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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-09
(54)【発明の名称】ヘテロ二量体化のための直交変異
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20231226BHJP
C12N 15/01 20060101ALN20231226BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C12N15/01 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535392
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-08-08
(86)【国際出願番号】 US2021062951
(87)【国際公開番号】W WO2022125986
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】63/123,915
(32)【優先日】2020-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514194417
【氏名又は名称】インベンラ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デイビス， ジョナサン ハリー
(72)【発明者】
【氏名】マーシャル， ニコラス エム．
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
ヘテロ二量体化を駆動する直交変異を有するヘテロ二量体化ドメイン、特にヘテロ二量体化抗体ＣＨ３ドメイン、そのようなヘテロ二量体化ドメインを含むヘテロ二量体ポリペプチド、およびそのようなヘテロ二量体ポリペプチドを含む抗体構築物が提供される。本発明者らは、複数のポリペプチド鎖の特異的なヘテロ二量体化を駆動することができ、ポリペプチドの高忠実度会合を促進することができる、特に多価多重特異性抗体構築物に有用な、新しい直交変異を操作した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヘテロ二量体タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、
ａ）前記第１のポリペプチド鎖が第１のＣＨ３ドメインを含み、前記第２のポリペプチド鎖が第２のＣＨ３ドメインを含み、
ｂ）前記第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９がシステイン（Ｃ）に置換されており（Ｙ３４９Ｃ）、
ｃ）前記第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４がシステイン（Ｃ）に置換されており（Ｓ３５４Ｃ）、
ｄ）前記第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７が疎水性アミノ酸または芳香族アミノ酸で置換されており、
位置はＥＵインデックスに従ってナンバリングされている、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項2】
前記疎水性アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択される、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項3】
前記第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７が疎水性アミノ酸で置換されている、請求項１または請求項２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項4】
前記疎水性アミノ酸残基がメチオニン（Ｍ）（Ｅ３５７Ｍ）である、請求項３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項5】
前記芳香族アミノ酸残基が、ヒスチジン（Ｈ）、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項6】
Ｅ３５７が芳香族アミノ酸で置換されている、請求項１、２または５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項7】
前記芳香族アミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）（Ｅ３５７Ｗ）である、請求項６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項8】
前記第２のＣＨ３ドメインのＳ３６４が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項9】
前記第２のＣＨ３ドメインのＳ３６４がアルギニン（Ｒ）で置換されている（Ｓ３６４Ｒ）、請求項１～８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項10】
前記第１のＣＨ３ドメインのＫ３７０が、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項11】
前記第１のＣＨ３ドメインのＫ３７０がアルギニン（Ｒ）で置換されている（Ｋ３７０Ｒ）、請求項１０に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項12】
各ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧＡ１またはＩｇＧＡ２ ＣＨ３ドメインから独立して選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項13】
両方のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧＡ１またはＩｇＧＡ２ ＣＨ３ドメインから同一であるように選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項14】
両方のＣＨ３ドメインがヒトＩｇＧ１ドメインである、請求項１３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項15】
両方のＣＨ３ドメインがヒトＩｇＧ４ドメインである、請求項１３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項16】
前記第１または第２のＣＨ３ドメインに追加の操作された変異がない、請求項１～１５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項17】
前記第１および／または第２のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの追加の操作された変異がある、請求項１～１５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項18】
前記少なくとも１つの追加の操作された変異の少なくとも１つが、前記第１のＣＨ３ドメイン中のノブ変異および前記第２のＣＨ３ドメイン中のホール変異である、請求項１７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項19】
前記第１のＣＨ３ドメイン中にホール変異があり、前記第２のＣＨ３ドメイン中にノブ変異がある、請求項１７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項20】
前記ノブ変異がＴ３６６Ｗである、請求項１８または請求項１９記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項21】
前記ホール変異が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５ＴまたはＹ４０７Ｖから選択される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項22】
前記ホール変異がＦ４０５Ｔである、請求項２１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項23】
前記少なくとも１つの追加の操作された変異のうちの少なくとも１つが操作された電荷対である、請求項１７～２２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項24】
前記第１のＣＨ３ドメインがＬ３５１Ｄ変異を含み、前記第２のＣＨ３ドメインがＴ３６６Ｋ変異を含む、請求項２３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項25】
前記第２のＣＨ３ドメインがＬ３５１Ｄ変異を含み、前記第１のＣＨ３ドメインがＴ３６６Ｋ変異を含む、請求項２３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項26】
前記第１および第２のポリペプチド鎖の各々が免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項27】
前記第１のポリペプチドが、配列番号１または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項28】
前記第２のポリペプチドが、配列番号２または配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項29】
前記第１および第２のポリペプチド鎖の両方がＶＨドメインを含む、請求項２６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項30】
請求項２６に記載のヘテロ二量体タンパク質であって、（ａ）前記第１のポリペプチド鎖がＶＨドメインを含み、前記第２のポリペプチド鎖がＶＬドメインを含むか、または
（ｂ）前記第１のポリペプチド鎖がＶＬドメインを含み、前記第２のポリペプチド鎖がＶＨドメインを含み、
前記第１および第２のポリペプチドの可変ドメインが会合して第１の抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成し、前記ヘテロ二量体タンパク質が抗体構築物を形成する、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項31】
請求項３０に記載の抗体構築物であって、前記ＶＨドメインを含む前記ポリペプチド鎖がＣＨ２ドメインおよび第３のＣＨ３ドメインをさらに含み、前記ドメインがＮ末端からＣ末端に、ａ）ＶＨ－第１のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、
ｂ）ＶＨ－第２のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、
ｃ）ＶＨ－第３のＣＨ３－ＣＨ２－第１のＣＨ３、または
ｄ）ＶＨ－第３のＣＨ３－ＣＨ２－第２のＣＨ３
の順序である、抗体構築物。
【請求項32】
請求項３１に記載の抗体構築物であって、前記ＶＨドメインを含む前記ポリペプチド鎖の前記ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に、ａ）ＶＨ－第１のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、または
ｂ）ＶＨ－第２のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３
の順序である、抗体構築物。
【請求項33】
前記ＶＬドメインを含む前記ポリペプチド鎖が、ＣＨ２ドメインおよび第３のＣＨ３ドメインをさらに含み、前記ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に以下：【表6】
【請求項34】
前記ＶＬドメインを含む前記ポリペプチド鎖の前記ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に以下：【表7】
【請求項35】
前記ＶＬドメインを含む前記ポリペプチド鎖の前記ドメインおよび前記ＶＨドメインを含む前記ポリペプチド鎖の前記ドメインがそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に以下：【表8】
【請求項36】
請求項３５に記載の抗体構築物であって、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）前記第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する；
（ｂ）前記第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを含み、前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置されており、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する；
（ｃ）前記第３および前記第４のポリペプチドは、第２の抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用および前記Ｉドメインと前記Ｍドメインとの間の相互作用を介して会合している；かつ
（ｄ）前記第１および第３のポリペプチドは、前記Ｄドメインと前記Ｊドメインとの間の相互作用および前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間の相互作用を介して会合している、
抗体構築物。
【請求項37】
ドメインＨがＶＬドメインであり；ドメインＩがＣＬドメインであり；
ドメインＪがＣＨ２ドメインであり；かつ
ドメインＫが第４のＣＨ３ドメインである、
請求項３６に記載の抗体構築物。
【請求項38】
ドメインＬがＶＨドメインであり；かつドメインＭがＣＨ１ドメインである、
請求項３７記載の抗体構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年１２月１０日に出願された米国仮出願第６３／１２３，９１５号の利益および優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月１０日に出願された米国仮出願第６３／１２３，９１５号の利益および優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
【0002】
２．配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２Ｘ年ＸＸ月ＸＸに作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前であり、サイズはＸＸＸバイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２Ｘ年ＸＸ月ＸＸに作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前であり、サイズはＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【0003】
３．本発明の背景
細胞内のタンパク質ヘテロ二量体の適切な集合は、構成ポリペプチド鎖のホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を促進するタンパク質：タンパク質相互作用を必要とする。タンパク質中のポリペプチドの数が増加するにつれて、異なるポリペプチド鎖の特異的な会合を駆動する必要性が増加する。例えば、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖を有する二価二重特異性抗体の正しい集合は、第１の軽鎖の第１重鎖への特異的なヘテロ二量体化、第２の軽鎖の第２重鎖への特異的なヘテロ二量体化、および第１重鎖の第２重鎖への特異的なヘテロ二量体化を必要とする。効率的な集合は、様々なヘテロ二量体の会合を駆動するタンパク質：タンパク質相互作用が、そのようなヘテロ二量体対ごとに異なることを必要とする。
細胞内のタンパク質ヘテロ二量体の適切な集合は、構成ポリペプチド鎖のホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を促進するタンパク質：タンパク質相互作用を必要とする。タンパク質中のポリペプチドの数が増加するにつれて、異なるポリペプチド鎖の特異的な会合を駆動する必要性が増加する。例えば、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖を有する二価二重特異性抗体の正しい集合は、第１の軽鎖の第１重鎖への特異的なヘテロ二量体化、第２の軽鎖の第２重鎖への特異的なヘテロ二量体化、および第１重鎖の第２重鎖への特異的なヘテロ二量体化を必要とする。効率的な集合は、様々なヘテロ二量体の会合を駆動するタンパク質：タンパク質相互作用が、そのようなヘテロ二量体対ごとに異なることを必要とする。
【0004】
特定の操作された抗体ドメインの優先的なヘテロ二量体化を駆動する様々な直交変異が開発されており、ノブインホール（ＫＩＨ）変異（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同５，８０７，７０６号；および同５，８２１，３３３号を参照のこと）、電荷対変異（例えば、米国特許第９，３５８，２８６号を参照のこと）、ジスルフィド安定化ＫＩＨ変異（例えば、米国特許第７，９５１，９１７号；同８，６４２，７４５号および同９，４０９，９８９号を参照のこと）などが含まれる。
当技術分野では、単独でおよび既知のヘテロ二量体化特徴と組み合わせて使用される、特異的なヘテロ二量体化および多量体化を駆動するさらなるアプローチが必要とされている。
当技術分野では、単独でおよび既知のヘテロ二量体化特徴と組み合わせて使用される、特異的なヘテロ二量体化および多量体化を駆動するさらなるアプローチが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第５，７３１，１６８号明細書
【特許文献2】米国特許第５，８０７，７０６号明細書
【特許文献3】米国特許第５，８２１，３３３号明細書
【特許文献4】米国特許第９，３５８，２８６号明細書
【特許文献5】米国特許第７，９５１，９１７号明細書
【特許文献6】米国特許第８，６４２，７４５号明細書
【特許文献7】米国特許第９，４０９，９８９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
４．本発明の概要
本発明者らは、複数のポリペプチド鎖の特異的なヘテロ二量体化を駆動することができ、ポリペプチドの高忠実度会合を促進することができる、特に多価多重特異性抗体構築物に有用な、新しい直交変異を操作した。
