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▶ ザ チャイニーズ ユニバーシティー オブ ホンコンの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-09
(54)【発明の名称】老化脳機能低下を逆転する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20231226BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231226BHJP
A61K 38/26 20060101ALI20231226BHJP
A61B 5/00 20060101ALI20231226BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P25/28
A61K38/26
A61B5/00 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023536878
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-08-15
(86)【国際出願番号】 CN2021138827
(87)【国際公開番号】W WO2022127868
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】63/126,122
(32)【優先日】2020-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504375477
【氏名又は名称】ザ チャイニーズ ユニバーシティー オブ ホンコン
(74)【代理人】
【識別番号】110003339
【氏名又は名称】弁理士法人南青山国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】コ，ホー
(72)【発明者】
【氏名】リー，チョンチ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，シンイー
(72)【発明者】
【氏名】ヴォン，シー ロン
(72)【発明者】
【氏名】チャオ，レイ
(72)【発明者】
【氏名】モク，チュン トン ヴィンセント
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ジュンチェ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，イク チュン レオ
(72)【発明者】
【氏名】ライ，ヘイ，ミン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C117
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA17
4C084BA08
4C084BA19
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA59
4C084DB35
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZC411
4C084ZC412
4C084ZC521
4C084ZC522
4C117XA01
4C117XB01
4C117XD03
4C117XE05
4C117XE18
4C117XE44
4C117XE45
4C117XE46
4C117XQ13
4C117XR07
4C117XR08
4C117XR09
4C117XR10
(57)【要約】
脳の老化に伴う変化を処置するグルカゴン様ペプチド－１レセプター（ＧＬＰ－１）アゴニスト（ＧＬＰ－１ＲＡ）の投与を含む、老化中の脳の機能低下を処置する方法が提供される。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、ＰＦ－０６８８２９６１、ＯＷＬ－８３３、ＴＴＰ－２７３又はＧＬＰ－１Ｒを活性化する任意のその他の分子である。
【選択図】図２Ａ
【選択図】図２Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
老化に伴う脳機能障害について、対象を処置する方法であって、前記対象に、有効量のＧＬＰ－１Ｒアゴニストを投与することによって、前記老化に伴う脳機能障害を処置することを含む、方法。
【請求項2】
前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、ＰＦ－０６８８２９６１、ＯＷＬ－８３３、若しくはＴＴＰ－２７３、又はＧＬＰ－１Ｒを活性化するその他分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
薬学的に許容される担体を、前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストと共に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記対象は、哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記哺乳類は、霊長類である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記霊長類は、ヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記対象は、５０歳以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記老化に伴う脳機能障害は、認知障害を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記認知障害は、注意力と集中力、学習タスクと概念、記憶、情報処理、視空間機能、発話、言語理解、発話流暢性、問題解決、意思決定及び実行機能のいずれかである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記老化に伴う脳機能障害は、前記脳の測定可能な構造的、機能的及び分子変化のいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記老化に伴う測定可能な構造的変化は、海馬萎縮、皮質萎縮、皮質下の構造的萎縮、小脳萎縮、全脳萎縮、灰白質中の微小脳出血、白質中の微小脳出血、ラクナ、脳梗塞、血管周囲腔、白質強度変化、及びタンパク質種の凝集のいずれかである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記タンパク質種は、アミロイドベータ、タウ、アルファ－シヌクレイン、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３、及びプリオンのいずれかである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記老化に伴う測定可能な構造的変化は、画像検査法により測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記画像検査法は、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、及び／又は超音波検査（ＵＳ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記老化に伴う測定可能な機能的変化は、改変した脳の領域の活性パターン、ニューロンの活動、機能的結合、血液脳関門漏出、安静時血流、グルコース消費、代謝物濃度、神経血管カップリング又は機能的充血である、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
前記老化に伴う測定可能な機能的変化は、機能的画像検査法又は記録法により測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記機能的画像検査法又は記録法は、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＳＩ）、超偏極炭素－１３（１３Ｃ）核磁気共鳴画像検査法（ＭＲＳＩ）、超音波検査（ＵＳ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、脳波検査（ＥＥＧ）、脳磁図（ＭＥＧ）、機能的近赤外線分光法（ｆＮＩＲＳ）、頭蓋内電記録、又は脳深部電記録である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記老化に伴う測定可能な分子変化は、遺伝子発現における変化；ＤＮＡ転写；ＲＮＡ翻訳；脳細胞又は組織におけるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の位置；又はタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア、細胞成分又はミトコンドリア成分の血液への分泌又は放出である、請求項１０に記載の方法。
【請求項19】
前記老化に伴う測定可能な分子変化は、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は血液／血漿組成における変化である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願を相互参照
本出願は、２０２０年１２月１６日出願の米国仮出願第６３／１２６，１２２号の優先権を主張するものであり、表、図、又は描画を含むその全てを参照することにより援用される。
本出願は、２０２０年１２月１６日出願の米国仮出願第６３／１２６，１２２号の優先権を主張するものであり、表、図、又は描画を含むその全てを参照することにより援用される。
【背景技術】
【0002】
老化は、不可逆的な過程と考えられてきた。ほぼ全ての細胞過程は、代謝、ストレス応答、免疫応答、細胞老化から遺伝子発現及びゲノム安定性に及ぶ老化に関与しており、影響を受けている（非特許文献１）。これらの複雑な分子改変（alterations）はおそらく、多くの身体器官における細胞状態及び組成の改変をもたらし、加齢に伴う（age-related）機能低下として現れる。脳において、老化の顕著な特徴は、（１）ミトコンドリア機能不全、（２）エネルギー代謝の調節不全、（３）酸化的に損傷したタンパク質、核酸及び脂質の細胞内蓄積、（４）細胞の「老廃物処理」機構（すなわち、オートファジー、リソソーム及びプロテアソーム機能性）の障害、（５）適応ストレス応答シグナリングの障害、（６）ＤＮＡ修復の障害、（７）ニューラルネットワーク活動の異常、（８）ニューロンのカルシウムシグナリング及び対処の調節不全、（９）幹細胞枯渇、及び（１０）炎症を含む（非特許文献１５）。関与する生物学的変化の複雑さ、及び容易に標的化可能な一連の駆動経路がないことを考慮すると、抗老化薬物療法は、非常に困難であると考えられる。老化脳内の分子及び細胞改変は、その機能の低下をもたらし、脳卒中や神経変性（例えば、アルツハイマー及びパーキンソン病）にかかりやすくさせる。ヒトの寿命が長くなるにつれて、老化に伴う(aging-associated）脳の症状を患う集団は劇的に増大している。老化脳内のこれらの改変を遅くする、さらには逆転させること（reversing）は、これらの症状を一次的予防する、さらには処置するための方策を提供し得る。
【0003】
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、グルコース依存性インシュリン放出を増強するために、腸Ｌ細胞により末梢で、及び孤束核のプレプログルカゴンニューロンによる脳内の中央で生成されるペプチドホルモンである（非特許文献１１）。過去１０年間で、多数の薬物動態的に最適化されたＧＬＰ－１レセプター（ＧＬＰ－１Ｒ）アゴニスト（ＧＬＰ－１ＲＡ）が、真性糖尿病の臨床処置に承認されている。真性糖尿病の処置とは別に、神経変性の細胞及び動物モデルにおけるエビデンスは、ＧＬＰ－１Ｒ刺激の神経栄養及び神経保護の役割を支持し、同様に、神経新生の増加において（非特許文献１７、非特許文献９、非特許文献７、特許文献１、非特許文献１２、非特許文献７）、ＧＬＰ－１Ｒが学習及び神経保護に関与することを示している。８週齢ラットへのＧＬＰ－１及び［Ｓｅｒ（２）］エキセンディン（１－９）の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）投与は、ＧＬＰ－１Ｒを介して、連合及び空間学習を増強する。［Ｓｅｒ（２）］エキセンディン（１－９）の末梢投与も活性である。Ｉｓａｃｓｏｎら（非特許文献１２）は、エキセンディン－４の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射が、強制水泳テストにおいて、海馬関連基準記憶能力を改善し、不動性を減少することを示した。注目すべきことに、最近の臨床研究によれば、ＧＬＰ－１ＲＡが血糖コントロールによって与えられるものを超える神経保護作用を示し、糖尿病の患者において、認知低下及びパーキンソン病（ＰＤ）の発生率を低下させるという説得力のあるエビデンスが提供された（非特許文献６、非特許文献４）。さらに、ＧＬＰ－１ＲＡは、非糖尿病患者において、確立されたアルツハイマー病（ＡＤ）及びＰＤの進行を遅らせることができる（非特許文献８、非特許文献２）。機械的には、神経変性の動物モデルにおける神経炎症の軽減とは別に（非特許文献５、非特許文献１９）、Ｚｈａｏらは、エキセナチド（ＧＬＰ－１ＲＡ）による処置は、脳内皮細胞（ＥＣ）における加齢に伴うトランスクリプトーム変化を部分的に逆転し、非特異的血液脳関門（ＢＢＢ）漏出を減少させることを実証した（非特許文献２０）。
