＩｇＧ定常領域とを含むか、またはそれらからなる。具体的には、ＣＨ１ドメインの前記一部は、シャペロン結合ドメインを欠いており、好ましくは、ＣＨ１ドメインからＢｉＰシャペロン結合ドメインが欠如している。
【0061】
本明細書ではさらに、ＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現するＢ細胞レパートリーが提供される。具体的には、Ｂ細胞レパートリーは、本明細書に記載される方法によって取得されたマウスに由来するＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現する。本明細書に記載されるマウスが前記Ｂ細胞レパートリーを含んでもよく、またはＢ細胞レパートリーがマウスから単離されてもよい。Ｂ細胞レパートリーは、Ｂ細胞のライブラリー、または前記Ｂ細胞レパートリーに由来する核酸分子のライブラリーの形態で提供され得る。それぞれのライブラリーは、抗原結合特性を発現する分子のスクリーニングを可能にするディスプレイ系を用いて提供され得る。具体的には、そのような核酸分子のライブラリーは、様々なＨＣＡｂ、またはそのようなＨＣＡｂのＶＨ結合部位を含むそれぞれの抗原結合分子をコードする。特定の態様によれば、そのような核酸分子のライブラリーは、ＶＨ抗原結合部位または結合特性の異なるＶＨドメインを含むかまたはそれからなる抗原結合分子のライブラリーを生産する方法において使用され得る。
【0062】
具体的には、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーは、その（ＶＨ）抗原結合部位の異なる様々なＨＣＡｂを発現することが可能であり、例えば、それにより、親和性成熟型もしくは別様に最適化された抗体バリアントの生産のような、抗体などの様々な抗原結合分子（この様々なものは、同じ抗原もしくはエピトープを認識する）の生産、または、ターゲット抗原（ただし、かかるターゲット抗原の様々なエピトープ）を特異的に認識する抗体の生産が可能になる。
【0063】
特定の態様によれば、本明細書に記載されるライブラリー、例えば、Ｂ細胞のライブラリー、または核酸分子もしくは抗原結合分子のそれぞれのライブラリーを好適にスクリーニングすることができ、ライブラリーメンバーを所望の構造特性または機能特性に従って選択して、選択されたライブラリーメンバーのＶＨ結合部位を含む抗原結合分子を識別し、生産することができる。このような本明細書に記載されるライブラリーは、好適にスクリーニングすることができ、個々のライブラリーメンバーを所望の構造特性または機能特性に従って選択して、抗原結合分子、特に抗体生成物を生産することができる。
【0064】
具体的には、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーは、ＶＨドメインの異なる抗原特異的様々なＨＣＡｂを発現することが可能である。
特定の態様において、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーは、抗体または抗体フラグメント、特に、本明細書に記載される様々なＨＣＡｂを発現し、この様々なものは、同じターゲット抗原またはエピトープを各々が特異的に認識する多様な抗体または抗体フラグメントを含む。具体的には、Ｂ細胞レパートリーは、本明細書に記載されるマウスが抗原で免疫化された後、抗原特異的抗体または抗体フラグメントを発現する。特定の態様によれば、同じターゲット抗原またはエピトープを認識する多様な抗体を含むかまたはカバーする抗体ライブラリーが本明細書で提供される。
特定の態様において、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーは、抗体または抗体フラグメント、特に、本明細書に記載される様々なＨＣＡｂを発現し、この様々なものは、同じターゲット抗原またはエピトープを各々が特異的に認識する多様な抗体または抗体フラグメントを含む。具体的には、Ｂ細胞レパートリーは、本明細書に記載されるマウスが抗原で免疫化された後、抗原特異的抗体または抗体フラグメントを発現する。特定の態様によれば、同じターゲット抗原またはエピトープを認識する多様な抗体を含むかまたはカバーする抗体ライブラリーが本明細書で提供される。
【0065】
特定の態様において、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーは、抗体または抗体フラグメント、特に、本明細書に記載される様々なＨＣＡｂを発現し、この様々なものは、異なるターゲット抗原を認識する多様な抗体を含む。そのようなレパートリーは、各々に複数のエピトープがある多くの異なるターゲット抗原を有するウイルスまたは細菌などの複雑な多成分抗原による免疫化によって取得することができる。特定の態様によれば、異なるターゲット抗原を認識する多様な抗体を含むかまたはカバーする抗体ライブラリーが本明細書で提供される。
【0066】
特定の態様によれば、本発明は、いかなる軽鎖も欠いている様々な抗体または抗体フラグメントを発現するＢ細胞のレパートリーを提供する。具体的には、本発明は、同じターゲット抗原または異なるターゲット抗原を各々が特異的に認識する、本明細書に記載される様々なＨＣＡｂを発現するＢ細胞のレパートリーを提供する。具体的には、本明細書では、本明細書で提供される方法によって取得可能な、または取得された、Ｂ細胞レパートリーが提供される。具体的には、Ｂ細胞レパートリーは、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスによって発現される。
【0067】
具体的には、本明細書で言及される様々な抗原結合分子、例えば、本明細書に記載される様々なＢ細胞レパートリーまたはそれぞれのライブラリーは、様々な、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５または１０６個のうちのいずれか１つの抗原特異的分子、例えば抗体またはＨＣＡｂを含むか、またはカバーする。
【0068】
Ｂ細胞レパートリーの多様性は、例えば、Ｂ細胞レパートリーによって発現されるＨＣＡｂの多様性を示す、異なるＶＤＪ構成の数を決定するディープシーケンシングなどによって決定することができる。
【0069】
本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーは、本明細書に記載されるマウスによって生産されたＢ細胞における組み換えられたＶＨ配列のシーケンシングによって取得可能な、または取得された、核酸配列のレパートリーとして提供され得る。そのようなシーケンシングは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などのディープシーケンシング法を使用して行われ得る。ディープシーケンシングは、ゲノム領域を複数回、時には数百回またはさらには数千回シーケンシングすることを指す。このＮＧＳアプローチは、種々のＶＨドメインの核酸またはアミノ酸の配列を提供することを可能にする。
【0070】
特定の態様によれば、ＨＣＡｂの抗体ライブラリーが提供され、ここで、
ａ）前記抗体をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーから誘導されるか、または
ｂ）抗体は、哺乳動物のプラズマ細胞、好ましくは齧歯類由来のもの、特にマウス由来のものによって分泌される。
ａ）前記抗体をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーから誘導されるか、または
ｂ）抗体は、哺乳動物のプラズマ細胞、好ましくは齧歯類由来のもの、特にマウス由来のものによって分泌される。
【0071】
具体的には、このライブラリーは、本明細書に記載されるＢ細胞レパートリーのＢ細胞から前記抗体レパートリーをコードする遺伝子をクローニングすることによって、または、種々の哺乳動物のプラズマ細胞に抗体を分泌させることによって取得可能である。具体的には、哺乳動物のプラズマ細胞によって分泌される抗体は、哺乳動物のプラズマ細胞の由来の種に特徴的なグリコシル化パターンによって特徴付けられる。
【0072】
したがって、本発明はさらに、本明細書に記載される抗体、特に本明細書に記載される抗体のレパートリーを、かかる抗体を発現および分泌する哺乳動物のプラズマ細胞をエンジニアリングすることによって生産する方法を提供する。
【0073】
具体的には、哺乳動物のプラズマ細胞は、齧歯類、好ましくはマウスに由来する。
本明細書に記載される抗体が、例えば、非マウス動物、もしくはヒト由来、またはそれらの任意の組み合わせ、例えば、それぞれのヒト抗体ドメインをコードするヒト核酸配列を含む、マウス以外の種のそれぞれの配列を１つまたは複数用いて調製され得ることは、十分に理解される。
本明細書に記載される抗体が、例えば、非マウス動物、もしくはヒト由来、またはそれらの任意の組み合わせ、例えば、それぞれのヒト抗体ドメインをコードするヒト核酸配列を含む、マウス以外の種のそれぞれの配列を１つまたは複数用いて調製され得ることは、十分に理解される。
【0074】
ヒト抗体定常ドメインの配列は、当技術分野で周知であり、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）を含む様々なデータベースから取得することができる。ヒトＩｇＧ１定常ドメインエキソンのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３－Ｓ（Ｓは、分泌型のγ１ ＨＣをコードするＣＨ３エキソンの３’部分）の例示的な配列は、配列番号１６～１８によって識別される。
【0075】
ヒト抗体ドメインの配列のいずれも例示にすぎないことは十分に理解される。代替的には、それぞれの異なる対立遺伝子のヒト抗体ドメインの配列を使用してもよい。
本明細書に記載されるそれぞれの抗体の構造において、それぞれの抗体ドメインが対になり連結するように機能的である限り、抗体ドメインをコードする動物もしくはヒト由来のヌクレオチド配列、または動物もしくはヒトのアミノ酸配列に代わるものとして、修飾された（人工）ヌクレオチド配列およびそれぞれのアミノ酸配列、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％のうちのいずれか１つの配列同一性を含むそれぞれの配列が使用され得る。
本明細書に記載されるそれぞれの抗体の構造において、それぞれの抗体ドメインが対になり連結するように機能的である限り、抗体ドメインをコードする動物もしくはヒト由来のヌクレオチド配列、または動物もしくはヒトのアミノ酸配列に代わるものとして、修飾された（人工）ヌクレオチド配列およびそれぞれのアミノ酸配列、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％のうちのいずれか１つの配列同一性を含むそれぞれの配列が使用され得る。
【0076】
特定の実施形態によれば、抗体は、宿主細胞において（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、または非ヒト動物宿主、特にマウスにおいて（ｉｎ ｖｉｖｏ）生産される。
本明細書に記載される例示的なＨＣＡｂの構造を図３Ｂに示す。
本明細書に記載される例示的なＨＣＡｂの構造を図３Ｂに示す。
【0077】
ＶＨ抗原結合部は、ＶＨドメインの３つのＣＤＲループ、すなわち、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を具体的に含むか、またはそれらからなる。抗原結合部は、ＣＤＲループのうちの１つまたは複数の変異によって親和性成熟させ、それにより、ターゲット抗原に結合する親和性を最適化または増加させることができる。そのような変異は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏプロセスによって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発技法によって、親和性成熟した抗原結合部位を得るための、ＣＤＲ配列のいずれかまたは各々における１つまたは複数の点突然変異、例えば、１、２、３またはそれ以上の点突然変異によって得ることができる。
【0078】
具体的には、ＨＣＡｂは、抗体定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３に融合したＶＨドメインを各々が含む２つの同一の重鎖からなる分子である。具体的には、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ定常ドメインである。両方の重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが対になると、ＨＣＡｂは、２つのＶＨドメインと、Ｆｃ領域とを含む。
【0079】
本明細書に記載されるＨＣＡｂのＦｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を具体的に含む。「Ｆｃ領域」は、典型的には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインのＮ末端側の柔軟なヒンジ領域と、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインとを指す。具体的には、ヒンジは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ抗体のものである。
【0080】
ＩｇＧ型のＨＣＡｂの場合、Ｆｃは、Ｃγ免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３、ならびに場合によりＦｃドメインとＶＨアームの抗体ドメインとの間またはＶＨとＣＨ２との間のヒンジ領域を具体的に含むか、またはそれらからなる。ＩｇＧ型のＨＣＡｂのＦｃ領域は、ＣＨ１ドメインを具体的に含まないか、またはシャペロン結合配列を欠いているＣＨ１ドメインの一部を含む。Ｆｃ領域は、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを、それぞれの天然に発生する抗体ドメインの人工バリアントの形態で、例えば、前記天然に発生する抗体ドメインとの少なくとも９０％の配列同一性を有する形態で含んでもよい。
【0081】
特に、本明細書に記載されるＦｃ領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの二量体を含むか、またはそれからなり、これらのドメインは、抗体重鎖（ＨＣ）の一部であり、第１のＨＣのＣＨ２ドメインは、第２のＨＣのＣＨ２と対になり、第１のＨＣのＣＨ３ドメインは、第２のＨＣのＣＨ３と対になる。そのような二量体は、ホモ二量体、すなわち、同じアミノ酸配列の２つのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン鎖から構成されたもの、またはヘテロ二量体、すなわち、各々が異なるアミノ酸配列を有する、例えば、Ｆｃを安定化するために異なるＣＨ３アミノ酸配列をもつ、２つのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン鎖から構成されたものであり得る。
【0082】
特定の態様において、ＨＣＡｂは、Ｆｃ領域のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン鎖をＶＨドメインに接続するヒンジ領域を含む。具体的には、ＨＣＡｂは、ＶＨドメインと抗体定常ドメインとを接続するヒンジ領域を含む。具体的には、ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に連結する従来の抗体重鎖ヒンジ領域に由来する。代替的には、ほぼ同じ長さをもつ任意の他の天然または人工のリンカーを使用してもよい。好適なヒンジ領域は、自然状態の（天然に発生する、例えば、ヒトまたはマウスの）ＩｇＧもしくはＩｇＡ重鎖ヒンジ領域、または、１つもしくは複数の、最大５つ以下の点突然変異を場合により含む、同じ長さ±１または２アミノ酸のそれらの機能的バリアントである。ヒンジ領域は、典型的に、例えば２つのＨＣを接続するように、ＨＣＡｂにジスルフィド架橋を作るために、１つまたは複数のシステイン残基を含む。
【0083】
具体的には、ＨＣＡｂに含まれる２つのＨＣ（本明細書では第１および第２のＨＣとも呼ばれる）のアミノ酸配列は同一である。代替的には、２つのＨＣのアミノ酸配列は、例えば、ＶＨドメインの抗原結合部位が異なるように、異なっている。
【0084】
例えば、第１のＨＣは、第１のＶＨを含み、第２のＨＣは、第２のＶＨを含む。第１および第２のＶＨは、同じ、または異なる抗原結合部位、例えば、２つの異なるターゲット抗原を特異的に認識するものを含み得る。したがって、ＨＣＡｂは、単特異性、二価、または二重特異性であり得る。
【0085】
本明細書に記載されるマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物によって生産される抗体は、天然抗体または自然抗体として一般的に理解される。そのような天然抗体は、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスによって生産されるような、抗原を特異的に認識する抗体のレパートリーから誘導され得る。
【0086】
特定の態様によれば、抗体または抗体のレパートリーは、ｉｎ ｖｉｖｏで親和性成熟を起こし、例えば１０－７Ｍ未満、例えば１０－７から１０－１０Ｍの間のＫＤで特定のターゲット抗原に結合する高親和性抗体をもたらし得る。
【0087】
ランダム突然変異誘発および／またはライブラリー技法を用いるものなど、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法によって生産された親和性成熟型抗体は、例えば、ＫＤが１０－８Ｍ未満、例えば１０－１１Ｍ未満の、さらに高い親和性をもたらし得る。
【0088】
天然抗体は、有利なことに、ＶＨ－ＣＤＲ配列の自然状態の立体構造によって特徴付けられる。そのような自然状態の立体構造は、抗原結合部位の天然に発生する一次構造、および／または完全長ＶＨドメインの天然に発生する一次構造によって特徴付けられる。
【0089】
ＨＣＡｂを生産する際、選択される抗体ドメインおよび／またはヒンジ領域は、ヒト、人工、または非ヒト動物由来のものであり得る。例えば、ＨＣＡｂは、ヒトおよびマウスの配列を含むトランスジェニックマウスで生産される。
【0090】
特定の態様によれば、本明細書に記載されるＨＣＡｂは、薬学的調製物で好適に使用される濃度で、可溶性形態、例えば水溶性形態で提供される。本明細書で具体的に提供されるのは、本明細書に記載されるＨＣＡｂを、それを生産する動物の血清もしくは血液画分から単離された、または細胞培養画分から単離されたような単離形態で含む、可溶性調製物である。
【0091】
本明細書ではさらに、本明細書に記載される方法によって取得可能な、または取得されたマウスが提供される。具体的には、本明細書では、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。具体的には、本明細書に記載されるマウスは、その内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む。
【0092】
具体的には、本明細書に記載されるマウスは、そのゲノムに、修飾された免疫グロブリン対立遺伝子または他の導入遺伝子を含む。具体的には、本明細書に記載されるマウスは、その内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、少なくともトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、したがってトランスジェニック動物である。
【0093】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるマウスは、ヒト免疫グロブリン領域をさらに含む。例えば、部分的または完全にヒトの抗体を創薬目的で作出するために、内因性マウス免疫グロブリン領域をヒト免疫グロブリン配列で置換するための多数の方法が開発されてきた。そのようなマウスの例としては、例えば、米国特許第７，１４５，０５６号、同第７，０６４，２４４号、同第７，０４１，８７１号、同第６，６７３，９８６号、同第６，５９６，５４１号、同第６，５７０，０６１号、同第６，１６２，９６３号、同第６，１３０，３６４号、同第６，０９１，００１号、同第６，０２３，０１０号、同第５，５９３，５９８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６１２，２０５号、および同第５，５９１，６６９号に記載されているものが挙げられる。
【0094】
特定の態様によれば、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、キメラ遺伝子セグメントを含む。具体的には、本明細書に記載されるマウスは、ＵＳ２０１３／０２１９５３５に記載されているようなキメラ免疫グロブリンセグメント、特に、対応するマウスの非コード性の調節配列に埋め込まれたヒトＩＧＨ（ＶＨ、Ｄ、ＪＨ）コード配列を含む。ヒト免疫グロブリンコード配列およびマウス発現制御配列を含む免疫グロブリン遺伝子セグメントは、本明細書では、「キメラ免疫グロブリン遺伝子セグメント」とも呼ばれる。
【0095】
具体的には、そのようなトランスジェニックマウスは、部分的にヒトのものである導入された外因性免疫グロブリン領域を含むゲノムを有し、導入された領域は、ヒト可変領域コード配列と、マウス由来またはマウスの内因性ゲノムのものであり、キメラ免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはキメラ免疫グロブリン遺伝子座の導入によってマウスゲノムにノックインされた、ヒト配列の発現を制御するマウス非コード性調節配列とを含む。特に、マウス配列、具体的にはマウスの非コード性の調節配列は、対応するマウス内因性配列、すなわち内因性野生型免疫グロブリン遺伝子座のものと同一の配列に基づく。
【0096】
ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の発現を目的とする、本明細書に記載されるマウス発現制御配列は、プロモーター、転写開始および停止配列、エンハンサーおよびアクチベーター配列、リボソーム結合部位からなる群から具体的に選択される。そのような発現制御配列の具体例は、プロモーター、５’非翻訳配列、リーダーペプチドのコード配列の間にあるイントロン、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）、およびスプライス部位を含み得る、コード配列をフランキングする配列である。
【0097】
具体的には、本明細書に記載されるマウスは、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座内に、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列、ならびにＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列の発現を制御するように作動可能に連結している発現制御配列を含むＶＨ重鎖遺伝子座を含む。具体的には、ＶＨ重鎖遺伝子座はキメラであり、ＶＨ重鎖遺伝子座の発現制御配列は、マウスのものであり、好ましくは内因性発現制御配列である。
【0098】
具体的には、ＶＨ重鎖遺伝子座は、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列のレパートリーを含む。具体的には、これは、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０個のＶＨコード配列、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個のＤコード配列、および少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＪＨコード配列、具体的にはヒトのＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列である。具体的には、これは、最大１２０個のＶＨコード配列、最大４０個のＤコード配列、および最大２０個のＪＨコード配列である。具体的には、ＶＨ重鎖遺伝子座は、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列の完全なレパートリーを含む。
【0099】
具体的には、ＶＨ重鎖遺伝子座のＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列は、抗原を特異的に認識するＶＤＪコード配列を形成するように組み換わり、組み換えられたＶＨ重鎖遺伝子座を含むＢ細胞は、抗原特異的ＶＨ結合ドメインと、ＣＨ１ドメインを欠いているまたはＣＨ１ドメインの少なくとも一部を欠いているＩｇＧ定常領域とを含むＨＣＡｂを発現する。
【0100】
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、核酸コンストラクトに含まれる。
特定の実施形態において、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子セグメントコード配列、特に、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくともＪＨ遺伝子セグメントコード配列、好ましくは少なくともＪＨ２－６遺伝子セグメントのコード配列を含む核酸コンストラクトに含まれる。
特定の実施形態において、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントは、少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子セグメントコード配列、特に、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくともＪＨ遺伝子セグメントコード配列、好ましくは少なくともＪＨ２－６遺伝子セグメントのコード配列を含む核酸コンストラクトに含まれる。
【0101】
具体的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントと、対応するマウスの非コード性の調節配列に埋め込まれたヒトＩＧＨコード配列、好ましくは少なくともヒトＩＧＨ Ｊコード配列を含むキメラ免疫グロブリン遺伝子セグメントとを含む核酸コンストラクトが、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流で、かつマウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を置換する外因性核酸コンストラクトまたはエレメントとして、マウスゲノムに導入され得る。具体的には、この核酸コンストラクトは、ヒトＩＧＨ ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列を含む。
