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特表2024-500446内分泌撹乱評価のための細胞内分泌モデルにおけるバイオマーカー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-09
(54)【発明の名称】内分泌撹乱評価のための細胞内分泌モデルにおけるバイオマーカー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20231226BHJP
C12Q 1/26 20060101ALI20231226BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231226BHJP
G01N 33/74 20060101ALI20231226BHJP
C12N 5/073 20100101ALN20231226BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12Q1/26
G01N33/50 Z
G01N33/74
C12N5/073
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537634
(86)(22)【出願日】2021-12-17
(85)【翻訳文提出日】2023-08-03
(86)【国際出願番号】 EP2021086657
(87)【国際公開番号】W WO2022129615
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】20306607.1
(32)【優先日】2020-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】595040744
【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】523229089
【氏名又は名称】ワイエスラブ
【氏名又は名称原語表記】ＹＳＬＡＢ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ラット、パトリス
(72)【発明者】
【氏名】オリヴィエ、エロディ
(72)【発明者】
【氏名】デュト、メロディ
(72)【発明者】
【氏名】ワクー、アナイス
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045BB20
2G045CB01
2G045DA54
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ22
4B063QR58
4B063QR66
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AC14
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、胎盤細胞と、最小必須栄養素及び少量の血清からなる培養培地と、を含む、細胞培養物に関する。本発明はまた、内分泌撹乱物質を特定するために細胞培養物を使用する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかをインビトロで決定するための方法であって、前記方法が、ａ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物を、細胞培養物と接触させることであって、前記細胞培養物が、培養培地中で培養されたヒト胎盤内分泌細胞を含み、前記培養培地が、最小必須栄養素及び血清を含み、前記血清が、前記細胞培養物の前記培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する、こと、続いて、
ｂ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた前記培養培地中における、各々が前記ヒト胎盤内分泌細胞によって分泌された第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンを含む４つのホルモンのセットの発現レベルを測定して、前記第１のホルモン、前記第２のホルモン、前記第３のホルモン及び前記第４のホルモンの測定された発現レベルを得て
（前記セットは、プロゲステロンホルモン及びポリペプチドホルモン又はその誘導体を含む）、
前記第１のホルモン、前記第２のホルモン、前記第３のホルモン及び前記第４のホルモンの各々の前記測定された発現レベルを、前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触していない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触している、ヒト胎盤内分泌細胞を含有する細胞培養物からの培養培地において測定された前記第１のホルモン、前記第２のホルモン、前記第３のホルモン及び前記第４のホルモンのそれぞれの対照の発現レベルと比較すること、
ｃ）前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた前記細胞培養の前記ヒト胎盤内分泌細胞において、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性を測定して、前記Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性を得て、前記Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの前記測定された発現レベル及び／又は前記活性を、前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定された前記Ｐ２Ｘ７の対照の発現レベル及び／又は活性と比較すること、
ｄ）結論付けることであって、
ｉ）前記第１のホルモン、前記第２のホルモン、前記第３のホルモン及び前記第４のホルモンのうちの少なくとも１つの前記測定された発現レベルが、前記第１のホルモン、前記第２のホルモン、前記第３のホルモン及び前記第４のホルモンの前記それぞれの対照の発現レベルと有意に異なり、前記Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの前記測定された発現レベル及び／又は前記活性が、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意に異なる場合、前記化合物は内分泌撹乱物質であり、
ｉｉ）前記第１のホルモン、前記第２のホルモン、前記第３のホルモン及び前記第４のホルモンのうちの少なくとも１つの前記測定された発現レベルが、前記第１のホルモン、前記第２のホルモン、前記第３のホルモン及び前記第４のホルモンの前記それぞれの対照の発現レベルと有意に異なるが、前記Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの前記測定された発現レベル及び／又は前記活性が、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意には異ならない場合、前記の化合物が内分泌撹乱物質であるということは排除されず、
ｉｉｉ）前記Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの前記測定された発現レベル及び／又は前記活性のみが、前記それぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意に異なる場合、前記化合物は、内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記方法が、－ 測定することであって、
－ 前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた前記細胞培養物からの前記ヒト胎盤内分泌細胞における、インフラマソーム経路の前記活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、若しくは
－ 前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた前記細胞培養物からの前記ヒト胎盤内分泌細胞における、ミトコンドリア活性を測定し、測定されたミトコンドリア活性を得ること、
－ 又はそれら両方を測定すること、
－ 比較をすることであって、
－ 前記測定されたインフラマソーム活性を、前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定された前記インフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
及び／又は
－ 前記測定されたミトコンドリア活性を、前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定された前記ミトコンドリアの対照の活性と比較すること、並びに
ｄ）結論付けることであって、
＊前記測定されたインフラマソーム活性又は前記測定されたミトコンドリア活性が、前記それぞれの対照のインフラマソーム活性及び前記それぞれの対照のミトコンドリア活性と有意に異なる場合、前記化合物が内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、前記化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されない
と結論付けること、
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項3】
前記方法が、－ 前記内分泌細胞におけるＤＮＡ損傷の存在を測定して、測定されたＤＮＡ断片化を得ること、
－ 前記測定されたＤＮＡ損傷を、前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定された前記対照のＤＮＡ損傷と比較すること、及び
－ 結論付けることであって、
＊＊前記化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しないときに、
＊前記測定されたＤＮＡ損傷が、前記対照のＤＮＡ断片化と有意に異なる場合、前記化合物は、遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊前記測定されたＤＮＡ損傷が、前記対照のＤＮＡ損傷と有意には異ならない場合、前記化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊前記化合物が内分泌撹乱物質であるときに、
＊前記測定されたＤＮＡ損傷が、前記対照の断片化と有意に異なる場合、前記化合物は、遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、前記化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊前記測定されたＤＮＡ損傷が、前記対照の断片化と有意には異ならない場合、前記化合物は、遺伝毒性効果を有さない内分泌撹乱物質である、
と結論付けること、
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記方法が－ 発癌性刺激時に誘導されるホルモンの、前記内分泌細胞の前記培養培地における前記発現を測定し、測定された発癌性刺激を得ること、
－ 前記測定された発癌性刺激を、前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定される対照の発癌性刺激と比較すること、及び
－ 結論付けることであって、
＊＊前記化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しないときに、
＊前記測定された発癌性刺激が、前記対照の発癌性刺激と有意に異なる場合、前記化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊前記測定された発癌性刺激が、前記対照の発癌性刺激と有意には異ならない場合、前記化合物は内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊前記化合物が内分泌撹乱物質であるときに、
＊前記測定された発癌性刺激が、前記対照の発癌性刺激と有意に異なる場合、前記化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊前記測定された発癌性刺激が、前記対照の発癌性刺激と有意には異ならない場合、前記化合物は発癌性効果を有さない内分泌撹乱物質である、
と結論付けること、
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記方法が、－ 前記内分泌細胞のアロマターゼ酵素の活性を測定して、測定されたアロマターゼ活性を得ること、
－ 前記測定されたアロマターゼ活性を、前記内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている前記化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定された前記対照のアロマターゼ活性と比較すること、及び
ｄ）結論付けることであって、
＊＊前記化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しないときに、
＊前記測定されたアロマターゼ活性が、前記対照のアロマターゼ活性と有意に異なる場合、前記化合物は、妊孕性に影響を及ぼす内分泌撹乱物質であり、
＊前記測定されたアロマターゼ活性が、前記対照のアロマターゼ活性と有意には異ならない場合、前記化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊前記化合物が内分泌撹乱物質であるときに、
＊前記測定されたアロマターゼ活性が、前記対照のアロマターゼ活性と有意に異なる場合、前記化合物は、妊孕性に影響を及ぼす内分泌撹乱物質であり、
＊前記測定されたアロマターゼ活性が、前記対照のアロマターゼ活性と有意には異ならない場合、前記化合物は、妊孕性に影響を及ぼさない内分泌撹乱物質である、
と結論付けること、
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
前記測定値と前記対照値とが、±１５％異なるときに、有意差が存在する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ペプチドホルモンが、ベータ絨毛性ゴナドトロピンホルモンすなわちβｈＣＧ、又はその誘導体のうちの１つ、例えばグリコシル化βｈＣＧ、及びヒト胎盤ラクトゲンすなわちｈＰＬである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記インフラマソーム経路の活性化が、カスパーゼ－１タンパクの活性、並びに／又はＩＬ１βの発現及び／若しくは分泌を評価することによって測定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
キットであって、－ ヒト胎盤内分泌細胞を含む細胞培養物と、
－ 胎盤細胞によって分泌される４つのホルモンの発現を測定するための手段であって、前記４つのホルモンが、胎盤細胞によって分泌される、プロゲステロンホルモン及びペプチドホルモン又はその誘導体を含む手段と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体の前記発現及び／又は前記活性化を測定するための可能な手段と、
を含む、キット。
【請求項10】
細胞培養物であって、－ ヒト胎盤内分泌細胞；及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地、
を含む細胞培養物であって、
前記血清が、前記培養培地の総重量と比較して、１．５～３．５重量％、好ましくは約２．５重量％に相当する、細胞培養物。
【請求項11】
前記胎盤内分泌細胞が、胎盤細胞株である、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項12】
前記内分泌細胞が、細胞性栄養膜胎盤細胞である、請求項１０又は１１に記載の細胞培養物。
【請求項13】
前記内分泌細胞が、自身が培養される支持体にしっかりと付着している、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項14】
前記内分泌細胞が、胎盤細胞株ＪＥＧ－３、特に、ＡＴＣＣに番号ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６で寄託された胎盤細胞株である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項15】
化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかをインビトロで決定するための、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の細胞培養物の使用であって、前記化合物が、プロゲステロンホルモン及びポリペプチドホルモン又はその誘導体を含む、４つのホルモンのセットのうちの少なくとも１つのホルモンの発現レベルを調節し、
かつ、
前記化合物が、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの前記発現及び／又は前記活性化を調節する、というとき、前記化合物が内分泌撹乱物質であるとされる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、内分泌細胞に関し、特に毒物学及び内分泌撹乱物質評価の分野におけるそれらの使用に関する。
【0002】
世界保健機関は、内分泌撹乱化学物質（Endocrine Disrupting Chemical、ＥＤＣ）を、内分泌系の機能を変化させ、その結果、無傷の生物、又はその子孫、又は（亜）集団において健康への悪影響を引き起こす外因性物質又は混合物と定義している（ＷＨＯ、２００２年）。ＥＤＣ及び潜在的なＥＤＣは、ほとんどが人工のものであり、食品及びパーソナルケア製品中の、プラスチック、金属、添加剤又は汚染物質などの様々な材料中に見出されるので、ヒトはＥＤＣに継続的に曝露されている。
【0003】
欧州連合の定義によれば、内分泌撹乱化学物質（「内分泌撹乱物質」）は、ホルモン系の機能を変化させ、その結果として有害作用を引き起こす物質である。
【0004】
ＥＤＣは、妊娠中の母体組織を含むいくつかのヒト組織において見出される：ビスフェノールＡ、トリクロサン、フタレート、及びパラベンは、妊婦の尿において特定されており、フタレートは、臍帯血試料において特定されている。
【0005】
問題は、妊娠中のＥＤＣへの曝露が、母親及び乳児の両方にとって有害である多くの有害な妊娠転帰をもたらし得ることである。
【0006】
フタレート、主にジブチルフタレートは、妊娠期間の短縮及び早産によって胎児発育に悪影響を及ぼす可能性があり、アルキルフェノールは、自然流産に関連し、パラベンは、出産転帰及び早産に影響を及ぼす可能性があり、トリクロザンは、妊娠期間を混乱させる可能性があり、フタレート及びビスフェノールは、胎盤の成長及び機能を潜在的に妨害し、妊娠高血圧腎症をもたらす可能性がある。妊娠高血圧腎症は、多系統妊娠特異性障害であり、世界的に見て、罹患及び死亡の主要な原因となっている。妊娠高血圧腎症だけでなく流産も、胎盤機能不全に関連している。
【0007】
妊娠のリスクを研究するために胎盤に対して行われた研究のほとんどは、胎盤を、胎児の発達に必要な器官としてではなく、母親と胎児との間の障壁とみなしている。分子量１０００ダルトン未満の化学物質は、母体から胎児へ胎盤を容易に通過し、農薬、金属、ＥＤＣのほとんどは、分子量１０００未満であるため、胎盤は、真の障壁とは言えない。母親から胎児へのこの潜在的な移動は、ヒト胎盤において濃縮し得る、パラベン、アルキルフェノール、ビスフェノール、及び３－ベンジリデンカンファーを特定した研究によって確認された。
【0008】
妊娠障害をもたらすＥＤＣの細胞機序は、未だ不明である。
【0009】
ＷＨＯ及び欧州連合の定義によれば、ホルモン産生の改変が形式的には有害作用に関連付けられない場合、化学物質は、内分泌撹乱物質そのものであるとはみなされない。したがって、これらの化合物を、一意的に特定する試験を提供することが不可欠である。
【0010】
内分泌撹乱物質を特定するためのいくつかの方法が、当技術分野において説明されている。例えば、国際公開第２００７１１３２０４号は、そのような種類の化合物を特定することを可能にするチップアレイを開示している。国際公開第２０１１０３２２８４号は、内分泌撹乱物質を特定することを可能にするステロイド生合成ノックダウン核酸を含む細胞モデルを開示している。
【0011】
しかしながら、これらの方法は、実際に特異的ではなく、ホルモン分泌の調節とヒトの健康における結果との間の関連を、正確に評価してはいない。
【0012】
化合物がＰ２Ｘ７の発現を誘導することができることは、当技術分野で公知である。これは、ベンゾ（Ａ）ピレンの代謝を評価する、本発明者らの先行文献であるＡｎａｉｓ Ｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．－Ｔｏｘｙｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ－２０１６－ｐｐ ７６－８５の場合である。しかしながら、この化合物は真の内分泌撹乱物質として分類されたことはない。この文献において、著者らは、１０％血清を含有する培地中で内分泌細胞を培養し、血清の処理及び除去後にはアポトーシスが観察されないということを見出した。この文献は、ベンゾ（Ａ）ピレンが内分泌撹乱物質であるということも、Ｐ２Ｘ７が内分泌撹乱物質と関連しているということも意図せず、確立もしていない。
【0013】
したがって、内分泌撹乱物質を明確に特定することができる新しい効率的な方法を提供する必要がある。
【0014】
本発明の１つの目的は、上記の当該技術分野に欠けている点を克服することである。
【0015】
本発明の別の目的は、内分泌撹乱物質を特定するための新規で効率的なモデルを提供することである。
【0016】
本発明の更に別の目的は、ホルモン分泌に対して効果を有する化合物が、内分泌撹乱物質であるかどうかを、明確に特定する方法を提供することである。
【0017】
したがって、本発明は、
－ 内分泌細胞、好ましくは胎盤細胞；及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地、
を含む細胞培養物（ただし、血清が、培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）に関する。
－ 内分泌細胞、好ましくは胎盤細胞；及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地、
を含む細胞培養物（ただし、血清が、培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）に関する。
【0018】
本発明は、最小必須栄養素及び所定量の血清を含む特定の培養培地中で培養される内分泌細胞が、生存可能であり、増殖することができるが、化学物質に対してより感受性が高くなり、したがって、内分泌撹乱物質を検出及び分類するための理想的なモデルを構成するという、本発明者らによってなされた予想外の観察に基づいている。
【0019】
上記培養培地に属する内分泌細胞は、ホルモンを産生及び放出することができる細胞である。これらの細胞は、有利には、精巣内分泌細胞、卵巣内分泌細胞、及び胎盤内分泌細胞、又は少なくとも１つのホルモンを分泌することができる任意の細胞であり得る。
【0020】
細胞培養培地は、一般に、適切なエネルギー源及び細胞周期を調節する化合物を含む。典型的な培養培地は、補足的なアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコースから構成される。栄養素に加えて、培地はまた、ｐＨ及び浸透圧を維持するのに役立つ。
【0021】