【0004】
老化は、年をとる過程である。この用語は、特に、哺乳類を指す。より広い意味では、老化は、生物体内の単一細胞又は器官を指すことができる。ヒトにおいて、老化は、経時的なヒトの変化の蓄積を表す。老化は、先進国の蔓延している疾患である癌、心血管疾病及び神経変性疾患の主な危険因子である（非特許文献１６）。老化の原因は不明である。現在の理論の１つは、蓄積された損傷が、生理学的完全性の漸進的な喪失をもたらし、機能損傷や死に至る脆弱性の増加につながる、という損傷説である（非特許文献１４）。
【0005】
老化は、ほぼ全ての細胞型及び細胞過程を含む。さらに、老化脳の特徴は、特定の徴候を有する神経変性疾患、例えば、ＡＤ、ＰＤ及びハンチントン病の特徴とは異なっている。関与する生物学的変化の複雑さ、及び容易に標的化可能な一連の駆動経路がないことを考慮すると、抗老化薬物療法は、可能であっても、非常に困難であると考えられる。このように、老化脳内のトランスクリプトームの改変及び機能的改変（transcriptomic and functional alterations）を遅くする、さらには逆転させることが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許公開公報第６９６９７０２Ｂ２号明細書
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Almanzar et al., A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature 583, 590-595 (2020)
【非特許文献2】Athauda et al., Exenatide once weekly versus placebo in Parkinson's disease: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet (London, England) 390, 1664-1675 (2017)
【非特許文献3】Boisvert, M. M., G. A. Erikson, M. N. Shokhirev, N. J. Allen, The Aging Astrocyte Transcriptome from Multiple Regions of the Mouse Brain. Cell Reports 22, 269-285 (2018)
【非特許文献4】Brauer et al., Diabetes medications and risk of Parkinson's disease: a cohort study of patients with diabetes. Brain (2020) https:/doi.org/10.1093/brain/awaa262
【非特許文献5】Cai et al., Lixisenatide reduces amyloid plaques, neurofibrillary tangles and neuroinflammation in an APP/PS1/tau mouse model of Alzheimer's disease. Biochem Bioph Res Co 495, 1034-1040 (2018)
【非特許文献6】Cukierman-Yaffe et al., Effect of dulaglutide on cognitive impairment in type 2 diabetes: an exploratory analysis of the REWIND trial. Lancet Neurology 19, 582-590 (2020)
【非特許文献7】During et al., Glucagon-like peptide-1 receptor is involved in learning and neuroprotection. Nature Medicine 9, 1173-1179 (2003)
【非特許文献8】Gejl, et al., In Alzheimer's Disease, 6-Month Treatment with -1 Analog Prevents Decline of Brain Glucose Metabolism: Randomized, Placebo-Controlled, Double-Blind Clinical Trial. Frontiers in aging neuroscience 8, 108 (2016)
【非特許文献9】Grieco et al., Glucagon-Like Peptide-1: A Focus on Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience vol. 13 (2019)
【非特許文献10】Hammond et al., Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity 50, 253-271.e6 (2019)
【非特許文献11】Holt et al., Preproglucagon Neurons in the Nucleus of the Solitary Tract Are the Main Source of Brain GLP-1, Mediate Stress-Induced Hypophagia, and Limit Unusually Large Intakes of Food. Diabetes 68, 21-33 (2018)
【非特許文献12】Isacson et al., The glucagon-like peptide 1 receptor agonist exendin-4 improves reference memory performance and decreases immobility in the forced swim test. European Journal of Pharmacology 650, 249-255 (2011))(1,2,3-5)
【非特許文献13】Lloyd, A.F. & V. E. Miron, The pro-remyelination properties of microglia in the central nervous system. Nature Reviews Neurology, 1-12 (2019))
【非特許文献14】Lopez-Otin et al. The hallmarks of aging. Cell vol. 153: 1194 (2013)
【非特許文献15】Mattson and Arumugan, Hallmarks of Brain Aging: Adaptive and Pathological Modification by Metabolic States. Cell Metabolism 27: 1176-1199 (2018)
【非特許文献16】Niccoli, T. & Partridge, L. Ageing as a risk factor for disease. Current Biology vol. 22 R741-R752 (2012)
【非特許文献17】Salcedo et al., Neuroprotective and neurotrophic actions of glucagon-like peptide-1: An emerging opportunity to treat neurodegenerative and cerebrovascular disorders. British Journal of Pharmacology. Vol. 166 1586-1599 (2012)
【非特許文献18】Vanlandewijck et al., Primary isolation of vascular cells from murine brain for single cell sequencing. Protocol Exchange https://doi.org/10.1038/protex.2017.159 (2018)
【非特許文献19】Yun et al., Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine 24, 931-938 (2018)
【非特許文献20】Zhao et al., Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nat Commun 11, 4413 (2020)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本明細書に記載されているのは、老化に伴う脳の症状について対象を処置する方法である。本方法の態様は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストを、それを必要とする対象、例えば、老化に伴う脳の症状を発現又は患うリスクのある個人に投与することを含む。老化に伴う脳の症状としては、例えば、脳の老化に伴う認知障害及び構造的、機能的又は分子変化が挙げられる。
【0009】
特定の実施形態において、本方法は、自然老化によって引き起こされる脳の症状を発現又は患うリスクの可能性のある対象の処置を含む。
【0010】
特定の実施形態において、対象は、例えば、成熟ニューロン（ｍＮｅｕｒ）及び未成熟ニューロン（ｉｍＮｅｕｒ））等のニューロン；例えば、星状細胞（ＡＣ）、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）、小膠細胞（ＭＧ）、及び希突起膠細胞（ＯＬＧ）等のグリア細胞；例えば、周皮細胞（ＰＣ）及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）細胞等の壁細胞；脈絡叢細胞（ＣＰＣ）；ヘモグロビン発現血管細胞（Ｈｂ＿ＥＣ）；及び単球（ＭＮＣ）を含む、脳内の多数の細胞型にわたってトランスクリプトーム及び機能的変化を有する老化に伴う脳の症状を発現又は患うリスクの可能性がある。
【0011】
特定の実施形態において、対象は、例えば、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、ＰＦ－０６８８２９６１、ＯＷＬ－８３３及び／又はＴＴＰ－２７３等のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト（ＧＬＰ－１ＲＡ）で処置可能な老化に伴う脳の症状を発現又は患うリスクの可能性がある。
【0012】
特定の実施形態において、ＧＬＰ－１ＲＡ処置は、例えば、成熟ニューロン（ｍＮｅｕｒ）及び未成熟ニューロン（ｉｍＮｅｕｒ））等のニューロン；例えば、星状細胞（ＡＣ）、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）、小膠細胞（ＭＧ）及び希突起膠細胞（ＯＬＧ））等のグリア細胞；例えば、周皮細胞（ＰＣ）及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）細胞等の壁細胞；脈絡叢細胞（ＣＰＣ）；ヘモグロビン発現血管細胞（Ｈｂ＿ＥＣ）；及び単球（ＭＮＣ）を含む、脳内の多数の細胞型において提示されるトランスクリプトーム及び機能的変化を逆転及び／又は阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】マウスの脳において識別及び分析された主要な細胞型クラスターのＵＭＡＰ可視化を示す。ＡＣ：星状膠細胞;ＯＰＣ：希突起膠細胞前駆細胞；ＭＧ：小膠細胞；ＭＡＣ：血管周囲マクロファージ；ＯＬＧ：希突起膠細胞；ＳＭＣ：平滑筋細胞；ＰＣ：周皮細胞；ＥＣ：内皮細胞。括弧内の数字：それぞれの細胞型の細胞番号。
【図1B】若齢成体マウスの脳からの単一細胞トランスクリプトームのＵＭＡＰ可視化を示す。括弧内の数字：群の細胞番号（群についてｎ＝３匹）。
【図1C】老齢成体マウスの脳からの単一細胞トランスクリプトームのＵＭＡＰ可視化を示す。括弧内の数字：群の細胞番号（群についてｎ＝３匹）。
【図1D】ＧＬＰ－１ＲＡ（エキセナチド）－処置老齢マウスの脳からの単一細胞トランスクリプトームのＵＭＡＰ可視化を示す。括弧内の数字：群の細胞番号（群についてｎ＝３匹）。
