特表 2024-500492 蛍光色素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-09

(54)【発明の名称】蛍光色素

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20231226BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231226BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20231226BHJP

   C07D 311/82 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20231226BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12Q1/02

C12N15/87 Z

C07D311/82 CSP

A61K47/46

A61K9/50

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023538940

(86)(22)【出願日】2021-12-24

(85)【翻訳文提出日】2023-08-22

(86)【国際出願番号】 AU2021051560

(87)【国際公開番号】W WO2022133552

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】2020904852

(32)【優先日】2020-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519181113

【氏名又は名称】エクソファーマ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】パルマー，ジム

(72)【発明者】

【氏名】ディクソン，イアン

(72)【発明者】

【氏名】ジェームズ，パトリック

(72)【発明者】

【氏名】ショペット，メラニー

(72)【発明者】

【氏名】コング，カルメン

(72)【発明者】

【氏名】マルクッチョ，セバスチャン エム

(72)【発明者】

【氏名】フェイバー，ジョナサン エム

(72)【発明者】

【氏名】ストックトン，キーラン ピー

(72)【発明者】

【氏名】ウェレット，メリッサ

(72)【発明者】

【氏名】ジョイス，ローハン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C076

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR66

4B063QR72

4B063QR77

4B063QS28

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BC50

4B065CA44

4B065CA46

4B065CA60

4C076AA61

4C076AA95

4C076EE57

4C076GG21

(57)【要約】

本発明は、その塩を含む式（Ｉ）の蛍光色素ならびにこの蛍光色素で標識された細胞外小胞および細胞に関する。本発明はその方法、使用およびキットにも関する。
【化１】

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）：

【化1】

（式中、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、ここではＲ^１およびＲ^２の少なくとも１つは任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族または任意に置換されたＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、任意に置換されたＣ_１～６アルキル、任意に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロアルキル、任意に置換されたアリールおよび任意に置換されたＣ_１～６アルキルアリールから選択されるか、あるいは
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ／または
Ｒ^５およびＲ^６はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄは独立して水素、フッ素および塩素から選択される）
の蛍光色素で標識された細胞外小胞（ＥＶ）。

【請求項2】

Ｒ^１は、Ｃ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニルおよびＣ_{１３～２６}ヘテロアルキルから選択され、
Ｒ^２は、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ヘテロアルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨおよびＣ_１～６ヘテロアルキル－ＯＨから選択され、かつ
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキルまたはＣ_１～６ハロアルキルである、
請求項１に記載のＥＶ。

【請求項3】

Ｒ^１は、Ｃ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、Ｃ_２アルキル－Ｏ－Ｃ_{１０～２３}アルキルおよびＯＣ_{１２～２５}アルキルから選択される、請求項１または請求項２に記載のＥＶ。

【請求項4】

Ｒ^１は、Ｃ_{１４～２２}アルキルおよびＣ_{１４～２２}アルケニルから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のＥＶ。

【請求項5】

Ｒ^２は、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_１～６アルキルＯＲ^８（式中、Ｒ^８は水素およびメチルから選択される）から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載のＥＶ。

【請求項6】

Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキルまたはＣ_１～６ハロアルキルである、請求項１～５のいずれか１項に記載のＥＶ。

【請求項7】

Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～３アルキルまたはＣ_１～３フルオロアルキルである、請求項１～６のいずれか１項に記載のＥＶ。

【請求項8】

Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄはそれぞれ水素である、請求項１～７のいずれか１項に記載のＥＶ。

【請求項9】

前記ＥＶは、エキソソーム、エクソメア、微小小胞体、オンコソームおよびアポトーシス小体から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載のＥＶ。

【請求項10】

式（ＩＩ）：

【化2】

（式中、
Ｒ^１は、任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族、最も長い直鎖状ヘテロ脂肪族鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子を含むＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、
Ｒ^２は、任意に置換されたＣ_１～６脂肪族、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_１～６脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、任意に置換されたＣ_１～６アルキル、任意に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意に置換されたアリールおよび任意に置換されたＣ_１～６アルキルアリールから選択されるか、あるいは
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ／または
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄは独立して、水素、フッ素および塩素から選択され、かつ
Ｘ^－は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、トリクロロ亜鉛（ＩＩ）酸、テトラクロロ鉄酸および過塩素酸から選択される）
の化合物の塩。

【請求項11】

Ｒ^１は、Ｃ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、および最も長い直鎖状ヘテロアルキル鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子を含むＣ_{１３～２６}ヘテロアルキルから選択され、
Ｒ^２は、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ヘテロアルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨおよびＣ_１～６ヘテロアルキル－ＯＨから選択され、かつ
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキルまたはＣ_１～６ハロアルキルである、
請求項１０に記載の塩。

【請求項12】

Ｒ^１は、Ｃ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、Ｃ_２アルキル－Ｏ－Ｃ_{１０～２３}アルキルおよびＯＣ_{１２～２５}アルキルから選択される、請求項１０または請求項１１に記載の塩。

【請求項13】

Ｒ^１は、Ｃ_{１４～２２}アルキルおよびＣ_{１４～２２}アルケニルから選択される、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の塩。

【請求項14】

Ｒ^２は、Ｃ_１～６アルキルおよびＣ_１～６アルキルＯＲ^８（式中、Ｒ^８は水素およびメチルから選択される）から選択される、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の塩。

【請求項15】

Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキルまたはＣ_１～６ハロアルキルである、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の塩。

【請求項16】

Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～３アルキルまたはＣ_１～３フルオロアルキルである、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の塩。

【請求項17】

Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄはそれぞれ水素である、請求項１０～１６のいずれか１項に記載の塩。

【請求項18】

以下のいずれか１つから選択される構造を有する、請求項１０～１７のいずれか１項に記載の塩：

【化3】

（式中、Ｘ^－は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸および過塩素酸から選択される）。

【請求項19】

Ｘ^－は、塩化物、臭化物およびヨウ化物から選択される、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の塩。

【請求項20】

Ｘ^－は塩化物である、請求項１０～１９のいずれか１項に記載の塩。

【請求項21】

以下のいずれか１つから選択される請求項１０に記載の塩。

【表1】

【請求項22】

請求項１０～２１のいずれか１項に記載の塩をＥＶまたは細胞と組み合わせる工程を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を標識する方法。

【請求項23】

請求項１０～２１のいずれか１項に記載の塩をＥＶと組み合わせて、それによりＥＶを前記式（Ｉ）の化合物で標識する工程を含む、標識された細胞外小胞（ＥＶ）を調製する方法。

【請求項24】

前記組み合わせる工程は、前記塩を前記ＥＶまたは細胞を含む水溶液に添加することを含む、請求項２２または請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記水溶液は緩衝液を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

・請求項１～９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の蛍光色素で標識されたＥＶまたは細胞を選択された光源に曝露して前記式（Ｉ）の蛍光色素を励起させる工程と、
・前記蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を検出する方法。

【請求項27】

・請求項１～９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の蛍光色素で標識されたＥＶまたは細胞を選択された光源に曝露して前記式（Ｉ）の蛍光色素を励起させる工程と、
・前記蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を追跡する方法。

【請求項28】

ＥＶまたは細胞を標識するための請求項１０～２１のいずれか１項に記載の塩の使用。

【請求項29】

ＥＶまたは細胞を蛍光標識するためのキットあるいはＥＶまたは細胞を蛍光標識するために使用する場合
・請求項１０～２１のいずれか１項に記載の塩と、
・任意に、細胞外小胞または細胞を蛍光標識するためのその使用についての説明書と
を含むキット。

【請求項30】

細胞を請求項１～９のいずれか１項に記載のＥＶであって、治療用カーゴを含むＥＶと接触させる工程を含む、治療用カーゴを細胞に送達するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、その塩を含む式（Ｉ）の蛍光色素ならびにこの蛍光色素で標識された細胞外小胞および細胞に関する。本発明は細胞外小胞および細胞を標識する方法ならびにこの蛍光色素を用いて標識された細胞外小胞および細胞を調製する方法にも関する。本発明はさらに本発明の蛍光色素ならびに塩の使用およびキットに関する。

【0002】

関連出願
本出願はオーストラリア仮特許出願第２０２０９０４８５２号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

細胞外小胞（ＥＶ）は細胞の細胞膜から形成された小胞である。リポソームなどの他の小胞とは異なりＥＶは、例えば細胞外タンパク質の存在を含む細胞の脂質二重層の特性を有する。従ってＥＶは、体の自然防御システムおよび免疫応答をより上手く回避することができる。

【0004】

エキソソーム、微小小胞体およびアポトーシス小体を含むＥＶのいくつかのクラスが同定されている。健康細胞および癌細胞を含む様々な細胞型がＥＶを放出することができる。それらの発見以来、ＥＶの数多くの機能が仮定または確立されてきたが、最近の研究により、ＥＶが核酸（例えばＲＮＡ）などのカーゴを細胞から細胞に運ぶそれらの能力に基づいて細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を担うことが確認された。現在、疾患の診断マーカーとして、および様々な治療用カーゴの送達のためにＥＶを開発および使用することに大きな関心が寄せられている。幹細胞などの特定の細胞型に由来するＥＶそれ自体も潜在的な治療薬としてかなり興味深い。

【0005】

ＥＶの潜在的な診断および治療用途を前提として、どのようにそれらが作用するかについてのさらなる理解を得るためにＥＶを検出および追跡できるかについて関心が寄せられている。好ましくは、ＥＶを検出および追跡するための方法は単純かつ安価であり、かつ従来の器具および当該技術分野で公知の技術を使用するべきである。ＥＶを追跡および／または追跡するための方法が開発されてきたが、この目的のために新しい方法論およびシステムが必要とされ続けている。ＥＶを検出および追跡することは、それらの生物学的機能をさらに解明すること、および潜在的にそれらの臨床使用において有用であり得る。

【0006】

従って、ＥＶの検出および／または追跡を可能にする新しい手段または他の手段が必要とされている。

【0007】

本明細書におけるあらゆる先行技術の参照は、この先行技術が任意の管轄における一般常識の一部をなしているという承認または示唆ではなく、この先行技術が合理的に理解され、関連があるとみなされることが予測され得る、かつ／または当業者によって先行技術の他の部分と組み合わせることができるという承認または示唆ではない。

【発明の概要】

【0008】

本発明者らは、ＥＶを標識することができる蛍光色素であって、有利には当該色素で標識されたＥＶを検出および追跡するのを可能にすることができる蛍光色素を突き止めた。本発明者らは、本蛍光色素が有利にはヒト細胞を含む培養細胞を標識することもできることを突き止めた。

【0009】

従って一態様では、本発明は式（Ｉ）：

【化1】

（式中、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、ここではＲ^１およびＲ^２の少なくとも１つは任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族または任意に置換されたＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、任意に置換されたＣ_１～６アルキル、任意に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロアルキル、任意に置換されたアリールおよび任意に置換されたＣ_１～６アルキルアリールから選択されるか、あるいは
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ／または
Ｒ^５およびＲ^６はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄは独立して水素、フッ素および塩素から選択される）
の蛍光色素で標識された細胞外小胞（ＥＶ）を提供する。

【0010】

別の態様では、本発明は式（ＩＩ）：

【化2】

（式中、
Ｒ^１は、任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族、最も長い直鎖状ヘテロ脂肪族鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子を含むＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、
Ｒ^２は、任意に置換されたＣ_１～６脂肪族、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_１～６脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、任意に置換されたＣ_１～６アルキル、任意に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意に置換されたアリールおよび任意に置換されたＣ_１～６アルキルアリールから選択されるか、あるいは
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ／または
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄは独立して、水素、フッ素および塩素から選択され、かつ
Ｘ^－は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、トリクロロ亜鉛（ＩＩ）酸、テトラクロロ鉄酸および過塩素酸から選択される）
の塩を提供する。

【0011】

別の態様では、本発明は式（Ｉ）の化合物と対イオンとの塩を提供する。いくつかの実施形態では、対イオンは、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、トリクロロ亜鉛（ＩＩ）酸、テトラクロロ鉄酸および過塩素酸から選択される。

【0012】

別の態様では、本発明は本明細書に記載されている式（ＩＩ）の塩（例えば、式（Ｉ）の化合物の塩）をＥＶまたは細胞と組み合わせる工程を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を標識する方法を提供する。

【0013】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている式（ＩＩ）の塩（例えば、式（Ｉ）の化合物の塩）をＥＶと組み合わせて、それによりＥＶを式（Ｉ）の化合物で標識する工程を含む、標識された細胞外小胞（ＥＶ）を調製する方法を提供する。

【0014】

別の態様では、本発明は、
・本明細書に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素で標識されたＥＶまたは細胞を選択された光源に曝露して式（Ｉ）の蛍光色素を励起させる工程と、
・この蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を検出する方法を提供する。

【0015】

別の態様では、本発明は、
・本明細書に定められている式（Ｉ）の蛍光色素で標識されたＥＶまたは細胞を選択された光源に曝露して式（Ｉ）の蛍光色素を励起させる工程と、
・この蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を追跡する方法を提供する。

【0016】

別の態様では、本発明は、ＥＶまたは細胞を標識するための本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物の塩の使用を提供する。

【0017】

別の態様では、本発明は、ＥＶまたは細胞を蛍光標識するためのキット、あるいはＥＶまたは細胞を蛍光標識するために使用する場合、
・本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物の塩と、
・任意に、細胞外小胞または細胞を蛍光標識するためのその使用についての説明書と
を含むキットを提供する。

【0018】

別の態様では、本発明は、細胞を本明細書に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素で標識されたＥＶであって治療用カーゴを含むＥＶと接触させる工程を含む、治療用カーゴを細胞に送達するための方法を提供する。

【0019】

上のパラグラフに記載されている本発明のさらなる態様および当該態様のさらなる実施形態は例として提供されており、添付の図面を参照しながらの以下の説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明の蛍光色素で標識された血小板由来のＥＶのフローサイトメトリー画像。

【図2】本発明の蛍光色素で標識された正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）のフローサイトメトリー画像。

【図3】本発明の蛍光色素で標識された（ａ）正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、（ｂ）ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）および（ｃ）骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の顕微鏡画像。

【図4】ＮＨＤＦ細胞上での、（ａ）色素２および１２～１８単独ならびに（ｂ）色素２および１２～１８で標識された血小板由来のＥＶの蛍光を示すグラフ。（ａ）および（ｂ）に示されている蛍光はそれぞれ、色素２単独および色素２で標識されたＥＶに対して正規化されている。

【図5】Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラムを通過した後の色素２で標識された血小板由来のＥＶならびに色素１７および１８の蛍光を示すグラフ。

【図6】ＮＨＤＦ細胞上での、色素２、４、６、１７、１８、２３、２４および２５で標識された血小板由来のＥＶの蛍光を示すグラフ。この蛍光は色素２で標識されたＥＶに対して正規化されている。

【図7】各時点について基本培地対照に対して正規化された、処理から（ａ）２４時間、（ｂ）３６時間、（ｃ）４８時間および（ｄ）７２時間後のＮＨＤＦ細胞の増殖に関する、色素２、４、６、１７，１８、２３、２４および２５で標識されたＥＶのデルタ細胞指標（ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ）を示すグラフ。これらの試料は以下のように表されている：０．１％基本培地：黒い丸；２％完全培地：黒い四角形；１０％高い培地（ｈｉｇｈ ｍｅｄｉａ）：黒い上向き三角形；０．１％基本培地中のＰＢＳ対照：黒い下向き三角形；ＰＬＸ＋色素２３：黒い菱形；ＰＬＸ＋色素２４：白い丸；ＰＬＸ＋色素２５：白い四角形；ＰＬＸ＋色素１８：白い上向き三角形；ＰＬＸ＋色素１７：白い下向き三角形；ＰＬＸ＋色素４：白い菱形；ＰＬＸ＋色素６：アスタリスク；ＰＬＸ＋色素２：星；ＰＬＸ単独：プラス。有意性は、多重比較（補正なしＤｕｎｎ検定）を用いるクラスカル・ウォリスノンパラメトリック一元配置分散分析により決定し、ここでは（^＊）は＜０．０５を意味し、（^＊＊）は＜０．００５を意味し、（^＊＊＊）は＜０．０００５を意味し、かつ非有意性は（^＊）がないことで示されている。

【図8】ＭＳＣ－ＥＶ調製物中の解析対象の従来の色素および色素２による蛍光標識。蛍光標識手順は、あらゆるＥＶ調製物の非存在下（上の行）、ＭＳＣ－ＥＶ単独の存在下（中間の行）またはＭＳＣ－ＥＶおよび界面活性剤ＮＰ４０の存在下で、ＣＦＳＥ、カルセインＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ、ＰＫＨ６７および色素２について行った。色素で標識された解析対象の蛍光強度（ｘ軸）は、それらのサイズを反映しているＳＳＣシグナルの強度（ｙ軸）に対してプロットされている。

