特表 2024-500414 振動流動床オリゴヌクレオチド合成装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-09

(54)【発明の名称】振動流動床オリゴヌクレオチド合成装置

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20231226BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20231226BHJP

   C07H 1/00 20060101ALI20231226BHJP

   C07H 21/04 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALN20231226BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 110Z

C12N15/10 120Z

C12M1/00 A

C07H1/00

C07H21/04 A

A61K31/7088

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537057

(86)(22)【出願日】2021-12-14

(85)【翻訳文提出日】2023-08-08

(86)【国際出願番号】 US2021063185

(87)【国際公開番号】W WO2022132681

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】63/127,269

(32)【優先日】2020-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(72)【発明者】

【氏名】ブレイデン，ティモシー マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソン，マーティン デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】スン，ワイミン

(72)【発明者】

【氏名】ウェブスター，ルーク フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ワイ，ユーフェイ

(72)【発明者】

【氏名】ゼリンスキー，ジェシカ アン

【テーマコード（参考）】

4B029

4C057

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B029AA27

4B029BB20

4B029CC01

4B029DG10

4C057AA20

4C057BB04

4C057CC01

4C057DD03

4C057MM08

4C086AA04

4C086EA16

(57)【要約】

固相合成システムとして使用される、フィルター反応器内の固相樹脂上にオリゴヌクレオチドを構築するための方法及びデバイス。固相合成プロセスの一環として、保護基が固相樹脂に結合しているオリゴヌクレオチドの５’位から除去され、その後、活性化アミダイト（ホスホアミダイト）溶液が添加される。活性化アミダイト溶液は床反応器内を上下に流れるか、又は流動化して樹脂ビーズと混合し、オリゴヌクレオチドの５’位で反応し、アミダイト内で見つけられる亜リン酸結合が酸化状態ＩＩＩのＰ原子を含む。活性化アミダイト溶液が反応すると、Ｐ原子は酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換される。脱ブロッキング、カップリング、酸化、硫化、又はキャッピングを含む反応のうちのいずれかが流動化又は混合されて、試薬と樹脂との間の完全な接触をもたらすことができる。試薬は、洗浄前にフィルター底部から排出されて反応器から出る。洗浄前の流動化又は混合のため、樹脂床は平らであり、チャネルを有さず、洗浄のうちのいずれかの最中に再流動化され得る。スプレーコーン又は他の分布器により、試薬又は洗浄溶媒が樹脂の平らで均等な半径方向分布を妨害することなく樹脂床の上部に均等に分布される。任意の所与の反応後の洗浄をいくつかの別個の区分に分けることができる。あるサイクルにおける特定の反応後の洗浄のよりきれいな部分が保持容器に収集され、次のサイクルにおける反応後の第１の洗浄として使用することができる。インプロセス統合マルチパス洗浄を使用して、洗浄溶媒のより効率的な使用を可能にすることができる。脱ブロッキング反応に使用された過剰量の試薬溶液がホスホロアミダイトサイクル毎にリサイクルされて再利用され、脱ブロッキングの使用をより効率的にする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オリゴヌクレオチドを床反応器内の固体支持体に添加する方法であって、
前記固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドの５’位から保護基を除去することと、
活性化アミダイト溶液を前記床反応器に添加することであって、前記活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、前記床反応器内で上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化し、前記オリゴヌクレオチドの５’位で反応し、前記アミダイト内で見られる亜リン酸結合が酸化状態ＩＩＩのＰ原子を含む、添加すること、次いで
前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換することを含む、方法。

【請求項2】

前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換する前又は変換した後に、キャッピング溶液を添加するステップを更に含み、カップリング部分が前記アミダイト溶液と反応しなかった場合、前記キャッピング溶液が前記カップリング部分をキャップし、これにより、更なるアミダイトが前記カップリング部分にカップリングすることができないようになり、前記キャッピング溶液が前記床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化するか、又は流動化／混合若しくは前記反応の流動化部分とそれに続くプラグフロー部分なしで樹脂床を通って下方に流れる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記アミダイト溶液を通すことによって前記活性化アミダイト溶液を前記床反応器から除去するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

第１の洗浄溶液を前記床反応器に添加するステップを更に含み、前記第１の洗浄溶液の前記添加が前記保護基を除去した後に起こる、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

第２の洗浄溶液を前記床反応器に添加するステップを更に含み、前記第２の洗浄溶液の前記添加が、前記活性化アミダイト溶液が前記床反応器に添加された後に起こる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液が前記床反応器内を上下に流れ、前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を通すことによって前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を前記床反応器から個別に除去するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第２の洗浄溶液の前記添加が、前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換するステップの前に起こる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

第３の洗浄溶液を前記床反応器に添加するステップを更に含み、前記第３の洗浄溶液の前記添加が、前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換した後に起こる、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記第３の洗浄溶液が前記床反応器内を上下に流れ、前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記第３の洗浄溶液を通すことによって前記第３の洗浄溶液を前記床反応器から除去するステップを更に含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記保護基がＤＭＴ基であり、前記保護基の前記除去が、オリゴヌクレオチドの５’位を、溶媒中に酸を含む活性化溶液と反応させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記活性化溶液を通すことによって前記活性化溶液床反応器を除去するステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記床反応器内での前記上下の流れが、下方押圧中に前記反応器の上部に圧力を加え、その後、上方押圧中に前記反応器の上部から圧力を解放することによって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記床反応器内での固体と液体の流動床混合が、窒素又は別のガスを前記反応器の底部に添加すること又は他の何らかのタイプの撹拌によって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

床反応器及び活性化アミダイト溶液を備える、オリゴヌクレオチドを固体支持体に添加するためのシステムであって、前記活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、前記床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化する、システム。

【請求項15】

前記床反応器が、加圧ガスが前記床反応器に入るのを許可する入口を備え、前記加圧ガス又は他の何らかのタイプの撹拌により、前記アミダイト溶液が前記床反応器内で前記固体と混合するようになる、請求項１４に記載のシステム。

【請求項16】

前記入口が前記床反応器の底部に配置されている、請求項１５に記載のシステム。

【請求項17】

前記床反応器が前記床反応器の上部から加圧及び減圧され、前記圧力変動により、前記アミダイトが前記床反応器内を上下に流れるようになる、請求項１４に記載のシステム。

【請求項18】

前記第１の洗浄溶液と前記第２の洗浄溶液とが前記床反応器内で混合し、前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を通すことによって前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を前記床反応器から個別に除去するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項19】

洗浄溶媒が次の試薬を充填する前にフィルター反応器の底部から排出され、前記試薬が次の洗浄溶媒を充填する前に前記フィルター反応器の底部から排出され、前記樹脂床が混合されて、各サイクルにおいて選択された反応及び／又は洗浄中に選択された時点で不活性ガスバブリング又は前記液体の上下の流れによって前記樹脂粒子を前記試薬及び／又は前記洗浄溶媒中に懸濁させる、請求項５に記載の方法。

【請求項20】

前記試薬の第１の分量が前記反応器に充填され、前記第１の分量が前記反応の開始時に目標時間にわたって流動化されて、完全な接触を達成し、かつ樹脂膨張を達成し、その後、前記第１の分量が前記樹脂床プラグフロー様式によりポンプ注入されると同時に前記試薬の第２の分量を前記反応器の上部に同時に充填し、これにより、残りの試薬がプラグフローによりポンプ注入されるようになる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

脱ブロッキング試薬溶液の最終区分がホスホロアミダイトサイクル毎に再利用され、これにより、前記脱ブロッキングの反応に必要な酸量が減少し、前記樹脂が膨張して脱ブロッキングの開始時に前記床がチャネルなしでリセットされ、未使用の脱ブロッキング試薬溶液とのプラグフロー反応前にＡＣＮが洗い流される、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

各洗浄が、完全に排出される一連の複数のより小規模な洗浄部分に分割され、これにより、１回の大規模な連続洗浄と比較して逆混合を最小限に抑えることができる、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記溶媒洗浄のうちのいくつか又は全てが流動化されず、前記洗浄が流動化部分から始まりプラグフロー部分が続くか、又は前記洗浄がプラグフロー洗浄の最中のどこか若しくは最後に流動化部分を有し、試薬除去の効率を考慮し、かつ圧力降下を克服するために流動化がいつ必要とされるかに応じてカスタム設計されている、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

流入する前記試薬及び前記洗浄溶媒がスプレーコーン又は他の分布器で前記樹脂床の上部に半径方向に均等に分布して、前記樹脂床を平らに保ち、かつ効率的なプラグフロー反応及び洗浄を可能にする、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記洗浄溶媒のよりきれいな画分がホスホロアミダイトサイクル毎にリサイクルされて再利用される、請求項１９に記載の方法。

【請求項26】

本明細書に記載されるように、インプロセス統合マルチパス洗浄が反応後に使用される、請求項１９に記載の方法溶媒部分が反応器に複数回通される。例えば、サイクル１での脱ブロッキング後の第６の溶媒洗浄部分がサイクル２での脱ブロッキング後の第５の洗浄部分になり、その後、これがサイクル３での脱ブロッキング後の第４の洗浄部分になるといった具合である。毎回の反応後に「最も汚れた」洗浄溶媒のみが本システムから出て廃棄され、新しいきれいな溶媒供給のみが最終洗浄区分に必要とされるため、インプロセス統合マルチパス洗浄により、洗浄溶媒のはるかにより効率的な使用が可能になる。

【請求項27】

前記反応器が、流動化を容易にするために、前記試薬又は前記洗浄溶媒が最初に前記反応器に入ったときにより大きい直径の上部セクションに拡張するより小さい直径の下部セクションを有する、請求項１９に記載の方法。上向流不活性ガスが樹脂ビーズのうちのいくつか又は全てを押し上げてより大きい直径のセクションに入れ、ここで、壁効果をあまり受けることなく液体と固体が相互作用することができる。

【請求項28】

前記樹脂床が各サイクルにおいて前記他の反応ステップ中に流動化され／試薬液体と混合されて、完全な接触を達成し、かつ反応中に前記樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下も緩和する、請求項１９に記載の方法。

【請求項29】

前記溶媒洗浄の初期部分が流動化されて、前記洗浄中に前記樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下を緩和する、請求項１９に記載の方法。

【請求項30】

前記樹脂膨張が主に流動化中に起こることが許可され、これにより、液体がその後に前記床を通って下方に流れて前記反応器の底部から出るときに圧力降下が緩和される、請求項１９に記載の方法。

【請求項31】

キャッピングが前記サイクルのうちのいくつかから省略される、請求項１９に記載の方法。

【請求項32】

前記反応のうちのいくつかが前記反応におけるいずれの時点でも流動化されず、プラグフロー接触のみ、例えば、前記未使用のＤＣＡ溶液が充填されたときに流動化なしで脱ブロッキングが行われる、請求項１９に記載の方法。

【請求項33】

不活性ガスが前記樹脂床を通って液体を押し下げ、前記反応器の出口にあるポンプ又は他の計量デバイスが前記床を通る液体の流量を制御する、請求項１９に記載の方法。

【請求項34】

アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的に前記ゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、前記反応器に押し込まれる、請求項１９に記載の方法。

【請求項35】

アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的に前記ゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、前記反応器に押し込まれる前に供給ゾーンに押し込まれる、請求項１９に記載の方法。

【請求項36】

試薬が前記反応器に押し込まれる前に個々の供給ゾーンに充填される、請求項１９に記載の方法。

【請求項37】

試薬が前記反応器に押し込まれる前に共通の供給ゾーンに充填される、請求項１９に記載の方法。

【請求項38】

試薬が供給ゾーンではなく前記反応器に直接押し込まれる、請求項１９に記載の方法。

【請求項39】

カップリング後の洗浄溶媒が酸化／チオール化後に前記洗浄溶媒中で再利用される、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、オリゴヌクレオチドを合成的に製造するための新たなシステム及び方法に関する。より具体的には、本開示は、固相オリゴヌクレオチド合成（ＳＰＯＳ）の一環として振動流又はガスバブリングを使用して流動床を生成し、毎回の反応及び洗浄ステップ後に固体樹脂から液体を完全に排出するデバイス及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

固相オリゴヌクレオチド合成（「ＳＰＯＳ」）は、オリゴヌクレオチドを合成するために最も一般的に使用されている方法及びシステムである。ＳＰＯＳは、一般に制御細孔ガラス（ＣＰＧ）又はマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）球で一般に作られている固体支持体である固相媒体上で実施される。ＳＰＯＳは、様々なヌクレオシド誘導体である構成要素を使用したオリゴヌクレオチドの固相合成であり、それらの中で最も一般的なものはホスホロアミダイトである。具体的には、出発ホスホロアミダイト構成要素を固相に結合させ、その後、各ヌクレオシド（ホスホロアミダイト）を添加し、所望の分子が得られるまでホスホロアミダイト構成要素に順次カップリングさせる。言い換えれば、あるホスホロアミダイトを添加してカップリングさせ（通常５’末端ＯＨ位）、その後、次のホスホロアミダイトを添加するなどして、それにより、所望の配列が得られるまで鎖を成長させる。保護基がオリゴヌクレオチドの各アミン塩基及びリンに用いられるため、官能基はＳＰＯＳサイクルで利用される酸性条件及び中性条件に耐えることができる。オリゴヌクレオチド配列が得られると、分子が固体支持体から切断され、全体的に脱保護されて、所望のオリゴヌクレオチドが得られる。

【0003】

ＳＰＯＳプロセスでは、単一のホスホロアミダイトを鎖に付加するために一般に４つの化学反応が生じる。第１のステップは、一般に脱トリチル化反応である「脱ブロッキング」ステップである。具体的には、ヌクレオチドの５’－ヒドロキシル基がＤＭＴ（４，４’－ジメトキシトリチル）などの酸に不安定な保護基で保護されている。この保護基は、酸溶液を連続して流している最中に、又は溶媒中に酸を添加することによって除去される。酸は、例えば、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、又はトルエン若しくはジクロロメタンなどの不活性溶媒又は他の溶媒中に担持される他の何らかの酸であってもよい。いくつかの実施形態では、２％ＴＣＡ、３％ＤＣＡ、又は１０％ＤＣＡがトルエンとともに使用される。ＤＭＴ保護基の場合、この「脱ブロッキング」反応中に、形成されたオレンジ色のＤＭＴカチオンが洗浄溶液の添加によって洗い流される。したがって、このステップにより、遊離５’末端ヒドロキシル基を有する固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド前駆体が得られる。

【0004】

脱ブロッキングステップが起こると、次に「カップリング」ステップが行われる。このカップリングは、活性化ホスホロアミダイトの溶媒溶液（例えば、ホスホロアミダイトの０．０２～０．２Ｍアセトニトリル（ＡＣＮ）（又は無水ＡＣＮ）溶液など）を添加することを含む。この活性化ホスホロアミダイトは、事前に脱保護された遊離５’末端ヒドロキシル基と反応し、それにカップリングする。一般に、当該技術分野で知られているように、ホスホロアミダイト溶液は、カップリング反応を容易にする触媒の添加によって「活性化」され得る。様々なアゾール化合物又はイミダゾール化合物を含む様々な触媒がホスホロアミダイトを「活性化」することが知られている。触媒の酸性性質がカップリング時に生じるジイソプロピルアミン副生成物の中和に役立つため、多くの場合、１当量超の触媒が使用される。カップリングが完了すると、結合していない試薬及び副生成物は洗浄によって除去される。

【0005】

カップリングステップ後、ＳＰＯＳの次のステップは、酸化、チオール化（硫化とも呼ばれる）、又は「キャッピング」のいずれかである。固体支持体に結合した５’－ＯＨ基のわずかな割合（０．１～１％以上）が未反応のままであり、一般に（ｎ－１）、（ｎ－２）、（ｎ－３）などのショートマーと称される内部塩基欠失を伴うオリゴヌクレオチドの形成を防ぐために更なる鎖伸長からブロックされる必要があるため、キャッピングが行われる。未反応の５’－ヒドロキシ基は、キャッピング混合物によって大部分がアセチル化される。これらの未反応のＯＨ基をキャップすることにより、これらの不純物を所望の生成物からクロマトグラフィーでより容易に分離することができる。同様に、カップリング反応によって他の望ましくない生成物（グアノシン塩基又は他の化学物質におけるＯの反応など）が生成された場合、これらの望ましくない生成物も更に反応しないようにブロック（キャップ）され、これにより、後続の精製ステップでより容易に分離されるようになり得る。いくつかの実施形態では、キャッピングステップは、固体支持体に結合した物質を無水酢酸と１－メチルイミダゾールの混合物で処理することを含む。他のキャッピング試薬が使用される場合もある。

【0006】

酸化ステップにおいて、ホスホロアミダイトが５’末端ＯＨ基と反応してそれにカップリングすることにより、亜リン酸トリエステル結合が生じる（例えば、ここで、Ｐ原子が酸化状態＋３である）。この亜リン酸トリエステル結合は天然ではなく、オリゴヌクレオチド合成の条件下では安定性が限られている。したがって、Ｐ原子は、弱塩基（ピリジン、ルチジン、又はコリジン）の存在下でヨウ素及び水などの酸化剤の添加により、より安定した酸化状態＋５に酸化される。この反応は、亜リン酸トリエステルを、天然に存在するリン酸ジエステルヌクレオシド間結合の保護された前駆体である四配位リン酸トリエステルに酸化させる。酸化は、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド又は（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）－オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して無水条件下で実施され得る。他の実施形態では、酸化の代わりにホスホチオレートリンカーへの硫化が行われる。当業者であれば、ＳＰＯＳのいくつかの実施形態が、この酸化ステップ又は硫化ステップの後にキャッピングステップが行われるか、又はその逆が行われるように最良に設計され得ることを理解するであろう。また、当業者であれば、高い変換率が期待される場合、ＳＰＯＳのいくつかの実施形態が、キャッピングステップをサイクルのうちのいくつかから省略するように最良に設計され得ることを理解するであろう。

【0007】

これらの４つのステップ（脱ブロッキング、カップリング、酸化又は硫化のいずれか、及びキャッピング）が完了すると、ホスホロアミダイト構成要素が成長中の鎖に付加される。理解されるように、カップリングされたホスホロアミダイト構成要素は、５’末端ＯＨ基を保護する独自のＤＭＴ保護基を有する。したがって、このプロセスを繰り返し、鎖が所望の長さに達するまで別のホスホロアミダイト部分を付加することができる。

【0008】

鎖が所望の長さに達すると、オリゴヌクレオチド保護基を除去することができ、オリゴヌクレオチドを樹脂から切断して溶液中に放出することができる。いくつかの事例では、ヌクレオシドアミン由来のこれらの保護基及びリン酸２－シアノエチル保護基は、同じ塩基触媒加水分解切断反応で全体的に脱保護される。この切断／脱保護ステップには、アンモニア水溶液、アンモニアとメチルアミンの混合物などが一般に使用される。これらの条件により、３’リンカーが効率的に加水分解され、樹脂からオリゴヌクレオチドが切断されるようにもなる。

【0009】

しかしながら、２－シアノエチル保護基のアンモノリシス中に生成されるアクリロニトリル副生成物は、アミノ塩基部分をアルキル化し、潜在的に問題のある付加物を形成する可能性がある。この理由により、オリゴヌクレオチドがまだ樹脂に結合している間に無水二級アミン（例えば、ジエチルアミン）溶液で処理することによってリン酸塩を選択的に脱保護することが望ましい場合がある。アクリロニトリル副生成物が溶媒で洗い流されると、アクリロニトリル付加物の形成を恐れることなく、オリゴヌクレオチドをアンモニア水中で切断し、脱保護することができる。

【0010】

このＳＰＯＳプロセスが商業的に使用されており、依然としてオリゴヌクレオチド合成の標準になっている一方で、このＳＰＯＳプロセスには明らかに欠点があり、その最大の欠点は、高価であり、大量の廃棄物を生み出し、拡張性が限られていることである。複数のステップが必要とされるため、このプロセスは非常に高価であり、大量の溶媒が使用され、廃棄物が生み出される。更に困ったことに、これらの溶媒の多くは環境に優しくない。また、ＳＰＯＳ固体支持体の多くは、支持体上にロードされ得る材料の量が少なく、それにより、商業量を製造するには過剰な複数のバッチが必要になる。また、従来の充填床プラグフローＳＰＯＳ反応器ではバッチサイズが制限され、これは、床を通って下方に流れる液体の圧力降下により樹脂床の高さが制限され、試薬の半径方向分布に関する問題及び断面全体にわたる均一な床高さの維持に関する問題により直径が制限されるためである。更に、各オリゴヌクレオチドが保護基を必要とし、これにより、全体の製造コストが増大する。

【0011】

恐らく、ＳＰＯＳの最も明らかな弱点は、その非効率性である。単一のホスホロアミダイトを添加するのに４つの反応が必要であるため、１つの反応タイプでも各サイクルの変換率が低い場合、プロセス全体の収率が大幅に影響される。更に、４つの反応で使用される溶液は、通常、溶液を容器の上部に添加し、かつ溶液が下方にポンプ注入されて底部から排出される際にそれらを反応させることによって樹脂に添加される。かかるプロセスでは、一般に、特にチャネルが樹脂床に生じた場合、液相と固相の接触が不均一になり、反応効率が低下する。したがって、完全な反応、徹底的な洗浄、及び高い収率を達成するために、より大過剰量の試薬が必要とされる。試薬及び洗浄液を含めると、商業量のオリゴヌクレオチドを製造するのに必要な材料の量は非常に多くなる。この不均一な接触は、反応器容器全体、特に上部から底部までの不均一な純度の原因にもなる。充填床反応器規模の制限を考慮すると、当社のポートフォリオ資産の一部が年に何百個もの合成バッチを必要とすると予測される。加えて、樹脂床高さを変化させることにより、不均一な上部と底部の接触に起因して異なる収率及び不純物プロファイルがもたらされ得るため、従来の下向流充填床反応器を使用するＳＰＯＳは、同じ反応器では柔軟なバッチサイズに容易に対応することができない。更に、特に流動中に溶媒を移行させながらポリスチレン樹脂粒子が膨張と圧縮を同時に行う際に、樹脂床を通る圧力降下により、最大樹脂床高さも制限される。ポリスチレン樹脂の充填量は約３００μｍｏｌ／ｇに制限されており、これは、樹脂の膨張を制限し、それ故に樹脂床を通る圧力降下を制限する必要があるためである。

【0012】

したがって、これらの欠点のうちの１つ以上に対処するＳＰＯＳの新たな使用方法を見つけることが改善となるであろう。例えば年に何メートルトンといった大量の製品のオリゴヌクレオチドに商業規模で使用することができるＳＰＯＳシステムを見つけることが特別な改善となるであろう。かかるシステムがより環境に優しく、製造コストを削減し、全体的な効率を上げることができれば、更なる進歩となるであろう。本実施形態は、これらの欠点のうちの１つ以上を解決する。

【発明の概要】

【0013】

本実施形態は、ホスホロアミダイトを床反応器内の固相樹脂に添加する方法であって、保護基がオリゴヌクレオチドの５’位から除去され、活性化アミダイト溶液を非保護基にカップリングさせ、活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、反応器内の樹脂を流動化させる、方法を含む。流動化は、液体が床反応器内を上下に流れるよう強制するか、不活性ガスをバブリングするか、又は他のタイプの撹拌によって起こり、スラリーを生成することができる。アミダイトはオリゴヌクレオチドの５’位で反応する。

【0014】

カップリング反応に加えて、脱ブロッキング、酸化、チオール化、及びキャッピングのための試薬溶液が各々樹脂とともに流動して、完全な液体／固体接触をもたらし、チャネルのない樹脂床をリセットすることができる。流動化の後に、従来のＳＰＯＳの典型である試薬が樹脂床を通って下方向に流れるプラグフロー反応が続き得る。同じ流動化部分とそれに続くプラグフロー部分が毎回の反応後に溶媒洗浄に対して行われ得る。このようにして、樹脂の膨張及び収縮の大部分は、固体／液体接触の流動化部分中に起こり得、ここで、圧力降下を克服し、かつチャネリングを排除することが有利である。

【0015】

本開示の特徴及び利点は、添付の図面と併せて以下の発明を実施するための形態を考慮すると、当業者により明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】オリゴヌクレオチドＳＰＯＳシステム内で行われる反応の概略図である。

【図2】ＳＰＯＳシステムの概略図である。

【図3-1】小規模振動流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図3-2】小規模振動流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図4】各ホスホロアミダイトサイクルにおける実施例２の樹脂床の高さを示すグラフである。

【図5-1】パイロット規模流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図5-2】パイロット規模流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図6-1】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図6-2】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図6-3】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図6-4】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図7-1】代替の研究規模流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図7-2】代替の研究規模流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図8】代替の研究規模流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図9】代替のパイロット規模流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図10-1】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図10-2】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図10-3】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図10-4】本明細書で概説される技法を使用して作製することができる分子の概略図である。

【図11】代替のパイロット規模流動床オリゴヌクレオチド合成装置セットアップの概略図である。

【図12】脱ブロッキング後のインプロセス統合マルチパス洗浄システムの概略図である。

【図13】酸化／チオール化後のインプロセス統合マルチパス洗浄システムの概略図である。

【図14】実施例の様々なＵＰＬＣクロマトグラムである。

【図15】実施例の様々なＵＰＬＣクロマトグラムである。

【図16】実施例の様々なＵＰＬＣクロマトグラムである。

【図17】実施例の様々なＵＰＬＣクロマトグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

オリゴヌクレオチドを床反応器内の固相樹脂に添加する方法が開示される。本方法は、固相樹脂に結合しているオリゴヌクレオチドの５’位から保護基を除去することと、活性化アミダイト溶液を床反応器に添加することであって、活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、床反応器内を上下に流れるか、窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化し、オリゴヌクレオチドの５’位で反応し、アミダイト内で見つけられる亜リン酸結合が酸化状態ＩＩＩのＰ原子を含む、添加することと、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換することとを含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、本方法は、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換する前又は変換した後にキャッピング溶液を添加するステップを更に含み、カップリング部分がアミダイト溶液と反応しなかった場合、キャッピング溶液がカップリング部分をキャップし、これにより、更なるアミダイトがカップリング部分にカップリングすることができないようになり、キャッピング溶液が床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化若しくは混合する。いくつかの実施形態では、キャッピングは、選択されたホスホロアミダイトサイクルに対してのみ行われる。

【0019】

追加の実施形態では、本方法は、床反応器の底部に位置するフィルターにアミダイト溶液を通すことによって活性化アミダイト溶液を床反応器から除去するステップを更に含む。

【0020】

第１の洗浄溶液を床反応器に添加する追加のステップを含む更なる実施形態が作製されてもよく、ここで、第１の洗浄溶液の添加は、保護基を除去した後に起こる。追加の実施形態では、本方法は、第２の洗浄溶液を床反応器に添加するステップを更に含み、第２の洗浄溶液の添加は、活性化アミダイト溶液が床反応器に添加された後に起こる。第１及び第２は、床反応器内を上下に流れるか、又はガスバブリング若しくは他の撹拌により混合してもよく、本方法は、床反応器の底部に位置するフィルターに第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を通すことによって第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を床反応器から個別に除去するステップを更に含む。より多くの洗浄区分が使用されてもよく、本明細書に記載されるように統合マルチパス様式で行われてもよい。

【0021】

更なる実施形態では、第２の洗浄溶液を添加するステップは、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換するステップの前に起こる。他の実施形態では、第３の洗浄溶液を床反応器に添加するステップであって、第３の洗浄溶液を添加するステップは、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換するステップの後に起こる。他の実施形態では、第３の洗浄溶液は、床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化若しくは混合し、本方法は、床反応器の底部に位置するフィルターに第３の洗浄溶液を通すことによって床反応器から第３の洗浄溶液を除去するステップを更に含む。より多くの洗浄区分が使用されてもよく、本明細書に記載されるように統合マルチパス様式で行われてもよい。他の実施形態では、保護基はＤＭＴ基であり、保護基の除去は、ヌクレオチドの５’位を、溶媒中に酸を含む活性化溶液と反応させることを含む。床反応器の底部に位置するフィルターに活性化溶液を通すことによって活性化溶液床反応器を除去するステップを更に含む追加の実施形態が作製されてもよい。いくつかの実施形態では、床反応器内での上下の流れは、反応器の上部に圧力を加えることによって達成される。更なる実施形態では、床反応器内での固体と液体の流動床混合が、窒素又は別のガスを反応器の底部に添加すること又は他の何らかのタイプの撹拌によって達成される。いくつかの実施形態では、脱ブロッキングステップ中に流動化又は混合は行われず、樹脂床を通るプラグフローのみが行われる。

【0022】

追加の実施形態では、洗浄溶媒のよりきれいな画分が、ホスホロアミダイトサイクル毎にリサイクルされて再利用される。脱ブロッキング反応に使用された試薬溶液のよりきれいな部分がホスホロアミダイトサイクル毎にリサイクルされて再利用される更なる実施形態が設計されている。本明細書に記載されるようにインプロセス統合マルチパス洗浄を含む追加の実施形態が作製される。

【0023】

オリゴヌクレオチドを固相樹脂に添加するためのシステムも開示される。本システムは、床反応器及び活性アミダイト溶液を含み、活性アミダイト溶液はアミダイトを含み、床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化する。本システムは、加圧ガスが床反応器に入るのを許可する入口を含む床反応器を有してもよく、加圧ガス又は他の何らかのタイプの撹拌により、アミダイト溶液が床反応器内で固体と混合するようになる。他の実施形態では、入口は、床反応器の底部に配置されている。床反応器は、床反応器の上部から加圧されてもよく、その圧力により、アミダイトが床反応器内を上下に流れるようになる。いくつかの実施形態では、液体は反応器内を上下に流れるのではなく、不活性ガスが底部からバブリングし、反応器内で液体と固体を混合する。

【0024】

本開示の原理の理解を促進するために、これから、図面に例証されている実施形態を参照し、特定の言語を使用してこれらの実施形態を説明する。しかしながら、これによって本発明の範囲を限定するようには意図されていないことが理解されるであろう。

【0025】

ここで図１を参照すると、ＳＰＯＳシステム内で起こる反応を表す概略図が示されている。具体的には、オリゴヌクレオチド１０２が樹脂１０４に結合している。図１に示されるように、オリゴヌクレオチド１０２は、酸素（エーテル）結合を介して樹脂１０４に共有結合していてもよい。言うまでもなく、オリゴヌクレオチドを樹脂１０４に結合させることができる他のタイプ及び方法が使用されてもよい。（樹脂の領域は、本明細書で樹脂床とも称される）。オリゴヌクレオチド１０２は、一般にＤＮＡ又はＲＮＡに結合する塩基などの塩基１０８を含む。塩基１０８は保護されていてもよい（例えば、当該技術分野で知られているように、塩基の１つ以上の官能基が保護されている）。

【0026】

オリゴヌクレオチドは、５’位１１６のＯ原子団を保護する保護基１１０を含んでもよい。反応１１５（矢印で表される）で示されるように、５’位１１６のＯ原子は、ＯＨ基１１７が５’位１１６に位置するように脱保護されてもよい。いくつかの実施形態では、保護基１１０はＤＭＴ基であり、保護基の除去は、オリゴヌクレオチドの５’位を、溶媒中に酸を含む活性化溶液と反応させることを含む。

【0027】

５’位１１６が脱保護されると、オリゴヌクレオチド１０２はアミダイト１０２ａと反応することができる。このアミダイト１０２ａは、Ｐ結合を介して脱保護されたＯＨ基１１７と反応する。より具体的には、Ｐ原子１２０はＯＨ基１１７と反応して、オリゴヌクレオチド１２０とホスホロアミダイト１２０ａとの間に結合を形成する。この反応はカップリング反応１２１（矢印で示される）として知られている。Ｐ原子１２０は、酸化状態３（「ＩＩＩ」とも表される）である。カップリング反応１２１の結果として、オリゴヌクレオチド１２０とホスホロアミダイト１２０ａが互いに結合され、オリゴヌクレオチドのうちの１つが樹脂１０４にカップリングされたままになる。

【0028】

その後、酸化ステップ１２８（矢印で示される）が起こり、これにより、Ｐ原子１２０が酸化状態ＩＩＩから酸化状態「Ｖ」（５（ｆｉｖｅ）又は５）に変換される。当業者であれば、この酸化を達成するために使用される条件を理解するであろう。図１には示されていないが、酸化反応１２８の前又は後のいずれかにキャッピングステップが行われる場合もある。

【0029】

酸化反応１２８の後、添加されたアミダイト１２０ａも保護基１１０を有する。したがって、反応の新たな「サイクル」又は「一連の」反応が起こり得る。これには、単に上記の反応を繰り返して次のアミダイトを鎖に付加することが含まれてもよい。具体的には、アミダイト１２０ａの保護基１１０が除去（脱保護）され、その後、必要に応じてカップリング反応１２１及び酸化反応１２８（及び／又はキャッピング反応）が行われてもよい。この反復プロセスは、所望の長さのオリゴヌクレオチド鎖を作製するのに必要な回数繰り返されてもよい。あるいは、１２８は、Ｐ原子１２０を酸化状態ＩＩＩから酸化状態「Ｖ」（５（ｆｉｖｅ）又は５）に変換する硫化（チオール化とも呼ばれる）反応であってもよく、ここで、Ｐ原子はＰ＝Ｓ二重結合を介して硫黄（Ｓ）原子に結合する。

【0030】

ここで図２を参照すると、ＳＰＯＳ反応器システム２００の概略図が例証されている。システム２００は、樹脂２０４を収容する反応器２０２（別名、反応器床）を含む。樹脂２０４は、上述の樹脂１０４と同じである。したがって、上述のように、樹脂２０４は、（ＳＰＯＳ合成で知られているように）所望の長さに成長することができるオリゴヌクレオチド鎖を含む。反応器２０２は、反応器２０２の底部に配置され得るフィルター２０６を含む。図２の実施形態では、ガスチャンバ２１０は、出口ポート２１２と同様にフィルター２０６の下に配置されている。出口ポート２１２は、液体及び／又は気体が反応器２０２から出ることを可能にする。他の実施形態では、出口ポート２１２及びガスチャンバ２１０は同じ開口部であってもよい。図２の実施形態では、出口ポート２１２は反応器内に示されている。更に好ましい実施形態では、出口ポートはフィルター２０６から生じてもよい。ガスチャンバは、単にフィルターの下の反応器の底部から出るプロセスチューブ又はプロセスパイプであってもよい。

【0031】

反応器２０２は、もう１つの入口ポート２２０も含む。図２の具体的な実施形態では、複数の入口ポート２２０ａ、２２０ｂ、２２０ｃ、２２０ｄ、２２０ｅが存在する。ポート２２０ａ、２２０ｂ、２２０ｃ、２２０ｄ、２２０ｅを有する反応器の上部分と、２０６、２１０、及び２１２を有する反応器の底部分は、第１の供給ゾーン容器と第２のフィルター反応器ゾーン容器との間にチューブ及び任意選択的な弁を備えた別個の容器であってもよい。言うまでもなく、当業者であれば、より多くの又はより少ないポート２２０が使用されてもよいことを理解するであろう。実際には、いくつかの実施形態では、単一のポートが使用されてもよい。ポート２２０ａは、洗浄溶液２４０（ボックスで図示されている）を反応器２０２に導入するために使用されてもよい。ポート２２０ｂは、活性化アミダイト溶液２４２（ボックスで図示されている）を反応器２０２に導入するために使用されてもよい。ポート２２０ｃは、キャッピング溶液２４４（ボックスで図示されている）を反応器２０２に導入するために使用されてもよい。ポート２２０ｄは、酸化溶液２４６（ボックスで図示されている酸化又はチオール化用のもの）を反応器２０２に導入するために使用されてもよい。ポート２２０ｅは、脱保護溶液２４８（ボックスで図示されている）を反応器２０２に導入するために使用されてもよい。ポート２２０が１つのみ存在し、全ての溶液が単一の入口ポート２２０を介して反応器２０２に入る他の実施形態が設計されてもよい。

