特表 2024-500500 脂肪酸導入高分子ナノ粒子およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-09

(54)【発明の名称】脂肪酸導入高分子ナノ粒子およびその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 33/10 20060101AFI20231226BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20231226BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20231226BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20231226BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20231226BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20231226BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20231226BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20231226BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20231226BHJP

【ＦＩ】

A61K33/10

A61K9/16

A61K47/12

A61K47/34

A61K47/36

A61K47/42

A61K47/20

A61P3/04

A61K47/69

B82Y5/00

B82Y40/00

A61K9/51

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539007

(86)(22)【出願日】2021-12-21

(85)【翻訳文提出日】2023-06-23

(86)【国際出願番号】 KR2021019527

(87)【国際公開番号】W WO2022139418

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】10-2020-0183085

(32)【優先日】2020-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522244078

【氏名又は名称】スーパーノヴァ バイオ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＰＥＲＮＯＶＡ ＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】イ グンヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ へウォン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076AA65

4C076AA95

4C076BB31

4C076CC21

4C076DD25

4C076DD41

4C076DD46

4C076DD55

4C076EE06

4C076EE23

4C076EE24

4C076EE30

4C076EE36

4C076EE37

4C076EE38

4C076EE41

4C076EE48

4C076EE49

4C076FF34

4C086AA01

4C086AA02

4C086HA04

4C086HA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA38

4C086MA41

4C086MA63

4C086NA05

4C086NA11

4C086NA13

4C086ZA70

(57)【要約】

本発明は、脂肪酸導入高分子ナノ粒子およびその用途に関する。本発明では、生体親和性高分子および脂肪細胞標的リガンド（脂肪酸）を用いて炭酸カルシウム結晶が包埋されたナノ粒子を形成することによって、脂肪細胞以外の周辺細胞および組織に伝達を最小化し、脂肪細胞内へのナノ粒子の包埋を最大化することができる。本発明によるナノ粒子は、注射可能な製剤で製作可能であり、局所脂肪を分解する局所脂肪分解補完材またはダイエット美容製品に適用することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）結晶、生体適合性高分子および脂肪酸を含むナノ粒子であって、前記炭酸カルシウムは、ナノ粒子の内部に包埋され、前記脂肪酸は、ナノ粒子の表面に露出しているナノ粒子。

【請求項2】

前記ナノ粒子は、酸性環境で二酸化炭素を放出する、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項3】

前記生体適合性高分子は、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド－ポリグリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、澱粉、グリコーゲン、キチン、ペプチドグリカン、リグノスルホナート、タンニン酸、リグニン、ペクチン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、セルロース、ヘミセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストランまたはアルギネート構造を有する重合体である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項4】

前記ナノ粒子の直径は、１００～３００ｎｍである、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項5】

前記脂肪酸は、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項6】

前記脂肪酸および生体適合性高分子は、重量比が０．０１：１～０．２：１である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む脂肪分解用組成物。

【請求項8】

請求項７に記載の脂肪分解用組成物を含む肥満の予防および治療用薬学的組成物。

【請求項9】

下記の段階を含む請求項１から６のいずれか一項に記載のナノ粒子の製造方法：
（ａ）炭酸カルシウム結晶を含む第１水相（ｗａｔｅｒ ｐｈａｓｅ）と脂肪酸および生体適合性高分子を含む油相（ｏｉｌ ｐｈａｓｅ）を混合し、油中水型の単一エマルジョン（Ｗ／Ｏ）を形成する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）のエマルジョンと第２水相を混合し、水中油中水型の二重エマルジョン（Ｗ／Ｏ／Ｗ）を形成する段階；および
（ｃ）前記段階（ｂ）の二重エマルジョンを固形化させる段階。

【請求項10】

前記生体適合性高分子は、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド－ポリグリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、澱粉、グリコーゲン、キチン、ペプチドグリカン、リグノスルホナート、タンニン酸、リグニン、ペクチン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、セルロース、ヘミセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストランまたはアルギネート構造を有する重合体である、請求項９に記載のナノ粒子の製造方法。

【請求項11】

前記方法によって製造されたナノ粒子の直径は、１００～３００ｎｍである、請求項９に記載のナノ粒子の製造方法。

【請求項12】

前記脂肪酸は、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸である、請求項９に記載のナノ粒子の製造方法。

【請求項13】

前記生体適合性高分子および脂肪酸は、重量比が０．０１：１～０．２：１で混合されたものである、請求項９に記載のナノ粒子の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脂肪酸導入高分子ナノ粒子およびその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚の表皮と真皮の下に存在する皮下脂肪の減少は、美容処理の最も重要な分野の一つであり、このような美容処理の目的のために多様な施術方法が用いられている。

【0003】

皮下脂肪の減少のための施術としては、皮下脂肪にカニューレ（ｃａｎｎｕｌａ）を挿入し、脂肪を吸入する脂肪吸入術、冷却パッドを皮膚の表面に付着し、皮下脂肪を冷却壊死させる冷凍施術、高周波または超音波を皮下脂肪組織に照射し、加熱によって皮下脂肪を除去する熱的加熱施術、二酸化炭素（ＣＯ_２）を注射針で皮下脂肪に徐々に注入し、脂肪組織の血流循環およびリンパ循環を促進することによって脂肪を除去するカルボキシセラピー（Ｃａｒｂｏｘｙｔｈｅｒａｐｙ）施術、皮下脂肪に肥満治療用薬物を注入するメソセラピー（Ｍｅｓｏｔｈｅｒａｐｙ）施術などがある。