【図9】（Ａ）ＰＫＨ６７および抗ＣＤ９抗体で対比染色したＭＳＣ－ＥＶ調製物について検出される解析対象のゲーティング戦略。両方の蛍光チャネル（ＣＨ０２およびＣＨ０３）を最初に全ての記録される解析対象の側方散乱強度（ＳＳＣ）に対してプロットした。チャネルごとの同時発生の解析対象の数が示されている（２番目の列）。全ての記録された解析対象のうち、その後の解析で検討される唯一の解析対象は、ＰＫＨ６７または抗体チャネルにおいて単一のシグナル、あるいは両方のチャネルにおいて単一のシグナル（シングレット）のいずれかを示したものであった。Ｃｈ０２ ＳＳＣシングレットプロット内に、低い側方散乱シグナルを有するＲ１およびＲ２ならびに明確な側方散乱シグナルを有するＲ３においてシングレットで３つの異なるゲートを定めた。Ｒ１内の解析対象はＰＫＨ６７を示さず、Ｒ２およびＲ３内のものは明確なＰＫＨ６７シグナルを示した。シングレットのＳＳＣシグナルに対してプロットしたＣｈ０２シグナルも、ゲーティング前の左側の列と同じプロットサイズまたは同じプロットのバージョンで拡大された状態のいずれかで示されている（右側の列）。（Ｂ）抗体非標識または抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３または抗ＣＤ８１標識後のＲ１、Ｒ２およびＲ３においてそれぞれ記録されたシングレットの分布。シングレットの側方散乱強度に対してＰＫＨ６７チャネル（Ｃｈ０２）または抗体チャネル（Ｃｈ０３）におけるシングレットの蛍光強度のプロット。列３～５はＲ１～Ｒ３でゲートされたシングレットの蛍光強度。（Ｃ）それぞれの測定のためのゲートＲ１～Ｒ３におけるイベントの数。平均値±標準偏差が示されている。

【図10】色素２ならびに抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３または抗ＣＤ８１抗体のいずれかで対比染色したＭＳＣ－ＥＶ調製物。図９に記載されている同じゲーティング戦略を適用した。抗体チャネル（Ｃｈ０２）または色素２チャネル（Ｃｈ０３）のいずれかについてシングレットの蛍光強度が側方散乱（ＳＳＣ）強度に対してプロットされている。３つ目の列には色素２シグナルがそれぞれの抗体のシグナルに対してプロットされている。

【図11】非標識もしくは色素２で標識されたＭＳＣ－ＥＶ調製物の存在または非存在下あるいは色素２の存在下で１２人の異なるドナーのＰＢＭＣの混合物を５日間培養した。その後、細胞を回収してＤＡＰＩで染色し、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５および抗ＣＤ５４抗体を蛍光標識し、従来のフローサイトメトリーで解析した。（Ａ）ＣＤ４ Ｔ３８１細胞のためのゲーティング戦略。生細胞をそれらの前方および側方散乱特徴に従ってシングレットおよびＤＡＰＩ陰性細胞として同定した。ＣＤ４ Ｔ細胞をＣＤ４^＋生細胞としてゲートした。（Ｂ）添加剤（ｓｔｉｍ）の非存在下、非標識ＭＳＣ－ＥＶ（ＭＳＣ－ＥＶ）、色素２で標識されたＭＳＣ－ＥＶ（ＭＳＣ－ＥＶ＋色素２）の存在下または緩衝液に溶解した色素２（緩衝液＋色素２）の存在下で培養した、ｍｄＭＬＲアッセイのＣＤ２５およびＣＤ５４でゲートした生ＣＤ４^＋細胞の蛍光強度。

【図12】イメージングフローサイトメトリーによる色素２で染色したＥＶの取込み後のｍｄＭＬＲの免疫細胞の細胞下染色の分析。光（明視野）、蛍光顕微鏡およびマージ画像が示されている。

【図13】（Ａ）従来および（Ｂ）共焦点顕微鏡法によって観察したＮＨＤＦ細胞中の本発明の色素２で染色したＥＶ。血小板由来のＥＶは色素２（赤色）で染色した。核染色はヘキスト染色（青色）を用いて行った。

【発明を実施するための形態】

【0021】

当然のことながら、本明細書に開示および定義されている発明は本文において言及されているか図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての他の組み合わせにまで及ぶ。これらの異なる組み合わせの全てが本発明の様々な他の態様を構成している。

【0022】

次に本発明の特定の実施形態を詳細に参照する。本発明を実施形態と共に説明するが、当然のことながら、その意図は本発明をそれらの実施形態に限定することではない。それどころか、本発明は全ての代替形態、修正形態および均等物を包含することを意図しており、これらは特許請求の範囲によって定められている本発明の範囲内に含めることができる。

【0023】

当業者であれば、本発明の実施において使用することができる本明細書に記載されているものと同様または同等の多くの方法および材料を認識しているであろう。本発明は決して記載されている方法および材料に限定されない。当然のことながら、本明細書に開示および定義されている発明は本文に言及されているか図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての他の組み合わせにまで及ぶ。これらの異なる組み合わせの全てが本発明の様々な他の態様を構成している。

【0024】

本明細書において参照されている特許および刊行物の全ての内容全体が参照により組み込まれる。

【0025】

本明細書を解釈するという目的のために、単数形で使用されている用語は複数形も含み、かつ逆もまた同様である。

【0026】

本発明者らは本明細書において、ＥＶおよび細胞を標識するのに有用な蛍光色素を同定した。この蛍光色素は、蛍光色素であるローダミンＢの類似体および誘導体である。本発明者らは驚くべきことに、本発明の蛍光色素がＥＶおよび細胞を標識することができ、これにより有利には当該色素で標識されたＥＶおよび細胞をフルオロメーターなどの好適な市販されている器具を用いて比較的容易に、かつ安価に検出および追跡するのを可能にすることができることを見出した。理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、式（Ｉ）の色素のＲ^１および／またはＲ^２の比較的疎水性の部分がＥＶおよび細胞の脂質二重層と結合することができ、これがそれによりＥＶ脂質二重層の中に組み込まれてＥＶ／細胞を当該色素で標識するのを可能にすると仮定する。これも理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、Ｒ^１および／またはＲ^２の比較的長い鎖長が色素凝集を防止し、かつＥＶまたは細胞の表面で負に帯電した化学種と相互作用するための正に帯電したローダミン蛍光体の高い相互作用を可能にすることができるとも考える。本発明の色素は脂質二重層を含む他の種類の分子または巨大分子と結合することができ、かつ従ってそれらを標識することができることが期待される。

【0027】

実施例に示されているように、本発明の蛍光色素はＥＶおよび様々なヒト細胞を標識することが分かった。これも実施例に示されているように、本発明の蛍光色素で標識されたＥＶおよび細胞は従来の器具を用いて検出して画像化することができる。

【0028】

当然のことながら、本明細書に開示および定義されている本発明は本文に言及されているか図面から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての他の組み合わせにまで及ぶ。これらの異なる組み合わせの全てが本発明の様々な他の態様を構成する。

【0029】

定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等のあらゆる方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。

【0030】

冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

【0031】

本明細書で使用される「および／または」、例えば「Ｘおよび／またはＹ」という用語は「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するように理解され、両方の意味またはいずれか一方の意味の明示的な支持を与えるように解釈されるべきである。

【0032】

本発明の様々な特徴が特定の値または値の範囲を参照しながら記載されている。これらの値は様々な適当な測定技術の結果に関するものであることが意図されており、従ってどんな特定の測定技術にもつきものの許容誤差を含むものとして解釈されるべきである。本明細書において参照されている値のいくつかは、少なくとも部分的にこのばらつきを補償するために「約」という用語によって示されている。「約」という用語は、値を記載するために使用されている場合、その値の±１０％、±５％または±１％以内の量を意味してもよい。

【0033】

特に文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、本明細書で使用される「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語ならびに「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載されている整数または工程あるいは整数または工程の群を含むが、あらゆる他の整数または工程あるいは整数または工程の群を排除しないことを意味するように理解される。

【0034】

「脂肪族」という用語はそれ単独または別の置換基の一部として、特に明記しない限り直鎖状もしくは分岐鎖状の鎖またはそれらの組み合わせのヒドロカルビルラジカルを意味し、それらは完全飽和、一価もしくは多価不飽和であってもよく、指定されている炭素原子数を有する（すなわちＣ_１～Ｃ_１０は１～１０個の炭素を意味する）一価、二価および多価のラジカルを含むことができる。飽和アルキルラジカルの例としては、限定されるものではないが、メチル、メチレン、エチル、エチレン、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基、それらの相同体および異性体、例えばｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチルおよびｎ－オクチルなどが挙げられる。不飽和アルキル基は１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されるものではないが、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－および３－プロピニル、３－ブチニルならびにより高級の相同体および異性体が挙げられる。「脂肪族」という用語は、特に断りのない限り「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」を含む。また、「アルキル」などの脂肪族基の一価のラジカル化学種への言及は、特に断りのない限り多価のラジカル化学種「アルキレン」を含む。

【0035】

「ヘテロ脂肪族」という用語はそれ単独または別の用語との組み合わせで、特に明記しない限り、記載されている原子数からなるＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳ（好ましくはＯおよびＮ）からなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子が途中に存在する脂肪族鎖またはそれらの組み合わせを意味する（例えば、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロ脂肪族は、炭素およびヘテロ原子の総数が１～１０個であることを意味する）。ヘテロ脂肪族基に含まれている任意の窒素および／または硫黄原子は任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、ヘテロ脂肪族基の任意の原子価が許容される内部位置またはヘテロ脂肪族基がその分子の残りまたは複合部分の場合の場合には別の基（例えば、ヘテロ脂肪族－ＯＨ）に結合されている位置にあってもよい。例としては限定されるものではないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３および－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３が挙げられる。最大２個のヘテロ原子は例えば－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３および－ＣＨ_２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３などのように連続していてもよい。好ましくは、ヘテロ脂肪族基は１、２、３、４個もしくはそれ以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、典型的には最も長い直鎖状ヘテロ脂肪族鎖に含まれている原子の４０％超を占めていてもよい。「ヘテロ脂肪族」基は「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」または「ヘテロアルキニル」基であってもよい。また、一価の化学種への言及は二価のラジカルへの言及を含み、例えば「ヘテロアルキル」という用語は「ヘテロアルキレン」を含む。ヘテロアルキレン部分の例としては、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－および－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－が挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は鎖末端のいずれか一方または両方を占めることもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノおよびアルキレンジアミノなど）。

【0036】

「アルキル」という用語は、１～２６個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状飽和炭化水素基を指す。適当であれば、アルキル基は指定された炭素原子数を有していてもよく、例えば直鎖状もしくは分岐鎖状構成で１、２、３、４、５もしくは６個の炭素原子を有するアルキル基を含むＣ_１～６アルキルである。好適なアルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、４－メチルブチル、ｎ－ヘキシル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、５－メチルペンチル、２－エチルブチル、３－エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル（ｐａｌｍｉｔａｄｙｌ）、ヘプタデカニル、オクタデカニル（ｓｔｅａｒａｄｙｌ）、ノナデカニル、イコサニル、ヘンイコサニル、ドコサニル、トリコサニル、テトラコサニル、ペンタコサニルおよびヘキサコサニルが挙げられる。

【0037】

「アルケニル」という用語は、炭素原子の間に１つ以上の二重結合を有し、かつ２～２６個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状炭化水素基を指す。適当であれば、アルケニル基は指定された炭素原子数を有していてもよい。例えば「Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル」のように、Ｃ_２～Ｃ_６は直鎖状もしくは分岐鎖状構成で２、３、４、５もしくは６個の炭素原子を有する基を含む。好適なアルケニル基の例としては、限定されるものではないが、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、ヘキサジエニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル（ｐａｌｍｉｔａｄｅｎｙｌ）、ヘプタデセニル、オクタデセニル（ｓｔｅａｒｅｄｙｌ）、ノナデセニル、イコセニル、ヘンイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニルおよびヘキサコセニルが挙げられる。

【0038】

「アルキニル」という用語は、炭素原子の間に１つ以上の三重結合を有し、かつ２～２６個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状炭化水素基を指す。適当であれば、アルキニル基は指定された炭素原子数を有していてもよい。例えば「Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル」のようにＣ_２～Ｃ_６は、直鎖状もしくは分岐鎖状構成で２、３、４、５もしくは６個の炭素原子を有する基を含む。好適なアルキニル基の例としては、限定されるものではないが、エチニル、プロピニル、イソプロピニル、ブチニル、ブタジイニル、ペンチニル、ペンタジイニル、ヘキシニル、ヘキサジイニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル、ウンデシニル、ドデシニル、トリデシニル、テトラデシニル、ペンタデシニル、ヘキサデシニル（ｐａｌｍｉｔａｄｙｎｙｌ）、ヘプタデシニル、オクタデシニル（ｓｔｅａｒｙｄｙｌ）、ノナデシニル、イコシニル、ヘンイコシニル、ドコシニル、トリコシニル、テトラコシニル、ペンタコシニルおよびヘキサコシニルが挙げられる。

【0039】

「シクロアルキル」および「ヘテロシクリル」という用語はそれ自体または他の用語との組み合わせで、特に明記しない限り「脂肪族」および「ヘテロ脂肪族」の環式バージョンをそれぞれ表す。「シクロアルキレン」などの二価および多価化学種も含まれる。さらにヘテロシクリルの場合、ヘテロ原子（例えばＮまたはＳｉ）は複素環がその分子の残りに結合されている位置を占めることができる。従ってシクロアルキルおよびヘテロシクリル基は飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和シクロアルキルおよび／またはヘテロシクリル基は１もしくは２個の二重結合を含んでいてもよい。シクロアルキルの例としては、限定されるものではないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニルおよびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定されるものではないが、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニルおよび２－ピペラジニルなどが挙げられる。

【0040】

「アリール」という用語は、それ自体または他の用語との組み合わせで、炭素環式（非複素環式）芳香族環または単環、二環もしくは三環式の環系を指す。多環式の環系は、この系内の少なくとも１つの環が芳香族であれば「アリール」と呼ぶ場合がある。芳香族環もしくは環系は一般に６～１０個の炭素原子からなる。アリール基の例としては、限定されるものではないが、フェニル、ビフェニル、ナフチルおよびテトラヒドロナフチルが挙げられる。フェニルなどの６員環アリールが好ましい。「アルキルアリール」という用語は、ベンジルなどのＣ_１～６アルキルアリールを指す。

【0041】

「ハロゲン」および「ハロ」という用語はそれ自体または他の用語との組み合わせで、周期表のＶＩＩａ族を構成している元素を表す。ハロゲンの例としては、限定されるものではないが、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。「ハロアルキル」という用語は、１つ以上の水素がハロゲンで置換されている飽和アルキルラジカルを指す。

【0042】

アルキルアミノおよびアルキルアリールなどの、どちらもそのラジカルを化合物の残りに結合する結合を形成することができる２つの部分を記述する置換基ラジカルの複合命名の場合、基の順番の方向は意図されておらず、従ってその結合点は複合ラジカルに含まれている部分のいずれに対してであってもよい。例えば、「アルキルアリール」および「アリールアルキル」という用語は同じ基を指すことが意図されており、その結合点はアルキルもしくはアリール部分（またはジラジカル化学種の場合には両方）によるものであってもよい。そのような複合ラジカルの結合方向は結合を含めることにより示されている場合があり、例えば、「－アルキルアリール」または「アリールアルキル－」は化合物の残りへのラジカルの結合点がアルキル部分を介していることを意味し、「アルキルアリール－」または「－アリールアルキル」はその結合点がアリール部分を介していることを意味する。

【0043】

蛍光色素
本発明は、式（Ｉ）：

【化3】

（式中、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、ここではＲ^１およびＲ^２の少なくとも１つは任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族または任意に置換されたＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、任意に置換されたＣ_１～６アルキル、任意に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロアルキル、任意に置換されたアリールおよび任意に置換されたＣ_１～６アルキルアリールから選択されるか、あるいは
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ／または
Ｒ^５およびＲ^６はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄは独立して水素、フッ素および塩素から選択される）
の蛍光色素に関する。

【0044】

式（Ｉ）の任意の実施形態では、式（Ｉ）の１つ以上のＲ基は任意に置換されていてもよく、すなわち１つ以上のＲ基は１つ以上の任意の置換基で置換されていても置換されていなくてもよい。

【0045】

特に定義しない限り、本明細書で使用される「任意に置換された」または「任意の置換基」という用語は、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２～６アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、Ｃ_３～８シクロアルキル、ヒドロキシル、オキソ、Ｃ_１～６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_１～６アルコキシアリール、ハロ、Ｃ_１～６アルキルハロ（ＣＦ_３など）、Ｃ_１～６アルコキシハロ（ＯＣＦ_３など）、カルボキシル、エステル、シアノ、ニトロ、アミノ、置換アミノ、二置換アミノ、アシル、ケトン、置換ケトン、アミド、アミノアシル、置換アミド、二置換アミド、チオール、アルキルチオ、チオキソ、硫酸、スルホン酸、スルフィニル、置換スルフィニル、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルアミド、置換スルホンアミド、二置換スルホンアミド、アリール、アルＣ_１～６アルキル（ａｒＣ_１～６ａｌｋｙｌ）、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１、２、３、４個もしくはそれ以上の基、好ましくは１、２もしくは３個、より好ましくは１もしくは２個の基で置換されていなくてもさらに置換されていてもよい基を指す。