本発明者らは、複数のポリペプチド鎖の特異的なヘテロ二量体化を駆動することができ、ポリペプチドの高忠実度会合を促進することができる、特に多価多重特異性抗体構築物に有用な、新しい直交変異を操作した。
【図面の簡単な説明】
【0007】
５．図面のいくつかの図の簡単な説明
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面を参照することによってよりよく理解されるであろう。
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【0008】
【図1A】図１Ａ～図１Ｅは、本発明の例示的な直交変異を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを示す。図１Ａは、追加の変異のない二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｂは、ノブがＥ３５７Ｗ変異と同じドメインにある追加のノブインホール変異を有する二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｃは、ノブがＥ３５７Ｗ変異とは反対側のドメインにある追加のノブインホール変異を有する二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｄは、Ｅ３５７Ｗ変異を有するドメインとは反対側のＣＨ３ドメインにおけるさらなる「カスケード」変異を示す。図１Ｅは、Ｅ３５７Ｗ変異を含むＣＨ３ドメインにおけるさらなる「カスケード」変異を示す。
【図1B】図１Ａ～図１Ｅは、本発明の例示的な直交変異を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを示す。図１Ａは、追加の変異のない二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｂは、ノブがＥ３５７Ｗ変異と同じドメインにある追加のノブインホール変異を有する二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｃは、ノブがＥ３５７Ｗ変異とは反対側のドメインにある追加のノブインホール変異を有する二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｄは、Ｅ３５７Ｗ変異を有するドメインとは反対側のＣＨ３ドメインにおけるさらなる「カスケード」変異を示す。図１Ｅは、Ｅ３５７Ｗ変異を含むＣＨ３ドメインにおけるさらなる「カスケード」変異を示す。
【図1C】図１Ａ～図１Ｅは、本発明の例示的な直交変異を有するヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを示す。図１Ａは、追加の変異のない二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｂは、ノブがＥ３５７Ｗ変異と同じドメインにある追加のノブインホール変異を有する二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｃは、ノブがＥ３５７Ｗ変異とは反対側のドメインにある追加のノブインホール変異を有する二量体化ＣＨ３ドメインを示す。図１Ｄは、Ｅ３５７Ｗ変異を有するドメインとは反対側のＣＨ３ドメインにおけるさらなる「カスケード」変異を示す。図１Ｅは、Ｅ３５７Ｗ変異を含むＣＨ３ドメインにおけるさらなる「カスケード」変異を示す。
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【図8A】図８Ａ～図８Ｄは、ＢＣ９６および様々な代替物のＣＨ１精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示す。図８Ａは、ドメインＢがＫ３７０変異を欠き、ドメインＧがＥ３５７変異を欠くという点でＢＣ９６とは異なるバリアントからの結果を示す。図８Ｂは、ドメインＢがＫ３７０変異を欠くという点でＢＣ９６とは異なるバリアントからの結果を示す。図８Ｃは、ドメインＧがＥ３５７変異を欠くという点でＢＣ９６とは異なるバリアントからの結果を示す。図８Ｄは、ドメインＢにおけるＫ３７０Ｒ変異およびドメインＧにおけるＥ３５７Ｗ変異の両方を含有するＢＣ９６からの結果を示す。
【図8B】図８Ａ～図８Ｄは、ＢＣ９６および様々な代替物のＣＨ１精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示す。図８Ａは、ドメインＢがＫ３７０変異を欠き、ドメインＧがＥ３５７変異を欠くという点でＢＣ９６とは異なるバリアントからの結果を示す。図８Ｂは、ドメインＢがＫ３７０変異を欠くという点でＢＣ９６とは異なるバリアントからの結果を示す。図８Ｃは、ドメインＧがＥ３５７変異を欠くという点でＢＣ９６とは異なるバリアントからの結果を示す。図８Ｄは、ドメインＢにおけるＫ３７０Ｒ変異およびドメインＧにおけるＥ３５７Ｗ変異の両方を含有するＢＣ９６からの結果を示す。
【0016】
【0017】
【図10A】図１０Ａ～図１０Ｃは、様々な構築物のプロテインＡ精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図１０Ａは、第１のＣＨ３ドメインがＳ３５４Ｃ変異を含有し、第２の反対側のＣＨ３ドメインがＹ３４９Ｃ変異を含有する構築物からの結果を示す。図１０Ｂは、第１のＣＨ３ドメインがＳ３５４ＣおよびＥ３５７Ｗ変異を含有し、第２の反対側のＣＨ３ドメインがＹ３４９Ｃ変異を含有する構築物からの結果を示す。図１０Ｃは、第１のＣＨ３ドメインがＳ３５４Ｃ、Ｅ３５７ＷおよびＳ３６４Ｒ変異を含有し、第２の反対側のＣＨ３ドメインがＹ３４９Ｃ変異を含有する構築物からの結果を示す。
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
６．本発明の詳細な説明
６．１．定義
本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
６．１．定義
本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0020】
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に記載される意味を有する。
【0021】
「抗原結合部位」（「ＡＢＳ」）とは、所与の抗原またはエピトープを特異的に認識するかまたはそれに結合する抗体構築物の領域を意味する。ＡＢＳ、およびそのようなＡＢＳを含む抗体構築物は、ＡＢＳが特異的に結合するエピトープ（またはより一般的には、抗原）を「認識する」と言われ、エピトープ（またはより一般的には、抗原）は、ＡＢＳの「認識特異性」または「結合特異性」であると言われる。
【0022】
ＡＢＳは、特定の親和性でその特異的抗原またはエピトープに結合すると言われる。本明細書に記載される場合、「親和性」は、ある分子と別の分子との間の非共有結合分子間力の相互作用の強さを指す。親和性、すなわち相互作用の強さは、解離平衡定数（ＫＤ）として表すことができ、ＫＤ値が低いほど分子間の相互作用が強いことを示す。抗体構築物のＫＤ値は、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））、および細胞結合アッセイを含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の方法によって測定される。特に明記しない限り、本明細書の目的のために、親和性は、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）を用いたバイオレイヤー干渉法によって測定される解離平衡定数である。
【0023】
本明細書で使用される「特異的結合」は、ＫＤ値が１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、または１０－１０Ｍ．未満である、ＡＢＳとその同族抗原またはエピトープとの間の親和性を指す。
【0024】
本明細書に記載の抗体構築物中のＡＢＳの数は、抗体構築物の「結合価」を定義する。単一のＡＢＳを有する抗体構築物は「一価」である。複数のＡＢＳを有する抗体構築物は、「多価」であると言われる。２つのＡＢＳを有する多価抗体構築物は「二価」である。３つのＡＢＳの多価抗体構築物は「三価」である。４つのＡＢＳを有する多価抗体構築物は「四価」である。
【0025】
抗体構築物の様々な多価実施形態では、複数のＡＢＳのすべてが同じ認識特異性を有する。そのような構築物は、「単一特異性」「多価」抗体構築物である。他の多価実施形態では、複数のＡＢＳのうちの少なくとも２つは、異なる認識特異性を有する。そのような抗体構築物は多価かつ「多重特異性」である。ＡＢＳが集合的に２つの認識特異性を有する多価実施形態では、結合分子は「二重特異性」である。ＡＢＳが集合的に３つの認識特異性を有する多価実施形態では、結合分子は「三重特異性」である。
【0026】
ＡＢＳが同じ抗原上に存在する異なるエピトープに対して複数の認識特異性を集合的に有する多価実施形態では、抗体構築物は「多重パラトピック」である。ＡＢＳが同じ抗原上の２つのエピトープを集合的に認識する多価実施形態は「二重パラトピック」である。
【0027】
様々な多価実施形態において、抗体構築物の多価性は、特異的標的に対する結合分子の結合活性を改善する。本明細書に記載される場合、「結合活性」は、２つまたはそれを超える分子間、例えば特定の標的に対する多価結合分子の相互作用の全体的な強度を指し、結合活性は、複数のＡＢＳの親和性によって提供される相互作用の累積強度である。上記のように、親和性を決定するために使用されるのと同じ方法によって、結合活性を測定することができる。特定の実施形態では、特異的標的に対する結合分子の結合活性は、相互作用が特異的結合相互作用であり、２つの分子間の結合活性が１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、または１０－１０Ｍ未満のＫＤ値を有するようなものである。特定の実施形態では、特異的標的に対する結合分子の結合活性は、相互作用が特異的結合相互作用であるようなＫＤ値を有し、個々のＡＢＳの１またはそれを超える親和性は、それらのそれぞれの抗原またはエピトープ自体に特異的に結合するような適格なＫＤ値を有さない。特定の実施形態では、結合活性は、共有される特異的標的または複合体上の別々の抗原、例えば個々の細胞上に見られる別々の抗原に対する複数のＡＢＳの親和性によって提供される相互作用の累積強度である。特定の実施形態では、結合活性は、共有される個々の抗原上の別々のエピトープに対する複数のＡＢＳの親和性によって提供される相互作用の累積強度である。
【0028】
本明細書で使用される「Ｂ－Ｂｏｄｙ」は、第１および第２のポリペプチド鎖を含む図２に示す抗体構築物を指し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向き（orientation）で配置されており、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置されており、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合して、抗体構築物を形成する。Ｂ－ボディは、米国特許出願公開第２０１８／０１１８８１１号および国際公開第２０１９／２０４５２２号にさらに詳細に記載されており、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0029】
本明細書に記載の「直交改変」または同義的に「直交変異」は、直交改変の非存在下での第１および第２のドメインの結合と比較して、相補的な直交改変を有する第２のドメインに対する直交改変を有する第１のドメインの結合の親和性を変化させる、抗体ドメインのアミノ酸配列における１またはそれを超える操作された変異である。いくつかの実施形態では、直交改変は、直交改変の非存在下での第１および第２のドメインの結合と比較して、相補的な直交改変を有する第２のドメインに対する直交改変を有する第１のドメインの結合の親和性を低下させる。いくつかの実施形態では、直交改変は、直交改変の非存在下での第１および第２のドメインの結合と比較して、相補的な直交改変を有する第２のドメインに対する直交改変を有する第１のドメインの結合の親和性を変化させない。好ましい実施形態では、直交改変は、直交改変の非存在下での第１および第２のドメインの結合と比較して、相補的な直交改変を有する第２のドメインに対する直交改変を有する第１のドメインの結合の親和性を増加させる。特定の好ましい実施形態では、直交改変は、相補的な直交改変を欠くドメインに対する直交改変を有するドメインの親和性を低下させる。
【0030】
特定の実施形態では、直交改変には、以下により詳細に記載されるように、操作されたジスルフィド架橋、ノブインホール変異、および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交改変は、操作されたジスルフィド架橋、ノブインホール変異、および電荷対変異から選択されるがこれらに限定されない直交改変の組み合わせを含む。
【0031】
６．２．他の解釈規則
別段特定されない限り、本明細書における「配列」へのすべての言及は、アミノ酸配列に対するものである。「内因性配列」または「天然配列」とは、生物、組織または細胞に由来し、人工的に改変または変異されていない、文脈が指示する核酸およびアミノ酸配列を含む任意の配列を意味する。
別段特定されない限り、本明細書における「配列」へのすべての言及は、アミノ酸配列に対するものである。「内因性配列」または「天然配列」とは、生物、組織または細胞に由来し、人工的に改変または変異されていない、文脈が指示する核酸およびアミノ酸配列を含む任意の配列を意味する。
【0032】
別段特定されない限り、抗体定常領域残基のナンバリングは、www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refsに記載されるようなＥｕインデックスに従い、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に記載の抗体構築物の鎖内の残基の物理的位置にかかわらず、内因性定常領域配列内のその位置に従って残基を同定する。
【0033】
別段特定されない限り、相補性決定領域（ＣＤＲ）へのすべての言及は、Ｋａｂａｔ定義のＣＤＲである。
【0034】
ポリペプチド鎖に関して使用される場合、用語「第１」、「第２」、「第３」、「第４」など（例えば、「第１」のポリペプチド鎖、「第２」のポリペプチド鎖など、またはポリペプチド「鎖１」、「鎖２」など）は、本明細書では、多量体分子を形成する特定のポリペプチド鎖の固有の識別子として使用され、抗体構築物内の異なるポリペプチド鎖の順序または量を暗示することを意図しない。
【0035】
「第１」、「第２」、「第３」、「第４」などの用語は、ＣＨ３ドメインに関して使用される場合、特定のドメインを指定するために使用され、ドメインの順序または量を含意するものではない。
【0036】
本開示において、「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、およびそれらの言語変形は、米国特許法においてそれらに帰される意味を有し、明示的に列挙されたものを超える追加の構成要素の存在を可能にする。
【0037】
本明細書で提供される範囲は、列挙された終点を含む範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。
【0038】
特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」という用語は包括的であると理解される。特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、単数または複数であると理解される。
【0039】
特に明記しない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差以内であると理解される。「約」は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解することができる。特に明記しない限り、「約」は、記載された値の１０％以内を意味する。
【0040】
６．３．ヘテロ二量体タンパク質
第一の局面では、ヘテロ二量体タンパク質が提供される。ヘテロ二量体タンパク質は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、
ａ）第１のポリペプチド鎖は第１のＣＨ３ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖は第２のＣＨ３ドメインを含み、
ｂ）第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９はシステイン（Ｃ）に置換されており（Ｙ３４９Ｃ）、
ｃ）第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）に置換されており（Ｓ３５４Ｃ）、
ｄ）第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性アミノ酸または芳香族アミノ酸で置換されており、
位置はＥｕインデックスに従ってナンバリングされている。
第一の局面では、ヘテロ二量体タンパク質が提供される。ヘテロ二量体タンパク質は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、
ａ）第１のポリペプチド鎖は第１のＣＨ３ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖は第２のＣＨ３ドメインを含み、
ｂ）第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９はシステイン（Ｃ）に置換されており（Ｙ３４９Ｃ）、
ｃ）第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）に置換されており（Ｓ３５４Ｃ）、
ｄ）第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性アミノ酸または芳香族アミノ酸で置換されており、
位置はＥｕインデックスに従ってナンバリングされている。
【0041】
種々の実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択される。種々の実施形態において、芳香族アミノ酸残基は、ヒスチジン（Ｈ）、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択される。
【0042】
特定の実施形態において、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は、疎水性アミノ酸で置換される。特定の実施形態では、疎水性アミノ酸残基はメチオニン（Ｍ）（Ｅ３５７Ｍ）である。
【0043】
特定の実施形態において、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は、芳香族アミノ酸で置換される。特定の実施形態では、芳香族アミノ酸残基はトリプトファン（Ｗ）（Ｅ３５７Ｗ）である。