【0004】

施術のうち最も効果が高いと知られた脂肪吸入術は、施術時に伴う苦痛および後続管理において短所を有する。代表的に、脂肪吸入時に出血があり、施術時に痛みを伴う。これは、施術後にも痛みを誘発し、個人によって鎮痛剤を服用しなければならない場合も発生する。また、吸入手術後に圧迫服を一週間以上着用しなければならず、手術後に一ヶ月程度の管理を必要とする。

【0005】

また、冷凍施術は、施術が手軽であるが、施術効果が低いという短所を有する。韓国公開特許第１０－２０１１－０１１９６４０号公報には、冷媒を内部に循環させて冷却されるプローブを皮下脂肪に挿入する侵襲的施術を用いた。しかしながら、侵襲的冷却施術を用いる場合、施術時間が非侵襲的冷却施術より短縮されるが、冷却による皮下脂肪の壊死を防止するために、非常に長い施術時間を要するという短所を有する。

【0006】

なお、カルボキシセラピーは、脂肪が過度に蓄積された部位を集中的に治療する施術であり、韓国登録特許第１０－０７７２９６１号公報には、メソセラピー施術およびカルボキシセラピー施術を全部行って、脂肪除去効率を高めた。しかしながら、前記特許は、各施術に対して別途の注射器針を用いていて、内部構造が複雑であり、それぞれの針によって別途の切開創が生じるという短所を有する。

【0007】

現在食品医薬品安全処の許可が完了した局所脂肪分解補完材は、用途が非常に限定的であり、現在市中ではオフラベル施術が頻繁に施行されている実情である。このようなオフラベル施術は、安全性および有効性の根拠が不十分であり、保険適用外領域であるから、安全使用管理の死角地帯に置かれていて、制度的な管理が不十分である。

【0008】

脂肪分解補完材として許可を受けた薬物として局所脂肪細胞の細胞膜を破壊することによって脂肪細胞を死滅させるベルキラがある。しかしながら、ベルキラは、二重顎の施術にのみ限定的に利用可能であるという短所を有する。また、このような薬物は、非特異的に細胞膜を破壊するので、脂肪細胞だけでなく、周辺細胞に対する影響が大きいため、周辺組織に副作用を及ぼすことができるので、現在乳がんまたは大腸がんの危険性が増加することが報告されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、前述したような問題点を解決するために、局所脂肪を分解する高分子ナノ粒子およびその用途を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）結晶、生体適合性高分子および脂肪酸を含むナノ粒子であって、前記炭酸カルシウムは、ナノ粒子の内部に包埋され、脂肪酸は、ナノ粒子の表面に露出しているナノ粒子を提供する。

【0011】

従来、局所脂肪分解施術の場合、注射針で脂肪が蓄積された当該部位に直接薬物を注入して治療する方式に該当し、非特異的薬物を使用するので、注射部位の周辺の他の細胞も破壊する可能性があり、近くの神経に触れると、無感覚や神経損傷の危険性の問題点があった。本発明者らは、これを解決するために、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）結晶、生体適合性高分子および脂肪酸を含むナノ粒子を用いることによって、ナノ粒子の表面に露出している脂肪酸により脂肪細胞の内部に特異的にナノ粒子を導入することができることを糾明し、本発明を完成した。

【0012】

本明細書上の用語「炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）結晶」は、化学的加工によって製造された沈降炭酸カルシウム（Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）と区分されるものであり、一般的に、高純度の結晶質石灰石を機械的に粉砕し、分級して製造したものを意味する。

【0013】

本発明によるナノ粒子は、前記炭酸カルシウム結晶が生体適合性高分子の内部に包埋されている形態を有するが、これは、生体適合性高分子が形成する硬質皮膜（ｈａｒｄ ｓｈｅｌｌ）の球形状構造体の内部に炭酸カルシウム結晶が流動なく包埋された形態であり、前記球形状構造体の中心から外部表面に至るまで分布確率上の有意差がなく均等に包埋された固体構造（ｓｏｌｉｄ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を意味する。

【0014】

本発明のナノ粒子は、酸性環境でパーティクルの内部に包埋された炭酸カルシウム結晶が二酸化炭素気体を生成する反応を起こす。本発明のナノ粒子は、層状の膜構造の内部に炭酸カルシウムを含有するコア－シェル（ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ）形態でなく、内部が満たされた固体結晶の内部に炭酸カルシウム結晶が包埋された形態である。すなわち、内部で発生した気体が気体の発生と同時に外部に漏れる（ｌｅａｋｅｄ）構造と差別化されるように、ナノ粒子に包埋された炭酸カルシウム結晶が二酸化炭素気体を発生させる場合、ナノ粒子の内部圧力が徐々に増加し、最終的に、ナノ粒子の爆発を誘導する。このような特性によって、二酸化炭素気泡の放出およびナノ粒子の爆発による細胞打撃効果を同時に達成する。