【0046】

任意に置換されたアルキル、アルケニルおよびアルキニルの場合、１つ以上の任意の置換基は、好ましくはＣ_３～８シクロアルキル、ヒドロキシル、オキソ、Ｃ_１～６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ_１～６アルコキシアリール、ハロ、Ｃ_１～６アルキルハロ（ＣＦ_３など）、Ｃ_１～６アルコキシハロ（ＯＣＦ_３など）、カルボキシル、エステル、シアノ、ニトロ、アミノ、置換アミノ、二置換アミノ、アシル、ケトン、置換ケトン、アミド、アミノアシル、置換アミド、二置換アミド、チオール、アルキルチオ、チオキソ、硫酸、スルホン酸、スルフィニル、置換スルフィニル、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルアミド、置換スルホンアミド、二置換スルホンアミド、アリール、アルＣ_１～６アルキル（ａｒＣ_１～６ａｌｋｙｌ）、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールから選択され、より好ましくはハロ、アリール、ヘテロシクリル、Ｃ_３～８シクロアルキル、Ｃ_１～６アルコキシ、ヒドロキシル、オキソ、アリールオキシ、ハロＣ_１～６アルキル、ハロＣ_１～６アルコキシルおよびカルボキシルから選択される。

【0047】

式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、
Ｒ^１は、Ｃ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、Ｃ_{１３～２６}ヘテロアルキル（好ましくは最も長い直鎖状ヘテロアルキル鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子、好ましくは１もしくは２個の酸素原子を含む）およびＯＨ、好ましくはＣ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニルおよびＣ_{１３～２６}ヘテロアルキル（好ましくは最も長い直鎖状ヘテロアルキル鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子、好ましくは１もしくは２個の酸素原子を含む）、より好ましくはＣ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、Ｃ_２アルキル－Ｏ－Ｃ_{１０～２３}アルキルおよびＯＣ_{１２～２５}アルキル、さらにより好ましくはＣ_{１４～２２}アルキルおよびＣ_{１４～２６}アルケニル、なおより好ましくはＣ_{１４～２２}アルキルから選択され、
Ｒ^２は、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ヘテロアルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨおよびＣ_１～６ヘテロアルキル－ＯＨ、好ましくはＣ_１～６アルキルおよびＣ_１～６アルキルＯＲ^８（式中、Ｒ^８は水素およびメチルから選択される）から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキルまたはＣ_１～６ハロアルキルであり、好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～３アルキルまたはＣ_１～３フルオロアルキルであり、より好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してメチル、エチルまたはＣＨ_２ＣＦ_３であり、さらにより好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれエチルであり、
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄはそれぞれ水素である。

【0048】

式（Ｉ）の色素は塩の形態であってもよい。当該塩は正味電気的中性を達成するためにアニオン性対イオンである対イオンＸ^－を含む。アニオン性対イオンＸ^－は、例えばハロゲン化物、カルボン酸、炭酸、硫酸、スルホン酸、亜硫酸、硫化物、硝酸、亜硝酸、リン酸、ホウ酸およびアルコキシドなどを含む無機および／または有機アニオンから選択されてもよい。有利には、式（Ｉ）の化合物の塩形態は本明細書に記載されている方法のいずれかにおいてＥＶを標識するために好都合な試薬を提供することができる。

【0049】

従って、本発明は式（Ｉ）の化合物の塩を提供する。当該塩は式（ＩＩ）：

【化4】

（式中、
Ｒ^１およびＲ^２は独立して、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_１～２６脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_１～２６ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、ここではＲ^１およびＲ^２の少なくとも１つは任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族または任意に置換されたＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、任意に置換されたＣ_１～６アルキル、任意に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意に置換されたアリールおよび任意に置換されたＣ_１～６アルキルアリールから選択されるか、あるいは
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ／または
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄは独立して、水素、フッ素および塩素から選択され、かつ
Ｘ^－は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、トリクロロ亜鉛（ＩＩ）酸、テトラクロロ鉄酸および過塩素酸から選択される）
の化合物であってもよい。

【0050】

式（ＩＩ）の塩のいくつかの実施形態では、
Ｒ^１は、任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族、最も長い直鎖状ヘテロ脂肪族鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子（好ましくは１もしくは２個の酸素原子）を含むＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_{１３～２６}脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_{１３～２６}ヘテロ脂肪族－ＯＨ（好ましくは、末端ＯＨ酸素原子を除外して最も長い直鎖状ヘテロ脂肪族鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子、好ましくは１もしくは２個の酸素原子を含む）およびＯＨから選択され、
Ｒ^２は、任意に置換されたＣ_１～６脂肪族、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロ脂肪族、任意に置換されたＣ_１～６脂肪族－ＯＨ、任意に置換されたＣ_１～６ヘテロ脂肪族－ＯＨおよびＯＨから選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、任意に置換されたＣ_１～６アルキル、任意に置換されたＣ_１～６ハロアルキル、任意に置換されたアリールおよび任意に置換されたＣ_１～６アルキルアリールから選択されるか、あるいは
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ／または
Ｒ^３およびＲ^４はそれらが結合している窒素原子と一緒に、任意に置換された３～７員環の複素環を形成しており、かつ
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄは独立して、水素、フッ素および塩素から選択され、かつ
Ｘ^－は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、トリクロロ亜鉛（ＩＩ）酸、テトラクロロ鉄酸および過塩素酸から選択される。

【0051】

式（ＩＩ）の塩のいくつかの実施形態では、
Ｒ^１は、Ｃ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、最も長い直鎖状ヘテロアルキル鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子、好ましくは１もしくは２個の酸素原子を含むＣ_{１３～２６}ヘテロアルキルおよびＯＨ、好ましくはＣ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、および最も長い直鎖状ヘテロアルキル鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子（好ましくは１もしくは２個の酸素原子）を含むＣ_{１３～２６}ヘテロアルキル、より好ましくはＣ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、Ｃ_２アルキル－Ｏ－Ｃ_{１０～２３}アルキルおよびＯＣ_{１２～２５}アルキル、さらにより好ましくはＣ_{１４～２２}アルキルおよびＣ_{１４～２２}アルケニル、なおより好ましくはＣ_{１４～２２}アルキルから選択され、
Ｒ^２は、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ヘテロアルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨおよびＣ_１～６ヘテロアルキル－ＯＨ、好ましくはＣ_１～６アルキルおよびＣ_１～６アルキルＯＲ^８（式中、Ｒ^８は水素およびメチルから選択される）から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキルまたはＣ_１～６ハロアルキルであり、好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～３アルキルまたはＣ_１～３フルオロアルキルであり、より好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してメチル、エチルまたはＣＨ_２ＣＦ_３であり、さらにより好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれエチルであり、
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄはそれぞれ水素であり、かつ
Ｘ^－は塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸および過塩素酸、好ましくは塩化物、臭化物およびヨウ化物、より好ましくは塩化物から選択される。

【0052】

式（ＩＩ）の塩のいくつかの実施形態では、
Ｒ^１は、Ｃ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、および最も長い直鎖状ヘテロアルキル鎖の中に１もしくは２個のヘテロ原子、好ましくは１もしくは２個の酸素原子を含むＣ_{１３～２６}ヘテロアルキル、好ましくはＣ_{１３～２６}アルキル、Ｃ_{１３～２６}アルケニル、Ｃ_２アルキル－Ｏ－Ｃ_{１０～２３}アルキルおよびＯＣ_{１２～２５}アルキル、より好ましくはＣ_{１４～２２}アルキルおよびＣ_{１４～２２}アルケニル、さらにより好ましくはＣ_{１４～２２}アルキルから選択され、
Ｒ^２は、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６ヘテロアルキル、Ｃ_１～６アルキル－ＯＨおよびＣ_１～６ヘテロアルキル－ＯＨ、好ましくはＣ_１～６アルキルおよびＣ_１～６アルキルＯＲ^８（式中、Ｒ^８は水素およびメチルから選択される）から選択され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～６アルキルまたはＣ_１～６ハロアルキルであり、好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してＣ_１～３アルキルまたはＣ_１～３フルオロアルキルであり、より好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立してメチル、エチルまたはＣＨ_２ＣＦ_３であり、さらにより好ましくはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれエチルであり、
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^ＣおよびＲ^Ｄはそれぞれ水素であり、かつ
Ｘ^－は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸および過塩素酸、好ましくは塩化物、臭化物およびヨウ化物、より好ましくは塩化物から選択される。

【0053】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の塩は、以下のいずれか１つから選択される構造を有する：

【化5】

（式中、Ｘ^－は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸および過塩素酸、好ましくは塩化物、臭化物およびヨウ化物、より好ましくは塩化物から選択される）。

【0054】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の塩は以下のいずれか１つから選択される構造を有する：

【化6】

（式中、Ｘ^－は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸および過塩素酸、好ましくは塩化物、臭化物およびヨウ化物、より好ましくは塩化物から選択される）。

【0055】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の塩は以下のいずれか１つから選択される構造を有する：

【化7】

（式中、Ｘ^－は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸および過塩素酸、好ましくは塩化物、臭化物およびヨウ化物、より好ましくは塩化物から選択される）。

【0056】

一実施形態では、式（ＩＩ）の塩は以下の構造を有する：

【化8】

（式中、Ｘ^－は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸および過塩素酸、好ましくは塩化物、臭化物およびヨウ化物、より好ましくは塩化物から選択される）。

【0057】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の塩は、以下のいずれか１つから選択される。

【表1】

【0058】

好ましい実施形態では、式（ＩＩ）の塩は、化合物２、３、４、６、１３、１５、１７および１８のいずれか１つ、好ましくは化合物２、１５、１７および１８のいずれか１つから選択される。

【0059】

好ましい実施形態では、式（ＩＩ）の塩は化合物２である。

【0060】

本発明の式（Ｉ）およびその塩（例えば式（ＩＩ）の化合物）の色素は、化学合成を含む当該技術分野で知られている方法によって調製してもよい。例えば、本発明の化合物は式（Ａ）：

【化9】

（式中、Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ、Ｒ^Ｃ、Ｒ^Ｄ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、本明細書に記載されている式（Ｉ）のいずれかの化合物のために定義されているとおりである）の化合物を、式（Ｂ）：

【化10】

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は本明細書に記載されているとおりである）の化合物と反応させることによって調製してもよい。式（Ａ）の化合物と式（Ｂ）の化合物との反応は、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの好適なカップリング剤の存在下で、任意に４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの触媒の存在下で行ってもよい。代わりまたは追加として、式（Ａ）の化合物のカルボン酸部分を酸塩化物または混合無水物などの活性化カルボン酸に変換してもよい。酸塩化物は塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ_３）または塩化チオニル（ＳＯＣｌ_２）などの塩素化試薬との反応によって調製してもよい。混合無水物はジメチル無水物との反応によって調製してもよい。

【0061】

いくつかの実施形態では、当該色素は出発物質として市販されているローダミンＢを用いて調製してもよい。ローダミンＢの安息香酸部分を塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ_３）と反応させることにより酸ハロゲン化物、例えば酸塩化物に変換し、その後に酸ハロゲン化物を好適なアミンと反応させて標的色素を得てもよい。また本発明の色素および塩は、実施例１に記載されているものと類似した方法を用いて合成してもよい。

【0062】

実施例に示されているように、本発明の色素は蛍光を発し、かつ当該技術分野で知られている方法を用いてフルオロメーターで検出および追跡することができる蛍光マーカーとして機能することができる。本発明の色素は４５０～７００ｎｍの可視域で蛍光を示す。実施例に示されているように、色素１～１０は約５６４ｎｍの最大吸収および約５８８ｎｍの最大発光を有する。従っていくつかの実施形態では、本発明の色素は約５４４ｎｍ～約５８４ｎｍまたは約５５４ｎｍ～約５７４ｎｍの波長の光を吸収し、かつ約５６８ｎｍ～約６０８ｎｍまたは約５７８ｎｍ～約５９８ｎｍの波長で蛍光を発する。好ましい実施形態では、本発明の色素は約５６２ｎｍの波長で光を吸収し、かつ約５８３ｎｍの波長の光を発する。

【0063】

標識された細胞外小胞および細胞
本発明の式（Ｉ）およびその塩の色素は、ＥＶおよびヒト細胞を標識するために有用である。

【0064】

ＥＶおよび細胞は脂質二重層を含む。「脂質二重層」という用語は、リン脂質分子の２つの層からなる生体膜を意味するように理解され、各リン脂質分子は親水性リン酸頭部および疎水性脂質尾部を含み、ここでは尾部領域は水によってはじかれ、かつ互いに僅かに引き寄せられ、互いに集合する。理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、式（Ｉ）の色素のＲ^１および／またはＲ^２の比較的疎水性の部分がＥＶおよび細胞の脂質二重層に結合し、これがそれにより当該色素によるＥＶ／細胞の標識を可能にすると仮定する。

【0065】

従って本発明は、本明細書に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素で標識された細胞外小胞（ＥＶ）を提供する。

【0066】

本明細書で使用される「細胞外小胞」（ＥＶ）という用語は、細胞の中または外にあり、かつ脂質二重層によって封入された液体または細胞質を含む小胞を包含することを意図している。ＥＶは典型的にカーゴを含み、これは治療薬すなわち薬物カーゴ、例えば１種以上の膜タンパク質、サイトゾルおよび核タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、代謝産物ならびにｍＲＮＡおよび非翻訳ＲＮＡ種などのＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸であってもよい。カーゴの好適な種類の例は、Ｋａｌｌｕｒｉ ＲおよびＬｅＢｌｅｕ Ｖ Ｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０年２月７日；３６７（６４７８））に記載されている。ＥＶはナイーブＥＶまたは操作されたＥＶであってもよい。本明細書で使用される「ナイーブＥＶ」という用語は、細胞によって天然に産生される未修飾ＥＶを意味するように理解される。そこからナイーブＥＶを得ることができる好適な細胞の例としては、間葉細胞（ＭＳＣ）、血小板およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、例えばｈｉＰＳＣ由来神経幹細胞などの幹細胞が挙げられる。ナイーブＥＶは、ＥＶが得られる細胞の脂質二重層と実質的に同様の１種以上のリン脂質を含む脂質二重層を有していてもよい。本明細書で使用される「操作されたＥＶ」という用語は、それらの表面上に標的分子を発現し、かつ／または特異的薬物カーゴを運ぶように修飾されている小胞を意味するように理解される。ＥＶは当該技術分野で知られている方法、例えば国際公開第２０１８／１１２５５７号および国際公開第２０１９／２４１８３６号に記載されている方法によって得てもよい。

【0067】

いくつかの実施形態では、ＥＶは、エキソソーム、エクソメア（ｅｘｏｍｅｒｅ）、微小小胞体、オンコソーム（ｏｎｃｏｓｏｍｅ）およびアポトーシス小体から選択される。好ましい実施形態では、ＥＶはエキソソームである。本明細書で使用される「エキソソーム」という用語は、真核細胞のエンドソーム区画で産生されるＥＶを包含することを意図している。エキソソームは典型的には約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの直径サイズを有し、かつタンパク質および核酸カーゴを含む。本明細書で使用される「エクソメア」という用語は、約５０ｎｍ未満の直径サイズを有する非膜性ＥＶを包含することを意図している。エクソメアは典型的には約３５ｎｍの直径サイズし、かつタンパク質および核酸カーゴを含む。本明細書で使用される「微小小胞体」という用語は、細胞の細胞膜から放出されるＥＶを包含することを意図している。微小小胞体は典型的には約１５０ｎｍ～約１０００ｎｍの直径サイズを有し、かつタンパク質および核酸カーゴを含む。本明細書で使用される「オンコソーム」という用語は、典型的にはより進行したステージの疾患において癌細胞からの膜小疱の放出から産生される腫瘍化促進特性を有するＥＶを包含することを意図している。オンコソーム（「大型オンコソーム」すなわちＬＯとも呼ぶ）は典型的には約１μｍ～約１０μｍの直径サイズを有し、かつタンパク質を含む腫瘍カーゴを含む。本明細書で使用される「アポトーシス小体」という用語は、アポトーシスの間に細胞の細胞膜から放出されるＥＶを包含することを意図している。アポトーシス小体は典型的には約５００ｎｍ～約２０００ｎｍの直径サイズを有し、かつ核画分および細胞小器官を含むカーゴを含む。

【0068】

本発明は本明細書に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素で標識された細胞も提供する。いくつかの実施形態では、当該細胞はヒト細胞である。好適なヒト細胞の例としては正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）および骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）が挙げられる。

【0069】

実施例に示されているように、本発明の蛍光色素で標識されたＥＶおよび様々なヒト細胞は、それらの非標識対応物と比較してより高い蛍光を示す。これは有利には、フルオロメーターなどの好適な器具を用いて本発明の色素で標識されたＥＶおよび細胞を検出および追跡するのを可能にすることができる。

【0070】

用途
本発明の色素は標識されたＥＶおよび細胞を検出および／または追跡するための蛍光マーカーとして有用であり得る。

【0071】

従って本発明は、本明細書に記載されている式（ＩＩ）の塩（例えば、式（Ｉ）の化合物の塩）をＥＶまたは細胞と組み合わせる工程を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を標識する（またはタグ付けする）方法を提供する。

【0072】

本発明は、本明細書に記載されている式（ＩＩ）の塩（例えば、式（Ｉ）の化合物の塩）をＥＶと組み合わせて、それによりＥＶを式（Ｉ）の化合物で標識する工程を含む、標識された細胞外小胞（ＥＶ）を調製する方法も提供する。ＥＶは本明細書に記載されている任意の好適なＥＶであればよい。