【図2A】グリア（ＡＣ：星状細胞;ＯＰＣ：希突起膠細胞前駆細胞；ＭＧ：小膠細胞；及びＯＬＧ：希突起膠細胞）、血管（ＥＣ：内皮細胞；ＰＣ：周皮細胞；ＳＭＣ：平滑筋細胞）細胞型、及びＭＡＣ（血管周囲マクロファージ）におけるＧＬＰ－１ＲＡ処置後発現変化（ｙ軸）に対してプロットされた加齢に伴う発現変化（ｘ軸）を示す。各点は、１つの発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を表す。灰色の線：線形回帰による最良適合の線。
【図3】ニューロン（ｍＮｅｕｒ：成熟ニューロン;ｉｍＮｅｕｒ：未成熟ニューロン；ＭＧ：小膠細胞；及びＯＬＧ：希突起膠細胞）、単球（ＭＮＣ）、脈絡叢細胞（ＣＰＣ）及びヘモグロビン発現血管細胞におけるＧＬＰ－１ＲＡ処置後発現変化（ｙ軸）に対してプロットされた加齢に伴う発現変化（ｘ軸）を示す。各点は、１つの発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を表す。灰色の線：線形回帰による最良適合の線。
【図4】異なる脳細胞型において、ＧＬＰ－１ＲＡ処置によって逆転された最も顕著な加齢に伴う発現変化の中で有意なエンリッチメントを伴う機能的パスウェイを示す。
【図5】老化及びＧＬＰ－１ＲＡ処置後における、ＡＣ、ＭＧ及びＳＭＣにおける選択された機能的に重要な遺伝子の発現変化を示す。
【図6】Ｙ迷路テストにおけるＧＬＰ－１ＲＡで処置された老齢マウスの空間記憶の改善を示す。生後１５～１７カ月のＣ５７ＢＬ／６マウスを、生理食塩水ビヒクル又は５ｎｍｏｌ／体重ｋｇのエキセナチドで２～４カ月間毎日処置した。
【発明を実施するための形態】
【0014】
定義
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値について短縮されたものであると理解される。例えば、１～２０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０からなる群からの数又は下位範囲の任意の数、組み合わせ、同様に、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９等の前述の整数間の全ての介在する１０進数値を含むと理解される。下位範囲に関して、範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子下位範囲」が特に想定される。例えば、１～５０の例示的な範囲の入れ子下位範囲は、一方向に１～１０、１～２０、１～３０及び１～４０、他方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０及び５０～１０を含むことができる。
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値について短縮されたものであると理解される。例えば、１～２０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０からなる群からの数又は下位範囲の任意の数、組み合わせ、同様に、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９等の前述の整数間の全ての介在する１０進数値を含むと理解される。下位範囲に関して、範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子下位範囲」が特に想定される。例えば、１～５０の例示的な範囲の入れ子下位範囲は、一方向に１～１０、１～２０、１～３０及び１～４０、他方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０及び５０～１０を含むことができる。
【0015】
本明細書で使用される「減少」は負の改変を意味し、「増加」は、正の改変を意味し、負又は正の改変は、少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％で正の変化を意味する。
【0016】
移行句「有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的又は非限定（オープンエンド）であり、追加の引用されていない要素又は方法ステップを排除しない。対照的に、移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項に特定された要素、ステップ又は成分を除外する。移行句「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の範囲を、請求された発明の特定の材料又はステップ「及び基本及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の使用は、列挙された構成要素を「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」又は「実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態を想定している。
【0017】
特に指定されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「又は」という用語は、包括的であると理解される。特に指定されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される、用語「１つの（ａ）（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、単数又は複数であると理解される。
【0018】
特に指定されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内であると理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内と理解することができる。文脈から他に明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【0019】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という語は、医薬組成の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないことを意味する。
【0020】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」、「治療有効用量」、「有効量」及び「効果用量」という用語は、対象に投与すると、対象の症状、疾患又は疾病を処置又は改善することができ、又は臓器、組織又は身体系への健康又は機能の増強を提供することができる化合物又は組成物の量又は用量を指すのに用いられる。言い換えると、対象に投与するとき、その量は「治療に有効」である。実際の量は、これらに限定されるものではないが、処置又は改善されている特定の症状、疾患又は疾病；症状の重篤度；健康又は機能における増強が望まれる特定の臓器、組織又は身体系；患者の体重、身長、年齢及び健康、ならびに投与経路を含む多くの要因に応じて変化する。
【0021】
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ」、「緩和する（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」及び「改良する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ」（及びこれらの用語の文法的変形）は、本明細書で使用される場合、区別なく使用される。これらの用語は、限定されるものではないが、治療的利益を含む、有益な又は所望の結果を得るための手法を指す。対象が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、基礎疾患に関連する生理学的徴候の１つ以上を根絶又は改良することによって治療的利益が達成される。処置には、疾患又は症状の出現を遅延させること、疾患又は症状の徴候の発症を遅延させること、疾患又は症状の進行を遅らせる、症状又は任意の組合せの進行を遅らせること、止める又は逆転させること、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。この用語は、ある程度まで、基礎疾患の兆候又は症状を根絶、減少、改良又は逆転させることを指し、必要とはされないが、症状、疾患又は疾病の完治を含む。処置は、疾病の治癒、改善又は部分改良であり得る。「処置」はまた、例えば、身体内の特定の系の機能を、健康又はホメオスタシスの高められた状態にすることも含むことができる。
【0022】
本明細書で使用される場合、「高齢者」という用語は、中年期を過ぎた年齢層の対象を指す。高齢者とは、例えば、５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上又は７５歳以上といった、具体的な年齢群の対象を指す。高齢者対象は、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒト及びさらに好ましくは、成人のヒト、少なくとも５０、５５、６０６５又は７０歳である。より好ましくは、患者は、老齢又は老人の高齢（成人）ヒト患者である。高齢患者は、男性であっても女性であってもよい。
【0023】
本明細書で使用される場合、「実行機能」という語句は、他の能力や挙動を制御又は規制する一連の認知能力を指す。実行機能は、注意力、記憶力及び運動能力のような、より基本的な能力に影響を及ぼす高レベルの能力である。この実行機能は、目標指向の挙動に必要であり、必要に応じて、挙動を監視及び変更して、新規なタスクや状況に直面したときに、将来の挙動を計画するために、行動を開始又は停止する能力が含まれる。実行機能は、対象が、結果を予測し、変化する状況に適応できるようにする。抽象的に考える概念及び能力を形成する能力が、実行機能の構成要素と考えられることが多い。
【0024】
老化に伴う脳の症状
他の臓器と共に、脳の機能は、老化により徐々に低下する。老齢者集団の脳は、学習及び記憶、注意力、意思決定スピード、感覚認知及び運動協調の減少として現れる老化に伴う症状を発現又は患うリスクがある。
他の臓器と共に、脳の機能は、老化により徐々に低下する。老齢者集団の脳は、学習及び記憶、注意力、意思決定スピード、感覚認知及び運動協調の減少として現れる老化に伴う症状を発現又は患うリスクがある。
【0025】
特定の実施形態において、ここに開示されるような処置から利益を受けるであろう対象は、少なくとも５０歳、６０歳、７０歳、８０歳、９０歳、通常、１００歳を超えない年齢、約５０～１００歳、約５０歳、約５５歳、約６０歳、約６５歳、約７０歳、約７５歳、約８０歳、約８５歳、約９０歳又は約１００歳であり、例えば、認知障害及び／又は脳の測定可能な構造的、機能的又は分子変化のような老化に伴う症状を発現又は患うリスクがある。
【0026】
特定の実施形態において、認知障害は、例えば、注意力と集中力；学習タスクと概念；記憶；情報処理；視空間機能；発話；言語理解；発話流暢性；問題解決；意思決定；及び実行機能等の様々な脳の症状を含むことができる。認知障害は、例えば、記憶、想起、視空間認識、発話流暢性、表現力、実行機能、歩き方及びデュアルタスク等、多くのテストによって評価することができる。そのような差異を検出するために使用されるテストとしては、例えば、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、モントリオール認知評価（ＭｏＣＡ）及びその変形、アルツハイマー病評価尺度－認知サブスケール（ＡＤＡＳ－Ｃｏｇ）及び臨床的認知症（ＣＤＲ）尺度が挙げられる。基準のいずれかを満たすスコア：ＭＭＳＥで２６以下、ＭｏＣＡで２５以下、ＡＤＡＳ－Ｃｏｇで１２以上又はＣＤＲで０．５以上は、認知障害とみなされる。
【0027】
特定の実施形態において、脳の構造的変化は、脳容積、すなわち、５％、１０％、１５％、２０％以上の減少、灰白質の構造、白質の構造、心室系の構造、神経血管系の構造及び完全性の変化であり得る。脳における構造的変化は、例えば、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）又は超音波検査（ＵＳ）等の画像検査法によって測定することができる。これらの測定における加齢に伴う低下は、構造の容積の変化を反映する、それぞれの画像検査法又は記録法によって得られた数値及び／又はパターンの改変として定義され、全人口又は同じ年齢の人口についての分布の極値（例えば、頂点又は底辺５％、１０％、２０％、２５％、３０％）に入る、又は経時による、同じ対象からの反復測定において変化を呈す（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上）。
【0028】