【0015】

本発明の一具現例において、本発明の生体適合性高分子は、脂肪酸により表面改質されている。具体的には、前記脂肪酸は、生体適合性高分子と混合されて、前記球形状の構造体を形成し、脂肪酸は、前記構造体の表面に露出した形態を有する。本発明の脂肪酸は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸を含んでもよいし、好ましくは、Ｃ_１２～Ｃ_２０の飽和または不飽和脂肪酸であってもよい。本発明のナノ粒子表面に露出した脂肪酸は、脂肪細胞標的指向性を有する。具体的には、ナノ粒子表面の脂肪酸は、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の細胞膜に存在する脂肪酸輸送タンパク質などとの反応を通じてナノ粒子が脂肪細胞に細胞内吸収の方法で導入する。したがって、脂肪酸により表面改質されたナノ粒子は、脂肪細胞または脂肪組織内に選択的に吸収／蓄積され、脂肪細胞内で二酸化炭素気体を生成させて、ナノ粒子の構造を変形、破壊させ、急激に噴出され、脂肪細胞に物理的に打撃を与えて分解したり、ネクローシス性壊死を起こすようにして、脂肪組織を減少させることができる。

【0016】

本発明の生体適合性高分子は、生体組織または血液と接触して組織を破壊させたり血液を凝固させない組織適合性（ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）および抗凝血性（ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を有する高分子を意味し、本発明のエマルジョン工法により炭酸カルシウム結晶が包埋された固体構造を形成できるものであれば、特別な制限なく、適切に選択可能である。

【0017】

本発明の一具現例において、本発明の生体適合性高分子は、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド－ポリグリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、澱粉、グリコーゲン、キチン、ペプチドグリカン、リグノスルホナート、タンニン酸、リグニン、ペクチン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、セルロース、ヘミセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストランまたはアルギネート構造を有する重合体である。好ましくは、ポリラクチド－ポリグリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）を使用することができる。

【0018】

本発明の一具現例において、本発明のナノ粒子の直径は、１００～３００ｎｍであってもよく、好ましくは、１２０～２９０ｎｍ、さらに好ましくは、１５０～２８０ｎｍ、より好ましくは、２００～２６０ｎｍであってもよい。前記直径の範囲で脂肪細胞のネクローシス性死滅を誘導できる細胞打撃効果を最大化させることができる。

【0019】

本発明の一具現例において、前記脂肪酸および生体適合性高分子の重量比が０．０１：１～０．５：１（脂肪酸：高分子）であってもよく、好ましくは、０．０５：１～０．１５：１であってもよい。前記重量比内で脂肪細胞への標的化および細胞生存率を高めることができる。脂肪酸の含有量が前記範囲より多くなる場合、ナノ粒子の直径が大きくなることがあるが、製造過程の低い温度に起因して多く失われ、製造されたナノ粒子の安定性が低下する短所が発生する。

【0020】

本発明の一具現例において、前記炭酸カルシウム結晶と生体適合性高分子は、重量比が０．００１：１～１：１（炭酸カルシウム：高分子）であってもよい。好ましくは、炭酸カルシウム結晶と生体適合性高分子の重量比が０．０１：１～０．８：１、さらに好ましくは、０．１：１～０．６：１である。前記重量比に該当する炭酸カルシウム結晶と生体適合性高分子は、脂肪細胞の減少効果を最大化させることができる。炭酸カルシウム結晶と生体適合性高分子の割合は、生成されるガス生成ナノパーティクルの直径には有意な影響を与えない。表２に示されたように、炭酸カルシウム結晶の含有量が増加するほど含有効率が大幅に低下することから見て、前記範囲より高い含有は期待しにくく、生体適合性高分子による硬質皮膜（ｈａｒｄ－ｓｈｅｌｌ）構造も、相対的に堅固でない。なお、前記範囲より炭酸カルシウムがさらに少なく含まれる場合には、発生する気体の量が脂肪細胞打撃効果を得るのに不十分である。

【0021】

本発明の一具現例において、炭酸カルシウム、生体適合性高分子および脂肪酸の前記重量比内で製造したナノ粒子を用いる場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有意な脂肪減少効果を導き出した。

【0022】

本発明の一様態によれば、本発明は、上述したナノ粒子を含む脂肪分解用組成物を提供する。本発明の脂肪分解用組成物は、脂肪細胞内環境で特異的に二酸化炭素を放出する効果を有し、また、従来の脂肪分解局所治療法とは異なって、脂肪細胞組織標的化が可能である。

【0023】

本発明の一様態によれば、本発明は、上述したナノ粒子および／またはこれを含む組成物を含む肥満の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0024】

本発明の一様態によれば、本発明は、下記の段階を含むナノ粒子の製造方法を提供する：
（ａ）炭酸カルシウム結晶を含む第１水相（ｗａｔｅｒ ｐｈａｓｅ）と脂肪酸および生体適合性高分子を含む油相（ｏｉｌ ｐｈａｓｅ）を混合し、油中水型の単一エマルジョン（ｗ／ｏ）を形成する段階；
（ｂ）段階（ａ）のエマルジョンと第２水相を混合し、水中油中水型の二重エマルジョン（ｗ／ｏ／ｗ）を形成する段階；および
（ｃ）段階（ｂ）の二重エマルジョンを固形化させる段階。