【0073】

これらの実施形態では、本方法はＥＶを提供する工程をさらに含んでいてもよい。ＥＶは本明細書に記載されている当該技術分野で知られている方法によって調製するか得てもよい。ＥＶを単離するのに適した方法としては、例えばＳｉｄｈｏｍ Ｋら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０，２１（１８），６４６６）およびＺｈａｎｇ Ｙら（Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０２０；１５：６９１７－６９３４）に記載されているものが挙げられる。ＥＶを精製するのに適した方法としては、例えば国際公開第２０１８／１１２５５７Ａ１号に記載されているものが挙げられる。ＥＶを提供する工程は、例えば細胞株からＥＶを得ること、およびＥＶを細胞から分離することを含んでもよい。言い換えると、本明細書に記載されている方法は、ＥＶを細胞から単離してＥＶを含む水溶液を得る工程をさらに含んでいてもよい。

【0074】

本発明は、本明細書に記載されている式（ＩＩ）の塩（例えば、式（Ｉ）の化合物の塩）を細胞と組み合わせて、それにより細胞を式（Ｉ）の化合物で標識する工程を含む、標識された細胞を調製する方法も提供する。

【0075】

これらの実施形態では、本方法は細胞を提供する工程をさらに含んでいてもよい。細胞は当該技術分野で知られている方法によって調製するか得てもよい。細胞を提供する工程は、例えば細胞を培養することを含んでもよい。異なる細胞型のための好適な細胞培養技術は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／においてアメリカ培養細胞系統保存機関（Ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ）から入手可能である。

【0076】

本発明は、ＥＶまたは細胞を標識するための本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物の塩の使用も提供する。

【0077】

本発明はＥＶまたは細胞を蛍光標識するためのキット、あるいはＥＶまたは細胞を蛍光標識するために使用する場合、
・本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物の塩と、
・任意に、細胞外小胞または細胞を蛍光標識するためのその使用についての説明書と
を含むキットも提供する。

【0078】

本発明の方法、使用およびキットの任意の実施形態では、標識されるＥＶまたは細胞は、本明細書に記載されている任意の好適なＥＶまたは細胞であってもよい。

【0079】

好適には、式（Ｉ）の化合物がＥＶまたは細胞を標識するように本発明の塩およびＥＶまたは細胞を組み合わせる。例えば標識されるＥＶまたは細胞を好適な条件下および好適な期間で、例えば３７℃で約１時間の期間にわたって本発明の塩と共にインキュベートしてもよい。典型的には当該塩をＥＶおよび／または細胞を含む水溶液に添加する。但し、いくつかの実施形態では、ＥＶおよび／または細胞の溶液を本発明の塩を含む水溶液に添加する。この水溶液は水を含み、かつＥＶ完全性および細胞生存度を維持することができるレベルで他の水混和性溶媒を含んでいてもよい。好適な水混和性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール（ＭｅＯＨ）およびエタノール（ＥｔＯＨ）などが挙げられる。この水溶液は、緩衝剤、界面活性剤、培地、凍結保護剤およびそれらの組み合わせから選択される１種以上の添加剤を含んでいてもよい。

【0080】

従っていくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の塩をＥＶまたは細胞と組み合わせる工程は、式（ＩＩ）の塩およびＥＶまたは細胞の水溶液を形成することを含む。式（ＩＩ）の塩は、ＥＶまたは細胞を標識するのに適した任意の量または任意の濃度で提供してもよい。いくつかの実施形態では、当該水溶液中の式（ＩＩ）の塩の最小濃度は、少なくとも約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０６μＭ、約０．０７μＭ、約０．０８μＭ、約０．０９μＭ、約０．１μＭ、約０．１１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭまたは約０．２μＭである。いくつかの実施形態では、当該水溶液中の式（ＩＩ）の塩の最大濃度は、当該水溶液に対して約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、または約２０μＭ以下である。いくつかの実施形態では、当該水溶液中の式（Ｉ）の化合物の濃度は、これらの最小濃度のいずれかからこれらの最大濃度のいずれか、例えば約０．１μｍ～約５μＭまたは約０．２μｍ～約２μＭであってもよい。式（ＩＩ）の塩がＥＶを標識するためのものである実施形態では、式（ＩＩ）の塩の最小量は、１個のＥＶ当たり少なくとも約６０分子、約９０分子、約１５０分子、約１８０分子、約２１０分子、約２４０分子、約２７０分子、約３００分子、約３３０分子、約３６０分子、約３９０分子、約４２０分子、約４５０分子、約４８０分子、約５１０分子、約５４０分子、約５７０分子または約６００分子の塩であってもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の塩の最大量は、１個のＥＶ当たり約３０００分子、約６０００分子、約９０００分子、約１２０００分子、約１５０００分子、約１８０００分子、約２１０００分子、約２４０００分子、約２７０００分子、約３００００分子、約４５０００分子または約６００００分子の塩であってもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の塩は最小量のいずれか１つから最大量のいずれか１つまでの範囲の量、例えば１個のＥＶ当たり約３００分子～約１５０００分子または約６００分子～約６０００分子の塩であってもよい。式（ＩＩ）の塩が細胞を標識するためのものである実施形態では、１個の細胞当たりの塩の量は、１個のＥＶ当たりの塩の量と比較して桁違いにより大きくてもよい。

【0081】

いくつかの実施形態では、当該水溶液は、ＥＶまたは細胞を標識する塩の量に対して過剰な式（ＩＩ）の塩を含む。従っていくつかの実施形態では、本方法は、当該溶液を精製して式（ＩＩ）の残留する塩を除去する工程をさらに含む。この精製する工程は、例えばサイズ排除クロマトグラフィによって達成してもよい。

【0082】

実施例に示されているように、本発明の色素がＥＶまたは細胞上に標識されている場合、蛍光を発することができ、これを好適な器具によって検出することができる。これは有利には、好適な器具を用いて当該色素で標識されたＥＶおよび細胞を検出および追跡するのを可能にする。

【0083】

従って本発明は、
・本明細書に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素で標識されたＥＶまたは細胞を選択された光源に曝露して式（Ｉ）の蛍光色素を励起させる工程と、
・この蛍光色素からの蛍光発光を検出する工程と
含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を検出する方法を提供する。

【0084】

本発明は、
・本明細書に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素で標識されたＥＶまたは細胞を選択された光源に曝露して式（Ｉ）の蛍光色素を励起させる工程と、
・この蛍光色素からの蛍光発光を検出し、それによりこの蛍光色素からの蛍光発光の検出により標識されたＥＶまたは細胞の追跡を可能にする工程と
を含む、細胞外小胞（ＥＶ）または細胞を追跡する方法も提供する。

【0085】

光源は、可視光領域内の波長、すなわち約３００ｎｍ～約１０００ｎｍの範囲の波長で光を放射することができる任意の好適な光源であってもよい。いくつかの実施形態では、この光源は約４５０～約７００ｎｍ、好ましくは約５００ｎｍ～約６５０ｎｍ、より好ましくは約５４０～約５９０ｎｍの波長で光を放射する。

【0086】

本発明は、ＥＶまたは細胞を検出および／または追跡するための本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物の塩の使用も提供する。

【0087】

本発明の方法または使用の任意の実施形態では、標識されたＥＶまたは標識された細胞は、本明細書に記載されている任意の好適なＥＶまたは細胞であってもよい。

【0088】

実施例に示されているように、本発明の色素で標識されたＥＶおよび様々なヒト細胞は従来の器具を用いて検出して画像化することができる。ＥＶおよび細胞、特にＥＶの検出および追跡は、有利には診断および治療研究において用途を有し得る。

【0089】

従って本発明は、細胞を本明細書に記載されている式（Ｉ）の蛍光色素で標識し、かつ本明細書に記載されている治療用カーゴを含むＥＶと接触させる工程を含む、治療用カーゴを細胞に送達する方法も提供する。ＥＶの治療用カーゴが細胞に送達されるように、細胞および標識されたＥＶを好適には接触させる。

【実施例】

【0090】

本発明を非限定的な実施例によってさらに説明する。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく多くの修正を行うことができることが本発明の当業者には理解されるであろう。

【0091】

実施例１：色素の合成
本発明の色素は文献から公知の方法または当業者に公知の方法に従って調製することができる。当該色素を調製するために使用される試薬はほとんどの場合に市販されているものであり、そうでなければ文献から公知の方法によって入手可能なものである。本発明の色素を調製するための好ましいプロセスを色素１～１０に基づいて例として説明する。

【0092】

化合物１の合成

【化11】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－メチルヘキサデシルアミン（１２８．０ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．３２ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製して、ローダミンＢ Ｎ－メチルヘキサデシルアミド（１）を粘着性の紫色の固体として得た（２２６．８ｍｇ、７６％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６８－７．６０（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５５－７．４９（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３３（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２７（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），７．２２（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８９（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．７０－３．５８（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．０２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），２．８９（ｓ，３Ｈ_Ｒ１），２．６９（ｓ，３Ｈ_Ｒ２），１．３１（ａｐｐ．ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ_Ｒ１，１２Ｈ_Ｒ２），１．２８－１．１５（ｍ，２８Ｈ_Ｒ１，２８Ｈ_Ｒ２），１．１３－１．０２（ｍ，６Ｈ），０．９９－０．９０（ｍ，１Ｈ），０．８６（ｍ，３Ｈ_Ｒ１，３Ｈ_Ｒ２）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0093】

化合物２の合成

【化12】

ローダミンＢ（０．５００ｇ、１．０４４ｍｍｏｌ、１．０当量）の１，２－ジクロロエタン（５０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（０．３５１ｍＬ、３．７５８ｍｍｏｌ、３．６当量）を添加し、明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。残留物を乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－メチルオクタデシルアミン（０．３５５ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、１．２当量）に一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（０．４３４ｍＬ、３．１３ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）で失活させ、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（５０ｍＬ）、次いで塩水（２０ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．８１ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製してローダミンＢ Ｎ－メチルオクタデシルアミド（２）を粘着性の紫色の固体として得た（０．６８ｇ、８７％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６８－７．６０（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５６－７．４８（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３７－７．２９（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２７（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），７．２２（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），７．００（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝９．４，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．７２－３．５４（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．０２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），２．８９（ｓ，３Ｈ_Ｒ１），２．６９（ｓ，３Ｈ_Ｒ２），１．３１（ａｐｐ．ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ_Ｒ１，１２Ｈ_Ｒ２），１．２７－０．９０（ｍ，３２Ｈ_Ｒ１，３２Ｈ_Ｒ２），０．８６（ａｐｐ．ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ_Ｒ１，３Ｈ_Ｒ２）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0094】

化合物３の合成

【化13】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－メチルイコサン－１－アミン（１５６．１１ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／Ｅｔ_２Ｏ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．６４ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製してローダミンＢ Ｎ－メチルイコサンアミド（３）を粘着性の紫色の固体として得た（１８８．０ｍｇ、５８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６７－７．５８（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５４－７．４７（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３５－７．２８（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２５（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），７．２０（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），７．００（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．７１－３．５５（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．０１（ｍ，２Ｈ_Ｒ２），２．８７（ｓ，３Ｈ_Ｒ１），２．６７（ｓ，３Ｈ_Ｒ２），１．３０（ａｐｐ．ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ_Ｒ１，１２Ｈ_Ｒ２），１．２６－１．１１（ｍ，３６Ｈ_Ｒ１，３６Ｈ_Ｒ２），１．１１－１．００（ｍ，６Ｈ），０．９６－０．８８（ｍ，１Ｈ），０．８７－０．８１（ｍ，３Ｈ_Ｒ１，３Ｈ_Ｒ２）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0095】

化合物４の合成

【化14】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－メチルドコシルアミン（１７０．１６ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／Ｅｔ_２Ｏ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．２７ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製してローダミンＢ Ｎ－ペンチルテトラデカンアミド（４）を粘着性の紫色の固体として得た（２９１．１ｍｇ、７３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６８－７．５９（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５４－７．４９（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３６－７．３１（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２７（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），７．２２（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８９（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．６９－３．５７（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．０８－２．９８（ｍ，２Ｈ_Ｒ２），２．８９（ｓ，３Ｈ_Ｒ１），２．６９（ｓ，３Ｈ_Ｒ２），１．３１（ａｐｐ．ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ_Ｒ１，１２Ｈ_Ｒ２），１．２８－１．１２（ｍ，４０Ｈ_Ｒ１，４０Ｈ_Ｒ２），１．１２－１．００（ｍ，６Ｈ），０．９９－０．８９（ｍ，１Ｈ），０．８９－０．７８（ｍ，３Ｈ_Ｒ１，３Ｈ_Ｒ２）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0096】

化合物５の合成

【化15】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－ペンチルテトラデカン－１－アミン（１４２．０５ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／Ｅｔ_２Ｏ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．３５ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製してローダミンＢ Ｎ－ペンチルテトラデカンアミド（５）を粘着性の紫色の固体として得た（２１１．５ｍｇ、６８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．６８－７．６１（ｍ，２Ｈ），７．５４－７．４７（ｍ，１Ｈ），７．３８－７．３２（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９１（ｄｄｄ，Ｊ＝９．７，５．３，２．３Ｈｚ，２Ｈ），６．７５（ｄｄ，Ｊ＝５．５，２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｄｑ，Ｊ＝１１．３，７．３Ｈｚ，８Ｈ），３．２０－３．０２（ｍ，２Ｈ），２．９０（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．４９－１．３６（ｍ，３Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１２Ｈ），１．２７－０．９５（ｍ，２０Ｈ），０．９３－０．７７（ｍ，９Ｈ），０．７１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）。

【0097】

化合物６の合成

【化16】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－ペンチルオクタデカン－１－アミン（１７０．１６ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／Ｅｔ_２Ｏ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．４１ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製してローダミンＢ Ｎ－ペンチルオクタデカンアミド（６）を粘着性の紫色の固体として得た（２８１．４ｍｇ、８４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．７０－７．６１（ｍ，２Ｈ），７．５５－７．４８（ｍ，１Ｈ），７．３９－７．３３（ｍ，１Ｈ），７．２７－７．２３（ｍ，２Ｈ），６．９１（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６，５．８，２．５Ｈｚ，２Ｈ），６．７７（ｄｄ，Ｊ＝６．１，２．５Ｈｚ，２Ｈ），３．６５（ｄｑ，Ｊ＝１１．９，７．４Ｈｚ，８Ｈ），３．１０（ｓ，２Ｈ），２．９１（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．４２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ），１．２８－０．９５（ｍ，２８Ｈ），０．９１－０．８０（ｍ，９Ｈ），０．７２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）。

【0098】

化合物７の合成

【化17】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－（２－メトキシエチル）ヘキサデカン－１－アミン（１５０．０７ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．３５ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製して１６２．０ｍｇのローダミンＢ Ｎ－エチルメチルエーテルヘキサデカンアミド（７）を粘着性の紫色の固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７３－７．５７（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５５－７．５０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３９－７．２９（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２９－７．２２（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．０３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．７２－３．５５（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．４２（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．３７－３．２３（ｍ，３Ｈ）；３．１９－３．０９（ｍ，２Ｈ_Ｒ１），３．００－２．８８（ｍ，２Ｈ_Ｒ２，３Ｈ_Ｒ１，３Ｈ_Ｒ２），１．３６－１．２８（ｍ，１２Ｈ_Ｒ１，１２Ｈ_Ｒ２），１．２７－１．１２（ｍ，２８Ｈ_Ｒ１，２８Ｈ_Ｒ２），０．９３－０．８２（ｍ，６Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0099】

化合物８の合成

【化18】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－（２－メトキシエチル）オクタデカン－１－アミン（１６４．１２ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／Ｅｔ_２Ｏ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．５３ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製してローダミンＢ Ｎ－エチルメチルエーテルオクタデカンアミド（８）を粘着性の紫色の固体として得た（１７５．９ｍｇ、５３％）。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７５－７．５８（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５７－７．５０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．４０－７．３０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３０－７．２３（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．００（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．９０（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．７７－３．５５（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．４４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ）；３．１４（ｍ，２Ｈ_Ｒ１），２．９６（ｍ，２Ｈ_Ｒ２，３Ｈ_Ｒ１，３Ｈ_Ｒ２），１．３６－１．２９（ｍ，１２Ｈ_Ｒ１，１２Ｈ_Ｒ２），１．２９－１．１３（ｍ，３２Ｈ_Ｒ１，３２Ｈ_Ｒ２），０．９３－０．８２（ｍ，６Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0100】

化合物９の合成

【化19】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、２－（オクタデシルアミノ）エタン－１－オール（１５７．１０ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．３３ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製してローダミンＢ Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）オクタデカンアミド（９）を粘着性の紫色の固体として得た（１４４．２ｍｇ、４５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．７２－７．５４（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｓ，２Ｈ），７．２０－７．１０（ｍ，１Ｈ），６．９０－６．８３（ｍ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７４－３．６１（ｍ，８Ｈ），３．６１－３．５０（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３３（ｓ，１Ｈ），３．２１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１１（ｑｄ，Ｊ＝７．３，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），１．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．３６－１．２８（ｍ，１２Ｈ），１．２８－１．０２（ｍ，３２Ｈ），１．０２－０．９２（ｍ，１Ｈ），０．９１－０．８２（ｍ，３Ｈ）。