【0044】
６．３．１．ＣＨ３ドメイン
本明細書中に記載のヘテロ二量体タンパク質のＣＨ３ドメインは、上記の変異が操作される抗体重鎖のＣ末端に天然に位置するドメインに由来するアミノ酸配列を有する。
本明細書中に記載のヘテロ二量体タンパク質のＣＨ３ドメインは、上記の変異が操作される抗体重鎖のＣ末端に天然に位置するドメインに由来するアミノ酸配列を有する。
【0045】
様々な実施形態において、ＣＨ３配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列はヒト配列である。特定の実施形態において、ＣＨ３配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプに由来する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列はＩｇＧアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列はＩｇＧ１アイソタイプに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＨ３配列はＩｇＡアイソタイプに由来する。
【0046】
特定の実施形態において、ＣＨ３配列は、ＩｇＥまたはＩｇＭアイソタイプ由来のＣＨ４配列である。
【0047】
特定の実施形態では、ＣＨ３配列は内因性配列である。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸２２４～３３０である。様々な実施形態では、ＣＨ３配列は、内因性ＣＨ３配列のセグメントである。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５を欠く内因性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｃ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９、およびＫ３３０を欠く内因性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５ならびにＣ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９、およびＫ３３０の両方を欠く内因性ＣＨ３配列を有する。
【0048】
特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、あるアロタイプの特定のアミノ酸を別のアロタイプのアミノ酸で置き換えることによって免疫原性を低減するように操作される（本明細書ではイソアロタイプ変異と呼ぶ）、より詳細にＳｔｉｃｋｌｅｒら（Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．２０１１ Ａｐｒ；１２（３）：２１３－２２１）に詳細に記載されており、これは、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、Ｇ１ｍ１アロタイプの特定のアミノ酸が置き換えられる。好ましい実施形態では、イソアロタイプ変異Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８ＭがＣＨ３配列において作製される。
【0049】
いくつかの実施形態では、第１または第２のＣＨ３ドメインには追加の操作された変異はない。いくつかの実施形態では、ＣＨ３配列は、以下に記載されるように、上記のものに追加の１またはそれを超える操作された変異を有する内因性配列である。
【0050】
６．３．２．ＣＨ３ドメインにおける追加の操作された直交変異
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＣＨ３ドメインに操作された少なくとも１つの追加の直交変異が存在する。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＣＨ３ドメインに操作された少なくとも１つの追加の直交変異が存在する。
【0051】
６．３．２．１ カスケード変異
様々な実施形態では、第１および／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｗ変異などのＥ３５７変異によって新たに可能になった変異（「カスケード」変異）をさらに含む。
様々な実施形態では、第１および／または第２のＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｗ変異などのＥ３５７変異によって新たに可能になった変異（「カスケード」変異）をさらに含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、Ｅ３５７変異を含有するのと反対側のＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０における変異をさらに含む。様々な実施形態では、リジン（Ｋ）は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹに変異している。特定の実施形態では、リジン（Ｋ）は、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹに変異している。特定の実施形態では、変異はＫ３７０Ｒである。
【0053】
いくつかの実施形態では、Ｅ３５７変異を含有するＣＨ３ドメインは、Ｓ３６４における変異をさらに含む。様々な実施形態では、セリン（Ｓ）は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹに変異している。特定の実施形態では、セリンは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、ＷまたはＹに変異している。好ましい実施形態では、セリンをＲに変異している。
【0054】
いくつかの実施形態では、Ｅ３５７変異を含有するのと反対側のＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０における変異をさらに含み、Ｅ３５７変異を含有するドメインは、Ｓ３６４における変異をさらに含む。様々な実施形態において、Ｋ３７０は、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹに変異している。特定の実施形態では、変異はＫ３７０Ｒである。様々な実施形態において、Ｓ３６４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、ＷまたはＹに変異している。
【0055】
６．３．２．２ ノブインホール
様々な実施形態において、第１および第２のＣＨ３ドメインは、直交ノブインホール（「Ｋ－Ｉ－Ｈ」）変異をさらに含む。
様々な実施形態において、第１および第２のＣＨ３ドメインは、直交ノブインホール（「Ｋ－Ｉ－Ｈ」）変異をさらに含む。
【0056】
本明細書で使用される場合、ノブインホール変異は、第１のドメインが相補的な立体変異を有する第２のドメインと、相補的な立体変異のないドメインとの会合と比較して優先的に会合するように、第１のドメインの表面の立体的特徴を変化させる変異である。ノブインホール変異は、米国特許第５，８２１，３３３号および同８，２１６，８０５号にさらに詳細に記載されており、その各々はその全体が本明細書に組み込まれる。
【0057】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の操作された変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のノブ変異および第２のＣＨ３ドメイン中のホール変異である。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン中にホール変異があり、第２のＣＨ３ドメイン中にノブ変異がある。
【0058】
特定の実施形態では、ノブ変異は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙである。
【0059】
特定の実施形態では、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔから選択される。特定の実施形態では、ホール変異はＦ４０５Ｔである。
【0060】
特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗ変異および第２のＣＨ３ドメイン中のＹ４０７Ａ変異である。特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第２のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異および第１のＣＨ３ドメインにおけるＹ４０７Ａ変異である。
【0061】
特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第１のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異および第２のメインにおけるＹ４０７Ｔ変異である。特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第２のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異および第１のメインにおけるＹ４０７Ｔ変異である。
【0062】
特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のＴ３９４Ｗおよび第２のＣＨ３ドメイン中のＦ４０５Ａである。特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第２のＣＨ３ドメイン中のＴ３９４Ｗおよび第１のＣＨ３ドメイン中のＦ４０５Ａである。
【0063】
特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｙ変異およびＦ４０５Ａ、ならびに第２のＣＨ３ドメイン中のＴ３９４Ｗ変異およびＹ４０７Ｔ変異である。特定の実施形態では、ノブインホール変異は、第２のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｙ変異およびＦ４０５Ａ、ならびに第１のＣＨ３ドメイン中のＴ３９４Ｗ変異およびＹ４０７Ｔ変異である。
【0064】
６．３．２．３ 操作された電荷対
様々な実施形態において、第１および第２のＣＨ３ドメインは、直交電荷対変異をさらに含む。
様々な実施形態において、第１および第２のＣＨ３ドメインは、直交電荷対変異をさらに含む。
【0065】
本明細書で使用される場合、電荷対変異は、ドメインが相補的な電荷対変異を有する第２のドメインと、相補的な電荷対変異のないドメインとの会合と比較して優先的に会合するように、ドメインの表面におけるアミノ酸の電荷に影響を及ぼす変異である。特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の直交会合を改善する。電荷対変異は、米国特許第８，５９２，５６２号；同９，２４８，１８２号；および同９，３５８，２８６号にさらに詳細に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0066】
特定の実施形態では、電荷対変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｋ変異および第２のＣＨ３ドメイン中のＬ３５１Ｄ変異である。特定の実施形態では、電荷対変異は、第２のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｋ変異および第１のＣＨ３ドメイン中のＬ３５１Ｄ変異である。
【0067】
６．４．抗体構築物
６．４．１．可変ドメイン
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む。
６．４．１．可変ドメイン
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖の両方が、免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖の両方がＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖の両方がＶＬドメインを含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖はＶＨドメインを含み、第２のポリペプチド鎖はＶＬドメインを含むか、または第１のポリペプチド鎖はＶＬドメインを含み、第２のポリペプチド鎖はＶＨドメインを含む。これらの実施形態において、第１および第２のポリペプチドの可変ドメインが会合して第１の抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成し、ヘテロ二量体タンパク質は抗体構築物である。
【0071】
ある特定の抗体構築物において、ＶＨドメインを含むポリペプチド鎖はＣＨ２ドメインおよび第３のＣＨ３ドメインをさらに含み、ドメインはＮ末端からＣ末端に、
ａ）ＶＨ－第１のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、
ｂ）ＶＨ－第２のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、
ｃ）ＶＨ－第３のＣＨ３－ＣＨ２－第１のＣＨ３、または
ｄ）ＶＨ－第３のＣＨ３－ＣＨ２－第２のＣＨ３
の順序である。特定の実施形態において、ＶＨドメインを含むポリペプチド鎖のドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ）ＶＨ－第１のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、または
ｂ）ＶＨ－第２のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３
の順序である。
ａ）ＶＨ－第１のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、
ｂ）ＶＨ－第２のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、
ｃ）ＶＨ－第３のＣＨ３－ＣＨ２－第１のＣＨ３、または
ｄ）ＶＨ－第３のＣＨ３－ＣＨ２－第２のＣＨ３
の順序である。特定の実施形態において、ＶＨドメインを含むポリペプチド鎖のドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ）ＶＨ－第１のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３、または
ｂ）ＶＨ－第２のＣＨ３－ＣＨ２－第３のＣＨ３
の順序である。
【0072】
ある特定の抗体構築物の実施形態において、ＶＬドメインを含むポリペプチド鎖は、ＣＨ２ドメインおよび第３のＣＨ３ドメインをさらに含む。図２を参照する特定の実施形態において、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に以下：
の順序である。
【表3】
【0073】
【0074】
【0075】
図２を参照する種々の実施形態において、抗体構築物は、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで：
（ａ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する；
（ｂ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置されており、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する；
（ｃ）第３および第４のポリペプチドは、第２の抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成するＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合している；および
（ｄ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合している。
（ａ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する；
（ｂ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置されており、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する；
（ｃ）第３および第４のポリペプチドは、第２の抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成するＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合している；および
（ｄ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合している。
【0076】
特定の実施形態において、ドメインＨはＶＬドメインであり；ドメインＩはＣＬドメインであり；ドメインＪはＣＨ２ドメインであり；かつドメインＫは第４のＣＨ３ドメインである。特定の実施形態において、ドメインＬはＶＨドメインであり；かつドメインＭはＣＨ１ドメインである。
【0077】
特定の実施形態では、ドメインＡはＶＬ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＡはＶＨ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
【0078】
いくつかの実施形態では、抗体構築物は、天然抗体構造を含み、ドメインＡおよびＨはＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＦおよびＬはＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＢおよびＩはＣＨ１を含み、ドメインＧおよびＭはＣＬを含み、ドメインＤおよびＪはＣＨ２を含み、ドメインＥおよびＫはＣＨ３を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、抗体構築物はＢ－Ｂｏｄｙ（商標）である。Ｂ－Ｂｏｄｙ（商標）抗体構築物は、米国特許出願公開第２０１８／０１１８８１１号および国際公開第２０１９／２０４５２２号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的な実施形態は、以下にさらに記載される。
【0080】