特定の実施形態において、脳の機能的変化とは、ニューロンの活動、代謝又は神経血管機能の変化した状態を反映する、脳の測定可能な変化を指すことができる。脳の機能的変化は、例えば、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＳＩ）、超偏極炭素－１３（１３Ｃ）核磁気共鳴画像検査法（ＭＲＳＩ）、超音波検査（ＵＳ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）等の画像検査法によって測定することができる。脳の機能的変化は、電気生理学的方法、例えば、脳波検査（ＥＥＧ）、頭蓋内電極記録及び脳深部電極記録又は磁場ベースの記録方法、例えば、脳磁図（ＭＥＧ）によって記録することもできる。これらの測定における加齢に伴う低下は、ニューロンの活動、代謝又は神経血管機能を反映する、それぞれの画像検査法又は記録法によって得られた数値及び／又はパターンの改変として定義され、全人口又は同じ年齢の人口についての分布の極値（例えば、頂点又は底辺５％、１０％、２０％、２５％、３０％）に入る、又は経時による、同じ対象からの反復測定において変化を呈す（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上）。
【0029】
特定の実施形態において、脳の分子変化とは、脳組織又は血液における分子レベル測定可能な改変、例えば、遺伝子発現;ＤＮＡ転写；ＲＮＡ翻訳；脳細胞又は組織におけるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の位置、及び／又はタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア、細胞成分又はミトコンドリア成分の血液への分泌又は放出における変化を指すことができる。体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液又は血漿であり得る。これらの測定における加齢に伴う変化は、脳の分子変化を反映する、それぞれの方法によって得られた数値及び／又はパターンの改変として定義され、全人口又は同じ年齢の人口についての分布の極値（例えば、頂点又は底辺５％、１０％、２０％、２５％、３０％）に入る、又は経時による、同じ対象からの反復測定において変化を呈す（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上）。
【0030】
ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト
特定の実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストを、本対象の方法において使用することができる。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、ＧＬＰ－１レセプターのアゴニストである。ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１Ｒの天然アゴニストは、作用持続時間が短い。いくつかの薬理学的に最適化されたＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、真性糖尿病又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン病の臨床的処置のために認可又は開発されてきた。
特定の実施形態において、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストを、本対象の方法において使用することができる。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、ＧＬＰ－１レセプターのアゴニストである。ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－１Ｒの天然アゴニストは、作用持続時間が短い。いくつかの薬理学的に最適化されたＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、真性糖尿病又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン病の臨床的処置のために認可又は開発されてきた。
【0031】
ＧＬＰ－１Ｒアゴニストの活性は、例えば、ｃＡＭＰ生成の増加、ＥＲＫ１／２のリン酸化の誘導、カルシウムの細胞内動員の増強、及びベータ－アレスチン－１及びベータ－アレスチン－２の補充等の、ＧＬＰ－１Ｒ活性化に関連する十分に研究されたダウンストリームシグナリング及び制御経路のアッセイによって決定することができる。
【0032】
ＧＬＰ－１Ｒアゴニストのいくつかの非限定的な例としては、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、ＰＦ－０６８８２９６１、ＯＷＬ－８３３及びＴＴＰ－２７３が挙げられる。
【0033】
用量及び投与
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、老化に伴う脳の症状を処置する方法を提供する。一実施形態において、対象は、哺乳類とすることができる。他の実施形態において、対象はヒトとすることができるが、本発明は、全ての哺乳類に対して有効である。本方法は、老化脳内のトランスクリプトーム及び機能的変化を逆転させるＧＬＰ－１Ｒアゴニストを含む有効量の医薬組成物を対象に投与することができる。本組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤をさらに含むことができ、例えば、固体、半固体、液体又は気体形態、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルに製剤化することをさらに含むことができる。薬学的に許容される担体は、業界において周知されており、例えば、水溶液、水又は緩衝生理食塩水又はその他溶媒やビヒクル、例えば、ポリエチレングリコール、Ｔｗｅｅｎ－２０又はオリーブ油又は注射可能有機エステルである。アゴニストの用量範囲は、効力に依存し得る。特定の実施形態において、大量のアゴニストは、例えば、老化脳内の任意の主要な細胞型におけるトランスクリプトーム及び機能的変化の逆転や老化脳の構造的及び／又は機能的変化における逆転等、所望の効果を生じさせることができる。用量は、有害な副作用を引き起こすほど大きくすべきではない。一般に、用量は、使用される薬剤によって変わる。さらに、対象の年齢、症状及び性別は、当業者により決定され、用量を決定するために用いることができる。用量はまた、合併症の場合、個々の医師によって調整することもできる。
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、老化に伴う脳の症状を処置する方法を提供する。一実施形態において、対象は、哺乳類とすることができる。他の実施形態において、対象はヒトとすることができるが、本発明は、全ての哺乳類に対して有効である。本方法は、老化脳内のトランスクリプトーム及び機能的変化を逆転させるＧＬＰ－１Ｒアゴニストを含む有効量の医薬組成物を対象に投与することができる。本組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤をさらに含むことができ、例えば、固体、半固体、液体又は気体形態、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルに製剤化することをさらに含むことができる。薬学的に許容される担体は、業界において周知されており、例えば、水溶液、水又は緩衝生理食塩水又はその他溶媒やビヒクル、例えば、ポリエチレングリコール、Ｔｗｅｅｎ－２０又はオリーブ油又は注射可能有機エステルである。アゴニストの用量範囲は、効力に依存し得る。特定の実施形態において、大量のアゴニストは、例えば、老化脳内の任意の主要な細胞型におけるトランスクリプトーム及び機能的変化の逆転や老化脳の構造的及び／又は機能的変化における逆転等、所望の効果を生じさせることができる。用量は、有害な副作用を引き起こすほど大きくすべきではない。一般に、用量は、使用される薬剤によって変わる。さらに、対象の年齢、症状及び性別は、当業者により決定され、用量を決定するために用いることができる。用量はまた、合併症の場合、個々の医師によって調整することもできる。
【0034】
一実施形態において、組成物は、食品、カプセル、ピル又は飲用に適した液体等の経口摂取可能な製品として製剤化される。経口送達可能な健康促進化合物は、消化管又は口腔粘膜への初期吸収を介して送達される任意の生理活性物質である。組成物はまた、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、髄腔内又は皮下を含む注射によって投与できる溶液として製剤化することもできる。他の実施形態において、本組成物は、局所又は全身への影響のために、パッチを通して、又は直接皮膚を介して投与されるように製剤化される。組成物は、舌下、頬側、直腸又は経腟的に投与することもできる。さらに、組成物は、鼻粘膜を介して吸収するために、鼻に噴霧し、霧状にし、口又は鼻を介して吸入したり、眼や耳に投与することができる。
【0035】
本発明による経口摂取可能な製品は、摂取、栄養、口腔衛生又は嗜好にとって好適な調製物や組成物であり、ヒト又は動物の口腔内に入れて、しばらくの間そこに留まったのち、嚥下される（例えば、摂取向け食品やピル）か、又は口腔内から再び取り出される（例えば、チューインガム、又は口腔衛生や薬用マウスウオッシュ等の製品）製品である。経口送達可能な医薬品は、経口摂取可能な製品へ製剤化でき、経口摂取可能な製品は、経口送達可能な医薬品を含むことができるが、２つの用語は本明細書において区別なく使用されることを意味するものではない。
【0036】
経口摂取可能な製品は、加工、半加工又は未加工の状態で、ヒト又は動物によって摂取されることが意図される全ての物質又は生成物を含む。これには、製造、処置又は処理中に経口摂取可能な製品（特に、食品及び医薬品）に添加され、ヒトや動物の口腔内に導入されるものも含まれる。
【0037】
また、経口摂取可能な製品は、ヒトや動物に嚥下されて、未変性、調製済み又は加工済み状態で消化されることを意図する物質も含むことができる。口腔摂取可能な製品はまた、製品と共に嚥下が意図される、又は嚥下が予想される、ケーシング、コーティング又はその他カプセル化も含む。
【0038】
一実施形態において、経口摂取可能な製品は、所望の経口送達可能な物質を含むカプセル、ピル、シロップ、乳剤又は懸濁液である。一実施形態において、経口摂取可能な製品は、粉末形態の経口送達可能な物質を含むことができ、これを、水又はその他液体と混合して、飲用経口摂取可能な製品を製造することができる。
【0039】
本発明による担体及び／又は賦形剤は、あらゆる溶媒、希釈剤、緩衝液（中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、又は任意で、トリス－ＨＣｌ、酢酸又はリン酸緩衝液等）、水中油型又は油中水型乳剤、例えば、ＩＶ使用に適した有機共溶媒を含めた、又は含めない水性組成物、可溶化剤（例えば、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０）、コロイド、分散媒体、ビヒクル、フィラー、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アミノ酸（例えば、グリシン）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着香剤、芳香剤、増粘剤（例えば、カルボマー、ゼラチン又はアルギン酸ナトリウム）、コーティング、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、ポリクアテリウム）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、等張化制御剤（tonicity controlling agents）、吸収遅延剤、アジュバント、増量剤（ラクトース、マンニトール等）等を含むことができる。薬及びサプリメントの分野における担体及び／又は賦形剤の使用は周知である。標的の健康促進物質又は補助剤組成物と適合しない従来の培地や薬剤を除いて、本組成物における担体又は賦形剤の使用が想定されてもよい。
【0040】
一実施形態において、組成物は、例えば、霧状にしたり、吸入できるように、エアロゾル製剤として作製することができる。エアロゾル又はスプレーの形態での投与に好適な医薬製剤は、例えば、溶液、懸濁液又は乳剤である。経口又鼻エアロゾル又は吸入投与のための製剤はまた、例えば、生理食塩水、ポリエチレングリコール又はグリセロール、ＤＰＰＣ、メチルセルロース又は粉末分散剤やフルオロカーボンとの混合物を含む、例示的な担体を用いて製剤化してもよい。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素、フルオロカーボン、及び／又は当技術分野で公知のその他可溶化剤又は分散剤等の加圧噴射剤中に入れることができる。例示的には、送達は、単回使用送達デバイス、ミストネブライザー、呼気活性化粉末吸入器、エアロゾル定量吸入器（ＭＤＩ）又は当技術分野で利用可能な多数のネブライザー送達デバイスの使用によるものであってもよい。加えて、ミストテントや気管内管を通した直接投与を使用してもよい。