【0025】

本発明によるナノ粒子の製造方法において、「第１水相」は、炭酸カルシウムスラリーを含む水性溶媒（ｐＨ７．０～８．０）、具体的には、例えば、炭酸カルシウム結晶が懸濁した蒸留水、生理食塩水（ＰＢＳ）、水性界面活性液（ａｑｕｅｏｕｓ ＰＶＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを使用することができる。本発明の段階（ａ）の「油相」は、脂肪酸および生体適合性高分子を水相と混ざらない疎水性および揮発性の強い有機溶媒内で溶解したものを使用することができ、具体的には、例えば、脂肪酸および生体適合性高分子をメチレンクロリド、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、エチルアセテート、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドおよびこれらの混合溶媒などに溶解したものを使用することができる。本発明の段階（ａ）の第１水相と油相の混合は、好ましくは、機械的撹拌を用いて実施することができ、例えば、超音波破砕機、ホモミキサー、撹拌機などを用いて実施することができる。

【0026】

本発明の段階（ａ）を通じて製造した単一エマルジョン（ｗ／ｏ）は、第２水相と混合し、二重エマルジョン（ｗ／ｏ／ｗ）を形成させる。第２水相は、具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドンなどの水性界面活性液を使用することができる。生成された二重エマルジョンは、有機溶媒の蒸発または抽出方法を通じて固形化させることができる。

【0027】

本発明の一具現例において、本発明の段階（ａ）の単一エマルジョンは、前記脂肪酸および生体適合性高分子の重量比が０．０１：１～０．２：１（脂肪酸：高分子）であってもよく、好ましくは、０．０５：１～０．１５：１であってもよい。また、前記炭酸カルシウム結晶と生体適合性高分子は、重量比が０．００１：１～１：１（炭酸カルシウム：高分子）であってもよく、好ましくは、０．０１：１～０．８：１、さらに好ましくは、０．１：１～０．６：１であってもよい。

【0028】

本発明によるナノ粒子製造方法は、本発明の他の一態様によるナノ粒子を製造する方法に関し、ナノ粒子と重複する内容については、本明細書の記載の過度な複雑性を避けるために省略する。

【発明の効果】

【0029】

本発明による高分子ナノ粒子は、体内で循環しつつ脂肪細胞特異的に包埋されて、細胞内で二酸化炭素を発生させることによって、脂肪細胞の壊死を通じて脂肪を分解させることができる。特に、本発明では、リガンド（脂肪酸）を用いて脂肪細胞への標的が可能なので、周辺組織および細胞に対する影響を最小化することができ、これを通じて、薬物に対する副作用を最小化することができ、さらに安全な施術が可能な製品の開発が可能である。前記ナノ粒子は、一般的に施術頻度の高いあご、太もも、腕、腹などの部位に適用が可能である。

【0030】

また、本発明によるナノ粒子は、注射可能な製剤で製作可能であり、ダイエット美容分野および肥満治療剤の分野に適用され、局所脂肪の壊死を通じて局所脂肪を分解する局所脂肪分解補完材、体型矯正剤またはダイエット美容製品などに使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】本発明の一例による脂肪酸導入ナノ粒子（ａ）と脂肪酸（ｂ）および脂肪酸導入ナノ粒子（ｂ）の脂肪細胞内への包埋過程を示す模式図である。

【図2】ＤＬＳで測定した（ａ）ＰＮＰ、（ｂ）ＧＮＰ、（ｃ）ＰＡ－ＧＮＰ２および（ｄ）ＰＡ－ＧＮＰ１０のサイズ分布を示す図である。

【図3】（ａ）ＰＮＰ、（ｂ）ＧＮＰ、（ｃ）ＰＡ－ＧＮＰ２および（ｄ）ＰＡ－ＧＮＰ１０のＳＥＭ像を示す図である。

【図4】パルミチン酸の濃度に応じたナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図5】パルミチン酸の濃度に応じたナノ粒子のｐｙ－ＧＣ／ＭＳスペクトルを示す図である。

【図6】ＧＮＰ、ＰＡ－ＧＮＰ２およびＰＡ－ＧＮＰ１０（［ＣａＣＯ_３］＝０．５ｍｇ／ｍＬ）で処理した細胞の試験管内生存率を示す図である。

【図7】（ａ）３Ｔ３－Ｌ１前脂肪細胞、（ｂ）６日目の３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞、（ｃ）１０日目の３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞、（ｄ）培養後１２日目の３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞のオイルレッドＯ染色像および（ｅ）時間による３Ｔ３－Ｌ１前脂肪細胞および脂肪細胞から溶出されたオイルレッドＯの光学密度値の変化を示す図である。

【図8】様々な濃度のＰＮＰ、ＧＮＰ、ＰＡ－ＰＮＰ２およびＰＡ－ＰＮＰ１０で処理した３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の試験管内生存率を示す図である。