【0101】

化合物１０の合成

【化20】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液にＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ－（２－メトキシエチル）イコサン－１－アミン（１７８．１８ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０ｍＬ）および１０％ＭｅＯＨ／Ｅｔ_２Ｏ（８０ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．３６ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製して１５４．１ｍｇのローダミンＢ Ｎ－エチルメチルエーテルイコサンアミド（１０）を粘着性の紫色の固体として得た（１５４．１ｍｇ、４５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７５－７．５８（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５７－７．５０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．４１－７．３４（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３４－７．２３（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．０８（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．９０（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），３．７４－３．５７（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．４５（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７－３．２８（ｓ，３Ｈ）；３．２０－３．０９（ｍ，２Ｈ_Ｒ１），３．０１－２．９０（ｍ，２Ｈ_Ｒ２，３Ｈ_Ｒ１，３Ｈ_Ｒ２），１．３７－１．２９（ｍ，１２Ｈ_Ｒ１，１２Ｈ_Ｒ２），１．２９－１．０５（ｍ，３６Ｈ_Ｒ１，３６Ｈ_Ｒ２），０．９４－０．８０（ｍ，６Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0102】

化合物１１の合成

【化21】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解したＮ－メチルヘンイコサン－１－アミン（１６３．１４ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて３１５．１ｍｇのローダミンＢ Ｎ－メチルヘンイコサンアミド（１１）を粘着性の紫色の固体として得た（３１５．１ｍｇ、９６％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７０－７．６１（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５６－７．５０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３８－７．３２（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），７．２３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２）７．０７（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１）６．７６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），３．７１－３．５９（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｓ，２Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ），１．３０－１．１３（ｍ，３８Ｈ），１．１３－１．０２（ｍ，４Ｈ），０．９９－０．９１（ｍ，１Ｈ），０．８６（ｔ，４Ｈ）。

【0103】

化合物１２の合成

【化22】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解したＮ－メチルノナデシルアミン（１４９．０８ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて２２９．６ｍｇのローダミンＢ Ｎ－メチルノナデシルアミド（１２）を粘着性の紫色の固体として得た（２２９．６ｍｇ、７２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７０－７．６１（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５８－７．５０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３８－７．３３（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），７．２３（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２）７．０６（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．９１（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．３Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１）６．７５（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），３．７２－３．５８（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｓ，２Ｈ），２．１９（ｓ，４Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ），１．２９－１．１４（ｍ，３４Ｈ），１．１４－１．０２（ｍ，４Ｈ），１．０１－０．９１（ｍ，１Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）。

【0104】

化合物１３の合成

【化23】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解したＮ－メチルヘンイコサン－１－アミン（１６３．１４ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて３１５．１ｍｇのローダミンＢ Ｎ－メチルヘンイコサンアミド（１３）を粘着性の紫色の固体として得た（３１５．１ｍｇ、９６％）^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７０－７．６１（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５６－７．５０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３８－７．３２（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），７．２３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２）７．０７（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１）６．７６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），３．７１－３．５９（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｓ，２Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ），１．３０－１．１３（ｍ，３８Ｈ），１．１３－１．０２（ｍ，４Ｈ），０．９９－０．９１（ｍ，１Ｈ），０．８６（ｔ，４Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0105】

化合物１４の合成

【化24】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解したＮ－プロピルオクタデカン－１－アミン（１５６．１１ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて２３５．３ｍｇのローダミンＢ Ｎ－プロピルオクタデシルアミド（１４）を粘着性の紫色の固体として得た（２３５．３ｍｇ、７３％）^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６９－７．６１（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５５－７．４８（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３９－７．３２（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２８－７．２２（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，Ｈ_Ｒ２）６．９４（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８９（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１）６．７５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），３．７１－３．５４（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１４－３．０３（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．５９（ｓ，１Ｈ）；２．０５－１．８４（ｍ，１Ｈ），１．５５－１．３６（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１１Ｈ），１．２８－１．０４（ｍ，３５Ｈ），１．０５－０．９３（ｍ，１Ｈ），０．９２－０．８２（ｍ，６Ｈ），０．７９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0106】

化合物１５の合成

【化25】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解したＮ－エチルオクタデカン－１－アミン（１４９．０９ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて１２３．０ｍｇのローダミンＢ Ｎ－エチルオクタデシルアミド（１５）を粘着性の紫色の固体として得た（１２３．０ｍｇ、３９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６８－７．６０（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５５－７．４６（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３９－７．３０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２７－７．２０（ｍ［２ｘｄ］２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），６．９６（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１）６．７２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），３．６８－３．５３（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．２３－３．０３（ｍ，３Ｈ），３．０３－２．７８（ｍ，１Ｈ），１．４８－１．３７（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ），１．２７－１．１０（ｍ，３４Ｈ），１．０５（ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），０．９６－０．８７（ｍ，４Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），０．５５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0107】

化合物１６の合成

【化26】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解した２－（イコシルオキシ）－Ｎ－メチルエタンアミン（１７８．１８ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて３３６．８ｍｇのローダミンＢ Ｎ－（２－（イコシルオキシ）エチル）－Ｎ－メチルアミド（１６）を粘着性の紫色の固体として得た（３３６．８ｍｇ、９９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．８１－７．７４（ｍ，１Ｈ），７．６９－７．６３（ｍ，２Ｈ），７．６３－７．５７（ｍ，１Ｈ），７．５７－７．５０（ｍ，１Ｈ），７．３８－７．３１（ｍ，１Ｈ），７．３０－７．２１（ｍ，５Ｈ），７．０２－６．９３（ｍ，３Ｈ），６．８０－６．７５（ｍ，３Ｈ），３．７１－３．５５（ｍ，１１Ｈ），３．４０－３．３１（ｍ，４Ｈ），３．２２－３．１１（ｍ，４Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｓ，２Ｈ），１．４２－１．３５（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１７Ｈ），１．２７－１．１５（ｍ，５９Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５Ｈ）。

【0108】

化合物１７の合成

【化27】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解した（Ｚ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９－エン－１－アミン（１４１．０５ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により０．３３ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて２５１．２ｍｇのローダミンＢ Ｎ－メチルオレイルアミド（１７）を粘着性の紫色の固体として得た（２５１．２ｍｇ、８１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６８－７．５８（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５５－７．４６（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３６－７．２８（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２８－７．１６（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．００（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２）６．７２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），５．４０－５．２３（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）；３．７２－３．５２（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；２．８８（ｓ，２Ｈ），２．６８（ｓ，１Ｈ）；２．０４－１．８５（ｍ，４Ｈ），１．４９－１．３５（ｍ，１Ｈ），１．３５－１．１５（ｍ，２８Ｈ），１．１５－０．９９（ｍ，３Ｈ），０．９８－０．８７（ｍ，２Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0109】

化合物１８の合成

【化28】

ローダミンＢ（０．６００ｇ、１．２５３ｍｍｏｌ、３．０当量）の１，２－ジクロロエタン（６０ｍＬ）部分溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（４２２μＬ、４．５１０ｍｍｏｌ、１０．８当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。この混合物を３つの別個の１００ｍＬのＲＢＦに分け、揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。１つのフラスコ中の残留物を乾燥ＤＣＭ（１７ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解した（Ｅ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９－エン－１－アミン（１４１．０５ｍｇ、０．５０１ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１７３．５μＬ、１．２５２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＢｉｏｔａｇｅ自動カラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて２４５．６ｍｇのローダミンＢ Ｎ－メチルエライジルアミド（１８）を粘着性の紫色の固体として得た（２４５．６ｍｇ、７９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６７－７．５８（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５３－７．４７（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３６－７．２８（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２６－７．１７（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），６．９８（ｄ，Ｊ＝９．０，２Ｈ_Ｒ１），６．８６（ｓ，２Ｈ_Ｒ２），６．７８（ｓ，２Ｈ_Ｒ２）６．７２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），５．４０－５．２６（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）；３．７５－３．４２（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；２．８６（ｓ，２Ｈ），２．６７（ｓ，１Ｈ）；２．０２－１．８３（ｍ，４Ｈ），１．４９－１．３８（ｍ，１Ｈ），１．３２－１．２６（ｍ，１２Ｈ），１．２６－１．１２（ｍ，２６Ｈ），１．１２－０．９８（ｍ，３Ｈ），０．９６－０．８６（ｍ，１Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0110】

化合物１９の合成

【化29】

ローダミンＢ（２．００ｇ、４．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）の１，２－ジクロロエタン（１７０ｍＬ）溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（１．４０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ、３．６当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。その残留物を１００ｍＬのＤＣＭに溶解し、一定分量の２６．３ｍｌを（Ｅ／Ｚ）－Ｎ－メチルオクタデカ－２－エン－１－アミン（０．３７ｇ、１．３ｍｍｏｌ、１．２当量）のＤＣＭ（１０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（４５５μＬ、３．３ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＤＣＭ／ＭｅＯＨ（５％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）の勾配溶媒系で溶離するカラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて６３０ｍｇのＮ－（６－（ジエチルアミノ）－９－（２－（メチル（オクタデカ－２－エン－１－イル）カルバモイル）フェニル）－３Ｈ－キサンテン－３－イリデン）－Ｎ－エチルエタンアミニウムクロリド（１９）を粘着性の紫色の固体として得た（６３０ｍｇ、８１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７０－７．６０（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５７－７．５３（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３６－７．３０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２６－７．１９（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．２Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．９５（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），５．６２－４．８５（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）；３．７５－３．４２（ｍ，１０Ｈ_Ｒ１，１０Ｈ_Ｒ２），２．８４（ｓ，２Ｈ），２．７０（ｓ，２Ｈ）；２．１０－１．９０（ｍ，４Ｈ），１．８５－１．７５（ｍ，１Ｈ），１．５－１．００（ｍ，３８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0111】

化合物２０の合成

【化30】

ローダミンＢ（２．００ｇ、４．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）の１，２－ジクロロエタン（１７０ｍＬ）溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（１．４０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ、３．６当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。その残留物を１００ｍＬのＤＣＭに溶解し、一定分量の４．５ｍｌを（Ｅ／Ｚ）－Ｎ－メチルノナデカ－１０－エン－１－アミン（６６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）のＤＣＭ（１０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（７７μＬ、０．５６ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＤＣＭ／ＭｅＯＨ（５％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）の勾配溶媒系で溶離するカラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させてＮ－（６－（ジエチルアミノ）－９－（２－（メチル（オクタデカ－９－エン－１－イル）カルバモイル）フェニル）－３Ｈ－キサンテン－３－イリデン）－Ｎ－エチルエタンアミニウムクロリド（２０）を粘着性の紫色の固体として得た（６３０ｍｇ、７５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７０－７．６０（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５７－７．５３（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３６－７．３０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３０－７．１９（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）），７．０８（ｄ，Ｊ＝９．６，２．２Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．９２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８０（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），５．４０－５．３０（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）；３．７５－３．４２（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；２．９０（ｓ，２Ｈ），２．７０（ｓ，１Ｈ）；２．２０－１．９０（ｍ，６Ｈ），１．５－１．００（ｍ，３８Ｈ），０．９６－０．８６（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0112】

化合物２１の合成

【化31】

ローダミンＢ（２．００ｇ、４．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）の１，２－ジクロロエタン（１７０ｍＬ）溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（１．４０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ、３．６当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製ハロゲン化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。その残留物を１００ｍＬのＤＣＭに溶解し、一定分量の３５．８ｍｌを（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９，１２－ジエン－１－アミン（０．５ｇ、１．７９ｍｍｏｌ、１．２当量）のＤＣＭ（１０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（６２０μＬ、４．４７ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（１５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、シリカの２ｃｍのプラグに通し、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１００ｍＬ）で徹底的に洗浄した。回転蒸発により粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＤＣＭ／ＭｅＯＨ（５％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）の勾配溶媒系で溶離するカラムクロマトグラフィにより精製し、回転蒸発後に真空乾燥器（４０℃）中で一晩乾燥させて７８０ｍｇのローダミンＢ（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９，１２－ジエン－１－アミド（２１）を粘着性の紫色の固体として得た（７８０ｍｇ、７４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６７－７．５８（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２），７．５３－７．４７（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．３６－７．３０（ｍ，１Ｈ_Ｒ１，１Ｈ_Ｒ２），７．２６－７．１９（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．２Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），６．８７（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．８４（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ２），６．７４（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ_Ｒ１），５．４０－５．２６（ｍ，２Ｈ_Ｒ１，２Ｈ_Ｒ２）；３．７５－３．４２（ｍ，８Ｈ_Ｒ１，８Ｈ_Ｒ２），３．１３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）；２．８６（ｓ，２Ｈ），２．８０－２．６８（ｍ，２Ｈ）；２．０２－１．８３（ｍ，４Ｈ），１．５－１．００（ｍ，３６Ｈ），０．９６－０．８６（ｍ，１Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。ＮＢ：回転異性体はＲ_１／Ｒ_２で示されている。

【0113】

化合物２２の合成

【化32】

テトラメチルローダミンクロリド（１５０ｍｇ、０．３５５ｍｍｏｌ、１．０当量）の１，２－ジクロロエタン（５０ｍＬ）溶液を含む２５ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（１９６ｍｇ、１２０μＬ、１．２８ｍｍｏｌ、３．６当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で３時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製塩化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。塩化アシル残留物を乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解したＮ－メチルオクタデシルアミン（１２１ｍｇ、０．４２６ｍｍｏｌ、１．２当量）を塩化アシル溶液に一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１０７ｍｇ、１４７μＬ、１．０７ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１６時間撹拌し、その時間の後に反応の進行をＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）、次いで塩水（２０ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。回転蒸発により２１３ｍｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドを、ＤＣＭ中に５～１５％のＭｅＯＨの溶離液勾配を用いる段階的カラム（３×１５ｃｍ、次いで４×７ｃｍ、シリカゲル）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィで精製した。生成物を含む画分を１つにまとめ、回転蒸発により濃縮し、次いで真空乾燥器（６０℃）中で一晩乾燥させてテトラメチルローダミン Ｎ－メチルオクタデシルアミド（２２）を濃い緑色の固体として得た（１４３ｍｇ、５９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．８１－７．７１（ｍ，２Ｈ），７．６８－７．６２（ｍ，１Ｈ），７．５５－７．４９（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝９．５，６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１０（ｍ，２Ｈ），６．９８（ｍ，２Ｈ），３．３３（ｓ，１０Ｈ），３．１８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．８５（ｓ，２Ｈ），２．６５（ｓ，１Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，２２Ｈ），１．０６（ｍ，３Ｈ），０．９４－０．８７（ｍ，３Ｈ）。

【0114】

ヘキサフルオロローダミンＢの合成

【化33】

撹拌子を含む２５ｍＬの１Ｎ ＲＢＦに空気冷却器を装着し、Ｎ－エチル－Ｎ－（２，２，２－トリフルオロエチル）－３－ヒドロキシアニリン（３．１１ｇ、１４．２ｍｍｏｌ、２．０当量）および無水フタル酸（１．０５ｇ、７．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を充填した。この混合物を撹拌しながら（５００ＲＰＭ）１６０℃で１６時間加熱して粗製ヘキサフルオロローダミンＢ遊離塩基を濃い紫色の固体として得た。粗製生成物をＤＣＭ中に５～２０％のＭｅＯＨの溶離液勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィ（６×１６ｃｍのカラム、注記１）で精製して、９－（２－（（λ^１－オキシダネイル）カルボニル）フェニル）－３，６－ビス（エチル（２，２，２－トリフルオロエチル）アミノ）キサンチリウムを濃い赤色の固体（２．１９ｇ）として得た。攪拌子および９－（２－（（λ^１－オキシダネイル）カルボニル）フェニル）－３，６－ビス（エチル（２，２，２－トリフルオロエチル）アミノ）キサンチリウム（２．１０ｇ、３．８１ｍｍｏｌ、２．２４当量）のＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦに、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中に２．８ＭのＨＣｌを添加した。反応混合物を５分間撹拌し、次いで溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、２５ｍＬのこの溶液を１００ｍＬの分液漏斗に移した。溶解された残留物の残りの半分を後で使用するために回転蒸発により濃縮した。ＤＣＭ層をＨ_２Ｏ（３×２５ｍＬ）および塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４で乾燥し、焼結ガラス漏斗で濾過した。次いで、濾液を回転蒸発により濃縮してヘキサフルオロローダミンＢ（１．００ｇ）をガラス状の濃い赤色の固体として得た。濃縮された反応混合物の残留物のもう半分を５０ｍＬのＤＣＭに再溶解し、２５ｍＬを１００ｍＬの分液漏斗に移した。ＤＣＭ層をＨ_２Ｏ（３×２５ｍＬ）および塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４で乾燥し、焼結ガラス漏斗で濾過した。次いで濾液を回転蒸発により濃縮してヘキサフルオロローダミンＢ（５７９ｍｇ）を濃い赤色の固体として得た。２５ｍＬのＤＣＭ中の反応混合物の残留物の残りの４分の１を１００ｍＬの分液漏斗に移した。ＤＣＭ層をＨ_２Ｏ（３×２５ｍＬ）および塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４で乾燥し、焼結ガラス漏斗で濾過した。次いで濾液を回転蒸発により濃縮してヘキサフルオロローダミンＢ（６１３ｍｇ）を濃い赤色の固体として得た。全収率：２．１９ｇ、９６％。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．０５－７．９６（ｍ，１Ｈ），７．７１－７．５６（ｍ，２Ｈ），７．２３－７．１７（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６７－６．５９（ｍ，４Ｈ），６．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．７Ｈｚ，２Ｈ），６．３９－６．２３（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．７２（ｍ，６Ｈ），３．５６－３．３５（ｍ，６Ｈ），１．２８－１．０８（ｍ，９Ｈ）。