【0102】
具体的には、本明細書に記載されるような、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメントと、対応するマウスの非コード性の調節配列に埋め込まれたヒトＩＧＨコード配列、好ましくは少なくともヒトＩＧＨ Ｊコード配列を含むキメラ免疫グロブリン遺伝子セグメントと、不活性Ｃμ遺伝子セグメントとを含む核酸コンストラクトが、内因性Ｃδ遺伝子セグメントの上流で、かつマウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を置換する外因性核酸コンストラクトまたはエレメントとして、マウスゲノムに導入され得る。具体的には、この核酸コンストラクトは、ヒトＩＧＨ ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列を含む。
【0103】
代替的には、トランスジェニックＣγ遺伝子セグメント、そして場合により、不活性なＣμ遺伝子セグメントは、マウスゲノム内の免疫グロブリン遺伝子座にノックインされる。
【0104】
別の好ましい態様では、本明細書に記載されるマウスのゲノム内容が改変されて、それらのＢ細胞が、細胞ごとに複数の機能的ＶＨドメインを発現することが可能になり、すなわち、細胞が、ＷＯ２０１７０３５２５２Ａ１に記載されているような二重特異性抗体を生産するようになる。
【0105】
具体的には、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座内のＣμ遺伝子セグメントは、不活性である。具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、機能喪失突然変異、Ｃμ遺伝子セグメントの欠失、または１つもしくは複数の停止コドンを導入する１つもしくは複数の突然変異によって不活性である。
【0106】
具体的には、本明細書に記載されるのは、Ｃμ遺伝子セグメントの５’側にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、本明細書に記載されるマウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座である。
【0107】
特定の実施形態において、Ｃμ遺伝子セグメントは、本明細書に記載されるマウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性遺伝子セグメントである。
特定の実施形態において、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＣμ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントを置換し、かつ１つまたは複数の不活性化突然変異を含むトランスジェニック遺伝子セグメントである。
特定の実施形態において、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＣμ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントを置換し、かつ１つまたは複数の不活性化突然変異を含むトランスジェニック遺伝子セグメントである。
【0108】
具体的には、トランスジェニックＣμ遺伝子セグメントは、Ｃμ遺伝子セグメントにおける、好ましくはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのいずれか１つまたは複数における、機能喪失突然変異、またはＣμ遺伝子セグメントの部分的な、例えば少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％のうちのいずれか１つの欠失、または外因性停止コドンの導入によって不活性である。
【0109】
具体的には、本明細書に記載されるＣμ遺伝子セグメントは、野生型マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＣμ遺伝子セグメントの天然の位置に位置する。
具体的には、本明細書に記載されるマウスは、本明細書に記載されるその内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の修飾を含む。
具体的には、本明細書に記載されるマウスは、本明細書に記載されるその内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の修飾を含む。
【0110】
具体的には、本明細書に記載される遺伝子座は、マウスに由来するが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列に欠失を含むＣγ遺伝子セグメントのような、遺伝子座の調節エレメントと自然状態では関連しない、少なくとも１つの外因性エレメント、例えば、１つまたは複数の外因性重鎖領域を含む、組換え（例えば、「キメラ」）遺伝子座である。
【0111】
具体的には、好適な遺伝子ターゲティング技法、例えば、部位特異的リコンビナーゼ技法を用いる指向性相同組換え、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技法により、遺伝子配列が免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組み込まれるように、マウスが処置される。
【0112】
具体的には、内因性カッパおよび／またはラムダ遺伝子座が欠失する、もしくはサイレンシングされる、または別様に機能喪失の突然変異を起こすため、このマウスは前記内因性カッパおよび／またはラムダ遺伝子座を発現しない。
【0113】
特定の実施形態によれば、本明細書に記載される抗体を生産する方法は、マウスのＢ細胞レパートリーに含まれる抗原特異的Ｂ細胞によって抗原に対する免疫応答が誘発されるように、本明細書に記載されるマウスを該抗原で免疫化するステップをさらに含む。応答するＢ細胞は、最終的に、免疫化抗原に特異的なＨＣＡｂを分泌する形質細胞へと分化する。
【0114】
抗原は、アジュバントの有無にかかわらず、任意の簡便な手法でマウスに投与することができ、予め決定されたスケジュールに従って投与することができる。
本明細書で具体的に提供されるのは、抗原特異的抗体を生産する方法であって、
ａ）トランスジェニックマウスを抗原で免疫化するステップであって、前記マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、ステップと、
ｂ）抗原特異的ＶＨおよびＩｇＧ定常領域を含むＨＣＡｂを発現させるステップと、
ｃ）前記抗原特異的ＶＨをコードする１つまたは複数の核酸配列を単離するステップと、
ｄ）前記抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法である。
本明細書で具体的に提供されるのは、抗原特異的抗体を生産する方法であって、
ａ）トランスジェニックマウスを抗原で免疫化するステップであって、前記マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、ステップと、
ｂ）抗原特異的ＶＨおよびＩｇＧ定常領域を含むＨＣＡｂを発現させるステップと、
ｃ）前記抗原特異的ＶＨをコードする１つまたは複数の核酸配列を単離するステップと、
ｄ）前記抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法である。
【0115】
具体的には、本明細書では、抗原特異的ＶＨドメインを含む抗体を生産する方法であって、
ａ）抗原でマウスを免疫化するステップであって、前記マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、それにより、抗原特異的ＨＣＡｂを発現する細胞のレパートリーをもたらす、ステップと、
ｂ）前記レパートリーから、抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを発現する細胞を選択するステップと、
ｃ）前記ＨＣＡｂから前記抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列を決定するステップと、
ｄ）前記抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法が提供される。
ａ）抗原でマウスを免疫化するステップであって、前記マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、それにより、抗原特異的ＨＣＡｂを発現する細胞のレパートリーをもたらす、ステップと、
ｂ）前記レパートリーから、抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを発現する細胞を選択するステップと、
ｃ）前記ＨＣＡｂから前記抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列を決定するステップと、
ｄ）前記抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法が提供される。
【0116】
具体的には、本明細書に記載される方法に従って生産されるモノクローナル抗体は、完全長免疫グロブリン、その抗原結合性抗体フラグメント、または少なくとも可変重鎖（ＶＨ）抗体ドメインを含む任意の他の抗体コンストラクト、または単一のＶＨドメイン、例えば１つまたは複数の単一ドメイン抗体を含む抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、または完全長抗体、例えば、ＩｇＧ型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体のいずれでもよい。特定の実施形態は、本明細書に記載されるＨＣＡｂなどの重鎖のみ抗体である。
【0117】
具体的には、前記抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列は、本明細書に記載されるマウスによって生産されたＢ細胞における組み換えられたＶＨ配列のシーケンシングによって決定される。そのようなシーケンシングは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などのディープシーケンシング法を使用して行われ得る。
【0118】
モノクローナル抗体を作製する際、抗体生産細胞、例えば、脾臓および／またはリンパ節の細胞が、免疫化されたトランスジェニックマウスから単離され、ハイブリドーマの生産のための形質転換細胞株との細胞融合に使用され得るか、または抗体をコードするｃＤＮＡが、標準的な分子生物学技法によってクローニングされ、トランスフェクトされた細胞で発現される。モノクローナル抗体を作製するための手順は、当技術分野において十分に確立されている。
【0119】
具体的には、この方法は、ハイブリドーマを調製するステップと、抗体生産細胞、特にターゲット抗原を特異的に認識するものを生産し、スクリーニングするステップとをさらに含む。
【0120】
具体的には、本明細書では、抗原特異的ＶＨドメインを含む抗体を生産する方法であって、
ａ）マウスを抗原で免疫化するステップであって、前記マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、ステップと、
ｂ）前記トランスジェニックマウスから脾臓および／またはリンパ節の細胞を単離するステップと、
ｃ）前記脾臓および／またはリンパ節の細胞からハイブリドーマを生成するステップと、
ｄ）抗原特異的ハイブリドーマを選択するステップと、
ｅ）抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを前記ハイブリドーマから分泌させるステップと、
ｆ）培養上清から前記モノクローナルＨＣＡｂを単離するステップと
を含む方法が提供される。
ａ）マウスを抗原で免疫化するステップであって、前記マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、ステップと、
ｂ）前記トランスジェニックマウスから脾臓および／またはリンパ節の細胞を単離するステップと、
ｃ）前記脾臓および／またはリンパ節の細胞からハイブリドーマを生成するステップと、
ｄ）抗原特異的ハイブリドーマを選択するステップと、
ｅ）抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを前記ハイブリドーマから分泌させるステップと、
ｆ）培養上清から前記モノクローナルＨＣＡｂを単離するステップと
を含む方法が提供される。
【0121】
特定の実施形態において、この方法は、前記ハイブリドーマから前記抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列を決定するステップと、前記抗原特異的ＶＨを含む組換えモノクローナル抗体を生産するステップとを含む。
【0122】
具体的には、この方法は、細胞培養物中で、特異的抗体またはそのフラグメント、特に抗原結合性フラグメントを生産するために、免疫化されたマウスから核酸配列を単離するステップを含む。そのような抗体またはその抗原結合性フラグメントは、本明細書では、高度免疫抗体と理解される。
【0123】
本明細書ではさらに、本明細書に記載されるマウスまたは本明細書に記載されるそれぞれのＢ細胞レパートリーに由来する様々なＶＨ結合部位を含む抗原結合分子のライブラリーの生産のための方法における、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスの使用が提供される。具体的には、ＶＨドメインのレパートリー（例えばＶＨライブラリー）またはＶＨを含む分子のレパートリー（またはそれぞれのライブラリー）、特にＨＣＡｂのレパートリー（またはＨＣＡｂライブラリー）が本明細書で提供される。
【0124】
本明細書では、本明細書に記載されるマウスを生産するための方法であって、
ａ）マウス胚性幹細胞を用意するステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内の、本明細書に記載されるトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントと、場合により、本明細書に記載される不活性Ｃμ遺伝子セグメントとを含む核酸配列を含む、１つまたは複数のベクター（ターゲティングベクターとも呼ばれる）を用意するステップと、
ｃ）前記１つまたは複数のベクターを細胞に導入するステップと、
ｄ）トランスジェニック細胞を選択するステップであって、ｂ）の配列が、内因性Ｃμ遺伝子セグメント（突然変異していてもしていなくてもよい）の上流の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座、または、ベクターが内因性のものを置換する不活性Ｃμを含む場合は、内因性Ｃδ遺伝子セグメントの上流のＣμにおいて、ターゲティングされた組み入れによって前記細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、ステップと、
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞から誘導されたトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む方法も提供される。
ａ）マウス胚性幹細胞を用意するステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内の、本明細書に記載されるトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントと、場合により、本明細書に記載される不活性Ｃμ遺伝子セグメントとを含む核酸配列を含む、１つまたは複数のベクター（ターゲティングベクターとも呼ばれる）を用意するステップと、
ｃ）前記１つまたは複数のベクターを細胞に導入するステップと、
ｄ）トランスジェニック細胞を選択するステップであって、ｂ）の配列が、内因性Ｃμ遺伝子セグメント（突然変異していてもしていなくてもよい）の上流の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座、または、ベクターが内因性のものを置換する不活性Ｃμを含む場合は、内因性Ｃδ遺伝子セグメントの上流のＣμにおいて、ターゲティングされた組み入れによって前記細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、ステップと、
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞から誘導されたトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む方法も提供される。
【0125】
具体的には、内因性Ｃμ遺伝子セグメントは、好ましくは、機能喪失突然変異、Ｃμ遺伝子セグメントの欠失、または停止コドンを導入する突然変異によって不活性化される。
具体的には、このマウスは、本明細書に記載されるＨＣＡｂを発現する。具体的には、このマウスは、重鎖抗体のみを発現し、かつ／またはＶＬドメインを含む抗体コンストラクトを発現しない。
具体的には、このマウスは、本明細書に記載されるＨＣＡｂを発現する。具体的には、このマウスは、重鎖抗体のみを発現し、かつ／またはＶＬドメインを含む抗体コンストラクトを発現しない。
【0126】
具体的には、細胞ゲノムへの前記１つまたは複数のベクターの組み入れの成功を示す、１つのマーカーまたは複数のマーカーが使用される。具体的には、宿主における発現が可能であり、導入された核酸またはベクターを含む宿主の選択を容易にする選択マーカーが使用される。
【0127】
選択マーカーの例としては、例えば、抗菌剤（例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）または抗ウイルス剤（例えばガンシクロビル）に対する抵抗性を付与するタンパク質、宿主細胞に栄養上の利点のような代謝的利点を付与するタンパク質、および細胞に機能または表現型に関する利点（例えば、細胞分裂）を付与するタンパク質が挙げられる。
【0128】
特定の実施形態において、ガンシクロビルでの負の選択のための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、および／またはターゲティングベクターがゲノムに組み入れられた細胞の選択のためのピューロマイシン抵抗性遺伝子が使用される。
【0129】
具体的には、核酸配列を真核細胞に組み込むことが可能な手段によってコード核酸配列が細胞に挿入されるように、ベクターが導入され、ここで、核酸配列は、細胞内に一過性に存在してもよいが、細胞のゲノム（特に染色体）内に組み込まれるまたは安定に組み入れられるのが好ましい。
【0130】
具体的には、前記１つまたは複数のベクターは、ターゲティングされた組換えの任意の方法によって、例えば、相同組換えまたは部位特異的組換え技法によって、ターゲット部位で前記マウス細胞の細胞ゲノムに組み入れられる。具体的には、ターゲティングされた組換えのために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集系が使用され得る（Ｈｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、４４：ｅ８５、２０１６）。
【0131】
特定の実施形態によれば、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスを生成するための方法であって、
ａ）内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性Ｃδ遺伝子セグメントの５’側の位置にターゲット部位を含むマウス細胞を用意するステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含むＣγ遺伝子セグメントと、場合により、少なくとも１つの不活性化突然変異を含むＣμ遺伝子セグメントとを含む核酸配列であって、前記ターゲット部位と相同のＤＮＡ配列によってフランキングされた核酸配列、および細胞ゲノムへのベクターのターゲティングされた相同組換えについて選択するための１つまたは複数のマーカーを含む、１つまたは複数のベクターを用意するステップと、
ｃ）前記１つまたは複数のベクターを前記マウス細胞に導入するステップと、
ｄ）前記マウス細胞のゲノムに前記核酸配列を組み込み、前記核酸配列が前記ターゲット部位で前記細胞の細胞ゲノムに組み入れられたトランスジェニック細胞を選択するステップと、
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む方法が提供される。
ａ）内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性Ｃδ遺伝子セグメントの５’側の位置にターゲット部位を含むマウス細胞を用意するステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含むＣγ遺伝子セグメントと、場合により、少なくとも１つの不活性化突然変異を含むＣμ遺伝子セグメントとを含む核酸配列であって、前記ターゲット部位と相同のＤＮＡ配列によってフランキングされた核酸配列、および細胞ゲノムへのベクターのターゲティングされた相同組換えについて選択するための１つまたは複数のマーカーを含む、１つまたは複数のベクターを用意するステップと、
ｃ）前記１つまたは複数のベクターを前記マウス細胞に導入するステップと、
ｄ）前記マウス細胞のゲノムに前記核酸配列を組み込み、前記核酸配列が前記ターゲット部位で前記細胞の細胞ゲノムに組み入れられたトランスジェニック細胞を選択するステップと、
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む方法が提供される。
【0132】
具体的には、相同性ターゲティングベクターまたは「ターゲティングベクター」を使用することができ、これは、宿主細胞における相同性による組換え、特に相同組換えを使用して内因性免疫グロブリン領域を修飾するために使用される、ターゲティング配列と、部位特異的組換え部位と、場合により選択マーカー遺伝子とをコードする核酸を含むベクターである。具体例において、相同性ターゲティングベクターは、部位特異的組換え部位をさらに含んでもよく、宿主細胞ゲノムの特定の領域に部位特異的組換え部位を導入するために使用され得る。
【0133】
具体的には、宿主細胞のトランスフェクションの際に宿主細胞ゲノムと組み換わるターゲティングベクターが使用され、生産的ＶＤＪ再構成の後、コードされた抗体が発現され、形質膜に挿入され、かつ／または宿主細胞によって分泌される。具体的には、ベクターは、抗体コード配列に作動可能に連結した、エンハンサーまたはプロモーターのような１つまたは複数の外因性または異種の調節エレメントを含み、この調節エレメントは、前記抗体コード配列と自然状態では関連しない。
【0134】
別の特定の実施形態によれば、本明細書に記載されるマウスを生成するための方法であって、
ａ）マウス細胞を用意し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの５’および３’の位置で部位特異的リコンビナーゼの認識配列によってフランキングされた２つのリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）ターゲット部位を組み入れるステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内の、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部または全部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含むＣγ遺伝子セグメントと、場合により、少なくとも１つの不活性化突然変異を含むＣμ遺伝子セグメントとを含む核酸配列であって、部位特異的リコンビナーゼのためのさらなる認識部位によってフランキングされた核酸配列、およびマウスゲノムへのベクターのターゲティングされた組み入れについて選択するための１つまたは複数のマーカーを含む、１つまたは複数のベクターを用意するステップであって、さらなる認識部位が前記ＲＭＣＥターゲット部位と組み換わることが可能である、用意するステップと、
ｃ）前記マウス細胞に、前記１つまたは複数のベクター、ならびに前記ＲＣＭＥターゲット部位およびさらなる認識部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを導入するステップと、
ｄ）前記マウス細胞のゲノムに前記核酸配列を組み込み、前記核酸配列が前記ＲＭＣＥターゲット部位で前記細胞の細胞ゲノムに組み入れられたトランスジェニック細胞を選択するステップと、
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む方法が提供される。
ａ）マウス細胞を用意し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの５’および３’の位置で部位特異的リコンビナーゼの認識配列によってフランキングされた２つのリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）ターゲット部位を組み入れるステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内の、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部または全部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含むＣγ遺伝子セグメントと、場合により、少なくとも１つの不活性化突然変異を含むＣμ遺伝子セグメントとを含む核酸配列であって、部位特異的リコンビナーゼのためのさらなる認識部位によってフランキングされた核酸配列、およびマウスゲノムへのベクターのターゲティングされた組み入れについて選択するための１つまたは複数のマーカーを含む、１つまたは複数のベクターを用意するステップであって、さらなる認識部位が前記ＲＭＣＥターゲット部位と組み換わることが可能である、用意するステップと、
ｃ）前記マウス細胞に、前記１つまたは複数のベクター、ならびに前記ＲＣＭＥターゲット部位およびさらなる認識部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを導入するステップと、
ｄ）前記マウス細胞のゲノムに前記核酸配列を組み込み、前記核酸配列が前記ＲＭＣＥターゲット部位で前記細胞の細胞ゲノムに組み入れられたトランスジェニック細胞を選択するステップと、
ｅ）前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む方法が提供される。
【0135】