【図9】（ａ）ＧＮＰ、ＰＡ－ＧＮＰ２およびＰＡ－ＧＮＰ１０（［ＣａＣＯ_３］＝０．５ｍｇ／ｍＬ）で処理された３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の試験管内生存率および（ｂ）様々な濃度のＣａＣＯ_３が含有されたＰＡ－ＧＮＰ１０で処理された３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の試験管内生存率を示す図である。

【図10】ａｌｅｘａ ４８８カダベリンがコンジュゲートされたＰＮＰおよびＰＡ－ＰＮＰで処理された３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の共焦点顕微鏡像を示す図である。

【図11】ａｌｅｘａ ４８８カダベリンがコンジュゲートされたＰＮＰおよび様々な種類のＦＡ－ＰＮＰで処理された３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の共焦点顕微鏡像を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明だろう。

【実施例】

【0033】

参考実験材料
ポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ、Ｍｗ６４００、５０：５０，０．１５～０．２５ｄＬ／ｇ、カルボキシレート末端基）は、Ｌａｃｔｅｌ Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）から購入した。ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ、Ｍｗ３００００～７００００、８７～９０％加水分解される）、ジクロロメタン（メチレンクロリド、ＭＣ）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）、パルミチン酸（ＰＡ）、オイルレッドＯ、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、塩酸塩（ＨＣｌ）、酢酸ナトリウム（無水）、酢酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３－イソブチル－１－メチル－キサンチン（ＩＢＭＸ）、インスリン、デキサメタソン、ダルベッコリン酸塩緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）、ペニシリン－ストレプトマイシングルタミン、１０％ホルマリン溶液は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。２－プロパノール（イソプロパノール、９９．５％）は、サムチョン（ソウル、江南）から購入した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＴＳ分析）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から購入した。ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌ、Ｄ－ブドウ糖）は、ウェルジン（慶北、慶山）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および小牛血清（ＣＳ）は、Ｇｉｂｃｏ（米国ニューヨーク州、グランドアイランド）から購入した。トリプシン－エチレンジアミンテトラ酢酸およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カダベリンナトリウム塩およびｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄ ＤＮＤ－９９は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）から購入した。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤＡｎｔｉｆａｄｅマウント培地は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。水は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（Ｒ）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；米国マサチューセッツ州、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）と精製水ＲＯ ＭＡＸ（Ｈｕｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｈａｎａｍ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ、Ｋｏｒｅａ）を用いて蒸留および脱イオン化された。マウスＣ５７ＢＬ／６は、オリエント（京畿、城南）から購入した。

【0034】

実施例１．パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）で改質された気体生成ナノ粒子（ＰＡ－ＧＮＰｓ）の製造
脂肪酸改質ガス生成ＰＬＧＡナノ粒子（ＦＡ－ＧＮＰ）は、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルジョンおよび溶媒蒸発方法で製造された。脂肪酸は、ＧＮＰ表面を物理的に改質した。１０％ｗ／ｖジクロロメタンに溶解した脂肪酸溶液をＰＬＧＡ溶液（５％ｗ／ｖ）と最小４時間混合した（ＦＡ－ＰＬＧＡ溶液）。（ＦＡ－ＰＬＧＡ溶液、脱イオン水中２５％ｗ／ｖ炭酸カルシウム（含有）および４％ＰＶＡ溶液は、使用時まで氷浴に固定された。）炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）を脱イオン水（ＤＷ）とともに２５Ｗ出力で９０秒間超音波装置（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）；Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて均一に分散させた（Ｗ_１）。ナノ粒子にＣａＣＯ_３をロードするためにＣａＣＯ_３分散溶液をＦＡ－ＰＬＧＡ溶液（Ｏ）に添加し、２５Ｗ出力で９０秒間超音波処理器で乳化した。このエマルジョン（Ｗ_１／Ｏ）を懸濁重合補助剤として使用する４％ＰＶＡ溶液に注入し、超音波処理器で２分間３５Ｗ出力で乳化し、他のエマルジョン（Ｗ_１／Ｏ／Ｗ_２）を作成した。完全な二重エマルジョンを１％ＰＶＡ溶液に添加し、一晩中撹拌し、残ったジクロロメタンを蒸発させた。アンロードされたＣａＣＯ_３は、４０００ｇで１分間超遠心分離して除去した。その後、上澄み液を３１，０００ｇで３０分間超遠心分離してナノ粒子を収集し、脱イオン水で４回洗浄した。ＦＡ－ＧＮＰは、凍結乾燥（京畿道東豆川市、ＩＬＳＨＩＮ ＢＩＯＢＡＳＥ凍結乾燥機）後、４℃で保管した。ＣａＣＯ_３がないＦＡ－ＰＬＧＡナノ粒子（ＦＡ－ＰＮＰ）も、同じ方法で製造して、対照群として使用した。