【0115】

化合物２３の合成

【化34】

ヘキサフルオロローダミンＢ（５７９ｍｇ、０．９８６ｍｍｏｌ、２．０当量）の１，２－ジクロロエタン（５０ｍＬ）溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（５４４ｍｇ、３３２μＬ、３．５５ｍｍｏｌ、７．２当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製塩化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。塩化アシル残留物を乾燥ＤＣＭ（４０ｍＬ）に懸濁させ、２０ｍＬの部分（１．０当量の塩化アシル）を得られた溶液から取り出した。ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解したＮ－メチルオクタデシルアミン（１６８ｍｇ、０．５９２ｍｍｏｌ、１．２当量）を２０ｍＬの塩化アシル溶液に一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１５０ｍｇ、２０５μＬ、１．４８ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１６時間撹拌し、その時間の後に反応の進行をＴＬＣで監視した。その混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２５ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（２５ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２５ｍＬ）、次いで塩水（２５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。回転蒸発により４７７ｍｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＤＣＭ中に５～１５％のＭｅＯＨの溶離液勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィ（４×２０ｃｍ、シリカゲル）で精製した。生成物を含む画分を１つにまとめ、回転蒸発により濃縮し、次いで真空乾燥器（６０℃）中で一晩乾燥させてヘキサフルオロローダミンＢ Ｎ－メチルオクタデシルアミド（２３）を濃い赤色の固体として得た（２４２ｍｇ、５８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７２－７．６２（ｍ，２Ｈ），７．４９－７．３３（ｍ，５Ｈ），７．２２－７．１６（ｍ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｑ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ），３．８９－３．７５（ｍ，４Ｈ），３．１８－３．０６（ｍ，２Ｈ），２．９９（ｓ，２Ｈ），２．６８（ｓ，１Ｈ），２．２１－１．９４（ｍ，３Ｈ），２．０９（ｓ，４Ｈ），１．３７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），１．３０－１．０２（ｍ，３４Ｈ），０．９６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），０．９１－０．８２（ｍ，４Ｈ）。

【0116】

化合物２４の合成

【化35】

ヘキサフルオロローダミンＢ（５７９ｍｇ、０．９８６ｍｍｏｌ、２．０当量）の１，２－ジクロロエタン（５０ｍＬ）溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（５４４ｍｇ、３３２μＬ、３．５５ｍｍｏｌ、７．２当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製塩化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。塩化アシル残留物を乾燥ＤＣＭ（４０ｍＬ）に懸濁させ、２０ｍＬの部分（１．０当量の塩化アシル）を得られた溶液から取り出した。ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した（Ｅ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９－エン－１－アミン（１６７ｍｇ、０．５９２ｍｍｏｌ、１．２当量）を２０ｍＬの塩化アシル溶液に一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（１５０ｍｇ、２０５μＬ、１．４８ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１６時間撹拌し、その時間の後に反応の進行をＴＬＣで監視した。その混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２５ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（２５ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（２５ｍＬ）、次いで塩水（２５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。回転蒸発により４１８ｍｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＤＣＭ中に５～１５％のＭｅＯＨの溶離液勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィ（４×２０ｃｍ、シリカゲル）で精製した。生成物を含む画分を１つにまとめ、回転蒸発により濃縮し、次いで真空乾燥器（６０℃）中で一晩乾燥させてヘキサフルオロローダミンＢ Ｎ－メチルオクタデシルアミド（２４）を濃い赤色の固体として得た（２５４ｍｇ、６１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７１－７．６３（ｍ，２Ｈ），７．５５（ｄｄ，Ｊ＝７．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４８－７．３５（ｍ，４Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），５．４６－５．２４（ｍ，２Ｈ），４．４２（ｑ，Ｊ＝８．３，７．９Ｈｚ，４Ｈ），３．９１－３．７５（ｍ，４Ｈ），３．１３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｓ，２Ｈ），２．６８（ｓ，１Ｈ），２．２１－１．８８（ｍ，４Ｈ），１．４３－１．０２（ｍ，２９Ｈ），１．００－０．９２（ｍ，１Ｈ），０．９０－０．８１（ｍ，３Ｈ）。

【0117】

化合物２５の合成

【化36】

ヘキサフルオロローダミンＢ（１．００ｇ、１．７０ｍｍｏｌ、１．０当量）の１，２－ジクロロエタン（１００ｍＬ）溶液を含む２５０ｍＬの１Ｎ ＲＢＦにＰＯＣｌ_３（９３８ｍｇ、５７２μＬ、６．１２ｍｍｏｌ、３．６当量）を添加した。明るい紫色の混合物をＮ_２下で４時間還流し、次いで周囲温度まで放冷した。揮発性物質を回転蒸発により除去して粗製塩化アシルを明るい紫色のフィルムとして得、それをさらに精製することなく使用した。塩化アシル残留物を乾燥ＤＣＭ（８０ｍＬ）に懸濁させ、ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解した（Ｚ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９－エン－１－アミン（５７４ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、次いでＥｔ_３Ｎ（５１６ｍｇ、７０７μＬ、５．１０ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。明るい紫色の溶液を１．５時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。この混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）で失活させ、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で抽出した。有機相をＨ_２Ｏ（１００ｍＬ）、次いで塩水（７５ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させた（Ｎａ_２ＳＯ_４）。回転蒸発により１．７８ｇの粗製アミドを粘着性の紫色の固体として得た。粗製アミドをＤＣＭ中に５～１５％のＭｅＯＨの溶離液勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィ（４×２０ｃｍ、シリカゲル）で精製した。生成物を含む画分を１つにまとめ、回転蒸発により濃縮し、次いで真空乾燥器（６０℃）中で一晩乾燥させてヘキサフルオロローダミンＢ Ｎ－メチルオレイルアミド（２５）を濃い赤色の固体として得た（４７８ｍｇ、３３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．７３－７．６１（ｍ，２Ｈ），７．５５（ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４９－７．３２（ｍ，４Ｈ），７．２４－７．１５（ｍ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４０－５．２６（ｍ，２Ｈ），４．４３（ｐ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，３Ｈ），３．８３（ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），３．１３（ｑ，Ｊ＝６．３，５．１Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｓ，１Ｈ），１．９８（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），１．３７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），１．３１－１．２３（ｍ，１５Ｈ），１．１０（ｓ，３Ｈ），０．９１－０．８３（ｍ，３Ｈ）。

【0118】

実施例２：色素のスペクトルスキャン
以下の手順に従って色素１～２５についてスペクトルスキャンを行った。２００μＬの２μＭの色素をＣｏｓｔａｒ９６ウェル平底プレートの中にピペットで移した。このプレートをＣＬＡＲＩＯＳｔａｒ分光光度計によりスキャンした。各ウェルを単一点でスキャンした。吸収スキャンでは期待される発光波長を５９８ｎｍに設定し、吸収データを４５０～５６８ｎｍから収集した。発光スペクトルでは期待される吸収波長を５５２ｎｍに設定し、発光スペクトルを５８０～７００ｎｍから収集した。そのゲインを１０００に設定した。

【0119】

ローダミンファミリーの最大吸収は５６４ｎｍであると決定し、最大発光は５８８ｎｍであると決定した。なお、大部分のシステムは約１０～２０ｎｍの帯域幅を有する。その後の実験では、蛍光を５６２ｎｍ／５８３ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）に設定した。

【0120】

実施例３：色素による細胞外小胞の標識
以下の手順に従って１～１０色素による細胞外小胞（ＥＶ）の標識を行った。２０μＬの血小板由来のＥＶを、２μＭの最終濃度の色素の各色素の存在下または非存在下でＨＰＬＣバイアル中でインキュベートし、色素原液は水の中で調製した。陰性対照では、当体積の希釈液をＥＶ溶液に添加した。この試料を穏やかに混合した。その後に各試料を３７℃で１時間インキュベートした。試料を４℃に設定したオートサンプラに移して貯蔵した。標識されたＥＶの前に非標識ＥＶを注入するバッチテーブルを準備した。各標識されたＥＶの実験後にブランク注入を行って持ち越し汚染が存在しないようにした。

【0121】

１５μＬの各試料をＣｙｔｉｖａ社製のＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（３．２／３００）に注入した。流速を０．１５ｍＬ／分に設定した。緩衝液Ａ：１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．４、１００ｎｍで濾過済）を用いて、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＢｉｏＨＰＬＣを定組成モードで実行した。カラム乾燥器温度は３０℃に設定した。総実行期間は３０分であった。２つの検出器を用いてデータを収集した。ＰＤＡ（ＵＶ検出器）は１９０～８００ｎｍでスキャンするように設定し、ＦＬＤ（蛍光検出器）のチャネルは５６２ｎｍ／５８３ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）に設定した。滴定実験を行って過剰な色素が除去されているかを確認した。２１４ｎｍでの吸収および５８３ｎｍでの発光からボイドピークの面積を手動の積分関数を用いてＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアにより計算した。蛍光シグナルを正規化するために、総蛍光面積をＵＶ２１４ｎｍでの面積で割った。この比を使用して各色素をランク付けすることができ、ここではより高い比がより大きい組み込みを示す。

【0122】

それらの結果が表１にまとめられている。全ての色素１～１０がＥＶの中に組み込まれていることが分かり、ＥＶ＋色素を含む各試料がそれぞれのＥＶ単独の試料と比較してより高いＦＬＤ／ＵＶ比を示していた。これらの結果は、色素１～１０をＥＶの中に組み込むことができることを示している。

【表2】

【0123】

ＥＶ内への色素の組み込みをフローサイトメトリーでも確認した。図１は、Ａｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ ＭＫＩＩイメージングフローサイトメーターを用いたＥＶ＋色素２の検出を示す。この結果は、色素がＥＶを標識することができることを示している。

【0124】

実施例４：色素によるヒト細胞の標識
以下の手順に従って色素１～１０によるヒト細胞の標識を行った。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル平底プレートの各ウェルに５，０００個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｐ９以下）を播種し、完全培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）＋２％ｖ／ｖウシ胎児血清）において一晩接着させた。各色素を１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を含む１ｍＭの原液から１：５０で２０μＭの最終濃度まで希釈した。その後に色素を完全培地にさらなる１：１０の希釈で２μＭの最終濃度まで添加した。その後に細胞上の培地を色素を含む新たに調製した完全培地で交換した。陰性対照では当体積の希釈溶液を細胞溶液に添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、次いで１×ＨＢＳＳ（ハンクス液）で洗浄して遊離色素を除去した。プレートをＣＬＡＲＩＯＳｔａｒ分光光度計（５×５行列モード、平均２５のデータ点、各色素のために３つのウェル）を用いて画像化した。より高い蛍光は細胞内へのより多くの量の組み込みを示している。

【0125】

それらの結果が表２にまとめられている。全ての色素１～１０がＮＨＤＦ内に組み込まれていることが分かり、色素を含む各試料がＮＨＤＦ単独と比較してより高いＦＬＤを示した。これらの結果は、色素１～１０をヒト細胞の中に組み込むことができることを示している。

【表3】

【0126】

フローサイトメトリーでもＮＨＤＦ内への色素の組み込みを確認した。図２は、Ａｍｎｉｓ ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ ＭＫＩＩイメージングフローサイトメーターを用いた細胞＋色素２の検出を示す。この結果は、色素がＮＨＤＦなどのヒト細胞を標識することができることを示している。

【0127】

実施例５：色素で標識されたヒト細胞の画像化
以下の手順に従って細胞を画像化して色素の組み込みを評価した。細胞をＮＨＤＦ（Ｐ９以下）、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）または骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）と共に播種し、かつ色素２を０．２μＭの最終濃度で使用したという修正以外は、実施例４の手順に従って細胞＋色素２試料を調製した。画像化前に、各ウェルを１×ＨＢＳＳ（－）で１回洗浄した。イメージング前に１００～２００μＬの１×ＨＢＳＳ（－）を各ウェルに添加して細胞が乾き切らないようにした。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄフィルタが装着されたＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＥＶｏｓ Ｍ５０００顕微鏡上で細胞を画像化した。日常的に利用される条件は、１０×Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、２２、１４６、１０５；２０×Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、１２、１３３、６４；４０×Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、３６、７９、４０（倍率、光、曝露、ゲイン）であった。同じプレート上で撮影された全ての画像のために設定を一定に維持した。

【0128】

その顕微鏡画像が図３に示されており、色素２がＮＨＤＦ、ＵＣ－ＭＳＣおよびＢＭ－ＭＳＣを標識することができることを実証している（それぞれ図３（ａ）、（ｂ）および（ｃ））。これらの結果は、当該色素が様々なヒト細胞を標識することができることを示している。

【0129】

実施例６：過剰な色素を除去するための手順
以下の手順に従って過剰な色素を除去するためのカラムの能力を調べた。Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（４０Ｋの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、２ｍＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して過剰な色素を除去した。４０ｋＤａのカットオフのＺｅｂａスピン脱塩カラムを使用するために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社によって提供されている説明書に従って遠心分離を行った。色素２を４０ｋＤａのカットオフのＺｅｂａスピン脱塩カラムを通過するその能力について、３つの濃度（２μＭ、０．２μＭおよび０．０２μＭ）で評価した。対照ウェルはＮＨＤＦ細胞のみを含んでいた。この手順の背後にある論理的根拠は、ＥＶ／細胞とのインキュベーション後にｘ％の色素２が「遊離している」場合、Ｚｅｂａカラムを使用して「遊離」（過剰な）色素を除去することができるかを決定することであった（２μＭ、０．２μＭおよび０．０２μＭの試料は１００％、１０％および１％の「遊離」色素２をそれぞれ表す）。ＣＬＡＲＩＯＳｔａｒ分光光度計（５×５行列モード、平均２５のデータ点、各色素のために３つのウェル）を用いてこれらの試料を分析した。

【0130】

それらの結果が表３に示されている。これらの結果は２μＭの試料では約１５％の色素が通過したが、０．２μＭおよび０．０２μＭの試料では本質的にどの色素も通過しなかったことを示している。これらの結果は、過剰な色素を好適なカラムを用いて除去することができると共に、カラムを通過する色素の量が実験結果に影響を与える可能性が低いことを示している。

【表4】

【0131】

実施例７：色素によるヒト細胞の標識および標識された細胞外小胞
以下の手順に従って色素１１～１８単独および色素１１～１８で標識されたＥＶによりＮＨＤＦ細胞の標識を行った。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル平底プレートの各ウェルに５，０００個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｐ９以下）を播種し、完全培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ社）＋２％ｖ／ｖのウシ胎児血清）において一晩接着させた。各色素を１ｍＭの最終濃度まで水で希釈した。次いで色素をベース製剤（１×ＰＢＳ）または１×ＰＢＳ中のＰｌｅｘａｒｉｓの試料（血小板由来の精製済ＥＶ）のいずれかで２μＭの最終濃度まで希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。その後に色素をさらなる１：１０の希釈で０．２μＭの最終濃度までＮＨＤＦに添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、次いで１×ＨＢＳＳ（ハンクス液）で洗浄して遊離色素を除去した。プレートをＣＬＡＲＩＯＳｔａｒ分光光度計（５×５行列モード、平均２５のデータ点、各色素のために３つのウェル）を用いて画像化した。このデータを色素２またはＰｌｅｘａｒｉｓ＋色素２のいずれかに対して正規化した。より高い蛍光は細胞内へのより多くの量の組み込みを示している。

【0132】

図４（ａ）はＮＨＤＦ上に色素のみに関する結果を示し、図４（ｂ）は、ＮＨＤＦ上にＰｌｅｘａｒｉｓ＋色素に関する結果を示す。単独またはＰｌｅｘａｒｉｓ（ＰＬＸ）を含む全ての色素１１～１８がＮＨＤＦ内に組み込まれていることが分かり、これは色素１１～１８および色素１１～１８でタグ付けされたＥＶをヒト細胞の中に組み込むことができることを示している。これらの結果は、単独またはＰＬＸを含む色素１２、１４，１５、１７および１８が色素２単独およびＰＬＸ＋色素２のそれぞれよりも大きい程度まで細胞に組み込まれたという指標も与える。

【0133】

実施例８：過剰な色素を除去するための手順
Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（４０Ｋの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ））を用いて色素１７および１８を除去することができるか否かを探求するために、色素をベース製剤（１×ＰＢＳ）中に２μＭの濃度で調製し、Ｚｅｂａスピンカラムにより回転させた。色素の除去をＰｌｅｘａｒｉｓ＋色素２、Ｐｌｅｘａｒｉｓ単独および対照として使用されるＮＨＤＦ細胞単独と比較した。

【0134】

それらの結果が図５に示されており、ここではデータはＰＬＸ＋色素２に対して正規化されている。これらの結果は、色素１７および１８では細胞染色が観察されなかったことを実証している。これらの結果は、好適なカラムを用いて過剰な色素を除去することができると共に、カラムを通過する色素の量が実験結果に影響を与える可能性が低いことを示している。