いくつかの実施形態では、抗体構築物はＣｒｏｓｓＭａｂ（商標）である。ＣｒｏｓｓＭａｂ（商標）抗体は、米国特許第８，２４２，２４７号；同９，２６６，９６７号；および同８，２２７，５７７号、米国特許出願公開第２０１２０２３７５０６号、米国特許出願公開第２００９０１６２３５９号、国際公開第２０１６０１６２９９号、国際公開第２０１５０５２２３０号に記載されている。いくつかの実施形態では、抗体構築物は、ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖抗体の軽鎖および重鎖とを含む二価二重特異性抗体であり、第２の抗原に特異的に結合する抗体由来の定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は互いに置き換えられている。
【0081】
いくつかの実施形態では、抗体構築物は、米国特許第８，８７１，９１２号および国際公開第２０１６／０８７６５０号に記載されている一般的な構造を有する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体構築物は、ＶＬ－ＣＨ３で構成される軽鎖（ＬＣ）と、ＶＨ－ＣＨ３－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（ＨＣ）とを含むドメイン交換抗体であり、ＬＣのＶＬ－ＣＨ３は、ＨＣのＶＨ－ＣＨ３と二量体化し、それにより、ＣＨ３ＬＣ／ＣＨ３ＨＣドメイン対を含むドメイン交換ＬＣ／ＨＣ二量体を形成する。
【0082】
いくつかの実施形態では、抗体構築物は、国際公開第２０１７／０１１３４２号に記載されている通りである。いくつかの実施形態では、抗体構築物は、国際公開第２００６／０９３７９４号に記載されている通りである。
【0083】
６．４．１．１．１ ＶＨドメイン
様々な実施形態では、ＶＨドメインは、ヒト配列、ヒト化配列、合成配列、またはヒト、非ヒト哺乳動物、および／または合成配列の組み合わせを含む哺乳動物配列であるアミノ酸配列を有する。様々な実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。
様々な実施形態では、ＶＨドメインは、ヒト配列、ヒト化配列、合成配列、またはヒト、非ヒト哺乳動物、および／または合成配列の組み合わせを含む哺乳動物配列であるアミノ酸配列を有する。様々な実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。
【0084】
６．４．１．１．２ ＶＬドメイン
様々な実施形態では、ＶＬドメインは、ヒト配列、ヒト化配列、合成配列、またはヒト、非ヒト哺乳動物、および／または合成配列の組み合わせを含む哺乳動物配列であるアミノ酸配列を有する。様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。
様々な実施形態では、ＶＬドメインは、ヒト配列、ヒト化配列、合成配列、またはヒト、非ヒト哺乳動物、および／または合成配列の組み合わせを含む哺乳動物配列であるアミノ酸配列を有する。様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。
【0085】
特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖可変ドメイン配列である。特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖可変ドメイン配列である。
【0086】
６．４．１．１．３ 相補性決定領域
本明細書に記載の抗体構築物のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる高度に可変な配列、典型的には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤ２およびＣＤＲ３）を含む。様々な実施形態において、ＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＤＲはヒト配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、特定の抗原またはエピトープに対する抗原結合部位の結合親和性を変化させるように変異された天然に存在する配列である。特定の実施形態では、天然に存在するＣＤＲは、親和性成熟および体細胞高頻度変異によってインビボ宿主において変異されている。特定の実施形態では、ＣＤＲは、ＰＣＲ変異誘発および化学変異誘発を含むがこれらに限定されない方法によってインビトロで変異されている。様々な実施形態において、ＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない合成配列である。
本明細書に記載の抗体構築物のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる高度に可変な配列、典型的には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤ２およびＣＤＲ３）を含む。様々な実施形態において、ＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＤＲはヒト配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、特定の抗原またはエピトープに対する抗原結合部位の結合親和性を変化させるように変異された天然に存在する配列である。特定の実施形態では、天然に存在するＣＤＲは、親和性成熟および体細胞高頻度変異によってインビボ宿主において変異されている。特定の実施形態では、ＣＤＲは、ＰＣＲ変異誘発および化学変異誘発を含むがこれらに限定されない方法によってインビトロで変異されている。様々な実施形態において、ＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない合成配列である。
【0087】
６．４．１．１．４ フレームワーク領域およびＣＤＲグラフティング
本明細書に記載の抗体構築物のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）配列を含む。ＦＲは、一般に、散在するＣＤＲの足場として作用する保存された配列領域、典型的にはＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４配列（Ｎ末端からＣ末端）である。様々な実施形態において、ＦＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＦＲはヒト配列である。様々な実施形態では、ＦＲは天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、限定されないが、合理的に設計された配列を含む合成配列である。
本明細書に記載の抗体構築物のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）配列を含む。ＦＲは、一般に、散在するＣＤＲの足場として作用する保存された配列領域、典型的にはＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４配列（Ｎ末端からＣ末端）である。様々な実施形態において、ＦＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＦＲはヒト配列である。様々な実施形態では、ＦＲは天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、限定されないが、合理的に設計された配列を含む合成配列である。
【0088】
様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは両方とも、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは異なる可変ドメイン配列に由来し、ＣＤＲはＦＲ足場上にグラフトされ、ＣＤＲは特定の抗原に対する特異性を提供する。特定の実施形態では、グラフトＣＤＲはすべて、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。特定の実施形態では、グラフトＣＤＲは、異なる可変ドメイン配列に由来する。特定の実施形態では、グラフトＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない合成配列である。特定の実施形態では、グラフトＣＤＲおよびＦＲは同じ種に由来する。特定の実施形態では、グラフトＣＤＲおよびＦＲは異なる種に由来する。好ましいグラフトＣＤＲの実施形態では、抗体は「ヒト化」され、グラフトＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバおよびヤギ配列を含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物配列であり、ＦＲはヒト配列である。ヒト化抗体は、米国特許第６，４０７，２１３号においてより詳細に議論されており、その全体が参照によりその教示のすべてについてここに組み込まれる。様々な実施形態では、ある種由来のＦＲの部分または特異的配列を使用して、別の種のＦＲの部分または特異的配列を置き換える。
【0089】
６．４．２．ＣＨ１およびＣＬドメイン
様々な実施形態では、抗体構築物の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインをさらに含む。様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、免疫グロブリンＣＬドメインをさらに含む。
様々な実施形態では、抗体構築物の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインをさらに含む。様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、免疫グロブリンＣＬドメインをさらに含む。
【0090】
様々な実施形態では、第１のポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含み、第２のポリペプチドはＣＬドメインをさらに含む。様々な実施形態では、第２のポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含み、第１のポリペプチドはＣＬドメインをさらに含む。
【0091】
様々な実施形態では、ＣＨ１配列は内因性配列である。様々な実施形態において、ＣＨ１配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列はヒト配列である。特定の実施形態において、ＣＨ１配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列はＩｇＧ１アイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１～９８である。
【0092】
本明細書に記載の抗体構築物のＣＬドメインは、抗体軽鎖定常ドメインである。特定の実施形態では、ＣＬドメインは、内因性配列である配列を有する。様々な実施形態において、ＣＬ配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＬ配列はヒト配列である。
【0093】
特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖定常ドメイン配列である。特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ラムダ（λ）軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＧ０４である。
【0094】
特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトカッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、カッパ軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８３４である。
【0095】
特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は両方とも内因性配列である。
【0096】
ＣＨ１ドメインフォールディングは、典型的には、ＩｇＧの分泌における速度制限工程である（Ｆｅｉｇｅら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊｕｎ １２；３４（５）：５６９－７９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、ＣＨ１含有ポリペプチド鎖の速度制限成分に基づいて本明細書に記載の抗体構築物を精製することは、不完全な鎖から完全な複合体を精製する手段、例えば、１またはそれを超える非ＣＨ１含有鎖のみを有する複合体から、制限ＣＨ１ドメインを有する複合体を精製する手段を提供することができる。
【0097】
ＣＨ１の発現を制限することは、いくつかの態様では利点であり得るが、論じられるように、ＣＨ１が完全な抗体構築物の全体的な発現を制限する可能性がある。したがって、特定の実施形態では、ＣＨ１配列を含むポリペプチド鎖の発現は、完全な複合体を形成する抗体構築物の効率を改善するように調整される。例示的な例では、ＣＨ１配列を含むポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターの比は、他のポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターと比較して増加させることができる。別の実例では、ＣＬ配列を含むポリペプチド鎖と比較した場合のＣＨ１配列を含むポリペプチド鎖は、２つのポリペプチド鎖のうちの小さい方であり得る。別の特定の実施形態では、ＣＨ１配列を含むポリペプチド鎖の発現は、どのポリペプチド鎖がＣＨ１配列を有するかを制御することによって調整することができる。例えば、ＣＨ１ドメインが、４ドメインポリペプチド鎖（例えば、本明細書に記載の第３のポリペプチド鎖）中のＣＨ１配列の天然の位置の代わりに、２ドメインポリペプチド鎖（例えば、本明細書に記載の第４のポリペプチド鎖）中に存在するように抗体構築物を操作して、ＣＨ１配列を含むポリペプチド鎖の発現を制御することができる。しかしながら、他の態様では、他の鎖と比較して高すぎるＣＨ１含有鎖の相対的発現レベルは、ＣＨ１鎖を有するが他の各鎖は有さない不完全な複合体をもたらし得る。したがって、特定の実施形態では、ＣＨ１配列を含むポリペプチド鎖の発現は、ＣＨ１含有鎖を含まない形成不完全複合体を減少させること、およびＣＨ１含有鎖を含むが完全な複合体中に存在する他の鎖を含まない形成不完全複合体を減少させることの両方のために調整される。
【0098】
特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は、以下により詳細に考察されるように、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列においてそれぞれ直交改変を別々に含む。好ましくは、ＣＨ１配列における直交変異は、ＣＨ１ドメインと精製に使用されるＣＨ１特異的結合試薬との間の特異的結合相互作用を排除しない。
【0099】
６．４．２．１ ＣＨ１およびＣＬ直交改変
特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列のそれぞれ直交改変をさらに含む。ＣＨ１／ＣＬ直交改変は、ＣＨ１ドメイン中の改変残基とＣＬドメイン中の対応する改変または非改変残基との間の相互作用を介してＣＨ１／ＣＬドメイン対形成に影響を及ぼし得る。
特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列のそれぞれ直交改変をさらに含む。ＣＨ１／ＣＬ直交改変は、ＣＨ１ドメイン中の改変残基とＣＬドメイン中の対応する改変または非改変残基との間の相互作用を介してＣＨ１／ＣＬドメイン対形成に影響を及ぼし得る。
【0100】
特定の実施形態では、直交改変は、イソアロタイプ変異などの免疫原性を低下させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
【0101】
他の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ対の一方の配列は少なくとも１つの改変を含み、ＣＨ１／ＣＬ対の他方の配列はそれぞれの直交アミノ酸位置に改変を含まない。
【0102】
ＣＨ１配列およびＣＬ配列はまた、ＣＨ１配列を有するドメインまたはその一部が、ＣＨ１配列を有するドメインまたはその一部と会合することができるように、内因性配列または改変配列のいずれかのその一部であり得る。さらに、本明細書に記載のＣＨ１配列の一部を有する抗体構築物は、ＣＨ１結合試薬によって結合され得る。
【0103】
６．４．２．１．１ 例示的なＣＨ１／ＣＬ直交改変：操作されたジスルフィド架橋
ＣＨ１／ＣＬ直交改変のいくつかの実施形態は、ＣＨ１およびＣＬ中の操作されたシステインの間に操作されたジスルフィド架橋を含む。そのような操作されたジスルフィド架橋は、改変ＣＨ１を含むポリペプチドと対応する改変ＣＬを含むポリペプチドとの間の相互作用を安定化し得る。
ＣＨ１／ＣＬ直交改変のいくつかの実施形態は、ＣＨ１およびＣＬ中の操作されたシステインの間に操作されたジスルフィド架橋を含む。そのような操作されたジスルフィド架橋は、改変ＣＨ１を含むポリペプチドと対応する改変ＣＬを含むポリペプチドとの間の相互作用を安定化し得る。
【0104】
操作されたジスルフィド架橋を含む直交ＣＨ１／ＣＬ改変は、ほんの一例として、ＥＵインデックスによってナンバリングされる１２８、１２９、１３８、１４１、１６８、または１７１の位置に操作されたシステインを有するＣＨ１ドメインを含むことができる。操作されたジスルフィド架橋を含むそのような直交ＣＨ１／ＣＬ改変は、ほんの一例として、ＥＵインデックスによってナンバリングされる１１６、１１８、１１９、１６４、１６２、または２１０の位置に操作されたシステインを有するＣＬドメインをさらに含んでもよい。
【0105】
例えば、ＣＨ１／ＣＬ直交改変は、米国特許第８，０５３，５６２号および同９，５２７，９２７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより詳細にナンバリングされ議論されているように、ＣＨ１配列の位置１３８およびＣＬ配列の位置１１６、ＣＨ１配列の位置１２８およびＣＬ配列の位置１１９、またはＣＨ１配列の位置１２９およびＣＬ配列の位置２１０における操作されたシステインから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交改変は、ＥＵインデックスによってナンバリングされるＣＨ１配列の１４１位およびＣＬ配列の１１８位に操作されたシステインを含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交改変は、ＥＵインデックスによってナンバリングされるＣＨ１配列の１６８位およびＣＬ配列の１６４位に操作されたシステインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交改変は、ＥＵインデックスによってナンバリングされるＣＨ１配列の１２８位およびＣＬ配列の１１８位に操作されたシステインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交改変は、ＥＵインデックスによってナンバリングされるＣＨ１配列の１７１位およびＣＬ配列の１６２位に操作されたシステインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬ配列は、ＣＬ－ラムダ配列である。好ましい実施形態では、ＣＬ配列はＣＬ－カッパ配列である。いくつかの実施形態では、操作されたシステインは、ＥＵインデックスによって番号付けされるＣＨ１配列の位置１２８およびＣＬカッパ配列の位置１１８にある。