【0041】
一実施形態において、組成物は、注射による投与のために、例えば、溶液又は懸濁液として製剤化することができる。溶液又は懸濁液は、好適な非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒、例えば、マンニトール、１，３－ブタンジオール、水、リンゲル溶液、又は生理食塩液又は好適な分散又は湿潤及び懸濁剤、例えば、無菌の非刺激性の、合成モノ－又はジグリセリドを含む不揮発性油、及びオレイン酸を含む脂肪酸を含むことができる。静脈内使用のための担体の１つの例示的な例としては、１０％ＵＳＰエタノール、４０％ＵＳＰプロピレングリコール又はポリエチレングリコール６００及び残部ＵＳＰ注射用水（ＷＦＩ）の混合物が挙げられる。静脈内使用のための他の例示的な担体としては、１０％ＵＳＰエタノール及びＵＳＰＷＦＩ；ＵＳＰ ＷＦＩ中０．０１～０．１％トリエタノールアミン；又はＵＳＰ ＷＦＩ中０．０１～０．２％ジパルミトイルジホスファチジルコリン；及び１－１０％スクワラン又は非経口的水中植物油型乳剤が挙げられる。水又は生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、好ましくは、特に、注射用溶液のための担体として使用してよい。皮下又は筋肉内使用のための担体の実例としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、ＷＦＩ中５％デキストロース及び５％デキストロース中０．０１～０．１％トリエタノールアミン又はＵＳＰ ＷＦＩ中０．９％塩化ナトリウムが挙げられ、又は１０％ＵＳＰエタノール、４０％プロピレングリコール及び残部の１～２又は１～４混合物が、許容される等張溶液であり、例えば、５％デキストロース又は０．９％塩化ナトリウム、又はＵＳＰ ＷＦＩ中０．０１～０．２％ジパルミトイルジホスファチジルコリン及び１～１０％スクワラン又は非経口水中植物油型乳剤である。
【0042】
一実施形態において、補助剤組成物は、例えば、すすぎ、噴霧、滴下、ローション、ゲル、軟膏、クリーム、泡、粉末、固形物、スポンジ、テープ、水蒸気、ペースト、チンキ又は経皮パッチを含む局所溶液として、皮膚への局所適用を介して投与するために製剤化することができる。局所適用の好適な製剤は、薬学的に活性な担体のいずれかに加えて、皮膚軟化剤、例えば、カルナウバワックス、セチルアルコール、セチルエステルワックス、乳化ワックス、含水ラノリン、ラノリン、ラノリンアルコール、微結晶性ワックス、パラフィン、ワセリン、ポリエチレングリコール、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ホワイトビーズワックス又はイエロービーズワックスを含むことができる。さらに、組成物は、保湿剤、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール溶液及び１，２，６ヘキサントリオール又は浸透促進剤、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール又はオレイン酸を含むことができる。
【0043】
当業者によって判断されるように、さらなる成分、例えば、緩衝剤、担体、粘度調整剤、防腐剤、香味料、染料及び意図される使用に特有のその他成分を添加することができる。当業者であれば、上記の説明が網羅的ではなく例示的であることが認識されるであろう。実際、特定の投与様式に適した多くのさらなる製剤技術及び薬学的に許容される賦形剤及び担体溶液は、当業者に周知されている。
【0044】
特定の実施形態において、用量は、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約１ｇ／体重ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態において、用量は、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約０．２ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約０．１ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約２０ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約１０ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約５ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約２ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約１ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約０．２ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約０．０２ｍｇ／体重ｋｇ、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ～約０．０１ｍｇ／体重ｋｇである。あるいは、いくつかの実施形態において、用量範囲は、約０．０１ｇ／体重ｋｇ～約１ｇ／体重ｋｇ、約０．０５ｇ／体重ｋｇ～約１ｇ／体重ｋｇ、約０．１ｇ／体重ｋｇ～約１ｇ／体重ｋｇ、約０．２ｇ／体重ｋｇ～約１ｇ／体重ｋｇ、約０．２５ｇ／体重ｋｇ～約１ｇ／体重ｋｇ、約０．５ｇ／体重ｋｇ～約１ｇ／体重ｋｇである。一実施形態において、用量範囲は、約５μｇ／体重ｋｇ～約５０μｇ／体重ｋｇである。
【0045】
老化に伴う脳の症状を逆転させるＧＬＰ－１ＲＡは、治療に有効な用量を達成するために、１日に複数回、例えば、１日に２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回又は１２回、１日に１回、1日に１回未満、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、１年に４回、１年に２回、１年に１回又は連続的に与えることができる。本明細書で使用される用量の投与は、限定された期間繰り返すことができ、例えば、本明細書で使用される用量は、数週間、数か月又は数年にわたって毎日投与することができる。処置期間は、治療に対する対象の臨床経過及び応答性により異なる。治療有効量は、脳の測定可能な変化を起こすのに充分なＧＬＰ－１ＲＡの量である（下記の「有効性の測定」参照）。このような有効量は、動物実験だけでなく、治験においても投与可能である。
【0046】
本発明に有用なＧＬＰ－１ＲＡは、経口、静脈内、鼻腔内、吸入、腹腔内、筋肉内、皮下又は腔内投与することができる。一実施形態において、本明細書で使用されるＧＬＰ－１ＲＡは、患者に経口又は皮下投与される。
【0047】
有効性の測定
一実施形態において、所与の処置の有効性は、例えば、記憶、想起、視空間認識、発話流暢性、表現言語、実行機能、歩き方及びデュアルタスク、マルチタスク等、数多くのテストによって測定される、認知能力の向上によって判断することができる。これらは、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、モントリオール認知評価（ＭｏＣＡ）及びその変形、アルツハイマー病評価尺度－認知下位尺度（ＡＤＡＳ－Ｃｏｇ）及び認知症評価（ＣＤＲ）尺度を含む認知テストによって得られる値の改善として反映され得る。臨床的改善は、以下の形態のいずれかにおける数値の変化として定義される：ＭＭＳＥスコアの増加、ＭｏＣＡスコアの増加、ＡＤＡＳ－Ｃｏｇスコアの減少又はＣＤＲスコアの減少。認知能力の改善はまた、これらのスコアのいずれにおいても、年齢適合集団と比較して、低下のないことや低下が遅いこと、例えば、継続的に低下すると予想される老化に伴う、ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡ、ＡＤＡＳ－Ｃｏｇ又はＣＤＲの値に変化がないこととしても反映させることができる。
一実施形態において、所与の処置の有効性は、例えば、記憶、想起、視空間認識、発話流暢性、表現言語、実行機能、歩き方及びデュアルタスク、マルチタスク等、数多くのテストによって測定される、認知能力の向上によって判断することができる。これらは、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、モントリオール認知評価（ＭｏＣＡ）及びその変形、アルツハイマー病評価尺度－認知下位尺度（ＡＤＡＳ－Ｃｏｇ）及び認知症評価（ＣＤＲ）尺度を含む認知テストによって得られる値の改善として反映され得る。臨床的改善は、以下の形態のいずれかにおける数値の変化として定義される：ＭＭＳＥスコアの増加、ＭｏＣＡスコアの増加、ＡＤＡＳ－Ｃｏｇスコアの減少又はＣＤＲスコアの減少。認知能力の改善はまた、これらのスコアのいずれにおいても、年齢適合集団と比較して、低下のないことや低下が遅いこと、例えば、継続的に低下すると予想される老化に伴う、ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡ、ＡＤＡＳ－Ｃｏｇ又はＣＤＲの値に変化がないこととしても反映させることができる。
【0048】
他の実施形態において、所与の処置の有効性は、老化に伴う脳の構造的変化の逆転によって判断することができ、変化は、例えば、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）及び超音波検査（ＵＳ）等の画像検査法によって測定することができる。特定の実施形態において、構造的変化は、海馬萎縮、皮質萎縮、皮質下の構造的萎縮、小脳萎縮、全脳萎縮；前頭葉、側頭葉、頭頂葉又は後頭葉の灰白質中の微小脳出血；前頭葉、側頭葉、頭頂葉又は後頭葉の白質中の微小脳出血；前頭葉、側頭葉、頭頂葉又は後頭葉のラクナ、脳梗塞、血管周囲腔、白質強度変化及び／又はタンパク質種の凝集であり得る。構造的変化の改善は、新たな加齢に伴う構造的変化の発達の欠如、経時による静的値、又は構造的変化の重大度を定量化する尺度の変化した大きさという形態であり得る。タンパク質種はアミロイドベータ、タウ、アルファ－シヌクレイン、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３及び／又はプリオンとすることができ、皮質領域、皮質下領域又は脳幹に発生する。
【0049】
他の実施形態において、所与の処置の有効性は、老化に伴う脳の機能的変化の逆転によって判断することができ、その変化は、画像検査法、例えば、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）；核磁気共鳴画像法（ＭＲＳＩ）；超偏極炭素－１３（１３Ｃ）核磁気共鳴画像検査法（ＭＲＳＩ）；超音波検査（ＵＳ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；及び単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）によって測定することができる。脳の機能的変化は、例えば、脳波検査（ＥＥＧ）；頭蓋内電極記録；脳深部電極記録；又は、例えば、脳磁図（ＭＥＧ）等の磁場ベースの記録法等の電気生理学的方法によって記録することもできる。機能的変化は、改変した脳の領域の活性パターン、ニューロンの活動、機能的結合、血液脳関門漏出、安静時血流、グルコース消費、代謝物濃度、神経血管カップリング及び／又は機能的充血とすることができる。これらの尺度のそれぞれについて、有効性は、より若い対象において見出されるものに近いそれぞれの値の逆転、又はそうでなければ自然に生じるであろうこれらの値の加齢に伴う変化の進行の欠如として定義される。
【0050】
他の実施形態において、所与の処置の有効性は、老化に伴う脳の分子変化の逆転によって判断することができ、変化は、脳組織又は血液からの分子を測定する、例えば、遺伝子発現;ＤＮＡ転写；ＲＮＡ翻訳；脳細胞又は組織におけるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の位置；タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア、細胞成分又はミトコンドリア成分の血液への分泌又は放出によって評価することができる。体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液及び／又は血漿であり得る。
【0051】
特定の実施形態において、生Ｐ値、偽発見率（ＦＤＲ）調整Ｐ値及び／又は自然対数倍率変化（ｌｎＦＣ）で表される変化の大きさに関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）の算出は、それぞれの細胞型について算出することができる。特定の実施形態において、Ｐ値が＜０．０５である、好ましくは、ＦＤＲ調整Ｐ値＜０．０５であるＤＥＧである。