【0032】

ここで図１及び図２を集合的に参照すると、反応器２００（別名、床反応器）がどのように組み立てられて操作されるかを示すために、ＳＰＯＳシステム２００の使用について説明される。上述のたように、固体支持体２０４は、ホスホロアミダイト１０２を成長中のオリゴヌクレオチドに結合させるための固体支持体である。ポート２２０ｅを使用することにより、脱保護溶液２４８を使用して、固体支持体２０４に結合しているオリゴヌクレオチド１０２の５’位１１６から保護基１１０を除去する。脱保護溶液２４８は固体支持体２０４を通って、その後、フィルター２０６を通って下方に流れる。

【0033】

最初は、フィルター２０６の上下の圧力差は低く、例えば、およそ０ｐｓｉｇ（ポンド毎平方インチゲージ圧）である。その後、反応器２００の上部に（加圧ポート２５２を介して）圧力が加えられる。通常、この圧力は約１５ｐｓｉｇであるが、他の圧力が使用されてもよい。かかる加圧により、液体脱保護溶液２４８のある分量が固体支持体２０４及びフィルター２０６に下方に押し通される（矢印２６５で示されるように）。溶液２４８がフィルター２０６に下方に押し通された後、フィルター２０６の下のガスチャンバ又はプロセスパイプ２１０は１５ｐｓｉｇに近づく。その後、システム２００は、フィルター２０６の上部を（例えば、圧力ポート２５２（又は他の何らかの同様の機構／ポート）を介して）ベントし、フィルター２０６の下に捕捉されたおよそ１５ｐｓｉｇの圧力により、上下の圧力が再びおよそ０ｐｓｉｇでほぼ等しくなるまで、溶液２４８がフィルター２０６及び固体支持体２０４に上方に押し戻される（矢印２７０で示されるように）。

【0034】

かかる加圧を使用することにより、溶液２４８が、所望の回数（及び流れに使用される速度で）、反応器２００を通って上下に流れるようにすることができる。（かかる圧力差を使用して、反応器２０２に添加される全ての溶液を同じように流してもよい）。いくつかの実施形態では、溶液２４８は、１０～１５秒毎に１回上下に流れてもよい。他の実施形態では、システム２００は、溶液２４８が１回以上上下に流れて反応器２０２を流動化させ、その後、下方向にゆっくりと流れて従来のプラグフロー様式で反応を継続するように設計されている。溶液２４８を上下に流すことにより、溶液２４８が固体支持体２０４と複数回接触し、それ故に、固相と液相の完全な接触及び徹底的な分布による反応が促進される。また、これにより、膨張と収縮の多くが流動化中に起こるため、液体の下降流が起こったときの圧力降下も軽減される。他の実施形態では、ごく少量の液体のみが反応器の底部のフィルタースクリーンに下方に押し通されるが、窒素が底部からフィルタースクリーンを通って上方に吹き込み、バブリングにより反応器内で固体支持体床を流動化させ、液体と混合する。反応器の底部からの液体試薬又は不活性ガスの上昇流による流動化の後、脱保護反応の次の部分は、従来の充填床ＳＰＯＳと同様に、固体支持体床を通る試薬溶液の制御された速度の下降流を利用することができる。しかしながら、この実施形態は、反応器内での溶液２４８の混合を全く引き起こさず、単に固体支持体プラグフローを通って流れて反応器２０６のフィルターから出てもよい。

【0035】

脱保護溶液２４８は、ポート２１２を介して反応器２０２から除去されてもよい。圧力ポート２５２を介した圧力の使用は、脱保護溶液２４８の除去を容易にすることができ、液体は制御された速度で２１２を通って反応器２０２の底部からポンプ排出されてもよい。第１の洗浄溶液２４０ａは、ポート２２０ａを介して添加されてもよい。この洗浄溶液２４０ａは、上で概説した圧力差を使用して反応器２０２を通って上下に流れてもよく、又は反応器の底部を通ってガスをバブリングすることによって若しくは他の何らかの混合方法によって固体支持体と混合してもよく、又は上下に流れることも混合することもなく、単に固体支持体プラグフローを通ってもよい。洗浄溶液を上下に流すか、又はガスバブリング若しくは他の撹拌によって流動化させることにより、同じ溶液が固体支持体２０４と１回又は複数回接触する（かつそれを「洗浄」する）。洗浄溶媒の添加前に試薬溶液が反応器から完全に空にされ、次の液体の添加前に洗浄溶媒が反応器から完全に空にされる。これにより、移行中に固体支持体床の上部の液体層内で逆混合が生じる可能性がある従来の充填床ＳＰＯＳプロセスと比較して、必要とされる洗浄溶液２４０ａの量が少なくなり得る（それにより、洗浄溶液の入手、使用、及び廃棄に関連するコストが削減され得る）。分布器を使用して、固体支持体床の平坦性を妨げない方法で洗浄溶媒２４０ａを固体支持体表面全体に均一に充填することができる。反応器２０２を通って洗浄溶液を上下に流す反復回数は、特定の反応及び特定のサイクルに依存する。更に、流動化洗浄に続いてプラグフロー洗浄が行われてもよく、その後、流動化洗浄は、固体支持体床を脱膨張（ｄｅ－ｓｗｅｌｌ）し、上部が水平でチャネリングのない固体支持体床にリセットする役割を果たす。あるいは、特定のステップで圧力降下又はチャネリングの問題がない場合、全ての洗浄が流動化なしのプラグフローで行われてもよい。完了すると、洗浄溶液２４０ａは出口２１２を介して反応器２０２から出てもよい。当業者であれば、所望に応じて、第１の洗浄溶液２４０ａのより多くの分量を導入することによって、１回以上の追加の洗浄「サイクル」又は「ラウンド」が行われてもよいことを理解するであろう。更に、洗浄溶液は、本明細書に記載されるように、先のサイクルからの洗浄溶液の統合マルチパス再利用であってもよい。

【0036】

第１の洗浄ステップ（又は複数のステップ）が起こり、第１の洗浄溶液２４０ａが反応器２０２から除去されると（圧力、ポンプ排出、又は液体をフィルターから流出させる他の駆動力を使用して）、活性化アミダイト溶液２４２が入口２２０ｂを介して添加されてもよい。活性化アミダイト溶液２４２はアミダイト１２０ａを含み、所望の回数反応器２０２を通って上下に流れるか、又は反応器の底部を通ってガスをバブリングすることによって若しくは他の何らかの混合方法によって固体支持体と混合する。上下に流すか、又は混合することにより、活性化アミダイト溶液２４２は固体支持体２０４上のオリゴヌクレオチド１０２と複数回接触し、それにより、カップリング反応の可能性及び／又はカップリング反応の効率が増大する。上で詳細に説明したように、カップリング反応には、アミダイトがオリゴヌクレオチドの５’位で反応してＰ原子１２０のリン結合を形成することが含まれる。他の実施形態では、流動化は、固相と液相の混合を達成するために反応器の底部を通って窒素ガスをバブリングすることによって達成される。液相と固相を混合するための反応器の底部からの窒素のバブリングに関する同じ記述が、この物語の以下の流動化の説明の各々に適用される。

【0037】

カップリング反応が完了した後、活性化アミダイト溶液２４２が出口２１２を介して（圧力の有無にかかわらず）反応器２０２から除去されてもよく、第２の洗浄溶液２４０ｂが（ポート２２０ａ又は別様のものを介して）添加されてもよい。第２の洗浄溶液２４０ｂは、第１の洗浄溶液２４０ａと同じ溶液であってもよく、又は他の実施形態では、異なる洗浄混合物であってもよい。この第２の洗浄溶液２４０ｂは、本明細書に記載の方法で反応器２０２を通って上下に流れてもよい。あるいは、第２の洗浄溶液２４０ｂは、反応器の底部を通ってガスをバブリングすることによって若しくは他の何らかの混合方法によって固体支持体と混合してもよく、又は全く混合若しくは流動化することなく固体支持体床プラグフロー様式により流れてもよい。第１の洗浄溶液２４０ａと同様に、第２の洗浄溶液２４０ｂが出口２１２を介して反応器２０２から出てもよく、かつ１つ以上の追加の洗浄の「サイクル」又は「ラウンド」又は「部分」が所望に応じて、第２の洗浄溶液２４０ｂの新たな（きれいな）バッチを導入することによって行われてもよい実施形態が設計されてもよい。第２の洗浄溶液２４０ｂの単一バッチが使用される他の実施形態が設計されてもよい。

【0038】

最終洗浄溶液２４０ｂを（圧力の有無にかかわらず）除去した後、入口２２０ｄを介して酸化又はチオール化溶液２４６を導入することによって酸化反応が起こってもよい。上述のように、酸化反応は、Ｐ原子１２０を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換する。この場合もやはり、酸化溶液２４６が、本明細書で概説した方法で反応器２０２を通って上下に流れるようにしてもよく、それにより、反応効率が向上し、必要な酸化溶液２４６の量が少なくなる可能性があり、又は反応器の底部を通ってガスをバブリングすることによって若しくは他の何らかの混合方法によって固体支持体と混合してもよく、又は全く混合若しくは流動化することなく固体支持体床プラグフロー様式により流れてもよい。上下の流れの反復回数及び各サイクルの時間は、他の解決策と同様に、条件に応じて変化し、当業者によって修正され得る。反応器の底部からの液体試薬又は不活性ガスの上昇流による流動化の後、酸化反応の次の部分は、従来の充填床ＳＰＯＳと同様に、固体支持体床を通る酸化試薬溶液の制御された速度の下降流を利用することができる。酸化反応が終了すると、酸化溶液２４６はポート２１２を介して（圧力の補助の有無にかかわらず）反応器２０２から出てもよい。

【0039】

酸化反応の後、第３の洗浄溶液２４０ｃが入口２２０ａを介して（ポート２２０ａ又は別様のものを介して）導入されてもよい。第３の洗浄溶液２４０ｃは、第１の洗浄溶液２４０ａ又は第２の洗浄溶液２４０ｂと同じ溶液であってもよく、又は他の実施形態では、異なる洗浄混合物であってもよい。この第３の洗浄溶液２４０ｃは、本明細書に記載の方法で反応器２０２を通って上下に流れてもよく、又は反応器の底部を通ってガスをバブリングすることによって若しくは他の何らかの混合方法によって固体支持体と混合してもよく、又は全く混合若しくは流動化することなく固体支持体床プラグフロー様式により流れてもよい。この場合もやはり、かかる上下の流れ及び各液体部分の完全な空化、これに続くプラグフロー洗浄は、チャネリングリングを排除することにより、より効率的な洗浄を可能にするか、又は固体支持体が流動化又は懸濁中に膨張又は脱膨張することを可能にすることにより圧力降下の問題を軽減する可能性があり、必要な洗浄液の総量を減少させることができる。第１の洗浄溶液２４０ａ及び第２の洗浄溶液２４０ｂと同様に、第３の洗浄溶液２４０ｃが出口２１２を介して反応器２０２から出てもよく、かつ１つ以上の追加の洗浄の「サイクル」又は「ラウンド」又は「部分」が所望に応じて、第３の洗浄溶液２４０ｃの追加部分を導入することによって行われてもよい実施形態が設計されてもよい。更に、洗浄溶液は、本明細書に記載されるように、先のサイクルからの洗浄溶液の統合マルチパス再利用であってもよい。第３の洗浄溶液２４０ｃの単一のバッチが使用される他の実施形態が設計されてもよい。反応器への全ての洗浄装填又は試薬装填と同様に、分布器を使用して、固体支持体床の平坦性を妨げない方法で洗浄溶媒を固体支持体表面全体に均一に装填することができる。

【0040】

キャッピング反応も反応器２０２内で起こってもよい。このキャッピング反応は、酸化反応（すなわち、Ｐ原子が酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換されるステップ）の前又は後のいずれかに起こってもよい。このキャッピング反応を容易にするために、キャッピング溶液２４４が入口２２０ｃを介して添加されてもよい。このキャッピング溶液２４４が、本明細書で概説した方法で反応器２０２を通って上下に流れるようにしてもよく、それにより、反応効率が向上し、必要な溶液２４４の量が少なくなる可能性がある。上下の流れの反復回数及び各サイクルの時間は、他の解決策と同様に、条件に応じて変化し、当業者によって修正され得る。あるいは、キャッピング試薬溶液は、反応器の底部を通ってガスをバブリングすることによって若しくは他の何らかの混合方法によって固体支持体と混合してもよく、又は全く混合若しくは流動化することなく固体支持体床プラグフロー様式により流れてもよい。反応器の底部からの液体試薬又は不活性ガスの上昇流による流動化の後、キャッピング反応の次の部分は、従来の充填床ＳＰＯＳと同様に、固体支持体床を通る試薬溶液の制御された速度の下降流を利用することができる。キャッピング反応が終了すると、キャッピング溶液２４４はポート２１２を介して（圧力の補助の有無にかかわらず）反応器２０２から出てもよい。キャッピング溶液２４４を除去した後、洗浄ステップが起こってもよい。キャッピング反応が酸化反応の前に起こった場合、これは３回目の洗浄になるが、キャッピング反応が酸化ステップの後に起こった場合、これは４回目の洗浄ステップになる。この洗浄は、本明細書で概説した方法と同じ方法で起こってもよい。

【0041】

酸化反応又はキャッピング反応（及び洗浄）の後、新たなポスホロアミダイトを成長中の鎖に付加するために、サイクルが「再開」してもよい。これには、脱保護反応（例えば、脱保護溶液の添加）から始まり、その後、所望の生成物を得るのに必要な回数サイクルを完了することが含まれる。

【0042】

いくつかの実施形態では、溶液（洗浄溶液、活性アミダイト溶液、キャッピング溶液、酸化溶液、及び／又は脱保護溶液など）は、反応器の底部のフィルターを通ることによって反応器から出てもよい。言うまでもなく、これらの溶液を除去する他の方法を使用することもできる。

【0043】

図２に示される実施形態では、反応器床を通る「上下」の流れは圧力によって達成され、流体を垂直方向に移動させる。しかしながら、本明細書で使用される場合、「上下」には、流体を水平方向（例えば、反応器の一方の側から床を通って他方の側へ）又は反応器を通って斜めに移動させることも含まれる。反応器を通る流体のあらゆるタイプの「振動」が「上下」の流れの意味に含まれる。かかる動きは圧力差によって達成することもでき、これは当業者の知識の範囲内である。混合は、内部ガスを反応器の底部からバブリングすることによって引き起こされてもよい。気体のバブリングは断続的であってもよく、これにより、液体が固体支持体に下方に押し通されることと固体支持体とともに流動化することが交互に生じるようになるか、又は全反応時間にわたって一定のバブリングであってもよい。断続的な流動化は、固体支持体全体との完全な液体接触を迅速に達成するために細くて高い反応器にとってより重要であり得るが、より大きい直径の反応器にはそれほど重要ではない可能性がある。

【0044】

実施例１～４及び６～１０では、洗浄溶媒は、試薬が充填される前にフィルター反応器の底部から排出される。同様に、反応溶液は、次の洗浄溶媒が充填される前にフィルター反応器の底部から排出される。これにより、逆混合が軽減し、サイクルの途中で排出しない充填床反応器と比較してプロセスがより効率的になる。

【0045】

実施例１－液体上昇流流動化を使用したＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖の調製
ＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖は、以下の配列：５’［Ｐｈｏｓ］ｍＡ＊ｆＵ＊ｍＡ ｍＡ ｍＡ ｆＡ ｍＵ ｍＣ ｍＵ ｍＡ ｍＣ ｍＡ ｍＧ ｆＵ ｍＣ ｆＡ ｍＵ ｍＡ ｍＧ ｍＧ ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＵを有し、ここで、＊がＰ＝Ｓ結合を表し、全ての他のアミダイトがＰ＝Ｏ結合及びＲＮＡ１｛ｐ．ｍ（Ａ）［ｓｐ］．［ｆｌ２ｒ］（Ｕ）［ｓｐ］．ｍ（Ａ）ｐ．ｍ（Ａ）ｐ．ｍ（Ａ）ｐ．［ｆｌ２ｒ］（Ａ）ｐ．ｍ（Ｕ）ｐ．ｍ（Ｃ）ｐ．ｍ（Ｕ）ｐ．ｍ（Ａ）ｐ．ｍ（Ｃ）ｐ．ｍ（Ａ）ｐ．ｍ（Ｇ）ｐ．［ｆｌ２ｒ］（Ｕ）ｐ．ｍ（Ｃ）ｐ．［ｆｌ２ｒ］（Ａ）ｐ．ｍ（Ｕ）ｐ．ｍ（Ａ）ｐ．ｍ（Ｇ）ｐ．ｍ（Ｇ）ｐ．ｍ（Ａ）［ｓｐ］．ｍ（Ａ）［ｓｐ］．ｍ（Ｕ）］＄＄＄＄Ｖ２．０を有する。（構造を図６に示す）。

【0046】

本発明の流動床法を使用したこの分子の合成を本明細書に記載しており、これは、残りのホスホロアミダイトをＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖の３’から５’に順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む。実施例１の目標は、研究規模流動床反応器において高純度かつ高収率で初めて化学反応を機能させることであった。この目標は、ＡＣＮ洗浄溶媒を最小限に抑えることでも、ＤＣＡ試薬溶液を最小限に抑えることでも、アミダイト当量を最小限に抑えることでも、高い固体支持体床の高さを実証することでもなかった。ＡＣＮ溶媒の使用を最小限に抑える実施例については、研究規模での実施例６並びにパイロット規模での実施例８及び実施例９を参照されたい。ＤＣＡ溶液の量を最小限に抑える実施例については、実施例７を参照されたい。更に、実施例１では、各サイクルで４当量のアミダイトを使用した。対照的に、実施例２～９では、全て又はほとんどのサイクルで２当量のアミダイトを使用した。実施例１の固体支持体床の高さは最大わずか２ｃｍであったが、実施例２～４及び実施例６～１０の固体支持体床の高さはより高かった。高さ３０ｃｍの樹脂床については、実施例２を参照されたい。全ての実施例のガイドを表３１に列記している。

【0047】

既知の方法を使用してｍＵ（本明細書では「ｍＵ樹脂」と称する）をＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＵ（ｂｚ）３００樹脂（ロット番号Ｅ０５００５、２９９ｕｍｏｌ／ｇ）にカップリングさせることから開始し、合成装置のセットアップについては図３を参照されたい。

【0048】

表１に示す試薬溶液を調製する。

【表1】

【0049】

表２に示す０．１Ｍアミダイト溶液を以下のように調製する：アミダイト固体を秤量してボトルに入れ、ドライパッドを挿入し、その後、ＡＣＮを添加して０．１Ｍの濃度を達成する。言うまでもなく、当業者であれば、固体を秤量し、ＡＣＮで溶解し、その後、篩を添加して乾燥させることもできる。

【表2】

【0050】

振動流動床オリゴヌクレオチド合成装置のセットアップについては、図３を参照されたい。図３中、「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指す。全てのポンプ及び供給ラインに呼び水を差す。ドライパックをＡＣＮボトル及び全てのシリンジに入れる。アミダイト溶液（図３のアミダイトポンプ１０１～１０８）、リン酸化溶液（図３のアミダイトポンプ１０９）、及び活性化剤溶液（活性化剤ポンプ１１０）にはシリンジポンプを使用し、全ての他の試薬及び溶媒供給には蠕動ポンプ及び供給容器を使用する。直径１ｃｍ、高さ２０ｃｍの反応器の底部にフィルター及び自動ブロック弁（図３の弁２４）を備え付け、その後、約２．５ｍＬの流出液量を収容するのに十分な内径１．５９ｍｍのチューブを反応器から１つ以上の出口弁（図３の弁９及び弁１０）まで備え付ける。反応器に０．１０４０ｇのｍＵ樹脂を充填する。乾燥樹脂の開始時の床の高さは約０．３～０．４ｃｍであった。合成時にホスホロアミダイトを添加するたびに、以下に説明するように、脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。

【0051】

各ステップで、樹脂床流動化を２つの異なる時点で行い、１回目は、試薬混合物を反応器に充填し、樹脂をそれに曝した時点であり、２回目は、洗浄溶媒を反応器に充填した時点である。しかしながら、カップリング反応中、１０分間の全カップリング時間にわたって流動化を続ける。この実施例では、試薬充填中及び溶媒洗浄中のいずれでも、試薬混合物又は洗浄溶媒（又はその一部）を供給ゾーンに添加し、窒素圧を加え、液体が反応器に入るよう強制する。図３を参照すると、これは、弁９及び弁１０を閉じ、弁２４を開き、適切な入口（弁４１、４２、４３、４４、又は４５）から窒素圧を加えることによって達成される。これにより、反応器の上部と、反応器の底部と弁９及び弁１０との間のチューブとの間の圧力勾配が等しくなるため、反応器内の液体が樹脂床を通って反応器と弁９及び弁１０との間のチューブに入るよう強制される。その後、適切なベント（弁５１、弁５２、弁５３、弁５４、又は弁５５）を開くことによって反応器の上部の圧力を解放し、液体が反応器の底部から上方に流れるときに大気圧と等しくなる圧力勾配を作り出し、樹脂床を撹拌し、流動化させる。窒素加圧及び排気プロセスを、少なくとも毎回樹脂床を流動化させるのに十分な持続時間にわたって指定した回数繰り返す。試薬混合物又は洗浄溶媒の一部のみを床の流動化に使用する場合、残りの試薬混合物又は洗浄溶媒は「プラグフロー」様式で樹脂を通り、ここで、弁９が閉じられ、弁１０が開かれており、窒素圧が反応器の上部に加えられ、液体（試薬混合物又は洗浄溶媒）が反応器の上部に添加されると、ポンプ９が作動して液体を反応器の底部から計量排出する。

【0052】

この第１の実施例が初期のプロトタイプの初期のデモンストレーションであったため、アミダイト＋活性化剤当量、ＤＣＡ当量、及び溶媒洗浄量は、全ての後続の実施例と比較して、この最初の実施例では非常に多かった。読者は、実施例及び実施形態が進むにつれてプロセスが改善され、洗浄溶媒が減少することを確認するであろう。実施形態の概要については、表３１を参照されたい。

【0053】

脱ブロッキング：弁８をＡに回し、弁７をＢに回し、弁２４を閉じる。８ｍＬの脱ブロッキング溶液（表１）を供給ゾーンに充填し、窒素圧で８秒間にわたって反応器に押し込む。弁２４を開く。廃棄用の出口弁（図３の弁９及び弁１０）は閉じている。窒素圧を反応器に５秒間加え、これにより、約１．５ｍＬの試薬溶液が樹脂床に下方に押し通され、反応器の底部のフィルターからプロセスチューブに流れ込み、チューブ内のガスポケットが圧縮される。反応器の上部から圧力を５秒間ベントし、試薬液体を逆流させて反応器の底部に戻し入れ、樹脂床を撹拌して流動化させる。流動化プロセスを繰り返す（窒素で５秒間加圧し、５秒間ベントする）。廃棄用の弁（弁１０）を開き、脱ブロッキング溶液をポンプ９で樹脂床に通して３３０秒あたり１６ｍＬの速度で３３０秒間ポンプ注入する。ポンプ９でのポンプ注入と並行して、弁１４を開き、８ｍＬの脱ブロッキング溶液がポンプ注入されるまで脱ブロッキング溶液のポンプ１供給を１０ｍＬ／分で開始する（ポンプ１がポンプ９の前に終了する）。ポンプ１から酸供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、流れを３３０秒間持続させる。次のＡＣＮ洗浄ステップまでに樹脂が脱ブロッキング溶液と接触する合計時間は６．９分である。弁１０を閉じ、ＡＣＮ洗浄手順Ａを１回行い、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂを２回行う。

【0054】

ＡＣＮ洗浄手順Ａ：廃棄弁９を開き、ＡＣＮ（４ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、その後、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。上記のように樹脂床を５回流動化させ、反応器を窒素で５秒間加圧し、５秒間ベントする。廃棄用の弁９を開き、窒素圧で８秒間押し出して廃棄する。

【0055】

ＡＣＮ洗浄手順Ｂ：弁９を開き（廃棄用）、ＡＣＮ（１２ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、その後、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。上記のように樹脂床を３回流動化させ、反応器を窒素で５秒間加圧し、５秒間ベントする。弁１０を開き、ポンプ９を用いて１１０秒あたり２０ｍＬの速度で１１０秒間ポンプ注入する。ポンプ９でのポンプ注入と並行して、弁３４を開き、８ｍＬのＡＣＮがポンプ注入されるまでポンプ２供給を４０ｍＬ／分で開始する（ポンプ２がポンプ９の前に終了する）。ポンプ２から供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、流れを１１０秒間持続させる。終了時に弁１０を閉じる。

【0056】

カップリング反応：脱ブロッキング洗浄後、次の連続ホスホロアミダイトをカップリングさせ、３’から５’に連続ステップで導入する。配列内でカップリングした各ホスホロアミダイトについて、配列内のホスホロアミダイトに対応するアミダイト溶液（表２に列記したもの）を使用して、本質的に以下に記載したようにカップリング反応手順を行う。弁８をＢに回す。毎回、弁９を閉じた状態で４ｍＬのＡＣＮをアミダイト供給ゾーンにポンプ注入することにより、アミダイトゾーン及び反応器への流路を２回予洗浄し、その後、弁９を開き、窒素圧で８秒間押し出して廃棄する。最初に活性化剤溶液（１．２ｍＬ、２０当量、表１）、その後、表２の適切なアミダイト溶液（１．２ｍＬ、４．０当量）を供給ゾーンにポンプ注入する。弁９及び弁２４を閉じ、供給ゾーン内の混合物を窒素圧で反応器に５秒間押し込み、その後、弁２４を開き、窒素圧を８秒間継続する。

【0057】

アミダイト溶液及び活性化剤溶液を樹脂と混合し、弁２４が開いており、かつ弁９が閉じた状態で、以下のように床を繰り返し流動化させる：反応器の上部に窒素圧を５秒間加え、その後、反応器の上部から圧力を５秒間ベントする。このプロセスを１０分間繰り返し、その後、弁９を開き、窒素圧を反応器の上部に８秒間加え、反応器の底部から液体を排出して廃棄する。ＡＣＮ（１０ｍＬ）をアミダイト供給ゾーンにポンプ注入し、窒素圧で反応器に３０秒間押し通し、このＡＣＮ洗浄をもう１回繰り返す。

【0058】

酸化反応（硫化の代わりに必要な場合）：カップリング反応洗浄後、本質的に以下に記載したように酸化反応を行う。弁６、７、及び８をＡに回し、弁９を開く。酸化溶液（表１、４．５ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入し、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように２回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で５秒間加圧し、その後、５秒間ベントすることによって窒素圧を解放する。弁１０を開き、ポンプ９で４．５ｍＬの液量を４０秒間かけてポンプ注入し、その後、弁１０を閉じる。弁９を開き、ＡＣＮ（４ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入し、その後、弁９を閉じ、ＡＣＮを窒素圧で反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように５回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で５秒間加圧し、その後、５秒間ベントすることによって窒素圧を解放する。弁９を開き、窒素圧を反応器の上部に８秒間加えた状態で反応器内の液体を押し出して廃棄する。

【0059】

酸化反応後に以下の「プラグフロー」ＡＣＮ洗浄を２回行う。弁９を開き、ＡＣＮを供給ゾーン（８ｍＬ）にポンプ注入する。弁９を閉じ、窒素圧を使用して液体を反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように２回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で５秒間加圧し、その後、５秒間ベントすることによって窒素圧を解放する。弁１０を開き、ポンプ９で１２ｍＬの液量を９５秒間かけてポンプ注入する。ポンプ９でのポンプ注入と並行して、弁３３を開き、４ｍＬのＡＣＮがポンプ注入されるまでポンプ２供給を３０ｍＬ／分で開始する（ポンプ２はポンプ９の前に終了する）。ポンプ２から供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、流れを９５秒間持続させる。終了時に弁１０を閉じる。

【0060】

硫化（チオール化）反応（酸化の代わりに必要な場合）：カップリング反応洗浄後、本質的に以下に記載したようにチオール化反応を行う。弁６をＢに回し、弁５、７、及び８をＡに回し、弁９を開く。硫化溶液（表１、４．５ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入し、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように２回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で５秒間加圧し、その後、５秒間ベントすることによって窒素圧を解放する。弁９を開き、窒素圧を反応器の上部に８秒間加えた状態で反応器内の液体を押し出して廃棄する。洗浄が「ＸＨ供給ゾーン」を通ることを除き、酸化反応手順に記載した洗浄と同じ「プラグフロー」ＡＣＮ洗浄を２回行う（図３）。

【0061】

キャッピング反応：酸化（又は硫化）反応洗浄後、本質的に以下に記載したようにキャッピング反応を行う。弁５及び６をＢに回し、弁７及び８をＡに回す。弁９を開く。キャッピング溶液Ａ（表１、２．１ｍＬ）とキャッピング溶液Ｂ（表１、２．１ｍＬ）を供給ゾーンに同時にポンプ注入し、その後、弁９を閉じる。液体を窒素圧で反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように２回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で５秒間加圧し、その後、５秒間ベントすることによって窒素圧を解放する。弁１０を開き、４．２ｍＬの液量を１００秒間かけてポンプ注入する。弁１０を閉じ、洗浄が「キャップ供給ゾーン」を通ることを除き、酸化反応手順に記載した洗浄と同じ「プラグフロー」ＡＣＮ洗浄を２回行う（図３）。

【0062】

最後のホスホロアミダイトサイクルが完了した後、アミダイトの代わりにリン酸化溶液（表１）を使用してサイクルを繰り返す。リン酸化試薬がカップリングして酸化した後、脱ブロッキングステップ、その後、溶媒洗浄を繰り返す。樹脂をＤＥＡ溶液（表１）で１０分間洗浄する。ＡＣＮで洗浄し、窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで乾燥させて、３８０ｍｇの乾燥樹脂を得る。出発樹脂質量は１０４ｍｇであった。これは２７６ｍｇの重量増加に相当し、８．８８ｇ／ｍｍｏｌであり、それ故に、保護されたオリゴヌクレオチド生成物の粗質量収率は質量増加に基づいて９６％である。

【0063】

濃縮ＮＨ_４ＯＨ溶液を用いて切断及び脱保護反応を５０℃で４時間行う。ＵＰＬＣは、実施例１～５のＵＰＬＣ結果の表（表１３）に示すように、切断されて脱保護されたオリゴヌクレオチド生成物がピーク面積パーセントで純度８２％であることを示している。ＬＣＭＳ分析により、主生成物のピークが正しいＨＰＲＴ ｄｉｖ２２ ＡＳ鎖を表すことが確認される。

【0064】

図３を参照し、実施例１を考察して、ポンプ及び弁操作順序の詳細な自動化手順を以下のように記述する。

【0065】

ポンプ及び弁操作順序の詳細な自動化手順の例を以下に示す（図３の実施形態と併せて実施例１を考察して説明する）。

【0066】

実施例１のポンプ及び弁操作順序の詳細な自動化手順。キー：「Ｏ」は「開く」を意味し、「Ｃ」は「閉じる」を意味し、「Ｐ」は「ポンプ」を意味し、例えば、図３の「Ｐ９」は「ポンプ９」を指す。

【0067】

脱ブロッキング
弁８をＡに回す。
弁７をＢに回す。

【0068】

酸溶液を酸供給ゾーンに押し込む。
９を開く（Ｏ９）
５４を開く（Ｏ５４）
１４を開く（Ｏ１４）
酸（８ｍＬ）を酸供給ゾーンにポンプ注入する。
１４を閉じる（Ｃ１４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）

【0069】

酸溶液を反応器に押し込み、２回流動化させて完全な液体と固体の接触を達成し、チャネルのない平らな床にリセットする。
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を２回行う。
４４を開く（Ｏ４４）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４４を閉じる（Ｃ４４）
５４を開く（Ｏ５４）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５４を閉じる（Ｃ５４）

【0070】

反応のために樹脂プラグフローを通って酸溶液をポンプ注入する。
４４を開く（Ｏ４４）
１０を開く（Ｏ１０）
次の３３０秒間にわたって３３０秒あたり１６ｍＬの速度でポンプＰ９を始動させる。
Ｐ９でのポンプ注入と並行して、１４を開き、８ｍＬがポンプ注入されるまでＰ１供給を１０ｍＬ／分で開始する。Ｐ１がＰ９の前に終了する。Ｐ１から酸供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、プラグフローを３３０秒間継続させる。
１４を閉じる（Ｃ１４）
４４を閉じる（Ｃ４４）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0071】

ＡＣＮを酸供給ゾーンにポンプ注入する。
９を開く（Ｏ９）
３４を開く（Ｏ３４）
５４を開く（Ｏ５４）
「流動床洗浄脱ブロッキング用のＡＣＮ量」（４ｍＬ）をポンプ注入する。
３４を閉じる（Ｃ３４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）

【0072】

脱ブロッキング後の小規模流動床ＡＣＮ洗浄。
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を５回繰り返す。
４４を開く（Ｏ４４）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４４を閉じる（Ｃ４４）
５４を開く（Ｏ５４）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５４を閉じる（Ｃ５４）
４４を開く（Ｏ４４）
９を開く（Ｏ９）
「流動化後に押し出して廃棄するまでの時間」（８秒間）待つ。
４４を閉じる（Ｃ４４）

【0073】

脱ブロッキング後のプラグフロー洗浄（これを２回行う）。プラグフロー洗浄を開始して流動化を３回行い、床を平らにセットし、チャネリングを排除する。
９を開く（Ｏ９）
３４を開く（Ｏ３４）
５４を開く（Ｏ５４）
ＡＣＮ（１２ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３４を閉じる（Ｃ３４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回繰り返す。
４４を開く（Ｏ４４）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４４を閉じる（Ｃ４４）
５４を開く（Ｏ５４）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５４を閉じる（Ｃ５４）
４４を開く（Ｏ４４）
１０を開く（Ｏ１０）
次の１１０秒間にわたって１１０秒あたり２０ｍＬの速度でポンプＰ９を始動させる。
Ｐ９でのポンプ注入と並行して、３４を開き、８ｍＬのＡＣＮがポンプ注入されるまでＰ２供給を４０ｍＬ／分で開始する。Ｐ２がＰ９の前に終了する。Ｐ２から酸供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、プラグフローを１１０秒間継続させる。
３４を閉じる（Ｃ３４）
４４を閉じる（Ｃ４４）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0074】

カップリング反応
弁８をＢに回す。

【0075】

カップリング前にアミダイトゾーン及び反応器への流路を予洗浄する（これを２回行う）。
３５を開く（Ｏ３５）
５５を開く（Ｏ５５）
Ｐ２で４ｍＬのＡＣＮをアミダイト供給ゾーンにポンプ注入する。
３５を閉じる（Ｃ３５）
５５を閉じる（Ｃ５５）
９を開く（Ｏ９）
４５を開く（Ｏ４５）
押し出して廃棄するまでの時間（８秒間）待つ。
４５を閉じる（Ｃ４５）