【0107】
以下の表１は、ＥＵインデックスによってナンバリングされるＣＨ１とＣＬとの間の操作されたジスルフィド架橋を含む例示的なＣＨ１／ＣＬ直交改変を提供する。
【表1】
【0108】
一連の好ましい実施形態では、非内因性（操作された）システインアミノ酸を提供する変異は、Ｅｕインデックスによってナンバリングされる、ＣＬ配列中のＦ１１８Ｃ変異とＣＨ１配列中の対応するＡ１４１Ｃ、またはＣＬ配列中のＦ１１８Ｃ変異とＣＨ１配列中の対応するＬ１２８Ｃ、ＣＬ配列中のＴ１６４Ｃ変異とＣＨ１配列中の対応するＨ１６８Ｃ変異、またはＣＬ配列中のＳ１６２Ｃ変異とＣＨ１配列中の対応するＰ１７１Ｃ変異である。
【0109】
６．４．２．１．２ ＣＨ１／ＣＬ直交改変：操作された電荷対変異
様々な実施形態において、ＣＬ配列およびＣＨ１配列における直交改変は、電荷対変異である。
様々な実施形態において、ＣＬ配列およびＣＨ１配列における直交改変は、電荷対変異である。
【0110】
特定の実施形態では、電荷対変異は、Ｅｕインデックスによってナンバリングされ、それが教示するすべてについて参照により本明細書に組み込まれるＢｏｎｉｓｃｈら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０１７，ｐｐ．１－１２）により詳細に記載されているように、ＣＬ配列中のＦ１１８Ｓ、Ｆ１１８ＡもしくはＦ１１８Ｖ変異とＣＨ１配列中の対応するＡ１４１Ｌ、またはＣＬ配列中のＴ１２９Ｒ変異とＣＨ１配列中の対応するＫ１４７Ｄである。
【0111】
いくつかの場合において、ＣＨ１／ＣＬ電荷対変異は、Ｅｕインデックスによってナンバリングされる、ＣＬ配列中のＮ１３８Ｋ変異とＣＨ１配列中の対応するＧ１６６Ｄ、またはＣＬ配列中のＮ１３８Ｄ変異とＣＨ１配列中の対応するＧ１６６Ｋである。いくつかの実施形態では、電荷対変異は、ＣＨ１配列中のＰ１２７Ｅ変異と、対応するＣＬ配列中の対応するＥ１２３Ｋ変異である。いくつかの実施形態では、電荷対変異は、ＣＨ１配列中のＰ１２７Ｋ変異と、対応するＣＬ配列中の対応するＥ１２３（変異していない）である。
【0112】
以下の表２は、例示的なＣＨ１／ＣＬ直交電荷対改変を提供する。
【表2】
【0113】
６．４．２．１．３ ＣＨ１／ＣＬ直交改変の組み合わせ
特定の実施形態では、単一のＣＨ１／ＣＬ対のＣＨ１およびＣＬドメインは、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列に２つまたはそれを超えるそれぞれ直交改変を別々に含む。例えば、ＣＨ１およびＣＬ配列は、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列における第１の直交改変および第２の直交改変を含んでもよい。内因性ＣＨ１およびＣＬ配列における２つまたはそれを超えるそれぞれ直交改変は、本明細書に記載のＣＨ１／ＣＬ直交改変のいずれかから選択することができる。
特定の実施形態では、単一のＣＨ１／ＣＬ対のＣＨ１およびＣＬドメインは、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列に２つまたはそれを超えるそれぞれ直交改変を別々に含む。例えば、ＣＨ１およびＣＬ配列は、内因性ＣＨ１およびＣＬ配列における第１の直交改変および第２の直交改変を含んでもよい。内因性ＣＨ１およびＣＬ配列における２つまたはそれを超えるそれぞれ直交改変は、本明細書に記載のＣＨ１／ＣＬ直交改変のいずれかから選択することができる。
【0114】
いくつかの実施形態では、第１の直交改変は、直交電荷対変異であり、第２の直改変は、直交する操作されたジスルフィド架橋である。いくつかの実施形態では、第１の直交改変は、表２に記載されるような直交電荷対変異であり、追加の直交改変は、米国特許第８，０５３，５６２号および同９，５２７，９２７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより詳細にナンバリングされ議論されているように、ＣＨ１配列の位置１３８およびＣＬ配列の位置１１６、ＣＨ１配列の位置１２８およびＣＬ配列の位置１１９、またはＣＨ１配列の位置１２９およびＣＬ配列の位置２１０における操作されたシステインから選択され得る操作されたジスルフィド架橋を含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、第１の直交改変は、表２に記載の直交電荷対変異であり、追加の直交改変は、表１に記載の操作されたジスルフィド架橋を含む。いくつかの実施形態では、第１の直交改変は、ＣＨ１配列中のＬ１２８Ｃ変異およびＣＬ配列中のＦ１１８Ｃ変異を含み、第２の直交改変は、同じＣＨ１配列中の残基１６６の修飾および同じＣＬ配列中の残基１３８の修飾を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、第１の直交改変は、ＣＨ１配列中のＬ１２８Ｃ変異およびＣＬ配列中のＦ１１８Ｃ変異を含み、第２の直交改変は、ＣＨ１配列中のＧ１６６Ｄ変異およびＣＬ配列中のＮ１３８Ｋ変異を含む。いくつかの実施形態では、第１の直交改変は、ＣＨ１配列中のＬ１２８Ｃ変異およびＣＬ配列中のＦ１１８Ｃ変異を含み、第２の直交改変は、ＣＨ１配列中のＧ１６６Ｋ変異およびＣＬ配列中のＮ１３８Ｄ変異を含む。
【0117】
６．４．３．ＣＨ２ドメイン
様々な実施形態では、抗体構築物の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、ＣＨ２ドメインをさらに含む。様々な実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの両方がＣＨ２ドメインを含む。
様々な実施形態では、抗体構築物の第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１つは、ＣＨ２ドメインをさらに含む。様々な実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの両方がＣＨ２ドメインを含む。
【0118】
いくつかの実施形態では、抗体構築物は、１つよりも多くの対になったＣＨ２ドメインセットを有する。これらの実施形態の様々なものにおいて、対になったＣＨ２ドメインの第１のセットは、第１のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列および別のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列の１またはそれを超えるオルソロガスセットを有する。本明細書に記載のオルソロガスＣＨ２アミノ酸配列は、共有アイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列と相互作用することができるが、抗体構築物中に存在する別のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列とは有意に相互作用しない。
【0119】
特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の第１のセットは、抗体構築物中の他の非ＣＨ２ドメインと同じアイソタイプに由来する。特定の実施形態では、第１のセットはＩｇＧアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列を有し、１またはそれを超えるオルソロガスセットはＩｇＭまたはＩｇＥアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列を有する。
【0120】
特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットの１またはそれを超えるものが内因性ＣＨ２配列である。他の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットの１またはそれを超えるものが、１またはそれを超える変異を有する内因性ＣＨ２配列である。特定の実施形態では、１またはそれを超える変異は、直交ノブホール変異、直交電荷対変異、または直交疎水性変異である。本明細書に記載の抗体構築物に有用なオルソロガスＣＨ２アミノ酸配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／０１１３４２およびＷＯ２０１７／１０６４６２により詳細に記載されている。
【0121】
特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の全てのセットは同じ種に由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の全てのセットがヒトＣＨ２アミノ酸配列である。他の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットは、異なる種に由来する。
【0122】
６．４．４．特異的二価抗体構築物
様々な実施形態において、抗体構築物は、図２に示される構造を有する。
様々な実施形態において、抗体構築物は、図２に示される構造を有する。
【0123】
６．４．４．１ ドメインＡ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＡはＶＬ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＡはＶＨ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＡはＶＬ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＡはＶＨ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
【0124】
本明細書に記載の抗体構築物では、ドメインＡのＣ末端はドメインＢのＮ末端に接続されている。特定の実施形態では、ドメインＡは、ドメインＡとドメインＢとの間の接合部におけるそのＣ末端において変異しているＶＬアミノ酸配列を有する。
【0125】
６．４．４．２ ドメインＢ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＢは定常領域ドメイン配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＢは定常領域ドメイン配列を有する。
【0126】
いくつかの実施形態では、ドメインＢは、ＣＨ３配列を有する。
【0127】
特定の実施形態では、ドメインＢは、「ノブインホール」（「ＫＩＨ」）直交変異を含むＣＨ３配列を有する。
【0128】
特定の実施形態において、ドメインＢは、ＣＨ３配列と、直交変異を含有するＣＨ３ドメインとの操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかとを有する。
【0129】
特定の実施形態では、ドメインＢは、第１のＣＨ３ドメイン配列を有し、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９は、システイン（Ｃ）で置換され（Ｙ３４９Ｃ）、位置は、Ｅｕインデックスにしたがってナンバリングされている。
【0130】
特定の実施形態では、ドメインＢは第２のＣＨ３ドメイン配列を有し、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。特定の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｗ変異を有する。
【0131】
特定の実施形態では、ドメインＢは、以下の変異の変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する：Ｐ３４３Ｖ；Ｙ３４９Ｃ；およびトリペプチド挿入、４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ。他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異の変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する：Ｔ３６６Ｋ；およびトリペプチド挿入、４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃ。さらに他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異の変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する：Ｙ３４９Ｃ；およびトリペプチド挿入、４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ。
【0132】
遠く亭の実施形態では、ドメインＢは、その他は内因性であるＣＨ３配列に組み込まれたＫ４４７Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する。
【0133】
いくつかの実施形態では、定常領域配列は、オルソロガスＣＨ２配列である。いくつかの実施形態では、ドメインＢは、ＩｇＥ由来のＣＨ２配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＢは、ＩｇＭ由来のＣＨ２配列を有する。
【0134】
いくつかの実施形態では、例えば、結合分子の結合価が３またはそれを超える場合、定常領域配列はＣＨ１またはＣＬ配列である。いくつかの実施形態では、ドメインＢは、ＣＨ１配列を有する。いくつかの実施形態では、定常領域配列はＣＬ配列である。いくつかの実施形態では、ＣＨ１またはＣＬ配列は、本明細書に記載の１またはそれを超えるＣＨ１またはＣＬ直交改変を含む。
【0135】
本明細書に記載の抗体構築物では、ドメインＢのＮ末端はドメインＡのＣ末端に接続されている。特定の実施形態では、ドメインＢは、ドメインＡとドメインＢとの間の接合部におけるそのＮ末端において変異しているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【0136】
本明細書に記載の抗体構築物では、ドメインＢのＣ末端はドメインＤのＮ末端に接続されている。特定の実施形態では、ドメインＢは、ドメインＢとドメインＤとの間の接合部のＣ末端で伸長されるＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【0137】
いくつかの実施形態では、ドメインＢはヒトＩｇＡ ＣＨ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＡ ＣＨ３配列はＣＨ３リンカー配列を含む。
【0138】
６．４．４．３ ドメインＤ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＤは定常領域アミノ酸配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＤは定常領域アミノ酸配列を有する。
【0139】
好ましい一連の実施形態において、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ２配列は内因性配列である。特定の実施形態では、配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１１１～２２３である。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、Ｎ末端可変ドメイン定常ドメインセグメントをＣＨ２ドメインに連結するＮ末端ヒンジ領域ペプチドを有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２配列は、エフェクター機能を調整する１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、エフェクター機能を低下させる１またはそれを超える変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２配列は、ＦｃＲＮ結合を調整する１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＦｃＲＮ結合を低下させる１またはそれを超える変異を含む。
【0140】
本明細書に記載の抗体構築物では、ドメインＤのＮ末端はドメインＢのＣ末端に接続されている。特定の実施形態では、ドメインＢは、ドメインＤとドメインＢとの間の接合部のＣ末端で伸長されるＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【0141】
６．４．４．４ ドメインＥ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。
【0142】
特定の実施形態では、定常領域配列はＣＨ３配列である。
【0143】
特定の実施形態では、ドメインＥは、「ノブインホール」（「ＫＩＨ」）直交変異を含むＣＨ３配列を有する。
【0144】
特定の実施形態において、ドメインＥは、ＣＨ３配列と、直交変異を含有するＣＨ３ドメインとの操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかとを有する。
【0145】
特定の実施形態では、ドメインＥは、第１のＣＨ３ドメイン配列を有し、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９は、システイン（Ｃ）で置換されている（Ｙ３４９Ｃ）。
【0146】
特定の実施形態では、ドメインＥは第２のＣＨ３ドメイン配列を有し、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。特定の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｗ変異を有する。
【0147】
特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列はＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＥのＣＨ１アミノ酸配列は、結合分子中の唯一のＣＨ１アミノ酸配列である。特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続している。