血清は、増殖因子、ホルモン、及び付着因子の供給源として提供される。これは、仔ウシ若しくはウシの血清、又は特に恒常性、細胞の生存、増殖を可能にする因子を含む人工的に再構成された血清であり得る。血清は、好ましくは「補足物を除去」されるが、補足物の成分が、当技術分野において周知の技術に従って、タンパク質沈殿／凝固を誘導するために熱によって不活性化される。
【0022】
本発明において、血清は、培養培地の総重量と比較して「１．５～３．５％」に相当し、これは、血清が、培養培地の総重量と比較して１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、又は３．５重量％に相当することを意味する。
【0023】
細胞培養物の総体積と比較した、すなわち、最小必須栄養素を含む培地の総体積と比較した血清の量をｖ／ｖ％で表すことも可能である。
【0024】
最小必須栄養素は、必須アミノ酸、ビタミン、微量元素などで構成されている。本発明による最小必須栄養素は、例えば、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－アスパラギン－Ｈ２Ｏ、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン塩酸塩－Ｈ２Ｏ、Ｌ－シスチン２ＨＣｌ、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩－Ｈ２Ｏ、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ－バリン、アスコルビン酸、ビオチン、塩化コリン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、ｉ－イノシトール、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水物）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水物）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏ）、Ｄ－グルコース（デキストロース）、リポ酸、及びピルビン酸ナトリウムであり得る。
【0025】
当業者は、本発明による細胞培養を実施するために、市販の最小必須培養培地から、より適切なものを選択することができる。
【0026】
有利には、本発明は、内分泌細胞が胎盤細胞株である、上で定義した細胞培養物に関する。
【0027】
本発明によれば、細胞株は、適切な新鮮な培地及び空間が与えられれば無限に増殖する、永久的に確立された細胞培養物である。細胞培養物及び細胞株は、特定の細胞の生理学的プロセス、病態生理学的プロセス、及び分化プロセスを研究する際に重要な役割を担っている。それは、制御された環境下での細胞の構造、生物学、及び遺伝的構成における段階的変化の検査を可能にする。
【0028】
有利には、本発明は、ホルモンを産生する、上で定義した細胞培養物、細胞性栄養膜胎盤細胞に関する。
【0029】
細胞性栄養膜（又はラングハンス層）は、栄養膜の内層である。それは、発生中の胚において、合胞体栄養細胞の内部であり、胚盤胞の壁の外部である。
【0030】
細胞性栄養膜は胎盤の一部である。胚盤胞を取り囲む層は残っているが、娘細胞は分化及び増殖して複数の役割で機能するので、それは細胞性栄養膜幹細胞であると考えられる。細胞性栄養膜細胞が分化する際に介し得る、融合及び浸潤という２つの系統が存在する。融合系統は合胞体栄養細胞を生じ、浸潤系統は間質細胞性栄養膜細胞を生じる。細胞性栄養膜細胞がインビトロでｈＣＧ、プロゲステロン、エストロゲン、ｃＧｎＲＨ及びβ－エンドルフィンを産生する能力を有するということは、すでに以前に実証されている。従って、細胞性栄養膜細胞は、ホルモン産生に対する内分泌撹乱物質の化合物の効果を評価するため、及び未知の化合物が内分泌撹乱物質として分類され得るか否かを決定するための良好な候補である。
【0031】
有利には、本発明は、内分泌細胞、特に胎盤細胞が培養される支持体に、内分泌細胞、特に胎盤細胞がしっかりと付着している、上で定義した細胞培養物に関する。
【0032】
本発明による細胞培養物を効率的に使用するために、上述の細胞培養物に含まれる内分泌細胞が接着特性を有するということ、すなわち、培養が行われる支持体と相互作用することができるということが有利である。これは、特に、化合物への曝露後に、例えば、内分泌撹乱物質として分類することができるかどうかを評価するために使用された化合物の存在を除去するため、及び別の化合物を評価するために同じ培養（及び同じ細胞）を使用するために、簡単な洗浄によって、細胞培養物を再使用することを可能にする。
【0033】
有利には、本発明は、内分泌細胞が、胎盤細胞株ＪＥＧ－３、特にＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３６（商標）の番号でＡＴＣＣに寄託された胎盤細胞株である、上で定義した細胞培養物に関する。
【0034】
ＪＥＧ３細胞株は、最初はヒト絨毛癌に由来し、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、乳腺刺激ホルモン、プロゲステロン、並びにエストラジオール及びポリペプチドホルモン（ヒト胎盤乳腺刺激ホルモン（ｈＰＬ）など）などの他のホルモンを分泌するように特徴付けられている。
【0035】
クローンＨＴＢ－３６は、アメリカ合衆国の細胞培養物収集センターであるＡＴＣＣに寄託されており、一般に入手可能である。このクローンは、高三倍体ヒト細胞株である。最頻染色体数は７１であり、３４％で生じ、倍数性は２．６％である。ｔ（４；１１）（ｐ１５；ｑ１３）、ｉ（１３ｑ）、ｔ（１０ｐ１５ｑ）、ｄｅｌ（１８）（ｑ２１）、及び６つの他のマーカーは、ほとんどの細胞に共通であり、２つの他のマーカーがいくつかの細胞に見出される。１つのＮ１４と２つのＮ２２に、巨大付随体が見られる。Ｎ２、Ｎ５、及びＮ９は４つの複製を有し、Ｎ７、Ｎ１３、Ｎ１８、Ｎ２１、及びＸは、単一の複製を有する。単一のＹ染色体がＱバンド検査によって検出される。
【0036】
推奨される培養条件は以下の通りである：イーグル最小必須培地に、ウシ胎児血清を最終濃度１０％まで補充する。細胞増殖のために、抗生物質及びグルタミンを添加してもよい。
【0037】
本発明による細胞培養物を調製する場合、ＪＥＧ－３細胞、特にクローンＨＴＢ－３６を上述の培地中で消費させ、次いで無血清培地で多数回洗浄し、次いで培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％の血清を補充した最小必須培地中に入れる。
【0038】
本発明は、
－ ヒト胎盤内分泌細胞、及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地
（ただし、血清は、培養培地の総重量と比較して、１．５～３．５重量％、好ましくは約２．５重量％に相当する）を含む細胞培養物に関する。
－ ヒト胎盤内分泌細胞、及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地
（ただし、血清は、培養培地の総重量と比較して、１．５～３．５重量％、好ましくは約２．５重量％に相当する）を含む細胞培養物に関する。
【0039】
上で定義した細胞培養物は、抗生物質を含有せず、ＯＰＴＩＭＵＭ培地などのリッチ培養培地を含有する細胞培養物ではない。
【0040】
この特定の培地の目的は、タンパク質及び抗体の干渉を制限して、細胞を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と直接接触させることである。
【0041】
有利には、本発明は、上記胎盤内分泌細胞が胎盤細胞株である、上で定義した細胞培養物に関する。
【0042】
有利には、本発明は、内分泌細胞が細胞性栄養膜胎盤細胞である、上で定義した細胞培養物に関する。
【0043】
有利には、本発明は、内分泌細胞が、自身が培養される支持体にしっかりと付着している、上で定義した細胞培養物に関する。
【0044】
有利には、本発明は、内分泌細胞が、胎盤細胞株ＪＥＧ－３、特にＡＴＣＣにＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６の番号で寄託された胎盤細胞株である、上で定義した細胞培養物に関する。
【0045】
本発明はまた、化合物が内分泌撹乱物質であるか否かをインビトロで決定するための、上記定義による細胞培養物の使用に関し、
化合物が、プロゲステロンホルモン及びポリペプチドホルモン又はその誘導体を含む４つのホルモンのセットのうちの少なくとも１つのホルモンの発現レベルを調節し、
かつ、
化合物が、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現及び／又は活性化を調節する、というとき、化合物が内分泌撹乱物質であるとされる。
化合物が、プロゲステロンホルモン及びポリペプチドホルモン又はその誘導体を含む４つのホルモンのセットのうちの少なくとも１つのホルモンの発現レベルを調節し、
かつ、
化合物が、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現及び／又は活性化を調節する、というとき、化合物が内分泌撹乱物質であるとされる。
【0046】
本発明はまた、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかをインビトロで特定するための、上で定義した細胞培養物の使用に関する。
【0047】
本発明はまた、
－ 内分泌細胞、好ましくは胎盤細胞；及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地、
（ただし血清が、培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）を含む、上で定義した細胞培養物の使用であって、
特にインビトロで、化合物が、内分泌撹乱物質の化合物又は撹乱化合物であるかどうかを特定するための使用に関する。
－ 内分泌細胞、好ましくは胎盤細胞；及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地、
（ただし血清が、培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）を含む、上で定義した細胞培養物の使用であって、
特にインビトロで、化合物が、内分泌撹乱物質の化合物又は撹乱化合物であるかどうかを特定するための使用に関する。
【0048】
本発明者らは、上述の細胞培養物が、化合物が内分泌撹乱物質として分類されるかどうか、したがって、例えば食料品への組み込みのための商業化から撤退されるべきであるかどうかを決定するのに、非常に有用であるということを特定した。
【0049】
更に、本発明者らは、内分泌撹乱物質が、上述の細胞培養物において、すなわち特定の低血清含有培養培地中で培養された内分泌細胞において、ピロトーシス経路を介して炎症性細胞死を誘導し、この経路がＰ２Ｘ７受容体によって活性化されることを特定した。
【0050】
ピロトーシスは、脳卒中、心臓発作、癌、及び微生物感染などの様々な病理学的刺激によって引き起こされる、炎症性プログラム細胞死の形態であることが知られている。ピロトーシスは、そのカスパーゼ－１への依存性によって他の細胞死経路とは基本的に異なる。
【0051】
ピロトーシスは、以下のような多くの特徴により特徴付けられる：
－ 細胞膨潤による細胞溶解、
－ 核の完全性及びオリゴヌクレオソームＤＮＡ断片化が観察されない、ＤＮＡ切断又はＤＮＡ損傷、
－ インフラマソーム経路の活性化（なお、インフラマソームとは、侵入病原体に対する免疫応答の活性化を調整する細胞質ゾル多量体シグナル伝達複合体である。インフラマソームの活性化は、その後、カスパーゼ－１のプロセシング及び活性化をもたらす。）、並びに
－ 活性化ＩＬ－１β及びＩＬ－１８サイトカインの放出。
－ 細胞膨潤による細胞溶解、
－ 核の完全性及びオリゴヌクレオソームＤＮＡ断片化が観察されない、ＤＮＡ切断又はＤＮＡ損傷、
－ インフラマソーム経路の活性化（なお、インフラマソームとは、侵入病原体に対する免疫応答の活性化を調整する細胞質ゾル多量体シグナル伝達複合体である。インフラマソームの活性化は、その後、カスパーゼ－１のプロセシング及び活性化をもたらす。）、並びに
－ 活性化ＩＬ－１β及びＩＬ－１８サイトカインの放出。
【0052】
更に有利には、本発明は、上で定義した細胞培養物の使用であって、その細胞培養物が、
－ 細胞性栄養膜胎盤細胞、好ましくはＪＥＧ－３細胞株；及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地
（ただし、血清が、上記培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）を含み、
特にインビトロで、化合物が内分泌撹乱物質の化合物又は撹乱化合物であるかどうかを特定するための使用に関する。
－ 細胞性栄養膜胎盤細胞、好ましくはＪＥＧ－３細胞株；及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地
（ただし、血清が、上記培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）を含み、
特にインビトロで、化合物が内分泌撹乱物質の化合物又は撹乱化合物であるかどうかを特定するための使用に関する。
【0053】
より有利には、本発明は、細胞培養物の使用であって、その細胞培養物が、
－ ＪＥＧ－３、ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３６（商標）細胞株、及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地
（ただし血清が、上記培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）を含み、
特にインビトロで、化合物が内分泌撹乱物質の化合物又は撹乱化合物であるかどうかを特定するための使用に関する。
－ ＪＥＧ－３、ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３６（商標）細胞株、及び
－ 最小必須栄養素及び血清からなる培養培地
（ただし血清が、上記培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する）を含み、
特にインビトロで、化合物が内分泌撹乱物質の化合物又は撹乱化合物であるかどうかを特定するための使用に関する。
【0054】
本発明はまた、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって、
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得ること、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
並びに
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソームの活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク活性、及び対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって、
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得ること、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
並びに
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソームの活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク活性、及び対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0055】
本発明者らは、上で定義した細胞培養物の細胞における、発現レベル、活性、又はインフラマソーム経路の活性化を測定することにより、ホルモン発現を調節する化合物が、正確な内分泌撹乱物質であるか否かを評価することが可能になることを発見した。
【0056】
本発明はまた、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかをインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物を、細胞培養物と接触させることであって、細胞培養物は、培養培地中で培養されたヒト胎盤内分泌細胞を含み、上記の培養培地は、最小必須栄養素及び血清を含み、血清が、細胞培養物の培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する、こと、続いて、
ｂ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた上記の培養培地中における、各々がヒト胎盤内分泌細胞によって分泌された第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンを含む４つのホルモンのセットの発現レベルを測定して、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンの測定された発現レベルを得て
（なお、上記のセットは、プロゲステロンホルモン、及びポリペプチドホルモン又はその誘導体を含む）、
第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンの各々の測定された発現レベルを、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触していないか又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触しているヒト胎盤内分泌細胞を含有する細胞培養物からの培養培地において測定される、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのそれぞれの対照の発現レベルと比較すること、
ｃ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた細胞培養からのヒト胎盤内分泌細胞において、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性を測定して、そのＰ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性を得て、
１．Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定されるＰ２Ｘ７の対照の発現レベル及び／又は活性と比較すること、及び
ｄ）結論付けることであって、
ｉ）第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのうちの少なくとも１つの測定された発現レベルが、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのそれぞれの対照の発現レベルと有意に異なり、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性が、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意に異なる場合、上記の化合物は内分泌撹乱物質であり、
ｉｉ）第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのうちの少なくとも１つの測定された発現レベルが、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのそれぞれの対照の発現レベルと有意に異なるが、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性が、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意には異ならない場合、上記の化合物が内分泌撹乱物質であるということは排除されず、
ｉｉｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性のみが、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意に異なる場合、上記の化合物は、内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、
を含む方法に関する。
ａ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物を、細胞培養物と接触させることであって、細胞培養物は、培養培地中で培養されたヒト胎盤内分泌細胞を含み、上記の培養培地は、最小必須栄養素及び血清を含み、血清が、細胞培養物の培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％に相当する、こと、続いて、
ｂ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた上記の培養培地中における、各々がヒト胎盤内分泌細胞によって分泌された第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンを含む４つのホルモンのセットの発現レベルを測定して、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンの測定された発現レベルを得て
（なお、上記のセットは、プロゲステロンホルモン、及びポリペプチドホルモン又はその誘導体を含む）、
第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンの各々の測定された発現レベルを、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触していないか又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触しているヒト胎盤内分泌細胞を含有する細胞培養物からの培養培地において測定される、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのそれぞれの対照の発現レベルと比較すること、
ｃ）内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた細胞培養からのヒト胎盤内分泌細胞において、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性を測定して、そのＰ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性を得て、
１．Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定されるＰ２Ｘ７の対照の発現レベル及び／又は活性と比較すること、及び
ｄ）結論付けることであって、
ｉ）第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのうちの少なくとも１つの測定された発現レベルが、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのそれぞれの対照の発現レベルと有意に異なり、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性が、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意に異なる場合、上記の化合物は内分泌撹乱物質であり、
ｉｉ）第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのうちの少なくとも１つの測定された発現レベルが、第１のホルモン、第２のホルモン、第３のホルモン及び第４のホルモンのそれぞれの対照の発現レベルと有意に異なるが、Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性が、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意には異ならない場合、上記の化合物が内分泌撹乱物質であるということは排除されず、
ｉｉｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの測定された発現レベル及び／又は活性のみが、そのそれぞれの対照の発現レベル及び／又は活性と有意に異なる場合、上記の化合物は、内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、
を含む方法に関する。
【0057】
換言すれば、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを決定することを可能にする非常に効率的な方法：
－ 特定のホルモンの分泌の変動を測定することと、
－ Ｐ２Ｘ７膜受容体の発現及び／又は活性を測定することと、
－ 内分泌撹乱物質に対して非常に感受性が高い特定のホルモンを分泌するヒト胎盤細胞（血清が細胞を生存させておくのに十分な量であるものの、化合物に干渉しない（血清に含まれる大量のタンパク質による化合物の隔離）という条件下で培養されるためである）を使用することと、
を組み合わせることによって提供する。
－ 特定のホルモンの分泌の変動を測定することと、
－ Ｐ２Ｘ７膜受容体の発現及び／又は活性を測定することと、
－ 内分泌撹乱物質に対して非常に感受性が高い特定のホルモンを分泌するヒト胎盤細胞（血清が細胞を生存させておくのに十分な量であるものの、化合物に干渉しない（血清に含まれる大量のタンパク質による化合物の隔離）という条件下で培養されるためである）を使用することと、
を組み合わせることによって提供する。
【0058】
ホルモン及びＰ２Ｘ７受容体の両方が、基準値又は対照と比較して、同時に有意に調整されている場合、その化合物は内分泌撹乱物質であり、市場から退出させなければならないということになる。
【0059】
現在利用可能な試験に対応するホルモンのみが調整されている場合、上の定義を満たすためには、損傷が細胞において観察されなければならないので、化合物が内分泌撹乱物質であるということを明確に述べるのは不可能である。
【0060】
Ｐ２Ｘ７のみが対照と比較して調整されている場合、その化合物は内分泌撹乱物質ではないが、それはこれらの種類の化合物はホルモン発現を調整している必要があるからである。
【0061】
有利なことに、本発明は、上で定義した方法であって、その方法は、
－ 測定することであって、
－ 内分泌撹乱物質である可能性がある上記の化合物と接触させた細胞培養物からのヒト胎盤内分泌細胞における、インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、若しくは
－ 内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた細胞培養物からのヒト内分泌胎盤におけるミトコンドリア活性を測定し、測定されたミトコンドリア活性を得ること、
－ 又はそれら両方を測定すること、
－ 比較をすることであって、
－ 測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
及び／又は
－ 測定されたミトコンドリア活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定されたミトコンドリアの対照の活性と比較すること、並びに
ｄ）結論付けることであって、
＊測定されたインフラマソーム活性又はミトコンドリア活性が、それぞれの対照のインフラマソーム活性及びそれぞれの対照のミトコンドリア活性と有意に異なる場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されない
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
－ 測定することであって、
－ 内分泌撹乱物質である可能性がある上記の化合物と接触させた細胞培養物からのヒト胎盤内分泌細胞における、インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、若しくは
－ 内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させた細胞培養物からのヒト内分泌胎盤におけるミトコンドリア活性を測定し、測定されたミトコンドリア活性を得ること、
－ 又はそれら両方を測定すること、
－ 比較をすることであって、
－ 測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
及び／又は
－ 測定されたミトコンドリア活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない、又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた、細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定されたミトコンドリアの対照の活性と比較すること、並びに
ｄ）結論付けることであって、
＊測定されたインフラマソーム活性又はミトコンドリア活性が、それぞれの対照のインフラマソーム活性及びそれぞれの対照のミトコンドリア活性と有意に異なる場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されない
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
【0062】
Ｐ２Ｘ７が調整されていないか、又は有意に調整されていない場合、ミトコンドリア活性又はインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが対照のそれと比較して調整されている場合、試験された化合物は内分泌撹乱物質であると言うことができる。
【0063】
ミトコンドリア活性は、当該技術分野で周知の多くの技術によって（例えば、膜貫通電位及びその変動を測定することによって、又はいくつかのミトコンドリア酵素の活性を測定することによって）測定され得る。
【0064】
より有利には、本発明は、上で定義した方法であって、その方法は
－ 内分泌細胞におけるＤＮＡ損傷の存在を測定して、測定されたＤＮＡ断片化を得ること、
－ 測定されたＤＮＡ損傷を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定される対照のＤＮＡ損傷と比較すること、及び
－ 結論付けることであって、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しない場合に、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照のＤＮＡ断片化と有意に異なる場合、その化合物は、遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照のＤＮＡ損傷と有意には異ならない場合、その化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質である場合に、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照の断片化と有意に異なる場合、化合物は、遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照の断片化と有意には異ならない場合、化合物は、遺伝毒性効果を有さない内分泌撹乱物質である
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
－ 内分泌細胞におけるＤＮＡ損傷の存在を測定して、測定されたＤＮＡ断片化を得ること、
－ 測定されたＤＮＡ損傷を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定される対照のＤＮＡ損傷と比較すること、及び
－ 結論付けることであって、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しない場合に、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照のＤＮＡ断片化と有意に異なる場合、その化合物は、遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照のＤＮＡ損傷と有意には異ならない場合、その化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質である場合に、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照の断片化と有意に異なる場合、化合物は、遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＤＮＡ損傷が、対照の断片化と有意には異ならない場合、化合物は、遺伝毒性効果を有さない内分泌撹乱物質である
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
【0065】
ＤＮＡ損傷を測定することによって、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを決定し、この化合物が遺伝毒性物質であることを立証することができる。
【0066】
より有利には、本発明は、上で定義した方法であって
－ 発癌性刺激時に誘導されるホルモンの、内分泌細胞の培養培地における発現を測定し、測定された発癌性刺激を得ること、
－ 測定された発癌性刺激を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定される対照の発癌性刺激と比較すること、及び
－ 結論付けることであって、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しない場合に、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意に異なる場合、その化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意には異ならない場合、その化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質である場合に、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意に異なる場合、その化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意には異ならない場合、その化合物は発癌性効果を有さない内分泌撹乱物質である、
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
－ 発癌性刺激時に誘導されるホルモンの、内分泌細胞の培養培地における発現を測定し、測定された発癌性刺激を得ること、
－ 測定された発癌性刺激を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定される対照の発癌性刺激と比較すること、及び
－ 結論付けることであって、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しない場合に、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意に異なる場合、その化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意には異ならない場合、その化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質である場合に、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意に異なる場合、その化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定された発癌性刺激が、対照の発癌性刺激と有意には異ならない場合、その化合物は発癌性効果を有さない内分泌撹乱物質である、
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
【0067】
発癌刺激を測定することによって、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを決定し、この化合物が発癌物質、すなわち癌を誘導する物質であることを立証することができる。
【0068】
より有利には、本発明は、上で定義した方法であって、その方法は、
－ 内分泌細胞のアロマターゼ酵素の活性を測定して、測定されたアロマターゼ活性を得ること、
－ 測定されたアロマターゼ活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定される対照のアロマターゼ活性と比較すること、及び
ｄ）結論付けることであって、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しない場合に、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照のアロマターゼ活性と有意に異なる場合、その化合物は、妊孕性に影響を及ぼす内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照のアロマターゼ活性と有意には異ならない場合、その化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質である場合に、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照のアロマターゼ活性と有意に異なる場合、その化合物は、妊孕性に影響を及ぼす内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照アロマターゼ活性と有意には異ならない場合、その化合物は、妊孕性に影響を及ぼさない内分泌撹乱物質である、
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
－ 内分泌細胞のアロマターゼ酵素の活性を測定して、測定されたアロマターゼ活性を得ること、
－ 測定されたアロマターゼ活性を、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させていない又は内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた細胞培養物のヒト胎盤内分泌細胞において測定される対照のアロマターゼ活性と比較すること、及び
ｄ）結論付けることであって、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質であることを排除しない場合に、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照のアロマターゼ活性と有意に異なる場合、その化合物は、妊孕性に影響を及ぼす内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照のアロマターゼ活性と有意には異ならない場合、その化合物が内分泌撹乱物質であることは排除されず、
＊＊化合物が内分泌撹乱物質である場合に、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照のアロマターゼ活性と有意に異なる場合、その化合物は、妊孕性に影響を及ぼす内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたアロマターゼ活性が、対照アロマターゼ活性と有意には異ならない場合、その化合物は、妊孕性に影響を及ぼさない内分泌撹乱物質である、
と結論付けること、
を更に含む方法に関する。
【0069】
アロマターゼ活性化を測定することによって、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを決定することができ、この化合物が、それを受けた個体の妊孕性に対していくらかの効果を有することを立証することができる。
【0070】
より有利には、本発明は、測定値と対照値とが±１５％異なる場合に、有意差が存在する、上で定義した方法に関する。
【0071】
測定データと対照データとの間の差を測定するために、当業者は、その常識に従って統計分析を行うであろう。差異が１５％より高い場合、差異は有意であると考えられる。
【0072】
例えば、ホルモンが対照試料においてレベル１で発現され、内分泌撹乱物質であると疑われる培養培地において１．１６又は０．８４のレベルで発現される場合、差異は１５％より大きく（１５％の減少又は１５％の増加）、この差異は有意であると考えられる。この例は制限的なものではなく、本発明の目的を明確にするためだけに与えられている。
【0073】
より有利には、本発明は、ペプチドホルモンが、β絨毛性ゴナドトロピンホルモンすなわちβｈＣＧ、又はその誘導体の１つ、例えば、グリコシル化βｈＣＧ、及びヒト胎盤ラクトゲンすなわちｈＰＬである、上で定義した方法に関する。
【0074】
有利な一実施形態では、本発明は、インフラマソーム経路の活性化が、カスパーゼ－１タンパクの活性、並びに／又はＩＬ１βの発現及び／若しくは分泌を評価することによって測定される、上で定義した方法に関する。
【0075】
この方法は、上で定義した細胞培養培地の使用に基づくものである。
【0076】
本方法の第１のステップでは、好ましくはＪＥＧ－３細胞である細胞は、培養培地の総重量と比較して１．５～３．５重量％の血清を補充した培地中で培養される。
【0077】
次に、化合物が細胞培養物の細胞によるホルモンの分泌に影響を及ぼす可能性があるように、内分泌撹乱物質であると疑われている化合物を細胞培養物と接触させる。
【0078】
化合物がホルモンの分泌に影響を及ぼさない場合、化合物は内分泌撹乱物質ではないので、この方法を更には進めない。
【0079】
化合物がホルモンの分泌に影響を及ぼす場合（これは当技術分野で開示されている周知の方法によって評価することができる）、次のステップは、細胞培養物の細胞の細胞膜におけるＰ２Ｘ７受容体の発現若しくは活性のいずれかを評価すること、及び／又はインフラマソーム経路の活性化を評価することからなる。
【0080】
Ｐ２Ｘ７受容体は、細胞質へのＮａ＋及びＣａ２＋の流入並びに細胞質からのＫ＋流出を支持する細胞外アデノシン５’－三リン酸によって開閉される三量体イオンチャネルである。この受容体は、細胞外アデノシン三リン酸による活性化の際に膜孔の形成を媒介し、炎症性カスケードの誘導を介して、遊走から細胞死への多数の生理的及び病態生理的プロセスに関連するいくつかの細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【0081】
受容体Ｐ２Ｘ７の発現を評価するために、蛍光標識抗体を使用して免疫検出を行い、細胞膜における受容体の存在及び／又は量を検出することが可能である。例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲなどの定量化技術を使用することによって、受容体をコードするｍＲＮＡ量を定量化することによって発現を評価することも可能である。
【0082】
Ｐ２Ｘ７の活性は、受容体によって構成される細孔の開口を評価することによって測定することができる。例えば、受容体が活性化されていない場合には細胞内に入ることができないが、受容体が活性化されている場合には細胞内に入ることができる蛍光タンパク質を使用することが可能である。そのような化合物の例は、以下の実施例２に開示されており、実施例２は、Ｒａｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｊａｎ ２０；４（１）：ｅ６４（本明細書に組み込まれる）に詳細に開示される、ＹＯ－ＰＲＯ－１の使用を開示している。
【0083】
インフラマソーム経路の活性を評価することも可能である。インフラマソーム、又はインフラマソーム経路は、炎症反応を制御し、抗菌宿主防御を調整する、多タンパク質シグナル伝達プラットフォームである。それらは、宿主細胞の細胞質ゾルにおける病原性微生物及び危険シグナルの検出後に、パターン認識受容体によって集められ、それらは、炎症性カスパーゼを活性化させてサイトカインを産生し、ピロトーシス細胞死を誘導する。インフラマソームは、サイトカインインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）及びＩＬ－１８の成熟を促進する、炎症性カスパーゼ、システイン依存性アスパラギン酸指向プロテアーゼを活性化する。アポトーシスカスケードを活性化するアポトソームに類似して、インフラマソーム経路は、ピロトーシス炎症カスケードを活性化する。ひとたび活性になると、インフラマソームは、プロカスパーゼ－１（カスパーゼ－１の前駆体分子）に、それ自体のカスパーゼ活性化及び動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を介してホモタイプで、又はインフラマソーム形成中にそれが結合するアダプタータンパク質ＡＳＣのＣＡＲＤを介して、結合する。その完全な形態において、インフラマソームは、多くのｐ４５プロカスパーゼ－１分子を一緒に並置し、ｐ２０及びｐ１０サブユニットへのそれらの自己触媒的切断を誘導する。次いで、カスパーゼ－１は、それぞれｐ２０サブユニット及びｐ１０サブユニットを有する２つのヘテロ二量体からなる、その活性型に集合する。ひとたび活性になると、初期炎症シグナルに応答して様々なプロセスを実行することができる。
【0084】
インフラマソームの活性を測定するために、カスパーゼ－１タンパク質の活性、及び／又はＩＬ－１βの分泌を測定することが可能である。
【0085】
次いで、収集された全てのデータを、基準値、すなわち、Ｐ２Ｘ７の発現の基準値、Ｐ２Ｘ７の活性化の基準値、及びインフラマソームの活性化の基準値と比較する。これらの基準値データは、細胞培養物を内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させることによって得られる。例えば、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物を可溶化するために使用される、水及び溶媒を使用することができる。
【0086】
本発明によるプロセスの最後のステップでは、測定されたＰ２Ｘ７の活性化／発現又は測定されたインフラマソームの活性化が基準と有意に異なるかどうかが評価される。全ての測定値が対照の値に近い場合、化合物は、内分泌撹乱物質ではないとみなすことができる。そうでない場合、例えば測定値の１つが対照の値と有意に異なる場合、化合物は内分泌撹乱物質として分類することができる。
【0087】
有利には、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベルを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを得ること、
ｄ）測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた上記の内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの対照発現レベルと比較すること、
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現が、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現よりも高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベルを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを得ること、