【0076】

アミダイト及び活性化剤を秤量してアミダイト供給ゾーンに入れる。
弁１１０Ａを開く。
指定量の活性化剤（１．２ｍＬ）をポンプ注入する。
弁１１０Ａを閉じる。
弁１１０Ｂを開く。
５秒間待って活性化剤溶液をアミダイト混合ゾーンに押し込む。
弁１１０Ｂを閉じる。
弁１０１Ａを開く。注記：弁１０１をｍＡに使用した。アミダイトは各々、独自の弁及び活性化ゾーンへの独自の供給ラインを有した。
指定量のアミダイト（１．２ｍＬ）をポンプ注入する。
弁１０１Ａを閉じる。
弁１０１Ｂを開く。
５秒間待ってアミダイト溶液をアミダイト混合ゾーンに押し込む。
弁１０１Ｂを閉じる。

【0077】

アミダイト反応溶液を反応器に押し込み、樹脂と１０分間混合する。
５５を閉じる（Ｃ５５）
９を閉じる（Ｃ９）
２４を閉じる（Ｃ２４）
４５を開く（Ｏ４５）
５秒間待つ。
２４を開く（Ｏ２４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の７行の「流動床カップリング時間」（１０分間）を繰り返す。
４５を開く（Ｏ４５）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４５を閉じる（Ｃ４５）
５５を開く（Ｏ５５）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５５を閉じる（Ｃ５５）
「カップリング中の流動化と流動化との間の時間」（２秒間）待つ。
「流動床カップリング時間」が終了した後
４５を開く（Ｏ４５）
９を開く（Ｏ９）
「流動化後に押し出して廃棄するまでの時間」（８秒間）待つ。
４５を閉じる（Ｃ４５）

【0078】

カップリング後にＡＣＮでの溶媒洗浄（これを２回行う）。
３５を開く（Ｏ３５）
５５を開く（Ｏ５５）
「シングルパス洗浄カップリング用のＡＣＮ量」（１０ｍＬ）をポンプ注入する。
３５を閉じる（Ｃ３５）
５５を閉じる（Ｃ５５）
９を開く（Ｏ９）
１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂを同時に開く（Ｏ１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂ（同時に））
「シングルパスカップリング洗浄を押し出して廃棄するまでの時間」（３０秒間）待つ
１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂを同時に閉じる（Ｃ１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂ（同時に））
９を閉じる（Ｃ９）

【0079】

酸化（硫化の代わりに必要な場合）
９を開く（Ｏ９）
弁８をＡに回す。
弁７をＡに回す。
弁６をＡに回す。

【0080】

ヨウ素溶液を酸化供給ゾーンにポンプ注入する。
１３を開く（Ｏ１３）
５３を開く（Ｏ５３）
４．５ｍＬのヨウ素をポンプ注入する。
１３を閉じる（Ｃ１３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）

【0081】

ヨウ素溶液を反応器に押し込み、２回流動化させて、チャネルのない平らな床にリセットする。
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を２回行う。
４３を開く（Ｏ４３）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４３を閉じる（Ｃ４３）
５３を開く（Ｏ５３）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５３を閉じる（Ｃ５３）

【0082】

反応のために樹脂プラグフローを通ってヨウ素溶液をポンプ注入する。
４３を開く（Ｏ４３）
１０を開く（Ｏ１０）
次の４０秒間にわたって４０秒あたり４．５ｍＬの速度でポンプＰ９を始動させる。
４３を閉じる（Ｃ４３）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0083】

酸化後の小規模流動床ＡＣＮ洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３３を開く（Ｏ３３）
５３を開く（Ｏ５３）
４ｍＬのＡＣＮを酸化供給ゾーンにポンプ注入する。
３３を閉じる（Ｃ３３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を５回行う。
４３を開く（Ｏ４３）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４３を閉じる（Ｃ４３）
５３を開く（Ｏ５３）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５３を閉じる（Ｃ５３）
４３を開く（Ｏ４３）
９を開く（Ｏ９）
「流動化後に押し出して廃棄するまでの時間」（８秒間）待つ。
４３を閉じる（Ｃ４３）

【0084】

酸化後のプラグフロー洗浄（これを２回行う）。プラグフロー洗浄を開始して流動化を３回行い、床を平らにセットし、チャネリングを排除する。
９を開く（Ｏ９）
３３を開く（Ｏ３３）
５３を開く（Ｏ５３）
ＡＣＮ（８ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３３を閉じる（Ｃ３３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回行う。
４３を開く（Ｏ４３）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４３を閉じる（Ｃ４３）
５３を開く（Ｏ５３）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５３を閉じる（Ｃ５３）
４３を開く（Ｏ４３）
１０を開く（Ｏ１０）
次の９５秒間にわたって９５秒あたり１２ｍＬの速度でポンプＰ９を始動させる。
Ｐ９でのポンプ注入と並行して、３３を開き、４ｍＬのＡＣＮがポンプ注入されるまでＰ２供給を３０ｍＬ／分で開始する。Ｐ２がＰ９の前に終了する。Ｐ２から酸化供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、プラグフローを９５秒間継続させる。
３３を閉じる（Ｃ３３）
４３を閉じる（Ｃ４３）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0085】

硫化（酸化の代わりに必要な場合）
９を開く（Ｏ９）
弁８をＡに回す。
弁７をＡに回す。
弁６をＢに回す。
弁５をＡに回す。

【0086】

硫化溶液を硫化供給ゾーンにポンプ注入する。
１２を開く（Ｏ１２）
５２を開く（Ｏ５２）
硫化溶液（４．５ｍＬ）をポンプ注入する。
１２を閉じる（Ｃ１２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）

【0087】

硫化溶液を反応器に押し込み、２回流動化させて、チャネルのない平らな床にリセットする。
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を２回行う。
４２を開く（Ｏ４２）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４２を閉じる（Ｃ４２）
５２を開く（Ｏ５２）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５２を閉じる（Ｃ５２）

【0088】

反応のために樹脂プラグフローを通って硫化溶液をポンプ注入する。
４２を開く（Ｏ４２）
１０を開く（Ｏ１０）
次の９０秒間にわたって９０秒あたり４．５ｍＬの速度でポンプＰ９を始動させる。
４２を閉じる（Ｃ４２）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0089】

硫化後の小規模流動床ＡＣＮ洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３２を開く（Ｏ３２）
５２を開く（Ｏ５２）
４ｍＬのＡＣＮを硫化供給ゾーンにポンプ注入する。
３２を閉じる（Ｃ３２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を５回行う。
４２を開く（Ｏ４２）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４２を閉じる（Ｃ４２）
５２を開く（Ｏ５２）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５２を閉じる（Ｃ５２）
４２を開く（Ｏ４２）
９を開く（Ｏ９）
「流動化後に押し出して廃棄するまでの時間」（８秒間）待つ。
４２を閉じる（Ｃ４２）

【0090】

硫化後のプラグフロー洗浄（これを２回行う）。プラグフロー洗浄を開始して流動化を２回行い、床を平らにセットし、チャネリングを排除する。
９を開く（Ｏ９）
３２を開く（Ｏ３２）
５２を開く（Ｏ５２）
ＡＣＮ（８ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３２を閉じる（Ｃ３２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を２回行う。
４２を開く（Ｏ４２）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４２を閉じる（Ｃ４２）
５２を開く（Ｏ５２）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５２を閉じる（Ｃ５２）
４２を開く（Ｏ４２）
１０を開く（Ｏ１０）
次の９５秒間にわたって９５秒あたり１２ｍＬの速度でポンプＰ９を始動させる。
Ｐ９でのポンプ注入と並行して、３２を開き、４ｍＬのＡＣＮがポンプ注入されるまでＰ２供給を３０ｍＬ／分で開始する。Ｐ２がＰ９の前に終了する。Ｐ２から硫化供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、プラグフローを９５秒間継続させる。
３２を閉じる（Ｃ３２）
４２を閉じる（Ｃ４２）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0091】

キャッピング
弁８をＡに回す。
弁７をＡに回す。
弁６をＢに回す。
弁５をＢに回す。

【0092】

キャッピング溶液をキャッピング供給ゾーンにポンプ注入する。
１１Ａを開く（Ｏ１１Ａ）
１１Ｂを開く（Ｏ１１Ｂ）
５１を開く（Ｏ５１）
キャッピング溶液Ａ「キャッピング溶液Ａ量」（２．１ｍＬ）とキャッピング溶液Ｂ「キャッピング溶液Ｂ量」（２．１ｍＬ）を同時にポンプ注入する。
１１Ａを閉じる（Ｃ１１Ａ）
１１Ｂを閉じる（Ｃ１１Ｂ）
５１を閉じる（Ｃ５１）
９を閉じる（Ｃ９）

【0093】

キャッピング溶液を反応器に押し込み、２回流動化させて、チャネルのない平らな床にリセットする。
４１を開く（Ｏ４１）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を２回行う。
４１を開く（Ｏ４１）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４１を閉じる（Ｃ４１）
５１を開く（Ｏ５１）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５１を閉じる（Ｃ５１）

【0094】

反応のために樹脂プラグフローを通ってキャッピング溶液をポンプ注入する。
４１を開く（Ｏ４１）
１０を開く（Ｏ１０）
次の１００秒間にわたって１００秒あたり４．２ｍＬの流量でポンプＰ９を始動させる。
４１を閉じる（Ｃ４１）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0095】

キャッピング後のプラグフロー洗浄（これを２回行う）。プラグフロー洗浄を開始して流動化を２回行い、床を平らにセットし、チャネリングを排除する。
９を開く（Ｏ９）
３１を開く（Ｏ３１）
５１を開く（Ｏ５１）
ＡＣＮ（８ｍＬ）をキャッピング供給ゾーンにポンプ注入する。
３１を閉じる（Ｃ３１）
５１を閉じる（Ｃ５１）
９を閉じる（Ｃ９）
４１を開く（Ｏ４１）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を２回行う。
４１を開く（Ｏ４１）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４１を閉じる（Ｃ４１）
５１を開く（Ｏ５１）
「流動床をベントするまでの時間」（５秒間）待つ。
５１を閉じる（Ｃ５１）
４１を開く（Ｏ４１）
１０を開く（Ｏ１０）
次の９５秒間にわたって９５秒あたり１２ｍＬの速度でポンプＰ９を始動させる。
Ｐ９でのポンプ注入と並行して、３１を開き、４ｍＬのＡＣＮがポンプ注入されるまでＰ２供給を３０ｍＬ／分で開始する。Ｐ２がＰ９の前に終了する。Ｐ２からキャッピング供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、プラグフローを９５秒間継続させる。
３１を閉じる（Ｃ３１）
４１を閉じる（Ｃ４１）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0096】

実施例２－樹脂床高さ最大３０ｃｍのＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖の調製
同じＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖を実施例１と同様に調製する。本発明の流動床法を使用したこの分子の合成を本明細書に記載しており、これは、残りのホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む。主な違いは、樹脂床の高さをはるかに高くすることができるように反応器の形状及び流動化方法が変更されることである。この実施例のプロセスを１８０μｍｏｌ規模で実行し、実験の終了時までにＡＣＮ溶媒が湿った状態で樹脂床の高さが２５ｃｍに達する。最終脱ブロッキングステップの下降流部分中に、樹脂床の最大高さが３０ｃｍに達する。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は２０ｐｓｉｇである。反応器は、高さ３２ｃｍ、内径０．６３ｃｍの底部セクションと、高さ１０．５ｃｍ、直径４．７ｃｍの円錐形底部の上部セクションとを有する。反応器には、直径０．６３ｃｍのセクションの底部にステンレス鋼フィルタースクリーンが備え付けられている。

【0097】

樹脂床が流動化するたびに、窒素が液体及び固体を内径０．６３ｃｍのセクションから円錐形底部の上部セクションに押し上げ、ここで、窒素バブリングにより、固体が完全に混合されて流動化する。その後、少量の液体がフィルタースクリーンを通って反応器の底部から出ている間に、毎回の流動化後に流動化されたスラリーを内径０．６３ｃｍのセクションに下方に押し通して樹脂床を再形成する。壁に向かって角度を付け、その後、半径方向に角度を付けた外径１／８インチのステンレス鋼管を通って供給ゾーンから流入する液体が内径４．７ｃｍのセクションの上部に押し込まれ、これにより、流入する液体が内壁の周りをボルテックスして跳ね返りを防ぐようになる。実施例１では４当量のアミダイトを使用したが、実施例２では２当量のアミダイトをカップリングに使用した。

【0098】

既知の方法を使用してｍＵ（本明細書では「ｍＵ樹脂」と称する）をＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＵ（ｂｚ）２５０樹脂にカップリングさせることから開始し、合成装置のセットアップについては図３を参照されたい。樹脂バッチはＧ０７０１０であり、ロード量は２４６ｕｍｏｌ／ｇであった。反応器内に入れた乾燥樹脂の初期重量は０．７３２２ｇであった。したがって、実験の規模は１８０．１ｕｍｏｌであった。

【0099】

表３に記載の試薬溶液を使用する。

【表3】

【0100】

以下の表４に示す０．１Ｍアミダイト溶液を調製する。アミダイト固体を秤量してボトルに入れ、ドライパッドを挿入し、その後、ＡＣＮを添加して０．１Ｍの濃度を達成する。

【表4】

【0101】

全てのポンプ及び供給ラインに呼び水を差す。ドライパックをＡＣＮボトル及び全てのシリンジに入れる。アミダイト及び活性化剤にはシリンジポンプを使用し、全ての他の試薬及び溶媒の供給には蠕動ポンプ及び供給容器を使用する。Ｐｈｏｓ試薬にはアミダイトシリンジポンプ（アミダイト９ポンプ）のうちの１つを使用した。上記の内径０．６３ｃｍの反応器にフィルターを備え付ける。反応器の底部に自動ブロック弁（図３の弁２４）の上部を取り付け、その後、約３～４ｍＬの流出液量を収容するのに十分なチューブを反応器から１つ以上の出口弁（図３の弁９及び弁１０）まで取り付ける。

【0102】

全合成条件を表５に示す。

【表5】

【0103】

合成時にホスホロアミダイトを添加するたびに、以下に説明するように、脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。

【0104】

図３を参照し、実施例２を考察して、ポンプ及び弁操作順序の詳細な自動化手順を本明細書に記述する。この手順で液体が樹脂床を通って下方にポンプ注入されると記載されている場合、これは、窒素圧が樹脂床の上部を押して液体を下方に押し通している間、反応器の底部の出口にある廃棄ポンプが目標設定値で動作することを意味する。蠕動ポンプ（ポンプ９）の目的は、制御された速度で床を通って流れる液体を計量することである。

【0105】

脱ブロッキング：弁８をＡに回し、弁７をＢに回し、弁２４を閉じる。３０ｍＬの脱ブロッキング溶液（３体積％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）／トルエン溶液）を供給ゾーンに充填し、窒素圧で８秒間にわたって反応器に押し込む。弁２４を開く。廃棄用の出口弁（図３の弁９及び弁１０）は閉じている。窒素圧を反応器に３秒間加える。反応器の上部から圧力を１０秒間ベントすると同時に弁３８を開き、窒素バブリングさせて、樹脂床を試薬溶液で撹拌し、流動化させる。弁３８と直列の計量弁を、固体と液体を上部ゾーンに上昇させて一緒に混合するのに十分な高さになるようにするが、固体が上部セクションの上部に飛び散らないように過度に高くならないように、かつ取り除く溶媒の量を最小限に抑えるように調整する。流動化プロセスを更に４回繰り返す。樹脂の膨張の大半は流動化中に起こる。廃棄用の弁（弁１０）を開き、脱ブロッキング溶液をポンプ９で樹脂床に通して１２ｍＬ／分の速度でユーザーが指定した時間（サイクル７～１２の場合は３３０秒間、サイクル１３～２４の場合は４１０秒間）送り込む。総脱ブロッキング溶液接触時間は以下のとおりである：サイクル１及び２は１４分間であり、サイクル３は１２分間であり、サイクル４及び５は９間であり、サイクル６は７分間であり、サイクル７～２４は５．５分間であった。ポンプ９注入と並行して、弁１４を開き、ユーザーが定義した量がポンプ注入されるまで（サイクル１～１２の場合は４０ｍＬ、サイクル１３～２４の場合は５７ｍＬ）、脱ブロッキング溶液のポンプ１供給を１５ｍＬ／分で開始する。ポンプ１はポンプ９の前に終了する。ポンプ１から酸供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、流れを指定した持続時間にわたって維持する。ＡＣＮ洗浄手順Ａを１０ｍＬの溶媒で２回行い、洗浄毎に４回流動化させ、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂを１０ｍＬの溶媒で１回行い、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ａを４０ｍＬの溶媒で１回行い、洗浄毎に２回流動化させ、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂを１０ｍＬの溶媒で１回行う。全ての洗浄溶媒が酸供給ゾーンを通って反応器に入る（図３）。樹脂の収縮の大半は最初の２回の流動化洗浄中に起こり、これにより、高い床内での圧力降下の問題が軽減される。最初の６つのホスホロアミダイトでは、流れに対する抵抗のため、かつ反応床の上部の圧力が意図的に２０ｐｓｉｇに制限されているため、脱ブロッキング溶液の流速は遅くなり、総接触時間は長くなる。塩基１～７では、液体流束が徐々に増加し、脱ブロッキング溶液の総接触時間が徐々に短くなる。

【0106】

ＡＣＮ洗浄手順Ａ（流動化洗浄）：廃棄弁９を開き、ＡＣＮを酸供給ゾーンに充填し、その後、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。上記のように樹脂床を所望の回数流動化させ、反応器を窒素で３秒間加圧し、窒素を反応器に通して上方に１０秒間ベント及び吹き込む。弁１０を開き、廃棄ポンプ９を始動させて、３０ｍＬ／分の速度で２０秒間ポンプ注入して廃棄する。

【0107】

ＡＣＮ洗浄手順Ｂ（プラグフロー洗浄、流動化なし）：弁９を開き（廃棄用）、ＡＣＮを酸供給ゾーンに充填し、その後、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。弁１０を開き、ポンプ９を用いて３０ｍＬ／分の速度で２０秒間ポンプ注入する。

【0108】

カップリング反応：脱ブロッキング洗浄後、次の連続ホスホロアミダイトをカップリングさせ、３’から５’に連続ステップで導入する。配列内でカップリングした各ホスホロアミダイトについて、配列内のホスホロアミダイトに対応するアミダイト溶液（表２に列記したもの）を使用して、本質的に以下に記載したようにカップリング反応手順を行う。弁８をＢに回す。毎回、弁９を閉じた状態で８ｍＬのＡＣＮをアミダイト供給ゾーンにポンプ注入することにより、アミダイトゾーン及び反応器への流路を２回予洗浄し、その後、弁９を開き、窒素圧で３０秒間押し出して廃棄する。最初に活性化剤溶液（３．６ｍＬ、１０当量）、その後、表２の適切なアミダイト溶液（３．６ｍＬ、２．０当量）を供給ゾーンにポンプ注入する。弁９及び弁２４を閉じ、供給ゾーン内の混合物を窒素圧で反応器に５秒間押し込む。

【0109】

アミダイト溶液及び活性化剤溶液を樹脂と混合し、弁２４が開いており、かつ弁９が閉じた状態で、以下のように床を繰り返し流動化させる：反応器の上部に窒素圧を３秒間加え、その後、反応器の上部から圧力をベントし、弁３８を開き、窒素を反応器に通して上方に６秒間吹き込む。樹脂を、液体を通って下方に８秒間流れさせる。このプロセスを１０分間繰り返し、その後、弁９を開き、窒素圧を反応器の上部に３０秒間加え、反応器の底部から液体を排出して廃棄する。ＡＣＮ（１０ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入し、窒素圧で反応器に３０秒間押し通し、このＡＣＮ洗浄をもう１回繰り返す。

【0110】

酸化反応（硫化の代わりに必要な場合）：カップリング反応洗浄後、本質的に以下に記載したように酸化反応を行う。弁６、７、及び８をＡに回し、弁９を開く。酸化溶液（９ｍＬ、２．５当量）を供給ゾーンにポンプ注入し、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように５回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で３秒間加圧し、その後、ベントすることによって窒素圧を解放し、弁３８を開き、窒素を反応器に通して上方に１０秒間吹き込む。弁１０を開き、ポンプ９で９ｍＬの液量を６０秒間かけてポンプ注入する。ＡＣＮ洗浄手順Ａ（流動化洗浄）を１０ｍＬの溶媒で２回行い、１回目の洗浄で４回流動化させ、２回目の洗浄で２回流動化させる。その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂ（プラグフロー洗浄）を１０ｍＬの溶媒で１回行い、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ａを３０ｍＬの溶媒で１回行い、３回流動化させ、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂを１０ｍＬの溶媒で１回行う。全ての洗浄溶媒が酸化供給ゾーンを通って反応器に入る。樹脂の収縮の大半は最初の２回の流動化洗浄中に起こり、これにより、高い床内での圧力降下の問題が軽減される。

【0111】

硫化（チオール化）反応（酸化の代わりに必要な場合）：カップリング反応洗浄後、本質的に以下に記載したようにチオール化反応を行う。弁６をＢに回し、弁５、７、及び８をＡに回し、弁９を開く。硫化溶液（１２ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入し、弁９を閉じ、窒素圧で反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように２２回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で３秒間加圧し、その後、ベントすることによって窒素圧を解放し、弁３８を開き、窒素を反応器に通して上方に１０秒間吹き込む。樹脂の膨張の大半は流動化中に起こる。２２回の流動化の合計時間は約８分間である。廃棄用の弁（弁１０）を開き、硫化溶液をポンプ９で樹脂床に通して３０秒あたり１２ｍＬの速度でポンプ注入する。ＡＣＮ洗浄手順Ａ（流動化洗浄）を１０ｍＬの溶媒で２回行い、１回目の洗浄で４回流動化させ、２回目の洗浄で２回流動化させる。その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂ（プラグフロー洗浄）を１０ｍＬの溶媒で１回行い、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ａを３０ｍＬの溶媒で１回行い、３回流動化させ、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂを１０ｍＬの溶媒で１回行う。全ての洗浄溶媒がＸＨ供給ゾーンを通って反応器に入る（図３）。樹脂の収縮の大半は最初の２回の流動化洗浄中に起こり、これにより、高い床内での圧力降下の問題が軽減される。

【0112】

キャッピング反応：酸化（又は硫化）反応洗浄後、本質的に以下に記載したようにキャッピング反応を行う。弁５及び６をＢに回し、弁７及び８をＡに回す。弁９を開く。キャッピング溶液Ａ（６．３ｍＬ）とキャッピング溶液Ｂ（６．３ｍＬ）を供給ゾーンに同時にポンプ注入し、その後、弁９を閉じる。液体を窒素圧で反応器に８秒間押し込む。反応器床を以下のように３回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で３秒間加圧し、その後、ベントすることによって窒素圧を解放し、弁３８を開き、窒素を反応器に通して上方に１０秒間吹き込む。樹脂の膨張の大半は流動化中に起こる。弁１０を開き、１２．６ｍＬの液量を７０秒間かけてポンプ注入する。ＡＣＮ洗浄手順Ａ（流動化洗浄）を１０ｍＬの溶媒で２回行い、１回目の洗浄で３回流動化させ、２回目の洗浄で２回流動化させる。その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂ（プラグフロー洗浄）を１０ｍＬの溶媒で１回行い、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ａを３０ｍＬの溶媒で１回行い、３回流動化させ、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂを１０ｍＬの溶媒で１回行う。全ての洗浄溶媒がキャッピング供給ゾーンを通って反応器に入る（図３）。樹脂の収縮の大半は最初の２回の流動化洗浄中に起こり、これにより、高い床内での圧力降下の問題が軽減される。

【0113】

最後のアミダイトカップリングサイクルが完了した後、アミダイトの代わりにリン酸化溶液を使用してサイクルを繰り返す。リン酸化試薬がカップリングして酸化した後、脱ブロッキングステップを繰り返す。以下のように樹脂をＤＥＡ溶液で洗浄する。９．３ｍＬのＤＥＡ溶液を反応器に充填し、４回流動化させ、その後、８ｍＬ／分で反応器の底部からポンプ排出する。この９．３ｍＬのＤＥＡでの洗浄を更に３回繰り返す。その後、以下のようにＡＣＮで洗浄する。ＡＣＮ洗浄手順Ａ（流動化洗浄）を１０ｍＬの溶媒で２回行い、１回目の洗浄で４回流動化させ、２回目の洗浄で２回流動化させる。その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂ（プラグフロー洗浄）を１０ｍＬの溶媒で１回行い、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ａを３０ｍＬの溶媒で１回行い、２回流動化させ、その後、ＡＣＮ洗浄手順Ｂを１０ｍＬの溶媒で１回行う。

【0114】

窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで乾燥させて、２．２３１９グラムの乾燥樹脂を得る。これは１．４９９７グラムの重量増加に相当する。これは８．８３ｇ／ｍｍｏｌの重量増加に相当し、それ故に、保護されたオリゴヌクレオチド生成物の粗質量収率は質量増加に基づいて９６％である。

【0115】

少量の試料に濃縮ＮＨ_４ＯＨ溶液を用いて切断及び脱保護反応を５０℃で４時間行う。ＵＰＬＣは、実施例１～５のＵＰＬＣ結果の表（表１３）に示すように、切断されて脱保護されたオリゴヌクレオチド生成物がピーク面積パーセントで純度８０．８５％であることを示している。ＬＣＭＳ分析により、主生成物のピークが正しいＨＰＲＴ ｄｉｖ２２ ＡＳ鎖を表すことが確認される。

【0116】

２３ｍｅｒオリゴヌクレオチド構築全体にわたる樹脂床の膨張、収縮、及び成長のデータを図４に示す。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であったため、２０ｐｓｉｇであった。

【0117】

図４で「ｄｅｔｒｉｔ」とラベル付けしたトレンドは、洗浄前の脱ブロッキング反応溶液が全て樹脂床を通って排水された後の樹脂床の高さである。図４で「ＡＣＮ＿ｄｅｔｒｉｔ」とラベル付けしたトレンドは、脱ブロッキング後の最後のＡＣＮ溶媒洗浄後の床の高さである。同様に、「硫化／酸化」とラベル付けしたトレンドは、洗浄前の硫化又は酸化反応溶液が全て樹脂床を通って排水された後の樹脂床の高さであるといった具合である。樹脂床の高さは、アミダイトサイクル１からサイクル２４までほぼ直線的に増加した。樹脂床の高さは、各サイクル内で最小値から最大値まで約５ｃｍ変化した。例えば、樹脂ビーズが脱ブロッキング反応中に膨張し、充填した樹脂床の高さを約４ｃｍ増加させる。その後、樹脂ビーズが洗浄中に収縮し、樹脂床の高さを約５ｃｍ収縮させる。カップリング後、樹脂ビーズが酸化又は硫化反応中に膨張し、床の高さを約４ｃｍ増加させる。その後、樹脂ビーズが後続の洗浄中に収縮し、樹脂床の高さを約４ｃｍ減少させる。かかる極端な膨張事象及び収縮事象が２４サイクルでサイクル毎に３回起こることを考慮すると、圧力降下が法外に大きくなるため、ダウンフローのみの充填床反応器でかかる高い床高さを実行することは不可能であろう。圧力降下が流動床反応器内で軽減されるのは、樹脂粒子の膨張及び収縮が主に床の流動化中に起こるためである。樹脂床が各々の新たな床高さで再び沈殿したとしても、ケーキを通る流動抵抗は依然として低く、最大圧力降下はわずか２０ｐｓｉｇである。更に、毎回の溶媒交換後に樹脂床が再沈殿するたびにチャネリングが起こることはない。

【0118】

図３を参照し、実施例２を考察して、ポンプ及び弁操作順序の詳細な自動化手順を以下のように記述する。

【0119】

手順は実施例１に記載した手順と同様であるが、窒素を底部から反応器に通して上方に吹き込むことによって流動化を行う。また、毎回の反応後に洗浄を異なる方法で行った。最初の２回の洗浄を流動化させ、これは、高さの高い樹脂床の後続の液体流束に役立つためであった。樹脂の膨張の大半は試薬を用いて反応の開始時に流動化させている間に起こり、樹脂の脱膨張の大半は溶媒を用いて洗浄の開始時に流動化させている間に起こった。

【0120】

各アミダイトに対してこのシーケンスを繰り返す。この記載の手順では、脱ブロッキング中のポンプ速度及び時間はサイクル７～１２を表す。最初の１２サイクル後に大量の脱ブロッキング溶液を使用しため、サイクル１３～２４ではポンプ時間は３３０秒ではなく４１０秒であった。最初の６サイクルでは樹脂床を通る流れに対する抵抗が大きくなるため、最初に脱ブロッキング中のポンプ速度をより遅く開始させた。最初の６サイクルでは、脱ブロッキング流量が徐々に増加し、時間が徐々に減少した。例えば、最初の２サイクルでは、脱ブロッキングプラグフロー反応時間は８４０秒間であり、ポンプ速度を５ｍＬ／分に設定したが、７回目のサイクルまでに、脱ブロッキングプラグフロー反応時間は３３０秒間であり、ポンプ速度を１２ｍＬに設定し、これは、オリゴが樹脂上でより長く成長するにつれて床を通る流れに対する抵抗が低下したためである。

【0121】

脱ブロッキング
弁８をＡに回す。
弁７をＢに回す。

【0122】

酸溶液を酸供給ゾーンにポンプ注入する。
Ｏ９（これにより、樹脂床を通って反応器が減圧され、酸が測定されている間に液体が反応器の底部から出るようになる）。
５４を開く（Ｏ５４）
１４を開く（Ｏ１４）
酸（３０ｍＬ）を酸供給ゾーンにポンプ注入する。
１４を閉じる（Ｃ１４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）

【0123】

酸溶液を反応器に押し込み、３回流動化させて反応させ、チャネルのない平らな床にリセットする。
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回行う。
４４を開く（Ｏ４４）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４４を閉じる（Ｃ４４）
５４を開き（Ｏ５４）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５４を閉じ（Ｃ５４）、３８を閉じる（Ｃ３８）

【0124】

反応のために樹脂プラグフローを通って酸溶液をポンプ注入する。
４４を開く（Ｏ４４）
１０を開く（Ｏ１０）
３３０秒間にわたって１２ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
Ｐ９でのポンプ注入と並行して、１４を開き、４０ｍＬがポンプ注入されるまで酸供給を１５ｍＬ／分で開始する。酸供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、プラグフローを３３０秒間継続させる。
１４を閉じる（Ｃ１４）
４４を閉じる（Ｃ４４）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下する（約２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで降下する）まで待つ。

【0125】

流動化洗浄。これを２回行うが、初回に４回流動化させ、２回目に２回流動化させる。
９を開く（Ｏ９）
３４を開く（Ｏ３４）
５４を開く（Ｏ５４）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３４を閉じる（Ｃ３４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を１回目の洗浄で４回、２回目の洗浄で２回行う。
４４を開く（Ｏ４４）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４４を閉じる（Ｃ４４）
５４を開き（Ｏ５４）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５４を閉じ（Ｃ５４）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４４を開く（Ｏ４４）
１０を開く（Ｏ１０）
３０秒間にわたって２０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４４を閉じる（Ｃ４４）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下する（約２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで降下する）まで待つ。

【0126】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３４を開く（Ｏ３４）
５４を開く（Ｏ５４）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３４を閉じる（Ｃ３４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
２０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４４を閉じる（Ｃ４４）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下するまで待つ。

【0127】

反応器の上壁を高い位置から洗い流すためのより大規模な流動化洗浄（これは後に不必要であると決定されたことに留意されたい）。
９を開く（Ｏ９）
３４を開く（Ｏ３４）
５４を開く（Ｏ５４）
ＡＣＮ（４０ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３４を閉じる（Ｃ３４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回行う。
４４を開く（Ｏ４４）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４４を閉じる（Ｃ４４）
５４を開き（Ｏ５４）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５４を閉じ（Ｃ５４）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４４を開く（Ｏ４４）
１０を開く（Ｏ１０）
８０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４４を閉じる（Ｃ４４）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下する（約２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで降下する）まで待つ。

【0128】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３４を開く（Ｏ３４）
５４を開く（Ｏ５４）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３４を閉じる（Ｃ３４）
５４を閉じる（Ｃ５４）
９を閉じる（Ｃ９）
４４を開く（Ｏ４４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
２０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４４を閉じる（Ｃ４４）
１０を閉じる（Ｃ１０）

【0129】

９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下する（約２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで降下する）まで待つ。

【0130】

カップリング反応
弁８をＢに回す。

【0131】

カップリング前にアミダイトゾーン及び反応器への流路を予洗浄する（これを２回行う）。
３５を開く（Ｏ３５）
５５を開く（Ｏ５５）
Ｐ２で８ｍＬのＡＣＮをアミダイトゾーンにポンプ注入する。
３５を閉じる（Ｃ３５）
５５を閉じる（Ｃ５５）
９を開く（Ｏ９）
４５を開く（Ｏ４５）
反応器内の樹脂床に下方に押し通して廃棄するまでの時間（３０秒間）待つ
４５を閉じる（Ｃ４５）

【0132】

アミダイト及び活性化剤を秤量してアミダイト＋活性化剤供給ゾーンに入れる。
弁１１０Ａを開く。
指定量の活性化剤（３．６ｍＬ）をポンプ注入する。
弁１１０Ａを閉じる。
弁１１０Ｂを開く。
５秒間待って活性化剤溶液をアミダイト＋活性化剤供給ゾーンに押し込む。
弁１１０Ｂを閉じる。
弁１０１Ａを開く。注記：弁１０１をｍＡに使用した。アミダイトは各々、独自の弁及び活性化ゾーンへの独自の供給ラインを有した（図３）。
指定量のアミダイト（３．６ｍＬ）をポンプ注入する。
弁１０１Ａを閉じる。
弁１０１Ｂを開く。
５秒間待ってアミダイト溶液をアミダイト＋活性化剤供給ゾーンに押し込む。
弁１０１Ｂを閉じる。

【0133】

アミダイト反応溶液を反応器に押し込み、樹脂と１０分間混合する。
５５を閉じる（Ｃ５５）
９を閉じる（Ｃ９）
２４を閉じる（Ｃ２４）
４５を開く（Ｏ４５）
５秒間待つ。
２４を開く（Ｏ２４）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の７行の「流動床カップリング時間」（１０分間）を繰り返す。
４５を開く（Ｏ４５）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（３秒間）待つ。
４５を閉じる（Ｃ４５）
５５を開き（Ｏ５５）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（６秒間）待つ。
５５を閉じる（Ｃ５５）
「カップリング中の流動化と流動化との間の時間」（８秒間）待つ。
「流動床カップリング時間」が終了した後
４５を開く（Ｏ４５）
９を開く（Ｏ９）
「流動化後に押し出して廃棄するまでの時間」（３０秒間）待つ。
４５を閉じる（Ｃ４５）
反応器圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで下がり、カップリング溶液が全て押し出されて廃棄されたことを示すまで待つ。