具体的には、部位特異的リコンビナーゼのための前記認識部位はいずれも、リコンビナーゼがその認識部位のうちの２つの間のＤＮＡ配列を切除することが可能な、リコンビナーゼ認識部位（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ、Ｆｌｐ－ＦＲＴなど）である。
【0136】
特定の態様によれば、本明細書では、重鎖のみ抗体を生産するための方法であって、
ａ）マウスにおいて組換え免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現させるステップであって、該遺伝子座が、
ｉ）ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントの各々を１つまたは複数含む、好ましくは、マウス調節配列に埋め込まれたヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列を含む、可変重鎖領域、
ｉｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子座内のＣμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含む定常重鎖領域であって、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部または全部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、場合により、Ｃμ遺伝子セグメントが不活性である、定常重鎖領域、ならびに
ｉｉｉ）連結領域であって、本明細書に記載されるＨＣＡｂを発現するようにエンジニアリングされ位置付けられた領域
を含み、
マウスが内因性カッパおよび／またはラムダ遺伝子座を発現しない、発現させるステップと、
ｂ）前記ＨＣＡｂである抗体を生産するステップと
を含む方法が提供される。
ａ）マウスにおいて組換え免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現させるステップであって、該遺伝子座が、
ｉ）ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントの各々を１つまたは複数含む、好ましくは、マウス調節配列に埋め込まれたヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列を含む、可変重鎖領域、
ｉｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子座内のＣμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含む定常重鎖領域であって、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部または全部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、場合により、Ｃμ遺伝子セグメントが不活性である、定常重鎖領域、ならびに
ｉｉｉ）連結領域であって、本明細書に記載されるＨＣＡｂを発現するようにエンジニアリングされ位置付けられた領域
を含み、
マウスが内因性カッパおよび／またはラムダ遺伝子座を発現しない、発現させるステップと、
ｂ）前記ＨＣＡｂである抗体を生産するステップと
を含む方法が提供される。
【0137】
特定の実施形態によれば、本明細書に記載される抗体は、好適な生産宿主細胞株を用いた細胞培養物中で生産される。具体的には、生産には、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物の細胞培養が用いられる。具体的には、宿主細胞は、本明細書に記載される抗体をコードするそれぞれの核酸分子の導入の際に使用される。特に、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０またはＶＥＲＯ細胞の哺乳動物宿主細胞は、いずれも有利に使用される。
【0138】
特定の態様によれば、本発明は、少なくともＶＨ結合部位もしくはそれぞれのＶＨドメインを含む抗体などの抗原結合分子、例えば少なくともＶＨ結合部位を含むＨＣＡｂ抗体もしくはそのフラグメントのライブラリー、または前記ライブラリーをコードもしくは発現する核酸配列のライブラリーを生産するための、本明細書に記載されるマウスの使用を提供する。
【0139】
本明細書に記載されるトランスジェニック細胞は、例えば、Ｂ細胞から抗体をコードする遺伝子をクローニングすることにより、または、例えばＵＳ２０１７０２２６１６２Ａ１に記載されているような、形質細胞膜で抗体を発現するエンジニアリングされたマウスにおいて明確な特異性をもつ形質細胞を選択することにより、目的の抗体を識別するための発現ライブラリーを生産するために使用され得る。したがって、本発明は、形質細胞によって発現される抗原特異的抗体の識別のための細胞技術を使用して生産された抗体ライブラリーも含む。
【0140】
特定の実施形態には、本明細書に記載される遺伝子修飾マウスのエンジニアリングされた部分に由来する免疫グロブリン重鎖遺伝子から転写される免疫グロブリンタンパク質の一部または全体、および遺伝子修飾マウスの細胞から誘導されるエンジニアリングされた免疫グロブリンタンパク質の一部または全体が含まれる。
【0141】
本発明のこれらおよび他の態様、目的、および特徴は、以下にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0142】
【図1】マウス生殖系列Ｉｇｈ遺伝子座（上）［Ｖ（ＩｇｈＶ）、Ｄ（ＩｇｈＤ）、Ｊ（ＩｇｈＪ）、およびＣ（ＩｇｈＣ）遺伝子セグメントを含む；異なるＩｇ Ｈ鎖アイソタイプをコードするために複数のＩｇｈＣエキソンがある］、Ｉｇκ遺伝子座（Ｉｇｋ、中央）［Ｖ（ＩｇｋＶ）、Ｊ（ＩｇｋＪ）、およびＣ（ＩｇｋＣ）遺伝子セグメントを含む］、およびＩｇλ遺伝子座（下）［Ｖ（ＩｇｌＶ）、Ｊ（ＩｇｌＪ）、およびＣ（ＩｇｌＣ）遺伝子セグメントを含む］を示す。また、（１）ＶＤＪ再構成における遠位ＶＨ遺伝子セグメントの利用を確実にするためのＩｇｈルーピングに重要なシス調節配列であるＰＡＩＲエレメント、（２）Ａｄａｍ６ａ雄性稔性有効化遺伝子、（３）Ｉｇｈ遺伝子座の秩序だった系統特異的再構成を調節する部位を含む遺伝子間制御領域１（ＩＧＣＲ１）、（４）重鎖、κおよびλ軽鎖のイントロンエンハンサーであるＥμ、ｉＥκおよびＥλ２－４、（５）κおよびλ軽鎖３’エンハンサーである３’Ｅκ、ＥλおよびＥλ３－１、（６）μスイッチ領域であるＳμ、ならびに（７）アイソタイプスイッチを制御するシス作用性エレメントである３’調節領域（３’ＲＲ）も示されている。
【図2】ＨＣＯ抗体の生産のために相同組換えによってＩｇｈｍの上流の内因性マウスＩｇｈ遺伝子座にマウスＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットを導入するためのターゲティングベクター。この図および図３において、「内因性マウスＩｇｈ遺伝子座」は、ＷａｂｌおよびＫｉｌｌｅｅｎによるＵＳ２０１３０２１９５３５Ａ１に記載されている部分的にヒトのＩＧＨ遺伝子座を含むＥＳ細胞にある。
【図3】（Ａ）重鎖（ＨＣＯ）抗体（ΔＣＨ１ ＨＣＯ ＩｇＧ１）をコードするように、図２に示したベクターでターゲティングされる内因性マウスＩｇｈ遺伝子座を示す。ＣＨ１エキソンの欠失を有するマウスＣγ１遺伝子が、ＥμとＩｇｈｍとの間のマウスＩｇｈ遺伝子座に挿入され、停止コドン（アステリスクによって示されるＴＧＡ）が、μ重鎖（ＨＣ）のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードするエキソンの各々に挿入された。野生型マウスでは、発達しているＢ細胞における生産的ＶＤＪＨ組換えの後に、軽鎖（ＬＣ）依存性μＨＣが生産される。ここで示される突然変異したＩｇｈ遺伝子座では、代わりにＬＣ非依存性ΔＣＨ１γ１ ＨＣが生産される。膜貫通（Ｍ）分泌（Ｓ）型の両方のＩｇＧ１ ＨＣＯ抗体が、この修飾されたＩｇｈ遺伝子座によってコードされる。選択的スプライシングにより、Ｍ１およびＭ２エキソンを含むγ１ｍ転写産物、ならびにＣＨ３エキソンの３’末端に位置するＳエキソンを含むγ１ｓが生産される。ＣＨ１欠失により、ＨＣは、サロゲートまたは従来の（κまたはλ）ＬＣと会合する必要なしに、形質膜に移動することができる（γ１ｍ）、または分泌されることができる（γ１ｓ）。Ｃμにおける３つの停止コドンは、ＶＤＪＨエキソンがＣγ１ΔＣＨ１ではなくＣμに直接スプライスされる場合にＬＣ依存性μＨＣの発現を防止する。（Ｂ）は、可変（ＶＨ）、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＭドメインを含むが、ＣＨ１ドメインが欠如している、膜貫通型のＩｇＧ１ ＨＣＯ抗体タンパク質の概略図である。ＨＣは、非共有結合性相互作用および鎖間ジスルフィド結合（ＶＨドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する横線によって示される）によって結び付けられた二量体として存在し、そのＭドメインによって形質膜に挿入される。分泌型のＩｇＧ１ ＨＣＯ抗体（図示せず）では、Ｍドメインが欠如しており、その代わり、タンパク質のＣＯＯＨ末端に短い分泌性（Ｓ）ドメインがある。これは、Ｂ細胞活性化および形質芽球／形質細胞への分化の後に発現される。
【図4】ＴＲＮ１１／２／５およびＴＲＮ３４／２９／３０マウスの骨髄におけるＢ細胞の発達を示す。ＴＲＮ１１／２／５マウスでは、内因性ＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座が、マウス調節配列によってフランキングされたヒトＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座コード配列でそれぞれ置換されている。ＴＲＮ３４／２９／３０マウスでは、ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントはＴＲＮ１１と同一であるが、Ｉｇｈ遺伝子座の残りは、図３に示されるように、ＩｇＧ１ ＨＣＯ抗体をコードするように修飾されている。ＶκおよびＶλ遺伝子座は、それぞれ、ＴＲＮ２９およびＴＲＮ３０対立遺伝子で不活性化されている。示されているＣＤ抗原に特異的な蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により、骨髄細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。フロープロット中の数字は、所定のゲートでの細胞のパーセンテージを示す。Ｂ細胞の発達段階も示されている。成熟型再循環Ｂとは、骨髄で生成され、末梢で、例えば脾臓でその成熟を完了し、血流を介して骨髄（ＢＭ）に再循環したＢ細胞である。
【図5】ＴＲＮ１１／２／５およびＴＲＮ３４／２９／３０マウスの脾臓におけるＢ細胞の分化を示す。示されているＣＤ抗原に特異的な蛍光コンジュゲートｍＡｂで脾臓細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。フロープロット中の数字は、所定のゲートでの細胞のパーセンテージを示す。Ｂ細胞の発達段階も示されている。Ｆｏ．Ｂは濾胞Ｂ細胞、ＭＺ Ｂは辺縁帯Ｂ細胞、Ｔは移行期、Ｍａｔは成熟型である。
【図6】ＴＲＮ１１／２／５およびＴＲＮ３４／２９／３０マウスの脾臓辺縁帯および濾胞Ｂ細胞における表面ＩｇＧ１発現。ＭＺ（上）およびＦｏ．（下）のＢ細胞でゲーティングした脾臓細胞を、γ１ ＨＣの細胞表面発現について分析した。
【図7】ＴＲＮ１１／２／５およびＴＲＮ３４／２９／３０マウスのリンパ節におけるＢ細胞の分化および表面ＩｇＧ１発現を示す。示されているＣＤ抗原およびγ１ ＨＣに特異的な蛍光コンジュゲートｍＡｂでリンパ節細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。フロープロット中の数字は、所定のゲートでの細胞のパーセンテージを示す。
【図8】ＴＲＮ１１／２／５およびＴＲＮ３４／２９／３０マウスの腹膜腔におけるＢ細胞の分化および表面ＩｇＧ１発現を示す。示されているＣＤ抗原およびγ１ ＨＣに特異的な蛍光コンジュゲートｍＡｂで腹膜腔細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。フロープロット中の数字は、所定のゲートでの細胞のパーセンテージを示す。
【図9】未免疫化ＴＲＮ１１／２／５（白抜きの丸）およびＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯ（黒塗りの丸）マウスにおける血清ＩｇＧ１およびＩｇＭを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す。光学密度がＹ軸に、血清希釈度がＸ軸に示されている。標準化（白抜きの四角）のために、１００μｇ／ｍｌのモノクローナルＩｇＧ１（左）およびＩｇＭ（右）を同じく連続的に希釈した。
【図10】未免疫化ＴＲＮ１１／２／５（白抜きの丸）およびＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯ（黒塗りの丸）マウスにおける血清ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す。光学密度がＹ軸に、血清希釈度がＸ軸に示されている。標準化（白抜きの四角）のために、１００μｇ／ｍｌのモノクローナルＩｇＧ２ｂ（左）、ＩｇＧ２ｃ（中央）およびＩｇＧ３（右）を同じく連続的に希釈した。
【図11-1】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-2】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-3】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-4】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-5】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-6】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-7】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-8】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【図11-9】本明細書で言及されるヌクレオチド配列。
【発明を実施するための形態】
【0143】
別段の記載または定義がない限り、本明細書で使用される用語はすべて、当業者にとって明らかである、当技術分野における通常の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版）、第１～３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ ＩＶ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９０）、およびＪａｎｅｗａｙら、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」（第５版、またはより最近の版）、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１など、標準的教本が参照される。
【0144】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、同義に使用される場合があり、さらなるメンバーまたは部分または要素を許容する、制限のない定義として理解されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、「からなる」の定義の特徴のさらなる要素を含まない、最も近い定義とみなされる。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はより広く、「からなる」の定義を含む。
【0145】
本明細書で使用される「約」という用語は、所定の値と同じ値、またはそれと±５％異なる値を指す。
本発明者らは、先行技術の限界を克服するとともに、免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｃμ遺伝子セグメントの５’側でのトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントのターゲティングされた組み入れによってトランスジェニックマウスを生成することで、Ｂ細胞により発現され、形質細胞により分泌される重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）を効率的に生産できることを示した。これらはその後、例えば、確立されたハイブリドーマ技術などを使用して、ＨＣＡｂまたはその抗原結合性フラグメントの信頼できる供給源を生成するために使用され得る。
本発明者らは、先行技術の限界を克服するとともに、免疫グロブリン重鎖遺伝子座における内因性Ｃμ遺伝子セグメントの５’側でのトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントのターゲティングされた組み入れによってトランスジェニックマウスを生成することで、Ｂ細胞により発現され、形質細胞により分泌される重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）を効率的に生産できることを示した。これらはその後、例えば、確立されたハイブリドーマ技術などを使用して、ＨＣＡｂまたはその抗原結合性フラグメントの信頼できる供給源を生成するために使用され得る。
【0146】
本明細書で提供される、本明細書でＨＣＡｂと呼ばれる抗体コンストラクト、ならびに本明細書に記載されるレパートリーおよびライブラリーは、人工コンストラクトである。例えば、単離された核酸配列、アミノ酸配列、発現コンストラクト、形質転換された宿主細胞、トランスジェニック動物、および組換え抗体に具体的に言及する、本発明の物質、方法、および使用は、「人工」または合成のものであり、したがって、「天然産物」とも、「自然の法則」の結果ともみなされないことは、十分に理解される。
【0147】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインとして理解される、様々な組み合わせまたは構成における抗体ドメインからなるか、またはそれらを含む、ポリペプチドまたはタンパク質を指すものとする。ポリペプチドは、ループ配列によって接続された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータストランドからなるベータバレル構造を含む場合、抗体ドメインとして理解される。抗体ドメインは、自然状態の構造のものでもよく、または、抗原結合特性もしくは任意の他の特性、例えば安定性もしくは機能特性、例えば、Ｆｃ受容体、Ｆｃμ、Ｆｃα／μ、Ｆｃα、Ｆｃε、および／もしくはＦｃγ受容体（例えば、マウスのＦｃＲｎ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、もしくはＦｃγＲＩＶ）、もしくは高分子Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）への結合などを改変するように、突然変異誘発もしくは誘導体化によって修飾されてもよい。
【0148】
本明細書では、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、交換可能に使用される。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特にＶＨドメインのものである抗原結合部位を含む抗体コンストラクトを具体的に指すものとする。特定の実施形態は、例えば１つまたは複数の他の可変ドメインおよび／または定常抗体ドメインと組み合わせられた（または融合した）、単一の可変抗体ドメインとしてのＶＨを含むか、またはそれからなり、場合により１つまたは複数の連結配列またはヒンジ領域を含む抗体、例えば、１つまたは２つの単鎖から構成され、各単鎖が、定常ドメインに連結した可変重鎖領域（すなわちＶＨ）を含むか、またはそれからなる重鎖抗体に言及する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特にＶＨドメインのものである抗原結合部位を含む抗体コンストラクトを具体的に指すものとする。特定の実施形態は、例えば１つまたは複数の他の可変ドメインおよび／または定常抗体ドメインと組み合わせられた（または融合した）、単一の可変抗体ドメインとしてのＶＨを含むか、またはそれからなり、場合により１つまたは複数の連結配列またはヒンジ領域を含む抗体、例えば、１つまたは２つの単鎖から構成され、各単鎖が、定常ドメインに連結した可変重鎖領域（すなわちＶＨ）を含むか、またはそれからなる重鎖抗体に言及する。
【0149】
本明細書で言及される特定の抗体は、完全長抗体もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、または、少なくとも可変重鎖（ＶＨ）抗体ドメイン、もしくは単一のＶＨドメインを含むか、もしくはそれからなる任意の他の抗体コンストラクト、例えば、１つまたは複数の単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖを含むか、またはそれからなる抗体であり得る。例示的な抗体は、本明細書にさらに記載されるＨＣＡｂのいずれかを含むか、またはそれからなる。本明細書に記載される抗体は、ある特定の免疫グロブリン型のものであり得る。特定の抗体は、ＩｇＧ型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ型、またはそれらに対応するマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのものである、抗体定常ドメイン、特に重鎖定常ドメインを含む。好ましくは、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）のものである定常抗体ドメインを含む。
【0150】
それに従って、抗体は、典型的に、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）として理解される。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖（ＬＣ）はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖（ＨＣ）はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、これにより、免疫グロブリンクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥがそれぞれ定義される。
【0151】
典型的なＩｇＧ抗体構造では、ＨＣまたはＬＣは各々、結合部位ドメインの対を作るように互いに接続された少なくとも２つのドメインを含む。特定の場合では、重鎖は、ＬＣ定常ドメインを組み込んでも、依然として、例えば、軽鎖可変ドメインまたは領域を欠いているＨＣとみなされ得る。
【0152】
抗体のＨＣは、抗体の１つまたは２つの抗原結合アームをＦｃ部分に接続するヒンジ領域を含み得る。ヒンジ領域は、免疫グロブリンの、例えばＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３の、天然に発生する重鎖ヒンジ領域でもよく、または天然に発生するものとほぼ同じ長さ（±２０％、または±１０％）である複数の連続したアミノ酸を含むか、もしくはそれからなる人工ヒンジ領域でもよい。好ましいヒンジ領域は、１つまたは複数の、例えば、２、３、または４つのシステイン残基を含み、これらは別のヒンジ領域とのジスルフィド架橋を形成することができ、それによって二量体コンストラクトが得られる。
【0153】
本明細書に記載される抗体は、短縮された、または例えば連結配列もしくはリンカーを使用して拡張された、１つまたは複数の抗体ドメインを含み得る。そのような連結は、具体的には、組換え融合または化学的連結による。特定の連結は、１つのドメインのＣ末端を別のドメインのＮ末端に連結することによるもの、例えば、末端領域の１つまたは複数のアミノ酸残基が、ドメインサイズを短縮するように欠失する、またはドメインの柔軟性を増加させるように拡張されるものであり得る。
【0154】
具体的には、短縮されたドメイン配列は、少なくとも１、２、３、４、または５、最大６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を欠失させるような、Ｃ末端および／またはＮ末端領域の欠失を含む。
【0155】
リンカーによるドメインの拡張は、ドメイン間の自然状態の結合部を含むように、自然状態ではドメインに隣接して位置付けられる、免疫グロブリンドメインのＮ末端またはＣ末端領域に由来するアミノ酸配列によるものであり得る。代替的には、リンカーは、ヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、リンカーは、例えば複数のＧｌｙおよびＳｅｒアミノ酸に富んだ、またはそれらからなる、人工配列でもよい。
【0156】
本明細書に記載される「抗原結合分子」という用語は、抗体の少なくとも抗原結合部位を含む抗体を含むか、またはそれからなる、あらゆるタンパク質またはタンパク質複合体（例えば、複合体形態に結合した複数のポリペプチド鎖からなる）を指す。さらに、抗原結合分子は、抗体部分と融合または複合した１つまたは複数のエレメントをさらに含み、それにより、融合タンパク質などの抗体誘導体をもたらしてもよい。
【0157】
「抗原結合部位」または「結合部位」という用語は、抗体のうち、抗原結合に関与する部分を指す。天然抗体の抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および／もしくは軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域、またはそれらの可変ドメインのアミノ酸残基によって形成される。重鎖（また、場合により軽鎖）のＶ領域内の３つの可変性の高い区間は、「超可変領域」と呼ばれ、フレームワーク領域として知られるより保存されたフランキング区間の間に介在する。抗原結合部位は、結合するエピトープまたは抗原の三次元表面に相補的である表面を提供し、超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ＣＤＲに組み込まれた結合部位は、本明細書では、「ＣＤＲ結合部位」とも呼ばれる。
【0158】
具体的には、本明細書に記載されるＨＣＡｂの抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。