ｄ）測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた上記の内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの対照発現レベルと比較すること、
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現が、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現よりも高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0088】
有利には、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの活性を測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を得ること、
ｄ）上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較すること、
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性が、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性よりも高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの活性を測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を得ること、
ｄ）上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較すること、
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性が、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性よりも高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0089】
有利には、本発明はまた、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）インフラマソーム経路の活性化を測定して、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｄ）測定されたインフラマソーム経路の活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定された対照のインフラマソーム経路の活性と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたインフラマソーム活性が、対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）インフラマソーム経路の活性化を測定して、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｄ）測定されたインフラマソーム経路の活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定された対照のインフラマソーム経路の活性と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたインフラマソーム活性が、対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0090】
より有利には、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び活性を測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得ること、
ｉｉ）及びインフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソームの活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク活性、及び対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び活性を測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得ること、
ｉｉ）及びインフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソームの活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク活性、及び対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0091】
より有利には、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル又は活性を測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得て、
及びインフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較するか、
又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
並びに
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソームの活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク活性、及び対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル又は活性を測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得て、
及びインフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較するか、
又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較すること、
並びに
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソームの活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク活性、及び対照のインフラマソーム活性より高い場合、化合物は内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0092】
有利には、本発明は、上で定義した方法であって、その方法は、ステップｅ）の前に、
ｃ１）内分泌細胞におけるＤＮＡ損傷の存在を測定して、測定されたＤＮＡ断片化を得ることと、
ｄ１）測定されたＤＮＡ修復を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のＤＮＡ修復と比較することと、を更に含み、及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片よりも高い場合、化合物は遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片以下である場合、化合物は遺伝毒性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ｃ１）内分泌細胞におけるＤＮＡ損傷の存在を測定して、測定されたＤＮＡ断片化を得ることと、
ｄ１）測定されたＤＮＡ修復を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のＤＮＡ修復と比較することと、を更に含み、及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片よりも高い場合、化合物は遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片以下である場合、化合物は遺伝毒性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0093】
換言すれば、有利には、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得るか、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得るか、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得て、
ｉｖ）及び内分泌細胞における細胞損傷の存在を測定して、測定された細胞損傷を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較し、
及び
－ 測定されたＤＮＡ修復を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のＤＮＡ修復と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片よりも高い場合、化合物は遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片以下である場合、化合物は遺伝毒性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得るか、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得るか、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得て、
ｉｖ）及び内分泌細胞における細胞損傷の存在を測定して、測定された細胞損傷を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較し、
及び
－ 測定されたＤＮＡ修復を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のＤＮＡ修復と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片よりも高い場合、化合物は遺伝毒性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたＤＮＡ損傷が対照のＤＮＡ断片以下である場合、化合物は遺伝毒性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0094】
本発明者らは、上に定義した方法によって特定された内分泌撹乱物質が遺伝毒性効果を有し得るかどうかを決定することも可能であることを示した。
【0095】
この目的のために、化合物の状態を評価する際に、細胞培養物の細胞において起こり得るＤＮＡ損傷を検出することが可能である。
【0096】
ＤＮＡ損傷の評価は当技術分野で周知であり、当業者によって容易に実施することができる。
【0097】
本発明において、ＤＮＡ損傷は、細胞に含まれるＤＮＡ分子の二本鎖破壊、又はＤＮＡの遺伝毒性的変化に対応する。
【0098】
有利には、本発明は、上で定義した方法であって、その方法は、ステップｅ）の前に、
ｃ２）発癌性刺激時に誘導されるホルモンの、内分泌細胞の培養培地における発現を測定し、測定された発癌性刺激を得ることと、
ｄ２）測定された発癌性刺激を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照の発癌性刺激と比較することと、を更に含み、及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激よりも高い場合、化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激以下である場合、化合物は発癌性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ｃ２）発癌性刺激時に誘導されるホルモンの、内分泌細胞の培養培地における発現を測定し、測定された発癌性刺激を得ることと、
ｄ２）測定された発癌性刺激を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照の発癌性刺激と比較することと、を更に含み、及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激よりも高い場合、化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激以下である場合、化合物は発癌性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0099】
換言すれば、有利には、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得るか、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得るか、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得て、
ｉｖ）及び発癌性刺激時に誘導されるホルモンの、内分泌細胞の培養培地における発現を測定し、測定された発癌性刺激を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較し、
及び
－ 測定された発癌性刺激を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照の発癌性刺激と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激よりも高い場合、化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激以下である場合、化合物は発癌性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得るか、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得るか、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得て、
ｉｖ）及び発癌性刺激時に誘導されるホルモンの、内分泌細胞の培養培地における発現を測定し、測定された発癌性刺激を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較し、
及び
－ 測定された発癌性刺激を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照の発癌性刺激と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激よりも高い場合、化合物は発癌性効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定された発癌性刺激が対照の発癌性刺激以下である場合、化合物は発癌性効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0100】
本発明者らは、上に定義した方法によって特定された内分泌撹乱物質が発癌性効果を有し得るかどうかを決定することも可能であることを示した。
【0101】
この目的のために、化合物の状態を評価する場合、発癌性化合物による刺激の際に刺激され、分泌されるであろう特定のホルモンの可能な分泌を検出することが可能である。
【0102】
例えば、ｈＣＧなどのいくつかのホルモンのグリコシル化プロファイルを評価することが可能である。実際に、発癌物質にさらされた場合のヒトにおける、特異的グリコシル化が特定されている。
【0103】
有利には、本発明は、上で定義した方法であって、その方法は、ステップｅ）の前に、
ｃ３）内分泌細胞のアロマターゼ酵素の活性を測定して、測定されたアロマターゼ活性を得ることと、
ｄ３）測定されたアロマターゼ活性を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のアロマターゼ活性と比較することと、を更に含み、及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性よりも高い場合、化合物は妊孕性への効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性以下である場合、化合物は妊孕性への効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ｃ３）内分泌細胞のアロマターゼ酵素の活性を測定して、測定されたアロマターゼ活性を得ることと、
ｄ３）測定されたアロマターゼ活性を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のアロマターゼ活性と比較することと、を更に含み、及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性よりも高い場合、化合物は妊孕性への効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性以下である場合、化合物は妊孕性への効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0104】
換言すれば、有利には、本発明は、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを、好ましくはインビトロで決定するための方法であって、その方法は、
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得るか、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得るか、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得て、
ｉｖ）及び、内分泌細胞のアロマターゼ酵素の活性を測定して、測定されたアロマターゼ活性を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較し、
及び
－ 測定されたアロマターゼ活性を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のアロマターゼ活性と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性よりも高い場合、化合物は妊孕性への効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性以下である場合、化合物は妊孕性への効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
ａ）上で定義した細胞培養物を提供すること、
ｂ）細胞培養物の内分泌細胞を、内分泌細胞によるホルモン産生を調節する、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物と接触させること、
ｃ）測定することであって
ｉ）Ｐ２Ｘ７膜受容体タンパクの発現レベル及び／又は活性のいずれかを測定して、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベル及び／又は測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性をそれぞれ得るか、
ｉｉ）インフラマソーム経路の活性化を測定し、測定されたインフラマソーム活性を得るか、
ｉｉｉ）又はその両方を測定し、それぞれを得て、
ｉｖ）及び、内分泌細胞のアロマターゼ酵素の活性を測定して、測定されたアロマターゼ活性を得ること、
ｄ）比較することであって、
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの発現レベルを測定することによって決定された、上記Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の発現レベルと比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性を測定することによって決定された、Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの対照の活性と比較し、
及び／又は
－ 上記測定されたインフラマソーム活性を、内分泌撹乱物質ではないことが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において決定されたインフラマソーム経路の対照の活性と比較し、
及び
－ 測定されたアロマターゼ活性を、内分泌撹乱物質であることが知られている化合物と接触させた内分泌細胞において得られた対照のアロマターゼ活性と比較すること、
及び
ｅ）結論付けることであって、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性よりも高い場合、化合物は妊孕性への効果を有する内分泌撹乱物質であり、
＊測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパク、測定されたＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び測定されたインフラマソーム活性のうちの少なくとも１つが、それぞれの対照のＰ２Ｘ７受容体タンパク、対照のＰ２Ｘ７受容体タンパクの活性、及び対照のインフラマソーム活性よりも高く、かつ測定されたアロマターゼ活性が対照のアロマターゼ活性以下である場合、化合物は妊孕性への効果を有さない内分泌撹乱物質であり、
＊そうでなければ、化合物は内分泌撹乱物質ではない、
と結論付けること、を含む方法に関する。
【0105】
本発明者らは、上に定義した方法によって特定された内分泌撹乱物質が妊孕性に対する何らかの効果を有し得るかどうかを決定することも可能であることを示した。
【0106】
この目的のために、化合物の状態を評価する際に、アロマターゼの活性を検出することが可能である。
【0107】
アロマターゼ（ＣＹＰ１９Ａ、ＥＣ１．１４．１４．１４）は、ミクロソーム異物代謝酵素のシトクロムＰ４５０モノオキシダーゼ（ＣＹＰ）ファミリーのメンバーである。アロマターゼは、ステロイド産生において重要な役割を果たし、アンドロゲンホルモンのエストロゲンへの変換を触媒する。その酵素は、生殖組織、胎盤、脳、及び脂肪組織において高いレベルで発現され、哺乳動物の性的二型性及び二次性徴の発生に関与する。
【0108】
アロマターゼの活性を検出するための多くのキットが利用可能であり、当業者はより適切なものを容易に選択することができる。
【0109】
より有利には、本発明は、内分泌撹乱物質である可能性がある化合物が、内分泌撹乱物質の非存在下でのホルモン発現と比較して±２０％のホルモン発現の変動を誘導する、上で定義した方法に関する。
【0110】
より有利には、本発明は、４つのホルモンのセットが、エストロゲン、プロゲステロン、又はヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン、ベータポリペプチド（βｈＣＧ）などのポリペプチドホルモンを含む、上で定義した方法に関する。
【0111】
ヒト絨毛膜ソマトマンモトロピン（ＨＣＳ）とも呼ばれるヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）は、ポリペプチド胎盤ホルモンである。その構造及び機能はヒト成長ホルモンのものと類似している。ｈＰＬは、妊娠中の母親の代謝状態を変更して、胎児のエネルギー供給を促進する。ｈＰＬは妊娠中に合胞体栄養細胞によって分泌される。
【0112】
βｈＣＧもまた、最初は合胞体栄養細胞によって分泌されるポリペプチド胎盤ホルモンである。グリコシル化βｈＣＧホルモンの発現を測定することも有利であるが、それは、このホルモンは、ヒト胎盤の最初の数日にのみ天然に発現されるが、内分泌細胞が発癌物質である内分泌撹乱物質に曝露されると調節解除されるからである。
【0113】
より有利には、本発明は、インフラマソーム経路の活性化が、カスパーゼ－１タンパクの活性、並びに／又はＩＬ１βの発現及び／若しくは分泌を評価することによって測定される、上で定義した方法に関する。