【0134】

カップリング後にＡＣＮでの溶媒洗浄（これを２回行う）。
３５を開く（Ｏ３５）
５５を開く（Ｏ５５）
「シングルパス洗浄カップリング用のＡＣＮ量」（１０ｍＬ）をポンプ注入する。
３５を閉じる（Ｃ３５）
５５を閉じる（Ｃ５５）
９を開く（Ｏ９）
１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂを同時に開く（Ｏ１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂ（同時に））
「シングルパスカップリング洗浄を押し出して廃棄するまでの時間」（３０秒間）待つ
１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂを同時に閉じる（Ｃ１０１Ｂ、１０２Ｂ、１０３Ｂ、１０４Ｂ、１０５Ｂ、１０６Ｂ、１０７Ｂ、１０８Ｂ、１０９Ｂ、１１０Ｂ（同時に））
９を閉じる（Ｃ９）

【0135】

酸化（硫化の代わりに必要な場合）
９を開く（Ｏ９）
弁８をＡに回す。
弁７をＡに回す。
弁６をＡに回す。

【0136】

ヨウ素溶液を酸化供給ゾーンにポンプ注入する。
１３を開く（Ｏ１３）
５３を開く（Ｏ５３）
９ｍＬのヨウ素供給溶液をポンプ注入する。
１３を閉じる（Ｃ１３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）

【0137】

ヨウ素溶液を反応器に押し込み、約４分かけて１１回流動化させる。これは反応のバッチ部分である。
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を１１回行う。
４３を開く（Ｏ４３）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（３秒間）待つ。
４３を閉じる（Ｃ４３）
５３を開き（Ｏ５３）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５３を閉じ（Ｃ５３）、３８を閉じる（Ｃ３８）

【0138】

反応のプラグフロー部分のために樹脂を通してヨウ素溶液をポンプ注入する。
４３を開く（Ｏ４３）
１０を開く（Ｏ１０）
６０秒間にわたって９ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４３を閉じる（Ｃ４３）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで（２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで）降下するまで待つ。

【0139】

流動化洗浄。これを２回行うが、初回に４回流動化させ、２回目に２回流動化させる。
９を開く（Ｏ９）
３３を開く（Ｏ３３）
５３を開く（Ｏ５３）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をＩ２供給ゾーンにポンプ注入する。
３３を閉じる（Ｃ３３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を１回目の流動化洗浄中に４回、２回目の流動化洗浄中に２回行う。
４３を開く（Ｏ４３）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４３を閉じる（Ｃ４３）
５３を開き（Ｏ５３）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５３を閉じ（Ｃ５３）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４３を開く（Ｏ４３）
１０を開く（Ｏ１０）
３０秒間にわたって２０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４３を閉じる（Ｃ４３）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで（２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで）降下するまで待つ。

【0140】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３３を開く（Ｏ３３）
５３を開く（Ｏ５３）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をＩ２供給ゾーンにポンプ注入する。
３３を閉じる（Ｃ３３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
２０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４３を閉じる（Ｃ４３）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開く（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下する（２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで降下する）まで待つ。

【0141】

反応器の上壁を高い位置から洗い流すためのより大規模な流動化洗浄（これは後に不必要であると決定されたことに留意されたい）。
９を開く（Ｏ９）
３３を開く（Ｏ３３）
５３を開く（Ｏ５３）
ＡＣＮ（３０ｍＬ）をＩ２供給ゾーンにポンプ注入する。
３３を閉じる（Ｃ３３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回行う。
４３を開く（Ｏ４３）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４３を閉じる（Ｃ４３）
５３を開き（Ｏ５３）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５３を閉じ（Ｃ５３）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４３を開く（Ｏ４３）
１０を開く（Ｏ１０）
６０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４３を閉じる（Ｃ４３）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで（２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで）降下するまで待つ。

【0142】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３３を開く（Ｏ３３）
５３を開く（Ｏ５３）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をＩ２供給ゾーンにポンプ注入する。
３３を閉じる（Ｃ３３）
５３を閉じる（Ｃ５３）
９を閉じる（Ｃ９）
４３を開く（Ｏ４３）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
２０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４３を閉じる（Ｃ４３）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで降下するまで待つ。

【0143】

硫化（酸化の代わりに必要な場合）
９を開く（Ｏ９）
弁８をＡに回す。
弁７をＡに回す。
弁６をＢに回す。
弁５をＡに回す。

【0144】

硫化溶液をＸＨ供給ゾーンにポンプ注入する。
１２を開く（Ｏ１２）
５２を開く（Ｏ５２）
硫化溶液（１２ｍＬ）をポンプ注入する。
１２を閉じる（Ｃ１２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）

【0145】

硫化溶液を反応器に押し込み、２２回流動化させる。
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を２２回行う。これには約８分かかる。
４２を開く（Ｏ４２）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（３秒間）待つ。
４２を閉じる（Ｃ４２）
５２を開き（Ｏ５２）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５２を閉じ（Ｃ５２）、３８を閉じる（Ｃ３８）

【0146】

反応のプラグフロー部分のために樹脂を通して硫化溶液をポンプ注入する。
４２を開く（Ｏ４２）
１０を開く（Ｏ１０）
約３０秒後に反応器が空になる速度でポンプＰ９を始動させる。
４２を閉じる（Ｃ４２）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで（２０ｐｓｉｇから１０ｐｓｉｇまで）降下するまで待つ。

【0147】

流動化洗浄。これを２回行うが、初回に４回流動化させ、２回目に２回流動化させる。
９を開く（Ｏ９）
３２を開く（Ｏ３２）
５２を開く（Ｏ５２）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をＸＨ供給ゾーンにポンプ注入する。
３２を閉じる（Ｃ３２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を１回目の流動化洗浄で４回、２回目の流動化洗浄で２回行う。
４２を開く（Ｏ４２）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４２を閉じる（Ｃ４２）
５２を開き（Ｏ５２）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５２を閉じ（Ｃ５２）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４２を開く（Ｏ４２）
１０を開く（Ｏ１０）
２０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４２を閉じる（Ｃ４２）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで降下するまで待つ。

【0148】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３２を開く（Ｏ３２）
５２を開く（Ｏ５２）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をＸＨ供給ゾーンにポンプ注入する。
３２を閉じる（Ｃ３２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
１５秒間にわたって４０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４２を閉じる（Ｃ４２）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで降下するまで待つ。

【0149】

反応器の上壁を高い位置から洗い流すためのより大規模な流動化洗浄（これは後に不必要であると決定されたことに留意されたい）。
９を開く（Ｏ９）
３２を開く（Ｏ３２）
５２を開く（Ｏ５２）
ＡＣＮ（３０ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。
３２を閉じる（Ｃ３２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回行う。
４２を開く（Ｏ４２）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４２を閉じる（Ｃ４２）
５２を開き（Ｏ５２）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５２を閉じ（Ｃ５２）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４２を開く（Ｏ４２）
１０を開く（Ｏ１０）
４５秒間にわたって４０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４２を閉じる（Ｃ４２）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下するまで待つ。

【0150】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３２を開く（Ｏ３２）
５２を開く（Ｏ５２）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をＸＨ供給ゾーンにポンプ注入する。
３２を閉じる（Ｃ３２）
５２を閉じる（Ｃ５２）
９を閉じる（Ｃ９）
４２を開く（Ｏ４２）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
１４秒間にわたって４０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４２を閉じる（Ｃ４２）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで降下するまで待つ。

【0151】

キャッピング
弁８をＡに回す。
弁７をＡに回す。
弁６をＢに回す。
弁５をＢに回す。

【0152】

キャッピング溶液をキャッピング供給ゾーンにポンプ注入する。
１１Ａを開く（Ｏ１１Ａ）
１１Ｂを開く（Ｏ１１Ｂ）
５１を開く（Ｏ５１）
キャッピング溶液Ａ「キャッピング溶液Ａ量」（６．３ｍＬ）とキャッピング溶液Ｂ「キャッピング溶液Ｂ量」（６．３ｍＬ）を同時にポンプ注入する。
１１Ａを閉じる（Ｃ１１Ａ）
１１Ｂを閉じる（Ｃ１１Ｂ）
５１を閉じる（Ｃ５１）
９を閉じる（Ｃ９）

【0153】

キャッピング溶液を反応器に押し込み、３回流動化させて反応させ、チャネルのない平らな床にリセットする。
４１を開く（Ｏ４１）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回行う。
４１を開く（Ｏ４１）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（３秒間）待つ。
４１を閉じる（Ｃ４１）
５１を開き（Ｏ５１）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５１を閉じ（Ｃ５１）、３８を閉じる（Ｃ３８）

【0154】

反応のプラグフロー部分のために樹脂を通してキャッピング溶液をポンプ注入する。
４１を開く（Ｏ４１）
１０を開く（Ｏ１０）
約７０秒後に反応器が空になる速度でポンプＰ９を始動させる。
４１を閉じる（Ｃ４１）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下するまで待つ。

【0155】

流動化洗浄。これを２回行うが、初回に３回流動化させ、２回目に２回流動化させる。
９を開く（Ｏ９）
３１を開く（Ｏ３１）
５１を開く（Ｏ５１）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をキャッピング供給ゾーンにポンプ注入する。
３１を閉じる（Ｃ３１）
５１を閉じる（Ｃ５１）
９を閉じる（Ｃ９）
４１を開く（Ｏ４１）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を１回目の流動化洗浄で３回、１回目の流動化洗浄で２回行う。
４１を開く（Ｏ４１）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４１を閉じる（Ｃ４１）
５１を開き（Ｏ５１）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５１を閉じ（Ｃ５１）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４１を開く（Ｏ４１）
１０を開く（Ｏ１０）
２０秒間にわたって３０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４１を閉じる（Ｃ４１）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで降下するまで待つ。

【0156】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３１を開く（Ｏ３１）
５１を開く（Ｏ５１）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をキャッピング供給ゾーンにポンプ注入する。
３１を閉じる（Ｃ３１）
５１を閉じる（Ｃ５１）
９を閉じる（Ｃ９）
４１を開く（Ｏ４１）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
１５秒間にわたって４０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４１を閉じる（Ｃ４１）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで降下するまで待つ。

【0157】

反応器の上壁を高い位置から洗い流すためのより大規模な流動化洗浄（これは後に不必要であると決定されたことに留意されたい）。
９を開く（Ｏ９）
３１を開く（Ｏ３１）
５１を開く（Ｏ５１）
ＡＣＮ（３０ｍＬ）をキャッピング供給ゾーンにポンプ注入する。
３１を閉じる（Ｃ３１）
５１を閉じる（Ｃ５１）
９を閉じる（Ｃ９）
４１を開く（Ｏ４１）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
次の６行を３回行う。
４１を開く（Ｏ４１）
「Ｎ２で床を押し下げるまでの時間」（５秒間）待つ。
４１を閉じる（Ｃ４１）
５１を開き（Ｏ５１）、３８を開く（Ｏ３８）
「Ｎ２バブリングにより流動床をベントするまでの時間」（１０秒間）待つ。
５１を閉じ（Ｃ５１）、５８を閉じる（Ｃ５８）
４１を開く（Ｏ４１）
１０を開く（Ｏ１０）
４５秒間にわたって４０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４１を閉じる（Ｃ４１）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値（１０ｐｓｉｇ）まで降下するまで待つ。

【0158】

プラグフロー洗浄。
９を開く（Ｏ９）
３１を開く（Ｏ３１）
５１を開く（Ｏ５１）
ＡＣＮ（１０ｍＬ）をキャッピング供給ゾーンにポンプ注入する。
３１を閉じる（Ｃ３１）
５１を閉じる（Ｃ５１）
９を閉じる（Ｃ９）
４１を開く（Ｏ４１）
「反応器に押し込むまでの時間」（８秒間）待つ。
１０を開く（Ｏ１０）
１５秒間にわたって４０ｍＬ／分の速度でポンプＰ９を始動させる。
４１を閉じる（Ｃ４１）
１０を閉じる（Ｃ１０）
９を開き（Ｏ９）、圧力がユーザー設定値まで降下するまで待つ。

【0159】

実施例３－ＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖の調製
同じＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖を実施例１及び実施例２と同様に調製する。本発明の流動床法を使用したこの分子の合成を本明細書に記載しており、これは、残りのホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む。主な違いは、以下のとおりである：実施例３を、より大規模（１ｍｍｏｌ）で、底部から上部まで同じ直径、内径２．２ｃｍ、高さ１ｍのより大きい流動床反応器内で行う。このより直径の大きい反応器では、上部に広い漏斗ゾーンがなくても流動化が十分に行われる。反応器の直径が大きいほど、壁の影響が少なくなるため、上部の広い直径セクションなしで固体及び液体を完全に流動化させ、再分布することが容易になる。各反応ステップの開始時の流動化は、典型的には反応器内約０．３ｍの高さに達した。また、実施例３では、カップリング以外の各反応（脱ブロッキング、酸化、硫化、及びキャッピング）を、試薬の第１の分量を反応物に充填し、この第１の分量を目標時間にわたって流動化させ、その後、この第１の分量を樹脂床プラグフロー様式によりポンプ注入すると同時に試薬の第２の分量を反応器の上部に充填することによって行い、これにより、全ての試薬がプラグフロー様式によりポンプ注入されるようになる。実施例１及び実施例２と同様に、大過剰量の洗浄溶媒及びＤＣＡ試薬溶液を実施例３に使用した。ＤＣＡ試薬量を減少させた実施例については実施例７を参照されたく、ＡＣＮ洗浄量を減少させた実施例については実施例６、８、及び９を参照されたい。表３１は、流動床反応器実施例における様々な実施形態のガイドである。

【0160】

排出後のＡＣＮ溶媒洗浄の終了時に樹脂床の高さが９ｃｍに達し、実験終了までに乾燥した状態で７ｃｍになった。排水後の最終脱ブロッキングステップ及び酸化ステップの終了時に、樹脂床の最大高さが１１ｃｍに達した。実験中のいずれの時点でも樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であるため、２０ｐｓｉｇであった。実施例２と同様に、２当量のアミダイトをカップリングに使用した。全合成条件を表６に示す。

【表6】

【0161】

既知の方法を使用してｍＵ（本明細書では「ｍＵ樹脂」と称する）をＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＵ（ｂｚ）３００樹脂（２９９μｍｏｌ／ｇ）にカップリングさせることから開始し、合成装置のセットアップについては図５を参照されたい。３．３４４ｇ（１．００ｍｍｏｌ）のｍＵ樹脂を、底部にフィルターフリットを備えた内径２．２ｃｍの反応器に入れる。初期乾燥樹脂深さは高さ約３ｃｍである。

【0162】

試薬及びアミダイト溶液を実施例１及び実施例２と同じように調製する。全てのポンプ及び供給ラインに呼び水を差す。不活性化供給缶（ｉｎｅｒｔｅｄ ｆｅｅｄ ｃａｎ）に入る途中でＡＣＮを分子篩の床に通過させた。全ての供給には蠕動ポンプ及び供給容器を使用する。アミダイト溶液は、「ＡＭ．１Ｌ」とラベル付けし、かつ図５の弁Ｖ１Ａ～Ｖ８Ａに取り付けられた蠕動ポンプに接続した供給容器に別個に収容されている。リン酸化試薬は、「ＡＭ．１Ｌ」とラベル付けし、かつ図５の弁Ｖ９Ａに取り付けられた蠕動ポンプに接続した供給容器に収容されている。活性化剤溶液及びＤＥＡ溶液は、それぞれ、図５で「活性化剤 ５ｇａｌ」及び「ＤＥＡ」とラベル付けした供給容器に収容されている。図３と同様に、図５ではアセトニトリルを「ＡＣＮ」と省略している。

【0163】

合成時にホスホロアミダイトを添加するたびに、以下に説明するように、脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。

【0164】

各ステップで、樹脂床流動化を２つの異なる時点で行い、１回目は、試薬混合物を反応器に充填し、樹脂をそれに曝した時点であり、２回目は、洗浄溶媒ステップのうちのいくつかを反応器に充填した時点である。しかしながら、カップリング反応中、１０分間の全カップリング時間にわたって流動化を繰り返し続ける。実施例２と同様に、ベント弁Ｖ５２が開くと同時に弁５８、弁５４、及び弁５３（図５のＶ５８、Ｖ５４、Ｖ５３）を開くことにより窒素ガスを底部フィルタースクリーンに通して上方に吹き込むことによって流動化を行う。この手順で液体が樹脂床を通って下方にポンプ注入されると記載されている場合、これは、窒素圧が樹脂床の上部を押して液体を下方に押し通している間、反応器の底部の出口にある廃棄ポンプが目標設定値で動作することを意味する。蠕動ポンプの目的は、制御された速度で床を通って流れる液体を計量することである。

【0165】

脱ブロッキング反応：脱ブロッキング溶液（１００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。窒素で脱ブロッキング溶液を供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。脱ブロッキング溶液を反応器に押し込む。樹脂床を２回流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床をリセットする。両方の流動化の合計時間は約１分間である。脱ブロッキング溶液を１１０ｍＬ／分のポンプ設定値で３１５秒間にわたって樹脂床に通して下方にポンプ注入し始める。追加の脱ブロッキング溶液（４２８ｍＬ）を反応器に同時にポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。３１５秒間に合計５２８ｍＬが樹脂床を通ってポンプ注入される。窒素で脱ブロッキング溶液を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。残留している脱ブロッキング溶液をフィルター底部から押し出して廃棄する。

【0166】

洗浄１（このステップを２回行う）：ＡＣＮ溶媒（５０ｍＬ）を、酸供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通して廃棄する。

【0167】

洗浄２：ＡＣＮ溶媒（９０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。窒素で反応器に下方に押し通し、流動化押し込みゾーンの底部（Ｖ５４とＶ５７との間）に押し込む。樹脂床を流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床を２回リセットする。ＡＣＮ溶媒を１１０ｍＬ／分のポンプ設定値で１２０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。追加のＡＣＮ溶媒（１１０ｍＬ）を反応器に同時にポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。合計２００ｍＬが樹脂床を通ってポンプ注入される。残留しているＡＣＮ溶媒をフィルター底部から押し出して廃棄する。

【0168】

洗浄３（このステップを２回行う）：ＡＣＮ溶媒（４０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。弁５４と弁５７との間の流動化押し込みゾーン及び廃棄チューブを洗浄するために、弁５７を介して溶媒を樹脂床に押し通し、反応器から押し出して廃棄する。

【0169】

カップリング反応：交差汚染の可能性を最小限に抑えるために、６つのアミダイトは各々、図５に示すように、独自の個々のポンプ、弁、及び活性化ゾーン（「２Ｌ」とラベル付けした活性化ゾーン）への独自の供給ライン有する。この構築体は６つのアミダイトのみを使用するが、合計９つのアミダイト（ｍＡ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵ、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、ｆＵ、ｐｈｏｓ）があり、アミダイトゾーンに１０個のポートがある（活性化剤を含む）。

【0170】

予洗浄（このステップを２回行う）：ＡＣＮ溶媒をアミダイト活性化ゾーン（８０ｍＬ）に充填し、反応器に下方に押し通して廃棄し、弁５４と弁５７との間の流動化押し込みゾーンも洗浄する。

【0171】

反応：指定量のアミダイト（２０ｍＬ）をアミダイト活性化ゾーンにポンプ注入し、窒素で追い込む。活性化剤溶液（２０ｍＬ）をアミダイト活性化ゾーンにポンプ注入し、窒素で追い込む。この混合物を供給ゾーンに押し込み、その後、反応器に押し込んで、樹脂上でのカップリング反応を開始する。１０分間のカップリング時間中、樹脂反応器を３０秒毎に１回流動化させて内容物を混合する。（言い換えれば、３０秒毎に１５秒間流動化させる。）反応時間が経過した後、カップリング溶液をフィルター底部から押し出して廃棄する。

【0172】

洗浄１（このステップを２回行う）：ＡＣＮ溶媒（１００ｍＬ）をアミダイト活性化ゾーンに充填し、反応器に下方に押し通して廃棄し、弁５４と弁５７との間の流動化押し込みゾーンも洗浄する。

【0173】

洗浄２（このステップを２回行う）：ＡＣＮ（４０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通し、反応器から押し出して廃棄し、それと同時に溶媒を使用して流動化押し込みゾーン（Ｖ５４とＶ５７との間）及び廃棄ポンプチューブを洗浄する。

【0174】

酸化反応（硫化の代わりに必要な場合）：ＡＣＮ（１００ｍＬ）をアミダイト活性化剤混合ゾーンに充填し、これにより、酸化反応の終了直後に樹脂を洗浄することができるようになる。酸化溶液（５９ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込み、樹脂床を２回流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床をリセットする。両方の流動化の合計時間は約１．２分間である。酸化溶液を１３０ｍＬ／分のポンプ設定値で３０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。追加のヨウ素溶液（１ｍＬ）を反応器に同時にポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。窒素でヨウ素溶液を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。３０秒間に合計６０ｍＬの酸化溶液が樹脂床を通って送り込まれる。残留している酸化溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。１００ｍＬのＡＣＮ洗浄溶媒を（アミダイト活性化剤混合ゾーンから）反応器に押し通し、樹脂を洗浄する。

【0175】

洗浄１（このステップを２回行う）：ＡＣＮ（５０ｍＬ）を、酸化溶液供給ラインを通して反応器に充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通して廃棄する。

【0176】

洗浄２：ＡＣＮ（４０ｍＬ）溶媒を、溶媒供給ラインを通して供給ゾーンに充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通し、反応器から押し出して廃棄し、それと同時に溶媒を使用して流動化押し込みゾーン（Ｖ５４とＶ５７との間）及び廃棄ポンプチューブを洗浄する。

【0177】

洗浄３：ＡＣＮ（９０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して供給ゾーンに充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を反応器に下方に押し通し、流動化押し込みゾーンの底部（Ｖ５４とＶ５７との間）に押し込む。樹脂床を流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床を２回リセットする。ＡＣＮ溶媒を１１０ｍＬ／分のポンプ設定値で１３０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。追加のＡＣＮ（１１０ｍＬ）を反応器に同時にポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。合計２００ｍＬが樹脂床を通ってポンプ注入される。残留しているＡＣＮ溶媒をフィルター底部から押し出して廃棄する。

【0178】

洗浄４（このステップを２回行う）：ＡＣＮ（４０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通し、反応器から押し出して廃棄し、それと同時に溶媒を使用して流動化押し込みゾーン（Ｖ５４とＶ５７との間）及び廃棄ポンプチューブを洗浄する。

【0179】

硫化（チオール化）反応（酸化の代わりに必要な場合）：水素化キサンタン溶液（９０ｍＬ）を供給ゾーン及び反応器に充填する。窒素で溶液を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。樹脂床を２回流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床をリセットする。両方の流動化の合計時間は約１分間である。水素化キサンタン溶液を１３０ｍＬ／分のポンプ設定値で８０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。追加の水素化キサンタン溶液（６０ｍＬ）を反応器に同時にポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。窒素で水素化キサンタン溶液を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。８０秒間に合計１５０ｍＬが樹脂床を通ってポンプ注入される。残留している水素化キサンタン溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0180】

洗浄１（このステップを２回行う）：ＡＣＮ（５０ｍＬ）を、水素化キサンタン溶液供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通して廃棄する。

【0181】

洗浄２：ＡＣＮ（４０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通し、反応器から押し出して廃棄し、それと同時に溶媒を使用して流動化押し込みゾーン（Ｖ５４とＶ５７との間）及び廃棄ポンプチューブを洗浄する。

【0182】

洗浄３：ＡＣＮ（９０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して反応器に充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶媒を反応器に下方に押し通し、流動化押し込みゾーンの底部（Ｖ５４とＶ５７との間）に押し込む。樹脂床を流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床を２回リセットする。ＡＣＮ溶媒を１１０ｍＬ／分のポンプ設定値で１３０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。追加のＡＣＮ（１１０ｍＬ）を反応器に同時にポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。合計２００ｍＬのＡＣＮが樹脂床を通ってポンプ注入される。残留している溶媒をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0183】

洗浄４（このステップを２回行う）：ＡＣＮ（４０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通し、反応器から押し出して廃棄し、それと同時に溶媒を使用して流動化押し込みゾーン（Ｖ５４とＶ５７との間）及び廃棄ポンプチューブを洗浄する。

【0184】

キャッピング反応：キャッピング溶液Ａ及びキャッピング溶液Ｂの溶液（各々４５ｍＬ）を反応器に充填し、窒素で各溶液を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。樹脂床を２回流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床をリセットする。両方の流動化の合計時間は約１分間である。キャッピング溶液Ａとキャッピング溶液Ｂの混合物を１３０ｍＬ／分のポンプ設定値で７０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。追加のキャッピング溶液Ａとキャッピング溶液Ｂ（各々２５ｍＬ）を反応器に同時にポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。窒素でキャッピング溶液Ａ及びキャッピング溶液Ｂを反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。７０秒間で合計１４０ｍＬが樹脂床を通ってポンプ注入される。残留しているキャッピング溶液Ａ及びキャッピング溶液Ｂをフィルター底部から押し出して廃棄する。

【0185】

洗浄１（このステップを２回行う）：ＡＣＮ（各々５０ｍＬ）を、キャッピング溶液Ａ及びキャッピング溶液Ｂ供給ラインを通して反応器に充填し、窒素で反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通して廃棄する。

【0186】

洗浄２（このステップを２回行う）：ＡＣＮ（４０ｍＬ）を、溶媒供給ラインを通して反応器に充填する。窒素で洗浄溶媒を反応器に追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床に押し通し、反応器から押し出して廃棄し、それと同時に溶媒を使用して流動化押し込みゾーン（Ｖ５４とＶ５７との間）及び廃棄ポンプチューブを洗浄する。

【0187】

最後のカップリングサイクルが完了した後、アミダイトの代わりにリン酸化溶液を使用してサイクルを繰り返す。リン酸化試薬がカップリングして酸化した後、脱ブロッキングステップを繰り返す。樹脂を５００ｍＬのＤＥＡ溶液と１０分間反応させる。ＡＣＮで洗浄し、窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで３０分間乾燥させて、樹脂上に１１．９６ｇの乾燥生成物を得る。２０ｍｇの生成物＋樹脂を試料として採取し、最初に３．３４４ｇの樹脂を使用し、８．６３６ｇ（粗質量収率９４％）の保護オリゴヌクレオチド生成物が残る。

【0188】

少量の試料に濃縮ＮＨ_４ＯＨ溶液を用いて切断及び脱保護反応を５０℃で４時間行う。ＵＰＬＣは、実施例１～５のＵＰＬＣ結果の表（表１３）に示すように、切断されて脱保護されたオリゴヌクレオチド生成物がピーク面積パーセントで純度７７．８％であることを示している。ＬＣＭＳ分析により、主生成物のピークが正しいＨＰＲＴ ｄｉｖ２２ ＡＳ鎖を表すことが確認される。

【0189】

実施例４－ＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖の調製
実施例１、実施例２、及び実施例３と同様に、この実施例でも同じＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖を作製した。実施例１、実施例２、及び実施例３と同様に、本発明の流動床法を使用したこの分子の合成を本明細書に記載しており、これは、残りのホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む。この実験では、実施例２と同じ反応器及び手順を使用した。主な違いは、実施例４では規模が小さく（０．１８ｍｍｏｌ規模に対して０．１ｍｍｏｌ規模）、樹脂ロード量が高く（２４６ｕｍｏｌ／ｇに対して２９９ｕｍｏｌ／ｇ）、それ故に、樹脂床の高さが実施例２ほど高くなく、短い樹脂床では脱ブロッキング及び脱ブロッキング後の洗浄の時間調整が短いことであった。この実験では、０．３３４６ｇのＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＵ３００樹脂（ロット番号ＥＯ５００５、ロード量２９９ｕｍｏｌ／ｇ）を使用した。ｍＵ１７、ｆＡ１８、及びｆＵ２２カップリングでは２．５当量のアミダイト（サイクル１７、１８、及び２１）及び１２．５当量の活性化剤を使用したが、残りのアミダイトカップリングステップでは全て、実施例２と同様に、２．０当量のアミダイト及び１０当量の活性化剤を使用した。実施例１、実施例２、及び実施例３と同様に、大過剰量の洗浄溶媒及びＤＣＡ試薬溶液を実施例４に使用した。ＤＣＡ試薬量を減少させた実施例については実施例７を参照されたく、ＡＣＮ洗浄量を減少させた実施例については実施例６、８、及び９を参照されたい。表３１は、流動床反応器実施例における様々な実施形態のガイドである。

【0190】

表７に記載の試薬溶液を使用する。

【表7】

【0191】

以下の表８に示す０．１Ｍアミダイト溶液を調製する。アミダイト固体を秤量してボトルに入れ、ドライパッドを挿入し、その後、ＡＣＮを添加して０．１Ｍの濃度を達成する。実施例４の合成条件を表９に列記している。合成手順は実施例２に記載のものと同じであり、図３も参照されたい。

【表8】

【表9】

【0192】

最終脱ブロッキングステップでの下降流部分中の樹脂床の高さは１２．７ｃｍであり、したがって、樹脂床の高さは実施例２と比較して半分未満であった。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であるため、１５ｐｓｉｇである。合成の開始から終了までの樹脂床の高さを表１０に示す。

【表10】

【0193】

最終ＤＥＡ処理後、ＡＣＮで洗浄し、窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで乾燥させて、１．１４５８グラムの乾燥樹脂を得る。これは０．８１１グラムの重量増加に相当するが、これには全材料の約６％であった試料質量の補正は含まれていない。粗質量増加は８．６０ｇ／ｍｍｏｌであり、これは約９３％の粗質量収率である。２１．９ｍｇの試料に対して０．５ｍＬの濃縮ＮＨ_４ＯＨ溶液を用いて切断及び脱保護反応を５５℃で４時間行う。ＵＰＬＣは、実施例１～５のＵＰＬＣ結果の表（表１３）に示すように、切断されて脱保護されたオリゴヌクレオチド生成物がピーク面積パーセントで純度８４．５％であることを示している。ＬＣＭＳ分析により、主生成物のピークが正しいＨＰＲＴ ｄｉｖ２２ ＡＳ鎖を表すことが確認される。

【0194】

実施例５－Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡオリゴヌクレオチド合成装置との比較
実施例１～４由来の同じＨＰＲＴ Ｄｉｖ２２アンチセンス鎖も、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＵ２５０樹脂（２４６μｍｏｌ／ｇ、０．６０３ｇ、１４８．４μｍｏｌ）から開始してＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ自動オリゴヌクレオチド合成装置で調製し、同じ脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。実施例５の合成条件を表１１に列記する。

【表11-1】

【表11-2】

【0195】

合成が完了し、樹脂を乾燥させた後、質量増加を８．６４ｇ／ｍｍｏｌと測定し、これは９４％の粗質量増加である。粗収率も１６９ＯＤ／ｕｍｏｌと測定した。切断及び脱保護時、オリゴヌクレオチド生成物はＵＰＬＣにより純度８０．２８％である。ＬＣＭＳ分析により、主生成物のピークが正しいＨＰＲＴ ｄｉｖ２２ ＡＳ鎖を表すことが確認される。表１３に示すように、オリゴヌクレオチド生成物の粗収率及び純度は、実施例１～４で得た生成物と同等である。しかしながら、Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡシステムでは、樹脂床は静的であり、全ての試薬及び溶媒は「プラグフロー」様式で樹脂床を通る。このシステムの制限は、樹脂床の高さが１０ｃｍを超えると、樹脂床全体にわたる圧力降下の増大及び樹脂床内のチャネリングなどの悪影響が生じるような制限である。実施例５では、樹脂床の高さは最大２ｃｍであった。対照的に、本発明は、樹脂床の高さをより高くすることができ（実施例２に記載の実験中の最大床高さは、反応の下方への押し込み部分中、３０ｃｍであった）、所与の反応器直径に対してバッチサイズ容量を増加させ、所与の反応器に対して柔軟なバッチサイズを容易にすることができる。

【0196】

ＨＰＲＴ ｄｉｖ２２アンチセンス鎖の純度分析のためのイオンペアリングＵＰＬＣ法条件の概要を表１２に示す。

【表12】

【表13-1】

【表13-2】

【表13-3】

【0197】

実施例６．５１．５ｕｍｏｌ規模のＡＮＧＰＴＬ３アンチセンス鎖、サイクル毎に洗浄溶媒を統合
ＡＮＧＰＴＬ３アンチセンス鎖を、ホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む本発明の流動床法を使用して調製する。サイクル２１ ＭｅＭＯＰホスホロアミダイトを添加した後のキャッピングは必要ではない。この実施例では、代替の研究規模合成装置設計を使用する。この新たな設計には、アミダイト及び活性化剤以外の試薬の供給ゾーンはない。複数のヘッドを並列して使用することによりポンプの数が減り、ホスホロアミダイトサイクル毎に溶媒再利用が統合されているため、溶媒洗浄量が削減される。この実験は、５１．５ｕｍｏｌ規模での２２ｍｅｒの一本鎖ＲＮＡ（ＡＮＧＰＴＬ３アンチセンス鎖）のベースライン合成である。このＲＮＡ鎖の配列を図１０に示し、以下のように省略することができ、ここで、＊は酸化の代わりにチオール化を示す。
５’ＭｅＭＯＰ＊ｆＧ＊ｆＵ＊ｆＡｆＵｍＡ ｆＡｍＣｍＣ ｆＵｍＵｍＣ ｍＣｆＡｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ３

【0198】

内径０．６３ｃｍ、高さ１０ｃｍのＰＦＡチューブを反応器として使用した。合成条件の概要を表１４に列記する。０．２０８７ｇのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２５０ ２’ＯＭｅＧ（ＩＢＵ）樹脂を使用し、０．６２８７ｇの最終樹脂質量を得た。したがって、粗質量増加量は０．４２００ｇであった。１ｍｍｏｌ規模への正規化により、８．１６ｇ／ｍｍｏｌになった。ＵＰＬＣ結果は８２．７％のＦＬＰを示した。ＵＰＬＣ及び収率結果を表１７に示す。合成規模で正規化した全ＯＤは１７１ＯＤ／ｕｍｏｌであった。Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ ＯＰ１００合成装置による典型的な合成と比較した溶媒の使用量を表１５に列記する。実施例１～４と比較して、実施例６では、１ｍｍｏｌあたりのＡＣＮ洗浄溶媒使用量が著しく少なかった。表３１は、流動床反応器実施例における様々な実施形態のガイドである。カート３１４流動床反応器による合成とＡＫＴＡ合成装置による合成間の純度、収率、及び不純物プロファイルの比較を表１７に示す。合成装置の概略図を図７に示す。合成装置の自動化手順を表１８に記載している。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であるため、１５ｐｓｉｇである。

【表14】

【表15】

【0199】

４つの実験を比較のためにＡＫＴＡ ＯＰ１００合成装置で実行した。これらを表１７に提示する。

【0200】

ＡＫＴＡ ＯＰ１００で実行した４つの実験に使用した材料及び合成条件を表１６に列記する。

【0201】

表１６の４つの実験は全て以下を使用した。
●Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ ＯＰ１００
●Ｋｉｎｎｏｖａｔｅ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ－２’－ＯＭｅＧ（ｉＢｕ）２５０樹脂、ロットＧ０８００４、ロード量２４７ｕｍｏｌ／ｇ
●脱ブロッキング、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）のトルエン溶液
●カップリング、酸化、チオール化、キャッピング後の２ＣＶ ＡＣＮ押し込み
●アミダイト当量＝２当量
●活性化剤試薬、０．５Ｍ ５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾールのＡＣＮ溶液
●カップリング時間＝１０分
●酸化試薬、０．０５Ｍヨウ素のピリジン／水溶液（９０／１０（ｖ／ｖ））
●酸化当量＝４当量
●酸化接触時間＝３分
●硫化試薬、０．２Ｍ水素化キサンタンのＡＣＮ／ピリジン溶液（７０／３０（ｖ／ｖ））
●水素化キサンタン使用量、２ＣＶ
●水素化キサンタン＝１３当量
●硫化接触時間＝５．５分
●キャッピング溶液Ａ、１－メチルイミダゾール／ＡＣＮ（２０／８０（ｖ／ｖ））
●キャッピング溶液Ｂ、Ｂ１とＢ２の１：１混合物
●キャッピング溶液Ｂ１、４０体積％無水酢酸のＡＣＮ溶液
●キャッピング溶液Ｂ２、６０体積％２，６－ルチジンのＡＣＮ溶液
●５０／５０（ｖ／ｖ）混合物中のキャッピング溶液Ａとキャッピング溶液Ｂの合計量＝２ＣＶ
●キャッピング接触時間＝０．５分
●ＤＥＡ、２０％ジエチルアミン／ＡＣＮ溶液（２０／８０（ｖ／ｖ））
●ＤＥＡ接触時間＝１０分
●ＤＥＡ量＝１０ｍＬ