「ＣＤＲ領域」という用語またはそれぞれの配列は、抗原との結合相互作用が可能な可変構造を含む、ＶＨドメインなどの可変抗体ドメインの可変抗原結合領域を指す。ＣＤＲ領域を含む抗体ドメインは、それ自体で使用されてもよく、または、より大きなタンパク様コンストラクト内に組み入れられ、それにより、そのようなコンストラクトのうちの結合機能を有する特異的領域を形成してもよい。可変構造は、免疫グロブリンなどの結合タンパク質の天然レパートリーから、具体的には抗体または免疫グロブリン様分子から誘導され得る。可変構造は、ランダム化技法、特に本明細書に記載されるものによって生産されてもよい。これらには、抗体可変ドメインの突然変異誘発されたＣＤＲループ領域、特に免疫グロブリンのＣＤＲループが含まれる。
「ＣＤＲ領域」という用語またはそれぞれの配列は、抗原との結合相互作用が可能な可変構造を含む、ＶＨドメインなどの可変抗体ドメインの可変抗原結合領域を指す。ＣＤＲ領域を含む抗体ドメインは、それ自体で使用されてもよく、または、より大きなタンパク様コンストラクト内に組み入れられ、それにより、そのようなコンストラクトのうちの結合機能を有する特異的領域を形成してもよい。可変構造は、免疫グロブリンなどの結合タンパク質の天然レパートリーから、具体的には抗体または免疫グロブリン様分子から誘導され得る。可変構造は、ランダム化技法、特に本明細書に記載されるものによって生産されてもよい。これらには、抗体可変ドメインの突然変異誘発されたＣＤＲループ領域、特に免疫グロブリンのＣＤＲループが含まれる。
【0159】
典型的に、特定のＣＤＲ構造をもつ抗原結合部位を有する抗体は、ターゲット抗原に特異的に結合する、すなわち、一対のＶＨドメインのＣＤＲループを介してかかるターゲット抗原を特異的に認識することができる。
【0160】
ＨＣ抗体において、抗原結合部位は、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３ループのみからなる特定のＣＤＲ構造によって特徴付けられる。このような抗原結合部位は、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスなどの動物によって生産される場合、自然状態である、または自然状態の構造および／もしくは立体構造のものであると理解される。抗原結合部位は、例えば、新しい構造を合成する組換え技法によってエンジニアリングされるため、人工的に生産され得るが、それぞれの抗体をコードするそれぞれの遺伝子をトランスジェニック非ヒト動物に組み込むと、自然状態の立体構造を有する新しい合成抗体の生産がもたらされる。
【0161】
親和性成熟の任意のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ技法によって、そのような自然状態の立体構造をさらに親和性成熟することにより、自然状態の立体構造によって特徴付けられ、そのターゲット抗原に特異的に結合する高い親和性によってさらに特徴付けられる、人工抗原結合部位を含むポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を生産することができる。
【0162】
「抗体」という用語は、ヒト、マウス、ウサギ、およびラットを含む哺乳動物、またはニワトリなどの鳥類のような動物由来の抗体に当てはまるものとし、この用語は、動物由来の配列、例えば、マウス配列に基づく組換え抗体を具体的に含むものとする。
【0163】
「抗体」という用語はさらに、完全にヒトの抗体に当てはまる。
免疫グロブリンに関して使用される「完全にヒト」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導される可変および定常領域を有する抗体を含むと理解される。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏで体細胞突然変異によって導入された突然変異）を、例えばＣＤＲに含み得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンもしくは抗体ライブラリーから、または１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体を含む。
免疫グロブリンに関して使用される「完全にヒト」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導される可変および定常領域を有する抗体を含むと理解される。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏで体細胞突然変異によって導入された突然変異）を、例えばＣＤＲに含み得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンもしくは抗体ライブラリーから、または１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体を含む。
【0164】
ヒト免疫グロブリンは、好ましくは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭからなる群から選択または誘導される。
マウス免疫グロブリンは、好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、ＩｇＧ３およびＩｇＭからなる群から選択または誘導される。
マウス免疫グロブリンは、好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、ＩｇＧ３およびＩｇＭからなる群から選択または誘導される。
【0165】
「抗体」という用語はさらに、マウスおよびヒト由来の配列など、異なる種に由来する混合配列を有するキメラ抗体に当てはまる。
具体的には、「抗体」という用語は、ヒトの抗原結合領域と、マウスなどの非ヒトの定常領域またはフレームワーク配列とを含む、マウスなどのトランスジェニック非ヒト動物によって生産される抗体に当てはまる。
具体的には、「抗体」という用語は、ヒトの抗原結合領域と、マウスなどの非ヒトの定常領域またはフレームワーク配列とを含む、マウスなどのトランスジェニック非ヒト動物によって生産される抗体に当てはまる。
【0166】
免疫グロブリンまたは抗体に関して使用される「キメラ」という用語は、抗体鎖の１つの部分が、特定の種から誘導された、または特定のクラスに属する免疫グロブリンにおいて対応する配列と相同であり、鎖の残りのセグメントが、別の種またはクラスの対応する配列と相同である分子を指す。典型的に、可変領域は、１つの哺乳動物種から誘導された免疫グロブリンの可変領域を模倣し、定常部分は、別のものから誘導された免疫グロブリンの配列と相同である。一例において、可変領域は、例えば非ヒト細胞調製物から誘導された定常領域と組み合わせて、ヒト宿主生物由来の容易に利用可能なＢ細胞を使用して、現在知られている供給源から誘導され得る。具体的には、キメラ抗体または抗体フラグメントは、例えば、ヒト可変領域コード配列（またはそれぞれの可変抗体ドメイン）と、マウス定常領域コード配列（またはそれぞれの定常領域抗体ドメイン）とを含む、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスなどのトランスジェニックマウスによって生産され得る。
【0167】
「抗体」という用語はさらに、モノクローナル抗体、具体的には組換え抗体に当てはまり、この用語には、ヒトを含む哺乳動物などの動物に由来し、異なる由来の遺伝子または配列を含む抗体、例えば、キメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来抗体のような、組換え手段によって調製、発現、作出、または単離される、あらゆるタイプの抗体および抗体構造が含まれる。さらなる例は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または他のＤＮＡ配列への抗体遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作出、もしくは単離された抗体を指す。
【0168】
「抗体」という用語は、新規または既存の（本明細書では「親」と呼ばれる）分子、例えば天然に発生する免疫グロブリンの機能的に活性なバリアントを含むと理解される。さらに、この用語は抗体バリアントを含み、そのような分子の誘導体も同様に含むことが理解される。誘導体は、１つもしくは複数の抗体の任意の組み合わせ、および／または融合タンパク質であり、ここで、抗体のいずれかのドメイン、例えば、ＶＨドメインの抗原結合部位を含む抗体ドメイン、またはＶＨドメインは、他の抗体、例えばＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドなどの１つまたは複数の他のタンパク質だけでなく、他のリガンド、酵素、毒素などにも任意の位置で融合していてよい。本明細書に記載される抗体は、具体的には、単離されたポリペプチドとして、または、例えば組換え、融合、もしくはコンジュゲーション技法により、他のペプチドもしくはポリペプチドとの複合分子として使用され得る。
【0169】
抗体の誘導体は、例えば共有結合性カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合などの様々な化学的技法により、他の物質との会合または結合によって取得することもできる。抗体に結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、ＰＥＧ、プロドラッグ、または薬物）であり得る。誘導体には、同じアミノ酸配列を有するが、非天然のまたは化学修飾されたアミノ酸から全面的または部分的に作製された抗体も含まれ得る。特定の実施形態において、抗体は、生物学的に許容されるコンパウンドとの特異的相互作用を可能にする追加のタグを含む誘導体である。本発明において使用可能なタグに関しては、ターゲットへの免疫グロブリンの結合に対する悪影響がないか、または許容できる限り、特に限定されない。好適なタグの例としては、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびＳタグが挙げられる。別の特定の実施形態において、抗体は、標識を含む誘導体である。本明細書で使用される「標識」という用語は、「標識された」抗体を生成するために抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能なコンパウンドまたは組成物を指す。標識は、単独で検出可能なもの、例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識でもよく、または、酵素標識の場合は、検出可能な基質コンパウンドの化学的改変を触媒してもよい。
【0170】
抗体の誘導体は、例えば、親抗原結合（例えば、ＣＤＲ）またはフレームワーク（ＦＲ）配列などの親抗体または抗体配列から誘導されるもの、例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏまたは組換えエンジニアリングによって、あるいは化学的誘導体化または合成によって取得される突然変異体またはバリアントなどである。
【0171】
「バリアント」という用語は、機能的に活性なバリアントを具体的に包含するものとする。本明細書に記載される抗体の機能的バリアントは、抗原結合の特異性に関して特に機能的である。
【0172】
「バリアント」という用語は、特に、特定の抗体のアミノ酸配列もしくは領域において欠失、交換、挿入もしくは欠失の導入を行うための、あるいは、例えば、改善された抗体安定性、向上したエフェクター機能もしくは半減期をエンジニアリングするように定常ドメインのアミノ酸配列を化学的に誘導体化するための、または、例えば当技術分野で利用可能な親和性成熟技法によって抗原結合特性をモジュレートするように可変ドメインのアミノ酸配列を化学的に誘導体化するための、突然変異誘発法によって取得されるような、突然変異抗体または抗体のフラグメントなどの抗体を具体的に指すものとする。例えばランダム化技法によって得られる所望の位置での点突然変異、またはＨＣＡｂエンジニアリングに使用されるドメイン欠失を含め、公知の突然変異誘発法のいずれを用いてもよい。場合によっては、例えば、可能なアミノ酸のいずれか、または抗体配列をランダム化するための好ましいアミノ酸の選択のいずれかにより、位置がランダムに選択される。「突然変異誘発」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を改変するための、当技術分野で認識されているあらゆる技法を指す。好ましいタイプの突然変異誘発としては、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、または他の部位指向性突然変異誘発が挙げられる。
【0173】
抗原が細胞表面で、または細胞内で、またはＬｕｍｉｎｅｘなどのマイクロビーズ上で発現される場合、抗原結合に関する抗体の機能的活性は、典型的に、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩアッセイ、またはフローサイトメトリーベースのアッセイで決定される。
【0174】
機能的に活性なバリアントは、例えば、親抗体、例えば、ＩｇＧ１構造のような免疫グロブリンの特定の自然状態の構造を有するモノクローナル抗体の配列を変化させて、ターゲット抗原の認識における特異性は同じだが親構造とは異なる構造を有するバリアントを取得すること、例えば、抗体ドメインのいずれかを修飾して特定の突然変異を導入すること、または親分子のフラグメントを生産することによって、取得することができる。
【0175】
特定の機能的に活性なバリアントは、１つまたは複数の機能的に活性なＣＤＲバリアントまたは親抗体を含み、その各々が、親ＣＤＲ配列における少なくとも１つの点突然変異を含み、親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0176】
特定のバリアントは、例えば、親ＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に組み込まれ、場合により、親ＣＤＲ配列の各々の１、２、３、または４つのアミノ酸残基が、親またはヒト化抗体の安定性、特異性および親和性を改善するために点突然変異を導入することによってさらに突然変異していてもよい、親抗体の機能的に活性なバリアントである。
【0177】
具体的には、抗体は、親抗体のＣＤＲ配列のいずれかの機能的に活性なＣＤＲバリアントを含むことができ、ここで、機能的に活性なＣＤＲバリアントは、
ａ）親ＣＤＲ配列における１、２、もしくは３つの点突然変異（好ましくは、ＣＤＲ配列の各々における点突然変異の数は０、１、２、または３のいずれかである）、および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端アミノ酸位置もしくは４つのＮ末端アミノ酸位置、もしくは４つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける１もしくは２つの点突然変異、および／または
ｃ）親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性
のうちの少なくとも１つを含み、好ましくは、機能的に活性なバリアント抗体は、本明細書に記載される機能的に活性なＣＤＲバリアントのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、機能的に活性なＣＤＲバリアントのうちの１つまたは複数を含む機能的に活性なバリアント抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する特異性を有する。
ａ）親ＣＤＲ配列における１、２、もしくは３つの点突然変異（好ましくは、ＣＤＲ配列の各々における点突然変異の数は０、１、２、または３のいずれかである）、および／または
ｂ）親ＣＤＲ配列の４つのＣ末端アミノ酸位置もしくは４つのＮ末端アミノ酸位置、もしくは４つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける１もしくは２つの点突然変異、および／または
ｃ）親ＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性
のうちの少なくとも１つを含み、好ましくは、機能的に活性なバリアント抗体は、本明細書に記載される機能的に活性なＣＤＲバリアントのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、機能的に活性なＣＤＲバリアントのうちの１つまたは複数を含む機能的に活性なバリアント抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する特異性を有する。
【0178】
特定の態様によれば、点突然変異は、１つまたは複数のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失および／または挿入のいずれかである。
抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を実現するために、必要に応じて、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｃｈｅｎｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３４９７、２００３）などの当技術分野で周知の方法に従って配列をアラインし、ギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、特定のポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要なあらゆるアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を実現するために、必要に応じて、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｃｈｅｎｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３４９７、２００３）などの当技術分野で周知の方法に従って配列をアラインし、ギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、特定のポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要なあらゆるアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【0179】
抗体バリアントは、機能的であり、かつ、例えば特定のターゲットに結合し、様々な機能特性を有する機能的均等物となり得る、例えばグリコエンジニアリングによって生産された、特定のグリコシル化パターンを有する相同体、類似体、フラグメント、修飾形態、またはバリアントを含むと具体的に理解される。抗体は、グリコシル化型でも非グリコシル化型でもよい。例えば、本明細書に記載される組換え抗体は、その抗体を発現する宿主細胞によって決定される分子の特定のグリコシル化を可能にする適切な哺乳動物細胞において、または非グリコシル化型タンパク質をもたらすグリコシル化機序が欠如した原核細胞において発現され得る。
【0180】
抗体ドメインの、特に定常抗体ドメインの「ベータシート」または「ベータストランド」は、本明細書では、次のように理解される。抗体ドメインは、典型的には、少なくとも２つまたは３つの主鎖水素結合によって側面で接続されて、全体的にねじれたプリーツ状シートを形成する、少なくとも２つのベータストランドからなる。ベータストランドは、典型的に３～１０アミノ酸長の一続きのアミノ酸の区間であり、そのような拡張された立体構造をとり、少なくとも１つの他のストランドとの主鎖水素結合に関与し、これによりベータシートが形成される。ベータシートでは、大半のベータストランドが、他のストランドに隣接して配置され、近隣のものと共に、１つのストランドの主鎖のＮ－Ｈ基が隣接したストランドの主鎖のＣ＝Ｏ基と水素結合を確立した広範な水素結合ネットワークを形成する。
【0181】
ＣＬ（Ｃκ、Ｃλ）、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインなどの抗体定常ドメインの構造は、いくつかが短いアルファヘリックス区間を含む、ループによって接続されたベータストランドからなる、可変ドメインのものと同様である。様々なＦｃ結晶構造のｘ線結晶構造解析のＢ因子から分かるように、フレームワークは大部分が強固であり、ループは比較的柔軟である。抗体定常ドメインは、典型的に、ベータシートを形成する７つのベータストランド（Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ－Ｆ－Ｇ）を有し、これらのベータストランドはループを介して連結されており、３つのループがドメインのＮ末端先端に位置しており（Ａ－Ｂ、Ｃ－Ｄ、Ｅ－Ｆ）、さらに３つのループがドメインのＮ末端先端に位置している（Ｂ－Ｃ、Ｄ－Ｅ、Ｆ－Ｇ）。ドメインの「ループ領域」は、ベータストランドの領域間に位置するタンパク質の部分を指す（例えば、各ＣＨ３ドメインが、Ｎ末端からＣ末端の方向にＡからＧの７つのベータシートを含む）。
【0182】
ある特定の実施形態において、抗体ドメインは、動物（ヒトを含む）に由来するような野生型アミノ酸配列を含んでもよく、または、突然変異を含む人工のものでもよく、例えば、１つまたは複数のベータストランドの少なくとも一部分が、例えば、２つの抗体ドメインのベータシート領域を接続するようなドメイン間ジスルフィド架橋などの別のドメインとの対形成を促進する突然変異、ノブおよび／もしくはホール突然変異、または鎖交換を含むように、異種配列で置換されていてもよい。
【0183】
特定のドメイン突然変異には、追加のドメイン間または鎖間のジスルフィド架橋を形成して、
ａ）追加のドメイン内ジスルフィド結合によって抗体ドメインを安定化すること、および／または
ｃ）追加の鎖間ジスルフィド架橋によって抗体ドメインの２つの鎖を安定化すること
が可能である、新しい（追加の）アミノ酸残基、例えば、Ｃｙｓ残基の組み込みが含まれ得る。
ａ）追加のドメイン内ジスルフィド結合によって抗体ドメインを安定化すること、および／または
ｃ）追加の鎖間ジスルフィド架橋によって抗体ドメインの２つの鎖を安定化すること
が可能である、新しい（追加の）アミノ酸残基、例えば、Ｃｙｓ残基の組み込みが含まれ得る。
【0184】
ジスルフィド結合は通常、２つのシステインもしくはチオールを生じる他のアミノ酸のチオール基の酸化から、またはアミノ酸側鎖のＳ原子を連結することにより人工ジスルフィド架橋を形成するアミノ酸類似体のチオール基の酸化から形成される。具体的には、システインを（追加のアミノ酸またはアミノ酸置換として）一対のドメインの間に挿入して追加のシステイン修飾を保証し、それにより、ジスルフィド結合形成によって安定化されたドメイン対を作ることができる。
【0185】
抗体は、抗体ライブラリーの各結合部位でＣＤＲ配列をフォールドすることによって形成された抗原結合部位をまずスクリーニングし、特異的バインダーを選択することによって生産され得る。次のステップとして、選択されたライブラリーメンバーは、完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合性フラグメントなど、あらゆる種類の抗体コンストラクトをエンジニアリングするために使用され得る、ＣＤＲ配列（または、抗原結合およびさらには表現型特性をモジュレートするようにさらに修飾され得る親ＣＤＲ配列）の供給源となり得る。
【0186】
抗体のライブラリー（例えば、同じターゲット抗原を認識する特異的抗体コンストラクトのレパートリーを含むもの、または、ある特定の動物もしくは種族、例えば、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスによって生産される抗体のナイーブライブラリーであって、異なるターゲット抗原を認識する抗体のレパートリーを含むライブラリー）は、選択されたディスプレイ系または格納容器において各抗体が適切に提示される抗体（例えば、本明細書に記載されるＨＣＡｂ）のセットまたはコレクションを指す。
【0187】
特定のディスプレイ系は、本明細書に記載されるＨＣＡｂなどの抗体のような所定のタンパク質を、そのコード核酸、例えば、そのコードｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは遺伝子とカップリングする。したがって、ライブラリーの各メンバーは、それで提示される抗体をコードする核酸を含む。ディスプレイ系は、限定されるものではないが、細胞、ファージなどのウイルス、リボソーム、酵母などの真核細胞、プラスミドを含むＤＮＡ、およびｍＲＮＡを包含する。
【0188】
このような目的には、例えば、多様な抗体配列を作出するための多数の個々のライブラリーメンバーを含む、または、例えば機能的に活性なライブラリーメンバーが濃縮もしくは安定化されている予め選択されたライブラリーを用いる、あらゆる抗体遺伝子多様性ライブラリーが使用され得る。例えば、ディスプレイ系は、ある特定のターゲットに結合するライブラリーメンバーが濃縮されていてもよい。
【0189】
ライブラリーは、例えば、鎖シャッフリング方法を含む周知の技法によって構築することができる。重鎖シャッフリングでは、ファージ抗体ライブラリー形質転換体を作出するために、例えばヒトＶＨ遺伝子レパートリーを含むベクターに抗体がクローニングされる。さらなる方法は、抗体のＣＤＲの部位指向性突然変異誘発、または、ＮＮＫコドンを含む突然変異誘発オリゴヌクレオチドの適用による、ターゲティングされる残基の完全ランダム化、もしくは、ターゲティングされるアミノ酸残基をコードする位置のオリゴヌクレオチドが、元のヌクレオチド塩基に偏った混合物を含む、倹約突然変異誘発を使用した、ターゲティングされる残基の部分的ランダム化のいずれかを使用する、ＣＤＲの一部もしくは全体がランダム化されるＣＤＲランダム化を含む。代替的には、ＰＣＲ反応において、ｄＮＴＰ類似体の適用、エラープローンポリメラーゼ、またはＭｎ２＋イオンの添加を用いるエラープローンＰＣＲを使用して、ライブラリーを構築することができる。
【0190】
ヒト抗体ライブラリー構築の設計をコードする遺伝子の製造のためには、様々な技法が利用可能である。部分的に重なるフラグメントに配列を分割し、その後これらを合成オリゴヌクレオチドとして調製する、完全に合成のアプローチによってＤＮＡを生産することが可能である。これらのオリゴヌクレオチドは、一緒に混合され、まず約１００℃に加熱してから周囲温度にゆっくりと冷却することによって互いにアニーリングされる。このアニーリングステップの後、合成的にアセンブルされた遺伝子を直接クローニングしてもよく、クローニング前にＰＣＲによって増幅してもよい。これは、大きなシングルポットのヒトライブラリーが望まれ、構築プロセスのために膨大な資源が利用可能である場合に特に望ましい。
【0191】