【0148】
特定の実施形態では、定常領域配列はＣＬ配列である。特定の実施形態では、ＣＬドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続している。
【0149】
６．４．４．５ ドメインＦ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＦはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＦはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＦはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＦはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
【0150】
６．４．４．６ ドメインＧ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＧは定常領域アミノ酸配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＧは定常領域アミノ酸配列を有する。
【0151】
いくつかの実施形態では、ドメインはＧ、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【0152】
特定の実施形態では、ドメインＧは、以下の変異の変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する：Ｓ３５４Ｃ；およびトリペプチド挿入、４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ。いくつかの実施形態では、ドメインＧは、以下の変異の変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する：Ｓ３５４Ｃ；および４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋトリペプチド挿入。いくつかの好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する：Ｌ３５１Ｄ、および４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃのトリペプチド挿入。
【0153】
特定の実施形態では、ドメインＧは、「ノブインホール」（「ＫＩＨ」）直交変異を含むＣＨ３配列を有する。
【0154】
特定の実施形態において、ドメインＧは、ＣＨ３配列と、直交変異を含有するＣＨ３ドメインとの操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを有する。
【0155】
特定の実施形態では、ドメインＧは、第１のＣＨ３ドメイン配列を有し、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９は、システイン（Ｃ）で置換されている（Ｙ３４９Ｃ）。
【0156】
特定の実施形態では、ドメインＧは第２のＣＨ３ドメイン配列を有し、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。特定の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｗ変異を有する。
【0157】
いくつかの実施形態では、ドメインＧはヒトＩｇＡ ＣＨ３配列を有する。
【0158】
いくつかの実施形態では、ドメインＧは、ＣＬ配列を有する。
【0159】
いくつかの実施形態では、ドメインＧは、ＩｇＥ由来のＣＨ２配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＧは、ＩｇＭ由来のＣＨ２配列を有する。
【0160】
特定の実施形態では、例えば、結合分子の結合価が３またはそれを超える場合、定常領域配列はＣＨ１またはＣＬ配列である。ドメインＢがＣＬ配列であるいくつかの実施形態では、ドメインＧはＣＨ１配列である。いくつかの実施形態では、ＣＨ１またはＣＬ配列は、本明細書に記載の１またはそれを超えるＣＨ１またはＣｌ直交改変を含む。
【0161】
いくつかの実施形態では、ドメインＧのＣ末端は、ドメインＤのＮ末端に接続されている。特定の実施形態では、ドメインＧは、ドメインＧとドメインＤとの間の接合部のＣ末端で伸長されるＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【0162】
６．４．４．７ ドメインＨ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＨはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＨはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＨはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＨはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
【0163】
６．４．４．８ ドメインＩ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。
【0164】
結合分子の一連の好ましい実施形態では、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有する。別の一連の実施形態において、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【0165】
６．４．４．９ ドメインＪ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、ドメインＪをドメインＩに接続するＮ末端ヒンジ領域を有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２配列は、エフェクター機能を調整する１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、エフェクター機能を低下させる１またはそれを超える変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２配列は、ＦｃＲＮ結合を調整する１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＦｃＲＮ結合を低下させる１またはそれを超える変異を含む。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、ドメインＪをドメインＩに接続するＮ末端ヒンジ領域を有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２配列は、エフェクター機能を調整する１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、エフェクター機能を低下させる１またはそれを超える変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２配列は、ＦｃＲＮ結合を調整する１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＦｃＲＮ結合を低下させる１またはそれを超える変異を含む。
【0166】
ドメインＪのＣ末端は、ドメインＫのＮ末端に接続されている。特定の実施形態では、ドメインＪは、ＣＨ１アミノ酸配列またはＣＬアミノ酸配列を有するドメインＫのＮ末端に接続している。
【0167】
６．４．４．１０ ドメインＫ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。
【0168】
いくつかの実施形態では、ドメインＫは、ＣＨ３配列を有する。
【0169】
特定の実施形態では、ドメインＫは、「ノブインホール」（「ＫＩＨ」）直交変異を含むＣＨ３配列を有する。
【0170】
特定の実施形態において、ドメインＫは、ＣＨ３配列と、直交変異を含有するＣＨ３ドメインとの操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかとを有する。
【0171】
特定の実施形態では、ドメインＫは、第１のＣＨ３ドメイン配列を有し、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９は、システイン（Ｃ）で置換されている（Ｙ３４９Ｃ）。
【0172】
特定の実施形態では、ドメインＫは第２のＣＨ３ドメイン配列を有し、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。特定の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｗ変異を有する。
【0173】
いくつかの実施形態では、ノブインホール直交変異は、イソアロタイプ変異と組み合わされる。特定の実施形態では、ノブ変異は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙである。特定の実施形態では、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔから選択される。特定の実施形態では、ホール変異はＦ４０５Ｔである。
【0174】
特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列はＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＫのＣＨ１アミノ酸配列は、結合分子中の唯一のＣＨ１アミノ酸配列である。特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続している。特定の実施形態では、定常領域配列はＣＬ配列である。特定の実施形態では、ＣＬドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続している。
【0175】
６．４．４．１１ ドメインＬ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＬはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＬはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＬはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態では、ドメインＬはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
【0176】
６．４．４．１２ ドメインＭ
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。一連の好ましい実施形態では、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を有し、ドメインＭはＣＬアミノ酸配列を有する。別の一連の好ましい実施形態では、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＭはＣＨ１アミノ酸配列を有する。
図２を参照すると、本明細書に記載の抗体構築物の様々な実施形態では、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。一連の好ましい実施形態では、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を有し、ドメインＭはＣＬアミノ酸配列を有する。別の一連の好ましい実施形態では、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＭはＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【0177】
６．４．４．１３ ドメインＡとドメインＦの対形成
図２に示す抗体構築物では、ドメイン「Ａ」ＶＬまたはＶＨアミノ酸配列および同族ドメイン「Ｆ」ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列が会合し、抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する。Ａ：Ｆ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、抗原のエピトープと特異的に結合することができる。
図２に示す抗体構築物では、ドメイン「Ａ」ＶＬまたはＶＨアミノ酸配列および同族ドメイン「Ｆ」ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列が会合し、抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する。Ａ：Ｆ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、抗原のエピトープと特異的に結合することができる。
【0178】
様々な多価実施形態では、ドメインＡおよびＦ（Ａ：Ｆ）によって形成されるＡＢＳは、結合分子内の１またはそれを超える他のＡＢＳと配列が同一であり、したがって、結合分子内の１またはそれを超える他の配列同一のＡＢＳと同じ認識特異性を有する。
【0179】
様々な多価実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、結合分子内の１またはそれを超える他のＡＢＳと配列が同一ではない。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、結合分子中の１またはそれを超える他の配列非同一ＡＢＳの認識特異性とは異なる認識特異性を有する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、結合分子中の少なくとも１つの他の配列非同一性ＡＢＳによって認識される抗原とは異なる抗原を認識する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、結合分子中の少なくとも１つの他の配列非同一性ＡＢＳによっても認識される抗原の異なるエピトープを認識する。これらの実施形態では、ドメインＡおよびＦによって形成されるＡＢＳは抗原のエピトープを認識し、結合分子内の１またはそれを超える他のＡＢＳは同じ抗原を認識するが、同じエピトープを認識しない。
【0180】
６．４．４．１４ ドメインＢとドメインＧの対形成
図２に示される抗体構築物では、ドメイン「Ｂ」定常領域アミノ酸配列とドメイン「Ｇ」定常領域アミノ酸配列とが会合している。
図２に示される抗体構築物では、ドメイン「Ｂ」定常領域アミノ酸配列とドメイン「Ｇ」定常領域アミノ酸配列とが会合している。
【0181】
いくつかの実施形態では、ドメインＢおよびドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【0182】
特定の実施形態では、ドメインＢは第１のＣＨ３ドメインであり、ドメインＧは第２のＣＨ３ドメインであり、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｙ３４９Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。
【0183】
特定の実施形態では、ドメインＢは第２のＣＨ３ドメインであり、ドメインＧは第１のＣＨ３ドメインであり、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｙ３４９Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。
【0184】
様々な実施形態では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列は同一である。特定のこれらの実施形態では、配列は内因性ＣＨ３配列である。配列は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ３配列であってもよい。配列は、ヒトＩｇＡ由来の配列であってもよい。
【0185】
様々な実施形態では、ＢドメインおよびＧドメインのアミノ酸配列は異なり、内因性ＣＨ３配列中にそれぞれ直交改変を別々に含み、ＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインもＧドメインも、直交改変を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。
【0186】
特定の実施形態では、ドメインＢまたはＧ含有ＣＨ３配列と、同じくＣＨ３配列を含有するドメインＥおよびＫとの望ましくない会合を減少させることが望ましい。そのような場合、ドメインＢおよび／またはＧにおけるヒトＩｇＡ（ＩｇＡ－ＣＨ３）由来のＣＨ３配列の使用は、そのような望ましくない会合を減少させることによって抗体の集合および安定性を改善し得る。結合分子のいくつかの実施形態では、ドメインＥおよびＫはＩｇＧ－ＣＨ３配列を含み、ドメインＢおよびＧはＩｇＡ－ＣＨ３配列を含む。
【0187】
６．４．４．１５ ドメインＥとドメインＫの対形成
特定の実施形態では、ドメインＥは第１のＣＨ３ドメインであり、ドメインＫは第２のＣＨ３ドメインであり、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｙ３４９Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。
特定の実施形態では、ドメインＥは第１のＣＨ３ドメインであり、ドメインＫは第２のＣＨ３ドメインであり、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｙ３４９Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。
【0188】
特定の実施形態では、ドメインＥは第２のＣＨ３ドメインであり、ドメインＫは第１のＣＨ３ドメインであり、第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｙ３４９Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＳ３５４はシステイン（Ｃ）で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５７は疎水性または芳香族アミノ酸で置換され、位置はＥｕインデックスにしたがってナンバリングされている。
【0189】