【表16】

【0202】

表１６に列記した各実験において、樹脂結合オリゴヌクレオチドを乾燥させた後、約２０ｍｇの樹脂を０．５０ｍＬのＮＨ４ＯＨ中に懸濁させ、５５℃で４時間又は３８℃で１８時間振盪した。樹脂を濾過し、濾液をＵＰＬＣにより分析した（５０μＬの濾液を１．５ｍＬの水で希釈した）。ＵＰＬＣ純度を表１７に示す。

【表17-1】

【表17-2】

【表17-3】

【表17-4】

【表17-5】

【表17-6】

【0203】

表の０．９７９～０．９８４ＲＲＴ領域及び１．００６～１．０１６ＲＲＴ領域で面積パーセントピークが特定されているため、合成装置間に違いがあると考えられ得るが、クロマトグラムを見ると、実際にはこれらの領域にはっきりと異なるピークはないことがわかる。例えば、流動床反応器実施例には存在しないピークがＡＫＴＡ実施例では０．９７９ＲＲＴで特定されている。同様に、ＡＫＴＡ実施例には存在しないピークが流動床反応器実施例では０．９８４ＲＲＴで特定されている。しかしながら、図１７のクロマトグラムを調べてみると、これらが主ピーク上の同様の左端のショルーダーであり、特定されたピーク時間が単に自動積分によって線が描かれた場所に依存することがわかる。同様に、１．００６ＲＲＴと１．０１６ＲＲＴとの間にはベースラインを超える上昇した領域があり、これは自動積分線が描かれる場所に応じて割り当てが異なるが、これは全ての試料において同様の上昇したベースライン領域である。この表から、流動床反応器試料には存在しないピークがＡＫＴＡ試料では１．００６ＲＲＴで存在し、ＡＫＴＡ試料には存在しないピークが流動床反応器試料では１．０１ＲＲＴで存在すると考えられ得るが、図１７のクロマトグラムを見ると、これらのＲＲＴ領域では実際には異なる合成装置からの試料間に有意差がないことがわかる。

【表18-1】

【表18-2】

【表18-3】

【表18-4】

【表18-5】

【表18-6】

【表18-7】

【0204】

実施例７．１００ｕｍｏｌ規模のＡＮＧＰＴＬ３アンチセンス鎖、サイクル毎にＤＣＡ試薬を統合
図１０に示す同じＡＮＧＰＴＬ３アンチセンス鎖を、ホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む本発明の流動床法を使用して調製する。実施例７は、全ての実施例の中で最も少ないＤＣＡ試薬を実証した。サイクル２１ ＭｅＭＯＰホスホロアミダイトを添加した後のキャッピングは必要ではない。この実施例は、実施例１、２、３、４、及び６と比較してより少ない当量のＤＣＡを使用した。表３１は、流動床反応器実施例における様々な実施形態のガイドである。ＤＣＡの減少に寄与する要因の１つは、各ホスホロアミダイトサイクルで前のホスホロアミダイトサイクルからの酸流出物のきれいな部分が再利用されることである。再利用酸が脱ブロッキングの一部を達成する。加えて、かつ恐らくより重要なことに、再利用酸が前のサイクルの終わりから濡れたビーズ内／上の残留ＡＣＮを洗い流し、流動化中に樹脂ビーズを膨張させることである。ＡＣＮはＤＣＡ脱ブロッキングを妨げることが知られている。前の実施形態は、新鮮なＤＣＡ溶液による初期樹脂流動化及びＡＣＮ排出を達成した。この概念は、この操作段階で新鮮な酸を使用する必要性を避けるために、代わりに再利用酸を使用することである。再利用酸が前のホスホロアミダイトサイクルからの酸流出物のよりきれいな部分であるため、再利用酸にはＡＣＮが含まれていない。初期流動化中に樹脂ビーズを膨張させることにより、流動化中に樹脂床が膨張して拡張することが可能になるため、その後に続く脱ブロッキングの下降流部分中のその後の圧力降下が減少する。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であるため、１５ｐｓｉｇである。前の実施例と比較した別の違いは、キャッピング溶液量の減少であり、キャッピング溶液Ａ及びキャッピング溶液Ｂが各々５０％減少して１．７５ｍＬになり、３つ目の違いは、反応間での大規模な流動化洗浄の除去である。この実施例でのプロセスでは、Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡで典型的に使用される標準量の酸（ｍＬ酸／ｍｍｏｌ出発樹脂）の２９．２％を使用する。酸再利用のための合成装置のセットアップについては、図８を参照されたい。

【0205】

酸の再利用を、別個の酸再利用供給ボトル及びポンプを使用して達成する。ホスホロアミダイトを導入するための各合成サイクルには、２つの酸脱ブロッキングステップがある。各サイクルの第１の酸ステップでは、酸を酸再利用供給ボトルから反応器に充填する。これを使用する主な理由が、流動中に床を膨張させ、その後、ＡＣＮを床から排出することであるため、樹脂床に通してより迅速にポンプ注入する。反応器から出るとき、第１の酸ステップからの酸をポンプ排出して廃棄する。第２の酸ステップでは、新鮮な酸供給ボトルから新鮮な酸を充填する。反応器から出るとき、第２の酸ステップからの酸を次のサイクルで再利用するために酸再利用供給ボトルにポンプで送り返す。このシーケンスの第１のサイクルでは、再利用酸供給ボトルに、第１の酸ステップで使用するのに十分な量の新鮮な酸を充填する。全ての後続のステップでは、再利用酸供給ボトル内の前のサイクルからの酸を再利用する。前のサイクルからの全ての再利用酸が反応器に充填されるようにポンプパラメータを設定する。再利用ボトルを毎回空にすることにより、キャリーオーバーが１サイクルのみに制限され、再利用酸供給ボトル内での蓄積が防止される。

【0206】

この実施例のプロセスを１００μｍｏｌ規模で実行し、最終サイクルの開始時にＡＣＮ溶媒が湿った状態で樹脂床の高さが１１ｃｍに達する。最終脱ブロッキングステップ下降流部分中に、樹脂床の最大高さが１２ｃｍに達する。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は１５ｐｓｉｇである。反応器は、高さ２３ｃｍ、直径０．６３ｃｍの底部セクションと、高さ２５ｃｍ、直径４．７ｃｍの円錐形底部の上部セクションとを有する。試薬溶液を実施例６と同じように調製する（水素化キサンタン濃度は０．２Ｍであった）。全てのポンプ及び供給ラインに呼び水を差す。ドライパックをＡＣＮボトル及び全てのシリンジに入れる。アミダイト及び活性化剤にはシリンジポンプを使用し、全ての他の試薬及び溶媒の供給には蠕動ポンプ及び供給容器を使用する。

【0207】

既知の方法を使用してｍＧ（本明細書では「ｍＧ樹脂」と称する）をＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＧ（ｉｂｕ）２５０樹脂（ロット番号Ｈ０８０２３）にカップリングさせることから開始する。全合成条件を表１９に示す。

【表19-1】

【表19-2】

【0208】

最終樹脂結合オリゴヌクレオチド質量は、乾燥した状態で１．２２０グラムであった。これは、０．８１７グラムの重量増加又は８．１３ｇ／ｍｍｏｌの質量増加に相当する。濃縮ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて切断及び脱保護反応を５５℃で５時間行う。ＵＰＬＣは、実施例６～９のＵＰＬＣ結果の表に示すように、切断されて脱保護されたオリゴヌクレオチド生成物がピーク面積パーセントで純度７９．９２％であることを示している。

【0209】

これから図８の装置を使用するプロセスについて説明する。合成時にホスホロアミダイトを添加するたびに、以下に説明するように、脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。この手順で液体が樹脂床を通って下方にポンプ注入されると記載されている場合、これは、窒素圧が樹脂床の上部を押して液体を下方に押し通している間、反応器の底部の出口にある廃棄ポンプが目標設定値で動作することを意味する。蠕動ポンプの目的は、制御された速度で床を通って流れる液体を計量することである。

【0210】

脱ブロッキング反応：脱ブロッキングプロセスには、再利用脱ブロッキングステップ及び新鮮な脱ブロッキングステップが含まれる。オリゴヌクレオチドの長さの関数として増加した体積と時間を表２０に列記する。

【表20】

【0211】

再利用脱ブロッキング：弁８０８をＡに回し、弁８０７をＢに回し、弁８２４を閉じる。再利用脱ブロッキング溶液の初期量（サイクル１～３では５ｍＬ、サイクル４～９では６ｍＬ、サイクル１０～２１では７ｍＬ）を酸供給ゾーンに充填し、その後、窒素圧で反応器に６秒間押し込む。各サイクルでの再利用脱ブロッキング溶液量は、前のサイクルでの新鮮な脱ブロッキング溶液量と一致する。弁８２４を開く。廃棄用の出口弁（図８の弁８０９及び弁８１０）は閉じている。反応器の上部から圧力を１５秒間ベントすると同時に弁３８を開き、窒素バブリングさせて、樹脂床を試薬溶液で撹拌し、流動化させる。弁８５４ベント及び弁８３８を閉じ、弁８４４を開いて窒素で３秒間押し下げる。弁８４４を閉じ、これらの流動化ステップを更に４回繰り返す。樹脂の膨張の大半は流動化中に起こる。廃棄用の弁（弁８１０）を開き、脱ブロッキング溶液をポンプ９で樹脂床に通して１０ｍＬ／分の速度でポンプ注入する。ポンプ９が出口速度を設定するための計量デバイスとしての役割を果たす一方で、反応器の上部の窒素圧は、液体が下方に流れて反応器の底部から出るための駆動力を供給する。ポンプ９でのポンプ注入と並行して、弁８３７を開き、ポンプ１０を始動させ、２～１１ｍＬ（サイクルに応じて）の第２の量がポンプ注入されるまで再利用脱ブロッキング溶液を３０ｍＬ／分で供給する（ポンプ１０はポンプ９の前に終了する）。ポンプ１０から酸供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、流れをポンプ９の作動時間の全持続時間にわたって維持する。ポンプ９を１１０～１６０秒間（実験を通して増加する）連続して作動させて、確実に反応器と弁８３９との間のチューブ内に再利用酸が残らないようにする。これにより、新鮮な酸がカラムを通って流れ、後続の新鮮な酸の脱ブロッキングステップで再利用酸ボトルにポンプで送り返される前に、廃棄チューブが一掃される。

【0212】

新鮮な脱ブロッキング：弁８０８をＡに回し、弁８０７をＢに回し、弁８２４を閉じる。５～７ｍＬの新鮮な脱ブロッキング溶液を酸供給ゾーンに充填し、窒素圧で６秒間にわたって反応器に押し込む。弁８２４を開く。廃棄用の出口弁（弁８０９及び弁８１０）は閉じている。廃棄用の弁（弁８１０）を開き、脱ブロッキング溶液をポンプ９で樹脂床を通って４ｍＬ／分でポンプ注入する。ポンプ９注入と並行して、弁８１４を開き、ポンプ１を塩生させ、２～１１ｍＬがポンプ注入されるされるまで脱ブロッキング溶液を３０ｍＬ／分で供給する（ポンプ１はポンプ９の前に終了する）。ポンプ１から酸供給ゾーンにポンプ注入される液体が反応器に同時に流れ込み、樹脂床上の液位を維持し、流れをポンプ９の作動時間の全持続時間にわたって維持する。追加のポンプ時間を使用して、反応器から再利用酸供給ボトルまでの全てのラインを一掃し、これにより、次のサイクルのその後に続く再利用酸ステップで全量の新鮮な酸を使用することができるようになる。

【0213】

以下のＡＣＮ洗浄手順を４回行う。廃棄用弁８０９を開き、ＡＣＮ（４ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、その後、弁８０９を閉じ、窒素圧で反応器に２秒間押し込む。廃棄用の弁（弁８１０）を開き、洗浄液が樹脂を通過するまでポンプ９で樹脂床に通して１０ｍＬ／分の速度でＡＣＮ洗浄液をポンプ注入する。これは、同じ合成装置を使用する実施例１、２、及び４と比較して、ＡＣＮ洗浄溶媒の大幅な減少である。最初のサイクル中のみ、プラグフロー洗浄ステップ間に追加の流動化洗浄を組み込む。

【0214】

カップリング反応：脱ブロッキング洗浄後、次の連続ホスホロアミダイトをカップリングさせ、３’から５’に連続ステップで導入する。配列内でカップリングした各ホスホロアミダイトについて、配列内のヌクレオチドに対応するアミダイト溶液を使用して、本質的に以下に記載したようにカップリング反応手順を行う。弁８０８をＢに回す。毎回、弁８０９を閉じた状態で４ｍＬのＡＣＮをアミダイト供給ゾーンにポンプ注入することにより、アミダイトゾーン及び反応器への流路を２回予洗浄し、その後、弁８１０を開き、１０ｍＬ／分の速度で１５秒間ポンピングして廃棄する。最初に活性化剤溶液（２ｍＬ、１０当量、表１）、その後、適切なアミダイト溶液（２ｍＬ、２．０当量）を供給ゾーンにポンプ注入する。弁８０９を閉じ、弁８５５、弁８２４、及び弁８３８を３秒間開いて、アミダイト溶液及び活性化剤溶液をバブリング窒素と混合する。弁８５５、弁８２４、及び弁８３８を閉じる。弁８４５を開いて供給ゾーン内の混合物を窒素圧で反応器に６秒間押し込み、その後、弁８２４を開き、窒素圧を８秒間継続する。アミダイト溶液及び活性化剤溶液を樹脂と混合し、弁８２４が開いており、かつ弁８０９が閉じた状態で、以下のように床を連続して流動化させる：反応器の上部に窒素圧を３秒間加える。反応器の上部から圧力を１５秒間ベントすると同時に弁８３８を開き、窒素バブリングさせて、樹脂床を試薬溶液で撹拌し、流動化させる。このプロセスを１０分間連続して繰り返し（サイクル１６のフルオロアミダイト及びｍＡの場合、１５分間）、その後、弁８０９を開き、反応器の上部に窒素圧を８秒間加え、反応器の底部から液体を排出して廃棄する。ＡＣＮ（４ｍＬ）をアミダイト供給ゾーンにポンプ注入し、窒素圧で反応器に１５秒間押し通す。この洗浄を１回繰り返す。これは、同じ合成装置を使用する実施例１、２、及び４と比較して、ＡＣＮ洗浄溶媒の大幅な減少である。更に、より大きいバージョンの反応器（実施例８、９、及び１０）はスプレーボールを使用し、ＡＣＮ（ｍＬ／ｍｍｏｌ）は更に少ない。

【0215】

酸化反応（硫化の代わりに必要な場合）：カップリング反応洗浄後、本質的に以下に記載したように酸化反応を行う。弁８０６、弁８０７、及び弁８０８をＡに回し、弁８２４、弁８０９、及び弁８５３を開く。酸化溶液（表１９、サイクル３及び４では４．２ｍＬ、サイクル５～１８では５．３ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入し、弁８０９を閉じ、ヨウ素溶液を窒素圧で反応器に１０秒間押し込む。反応器床を以下のように１１回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で５秒間加圧する。反応器の上部から圧力を１５秒間ベントすると同時に弁８３８を開き、窒素バブリングさせて、樹脂床を試薬溶液で撹拌し、流動化させる。弁８１０を開き、ポンプ９で５．３ｍＬの液量を３０秒間かけてポンプ注入し、その後、弁８１０を閉じる。弁８４３及び弁８０９を開いて、残っている試薬を反応器から押し出す。弁８４３を閉じ、弁８５３を開く。

【0216】

以下のＡＣＮ洗浄手順を４回行う。これは、同じ合成装置を使用する実施例１、２、及び４と比較して、ＡＣＮ洗浄溶媒の大幅な減少である。廃棄用弁８０９を開き、ＡＣＮ（４ｍＬ）をヨウ素供給ゾーンに充填し、その後、弁８０９を閉じ、窒素圧で反応器に２秒間押し込む。廃棄用の弁（弁８１０）を開き、洗浄液が樹脂を通過するまでポンプ９で樹脂床に通して１０ｍＬ／分の速度でＡＣＮ洗浄液をポンプ注入する。

【0217】

硫化（チオール化）反応（酸化の代わりに必要な場合）：カップリング反応洗浄後、本質的に以下に記載したようにチオール化反応を行う。弁８０６をＢに回し、弁８０５、弁８０７、及び弁８０８をＡに回し、弁８２４及び弁８０９を開く。硫化溶液（表１９、６．５ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入し、弁８０９を閉じ、窒素圧で反応器に６秒間押し込む。反応器床を以下のように２２回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で３秒間加圧する。反応器の上部から圧力を１５秒間ベントすると同時に弁８３８を開き、窒素バブリングさせて、樹脂床を試薬溶液で撹拌し、流動化させる。弁８１０を開き、ポンプ９で６．５ｍＬの液量を３０秒間かけてポンプ注入し、その後、弁８１０を閉じる。酸化反応について上述のように洗浄するが、ＡＣＮは硫化供給ゾーンを通って反応器に入る。

【0218】

キャッピング反応：酸化（又は硫化）反応洗浄後、本質的に以下に記載したようにキャッピング反応を行う。弁８０５及び弁８０６をＢに回し、弁８０７及び弁８０８をＡに回す。弁８２４及び弁８０９を開く。キャッピング溶液Ａとキャッピング溶液Ｂ（各々１．７５ｍＬ）を供給ゾーンに同時にポンプ注入し、その後、弁８０９を閉じる。液体を窒素圧で反応器に６秒間押し込む。反応器床を以下のように３回流動化させる：反応器の上部を窒素圧で５秒間加圧する。反応器の上部から圧力を１５秒間ベントすると同時に弁８３８を開き、窒素バブリングさせて、樹脂床を試薬溶液で撹拌し、流動化させる。弁８１０を開き、ポンプ９で３．５ｍＬの液量を３５秒間かけてポンプ注入し、その後、弁８１０を閉じる。酸化反応について上述のように洗浄するが、ＡＣＮはキャッピング供給ゾーンを通って反応器に入る。

【0219】

以下のＡＣＮ洗浄手順を１回行う。廃棄用弁８０９を開き、ＡＣＮ（４ｍＬ）をキャッピング供給ゾーンに充填し、その後、弁８０９を閉じ、窒素圧で反応器に２秒間押し込む。廃棄用の弁（弁８１０）を開き、洗浄液が樹脂を通過するまでポンプ９で樹脂床に通して３ｍＬ／分の速度でＡＣＮ洗浄液をポンプ注入する。

【0220】

まさに最後のサイクルでは硫化ステップを使用し、その後、ＡＣＮ洗浄を使用する。その後、樹脂をＤＥＡ溶液（２０％（Ｖ／Ｖ）ＡＣＮ溶液）で１０分間洗浄する。弁８０８を開位置（Ｂ）に設定し、弁８１５及び弁８２４を開く。ポンプ４を使用して９．３ｍＬのＤＥＡを供給ゾーンに充填する。４回流動化させ、その後、弁８１０を開き、ポンプ９を６０秒間オンにし、ＤＥＡを８ｍＬ／分の速度でポンプ排出して廃棄する。これらのステップを更に３回繰り返し、合計４回のＤＥＡ洗浄を行う。アミダイト供給ゾーンを通して４ｍＬのＡＣＮで３回洗浄し、続いて１２ｍＬのＡＣＮで２回流動化洗浄する。

【0221】

本実験にわたる樹脂床の高さは表２１に示したとおりである。

【表21】

【0222】

窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで１２０分間乾燥させる。最終質量は、乾燥樹脂１．２２０グラムであった。これは、０．８１７グラムの重量増加又は８．１３ｇ／ｍｍｏｌに相当する。ＯＤ／ｕｍｏｌを表１７に列記する。切断及び脱保護を、オリゴヌクレオチドが結合した乾燥樹脂試料２２．８ｍｇに行った。これを行うために、樹脂を０．５ｍＬの水酸化アンモニウムとともにＵＰＬＣバイアルに添加した。切断及び脱保護のためにバイアルを振盪機上に置いた（５５℃で５時間）。割り当てられた時間が経過した後、バイアルを取り除き、室温まで冷却させた。試料をフィルターバスケットの入った１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、３０秒～１分間遠心分離した。１．５ｍＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水を別のＵＰＬＣバイアルに添加し、５０ｕＬの試料液体（オリゴヌクレオチドを含む）を添加した。使用済みの樹脂を廃棄した。ＵＰＬＣ管を繰り返し反転させて試料を混合し、その後、ＵＰＬＣに供した。ＵＰＬＣは、実施例６～１０のＵＰＬＣ結果及びＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡとの比較（表１７）に示すように、切断されて脱保護されたオリゴヌクレオチド生成物がピーク面積パーセントで純度７９．９２％であることを示している。ＬＣＭＳ分析により、主生成物のピークが正しい鎖を表すことが確認された。顕著な切断（面積１％超）が１つのみ観察され、２．０２％面積のピークは最終アミダイトＭｅＭＯＰの不完全なカップリングに対応する。純度及び収率が高いため、これらの結果は、ＡＣＮ洗浄とそれに続く酸の再利用がキャッピング後の許容される洗浄方法であり、かつ流動化洗浄の除去が実施例２及び実施例４と比較して有害ではないことを示している。使用した新鮮な酸の合計は、前後の供給ボトル質量から計算して２６３ｍＬ、ひいては約２６３０ｍＬ／ｍｍｏｌであった。これは、Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡの典型的な量（典型的には約９０００ｍＬ／ｍｍｏｌ）の２９．２％である。

【0223】

実施例８－内径４インチの反応器における１０ｍｍｏｌ規模でのＡｎｇＰＴＬ３アンチセンス鎖の調製
ＡｎｇＰＴＬ３の単一アンチセンス鎖をパイロット規模で、流動床反応器内で合成した。（これは図１０に示す配列と同じである）。
５’ＭｅＭＯＰ＊ｆＧ＊ｆＵ＊ｆＡｆＵｍＡ ｆＡｍＣｍＣ ｆＵｍＵｍＣ ｍＣｆＡｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ３’

【0224】

本発明の流動床法を使用したこの分子の合成を本明細書に記載しており、これは、残りのホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む。この実施例での主な違いの１つは、より大規模（１０ｍｍｏｌ）で、底部から上部まで同じ直径、内径１０．１６ｃｍ、高さ６１ｃｍのより大きい流動床反応器で行われることである。反応器はフィルターフリット平底を有する。このより直径の大きい反応器では、上部に広い漏斗ゾーンがなくても流動化が十分に行われる。反応器の直径が大きいほど、壁の影響が少なくなるため、上部の広い直径セクションなしで固体及び液体を完全に流動化させ、再分布することが容易になる。各反応ステップの開始時の流動化は、典型的には反応器内のスラリーの高さを約２～４ｃｍ拡張するのみである。この合成のための装置を図９に示す。この実施例の別の違いは、脱ブロッキング前の洗浄にトルエンを使用することである。また、実施例６と同様に、実施例８では、ホスホロアミダイトサイクル毎に溶媒再利用が統合されているため、溶媒洗浄量が減少する。脱ブロッキング後のよりきれいな洗浄液を再利用ＡＣＮ容器にポンプ注入し、次のホスホロアミダイトサイクルで脱ブロッキング後の洗浄の第１の部分に使用する。表３１は、流動床反応器実施例における様々な実施形態のガイドである。

【0225】

実験終了までに樹脂床の高さがＡＣＮ溶媒湿潤状態で５ｃｍに達し、乾燥した状態で４ｃｍに達する。最終脱ブロッキングステップの下降流部分中に、樹脂床の最大高さが６ｃｍに達する。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であるため、１５ｐｓｉｇである。実施例６及び実施例７と同様に、２当量のアミダイトをカップリングに使用する。全合成条件を表２２に示す。

【表22】

【0226】

既知の方法を使用してｍＧ（本明細書では「ｍＧ樹脂」と称する）をＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＧ（ｉＢｕ）２５０樹脂（２４７μｍｏｌ／ｇ）にカップリングさせることから開始し、合成装置のセットアップについては図９を参照されたい。ＡＣＮを使用して４０．５０ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）のｍＧ樹脂をスラリー化し、底部に４０ミクロンの焼結メッシュフィルターフリットを備えた内径１０．１６ｃｍの反応器に入れる。初期樹脂深さは高さ約１ｃｍである。

【0227】

以下のように試薬溶液を調製する。

【0228】

全てのアミダイト溶液をＦｉｓｈｅｒロット番号２１２２１５のＡＣＮで調製した。以下のようにアミダイトをＡＣＮ溶媒中に溶解させる。溶解するまで混合する。分子篩ドライパックを密封ボトルに添加する。

【表23】

Ｃａｐ Ｂ１：
無水酢酸：Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓロット番号００００２３９１３１
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２０６４９６
１６５７ｍＬの無水酢酸及び２４８６ｍＬのＡＣＮを供給容器に充填した。
Ｃａｐ Ｂ２：
２，６－ルチジン：Ａｃｒｏｓロット番号Ａ０４２８３３２
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２０６４９６
２４８６ｍＬのルチジン及び１６５７ｍＬのＡＣＮを供給容器に充填した。
Ｃａｐ Ａ：
１－メチルイミダゾール：Ａｃｒｏｓロット番号Ａ０４２５７８９
ＡＣＮ：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２０６４９６
１６５７ｍＬのイミダゾールを充填した。６６２８ｍＬのＡＣＮを充填した。
０．２Ｍ水素化キサンタン硫化溶液：
水素化キサンタン：ＴＣＩロット番号ＱＬＸＫＣ－ＲＩ
ピリジン：Ｆｉｓｈｅｒｓロット番号２０８０５９
３７７５ｍＬのピリジンを充填した。１１４ｇのＸＨをピリジンボトルに充填した。溶解するまで混合する。
酸化溶液：
ヨウ素溶液（０．０５Ｍ）
Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌロット番号ＥＡ７０２－ＵＳ
１０Ｋｇの樽ストックを供給缶に充填した。
活性化剤溶液：
Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌロット番号ＥＡ９５２－ＵＳ
５Ｋｇの樽ストック溶液を供給缶に充填した。
３％ＤＣＡのトルエン溶液：
ＤＣＡ：Ｓｕｐｅｌｃｏロット番号６１０６９１１６
トルエン：Ｓｕｐｅｒｉｏｒロット番号ＦＨ１１３１３２６６
ロット番号１
１．１８，２０１ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．５６３ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。
ロット番号２
１．１８，４２８ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．５７０ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。
ロット番号３
１．１８，４８３ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．５７２ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。
ロット番号４
１．１８，５７５ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．５７５ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。

【0229】

全てのポンプ及び供給ラインに呼び水を差す。不活性化供給缶に入る途中でＡＣＮを分子篩の床に通過させた。ＡＣＮ、トルエン、及びＤＣＡのトルエン溶液を押圧により供給缶から供給し、自動流量制御弁で制御する。全ての他の供給には蠕動ポンプ及び供給容器を使用する。アミダイト溶液は、「ＡＭ．１Ｌ」とラベル付けし、かつ図９の弁Ｖ９０１Ａ～Ｖ９０８Ａに取り付けられた蠕動ポンプに接続した供給容器に別個に収容されている。ＭｅＭＯＰホスホロアミダイトはＡＭ供給容器のうちの１つを使用した。活性化剤溶液及びＤＥＡ溶液は、それぞれ、図９で「活性化剤 ５ｇａｌ」及び「ＤＥＡ」とラベル付けした供給容器に収容されている。

【0230】

合成時にホスホロアミダイトを添加するたびに、以下に説明するように、脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。サイクル２１ ＭｅＭＯＰホスホロアミダイトを添加した後のキャッピングは必要ではない。

【0231】

カップリング、酸化、硫化、及びキャッピング反応中、指定した反応時間の大半にわたって流動化をオン／オフサイクルで継続させた。流動化をオン／オフサイクルで行う必要はないことに留意されたい。流動化は、押し上げ及び押し下げなしに常にバブリングであり得る。この手順は研究規模の実験からの持ち越しである。研究規模で、小径の反応器では、最初に全ての樹脂ビーズを濡らして流動化させるのに役立つため、流動化中の押し上げ及び押し下げにはいくらかの利点があるが、その後の押し上げ及び押し下げにはそれ以上の利点はない。より大きい直径、例えば、この直径４インチの反応器では、オン／オフサイクルによる押し上げ及び押し下げは必要ではない。

【0232】

脱保護反応中、最初に樹脂床を２００～２５０ｍＬのＤＣＡ溶液で流動化させ、その後、流動化することなくプラグフロー反応様式の最後まで脱保護反応を継続させる。供給ゾーンベント弁（Ｖ９５２）が開くと同時に弁９５６又は弁９５８（Ｖ９５６、Ｖ９５８）のいずれか及び弁９５３を開くことにより窒素ガスを底部フィルタースクリーンに通して上方に吹き込むことによって流動化を行う。この手順で液体が樹脂床を通って下方にポンプ注入されると記載されている場合、これは、窒素圧が樹脂床の上部を押して液体を下方に押し通している間、反応器の底部の出口にある廃棄ポンプが目標設定値で動作することを意味する。蠕動ポンプの目的は、制御された速度で床を通って流れる液体を計量することである。

【0233】

トルエン洗浄：トルエン（３００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。窒素でトルエンを供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。トルエンを反応器に押し込む。樹脂床を２秒間ずつ４回流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂ビーズを膨張させ、樹脂床をリセットする。廃棄ポンプを始動させ、弁９５１で供給ゾーンの上部に窒素圧を加え、これにより、トルエンが樹脂床を通って下方に流れ始め、反応器の底部から出るようになる。更に２００ｍＬのトルエンを供給ゾーンに充填し、トルエンが底部からポンプ排出されると同時に反応器の上部に流入する。５００ｍＬのトルエンをポンプ排出するのに２分かかるように出口ポンプ速度を設定する。あらゆる残留している洗浄溶媒をフィルター底部から押し出して廃棄する。

【0234】

脱ブロッキング反応：脱ブロッキング溶液（表２２、２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。窒素で脱ブロッキング溶液を供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。脱ブロッキング溶液を反応器に押し込む。樹脂床を７秒間流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床をリセットする。廃棄ポンプを始動させ、弁９５１で供給ゾーンの上部に窒素圧を加え、これにより、ＤＣＡ溶液が樹脂床を通って下方に流れ始め、反応器の底部から出るようになる。同時に追加のＤＣＡ溶液を供給ゾーンに充填し、ＤＣＡ溶液が底部からポンプ排出されると同時に反応器の上部に流入する。脱ブロッキング溶液のポンプ排出は２回目の供給開始の５～３０秒前に始まる。この時間は調整可能である。目標は、新鮮な脱ブロッキング溶液が反応器に流入し始めたときに、樹脂床の上での逆混合を少なくするように脱ブロッキング溶液の液面が樹脂床の上部の少し上になるまでポンプ排出することである。出口ポンプ速度を、表２２に記載の所望の反応時間内に総ポンプ排出が達成されるように設定する。脱ブロッキング溶液を、供給制御弁が開いているパーセントを設定することによってポンプ排出するのとほぼ同じ速度で反応器に添加する。あらゆる残留している溶液をフィルター底部から押し出して廃棄する。

【0235】

洗浄１：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を、酸供給ラインを通して供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床反応器に押し込む。溶媒が反応器に入ると、溶媒が反応器の壁に噴霧する。５秒間にわたって１回流動化させる。反応器から押し出して廃棄する。

【0236】

洗浄２、洗浄３、洗浄４、洗浄５：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を、ＡＣＮ再利用缶から溶媒供給ラインを通して供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。スプレーコーンを介して溶媒を反応器に押し込むことにより、樹脂床を破壊することなく溶媒を均一に分布させることが可能になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。同じ洗浄を更に３回繰り返す。

【0237】

洗浄６、洗浄７、洗浄８：新鮮なＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。スプレーコーンを介して溶媒を反応器に押し込むことにより、樹脂床を破壊することなく溶媒を均一に分布させることが可能になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒をフィルター底部から押し出して再利用ＡＣＮ缶に入れる。同じ洗浄を更に２回繰り返す。

【0238】

洗浄９：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床反応器に押し込む。溶媒が反応器に入ると、溶媒が反応器の壁に噴霧する。５秒間にわたって１回流動化させる。ＡＣＮ溶媒をフィルター底部から押し出して再利用ＡＣＮ缶に入れる。

【0239】

カップリング反応：指定量のアミダイト（２００ｍＬ）をアミダイト活性化ゾーンにポンプ注入し、窒素で追い込む。活性化剤溶液（２００ｍＬ）をアミダイト活性化ゾーンにポンプ注入し、窒素で追い込む。窒素をアミダイトゾーンの底部に約２秒間バブリングすることによってこれらの２つを一緒に混合する。この混合物を供給ゾーンに押し込み、その後、反応器に押し込んで、樹脂上でのカップリング反応を開始する。カップリング時間（１０分間又は１５分間）にわたって約４５秒毎に１回、樹脂反応器を断続的に流動化させ、毎回１５秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。全反応時間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。反応時間が経過した後、カップリング溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0240】

溶媒洗浄：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）をアミダイト供給チューブに通してアミダイト活性化ゾーンに充填して、あらゆる残留している液滴を入口チューブから追い出し、その後、供給ゾーンに押し込み、その後、樹脂反応器に押し込む。反応器に入るときに溶媒が壁に噴霧する。流動化させることなく反応器に押し通して廃棄する。

【0241】

酸化反応（硫化の代わりに必要な場合）：ＡＣＮ（２００ｍＬ）をアミダイト活性化剤混合ゾーンに充填し、これにより、酸化反応の終了直後に樹脂を洗浄することができるようになる。溶媒がスプレーボールを通ってアミダイト活性化剤混合ゾーンに入り、全ての壁を洗浄する。０．０５Ｍヨウ素溶液（５３０ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込んで、樹脂上での酸化反応を開始する。酸化時間（約４分間）にわたって約３０秒毎に１回、樹脂反応器を断続的に流動化させ、毎回１２秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。全反応時間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。酸化溶液を５４０ｍＬ／分で６５秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。残留している酸化溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0242】

洗浄１：２００ｍＬのＡＣＮ洗浄溶媒を（アミダイト活性化剤混合ゾーンから）供給ゾーンに押し込み、その後、反応器に押し込んで樹脂を洗浄する。溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触し、樹脂床の上部に均一に噴霧し、樹脂床を平らに保ち、これにより、プラグフロー洗浄がより効率的になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。

【0243】

洗浄２：ＡＣＮ（２００ｍＬ）を、酸化溶液供給ラインを通して供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶媒を反応器に押し込む。反応器に入るときに溶媒が壁に噴霧する。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。