特定の方法は、直接バインダー選択および内在化ファージ抗体選択のために、ファージ、ファージミド、および／または酵母ライブラリーを用いる。ライブラリーインサートの生成のために、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８２：４８８、１９８５）またはＤｐｎＩ法［Ｗｅｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅ １５１：１１９、１９９４）など、部位指向性突然変異誘発のためのさらなる方法が用いられ得る。
【0192】
「抗原特異的ライブラリー」は、特定の抗原への特異性を有する抗体の存在について精査された、ポリヌクレオチド（またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）のライブラリーを指す。そのようなライブラリーは、任意の抗原群または特定の抗原に対する特異性を有する抗体配列に制限されているか、または別様にそれらが偏在するもしくは濃縮されている場合がある。例示的な抗原特異的ライブラリーは、抗体「最適化ライブラリー」（例えば、「成熟ライブラリー」または「親和性成熟ライブラリー」など）である。
【0193】
本明細書に記載される特定の実施形態は、抗原で免疫化される前の免疫前ライブラリーを含むかまたはそれを発現するマウスに基づく。免疫前ライブラリーは、天然に発生する配列が抗原選択を受ける前の、そのような天然に発生する抗体配列と同様の配列多様性を有するナイーブライブラリーであり得る。免疫前ライブラリーは、免疫前レパートリーを反映もしくは模倣するように設計および調製することができ、かつ／または、Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子のコレクション、ならびに重鎖配列（例えば、公に知られている生殖系列配列）の他の大規模データベースの情報を受けた合理的設計に基づいて設計および調製することができる。本発明のある特定の実施形態において、ヒトまたは非ヒトレパートリーに見出される可能性のあるＶ、Ｄ、およびＪの多様性、ならびに接合部多様性（すなわち、Ｎ１およびＮ２）を表すカセットが、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとしてｄｅ ｎｏｖｏ合成される。
【0194】
「最適化ライブラリー」または「成熟ライブラリー」は、抗原への特異性を有する抗体配列の存在についてナイーブライブラリーまたは免疫前ライブラリーなどのライブラリーを精査することで識別される、抗体配列の少なくとも１つの特徴を向上させるまたは改善するように設計されたライブラリーを指す。そのような成熟ライブラリーは、最初の（親）抗体との関連で導入された多様性を有するライブラリーを生成するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでさらに突然変異誘発するように設計されたライブラリーに、ナイーブライブラリーの精査から取得または識別された１つもしくは複数のＣＤＲ、１つもしくは複数の抗原結合領域、１つもしくは複数のＶＨ領域、および／または１つもしくは複数の重鎖に対応する核酸配列を組み込むことにより、生成され得る。
【0195】
アレイ技術の別の例として、Ｂ細胞のアレイ内の手動またはコンピュータでアドレス指定できる位置で、本明細書に記載される抗体コンストラクトをコードする遺伝子をもたらすＢ細胞クローニングを使用することができる。ロボット工学または手動の方法を使用してこのアレイを操作し、ある特定のタイプの抗体を発現する細胞、および／または、ある特定のターゲットを特異的に認識するものだけを再配置することができる。
【0196】
ある特定の実施形態において、例えば、抗体を生産するように遺伝子エンジニアリングされた本明細書に記載されるマウスなどの好適に免疫化された非ヒトトランスジェニック動物からのＢ細胞クローニング、または哺乳動物細胞発現ライブラリーが使用されるか、あるいは、安定に形質転換された哺乳動物細胞の大集団が、抗体およびタンパク質エンジニアリングの標準的方法およびロボットツールによって生成される。個々のクローンは、好適なインキュベータ内のプレート上に配置されたアドレス指定できるウェル内、かつ／または、例えば液体窒素中で細胞懸濁液を凍結して－１３５℃で貯蔵することを含み得る長期貯蔵条件下、もしくは貯蔵された細胞株の回復を可能にする他の許容される条件下で、生存可能な状態に保たれる。
【0197】
抗体に関して本明細書で使用される「レパートリー」という用語は、多様なターゲットエピトープまたは抗原特異性によって特徴付けられるバリアントなどのバリアントのコレクションを指すものとする。典型的に、抗体の構造（「足場」とも呼ばれる）は、そのようなレパートリーにおいて同じであるが、様々な異なるＣＤＲ配列がある。
【0198】
当技術分野において周知であるように、ある特定の結合特性および親和性を有するタンパク質の識別および単離のために使用され得るディスプレイおよび選択技術には、例えば、細胞を用いる方法および細胞を用いない方法、特に可動ディスプレイ系などのディスプレイ技術を含め、様々なものがある。細胞系の中では、ファージディスプレイ、ウイルスディスプレイ、酵母または他の真核細胞ディスプレイ、例えば哺乳動物または昆虫細胞ディスプレイが使用され得る。可動系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ系などの可溶性フォーマットにおけるディスプレイ系に関し、それらの中には、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、または核酸ディスプレイがある。
【0199】
ターゲットに結合することができる抗原結合構造を提示するライブラリーメンバーについてのライブラリーのスクリーニングは、任意の好適な方法によって行うことができる。スクリーニングステップは、１ラウンドまたは数ラウンドの選択を含み得る。
【0200】
ターゲット抗原に結合することができる抗体を識別するために好適な任意のスクリーニング方法を使用することができる。特に、選択のラウンドは、前記抗原またはそのエピトープに結合する抗体を選択するために前記ターゲットの存在下でライブラリーをインキュベートすることを含み得る。
【0201】
所望の構造をもつ抗体が識別されたら、例えば、ハイブリドーマ技法または組換えＤＮＡ技術を含む、当技術分野で周知の方法により、そのような抗体を生産することができる。
【0202】
ハイブリドーマ法では、本明細書に記載されるマウスなどの適切な非ヒト宿主動物を免疫化して、免疫化のために使用された抗原に特異的に結合する抗体を生産するまたは生産することが可能なリンパ球を活性化させる。代替的には、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用し、リンパ球をプラズマ細胞腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【0203】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、フローサイトメトリー、免疫沈降、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定される。
【0204】
別の具体例によれば、組換えモノクローナル抗体は、必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、周知の組換え発現ベクター、例えば、本明細書に記載される抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは発現カセットを使用して、発現のためにコード配列を組換え宿主細胞にトランスフェクトすることによって生産され得る。組換え宿主細胞は、原核細胞および真核細胞であり得る。
【0205】
特定の態様によれば、コードヌクレオチド配列は、抗体をヒト化するため、または抗体の親和性もしくは他の特徴を改善するための遺伝子操作に使用され得る。例えば、定常領域は、ヒト定常領域に類似するようにエンジニアリングされ得る。ターゲット抗原へのより高い親和性が得られるように抗体配列を遺伝子操作することが望ましい場合がある。当業者には、１つまたは複数のアミノ酸変化を抗体に加えても、ターゲット（エピトープまたは抗原）に対するその結合能力が維持され得ることが明らかであろう。
【0206】
様々な手段による抗体分子の生産は、一般に十分に理解されている。抗体の生産に関係する様々な技法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（２０１４）に記載されている。
【0207】
モノクローナル抗体は、例えば、培養下の連続細胞株によって抗体分子を生産する任意の方法を使用して生産することができる。モノクローナル抗体を調製するための好適な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５）のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法［Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１、１９８４；およびＢｒｏｄｅｕｒら、１９８７、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＬＢ Ｓｃｈｏｏｋ編（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、５１～６３ページ］が挙げられる。
【0208】
「Ｂ細胞」という用語は、液性免疫応答において（Ｔ細胞が司る細胞媒介性免疫応答とは対照的に）大きな役割を果たすリンパ球の一種を指す。Ｂ細胞の主な機能は、抗原に対する抗体を作ること、具体的には、特定の抗原に特異的な細胞表面抗体（ＢＣＲ複合体を形成する）を発現し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割を果たし、最終的には抗原相互作用による活性化後に抗体分泌形質細胞およびメモリーＢ細胞へと発達することである。Ｂ細胞は、適応免疫系の必須の構成要素である。具体的には、Ｂ細胞は、抗原に曝露されると活性化し、プラズマ細胞とも呼ばれる形質細胞、およびメモリー細胞などの免疫グロブリン発現Ｂ細胞バリアントへと分化する。
【0209】
本明細書では「Ｂ細胞レパートリー」とも呼ばれる、Ｂ細胞に関して本明細書で使用される「レパートリー」という用語は、多様なターゲットエピトープまたは抗原特異性を含む免疫グロブリンの発現によって特徴付けられる、Ｂ細胞バリアントなどのバリアントのコレクションを指すものとする。
【0210】
本明細書で使用される「ターゲット」という用語は、エピトープまたは抗原を指すものとする。
本明細書で使用される「抗原」という用語は、動物の免疫系または抗体のライブラリーへの抗原の曝露の結果として抗体の結合部位（少なくとも１つのパラトープ）によって認識されることが示されている抗原およびターゲット分子のすべてを特に含むものとする。具体的には、本明細書に記載される抗体によってターゲティングされる好ましい抗原は、免疫学的もしくは治療的に重要であることが既に証明されている、または重要となることが可能である分子、特に、臨床有効性が試験されたものである。
本明細書で使用される「抗原」という用語は、動物の免疫系または抗体のライブラリーへの抗原の曝露の結果として抗体の結合部位（少なくとも１つのパラトープ）によって認識されることが示されている抗原およびターゲット分子のすべてを特に含むものとする。具体的には、本明細書に記載される抗体によってターゲティングされる好ましい抗原は、免疫学的もしくは治療的に重要であることが既に証明されている、または重要となることが可能である分子、特に、臨床有効性が試験されたものである。
【0211】
「抗原」という用語は、ターゲット分子の全体、またはかかる分子のフラグメント、特に、ターゲットのポリペプチドまたは炭水化物構造などの部分構造を説明するために使用される。そのような部分構造（Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープなど、「エピトープ」と呼ばれることが多い）は、免疫学的に重要であり得る、すなわち、同じく天然抗体またはモノクローナル抗体によって認識可能である。
【0212】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗原と特異的抗体との間の界面に存在する分子構造を特に指すものとし、エピトープと相互作用する抗体表面は、「パラトープ」と呼ばれる。化学的には、エピトープは、炭水化物の配列もしくは構造、不連続エピトープ内のペプチド配列もしくは配列セット、脂肪酸、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドから構成され得る。抗原性分子は、有機、生化学、または無機の物質である場合、「ハプテン」と呼ばれる。エピトープまたはハプテンは、上記物質の誘導体または任意の組み合わせからなり得る。エピトープがポリペプチドである場合、通常、少なくとも３アミノ酸、好ましくは８～５０アミノ酸、より好ましくは約１０～２０アミノ酸がペプチドに含まれる。エピトープは、線状エピトープまたは不連続エピトープのいずれかであり得る。線状エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一のセグメントから構成される。線状エピトープは、連続的でも、部分的に重なってもよい。不連続エピトープは、三次構造を形成するようにポリペプチドをフォールドすることによってまとめられたアミノ酸または炭水化物から構成され、アミノ酸は、必ずしも線状配列において互いに隣接しているとは限らない。具体的には、エピトープは、診断上重要な分子の少なくとも一部であり、すなわち、サンプル中のエピトープの非存在または存在は、疾患、または患者の健康状態、または製造におけるプロセスステータス、または環境および食物のステータスのいずれかに、質的または量的に相関する。エピトープは、治療上重要な分子、すなわち、疾患の過程を変化させる、特異的結合ドメインによってターゲティングすることができる分子の少なくとも一部である場合もある。
【0213】
本明細書で使用される場合、「特異性」または「特異的結合」という用語は、分子の不均質集団における目的の同族リガンドを決定する結合反応を指す。したがって、特定の条件（例えば、免疫アッセイ条件）下で、抗体がその特定のターゲットに結合し、サンプル中に存在する他の分子に有意な量で結合することはない。特異的結合とは、結合が、選択されたターゲット同一性、高、中、または低の結合親和性またはアビディティに関して選択的であることを意味する。選択的結合は通常、結合定数または結合動態が、サンプル中の競合ターゲットと少なくとも１０倍異なる場合に実現され、好ましくは、この差異は、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である。
【0214】
特異的結合は、同様の抗原、または異なる種の同じ抗原（類似体）との特定の交差反応性を除外しない。例えば、結合実体は、好ましくは、前臨床動物実験を容易にするように、ヒトターゲットに類似する齧歯類または霊長類のターゲットとも交差反応し得る。
【0215】
本明細書で使用される「遺伝子座」という用語は、ＤＮＡコード配列、あるいは、ＤＮＡのうち、発現産物、すなわち、宿主生物のゲノムの一部などのゲノム配列、または、例えば定義された制限部位もしくは相同性領域のようなターゲット部位で組み入れられるベクターの一部をコードするセグメントを指す。
【0216】
制限部位は、発現カセットが適切なリーディングフレームに挿入されることを確実にするように設計され得る。典型的に、外来（本明細書では外因性ともいう）ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位で挿入され、その後、ベクターにより、伝染性ベクターＤＮＡと併せて宿主細胞内に運搬される。
【0217】
典型的に、遺伝子座は、本明細書に記載される少なくとも１つの遺伝子または１つもしくは複数の遺伝子セグメントを包含する。「遺伝子座」という用語は、遺伝子が活発に転写されること、またはインタクトであることを含意しない。不活性化された遺伝子が包含され得る。
【0218】
本明細書で使用される「免疫グロブリン重鎖遺伝子座」という用語は、１つまたは複数の重鎖定常領域に操作可能に連結された、１つまたは複数のＶ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＤ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のＪ遺伝子セグメントを含むＶＨドメインをコードする遺伝子座に関する。好ましくは、本明細書で言及される免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのトランスジェニック核酸配列、具体的には本明細書に記載されるＣγ遺伝子セグメントを含む、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座である。免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、それぞれ、ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列、ならびにそれぞれのＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列の発現を制御するように作動可能に連結している発現制御配列を含む。特定の実施形態によれば、ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列はヒトのものであり、ＶＨ重鎖遺伝子座の発現制御配列はマウスの、好ましくは内因性発現制御配列であり、したがって、キメラＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントがもたらされる。
【0219】
Ｖ遺伝子セグメントの複雑性は、遺伝子座に存在するＶ遺伝子セグメントの数を増加させることによって、または異なるＶ遺伝子セグメントを各々が含む異なる遺伝子座を使用することによって高めることができる。
【0220】
好ましくは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域は、任意の脊椎動物種または本明細書に記載されるキメラから誘導された５～１２０（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０）またはそれ以上の異なるＶ遺伝子セグメントを含む。
【0221】
好ましくは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域は、２～４０（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０または４０）またはそれ以上のＤ遺伝子セグメントを含む。Ｄ遺伝子セグメントは、任意の脊椎動物種から誘導されてもよく、本明細書に記載されるようなキメラでもよい。
【0222】
好ましくは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域は、２～２０（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０）またはそれ以上のＪ遺伝子セグメントを含む。Ｊ遺伝子セグメントは、任意の脊椎動物種から誘導されてもよく、本明細書に記載されるようなキメラでもよい。
【0223】
Ｖ遺伝子セグメントは、ＤＮＡレベルでＤ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメントと組み換わって機能的なＶＤＪエキソンを形成することが可能でなければならない。転写およびＲＮＡスプライシング後、ＶＤＪエキソンおよび重鎖定常（エフェクター）領域（いくつかのエキソンを含み得る）が、ｍＲＮＡ転写産物において隣接し、翻訳のために機能的になり、本発明によれば、核酸が発現されると重鎖のみ抗体を生成する。
【0224】
操作上、重鎖定常領域は、Ｂ細胞でＶＤＪエキソンと共に発現されることが可能な、天然に発生する、またはエンジニアリングされた遺伝子セグメントによってコードされる。
抗体は、アイソタイプまたはクラスとして知られる異なる様々な形態で生じ得る。有胎盤哺乳動物には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭとして知られる５つの抗体アイソタイプがある。これらは各々、免疫グロブリン（抗体と交換可能に使用されることがある名称）を表す接頭辞「Ｉｇ」を用いて名付けられ、生物学的特性、機能的位置、および様々な抗原に対処する能力において異なる。抗体アイソタイプの異なる接尾辞は、抗体が含む異なるタイプの重鎖を意味し、各重鎖クラスがアルファベット順にα（アルファ）、γ（ガンマ）、δ（デルタ）、ε（イプシロン）、およびμ（ミュー）と名付けられる。これにより、それぞれＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭとなる。
抗体は、アイソタイプまたはクラスとして知られる異なる様々な形態で生じ得る。有胎盤哺乳動物には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭとして知られる５つの抗体アイソタイプがある。これらは各々、免疫グロブリン（抗体と交換可能に使用されることがある名称）を表す接頭辞「Ｉｇ」を用いて名付けられ、生物学的特性、機能的位置、および様々な抗原に対処する能力において異なる。抗体アイソタイプの異なる接尾辞は、抗体が含む異なるタイプの重鎖を意味し、各重鎖クラスがアルファベット順にα（アルファ）、γ（ガンマ）、δ（デルタ）、ε（イプシロン）、およびμ（ミュー）と名付けられる。これにより、それぞれＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭとなる。
【0225】
本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座の重鎖定常領域は、ＩｇＧ型の重鎖のみ抗体の生成が起こり得るように、機能的ＣＨ１ドメインなしで発現される、本明細書に記載されるトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを少なくとも含む。各重鎖定常領域は、Ｃδ、Ｃμ、ＣεおよびＣα遺伝子セグメントからなる群から選択される、１つまたは複数の追加の重鎖定常領域遺伝子セグメントを含んでもよい。重鎖定常領域遺伝子セグメントは、好ましいクラスまたは必要とされる抗体クラスの混合に応じて選択される。
【0226】
例えば、ＣＨ１ドメインの全部または一部の欠失を含むトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含む異種免疫グロブリン重鎖遺伝子座の全部または一部の発現により、エンジニアリングされたＩｇｈ遺伝子座に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプに依存して、場合によりいくつかまたはすべてのＩｇＧアイソタイプが生産される。
【0227】
代替的には、選択された抗体混合物が取得され得る。例えば、重鎖定常領域がＣαおよびＣμ遺伝子セグメントを含む場合、ＩｇＡおよびＩｇＭがさらに取得され得る。
具体的には、本明細書に記載されるＣγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの全部または一部をコードするヌクレオチド配列の欠失、例えばＣＨ１エキソンの欠失を含む。そのような欠失は、ＣＨ１ドメインからその機能性を奪う限り、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分的欠失であり得る。好ましくは、部分的欠失は、シャペロン結合ドメイン、特にＢｉＰシャペロン結合ドメインを除去または不活性化する。
具体的には、本明細書に記載されるＣγ遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの全部または一部をコードするヌクレオチド配列の欠失、例えばＣＨ１エキソンの欠失を含む。そのような欠失は、ＣＨ１ドメインからその機能性を奪う限り、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の部分的欠失であり得る。好ましくは、部分的欠失は、シャペロン結合ドメイン、特にＢｉＰシャペロン結合ドメインを除去または不活性化する。
【0228】
場合により、異種重鎖遺伝子座は、Ｃμ欠損性であるか、または不活性のＣμ遺伝子セグメントを含む。具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、Ｃμ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の、機能喪失突然変異、例えば、停止コドンの導入、または欠失により、不活性である。具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインの欠失によって不活性である。
【0229】
具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、Ｃμ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列全体、または前記配列の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％のうちのいずれか１つの欠失により、不活性である。
【0230】
具体的には、Ｃμ遺伝子セグメントは、そのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのいずれか１つまたはすべてに、機能喪失突然変異、欠失、または不活性化突然変異、好ましくは停止コドンの導入を含む。好ましくは、Ｃμ遺伝子セグメントは、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに停止コドンを含む。
【0231】
具体例において、ヒトにおける治療用途のために使用されるＨＣＡｂの誘導のために、この遺伝子座に存在するＶＤＪコード配列は、場合により修飾されているヒト生殖系列配列から誘導され、定常領域は、宿主動物が齧歯類、例えばマウスである場合、齧歯類由来であり得る。可溶性ヒトＶＨ結合ドメインおよび齧歯類定常エフェクター領域を含む選択された重鎖のみ抗体をその後クローニングし、齧歯類エフェクター領域を、任意選択のヒト定常エフェクター領域、または代替的なＶＨ融合タンパク質、ＶＨドメイン抗体複合体などを誘導するために使用される可溶性ＶＨドメインによって置換してもよい。
【0232】
別の具体例によれば、重鎖のみ抗体が獣医学または別の目的で使用される場合、Ｖ、ＤおよびＪコード配列は、意図される目的に最も適した脊椎動物または哺乳動物から誘導されることが好ましい。例えば、Ｖ遺伝子セグメントならびにＤおよびＪ遺伝子セグメントは、獣医学、産業、農業、診断、または試薬の用途など、意図される使用に応じて、他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウマなど）から誘導されてもよい。