【0035】

炭酸カルシウムを含有するＰＬＧＡナノ粒子は、Ｗ／Ｏ／Ｗ二重乳化法で製造され、ガス発生ナノ粒子（ＧＮＰ）として使用した。炭酸カルシウム（ＰＮＰ、ガス発生なし）が含有されていないＰＬＧＡナノ粒子も準備し、対照群として使用した。ＧＮＰにおいてＣａＣＯ_３のローディング含有量が５５．０％（ＣａＣＯ_３／ＰＬＧＡ；ｗｔ／ｗｔ％）であるとき、ＧＮＰの平均直径は２４６．８ｎｍであった。炭酸カルシウム含有量の変化に応じたＰＮＰの平均直径に有意な変化は観察されなかった（表１）。これは、２．５多分散指数（ＰＤＩ）値に現れ、中性ｐＨ条件（ｐＨ７．４）で狭いサイズ分布を示した（図２の（ａ）、（ｂ））。ＳＥＭ像は、ＣａＣＯ_３が存在していても、ナノ粒子が球形を形成することを示した（図３の（ａ）、（ｂ））。ｐＨ依存的サイズ分布変化は、次のように測定された。ＰＮＰは、ｐＨによるサイズの差異も現れなかった。興味深く、ＧＮＰは、酸性条件（ｐＨ５．５）でサイズが大きく増加しただけでなく、サイズ分布も広くなることを確認した（図２）。この結果は、ＧＮＰが酸性ｐＨ条件に反応して二酸化炭素ガスを生成することを示唆する。

【0036】

【表1】

【0037】

実験例１．パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）で改質された気体生成ナノ粒子（ＰＡ－ＧＮＰｓ）の特性
ナノ粒子の形態は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ－４８００Ｕ電界放射型走査電子顕微鏡、Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察した。ＰＡ－ＧＮＰの平均サイズおよびサイズ分布は、ｐＨ７．４（脱イオン水）およびｐＨ５．５（酢酸）（［ＮＰｓ］＝０．５ｍｇ／ｍｌ）で動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ装置、英国）により決定された。ＮＭＲおよびｐｙ－ＧＣ／ＭＳは、パルミチン酸定性分析に用いられた。ＮＭＲ分光器を用いてスペクトルを獲得した。すべてのサンプルに対してＤＭＳＯを溶媒として使用し、２ｍｇ／ｍＬの等価濃度で希釈した。スペクトルは、また、ｐｙ－ＧＣ／ＭＳを用いて獲得し、すべてのサンプルは、４ｍｇを使用した。ＣａＣＯ_３のローディング含有量を決定するために、ＰＡ－ＧＮＰを１Ｍ ＮａＯＨ溶液に１時間溶解させ、１Ｍ ＨＣｌ溶液で中和させた。ナノ粒子溶液のＣａＣＯ_３濃度百分率は、Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）のカルシウム比色分析キットを用いて推定し、重量分率で計算した。ＰＡ－ＧＮＰで生成された二酸化炭素ガスの量は、カルシウム比色分析キットで測定することができ、カルシウムイオンのモル数（Ｃａ^２＋／ＣＯ_２＝１ｍｏｌ／ｍｏｌ）を決定して計算することができた。ナノ粒子をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４またはｐＨ５．５、［ＣａＣＯ_３］＝１ｍｇ／ｍＬ）に懸濁し、この溶液を１５分間３１，０００ｇで超遠心分離した。

【0038】

動物でよく見られる飽和脂肪酸であるパルミチン酸（ＰＡ）は、動物においてさらに他の豊富な脂肪酸であるオレイン酸よりも光、空気および熱にあまり敏感でないため、ＰＬＧＡナノ粒子の表面改質に選択されて使用された。ＰＡは、向上した脂肪細胞の吸収のために様々な重量比でＰＬＧＡナノ粒子に物理的に結合された。パルミチン酸で改質されたガス生成ＰＬＧＡナノ粒子（ＰＡ－ＧＮＰ）は、乳化過程でＯ相でＰＡとＰＬＧＡナノ粒子との間の自己組織化によって製造された。ＰＡ－ＧＮＰの後の数字は、パルミチン酸とＰＬＧＡの供給比率を示す（表１）。ＰＬＧＡ自体と非修飾ナノ粒子（ＧＮＰ）が対照群として使用された。

【0039】

パルミチン酸と炭酸カルシウムの添加によってパルミチン酸の添加量によるナノ粒子の平均直径に大きい変化がなかった（表１）。表面に付着したＰＡの量は、ＮＭＲとｐｙ－ＧＣ／ＭＳを用いて定性的に分析した。ＰＮＰおよびＰＡ－ＰＮＰスペクトルで５および１．５ｐｐｍのピークは、ＰＬＧＡで識別された。ＰＡ－ＰＮＰの場合、２．２ｐｐｍ（－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ_２、ＣＨ_２近所－ＣＯＯＨ）、１．３５ｐｐｍ（－（ＣＨ_２）ｎ－）および０．８５ｐｐｍ（－ＣＨ_３）でＰＡに該当する新しいピークが観察された（図４）。脂肪酸の供給比が増加すると、表面改質効率が減少した（表２）。超遠心分離工程中に低温（１０℃）は、脂肪酸の損失に影響を及ぼすと推定された。７．５～７．８分間に観察されたパルミチン酸ピークを基に７．５～７．８分にＰＮＰでは当該ピークが現れないことを確認した（図５）。また、パルミチン酸が添加されたＰＡ－ＰＮＰでは、パルミチン酸の濃度によってピークの程度が変わった。パルミチン酸ピーク面積は、ナノ粒子に付着したパルミチン酸の量を計算するために積分値で計算された。ナノ粒子の製造過程でパルミチン酸の損失を考慮してみると、実際にパルミチン酸の量は、５倍ではなく、６．５９倍と差があることが明らかとなった。このような^１Ｈ ＮＭＲおよびｐｙ－ＧＣ／ＭＳの結果は、ＰＡがナノ粒子の表面に成功裏に結合されたことを示した。