【0135】

実施例９：標識された細胞外小胞によるヒト細胞の標識
以下の手順に従って色素４、６、１７、１８、２３、２４および２５で標識されたＥＶによるＮＨＤＦ細胞の標識を行った。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル平底プレートの各ウェルに５，０００個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｐ９以下）を播種し、完全培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ社）＋２％ｖ／ｖウシ胎児血清）において一晩接着させた。各色素をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１ｍＭの最終濃度まで希釈した。次いで色素をＰｌｅｘａｒｉｓ（血小板由来の精製済ＥＶ）中で２μＭの最終濃度までＰＢＳで希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。その後に色素をさらなる１：１０の希釈で０．２μＭの最終濃度までＮＨＤＦに添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、次いで１×ＨＢＳＳ（ハンクス液）で洗浄して遊離色素を除去した。プレートをＣＬＡＲＩＯＳｔａｒ分光光度計（５×５行列モード、平均２５のデータ点、各色素のために３つのウェル）を用いて画像化した。このデータをＰｌｅｘａｒｉｓ＋色素２に対して正規化した。より高い蛍光は細胞内へのより多くの量の組み込みを示している。

【0136】

それらの結果が図６に示されている。Ｐｌｅｘａｒｉｓ（ＰＬＸ）を含む全ての色素４、６、１７、１８、２３、２４および２５がＮＨＤＦ内に組み込まれていることが分かり、これは色素４、６、１７、１８、２３、２４および２５で標識されたＥＶをヒト細胞の中に組み込むことができることを示している。

【0137】

実施例１０：標識された細胞外小胞を用いた細胞増殖アッセイ
色素が細胞増殖に対して影響を与えるか否かを調べるために、以下の手順に従って本発明の色素で標識されたＥＶを調べた。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル平底プレートのウェルに５，０００個の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｐ９以下）を播種し、２００μＬの完全培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ社）＋２％ｖ／ｖウシ胎児血清）中で一晩接着させた。２４時間後、ウェルの底にある接着細胞を阻害することなく完全培地を除去し、各ウェルを２００μＬのＨＢＳＳ（ハンクス液）で１回洗浄した。２００μＬの基本培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ社）＋０．１％ｖ／ｖウシ胎児血清）を各ウェルに添加した。標識されたＥＶを調製するために、エタノール中に７ｍＭの色素２、４、６、１７、１８、２３、２４および２５の原液をＰＢＳで１：３５０で希釈して２０μＭの最終濃度を得た。その後に色素をさらなる１：１０の希釈でＨＥＫ ＥＶ（１×ＰＢＳ）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。３６０μＬのＰｌｅｘａｒｉｓを４０μＬのＰＢＳで希釈することにより、非標識Ｐｌｅｘａｒｉｓの試料も調製した。

【0138】

１６時間後に基本培地を実験ウェルから除去し、処理条件および対照のウェルごとに２００μＬを添加した（それぞれｎ＝３）。このアッセイを７２時間後に停止した。正規化時間を用いたデータ分析のために、デルタ細胞指標を使用した（処理後の最初の読み取りを追加した）。処理から２４、３６、４８および７２時間後にデータを分析し、それらの値を各時点についてそれぞれの基本培地に対して正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８）を使用して、多重比較（補正なしＤｕｎｎ検定）を用いるクラスカル・ウォリスのノンパラメトリック一元配置分散分析を行った。

【0139】

処理から２４、３６、４８および７２時間後の結果がそれぞれ図７（ａ）～図７（ｄ）に示されている。これらの試料は以下のように表されている：０．１％基本培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ社）＋０．１％ｖ／ｖウシ胎児血清）：黒い丸；２％完全培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ社）＋２％ｖ／ｖウシ胎児血清）：黒い四角形；１０％高い培地（線維芽細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ社）＋１０％ｖ／ｖウシ胎児血清）：黒い上向き三角形；０．１％基本培地中のＰＢＳ対照：黒い下向き三角形；ＰＬＸ＋色素２３：黒い菱形；ＰＬＸ＋色素２４：白い丸；ＰＬＸ＋色素２５：白い四角形；ＰＬＸ＋色素１８：白い上向き三角形；ＰＬＸ＋色素１７：白い下向き三角形；ＰＬＸ＋色素４：白い菱形；ＰＬＸ＋色素６：アスタリスク；ＰＬＸ＋色素２：星；ＰＬＸ単独：プラス。有意性は以下のように表されている：（^＊）は＜０．０５を意味し、（^＊＊）は＜０．００５を意味し、（^＊＊＊）は＜０．０００５を意味し、かつ非有意性は（^＊）がないことで示されている。これらの結果は、色素が７２時間の期間にわたって０．１％基本培地と比較して細胞増殖に対してほとんど影響を及ぼさなかったことを示している。

【0140】

実施例１１：標識された細胞外小胞を用いた免疫調節アッセイ
この研究では、本発明の色素２ならびに従来通りに使用される色素ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－ＣＥＲ、カルセインＡＭ、ＣＦＳＥおよびＰＫＨ６７による間葉系間質細胞（ＭＳＣ－ＥＶ）からのＥＶ調製物の標識効率を調べた。ＰＫＨ６７および色素２で標識された解析対象の対比染色を抗テトラスパニン抗体を用いて行った。ＭＳＣ－ＥＶ調製物の免疫調節能力に対する色素２標識の影響をマルチドナー混合リンパ球反応（ｍｄＭＬＲ）アッセイにおいて調べた。さらにｍｄＭＬＲアッセイ内で、異なる免疫細胞による色素２で標識された解析対象の取込みを評価した。

【0141】

材料および方法
先に記載されているように（Ｂｏｒｇｅｒ，Ｖら，２０２０，間葉系幹細胞／間質細胞由来の細胞外小胞の調整された単離（Ｓｃａｌｅｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ／Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５５，ｅ１２８；Ｋｏｒｄｅｌａｓら，２０１４，ＭＳＣ由来エキソソーム：治療難治性移植片対宿主病を治療するための新規なツール（ＭＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２８，９７０－９７３；Ｌｕｄｗｉｇら，２０１８，ポリエチレングリコールによる沈殿ならびにその後の洗浄および超遠心分離によるペレット化により、小規模および大規模に組織培養物上澄みから細胞外小胞を濃縮する（Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｗａｓｈｉｎｇ ａｎｄ ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ ｂｙ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｅｎｒｉｃｈｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅｓ）．Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ７，１５２８１０９）、ポリエチレングリコール６０００沈殿およびその後の超遠心分離により、ＭＳＣ馴化培地を含むヒト血小板溶解物からＭＳＣ－ＥＶを調製した。馴化培地を４８時間ごとに回収した。１ｍＬの最終試料が約４．０×１０^７個の細胞の調製収率の馴化培地を含むように、得られたＭＳＣ－ＥＶ調製物をＮａＣｌ－ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、タウフキルヘン、ドイツ）で希釈した。

【0142】

ＥＶ調製物の特性評価
得られたＥＶ調製物をＭＩＳＥＶ基準に従って特性評価した（Ｔｈｅｒｙら，２０１８，細胞外小胞２０１８（ＭＩＳＥＶ２０１８）の研究についての最小情報：国際細胞外小胞学会の基本的な考え方およびＭＩＳＥＶ２０１４ガイドラインの更新（Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１８（ＭＩＳＥＶ２０１８）：ａ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ＭＩＳＥＶ２０１４ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）．Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ７，１５３５７５０）。簡単に言うと、先に記載されているように（Ｌｕｄｗｉｇら，２０１８）、ソフトウェアバージョン８．０３．０８．０２を備えたＺｅｔａＶｉｅｗ ＰＭＸ－１２０プラットフォーム（ＰａｒｔｉｃｌｅＭｅｔｒｉｘ社、メーアブッシュ、ドイツ）上のＮＴＡにより平均粒子濃度を決定した。製造業者の推奨に従って９６ウェルプレートにおいてビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社、米国イリノイ州ロックフォード）により、タンパク質濃度を決定した。先に記載されているように（Ｌｕｄｗｉｇら，２０１８）行ったウェスタンブロットにおいて、ＥＶ特異的タンパク質（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびシンテニン）の存在および不純物（カルネキシン）の不存在を確認した。

【0143】

色素によるＥＶ標識
ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ダルムシュタット、ドイツ）による染色は、製造業者のプロトコルに基づいていた。未結合ＣＦＳＥからのシグナルを減らすために僅かな修正が必要とされた。簡単に言うと、ＣＦＳＥ原液を１０μＭ ＣＦＳＥの作業溶液まで希釈した。この溶液を１７，０００×ｇおよび１０分間で３回遠心分離した。その後に、１×１０^６個のＭＳＣから得られたＥＶの量に対応する２５μＬのＭＳＣ－ＥＶ調製物を、遠心分離したＣＦＳＥ溶液と共に３７℃で２０分間インキュベートした。この試料を分析前に１ｍＬの最終体積まで１：２０で希釈した。

【0144】

カルセインＡＭによるＭＳＣ－ＥＶ調製物の染色は製造業者の説明書に従った。簡単に言うと、２５μＬのＭＳＣ－ＥＶ調製物をカルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の２５μＬの２０μＭ溶液と共に３７℃で４０分間インキュベートした。この試料を１：２０で１ｍＬの最終体積まで希釈してバックグラウンドノイズを減らし、洗浄工程の要求を回避した。

【0145】

ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－セラミドによるＭＳＣ－ＥＶ調製物の染色は製造業者の説明書に従った。簡単に言うと、４×１０^６個のＭＳＣからの精製済ＥＶに対応する２５μＬのＭＳＣ－ＥＶ調製物を２５μＬの２０μＭのＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－セラミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液と共に３７℃で２０分間インキュベートした。１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む４５０μＬの０．９％ＮａＣｌ（０．９％ＮａＣｌ、メルズンゲン、Ｂ．Ｂｒａｕｎ社；ＨＥＰＥＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）緩衝液を添加し、遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５００；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、ゲッティンゲン、ドイツ）を用いてＥＶを洗浄した。保持液を分析前に５００μＬに調整した。

【0146】

ＰＫＨ６７によるＭＳＣ－ＥＶ調製物の染色は、ＥＶを標識するための製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の説明書に従った。簡単に言うと、８×１０^６個の細胞からの精製済ＥＶに対応する２００μＬの所与のＭＳＣ－ＥＶ調製物を用いて、この溶液を１ｍＬの最終体積まで希釈液Ｃで調整した。６μＬのＰＫＨ６７色素を各チューブに添加し、連続的に３０秒間混合した。室温で５分後に、２ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン画分５（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ）を添加してこの溶液を失活させた。無血清培地すなわち１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ダルムシュタット、ドイツ）が添加されたＤＭＥＭ低グルコース（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、アイデンバッハ、ドイツ）を使用して、体積を８．５ｍＬに調整した。１．５ｍＬの０．９７１Ｍのスクロース溶液（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社）をチューブの底に添加し、このチューブを振動回転子（ＳＷ４０ Ｔｉ；１５９ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クレーフェルト、ドイツ；ｋファクター：１３７）の中で１９０，０００×ｇおよび４℃で２時間遠心分離した。その上澄みを捨て、そのペレットをＮａ－ＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁した。再懸濁後にその体積を５ｍＬに調整し、遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ６；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に移した。保持液を分析前に１２０μＬに調整した。

【0147】

以下のプロトコルに従ってＭＳＣ－ＥＶ調製物を本発明の色素２で染色した。色素２は凍結乾燥された粉末として提供された。１ｍｇの色素２を０．２μＭの最終濃度まで１ｍＬの緩衝液により再懸濁した。ＣＦＤＡ－ＳＥと同様に、色素２溶液を１７，０００×ｇで１０分間遠心分離してバックグラウンドノイズを最小まで減らした。簡単に言うと、ＥＶ標識のために２５μＬのＭＳＣ－ＥＶ調製物を２５μＬの調製済の遠心分離させた色素２溶液（０．２μＭ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。この試料を分析前に１ｍＬの最終体積まで１：２０で希釈した。ＥＶ取込み実験のために、色素２で標識されたＭＳＣ－ＥＶ調製物から限外濾過によりＥＶ未結合色素２を除去した。簡単に言うと、色素２による標識後に、ＭＳＣ－ＥＶをＶｉｖａｓｐｉｎ ５００フィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に通して１２，０００×ｇでの１０分間の遠心分離により洗浄した。保持液を標識されたＥＶ試料として回収した。

【0148】

調製済のＥＶの抗体標識
色素標識後に、５μＬの色素２で染色したＭＳＣ－ＥＶ試料を、２０μＬの１０ｎＭの抗ヒトＣＤ９ ＦＩＴＣ（ＥＸＢＩＯ社、Ｖｅｓｔｅｃ、チェコ共和国）、１２ｎＭの抗ヒトＣＤ６３ ＡＦ４８８（ＥＸＢＩＯ社）または１３ｎＭの抗ヒトＣＤ８１ ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）抗体溶液とそれぞれ混合した。ＰＫＨ６７で染色したＭＳＣ－ＥＶ試料では、先に記載されているように（Ｔｅｒｔｅｌら，２０２０ｂ，酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）の第４章：イメージングフローサイトメトリーによる個々の細胞外小胞の分析（Ｃｈａｐｔｅｒ Ｆｏｕｒ－Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ），Ｓ．ＳｐａｄａおよびＬ．Ｇａｌｌｕｚｚｉ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．５５－７８）、１０ｎＭの抗ヒトＣＤ９ ＰＥ（ＥＸＢＩＯ社）、１２ｎＭの抗ヒトＣＤ６３ ＰＥ（ＥＸＢＩＯ社）または１３ｎＭの抗ヒトＣＤ８１ ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）のそれぞれと共に室温で２時間インキュベートした。従ってアイソタイプコントロールを行った。色素２では、最終調製物をＣＤ９のために５００μＬまで希釈し（１～１００の最終希釈係数）、ＣＤ６３およびＣＤ８１分析のために２００μＬまで希釈した（１～４０の最終希釈係数）。ＰＫＨ６７のための調製物を全３回の分析のために１００μＬまで希釈した（１：２０の希釈）。

【0149】

界面活性剤コントロール
標識された解析対象のＥＶの性質について試験するために、２％（ｗ／ｖ）試料体積のＮＰ－４０溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を当該試料に添加して界面活性剤コントロールを行った。

【0150】

ＩＦＣＭ分析
ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ Ｍａｒｋ ＩＩフローサイトメーター（ＡＭＮＩＳ／Ｌｕｍｉｎｅｘ社、米国ワシントン州シアトル）により、１つのウェル当たり５分間の取得時間でＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｆａｌｃｏｎ、ｃａｔ３５３０７７）から、内蔵のオートサンプラを用いて全ての試料を測定した。先に記載されているように（Ｇｏｒｇｅｎｓら，２０１９，生物学的標準物質としての蛍光標識された小胞を用いた単一の細胞外小胞の分析のためのイメージングフローサイトメトリーの最適化（Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｔａｇｇｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）．Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ８，１５８７５６７；Ｔｅｒｔｅｌら，２０２０ａ，高解像度イメージングフローサイトメトリーにより抗体による細胞外小胞の標識に対するインキュベーション温度の影響を明らかにする（Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＲＥＶｅａｌｓ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ ９７，６０２－６０９）、全データを低い流速（０．３７９５±０．０００３μＬ／分）および６０×の倍率で、除去ビーズオプションは非有効化状態で取得した。そのデータを先に記載されているように（Ｔｅｒｔｅｌら，２０２０ｂ）解析した。

【0151】

マルチドナー混合リンパ球反応（ｍｄＭＬＲ）
先に記載されているように（Ｍａｄｅｌら，２０２０，独立したヒト間葉系間質細胞由来の細胞外小胞調製物は進行したマウスの移植片対宿主病モデルにおける症状に差次的に影響を与える（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｕｒｉｎｅ Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔ－Ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ）．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２０１２．２０２１．４２３６５８）、色素２標識／非標識ＭＳＣ－ＥＶ調製物の免疫調節可能性をマルチドナー混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）において比較した。簡単に言うと、１２人の健康なドナーからのフィコール調製した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を等しい割合で混合し、等分し、使用まで液体窒素の気相中に貯蔵した。解凍後に、９６ウェルＵ底型プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カイザースラウテルン、ドイツ）の１つのウェル当たり６００，０００個の細胞を播種し、試験されるＭＳＣ－ＥＶ調製物の存在下または非存在下のいずれかで１つのウェルあたり２００μＬの最終体積で１０％ヒトＡＢ血清（自社で生成）および１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で培養した。５日後に細胞を回収し、異なる蛍光標識された抗体の群（ＣＤ４－ＢＶ７８５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ；ＣＤ２５－ＰＥ－Ｃｙ５．５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；およびＣＤ５４－ＡＦ７００；ＥＸＢＩＯ社）で染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ２．３ソフトウェア、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で分析した。活性化および非活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞をそれらのＣＤ２５およびＣＤ５４発現によりそれぞれ区別した。典型的には、５μＬの試験されるＭＳＣ－ＥＶ調製物をそれぞれのウェルに加えた。以下の抗体：ＣＤ８－ＢＶ６５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＣＤ１４－ＰＯ（ＥＸＢＩＯ社）、ＣＤ１９－ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）およびＣＤ５６－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を使用してさらに亜集団を区別した。それらのデータの評価はＫａｌｕｚａソフトウェア（バージョン２．１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて行った。