【0052】
特定の実施形態において、本発明で評価できる遺伝子及び後続転写ｍＲＮＡ及び翻訳タンパク質は、以下の免疫応答関連遺伝子である。例えば、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃ１ｑｃ、Ｃ４ｂ、Ｂ２ｍ、Ｔａｐ２、Ｈ２－Ｄ１、Ｈ２－Ｋ１；シナプス修飾関連遺伝子、例えば、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｇｐｃ６、Ｔｇｆｂ２、Ｍｅｇｆ１０、Ｍｅｒｔｋ、Ｃｈｒｄｌ１；ホメオスタシス機能関連遺伝子、例えば、Ｋｃｎｊ１０、Ｋｃｎｎ２、Ｓｌｃ１ａ２、Ｓｌｃ１ａ３、Ｓｌｃ６ａ１、Ｓｌｃ６ａ９、Ｓｌｃ６ａ１１、Ｓｌｃ７ａ１０、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｃ１６ａ１、Ｓｒｅｂｆ１、Ｇｊａ１、Ｇｊｂ６、Ｉｔｐｒ２、Ｇｒｍ３、Ｇｒｉａ２、Ｇａｂｂｒ１、Ｇａｂｂｒ２；ＭＧ細胞中のホメオスタシス関連遺伝子、例えば、Ｃｓｆ２ｒ及びＰ２ｒｙ１３；ＭＧ細胞中の免疫活性化関連遺伝子、例えば、Ａｐｐｅ、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｄ５２、Ｃｓｔ７、Ｆａｂｐ５、Ｔｙｒｏｂｐ、Ｃｄ１４、Ｃｄ３３、Ｉｆｎｇｒ１、Ｌｙ８６、Ｍａｐ４ｋ４；ＭＧ細胞中の免疫応答阻害遺伝子、例えば、Ｃｄ３００ａ、Ｉｌ１０ｒａ、及びＩｌ１０ｒｂ；ＳＭＣ中のカルシウムシグナリング関連遺伝子、例えば、Ｃａｍｋ２ｇ、Ｓｔｉｍ１、Ｇｓｎ、Ａｔｐ２ａ２、Ｉｎｐｐ４ｂ、Ｍｃｕｒ１、Ｓ１００ａ６及びＴｓｐｏ；ＳＭＣ収縮関連遺伝子、例えば、Ｍｙｌｋ、Ｉｔｇａ１、Ｍｇｈ１１、及びＳｏｒｂｓ１；ならびに、ＳＭＣ中の細胞接着及びＥＣＭリモデリング、例えば、Ｃｏｌ１ａ２、Ｌａｍｂ１、Ｉｔｇａ７、Ｊａｍ３、Ｌａｍｂ２、Ｉｔｇｂ１、及びＢｓｇである。
【0053】
材料及び方法
対象動物
全ての実験方法は、香港の中国大学の動物研究倫理委員会（ＣＵＨＫ）によって事前に承認され、実験動物のケアと使用指針に従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＵＨＫの実験動物サービスセンターにより提供され、制御された温度（２２～２３℃）で、１２時間の明／暗サイクルを交互に行い、標準マウスは、食品及び水に自由にアクセスできた。周囲湿度は、＜７０％相対湿度に維持された。別段の指示がない限り、２つの年齢群（月齢２～３ヶ月と１８～２０カ月）の雄マウスを実験に使用した。処置群について、エキセナチド（５ｎｍｏｌ／体重ｋｇ、Ｂｙｅｔｔａ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＬＰ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）又は塩水ビヒクル（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム））は、別段の指示がない限り、実験前に４～５週間毎日、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与した（容積：２５０μｌ／３０ｇ体重）。
対象動物
全ての実験方法は、香港の中国大学の動物研究倫理委員会（ＣＵＨＫ）によって事前に承認され、実験動物のケアと使用指針に従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＵＨＫの実験動物サービスセンターにより提供され、制御された温度（２２～２３℃）で、１２時間の明／暗サイクルを交互に行い、標準マウスは、食品及び水に自由にアクセスできた。周囲湿度は、＜７０％相対湿度に維持された。別段の指示がない限り、２つの年齢群（月齢２～３ヶ月と１８～２０カ月）の雄マウスを実験に使用した。処置群について、エキセナチド（５ｎｍｏｌ／体重ｋｇ、Ｂｙｅｔｔａ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＬＰ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）又は塩水ビヒクル（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム））は、別段の指示がない限り、実験前に４～５週間毎日、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与した（容積：２５０μｌ／３０ｇ体重）。
【0054】
脳組織解離及び単一細胞分離
若齢と老齢の両マウス脳からの単一脳細胞分離のために最適化された解離プロトコル（非特許文献１８）を使用に適合させた。マウスを、深い麻酔下とし、２０ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心的にかん流した。次いで、急速に頭部を切除し、脳全体（小脳を除く）を氷冷ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に浸漬した。脳組織を小片に切断し、改変版の神経組織解離キット（Ｐ）（１３０－０９２－６２８、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単一細胞に解離した。Ｍｙｅｌｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ ＩＩ（１３０－０９６－７３３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、ミエリンデブリを除去した。細胞凝集塊を、予め湿潤させた７０μｍ（＃３５２３５０、Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）及び４０－μｍ（#３５２３４０、Ｆａｌｃｏｎ）ナイロンセルストレーナーを通した連続ろ過によって除去した。遠心分離は、３００×ｇで５分間、４℃で行った。最終細胞ペレットを、５００～１０００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充）に再懸濁した。
若齢と老齢の両マウス脳からの単一脳細胞分離のために最適化された解離プロトコル（非特許文献１８）を使用に適合させた。マウスを、深い麻酔下とし、２０ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心的にかん流した。次いで、急速に頭部を切除し、脳全体（小脳を除く）を氷冷ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に浸漬した。脳組織を小片に切断し、改変版の神経組織解離キット（Ｐ）（１３０－０９２－６２８、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単一細胞に解離した。Ｍｙｅｌｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ ＩＩ（１３０－０９６－７３３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、ミエリンデブリを除去した。細胞凝集塊を、予め湿潤させた７０μｍ（＃３５２３５０、Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）及び４０－μｍ（#３５２３４０、Ｆａｌｃｏｎ）ナイロンセルストレーナーを通した連続ろ過によって除去した。遠心分離は、３００×ｇで５分間、４℃で行った。最終細胞ペレットを、５００～１０００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充）に再懸濁した。
【0055】
単一細胞ライブラリー作製、配列決定及び配置
クロム単一細胞３’試薬キットｖ３（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いて、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを作製した。ＦＡＣＳ緩衝液中５００～１０００細胞／μＬの密度の単一細胞懸濁液を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）マスターミックスに添加し、製造業者の説明書に従って、単一細胞３’ゲルビーズ及び分配油と共に、単一細胞３’チップにロードした。単一細胞由来のＲＮＡ転写物は、液滴内で独自にバーコード化され、逆転写された。ｃＤＮＡ分子は、予備増幅及びプールされた後、製造業者の説明書に従ってライブラリーを構築した。全てのライブラリーを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システム（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＱｕｂｉｔ及びＲＴ－ＰＣＲによって定量した。予備増幅されたｃＤＮＡ及び配列決定ライブラリーのサイズプロファイルを、それぞれ、アラインメント好感度（Agilent High Sensitivity）Ｄ５０００及び高感度（High Sensitivity）Ｄ１０００スクリーンテープシステム（ScreenTape Systems）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって調べた。全ての単一細胞ライブラリーを、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによる推奨に従って、単一インデクシング（ｖ３ライブラリーについては２８／８／９１－ｂｐ）フォーマットで、カスタマイズされたペアエンドにより配列決定した。ＮｅｘｔＳｅｑ ５００高出力ｖ２キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で全ての単一細胞ライブラリーを配列決定した。細胞当たりの平均読取り値５８９７．２５の平均（範囲：２，３４０～１９，７００）が得られ、細胞当たり平均２２９６．０１の遺伝子（範囲：８８～６，０６２）が検出された。ライブラリー配列決定飽和は、平均６８．７３％であった。データをセルレンジャー（Cell Ranger）（ｖ３．０．０，１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で配置させた。
クロム単一細胞３’試薬キットｖ３（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いて、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを作製した。ＦＡＣＳ緩衝液中５００～１０００細胞／μＬの密度の単一細胞懸濁液を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）マスターミックスに添加し、製造業者の説明書に従って、単一細胞３’ゲルビーズ及び分配油と共に、単一細胞３’チップにロードした。単一細胞由来のＲＮＡ転写物は、液滴内で独自にバーコード化され、逆転写された。ｃＤＮＡ分子は、予備増幅及びプールされた後、製造業者の説明書に従ってライブラリーを構築した。全てのライブラリーを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システム（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＱｕｂｉｔ及びＲＴ－ＰＣＲによって定量した。予備増幅されたｃＤＮＡ及び配列決定ライブラリーのサイズプロファイルを、それぞれ、アラインメント好感度（Agilent High Sensitivity）Ｄ５０００及び高感度（High Sensitivity）Ｄ１０００スクリーンテープシステム（ScreenTape Systems）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって調べた。全ての単一細胞ライブラリーを、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによる推奨に従って、単一インデクシング（ｖ３ライブラリーについては２８／８／９１－ｂｐ）フォーマットで、カスタマイズされたペアエンドにより配列決定した。ＮｅｘｔＳｅｑ ５００高出力ｖ２キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で全ての単一細胞ライブラリーを配列決定した。細胞当たりの平均読取り値５８９７．２５の平均（範囲：２，３４０～１９，７００）が得られ、細胞当たり平均２２９６．０１の遺伝子（範囲：８８～６，０６２）が検出された。ライブラリー配列決定飽和は、平均６８．７３％であった。データをセルレンジャー（Cell Ranger）（ｖ３．０．０，１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で配置させた。
【0056】
データ品質管理