特定の実施形態では、異なる配列は、内因性ＣＨ３配列中にそれぞれ直交改変を別々に含み、ＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインもＫドメインも、直交改変を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。特定の実施形態では、直交改変には、操作されたジスルフィド架橋、ノブインホール変異、および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交改変は、操作されたジスルフィド架橋、ノブインホール変異、および電荷対変異から選択されるがこれらに限定されない直交改変の組み合わせを含む。
【0190】
特定の実施形態では、直交改変は、イソアロタイプ変異などの免疫原性を低下させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
【0191】
様々な実施形態では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一である。
【0192】
６．４．４．１６ ドメインＨとドメインＬの対形成
様々な実施形態では、ドメインＨはＶＬ配列を有し、ドメインＬはＶＨ配列を有し、ドメイン「Ｈ」ＶＬドメイン「Ｌ」ＶＨアミノ酸配列が会合して、抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する。Ｈ：Ｌ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、抗原のエピトープと特異的に結合することができる。
様々な実施形態では、ドメインＨはＶＬ配列を有し、ドメインＬはＶＨ配列を有し、ドメイン「Ｈ」ＶＬドメイン「Ｌ」ＶＨアミノ酸配列が会合して、抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する。Ｈ：Ｌ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、抗原のエピトープと特異的に結合することができる。
【0193】
好ましい実施形態では、ドメインＨはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【0194】
様々な実施形態では、ＨドメインおよびＬドメインのアミノ酸配列は、内因性配列中にそれぞれ直交改変を別々に含み、ＨドメインはＬドメインと相互作用し、ＨドメインもＬドメインも、直交改変を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｈドメインにおける直交変異はＶＬ配列にあり、Ｌドメインにおける直交変異はＶＨ配列にある。特定の実施形態では、直交変異は、ＶＨ／ＶＬ界面における電荷対変異である。好ましい実施形態では、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＩｇａｗａら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２０１０，ｖｏｌ．２３，６６７－６７７）により詳細に記載されているように、ＶＨ／ＶＬ界面における電荷対変異は、ＶＨ中のＱ３９ＥとＶＬ中の対応するＱ３８Ｋ、またはＶＨ中のＱ３９ＫとＶＬ中の対応するＱ３８Ｅである。
【0195】
特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【0196】
６．４．４．１７ ドメインＩとドメインＭの対形成
様々な実施形態では、ドメインＩはＣＬ配列を有し、ドメインＭはＣＨ１配列を有する。
様々な実施形態では、ドメインＩはＣＬ配列を有し、ドメインＭはＣＨ１配列を有する。
【0197】
様々な実施形態では、ＩドメインおよびＭドメインのアミノ酸配列は、内因性配列中にそれぞれ直交改変を別々に含み、ＩドメインはＭドメインと相互作用し、ＩドメインもＭドメインも、直交改変を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｉドメインにおける直交変異はＣＬ配列にあり、Ｍドメインにおける直交変異はＣＨ１配列にある。
【0198】
６．４．４．１８ ドメイン接合部
６．４．４．１８．１ ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを接続する接合部
様々な実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間の接合部を形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。
６．４．４．１８．１ ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを接続する接合部
様々な実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間の接合部を形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。
【0199】
特定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸が、ＶＬドメインのＣ末端において欠失または付加される。特定の実施形態では、Ａ１１１が、ＶＬドメインのＣ末端において欠失される。特定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失または付加される。特定の実施形態では、Ｐ３４３が、ＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失される。特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４が、ＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失される。特定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸が、ＶＬドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方に欠失または付加される。特定の実施形態では、Ａ１１１がＶＬドメインのＣ末端において欠失され、Ｐ３４３がＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失される。好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０が、ＶＬドメインのＣ末端において欠失される。別の好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０がＶＬドメインのＣ末端において欠失しており、ＣＨ３ドメインのＮ末端はＰ３４３Ｖ変異を有する。
【0200】
６．４．４．１８．２ ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを接続する接合部
様々な実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間の接合部を形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。
様々な実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間の接合部を形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。
【0201】
特定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端において欠失または付加される。特定の実施形態では、Ｋ１１７およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端において欠失している。特定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失または付加される。特定の実施形態では、Ｐ３４３が、ＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失される。特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４が、ＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失される。特定の実施形態では、Ｐ３４３、Ｒ３４４、およびＥ３４５が、ＣＨ３ドメインのＮ末端において欠失される。特定の実施形態では、１またはそれを超えるアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方に欠失または付加される。好ましい実施形態では、Ｔ１１６、Ｋ１１７、およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端において欠失している。
【0202】
６．４．４．１８．３ ＣＨ３のＣ末端とＣＨ２のＮ末端とを接続する接合部（ヒンジ）
本明細書に記載される抗体構築物のいくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインのＮ末端は、「ヒンジ」領域アミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域は、抗体のＮ末端可変ドメイン定常ドメインセグメントと抗体のＣＨ２ドメインとを連結する抗体重鎖の配列である。さらに、ヒンジ領域は、典型的には、Ｎ末端可変ドメイン定常ドメインセグメントとＣＨ２ドメインとの間の柔軟性、ならびに重鎖（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）間のジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列モチーフの両方を提供する。
本明細書に記載される抗体構築物のいくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインのＮ末端は、「ヒンジ」領域アミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域は、抗体のＮ末端可変ドメイン定常ドメインセグメントと抗体のＣＨ２ドメインとを連結する抗体重鎖の配列である。さらに、ヒンジ領域は、典型的には、Ｎ末端可変ドメイン定常ドメインセグメントとＣＨ２ドメインとの間の柔軟性、ならびに重鎖（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）間のジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列モチーフの両方を提供する。
【0203】
様々な実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とＣＨ２ドメインのＮ末端との間の接合部のＣ末端において伸長される。特定の実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とヒンジ領域との間の接合部のＣ末端で伸長され、ヒンジ領域がＣＨ２ドメインのＮ末端に接続される。好ましい実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３アミノ酸伸長配列（「ＣＨ３リンカー配列」または「ＣＨ３リンカー」）を挿入することによって伸長される。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列の後には、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが続く。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列は、３～１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列は、３～８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列は、３～６アミノ酸長である。
【0204】
いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列はＰＧＫトリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列はＡＧＣトリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列は、ＧＥＣトリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列はＡＧＫＣである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列はＰＧＫＣである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列はＡＧＫＧＣである。いくつかの実施形態では、ＣＨ３アミノ酸伸長配列はＡＧＫＧＳＣである。
【0205】
特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端での伸長は、別のＣＨ３ドメインの直交Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸配列を組み込む。好ましい実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端での伸長は、ＫＳＣトリペプチド配列を組み込み、その後に、カッパ軽鎖のＧＥＣモチーフを組み込む別のＣＨ３ドメインの直交Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成するＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが続く。
【0206】
結合分子のいくつかの実施形態では、ドメインＢおよびＧはＣＨ３アミノ酸配列を含み、ドメインＢは第１のＣＨ３リンカー配列を含み、ドメインＧは第２のＣＨ３リンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカー配列は、第１および第２のＣＨ３リンカー配列のシステイン残基間のジスルフィド架橋の形成によって第２のＣＨ３リンカー配列と会合する。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは同一である。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは同一ではない。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは、１～６アミノ酸長が異なる。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは、１～３アミノ酸長が異なる。
【0207】
好ましい実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＳＣである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＳＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。
【0208】
６．４．４．１８．４ ＣＬのＣ末端とＣＨ２のＮ末端とを接続する接合部（ヒンジ）
様々な実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、そのＣ末端を介してヒンジ領域に連結され、次にヒンジ領域はＣＨ２ドメインのＮ末端に連結される。
様々な実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、そのＣ末端を介してヒンジ領域に連結され、次にヒンジ領域はＣＨ２ドメインのＮ末端に連結される。
【0209】
６．４．４．１８．５ ＣＨ２のＣ末端を定常領域ドメインに接続する接合部
様々な実施形態において、ＣＨ２アミノ酸配列は、そのＣ末端を介して定常領域ドメインのＮ末端に連結される。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、その内因性配列を介してＣＨ３配列に連結される。他の実施形態では、ＣＨ２配列はＣＨ１またはＣＬ配列に連結されている。ＣＨ２配列をＣＨ１またはＣＬ配列に連結することを議論する例は、米国特許第８，２４２，２４７号にさらに詳細に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態において、ＣＨ２アミノ酸配列は、そのＣ末端を介して定常領域ドメインのＮ末端に連結される。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、その内因性配列を介してＣＨ３配列に連結される。他の実施形態では、ＣＨ２配列はＣＨ１またはＣＬ配列に連結されている。ＣＨ２配列をＣＨ１またはＣＬ配列に連結することを議論する例は、米国特許第８，２４２，２４７号にさらに詳細に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0210】
６．４．４．１９ 二価二重特異性Ｂ－Ｂｏｄｙ「ＢＣ１」
図２および図３を参照すると、一連の実施形態において、抗体構築物は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｔ３６６Ｋ変異およびＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＫＳＣトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、Ｌ３５１Ｄ変異およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
図２および図３を参照すると、一連の実施形態において、抗体構築物は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｔ３６６Ｋ変異およびＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＫＳＣトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、Ｌ３５１Ｄ変異およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【0211】
本明細書に記載の直交変異は、個の構築物のＥ：Ｋ対ドメインにさらに操作することができる。
【0212】
６．４．４．２０ 二価二重特異性Ｂ－Ｂｏｄｙ「ＢＣ６」
図２および図４を参照すると、一連の実施形態において、結合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＫＳＣトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、ＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
図２および図４を参照すると、一連の実施形態において、結合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＫＳＣトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、ＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【0213】