【0152】

統計
ＧｒａｐｈＰａｄバージョン８．４．３を用いて統計およびグラフ表示を行った。平均値±標準偏差が提供される。

【0153】

結果
ＣＦＳＥ、カルセインＡＭおよびＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－セラミドはＭＳＣ－ＥＶを標識しない
従来通りに使用されるＥＶ標識色素、具体的にはＣＦＳＥ、カルセインＡＭ、ＰＫＨ６７およびＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－セラミドならびに本発明の色素２の正確性を評価した。様々な動物モデルにおいて広範囲に探求されてきたＭＳＣ－ＥＶ調製物は、十分に確立されたＰＥＧ－超遠心分離プロトコル（Ｂｏｒｇｅｒら，２０２０；Ｄｏｅｐｐｎｅｒら，２０１５，細胞外小胞は脳卒中後の神経再生を向上させ、かつ虚血後免疫抑制を防止する（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐｏｓｔ－Ｓｔｒｏｋｅ Ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰｒＥＶｅｎｔ Ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４，１１３１－１１４３；Ｄｒｏｍｍｅｌｓｃｈｍｉｄｔら，２０１７，間葉系幹細胞由来の細胞外小胞は炎症誘発性早期脳損傷を寛解させる（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）．Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ Ｉｍｍｕｎ ６０，２２０－２３２；Ｇｕｓｓｅｎｈｏｖｅｎら，２０１９，新生児の低酸素性虚血性脳症における血液脳関門完全性のための神経保護決定因子としてのアネキシンＡ１（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１ ａｓ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｈｙｐｏｘｉｃ－Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ ８；Ｋａｍｉｎｓｋｉら，２０２０，間葉系間質細胞由来の細胞外小胞は神経炎症を減少させ、神経細胞増殖を促進させ、かつ新生児の低酸素性虚血性脳損傷におけるオリゴデンドロサイト成熟を向上させる（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｒｅｄｕｃｅ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｈｙｐｏｘｉｃ－Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ）．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４，６０１１７６；Ｋｏｒｄｅｌａｓら，２０１４；Ｌｕｄｗｉｇら，２０１８；Ｏｐｈｅｌｄｅｒｓら，２０１６，間葉系間質細胞由来の細胞外小胞は低酸素虚血後の胎児の脳を保護する（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ Ｆｅｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ａｆｔｅｒ Ｈｙｐｏｘｉａ－Ｉｓｃｈｅｍｉａ）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，７５４－７６３；Ｗａｎｇら，２０２０，間葉系間質細胞由来の小型細胞外小胞は白血球および具体的には好中球を調節することによる虚血性神経保護を誘導する（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｍａｌｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）．Ｓｔｒｏｋｅ ５１，１８２５－１８３４）によって、１０％ヒトの血小板溶解物が添加された培地において生じたＭＳＣの上澄みから得られてきた。従来の色素のいくつかのミセル形成が報告されているため、ＭＩＦｌｏｗＣｙｔ－ＥＶの推奨（Ｗｅｌｓｈら，２０２０，ＭＩＦｌｏｗＣｙｔ－ＥＶ：細胞外小胞フローサイトメトリー実験の標準化報告のためのフレームワーク（ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ９，１７１３５２６）に従って、ＥＶ試料以外の標識色素の全てを最初にＮａＣｌ－ＨＥＰＥＳ緩衝液、すなわちＭＳＣ－ＥＶが懸濁されている緩衝液に添加した。試料を製造業者の推奨に従って処理し、本発明者らが抗体標識されたＭＳＣ－ＥＶの特性評価のために確立に成功したプロトコル（Ｇｏｒｇｅｎｓら，２０１９；Ｔｅｒｔｅｌら，２０２０ａ；Ｔｅｒｔｅｌら，２０２０ｂ）を用いてＩＦＣＭにより分析した。

【0154】

製造業者のプロトコルに応じて、異なる量のＭＳＣ－ＥＶ調製物が必要とされた。ＣＦＳＥ、カルセイン－ＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－セラミド－（ＢＯＤＩＰＹ）および色素２標識のために、２５μＬの体積のＭＳＣ－ＥＶ調製物を使用し、ＰＫＨ６７のために２００μＬを用いた。最初に全ての記録された２３９個の解析対象を分析した。先行経験に基づくと、ｓＥＶは最小の側方散乱シグナル（ＳＳＣ）を有する蛍光標識された解析対象として見える。色素のみの溶液を比較すると、ＣＦＳＥ、カルセインＡＭおよび色素２は解析対象を含んでいないことが観察された。対照的にＢＯＤＩＰＹおよびＰＫＨ６７溶液を分析した際には、最小の側方散乱シグナルを有する標識された解析対象の固体集団が同定された（図８）。このデータはＢＯＤＩＰＹおよびＰＫＨ色素のミセルまたは凝集体形成を暗示している。

【0155】

その後に、同じ手順を用いて標識されたＭＳＣ－ＥＶ調製物を分析した。緩衝液のみの溶液とは対照的に、標識された解析対象の固体集団がＢＯＤＩＰＹ、ＰＫＨ６７および色素２標識後に、いくつかの解析対象はＣＦＳＥ標識後に観察された（図８）。カルセインＡＭはどの検出可能な解析対象も標識することができなかった。緩衝液－ＢＯＤＩＰＹ溶液対照において回収されなかったＢＯＤＩＰＹ^＋解析対象は、典型的には小型ＥＶ（ｓＥＶ）について認められるものよりも非常に高い側方散乱シグナルを示した。対照的に、ＰＫＨ６７または色素２で特異的に標識された解析対象の光散乱特性はｓＥＶのものを反映している。ＰＫＨ色素が標識されたＥＶのサイズを増加させるという公開されている報告書（Ｄｅｈｇｈａｎｉら，２０２０，ナノ粒子追跡分析による細胞外小胞サイズに関するＰＫＨ標識の系統的評価（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＥＶａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＫＨ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ｂｙ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０，９５３３；Ｍｏｒａｌｅｓ－Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら，２０１７，ナノスケールフローサイトメトリーのための細胞外小胞の標識（Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，１８７８）と十分に一致して、ＭＳＣ－ＥＶ調製物において特異的に標識されたＰＫＨ６７^＋解析対象は色素２^＋解析対象よりも高い側方散乱シグナルを示した（図８）。

【0156】

特異的に標識された解析対象が界面活性剤感受性（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であるか否かを決定するために、色素で標識されたＭＳＣ－ＥＶ試料をＮＰ４０で処理した。ＢＯＤＩＰＹ^＋解析対象がＭＳＣ－ＥＶ調製物において特異的に検出されたが、より高い光散乱特性を有するものならびに全てのＰＫＨ６７^＋および色素２^＋解析対象はＮＰ４０処理後に消失した。対照的に、ｓＥＶ光散乱特性を有するＣＦＳＥ^＋解析対象およびＢＯＤＩＰＹ^＋解析対象の集団はＮＰ４０処理によってほとんど影響を受けなかった。この目的を達成するために、カルセインＡＭがどの特異的解析対象も標識することができないことと併せて、低い光散乱特性を有する界面活性剤不溶性ＣＦＳＥ^＋またはＢＯＤＩＰＹ^＋解析対象はどちらも小型ＥＶとしてみなさず、ＣＦＳＥ、カルセインＡＭおよびＢＯＤＩＰＹを全ての後の分析から除外し、かつＭＳＣ－ＥＶ標識色素としてのＰＫＨ６７および色素２の正確性に焦点を当てた。

【0157】

ＰＫＨ６７はＣＤ９^＋、ＣＤ６３^＋およびＣＤ８１^＋ｓＥＶを有効に標識することができない
次に公知のＥＶマーカーとのＰＫＨ６７の潜在的な共局在化を調べた。この目的を達成するために、十分に特性評価されたＭＳＣ－ＥＶ調製物を使用した。これらをＰＫＨ６７単独または以下の抗体：抗ＣＤ９、抗ＣＤ８１または抗ＣＤ６３抗体のいずれかとの組み合わせのいずれか一方で染色した。バックグラウンドノイズを減らし、かつ同時に起こるイベント、すなわち同時に２つ以上の独立した解析対象の同時検出（大きい解析対象数での同時発生）を排除するために、最適化されたゲーティング戦略を適用した。簡単に言うと、同時の抗体シグナルを有しないＰＫＨ６７チャネルにおいてシングレットとして、または同時のＰＫＨ６７シグナルを有しない抗体チャネルにおいてシングレットとして認識される解析対象、および２つの個々の解析対象を提供しないシングレットとして両方のチャネルにおいて現れるイベントに焦点を当てた（図９Ａ）。

【0158】

側方散乱をＰＫＨ６７強度に対してプロットした際に、ＰＫＨ６７で標識された緩衝液およびＭＳＣ－ＥＶを含む対照よりも、抗ＣＤ９抗体で対比染色されていた試料において多くの解析対象が回収された。これらの解析対象の大部分がＰＫＨ６７に対して陰性であり、低いＳＳＣシグナルを示した。これらの解析対象を含む領域をＲ１として定めた。抗ＣＤ９染色では、領域Ｒ１において６６７２±１１７０個の解析対象が回収された。抗体により対比染色されていないＰＫＨ６７で標識されたＭＳＣ－ＥＶ試料中のＲ１ではどの解析対象もほとんど回収されなかった。ＰＫＨ６７で標識されたＭＳＣ－ＥＶ試料が抗ＣＤ６３抗体（２２１±４２個の解析対象）または抗ＣＤ８１抗体（９６±３２個の解析対象）で対比染色されている場合には解析対象数における僅かな上昇が記録された。ＰＫＨ６７に対して陽性の解析対象の大部分が固体のＳＳＣシグナルを示した。これらの解析対象を含む領域をＲ３として定めた。Ｒ２として定めた領域においてクラスター化したより小さい数のＰＫＨ６７で標識された解析対象を低いＳＳＣシグナルにより同定した。Ｒ１における解析対象の数とは対照的に、Ｒ２およびＲ３における解析対象の数は抗体標識手順によって僅かにのみ影響を受けた（図９Ａおよび図９Ｂ）。抗体非標識対照内では、Ｒ２において２０４０±３４４個の解析対象、抗ＣＤ９染色後に２９２７±４６６個の解析対象、抗ＣＤ６３染色後に１７４７±１４１個の解析対象、抗ＣＤ８１染色後に１７３４±２００個の解析対象が回収された。全ての抗体標識されたＭＳＣ－ＥＶ調製物において、抗体非標識対照（２０４６±１５７個の解析対象）よりも多くの解析対象がＲ３において認められた（抗ＣＤ９：６６２５±８０３個の解析対象；抗ＣＤ６３：５９１５±２７１個の解析対象；抗ＣＤ８１：５７７７±６７５個の解析対象）。３つの異なる領域内の解析対象をより詳細に分析するために、それらの抗体標識強度をＰＨＫ６７標識強度に対してプロットした。これらの結果から、Ｒ１において大きい割合の解析対象が抗ＣＤ９抗体によって有効に標識されたことが明らかに確認される。Ｒ１解析対象集団は抗ＣＤ９抗体染色後よりも抗ＣＤ６３および抗ＣＤ８１後に非常に小さいが、これらの解析対象の割合はそれぞれＣＤ６３^＋またはＣＤ８１^＋として明らかに認識される（図９Ｂ）。対照的に、Ｒ２またはＲ３において全ての解析対象がＣＤ６３^－およびＣＤ８１^－解析対象として現れ、その大部分は抗ＣＤ９抗体によって標識することができる。Ｒ１において回収されたＣＤ９^＋、ＣＤ６３^＋およびＣＤ８１^＋解析対象の頻度は、ＭＳＣ－ＥＶ調製物が多数のＣＤ９^＋ＣＤ８１^－および少数のＣＤ９^－ＣＤ８１^＋ｓＥＶ集団を含むという本発明者らの先の観察に一致している（Ｇｏｒｇｅｎｓら，２０１９）。全体として、Ｒ１において大部分の抗体染色した解析対象はＰＫＨ６７によって標識されないｓＥＶであり、かつｓＥＶの大部分はこれらの３種類の抗体のいずれかにより染色が成功した場合にのみ検出することができるとみなした。従って、このデータからＭＳＣ－ｓＥＶ標識色素としてのＰＫＨ６７の効率が疑問視される。

【0159】

色素２はＭＳＣ－ＥＶ調製物中のＣＤ９^＋、ＣＤ６３^＋およびＣＤ８１^＋ＥＶを有効に標識する
次に、ＥＶ標識色素としての本発明の色素２の信頼性をＰＫＨ６７と比較可能な方法で調べた。この目的を達成するために、ＭＳＣ－ＥＶ調製物（ｎ＝３）をそれぞれ、色素２単独または抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３もしくは抗ＣＤ８１抗体との組み合わせのいずれか一方で染色した。Ｒ１～３サブゲートを定めることなく、図９Ａに示すようなゲーティング戦略を適用した。ＰＫＨ６７標識実験とは対照的に、より低い側方散乱シグナル強度を有するより多くの解析対象がこれらの３種類の異なる抗体の非存在下であっても色素２で標識された。色素２のみまたはさらに抗ＣＤ９抗体（図１０）で標識されたＭＳＣ－ＥＶ試料間では、検出された解析対象の数の明らかな上昇は観察されなかった。従ってＰＫＨ６７標識とは対照的に、色素２による標識はＭＳＣ－ＥＶ調製物内のｓＥＶの大部分を標識するのに十分である。全ての標識された解析対象が界面活性剤不溶性であることが確認された。全体としてこれらのデータにより、色素２がＭＳＣ－ＥＶ調製物中のｓＥＶの大部分を上手く標識することが実証されている。

【0160】

色素２による染色はＭＳＣ－ＥＶ調製物の免疫調節能力に影響を与えない
次に、本発明の色素２がＭＳＣ－ＥＶ調製物の免疫調節能力に影響を与えるか否かを調べた。この目的を達成するために、マルチドナー混合リンパ球反応（ｍｄＭＬＲ）アッセイにおいて色素２で染色したＭＳＣ－ＥＶ調製物の活性を対応する非標識ＭＳＣ－ＥＶ調製物と比較した。１２人の異なる健康なドナーの末梢血からの単核細胞（ＰＢＭＣ）をプールした際に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化状態によって監視することができる同種異系免疫反応が誘導された。５日間の培養後に、全てのＣＤ４^＋Ｔ細胞の約４分の１がＴ細胞活性化を示すインターロイキン－２受容体（ＣＤ２５）および細胞間接着分子－１（ＣＤ５４）を発現している（図１１）。先に記載されているように、免疫調節能力を有するＭＳＣ－ＥＶ調製物は活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の含有量を有効に減少させる（Ｍａｄｅｌら，２０２０）。首尾一貫して、非標識ＭＳＣ－ＥＶ調製物の存在下で、監視されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の１６％のみが活性化細胞表面マーカーを示すことが分かった（図１１Ｂ）。色素２で標識されたＭＳＣ－ＥＶ調製物（ｎ＝３）の存在下で、本発明者らはＣＤ４^＋Ｔ細胞活性化の匹敵する減少を観察した（図１１Ｂ）。注目すべきことに、色素２それ自体はＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化状態に影響を与えなかった（図１１Ｂ）。従って色素２は、施用されるＭＳＣ－ＥＶ調製物の免疫調節能力に認識できるほどに影響を与えない。

【0161】

色素２で染色したＭＳＣ－ＥＶはｍｄＭＬＲアッセイの免疫細胞サブタイプにわたって異なる取込み能を示す
本発明の色素２によるＥＶ標識がＥＶ取り込み細胞の同定を可能にするか否かを調べるために、ｍｄＭＬＲアッセイ内での異なる免疫細胞の標識されたＥＶ取込みを調べた。この目的を達成するために、限外濾過によって過剰な色素２が除去された１２人の健康なドナーから得られたＰＢＭＣのプールを色素２で標識されたＭＳＣ－ＥＶ（ｎ＝３）の存在下で５日間培養した。その後に細胞を回収し、抗体を標識し、フローサイトメトリーで解析した。異なるＰＢＭＣサブタイプ内の色素２で標識された細胞の含有量を決定した。ほぼ全ての単球（ＣＤ１４^＋細胞、９９％）が色素２のシグナルを示した。対照的に異なるリンパ球の割合、すなわち全てのＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ４^＋細胞）の７１％、全てのＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８^＋細胞）の３４％、全てのＢ細胞（ＣＤ１９^＋細胞）の７２％および全てのＮＫ細胞（ＣＤ５６^＋細胞）の１５％のみが色素２陽性細胞として現れた。また、ＩＦＣＭを使用して色素２陽性細胞の細胞下染色を可視化した（図１２）。得られた画像は、本発明者らの経験によれば細胞内に位置している完全に標識された構造を示している。従って、ＭＳＣ－ＥＶ調製物内の色素２で標識されたＥＶは、アッセイ内で異なる含有量の免疫細胞型によって特異的に取り込まれた。

【0162】

実施例１２：色素で標識された細胞外小胞の可視化
電子顕微鏡法を適用して精製済ＥＶを可視化することができる。さらに共焦点顕微鏡法を使用して、インビトロおよび他のアッセイの間に細胞内部の標識されたＥＶの動きを追跡することができる。図１３は、従来（図１３Ａ）および共焦点（図１３Ｂ）顕微鏡法によって観察されるＮＨＤＦにおいて本発明の色素２で染色したＥＶを示す。本明細書に記載されているように、色素２はＥＶフローサイトメトリーでも使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3(a)】

【図3(b)】

【図3(c)】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【国際調査報告】