【0233】
「重鎖定常領域エキソン」（「ＣＨエキソン」）は、天然に発生する脊椎動物の、特に哺乳動物の、ＣＨエキソンの配列を含む。これは、クラスに固有の様式で異なる。例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡは、天然にＣＨ４ドメインを欠いている。「ＣＨエキソン」という用語は、ＣＨエキソンが、重鎖定常領域の構成要素であるときに、本明細書で定義されるような機能的なＨＣＡｂを形成することができる限り、その誘導体、相同体およびフラグメントもその範囲内に含む。
【0234】
本明細書に記載される特定の実施形態において、トランスジェニックマウスの内因性カッパおよびラムダ軽鎖遺伝子座は、内因性κおよび／もしくはλ軽鎖遺伝子座またはそれらの一部の機能喪失突然変異または欠失のような、１つまたは複数の修飾によって非機能的である。
【0235】
例示的な好適な修飾は、次のように理解される。カッパ鎖遺伝子座を不活性化するためには、Ｃκから最も遠いＶκ遺伝子セグメントであるＶκ２－１３７と、Ｃκに最も近いＪκであるＪκ５との間の３．２Ｍｂゲノム領域の全体を、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）ストラテジーによって欠失させる。これは、Ｖκ２－１３７の上流およびＪκ５の下流に適切なターゲティング配列を挿入した後、間にあるゲノム領域をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣｒｅによって欠失させることによって行われる。同様のストラテジーを使用することで、ラムダ鎖遺伝子座が不活性化される。マウスラムダＶ遺伝子セグメント（ＩｇｌＶ）を含む１９４Ｋｂ領域全体が、ＲＭＣＥによって欠失する。この場合、ＩｇｌＶ２の上流およびＩｇｌＶ１の下流に適切なターゲティング配列を挿入した後、間にあるゲノム領域をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣｒｅによって欠失させる。
【0236】
遺伝子座は、本明細書にさらに記載されるように、抗体をコードするエキソンを発現するまたは含むようにエンジニアリングされ得る。
組換え遺伝子座は、部位特異的編集および／または組換えのための様々な従来技法を使用して作出することができる。好ましくは、修飾された遺伝子座は、遺伝子セグメントを含む一片のＤＮＡ（ここでは「ドナーＤＮＡ」と呼ばれる）を、宿主生物の重鎖遺伝子座などの非ヒト動物免疫グロブリン遺伝子座の修飾バージョン（ここでは「アクセプター対立遺伝子」と呼ばれる）に挿入することによって生成される。アクセプター対立遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼなどの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼのための認識部位（ｌｏｘＰ部位およびｌｏｘＰ部位の突然変異バージョン）を含み得る。ドナーＤＮＡは、同じＣｒｅリコンビナーゼ認識部位によって（例えば、片側にｌｏｘＰ部位があり、反対側にｌｏｘＰ部位の突然変異バージョンがあるように、５’末端と３’末端との両方で）フランキングされていてもよい。Ｃｒｅリコンビナーゼは、アクセプター対立遺伝子へのドナーＤＮＡの挿入を触媒するために使用され得る。
組換え遺伝子座は、部位特異的編集および／または組換えのための様々な従来技法を使用して作出することができる。好ましくは、修飾された遺伝子座は、遺伝子セグメントを含む一片のＤＮＡ（ここでは「ドナーＤＮＡ」と呼ばれる）を、宿主生物の重鎖遺伝子座などの非ヒト動物免疫グロブリン遺伝子座の修飾バージョン（ここでは「アクセプター対立遺伝子」と呼ばれる）に挿入することによって生成される。アクセプター対立遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼなどの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼのための認識部位（ｌｏｘＰ部位およびｌｏｘＰ部位の突然変異バージョン）を含み得る。ドナーＤＮＡは、同じＣｒｅリコンビナーゼ認識部位によって（例えば、片側にｌｏｘＰ部位があり、反対側にｌｏｘＰ部位の突然変異バージョンがあるように、５’末端と３’末端との両方で）フランキングされていてもよい。Ｃｒｅリコンビナーゼは、アクセプター対立遺伝子へのドナーＤＮＡの挿入を触媒するために使用され得る。
【0237】
代替的な実施形態において、遺伝子セグメントは、相同組換えだけではないにせよ、主に相同組換えによって、免疫グロブリン遺伝子座に導入される。そのような実施形態では、抗体コード遺伝子セグメントを含む核酸配列をフランキングするゲノムターゲティング相同性アーム（すなわち、５’末端と３’末端との両方にある、ターゲット配列と相同でありハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列）から構成されるターゲティング配列またはベクターが用いられる。これらのゲノム相同性アームは、免疫グロブリン重鎖をコードするＤＮＡなどのＤＮＡを免疫グロブリン遺伝子座に挿入することを容易にする。ターゲティング配列は、細胞のゲノムにおける、修飾される免疫グロブリン遺伝子座の領域をフランキングする、またはそれに隣接して発生するＤＮＡ配列と相同である配列を指す。フランキングまたは隣接配列は、宿主細胞のゲノムにおいて、遺伝子座自体の中、またはコード配列の上流もしくは下流にあり得る。ターゲティング配列は、細胞ゲノムに挿入される配列、例えば組換え部位の配列が、ベクターのターゲティング配列によってフランキングされるように、細胞トランスフェクションに使用される組換えＤＮＡベクターに挿入される。
【0238】
挿入または欠失のようなゲノム内の遺伝子変化を達成するために相同組換えが用いられる多くの事例において、さらなる修飾には、所望の結果が達成され得る可能性を高めるために、エンジニアリングされた部位特異的エンドヌクレアーゼの使用が必要となる。そのようなエンドヌクレアーゼは、ターゲットゲノム内のユニーク配列に対して高度に特異的になるようにエンジニアリングすることができるため、また、それらが認識する部位で二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすため、有用である。二本鎖切断は、切断のごく近辺のＤＮＡとのターゲティング相同性を有するターゲティングベクターによる相同組換えを促進する。したがって、ターゲティングベクターと、ベクターによってターゲティングされる領域内またはその近くのＤＮＡを切断する部位特異的エンドヌクレアーゼとの組み合わせは、典型的に、ターゲティングベクター単独の使用よりも大幅に高い相同組換え効率をもたらす。さらに、１つまたは複数の部位特異的エンドヌクレアーゼと、一方のアームが欠失させる領域の片側をターゲティングし、他方のアームが反対側をターゲティングする、２つのターゲティング相同性アームから構成されるターゲティングベクターとを使用することにより、ゲノム欠失の作出を容易にすることが可能である。
【0239】
部位特異的組換えは、リコンビナーゼ認識に必要とされる短い特異的ＤＮＡ配列だけが組換えの起こる部位であるという点で、一般的な相同組換えとは異なる。部位特異的組換えには、部位を認識し、これらの部位での組換えを触媒するために、特殊化されたリコンビナーゼが必要である。バクテリオファージおよび酵母から誘導された複数の部位特異的組換え系（各々、リコンビナーゼおよび特異的同族ターゲット部位を含む）が、ＤＮＡ組み入れの目的で真核細胞において機能することが示されており、したがって、本明細書に記載される使用に適用可能である。これらは、バクテリオファージＰ１ Ｃｒｅ／ｌｏｘ、酵母ＦＬＰ－ＦＲＴ系、および部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーのＤｒｅ系を含む。このような系および使用方法は、先行技術で十分に説明されている。リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）の手順は、野生型および突然変異体ｌｏｘＰ（またはＦＲＴなど）の部位の組み合わせを、適切なリコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐ）、ならびに負および／または正の選択と併せて使用することによって容易になる。ＲＭＣＥは、用いられる部位が互いに同一である場合および／または選択の非存在下で起こるが、挿入反応ではなく切除が優先されるためにプロセスの効率は低下し、（正の選択を取り入れない場合）適切に突然変異した細胞が濃縮されない。
【0240】
バクテリオファージラムダＩｎｔインテグラーゼ、ＨＫ２０２２インテグラーゼなどの他のチロシンファミリー系、およびバクテリオファージｐｈｉＣ３１、Ｒ４Ｔｐ９０１インテグラーゼなどの別個のセリンリコンビナーゼファミリーに属するさらなる系が、それぞれの組換え部位を使用して哺乳動物細胞で機能することが知られており、本明細書に記載される使用に同じく適用可能である。
【0241】
本明細書に記載される方法は、同じリコンビナーゼを利用するが部位間の組換えを促進しない部位特異的組換え部位を具体的に利用する。例えば、ｌｏｘＰ部位および突然変異型ｌｏｘＰ部位が宿主のゲノムに組み入れられ得るが、宿主へのＣｒｅの導入は、２つの部位の組換えを引き起こさない。むしろ、ｌｏｘＰ部位は別のｌｏｘＰ部位と組み換わり、突然変異型部位は、別の同様の突然変異型ｌｏｘＰ部位だけと組み換わる。
【0242】
リコンビナーゼ媒介カセット交換を容易にするためには、２つのクラスのバリアントリコンビナーゼ部位が利用可能である。一方は、部位の８ｂｐスペーサー領域内に突然変異を保有し、他方は、１３ｂｐ逆方向反復に突然変異を有する。
【0243】
ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：２２８７、１９８６）、ｌｏｘ５１７１およびｌｏｘ２２７２（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、Ｇｅｎｅ、２１６：５５、１９９８）、ｍ２、ｍ３、ｍ７、およびｍｉｌ（Ｌａｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０：３０６７、２００２）などのスペーサー突然変異体は、それら自体とは容易に組み換わるが、野生型部位との組換え率は著しく低下する。この類の突然変異体部位をリコンビナーゼ媒介カセット交換によるＤＮＡ挿入のために使用することの例は、ＢａｅｒおよびＢｏｄｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２：４７３、２００１に見出すことができる。
【0244】
逆方向反復突然変異体は、第２のクラスのバリアントリコンビナーゼ部位を表す。例えば、ｌｏｘＰ部位は、左逆方向反復（ＬＥ突然変異体）または右逆方向反復（ＲＥ突然変異体）に改変された塩基を含み得る。ＬＥ突然変異体のｌｏｘ７１は、野生型配列からＴＡＣＣＧに変化した５ｂｐを左逆方向反復の５’末端に有する（Ａｒａｋｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：８６８、１９９７）。同様に、ＲＥ突然変異体のｌｏｘ６６では、最も３’側の５塩基がＣＧＧＴＡに変化している。逆方向反復突然変異体は、プラスミドインサートを染色体ＤＮＡに組み入れるために使用され得る。例えば、ＬＥ突然変異体は、「ターゲット」染色体ｌｏｘＰ部位として使用することができ、これに「ドナー」ＲＥ突然変異体が組み換わる。組換え後、ＲＥ部位を含んでいたＤＮＡのドナー部分は、片側に二重突然変異体部位（ＬＥおよびＲＥの両方の逆方向反復突然変異を含む）、反対側に野生型部位がフランキングするようにゲノム内に挿入された状態で見出される（ＬｅｅおよびＳａｄｏｗｓｋｉ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、８０：１、２００５）。二重突然変異体は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識されないように野生型部位と十分に異なり、挿入されたセグメントは、したがって、２つの部位間のＣｒｅによる組換えによって切除できない。
【0245】
ある特定の態様において、部位特異的組換え部位は、コード核酸領域または調節配列ではなく、イントロンまたは遺伝子間領域に導入され得る。これにより、動物細胞のゲノムに部位特異的組換え部位を挿入する際に、適切な遺伝子発現に必要な調節配列またはコード領域を意図せず破壊することが回避され得る。
【0246】
部位特異的組換え部位の導入は、従来の相同組換え技法によって実現され得る。そのような技法は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、およびＮａｇｙ、（２００３）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などの参考文献に記載されている。
【0247】
ゲノムへの特異的組換えは、当技術分野で知られる正または負の選択のために設計されたベクターを使用して容易にすることができる。置換反応を受けた細胞の識別を容易にするために、適切な遺伝子マーカー系を用い、例えば、選択培地の使用によって細胞を選択することができる。しかしながら、ゲノム配列が、置換間隔の２つの端点またはそれらの近隣に外来性核酸配列を実質的に含まないことを確実にするためには、置換された核酸を含む細胞の選択後にマーカー系／遺伝子が除去され得ることが望ましい。
【0248】
リコンビナーゼは、精製されたタンパク質として用意されてもよく、リコンビナーゼ活性をもたらすために細胞内で一過性に発現されるコンストラクトから発現されてもよい。代替的には、マーカー遺伝子および関連する組換え部位が欠如した子孫を生産するために、前記リコンビナーゼを発現する動物と交配され得るトランスジェニック動物を生成するように、細胞を使用してもよい。
【0249】
本明細書では、遺伝子に関する「内因性」という用語は、遺伝子が細胞にとって自然であること、すなわち、遺伝子が非修飾型細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に存在することを示す。内因性遺伝子は、野生型細胞の該遺伝子座に存在する（天然に見られるような）野生型遺伝子であり得る。内因性遺伝子は、ゲノム内で野生型遺伝子と同じ遺伝子座に存在する場合、修飾された内因性遺伝子でもよい。そのような修飾された内因性遺伝子の一例は、その配列内に欠失を含む、または外来核酸が挿入される遺伝子である。内因性遺伝子は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノムなどに存在し得る。具体的には、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、本明細書に記載される修飾を含む内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座である。
【0250】
本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、内因性Ｃμ遺伝子セグメントは不活性になるように修飾されるが、Ｃμ遺伝子セグメントはその遺伝子座内で野生型マウスと同じ位置に存在する。
【0251】
代替的な実施形態において、遺伝子セグメントは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって、この系で典型的に使用される相同配列依存的修復によってではなく、非相同末端結合アプローチ（例えば、Ｈｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、４４：ｅ８５、２０１６を参照されたい）を使用して、免疫グロブリン遺伝子座に導入される。
【0252】
本発明との関連において、「異種」という用語は、本明細書に記載されるようなヌクレオチド配列もしくは遺伝子座が、それが存在する哺乳動物にとって内因性ではないこと、または内因性遺伝子座が、内因性配列の置換もしくは除去によって修飾されていることを意味する。
【0253】
本明細書では、核酸エレメント、例えば、免疫グロブリン遺伝子セグメントなどの核酸コンストラクト、または遺伝子などの非コードもしくはコード遺伝子配列、または遺伝子座に関する「トランスジェニック」という用語は、それぞれ、遺伝子、遺伝子セグメント、および遺伝子座が、細胞にとって自然ではない（すなわち、同じ種の野生型細胞において細胞ゲノム内の同じ位置で自然に発生しない）こと、または組換え細胞を生産するための細胞にとって外来であること、すなわち、野生型細胞ではない修飾型（組換え）細胞のゲノムに核酸エレメントが存在することを示す。トランスジェニック遺伝子セグメントは、野生型細胞におけるそれぞれの遺伝子座または位置とは異なる遺伝子座または位置に存在する（したがって天然では同じ遺伝子座に見られない）野生型遺伝子セグメントであり得る。トランスジェニック遺伝子セグメントは、野生型遺伝子または生物に見られるもの以外のゲノム内の異なる遺伝子座に存在する場合、（修飾型または未修飾型）内因性コード配列または遺伝子を含み得る。そのようなトランスジェニック核酸エレメントの一例は、修飾された内因性のもの、例えば、ＣＨ１ドメインに欠失または修飾を含む本明細書に記載されるＣγ遺伝子セグメントであり、この遺伝子セグメントは、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流に組み入れられ、したがって、Ｃγ遺伝子セグメントが免疫グロブリン重鎖遺伝子座内でＣμ遺伝子セグメントの下流に置かれる、野生型細胞におけるそれぞれの場所とは異なる場所にある。
【0254】
「導入遺伝子」という用語は、本明細書では、細胞、特に宿主動物の細胞のゲノムに人工的に挿入された、またはその前の遺伝物質を表現するために使用される。本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、例えば、ＣＨ１ドメインに欠失を含む本明細書に記載されるＣγ遺伝子セグメントのような、宿主のゲノムに導入され組み込まれ得る発現コンストラクトおよび／またはターゲティングベクターに含まれる核酸などの核酸分子またはエレメントを指す。これにより、宿主生物（マウスなど）が「トランスジェニック」宿主としてエンジニアリングされる。
【0255】
「組換え」という用語は、宿主細胞において天然に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換えまたはトランスジェニック分子は、天然に発生しないようなかたちで一緒に連結された２つ以上の天然に発生する配列を含み得る。組換えまたはトランスジェニック細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。細胞がトランスジェニックまたは組換え核酸を受けた場合、その核酸は細胞にとって「外因性」である。
【0256】
「組換え」という用語は、「遺伝子エンジニアリングによって調製されること、またはその結果」を具体的に意味する。代替的には、「エンジニアリングされた」という用語が使用される。例えば、それぞれの親配列をエンジニアリングしてエンジニアリングされた抗体またはドメインをもたらすことによってバリアントを生産するように、抗体または抗体ドメインが修飾され得る。組換え宿主は、発現ベクターもしくはターゲティングベクターを具体的に含むか、または、特に、宿主にとって外来のヌクレオチド配列を用いて、組換え核酸配列を含むように遺伝子エンジニアリングされている。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主において発現させることによって生産される。本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、免疫グロブリン、特に、以下のような、組換え手段によって調製、発現、作出、または単離された抗体を含む。
【0257】
ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくは染色体導入型（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウスなどの非ヒト動物）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、
ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、
ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、および
ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列などを他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作出、または単離された抗体。このような組換え抗体は、例えば抗体成熟中に発生する再構成および突然変異を含むようにエンジニアリングされた抗体を含む。
ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、
ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、および
ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列などを他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作出、または単離された抗体。このような組換え抗体は、例えば抗体成熟中に発生する再構成および突然変異を含むようにエンジニアリングされた抗体を含む。
【0258】
諸実施形態のある特定の態様において、本発明のトランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリン領域をさらに含む。例えば、部分的または完全にヒトの抗体を創薬目的で作出するために、内因性マウス免疫グロブリン領域をヒト免疫グロブリン配列で置換するための多数の方法が開発されてきた。そのようなマウスの例としては、例えば、米国特許第７，１４５，０５６号、同第７，０６４，２４４号、同第７，０４１，８７１号、同第６，６７３，９８６号、同第６，５９６，５４１号、同第６，５７０，０６１号、同第６，１６２，９６３号、同第６，１３０，３６４号、同第６，０９１，００１号、同第６，０２３，０１０号、同第５，５９３，５９８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６１２，２０５号、および同第５，５９１，６６９号に記載されているものが挙げられる。
【0259】
本明細書で使用される場合、「キメラ免疫グロブリン遺伝子セグメント」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントコード配列、特にヒトＩＧＨ（ＶＨ、ＤおよびＪＨ）コード配列、およびマウス発現制御配列を含む免疫グロブリン遺伝子セグメントを指すために使用される。そのようなキメラ遺伝子セグメントを含むマウスは、部分的にヒトのものである導入された外因性免疫グロブリン領域を含むゲノムを有し、導入された領域は、ヒト可変領域コード配列と、マウス由来またはマウスの内因性ゲノムのものであり、キメラ免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはキメラ免疫グロブリン遺伝子座の導入によってマウスゲノムにノックインされた、ヒト配列の発現を制御するマウス非コード性調節配列とを含む。特に、マウス配列、具体的にはマウスの非コード性の調節配列は、対応するマウス内因性配列、すなわち内因性野生型免疫グロブリン遺伝子座のものと同一の配列に基づく。
【0260】
ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の発現を目的とする、本明細書に記載されるマウス発現制御配列は、プロモーター、転写開始および停止配列、エンハンサーおよびアクチベーター配列、またはリボソーム結合部位からなる群から具体的に選択される。そのような発現制御配列の具体例は、プロモーター、５’非翻訳配列、リーダーペプチドのコード配列の間にあるイントロン、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）、およびスプライス部位を含み得る、コード配列をフランキングする配列である。
【0261】
特に好ましい態様において、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスは、ＷａｂｌおよびＫｉｌｌｅｅｎによって米国公開第２０１３／０２１９５３５号に記載されたようなキメラ免疫グロブリンセグメントを含む。そのようなトランスジェニックマウスは、導入された部分的にヒトの免疫グロブリン領域を含むゲノムを有し、導入された領域は、ヒト可変領域コード配列と、マウスの内因性ゲノムに基づく非コード可変配列とを含む。具体的には、本発明のトランスジェニック細胞およびマウスは、内因性免疫グロブリン領域の一部または全部が除去されたゲノムを有する。
【0262】
別の好ましい態様では、本明細書に記載されるマウスのゲノム内容が改変されて、それらのＢ細胞が、細胞ごとに複数の機能的ＶＨドメインを発現することが可能になり、すなわち、細胞が、ＷＯ２０１７０３５２５２Ａ１に記載されているような二重特異性抗体を生産するようになる。
【0263】
本明細書で使用される「ベクター」は、好適な宿主生物における、クローニングされた組換えヌクレオチド配列の、すなわち組換え遺伝子の転写、およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義される。ベクターには、自己複製するか否かにかかわらず、細胞を形質転換、形質導入、またはトランスフェクトするために使用され得る、プラスミドおよびウイルス、ならびにあらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれる。ベクターは、自律的に複製するヌクレオチド配列、およびゲノムに組み入れられるヌクレオチド配列を含み得る。発現ベクターは、宿主細胞における自律複製起点またはゲノム組み入れ部位、１つまたは複数の選択マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、またはピューロマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、カナマイシン、Ｇ４１８、もしくはハイグロマイシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子）、複数の制限酵素切断部位、好適なプロモーター配列、および転写ターミネータをさらに含んでもよく、これらの構成要素は一緒に作動可能に連結している。
【0264】