【0244】

洗浄３、洗浄４、洗浄５：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。スプレーコーンを介して溶媒を反応器に押し込むことにより、樹脂床を破壊することなく溶媒を均一に分布させることが可能になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。同じ洗浄を更に２回繰り返す。

【0245】

洗浄６：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床反応器に押し込む。溶媒が反応器に入ると、溶媒が反応器の壁に噴霧する。５秒間にわたって１回流動化させる。ＡＣＮ溶媒をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0246】

硫化（チオール化）反応（酸化の代わりに必要な場合）：ＡＣＮ（２００ｍＬ）をアミダイト活性化剤混合ゾーンに充填し、これにより、硫化反応の終了直後に樹脂を洗浄することができるようになる。０．２Ｍ水素化キサンタン溶液（６５０ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込んで、樹脂上での硫化反応を開始する。酸化時間（約８分間）にわたって約３０秒毎に１回、樹脂反応器を断続的に流動化させ、毎回１２秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。全反応時間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。水素化キサンタン溶液を７００ｍＬ／分のポンプ設定値で６０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。残留している水素化キサンタン溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0247】

洗浄１：２００ｍＬのＡＣＮ洗浄溶媒を（アミダイト活性化剤混合ゾーンから）反応器に押し込んで樹脂を洗浄する。溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。

【0248】

洗浄２：ＡＣＮ（２００ｍＬ）を、水素化キサンタン溶液供給ラインを通して供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶媒を反応器に押し込む。反応器に入るときに溶媒が壁に噴霧する。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。

【0249】

洗浄３、洗浄４、洗浄５：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。スプレーコーンを介して溶媒を反応器に押し込むことにより、樹脂床を破壊することなく溶媒を均一に分布させることが可能になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。同じ洗浄を更に２回繰り返す。

【0250】

洗浄６：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床反応器に押し込む。溶媒が反応器に入ると、溶媒が反応器の壁に噴霧する。５秒間にわたって１回流動化させる。ＡＣＮ溶媒をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0251】

キャッピング反応：キャッピング溶液Ａ及びキャッピング溶液Ｂ（各々３５０ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込んで、樹脂上でのキャッピング反応を開始する。樹脂反応器を２回流動化させ、毎回１２秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。両方の流動化の合計時間は約１分間である。反応溶液を４００ｍＬ／分で７０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。残留している反応溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0252】

洗浄１、洗浄２：ＡＣＮ（１００ｍＬ）を、キャッピングＡ溶液供給ラインを通して供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃し、ＡＣＮ（１００ｍＬ）をキャッピングＢ溶液供給ラインを通して供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶媒を反応器に押し込む。反応器に入るときに溶媒が壁に噴霧する。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。同じ洗浄をもう１回繰り返す。

【0253】

洗浄３、洗浄４：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。スプレーコーンを介して溶媒を反応器に押し込むことにより、樹脂床を破壊することなく溶媒を均一に分布させることが可能になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。同じ洗浄をもう１回繰り返す。

【0254】

洗浄５：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床反応器に押し込む。溶媒が反応器に入ると、溶媒が反応器の壁に噴霧する。５秒間にわたって１回流動化させる。ＡＣＮ溶媒をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0255】

タイミング：午前９時２２分に開始した典型的な完全なアミダイトサイクルの全タイミングは以下のとおりであった：
午前９時２２分 トルエン洗浄流動化を４回行う。
午前９時２８分 酸試薬溶液を注入し、１回流動化させる。
午前９時３５分 酸試薬溶液を排出する。
午前９時３７分 流動化洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。
午前９時３９分 再利用ＡＣＮでプラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前９時４１分 再利用ＡＣＮでプラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前９時４３分 再利用ＡＣＮでプラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前９時４４分 再利用ＡＣＮでプラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前９時４６分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前９時４８分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前９時５０分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前９時５２分 流動化洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。
午前９時５７分 カップリング試薬溶液を注入する。
午前１０時１４分 カップリング試薬溶液を排出する。
午前１０時１６分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。
午前１０時２１分 ＸＨ試薬溶液を注入する。
午前１０時３０分 ＸＨ試薬溶液を排出する。
午前１０時３２分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前１０時３５分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。
午前１０時３７分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前１０時３９分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前１０時４１分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前１０時４３分 流動化洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。
午前１０時４８分 キャッピング試薬溶液を注入する。
午前１０時５２分 キャッピング試薬溶液を排出する。
午前１０時５４分 流動化洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。
午前１０時５６分 流動化洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。
午前１０時５９分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前１１時１分 プラグフロー洗浄を行い、溶媒がコーンスプレーを通って反応器に入り樹脂と接触する。
午前１１時３分 流動化洗浄を行い、溶媒が反応器に入ると壁に噴霧する。

【0256】

このプロセスを、１日あたり５回、５回、６回、及び５回のアミダイトサイクルで４日間連続して実行した。樹脂を反応器内に一晩保持し、ＡＣＮ中に浸漬し、毎晩窒素下に置いた。

【0257】

最終サイクル：最終アミダイト（ＭｅＭＯＰ）が５’位にＤＭＴ保護基を有しないため、最終脱ブロッキングは必要ではない。最終ＭｅＭＯＰカップリング、洗浄、硫化、洗浄が完了した後、ＤＥＡ溶液で洗浄する。ＤＥＡ溶液（５００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。ＤＥＡ溶液を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込む。樹脂床を２回流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床をリセットする。両方の流動化の合計時間は約１分間である。ＤＥＡ溶液を１００ｍＬ／分で６００秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。同時に追加のＤＥＡ溶液（５００ｍＬ）を並行して供給ゾーンにポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。ＤＥＡ溶液を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。６００秒間に合計１Ｌが樹脂床を通ってポンプ注入される。残留しているＤＥＡ溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。このＤＥＡ処理をもう１回繰り返す。

【0258】

洗浄１、洗浄２：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。スプレーコーンを介して溶媒を反応器に押し込むことにより、樹脂床を破壊することなく溶媒を均一に分布させることが可能になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。同じ洗浄をもう１回繰り返す。

【0259】

洗浄３：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床反応器に押し込む。溶媒が反応器に入ると、溶媒が反応器の壁に噴霧する。５秒間にわたって１回流動化させる。ＡＣＮ溶媒をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0260】

洗浄４、洗浄５：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。スプレーコーンを介して溶媒を反応器に押し込むことにより、樹脂床を破壊することなく溶媒を均一に分布させることが可能になる。ＡＣＮ溶媒を樹脂床に通して３００ｍＬ／分でポンプ注入する。残留しているＡＣＮ溶媒を押し出してフィルター底部から廃棄する。同じ洗浄をもう１回繰り返す。

【0261】

洗浄６：ＡＣＮ溶媒（２００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。洗浄溶媒を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶媒を樹脂床反応器に押し込む。溶媒が反応器に入ると、溶媒が反応器の壁に噴霧する。５秒間にわたって１回流動化させる。ＡＣＮ溶媒をフィルターの底部から押し出して廃棄する。

【0262】

乾燥：樹脂をスラリー化して反応器から出す。これを実験室用フィルターで濾過する。窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで５～６時間乾燥させる。２．５ｇの樹脂結合物質を試料として取り出し、これには、反応器から洗浄した２ｇと、乾燥後のバルクからの０．５ｇが含まれている。試料を含む粗質量増加は７．９９ｇ／ｍｍｏｌであった。

【0263】

樹脂結合粗生成物の約半分に対してバルク切断及び脱保護（Ｃ／Ｄ）を一度に行う。Ｃ／Ｄを、樹脂を２８％水酸化アンモニウム水溶液（３０ｍＬ／ｇ樹脂）と混合し、かつ密封容器内で３８℃まで１８～２０時間加熱することによって達成した。圧力計、２５ｐｓｉｇ圧力解放安全弁、熱電対、加熱マントル、及び磁気撹拌子を備えた１．８５ＬのＡｃｅ－ｔｈｒｅａｄ圧力容器に、保護されたＡＮＧＰＴＬ３ ＡＳ（５６．１ｇ、６．７９８ｍｍｏｌ）及び水酸化アンモニウム（２８質量％）の水溶液（１．６８Ｌ、２０００ｇ、１００００ｍｍｏｌ）を充填した。薄いスラリーを密封し、３８℃まで加熱しながら一晩撹拌した。

【0264】

３８℃で１８時間後、火を止め、氷水浴を添加して反応器を室温未満まで冷却した。樹脂を沈降させ、秤量した上清液のアリコートを秤量した量のｍｉｌｌ－Ｑ水で希釈した。
アリコートの質量＝０．１７５４ｇ
ｍｉｌｌｉ－Ｑ水の質量＝２０．２７６８ｇ

【0265】

Ｃ／Ｄが完了したら、バルク反応混合物の後処理に進む。

【0266】

バルク溶液を濾過して、使用済みの樹脂を除去する。使用済みの樹脂を１５０ｍＬのＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１）で３回洗浄する。濾液と洗浄液を合わせ、ロータリーエバポレーター（４０℃浴）で濃縮して、アンモニアの大半を除去する。残り半分の樹脂結合物質にも同じ手順を繰り返す。ＵＰＬＣ結果は、最初の半分の試料で７５．３％のＦＬＰを示し、最初の半分の試料で７８．９％のＦＬＰを示した。詳細を、表１７、実施例６～１０のＵＰＬＣ結果及びＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡとの比較で見ることができる。表２３に記録したように、ＯＤ／ｕｍｏｌを決定した。純度補正後の粗収率は、物質の最初の半分で約５８％であり、残りの半分で６２％であった。比較すると、先の１ｋｇ ｃＧＭＰキャンペーンでは純度補正後の粗収率は５７％であった。

【表24】

【0267】

この物質をクロマトグラフィー精製により前処理したが、これは本明細書の範囲を超えたものである。

【0268】

実施例９：インプロセス統合マルチパス洗浄を備えたパイロット規模流動床合成装置。
ＡｎｇＰＴＬ３の同じアンチセンス鎖（図１０）を、実施例８の流動床反応器システムの修正バージョンで合成した。
５’ＭｅＭＯＰ＊ｆＧ＊ｆＵ＊ｆＡｆＵｍＡ ｆＡｍＣｍＣ ｆＵｍＵｍＣ ｍＣｆＡｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ３’

【0269】

本発明の流動床法を使用したこの分子の合成を本明細書に記載しており、これは、残りのホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む。実施例８と実施例９の主な違いは、このシステムを、インプロセス統合マルチパス洗浄を含むように修正し、かつサイクル２～９（ホスホロアミダイト３～１０）にキャッピングがなかったことである。サイクル２１ ＭｅＭＯＰホスホロアミダイトを添加した後のキャッピングは必要ではない。

【0270】

実験終了までに樹脂床の高さがアセトニトリル溶媒湿潤状態で５ｃｍ、乾燥した状態で４ｃｍに達する。最終脱ブロッキングステップの下降流部分中に、樹脂床の最大高さが６ｃｍに達する。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であるため、１５ｐｓｉｇである。実施例６、実施例７、及び実施例８と同様に、２当量のアミダイトをカップリングに使用する。全合成条件を表２４に示す。合成の開始から終了までの脱ブロッキング時間及び新鮮なＤＣＡ溶液量を表２５に示す。

【表25】

【0271】

アミダイト溶液調製に使用したＡＣＮのＫＦ：５６ｐｐｍ水

【表26】

【0272】

実施例９で使用した試薬及びロット番号を表２６に示す。

【表27】

【0273】

全てのアミダイト溶液をＦｉｓｈｅｒロット番号２１２２１５のＡＣＮで調製した。以下のようにアミダイトをＡＣＮ溶媒中に溶解させる。溶解するまで混合する。分子篩ドライパックを密封ボトルに添加する。
使用したＡＣＮロット：ＥＭＤロット番号５２２６１、ＥＭＤロット番号５２２６１、Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１

【表28】

【0274】

アミダイト分子量は以下のとおりであった。
ｍＡ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＡ（ｂｚ）ホスホロアミダイト、分子量８８７．９７
ｍＣ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＣ（Ａｃ）ホスホロアミダイト、分子量８０１．８７
ｍＧ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＧ（ｉＢｕ）ホスホロアミダイト、分子量８６９．９５
ｍＵ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＵ－ＣＥホスホロアミダイト、分子量７６０．８２
ｆＡ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＡ（ｂｚ）ホスホロアミダイト、分子量８７５．９３
ｆＣ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＣ（Ａｃ）ホスホロアミダイト、分子量７８９．８４
ｆＧ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＧ（ｉＢｕ）ホスホロアミダイト、分子量８５７．９
ｆＵ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＵ－ＣＥホスホロアミダイト、分子量７４８．８
ＭｅＭＯＰ、分子量５５６．５

【0275】

以下のように試薬溶液を調製する。
Ｃａｐ Ｂ１：
無水酢酸：Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓロット番号００００２３９１３１
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１
４８１ｍＬの無水酢酸及び７２２ｍＬのＡＣＮをボトルに充填する。
Ｃａｐ Ｂ２：
２，６－ルチジン：Ａｃｒｏｓロット番号Ａ０４２８３３２
アセトニトリル：ＥＭＤロット番号５２２６１
７２２ｍＬのルチジン及び４８１ｍＬのＡＣＮをボトルに充填する。
Ｃａｐ Ａ：
１－メチルイミダゾール：Ａｌｆａ Ａｅｓａｒロット番号５００９Ｊ２４Ｗ
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１
４８１ｍＬのイミダゾールを充填する。１９２４ｍＬのＡＣＮを充填する。
０．２Ｍ水素化キサンタン硫化溶液：
水素化キサンタン：ＴＣＩロット番号ＱＬＸＫＣ－ＬＩ
ピリジン：Ｆｉｓｈｅｒｓロット番号２０８０５９
３７７５ｍＬのピリジンを充填する。１１４ｇのＸＨをピリジンボトルに充填する。溶解するまで混合する。
酸化溶液：
ヨウ素溶液（０．０５Ｍ）
Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌロット番号ＥＡ７０２－ＵＳ
約９ｋｇの樽ストックを供給缶に充填した。
活性化剤溶液：
Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌロット番号ＥＡ７１３－ＵＳ
約５ｋｇの樽崇徳溶液を供給缶に充填する。
２０％ＤＥＡのアセトニトリル溶液：
ＤＥＡ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈロット番号ＳＴＢＪ５０６９
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１
４００ｍＬのＤＥＡをボトルに充填する。１６００ｍＬのＡＣＮをボトルに充填する。
３％ＤＣＡのトルエン溶液：
ＤＣＡ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｔｃｈロット番号ＭＫＣＱ９２
トルエン：Ｓｕｐｅｒｉｏｒロット番号ＨＸ１１３１５１２２
ロット番号１
１．１９，２４０ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．５９５ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。
ロット番号２
１．２０，３１１ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．６２８ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。
ロット番号３
１．１２，２７２ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．３８０ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。

【0276】

既知の方法を使用してｍＧ（本明細書では「ｍＧ樹脂」と称する）をＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＧ（ｉＢｕ）２５０樹脂（２４９μｍｏｌ／ｇ）にカップリングさせることから開始し、合成装置のセットアップについては図１１を参照されたい。ＡＣＮを使用して４０．４０ｇ（１０．０６ｍｍｏｌ）のｍＧ樹脂をスラリー化し、底部に４０ミクロンの焼結メッシュフィルターフリットを備えた内径１０．１６ｃｍの反応器に入れる。初期樹脂深さは高さ約１ｃｍである。

【0277】

全てのポンプ及び供給ラインに呼び水を差す。ＡＣＮを不活性化供給缶に入る途中で分子篩の床に通過させる。ＡＣＮ及びＤＣＡのトルエン溶液を押圧により供給缶から供給し、自動流量制御弁で制御する。全ての他の供給には蠕動ポンプ及び供給容器を使用する。アミダイト溶液は、「ＡＭ．１Ｌ」とラベル付けし、かつ図１１の弁Ｖ１１０１Ａ～Ｖ１１０８Ａに取り付けられた蠕動ポンプに接続した供給容器に別個に収容されている。ＭｅＭＯＰホスホロアミダイトはＡＭ供給容器のうちの１つを使用した。活性化剤溶液及びＤＥＡ溶液は、それぞれ、図１１で「活性化剤 ５ｇａｌ」及び「ＤＥＡ １Ｌ」とラベル付けした供給容器に収容されている。

【0278】

合成時にホスホロアミダイトを添加するたびに、以下に説明するように、脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。サイクル２～９（ヌクレオシド３～１０）にはキャッピングはない。サイクル２１ ＭｅＭＯＰを添加した後のキャッピングは必要ではない。

【0279】

カップリング、酸化、硫化、及びキャッピング反応中、指定した反応時間の大半にわたって流動化をオン／オフサイクルで継続させた。流動化をオン／オフサイクルで行う必要はないことに留意されたい。流動化は、押し上げ及び押し下げなしに常にバブリングであり得る。この手順は研究規模の実験からの持ち越しである。研究規模で、小径の反応器では、最初に全ての樹脂ビーズを濡らして流動化させるのに役立つため、流動化中の押し上げ及び押し下げにはいくらかの利点があるが、その後の押し上げ及び押し下げにはそれ以上の利点はない。より大きい直径、例えば、この直径４インチの反応器では、オン／オフサイクルによる押し上げ及び押し下げは必要ではない。

【0280】

先の実施例と同様に、供給ゾーンのベント弁（図１１のＶ１１５２）が開くと同時に弁１１５６又は弁１１５８（図１１のＶ１１５６、Ｖ１１５８）を開くことにより窒素ガスを底部フィルタースクリーンに通して上方に吹き込むことによって流動化を行う。

【0281】

この手順を通して、図１１、図１２、及び図１３を参照されたい。最初に、Ａ～Ｆの６つ全ての再利用ボトル及びＡ２～Ｃ２の３つ全ての再利用ボトルに約４００ｍＬのＡＣＮを手動で充填する。

【0282】

この手順で液体が樹脂床を通って下方にポンプ注入されると記載されている場合、これは、窒素圧が樹脂床の上部を押して液体を下方に押し通している間、反応器の底部の出口にある廃棄ポンプが目標設定値で動作することを意味する。蠕動ポンプの目的は、制御された速度で床を通って流れる液体を計量することである。

【0283】

脱ブロッキング：
最初に、前のステップからの再利用酸を使用して樹脂を流動化させ、樹脂床を膨張させ、ＡＣＮ溶媒を洗い流す。このステップを最初のアミダイトサイクルで新鮮なＤＣＡ／トルエン溶液を使用して行ったが、その後、残りのアミダイトでは再利用ＤＣＡ／トルエン溶液を使用して行った。弁１１２５Ａを再利用酸に向けて設定し、弁１１２５Ｆを開き、ベント弁１１５２を開き、ＦＣＶ１を開いて、再利用酸の第１の分量（２５０ｍＬ）を充填する。コントローラーは供給缶のバランスウェイトを使用して正しい質量を測定する。ＦＣＶ１を閉じ、窒素弁１１２５Ｂを開いて、窒素で供給ラインを供給ゾーンに追い込み、窒素弁１１２５Ｂを閉じる。ベント弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開き、スプレーコーンを通して酸溶液を反応器に押し込む。窒素弁１１５１を閉じ、ベント弁１１５２を開き、弁１１５３を開き、計量窒素弁１１５６を開く。これにより、反応器の底部に窒素が吹き込まれて、酸溶液でユーザー設定時間（２０秒間）にわたって樹脂が流動化する。計量窒素弁１１５６、弁１１５３、ベント弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開いて押し下げる。流動化が完了した後、弁１１５９を開き、ポンプ１１５９を始動させ、弁１１５４を弁１１６０に向け、弁１１６０を弁１１５７に向け、弁１１５７を廃棄に向ける。弁１１２５Ｆを開き、ＦＣＶ１を開く。これにより、再利用酸が底部からポンプ排出されると同時に供給ゾーンを通って反応器内に押し出される。再利用酸缶の中身を完全に空にする。量は、サイクル１の約１１５０ｍＬからサイクル２１の２６００ｍＬの範囲であった。表２５を参照されたい。サイクル１の新鮮な酸の量は、サイクル２の再利用酸の量になったといった具合である。したがって、サイクル２の第２の充填再利用酸の量は、最初の流動化部分に２５０ｍＬを使用したため、１４００ｍＬから２５０ｍＬを引いた量であった。このステップでは、全てのＡＣＮ溶媒を樹脂から完全に洗い流して廃棄する。全ての再利用酸が容器から空になったら、ＦＣＶ１を閉じる。窒素弁１１２５Ｂを開くことにより窒素で供給ラインを供給ゾーンに追い込む。全ての再利用酸をポンプ排出して廃棄する。廃棄までの総ポンプ排出時間は、サイクル１の約３分からサイク２１の４分の範囲であり、体積がサイクル毎に徐々に増加したため、徐々に増加した。

【0284】

弁１１２５Ａを新鮮な酸源に向け、弁１１２５Ｆを開き、ベント弁１１５２を開き、ＦＣＶ１を開いて、指定した質量の新鮮な酸を充填することにより、新鮮な酸の第１の分量（１５０ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。コントローラーは供給缶のバランスウェイトを使用して正しい質量を送達する。ベント弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開き、スプレーコーンを通して酸を反応器内に押し込んで、樹脂床の上部に均一に噴霧し、樹脂床を平らに保つ。弁１１５９を開き、弁１１５４を弁１１６０に向けて開き、弁１１６０を弁１１５７に向けて開き、弁１１５７を再利用酸缶に向けて開き、ポンプ１１５９を始動させる。脱ブロッキング溶液のポンプ排出は２回目の供給開始の５～３０秒前に始まる。この時間は調整可能である。目標は、新鮮な脱ブロッキング溶液が反応器に流入し始めたときに、樹脂床の上での逆混合を最小限に抑えるように脱ブロッキング溶液の液面が樹脂床の上部の少し上になるまでポンプ排出することである。出口ポンプ速度を、表２５に記載の所望の反応時間内に総ポンプ排出が達成されるように設定する。脱ブロッキング溶液を、供給制御弁１が開いているパーセントを設定することによってポンプ排出するのとほぼ同じ速度で反応器に添加する。弁１１２５Ｆを開き、窒素弁１１２５Ｂを開き、ＦＣＶ１をポンプ１１５９の流れとバランスのとれた値に開くことにより、酸溶液を反応器の底部からポンプ排出すると同時に酸溶液を反応器の上部に供給し、これにより、酸が樹脂プラグフローを流れている間、樹脂床の上部の酸の液面が維持されるようになる。ＦＣＶ１は、ユーザー指定の総酸質量に達すると閉じる。最初の充填に使用した１５０ｍＬを含む充填した酸の総量を表２５にサイクル別に列記する。例えば、サイクル１の総酸量は１４００ｍＬであり、最初の充填での１５０ｍＬと２回目の充填での１２５０ｍＬからなった。量は各サイクルで直線的に増加し、サイクル２１までに２８３０ｍＬに達した。ポンプ排出時間の終了時に、弁１１５３及び弁１１５５を開き、供給ゾーンへの窒素供給を閉じる。これにより、供給ゾーン内の圧力がユーザー設定値未満に降下する（例えば、圧力が１５ｐｓｉｇから９ｐｓｉｇに降下する）まで残留している酸が再利用酸缶に押し出され、このシーケンスにおいて自動化が次のステップに進む前に反応器が空になったことを確認する。

【0285】

脱ブロッキング後のインプロセス統合マルチパス洗浄
酸供給後のインプロセス統合マルチパス洗浄の第１のステップは、ボトルＡの溶媒を使用して樹脂を洗浄し、押し出して廃棄することある。次のステップでは、ボトルＢの溶媒を使用して樹脂に通してポンプ注入し、ポンプで送り返してボトルＡを再充填する。その後、ボトルＣの溶媒で反応器内の樹脂を洗浄し、ポンプ排出してボトルＢを再充填するといった具合である。図１１及び図１２を参照されたい。全体として、実験の洗浄スケジュールを表２７に詳述する。表中の「ｗ２」は、脱ブロッキング後の第２の洗浄部分である。これが樹脂床を通って洗浄し、反応器の底部からポンプ排出されてボトルＡに入る。表に示すように、「ｗ２」はサイクル２の脱ブロッキング後の第１の洗浄部分になる。表に列記したように、「ｗ３」はサイクル１の脱ブロッキング後の第３の洗浄部分であり、これがサイクル２の脱ブロッキング後の第２の洗浄部分になり、その後、これがサイクル３の脱ブロッキング後の第１の洗浄部分になるといった具合である。第７の洗浄部分は３つの部分、例えば、表のサイクル１のｗ７ａ、ｗ７ｂ、及びｗ７ｃに分割される。３つ全てが反応器を通ってポンプ注入され、個別にボトルＦに戻され、これにより、一緒にプールした混合した溶媒がサイクル２の第６の洗浄部分になるといった具合である。

【表29】

【0286】

弁１２２０１Ａ（供給ゾーンへの）、並びに窒素供給弁１２２０１Ｂ及び窒素供給弁１２２０１Ｃ（図１２）は、同じアクチュエーター空気ラインを共有し、それ故に、弁１２２０１が開くと、ボトルから供給ゾーンに押し込まれる。同様に、弁１２２００Ａ（反応器からの戻り）及びベント弁番号１２２００Ｂは、同じアクチュエーター空気ラインを共有し、それ故に、弁１２２００が開くと、指定したボトルが反応器から使用済み洗浄溶媒を受け取る。

【0287】

最初にベント弁１１５２を開き、弁１１２０１を開き、弁１１２０２を開く。窒素がボトルＡの内容物を供給ゾーンに押し込む。ボトルＡが完全に空になる。自動化システムは、ベント弁１１５２を閉じ、かつ供給ゾーン内の圧力がユーザー指定値まで上昇するまで待つことにより、ボトルＡが完全に空になったことを認識し、これは、全ての溶媒がボトルＡから供給ゾーンに移送され、窒素で供給ゾーンに追い込まれることを意味する。窒素弁１１５１を開き、弁１１４５をスプレーコーンに向けることにより溶媒を供給ゾーンからスプレーコーンを通して反応器に押し込んで、樹脂床の上部に均一に噴霧し、樹脂床を平らに保ち、これにより、洗浄がより効率的になる。弁１１５９を開き、弁１１５４を１１６０に向けて開き、弁１１６０を１１５７に向けて開き、弁１１５７を廃棄に向けて開く。ポンプ１１５９をオンにし、洗浄液を樹脂床に通してポンプ排出して廃棄する。ポンプ排出時間の終了時に、弁１１５１を閉じ、弁１１５３を開き、弁１１５５を開いて、ゾーン内の圧力がユーザー指定値未満になる（例えば、圧力が１５ｐｓｉｇから９ｐｓｉｇに降下する）まで残留している洗浄液を押し出して廃棄する。これにより、確実に全ての液体が反応器から押し出されて廃棄されるようになる。同様に、同時にポンプ１１５９を作動させ、これにより、全ての液体がポンプから除去されて廃棄されるようになる。廃棄されるのはボトルＡ～ボトルＦの洗浄のみである。これにより、トルエン及び酸の大部分が樹脂から除去され、押し出されて廃棄される。残りの洗浄はボトルＡ～ボトルＥに戻される。この記載の手順では、ボトルＢから溶媒を取り出し、その溶媒を反応器に通して押し込み、その後、ボトルＡに戻す手順を説明し、残りは同様である。ベント弁１１５２、弁１１２０１、弁１１２０３を開き、ボトルが空になるまで洗浄溶媒をボトルＢから供給ゾーンに押し込む。これは、ベント弁１１５２を閉じ、供給ゾーン内の圧力がユーザー設定値（９ｐｓｉｇ）超まで上昇するまで待つことによって自動システムにより確認され、これは、全ての液体が移送され、窒素で追い込まれることを示す。弁１１２０１及び弁１１２０３を閉じ、窒素弁１１５１を開き、弁１１４５をスプレーコーンに向け、洗浄溶媒を供給ゾーンからスプレーコーンに通して反応器に押し込んで樹脂の上部に押し出し、樹脂の上部に均一に噴霧し、樹脂床を平らに保つ。弁１１５９を開き、弁１１５４を弁１１２００に向け、弁１１２００を開き、弁１１２０２を開く。ポンプ１１５９をオンにし、これにより、溶媒が樹脂床を洗浄してボトルＡに戻るようになる。ユーザー指定のポンプ時間の終了時に、弁１１５３及び弁１１５５を開き、窒素弁１１５１を閉じ、供給ゾーン内の圧力がユーザー設定値未満になる（１５ｐｓｉｇから９ｐｓｉｇに降下する）まで待つ。これにより、全ての溶媒が反応器を通ってボトルＡに移送されるようになる。この手順を繰り返して、ボトルＣ内の溶媒を使用して樹脂床を洗浄し、この溶媒をボトルＢに戻し、その後、ボトルＤからボトルＣに戻すといった具合である。ユーザーは、洗浄のうちのいずれかを流動化させるかを指定する選択肢を有する。ユーザーが洗浄のうちの１つを流動化させることを選択した場合、洗浄液を反応器に移送した後であり、かつポンプ１１５９を始動させる前に、弁１１５２を開いた状態で反応器の底部から窒素が上方に吹き込まれる。この実験では、インプロセス統合マルチパス洗浄のいずれも流動化させなかった。ユーザーは、本システムのこれらの洗浄のうちのどの洗浄が酸供給ラインへの自動追い込みを行うかを指定する選択肢と、本システムのこれらの洗浄のうちのどの洗浄が供給ゾーン壁及び反応器壁の自動洗浄を行うかを指定する選択肢を有する。例えば、ユーザーが第２の洗浄中に供給ラインへの追い込み洗浄を行うことを選択したとする。この場合、ボトルＢからの洗浄溶媒が供給ゾーンから反応器に押し込まれた後、本システムが供給ラインに追い込むことができるように反応器にポンプ注入される前にそこに留まって待機する。これは、弁１１２５Ｃを開き、ポンプ番号１１３０を使用して、指定量のＡＣＮ（５０ｍＬ）溶媒を酸供給ラインに通して供給ゾーンにポンプ注入することによって行われる。弁１１２５Ｃを閉じ、窒素弁１１２５Ｂを開くことにより、溶媒が前方に追い込まれる。その後、窒素弁１１５１を開くことによって、追い込まれた溶媒が供給ゾーンから反応器に押し込まれる。その後、上述のように、反応器内で混合した溶媒が樹脂を通ってポンプ排出され、送り先ボトルＡに入る。また、例えば、ユーザーがボトルＦからのＡＣＮ溶媒洗浄中に反応器壁の洗浄を行うように指定したとする。この場合、ボトルＦからの溶媒が反応器に押し込まれた後、溶媒は、樹脂を通って押し込まれる前にそこに留まり、反応器壁の洗浄が行われるまで待機する。反応器壁の洗浄を以下のように行う。指定した質量（５０ｍＬ）が壁を洗浄するスプレーボールを通って供給ゾーンに押し込まれるまで、ベント弁１１５２を開き、弁１１３０Ｂを開き、ＦＣＶ２を開く。充填中に弁１１３０Ｂを開き、これは、スプレーボールがこの規模でより効果的に機能するのに役立ち、弁１１３０Ｂを通る窒素も溶媒を供給ゾーンに追い込むためである。その後、ＦＣＶ２を閉じ、弁１１３０Ｂを閉じ、ベント弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開き、弁１１４５を反応器内への壁噴霧デバイスに向ける。この手順をもう１回繰り返して、供給ゾーンの壁にもう１回噴霧し、反応器の壁にもう１回噴霧する。ここで、ボトルＦ及び両方の反応器壁洗浄からの混合洗浄溶媒は、上述のように、ポンプ１１５９を介して反応器内の樹脂を通ってボトル番号Ｅにポンプで送り返される。これらの向流洗浄の終了時に、ボトルＦは空になる。

【0288】

脱ブロッキング後のプラグフロー洗浄：
次のステップでは、反応器内の樹脂を新鮮なＡＣＮ溶媒で洗浄し、反応器からボトルＦにポンプ注入する。これは、プラグフロー洗浄プログラムを使用し、かつ送り先をボトルＦとして指定することによって行われる。プラグフロー洗浄プログラムでユーザーが選択することができる送り先は３つあり、ボトルＦ、ボトルＣ２、又は廃棄である。プラグフロー洗浄は以下のように達成される。指定したＡＣＮ溶媒質量（１５０ｍＬ）が壁を洗浄するスプレーボールを通って供給ゾーンに押し込まれるまで、ベント弁１１５２を開き、弁１１３０Ｂを開き、ＦＣＶ２を開く。充填中に弁１１３０Ｂを開き、これは、スプレーボールがこの規模でより効果的に機能するのに役立ち、弁１１３０Ｂを通る窒素が溶媒を供給ゾーンに追い込むためである。その後、ＦＣＶ２を閉じ、弁１１３０Ｂを閉じ、ベント弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開き、弁１１４５を反応器内へのスプレーコーンに向けて、樹脂床の上部に均一に噴霧し、樹脂床を平らに保つ。その後、弁１１５９を開いてポンプ１１５９を始動させ、かつ送り先（ボトルＦ、ボトルＣ２、又は廃棄）に応じて下流弁Ｖ１１５４、Ｖ１１６０、Ｖ１１５７、Ｖ１１２００、Ｖ１１３００を適所に設定することによって、洗浄溶媒が樹脂床を通ってポンプ注入される。この場合、送り先はボトルＦである。このステップを更に２回実行し、合計３回の１５０ｍＬプラグフロー洗浄液を反応器からボトルＦに流し込む。

【0289】

サイクル番号７までに、ボトルＡからの向流洗浄には約６００ｍＬが含まれていた（３つのプラグフロー洗浄ステップで４５０ｍＬの新鮮なＡＣＮ、反応器壁洗浄で１００ｍＬ、供給ライン追い込み洗浄で５０ｍＬ）。ボトルＢからの２回目の洗浄と５０ｍＬの追い込み洗浄には６００ｍＬが含まれていた。ボトルＣ、ボトルＤ、ボトルＥ、ボトルＦからの３回目から６回目の洗浄液は５５０ｍＬであった（反応器壁洗浄１００ｍＬとボトルＦからの４５０ｍＬとの合計）。脱ブロッキング後の全ての洗浄で樹脂を通って流れる洗浄溶媒の総量は約４Ｌであった。しかしながら、６００ｍＬの新鮮なＡＣＮのみ本システムに充填した。残りはボトルＡ～Ｆの再利用ＡＣＮであった。このインプロセス統合マルチパス洗浄戦略（表２７）により、洗浄がより効率的になる。サイクル１からサイクル２１までこの実行を通して試料を最終洗浄から採取し、ＮＭＲで測定した全ての試料は９９．９％超ＡＣＮであった。Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ合成装置も洗浄終了時に９９．９％ＡＣＮ溶媒を達成するが、同じ洗浄終点を達成するには１ｍｍｏｌあたり７倍多くの洗浄溶媒が必要である。反応器をその流体で洗浄することにより効率が向上し、これにより、充填床反応器内での溶媒洗浄よりも優れたものになる理由がいくつか存在する。（１）洗浄開始前に試薬が排出されるため、排出後に樹脂が保持する液体に加えて、前の液体との大量の液体逆混合が排除される。（２）樹脂床が反応中に流動化され、これにより、洗浄開始時に平らになり、チャネルがない状態になる。（３）反応器が完全に液体で満たされていないため、重力により溶媒が樹脂床の上部に完全に半径方向に分布するようになる。（４）洗浄が複数のより小規模な洗浄充填に分割され、これにより、逆混合の少ないより多くのプラグフローが可能になる。（５）インプロセス統合マルチパス洗浄により、洗浄溶媒をはるかにより効率的に使用することができるようになる。毎回の反応後に「最も汚れた」洗浄溶媒のみが本システムから出て廃棄され、新しいきれいな溶媒供給のみが最終洗浄区分に必要とされる。