【0040】

ＰＡ－ＰＮＰの形態は、走査電子顕微鏡でも観察された。パルミチン酸を添加した場合にも、ＰＮＰに比べて、ＰＡ－ＰＮＰは、依然として球形であり、サイズに大きい変化がなかった（図３の（ｃ）、（ｄ））。酸性条件でのサイズ変化は、パルミチン酸が付着した場合にもＧＮＰと似ていた。以上の結果より、パルミチン酸による表面改質がＧＮＰのサイズ、形態、ガス発生能力などの物性に大きな影響を及ぼさないことを確認できた。

【0041】

【表2】

【0042】

実験例２．ナノ粒子処理された細胞生存力の分析
細胞培養および３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞分化
ＮＩＨ－３Ｔ３細胞（線維芽細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入し、細胞は、１０％ＣＳおよび１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（ＰＳ）を含むＤＭＥＭ完全成長培地で３７℃、５％ＣＯ_２条件で維持された（１０％ＣＳ ｍｅｄｉｕｍ）。Ｃ２Ｃ１２細胞（筋芽細胞）は、ＡＴＣＣから購入し、３７℃で５％ＣＯ_２条件下で１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳ（１０％ＦＢＳ培地）が含まれたＤＭＥＭ完全成長培地で維持された。３Ｔ３－Ｌ１前脂肪細胞は、ＡＴＣＣから購入し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で１０％ＣＳ培地で維持した。３Ｔ３－Ｌ１前脂肪細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到達して２日後、細胞は、１０％ＦＢＳに混合された１％ＩＢＭＸ（０．５ｍＭ）、０．１％インスリン（１μｇ／ｍＬ）、０．１％ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（１μＭ）を含む成長培地（ＭＤＩ培地）で２日間培養し、脂肪細胞分化を開始した。細胞は、１０％ＦＢＳと０．１％インスリンを含むＤＭＥＭ培地で２日間培養された。最後に、分化した細胞を１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地で培養し、隔日で培地を交替した。

【0043】

オイルレッドＯ染色
脂肪細胞の分化程度を決定し、脂質液滴を表示するために、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を用いた。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏストック液は、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ粉末０．７ｇをイソプロパン２００ｍＬに溶かして一晩中撹拌し、０．２２μｍシリンジフィルターでろ過し、４℃で保管して製造した。原液と脱イオン水を３：２の比で混合してＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏワーキング溶液を製造し、室温（ＲＴ）で２０分間放置した後、０．２２μｍシリンジフィルターでろ過して使用した。細胞をＲＴで５分間１０％ホルマリンで洗浄し、ＲＴで１時間１０％ホルマリンで固定した。固定後、細胞を６０％イソプロパノールで洗浄し、完全に乾燥させた。次に、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏワーキング溶液を１０分間添加した。細胞を脱イオン水で４回以上洗浄し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏストック溶液の残留物を除去した。顕微鏡で撮影した後、さらに完全に乾燥させた。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏを上下で複数回ピペッティングして、１００％イソプロパノールで溶出した後、紫外線／可視分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＡＢＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて５００ｎｍで測定した。

【0044】

ＰＡ－ＧＮＰの伝達能力とそれによるｉｎ ｖｉｔｒｏ処理効果を確認するために、様々な細胞株を対象に生存力実験をＭＴＳで分析して評価した。競争グループとしてＮＩＨ－３Ｔ３線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞および３Ｔ３－Ｌ１前脂肪細胞、３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞を使用した（図６）。大部分の細胞は、脂肪酸を吸収してエネルギー源に使用するので、脂肪細胞によりどれくらい特異的に吸収されるかを確認しようとした。

【0045】

ＧＮＰは、脂肪細胞、前脂肪細胞、幹細胞、線維芽細胞および筋芽細胞のような他のすべての細胞株の細胞生存力に影響を及ぼさなかった。これは、細胞がＧＮＰだけを吸収できず、二酸化炭素ガスの生成も、生物学的ｐＨに現れないことを示唆する。興味深く、ＰＡ－ＧＮＰを使用したとき、他の細胞株では、ＰＡの存在が大きく影響を及ぼさなかったが、脂肪細胞の場合、生存力が特に減少した。このような結果を基に、ＰＡ－ＧＮＰは、脂肪酸が最も多く吸収される脂肪細胞に効果的であることが分かった。また、脂肪酸を吸収する過程で発生する細胞内移入の酸性状態は、二酸化炭素ガスの生成を促進し、細胞生存力を大きく減少させることを確認した。