データ処理及び可視化は、Ｓｅｕｒａｔパッケージ（ｖ３．１．５）及びＲでのカスタムスクリプト（ｖ３．６．１）を用いて行った。未加工カウントマトリックスは、デフォルトパラメータ（ｍｍ１０参照ゲノムを有する）によって生成された。プライマリカウントマトリックスには１０６，８３２個の細胞があった。５個未満の細胞によって発現された遺伝子を除去し、全部で２１，２５９個の遺伝子を残した。これらの遺伝子の中で、３，０００の高分散遺伝子がＳｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅｓ関数によって同定された。データセットは、以下の基準：（１）＜５％又は＞９５％のＵＭＩカウント又は遺伝子カウント又は（２）＞２０％のミトコンドリア遺伝子の割合によって、低品質セルを除外するためにフィルタリングされた。次元削減のために、主成分分析（ＰＣＡ）を適用して、最初の３０個の上位主成分を計算した。クラスタリングは、Ｓｅｕｒａｔ関数ＦｉｎｄＮｅｉｇｈｂｏｒｓ及びＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓによって行った。ＦｉｎｄＮｅｉｇｈｂｏｒｓ関数は、最初の５０個の主成分に基づいて共有最近傍（ＳＮＮ）グラフを構築した。次に、クラスタリングのＳＮＮ結果に対してモジュラリティの最適化を行った（解像度パラメータ：１．２）。一様多様体の近似と投影（Uniform Manifold Approximation and Projection）（ＵＭＡＰ）を用いてクラスタリング結果を可視化した。
データ処理及び可視化は、Ｓｅｕｒａｔパッケージ（ｖ３．１．５）及びＲでのカスタムスクリプト（ｖ３．６．１）を用いて行った。未加工カウントマトリックスは、デフォルトパラメータ（ｍｍ１０参照ゲノムを有する）によって生成された。プライマリカウントマトリックスには１０６，８３２個の細胞があった。５個未満の細胞によって発現された遺伝子を除去し、全部で２１，２５９個の遺伝子を残した。これらの遺伝子の中で、３，０００の高分散遺伝子がＳｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅｓ関数によって同定された。データセットは、以下の基準：（１）＜５％又は＞９５％のＵＭＩカウント又は遺伝子カウント又は（２）＞２０％のミトコンドリア遺伝子の割合によって、低品質セルを除外するためにフィルタリングされた。次元削減のために、主成分分析（ＰＣＡ）を適用して、最初の３０個の上位主成分を計算した。クラスタリングは、Ｓｅｕｒａｔ関数ＦｉｎｄＮｅｉｇｈｂｏｒｓ及びＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓによって行った。ＦｉｎｄＮｅｉｇｈｂｏｒｓ関数は、最初の５０個の主成分に基づいて共有最近傍（ＳＮＮ）グラフを構築した。次に、クラスタリングのＳＮＮ結果に対してモジュラリティの最適化を行った（解像度パラメータ：１．２）。一様多様体の近似と投影（Uniform Manifold Approximation and Projection）（ＵＭＡＰ）を用いてクラスタリング結果を可視化した。
【0057】
細胞型同定
主要細胞型を同定するために、本発明者らは、既知の細胞型特異的マーカー遺伝子を用いて、含まれる全ての５２個の最初のクラスター中のうちのそれらの発現量を調べた。本発明者らはさらに、２つ以上の細胞型特異的マーカー遺伝子の二重高発現を有するクラスターを除外した。これらは、内皮細胞断片による周皮細胞の汚染に対応する、両方の内皮細胞と周皮細胞マーカーの高発現を有するクラスターを含んでいた。残りのクラスターを１６の主要細胞型に分類した（図１Ａ－１Ｄ参照）。
主要細胞型を同定するために、本発明者らは、既知の細胞型特異的マーカー遺伝子を用いて、含まれる全ての５２個の最初のクラスター中のうちのそれらの発現量を調べた。本発明者らはさらに、２つ以上の細胞型特異的マーカー遺伝子の二重高発現を有するクラスターを除外した。これらは、内皮細胞断片による周皮細胞の汚染に対応する、両方の内皮細胞と周皮細胞マーカーの高発現を有するクラスターを含んでいた。残りのクラスターを１６の主要細胞型に分類した（図１Ａ－１Ｄ参照）。
【0058】
発現変動遺伝子計算
品質制御及び細胞型分類後、遺伝子数正規化及び高分散遺伝子同定を、さらなる分析のために保持された７８，４９０の細胞の未加工データに適用した。Ｓｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ関数及びＭＡＳＴパッケージ（ｖ１．８．２）を用いて、未加工Ｐ値、偽発見率（ＦＤＲ）調整Ｐ－値に関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ：differentially expressed genes）と、各細胞型について、倍率変化の自然対数（ｌｎＦＣ）における発現した変化の大きさとを算出した。本発明者らは、有意なＤＥＧを、ＦＤＲ調整Ｐ値＜０．０５を満たすものと定義した。
品質制御及び細胞型分類後、遺伝子数正規化及び高分散遺伝子同定を、さらなる分析のために保持された７８，４９０の細胞の未加工データに適用した。Ｓｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ関数及びＭＡＳＴパッケージ（ｖ１．８．２）を用いて、未加工Ｐ値、偽発見率（ＦＤＲ）調整Ｐ－値に関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ：differentially expressed genes）と、各細胞型について、倍率変化の自然対数（ｌｎＦＣ）における発現した変化の大きさとを算出した。本発明者らは、有意なＤＥＧを、ＦＤＲ調整Ｐ値＜０．０５を満たすものと定義した。
【0059】
パスウェイエンリッチメント及び疾患関連分析
本発明者らは、パスウェイエンリッチメント分析のための１００以上のデータソースを含む、オンラインユニバーサル遺伝子関数分析ツールであるＧｅｎｅＡｎａｌｙｔｉｃｓを使用した。有意なＤＥＧを、半自動的にヒト遺伝子オルソログに変換した。代謝経路、免疫応答及びサイトカインシグナリングパスウェイ、呼吸電子伝達鎖／ＡＴＰ合成及びグルコース／エネルギー代謝パスウェイ、遺伝子発現／転写調節パスウェイ、カルシウム及びその他セカンドメッセンジャーシグナリングパスウェイ、細胞型特異的パスウェイ（例えば、ＳＭＣ収縮）、ホルモンシグナリングパスウェイ、細胞接着及び細胞外マトリックスリモデリング関連パスウェイを含む、顕著な機能的意味を有するパスウェイを、文献レビューから手動で識別化し、グループ化し、まとめた。
本発明者らは、パスウェイエンリッチメント分析のための１００以上のデータソースを含む、オンラインユニバーサル遺伝子関数分析ツールであるＧｅｎｅＡｎａｌｙｔｉｃｓを使用した。有意なＤＥＧを、半自動的にヒト遺伝子オルソログに変換した。代謝経路、免疫応答及びサイトカインシグナリングパスウェイ、呼吸電子伝達鎖／ＡＴＰ合成及びグルコース／エネルギー代謝パスウェイ、遺伝子発現／転写調節パスウェイ、カルシウム及びその他セカンドメッセンジャーシグナリングパスウェイ、細胞型特異的パスウェイ（例えば、ＳＭＣ収縮）、ホルモンシグナリングパスウェイ、細胞接着及び細胞外マトリックスリモデリング関連パスウェイを含む、顕著な機能的意味を有するパスウェイを、文献レビューから手動で識別化し、グループ化し、まとめた。
【0060】
Ｙ迷路テスト
Ｙ迷路テストを用いて空間記憶を評価した。Ｙ迷路は、長さ３０ｃｍ、幅８ｃｍ、高さ１５ｃｍの白色アクリルガラス製の３本の囲まれたアームを含み、互いに１２０°の角度に設定されている。視覚的手がかりをテスト室の迷路の周りに置いた。このテストは、２つの試験を含む。第１の試験では、マウスに、アームの１つを閉じた状態で、５分間迷路を探索させた。マウスを、試験の間の２分間、テスト室から離れたそのホームケージに戻した。第２の試験では、マウスに、迷路の３つのアーム全てを５分間自由に探索させた。それぞれのアームに費やされた時間が、映像記録から登録された。アームエントリーは、マウスの身体が、アームの中央ゾーンの敷居を越え、アームに入ったこととして定義された。新規アーム（最初の試験で、以前に閉鎖されたところ）に費やされた時間のパーセンテージを計算した。
Ｙ迷路テストを用いて空間記憶を評価した。Ｙ迷路は、長さ３０ｃｍ、幅８ｃｍ、高さ１５ｃｍの白色アクリルガラス製の３本の囲まれたアームを含み、互いに１２０°の角度に設定されている。視覚的手がかりをテスト室の迷路の周りに置いた。このテストは、２つの試験を含む。第１の試験では、マウスに、アームの１つを閉じた状態で、５分間迷路を探索させた。マウスを、試験の間の２分間、テスト室から離れたそのホームケージに戻した。第２の試験では、マウスに、迷路の３つのアーム全てを５分間自由に探索させた。それぞれのアームに費やされた時間が、映像記録から登録された。アームエントリーは、マウスの身体が、アームの中央ゾーンの敷居を越え、アームに入ったこととして定義された。新規アーム（最初の試験で、以前に閉鎖されたところ）に費やされた時間のパーセンテージを計算した。
【0061】
本明細書において言及又は参照される全ての特許、特許出願、仮出願及び公報は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、全ての図及び表を含めて、その全体が参照として援用される。
【0062】
以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は、限定とはみなされない。特に明記しない限り、全てのパーセンテージは重量により、全ての溶剤混合物の割合は容積による。
【0063】
実施例
実施例１－マウスのエキセナチド処置
老化は、例えば、ニューロン、グリア細胞、例えば、星状細胞（ＡＣ）、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）、小膠細胞（ＭＧ）及び希突起膠細胞（ＯＬＧ）、及び壁細胞、例えば、内皮細胞（ＥＣ）、周皮細胞（ＰＣ）及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）を含む、多数の主要脳細胞型にわたって劇的なトランスクリプトーム変化をもたらす。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストであるエキセナチドによる処置は、このような老化に伴うトランスクリプトームシグネチャーを逆転させる。ＧＬＰ－１ＲＡによって逆転される加齢に伴う発現変化は、老化及び神経変性に関与する共有及び細胞型特異的機能的パスウェイを包含する。
実施例１－マウスのエキセナチド処置
老化は、例えば、ニューロン、グリア細胞、例えば、星状細胞（ＡＣ）、希突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）、小膠細胞（ＭＧ）及び希突起膠細胞（ＯＬＧ）、及び壁細胞、例えば、内皮細胞（ＥＣ）、周皮細胞（ＰＣ）及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）を含む、多数の主要脳細胞型にわたって劇的なトランスクリプトーム変化をもたらす。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストであるエキセナチドによる処置は、このような老化に伴うトランスクリプトームシグネチャーを逆転させる。ＧＬＰ－１ＲＡによって逆転される加齢に伴う発現変化は、老化及び神経変性に関与する共有及び細胞型特異的機能的パスウェイを包含する。
【0064】
単細胞トランスクリプトームプロファイリングを、若齢成体、老齢及びエキセナチド－処置老齢マウスにおいて行った。図１Ａ～１Ｄに示すように、マウス脳において識別及び分析された主要な細胞型クラスターを、ＵＭＡＰによって可視化した。ＧＬＰ－１ＲＡ処置による加齢脳及びその調節における主要細胞型におけるゲノム全体の発現変化を分析した。エキセナチド処置の老化における発現変化のパターン及び効果を分析するために、それぞれの細胞型について、有意なＤＥＧ（偽発見率（ＦＤＲ）調整Ｐ値＜０．０５として定義）を計算した。図２Ａ、図２Ｂ及び図３に示されるように、老化に伴うトランスクリプトーム変化は、脳内の主要細胞型の大部分にわたって、エキセナチド処置によって普遍的に逆転された。
【0065】