【0290】

カップリング：
カップリングステップでは、ホスホロアミダイト及び活性化剤をアミダイトゾーンにポンプ注入し、それらをゾーン内で混合し、カップリング溶液を供給ゾーンに押し込み、その後、反応器に押し込み、ユーザー指定時間、例えば、１０分間にわたって反応器内でカップリング溶液を流動化させ、その後、反応溶液を反応器から押し出し、これにより、完全に排出されて廃棄されるようになる。より具体的には、指定したアミダイト（２００ｍＬ）をアミダイト活性化ゾーンにポンプ注入し、窒素で追い込む。活性化剤溶液（２００ｍＬ）をアミダイト活性化ゾーンにポンプ注入し、窒素で追い込む。混合し、この混合物を供給ゾーンに押し込み、その後、反応器に押し込んで、樹脂上でのカップリング反応を開始する。カップリング時間（１０分間又は１５分間）にわたって約４５秒毎に１回、樹脂反応器を断続的に流動化させ、毎回１５秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。例えば、アミダイト番号４を使用している場合、自動化により以下が行われる。ベント弁１１４２を開き、弁１１０４Ａを開き、ポンプ番号１１０４をオンにする。ユーザー指定の質量（２００ｍＬ）をポンプ注入する。本制御システムは、正しい量を測定するために、供給容器計量器上で質量の変化を監視している。ポンプ送り込みの終了時に、弁１１０４Ａ閉じ、弁１１０４Ｂを開いて、アミダイト供給溶液を窒素でアミダイトゾーンに追い込む。活性化剤の場合も同じことを行う。ベント弁１１４２を開き、弁１１２０Ａを開き、ポンプ１１２０をオンにして、ユーザー指定質量（２００ｍＬ）を充填し、その後、弁１１２０Ａを閉じ、弁１１２０Ｂを開いて、窒素でアミダイトゾーンに前方に追い込む。弁１１４３を開いて窒素を供給ゾーンからアミダイトゾーンに後方に吹き込み、アミダイト中に活性化剤を混合する。弁１１４１を開き、弁１１４３を開き、ベント弁１１４２を閉じ、ベント弁１１５２を開くことにより、カップリング溶液を供給ゾーンに押し込む。ベント弁１１５２を閉じ、弁１１４３を閉じ、窒素弁１１５１を開くことにより、カップリング溶液を供給ゾーンから反応器に押し込む。弁１１４５をスプレーコーンに向ける。ベント弁１１５２を開き、弁１１５３を開き、弁１１５８を開き、窒素を反応器の底部にバブリングして供給ゾーンのベントから出すことにより、バッチ反応を完全に混合する。交互に押し下げて液体を樹脂に押し込み、その後、ユーザー指定の周波数で窒素を上方に吹き込んでその流体を樹脂から出す。全反応時間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。押し下げたときに、ベント弁１１５２が閉じ、窒素弁１１５１が開き、弁１１５３が閉じる。押し上げたときに、弁は反対の位置にあり、これにより、窒素が反応器の底部に流れ、ベントから排出されるようになる。カップリングの終了時に、押し出されて廃棄される。これは、本システムが弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開き、弁１１５３を開き、弁１１５５を開くことを意味する。弁１１５４を弁１１６０に向け、弁１１６０を弁１１５７に向け、弁１１５７を廃棄に向ける。その後、弁１１０４Ａを開き、蠕動ポンプ番号１１０４を約１ｍＬ分だけ逆方向に起動させてデッドレグから試薬溶液を除去し、異なるサイクル中にアミダイト４がアミダイトゾーンに滴下する可能性を最小限に抑える。

【0291】

カップリング後の追い込み供給ライン洗浄：
これは、アミダイト弁１１０４を使用した実施例の続きである。弁１１０４Ｃを開き、ベント弁１１４２を開き、ポンプ１１３０を用いてユーザー指定量のＡＣＮ溶媒（１００ｍＬ）をポンプ注入する。その後、弁１１０４Ｃを閉じ、弁１１０４Ｂを開いて、溶媒を窒素でアミダイトゾーンに追い込む。ベント弁１１４２を閉じ、弁１１４１を開き、弁１１４３を開き、ベント弁１１５２を開き、追い込んだ洗浄溶媒を供給ゾーンに押し込む。その後、追い込んだ洗浄液を、スプレーコーンを通して反応器に押し込み、弁１１４３及び弁１１５２を閉じ、弁１１５１を開き、かつ洗浄溶媒を反応器の底部からポンプ排出して廃棄することによって反応器を加圧する。

【0292】

酸化：（硫化の代わりに必要な場合）：
０．０５Ｍヨウ素溶液（５３０ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込んで、樹脂上での酸化反応を開始する。酸化時間（約４分間）にわたって約３０秒毎に１回、樹脂反応器を断続的に流動化させ、毎回１２秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。全反応時間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。酸化溶液を５４０ｍＬ／分で６５秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。残留している酸化溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。より具体的には、ベント弁１１５２を開き、弁１１２３Ａを開き、かつユーザー指定のヨウ素溶液質量に達するまでポンプ１１２３で注入することによってヨウ素溶液を供給ゾーンに充填する。本制御システムは、ヨウ素供給容器のバランスウェイトを使用して、正しい量を送達する。正しいヨウ素送達質量に達した後、弁１１２３Ａを閉じ、弁１１２３Ｂを開き、これにより、窒素がヨウ素を供給ラインから供給ゾーンに追い込むようになる。ベント弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開き、弁１１４５をスプレーコーンに向け、ユーザー指定時間（約１０秒間）待機してヨウ素を供給ゾーンから樹脂の上部の反応器に押し込む。弁１１５９を開き、ヨウ素が樹脂を通して押し下げられたときに反応器の底部から押し出された約２０ｍＬのＡＣＮをポンプ排出するのに十分な時間にわたってポンプ１１５９をオンにする。カップリング反応で行ったのと同様に、ヨウ素溶液中で樹脂床を繰り返し流動化させることにより、酸化反応バッチ様式の実行に進む。ただし、流動化中に弁１１５８に加えて計量窒素弁１１５６を開くことにより、より活発な窒素バブリングを使用する。計量弁の設定及びＣＶにより、弁１１５６がより高い流量の窒素であり、弁１１５８がより低い流量の窒素であることに留意されたい。樹脂を通してヨウ素を押し下げることと、ユーザー指定時間にわたって指定の周波数を使用して流動化のために樹脂を通して窒素をバブリングすることを、酸化反応の所望の持続時間（例えば、４分間）にわたって交互に行う。全反応時間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。流動化酸化時間の終了時に、ヨウ素溶液をポンプ排出して廃棄する。これを行うために、窒素弁１１５１を開き、弁１１５９を開き、弁１１５４を弁１１６０に向け、弁１１６０を弁１１５７に向け、弁１１５７を廃棄に向ける。ポンプ１１５９をオンにしてポンプ排出して廃棄する。指定のポンプ排出時間が経過した後、窒素弁１１５１を閉じ、弁１１５３を開き、弁１１５５を開き、供給ゾーン内の圧力がユーザー指定値未満になる（１５ｐｓｉｇから９ｐｓｉｇに降下する）まで待ち、これにより、確実に全ての液体が押し出されて廃棄され、窒素で追い込まれるようになる。弁１１２３Ａを開き、ポンプ番号１１２３を約１ｍＬ分だけ逆方向に作動させる。これにより、デッドレグから試薬を除去し、供給ラインのその後のきれいな追い込みを確実にする助けとなり、これにより、供給ラインにヨウ素が残らず、他のステップ中にヨウ素が供給ゾーンに滴下する可能性がなくなる。

【0293】

酸化後のインプロセス統合マルチパス洗浄：
酸化後のインプロセス統合マルチパス洗浄は、Ａ２、Ｂ２、及びＣ２の３つのボトルのみを使用することを除いて、酸脱ブロッキング後のインプロセス統合マルチパス洗浄と非常に似ている。機器の詳細を図１３に示す。ボトルＡ２が最初に使用され、その洗浄溶媒が反応器の樹脂床に押し通されて廃棄される。その後、ボトルＢ２からの溶媒を使用して反応器を洗浄し、その溶媒が樹脂床を通ってボトルＡ２に押し込まれる。といった具合である。インプロセス統合マルチパス洗浄の終了時に、ボトルＡ２及びボトルＢ２は満たされているが、ボトルＣ２は空である。ボトルＣ２は、次に説明するように、反応器壁洗浄、追い込み洗浄、及びアミダイトゾーン洗浄によって再充填される。

【0294】

サイクル番号９までに、ボトルＡ２、ボトルＢ２、ボトルＣ２からの向流洗浄には約４５０ｍＬが含まれていた（４５０ｍＬの新鮮なＡＣＮが、カップリング後の追い込み１００ｍＬ、反応器壁洗浄１００ｍＬ、供給ライン追い込み洗浄５０ｍＬ、アミダイトゾーン洗浄１００ｍＬ、プラグフロー洗浄１００ｍＬからボトルＣ２に入る）。酸化後の全ての洗浄で樹脂を通って流れる洗浄溶媒の総量は約１８００ｍＬであった。しかしながら、４５０ｍＬの新鮮なＡＣＮのみ本システムに充填した。残りはボトルＡ２、ボトルＢ２、ボトルＣ２からの再利用ＡＣＮであった。このインプロセス統合マルチパス洗浄戦略により、洗浄がより効率的になる。サイクル１からサイクル２１までこの実行を通して試料を最終洗浄から採取し、ＮＭＲで測定した全ての試料は９９．９％超ＡＣＮであり、これは、Ｃｙｔｉｖａ合成装置が洗浄終了時に取得する値とほぼ同じであるが、Ｃｙｔｉｖａは、カップリング後と酸化後に使用した合計のＣｙｔｉｖａ洗浄液と比較して、１ｍｍｏｌあたり７倍多くの洗浄溶媒を使用する。硫化後の最終洗浄でもＮＭＲにより９９．９％超ＡＣＮであると測定された。

【0295】

酸化後の反応器壁洗浄：
所望の質量の溶媒（５０ｍＬ）が供給ゾーンに入るまで、ベント弁１１５２を開き、弁１１３０Ｂを開き、ＦＣＶ２を開く。溶媒がスプレーボールを通って供給ゾーンに入り、これにより、供給ゾーンの壁がスプレーされるようになる。弁１１３０Ｂを閉じ、窒素弁１１５１を開き、弁１１４５を壁スプレーに向け、これにより、反応器の壁にスプレーされるようになる。窒素弁１１５１を閉じ、ベント弁１１５２を開き、これらのステップを繰り返して、供給ゾーンの壁及び反応器の壁に噴霧しながら追加の洗浄溶媒（５０ｍＬ）を充填する。反応器内の溶媒及び樹脂の流動化はユーザーによって選択されるようにこのステップでは任意選択的であり、この実験では流動化は行われなかった。窒素弁１１５１を開き、弁１１５９を開く。弁１１５４を弁１１６０に向け、弁１１６０を弁１１３００に向ける。弁１１３０４を開き、ポンプ１１５９をオンにし、洗浄溶媒を反応器に通してボトルＣ２にポンプ注入する。ポンプ送り込み時間の終了時に、窒素弁１１５３を開き、弁１１５５を開き、弁１１５１を閉じる。供給ゾーン内のユーザー定義の圧力になる（１５ｐｓｉｇから９ｐｓｉｇに降下する）まで押し込み、溶媒が全て反応器から除去されてボトルＣ２に入るようにする。

【0296】

酸化後の追い込み供給ライン洗浄：
ベント弁１１５２を開き、弁１１２３Ｃを開き、ポンプ１１３０を始動させ、指定の質量の溶媒（５０ｍＬ）を供給ゾーンにポンプ注入する。弁１１２３Ｃを閉じ、弁１１３０Ｂを開いて、溶媒を供給ゾーンに前方に吹き込む。弁１１４５をスプレーコーンに向けて、樹脂床の上部に均一に噴霧し、樹脂床を平らに保つ。窒素弁１１５１を開いて、洗浄溶媒を反応器に押し込む。弁１１５９、弁１１３００、及び弁１１３０４を開く。弁１１５４を１１６０に向け、弁１１６０を弁１１３００に向ける。洗浄溶媒を反応器に通してボトルＣ２にポンプ注入する。ポンプ時間の終了時に、窒素弁１１５１を閉じ、弁１１５３を開き、弁１１５５を開き、供給ゾーン内の圧力がユーザー設定値未満になる（１５ｐｓｉｇから９ｐｓｉｇに降下する）まで残留している溶媒を反応器からボトルＣ２に押し出させる。

【0297】

アミダイトゾーン洗浄。
アミダイトゾーン洗浄により、少量の残留している液滴がアミダイトゾーンの壁から洗浄され、次のホスホロアミダイトサイクルのためにより多くのヨウ素もピリジンも水も含まない洗浄溶媒がボトルＣ２に保管されるため、洗浄溶媒から２倍の価値を得るために酸化（又は硫化）後にアミダイトゾーン洗浄が行われる。弁１１３０Ｅを開き、ポンプ１１３０を始動させてＡＣＮ（１００ｍＬ）を洗浄ボトルに送り込む。ポンプ１１３０を停止し、弁１１３０Ｅを閉じる。ベント弁１１４２を開き、弁１１３０Ｆを開き、スプレーボールを通して溶媒をアミダイトゾーンに押し込んで、ゾーン内の全ての表面に完全に噴霧し、前のアミダイト液滴を洗い流す。ソレノイドから弁１１３０Ｆへの空気が、洗浄容器の上部の窒素供給弁のアクチュエーターにも供給され、これにより、弁１１３０Ｆが開くと同時に窒素が洗浄容器を加圧するようになる。弁１１３０Ｆは、フェールオープンしてベントする三方弁である。ベント弁１１４２を閉じ、弁１１３０Ｆを閉じ（弁１１３０Ｆを閉じることにより、洗浄容器の上部のＮ２供給弁がベントに戻されるようにもなる）、弁１１４１を開き、弁１１４３を開き、ベント弁１１５２を開く。これにより、ユーザー指定時間（例えば、５秒間）にわたって全ての洗浄溶媒が供給ゾーンに押し込まれる。弁１１４１、弁１１４３、弁１１５２を閉じ、窒素弁１１５１を開く。弁１１５９を開き、弁１１５４を弁１１６０に向けて設定し、弁１１６０を弁１１３００に向けて設定し、弁１１３００を開き、弁１１３０４を開く。ポンプ１１５９を始動させ、ユーザー指定時間にわたって洗浄溶媒を樹脂床に通してボトルＣ２にポンプ注入する。ポンプ送り込みの終了時に、弁１１５３及び弁１１５５を開き、窒素弁１１５１を閉じ、窒素圧により残留している溶媒を反応器からボトルＣ２に押し出させる。供給ゾーン内の圧力がユーザー指定値を下回るまで待ち、これにより、全ての溶媒が反応器からボトルＣ２に押し出されたことが確認される。

【0298】

酸化後のプラグフロー洗浄：
前述のようにプラグフロー洗浄を行うが、洗浄溶媒（１００ｍＬ）をボトルＣ２に押し込む。

【0299】

カップリング反応：
キャッピング溶液Ａ及びキャッピング溶液Ｂ（各々１００ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、それらを窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込んで、樹脂上でのキャッピング反応を開始する。樹脂反応器を２回流動化させ、毎回１２秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。両方の流動化の合計時間は約１分間である。１分間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。反応溶液を２００ｍＬ／分で約１分間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。残留している反応溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。キャッピングステップの特定の自動化シーケンスは、酸化ステップで説明したように、窒素追い込み及び溶媒追い込みに弁１１２１Ｂ、弁１１２２Ｂ、弁１１２１Ｃ、弁１１２２Ｃを使用してキャッピング試薬が弁１１２１Ａ及び弁１１２２Ａを通って流れ込むことを除いて、酸化ステップの自動化と同様である。

【0300】

合成装置の別の実施形態は、キャッピング後の洗浄にも３つのインプロセス統合マルチパス洗浄ボトルＡ、ボトルＢ、及びボトルＣを使用する。ただし、この実験では、キャッピング後の洗浄液は廃棄に直接送られた。

【0301】

硫化（チオール化）反応（酸化の代わりに必要な場合）：
０．２Ｍ水素化キサンタン溶液（６５０ｍＬ）を供給ゾーンに充填し、窒素で追い込んで供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込んで、樹脂上での硫化反応を開始する。硫化流動化時間（約８分間）にわたって約３０秒毎に１回、樹脂反応器を断続的に流動化させ、毎回１２秒間にわたって樹脂反応器の底部に窒素をバブリングする。全反応時間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。水素化キサンタン溶液を７００ｍＬ／分で６０秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。残留している水素化キサンタン溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。硫化ステップの詳細な自動化シーケンスは、弁１１２４Ａ、弁１１２４Ｂ、及び弁１１２４Ｃを使用して水素化キサンタン溶液がポンプ番号１１２４で送り込まれることを除いて、酸化ステップの自動化と同様である。最初の２サイクル及び最後の３サイクルで硫化を使用した。最初の２サイクルの後に、ボトルＡ２、ボトルＢ２、及びボトルＣ２を取り除き、各々約４００ｍＬの新鮮なＡＣＮが充填された新たなボトルＡ２、ボトルＢ２、及びボトルＣ２と交換した。その後、最後の３サイクルの前に、ボトルＡ２、ボトルＢ２、及びボトルＣ２を取り除き、最初の２サイクルからの水素化キサンタン含有ＡＣＮ洗浄溶媒がまだ充填されている古いボトルＡ２、ボトルＢ２、及びボトルＣ２と交換した。これは、この実験では酸化後の洗浄に水素化キサンタン含有ＡＣＮ洗浄溶媒を使用しないことを選択したためであり、その逆も同様であった。

【0302】

酸化後の洗浄と同様に、硫化後の全ての洗浄で樹脂を通って流れる洗浄溶媒の総量は約１８００ｍＬであった。しかしながら、４５０ｍＬの新鮮なＡＣＮのみ本システムに充填した。残りはボトルＡ２、ボトルＢ２、ボトルＣ２からの再利用ＡＣＮであった。この場合もやはり、このインプロセス統合マルチパス洗浄戦略により、洗浄がより効率的になる。

【0303】

最終サイクル：
最終アミダイト（ＭｅＭＯＰ）が５’位にＤＭＴ保護基を有しないため、最終脱ブロッキングは必要ではない。最終ＭｅＭＯＰカップリング、洗浄、硫化、洗浄が完了した後、ＤＥＡ溶液で洗浄する。ＤＥＡ溶液（５００ｍＬ）を供給ゾーンに充填する。ＤＥＡ溶液を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。溶液を反応器に押し込む。樹脂床を２回流動化させて液体と固体を完全に接触させ、樹脂床をリセットする。両方の流動化の合計時間は約１分間である。１分間にわたって断続的ではなく持続的な流動化も許容される。ＤＥＡ溶液を１００ｍＬ／分で６００秒間にわたって樹脂床に通してポンプ注入し始める。同時に追加のＤＥＡ溶液（５００ｍＬ）を並行して供給ゾーンにポンプ注入し、これにより、ポンプ排出とほぼ同じ速度で反応器の上部に入るようになる。ＤＥＡ溶液を窒素で供給ゾーンに追い込み、供給チューブを一掃する。６００秒間に合計１Ｌが樹脂床を通ってポンプ注入される。残留しているＤＥＡ溶液をフィルターの底部から押し出して廃棄する。このＤＥＡ処理をもう１回繰り返す。

【0304】

以下のようにＡＣＮで十分に洗浄する。ＤＥＡ後のこれらのＡＣＮは全て、供給缶からの新鮮なＡＣＮを使用し、反応器から押し出して廃棄した。この手順で前述した他の追い込み洗浄と同様に、２００ｍＬのＡＣＮを使用してＤＥＡ供給ラインに追い込み、樹脂床のプラグフロー洗浄を行う。前述のプラグフロー洗浄と同じ手順を使用して、プラグフロー洗浄を各々１５０ｍＬのＡＣＮで３回行う。前述のように反応器の壁を５０ｍＬのＡＣＮで洗浄する（「反応器壁洗浄」）。前述のプラグフロー洗浄と同じ手順を使用して、プラグフロー洗浄を各々１５０ｍＬのＡＣＮで２回行う。

【0305】

乾燥：樹脂をスラリー化して反応器から出す。単一プレートフィルターに移す。窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで５～６時間乾燥させる。約３ｇの試料を除去した後に回収した乾燥樹脂の総重量は１１５．７ｇであった。

【0306】

切断、脱保護、及びＵＰＬＣのために少量の試料を採取した。結果は、表１７、実施例６～１０のＵＰＬＣ結果及びＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡとの比較に含まれている。純度は７７．８９％のＦＬＰであった。これは表中の他の流動床反応器実施例よりもわずかに低いが、これには特別な理由がある。サイクル１９でカップリング供給ラインに誤って少量の酸が入ってしまった。これにより、表に示すように、１９ｍｅｒで通常よりも大きな切断が起こった。このミスによりＦＬＰが約１．５％低下した。さもなければ、実行時のＦＬＰは７９～８０％であったと推測する。この実験の収率及び純度のデータを表１７に列記する。

【0307】

バルク切断及び脱保護（Ｃ／Ｄ）を、各ロットに樹脂結合粗生成物の約半分の２つのロットで行う。２つのロットの各々について、Ｃ／Ｄを、樹脂を２８％水酸化アンモニウム水溶液（３０ｍＬ／ｇ樹脂）と混合し、かつ密封容器内で３８℃まで１８～２０時間加熱することによって達成した。圧力計、２５ｐｓｉｇ圧力解放安全弁、熱電対、加熱マントル、及び磁気撹拌子を備えた１８５０ｍＬのＡｃｅ－ｔｈｒｅａｄ圧力容器に、保護されたＡＮＧＰＴＬ３ ＡＳ及び水酸化アンモニウム（２８質量％）の水溶液（１．６８Ｌ、２０００ｇ、１００００ｍｍｏｌ）を充填した。薄いスラリーを密封し、３８℃まで加熱しながら一晩撹拌した。５８．４３ｇの樹脂結合生成物を第１のロットに充填し、５６．９１ｇの樹脂結合生成物を第２のロットに充填した。

【0308】

３８℃で１８時間後、火を止め、氷水浴を添加して反応器を室温未満まで冷却した。樹脂を沈降させ、秤量した上清液のアリコートを秤量した量のｍｉｌｌ－Ｑ水で希釈した。各ロットをＵＰＬＣで分析した。ロット１のＦＬＰは７７．６％であり、ロット２のＦＬＰは７８．４％であった。前述したように、１９ｍｅｒの切断は両方のロットで２％であった。バルク溶液を濾過して、使用済みの樹脂を除去する。各ロットからの使用済み樹脂を１５０ｍＬのＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１）で３回洗浄する。今回は、アンモニアをロータリーエバポレーターで除去せず、代わりにＴＦＦによってＣ／Ｄ副生成物とともに除去した。得られた粗質量は、ロット１から２７．５２ｇであり、ロット２から２８．０７ｇであった。この物質をクロマトグラフィー精製により前処理したが、これは本明細書の範囲を超えたものである。

【0309】

実施例１０：インプロセス統合マルチパス洗浄を備えたパイロット規模流動床合成装置。
実施例１０は実施例９と非常に似ていた。しかしながら、実施例１０では、インプロセス統合マルチパス洗浄をキャッピング後にも行った。実施例１０は、全ての実施例の中で最も少ないＡＣＮ溶媒洗浄量（ｍＬ／ｍｍｏｌ）を実証した。

【0310】

ＡｎｇＰＴＬ３の同じアンチセンス鎖（図１０）を、実施例１０の流動床反応器システムの修正バージョンで合成した。
５’ＭｅＭＯＰ＊ｆＧ＊ｆＵ＊ｆＡｆＵｍＡ ｆＡｍＣｍＣ ｆＵｍＵｍＣ ｍＣｆＡｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ３’

【0311】

本発明の流動床法を使用したこの分子の合成を本明細書に記載しており、これは、残りのホスホロアミダイトを順次導入するための脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを含む。

【0312】

実験終了までに樹脂床の高さがアセトニトリル溶媒湿潤状態で５ｃｍ、乾燥した状態で４ｃｍに達する。最終脱ブロッキングステップの下降流部分中に、樹脂床の最大高さが６ｃｍに達する。実験中の樹脂床にわたる最大圧力降下は、その圧力が液体を樹脂床に押し通すために使用した供給窒素の圧力であるため、１５ｐｓｉｇである。最終サイクルを除いて、２当量のアミダイトをカップリングに使用する。２．１当量をＭｅＭＯＰアミダイトカップリングに使用した。全合成条件を表２８に示す。合成の開始から終了までの脱ブロッキング時間及び新鮮なＤＣＡ溶液量を表２９に示す。

【表30】

【表31】

【0313】

実施例９で使用した試薬及びロット番号を表３０に示す。

【表32】

【0314】

全てのアミダイト溶液をＦｉｓｈｅｒロット番号２１２２１５のＡＣＮで調製した。以下のようにアミダイトをＡＣＮ溶媒中に溶解させる。溶解するまで混合する。分子篩ドライパックを密封ボトルに添加する。

【0315】

使用したＡＣＮロット：ＥＭＤロット番号５２２６１、ＥＭＤロット番号５２２６１、Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１

【表33】

【0316】

アミダイト分子量は以下のとおりであった。
ｍＡ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＡ（ｂｚ）ホスホロアミダイト、分子量８８７．９７
ｍＣ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＣ（Ａｃ）ホスホロアミダイト、分子量８０１．８７
ｍＧ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＧ（ｉＢｕ）ホスホロアミダイト、分子量８６９．９５
ｍＵ ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＭｅＵ－ＣＥホスホロアミダイト、分子量７６０．８２
ｆＡ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＡ（ｂｚ）ホスホロアミダイト、分子量８７５．９３
ｆＣ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＣ（Ａｃ）ホスホロアミダイト、分子量７８９．８４
ｆＧ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＧ（ｉＢｕ）ホスホロアミダイト、分子量８５７．９
ｆＵ ＤＭＴ－２’－Ｆ－ｄＵ－ＣＥホスホロアミダイト、分子量７４８．８
ＭｅＭＯＰ、分子量５５６．５

【0317】

以下のように試薬溶液を調製する。
Ｃａｐ Ｂ１：
無水酢酸：Ｍａｃｒｏｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓロット番号００００２３９１３１
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１
４８１ｍＬの無水酢酸及び７２２ｍＬのＡＣＮをボトルに充填する。
Ｃａｐ Ｂ２：
２，６－ルチジン：Ａｃｒｏｓロット番号Ａ０４２８３３２
アセトニトリル：ＥＭＤロット番号５２２６１
７２２ｍＬのルチジン及び４８１ｍＬのＡＣＮをボトルに充填する。
Ｃａｐ Ａ：
１－メチルイミダゾール：Ａｌｆａ Ａｅｓａｒロット番号５００９Ｊ２４Ｗ
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１
４８１ｍＬのイミダゾールを充填する。１９２４ｍＬのＡＣＮを充填する。
０．２Ｍ水素化キサンタン硫化溶液：
水素化キサンタン：ＴＣＩロット番号ＱＬＸＫＣ－ＬＩ
ピリジン：Ｆｉｓｈｅｒｓロット番号２１２１４７
３７７５ｍＬのピリジンを充填する。１１４ｇのＸＨをピリジンボトルに充填する。溶解するまで混合する。
酸化溶液：
ヨウ素溶液（０．０５Ｍ）
Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌロット番号ＥＡ７０２－ＵＳ
約８ｋｇの樽ストックを供給缶に充填した。
活性化剤溶液：
Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌロット番号ＥＡ７１３－ＵＳ
約４．３Ｋｇの樽ストック溶液を供給缶に充填した。
２０％ＤＥＡのアセトニトリル溶液：
ＤＥＡ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈロット番号ＳＴＢＪ５０６９
ＤＥＡ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈロット番号ＳＨＢＫ７１９７
アセトニトリル：Ｆｉｓｈｅｒロット番号２１４１４１
４００ｍＬのＤＥＡをボトルに充填する。１６００ｍＬのＡＣＮをボトルに充填する。
３％ＤＣＡのトルエン溶液：
ＤＣＡ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｔｃｈロット番号ＭＫＣＱ９２
トルエン：Ｓｕｐｅｒｉｏｒロット番号ＨＸ１１３１５１２２
ロット番号１
１．１８，６６４ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．５７７ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。
ロット番号２
１．１９，５１６ｍＬのトルエンをカーボイに充填した。
２．６０４ｍＬのＤＣＡをカーボイに充填した。
３．カーボイを供給缶に充填した。

【0318】

既知の方法を使用してｍＧ（本明細書では「ｍＧ樹脂」と称する）をＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ２’ＯＭｅＧ（ｉＢｕ）２５０樹脂（２４９μｍｏｌ／ｇ）にカップリングさせることから開始し、合成装置のセットアップについては図１１を参照されたい。ＡＣＮを使用して４０．１８ｇ（１０．００ｍｍｏｌ）のｍＧ樹脂をスラリー化し、底部に４０ミクロンの焼結メッシュフィルターフリットを備えた内径１０．１６ｃｍの反応器に入れる。初期樹脂深さは高さ約１ｃｍである。

【0319】

全てのポンプ及び供給ラインに呼び水を差す。ＡＣＮを不活性化供給缶に入る途中で分子篩の床に通過させる。ＡＣＮ及びＤＣＡのトルエン溶液を押圧により供給缶から供給し、自動流量制御弁で制御する。全ての他の供給には蠕動ポンプ及び供給容器を使用する。アミダイト溶液は、「ＡＭ．１Ｌ」とラベル付けし、かつ図１１の弁Ｖ１１０１Ａ～Ｖ１１０８Ａに取り付けられた蠕動ポンプに接続した供給容器に別個に収容されている。ＭｅＭＯＰホスホロアミダイトはＡＭ供給容器のうちの１つを使用した。活性化剤溶液及びＤＥＡ溶液は、それぞれ、図１１で「活性化剤 ５ｇａｌ」及び「ＤＥＡ １Ｌ」とラベル付けした供給容器に収容されている。

【0320】

サイクル２～９（ヌクレオシド３～１０）にはキャッピングはない。サイクル２１ ＭｅＭＯＰを添加した後のキャッピングは必要ではない。合成時にホスホロアミダイトを添加するたびに、以下の違いを除いて、実施例９で説明するように、脱ブロッキングステップ、カップリングステップ、酸化ステップ（又は配列内にＰ＝Ｓ結合がある場合は硫化ステップ）、及びキャッピングステップを順次行う。

【0321】

追加の３つの１Ｌボトル、ボトルＡ３、ボトルＢ３、及びボトルＣ３をシーケンス自動ブロック弁とともに使用して、キャッピング後のインプロセス統合マルチパス洗浄も達成した。これらを図１１には示していないが、ボトルＡ２、ボトルＢ２、及びボトルＣ２を含む図１１のセクション及びＡ２、Ｂ２、及びＣ２の図１３の説明と同様である。ボトルＡ３、ボトルＢ３、及びボトルＣ３の弁は全て、図１３に示す弁と同じであるが、これらを、４００シリーズ、すなわち、弁４００Ａ、弁４００Ｂ、弁４００Ｃ、弁４０１Ａ、弁４０１Ｂ、弁４０１Ｃ、弁４０２、弁４０３、弁４０４としてラベル付けした。マルチパス洗浄手順は、実施例９の酸化／チオール化後の洗浄について記載した手順と同様であった。ボトルＡ３洗浄液からの全ての溶媒を樹脂床に通してポンプ注入して廃棄し、その後、ボトルＢ３洗浄液を樹脂床に通してボトルＡ３にポンプ注入し、ボトルＣ３洗浄液を樹脂床に通してボトルＢ３にポンプ注入した。その後、１５０ｍＬの未使用のＡＣＮ洗浄を２回行い、各々、樹脂床に通してポンプ注入し、ボトルＣ３にポンプで送り返した。最初の１５０ｍＬが供給ゾーンへの試薬供給チューブを洗浄し、その後、樹脂床プラグフローを洗浄した。２回目の１５０ｍＬの洗浄液が供給ゾーンの壁に噴霧し、その後、反応器の壁に噴霧し、その後、樹脂床プラグフローを洗浄した。全体として、マルチパス洗浄ボトルに各々３００ｍＬを事前に充填した後、合計１．３Ｌの新鮮なＡＣＮを各サイクルの洗浄に使用した。これには、脱ブロッキング後５５０ｍＬ、カップリング後１００ｍＬ、酸化後３５０ｍＬ、キャッピング後３００ｍＬが含まれる。比較すると、１０ｍｍｏｌ規模で、充填床合成装置は、典型的には、各サイクル中の溶媒押し出し及び溶媒洗浄に約８～１０Ｌの新鮮なＡＣＮを使用する。試料により、洗浄エンドポイントが各々、典型的に充填床合成装置を使用して達成されるものと同じである、すなわち、洗浄溶媒の最終分量中約９９．９％のＡＣＮが反応器から出ることが証明された。充填床反応器と比較してＡＣＮ洗浄溶媒の溶媒が約８５％削減される理由は以下のとおりである：試薬が洗浄前に反応器から排出されるため、樹脂床が反応中の流動化により平らにされ、チャネルがなくなるため、洗浄溶媒がコーンスプレー分布器によって樹脂上に効果的に分布するため、洗浄が複数のプラグフロー区分に分割されるため、かつ最も重要なことに、インプロセス統合マルチパス洗浄により洗浄溶媒の使用がはるかに効率的になるためである。例えば、脱ブロッキング後の洗浄には５５０ｍＬの未使用のＡＣＮのみが使用されるが、脱ブロッキング後の洗浄中に反応器を通る洗浄溶媒の総量は３５００ｍＬになる。同様に、酸化／チオール化後の洗浄には３５０ｍＬの未使用のＡＣＮのみが使用されるが、カップリング後の１００ｍＬの洗浄液がボトルＣ２にポンプ注入されると仮定して、酸化／チオール化後の洗浄中に反応器を通る洗浄溶媒の総量は１７００ｍＬになる。同様に、キャッピング後の洗浄には３００ｍＬの未使用のＡＣＮのみが使用されるが、キャッピング後の洗浄中に反応器を通る洗浄溶媒の総量は１２００ｍＬになる。最も重要なことに、洗浄を減らしても洗浄エンドポイントは変化しない。１サイクルあたり８００～１０００ｍＬ／ｍｍｏｌの総ＡＣＮ洗浄溶媒を使用する充填床合成装置実験における洗浄エンドポイントは９９．９％ＡＣＮであり、１サイクルあたり１３０ｍＬ／ｍｍｏｌの総ＡＣＮ洗浄溶媒を使用する流動床合成装置における洗浄エンドポイントは９９．９％ＡＣＮである。違いは、洗浄溶媒がインプロセス統合マルチパス洗浄を備えた流動床反応器でより効率的に使用されることである。

【0322】

実施例９と比較した別の違いは、実施例１０ではカップリング後の洗浄溶媒が酸化／チオール化後の洗浄溶媒に再利用されることである。カップリング後の追い込み洗浄の手順を以下のように実行する。