一般的なタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは通常、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、かつ好適な宿主細胞に容易に導入され得る、二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子である。プラスミドは、多くの場合、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含み、外来ＤＮＡを挿入するのに好適な１つまたは複数の制限部位を有する。具体的には、「プラスミド」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することのできる輸送手段を指す。
【0265】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載される抗体などの特定の組換えタンパク質を生産するために形質転換される初代対象細胞、およびそのあらゆる子孫を指すものとする。すべての子孫が親細胞と厳密に同一であるとは限らないが（意図的もしくは偶発的な突然変異、または環境における差異のため）、元々形質転換された細胞と同じ機能性を子孫が保持する限り、そのような改変された子孫がこれらの用語に含まれることを理解されたい。「宿主細胞株」という用語は、組換え遺伝子を発現させて組換え抗体などの組換えポリペプチドを生産するために使用される宿主細胞の細胞株を指す。本明細書で使用される「細胞株」という用語は、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを指す。そのような宿主細胞または宿主細胞株は、組換えポリペプチドを生産するために、細胞培養下で維持され、かつ／または培養され得る。
【0266】
核酸、抗体または他のコンパウンドに関して本明細書で使用される「単離された」または「単離」という用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが天然では関連するであろう環境から十分に分離されたコンパウンドを指すものとする。「単離された」は、他のコンパウンドもしくは物質との人工もしくは合成の混合物、または基礎的活性に干渉せず、例えば不完全な精製のために存在し得る不純物の存在の排除を必ずしも意味しない。特に、本明細書に記載される単離された核酸分子は、化学合成されたものを含むことも意図している。
【0267】
本明細書に記載される核酸に関して、「単離された核酸」という用語が使用されることがある。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、その由来である生物の天然に発生するゲノムにおいてそれがすぐ隣接している配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み入れられたＤＮＡ分子を含み得る。ＲＮＡに適用される場合、「単離された核酸」という用語は、上記で定義したような単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を主に指す。代替的には、この用語は、天然状態（すなわち、細胞または組織内）では関連するであろう他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を指し得る。「単離された核酸」は（ＤＮＡにせよＲＮＡにせよ）、さらに、生物学的手段または合成手段によって直接生産され、その生産中に存在する他の構成要素から分離された分子を表し得る。
【0268】
単離された抗体などのポリペプチドまたはタンパク質に関して、「単離された」という用語は、それらの天然環境、またはそれらが調製される環境、例えば、かかる調製がｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで行われる組換えＤＮＡ技術による場合は細胞培養下で、それらと共に見出される他のコンパウンドのような、それらが天然に関連している物質を含まない、または実質的に含まないコンパウンドを具体的に指すものとする。単離されたコンパウンドは、希釈剤またはアジュバントと共に製剤しても、実用目的のために単離することができ、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または治療で使用される場合、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。
【0269】
本明細書に記載される抗体は、特に、異なるターゲット抗原に対するものであり、かつ／または抗体ドメインの異なる構造的構成を含む、他の抗体を実質的に含まない、単離された形態で提供される。それでも、単離された抗体は、単離された抗体と、例えば、異なる特異性を有するモノクローナル抗体または抗体フラグメントのような少なくとも１つの他の抗体との組み合わせを含む、複合調製物に含まれ得る。
【0270】
具体的には、本明細書に記載される抗体は、実質的に純粋な形態で提供される。本明細書で使用される「実質的に純粋」または「精製された」という用語は、核酸分子または抗体などのコンパウンドの少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちのいずれか１つを含む調製物を指すものとする。純度は、コンパウンドに適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【0271】
「部位特異的組換え」は、次の３つの事象のいずれかを含む、２つの適合する組換え部位間の組換えのプロセスを指す：
ａ）組換え部位によってフランキングされた、予め選択された核酸の欠失、
ｂ）組換え部位によってフランキングされた、予め選択された核酸のヌクレオチド配列の反転、および
ｃ）異なる核酸分子上にある組換え部位に近接した核酸領域の相互交換。核酸セグメントのこの相互交換は、核酸分子の一方または両方が環状である場合に組み入れ事象をもたらすことを理解されたい。
ａ）組換え部位によってフランキングされた、予め選択された核酸の欠失、
ｂ）組換え部位によってフランキングされた、予め選択された核酸のヌクレオチド配列の反転、および
ｃ）異なる核酸分子上にある組換え部位に近接した核酸領域の相互交換。核酸セグメントのこの相互交換は、核酸分子の一方または両方が環状である場合に組み入れ事象をもたらすことを理解されたい。
【0272】
前述の説明は、以下の実施例を参照するとより十分に理解されるであろう。しかしながら、かかる実施例は、本発明の１つまたは複数の実施形態を行う方法を代表するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【0273】
実施例１
重鎖のみ（ＨＣＯ）抗体の生産のためにＩｇｈｍの上流の内因性マウスＩｇｈ遺伝子座にマウスＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットを導入するための相同組換えの使用。
重鎖のみ（ＨＣＯ）抗体の生産のためにＩｇｈｍの上流の内因性マウスＩｇｈ遺伝子座にマウスＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットを導入するための相同組換えの使用。
【0274】
ＨＣＯ抗体（またはＨＣＡｂ）の生成のためにＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットを導入するための例示的な方法が、図２および３に示されている。
相同組換えターゲティングベクター（図２）の２つの必須構成要素は、修飾される内因性遺伝子座の領域をフランキングする相同ＤＮＡセグメントとの配列同一性を共有する、短い相同性アーム（ＳＨＡ）および長い相同性アーム（ＬＨＡ）である。この場合、ＳＨＡは、対応するマウスＪｈ非コード配列によってフランキングされたヒトＪＨ２－ＪＨ６遺伝子セグメントからなる（配列番号２）。ＬＨＡは、５’イントロンで開始して３’イントロンで終結するＩｇｈｍ遺伝子の全体からなる（配列番号１２）。５’末端から始まるターゲティングベクターの他の特筆すべき特徴には、次のものが含まれる。１）ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（Ｐｇｋ）により駆動され、ｐｏｌｙＡ部位（ｐＡ）を含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である、Ｐｇｋ＿ＴＫ＿ｐＡ（配列番号１）。このエレメントは、ターゲティングベクターを組み入れた、しかし相同組換えによらない、細胞に対するガンシクロビルでの負の選択のために使用される。相同組換え中、ＳＨＡの５’側（すなわちＬＨＡの３’側）の非相同ＤＮＡが排除される（図２）。この例において、ベクターが相同組換えによって組み入れられる場合、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子が欠失する。相同組換えによってベクターを組み入れなかった細胞はすべて、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を保持し、殺傷される。２）Ｔ３バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのためのＴ３プロモーター（配列番号３）。このＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ファージプロモーターに対して高度に特異的である。この９９ＫＤ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成を触媒し、少数のＢ細胞またはハイブリドーマからのＶＤＪ再構成の迅速なクローニングを可能にする。３）強力なＣＡＧプロモーターによって駆動され、ｐｏｌｙＡ部位を含むピューロマイシン抵抗性遺伝子である、ＣＡＧ＿ＰｕｒｏＲ＿ｐＡ（配列番号５）。このエレメントは、ピューロマイシン抵抗性に基づく、ターゲティングベクターを組み入れた細胞の正の選択のために使用される。４）相同組換えによってターゲティングベクターをゲノムに安定に組み入れた細胞は、ガンシクロビルおよびピューロマイシンの両方に対して抵抗性をもつことに留意されたい。５）ＣＡＧ＿ＰｕｒｏＲ＿ｐＡエレメントは、適切にターゲティングされたＥＳ細胞クローンの識別後に、Ｆｌｐリコンビナーゼを供給することによって、このエレメントをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで除去するために使用することのできる、ＦＲＴ部位（配列番号４および配列番号６）によってフランキングされていることに留意されたい。Ｅμエンハンサー（配列番号７）は、遺伝子座の転写を促進するために、Ｉｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットの上流に含まれている。このターゲティングベクターでは、これに、Ｉｇｈｇ１ ５’イントロンの部分の配列（配列番号８）、Ｉｇｈｇ１ヒンジ５’イントロンの部分の配列（配列番号９）、Ｉｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子（配列番号１０）、およびヒト成長ホルモン１ポリアデニル化シグナル配列（ｈＧＨ１ ｐＡ、配列番号１１）が続く。すぐ下流にはＬＨＡ（配列番号１２）がある。これは、Ｉｇｈｍ ５’イントロンの部分の配列（配列番号１３）と、３’ＵＴＲを含むＩｇｈｍ遺伝子（配列番号１４）とから構成され、これに、Ｉｇｈｍ ３’イントロンの部分の配列（配列番号１５）が続く。ＶＤＪＨエキソンがＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子ではなくＣμに直接スプライスされる場合にＬＣ依存性μＨＣの発現を防止するために、停止コドン（ＴＧＡ）をＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ Ｉｇｈｍエキソンに導入した。このターゲティングベクターでは、内因性Ｉｇｈ遺伝子座に存在するμスイッチ（Ｓ）領域が欠如しているため、ターゲティングされる遺伝子座でもＳ領域が欠如し、したがってアイソタイプスイッチを起こすことができない。ターゲティングベクターは、電気穿孔によってＥＳ細胞に導入する。ガンシクロビルおよびピューロマイシンを補った培地で細胞を増殖させる。その後、生存している単離ＥＳ細胞クローンを、新しく導入されたＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットの５’および３’で内部に位置するプライマーを用い、広く用いられている遺伝子ターゲティングストラテジーを使用したゲノムＰＣＲにより、遺伝子ターゲティングの成功についてモニターする。ＳＨＡの５’側をフランキングするＤＮＡ配列にマッピングするプローブと、ＬＨＡの３’側をフランキングするＤＮＡ配列にマッピングする第２のプローブと、ベクター内のゲノム同一性の２つのアーム間の新規ＤＮＡ内をマッピングする第３のプローブとを使用したゲノムサザンブロットにより、ターゲティングカセットの適切な組み入れをさらに検証する（正しくターゲティングされた遺伝子座の構造は、図３に示され、以降、ＨＣＯ遺伝子座と呼ばれる）。
相同組換えターゲティングベクター（図２）の２つの必須構成要素は、修飾される内因性遺伝子座の領域をフランキングする相同ＤＮＡセグメントとの配列同一性を共有する、短い相同性アーム（ＳＨＡ）および長い相同性アーム（ＬＨＡ）である。この場合、ＳＨＡは、対応するマウスＪｈ非コード配列によってフランキングされたヒトＪＨ２－ＪＨ６遺伝子セグメントからなる（配列番号２）。ＬＨＡは、５’イントロンで開始して３’イントロンで終結するＩｇｈｍ遺伝子の全体からなる（配列番号１２）。５’末端から始まるターゲティングベクターの他の特筆すべき特徴には、次のものが含まれる。１）ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（Ｐｇｋ）により駆動され、ｐｏｌｙＡ部位（ｐＡ）を含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である、Ｐｇｋ＿ＴＫ＿ｐＡ（配列番号１）。このエレメントは、ターゲティングベクターを組み入れた、しかし相同組換えによらない、細胞に対するガンシクロビルでの負の選択のために使用される。相同組換え中、ＳＨＡの５’側（すなわちＬＨＡの３’側）の非相同ＤＮＡが排除される（図２）。この例において、ベクターが相同組換えによって組み入れられる場合、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子が欠失する。相同組換えによってベクターを組み入れなかった細胞はすべて、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を保持し、殺傷される。２）Ｔ３バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのためのＴ３プロモーター（配列番号３）。このＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ファージプロモーターに対して高度に特異的である。この９９ＫＤ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成を触媒し、少数のＢ細胞またはハイブリドーマからのＶＤＪ再構成の迅速なクローニングを可能にする。３）強力なＣＡＧプロモーターによって駆動され、ｐｏｌｙＡ部位を含むピューロマイシン抵抗性遺伝子である、ＣＡＧ＿ＰｕｒｏＲ＿ｐＡ（配列番号５）。このエレメントは、ピューロマイシン抵抗性に基づく、ターゲティングベクターを組み入れた細胞の正の選択のために使用される。４）相同組換えによってターゲティングベクターをゲノムに安定に組み入れた細胞は、ガンシクロビルおよびピューロマイシンの両方に対して抵抗性をもつことに留意されたい。５）ＣＡＧ＿ＰｕｒｏＲ＿ｐＡエレメントは、適切にターゲティングされたＥＳ細胞クローンの識別後に、Ｆｌｐリコンビナーゼを供給することによって、このエレメントをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで除去するために使用することのできる、ＦＲＴ部位（配列番号４および配列番号６）によってフランキングされていることに留意されたい。Ｅμエンハンサー（配列番号７）は、遺伝子座の転写を促進するために、Ｉｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットの上流に含まれている。このターゲティングベクターでは、これに、Ｉｇｈｇ１ ５’イントロンの部分の配列（配列番号８）、Ｉｇｈｇ１ヒンジ５’イントロンの部分の配列（配列番号９）、Ｉｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子（配列番号１０）、およびヒト成長ホルモン１ポリアデニル化シグナル配列（ｈＧＨ１ ｐＡ、配列番号１１）が続く。すぐ下流にはＬＨＡ（配列番号１２）がある。これは、Ｉｇｈｍ ５’イントロンの部分の配列（配列番号１３）と、３’ＵＴＲを含むＩｇｈｍ遺伝子（配列番号１４）とから構成され、これに、Ｉｇｈｍ ３’イントロンの部分の配列（配列番号１５）が続く。ＶＤＪＨエキソンがＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子ではなくＣμに直接スプライスされる場合にＬＣ依存性μＨＣの発現を防止するために、停止コドン（ＴＧＡ）をＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ Ｉｇｈｍエキソンに導入した。このターゲティングベクターでは、内因性Ｉｇｈ遺伝子座に存在するμスイッチ（Ｓ）領域が欠如しているため、ターゲティングされる遺伝子座でもＳ領域が欠如し、したがってアイソタイプスイッチを起こすことができない。ターゲティングベクターは、電気穿孔によってＥＳ細胞に導入する。ガンシクロビルおよびピューロマイシンを補った培地で細胞を増殖させる。その後、生存している単離ＥＳ細胞クローンを、新しく導入されたＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットの５’および３’で内部に位置するプライマーを用い、広く用いられている遺伝子ターゲティングストラテジーを使用したゲノムＰＣＲにより、遺伝子ターゲティングの成功についてモニターする。ＳＨＡの５’側をフランキングするＤＮＡ配列にマッピングするプローブと、ＬＨＡの３’側をフランキングするＤＮＡ配列にマッピングする第２のプローブと、ベクター内のゲノム同一性の２つのアーム間の新規ＤＮＡ内をマッピングする第３のプローブとを使用したゲノムサザンブロットにより、ターゲティングカセットの適切な組み入れをさらに検証する（正しくターゲティングされた遺伝子座の構造は、図３に示され、以降、ＨＣＯ遺伝子座と呼ばれる）。
【0275】
マウスＥＳ細胞で生じる、最も一般的に生じる染色体異常を区別するように設計されたｉｎ ｓｉｔｕ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して、ＰＣＲおよびサザンブロットで検証されたＥＳ細胞のクローンの核型を分析する。そのような異常を有するクローンは、さらなる使用から除外する。ＰＣＲおよびサザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断され、核型分析に基づいて検出可能な染色体異常を有しないＥＳ細胞クローンを、さらなる使用のために選択する。
【0276】
標準的な手順に従い、適切にターゲティングされたＩｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットをマウス重鎖遺伝子座内に有するＥＳ細胞クローンを系統ＤＢＡ／２由来のマウス胚盤胞にミクロ注入して、部分的にＥＳ細胞から誘導されたキメラマウスを作出する。外被に対するＥＳ細胞から誘導された寄与のレベルが最も高い雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。ここで選択される雌マウスは、その生殖系列にＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を有するＣ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統のものである。これらの交配からの子を、Ｉｇｈｇ１ΔＣＨ１遺伝子カセットの存在、およびＦＲＴにフランキングされたピューロマイシン抵抗性遺伝子の喪失について分析する。（図３）ＴＲＮ００３４またはＴＲＮ３４と呼ばれる、正しくターゲティングされたマウスを使用して、マウスのコロニーを確立する。
【0277】
実施例２
ＨＣＯマウスの骨髄（ＢＭ）におけるＢ細胞の発達。
先行技術では（例えば、ＷＯ２０１１／０７２２０４Ａ１を参照されたい）、機能的な軽鎖を欠き、ＣＨ１ドメインを欠いた組換えＣγ遺伝子セグメントの上流の機能的なＣμ遺伝子セグメントを有するマウスにおいて、ＩｇＧ型のＨＣＡｂが生産される。これらのマウスにおけるＨＣＡｂの生産には、大きな不利点がある。機能的なＣμ遺伝子セグメントがあれば、抗原ＢＣＲとしてカノニカルなＩｇＭを有する成熟型Ｂ細胞が正常に発達する。しかしながら、免疫応答中に抗体のクラスが（所望の）γ鎖にスイッチし、これらの鎖は、Ｌ鎖が欠如しているため、それと対になることができない。これには２つの効果がある：
（ｉ）特異性がＨ鎖とＬ鎖の組み合わせによって定義された抗体をもつ細胞が、もはや刺激されず、死ぬことになり、
（ｉｉ）不対ＶＨは構造的に存続不可能であるため、特異性がＨ鎖によって主に定義された細胞が死ぬ可能性がある。
ＨＣＯマウスの骨髄（ＢＭ）におけるＢ細胞の発達。
先行技術では（例えば、ＷＯ２０１１／０７２２０４Ａ１を参照されたい）、機能的な軽鎖を欠き、ＣＨ１ドメインを欠いた組換えＣγ遺伝子セグメントの上流の機能的なＣμ遺伝子セグメントを有するマウスにおいて、ＩｇＧ型のＨＣＡｂが生産される。これらのマウスにおけるＨＣＡｂの生産には、大きな不利点がある。機能的なＣμ遺伝子セグメントがあれば、抗原ＢＣＲとしてカノニカルなＩｇＭを有する成熟型Ｂ細胞が正常に発達する。しかしながら、免疫応答中に抗体のクラスが（所望の）γ鎖にスイッチし、これらの鎖は、Ｌ鎖が欠如しているため、それと対になることができない。これには２つの効果がある：
（ｉ）特異性がＨ鎖とＬ鎖の組み合わせによって定義された抗体をもつ細胞が、もはや刺激されず、死ぬことになり、
（ｉｉ）不対ＶＨは構造的に存続不可能であるため、特異性がＨ鎖によって主に定義された細胞が死ぬ可能性がある。
【0278】
したがって、先行技術のこのようなマウスでは、ＶＨ選択が「延期される」、すなわち免疫応答中に起こる。
トランスジェニックＣγ１遺伝子セグメントをＣμ遺伝子セグメント上流の内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み入れることにより、ＶＨ選択は「前倒しされる」、すなわち個体発生中に起こる。
トランスジェニックＣγ１遺伝子セグメントをＣμ遺伝子セグメント上流の内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み入れることにより、ＶＨ選択は「前倒しされる」、すなわち個体発生中に起こる。
【0279】
このようなマウスにおいてＢ細胞が正常に発達することを示すために、図４に示すＣＤ抗原に特異的なｍＡｂで骨髄細胞の表面を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。対照ＴＲＮ１１／２／５マウスでは、ＷａｂｌおよびＫｉｌｌｅｅｎによる同時係属出願の米国公開第２０１３０２１９５３５号Ａ１に記載されているように、内因性ＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座が、マウス調節配列によってフランキングされたヒトＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座コード配列でそれぞれ置換されている。ＴＲＮ３４／２９／３０マウスでは、ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントはＴＲＮ１１と同一であるが、Ｉｇｈ遺伝子座の残りは、図３に示されるように、ＩｇＧ１ ＨＣＯ抗体をコードするように修飾されている。ＶκおよびＶλ遺伝子座は、それぞれ、ＴＲＮ２９およびＴＲＮ３０対立遺伝子で不活性化されている。フロープロット中の数字は、所定のゲートでの細胞のパーセンテージを示す。
【0280】
ＴＲＮ１１／２／５マウスの遺伝子構造：
－ マウス調節配列によってフランキングされたヒトＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座コード配列でそれぞれ置換された、内因性ＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座
ＴＲＮ３４／２９／３０マウスの遺伝子構造：
－ ＨＣＯ遺伝子座：Ｉｇｈｇ１ΔＣＨ１および停止コドン（ＴＧＡ）を、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ Ｉｇｈｍエキソンに導入した、
－ キメラＶＨ遺伝子座：内因性ＶＨ遺伝子座を置換する、マウス調節配列によってフランキングされたヒトＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座コード配列、ならびに
－ 不活性化されたＶκおよびＶλ遺伝子座。
－ マウス調節配列によってフランキングされたヒトＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座コード配列でそれぞれ置換された、内因性ＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座
ＴＲＮ３４／２９／３０マウスの遺伝子構造：
－ ＨＣＯ遺伝子座：Ｉｇｈｇ１ΔＣＨ１および停止コドン（ＴＧＡ）を、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ Ｉｇｈｍエキソンに導入した、
－ キメラＶＨ遺伝子座：内因性ＶＨ遺伝子座を置換する、マウス調節配列によってフランキングされたヒトＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子座コード配列、ならびに
－ 不活性化されたＶκおよびＶλ遺伝子座。
【0281】
Ｂ細胞の発達段階も示されている。成熟型再循環Ｂは、骨髄で生成され、末梢で、例えば脾臓でその成熟を完了し、血流を介して骨髄（ＢＭ）に再循環したＢ細胞を示す。