ＧＬＰ－１ＲＡ処置によって逆転される発現変化は、機能的に関連する。図４に示すように、最も顕著な逆転ＤＥＧ上のそれぞれの細胞型についてのパスウェイエンリッチメント分析は、広範な細胞機能に関与する加齢に伴う発現変化の改善が強調された。ほとんどの細胞型において、これらは、グルコース／エネルギー、脂質及びタンパク質代謝プロセス、同様に、転写及び翻訳調節を媒介する遺伝子を含んでいた。パスウェイ分析による細胞型特異的変化がある。さらに、いくつかの遺伝子の発現変化は、重要な機能的な役割を果たす。ＡＣにおいて、免疫反応を仲介する遺伝子の加齢に伴う発現変化、ホメオスタティック機能及びシナプス可塑性が報告されている（非特許文献３）。この実施例では、ＧＬＰ－１ＲＡ－処置マウスからのＡＣが、いくつかの補完１成分遺伝子のダウンレギュレーション（図５）及びシナプス修飾関連タンパク質、代謝物レセプター及びトランスポーター、神経伝達物質レセプター及びイオンチャネルをコードする遺伝子のサブセットのアップレギュレーション（図５）により、若い表現型に部分的に復帰するようであった。一方、免疫応答及びサイトカインシグナル伝達関連遺伝子は、ＭＧ及びＭＡＣ、続いてＥＣで逆転したＤＥＧ間で顕著であった（図５）。過去の研究によれば、老化脳内のミクログリアが炎症誘発性表現型を示すことが報告されている（非特許文献１０、非特許文献１３）。ＧＬＰ－１ＲＡ処置後、ＭＧは、多数のホメオスタシス機能関連及び免疫応答阻害遺伝子のアップレギュレーション、及びいくつかの活性化関連遺伝子の逆転された発現変化を示した（図５）。ＳＭＣにおいて、加齢に伴う血管硬化に関連する重要な機能的プロセス、例えば、カルシウムシグナリング、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）リモデリング及び収縮性パスウェイを含む発現変化の処置後の逆転が見出された（図４及び図５）。
【0066】
実施例２－老齢マウスの認知機能を改善するエキセナチド処理
老齢マウスにおける認知を改善するためのエキセナチドの効果を評価するために、１５～１７ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６を、生理食塩水ビヒクル（１匹の雄及び２匹の雌；計３匹）又は５ｎｍｏｌ／体重ｋｇのエキセナチド（４匹の雄及び３匹の雌；計７匹のマウス）で２～４ヶ月間毎日処置した。処置後、マウスをＹ迷路テストに供した。図６に示されるように、エキセナチドで処理したマウスは、新規アームにおいて有意により多くの時間を費やした。これは、空間記憶の向上を示す。
老齢マウスにおける認知を改善するためのエキセナチドの効果を評価するために、１５～１７ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６を、生理食塩水ビヒクル（１匹の雄及び２匹の雌；計３匹）又は５ｎｍｏｌ／体重ｋｇのエキセナチド（４匹の雄及び３匹の雌；計７匹のマウス）で２～４ヶ月間毎日処置した。処置後、マウスをＹ迷路テストに供した。図６に示されるように、エキセナチドで処理したマウスは、新規アームにおいて有意により多くの時間を費やした。これは、空間記憶の向上を示す。
【0067】
例示の実施形態
実施形態１ 老化に伴う脳機能障害について、対象を処置する方法であって、前記対象に、有効量のＧＬＰ－１Ｒアゴニストを投与することによって、前記老化に伴う脳機能障害を処置することを含む、方法。
実施形態２ 前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、ＰＦ－０６８８２９６１、ＯＷＬ－８３３、ＴＴＰ－２７３、又はＧＬＰ－１Ｒを活性化するその他分子である、実施形態１に記載の方法。
実施形態３ 薬学的に許容される担体を、前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストと共に投与することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態４ 前記対象は、哺乳類である、実施形態１に記載の方法。
実施形態５ 前記哺乳類は、霊長類である、実施形態４に記載の方法。
実施形態６ 前記霊長類は、ヒトである、実施形態５に記載の方法。
実施形態７ 前記対象は、５０歳以上である、実施形態１に記載の方法。
実施形態８ 前記老化に伴う脳機能障害は、認知障害を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態９ 前記認知障害は、注意力と集中力、学習タスクと概念、記憶、情報処理、視空間機能、発話、言語理解、発話流暢性、問題解決、意思決定及び実行機能のいずれかである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０ 前記老化に伴う脳機能障害は、前記脳の測定可能な構造的、機能的及び分子変化のいずれかを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態１１ 前記老化に伴う測定可能な構造的変化は、海馬萎縮、皮質萎縮、皮質下の構造的萎縮、小脳萎縮、全脳萎縮、灰白質中の微小脳出血、白質中の微小脳出血、ラクナ、脳梗塞、血管周囲腔、白質強度変化、及びタンパク質種の凝集のいずれかである、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２ 前記タンパク質種は、アミロイドベータ、タウ、アルファ－シヌクレイン、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３、及びプリオンのいずれかである、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３ 前記老化に伴う測定可能な構造的変化は、画像検査法により測定される、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１４ 前記画像検査法は、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、及び／又は超音波検査（ＵＳ）である、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５ 前記老化に伴う測定可能な機能的変化は、改変した脳の領域の活性パターン、ニューロンの活動、機能的結合、血液脳関門漏出、安静時血流、グルコース消費、代謝物濃度、神経血管カップリング又は機能的充血である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１６ 前記老化に伴う測定可能な機能的変化は、機能的画像検査法又は記録法により測定される、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７ 前記機能的画像検査法又は記録法は、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＳＩ）、超偏極炭素－１３（１３Ｃ）核磁気共鳴画像検査法（ＭＲＳＩ）、超音波検査（ＵＳ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、脳波検査（ＥＥＧ）、脳磁図（ＭＥＧ）、機能的近赤外線分光法（ｆＮＩＲＳ）、頭蓋内電記録、又は脳深部電記録である、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８ 前記老化に伴う測定可能な分子変化は、遺伝子発現における変化；ＤＮＡ転写；ＲＮＡ翻訳；脳細胞又は組織におけるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の位置；又はタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア、細胞成分又はミトコンドリア成分の血液への分泌又は放出である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１９ 前記老化に伴う測定可能な分子変化は、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は血液／血漿組成における変化である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１ 老化に伴う脳機能障害について、対象を処置する方法であって、前記対象に、有効量のＧＬＰ－１Ｒアゴニストを投与することによって、前記老化に伴う脳機能障害を処置することを含む、方法。
実施形態２ 前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、ＰＦ－０６８８２９６１、ＯＷＬ－８３３、ＴＴＰ－２７３、又はＧＬＰ－１Ｒを活性化するその他分子である、実施形態１に記載の方法。
実施形態３ 薬学的に許容される担体を、前記ＧＬＰ－１Ｒアゴニストと共に投与することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態４ 前記対象は、哺乳類である、実施形態１に記載の方法。
実施形態５ 前記哺乳類は、霊長類である、実施形態４に記載の方法。
実施形態６ 前記霊長類は、ヒトである、実施形態５に記載の方法。
実施形態７ 前記対象は、５０歳以上である、実施形態１に記載の方法。
実施形態８ 前記老化に伴う脳機能障害は、認知障害を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態９ 前記認知障害は、注意力と集中力、学習タスクと概念、記憶、情報処理、視空間機能、発話、言語理解、発話流暢性、問題解決、意思決定及び実行機能のいずれかである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０ 前記老化に伴う脳機能障害は、前記脳の測定可能な構造的、機能的及び分子変化のいずれかを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態１１ 前記老化に伴う測定可能な構造的変化は、海馬萎縮、皮質萎縮、皮質下の構造的萎縮、小脳萎縮、全脳萎縮、灰白質中の微小脳出血、白質中の微小脳出血、ラクナ、脳梗塞、血管周囲腔、白質強度変化、及びタンパク質種の凝集のいずれかである、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２ 前記タンパク質種は、アミロイドベータ、タウ、アルファ－シヌクレイン、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３、及びプリオンのいずれかである、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３ 前記老化に伴う測定可能な構造的変化は、画像検査法により測定される、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１４ 前記画像検査法は、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、及び／又は超音波検査（ＵＳ）である、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５ 前記老化に伴う測定可能な機能的変化は、改変した脳の領域の活性パターン、ニューロンの活動、機能的結合、血液脳関門漏出、安静時血流、グルコース消費、代謝物濃度、神経血管カップリング又は機能的充血である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１６ 前記老化に伴う測定可能な機能的変化は、機能的画像検査法又は記録法により測定される、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７ 前記機能的画像検査法又は記録法は、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＳＩ）、超偏極炭素－１３（１３Ｃ）核磁気共鳴画像検査法（ＭＲＳＩ）、超音波検査（ＵＳ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、脳波検査（ＥＥＧ）、脳磁図（ＭＥＧ）、機能的近赤外線分光法（ｆＮＩＲＳ）、頭蓋内電記録、又は脳深部電記録である、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８ 前記老化に伴う測定可能な分子変化は、遺伝子発現における変化；ＤＮＡ転写；ＲＮＡ翻訳；脳細胞又は組織におけるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の位置；又はタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア、細胞成分又はミトコンドリア成分の血液への分泌又は放出である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１９ 前記老化に伴う測定可能な分子変化は、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は血液／血漿組成における変化である、実施形態１０に記載の方法。
【0068】
本明細書に記載された実施例及び実施形態は例示のためのものであり、それに照らした種々の変更又は変化は、本明細書及び添付の請求項の趣旨及び範囲内に含まれることは、当業者に示唆されるものと理解されたい。さらに、本明細書に開示された発明又は実施形態の要素又は限定は、あらゆる他の要素又は限定（個々に、又は任意の組み合わせで）、又は本明細書に開示された他の発明又は実施形態、ならびにかかる全ての組み合わせは、限定されることなく、本発明の範囲と想定される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】