【0046】

実験例３．ナノ粒子の脂肪細胞への特異的吸収および脂肪細胞死滅能力の分析
３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞へのＰＡ－ＰＮＰの吸収は、共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて確認した。まず、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カダベリンをＭＥＳ緩衝液に溶解させ、暗条件で一晩中ＰＡ－ＰＮＰと反応させて、ａｌｅｘａ ４８８カダベリン－ＰＡ－ＰＮＰｓを製造した（Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン／ポリマー＝１／５０、ｗ／ｗ）。標識されたナノ粒子は、３１，０００ｇで１５分間超遠心分離して収集し、脱イオン水で３回洗浄した。Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン－ＰＡ－ＰＮＰは、凍結乾燥後、４℃で保管された。

【0047】

３Ｔ３－Ｌ１前脂肪細胞を共焦点皿に推奨接種密度８×１０^４細胞でシードし、前記セクションで説明したように、分化させた。Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄ（５０ｎＭ）およびａｌｅｘａ ４８８カダベリン－ＰＡ－ＰＮＰ（０．５ｍｇ／ｍＬ）含有培地を２４時間脂肪細胞に処理した。その後、脂肪細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、残っているナノ粒子を除去し、ＨＯＥＣＨＳＴ（１μｇ／ｍＬ）を１５分間処理して、核を染色した。細胞を１０％ホルマリンで１５分間固定し、アンチフェージングマウント培地（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて装着し、共焦点顕微鏡で分析した。すべてのプロセスは、暗条件で行われた。

【0048】

３Ｔ３－Ｌ１前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）は、ＣＳ培地で培養され、ＦＢＳ培地で脂肪細胞に分化した。脂肪細胞分化後、細胞質で脂質液滴が観察され、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色で検出された（図７）。分化前から分化後１２日まで段階別に脂質液滴の蓄積を調査した。

【0049】

３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞のＭＴＳ分析を用いてナノ粒子の細胞毒性を評価した。対照群としては、処理しない細胞を使用し、ＰＮＰ、ＧＮＰ、ＰＡ－ＰＮＰ２、ＰＡ－ＰＮＰ１０を処理した細胞は、試料濃度によって大きな変化を示さなかった（図８）。これは、また、ナノ粒子の生産に使用されるＰＬＧＡ、ＰＡおよびＣａＣＯ_３が目につく毒性がないことを示唆する。一方、ＰＡの濃度が増加するにつれて、ＰＡ－ＧＮＰを処理した細胞の細胞生存率が減少した（図９）。これは、重要な意味があるものと見なされ、追加実験に使用された。図示してはいないが、ＰＡ／ＰＬＧＡの割合が１であるとき、細胞生存率が最も低い傾向にあったが、ナノ粒子の特性が実験するのに非常にオイリーであるから、実験群から除外された。

【0050】

３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞へのＰＡ－ＰＬＧＡナノ粒子の特定細胞吸収は、Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン－ＰＡ－ＰＮＰを用いて共焦点顕微鏡で検査された。ＰＡ－ＰＮＰの３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞への細胞吸収は、表面が改質されていないナノ粒子と比較して明確に観察された（図１０）。この実験に使用されたｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒプローブは、中性ｐＨで部分的に中和し、細胞膜を自由に貫通できる弱い塩基を有している。また、酸度のある細胞器官に対して非常に選択的である。したがって、この実験で細胞内部の酸性ｐＨを示すリソソームは、選択的に染色され、赤色で現れる。この研究で仮定されたように、表面がＡｌｅｘａ ４８８カダベリンの緑色標識で改質されたナノ粒子は、様々なメカニズムによって吸収され、エンドソームに入り、結局、リソソームとの共局在化につながる。したがって、リソソームとナノ粒子が会うと、黄色が現れることは、成功した吸収を意味する。そして、これは、また、将来ＰＡ－ＧＮＰで二酸化炭素ガスが生成され、脂肪細胞死滅を予想することができる。

【0051】

実験例４．様々な脂肪酸により改質されたナノ粒子の脂肪細胞への吸収能の分析
前記実施例１と同じ方法で様々な長さの炭素鎖を有する脂肪酸を用いてＣａＣＯ_３がないＦＡ－ＰＬＧＡナノ粒子（ＦＡ－ＰＮＰ）を製造し、脂肪細胞内移入の有無を評価した。

【0052】

具体的には、飽和脂肪酸であるＭｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ（ＭＡ、Ｃ１４）、Ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ（ＰＡ、Ｃ１６）およびＳｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ（ＳＡ、Ｃ１８）と不飽和脂肪酸であるＯｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＯＡ、Ｃ１８）を使用し、下記表３の割合で脂肪酸およびＰＬＧＡを使用してＦＡ－ＰＬＧＡナノ粒子（ＦＡ－ＰＮＰ）を製造した。

【0053】

【表3】

【0054】

また、実験例３と同じ方法で製造されたＦＡ－ＰＮＰの脂肪細胞への吸収能を分析した。

【0055】

その結果、図１１に示されたように、パルミチン酸だけでなく、他の炭素数を有する飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸を使用した場合にも、ナノ粒子の脂肪細胞への吸収能が向上したことを確認できた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】