【0323】

カップリング後の追い込み供給ライン洗浄：
これは、アミダイト弁１１０４を使用した実施例の続きである（図１１）。弁１１０４Ｃを開き、ベント弁１１４２を開き、ポンプ１１３０を用いてユーザー指定量のＡＣＮ溶媒（１００ｍＬ）をポンプ注入する。その後、弁１１０４Ｃを閉じ、弁１１０４Ｂを開いて、溶媒を窒素でアミダイトゾーンに追い込む。ベント弁１１４２を閉じ、弁１１４１を開き、弁１１４３を開き、ベント弁１１５２を開き、追い込んだ洗浄溶媒を供給ゾーンに押し込む。その後、溶媒を、スプレーコーンを通して樹脂の上部の反応器に押し込み、樹脂を通して反応器の底部からポンプ排出し、ボトルＣ２にポンプ注入する。これを行うために、ベント弁１１５２を閉じ、弁１１４３を閉じ、窒素弁１１５１を開き、弁１１４５をスプレーコーンに向け、弁１１５９を開き、弁１１５４を弁１１６０に向け、弁１１６０を弁１１３００に向け、弁１１３００を開き、弁１１３０４を開き、ポンプ１１５９で送り込む。ユーザー指定のポンプ時間の終了時に、弁１１５９を閉じ、弁１１５３を開き、弁１１５５を開き、供給ゾーン内の圧力がユーザー指定値未満まで降下する（１５ｐｓｉｇから９ｐｓｉｇに降下する）まで残留している溶媒を窒素でボトルＣ２に押し出させる。

【0324】

この手順の他の全ての部分は、キャッピング後に複数パス洗浄も行うことを除いて、実施例９に記載した手順と同じである。

【0325】

乾燥：最終サイクル、ＤＥＡ処理、及び洗浄の後、樹脂をスラリー化して反応器から出す。単一プレートフィルターに移す。窒素を樹脂床に通して下方に吹き込んで６時間乾燥させる。少量の試料を含む回収した乾燥樹脂の総重量は１１６．２４ｇであった。

【0326】

切断、脱保護、及びＵＰＬＣのために少量の試料を採取した。結果は、表１７（実施例６～１０のＵＰＬＣ結果及びＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡとの比較）に含まれている。

【0327】

実施例６～９は全て同じ鎖を合成した。上述したように、実施例６は、代替の研究規模合成装置設計を実証する。この新たな設計には、アミダイト及び活性化剤以外の試薬の供給ゾーンはない。複数のヘッドを並列して使用することによりポンプの数が減り、ホスホロアミダイトサイクル毎に溶媒再利用が統合されているため、溶媒洗浄量が削減される。

【0328】

実施例７は、ホスホロアミダイトサイクル毎に過剰な脱ブロッキング試薬溶液の再利用が統合された代替の研究規模合成装置設計を実証しており、これは、脱ブロッキング反応に必要な酸量の減少に役立つ。この実施例では、１ｍｍｏｌあたり典型的にＣｙｔｉｖａ充填床合成装置で使用されるＤＣＡ溶液の２９％を使用した。

【0329】

実施例８は、規模拡大のための新たな反応器設計を実証する。新たな１０ｍｍｏｌ規模の反応器設計では、より多くの小規模な洗浄を行う異なる洗浄戦略を使用する。洗浄はプラグフローと流動化の組み合わせであり、試薬除去の効率を考慮して設計されている。コーンスプレー分布器を使用して樹脂床を平らに保ち、効率的なプラグフロー洗浄を可能にする。この実施例は、１ｍｍｏｌあたりＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ合成装置と比較して４０％少ない洗浄溶媒を実証している。トルエンを脱ブロッキング反応前に洗浄溶媒として使用して、樹脂を事前に膨張させてＡＣＮを除去し、これにより、脱ブロッキング反応がより効率的になる。

【0330】

実施例９では、脱ブロッキング前にトルエン洗浄を行わなかった。トルエンを再利用酸に置き換えた。あるサイクルで得た酸脱ブロッキング溶液の最もきれいな部分を使用して樹脂を事前に膨張させ、次のサイクルの開始時に樹脂からのＡＣＮで洗浄する。実施例９では、サイクル２から９までキャッピングを行わなかった。実施例９では、脱ブロッキング、酸化、及びチオール化の後にインプロセス統合マルチパス洗浄を行った。

【0331】

実施例１０は実施例９と同様であるが、キャッピング後のインプロセス統合マルチパス洗浄も有しており、カップリング後の洗浄液は酸化／チオール化後の洗浄に再利用されている。実施例１０は、本明細書の全ての他の実施例と比較して最も少ないＡＣＮ洗浄溶媒を有し、これは、１ｍｍｏｌあたりＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ合成装置と比較して８５％少ない洗浄溶媒であった。

【0332】

全ての流動床反応器実施形態のガイドを表３１に示す。

【表34】

【0333】

実施例１～５のＵＰＬＣクロマトグラムオーバーレイを図１４及び図１５に示し、実施例６～１０及び「ＡＫＴＡ比較１～４」実施例のＵＰＬＣクロマトグラムオーバーレイを図１６及び図１７に示す。これらは、流動床合成装置実験からの不純物プロファイルがＣｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ ＯＰ１００実験からの不純物プロファイルと類似していることを示している。Ｃｙｔｉｖａ ＡＫＴＡ ＯＰ１００実験に存在しない新たな不純物は流動床合成装置の実験にも存在しない。しかしながら、高純度実験では、ＡＫＴＡ合成装置の樹脂床高さが最大２ｃｍであった一方で、流動床反応器の樹脂床高さは最大３０ｃｍであった。また、純度の考慮に加えて、流動床合成装置は、ＡＫＴＡと比較して、より高い収率、約８５％少ない溶媒洗浄量、及びより低いＤＣＡ当量を達成した。

【0334】

実施例１～９におけるアンチセンス鎖の純度分析のためのイオンペアリングＵＰＬＣ法条件の概要。
機器：バイナリポンプ付きＷａｔｅｒｓ Ｉ－Ｃｌａｓｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ
カラム：５０×２．１ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７ｍｍ、１３０Ａ（製品番号１８６００３９４９）
カラム温度：５５℃
移動相Ａ：１０ｍＭ ＤＩＰＥＡ、１００ｍＭ ＨＦＩＰ水溶液
移動相Ｂ：アセトニトリル
勾配
●初期条件：９９％Ａ／１％Ｂ
●２５分かけてＢを１％から２４．３％に増加させる
●０．１分かけてＢを２４．３から１００％に増加させる
●Ｂを１００％で１．９分保持する
●０．１分かけてＢを１００％から１％に減少させる
●Ｂを１％で２．９分間保持する
●合計ランタイム３０分
流量：０．６ｍＬ／分
波長：２６０ｎｍ

【0335】

例示的な実施形態
実施形態１．オリゴヌクレオチドを床反応器内の固相樹脂に添加する方法であって、
固相樹脂に結合しているオリゴヌクレオチドの５’位から保護基を除去することと、
活性化アミダイト溶液を床反応器に添加することであって、活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化し、オリゴヌクレオチドの５’位で反応し、アミダイト内で見つけられる亜リン酸結合が酸化状態ＩＩＩのＰ原子を含む、添加することと、
Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換することと、を含む、方法。

【0336】

実施形態２．Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換する前又は変換した後に、キャッピング溶液を添加するステップを更に含み、カップリング部分がアミダイト溶液と反応しなかった場合、キャッピング溶液がカップリング部分をキャップし、これにより、更なるアミダイトがカップリング部分にカップリングすることができないようになり、キャッピング溶液が床反応器内を上下に流れるか、又は不活性ガスバブリング若しくは他の撹拌を使用して樹脂を流動化させるか、又は流動化／混合若しくは反応の流動化部分とそれに続くプラグフロー部分なしで樹脂床を通って下方に流れる、実施形態１に記載の方法。

【0337】

実施形態３．床反応器の底部に位置するフィルターにアミダイト溶液を通すことによって活性化アミダイト溶液を床反応器から除去するステップを更に含む、実施形態１に記載の方法。

【0338】

実施形態４．第１の洗浄溶液を床反応器に添加するステップを更に含み、第１の洗浄溶液の添加が保護基を除去した後に起こる、実施形態１に記載の方法。

【0339】

実施形態５．第２の洗浄溶液を床反応器に添加するステップを更に含み、第２の洗浄溶液の添加が、活性化アミダイト溶液が床反応器に添加された後に起こる、実施形態４に記載の方法。

【0340】

実施形態６．第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液が床反応器内を上下に流れ、方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を通すことによって第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を床反応器から個別に除去するステップを更に含む、実施形態５に記載の方法。

【0341】

実施形態７．第２の洗浄溶液の添加が、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換するステップの前に起こる、実施形態５に記載の方法。

【0342】

実施形態８．第３の洗浄溶液を床反応器に添加するステップを更に含み、第３の洗浄溶液の添加が、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換した後に起こる、実施形態５に記載の方法。

【0343】

実施形態９．第３の洗浄溶液が床反応器内を上下に流れ、方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに第３の洗浄溶液を通すことによって第３の洗浄溶液を床反応器から除去するステップを更に含む、実施形態８に記載の方法。

【0344】

実施形態１０．保護基がＤＭＴ基であり、保護基の除去が、オリゴヌクレオチドの５’位を、溶媒中に酸を含む活性化溶液と反応させることを含む、実施形態１に記載の方法。

【0345】

実施形態１１．方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに活性化溶液を通すことによって活性化溶液を床反応器から除去するステップを更に含む、実施形態１０に記載の方法。

【0346】

実施形態１２．床反応器内での上下の流れが、下方押圧中に反応器の上部に圧力を加え、その後、上方押圧中に反応器の上部から圧力を解放することによって達成される、実施形態１に記載の方法。

【0347】

実施形態１３．床反応器内での固体と液体の流動床混合が、窒素又は別のガスを反応器の底部に添加すること又は他の何らかのタイプの撹拌によって達成される、実施形態１に記載の方法。

【0348】

実施形態１４．床反応器及び活性化アミダイト溶液を備える、オリゴヌクレオチドを固相樹脂に添加するためのシステムであって、活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、床反応器内を上下に流れるか、又は不活性ガスバブリング若しくは他の撹拌により流動化する、システム。

【0349】

実施形態１５．床反応器が、加圧ガスが床反応器に入るのを許可する入口を備え、加圧ガス又は他の何らかのタイプの撹拌により、アミダイト溶液が床反応器内で固体と混合するようになる、実施形態１４に記載のシステム。

【0350】

実施形態１６．入口が床反応器の底部に配置されている、実施形態１５に記載のシステム。

【0351】

実施形態１７．床反応器が床反応器の上部から加圧され、圧力により、アミダイトが床反応器内を上下に流れるようになる、実施形態１４に記載のシステム。

【0352】

実施形態１８．第１の洗浄溶液と第２の洗浄溶液とが床反応器内で混合し、方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を通すことによって第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を床反応器から個別に除去するステップを更に含む、実施形態５に記載の方法。

【0353】

実施形態１９．洗浄溶媒が次の試薬を充填する前にフィルター反応器の底部から排出され、試薬が次の洗浄溶媒を充填する前にフィルター反応器の底部から排出され、樹脂床が混合されて、各サイクルにおいて選択された反応及び／又は洗浄中に選択された時点で不活性ガスバブリング又は液体の上下の流れによって樹脂粒子を試薬及び／又は洗浄溶媒中に懸濁させる、実施形態５に記載の方法。

【0354】

実施形態２０．試薬の第１の分量が反応器に充填され、第１の分量が反応の開始時に目標時間にわたって流動化されて、完全な接触を達成し、かつ樹脂膨張を達成し、その後、第１の分量が樹脂床プラグフロー様式によりポンプ注入されると同時に試薬の第２の分量を反応器の上部に同時に充填し、これにより、残りの試薬がプラグフローによりポンプ注入されるようになる、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、３、４、７、８、９、１０で実証した。

【0355】

実施形態２１．脱ブロッキング試薬溶液の最終区分がホスホロアミダイトサイクル毎に再利用され、これにより、脱ブロッキングの反応に必要な酸量が減少し、樹脂が膨張して脱ブロッキングの開始時に床がチャネルなしでリセットされ、未使用の脱ブロッキング試薬溶液とのプラグフロー反応前にＡＣＮが洗い流される、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例７、９、及び１０で実証した。

【0356】

実施形態２２．各洗浄が、完全に排出される一連の複数のより小規模な洗浄部分に分割され、これにより、１回の大規模な連続洗浄と比較して逆混合を最小限に抑えることができる、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、３、４、６、７、８、９、１０で実証した。

【0357】

実施形態２３．溶媒洗浄のうちのいくつか又は全てが流動化されず、洗浄が流動化部分から始まりプラグフロー部分が続くか、又は洗浄がプラグフロー洗浄の最中のどこか若しくは最後に流動化部分を有し、試薬除去の効率を考慮し、かつ圧力降下を克服するために流動化がいつ必要とされるかに応じてカスタム設計されている、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、３、４、６、７、８、９、１０で実証した。

【0358】

実施形態２４．流入する試薬及び洗浄溶媒がスプレーコーン又は他の分布器で樹脂床の上部に半径方向に均等に分布して、樹脂床を平らに保ち、かつ効率的なプラグフロー反応及び洗浄を可能にする、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例８、９、及び１０で実証した。

【0359】

実施形態２５．洗浄溶媒のよりきれいな画分がホスホロアミダイトサイクル毎にリサイクルされて再利用される、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例６、８、９、１０で実証した。

【0360】

実施形態２６．本明細書に記載されるように、インプロセス統合マルチパス洗浄が反応後に使用される、実施形態１９に記載の方法。溶媒部分が反応器に複数回通される。例えば、サイクル１での脱ブロッキング後の第６の溶媒洗浄部分がサイクル２での脱ブロッキング後の第５の洗浄部分になり、その後、これがサイクル３での脱ブロッキング後の第４の洗浄部分になるといった具合である。毎回の反応後に洗浄溶媒の「最も汚れた」区分のみが本システムから出て廃棄され、未使用の溶媒供給のみが最終洗浄区分に必要とされるため、インプロセス統合マルチパス洗浄により、洗浄溶媒のはるかにより効率的な使用が可能になる。この実施形態を、実施例９、１０で実証した。

【0361】

実施形態２７．反応器が、流動化を容易にするために、試薬又は洗浄溶媒が最初に反応器に入ったときにより大きい直径の上部セクションに拡張するより小さい直径の下部セクションを有する、実施形態１９に記載の方法。上向流不活性ガスが樹脂ビーズのうちのいくつか又は全てを押し上げてより大きい直径のセクションに入れ、ここで、壁効果をあまり受けることなく液体と固体が相互作用することができる。この実施形態を、実施例２、４、６、７で実証した。

【0362】

実施形態２８．樹脂床が各サイクルにおいて脱ブロッキング、カップリング、酸化、硫化、及びキャッピング反応ステップ中に流動化され／試薬液体と混合されて、完全な接触を達成し、かつ反応中に樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下も緩和する、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、３、４、６、７、８、９、１０で実証した。

【0363】

実施形態２９．溶媒洗浄の初期部分が流動化されて、洗浄中に樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下を緩和する、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例２、３、及び４で実証した。

【0364】

実施形態３０．樹脂膨張が主に流動化中に起こることが許可され、これにより、液体がその後に床を通って下方に流れて反応器の底部から出るときに圧力降下が緩和される、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、３、４、６、７、８、９、１０で実証した。

【0365】

実施形態３１．キャッピングがサイクルのうちのいくつかから省略される、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例９、１０で実証した。

【0366】

実施形態３２．反応のうちのいくつかが反応におけるいずれの時点でも流動化されず、プラグフロー接触のみ、例えば、未使用のＤＣＡ溶液が充填されたときに流動化なしで脱ブロッキングが行われる、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例７、９、１０で実証した。

【0367】

実施形態３３．不活性ガスが樹脂床を通って液体を押し下げ、反応器の出口にあるポンプ又は他の計量デバイスが床を通る液体の流量を制御する、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、３、４、６、７、８、９、１０で実証した。

【0368】

実施形態３４．アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的にゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、反応器に押し込まれる、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、４、６、７で実証した。

【0369】

実施形態３５．アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的にゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、反応器に押し込まれる前に供給ゾーンに押し込まれる、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例３、８、９、１０で実証した。

【0370】

実施形態３６．試薬が反応器に押し込まれる前に個々の供給ゾーンに充填される、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１、２、４、７で実証した。

【0371】

実施形態３７．試薬が反応器に押し込まれる前に共通の供給ゾーンに充填される、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例３、８、９、１０で実証した。

【0372】

実施形態３８．試薬が供給ゾーンではなく反応器に直接押し込まれる、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例６で実証した。

【0373】

実施形態３９．カップリング後の洗浄溶媒が酸化／チオール化後に洗浄溶媒中で再利用される、実施形態１９に記載の方法。この実施形態を、実施例１０で実証した。

【0374】

本明細書で概説した方法及び／又はプロセス及び／又は実施形態のうちのいずれかにより生成物（オリゴヌクレオチドを含む）が作製される様々な実施形態が存在する。例えば、以下の方法を使用して生成物を作製することができる。

【0375】

オリゴヌクレオチドを床反応器内の固相樹脂に添加する方法であって、
固相樹脂に結合しているオリゴヌクレオチドの５’位から保護基を除去することと、
活性化アミダイト溶液を床反応器に添加することであって、活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化し、オリゴヌクレオチドの５’位で反応し、アミダイト内で見つけられる亜リン酸結合が酸化状態ＩＩＩのＰ原子を含む、添加することと、
Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換することと、を含む、方法。

【0376】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換する前又は変換した後に、キャッピング溶液を添加するステップを更に含み、カップリング部分がアミダイト溶液と反応しなかった場合、キャッピング溶液がカップリング部分をキャップし、これにより、更なるアミダイトがカップリング部分にカップリングすることができないようになり、キャッピング溶液が床反応器内を上下に流れるか、又は不活性ガスバブリング若しくは他の撹拌を使用して樹脂を流動化させるか、又は流動化／混合若しくは反応の流動化部分とそれに続くプラグフロー部分なしで樹脂床を通って下方に流れる、プロセスを用いて作製することができる。

【0377】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、床反応器の底部に位置するフィルターにアミダイト溶液を通すことによって活性化アミダイト溶液を床反応器から除去するステップを更に含む、プロセスを用いて作製することができる。

【0378】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、第１の洗浄溶液を床反応器に添加するステップを更に含み、第１の洗浄溶液の添加が保護基を除去した後に起こる、プロセスを用いて作製することができる。

【0379】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、第２の洗浄溶液を床反応器に添加するステップを更に含み、第２の洗浄溶液の添加が、活性化アミダイト溶液が床反応器に添加された後に起こる、プロセスを用いて作製することができる。

【0380】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液が床反応器内を上下に流れ、かつ方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を通すことによって第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を床反応器から個別に除去するステップを更に含む、プロセスを用いて作製することができる。

【0381】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、第２の洗浄溶液の添加が、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換するステップの前に起こる、プロセスを用いて作製することができる。

【0382】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、第３の洗浄溶液を床反応器に添加するステップを更に含み、第３の洗浄溶液の添加が、Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換した後に起こる、プロセスを用いて作製することができる。

【0383】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、第３の洗浄溶液が床反応器内を上下に流れ、方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに第３の洗浄溶液を通すことによって第３の洗浄溶液を床反応器から除去するステップを更に含む、プロセスを用いて作製することができる。

【0384】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、保護基がＤＭＴ基であり、保護基の除去が、オリゴヌクレオチドの５’位を、溶媒中に酸を含む活性化溶液と反応させることを含む、プロセスを用いて作製することができる。

【0385】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに活性化溶液を通すことによって活性化溶液を床反応器から除去するステップを更に含む、プロセスを用いて作製することができる。

【0386】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、床反応器内での上下の流れが、下方押圧中に反応器の上部に圧力を加え、その後、上方押圧中に反応器の上部から圧力を解放することによって達成される、プロセスを用いて作製することができる。

【0387】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、床反応器内での固体と液体の流動床混合が、窒素又は別のガスを反応器の底部に添加すること又は他の何らかのタイプの撹拌によって達成される、プロセスを用いて作製することができる。

【0388】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、第１の洗浄溶液と第２の洗浄溶液とが床反応器内で混合し、方法が、床反応器の底部に位置するフィルターに第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を通すことによって第１の洗浄溶液及び第２の洗浄溶液を床反応器から個別に除去するステップを更に含む、プロセスを用いて作製することができる。

【0389】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、洗浄溶媒が次の試薬を充填する前にフィルター反応器の底部から排出され、試薬が次の洗浄溶媒を充填する前にフィルター反応器の底部から排出され、樹脂床が混合されて、各サイクルにおいて選択された反応及び／又は洗浄中に選択された時点で不活性ガスバブリング又は液体の上下の流れによって樹脂粒子を試薬及び／又は洗浄溶媒中に懸濁させる、プロセスを用いて作製することができる。

【0390】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、試薬の第１の分量が反応器に充填され、第１の分量が反応の開始時に目標時間にわたって流動化されて、完全な接触を達成し、かつ樹脂膨張を達成し、その後、第１の分量が樹脂床プラグフロー様式によりポンプ注入されると同時に試薬の第２の分量を反応器の上部に同時に充填し、これにより、残りの試薬がプラグフローによりポンプ注入されるようになる、プロセスを用いて作製することができる。

【0391】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、脱ブロッキング試薬溶液の最終区分がホスホロアミダイトサイクル毎に再利用され、これにより、脱ブロッキングの反応に必要な酸量が減少し、樹脂が膨張して脱ブロッキングの開始時に床がチャネルなしでリセットされ、未使用の脱ブロッキング試薬溶液とのプラグフロー反応前にＡＣＮが洗い流される、プロセスを用いて作製することができる。

【0392】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、各洗浄が、完全に排出される一連の複数のより小規模な洗浄部分に分割され、これにより、１回の大規模な連続洗浄と比較して逆混合を最小限に抑えることができる、プロセスを用いて作製することができる。

【0393】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、溶媒洗浄のうちのいくつか又は全てが流動化されず、洗浄が流動化部分から始まりプラグフロー部分が続くか、又は洗浄がプラグフロー洗浄の最中のどこか若しくは最後に流動化部分を有し、試薬除去の効率を考慮し、かつ圧力降下を克服するために流動化がいつ必要とされるかに応じてカスタム設計されている、プロセスを用いて作製することができる。

【0394】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、流入する試薬及び洗浄溶媒がスプレーコーン又は他の分布器で樹脂床の上部に半径方向に均等に分布して、樹脂床を平らに保ち、かつ効率的なプラグフロー反応及び洗浄を可能にする、プロセスを用いて作製することができる。

【0395】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、洗浄溶媒のよりきれいな画分がホスホロアミダイトサイクル毎にリサイクルされて再利用される、プロセスを用いて作製することができる。

【0396】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、本明細書に記載されるように、インプロセス統合マルチパス洗浄が反応後に使用される、プロセスを用いて作製することができる。溶媒部分が反応器に複数回通される。例えば、サイクル１での脱ブロッキング後の第６の溶媒洗浄部分がサイクル２での脱ブロッキング後の第５の洗浄部分になり、その後、これがサイクル３での脱ブロッキング後の第４の洗浄部分になるといった具合である。毎回の反応後に洗浄溶媒の「最も汚れた」区分のみが本システムから出て廃棄され、未使用の溶媒供給のみが最終洗浄区分に必要とされるため、インプロセス統合マルチパス洗浄により、洗浄溶媒のはるかにより効率的な使用が可能になる。

【0397】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、反応器が、流動化を容易にするために、試薬又は洗浄溶媒が最初に反応器に入ったときにより大きい直径の上部セクションに拡張するより小さい直径の下部セクションを有する、プロセスを用いて作製することができる。上向流不活性ガスが樹脂ビーズのうちのいくつか又は全てを押し上げてより大きい直径のセクションに入れ、ここで、壁効果をあまり受けることなく液体と固体が相互作用することができる。

【0398】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、樹脂床が各サイクルにおいて脱ブロッキング、カップリング、酸化、硫化、及びキャッピング反応ステップ中に流動化され／試薬液体と混合されて、完全な接触を達成し、かつ反応中に樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下も緩和する、プロセスを用いて作製することができる。

【0399】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、溶媒洗浄の初期部分が流動化されて、洗浄中に樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下を緩和する、プロセスを用いて作製することができる。

【0400】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、樹脂膨張が主に流動化中に起こることが許可され、これにより、液体がその後に床を通って下方に流れて反応器の底部から出るときに圧力降下が緩和される、プロセスを用いて作製することができる。

【0401】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、キャッピングがサイクルのうちのいくつかから省略される、プロセスを用いて作製することができる。

【0402】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、反応のうちのいくつかが反応におけるいずれの時点でも流動化されず、プラグフロー接触のみ、例えば、未使用のＤＣＡ溶液が充填されたときに流動化なしで脱ブロッキングが行われる、プロセスを用いて作製することができる。

【0403】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、不活性ガスが樹脂床を通って液体を押し下げ、反応器の出口にあるポンプ又は他の計量デバイスが床を通る液体の流量を制御する、プロセスを用いて作製することができる。

【0404】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的にゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、反応器に押し込まれる、プロセスを用いて作製することができる。

【0405】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的にゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、反応器に押し込まれる前に供給ゾーンに押し込まれる、プロセスを用いて作製することができる。

【0406】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、試薬が反応器に押し込まれる前に個々の供給ゾーンに充填される、プロセスを用いて作製することができる。

【0407】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、試薬が反応器に押し込まれる前に共通の供給ゾーンに充填される、プロセスを用いて作製することができる。

【0408】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、試薬が供給ゾーンではなく反応器に直接押し込まれる、プロセスを用いて作製することができる。

【0409】

上記の方法で作製される生成物を、プロセスであって、カップリング後の洗浄溶媒が酸化／チオール化後に洗浄溶媒中で再利用される、プロセスを用いて作製することができる。

【0410】

あるいは、他の生成物を他の方法を使用して作製することもできる。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【手続補正書】

【提出日】2023-08-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オリゴヌクレオチドを床反応器内の固体支持体に添加する方法であって、
前記固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドの５’位から保護基を除去することと、
活性化アミダイト溶液を前記床反応器に添加することであって、前記活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、前記床反応器内で上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化し、前記オリゴヌクレオチドの５’位で反応し、前記アミダイト内で見られる亜リン酸結合が酸化状態ＩＩＩのＰ原子を含む、添加すること、次いで
前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換することを含む、方法。

【請求項2】

前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換する前又は変換した後に、キャッピング溶液を添加するステップを更に含み、カップリング部分が前記アミダイト溶液と反応しなかった場合、前記キャッピング溶液が前記カップリング部分をキャップし、これにより、更なるアミダイトが前記カップリング部分にカップリングすることができないようになり、前記キャッピング溶液が前記床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化するか、又は流動化／混合若しくは前記反応の流動化部分とそれに続くプラグフロー部分なしで樹脂床を通って下方に流れる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記アミダイト溶液を通すことによって前記活性化アミダイト溶液を前記床反応器から除去するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

第１の洗浄溶液を前記床反応器に添加するステップを更に含み、前記第１の洗浄溶液の前記添加が前記保護基を除去した後に起こる、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

第２の洗浄溶液を前記床反応器に添加するステップを更に含み、前記第２の洗浄溶液の前記添加が、前記活性化アミダイト溶液が前記床反応器に添加された後に起こる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液が前記床反応器内を上下に流れ、前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を通すことによって前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を前記床反応器から個別に除去するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第２の洗浄溶液の前記添加が、前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換するステップの前に起こる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

第３の洗浄溶液を前記床反応器に添加するステップを更に含み、前記第３の洗浄溶液の前記添加が、前記Ｐ原子を酸化状態ＩＩＩから酸化状態Ｖに変換した後に起こる、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記第３の洗浄溶液が前記床反応器内を上下に流れ、前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記第３の洗浄溶液を通すことによって前記第３の洗浄溶液を前記床反応器から除去するステップを更に含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記保護基がＤＭＴ基であり、前記保護基の前記除去が、オリゴヌクレオチドの５’位を、溶媒中に酸を含む活性化溶液と反応させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記活性化溶液を通すことによって前記活性化溶液床反応器を除去するステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記床反応器内での前記上下の流れが、下方押圧中に前記反応器の上部に圧力を加え、その後、上方押圧中に前記反応器の上部から圧力を解放することによって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記床反応器内での固体と液体の流動床混合が、窒素又は別のガスを前記反応器の底部に添加すること又は他の何らかのタイプの撹拌によって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

床反応器及び活性化アミダイト溶液を備える、オリゴヌクレオチドを固体支持体に添加するためのシステムであって、前記活性化アミダイト溶液がアミダイトを含み、前記床反応器内を上下に流れるか、又は窒素バブリング若しくは他の撹拌により流動化する、システム。

【請求項15】

前記床反応器が、加圧ガスが前記床反応器に入るのを許可する入口を備え、前記加圧ガス又は他の何らかのタイプの撹拌により、前記アミダイト溶液が前記床反応器内で前記固体と混合するようになる、請求項１４に記載のシステム。

【請求項16】

前記入口が前記床反応器の底部に配置されている、請求項１５に記載のシステム。

【請求項17】

前記床反応器が前記床反応器の上部から加圧及び減圧され、前記圧力変動により、前記アミダイトが前記床反応器内を上下に流れるようになる、請求項１４に記載のシステム。

【請求項18】

前記第１の洗浄溶液と前記第２の洗浄溶液とが前記床反応器内で混合し、前記方法が、前記床反応器の底部に位置するフィルターに前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を通すことによって前記第１の洗浄溶液及び前記第２の洗浄溶液を前記床反応器から個別に除去するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項19】

洗浄溶媒が次の試薬を充填する前にフィルター反応器の底部から排出され、前記試薬が次の洗浄溶媒を充填する前に前記フィルター反応器の底部から排出され、前記樹脂床が混合されて、各サイクルにおいて選択された反応及び／又は洗浄中に選択された時点で不活性ガスバブリング又は前記液体の上下の流れによって前記樹脂粒子を前記試薬及び／又は前記洗浄溶媒中に懸濁させる、請求項５に記載の方法。

【請求項20】

前記試薬の第１の分量が前記反応器に充填され、前記第１の分量が前記反応の開始時に目標時間にわたって流動化されて、完全な接触を達成し、かつ樹脂膨張を達成し、その後、前記第１の分量が前記樹脂床プラグフロー様式によりポンプ注入されると同時に前記試薬の第２の分量を前記反応器の上部に同時に充填し、これにより、残りの試薬がプラグフローによりポンプ注入されるようになる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

脱ブロッキング試薬溶液の最終区分がホスホロアミダイトサイクル毎に再利用され、これにより、前記脱ブロッキングの反応に必要な酸量が減少し、前記樹脂が膨張して脱ブロッキングの開始時に前記床がチャネルなしでリセットされ、未使用の脱ブロッキング試薬溶液とのプラグフロー反応前にＡＣＮが洗い流される、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

各洗浄が、完全に排出される一連の複数のより小規模な洗浄部分に分割され、これにより、１回の大規模な連続洗浄と比較して逆混合を最小限に抑えることができる、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記溶媒洗浄のうちのいくつか又は全てが流動化されず、前記洗浄が流動化部分から始まりプラグフロー部分が続くか、又は前記洗浄がプラグフロー洗浄の最中のどこか若しくは最後に流動化部分を有し、試薬除去の効率を考慮し、かつ圧力降下を克服するために流動化がいつ必要とされるかに応じてカスタム設計されている、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

流入する前記試薬及び前記洗浄溶媒がスプレーコーン又は他の分布器で前記樹脂床の上部に半径方向に均等に分布して、前記樹脂床を平らに保ち、かつ効率的なプラグフロー反応及び洗浄を可能にする、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記洗浄溶媒のよりきれいな画分がホスホロアミダイトサイクル毎にリサイクルされて再利用される、請求項１９に記載の方法。

【請求項26】

インプロセス統合マルチパス洗浄をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項27】

前記反応器が、より大きい直径の上部セクションに拡張するより小さい直径の下部セクションを有する、請求項１９に記載の方法。

【請求項28】

前記樹脂床が各サイクルにおいて前記他の反応ステップ中に流動化され／試薬液体と混合されて、完全な接触を達成し、かつ反応中に前記樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下も緩和する、請求項１９に記載の方法。

【請求項29】

前記溶媒洗浄の初期部分が流動化されて、前記洗浄中に前記樹脂床を通って下方に流れるときにさもなければ高い圧力降下を緩和する、請求項１９に記載の方法。

【請求項30】

前記樹脂膨張が主に流動化中に起こることが許可され、これにより、液体がその後に前記床を通って下方に流れて前記反応器の底部から出るときに圧力降下が緩和される、請求項１９に記載の方法。

【請求項31】

キャッピングが前記サイクルのうちのいくつかから省略される、請求項１９に記載の方法。

【請求項32】

前記反応のうちのいくつかが前記反応におけるいずれの時点でも流動化されず、プラグフロー接触のみ、例えば、前記未使用のＤＣＡ溶液が充填されたときに流動化なしで脱ブロッキングが行われる、請求項１９に記載の方法。

【請求項33】

不活性ガスが前記樹脂床を通って液体を押し下げ、前記反応器の出口にあるポンプ又は他の計量デバイスが前記床を通る液体の流量を制御する、請求項１９に記載の方法。

【請求項34】

アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的に前記ゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、前記反応器に押し込まれる、請求項１９に記載の方法。

【請求項35】

アミダイト及び活性化剤溶液が別個のゾーンに充填され、任意選択的に前記ゾーン内で不活性ガスバブリングにより混合され、その後、前記反応器に押し込まれる前に供給ゾーンに押し込まれる、請求項１９に記載の方法。

【請求項36】

試薬が前記反応器に押し込まれる前に個々の供給ゾーンに充填される、請求項１９に記載の方法。

【請求項37】

試薬が前記反応器に押し込まれる前に共通の供給ゾーンに充填される、請求項１９に記載の方法。

【請求項38】

試薬が供給ゾーンではなく前記反応器に直接押し込まれる、請求項１９に記載の方法。

【請求項39】

カップリング後の洗浄溶媒が酸化／チオール化後に前記洗浄溶媒中で再利用される、請求項１９に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0108】

カップリング反応：脱ブロッキング洗浄後、次の連続ホスホロアミダイトをカップリングさせ、３’から５’に連続ステップで導入する。配列内でカップリングした各ホスホロアミダイトについて、配列内のホスホロアミダイトに対応するアミダイト溶液（表４に列記したもの）を使用して、本質的に以下に記載したようにカップリング反応手順を行う。弁８をＢに回す。毎回、弁９を閉じた状態で８ｍＬのＡＣＮをアミダイト供給ゾーンにポンプ注入することにより、アミダイトゾーン及び反応器への流路を２回予洗浄し、その後、弁９を開き、窒素圧で３０秒間押し出して廃棄する。最初に活性化剤溶液（３．６ｍＬ、１０当量）、その後、表４の適切なアミダイト溶液（３．６ｍＬ、２．０当量）を供給ゾーンにポンプ注入する。弁９及び弁２４を閉じ、供給ゾーン内の混合物を窒素圧で反応器に５秒間押し込む。

【手続補正3】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図14】

【手続補正4】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図15】

【手続補正5】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図16】

【手続補正6】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図17】

【国際調査報告】