本明細書に記載の直交変異は、Ｅ：Ｋ対ドメインにさらに操作することができる。
【0214】
６．４．４．２１ 二価二重特異性Ｂ－Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」
図２および図５を参照すると、一連の実施形態において、結合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異およびＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、Ｓ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
図２および図５を参照すると、一連の実施形態において、結合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異およびＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、Ｓ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【0215】
本明細書に記載の直交変異は、Ｂ：Ｇ対ドメインまたはＥ：Ｋ対ドメインにさらに操作することができる。
【0216】
６．４．４．２２ 二価二重特異性Ｂ－Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」
図２および図６を参照すると、一連の実施形態において、結合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異、Ｐ３４３Ｖ変異、およびＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４Ｃ変異およびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、Ｓ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；ならびに（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
図２および図６を参照すると、一連の実施形態において、結合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＡ－Ｂ－Ｄ－Ｅの向きで配置されており、ドメインＡは、第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異、Ｐ３４３Ｖ変異、およびＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフが後に続くＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは、Ｓ３５４Ｃ変異およびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有する；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ドメインＦおよびドメインＧを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ－Ｇの向きで配置され、ドメインＦは、第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧは、Ｓ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｃ）第３のポリペプチド鎖は、ドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＨ－Ｉ－Ｊ－Ｋの向きで配置されており、ドメインＨは、第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、Ｋは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する；（ｄ）第４のポリペプチド鎖は、ドメインＬおよびドメインＭを有し、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＬ－Ｍの向きで配置され、ドメインＬは、第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有する；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合する；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合する；ならびに（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成する；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【0217】
本明細書に記載の直交変異は、Ｂ：Ｇ対ドメインまたはＥ：Ｋ対ドメインにさらに操作することができる。
【実施例】
【0218】
６．５．実施例
以下に、本発明を実施するための具体的な実施形態の例を示す。実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、当然ながら、いくらかの実験誤差および偏差が許容されるべきである。
以下に、本発明を実施するための具体的な実施形態の例を示す。実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、当然ながら、いくらかの実験誤差および偏差が許容されるべきである。
【0219】
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献で十分に説明されている。
【0220】
６．５．１．実施例１－「ＢＣ９６」二価抗体構築物
本発明者らは、特定のヘテロ二量体化を駆動するために様々な直交変異を組み込んだ、第１の抗原「抗原Ａ」および第２の抗原「抗原Ｂ」に特異的な「ＢＣ９６」と呼ばれる新しい二価二重特異性構築物を構築した。例示的な「ＢＣ９６」構造の顕著な特徴を図７に示す。
本発明者らは、特定のヘテロ二量体化を駆動するために様々な直交変異を組み込んだ、第１の抗原「抗原Ａ」および第２の抗原「抗原Ｂ」に特異的な「ＢＣ９６」と呼ばれる新しい二価二重特異性構築物を構築した。例示的な「ＢＣ９６」構造の顕著な特徴を図７に示す。
【0221】
より詳細には、図２によるドメインおよびポリペプチド鎖の言及、括弧内に示されている野生型配列からの変異、および以下のセクション５に記載されている配列では、構造は以下の通りである。
第１のポリペプチド鎖（配列番号１）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；Ｋ３７０Ｒ）（配列番号５）
ドメインＤ＝ＣＨ２（配列番号６）
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｗ）（配列番号７）
第２のポリペプチド鎖（配列番号２）
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｇ３４１Ａ；Ｓ３５４Ｃ；Ｅ３５７Ｗ）（配列番号８）
第３のポリペプチド鎖（配列番号３）
ドメインＨ＝ＶＬ（「抗原Ｂ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（κ）（配列番号９）
ドメインＪ＝ＣＨ２（配列番号１０）
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）（配列番号１１）
第４のポリペプチド鎖（配列番号４）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「抗原Ｂ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１（配列番号１２）。
第１のポリペプチド鎖（配列番号１）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；Ｋ３７０Ｒ）（配列番号５）
ドメインＤ＝ＣＨ２（配列番号６）
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｗ）（配列番号７）
第２のポリペプチド鎖（配列番号２）
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｇ３４１Ａ；Ｓ３５４Ｃ；Ｅ３５７Ｗ）（配列番号８）
第３のポリペプチド鎖（配列番号３）
ドメインＨ＝ＶＬ（「抗原Ｂ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（κ）（配列番号９）
ドメインＪ＝ＣＨ２（配列番号１０）
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）（配列番号１１）
第４のポリペプチド鎖（配列番号４）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「抗原Ｂ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１（配列番号１２）。
【0222】
ＡドメインおよびＦドメインは、「抗原Ａ」に特異的な抗原結合部位（Ａ：Ｆ）を形成する。ＨドメインとＬドメインとが会合して、「抗原Ｂ」に特異的な抗原結合部位（Ｈ：Ｌ）が形成される。
【0223】
Ｂドメイン（配列番号５）は、２つの変異：Ｙ３４９ＣおよびＫ３７０Ｒを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する。Ｙ３４９Ｃ変異は、ドメインＧ内に同族Ｃ３５４変異を有するジスルフィドを形成することができるシステインを導入するが、Ｋ３７０Ｒ変異は、鎖Ｇ内の３５７Ｗ変異のコンテキストに含まれる場合、正確に形成された分子の収量を増加させることができる。
【0224】
ドメインＤ（配列番号６）はヒトＩｇＧ１ ＣＨ２の配列を有する
【0225】
ドメインＥ（配列番号７）は、変異Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する。３６６Ｗは「ノブ」変異である。
【0226】
ドメインＧ（配列番号８）は、以下の変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する：Ｇ３４１Ａ、Ｓ３５４Ｃ、およびＥ３５７Ｗ。Ｇ３４１Ａ変異は、正しく形成された分子の収率を増加させることができ、３５４Ｃ変異は、ドメインＢ内の同族３４９Ｃ変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入し、Ｅ３５７Ｗ変異は、ヘテロ二量体界面の直交性を改善し、正しく形成された分子の収率を増加させることができる。
【0227】
ドメインＩ（配列番号９）は、ヒトＣカッパ軽鎖（Ｃκ）の配列を有する
【0228】
ドメインＪ（配列番号１０）は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインの配列を有し、ドメインＤの配列と同一である。
【0229】
ドメインＫ（配列番号１１）は、以下の変化を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する：Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ。３５６ＥおよびＬ３５８Ｍは、免疫原性を低下させるイソアロタイプアミノ酸を導入する。３６６Ｓ、３６８Ａおよび４０７Ｖは、「ホール」変異である。
【0230】
ドメインＭ（配列番号１２）は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域の配列を有する。
【0231】
配列は、以下のセクション５に提供され、野生型から変異したすべての位置には、配列番号１～１２において下線が引かれている。４つの可変ドメインの配列は完全には提供されず、代わりに抗原結合部位「Ａ」および「Ｂ」についてそれぞれ＜ＶＬ－Ａ＞、＜ＶＨ－Ａ＞および＜ＶＬ－Ｂ＞、＜ＶＨ－Ｂ＞と示される。接合部融合の点を示すために、典型的なヒトκＶＬドメインの最後の３つのアミノ酸「ＥＩＫ」を含めて斜体で示し、典型的なヒトＶＨドメインの最後の３つのアミノ酸「ＶＳＳ」を含めて斜体で示す。
【0232】
構築物ＢＣ－１、ＢＣ－６、ＢＣ－２８およびＢＣ－４４とは対照的に、図７に示すＢＣ－９６の実施形態は、ドメインＥ：Ｋにおける操作されたジスルフィドを省略している。図示された構造とは異なる代替の実施形態は、（ａ）ドメインＥ：Ｋ内の操作されたジスルフィド結合を含むこと；（ｂ）ドメインＥ：Ｋ間のノブインホール変異を反転させること；（ｃ）ドメインＢ：Ｇ内のＹ＋Ｋ：Ｓ＋Ｅ対を反転させること；またはそれらの任意のサブセットもしくは組み合わせを含む。さらに、ドメインＥ：Ｋにおいて、ノブインホール変異に加えて、またはその代わりに、ＣＨ３ドメインにおける他の公知の直交変異を使用することができる。
【0233】
「ＢＣ９６」は、１００μｇ／ｍｌを超える濃度で哺乳動物発現を使用して高レベルで容易に発現され得る。本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＣＨ１特異的ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）親和性樹脂を使用して、一段階で二価二重特異性「ＢＣ９６」タンパク質を容易に精製できることを見出した。
【0234】
ＢＣ９６タンパク質を、ＢＣ９６の適切な集合への様々な変異の寄与を調べるための代替物と共に発現させた。各構築物のＣＨ１精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果は、第１のＣＨ３ドメイン中のＥ３５７Ｗ変異および第１のＣＨ３ドメインの反対側の第２のＣＨ３ドメイン中のＫ３７０Ｒ変異の存在が、適切に集合した生成物のより高い純度をもたらすのに有意であることを実証している（図８Ａ～図８Ｄ）。ドメインＢのＫ３７０変異とドメインＧのＥ３５７変異の両方を欠くＢＣ９６バリアント（図８Ａ）、ドメインＢのＫ３７０変異を欠くがドメインＧのＥ３５７Ｗ変異を含むもの（図８Ｂ）、およびドメインＢのＫ３７０Ｒ変異を含むがドメインＧのＥ３５７変異を欠くもの（図８Ｃ）を、ドメインＢのＫ３７０Ｒ変異とドメインＧのＥ３５７Ｗ変異の両方を含むＢＣ９６（図８Ｄ）と比較した。結果は、第１のＣＨ３ドメインにおけるＥ３５７Ｗ変異および反対側のＣＨ３ドメインにおけるＫ３７０Ｒ変異の存在が、２つのドメインの二量体化の効率およびＢＣ９６抗体構築物の適切な集合を有意に改善することを実証している。
【0235】
６．５．２．実施例２－改善されたＣＨ３二量体化のためのＣＨ３改変の評価
個々の変異によって付与される直交度を評価するために、明確に異なる質量を有する２つの面からなる非対称抗体構築物を生成した（図９）。Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（ドメインＥおよびＫ）に変異を作製した。構築物の各側を構成するポリペプチドを共発現させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、所望のヘテロ二量体生成物およびホモ二量体夾雑物の集合を評価した（図１０Ａ～図１０Ｃおよび図１１Ａ～図１１Ｂ）。
個々の変異によって付与される直交度を評価するために、明確に異なる質量を有する２つの面からなる非対称抗体構築物を生成した（図９）。Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（ドメインＥおよびＫ）に変異を作製した。構築物の各側を構成するポリペプチドを共発現させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、所望のヘテロ二量体生成物およびホモ二量体夾雑物の集合を評価した（図１０Ａ～図１０Ｃおよび図１１Ａ～図１１Ｂ）。
【0236】
評価した各構築物は、Ｙ３４９Ｃ変異を有するＣＨ３ドメイン（ドメインＥ）およびＳ３５４Ｃ変異を有する反対側のＣＨ３ドメイン（ドメインＫ）を含み、適切に集合した生成物中の２つのＣＨ３ドメイン間に操作されたジスルフィドをもたらした（図９）。ドメインＫのＣＨ３配列に追加の置換を行って、Ｅ３５７Ｗおよび／またはＳ３６４Ｒ変異も含む構築物を生成した。精製後、大きなホモ二量体夾雑物（夾雑物１）および小さなホモ二量体夾雑物（夾雑物２）の存在を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用したサイズによって所望のヘテロ二量体と容易に区別することができた。
【0237】
結果は、ドメインＫのＣＨ３配列におけるＥ３５７およびＳ３６４変異の両方の非存在下での両方のホモ二量体夾雑物の有意な集合を実証した（図１０Ａ）。ドメインＫのＣＨ３配列がＥ３５７Ｗ変異を含むがＳ３６４変異を含まない場合、より少ない夾雑物１ホモ二量体が生成された（図１０Ｂおよび図１１Ａ）。対照的に、ドメインＫのＣＨ３配列がＥ３５７Ｗ変異およびＳ３６４Ｒ変異の両方を含有する場合、夾雑物１ホモ二量体は実質的に検出できなかった（図１０Ｃおよび図１１Ｂ）。
【0238】
図１０Ａ～１０Ｃの結果は、プロテインＡによる精製後のＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる生成物の分析を示す。図１１Ａ～１１Ｂの結果は、ＣＨ１による精製後のＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる生成物の分析を示す。
【0239】
これらの結果は、第１のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ、Ｅ３５７ＷおよびＳ３６４Ｒ変異が存在し、第１のＣＨ３ドメインとは反対側の第２のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異が存在すると、第１および第２のＣＨ３ドメインの二量体化を必要とする生成物の集合効率を有意に改善できることを示唆している。
７．配列
７．配列
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【0240】
８．均等物および参照による組み込み
本発明は、好ましい実施形態および様々な代替の実施形態を参照して特に示され説明されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には理解されよう。
本発明は、好ましい実施形態および様々な代替の実施形態を参照して特に示され説明されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には理解されよう。
【0241】
本明細書の本文内で引用されたすべての参考文献、発行された特許および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【国際調査報告】