【0114】
カスパーゼ－１タンパク質活性は、当該分野で既知の異なるキットを使用することによって評価することが容易である。例えば、カスパーゼ－１活性は、基質ＹＶＡＤ－ＡＦＣ（ＡＦＣ：７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン）の切断を検出することによって測定することができる。ＹＶＡＤ－ＡＦＣは青色光（Ｅｍ＝４００ｎｍ）を放出し、カスパーゼ－１又は関連するカスパーゼによって基質が切断されると、遊離ＡＦＣは、黄緑色蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝４００／５０５ｎｍ）を放出し、これは蛍光光度計又は蛍光マイクロタイタープレートリーダーを使用して定量化することができる。処理した試料からの蛍光を、未処理の対照からのそれと比較することにより、カスパーゼ－１活性の増加倍数を決定することができる。
【0115】
ＩＬ１βの発現及び／又は分泌は、分泌されたＩＬ１βのための培養培地において直接的に、又は細胞において直接的に、免疫学的手段を使用することによって評価することができる。
【0116】
ＩＬ１βの発現はまた、例えば、特定のオリゴヌクレオチド及びプローブを使用するＲＴ－ＰＣＲプロトコールを使用して、遺伝子発現を評価することによって、測定することもできる。
【0117】
本発明はまた、
－ 上で定義した細胞培養物、
－ 内分泌撹乱物質ではないことが知られている、少なくとも１つの化合物、及び
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、
を含むキットに関する。
－ 上で定義した細胞培養物、
－ 内分泌撹乱物質ではないことが知られている、少なくとも１つの化合物、及び
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、
を含むキットに関する。
【0118】
本発明はまた、
－ 上で定義した細胞培養物、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物、及び
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、
を含むキットに関する。
－ 上で定義した細胞培養物、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物、及び
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、
を含むキットに関する。
【0119】
本発明はまた、
－ 上で定義した細胞培養物、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物、及び内分泌撹乱物質ではないことが知られている少なくとも１つの化合物、特に培養培地、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、
を含むキットに関する。
－ 上で定義した細胞培養物、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物、及び内分泌撹乱物質ではないことが知られている少なくとも１つの化合物、特に培養培地、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパクの発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、
を含むキットに関する。
【0120】
有利には、上述のキットは、
－ ＪＥＧ－３細胞株と、最小必須栄養素及び上で定義された量の血清を含む培養培地と、
－ 内分泌撹乱物質ではないことが知られている、少なくとも１つの化合物と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパク発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、例えばＹＯ－ＰＲＯ－１化合物などと、
を含む。
－ ＪＥＧ－３細胞株と、最小必須栄養素及び上で定義された量の血清を含む培養培地と、
－ 内分泌撹乱物質ではないことが知られている、少なくとも１つの化合物と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパク発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、例えばＹＯ－ＰＲＯ－１化合物などと、
を含む。
【0121】
有利には、上述のキットは、
－ ＪＥＧ－３細胞株と、最小必須栄養素及び上で定義された量の血清を含む培養培地と、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパク発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、例えばＹＯ－ＰＲＯ－１化合物などと、
を含む。
－ ＪＥＧ－３細胞株と、最小必須栄養素及び上で定義された量の血清を含む培養培地と、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパク発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、例えばＹＯ－ＰＲＯ－１化合物などと、
を含む。
【0122】
有利には、上述のキットは、
－ ＪＥＧ－３細胞株と、最小必須栄養素及び上で定義された量の血清を含む培養培地と、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物、及び内分泌撹乱物質ではないことが知られている少なくとも１つの化合物と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパク発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、例えばＹＯ－ＰＲＯ－１化合物などと、
を含む。
－ ＪＥＧ－３細胞株と、最小必須栄養素及び上で定義された量の血清を含む培養培地と、
－ ビスフェノールＡなどの内分泌撹乱物質であることが知られている少なくとも１つの化合物、及び内分泌撹乱物質ではないことが知られている少なくとも１つの化合物と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体タンパク発現及び／又は活性化を測定するための、少なくとも１つの手段、例えばＹＯ－ＰＲＯ－１化合物などと、
を含む。
【0123】
キットはまた、ＤＮＡ損傷を検出するための手段、及び／又は発癌物質刺激の際に分泌されるホルモンの発現を検出するための手段、及び／又はアロマターゼ活性を評価するための手段を含み得る。
【0124】
本発明はまた、
－ ヒト胎盤内分泌細胞を含む細胞培養物と、
－ 胎盤細胞によって分泌される４つのホルモンの発現を測定するための手段であって、それらの４つのホルモンが、胎盤細胞によって分泌される、プロゲステロンホルモン及びペプチドホルモン又はその誘導体を含む手段と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体の発現及び／又は活性化を測定するための可能な手段と、
を含む、上で定義したキットに関する。
－ ヒト胎盤内分泌細胞を含む細胞培養物と、
－ 胎盤細胞によって分泌される４つのホルモンの発現を測定するための手段であって、それらの４つのホルモンが、胎盤細胞によって分泌される、プロゲステロンホルモン及びペプチドホルモン又はその誘導体を含む手段と、
－ Ｐ２Ｘ７受容体の発現及び／又は活性化を測定するための可能な手段と、
を含む、上で定義したキットに関する。
【0125】
本発明は、以下の図面及び実施例に照らしてより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0126】
【図1】種々の濃度のＦＢＳを補充した培地における、ＪＥＧ－３細胞の増殖を示すグラフを表す。ＪＥＧ－３細胞を、３つの異なる濃度のＦＢＳとともに、２４時間又は７２時間にわたってインキュベートし、細胞計数を行って、ＪＥＧ－３細胞の増殖に対するＦＢＳの効果を定量化した。黒色：１０％のＦＢＳ、濃い灰色：２．５％のＦＢＳ、薄い灰色：０％のＦＢＳ。Ｙ軸：生細胞の数（細胞数／ｍＬ）；Ｘ軸：時間（時間）
【図2】２．５％及び１０％のＦＢＳでの、ＪＥＧ－３細胞におけるＣＫ７の発現を示す写真を表す。 Ａ）２．５％のＦＢＳで培養した細胞を、抗ＣＫ７抗体で染色した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で染色した細胞。 Ｂ）２．５％のＦＢＳで培養した細胞を、ＤＮＡを染色するために使用したＤＡＰＩ（青色）で染色した細胞。 Ｃ）１０％のＦＢＳで培養した細胞を、抗ＣＫ７抗体で染色した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で染色した細胞。 Ｄ）１０％のＦＢＳで培養した細胞を、ＤＮＡを染色するために使用したＤＡＰＩ（青色）で染色した細胞。 データは、少なくとも３回の独立した実験を表す。 Ｅ）１０％のＦＢＳで培養した細胞を、アイソタイプ対照で染色した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で染色した細胞。 Ｆ）１０％のＦＢＳで培養した細胞を、ＤＮＡを染色するために使用したＤＡＰＩ（青色）で染色した細胞。 データは、少なくとも３回の独立した実験を表す。
【図3】ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いたＣＫ７蛍光の定量化を示すグラフである。選択された顕微鏡視野における細胞数の差を考慮に入れるために、緑色蛍光強度を青色蛍光強度で割ることによって、正規化されたＣＫ７蛍光強度を得た。Ｙ軸：正規化したＣＫ７強度。Ａ：対照アイソタイプ；Ｂ：２．５％のＦＢＳで培養した細胞であり、Ｃ：１０％のＦＢＳで培養した細胞である。
【図4】１０％のＦＢＳ又は２．５％のＦＢＳ中で、ＳＬＳ（Ａ）又はＰＦＯＡ（Ｂ）とともにインキュベートした後の、ＪＥＧ－３細胞の生存率の比較を示すヒストグラムを表す。ＪＥＧ－３細胞を、１０～５０μｇ／ｍＬのＳＬＳ又は４０～１２０μＭのＰＦＯＡとともに、２４時間にわたってインキュベートした。ニュートラルレッドアッセイを使用して細胞生存率を決定した。１０％のＦＢＳ中の陰性対照と比較して、≦≦≦ｐ＜０．００１及び≦≦≦≦ｐ＜０．０００１であり、２．５％のＦＢＳ中の陰性対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ｎ＝３）である。Ａ：Ｙ軸：細胞生存率（％）及びＸ軸：ＳＳＬ濃度（μｇ／ｍＬ）；Ｂ：Ｙ軸：細胞生存率（％）及びＸ軸：ＰＦＯＡ濃度（μｇ／ｍＬ）。
【図5】アポトーシス誘導剤とともに２４時間にわたってインキュベートした後の、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞の細胞生存率（単位は％で、Ｙ軸）及びクロマチン凝縮の評価を示すグラフを表す（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＨについては、濃度はμｇ／ｍＬ単位であり、Ａ及びＦについては、濃度はｖ／ｖパーセント単位である）。細胞生存率及びクロマチン凝縮を、それぞれ、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイ及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２アッセイを使用して定量化した。破線：細胞生存率、実線：クロマチン凝縮。陰性対照（ｎ＝３）と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ａ：エタノール；Ｂ：キナルホス；Ｃ：ビスフェノールＦ；Ｄ：４－４’－ＤＴＴ；Ｅ：ＢＡＣ；Ｆ：フェノキシエタノール；Ｇ：プロピルパラベン、及びＨ：ＰＦＯＡ。
【図6】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上で７２時間にわたり、ビスフェノールＡ（Ａ）、ジエチルスチルベストロール（Ｂ）、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール（Ｃ）、トリクロザン（Ｅ）、プロピルパラベン（Ｆ）、ブチルベンジルフタレート（Ｇ）、ジブチルフタレート（Ｈ）、ＤＥＨＰ（Ｉ）、及び３－ベンジリデンカンファー（Ｊ）とともにインキュベーションした後に、ニュートラルレッドアッセイを使用して評価された細胞生存率を表す。黒色及び白色カラムは、それぞれ溶媒及び対照を表す。
【図7】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上で７２時間にわたり、ビスフェノールＡ（Ａ）、ジエチルスチルベストロール（Ｂ）、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール（Ｃ）、トリクロザン（Ｅ）、プロピルパラベン（Ｆ）、ブチルベンジルフタレート（Ｇ）、ジブチルフタレート（Ｈ）、ＤＥＨＰ（Ｉ）、及び３－ベンジリデンカンファー（Ｊ）とともにインキュベーションした後に、評価されたＰ２Ｘ７受容体活性化を表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５である。黒色及び白色カラムは、それぞれ溶媒及び対照を表す。
【図8】７２時間にわたり、ビスフェノールＡ（Ａ）、ジエチルスチルベストロール（Ｂ）、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール（Ｃ）、トリクロザン（Ｅ）、プロピルパラベン（Ｆ）、ブチルベンジルフタレート（Ｇ）、ジブチルフタレート（Ｈ）、ＤＥＨＰ（Ｉ）、及び３－ベンジリデンカンファー（Ｊ）とともにインキュベートした後に、ＪＥＧ－Ｔｏｘにおいて評価したカスパーゼ－１活性細胞を表す。対照と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５である。黒色及び白色カラムは、それぞれ溶媒及び対照を表す。
【図9】トリクロサン（Ａ）、ベンジルブチルフタレート（Ｂ）、ジブチルベンジルフタレート（Ｃ）、ＤＥＨＰ（Ｄ）、及び３－ベンジリデンカンファー（Ｅ）とともにインキュベーション後に、ＪＥＧ－Ｔｏｘにおいて評価したカスパーゼ－９活性細胞を表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１である。黒色及び白色カラムは、それぞれ溶媒及び対照を表す。Ｙ軸：カスパーゼ－９活性の倍率変化。
【図10】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でビスフェノールＡ（ＢＰＡ）とともに７２時間にわたりインキュベートした後に、ニュートラルレッドアッセイを用いて評価した細胞生存率を示すグラフを表す。
【図11】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でビスフェノールＦ（ＢＰＦ）とともに７２時間にわたりインキュベーションした後に、ニュートラルレッドアッセイを用いて評価した細胞生存率を示すグラフを表す。
【図12】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＡとともに７２時間にわたりインキュベートした後の、Ｐ２Ｘ７受容体活性化を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊ｐ＜０．０１である。
【図13】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＦとともに７２時間にわたりインキュベーションした後の、Ｐ２Ｘ７受容体活性化を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊ｐ＜０．０１である。
【図14】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＡとともに７２時間にわたりインキュベーションした後に、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞において評価されたカスパーゼ－１活性を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊ｐ＜０．０５である。
【図15】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＦとともに７２時間にわたりインキュベーションした後に、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞において評価されたカスパーゼ－１活性を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊ｐ＜０．０５である。
【図16】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＡとともに７２時間にわたりインキュベーションした後に、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞において評価されたカスパーゼ－９活性を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊ｐ＜０．０５である。
【図17】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＦとともに７２時間にわたりインキュベーションした後に、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞において評価されたカスパーゼ－９活性を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊ｐ＜０．０５である。
【図18】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＦとともに４８時間にわたりインキュベーションした後の、Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡアッセイを使用することによるＲＯＳ産生を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。
【図19】ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞上でＢＰＡとともに４８時間にわたりインキュベーションした後の、Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡアッセイを使用することによるＲＯＳ産生を示すグラフを表す。対照と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。
【図20】内分泌撹乱物質による胎盤細胞の刺激によるＰ２Ｘ７受容体活性化、及びその結果活性化された細胞内経路の概略図である。内分泌撹乱物質の効果もこの概略図に示されている。
【実施例】
【0127】
実施例１：ＪＥＧ－Ｔｏｘモデル
本実施例の目的は、化学物質によって誘導される妊娠障害を明らかにするためのＪＥＧ－３胎盤細胞のインキュベーション条件を確立することである。この目的を達成するために、本発明者らは、最初に、２．５％の血清中でのＪＥＧ－３細胞の挙動を１０％の血清中での挙動と比較して研究し、第２に、ＪＥＧ－３細胞は、Ｐ２Ｘ７受容体の活性化及びピロトーシスを可能にし、妊婦にとって有毒な化学物質に応答してのＤＮＡ損傷及び変性経路が可能であるということを確認した。
本実施例の目的は、化学物質によって誘導される妊娠障害を明らかにするためのＪＥＧ－３胎盤細胞のインキュベーション条件を確立することである。この目的を達成するために、本発明者らは、最初に、２．５％の血清中でのＪＥＧ－３細胞の挙動を１０％の血清中での挙動と比較して研究し、第２に、ＪＥＧ－３細胞は、Ｐ２Ｘ７受容体の活性化及びピロトーシスを可能にし、妊婦にとって有毒な化学物質に応答してのＤＮＡ損傷及び変性経路が可能であるということを確認した。
【0128】
材料及び方法
１．材料
ＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のエタノール（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，製のペルフルオロオクタン酸（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を除いて、試験した化学物質はすべて、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
１．材料
ＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のエタノール（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，製のペルフルオロオクタン酸（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を除いて、試験した化学物質はすべて、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【0129】
全ての細胞培養試薬はＧｉｂｃｏ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から入手した。９６ウェルマイクロプレートをＣｏｒｎｉｎｇ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｓ）から購入し、Ｎｕｎｃ（登録商標）Ｌａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（商標）システムをＭｅｒｃｋ社から購入した。
【0130】
抗体は、Ｍｅｒｃｋ社から（マウス抗ＣＫ７抗体）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体及びアイソタイプ対照）購入した。蛍光プローブはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手した。
【0131】
蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer、ＦＲＥＴ）アッセイを、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏｓａｓｓａｙｓ（Ｃｏｄｏｌｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）製のＨＴＲＦ（登録商標）エストラジオールキット、並びにＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）製のヒト胎盤ラクトゲンホルモンキット及びヒト高グリコシル化絨毛性ゴナドトロピンホルモンアッセイキットを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて行った。
【0132】
２．細胞培養物
Ｍａｎａｓｓａｓ製，の絨毛癌由来ＪＥＧ－３細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３６ＴＭ（ＶＡ，ＵＳＡ）を、ＡＴＣＣによって推奨されるように増殖させた：１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、及び５０ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを、最小必須培地イーグル培地に補充した。細胞を、トリプシンを使用して剥離し、計数し、次いで免疫染色のために、９６ウェルマイクロプレート（ウェルごとに２００μＬ）及びＮｕｎｃ（登録商標）Ｌａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（商標）システム中に、１ｍＬにつき８０，０００個の細胞数で播種した。