初期Ｂ系統細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３－）の頻度は、両マウス系統で同一であるが、ＨＣＯマウスでは、対照と比較して、ｐｒｏ－Ｂ細胞の頻度は増加し、それらの子孫のｐｒｅ－Ｂ細胞の頻度は減少する（下のパネル）。この減少は、末梢における移行期および成熟型のＢ細胞（図５、７、８）、ならびにＢＭにおける成熟型再循環Ｂ細胞（上のパネル）における対応する減少をもたらす。ｐｒｏ－Ｂ細胞およびｐｒｅ－Ｂ細胞の頻度の変化については、いくつかの説明が考えられる。通常、ｐｒｅ－Ｂ細胞は、サロゲート軽鎖およびＣＤ７９Ａ／Ｂと会合し、低レベルで細胞表面に発現されるμＨＣを合成する。これにより、未成熟型Ｂ細胞段階を示すＶ→Ｊ再構成および軽鎖遺伝子の発現の前に増殖するよう細胞にシグナルが送られる。ＨＣＯマウスのγ１ ＨＣはＳＬＣと会合せず、ＣＤ７９Ａ／Ｂと共に細胞表面に発現される。このようなｐｒｅ－Ｂ細胞は、野生型（ＷＴ）と同程度まで増殖しない可能性があり、ＬＣ遺伝子再構成の必要がないため、より迅速に未成熟型Ｂ細胞へと分化してＢＭを離れる可能性がある。ｐｒｏ－Ｂ細胞の増加は、ｐｒｏ－Ｂからｐｒｅ－Ｂへの発達ステップにおける障害があり得ることを示唆する。
初期Ｂ系統細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３－）の頻度は、両マウス系統で同一であるが、ＨＣＯマウスでは、対照と比較して、ｐｒｏ－Ｂ細胞の頻度は増加し、それらの子孫のｐｒｅ－Ｂ細胞の頻度は減少する（下のパネル）。この減少は、末梢における移行期および成熟型のＢ細胞（図５、７、８）、ならびにＢＭにおける成熟型再循環Ｂ細胞（上のパネル）における対応する減少をもたらす。ｐｒｏ－Ｂ細胞およびｐｒｅ－Ｂ細胞の頻度の変化については、いくつかの説明が考えられる。通常、ｐｒｅ－Ｂ細胞は、サロゲート軽鎖およびＣＤ７９Ａ／Ｂと会合し、低レベルで細胞表面に発現されるμＨＣを合成する。これにより、未成熟型Ｂ細胞段階を示すＶ→Ｊ再構成および軽鎖遺伝子の発現の前に増殖するよう細胞にシグナルが送られる。ＨＣＯマウスのγ１ ＨＣはＳＬＣと会合せず、ＣＤ７９Ａ／Ｂと共に細胞表面に発現される。このようなｐｒｅ－Ｂ細胞は、野生型（ＷＴ）と同程度まで増殖しない可能性があり、ＬＣ遺伝子再構成の必要がないため、より迅速に未成熟型Ｂ細胞へと分化してＢＭを離れる可能性がある。ｐｒｏ－Ｂ細胞の増加は、ｐｒｏ－Ｂからｐｒｅ－Ｂへの発達ステップにおける障害があり得ることを示唆する。
【0282】
いずれにせよ、予想されるすべての発達段階のＢ系統細胞がＨＣＯマウスに存在する。
実施例３
ＨＣＯマウスの末梢におけるＢ細胞の分化および細胞表面ＩｇＧ１発現。
実施例３
ＨＣＯマウスの末梢におけるＢ細胞の分化および細胞表面ＩｇＧ１発現。
【0283】
示されているＣＤ抗原に特異的な蛍光コンジュゲートｍＡｂにより、実施例３と同じマウス由来の脾臓細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図５）。フロープロット中の数字は、所定のゲートでの細胞のパーセンテージを示す。ＢＭにおけるｐｒｅ－Ｂ細胞および成熟型再循環Ｂ細胞の頻度の低減に基づいて予期されたように（図４）、ＨＣＯマウスの脾臓中のすべてのＢ細胞サブセットが全体的に減少した。分析されたサブセットには、全Ｂ、Ｂ１、Ｂ２、移行期１および２（Ｔ１およびＴ２）、濾胞（Ｆｏ．）Ｂ、ならびに辺縁帯（ＭＺ）Ｂが含まれた。数は低減したにせよ、予想されるすべての分化段階の細胞がＨＣＯマウスに存在した。
【0284】
多数の脾臓ＭＺ（８０％）およびＦｏ．Ｂ（９１％）細胞が細胞表面でγ１ ＨＣを発現し（図６）、ＨＣＯ遺伝子座がｉｎ ｖｉｖｏで機能的であることを示した。
リンパ節では（ＬＮ、図７）、全Ｂ細胞（上のパネル）および成熟型Ｆｏ．Ｂ細胞（中央パネル）が低減した。脾臓Ｂ細胞と同様に、ＨＣＯマウスのＬＮ Ｂ細胞の８９％が、γ１ ＨＣを細胞表面に発現した（下のパネル）。
リンパ節では（ＬＮ、図７）、全Ｂ細胞（上のパネル）および成熟型Ｆｏ．Ｂ細胞（中央パネル）が低減した。脾臓Ｂ細胞と同様に、ＨＣＯマウスのＬＮ Ｂ細胞の８９％が、γ１ ＨＣを細胞表面に発現した（下のパネル）。
【0285】
腹膜腔では（図８）、全Ｂ細胞（上のパネル）、Ｆｏ．Ｂ細胞、およびＢ１ Ｂ細胞（中央パネル）が低減した。脾臓およびＬＮ Ｂ細胞と同様に、ＨＣＯマウスの腹膜Ｂ細胞のほとんどが、γ１ ＨＣを細胞表面に発現した（下のパネル）。
【0286】
まとめると、ＨＣＯマウスのＢＭおよび末梢では、すべてのＢ細胞の発達段階およびサブセットの頻度は低減したが（ＢＭのｐｒｏ－Ｂ細胞を除く）、すべてのＢ細胞の発達段階およびサブセットが存在し、γ１ ＨＣＯ遺伝子座はｉｎ ｖｉｖｏで正常に機能している。
【0287】
実施例４
ＨＣＯマウスにおける血清免疫グロブリン（Ｉｇ）のレベル
図９は、未免疫化ＴＲＮ１１／２／５（白抜きの丸）およびＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯ（黒塗りの丸）マウスにおける血清ＩｇＧ１およびＩｇＭを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。光学密度がＹ軸に、血清希釈度がＸ軸に示されている。標準化（白抜きの四角）のために、１００μｇ／ｍｌのモノクローナルＩｇＧ１（左）およびＩｇＭ（右）を同じく連続的に希釈した。ＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯマウスの血清では、対照ＴＲＮ１１／２／５血清中のＩｇＧ１（重鎖および軽鎖を含む）をわずかに下回る、有意なレベルの重鎖のみのＩｇＧ１が検出された。これに対し、ＨＣＯマウスにおけるＩｇＭはバックグラウンドレベルであった。同様のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血清ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を検出した（図１０）。ＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯマウスでは、３つすべてのＩｇアイソタイプが検出不可能であった。
ＨＣＯマウスにおける血清免疫グロブリン（Ｉｇ）のレベル
図９は、未免疫化ＴＲＮ１１／２／５（白抜きの丸）およびＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯ（黒塗りの丸）マウスにおける血清ＩｇＧ１およびＩｇＭを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。光学密度がＹ軸に、血清希釈度がＸ軸に示されている。標準化（白抜きの四角）のために、１００μｇ／ｍｌのモノクローナルＩｇＧ１（左）およびＩｇＭ（右）を同じく連続的に希釈した。ＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯマウスの血清では、対照ＴＲＮ１１／２／５血清中のＩｇＧ１（重鎖および軽鎖を含む）をわずかに下回る、有意なレベルの重鎖のみのＩｇＧ１が検出された。これに対し、ＨＣＯマウスにおけるＩｇＭはバックグラウンドレベルであった。同様のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血清ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を検出した（図１０）。ＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯマウスでは、３つすべてのＩｇアイソタイプが検出不可能であった。
【0288】
これらの結果は、ＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯマウスでは、３つの停止コドンがμＨＣオープンリーディングフレームに存在するため、Ｂ細胞がＩｇＭ分泌形質細胞に分化できないことを示す。これらの結果は、ＨＣＯマウスではμスイッチ領域がＩｇｈ遺伝子座から欠失しているため、これらのマウスではＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃまたはＩｇＧ３へのアイソタイプスイッチがないことも示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図11-5】
【図11-6】
【図11-7】
【図11-8】
【図11-9】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）の多様なレパートリーをＢ細胞が発現するマウスを生産する方法であって、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、該内因性Ｃμ遺伝子セグメントが、機能喪失突然変異、Ｃμ遺伝子セグメントの一部の欠失、または１つもしくは複数の停止コドンを導入する１つもしくは複数の突然変異によって不活性である、上記方法。
【請求項2】
マウスが、抗原で免疫化されると、抗原特異的Ｂ細胞を活性化し、多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するプラズマ細胞へのそれらの分化を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に、好ましくは、配列番号７を含む内因性Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に位置付けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｃγ１遺伝子セグメントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＣＨ１ドメインの少なくとも一部が、ＢｉＰシャペロン結合ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
マウスが、不活性化または欠失した内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、好ましくは、マウスが、内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列、ならびに前記ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列と作動可能に連結している発現制御配列を含み、好ましくは、該発現制御配列がマウスのものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列が、抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換えられ、それにより、所定のＢ細胞において組み換えられたＶＨコード配列が得られ、該Ｂ細胞は、形質細胞へと分化すると、組み換えられたＶＨコード配列によってコードされる抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ａ）マウス胚性幹細胞を用意するステップと、ｂ）１つまたは複数の発現カセット内のＣγ遺伝子セグメントを含む核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを用意するステップと、
ｃ）該１つまたは複数のベクターを該細胞に導入するステップと、
ｄ）トランスジェニック細胞を選択するステップであって、ｂ）の配列が、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、ターゲティングされた組み入れによって該細胞の細胞ゲノムに組み込まれており、Ｃμ遺伝子セグメントが場合により不活性である、ステップと、
ｅ）該トランスジェニック細胞を利用して、該トランスジェニック細胞から誘導されたトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なマウスであって、その内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内に、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流のトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、マウス。
【請求項11】
少なくとも２つのＶＨ、２つのＤ、および２つのＪＨであるヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列のレパートリーを含むＶＨ重鎖遺伝子座を含む、請求項１０に記載のマウス。
【請求項12】
内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、請求項１０または１１に記載のマウス。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なマウスに由来するＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現するＢ細胞レパートリー。
【請求項14】
ＶＨドメインの異なる様々な抗原特異的ＨＣＡｂを発現する、請求項１３に記載のＢ細胞レパートリー。
【請求項15】
抗原特異的ＶＨドメインを含む抗体を生産する方法であって、ａ）抗原でマウスを免疫化するステップであって、該マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、それにより、抗原特異的ＨＣＡｂを発現する細胞のレパートリーをもたらす、ステップと、
ｂ）レパートリーから、抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを発現する細胞を選択するステップと、
ｃ）ＨＣＡｂから抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列を決定するステップと、
ｄ）抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法。
【請求項16】
Ｂ細胞レパートリーまたはＶＨを含む分子のレパートリーの生産のための方法における、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のマウスの使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0288】
これらの結果は、ＴＲＮ３４／２９／３０ ＨＣＯマウスでは、３つの停止コドンがμＨＣオープンリーディングフレームに存在するため、Ｂ細胞がＩｇＭ分泌形質細胞に分化できないことを示す。これらの結果は、ＨＣＯマウスではμスイッチ領域がＩｇｈ遺伝子座から欠失しているため、これらのマウスではＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃまたはＩｇＧ３へのアイソタイプスイッチがないことも示す。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）の多様なレパートリーをＢ細胞が発現するマウスを生産する方法であって、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、上記方法。
［態様２］マウスが、抗原で免疫化されると、抗原特異的Ｂ細胞を活性化し、多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するプラズマ細胞へのそれらの分化を誘導する、態様１に記載の方法。
［態様３］Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に、好ましくは、配列番号７を含む内因性Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に位置付けられる、態様１または２に記載の方法。
［態様４］Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｃγ１遺伝子セグメントを含む、態様１～３のいずれか一に記載の方法。
［態様５］ＣＨ１ドメインの少なくとも一部が、ＢｉＰシャペロン結合ドメインを含む、態様１～４のいずれか一に記載の方法。
［態様６］マウスが、不活性化または欠失した内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、好ましくは、マウスが、内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、態様１～５のいずれか一に記載の方法。
［態様７］内因性Ｃμ遺伝子セグメントが不活性である、態様１～６のいずれか一に記載の方法。
［態様８］内因性Ｃμ遺伝子セグメントが、機能喪失突然変異、Ｃμ遺伝子セグメントの一部の欠失、または１つもしくは複数の停止コドンを導入する１つもしくは複数の突然変異によって不活性である、態様１～７のいずれか一に記載の方法。
［態様９］免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列、ならびに前記ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列と作動可能に連結している発現制御配列を含み、好ましくは、該発現制御配列がマウスのものである、態様１～８のいずれか一に記載の方法。
［態様１０］ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列が、抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換えられ、それにより、所定のＢ細胞において組み換えられたＶＨコード配列が得られ、該Ｂ細胞は、形質細胞へと分化すると、組み換えられたＶＨコード配列によってコードされる抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能である、態様９に記載の方法。
［態様１１］ａ）マウス胚性幹細胞を用意するステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内のＣγ遺伝子セグメントを含む核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを用意するステップと、
ｃ）該１つまたは複数のベクターを該細胞に導入するステップと、
ｄ）トランスジェニック細胞を選択するステップであって、ｂ）の配列が、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、ターゲティングされた組み入れによって該細胞の細胞ゲノムに組み込まれており、Ｃμ遺伝子セグメントが場合により不活性である、ステップと、
ｅ）該トランスジェニック細胞を利用して、該トランスジェニック細胞から誘導されたトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む、態様１～１０のいずれか一に記載の方法。
［態様１２］態様１～１１のいずれかに記載の方法によって取得可能なマウスであって、その内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内に、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流のトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、マウス。
［態様１３］少なくとも２つのＶＨ、２つのＤ、および２つのＪＨであるヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列のレパートリーを含むＶＨ重鎖遺伝子座を含む、態様１２に記載のマウス。
［態様１４］内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、態様１２または１３に記載のマウス。
［態様１５］態様１～１１のいずれか一に記載の方法によって取得可能なマウスに由来するＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現するＢ細胞レパートリー。
［態様１６］ＶＨドメインの異なる様々な抗原特異的ＨＣＡｂを発現する、態様１５に記載のＢ細胞レパートリー。
［態様１７］抗原特異的ＶＨドメインを含む抗体を生産する方法であって、
ａ）抗原でマウスを免疫化するステップであって、該マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、それにより、抗原特異的ＨＣＡｂを発現する細胞のレパートリーをもたらす、ステップと、
ｂ）レパートリーから、抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを発現する細胞を選択するステップと、
ｃ）ＨＣＡｂから抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列を決定するステップと、
ｄ）抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法。
［態様１８］Ｂ細胞レパートリーまたはＶＨを含む分子のレパートリーの生産のための方法における、態様１２～１４のいずれか一に記載のマウスの使用。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内で、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを組み込むことにより、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）の多様なレパートリーをＢ細胞が発現するマウスを生産する方法であって、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、上記方法。
［態様２］マウスが、抗原で免疫化されると、抗原特異的Ｂ細胞を活性化し、多様な抗原特異的ＨＣＡｂを分泌するプラズマ細胞へのそれらの分化を誘導する、態様１に記載の方法。
［態様３］Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に、好ましくは、配列番号７を含む内因性Ｅμメジャーイントロンエンハンサーの下流に位置付けられる、態様１または２に記載の方法。
［態様４］Ｃγ遺伝子セグメントが、Ｃγ１遺伝子セグメントを含む、態様１～３のいずれか一に記載の方法。
［態様５］ＣＨ１ドメインの少なくとも一部が、ＢｉＰシャペロン結合ドメインを含む、態様１～４のいずれか一に記載の方法。
［態様６］マウスが、不活性化または欠失した内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、好ましくは、マウスが、内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、態様１～５のいずれか一に記載の方法。
［態様７］内因性Ｃμ遺伝子セグメントが不活性である、態様１～６のいずれか一に記載の方法。
［態様８］内因性Ｃμ遺伝子セグメントが、機能喪失突然変異、Ｃμ遺伝子セグメントの一部の欠失、または１つもしくは複数の停止コドンを導入する１つもしくは複数の突然変異によって不活性である、態様１～７のいずれか一に記載の方法。
［態様９］免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列、ならびに前記ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列と作動可能に連結している発現制御配列を含み、好ましくは、該発現制御配列がマウスのものである、態様１～８のいずれか一に記載の方法。
［態様１０］ＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列が、抗原を特異的に認識するＶＨ結合部位を発現するＶＤＪコード配列を形成するように組み換えられ、それにより、所定のＢ細胞において組み換えられたＶＨコード配列が得られ、該Ｂ細胞は、形質細胞へと分化すると、組み換えられたＶＨコード配列によってコードされる抗原特異的ＶＨ結合ドメインを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを分泌することが可能である、態様９に記載の方法。
［態様１１］ａ）マウス胚性幹細胞を用意するステップと、
ｂ）１つまたは複数の発現カセット内のＣγ遺伝子セグメントを含む核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを用意するステップと、
ｃ）該１つまたは複数のベクターを該細胞に導入するステップと、
ｄ）トランスジェニック細胞を選択するステップであって、ｂ）の配列が、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、ターゲティングされた組み入れによって該細胞の細胞ゲノムに組み込まれており、Ｃμ遺伝子セグメントが場合により不活性である、ステップと、
ｅ）該トランスジェニック細胞を利用して、該トランスジェニック細胞から誘導されたトランスジェニックマウスを作出するステップと
を含む、態様１～１０のいずれか一に記載の方法。
［態様１２］態様１～１１のいずれかに記載の方法によって取得可能なマウスであって、その内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子座内に、内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流のトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、マウス。
［態様１３］少なくとも２つのＶＨ、２つのＤ、および２つのＪＨであるヒトＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列のレパートリーを含むＶＨ重鎖遺伝子座を含む、態様１２に記載のマウス。
［態様１４］内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方における機能喪失突然変異、または内因性カッパもしくはラムダ軽鎖遺伝子座のいずれかもしくは両方の欠失を含む、態様１２または１３に記載のマウス。
［態様１５］態様１～１１のいずれか一に記載の方法によって取得可能なマウスに由来するＩｇＧ型の様々なＨＣＡｂを発現するＢ細胞レパートリー。
［態様１６］ＶＨドメインの異なる様々な抗原特異的ＨＣＡｂを発現する、態様１５に記載のＢ細胞レパートリー。
［態様１７］抗原特異的ＶＨドメインを含む抗体を生産する方法であって、
ａ）抗原でマウスを免疫化するステップであって、該マウスが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の内因性Ｃμ遺伝子セグメントの上流にトランスジェニックＣγ遺伝子セグメントを含み、該Ｃγ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の欠失を含み、それにより、抗原特異的ＨＣＡｂを発現する細胞のレパートリーをもたらす、ステップと、
ｂ）レパートリーから、抗原特異的ＶＨを含むＩｇＧ型のＨＣＡｂを発現する細胞を選択するステップと、
ｃ）ＨＣＡｂから抗原特異的ＶＨをコードする核酸配列を決定するステップと、
ｄ）抗原特異的ＶＨを含むモノクローナル抗体を生産するステップと
を含む方法。
［態様１８］Ｂ細胞レパートリーまたはＶＨを含む分子のレパートリーの生産のための方法における、態様１２～１４のいずれか一に記載のマウスの使用。
【国際調査報告】