Ｍａｎａｓｓａｓ製，の絨毛癌由来ＪＥＧ－３細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３６ＴＭ（ＶＡ，ＵＳＡ）を、ＡＴＣＣによって推奨されるように増殖させた：１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、及び５０ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを、最小必須培地イーグル培地に補充した。細胞を、トリプシンを使用して剥離し、計数し、次いで免疫染色のために、９６ウェルマイクロプレート（ウェルごとに２００μＬ）及びＮｕｎｃ（登録商標）Ｌａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（商標）システム中に、１ｍＬにつき８０，０００個の細胞数で播種した。
【0133】
２．１．異なる濃度の血清を補充した培養培地におけるＪＥＧ－３細胞の挙動
２．１．１．細胞増殖に対するウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度の影響
細胞を３つの異なる濃度、すなわち０％、２．５％、及び１０％のＦＢＳ（同じバッチを使用）中で培養した。２４時間後及び７２時間後の時点で、トリプシンを使用して細胞を剥離し、次いでＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製，のＣｏｕｎｔｅｓｓ（商標）ＩＩ自動細胞計数器（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ製）によって計数した。
２．１．１．細胞増殖に対するウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度の影響
細胞を３つの異なる濃度、すなわち０％、２．５％、及び１０％のＦＢＳ（同じバッチを使用）中で培養した。２４時間後及び７２時間後の時点で、トリプシンを使用して細胞を剥離し、次いでＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製，のＣｏｕｎｔｅｓｓ（商標）ＩＩ自動細胞計数器（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ製）によって計数した。
【0134】
２．１．２．ＳＴＲ分析（遺伝子プロファイル）による細胞株の認証
細胞株ＤＮＡを、ショートタンデムリピート（Short Tandem Repeat、ＳＴＲ）によってプロファイリングした。この技術はまた、細胞に交差汚染がないことをチェックする（２３）。ＳＴＲ分析は、ＡＴＣＣのヒトＳＴＲプロファイリング細胞認証サービスによって行った。
細胞株ＤＮＡを、ショートタンデムリピート（Short Tandem Repeat、ＳＴＲ）によってプロファイリングした。この技術はまた、細胞に交差汚染がないことをチェックする（２３）。ＳＴＲ分析は、ＡＴＣＣのヒトＳＴＲプロファイリング細胞認証サービスによって行った。
【0135】
２．１．３．ＣＫ７免疫染色
サイトケラチン－７（ＣＫ７）中間フィラメントは、細胞性栄養膜細胞（１４、２４）の確立されたマーカーである。２．５％又は１０％のＦＢＳを補充した培養培地に播種してから２４時間後に、ＪＥＧ－３細胞を、４％のパラホルムアルデヒド中で２０分間にわたり固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１０分間にわたり透過処理し、１％のＢＳＡ及び０．１％のＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液で、２時間にわたり飽和させ、次いで１％のＢＳＡと０．１％のＴｗｅｅｎ２０とを含有するＰＢＳ中で希釈したマウス抗ＣＫ７抗体（１９６μｇ／ｍＬ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体（４μｇ／ｍＬ）とともに、室温で２時間にわたりインキュベートした。核を３００ｎＭのＤＡＰＩで５分間にわたり染色し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製，のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ封入剤を、顕微鏡画像（ＥＶＯＳ ＦＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に使用した。マウスＩｇＧ１カッパクローンＰ３．６．２．８．１を、アイソタイプ対照として使用して、非特異的バックグラウンドシグナルを、特異的抗体シグナルから区別する助けとした。
サイトケラチン－７（ＣＫ７）中間フィラメントは、細胞性栄養膜細胞（１４、２４）の確立されたマーカーである。２．５％又は１０％のＦＢＳを補充した培養培地に播種してから２４時間後に、ＪＥＧ－３細胞を、４％のパラホルムアルデヒド中で２０分間にわたり固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１０分間にわたり透過処理し、１％のＢＳＡ及び０．１％のＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液で、２時間にわたり飽和させ、次いで１％のＢＳＡと０．１％のＴｗｅｅｎ２０とを含有するＰＢＳ中で希釈したマウス抗ＣＫ７抗体（１９６μｇ／ｍＬ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体（４μｇ／ｍＬ）とともに、室温で２時間にわたりインキュベートした。核を３００ｎＭのＤＡＰＩで５分間にわたり染色し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製，のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ封入剤を、顕微鏡画像（ＥＶＯＳ ＦＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に使用した。マウスＩｇＧ１カッパクローンＰ３．６．２．８．１を、アイソタイプ対照として使用して、非特異的バックグラウンドシグナルを、特異的抗体シグナルから区別する助けとした。
【0136】
２．１．４．ホルモン放出の定量化
２．５％又は１０％のＦＢＳを補充した細胞培養培地中で７２時間にわたりインキュベーションした後、マイクロプレートを遠心分離し、細胞上清を回収した。エストラジオールを、製造業者の指示に従って蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術（ＨＴＲＦ（登録商標）、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏｓａｓｓａｙｓ製）によって、細胞上清中で定量化した。このアッセイの検出限界は、２０ｐｇ／ｍＬである。
２．５％又は１０％のＦＢＳを補充した細胞培養培地中で７２時間にわたりインキュベーションした後、マイクロプレートを遠心分離し、細胞上清を回収した。エストラジオールを、製造業者の指示に従って蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術（ＨＴＲＦ（登録商標）、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏｓａｓｓａｙｓ製）によって、細胞上清中で定量化した。このアッセイの検出限界は、２０ｐｇ／ｍＬである。
【0137】
ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）ホルモン及びヒト高グリコシル化絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）ホルモンを、製造業者の指示に従って、サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製）によって測定した。感度は、ｈＰＬの用量及びｈＣＧの用量についてそれぞれ、４６．８７５ｐｇ／ｍＬ未満及び３９ｐｇ／ｍＬ未満である。
【0138】
２．１．５．ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）及びペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）細胞毒性に対する、ウシ胎児血清濃度の影響
細胞を、２．５％又は１０％のＦＢＳのいずれかを補充した培養培地中で希釈したラウリル硫酸ナトリウム又はペルフルオロオクタン酸とともに、インキュベートした。２４時間後、ニュートラルレッドアッセイを使用して細胞生存率を評価した。水中０．４％のニュートラルレッド溶液を、１：７９の比で培養培地中に希釈して、５０μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。ニュートラルレッドを、３７℃で３時間のインキュベーション時間にわたってプレート中に分配した。次に細胞をＰＢＳですすぎ、取り込まれなかった残りの色素を除去した。次いで、溶解溶液（１％酢酸、５０％エタノール及び４９％Ｈ２Ｏ）を使用して、細胞から染料を放出させ、Ｔｅｃａｎ製のＳｐａｒｋマイクロプレート蛍光光度計（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、蛍光を測定した（λｅｘ＝５４０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。
細胞を、２．５％又は１０％のＦＢＳのいずれかを補充した培養培地中で希釈したラウリル硫酸ナトリウム又はペルフルオロオクタン酸とともに、インキュベートした。２４時間後、ニュートラルレッドアッセイを使用して細胞生存率を評価した。水中０．４％のニュートラルレッド溶液を、１：７９の比で培養培地中に希釈して、５０μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。ニュートラルレッドを、３７℃で３時間のインキュベーション時間にわたってプレート中に分配した。次に細胞をＰＢＳですすぎ、取り込まれなかった残りの色素を除去した。次いで、溶解溶液（１％酢酸、５０％エタノール及び４９％Ｈ２Ｏ）を使用して、細胞から染料を放出させ、Ｔｅｃａｎ製のＳｐａｒｋマイクロプレート蛍光光度計（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、蛍光を測定した（λｅｘ＝５４０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。
【0139】
２．２．毒性薬剤とのインキュベーション後のアポトーシス評価
２．２．１．毒性薬剤
アポトーシス評価のために試験した毒性薬剤を、表１に詳述した。溶媒を単独で評価して、それらの潜在的な効果を特定した（データは示さず）。
２．２．１．毒性薬剤
アポトーシス評価のために試験した毒性薬剤を、表１に詳述した。溶媒を単独で評価して、それらの潜在的な効果を特定した（データは示さず）。
【0140】
【表1】
【0141】
２．２．２．細胞毒性未満となる濃度の決定
既知のアポトーシス剤を、２．５％のＦＢＳを補充した培養培地中で希釈し、２４時間にわたってインキュベートした。アポトーシスアッセイを行う前に、アラマーブルーアッセイを使用して細胞生存率を決定して、壊死濃度を排除し、薬剤の細胞毒性未満となる濃度のみを維持した。アラマーブルーを培養培地中で、９μｇ／ｍＬの作業濃度に希釈した。細胞を上記の溶液とともに、３７℃で６時間にわたってインキュベートした。蛍光シグナルを、Ｓｐａｒｋサイトフルオロメーターを用いて読み取った（λｅｘ＝５３５ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。
既知のアポトーシス剤を、２．５％のＦＢＳを補充した培養培地中で希釈し、２４時間にわたってインキュベートした。アポトーシスアッセイを行う前に、アラマーブルーアッセイを使用して細胞生存率を決定して、壊死濃度を排除し、薬剤の細胞毒性未満となる濃度のみを維持した。アラマーブルーを培養培地中で、９μｇ／ｍＬの作業濃度に希釈した。細胞を上記の溶液とともに、３７℃で６時間にわたってインキュベートした。蛍光シグナルを、Ｓｐａｒｋサイトフルオロメーターを用いて読み取った（λｅｘ＝５３５ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。
【0142】
２．２．３．アポトーシスの特徴としてのクロマチン凝縮の評価
ＵＶ蛍光プローブＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、生細胞及びアポトーシス細胞に入り、ＤＮＡに挿入される。蛍光シグナルは、アポトーシスにおけるクロマチン凝縮に比例する。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２とともに、室温で３０分間にわたってインキュベートした。蛍光シグナルを、サイトフルオロメーター（Ｓｐａｒｋ）を用いて読み取った（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）。
ＵＶ蛍光プローブＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、生細胞及びアポトーシス細胞に入り、ＤＮＡに挿入される。蛍光シグナルは、アポトーシスにおけるクロマチン凝縮に比例する。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２とともに、室温で３０分間にわたってインキュベートした。蛍光シグナルを、サイトフルオロメーター（Ｓｐａｒｋ）を用いて読み取った（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）。
【0143】
３．統計分析
少なくとも３回の独立した実験の平均を計算し、対照に対して正規化した。Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ製のＧｒａｐｈＰａｄ（ＣＡ，ＵＳＡ）Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定を行った（αリスク＝５％）。有意性の閾値は、対照と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。
少なくとも３回の独立した実験の平均を計算し、対照に対して正規化した。Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ製のＧｒａｐｈＰａｄ（ＣＡ，ＵＳＡ）Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定を行った（αリスク＝５％）。有意性の閾値は、対照と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。
【0144】
結果
異なる濃度のウシ胎児血清を補充した培養培地におけるＪＥＧ－３細胞の挙動
細胞増殖に対するウシ胎児血清濃度の影響
３つの割合（培養培地中０％、２．５％、及び１０％）のウシ胎児血清を使用した（図１）。
異なる濃度のウシ胎児血清を補充した培養培地におけるＪＥＧ－３細胞の挙動
細胞増殖に対するウシ胎児血清濃度の影響
３つの割合（培養培地中０％、２．５％、及び１０％）のウシ胎児血清を使用した（図１）。
【0145】
生細胞の割合は、ＦＢＳを含まない培養培地（０％のＦＢＳ）中で、２４時間後には劇的に減少し、想定された通り、栄養及び高分子因子の欠如のため、ＪＥＧ－３細胞はＦＢＳなしでは増殖することができなかった。２．５％を補充した培養培地におけるＪＥＧ－３細胞増殖は、２４時間及び７２時間時点で、１０％のＦＢＳにおける増殖と同様であった。
【0146】
ＳＴＲ分析による細胞株認証
ＳＴＲ分析を実施して、２．５％のＦＢＳを補充した培養培地中のＪＥＧ－３細胞における９つのＳＴＲコアマーカーを、１０％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞におけるそれと比較した（表２）。
ＳＴＲ分析を実施して、２．５％のＦＢＳを補充した培養培地中のＪＥＧ－３細胞における９つのＳＴＲコアマーカーを、１０％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞におけるそれと比較した（表２）。
【0147】
【表2】
【0148】
１０％又は２．５％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞は、同じＳＴＲコアマーカーを発現した。ＪＥＧ－３細胞の培養培地中のＦＢＳの割合を減少させても、ＤＮＡ特異的遺伝子座に影響はなかった。
【0149】
胎盤細胞のマーカーとしてのＣＫ７の発現
ＣＫ７は、栄養膜細胞の周知の上皮マーカーであり、１０％のＦＢＳ中で培養されたＪＥＧ－３細胞において発現されることが知られている。本発明者らの顕微鏡観察によれば、ＪＥＧ－３細胞は、２．５％のＦＢＳ及び１０％のＦＢＳ中で、同様のレベルのＣＫ７を発現した（図２及び図３）。
ＣＫ７は、栄養膜細胞の周知の上皮マーカーであり、１０％のＦＢＳ中で培養されたＪＥＧ－３細胞において発現されることが知られている。本発明者らの顕微鏡観察によれば、ＪＥＧ－３細胞は、２．５％のＦＢＳ及び１０％のＦＢＳ中で、同様のレベルのＣＫ７を発現した（図２及び図３）。
【0150】
ＪＥＧ－３細胞によるエストラジオール、高グリコシル化ｈＣＧ及びｈＰＬ分泌の定量化
本発明者らは、１０％のＦＢＳを補充した培養培地中のＪＥＧ－３細胞による胎盤ホルモンの分泌を、２．５％のＦＢＳの場合のＪＥＧ－３細胞と比較した。いずれの培地においても２４時間後、各ホルモンのレベルは同等であった（表３）。
本発明者らは、１０％のＦＢＳを補充した培養培地中のＪＥＧ－３細胞による胎盤ホルモンの分泌を、２．５％のＦＢＳの場合のＪＥＧ－３細胞と比較した。いずれの培地においても２４時間後、各ホルモンのレベルは同等であった（表３）。
【0151】
【表3】
【0152】
ＳＬＳ及びＰＦＯＡの細胞毒性に対する、ウシ胎児血清濃度の影響
本発明者らは、２．５％のＦＢＳ及び１０％のＦＢＳにおいて、それぞれＳＬＳ及びＰＦＯＡの細胞毒性を比較した（図４）。試験した全ての濃度で、１０％のＦＢＳを補充した培養培地で希釈したＳＬＳは、ＪＥＧ－３細胞生存率に影響を及ぼさなかった。対照的に、２．５％のＦＢＳを補充した培養培地で希釈したＳＬＳは、３０μｇ／ｍＬ（生細胞の３７％、図４Ａ）及び５０μｇ／ｍＬ（生細胞の１０％）で、細胞傷害性を誘導した。ＰＦＯＡの細胞毒性は、２．５％のＦＢＳにおいて８０μｇ／ｍＬ及び１２０μｇ／ｍＬで観察されたが（それぞれ生細胞の６８％及び２７％、図４Ｂ）、細胞生存率のわずかな損失は、１０％のＦＢＳにおいて、１２０μｇ／ｍＬでのみ観察された（生細胞の８５％）。細胞培養に使用されるＦＢＳの古典的な濃度（全体積の１０％）は、ＦＢＳ濃度の低下（２．５％）とは対照的に、ＳＬＳ及びＰＦＯＡ細胞毒性を不顕性化する傾向がある。
本発明者らは、２．５％のＦＢＳ及び１０％のＦＢＳにおいて、それぞれＳＬＳ及びＰＦＯＡの細胞毒性を比較した（図４）。試験した全ての濃度で、１０％のＦＢＳを補充した培養培地で希釈したＳＬＳは、ＪＥＧ－３細胞生存率に影響を及ぼさなかった。対照的に、２．５％のＦＢＳを補充した培養培地で希釈したＳＬＳは、３０μｇ／ｍＬ（生細胞の３７％、図４Ａ）及び５０μｇ／ｍＬ（生細胞の１０％）で、細胞傷害性を誘導した。ＰＦＯＡの細胞毒性は、２．５％のＦＢＳにおいて８０μｇ／ｍＬ及び１２０μｇ／ｍＬで観察されたが（それぞれ生細胞の６８％及び２７％、図４Ｂ）、細胞生存率のわずかな損失は、１０％のＦＢＳにおいて、１２０μｇ／ｍＬでのみ観察された（生細胞の８５％）。細胞培養に使用されるＦＢＳの古典的な濃度（全体積の１０％）は、ＦＢＳ濃度の低下（２．５％）とは対照的に、ＳＬＳ及びＰＦＯＡ細胞毒性を不顕性化する傾向がある。
【0153】
本発明者らの結果に基づいて、本発明者らは、２．５％のＦＢＳを補充した培養培地のみを使用して本発明者らの研究を進める。彼らは、これらのインキュベーション条件の細胞を、ＪＥＧ－Ｔｏｘと改名した。
【0154】
アポトーシス誘導因子に対するＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞の応答
本発明者らは、アポトーシス化学物質とともにインキュベーションした後の、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞におけるクロマチン凝縮を研究した。クロマチン凝縮を評価する前に、本発明者らは、細胞傷害性未満の濃度、すなわち、７０％より高い生細胞の割合をもたらす濃度を選択した（データは示さず）。この閾値は、単層細胞に対する細胞毒性を評価するＩＳＯ標準及びＯＥＣＤのガイドラインにおいて推奨されている。細胞毒性未満の濃度は、エタノールについては０．１％～５％、キナルホスについては０．０３～１５０μｇ／ｍＬ、ビスフェノールＦについては２～２０μｇ／ｍＬ、４，４’ＤＤＴについては０．４～１６μｇ／ｍＬ、ＢＡＣについては０．１～２．５μｇ／ｍＬ、フェノキシエタノールについては０．０００１～０．１５％、プロピルパラベンについては０．２～２０μｇ／ｍＬ、及びＰＦＯＡについては０．０４～１００μｇ／ｍＬであった。
本発明者らは、アポトーシス化学物質とともにインキュベーションした後の、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞におけるクロマチン凝縮を研究した。クロマチン凝縮を評価する前に、本発明者らは、細胞傷害性未満の濃度、すなわち、７０％より高い生細胞の割合をもたらす濃度を選択した（データは示さず）。この閾値は、単層細胞に対する細胞毒性を評価するＩＳＯ標準及びＯＥＣＤのガイドラインにおいて推奨されている。細胞毒性未満の濃度は、エタノールについては０．１％～５％、キナルホスについては０．０３～１５０μｇ／ｍＬ、ビスフェノールＦについては２～２０μｇ／ｍＬ、４，４’ＤＤＴについては０．４～１６μｇ／ｍＬ、ＢＡＣについては０．１～２．５μｇ／ｍＬ、フェノキシエタノールについては０．０００１～０．１５％、プロピルパラベンについては０．２～２０μｇ／ｍＬ、及びＰＦＯＡについては０．０４～１００μｇ／ｍＬであった。
【0155】
図５に示すように、全てのアポトーシス化学物質は、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞においてクロマチン凝縮を有意に誘導した。エタノールは２．５％、キナルホスは０．３μｇ／ｍＬ、ビスフェノールＦは５μｇ／ｍＬ、４，４’ＤＤＴはμｇ／ｍＬ、ＢＡＣは２．５μｇ／ｍＬ、フェノキシエタノールは０．１５％、プロピルパラベンは２０μｇ／ｍＬ、及びＰＦＯＡは２０μｇ／ｍで、クロマチン凝縮を開始した。これらの濃度は全て、他の細胞型における文献に従う（２５～３１）。
【0156】
考察
化学物質は、母体組織よりも胎盤においてより濃縮される。アルコール、殺虫剤、防腐剤、又は可塑剤のような有害化学物質及び環境汚染物質への妊婦の曝露は、出産までの長さ及び体重の減少と、乳児死亡率の増加と、神経系及び他の重要臓器の発達の変化と、内分泌撹乱などをもたらし得る。
化学物質は、母体組織よりも胎盤においてより濃縮される。アルコール、殺虫剤、防腐剤、又は可塑剤のような有害化学物質及び環境汚染物質への妊婦の曝露は、出産までの長さ及び体重の減少と、乳児死亡率の増加と、神経系及び他の重要臓器の発達の変化と、内分泌撹乱などをもたらし得る。
【0157】
ＦＢＳ中に存在するタンパク質は化学物質に結合することができ、したがってそれらの潜在的な細胞毒性を覆い隠し、細胞応答に影響を及ぼす。粒子の周りに形成されたタンパク質コロナが粒子毒性に大きく影響するということが以前に提唱された。したがって、増殖培地中で使用される高ＦＢＳ濃度（主に１０％）は、毒性研究に適合しない。眼細胞株及び皮膚細胞株に関する本発明者らの先行研究のいくつかは、血清総枯渇が細胞死を誘導するので、２．５％のＦＢＳが、良好な妥協点であることを実証した（３８～４０）。この研究において、本発明者らは、２．５％のＦＢＳと１０％のＦＢＳとにおいて、胎盤ＪＥＧ－３細胞の挙動を比較した。本発明者らは、最初に細胞増殖を評価し、２．５％又は１０％のＦＢＳ中で培養したＪＥＧ－３細胞が、同様の増殖速度を有し、想定された通り、０％のＦＢＳ中の細胞は生存しなかったということを観察した。本発明者らは、第２に、ＳＴＲコアマーカーを分析し、ＪＥＧ－３細胞が、２．５％又は１０％のＦＢＳ中で培養されたかどうかにかかわらず、同じＳＴＲコアマーカー、したがって同じ遺伝子型を有すると結論付けた。本発明者らは、第３に、２．５％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞が、胎盤細胞の既知のマーカーであるサイトケラチン７（ＣＫ７）を発現することを確認するために、免疫化学研究を行った。本発明者らの結果は、ＪＥＧ－３細胞中のＦＢＳの割合を減少させても、細胞増殖速度、ＤＮＡプロファイル及び特異的タンパク質発現などの細胞同一性の特性が変化しないことを示した。２．５％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞は、１０％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞と同様のレベルのｈＣＧ、ｈＰＬ、及びエストラジオールを放出し、したがってヒト胎盤の内分泌機能を維持した。
【0158】
細胞毒性研究において、本発明者らは、ＳＬＳが１０％のＦＢＳ中で５０μｇ／ｍＬまで希釈された場合、いかなる細胞死も観察しなかったが、２．５％のＦＢＳ中で希釈された場合、ＳＬＳは３０μｇ／ｍＬで細胞生存率の劇的な損失を誘導した。ＰＦＯＡの細胞毒性は、２．５％のＦＢＳで希釈した場合には、２００μＭで明らかになったが、１０％のＦＢＳで希釈した場合には３００μＭでも、細胞生存率のわずかな低下しか観察されなかった。２．５％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞は、１０％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞よりも毒性試験に適しているようである。本発明者らは、２．５％のＦＢＳ中のＪＥＧ－３細胞を、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞と改名した。
【0159】
アポトーシスは、胎盤機能不全症における重要な機序であることが示唆されている。増加する量のデータは、制御されない胎盤アポトーシスが、胎盤及び母体の両方の生理機能に対して副作用を有するということを、実際に示唆している。胎盤毒性の評価のための適切なモデルとしてのＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞を検証するために、本発明者らは、それらが既知のアポトーシス剤とのインキュベーション後に、アポトーシスを誘発することができるかどうかを調べた。本発明者らは、妊婦が曝露され得る化学物質、例えばアルコール消費を通じてのエタノール、化粧品又は薬物中に存在する防腐剤、殺虫剤、及び調理器具のコーティングなどを選択した。本発明者の実験条件において、試験した全てのアポトーシス化学物質は、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞においてクロマチン凝縮を誘導した。
【0160】
結論として、ＦＢＳの割合を、細胞成長のために推奨される濃度である１０％から２．５％に減少させても、ＤＮＡプロファイルにも、胎盤マーカーにも、ホルモン分泌にも影響を与えないが、ＦＢＳが１０％の場合とは対照的に、化学物質に対する細胞感受性を増加させる胎盤毒性を明らかにする。ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞は、胎盤毒性学的研究において、特に、多数の重篤な妊娠障害の起源であるアポトーシスを研究するために、非常に価値があり得る。
【0161】
実施例２：内分泌撹乱化学物質は、妊娠障害においてＰ２Ｘ７受容体を活性化する
本発明者らは、実施例１に定義されるようなヒト胎盤ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞において、Ｐ２Ｘ７受容体及びカスパーゼ－１を活性化するそれらの能力について、異なる化学ファミリーからの１０種のＥＤＣ、３種のフタレート、２種のビスフェノール、１種のカンファー誘導体、３種のフェノール、及び１種のパラベンを試験した。本明細書に含まれるＥＤＣＳは、妊娠しているヒト及び胎盤において最も見出される化学物質ファミリーのメンバーであり、それらは、胎盤機能を変化させ、かつ／又は妊娠転帰及び合併症を誘導するということが実証されている。
本発明者らは、実施例１に定義されるようなヒト胎盤ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞において、Ｐ２Ｘ７受容体及びカスパーゼ－１を活性化するそれらの能力について、異なる化学ファミリーからの１０種のＥＤＣ、３種のフタレート、２種のビスフェノール、１種のカンファー誘導体、３種のフェノール、及び１種のパラベンを試験した。本明細書に含まれるＥＤＣＳは、妊娠しているヒト及び胎盤において最も見出される化学物質ファミリーのメンバーであり、それらは、胎盤機能を変化させ、かつ／又は妊娠転帰及び合併症を誘導するということが実証されている。
【0162】
材料及び方法
化学薬品及び試薬
細胞培養試薬：最小必須培地（ＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｇｉｂｃｏ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）によって提供され、フラスコ及びマイクロプレートなどの細胞培養材料は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｓｃｈｉｐｈｏｌ－Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供された。ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）プローブは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から入手し、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１インフラマソームアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手した。全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
化学薬品及び試薬
細胞培養試薬：最小必須培地（ＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｇｉｂｃｏ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）によって提供され、フラスコ及びマイクロプレートなどの細胞培養材料は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｓｃｈｉｐｈｏｌ－Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供された。ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）プローブは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から入手し、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１インフラマソームアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手した。全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【0163】
ジ（２－エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）を培養培地に溶解させた。ベンジルブチルフタレート、ジブチルフタレート、及びプロピルパラベンを無水エタノールに溶解させた。ビスフェノールＡ、ジエチルスチルベストロール、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール、トリクロザン、及び３－ベンジリデンカンファーをＤＭＳＯに溶解させた。ストック溶液は、－２０℃で保存し、作業溶液は、培養培地で１／１０００希釈した後に得た。細胞に対する無水エタノール及びＤＭＳＯの最終濃度は、０．１％以下であった。
【0164】
ＪＥＧ－３細胞培養物
ヒト胎盤癌腫に由来するＪＥＧ－３ヒト栄養膜細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手した（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６）。細胞を、７５ｃｍ２のポリスチレンフラスコ中、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のＬ－グルタミン、０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを補充した最小必須培地中で培養した。細胞培養物を、細胞培養インキュベーター内で、３７℃、飽和湿度、５％のＣＯ２濃度で維持した。ＪＥＧ－３細胞がサブコンフルエントに達したとき、それらをトリプシン－ＥＤＴＡを用いて剥離し、計数した。細胞懸濁液を希釈し、９６ウェルマイクロプレートに８０，０００細胞数／ｍＬの細胞密度又は６ウェルマイクロプレートに１２０，０００細胞数／ｍＬの細胞密度のいずれかで播種し、次いで３７℃で２４時間にわたり維持した。細胞を実施例１に従ってＥＤＣとともにインキュベートした。
ヒト胎盤癌腫に由来するＪＥＧ－３ヒト栄養膜細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手した（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６）。細胞を、７５ｃｍ２のポリスチレンフラスコ中、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のＬ－グルタミン、０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを補充した最小必須培地中で培養した。細胞培養物を、細胞培養インキュベーター内で、３７℃、飽和湿度、５％のＣＯ２濃度で維持した。ＪＥＧ－３細胞がサブコンフルエントに達したとき、それらをトリプシン－ＥＤＴＡを用いて剥離し、計数した。細胞懸濁液を希釈し、９６ウェルマイクロプレートに８０，０００細胞数／ｍＬの細胞密度又は６ウェルマイクロプレートに１２０，０００細胞数／ｍＬの細胞密度のいずれかで播種し、次いで３７℃で２４時間にわたり維持した。細胞を実施例１に従ってＥＤＣとともにインキュベートした。
【0165】
細胞生存率：ニュートラルレッドアッセイ
ニュートラルレッドアッセイを使用して細胞生存率を評価した。０．４％（水中ｍ／ｖ）のニュートラルレッド溶液を、細胞培養培地で希釈して、５０μｇ／ｍＬの作業濃度を得た。ニュートラルレッド作業溶液を、３７℃で３時間のインキュベーション時間にわたってプレート中に分配した。次いで、細胞をＰＢＳですすぎ、酢酸－エタノール（エタノール５０．６％、水４８．４％、及び酢酸１％）の溶液で溶解させた。均質化後、蛍光シグナルを、Ｔｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーでスキャンした（λｅｘｃ＝５４０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。細胞生存率を、対照の細胞の生存率（１００％生存率としての対照の細胞の蛍光）と比較して計算した。
ニュートラルレッドアッセイを使用して細胞生存率を評価した。０．４％（水中ｍ／ｖ）のニュートラルレッド溶液を、細胞培養培地で希釈して、５０μｇ／ｍＬの作業濃度を得た。ニュートラルレッド作業溶液を、３７℃で３時間のインキュベーション時間にわたってプレート中に分配した。次いで、細胞をＰＢＳですすぎ、酢酸－エタノール（エタノール５０．６％、水４８．４％、及び酢酸１％）の溶液で溶解させた。均質化後、蛍光シグナルを、Ｔｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーでスキャンした（λｅｘｃ＝５４０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。細胞生存率を、対照の細胞の生存率（１００％生存率としての対照の細胞の蛍光）と比較して計算した。
【0166】
Ｐ２Ｘ７受容体活性化：ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）アッセイ
Ｐ２Ｘ７細胞死受容体活性化を、ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）アッセイを用いて評価した（Ｒａｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｊａｎ ２０；４（１）：ｅ６４）。ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）プローブは、Ｐ２Ｘ７受容体活性化誘導性ポア開口後にのみ細胞内に入り、ＤＮＡに結合して蛍光を発する。１ｍＭのＹＯ－ＰＲＯ－１ストック溶液を、使用直前にＰＢＳで１／５００に希釈し、マイクロプレートのウェルに分配した。室温で１０分間インキュベートした後、蛍光シグナルをＳｐａｒｋサイトフルオロメーターで読み取った（λｅｘ＝４９１ｎｍ、λｅｍ＝５０９ｎｍ）。
Ｐ２Ｘ７細胞死受容体活性化を、ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）アッセイを用いて評価した（Ｒａｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｊａｎ ２０；４（１）：ｅ６４）。ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）プローブは、Ｐ２Ｘ７受容体活性化誘導性ポア開口後にのみ細胞内に入り、ＤＮＡに結合して蛍光を発する。１ｍＭのＹＯ－ＰＲＯ－１ストック溶液を、使用直前にＰＢＳで１／５００に希釈し、マイクロプレートのウェルに分配した。室温で１０分間インキュベートした後、蛍光シグナルをＳｐａｒｋサイトフルオロメーターで読み取った（λｅｘ＝４９１ｎｍ、λｅｍ＝５０９ｎｍ）。
【0167】
カスパーゼ１活性：カスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）１インフラマソームアッセイ
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１１インフラマソームアッセイキットを使用して、カスパーゼ１の活性を評価した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。発光をＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーで定量化した。
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１１インフラマソームアッセイキットを使用して、カスパーゼ１の活性を評価した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。発光をＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーで定量化した。
【0168】
結果の活用及び統計分析
結果を、対照の細胞と比較した割合又は倍率変化で表し、少なくとも３回の独立した実験の平均±平均の標準誤差として提示する。
結果を、対照の細胞と比較した割合又は倍率変化で表し、少なくとも３回の独立した実験の平均±平均の標準誤差として提示する。
【0169】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、統計分析を行った。一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を、５％に設定したリスクで実施した。有意性の閾値は、対照の細胞と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５であった。
【0170】
結果
ＪＥＧ－３細胞の生存率
本発明者らは、ニュートラルレッドアッセイを使用して、ＥＤＣとともにインキュベーションした後の、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞生存率を調査した。３０％以上の細胞生存率の損失を誘導する任意の濃度を、細胞毒性とみなした（ISO、２００９）。
ＪＥＧ－３細胞の生存率
本発明者らは、ニュートラルレッドアッセイを使用して、ＥＤＣとともにインキュベーションした後の、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞生存率を調査した。３０％以上の細胞生存率の損失を誘導する任意の濃度を、細胞毒性とみなした（ISO、２００９）。
【0171】
細胞生存率の損失は、最大２０μＭのビスフェノールＡ（図６）でも、最大５０μＭの４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール（図６Ｃ）でも、７２時間後には観察されなかった。プロピルパラベンは、１００μＭで、細胞生存率をわずかに低下させた（８７％、図６Ｆ）。
【0172】
１５μＭのジエチルスチルベストロール及び１０μＭのトリクロザンは、それぞれ、４０％及び６０％まで生存率を低下させた（図６Ｂ及び図６Ｅ）。５０μＭで、３－ベンジリデンカンファー、ジブチルフタレート、ベンジルブチルフタレート、及びＤＥＨＰは、細胞生存率をそれぞれ７０％、７０％、５５％、４０％及び２５％に、有意に低下させた（図６Ｄ、図６Ｊ、図６Ｈ、図６Ｇ、及び図６Ｉ）。細胞毒性濃度は、その後のアッセイからは排除した。
【0173】
Ｐ２Ｘ７受容体の活性化
Ｐ２Ｘ７受容体の活性化を反映するＰ２Ｘ７細孔開口を、蛍光ＹＯ－ＰＲＯ－１アッセイを用いて評価した。Ｐ２Ｘ７受容体は、１つを除いて、試験したＥＤＣの全てによって有意に活性化された。
Ｐ２Ｘ７受容体の活性化を反映するＰ２Ｘ７細孔開口を、蛍光ＹＯ－ＰＲＯ－１アッセイを用いて評価した。Ｐ２Ｘ７受容体は、１つを除いて、試験したＥＤＣの全てによって有意に活性化された。
【0174】
ビスフェノールＡ、ＤＥＨＰ、及びトリクロサンは、ごくわずかな倍率変化を誘導した薬剤であった（それぞれ、対照と比較して、図７Ａにおいて２０μＭで１．２１倍、図２Ｉにおいて１０μＭで１．１６倍、及び図７Ｅにおいて１μＭで１．１３倍）。
【0175】
ジエチルスチルベストロール、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール、ブチルベンジルフタレート、及び３－ベンジリデンカンファーは、中程度の倍率変化を誘導した（図２Ｂにおいて７．５μＭで１．４８倍、図７Ｃにおいて５０μＭで１．３６倍、図７Ｇにおいて１０μＭで１．３６倍、図７Ｊにおいて１０μＭで１．５０倍）。
【0176】
【0177】
カスパーゼ－１活性
生物発光Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１アッセイを使用して、カスパーゼ－１活性を定量化した。
生物発光Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１アッセイを使用して、カスパーゼ－１活性を定量化した。
【0178】
最も高い濃度のビスフェノール－Ａ、ジエチルスチルベストロール、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール、及びプロピルパラベンのみが、対照と比較してカスパーゼ－１を有意に活性化した（それぞれ、対照と比較して、１．６４倍、１．８４倍、１．５倍、５．１倍及び２．７倍、図８Ａ～図８Ｃ及び図８Ｆ）。
【0179】
【0180】
カスパーゼ－９活性
Ｐ２Ｘ７細胞死受容体はまた、主要な細胞死経路であるアポトーシスの開始を誘発することが知られている。Ｐ２Ｘ７受容体は、主にカルシウム依存性カスパーゼ－９媒介ミトコンドリア経路に関与するアポトーシスを刺激する。本発明者らは、カスパーゼ－９活性の評価を通してアポトーシスを研究した。
Ｐ２Ｘ７細胞死受容体はまた、主要な細胞死経路であるアポトーシスの開始を誘発することが知られている。Ｐ２Ｘ７受容体は、主にカルシウム依存性カスパーゼ－９媒介ミトコンドリア経路に関与するアポトーシスを刺激する。本発明者らは、カスパーゼ－９活性の評価を通してアポトーシスを研究した。
【0181】
【0182】
以下表４に、本実施例で得られた結果をまとめる。
【0183】
【表4】
【0184】
考察
先行研究は、胎盤が、毒性化合物のための完全な標的器官として考慮されるべきであり、ＪＥＧ－Ｔｏｘのような胎盤細胞株が、毒性学的研究のための有用なツールを代表し得るということを明らかにした。Ｐ２Ｘ７受容体は、ヒト胎盤及びＪＥＧ－Ｔｏｘによって発現される。
先行研究は、胎盤が、毒性化合物のための完全な標的器官として考慮されるべきであり、ＪＥＧ－Ｔｏｘのような胎盤細胞株が、毒性学的研究のための有用なツールを代表し得るということを明らかにした。Ｐ２Ｘ７受容体は、ヒト胎盤及びＪＥＧ－Ｔｏｘによって発現される。
【0185】
この研究は、試験したＥＤＣの大部分が、ＪＥＧ－ＴｏｘにおけるＰ２Ｘ７受容体の活性化を誘導することを示した。試験した１０個のＥＤＣのうち９個（ビスフェノールＡ、ジエチルスチルベストロール、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール、トリクロザン、プロピルパラベン、ブチルベンジルフタレート、ジブチルフタレート、ＤＥＨＰ、及び３－ベンジリデンカンファー）は、Ｐ２Ｘ７受容体活性化を誘発した。これらのＥＤＣは、ビスフェノールから、アルキルフェノール、パラベン、及びカンファー誘導体を介してフタレートまでの異なる化学ファミリーに属する。
【0186】
Ｐ２Ｘ７受容体を活性化するこれらのＥＤＣのうち、４つ（ビスフェノールＡ、ジエチルスチルベストロール、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール、及びプロピルパラベン）はまた、カスパーゼ－１も活性化した。カスパーゼ－１は、インフラマソーム複合体の形成を介して成熟及び活性化される。その活性化は、ＩＬ－１β及びＩＬ－１８などの活性化炎症性サイトカインの産生だけでなく、原形質膜透過性及び前炎症性細胞内化合物の放出によって特徴付けられる細胞死ももたらし得る。これは、ピロトーシスとしても知られる細胞死のインフラマソーム－カスパーゼ－１依存性プログラムである。Ｐ２Ｘ７受容体活性化は、カスパーゼ－１活性化を必要とする細胞死変性をもたらす。
【0187】
この研究は、Ｐ２Ｘ７受容体を活性化する試験されたいくつかのＥＤＣが、カスパーゼ－１活性に対して効果を有さないことも明らかにする。これは５つのＥＤＣ（トリクロサン、ブチルベンジルフタレート、ジブチルフタレート、ＤＥＨＰ、及び３－ベンジリデンカンファー）の場合である。これは、Ｐ２Ｘ７受容体が他の経路によって細胞変性を誘発することも知られているという事実によって説明することができる。
【0188】
Ｐ２Ｘ７細胞死受容体はまた、主要な細胞死経路であるアポトーシスの開始を誘発することが知られている。Ｐ２Ｘ７受容体は、主にカルシウム依存性カスパーゼ－９媒介ミトコンドリア経路に関与するアポトーシスを刺激する。本発明者らは、カスパーゼ－９活性の評価を通してアポトーシスを研究した。
【0189】
内分泌撹乱物質は、Ｐ２Ｘ７活性化によって、ＤＮＡ損傷、遺伝毒性効果及び癌リスクを誘導し得る。
【0190】
図２０に示すように、内分泌撹乱物質は、Ｐ２Ｘ７を活性化し、それ自体が、カスパーゼ－１の活性化を介してＤＮＡ損傷を誘導するインフラマソーム経路を活性化する。
【0191】
癌細胞成長及び腫瘍進行における役割も実証されている。
【0192】
ビスフェノールＡ、ジエチルスチルベストロール、４－ｔｅｒｔ－アミルフェノール、及びプロピルパラベンの曝露は、Ｐ２Ｘ７受容体及びカスパーゼ－１を活性化する。更に、これらのＥＤＣは胎盤において見出され、妊娠中のそれらの曝露は胎盤機能不全に関連し、多くの有害な妊娠転帰をもたらし得る。更に、早産及び妊娠高血圧腎症は、Ｐ２Ｘ７受容体活性化によって引き起こされるということが示唆されている（Ｔｓｉｍｉｓ ｅｔ ａｌ．、２０１７；Ｆｏｄｏｒら、２０１９年）。本発明者らの結果は、ＥＤＣが、Ｐ２Ｘ７受容体活性化及びインフラマソーム－カスパーゼ－１活性化を介して胎盤転帰を誘発し得ることを示唆している。
【0193】
Ｐ２Ｘ７活性化後に分泌される炎症促進性サイトカインには、ＩＬ－１ｂ及びＩＬ１８だけでなく、ＩＬ－６及びＩＬ－１ａも含まれるが、インフラマソーム非依存的経路を介するものである。おそらく、最も良く特徴付けられているものの１つは、核因子ＮＦ－ｊＢ（ＴＮＦａ、ＣＯＸ－２、及びＩＬ－１ｂ自体を含むいくつかの炎症性遺伝子の発現を制御する転写因子）の活性化である。
【0194】
ミクログリア、破骨細胞及び骨芽細胞におけるＮＦ－ＫＢのＰ２Ｘ７Ｒ依存性活性化を実証する影響力のある研究は、
Ｐ２Ｘ７Ｒ炎症促進活性をＮＦ－ＫＢ核転座に関連付ける、増加しつつある報告によって更に確認された。
Ｐ２Ｘ７Ｒ炎症促進活性をＮＦ－ＫＢ核転座に関連付ける、増加しつつある報告によって更に確認された。
【0195】
結論
本実施例において、本発明者らは、内分泌撹乱物質が、Ｐ２Ｘ７変性受容体を活性化することによって胎盤の変化を誘導するということを見出した。したがって、Ｐ２Ｘ７受容体の活性化は、胎盤に対する内分泌撹乱物質の有害作用を評価するためのバイオマーカーである。実際、その活性化は、分子の化学構造及びクラスに関係なく現れ、どのようなホルモンでも後に妨害される。
本実施例において、本発明者らは、内分泌撹乱物質が、Ｐ２Ｘ７変性受容体を活性化することによって胎盤の変化を誘導するということを見出した。したがって、Ｐ２Ｘ７受容体の活性化は、胎盤に対する内分泌撹乱物質の有害作用を評価するためのバイオマーカーである。実際、その活性化は、分子の化学構造及びクラスに関係なく現れ、どのようなホルモンでも後に妨害される。
【0196】
ヒト胎盤モデルは、内分泌撹乱物質の評価に十分に適している。これは、ホルモンの変化を評価し、急性（Ｐ２Ｘ７活性化）又は慢性の有害作用（遺伝毒性、アロマターゼｃｙｐ１９障害及び生殖障害、代謝障害のリスクなど）をチェックするために使用される。したがって、内分泌撹乱物質の欧州の定義に、ひいてはホルモン評価と有害効果とを組み合わせなければならないそれらの識別に、可能な限り最良に応答することが可能になる。
【0197】
革新的な細胞モデル、ホルモン測定、及び内分泌撹乱物質の有害な影響の新しいバイオマーカーを組み合わせるこの新世代の試験（すなわち、ｈＰＬＡＣＥＮＴＯＸ－ＥＤアッセイ）は、内分泌撹乱物質の有害な影響の評価及びこれらの欧州規制の枠組み内の任意の新しい物質によるこれらの影響の特定を現在必要とする新しい欧州規制（化学薬品－ＲＥＡＣＨ、化粧品、医療機器）に可能な限り最良に対応することを可能にする。
【0198】
実施例３：ビスフェノールＡ及びビスフェノールＦの分析
過去１０年間にわたって、環境内分泌撹乱化学物質、特にビスフェノールＡ（ＢＰＡ）へのヒトの曝露は、公衆衛生にとって支配的な脅威であると思われる。ＢＰＡは、１９世紀後半に発見されたフェノール化合物である。それは、食品容器及び飲料、コンパクトディスク、個人保護機器、スポーツ機器及び医療機器のような広範囲の製品において使用され、全てのヒトに対して多くの曝露源をもたらすものである。
過去１０年間にわたって、環境内分泌撹乱化学物質、特にビスフェノールＡ（ＢＰＡ）へのヒトの曝露は、公衆衛生にとって支配的な脅威であると思われる。ＢＰＡは、１９世紀後半に発見されたフェノール化合物である。それは、食品容器及び飲料、コンパクトディスク、個人保護機器、スポーツ機器及び医療機器のような広範囲の製品において使用され、全てのヒトに対して多くの曝露源をもたらすものである。
【0199】
胎盤に対するＢＰＡ効果は、それによって胎児プログラミングを変化させ得る。胎盤は、実際に妊娠中の重要な器官であり、内分泌器官として作用し、母親と胎児との間の界面である。Ｌｅｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ．は、非常に低濃度のＢＰＡであっても、インビトロでヒト細胞性栄養膜細胞のアポトーシス、壊死、及び炎症を誘導することができるということを示した。
【0200】
ＢＰＡは、まずその生殖毒性特性のため、次にその内分泌撹乱特性のために、ＲＥＡＣｈ法の下で非常に懸念の高い物質（ＳＶＨＣ）として挙げられている。カナダ（２００８）、フランス（２０１０）、及びＥＵ（２０１１）では、その使用は制限されており、哺乳瓶での使用は禁止されている。フランスでは、２０１５年１月以来、ＢＰＡはあらゆる食品又は飲料包装において禁止されている。ＢＰＡ使用に対するこのような制限により、製造業者はビスフェノールＦなどの代替ビスフェノールを使用するようになった。しかしながら、ＢＰＡ構造類似体の使用が増加しているにもかかわらず、これらの分子の潜在的な胎盤及び胎児に対する毒性に関する情報は限られている。
【0201】
本発明者らの目的は、ヒト胎盤細胞株に対するビスフェノールＡの毒性を、その代替物であるビスフェノールＦのそれと比較して、胎盤及び妊娠への潜在的リスクを強調することであった。
【0202】
１．材料及び方法
化学薬品及び試薬
ビスフェノールＡは、次式の化合物である：
化学薬品及び試薬
ビスフェノールＡは、次式の化合物である：
【0203】
【化1】
【0204】
ビスフェノールＦは、次式の化合物である：
【0205】
【化2】
【0206】
細胞培養試薬：最小必須培地（ＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｇｉｂｃｏ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）によって提供され、フラスコ及びマイクロプレートなどの細胞培養材料は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｓｃｈｉｐｈｏｌ－Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供された。ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）プローブは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から入手し、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１インフラマソームアッセイ及びＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）９アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手した。全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【0207】
ビスフェノールＡ及びビスフェノールＦをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。ストック溶液は、－２０℃で保存し、作業溶液は、培養培地で１／１０００希釈した後に得た。細胞上でのＤＭＳＯの最終濃度は０．１％以下であった。
【0208】
ＪＥＧ－３細胞培養物
ヒト胎盤癌腫に由来するＪＥＧ－３ヒト栄養膜細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手した（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６）。細胞を、７５ｃｍ２のポリスチレンフラスコ中、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のＬ－グルタミン、０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを補充した最小必須培地中で培養した。細胞培養物は、細胞培養インキュベーター（３７℃、飽和湿度、５％のＣＯ２濃度）内に維持した。ＪＥＧ－３細胞がサブコンフルエントに達したとき、それらをトリプシン－ＥＤＴＡを用いて剥離し、計数した。細胞懸濁液を希釈し、９６ウェルマイクロプレート中に８０，０００細胞数／ｍＬの細胞密度で、２４ウェルマイクロプレート中に１６０，０００細胞数／ｍＬで、又は６ウェルマイクロプレート中に１２０，０００細胞数／ｍＬで播種し、次いで３７℃で２４時間維持した。ＪＥＧ－Ｔｏｘモデルを以前に説明したＯｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．に従って、細胞をＥＤＣとともにインキュベートした。
ヒト胎盤癌腫に由来するＪＥＧ－３ヒト栄養膜細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手した（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６）。細胞を、７５ｃｍ２のポリスチレンフラスコ中、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のＬ－グルタミン、０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを補充した最小必須培地中で培養した。細胞培養物は、細胞培養インキュベーター（３７℃、飽和湿度、５％のＣＯ２濃度）内に維持した。ＪＥＧ－３細胞がサブコンフルエントに達したとき、それらをトリプシン－ＥＤＴＡを用いて剥離し、計数した。細胞懸濁液を希釈し、９６ウェルマイクロプレート中に８０，０００細胞数／ｍＬの細胞密度で、２４ウェルマイクロプレート中に１６０，０００細胞数／ｍＬで、又は６ウェルマイクロプレート中に１２０，０００細胞数／ｍＬで播種し、次いで３７℃で２４時間維持した。ＪＥＧ－Ｔｏｘモデルを以前に説明したＯｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．に従って、細胞をＥＤＣとともにインキュベートした。
【0209】
細胞生存率：ニュートラルレッドアッセイ
ニュートラルレッドアッセイを使用して細胞生存率を評価した。０．４％（水中ｍ／ｖ）のニュートラルレッド溶液を、細胞培養培地で希釈して、５０μｇ／ｍＬの作業濃度を得た。ニュートラルレッド作業溶液を、３７℃で３時間のインキュベーション時間にわたってプレート中に分配した。次いで、細胞をＰＢＳですすぎ、酢酸－エタノール（エタノール５０．６％、水４８．４％、及び酢酸１％）の溶液で溶解させた。均質化後、蛍光シグナルを、Ｔｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーでスキャンした（λｅｘｃ＝５４０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。細胞生存率を、対照の細胞のそれ（１００％生存率としての対照の細胞の蛍光）と比較して計算した。
ニュートラルレッドアッセイを使用して細胞生存率を評価した。０．４％（水中ｍ／ｖ）のニュートラルレッド溶液を、細胞培養培地で希釈して、５０μｇ／ｍＬの作業濃度を得た。ニュートラルレッド作業溶液を、３７℃で３時間のインキュベーション時間にわたってプレート中に分配した。次いで、細胞をＰＢＳですすぎ、酢酸－エタノール（エタノール５０．６％、水４８．４％、及び酢酸１％）の溶液で溶解させた。均質化後、蛍光シグナルを、Ｔｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーでスキャンした（λｅｘｃ＝５４０ｎｍ、λｅｍ＝６００ｎｍ）。細胞生存率を、対照の細胞のそれ（１００％生存率としての対照の細胞の蛍光）と比較して計算した。
【0210】
Ｐ２Ｘ７受容体活性化：ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）アッセイ
Ｐ２Ｘ７細胞死受容体活性化を、ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）アッセイ（Rat et al.、２０１７）を使用して評価した。ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）プローブは、Ｐ２Ｘ７受容体活性化誘導性ポア開口後にのみ細胞内に入り、ＤＮＡに結合して蛍光を発する。１ｍＭのＹＯ－ＰＲＯ－１ストック溶液を、使用直前にＰＢＳで１／５００に希釈し、マイクロプレートのウェルに分配した。室温で１０分間インキュベートした後、蛍光シグナルをＳｐａｒｋサイトフルオロメーターで読み取った（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５３１ｎｍ）。
Ｐ２Ｘ７細胞死受容体活性化を、ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）アッセイ（Rat et al.、２０１７）を使用して評価した。ＹＯ－ＰＲＯ－１（登録商標）プローブは、Ｐ２Ｘ７受容体活性化誘導性ポア開口後にのみ細胞内に入り、ＤＮＡに結合して蛍光を発する。１ｍＭのＹＯ－ＰＲＯ－１ストック溶液を、使用直前にＰＢＳで１／５００に希釈し、マイクロプレートのウェルに分配した。室温で１０分間インキュベートした後、蛍光シグナルをＳｐａｒｋサイトフルオロメーターで読み取った（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５３１ｎｍ）。
【0211】
カスパーゼ１活性：カスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）１インフラマソームアッセイ
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１インフラマソームアッセイキットを使用して、カスパーゼ１の活性を評価した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。発光をＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーで定量化した。
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１インフラマソームアッセイキットを使用して、カスパーゼ１の活性を評価した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。発光をＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーで定量化した。
【0212】
カスパーゼ９活性：Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ
カスパーゼ９活性を、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）９アッセイキットを使用して評価した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。発光をＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーで定量化した。
カスパーゼ９活性を、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）９アッセイキットを使用して評価した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。発光をＳｐａｒｋマイクロプレートリーダーで定量化した。
【0213】
活性酸素種（ＲＯＳ）産生：Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡアッセイ
細胞内ＲＯＳを、２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用して測定した。これは、細胞エステラーゼによって２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインに加水分解され、ＲＯＳによって高蛍光性２’，７’－ジクロロフルオレセインに酸化される。Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡの１０μＭ溶液をウェルに分配した。３７℃で２０分間のインキュベーション期間後、Ｓｐａｒｋマイクロプレートリーダーを使用して、蛍光シグナルを読み取った（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５３５ｎｍ）。
細胞内ＲＯＳを、２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用して測定した。これは、細胞エステラーゼによって２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインに加水分解され、ＲＯＳによって高蛍光性２’，７’－ジクロロフルオレセインに酸化される。Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡの１０μＭ溶液をウェルに分配した。３７℃で２０分間のインキュベーション期間後、Ｓｐａｒｋマイクロプレートリーダーを使用して、蛍光シグナルを読み取った（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５３５ｎｍ）。
【0214】
細胞遊走アッセイ：
ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞を、２４ウェルマイクロプレートに１６００００細胞数／ｍＬで、２４時間かけて播種した。物理的細胞排除は、細胞播種前に培養表面上にインサート（Ｉｂｉｄｉ）を置くことによって作製される。インサートを除去し（０日目）、細胞をビスフェノールとともに２４時間インキュベートした（１日目）。創傷表面を、任意単位での定量化を可能にするＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって分析する。１日目に観察された創傷面積に対する０日目に観察された創傷面積の比は、細胞遊走因子に対応する。
ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞を、２４ウェルマイクロプレートに１６００００細胞数／ｍＬで、２４時間かけて播種した。物理的細胞排除は、細胞播種前に培養表面上にインサート（Ｉｂｉｄｉ）を置くことによって作製される。インサートを除去し（０日目）、細胞をビスフェノールとともに２４時間インキュベートした（１日目）。創傷表面を、任意単位での定量化を可能にするＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって分析する。１日目に観察された創傷面積に対する０日目に観察された創傷面積の比は、細胞遊走因子に対応する。
【0215】
結果の活用及び統計分析
結果を、対照の細胞と比較した割合又は倍率変化で表し、少なくとも３回の独立した実験の平均±平均の標準誤差として提示する。
結果を、対照の細胞と比較した割合又は倍率変化で表し、少なくとも３回の独立した実験の平均±平均の標準誤差として提示する。
【0216】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、統計分析を行った。一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を、５％に設定したリスクで実施した。有意性の閾値は、対照の細胞と比較して、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５であった。
【0217】
２．結果
本発明者らは、ニュートラルレッドアッセイを使用して、ＥＤＣとともにインキュベーションした後の、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞生存率を調査した。３０％以上の細胞生存率の損失を誘導する任意の濃度を、細胞毒性とみなした（ISO、２００９）。
本発明者らは、ニュートラルレッドアッセイを使用して、ＥＤＣとともにインキュベーションした後の、ＪＥＧ－Ｔｏｘ細胞生存率を調査した。３０％以上の細胞生存率の損失を誘導する任意の濃度を、細胞毒性とみなした（ISO、２００９）。
【0218】
【0219】
Ｐ２Ｘ７受容体の活性化を反映するＰ２Ｘ７細孔開口を、蛍光ＹＯ－ＰＲＯ－１アッセイを用いて評価した。Ｐ２Ｘ７受容体は、試験した２種のビスフェノールによって有意に活性化された。ＢＰＦは最も強力な活性化因子であった（対照と比較して、２５μＭで１．２４倍、５０μＭでは、１．４６倍。図１３）。ＢＰＡは、中程度の倍率変化を誘導した（２５μＭで１．２６倍、５０μＭで１．３４倍、図１２）。
【0220】
生物発光Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）１アッセイ及びカスパーゼ－９アッセイを使用して、それぞれ、カスパーゼ－１の活性及びカスパーゼ－９の活性を定量化した。
【0221】
試験した全ての濃度のＢＰＦは、対照と比較して、カスパーゼ－１を有意に活性化した（それぞれ２５μＭ及び５０μＭで、１．６０倍及び２．６１倍、図１５）。同様の結果が、カスパーゼ－９の、２５μＭ及び５０μＭのＢＰＦについて得られ、これらは、カスパーゼ－９を有意に活性化した（それぞれ、１．４７倍及び１．６７倍、図１７）。最高濃度のＢＰＡのみが、カスパーゼ－１を有意に活性化し（５０μＭで１．５７倍、図１４）及びカスパーゼ－９を有意に活性化した（１．２８倍、図１６）。
【0222】
酸化ストレスを反映するＲＯＳ産生を、蛍光Ｈ２ＤＣＦ－ＤＡアッセイを使用して評価した。ＢＰＦのみが酸化ストレスを誘導したが、有意なＲＯＳ産生が誘導された（２５μＭ及び５０μＭで２．５倍、図１８）。対照的に、ＢＰＡはＲＯＳ産生に影響を及ぼさなかった（図１７）。
【0223】
考察及び結論
本実施例において、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７受容体の活性を測定することによって、本発明による細胞培養物、すなわち、少量の血清（２．５％）を含有する培地中で培養されたＪＥＧ－３細胞が、ビスフェノールＡは、欧州連合の定義による内分泌撹乱物質であることを確認できるということを実証した。更に、本発明者らは、ビスフェノールＡに非常に類似した構造を有する化合物、すなわちビスフェノールＦも、欧州連合の定義による内分泌撹乱物質に相当するということも特定した。
本実施例において、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７受容体の活性を測定することによって、本発明による細胞培養物、すなわち、少量の血清（２．５％）を含有する培地中で培養されたＪＥＧ－３細胞が、ビスフェノールＡは、欧州連合の定義による内分泌撹乱物質であることを確認できるということを実証した。更に、本発明者らは、ビスフェノールＡに非常に類似した構造を有する化合物、すなわちビスフェノールＦも、欧州連合の定義による内分泌撹乱物質に相当するということも特定した。
【0224】
従って、ビスフェノールＡは、化合物が内分泌撹乱物質であるかどうかを特定するための、血清含有培地中で培養されたＪＥＧ－３細胞を含有するキットにおいて、陽性対照として使用することができる。
【0225】
内分泌撹乱物質であることが確認された化合物の長期効果を評価するために、カスパーゼ－１及びカスパーゼ－９の活性、ＲＯＳ産生、ＤＮＡ損傷検出、並びに多くの他の更なる試験を行うことができる。
【0226】
本発明は上の説明に限定されず、当業者は本発明の追加の実施形態を推論することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】